特表 2024-532461 低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、改善されたＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、改善されたＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240829BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

A61P43/00 121

A61P31/12

A61P35/00

A61P29/00

A61P31/04

A61P31/00

A61P11/06

A61P9/00

A61P19/02

A61P1/04

A61P1/16

A61P1/18

A61P13/12

A61P13/10

A61P3/10

A61P25/00

A61P17/06

A61K39/395 D

A61K39/395 N

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024513731

(86)(22)【出願日】2022-09-02

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 EP2022074449

(87)【国際公開番号】W WO2023031397

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】21194701.5

(32)【優先日】2021-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21204108.1

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22155394.4

(32)【優先日】2022-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520476488

【氏名又は名称】オンコワン・リサーチ・アンド・ディベロップメント・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】シナグル，アレクサンデル

(72)【発明者】

【氏名】ケルスバウメル，ランドルフ

(72)【発明者】

【氏名】ティーレ，ミヒャエル・ロベルト

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA01

4B064CA19

4B064CC15

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B064DA08

4C085AA13

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA25

(57)【要約】

本発明は、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により改善された特性、例えば、低減された凝集能及び低減された疎水性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体と、ｏｘＭＩＦ関連症状の治療におけるその使用とを指す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域、並びに以下の可変ドメイン：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；及び
（ｂ１）配列番号３を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号３及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
変異体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲ結合の減少を示し、
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号２及び配列番号３を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項2】

軽鎖可変ドメインがアミノ酸置換Ｗ９３Ｆを含み、重鎖可変領域がアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む、請求項１に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項3】

配列番号４、５、６、７、８、９、４３、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、請求項１又は２に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項4】

ｉ．）配列番号３及び６、
ｉｉ．）配列番号９及び６、
ｉｉｉ．）配列番号４及び６、
ｉｖ．）配列番号４及び８、
ｖ．）配列番号４及び５、又は
ｖｉ．）配列番号４３及び配列番号５、６、７若しくは８のいずれか１つ
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項5】

配列番号１４を更に含む、請求項４に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項6】

配列番号１５、及び１６又は１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項7】

Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域を含み、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号７４又は８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号７７又は８４から選択される重鎖ＣＤＲ３配列
を含み、
ただし、配列番号７４及び配列番号７７は一緒に含まれない、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項8】

アミノ酸置換が、配列番号１の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｉ２５３、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｈ４３５のいずれか１つにおいてであり、具体的には、アミノ酸置換が、ＥＵ付番指標に従って、位置Ｌ２３４及びＬ２３５、特に位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０及びＨ４３５であり、及び／又はＦｃ領域がアグリコシル化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項9】

二重特異性抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、Ｆａｂ／ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項10】

前記抗体が、具体的には、ＣＤ３のエピトープ又はヒスタミン－スクシニル－グリシン（ＨＳＧ）を特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含む二重特異性抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項11】

前記抗体が第１の工程で対象に投与され、ＨＳＧハプテンが第２の工程で投与され、前記ＨＳＧハプテンが、抗体に結合し、放射性核種で標識されている、固形腫瘍の治療又は検出における使用のための、請求項１０に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項12】

医薬の調製における使用のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＦｃサイレンシングされた抗体。

【請求項13】

場合により医薬担体又はアジュバントと共に、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。

【請求項14】

皮下投与のために製剤化される、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

単一の物質として投与するためか、又は好ましくは抗ウイルス、抗癌、抗炎症、及び抗生物質からなる群から選択される更なる活性物質と共に投与するための、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

炎症性疾患、感染性疾患を患う患者の治療、具体的には、喘息、血管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、毒素性ショック症候群、後天性呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）、多発性硬化症、急性及び慢性膵炎、１型糖尿病、ＩｇＡ腎症、間質性膀胱炎、ポストＣＯＶＩＤ症候群並びに乾癬の治療における使用のため、又は過剰増殖性障害若しくは癌を患う患者の治療、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、及び肺癌の治療における使用のための、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。

【請求項18】

請求項１７に記載の核酸を含む発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により改善された特性、例えば、低減された凝集能及び低減された疎水性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体と、ｏｘＭＩＦ関連症状の治療におけるその使用とを指す。

【背景技術】

【0002】

サイトカインマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、早くも１９６６年には記載されている（Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｒ．，１９６６；Ｂｌｏｏｍ Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ，Ｂ．，１９６６）。ＭＩＦは、クローニング及び組換え発現の後、生化学特性及び生理的役割が解明された（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。現在では、ＭＩＦが自然免疫の極めて重要な制御因子であり、炎症反応及び癌において中心的な役割を果たすということが十分に認められている。ＭＩＦは、他の炎症促進性メディエーター、例えば、ＴＮＦ（Ｃａｌａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、一酸化窒素（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、及びプロスタグランジンＥ２（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）の産生を促進する。ＭＩＦの最も顕著な特性の１つは、グルココルチコイド（ＧＣ）の免疫抑制効果を無効化する能力である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＭＩＦは、単球（ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、及びＩＬ－８）（Ｃａｌａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）並びにＴ細胞（Ｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）におけるサイトカイン分泌のＧＣ誘導阻害を相殺し、線維芽細胞におけるＴＮＦ誘導アラキドン酸放出のデキサメタゾンによる抑制を無効化する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｉｎ ｖｉｖｏ研究により、ＭＩＦがデキサメタゾンで治療した内毒素血症マウスの死亡率を増加させることが明らかになった（Ｃａｌａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＭＩＦ血清レベルの上方制御及びその疾患との関連は、最も詳細なデータが重度の敗血症の患者において記載されている（Ｅｍｏｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｐｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＭＩＦの血漿レベルは、疾患の重症度及びショック状態と相関し、死亡患者では生存患者よりも有意に高かった。ＭＩＦ濃度は、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びコルチゾールの血漿中濃度の上昇と有意に相関した。患者におけるＭＩＦレベルの上昇は、多くの炎症性疾患、例えば、関節リウマチ（Ｏｎｏｄｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍｏｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）、クローン病（ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）、乾癬（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）、及び多発性硬化症（Ｎｉｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒｉｎｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８）でも測定されている。

【0003】

ＭＩＦは、ｐ５３依存性の細胞死を阻止し、単球及びマクロファージの生存を刺激することによって、更に炎症過程の維持に寄与する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0004】

炎症と多くの種類の癌との密接な関連を示唆する証拠がますます増えている。炎症経路は、感染及び傷害からの防御を行うようにできているが、腫瘍増殖及び転移を促す環境を促進しうる（Ｃｏｎｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。このように、炎症は、腫瘍形成を駆動する重要な要因であることが示唆されており、多くの癌が感染又は慢性炎症の結果として生じる（Ｂｕｃａｌａ ａｎｄ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，２００７；Ｃｏｎｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋａｒｉｎ，２００９）。更に、腫瘍微小環境の炎症性が血管形成及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の崩壊を促進し、ひいては腫瘍細胞の生存、増殖、及び遊走に寄与することがよく立証されている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｗｅｒｂ，２００２；Ｈａｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｂａｌｋｗｉｌｌ，２００５；Ｈａｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＭＩＦは、膵臓、乳房、前立腺、結腸、脳、皮膚、及び肺由来の腫瘍のような多種多様なヒト新生物において上方制御されることが示されている（Ｂａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋａｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｍｅｙｅｒ－Ｓｉｅｇｌｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，１９９６；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。いくつかの研究は、ＭＩＦの発現が腫瘍の攻撃性及び転移能と密接に相関していると報告しており、疾患の重症度及び細胞の生存においてＭＩＦが重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている（Ｒｅｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。最近のデータは、細胞外ＭＩＦが細胞内ＭＩＦと比較してより攻撃的な腫瘍表現型に寄与している可能性があることを示唆している（Ｖｅｒｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＭＩＦは、腫瘍増殖、血管形成、浸潤性、及び転移に有利な微小環境に寄与している。ＭＩＦは、炎症促進機能に加えて、ｐ５３の阻害（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ａｎｄ Ｂｕｃａｌａ，２０００）並びに中心的なキナーゼであるＥＲＫ１／２（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）及びＡＫＴ（Ｌｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）の活性化を含む抗アポトーシス効果及び増殖促進効果を発揮する。ＭＩＦは、血管新生（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）と、ＨＩＦ－１αの安定化（Ｗｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）並びにＶＥＧＦ及びＩＬ－８のような血管形成促進因子の上方制御（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）による腫瘍の血管新生とを促進する血管形成促進因子として更に記載されている。ＭＩＦはまた、ケモカインとしても機能し、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４を介して腫瘍環境内での炎症細胞の動員に寄与すると予測される（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｅｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0005】

しかしながら、ＭＩＦは、構成的に発現され、健常な対象の循環中に存在するため、他のサイトカイン及びケモカインとは著しく異なる。ＭＩＦは、予め形成され、マクロファージ、Ｔ細胞、及び視床下部－下垂体－副腎軸を含む体内の多くの他の細胞の細胞質プールに貯蔵されることで、ｄｅ ｎｏｖｏ合成をせずに刺激時に迅速な放出が可能となる（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｉｎｇｅｒｌｅ－Ｒｏｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0006】

このタンパク質の遍在性に起因して、ＭＩＦは、治療的介入には不適切な標的と考えられうる。しかしながら、ＭＩＦは、還元型ＭＩＦ（ｒｅｄＭＩＦ）及び酸化型ＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）と称される２つの免疫学的に別個の立体構造的なアイソフォームで存在する（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＲｅｄＭＩＦは、どの対象の細胞質及び循環においても見出されうる大量に発現されるＭＩＦのアイソフォームであることが分かった。ＲｅｄＭＩＦは、潜在型の非活性貯蔵形態に相当するようである（Ｓｃｈｉｎａｇｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0007】

対比して、ｏｘＭＩＦは、腫瘍組織、具体的にはｏｘＭＩＦの高い腫瘍特異性を示す結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌を有する患者由来の腫瘍組織（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）、更には、炎症性疾患を有する患者の循環及び炎症組織（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）において検出されうる、生理学的に関連する疾患関連のアイソフォームであるようである。

【0008】

上述のｏｘＭＩＦ陽性適応症のような癌を治療するための薬剤標的で成功したものの数は限定されている。例えば、３００超の潜在的な免疫腫瘍学標的が記載されているが、多くの臨床研究は抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体に焦点を当てている（Ｔａｎｇ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２０１８）。したがって、科学界と医学界は、予後不良の癌患者の治療選択肢を増やすために、腫瘍特異的抗原を標的とする見込みのある薬剤を切望している。

【0009】

更に、炎症性疾患を標的とする薬剤に対する需要も高い。グルココルチコイド（ＧＣ）は、通常の臨床診療において最も重要で頻繁に使用される抗炎症薬のクラスを表す（Ｓｃｈａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＧＣの有用性は、炎症細胞の動員を低減させ、炎症促進性サイトカイン及びメディエーターの合成を抑制することで、効果的に炎症カスケードを多くのレベルでブロックするＧＣの能力に主に関連している（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＧＣの経口使用率は、一般人口の０．５％及び５５歳超の人口の１．４％と推定されている（Ｒａｍｓｅｙ－Ｇｏｌｄｍａｎ，２００２；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＧＣは、明らかに有益であると考えられているが、用量依存性でしばしば不可逆な相当の副作用が認められるため、使用には制限がある（Ｐｉｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。最も懸念される副作用としては、高血圧、肥満、骨粗鬆症、ミオパチー、浮腫及び免疫低下が挙げられる。ＲＡ及び全身性エリテマトーデスを含む炎症性疾患において、アテローム性動脈硬化に関連した早過ぎる死もますます認められるようになってきている（Ｗａｌｌｂｅｒｇ－Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；ｄｅｌ Ｒｉｎｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｅｌ－Ｍａｇａｄｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＧＣの毒性は相当の負担となるため、ＧＣの炎症性疾患への作用を促進し、用量の低減を可能にする治療法の開発が求められている。しかし、このためには、ＧＣ感受性を制御する因子の解明が必要である。２０００年代初頭、サイトカインのマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）とＧＣとの間の特異な関係が明らかとなり、ＧＣ感受性を制御しうる因子の候補としてＭＩＦが同定された（Ａｅｂｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0010】

ｏｘＭＩＦを標的とする抗体は、炎症及び癌のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効性を示した（Ｈｕｓｓａｉｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｃｈｉｎａｇｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0011】

国際公開第２０１９／２３４２４１ Ａ１号において、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が開示されている。

【0012】

国際公開第２００９／０８６９２０ Ａ１号において、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｂａｘ６９（イマルマブ）が記載されている。

【0013】

タンパク質凝集、具体的には、抗体凝集は、タンパク質発現、精製及び保存を含むバイオプロセスのいくつかの段階で頻繁に観察される。抗体凝集は、治療用タンパク質製造工程の全収率に影響し、治療用抗体の安定性及び免疫原性に寄与しうる。

【0014】

したがって、抗体のタンパク質凝集は、それらの発生性に重大な問題であり続け、抗体産生における重要な関心事のままである。抗体凝集は、単量体－単量体会合後、核生成及び凝集体増殖をもたらす、そのドメインの部分的なアンフォールディングによって誘発されうる。抗体及び抗体ベースのタンパク質の凝集傾向は、外部実験条件によって影響されうるが、それらは、それらの配列及び構造によって決定される潜在的な抗体特性に強く依存する。

【0015】

例えば、凝集に対する耐性は、天然状態の安定化（すなわちアンフォールディングに耐性がある）により、又はタンパク質のアンフォールド若しくは部分的なフォールド状態が凝集する傾向を低減することにより達成しうる。天然状態の安定化の不都合な点は、タンパク質がアンフォールドするような環境に暴露される可能性が高い点である。一般に、タンパク質は、変性又はアンフォールドすると、タンパク質の内部において通常は分子内接触を媒介するアミノ酸残基が露出する。そのような露出により、タンパク質は、しばしば分子間接触を形成しやすくなり、凝集しやすくなる。アンフォールディングに耐性があるタンパク質とは対照的に、アンフォールディングしたときに凝集する傾向が低減しているタンパク質は、そのような環境に暴露された後、容易に生物活性のある非凝集状態へとリフォールディングする。

【0016】

抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質の凝集耐性又は凝集傾向は、通常、そこに含有される多くの凝集傾向ドメイン（複数可）によって、及び（存在する場合）周辺ドメインとのその相互作用の強度によって制限される。

【0017】

これは、ドメインが一旦アンフォールディングすると、リフォールディングできない場合、同じタンパク質内又は他のタンパク質内の他のドメインと相互作用し、凝集体を形成しうるためである。抗体の定常ドメインは、一般に、凝集せず、大きく変化しない。したがって、凝集能及び安定性に関して抗体の最も弱いドメインは、一般に、可変ドメインであると考えられる（例えば、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び／又は軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、Ｅｗｅｒｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２００３）。これに関して、凝集傾向のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインの、他の安定な組換え抗体産物への組み込みは、これらの一般に望ましくない特性を新しい組換え設計に付与することが多い。したがって、可変ドメインを凝集耐性であるように操作することは、その可変ドメインを含みうるタンパク質全体を凝集耐性にする可能性が最も高い。可変ドメインの凝集を低減させるための様々な戦略、例えば、凝集耐性タンパク質の合理的設計、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植、又は可変ドメインへのジスルフィド結合の導入、が提案されている。凝集耐性タンパク質の合理的設計は、一般的に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析を使用してタンパク質の凝集傾向における点突然変異の効果を予測することを含む。しかし、このアプローチではいくつかの障害に直面する。例えば、単に、アンフォールドタンパク質の凝集を低減する可能性のある突然変異を同定するだけでは不十分なことである。もっと厳密に言えば、突然変異は、フォールドタンパク質の凝集を増加させてはならず、また、フォールドタンパク質の機能、特に、抗体の場合、結合特性、例えば、親和性又は特異性に影響を与えてもいけない。更に、合理的設計は、改善される特定のタンパク質の詳細な構造解析が必要となり、したがって、十分に特徴付けられていないタンパク質では用いることが難しく、様々な異なるタンパク質にすぐに適用できない。ＣＤＲ移植は、１つの可変ドメインからのＣＤＲを別の可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）上に移植することを含む。この戦略は、抗ＥＧＰ－２ ｓｃＦｖを安定化するのに有用であることが示された（Ｗｉｌｌｕｄａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９）。このアプローチの不都合な点としては、ＣＤＲ移植後に生じうる親和性の低減が挙げられる。この親和性の喪失は、突然変異をＦＲに導入することで克服できるが、そのような突然変異は、タンパク質中に免疫原性エピトープを生じさせて、タンパク質を治療の観点から望ましくないものとさせる可能性がある。更に、ＣＤＲ移植は、一般に、移植の適合性を評価するために、ドナー及びアクセプター可変ドメインの結晶構造解析又はホモロジーモデリングを必要とする。そのようなアプローチは、手間がかかり、専門的な知識を必要とする。更に、この方法は、各可変ドメインが異なる構造を有するため、様々な分子に容易に適用できない。ジスルフィド結合を可変ドメインに導入する工程を含む方法に関しては、ジスルフィド結合は、タンパク質が正しくリフォールディングするのを助けうるが、同時にまた、可変ドメインに柔軟性のなさを導入することにもなる。そのような柔軟性のなさは、抗体の抗原に対する親和性を低減させうる。更に、ジスルフィド結合形成に必要なシステイン残基を、親和性の喪失又は免疫原性エピトープの導入なしに全ての可変ドメインに導入できるわけではない。更に、高タンパク質濃度下でのジスルフィド結合の形成は、タンパク質の凝集を引き起こして、見込みのあるジスルフィド結合の好ましい効果が打ち消されてしまう可能性がある。

【0018】

しかし、凝集傾向の低減は、発現力価の増加が伴うことが示されており、このことは、タンパク質の凝集の低減は、開発プロセス全体を通じて有益であり、より効率的な臨床研究への道につながる可能性があることを示す。治療用タンパク質の場合、凝集は、患者における有害な免疫応答の重大な危険因子であり、様々なメカニズムを介して形成されうる。凝集の制御は、タンパク質の安定性、製造性、減少率、安全性、製剤化、力価、免疫原性、及び溶解性を改善できる（Ｗｅｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａｎｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0019】

タンパク質の更に固有の特性、例えば疎水性も、抗体可溶性に重要な役割を果たす。表面疎水性によるこれらの治療用タンパク質の低い可溶性は、製剤開発をより困難にすることが示されており、ｉｎ ｖｉｖｏでの不十分な生体内分布、望ましくない薬物動態挙動及び免疫原性をもたらしうる。したがって、候補モノクローナル抗体の全体的な表面疎水性を減少させることは、精製及び投与レジメンに関して利益及びコスト削減を提供しうる。

【0020】

特定の治療目的に合わせて抗体のエフェクター機能を制御することも、関心が高まっている。具体的には、Ｆｃ ｎｕｌｌ又はＦｃサイレンシングされた抗体は、ＦｃγＲを介した強力な免疫エフェクター機能としてのＦｃエフェクター機能及び補体相互作用（これらは抗体メカニズムにとって好ましくない場合がある）を除く戦略でありうる。同様に、薬物動態を制御するためにＩｇＧ抗体の新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合を制御することもまた広く知られるようになってきている。

【0021】

Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）は、ＩｇＧアイソタイプのＦｃγＲ媒介活性を増加又は減少させるための抗体Ｆｃ操作を記載している。

【0022】

ＷＯ２０１７／１７８４９３Ａ１には、Ｆｃサイレンシングのために改変ＣＨ１－ＣＨ３ドメインを含むＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン含有分子（Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）３）を標的とする抗体が記載されている。低減された凝集能、低減された疎水性及びＦｃサイレンシングの組合せにより、抗体特性が非常に有利になると考えられる。当技術分野では、低減された疎水性を有するＦｃサイレンシングされた対ｏｘＭＩＦ凝集耐性抗体への需要が未だに満たされていない。

【発明の概要】

【0023】

本発明の目的は、ＦｃサイレンシングされたｏｘＭＩＦを標的とし、低減された凝集傾向及び疎水性を有する改善された抗体又はその抗原結合断片を提供することである。

【0024】

この目的は、本発明の主題によって解決される。

【0025】

本発明は、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１（ＣＨ２－ＣＨ３）、或いは代替として配列番号４４（ＣＨ１－ＣＨ３）を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域、並びに以下の可変ドメイン：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；及び
（ｂ１）配列番号３を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号３及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
変異体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲ結合の減少を示し、
上記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号２及び配列番号３を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を開示する。

【0026】

具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２を参照し、アミノ酸置換Ｗ９３Ｆを含む。

【0027】

具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３を参照し、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む。

【0028】

更なる特定の実施形態によれば、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、アミノ酸置換Ｗ９３Ｆ及びＷ９７Ｙを含む。

【0029】

本明細書に記載の特定の実施形態によれば、Ｆｃ領域におけるアミノ酸置換は、ＥＵ付番指標に従って、配列番号１の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｅ３１８、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１のいずれか１つにおいてである。

【0030】

代替の実施形態によれば、Ｆｃ領域はアグリコシル化されている。

【0031】

より具体的には、Ｆｃ領域におけるアミノ酸置換は、ＥＵ付番指標に従って、配列番号１の位置Ｌ２３４及びＬ２３５、具体的には、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａにおいてである。

【0032】

本明細書では、配列番号４、５、６、７、８、９、４３、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体が特に提供される。

【0033】

より具体的には、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、可変重鎖及び軽鎖
ｉ．）配列番号３及び６、
ｉｉ．）配列番号９及び６、
ｉｉｉ．）配列番号４及び６、
ｉｖ．）配列番号４及び８、
ｖ．）配列番号４及び５、又は
ｖｉ．）配列番号４３及び配列番号５、６、７若しくは８のいずれか１つ
を含む。

【0034】

一実施形態によれば、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１４のＣＨ１～ＣＨ３ドメインを更に含む。

【0035】

本発明の特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１５及び１６又は１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0036】

更なる実施形態によれば、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域を含み、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号７４又は８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号７７又は８４から選択される重鎖ＣＤＲ３配列
を含み、ただし、配列番号７４及び配列番号７７は一緒に含まれない、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供される。

【0037】

代替の実施形態において、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号７７又は８４から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0038】

代替の実施形態において、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号８４から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0039】

代替の実施形態において、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８４から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号８５から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0040】

本発明の更なる実施形態によれば、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｉ２５３、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｈ４３５のいずれか１つにおいてのアミノ酸置換を有し、具体的には、アミノ酸置換が、ＥＵ付番指標に従って、位置Ｌ２３４及びＬ２３５、特に位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０及びＨ４３５であり、及び／又はアグリコシル化されているＦｃ領域を有する。

【0041】

本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ＣＨ２及びＣＨ３抗体ドメインを含有する任意のフォーマット、具体的には、単一特異性抗体、二重特異性抗体（例えば、Ｃｒｏｓｓｍａｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ（２つのｓｃＦｖ断片が１つのアーム上に含まれる）、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ（すなわち、各アームがｓｃＦｖ断片を含む）、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、Ｆａｂ／ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２からなる群から選択されるフォーマットでありうる。

【0042】

更なる実施形態において、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体が、ＣＤ３のエピトープ又はヒスタミン－スクシニル－グリシン（ＨＳＧ）を特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含む二重特異性抗体である。特定の実施形態において、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、固形腫瘍の治療又は検出における使用のためのものであり、上記抗体が第１の工程で対象に投与され、ＨＳＧハプテンが第２の工程で投与され、上記ＨＳＧハプテンが、抗体に結合し、放射性核種で標識されている。

【0043】

医薬の調製における使用のための、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗体も本明細書で提供される。

【0044】

本発明の更なる実施形態において、場合により、医薬担体又はアジュバントと共に本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物も本明細書中で提供される。

【0045】

具体的には、組成物は、本発明の抗体を１０～２５０ｍｇ／ｍｌ、具体的には、５０ｍｇ／ｍｌ超を含む。

【0046】

より具体的には、上記医薬組成物は皮下投与のために製剤化される。

【0047】

本明細書で提供されるように、医薬組成物は、単一の物質として投与するためか、又は好ましくは抗ウイルス、抗癌、抗炎症、及び抗生物質からなる群から選択される１つ又は複数の活性物質を含む更なる医薬組成物と共に複合製剤として投与するためのものである。

【0048】

更なる実施形態において、本明細書では、炎症性疾患、感染性疾患を患う患者の治療、具体的には、喘息、血管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、毒素性ショック症候群、後天性呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）、多発性硬化症、急性及び慢性膵炎、１型糖尿病、ＩｇＡ腎症、間質性膀胱炎、ポストＣＯＶＩＤ症候群、並びに乾癬の治療における使用のための、医薬組成物が提供される。

【0049】

代替の実施形態によれば、医薬組成物は、過剰増殖性障害又は癌を患う患者の治療、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、及び肺癌の治療における使用のためのものである。

【0050】

本発明の抗体をコードする単離核酸が更に提供される。

【0051】

本明細書に記載の核酸分子（複数可）を含む発現ベクターも本明細書に提供される。

【0052】

更なる実施形態において、本明細書に記載の核酸又は発現ベクターを含有する宿主細胞が提供される。

【0053】

宿主細胞を培養する工程、及び上記抗体を細胞培養物から回収する工程を含む、本発明の抗体を産生する方法が更に提供される。

【0054】

宿主細胞において抗体をコードする核酸を発現させる工程を含む、本発明の抗体を産生するための方法が更に提供される。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1-1】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の親抗体（Ｃ００８３及びＣ００９０、Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較；（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の溶出プロフィールの比較。（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８並びにその親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較。

【図1-2】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールである。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の親抗体（Ｃ００８３及びＣ００９０、Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較；（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の溶出プロフィールの比較。（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８並びにその親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較。

【図2】固定化したｏｘＭＩＦへの新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（ＫＤ決定）を示す図である。抗ｏｘＭＩＦ抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８を参照抗体として使用した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式によって決定した（２つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【図3】ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計した抗体の差次的結合を示す図である。Ｃ０００８を参照抗体として、アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。２つ又は３つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される。

【図4-1】レポーターアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたエフェクター機能を示す図である。（Ａ～Ｂ）抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８（Ｂ）又はｗｔＦｃを有するその親抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ａ）のいずれかと比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖ：高応答性遺伝子型、Ｆ：低応答性遺伝子型）を安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞、及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【図4-2】レポーターアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたエフェクター機能を示す図である。（Ａ～Ｂ）抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８（Ｂ）又はｗｔＦｃを有するその親抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ａ）のいずれかと比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖ：高応答性遺伝子型、Ｆ：低応答性遺伝子型）を安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞、及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【図5】補体依存性細胞毒性バイオアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５の強く低減されたＣＤＣ活性を示す図である。補体の供給源としてＢＲＣ及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦを使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５によるＣＤＣバイオアッセイは、ｗｔＦｃを有するその親抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＩｇＧ４陰性対照としてのニボルマブと比較した。データ（適切な場合）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【図6-1】ＰＢＭＣ媒介細胞毒性バイオアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣ活性を示す図である。エフェクター細胞としてＰＢＭＣ及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦを使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５（Ａ）及びＣ０１１８（Ｂ）によるＡＤＣＣバイオアッセイは、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８又はｗｔＦｃを有するＣ０１１５の親抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ００８３）と比較した。２人の健常なドナーからのＰＢＭＣを使用した２回の反復の平均及びＳＥＭが示される。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした。

【図6-2】ＰＢＭＣ媒介細胞毒性バイオアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣ活性を示す図である。エフェクター細胞としてＰＢＭＣ及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦを使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５（Ａ）及びＣ０１１８（Ｂ）によるＡＤＣＣバイオアッセイは、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８又はｗｔＦｃを有するＣ０１１５の親抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ００８３）と比較した。２人の健常なドナーからのＰＢＭＣを使用した２回の反復の平均及びＳＥＭが示される。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした。

【図7】ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ ＭＩＦ－／－細胞への新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す図である。新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１５及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）並びに対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧによるＡ２７８０ＭＩＦ－／－細胞の染色；生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。

【図8】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５は、参照抗体Ｃ０００８と比較してヒトＰＢＭＣからの強く低減されたサイトカイン放出を示すことを示す図である。Ｆｃサイレンシング突然変異を持つ抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８は、ヒトＰＢＭＣと終夜インキュベートし、上清のヒトＭＣＰ－１（Ａ）、ヒトＩＬ－６（Ｂ）及びヒトＴＮＦ－α（Ｃ）をＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリービーズアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）において解析した。３人の異なるＰＢＭＣドナーからのサイトカイン濃度（単位：ｐｇ／ｍｌ）の平均＋／－ＳＥＭを示す。

【図9】皮下ＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持を示す図である。（Ａ）マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体Ｃ０１１５（上のパネル）及びＣ０００８（下のパネル）の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；（Ｂ）デジタル画像解析によって定量されたＣ０１１５及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。３匹のマウスの平均を示す。

【図10】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５は、コラーゲンＩＩ誘導ＤＢＡ／１ｊマウス関節炎モデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す図である。累積疾患スコア（Ａ）及び足の厚さ（Ｂ）は、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｍｌ）、標準治療コルチコステロイド薬としての高用量デキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクルを用いた治療時のマウス関節炎モデルにおいて評価した。平均±ＳＥＭが示される。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図11-1】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５は、腎毒性血清（ＮＴＳ）誘導ラット糸球体腎炎モデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す図である。血尿（ディップスティック試験）（Ａ）、タンパク尿（Ｂ）、及び糸球体マクロファージ浸潤を、ラット糸球体腎炎モデルにおいて、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５、アイソタイプ対照ＩｇＧ１又はビヒクルを用いた疾患ラットの治療時に評価した。平均±ＳＥＭが示され、統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、多重検定のためのダネット補正を使用した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図11-2】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５は、腎毒性血清（ＮＴＳ）誘導ラット糸球体腎炎モデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す図である。血尿（ディップスティック試験）（Ａ）、タンパク尿（Ｂ）、及び糸球体マクロファージ浸潤を、ラット糸球体腎炎モデルにおいて、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５、アイソタイプ対照ＩｇＧ１又はビヒクルを用いた疾患ラットの治療時に評価した。平均±ＳＥＭが示され、統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、多重検定のためのダネット補正を使用した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図12】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）であるＣ０１３２（Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びＣ０１３３（Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の概略図である。

【図13】固定化されたｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の結合曲線を示す図である。結合された抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８をｏｘＭＩＦへの二価結合の参照抗体として使用した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【図14】ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の差次的結合を示す図である。Ｃ０００８を参照抗ｏｘＭＩＦ抗体として使用した。３回の反復の平均及びＳＥＭが示される。

【図15】皮下同系移植ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化によって評価した、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の腫瘍浸透及び保持を示す図である。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体の注射後１時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた。

【図16-1】（Ａ）ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８の構造を示す図である。（Ｂ）ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドへの結合を示す図であり、この結合の評価は、ｉＴＬＣによるものであり、ｂｓＭａｂとインキュベーションしたときの１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８の移動プロフィールの変化に基づき、１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドのみの移動プロフィールと比較した。

【図16-2】（Ａ）ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８の構造を示す図である。（Ｂ）ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドへの結合を示す図であり、この結合の評価は、ｉＴＬＣによるものであり、ｂｓＭａｂとインキュベーションしたときの１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８の移動プロフィールの変化に基づき、１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドのみの移動プロフィールと比較した。

【図17-1】Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２を用いたＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系移植ＣＴ２６マウス結腸直腸癌のＰＲＡＩＴを示す図である。Ｃ０１３２は、－３日目に投与し、続けて、３日後（０日目）に１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。（Ａ）０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；＊＊ｐ＜０．０１対１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセント（％））。（Ｃ）０日目に測定した体重に対する体重（単位：％）。

【図17-2】Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２を用いたＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系移植ＣＴ２６マウス結腸直腸癌のＰＲＡＩＴを示す図である。Ｃ０１３２は、－３日目に投与し、続けて、３日後（０日目）に１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。（Ａ）０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；＊＊ｐ＜０．０１対１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセント（％））。（Ｃ）０日目に測定した体重に対する体重（単位：％）。

【図18】Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３３を用いたＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系移植ＣＴ２６マウス結腸直腸癌のＰＲＡＩＴを示す図である。Ｃ０１３３は、－３日目に投与し、続けて、３日後（０日目）に１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。図は、０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）を示す。平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；＊＊＊ｐ＜０．００１対１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。

【図19】ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞を同系移植したＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ＰＲＡＩＴアプローチを使用した抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２の有効性を示す図である。Ｃ０１３２は、－５日目に２．５ｍｇ／ｍｌ、及び５ｍｇ／ｍｌで投与し、続けて、５日後（０日目）に１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；＊＊＊ｐ＜０．００１対１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。（Ａ）０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）、（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセント（％））。

【図20】ＣＦＰＡＣ－１膵臓腺癌細胞を異種移植したＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、ＰＲＡＩＴアプローチを使用した抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２の有効性を示す図である。Ｃ０１３２は、－５日目に５ｍｇ／ｍｌで投与し、続けて、５日後（０日目）に１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクル。

【図21】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、単剤又はＧＣとの組合せでＤＢＡ／１ｊマウスにおいてコラーゲンＩＩ誘導関節炎の疾患の重症度を改善することを示す図である。累積疾患スコアは、マウス関節炎モデルにおいて、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｋｇ）を単独若しくは低用量０．１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（「Ｄｅｘａ」）との組合せで用いた治療の場合、標準治療コルチコステロイド薬としてデキサメタゾン（「Ｄｅｘａ」）を低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）で用いた治療の場合、又はビヒクル対照を用いた治療の場合で評価した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。

【図22】新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、単剤及びＧＣとの組合せで大腸炎のＴ細胞移入マウスモデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す図である。実験終了時の８３日目での体重変化（Ａ）及び累積便スコア（Ｂ）は、Ｃ０１１５を用いた治療の場合（１０ｍｇ／ｋｇ；単独若しくは低用量０．０１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（「Ｄｅｘａ」）との組合せで）、標準治療コルチコステロイド薬としてデキサメタゾン（「Ｄｅｘａ」）を低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で用いた治療の場合、又はビヒクル対照治療の場合で評価した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。

【発明を実施するための形態】

【0056】

他に指定又は定義しない限り、本明細書中で使用する全ての用語は、当技術分野において通常の意味を有し、当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（４ｔｈ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）；Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘｉ”，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，（２０１７）、及びＭｕｒｐｈｙ ＆ Ｗｅａｖｅｒ，“Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（９ｔｈ Ｅｄ．，又はより最新版），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｉｎｃ，２０１７を参照する。

【0057】

請求項の主題は、具体的には、人工産物又はそのような人工産物を用いるか若しくは産生する方法に関し、それは天然（野生型）産物の変異体でありうる。天然の構造に対してある程度の配列同一性がありうるが、本発明の材料、方法及び使用、例えば具体的には、単離核酸配列、アミノ酸配列、融合構築物、発現構築物、形質転換された宿主細胞及び改変タンパク質を指すものは、「人工」又は合成であり、したがって「自然の法則」の結果として考えられないことが十分に理解される。

【0058】

「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「を有する（ｈａｖｅ）」及び「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、同義的に使用することができ、広い定義として理解されるべきであり、更なる成員又は部品又は要素を可能にする。「からなる」は、構成している定義特性の更なる要素を伴わない最も閉じた定義と解釈される。したがって、「を含んでいる」はより広義であり、「からなる」の定義を含有する。

【0059】

「約」という用語は、本明細書中で使用する場合、同じ値又は所与の値の＋／－５％異なる値を指す。

【0060】

本明細書中及び請求項中で使用される場合、単数形、例えば「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数を包含する。

【0061】

本明細書中で使用する場合、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の自然発生のアミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる：

【0062】

「中性」アミノ酸を、各々の３文字コード及び１文字コード並びに極性と併せて、以下に示す：アラニン（Ａｌａ、Ａ；無極性、中性）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ；極性、中性）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ；無極性、中性）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ；極性、中性）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ；無極性、中性）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ；無極性、中性）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ；無極性、中性）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ；無極性、中性）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ；無極性、中性）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ；無極性、中性）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ；極性、中性）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ；極性、中性）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ；無極性、中性）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ；極性、中性）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ；無極性、中性）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ；極性、正（１０％）中性（９０％））。

【0063】

「正に」帯電したアミノ酸は：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ；極性、正）、及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ；極性、正）である。

【0064】

「負に」帯電したアミノ酸は：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ；極性、負）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ；極性、負）である。

【0065】

本発明の抗体又は抗原結合断片は、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を含み、可変重鎖及び軽鎖ドメインにおける標的化アミノ酸置換により、上記アミノ酸置換を欠損する非改変抗体と比較して低減された凝集傾向及び低減された疎水性を示す。

【0066】

凝集能の低減は、本明細書に記載の抗体の可変ドメイン内の選択された位置のアミノ酸置換による。

【0067】

抗体凝集のレベルは、マススペクトロメトリー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光遮蔽（ＬＯ）、動的画像粒子解析（ＤＩＰ Ａ）技術、例えばマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）、及びコールターカウンター（ＣＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を包含する様々な公知の技術を使用して測定されうる。

【0068】

低減された疎水性及び低減された凝集能は、本明細書中で使用する場合、本明細書で開示されるように配列番号４４及び２、３を含む抗体Ｃ０００８などの参照抗体と比較した、新しく設計した抗体の表面疎水性の低減及び低減された凝集能を指す。Ｃ０００８の配列は、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＩＮＮ Ｌｉｓｔ １１１（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，２０１４）で公表されたイマルマブの配列を含有するが、Ｃ末端リジンを欠く。測定は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又はアフィニティーキャプチャー自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ，Ｅｓｔｅｐ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）を包含するが、これらに限定されない様々な公知の技術を使用して実施されうる。

【0069】

一実施形態において、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する本発明のｏｘＭＩＦ抗体は、具体的には、Ｋａｂａｔ付番に従う位置Ｍ３０、Ｆ４９、Ａ５１、Ｐ８０、Ｗ９３、具体的には、Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの１つ若しくは複数のアミノ酸置換を有する軽鎖可変ドメイン、或いは、配列番号３を含む重鎖可変ドメインと組み合わせて、又はＫａｂａｔ付番に従う位置Ｌ５、若しくはＷ９７、具体的には、Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙのアミノ酸置換を含む重鎖可変ドメインと組み合わせて、位置３６にチロシンと、更に位置Ｍ３０、Ｆ４９、Ａ５１、Ｐ８０、Ｗ９３、具体的には、Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆでのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つとを含む、配列番号２と少なくとも９５、具体的には、少なくとも９６、９７、９８又は９９％配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、或いは、位置Ｌ５又はＷ９７、具体的には、Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙのアミノ酸置換の一方又は両方を更に含む１、２、３、４又は５アミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0070】

代替の実施形態において、配列番号２を含む軽鎖可変ドメインは、３６位のチロシンが保存され、更にアミノ酸のうちの少なくとも１つが、Ｍ３０位、Ｆ４９位、Ａ５１位、Ｐ８０位、Ｗ９３位で置換されるという条件で、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのアミノ酸置換を有する。

【0071】

特定の実施形態によれば、アミノ酸Ｗ９３は、Ｆ、Ｙ、又はＨによって置換される。

【0072】

更なる実施形態において、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、具体的には、配列番号３、及び位置Ｗ９７、具体的にはＷ９７Ｙのアミノ酸置換、Ｌ５、具体的にはＬ５Ｑのアミノ酸置換、又はＬ５Ｑ及びＷ９７Ｙのアミノ酸置換を含む重鎖可変ドメイン、或いは、場合によりＬ５Ｑと組み合わせて、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙを更に含む１、２、３、４又は５アミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0073】

特定の実施形態によれば、アミノ酸Ｗ９７は、Ｆ、Ｙ、又はＨによって置換される。

【0074】

代替の実施形態において、配列番号３を含む重鎖可変ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのアミノ酸置換を有し、更には、アミノ酸のうちの少なくとも１つが位置Ｌ５及びＷ９３で置換される。

【0075】

好ましい実施形態において、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、具体的には位置Ｗ９３及びＷ９７のアミノ酸置換を含む。

【0076】

軽鎖の位置３６のチロシンは、具体的には未改変のままであり、本明細書に記載の抗体の結合特性を保存する。上記アミノ酸位置における任意の改変は、不要な損なわれた結合特性を生じうる。

【0077】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号５を含み、可変重鎖ドメインは、配列番号３、４、９、又は４３の任意の１つ又は複数を含む。

【0078】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号６を含み、可変重鎖ドメインは、配列番号３、４、９、又は４３の任意の１つ又は複数である。

【0079】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号７を含み、可変重鎖ドメインは、配列番号３、４、９、又は４３の任意の１つ又は複数である。

【0080】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号８を含み、可変重鎖ドメインは、配列番号３、４、９、又は４３の任意の１つ又は複数である。

【0081】

更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、上記に列挙した可変軽鎖及び重鎖ドメインのいずれか１つと組み合わせて、配列番号１４及び１８を含む。

【0082】

Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）は、膜結合型表面受容体、非典型的な細胞内受容体及び細胞質糖タンパク質を含む、よく記載されているタンパク質ファミリーである。ＦｃγＲは、液性免疫及び自然免疫を制御し、感染への適切な応答、及び慢性炎症又は自己免疫疾患の予防に必須である。膜結合型受容体は、例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃｙＲＩＩｂ、ＦｃｙＲＩＩＩａ、及びＦｃｙＲＩａ受容体である。抗体は、ＦｃγＲとの相互作用により免疫応答を制御できる。
自然免疫エフェクター細胞では、活性化及び抑制性ＦｃγＲは、免疫複合体による細胞活性化の閾値を設定している。ＦｃγＲによって制御されるエフェクター応答の重要な例は、貪食、ＡＤＣＣ及び炎症性メディエーターの放出である。樹状細胞（ＤＣ）では、対になったＦｃγＲの発現は、細胞成熟及び抗原提示を制御し、それによって間接的に細胞性免疫応答を制御している。Ｂ細胞では、抑制性ＦｃγＲＩＩＢは、液性寛容の維持に必須である。これは、クラススイッチングされたメモリーＢ細胞、形質芽球又は形質細胞のレベルで後期チェックポイントとして働く。更に、ＦｃγＲＩＩＢは、形質細胞の恒常性及び生存の制御に重要な役割を有している。抗体－ＦｃγＲ相互作用は、活性化及び抑制性ＦｃγＲの発現レベルに影響を与えるいくつかの要因（例えば、サイトカイン）又は抗体－ＦｃγＲ相互作用の親和性を変化させるいくつかの要因（例えば、差次的抗体グリコシル化）によって影響を受ける。特定のグリコシル化パターンによって、ＩｇＧ分子は、炎症促進活性又は抗炎症活性を有しうる。重要なことに、抗体のグリコシル化は、免疫応答中に制御される。

【0083】

非典型的なＦｃγＲは、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）及び細胞質糖タンパク質、例えば、補体因子Ｃ１ｑタンパク質である。ＦｃＲｎは、内皮細胞によって発現され、ピノサイトーシスにより血流からの可溶性ＩｇＧを含む血清成分を内部移行させる。ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合は、ｐＨ依存性であり；エンドソーム構成成分内の酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を可能にする。細胞表面にリサイクルした後、生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．２）でＩｇＧはＦｃＲｎから解離し、血液循環に放出し戻され、それによりリソソーム分解から保護され、ＩｇＧの延長された半減期をもたらす。したがって、ＦｃＲｎは、循環中のＩｇＧ及びアルブミンの維持に関与するトランスサイトーシスリサイクリング受容体として機能する。ＦｃＲｎ結合に関して減少された又はサイレンシングされたＦｃを生じるＦｃ領域の改変は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｋｅｎａｎｏｖａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２００５及びＰｙｚｉｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０１９に記載される。

【0084】

本明細書中で使用する場合、「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体又はリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学イベントを意味する。エフェクター機能は、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣを包含する。

【0085】

本明細書中で使用する場合、「エフェクター細胞」は、１つ又は複数のＦｃ受容体を発現し、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、限定はされないが、単球、マイクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞が挙げられ、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを包含する任意の生物由来でありうる。本発明によれば、本明細書中に記載される抗ｏｘＭＩＦ抗体は、重鎖定常領域、具体的にはＦｃ領域において選択された位置でのアミノ酸置換により、サイレンシングされたエフェクター機能を有する。低減された補体及びＦｃγＲ媒介活性による、これらの抗体の減少された又はサイレンシングされたエフェクター機能は、低減又は消失された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を包含しうる。

【0086】

「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」（又は断片結晶性領域）という用語は、本明細書中で使用される場合、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１ドメイン）を除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、及び一部の場合においては、ヒンジの一部を指す。Ｆｃ領域は、抗体のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖：Ａ鎖及びＢ鎖の第２及び第３の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質断片から構成される。第２及び第３の定常ドメインは、それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとして公知である。ＣＨ２ドメインは、Ａ鎖のＣＨ２ドメイン配列及びＢ鎖のＣＨ２ドメイン配列を含む。ＣＨ３ドメインは、Ａ鎖のＣＨ３ドメイン配列及びＢ鎖のＣＨ３ドメイン配列を含む。本明細書中で使用される場合、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域又はその一部を含む。

【0087】

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＥＵ付番指標に従い、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで伸びる。ＣＨ２ドメイン配列はユニークであり、別のドメイン配列と厳密には対合しない。むしろ、２つのＮ結合型分岐状炭水化物鎖が無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン配列の間に挟まれる。

【0088】

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域配列中においてＣ末端残基からＣＨ２ドメイン配列の鎖を含む（すなわち、ＥＵ付番指標に従い、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７まで）。

【0089】

「機能性Ｆｃ領域」は、天然のＦｃ領域の「エフェクター機能」及びＦｃＲｎ結合を持つ。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）等を含む。そのようなエフェクター機能は、通常、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合されるＦｃ領域を必要とし、当技術分野で公知の、及び本明細書中で開示される様々なアッセイを使用して評価されうる。

【0090】

「天然のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に対して同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域及び天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域並びにその自然発生の変異体を含む。

【0091】

「変異体Ｆｃ領域」は、「１つ又は複数のアミノ酸置換」によって天然のＦｃ領域配列のものとは異なるアミノ酸配列を含む。変異体Ｆｃ領域配列は、天然のＦｃ領域配列又は親ポリエペプチドのＦｃ領域配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然のＦｃ領域配列又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列において、約１から約２０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約１７アミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態において、本明細書中の変異体Ｆｃ領域配列は、天然のＦｃ領域配列及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％の同一性を持つ。

【0092】

特定の実施形態において、アミノ酸置換は、ＥＵ付番指標に従って、ＩｇＧ１と関連してＥ２３３位、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｇ２３６位、Ｉ２５３位、Ｇ２３７位、Ｐ２３８位、Ｄ２６５位、Ｓ２６７位、Ｈ２６８位、Ｎ２９７位、Ｓ２９８位、Ｔ２９９位、Ｈ３１０位、Ｅ３１８位、Ｌ３２８位、Ｐ３２９位、Ａ３３０位、Ｐ３３１位及びＨ４３５位のいずれか１つにおいてである。

【0093】

エフェクター機能に関して減少された又はサイレンシングされたＦｃを生じるＦｃ領域の改変は、当技術分野において公知であり、Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｋ．，２０１９及びＬｉｕ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０２０に記載される。

【0094】

代替の実施形態において、アミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインにおけるＬ２３４Ｆ、Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ｙ２９６Ｆ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ及びＣＨ３ドメインにおけるＲ３５５Ｑ、Ｋ４０９Ｒ、Ｑ４１９Ｅ、Ｐ４４５Ｌのいずれか１つ又は全ての位置にある。

【0095】

具体的には、本明細書中に記載されるＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、アミノ酸置換又は欠失の以下の組合せの１つ又は複数を含み、アグリコシル化抗体をもたらす：
ｉ）Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＥ３１８、具体的にはＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＥ３１８Ａ；
ｉｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｉｉｉ）Ｓ２２８、Ｌ２３５、具体的にはＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ；
ｉｖ）Ｇ２３６、Ｌ３２８、具体的にはＧ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ；
ｖ）Ｓ２９８、Ｔ２９９、具体的にはＳ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ；
ｖｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ；
ｖｉｉ）Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｓ２６７、具体的にはＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｓ２６７Ｋ；
ｉｘ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３２９、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；
ｘ）Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ；
ｘｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、具体的にはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ；
ｘｉｉ）Ｄ２６５、具体的にはＤ２６５Ａ；
ｘｉｉｉ）Ｇ２３７、具体的にはＧ２３７Ａ；
ｘｉｖ）Ｅ３１８、具体的にはＥ３１８Ａ；
ｘｖ）Ｅ２３３、具体的にはＥ２３３Ｐ、
ｘｖｉ）Ｇ２３６、Ｌ３２８、具体的にはＧ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ；
ｘｖｉｉ）Ｌ２３５、具体的にはＬ２３５Ｅ；
ｘｖｉｉｉ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ｑ、Ｌ２３５Ｆ、Ｐ３３１Ｓ；
ｘｉｘ）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ａ３３０、Ｐ３３１、具体的にはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ
ｘｘ）Ｎ２９７、具体的にはＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ又はＮ２９７Ｇ。

【0096】

グリコシル化、Ｏ－及びＮ－グリコシル化は、Ａｂの翻訳後修飾であり、環境因子、例えばストレス又は疾患、サイトカイン活性、及び自然免疫シグナル伝達受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体を含む、Ｂ細胞刺激の範囲によって制御されうる。親抗体のグリコシル化パターンは、当技術分野で周知の方法によって改変されうる。具体的には、Ｏ結合型グリコシル化部位は、ＣＨ２及びヒンジ領域に位置する。

【0097】

更なる実施形態において、アミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインにおけるＩ２５３及びＨ３１０並びにＣＨ３ドメインにおけるＨ４３５のいずれか１つ又は全ての位置にある。

【0098】

具体的には、本明細書に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、アミノ酸置換の以下の組合せの１つ又は複数：
ｉ）Ｉ２５３Ａ
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ
ｉｉｉ）Ｈ４３５、具体的には、Ｈ４３５Ａ、Ｈ３４５Ｑ又はＨ４３５Ｒ
ｉｖ）Ｉ２５３Ａ及びＨ３１０Ａ
ｖ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ並びにＨ４３５Ｑ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒのうちの１つ
ｖｉ）Ｈ３１０Ａ並びにＨ４３５Ｑ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒのうちの１つを含む。

【0099】

本明細書に記載のＣＨドメインにおけるサイレンシング及び更なる突然変異は、しかしながら、ＥＵ付番指標に従って相当する位置に野生型ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃへも導入されうる。

【0100】

「アグリコシル化」という用語は、Ｆｃ領域がグリコシル化されていないことを示す。ＩｇＧアイソタイプの全てのヒト定常領域は、２９７位のアスパラギン残基においてグリコシル化されることが公知であり、Ｎグリコシル化モチーフ、アスパラギン２９７－Ｘ２９８－セリン２９９又はスレオニン２９９の一部を形成し、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸の残基である。グリカンは、七糖のコア及び可変伸長、例えば、フコース、ガラクトース、及び／又はシアル酸を有する。本発明の抗体は、したがって、酵素的な手段によってグリコシル化又は脱グリコシル化されない別のアミノ酸を有するそのような定常領域におけるアスパラギン２９７の置換によってアグリコシル化されうる。任意の他のアミノ酸残基を使用することができるが、アラニンが最も好ましい。或いは、アスパラギン２９７におけるグリコシル化は、モチーフの他の残基の１つを変更することによって、例えば、残基２９８をプロリンにより、又は残基２９９をセリン又はスレオニン以外の任意のアミノ酸により置換することによって防ぐことができる。この部位特異的変異誘発を実施するための技術は、当業者に周知であり、例えば、市販の部位特異的変異誘発キットを使用して実施されうる。

【0101】

「サイレンシングされたＦｃ」という用語は、任意のＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲＩＩａＲ、ＦｃｙＲＩＩｂ、ＦｃｙＲＩＩＩａＦ、ＦｃｙＲＩＩＩａＶ、及びＦｃｙＲＩａ及び／又はＦｃＲｎ受容体、並びに補体因子Ｃ１ｑタンパク質ヘの抗体の結合を低減又は除去する改変されたグリカンを生じるアミノ酸置換又はグリコシル化パターンの改変により、そのエフェクター機能及び／又はＦｃＲｎ結合が低減又は除去される抗体のＦｃ領域を指す。エフェクター機能及び／又はＦｃＲｎ結合の低減又は除去を生じるこの結合のそのような低減又は除去は、典型的には、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域によって媒介される。

【0102】

ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃｙＲＩＩ、ＦｃｙＲＩＩＩａ及びＦｃｙＲＩａ及び／又はＦｃＲｎ受容体のいずれか１つ並びに補体因子Ｃ１ｑタンパク質などのＦｃγＲ結合が完全に消失する場合、「Ｆｃ ｎｕｌｌ」という用語が本明細書中で使用されうる。

【0103】

大部分のＦｃサイレンシングは、突然変異を組み合わせることによって達成されうる。Ｌ２３４及びＬ２３５、これらの残基はヒンジ領域付近に位置し、アラニンによって置換されるとＦｃｙＲ結合が低減する。例として、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５ＡのＰ３２９Ｇとの組合せは、全てのＦｃｙＲアイソフォームについてＦｃｙＲ相互作用のほぼ完全な阻害をもたらしうる。

【0104】

大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＦｃｙＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチド又は天然のＦｃ領域配列を含むポリペプチドと比較してＦｃｙＲ結合活性及びＣ１ｑ結合活性が減少されたものである。一部の実施形態において、大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＦｃＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を有するＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチド又は天然のＦｃ領域配列を含むポリペプチドと比較して、大きく低減された、サイレンシングされた、無視できる又は除去されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性も有する。減少された又は検出できないＦｃｙＲへの結合を示す、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、親ポリペプチドよりも低い親和性を有する全てのＦｃｙＲに結合しうる。ＦｃｙＲへの減少した結合を示すそのような変異体は、ＦｃｙＲへのわずかな又は感知できるほどではない結合を有しうる。特定の一実施形態において、変異体は、例えば、平衡乗数の変化によって測定した場合、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～２０％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～１０％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～５％の結合を示す。一実施形態において、変異体は、天然のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃｙＲへの０～１％の結合を示す。

【0105】

サイレンシングされた補体活性を有する本明細書中に記載される抗体は、細胞ベースのＣＤＣアッセイ、及びすなわち、ＳＰＲ又はＥＬＩＳＡによって決定された、低減されたか又は消失されたＣ１ｑへの結合によって決定されうる。

【0106】

減少したか又はサイレンシングされたＣＤＣ活性は、参照、すなわち、未改変の、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも１．５倍、具体的には、少なくとも２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、より具体的には、少なくとも１０倍下方制御されることが決定される。
減少したＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性は、参照抗体、すなわち、未改変の、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、より具体的には、少なくとも１０倍減少されることが決定された。

【0107】

特定の実施形態において、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域における選択された位置でのアミノ酸置換により、ＦｃＲｎへの結合の低減を示す。本発明のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体のＦｃＲｎへの減少された結合は、循環において低減された半減期、及びより早いｉｎ ｖｉｖｏクリアランスをもたらす。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定は、当技術分野で公知の方法を使用しても実施されうる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２００６を参照）。

【0108】

野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片と比較して減少されたＦｃＲｎ結合を示すＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体、又はその抗原結合断片のＦｃドメインは、好ましくは、位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５のいずれか１つの１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含みうる。

【0109】

減少したＦｃＲｎ結合（すなわち、親和性）は、参照抗体、すなわち、未改変の、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、より具体的には、少なくとも１０倍減少した結合（すなわち、親和性）であることが決定される。

【0110】

更なる実施形態において、更に大きなＦｃサイレンシングは、アミノ酸位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０及びＨ４３５での突然変異を組み合わせることによって達成されうる。これらの残基は、Ｆｃ領域に位置し、ＦｃｙＲ相互作用のほぼ完全な阻害をもたらしうる。

【0111】

具体的には、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、Ｋａｂａｔ，ＩＭＧＴ ａｎｄ ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，１９９６（ＣＯＮＴＡＣＴ）に従い定義されたように表１Ａに列挙されるＣＤＲの任意の１つ又は複数を含む。

【0112】

【表1】

【0113】

ｏｘＭＩＦ結合特異性は、ｏｘＭＩＦへの選択的結合を決定するために適切な任意のアッセイ、例えば、ｏｘＭＩＦへの結合に関して、対照抗体、例えばイマルマブに対する任意の競合アッセイ、又は当技術分野で公知の、及び本明細書中で開示される様々なアッセイによって決定されうる。

【0114】

本明細書中の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、リンカー配列を有するか、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインからなるか、若しくはそれらを含むポリペプチド又はタンパク質を包含する。上記用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体等の多特異性抗体、及びそれらが、所望の抗原結合活性を示す限り、すなわちｏｘＭＩＦに結合する抗体断片を含むがこれらに限定されない各種抗体構造を包含する。用語は、融合タンパク質、例えば免疫毒素との融合体又は抗体コンジュゲート、例えばｏｘＭＩＦに結合する抗体薬コンジュゲートも包含する。

【0115】

抗体ドメインは、天然の構造であるか又は変異誘発若しくは誘導体化によって改変され、例えば、抗原結合特性又は任意の他の特性、例えば安定性若しくは機能特性、例えばＦｃ受容体、例えばＦｃＲｎ及び／又はＦｃガンマ受容体への結合を改変する。ポリペプチド配列は、ループ配列によって結合された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ－バレル構造を含む場合に、抗体ドメインであるとみなされる。

【0116】

「抗体」という用語は、それらの抗原結合誘導体、変異体及び断片を包含することが理解されよう。誘導体又は変異体は、本発明の１つ又は複数の抗体ドメイン又は抗体及び／又は本発明の抗体の任意のドメインが、他の抗体又は抗体型式等の１つ又は複数の他の結合タンパク質の任意の位置で融合されうる融合タンパク質の任意の組合せ、例えば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、更にはリガンド、スキャフォールドタンパク質、酵素、標識、毒素等を含む結合構造である。

【0117】

「抗体」という用語は、標的抗原ｏｘＭＩＦに対して結合特性を示すポリペプチド又はタンパク質について特に言及する。

【0118】

「抗体断片、抗原結合断片、抗原結合変異体又は抗体変異体」という用語は、交換可能に使用することができ、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の抗原結合部を含む無傷の抗体以外の分子、並びに抗体断片又は変異体から形成される本明細書に記載の変異体Ｆｃ領域を更に含む多特異性抗体を指す。抗原部の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）ディアボディ、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；線状抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によれば、抗体断片又は変異体は、ヒンジ領域及び／又はリンカー（例えば（ｓｃＦｖ）－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２）によって、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインに融合される。

【0119】

更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する、すなわち、Ｖ_Ｌドメインと一緒に集合することが可能であるか、又はＶ_Ｌドメインの特徴を有する、すなわち、機能性抗原結合部位に対してＶＨドメインと一緒に集合することが可能であり、それにより、完全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。本明細書中で言及された抗体断片は、抗原結合領域、例えば、Ｆｃａｂ（商標）又はサイレンシングされたＦｃ領域が第２の異なる抗原結合部位を含有するＦｃａｂ（商標）によって置換されたＩｇＧ構造を有する全長抗体フォーマットを含有する１つ又は複数の構造ループ領域を含む、サイレンシングされたＦｃドメインも包含する。

【0120】

本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂ断片又はＦａｂ」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。本発明の抗体は、少なくとも１つのＦａｂ断片を含むことができ、ここで、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換される。可変領域又は定常領域のいずれかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片はまた、「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の抗体に含まれる：Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されうる、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子はペプチド鎖から構成される。本発明によれば、Ｆａｂは、ヒンジ領域によって、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインに融合される。

【0121】

本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂアーム」は、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインにヒンジ領域によって融合されるＦａｂ断片を指す。

【0122】

「（ｓｃＦｖ）２」は、約５０キロダルトンの単一のペプチド鎖上の、異なる抗体又は同じ抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）２つ、すなわち、４つ又は２つの異なる遺伝子からのアミノ酸配列からなる融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。

【0123】

「ｂｓ（ｓｃＦｖ）２」は、約５０キロダルトンの単一のペプチド鎖上の、標的抗原が異なる抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）２つ、すなわち、４つの異なる遺伝子からのアミノ酸配列からなる融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。

【0124】

「機能性変異体」又は「機能的に活性な変異体」という用語は、自然発生の対立遺伝子変異体、並びに突然変異体又は任意の他の非自然発生の変異体も包含する。当技術分野で公知のように、対立遺伝子変異体（又は相同体とも呼ばれる）は、核酸又はポリペプチドの生物機能を基本的に変更しない１つ若しくは複数のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる核酸又はペプチドの代替形態である。具体的には、機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加、又はこれらの組合せを含んでもよく、その置換、欠失及び／又は付加は保存的改変であり、抗原結合特性を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以下、又はまでのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存改変であり、抗体の機能を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能的に活性な変異体は、１５個まで、好ましくは１０個又は５個までのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存的改変であり、抗体の機能を変更しない。

【0125】

機能性変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列における配列変更、例えば１つ又は複数の点突然変異によって得られ、ここで、配列変更は、本発明の組合せ中で使用される場合、未変更のポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更は、（保存）置換、付加、欠失、突然変異及び挿入を包含しうるが、これらに限定されない。保存置換は、それらの側鎖及び化学特性と関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、無電荷極性側鎖、小側鎖、大側鎖等を有するアミノ酸である。

【0126】

点突然変異は、１つ若しくは複数の個々のアミノ酸の欠失若しくは挿入によって、又は置換によるアミノ酸の交換によって、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。

【0127】

特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体は、例えば、親和性タグ、溶解度増強タグ及びモニタリングタグであるが、これらに限定されない、精製及び／又は検出用の１つ又は複数のタグを含みうる。

【0128】

具体的には、親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、抗体用のペプチド基質、キチン結合ドメイン、ＲＮＡ分解酵素Ｓペプチド、プロテインＡ、β－ガラクトシダーゼ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、及びｃ－Ｍｙｃタグからなる群から選択され、具体的には、タグは、１つ又は複数のＨを含むＨｉｓタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグである。

【0129】

「融合される」又は「結合される」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。

【0130】

「リンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチドリンカーを指し、２、３、４、５、６、７又はそれ以上のアミノ酸長、好ましくは２アミノ酸長～１０アミノ酸長、より好ましくは３アミノ酸長～５アミノ酸長を有するアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。

【0131】

「免疫グロブリン」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィドで結合されている２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。重鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、軽鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結される本質的に２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインからなる。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに帰属させてもよく、それらのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）に更に分類されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属されうる。

【0132】

「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来するのに対して、重鎖及び／又は軽鎖の残部が、異なる供給源又は種に由来する、通常は組換えＤＮＡ技法によって調製される抗体を指す。キメラ抗体は、ウサギ又はマウスの可変領域と、ヒト定常領域とを含みうる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生する方法は、従来の組換えＤＮＡに関与し、遺伝子トランスフェクション技法が当該技術分野で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４）。

【0133】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト供給源に由来する抗体、又は他のヒト抗体コード配列のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有する。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。キメラ抗体及びヒト化抗体に関しても述べたように、「ヒト抗体」という用語はまた、本明細書中で使用する場合、例えば、「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への変化、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において修飾されるかかる抗体を含む。

【0134】

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＨＥＫ細胞、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離される抗体、或いは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体等の、組換え手段によって調製、発現、創出又は単離されるヒト抗体全てを包含すると意図される。組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列配列に由来し、且つそれらに関連する一方で、天然ではｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体レパートリー内に存在しない可能性がある配列である。

【0135】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１に記載されるようなサブグループである。

【0136】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、及びヒト化を受けたヒトフレームワーク領域（ＦＲ）からのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のそれに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のそれに相当する。ヒト化抗体は場合によりヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。具体的には、ヒト化抗体の形態は、本発明によって包含され、定常領域が元の抗体の定常領域から更に修飾又は変更されて、すなわちＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合の低減又は消失に関して、新たな特性を発する。

【0137】

「二重特異性」という用語は、本明細書中で使用する場合、少なくともｏｘＭＩＦ抗原、並びに更なる抗原、例えば、限定はされないが、ＣＤ３又はＨＳＧ抗原などとの結合反応を指す。具体的には、二重特異性抗体は、特定の結合特性を有する少なくとも２つの部位を含むことができ、２つの異なる標的抗原、すなわちｏｘＭＩＦ及び更なる抗原が抗体によって認識される。例示的な二重特異性抗体フォーマットは、２つの結合部位を含むことができ、結合部位の各々が、異なる抗原、例えば、ＣＤ３又はＨＳＧ、並びにｏｘＭＩＦと特異的に結合できる。更なる例示的な二重特異性フォーマットは、２つ超の結合部位を含むことができ、１つ又は複数の結合部位が、ｏｘＭＩＦと、１つ又は複数の異なる抗原、例えば、ＣＤ３又はＨＳＧと特異的に結合できる１つ又は複数の結合部位と結合する。

【0138】

本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は、本明細書に記載の完全長抗体又は抗体断片として調製できるが、しかし、サイレンシングされたＦｃ領域を依然として含む。免疫グロブリンＦｃヘテロ二量体は、ＣＨ３ドメイン界面への改変により操作することができ、ＣＨ３変異体対を持つ操作したＦｃ断片がホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成するような異なる突然変異を各ドメイン上に有する（Ｈａ Ｊ－Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。二重特異性抗体フォーマットの例は、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１５、及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．，２０１７に記載されているような、二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）、すなわち、更なる抗原結合部分を付加したＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、ＢｓＡｂコンジュゲート、ハイブリッドｂｓＩｇＧ、改変Ｆｃ融合タンパク質、付加ＩｇＧｓ－ＨＣ融合体、付加ＩｇＧｓ－ＬＣ融合体、付加ＩｇＧｓ－ＨＣ＆ＬＣ融合体、Ｆｃ融合体、ＣＨ３融合体、Ｆ（ａｂ’）_２融合体、ＣＨ１／ＣＬ、改変ＩｇＧ、Ｆｃ改変ＩｇＧ、ディアボディなどを包含しうるが、これらに限定されない。

【0139】

本明細書に記載の二重特異性抗体又は抗体断片を包含する代替の実施形態において、「ＩｇＧ－ｓｃＦｖ」という用語は、二重特異性を目的として１つのｓｃＦｖを単一特異性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に融合することによって操作された二重特異性抗体の一種を指す。本発明によれば、二重特異性抗体は、Ｆｃサイレンシングされており、すなわち、本明細書に記載の１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する、野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧの特異性はｏｘＭＩＦに対するものであり、ｓｃＦｖの特異性はＣＤ３又はＨＳＧに対するものである場合があり、或いはその逆の場合もある。更に、軽鎖又は重鎖のうちの１つのアミノ末端又はＣ末端のいずれかは、ｓｃＦｖを付加でき、多様なタイプのＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）：（ｉ）ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、すなわち、完全長ＩｇＧ ＨＣのうちの１つのＣ末端に結合したｓｃＦｖ；（ｉｉ）ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ（これはｓｃＦｖがＨＣのＮ末端に結合している以外は、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖと同じである）；（ｉｉｉ）ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又は（ｉｖ）ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、すなわち、ＩｇＧ軽鎖のＣ末端又はＮ末端に結合されたｓｃＦｖ（これはそれぞれＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧを形成する）が形成される。具体的には、ＩｇＧ－ｓｃＦｖは、１６５ｋＤａ～１８５ｋＤａの範囲であり、具体的には、約１７５ｋＤａである。

【0140】

代替の実施形態によれば、組換え可変ドメイン、例えば、ディアボディをサイレンシングされたＦｃ領域に融合すること（例えばｓｃＤｂ－Ｆｃ）は、結合価を顕著に増加させうる。サイズの増加はまた、血清中のディアボディの半減期を延長させることができる。
「ディアボディ」という用語は、小さなペプチドリンカーによって結合される重鎖可変（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域からなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の非共有結合的二量体を指す。ディアボディの別の形態は、２つのｓｃＦＶ断片が互いに共有結合的に連結される単鎖（ＦＶ）_２である。更に、内部リンカーを用いて、各鎖における遺伝子をタンデムに連結させることによって、４つのＶＨ及びＶＬドメインは、タンデムに発現されて、単鎖ディアボディ（ｓｃＤｂ）としてフォールディングさせることができ、これはまた、二重特異性抗体産生にとって有効な戦略である。具体的には、ディアボディ－ＣＨ３は、約１２５ｋＤａを有する。

【0141】

特定の実施形態において、Ｆａｂ／ｂｓ（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃという用語は、一方のＦａｂアームがｂｓ（ｓｃＦｖ）２によって置換されるが他方のＩｇＧアームが保存されているＩｇＧである二重特異性抗体を指す。

【0142】

特定の実施形態において、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃという用語は、一方のＦａｂアームがｓｃＦｖによって置換されるが他方のＩｇＧアームが保存されているＩｇＧである二重特異性抗体を指す。図１２に概略的に示される本明細書に記載の抗体Ｃ０１３２は、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃの非限定的な例として機能する。

【0143】

特定の実施形態において、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃという用語は、一方のＦａｂアームがＦａｂ－ｓｃＦｖによって置換されるが他方のＩｇＧアームが保存されているＩｇＧである二重特異性抗体を指す。図１２に概略的に示される本明細書に記載の抗体Ｃ０１３３は、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃの非限定的な例として機能する。

【0144】

「ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ここで、Ｍａｂはモノクローナル抗体を指す）という用語は、独立した親の抗体に由来する二重特異性Ａｂのフォーマットである。重鎖の誤対合は、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）法を適用することで回避される。軽鎖の誤対合は、二重特異性抗体が抗体ドメイン交換によって産生されるが、１つのＦａｂアームの可変ドメイン又は定常ドメイン（ＣＬ及びＣＨ１）のいずれかを軽鎖と重鎖との間で入れ替えるので避けられる。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を維持し、また、軽鎖の誤対合を回避するために２つの異なるアームも保存する。ＣｒｏｓｓＭａｂの例は、異なる領域で交換したＦａｂ、ＶＨ－ＶＬ及びＣＨ１－ＣＬでありうるが、限定はされない。ＣｒｏｓｓＭＡｂ Ｆａｂでは、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬ領域の全てが交換され；ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＨ－ＶＬフォーマットでは、ＶＨ領域及びＶＬ領域のみが交換され；ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＣＨ１－ＣＬ１フォーマットでは、二重特異性抗体のＣＨ１及びＣＬ領域が交換される。具体的には、ＣｒｏｓｓＭａｂは約１５０ｋＤａである。

【0145】

本発明のｏｘＭＩＦ抗体は、例えば、ＣＤ３の更なるエピトープ、具体的には、細胞表面上に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むヒトＣＤ３のエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含みうる。例えば、固定化された抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスター形成は、Ｔ細胞受容体の結合と類似しているがそのクローンの典型的な特異性とは独立しているＴ細胞活性化をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との強力なＣＤ３結合親和性を示すだけでなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。一部の例では、抗体のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応する。一実施形態において、抗ＣＤ３結合部位は、本明細書に記載の抗ＣＤ３結合ドメインの１つ若しくは複数の（例えば３つ全ての）軽鎖相補性決定領域及び／又は本明細書に記載の抗ＣＤ３結合ドメインの１つ若しくは複数の（例えば３つ全ての）重鎖相補性決定領域を含み、例えば、１つ又は複数の、例えば３つ全てのＬＣ ＣＤＲ、及び１つ又は複数の、例えば３つ全てのＨＣ ＣＤＲを含む抗ＣＤ３結合ドメインを含む。

【0146】

更なる実施形態によれば、抗体は、エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージ上に発現する１つ又は複数の抗原、具体的には、ＣＤ３、ＡＤＡＭ１７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２ａ、ＣＤ４０、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７４、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ１３７、ＣＤ１７７、ＣＥＡＥＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＨＬＡ－ＤＲα鎖、ＫＩＲ、ＬＳＥＣｔｉｎ又はＳＬＣ４４Ａ２のうちの１つ又は複数、或いは１つ又は複数のハプテン抗原、すなわちＨＳＧを特異的に認識する１つ又は複数の更なる結合部位を含みうる。

【0147】

代替の実施形態によれば、本発明の抗体は、モスネツズマブ、パソツキシズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、シビサタマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ又はフォラルマブの１つ又は複数のＣＤ３可変結合ドメインを更に含む二重特異性抗体である。

【0148】

特定の実施形態によれば、抗ＣＤ３結合部位は、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ブリナツモマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブ、モスネツズマブ、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１及びＷＴ－３１からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに、該当する場合、その任意のヒト化誘導体を含む。

【0149】

具体的には、本発明によるＣＤ３結合ドメインとして、抗ＣＤ３可変領域の１つ又は複数のＣＤＲ、或いはムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、ソリトマブ、ブリナツモマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブ、モスネツズマブのＣＤＲ配列のいずれかと少なくとも７０％、具体的には、８０％、９０％、９５％又は９９％配列同一性を含む又は有するＣＤＲが使用できる。

【0150】

ＣＤ３に結合する上記特異的なＣＤＲは以下の通りである：

【0151】

【表2】

【0152】

【表3】

【0153】

より具体的には、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、上記に列挙したＣＤＲ配列の各々において０、１、又は２つの点突然変異を含む。

【0154】

更なる特定の実施形態は、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３ ｂｓ（ｓｃＦｖ）２を指し、相当する可変重鎖領域（ＶＨ）及び相当する可変軽鎖領域（ＶＬ）の領域が、ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－Ｖ_Ｌ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）、ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）又はＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている。本発明によれば、ｂｓ（ｓｃＦｖ）２は、ヒンジ領域によって、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインに融合される。

【0155】

更なる実施形態によれば、本発明のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ＨＳＧ（ヒスタミン－スクシニル－グリシン）ハプテンを特異的に更に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含みうる。

【0156】

特定の実施形態によれば、抗ＨＳＧ結合部位は、マウス（ｍ）抗ＨＳＧ抗体６７９（ｍ６７９）から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び該当する場合、その任意のヒト化（ｈｚ）誘導体を含む。

【0157】

そのような二重特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体は、以下の表３及び４に列挙したＣＤＲを含むＨＳＧを特異的に認識する結合部位を含みうる（ｈｚ抗ＨＳＧ抗体６７９（ｈｚ６７９）配列はＵＳ２００９／０２４００３７Ａ１からのものである）。

【0158】

【表4】

【0159】

【表5】

【0160】

より具体的には、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＨＳＧ抗体は、上記に列挙したＣＤＲ配列の各々において０、１、又は２つの点突然変異を含む。

【0161】

更なる特定の実施形態は、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＨＳＧ ｂｓ（ｓｃＦｖ）２を指し、相当する可変重鎖領域（ＶＨ）及び相当する可変軽鎖領域（ＶＬ）の領域が、ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－Ｖ_Ｌ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ＨＳＧ）－ＶＬ（ＨＳＧ）、ＶＨ（ＨＳＧ）－ＶＬ（ＨＳＧ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）又はＶＨ（ＨＳＧ）－ＶＬ（ＨＳＧ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている。本発明によれば、ｂｓ（ｓｃＦｖ）２は、ヒンジ領域によって、サイレンシングされたＦｃ部分又はサイレンシングされたＦｃドメインに融合される。

【0162】

更なる実施形態において、抗体は、具体的には、二重特異性ＩｇＧ、ＣＤ３又はＨＳＧ結合部位を付加したＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、ＢｓＡｂコンジュゲートからなる群から選択されるＦｃサイレンシングされた二重特異性抗体である。

【0163】

直接放射線標識した抗体は、固形腫瘍では血液クリアランスが遅く、腫瘍取り込みが遅れるため、健康な組織及び臓器への放射線用量暴露が継続的に高くなる。Ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＲＡＩＴ（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、これらの制限を克服することを可能とするが、ＰＲＡＩＴのためのｂｓＭａｂフォーマットの選択及び設計は、依然として困難である。ＰＲＡＩＴは、直接放射線標識した抗体又は抗体断片と比較して腫瘍への吸収用量の送達を増加させることにより治療指数（腫瘍対正常組織比）を改善することを目的としている。ＰＲＡＩＴは、ＨＳＧ及び腫瘍標的に対するｂｓＭａｂを投与し、続けて、数日後に放射線標識した二価ＨＳＧハプテンを投与することを含む。この技術を使用すると、相当量のｂｓＭａｂが腫瘍に蓄積し、循環から大幅にクリアされ、放射能標識した二価ＨＳＧハプテンが腫瘍に蓄積したｂｓＭＡｂに結合する一方、非結合放射能ＨＳＧハプテンが数時間以内に腎臓によって循環からクリアされる。したがって、放射能への正常臓器の暴露が最小限に抑えられる（ＵＳ２００５／００２５７０９、Ｓｈａｒｋｅｙ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｒｏｓｓｉ ＥＡ ｅｔ ａｌ，ａｎｄ Ｋａｒａｃａｙ Ｈ．ｅｔ ａｌ，２００５）。

【0164】

標的化放射性核種治療には、例えば、ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８（ＵＳ２００５／００２５７０９に記載されるような）及び^１７７Ｌｕを放射性核種として使用できる。ＩＭＰ２８８は、ＤＯＴＡコンジュゲートＤ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－ＮＨ２テトラペプチドであり、両リジン残基がε－アミノ基を介してＨＳＧ部分で誘導体化されている。

【0165】

「抗原」という用語は、本明細書中で「標的」又は「標的抗原」という用語と交換可能に使用される場合、抗体結合部位によって認識される全標的分子又はかかる分子の断片を指す。具体的には、抗原の下部構造、一般的に、免疫学的に関連性のある「エピトープ」、例えばＢ－細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープと称される抗原、例えば、ポリペプチド又は炭水化物構造は、かかる結合部位によって認識されうる。

【0166】

「エピトープ」という用語は、本明細書中で使用する場合、特に、特異的な結合パートナーを完全に構成しうるか、又は本発明の抗体型式の結合部位に対する特異的な結合パートナーの一部でありうる分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質若しくは無機物質又はそれらの誘導体及びそれらの任意の組合せで構成されうる。エピトープが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質等のペプチド構造に含まれる場合、エピトープは通常、少なくとも３アミノ酸、具体的には５アミノ酸～４０アミノ酸、及び具体的には１０アミノ酸以下、具体的には４アミノ酸～１０アミノ酸を含む。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造的エピトープのいずれかでありうる。線状エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。線状エピトープは、近接しうるか、又は重複しうる。立体構造的エピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって一緒にまとめられたアミノ酸又は炭水化物で構成され、アミノ酸は、線状配列において、必ずしも互いに隣接するとは限らない。かかるｏｘＭＩＦエピトープは、ｏｘＭＩＦの中心領域内に位置する配列ＥＰＣＡＬＣＳ（配列番号４２）でありうる。

【0167】

「抗原結合ドメイン」又は「結合ドメイン」又は「結合部位」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、また抗原の一部又は全てに相補的な区域を含む抗原結合部分の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分にのみ結合する場合があり、その特定の部分は、エピトープと称される。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。

【0168】

「結合部位」という用語は、本発明の抗体に関して本明細書中で使用する場合、抗原と結合相互作用が可能な分子構造を指す。通常、結合部位は、各種抗原に結合機能を付与する様々な構造を有する特異的な領域である、本明細書中で「ＣＤＲ結合部位」とも称される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。様々な構造は、抗体の天然レパートリー、例えば、マウス又はヒトレパートリーに由来しうるか、或いは例えば突然変異誘発によって、具体的には無作為化技法によって、組換え的に又は合成的に産生されうる。これらには、突然変異誘発されたＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に、抗体のＣＤＲループ、例えばＶＬ及び／又はＶＨ抗体ドメインのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ループが包含される。本明細書により使用される場合の抗体型式は通常、それぞれが抗原に特異的な１つ又は複数のＣＤＲ結合部位を含む。

【0169】

本明細書中に記載される抗体のｏｘＭＩＦ結合部位は、ＭＩＦの酸化形態に、すなわち動物、具体的には哺乳動物ｏｘＭＩＦ、例えば、限定はされないがマウス、ラット、サル及びヒト、具体的にはヒトｏｘＭＩＦに特異的であるが、還元型ＭＩＦの実質的な交差反応性を示さない。ｏｘＭＩＦは、炎症性疾患を有する対象の循環及び癌患者の腫瘍組織において、特異的に且つ優勢に検出されうるＭＩＦの疾患関連の構造アイソフォームである。一実施形態において、ヒト化又はヒト抗ｏｘＭＩＦ結合部位は、本明細書中に記載するヒト化又はヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域、例えば、配列番号２、５、６、７又は８に含まれるＣＤＲ及び／又は本明細書中に記載するヒト化又はヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域、例えば配列番号３、４、９、又は４３を含む。

【0170】

「特異的な」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子の異種集団において目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。本明細書中では、結合反応は、少なくともｏｘＭＩＦ抗原との反応である。したがって、指定条件、例えば、イムノアッセイ条件下で、特定の標的に特異的に結合する抗体は、試料中に存在する他の分子に、著しい量では結合せず、具体的には、その抗体は、還元型ＭＩＦへの実質的な交差反応性を示さない。

【0171】

特異的な結合部位は通常、他の標的と交差反応しない。依然として、特異的な結合部位は、標的の１つ又は複数のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合しうるか、又は他の関連標的抗原、例えば、相同体若しくは類似体に対して交差反応でありうる。

【0172】

特異的な結合は、結合が、選択に応じて、標的同一性、高、中若しくは低の親和性又はアビディティに関して選択されることを意味する。選択的な結合は通常、ｏｘＭＩＦ等の標的抗原に対する結合定数又は結合動態が、標的抗原ではない抗原に対する結合定数又は結合動態と比較して、少なくとも１０倍異なり、好ましくは、その差が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成される。

【0173】

「価」という用語は、本出願内で使用する場合、抗体分子における指定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗体分子における、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表す。

【0174】

「一価」という用語は、抗体の結合部位に関して本明細書中で使用する場合、標的抗原に対して向けられた唯一の結合部位を含む分子を指す。したがって、「結合価」という用語は、同じ標的抗原に対して向けられる抗原の同じ又は異なったエピトープに特異的に結合する結合部位の数として理解される。

【0175】

本発明の抗体は、ｏｘＭＩＦを特異的に結合する一価、二価、四価又は多価の結合部位を含むと理解される。

【0176】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域それぞれを指す。概して、自然四鎖抗体は、ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは概して、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関連して、本明細書中で交換可能に使用される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて様々である。抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかどうかを、当業者は日常的に決定することができる。

【0177】

Ｋａｂａｔは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する付番システムを規定した。当業者は、「Ｋａｂａｔ付番」のこのシステムを、配列自体を超えるいかなる実験データに頼らずに、任意の可変領域配列に一義的に帰属させることができる。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準」Ｋａｂａｔ付番配列との、抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより、所与の抗体について決定されうる。本明細書中で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」によって記載される付番システムを指す。別記しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の付番への言及は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う。定常領域の付番は、ＥＵ付番指標に従う。

【0178】

ＣＤＲはまた、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、これらは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、簡易ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。別記されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中では上述のＫａｂａｔらに従って付番される。ＣＤＲの決定は、ＩＭＧＴに従って行うこともできる（Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ．１９９７）。ＩＭＧＴは、フレームワーク領域（ＦＲ－ＩＭＧＴと命名）及びＣＤＲ（ＣＤＲ－ＩＭＧＴと命名）に対して独自の定義を有している。ＩＭＧＴ付番方法は、生殖系列Ｖ配列アラインメントに基づいて、残基を１から１２８まで連続的に数える。

【0179】

ＣＤＲ（又はＳＤＲ）はまた、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，１９９６に従って決定することもできる。本明細書中では、抗原接触残基を解析し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから入手可能な抗体Ｆｖ及びＦａｂの結晶構造中の部位形状を組み合わせる。抗原接触傾向を各抗体残基で示すことで、観察された抗原接触に基づいてＣＤＲの定義を提唱することができる。接触は、組合せ部位の中心に位置するＣＤＲ残基でより一般的であり；接触は、いくつかのあまり中心にないＣＤＲ残基では大きな抗原によってのみ生じる。ＣＤＲ中の非接触残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって「典型的」立体構造を定義するのに重要であると同定された残基と一致する。

【0180】

「点突然変異」は、種々のアミノ酸に関して１つ又は複数の単一（不連続）アミノ酸或いは二重アミノ酸の置換又は交換、欠失又は挿入における、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。好ましい点突然変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸を指す。これら２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる。

【0181】

本明細書中で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）の配列同一性」は、最大のパーセントの配列同一性を達成するように、必要に応じて、配列を整列させて、ギャップを導入した後の、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義され、配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮しない。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0182】

本発明によれば、可変又は定常領域配列の配列同一性は、本明細書中に記載する各々の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％である。

【0183】

「対象」は哺乳動物である。哺乳動物として、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体又は対象はヒトである。

【0184】

「単離核酸」は、その天然環境の構成成分と分離された核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を包含するが、核酸分子は、染色体外で、又はその天然染色体位置とは異なる染色体位置で存在する。

【0185】

「抗ｏｘＭＩＦ抗体をコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター中にかかる核酸分子を包含する、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子、及び宿主細胞における１つ又は複数の位置で存在するかかる核酸分子を指す。

【0186】

「実質的な交差反応なし」は、分子（例えば、抗体）が、特に当該標的抗原と比較した場合に、分子（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）の実際の標的抗原とは異なる抗原、具体的には還元型ＭＩＦを認識しないか、又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に、約１０％未満～約５％未満結合しうるか、又は約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％、又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量で、実際の標的抗原とは異なる抗原を結合しうる。結合は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって決定されうる。

【0187】

本発明の抗体の組換え産生は、好ましくは、例えば、抗体型式をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物又はベクターを包含する発現系を含む。

【0188】

「発現系」という用語は、動作可能な連結で所望のコード配列及び制御配列を含有する核酸分子を指し、その結果、これらの配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされるタンパク質を産生することが可能である。形質転換を達成するためには、発現系は、ベクター上に含まれうるが、続いて、関連ＤＮＡは、宿主染色体に組み込まれうる。或いは、発現系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳に使用することができる。

【0189】

本明細書中で使用する「発現ベクター」は、適切な宿主生物におけるクローニングされる組換えヌクレオチド配列の、すなわち組換え遺伝子の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、更に、宿主細胞における自己複製のための起源又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又はゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写終結因子を通常含み、これらの構成成分は、動作可能に一緒に連結される。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、自己複製ヌクレオチド配列及びゲノム組み込みヌクレオチド配列を包含する。

【0190】

具体的には、上記用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）、例えば本発明の抗体型式をコードするヌクレオチド配列が、宿主を形質転換するように宿主細胞に導入され、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進しうるビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。

【0191】

ベクターは通常、外来遺伝子が挿入される伝播性物質のＤＮＡを含む。ＤＮＡの一方のセグメントを、ＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を包含する。

【0192】

「カセット」は、規定の制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを指す。カセット制限部位は、適正なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するよう設計されている。概して、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位で挿入され、続いて、ベクターによって伝播性ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞へ運搬される。発現ベクター等のＤＮＡが挿入又は付加されたＤＮＡのセグメント又は配列はまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれうる。ベクターの一般的なタイプはプラスミドであり、これは概して、更なる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二重鎖ＤＮＡの自己完結式分子であり、適切な宿主細胞に容易に導入されうる。本発明のベクターは多くの場合、コードＤＮＡ及び発現制御配列、例えば、プロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１つ又は複数の制限部位を有する。コードＤＮＡは、本発明の抗体型式等の特定のポリペプチド又はタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、調節するか、又は他の場合には媒介するか、若しくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じか、又は異なる生物由来であってもよい。本発明の組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニング若しくは発現用の１つ又は複数の複製系、宿主における選択用の１つ又は複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ又は複数の発現カセットを包含する。

【0193】

例えば、本発明の要素を提供又はコードするＤＮＡ配列、及び／又は目的のタンパク質、プロモーター、終結因子及び更なる配列をそれぞれライゲーションして、組み込み又は宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載される。

【0194】

宿主細胞は、具体的には、本発明によるベクター等の発現構築物でトランスフェクトされた細胞、組換え細胞又は細胞株と理解される。

【0195】

「宿主細胞株」という用語は、本明細書中で使用する場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の樹立されたクローンを指す。宿主細胞株という用語は、本発明の組換え抗体型式等のポリペプチドを産生するように内因性又は組換え遺伝子を発現するのに使用される場合の細胞株を指す。

【0196】

「産生宿主細胞」又は「産生細胞」は、産生プロセスの産物である本発明の組換え抗体型式を得るように、バイオリアクターにおける培養のための使用準備済の細胞の細胞株又は培養物であると一般的に理解される。本発明による宿主細胞型は、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。

【0197】

「組換え」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば、具体的には組換えベクター又は組換え宿主細胞において取り込まれた異種配列を用いた「遺伝子操作によって調製されること」又は「遺伝子操作の結果」を意味する。

【0198】

本発明の抗体は、任意の既知の十分に樹立された発現系及び組換え細胞培養偽術を使用して、例えば、細菌宿主（原核生物系）又は酵母、真菌、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物系における発現によって産生されうる。本発明の抗体分子は、ヤギ、植物又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を有し、且つマウス抗体産生を欠損している操作されたマウス株であるトランスジェニックマウス等のトランスジェニック生物において産生されうる。抗体はまた、化学合成によって産生されてもよい。

【0199】

特定の実施形態によれば、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ハイブリドーマ及びジャーカットからなる群から選択される細胞の産生細胞株である。より具体的には、宿主細胞はＣＨＯ細胞から得られる。

【0200】

本発明の宿主細胞は、具体的には、例えば、血清に代わるものとして、血漿タンパク質、ホルモン及び成長因子等の他の構成成分を含む無血清培養物中で培養又は維持される。

【0201】

宿主細胞は、樹立されて、適応されて、無血清下で、任意選択により、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で完全に培養される場合に最も好ましい。

【0202】

本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収されうる。

【0203】

「医薬製剤」という用語は、調製物中に含有される有効成分の生物活性が有効であるのを可能にするような形態で存在し、製剤が投与される対象にとって受け入れられないほど毒性である更なる構成成分を含有しない調製物を指す。

【0204】

「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって無毒性である有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリシン若しくはヒスチジンなどのアミノ酸、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを包含することが好適である。薬学的に許容可能な物質の更なる例は、湿潤剤、又は少量の、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝液等の補助物質であり、これらは、抗体の寿命又は有効性を高める。

【0205】

本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」は、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の経過中に実施されうる。治療の所望の効果として、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的若しくは間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の向上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるのに、又は疾患の進行を減速させるのに使用される。

【0206】

本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体及びそれを含む医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、診断剤又は予防剤と組み合わせて投与されうる。更なる治療剤として、治療されるべき疾患に応じて、他の抗癌剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤及び化学療法剤、ステロイド、又はチェックポイント阻害剤が挙げられる。

【0207】

本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液体、半固体及び固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム並びに座薬で存在しうる。好ましい形態は、投与及び治療適用の意図した様式に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能な溶液又は注入可能な溶液の形態であり、例えば、ヒトの受動免疫のために使用されるものと類似の組成物である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変わるであろう。

【0208】

本発明の抗体の最適化された有利な特性により、高投与量の抗体組成物を投与することができる。具体的には、組成物は、抗体を約１０～２５０ｍｇ／ｍｌ、具体的には２５～１００ｍｇ／ｍｌ、具体的には５０ｍｇ／ｍｌ以上含む。

【0209】

抗ｏｘＭＩＦ抗体は、１回投与されうるが、より好ましくは、複数回投与される。例えば、抗体は、１日に３回～６ヶ月以上に１回投与することができる。投与は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、及び６ヶ月に１回などのスケジュールで行うことができる。

【0210】

本発明は、ＭＩＦ関連症状、具体的には、免疫疾患、例えば、炎症性疾患及び過剰増殖性障害の治療を必要とする対象の治療のための、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合部を含む組成物にも関する。一部の実施形態において、治療を必要とする対象はヒトである。

【0211】

「癌」という用語は、本明細書中で使用する場合、増殖性疾患を指し、具体的には、固形癌、例えば、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、黒色腫、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（例えば、頭頚部、食道、及び口腔）、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、腎臓癌、甲状腺髄様癌、乳頭様甲状腺癌、星状細胞腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、並びに悪性精上皮癌を指し、上記の癌の任意の難治性バージョン、又は上記の癌の１つ若しくは複数の組合せを含む。

【0212】

本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体によって治療されうる癌疾患又は癌などの過剰増殖性障害は、任意の組織又は臓器に関与し、脳癌、肺癌、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部癌、頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、食道癌、婦人科癌、鼻咽頭癌、若しくは甲状腺癌、黒色腫、リンパ腫、白血病又は多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、卵巣、膵臓、結腸及び肺の癌の治療に有用である。

【0213】

特定の実施形態において、
癌疾患の治療、具体的には、固形腫瘍の治療に非常に好適な抗体は、
組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体、その抗原結合断片、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体、又は二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＨＳＧ抗体であって、サイレンシングされたＦｃ並びに低減された凝集能及び低減された疎水性を有し、以下：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号３を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号３及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
変異体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲ結合の減少を示し、
上記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号２及び配列番号３を含む抗体と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体、その抗原結合断片、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体、又は二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＨＳＧ抗体である。

【0214】

本発明はまた、ヒトを含む対象における、血管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、毒素性ショック症候群、後天性呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎、アトピー性皮膚炎、喘息、結膜炎、発熱、マラリア、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）、多発性硬化症、急性及び慢性膵炎、１型糖尿病、ＩｇＡ腎症、間質性膀胱炎、ポストＣＯＶＩＤ症候群、乾癬、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、腎炎及び腹膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ－ループス腎炎を含む）、喘息、関節リウマチ（ＲＡ）並びに炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性疾患の治療のための方法であって、それを必要とする上記対象に抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合部の治療有効量を投与する工程を含む方法も包含する。

【0215】

特定の実施形態において、
炎症性又は感染性疾患の治療に非常に好適な抗体は、
組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、サイレンシングされたＦｃ並びに低減された凝集能及び低減された疎水性を有し、以下の可変ドメイン：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号３を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号３及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
変異体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲ結合の減少を示し、
上記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号２及び配列番号３を含む抗体と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片である。

【0216】

更に特定の実施形態において、炎症性又は感染性疾患の治療に非常に好適な抗体は、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢへの優先的結合も増加させた又はα２，６－Ｎ結合型シアリル化が亢進した本明細書に記載の組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体である。

【0217】

本発明は、下記の実施形態も更に包含する。
１．Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域、並びに以下：
（ａ１）アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号２を含み、
－ ３６位に保存されたチロシン、及び
－ アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；及び
（ｂ１）配列番号３を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号３及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）アミノ酸置換Ｌ５Ｑ若しくはＷ９７Ｙの少なくとも１つ及び１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの更なるアミノ酸置換を有する配列番号３を含む重鎖可変ドメイン
を含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、
変異体Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲ結合の減少を示し、
上記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸置換を欠く配列番号２及び配列番号３を含む抗体と比較して低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片。
２．アミノ酸置換Ｗ９３Ｆ及び／又はＷ９７Ｙを含む、実施形態１に記載の組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体。
３．アミノ酸置換が、ＥＵ付番指標に従って、配列番号１の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｅ３１８、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１のいずれか１つにおいてである、実施形態１又は２に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
４．Ｆｃ領域がアグリコシル化されている、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
５．アミノ酸置換が位置Ｌ２３４及びＬ２３５、具体的には、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
６．配列番号４、５、６、７、８、９、及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、実施形態１に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
７．ｉ．）配列番号３及び６、
ｉｉ．）配列番号９及び６、
ｉｉｉ．）配列番号４及び６、
ｉｖ．）配列番号４及び８、又は
ｖ．）配列番号４及び５
ｖｉ．）配列番号４３及び５、６、７、若しくは８のいずれか１つ
を含む、実施形態１に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
８．配列番号１４を更に含む、実施形態７に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
９．配列番号１５、及び１６又は１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１０．Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、１つ若しくは複数のアミノ酸置換又はグリコシル化修飾を有する配列番号１を含む野生型ヒトＩｇＧの変異体Ｆｃ領域を含み、
配列番号７２又は７８から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７３、７９、８０、又は８１から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号７４又は８２から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号７５から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７６又は８３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び
配列番号７７又は８４から選択される重鎖ＣＤＲ３配列
を含み、ただし、配列番号７４及び配列番号７７は一緒に含まれない、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片。
１１．アミノ酸置換が、配列番号１の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｉ２５３、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｈ４３５のいずれか１つにおいてであり、具体的には、アミノ酸置換が、ＥＵ付番指標に従って、位置Ｌ２３４及びＬ２３５、特に位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０及びＨ４３５であり、及び／又はＦｃ領域がアグリコシル化されている、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１２．二重特異性抗体（すなわちＣｒｏｓｓｍａｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｃｒｏｓｓＦａｂ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２からなる群から選択される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１３．上記抗体が、ＣＤ３のエピトープ又はヒスタミン－スクシニル－グリシン（ＨＳＧ）を特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含む二重特異性抗体である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１４．上記抗体が第１の工程で対象に投与され、ＨＳＧハプテンが第２の工程で投与され、上記ＨＳＧハプテンが、抗体に結合し、放射性核種で標識されている、固形腫瘍の治療又は検出における使用のための、項目１３に記載のＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１５．医薬の調製における使用のための、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＦｃサイレンシングされた抗体。
１６．場合により医薬担体又はアジュバントと共に、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の抗体を含む医薬組成物。
１７．実施形態１～１３のいずれか１つに記載の抗体を、１０～２５０ｍｇ／ｍｌ、具体的には、５０ｍｇ／ｍｌ超を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物。
１８．皮下投与のために製剤化される、実施形態１６又は１７に記載の医薬組成物。
１９．単一の物質として投与するためか、又は好ましくは抗ウイルス、抗癌、抗炎症、及び抗生物質からなる群から選択される１つ又は複数の活性物質を含む更なる医薬組成物と共に投与するための、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
２０．炎症性疾患、感染性疾患を患う患者の治療、具体的には、喘息、血管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、毒素性ショック症候群、後天性呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）、多発性硬化症、急性及び慢性膵炎、１型糖尿病、ＩｇＡ腎症、間質性膀胱炎、ポストＣＯＶＩＤ症候群、並びに乾癬の治療における使用のための、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
２１．過剰増殖性障害又は癌を患う患者の治療、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、及び肺癌の治療における使用のための、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
２２．実施形態１～１３のいずれか１つに記載の抗体をコードする単離核酸。
２３．実施形態２２に記載の核酸を含む発現ベクター。
２４．実施形態２２に記載の核酸又は実施形態２３に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
２５．実施形態２４に記載の宿主細胞を培養する工程、及び上記抗体を細胞培養物から回収する工程を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の抗体を産生する方法。

【実施例】

【0218】

本明細書中に記載される実施例は、本発明の例示であり、それを限定することを意図しない。本発明の範囲を逸脱することなく、多くの改変及びバリエーションが本明細書中に記載及び例示される技術に行われうる。したがって、実施例が例示のみであり、本発明の範囲を限定しないことが理解されるはずである。

【0219】

実施例１：実施例セクションで使用する、変異体ＩＤ、配列組合せ並びに抗ｏｘＭＩＦ抗体（表５Ａ）及び抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（表５Ｂ）の配列

【0220】

【表6】

【0221】

【表7】

【0222】

実施例２：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集傾向及び低減された疎水性
疎水性及び凝集を評価するため、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、２つの異なるＳＥＣカラム及びランニング緩衝液条件を使用するゲル濾過（ＳＥＣ）並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８並びにＦｃサイレンシングしていないそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較して解析した。

【0223】

ＳＥＣのため、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、室温で、１×ＰＢＳ中で実施した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。結果は、メインピークの保持容積（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けした。

【0224】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）解析のため、全ての試料を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９を使用して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。抗体の高度に精製された試料（約１００μｇ）を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム上に独立してロードした。１００μｌの試料を注入し、カラム流速を２２℃で１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。ピークの分離は、０～１００％Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容積（ＣＶ）で実行した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。

【0225】

結果：対照抗体Ｃ０００８は、サイズ排除カラムの総容量（約１６～１８ｍｌ Ｅｎｒｉｃｈ ６５０）に近い保持容量を示し、それはヒトＩｇＧで予測されるよりもはるかに小さい分子量に相当する（図１Ａ及びＢ）。異常に長い保持は、主に、固定相表面との疎水性相互作用による。更に、高保持容量には、Ｃ０００８では、顕著な量のＩｇＧ二量体及び凝集体が存在した。全ての新しく設計した抗体は、低減された保持容量（Ｖｒ）を示し、カラムとの相互作用の低減、したがって分子の疎水性の低減を実証した（表６、図１Ａ及びＢ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、分子量標準と比較した場合、単量体ヒトＩｇＧの分子量に相当する保持容量（表６、図１Ｂ）を示した。更に、抗体二量体及び凝集は、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の試料中では著しく低減された（図１Ｂ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８のＦｃサイレンシング突然変異は、それぞれ、ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較して、それらのＳＥＣプロフィールを変更しなかった。

【0226】

ＨＩＣカラム保持容量は、疎水性の測定であり、低保持容量の抗体は、高保持容量の抗体よりも低疎水性である（図１Ｃ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、非常に高い疎水性を示す対照抗体Ｃ０００８（保持容量約２１ｍｌ）と比較して、低疎水性であることが示された（保持容量１５～１６ｍｌ）。新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８のＦｃサイレンシング突然変異は、それぞれ、ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較して、それらのＨＩＣプロフィールを変更しなかった。

【0227】

結論：新しく設計した抗体が、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、改善された生化学特性、具体的には、低減された疎水性、及び凝集傾向を有することは、ＳＥＣ及びＨＩＣ解析から明らかである。

【0228】

【表8】

【0229】

図１は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムでの、Ｃ０００８（対照抗体、グレー領域）並びに新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の親抗体（Ｃ００８３及びＣ００９０、Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較；（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用するＥｎｒｉｃｈ ６５０ゲル濾過カラムでの、Ｃ０００８（対照抗体、グレー領域）並びに新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の溶出プロフィールの比較；（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムでの、Ｃ０００８（対照抗体、グレー領域）、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８、並びにその親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ｆｃサイレンシングなし）の溶出プロフィールの比較。

【0230】

実施例３：固定化されたＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合（Ｋ_Ｄ決定）。
ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加した。最後に、結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。異なる実験からのデータは、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する４パラメーターフィットによって決定した（２つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【0231】

結果及び結論：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する、新しく設計した抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図２に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合の参照として使用した。結合曲線及びＫ_Ｄを表す算出したＥＣ_５０値は、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８が、Ｃ０００８と比較して、ｏｘＭＩＦへのそれらの低ナノモルの親和性を保持したことを明確に示した（図２、表７）。

【0232】

図２は、固定化されたｏｘＭＩＦへの新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（Ｋ_Ｄ決定）を示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８を参照抗体として使用した。ＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式によって決定した（２つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【0233】

【表9】

【0234】

実施例４：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の差次的結合
抗ｏｘＭＩＦ抗体及びヒトＩｇＧアイソタイプ対照を、１５ｎＭの濃度で、４℃で終夜マイクロプレートに固定化した。ブロッキングした後、ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌのｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代理ＮＴＢ－ＭＩＦ（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とインキュベートした。捕捉したｏｘＭＩＦは、ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰによって検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって染色し、発色反応を３０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加により停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、２つ又は３つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される。

【0235】

結果及び結論：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対する、新しく設計した抗体の結合は、図３に示される。結果は、新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しないことを明確に示した。新しく設計した抗体は、参照抗体Ｃ０００８と非常に類似したＯＤを示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。アイソタイプＩｇＧでは、結合は観察されなかった。したがって、低減された疎水性及び凝集並びにＦｃサイレンシングを有する新しく設計した抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別するそれらの能力を保持した。

【0236】

図３は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗体の差次的結合を示す。Ｃ０００８を参照抗体として、アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。２つ又は３つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される。

【0237】

実施例５：レポーターアッセイによって決定された新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたエフェクター機能
上記のように、Ｆｃ部分の点突然変異、すなわちＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａにより抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ能を減少させる努力がなされた。標的結合抗体のＦｃ部分がまた、エフェクター細胞の細胞表面上のＦｃ受容体に結合する場合、２つの細胞型の複数の架橋が生じ、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰの経路活性化をもたらし、機能性Ｆｃ関連有害事象を防ぐ標的中和抗体に望まれない。

【0238】

エフェクター細胞として、ＡＤＣＣを解明するためにヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８（高親和性遺伝子型）、又はＡＤＣＰを解明するためにヒトＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１のいずれかを安定に発現する操作したジャーカット細胞、及びホタルルシフェラーゼのＮＦＡＴ応答エレメント駆動発現を使用して、抗体の生物学的活性を、エフェクター細胞においてＮＦ－ＡＴ経路活性化の結果として産生されたルシフェラーゼにより定量した。

【0239】

ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰレポーターアッセイは、基本的に製造業者によって推奨されるように実施した（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｇ７０１０及び＃Ｇ９９９１）。

【0240】

高応答性の標的細胞を生成するため、ＨＣＴ１１６及びＡ２７８０細胞を、ｈｕＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってトランスフェクトし、ジェネテシンによって選択し、ＦＡＣＳによってソートして膜係留単量体ヒトＭＩＦを安定に発現する細胞株（ＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ）を生成し、すなわちＭＩＦは、ｏｘＭＩＦエピトープが抗ｏｘＭＩＦ抗体に接近可能である単量体タンパク質として提示される（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８）。これらの細胞株は、細胞表面でのｏｘＭＩＦの提示の増加を示し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のための感度のよいツールである。手短に言えば、１００μｌの培養培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び４％低ＩｇＧ ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ １６４０培地）中の１×１０^４細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（図４Ａ及びＣ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（図４Ｂ）細胞は、９６ウェルプレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜接着させた。翌日、培養培地を、除去し、２５μｌの新しい培養培地と交換した。２５μｌの段階希釈のＦｃサイレンシングされた新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８、又はそれらの親抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０並びにｗｔＦｃを有する対照抗体Ｃ０００８（最終濃度０．０１～１００ｎＭ）と、２５μｌのジャーカットエフェクター細胞（図４Ａ～Ｂ、高応答性遺伝子型Ｖ１５８のＦｃγＲＩＩＩａ受容体エフェクター細胞；図４Ｃ、ＦｃγＲＩＩａ受容体エフェクター細胞）とを、約６：１のエフェクター対標的細胞比で添加し、加湿したインキュベーター内で、細胞を３７℃／５°ＣＯ_２で抗体及びエフェクター細胞と６時間インキュベートした。最後に、アッセイプレートを室温に平衡化し、７５μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加した。Ｔｅｃａｎマルチプレートリーダーを使用して、１０～２０分のインキュベーション後に発光（ＲＬＵ）を測定した（０．５ｓ積算時間）。データ（適切な場合）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【0241】

結果：Ｆｃサイレンシング突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、ＡＤＣＣ（図４Ａ～Ｂ）又はＡＤＣＰ（図４Ｃ）レポーターアッセイにおいてレポーター細胞のいずれの活性化も示さなかったが、対照抗体Ｃ０００８（図４Ｂ）並びにｗｔＦｃを有するそれらの親抗体、Ｃ００８３及びＣ００９０（図４Ａ）は、エフェクター細胞の強いＦｃｙＲＩＩＩａ（ＡＤＣＣ、図４Ａ～Ｂ）又はＦｃｙＲＩＩａ（ＡＤＣＰ、図４Ｃ）媒介活性化を誘導したことが、図４Ａ～Ｃから証明された。

【0242】

結論：Ｆｃサイレンシング突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を持つ新しく設計した変異体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、レポーターバイオアッセイにおいてＡＤＣＣ又はＡＤＣＰのいずれの開始も示さなかった。したがって、それらは、強く低減されたＡＤＣＣ及びＡＤＣＰエフェクター機能を示した。

【0243】

図４は、レポーターアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたエフェクター機能を示す。（Ａ～Ｂ）抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８（Ｂ）又はｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０（Ａ）のいずれかと比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔＦｃを有するそれらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及び／又はＣ０１１８によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【0244】

実施例６：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイによって決定された、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の強く低減されたＣＤＣ機能
このアッセイは、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体によって誘導された抗体駆動補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から生じる溶解細胞を決定するために実施した。細胞傷害は、ＬｇＢｉＴ（ＬａｒｇｅＢｉＴ）及びフリマジン（基質）を含有する非溶解性検出試薬を使用して標的細胞からのＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質の放出を定量するＨｉＢｉＴ検出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。ＨｉＢｉＴ及びＬｇＢｉＴは、自発的に機能性ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）酵素に集合し、基質の存在下で定量可能な発光シグナルを発する。

【0245】

高応答性のレポーター標的細胞を生成するために、ＨＣＴ１１６細胞は、ＨａｌｏＴａｇ－ＨｉＢｉＴプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃ＣＳ１９５６Ｂ１７）によってトランスフェクトし、ブラストサイジンによって選択し、ＦＡＣＳによって細胞プールとしてソートした。安定ＨｉＢｉＴ発現細胞プールを、次いで、ｈｕＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってトランスフェクトし、ジェネテシンによって選択し、ＦＡＣＳによってソートして、細胞内ＨｉＢｉＴ及び膜係留単量体ヒトＭＩＦを安定に発現する細胞プール（ＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ）を生成し、すなわちＭＩＦは、ｏｘＭＩＦエピトープが抗ｏｘＭＩＦ抗体に接近可能である単量体タンパク質として提示される（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１８）。これらの細胞株は、細胞表面でのｏｘＭＩＦの提示の増加を示し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のための感度のよいツールである。

【0246】

手短に言えば、１００μｌの培養培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１０％ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ １６４０培地）中の１×１０^４細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ細胞を９６ウェルプレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃及び５％ＣＯ_２で終夜接着させた。翌日、培養培地を除去し、５０μｌの無血清ＲＰＭＩ １６４０と、無血清ＲＰＭＩ １６４０中の５０μｌの段階希釈のＦｃサイレンシングされた新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５又はｗｔＦｃを有するその親抗体Ｃ００８３、及びニボルマブ（ヒトＩｇＧ４、陰性対照）（最終濃度１～１００ｎＭ）とを添加した。抗体と細胞とを３７℃で３０分間インキュベーションした後、５０μｌの仔ウサギ補体（ＢＲＣ、Ｓｅｄａｒｌａｎｅ社、アッセイ直前に無血清ＲＰＭＩ中に１：１０に希釈）をプレートに添加した。補体添加後、プレートを加湿したインキュベーター内で、３７℃及び５％ＣＯ_２で終夜インキュベーションした。翌日、１０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｎ２４２１）を添加し、３分後に発光シグナル（ＲＬＵ、積算時間０．１ｓ）をＴｅｃａｎプレートリーダーで測定した。データ（適切な場合）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【0247】

結果及び結論：図５によって、Ｆｃサイレンシング突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５は、ＣＤＣ活性を誘導せず、測定されたシグナルが陰性対照（ニボルマブ、ＩｇＧ４）よりも更に低かったことが明確に示される。対比して、ｗｔＦｃを有する親抗体Ｃ００８３は、ヒトＩｇＧ１に対して予想されるように、ＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ細胞の補体依存性細胞溶解を示した。したがって、Ｆｃサイレンシング（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５は、強く低減されたＣＤＣ活性を示す。

【0248】

図５は、補体依存性細胞毒性バイオアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５の強く低減されたＣＤＣ活性を示す。補体の供給源としてＢＲＣ及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦを使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５によるＣＤＣバイオアッセイは、ｗｔＦｃを有するその親抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＩｇＧ４陰性対照としてのニボルマブと比較した。データ（適切な場合）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＤが示される）。

【0249】

実施例７：ＰＢＭＣ細胞溶解バイオアッセイによって決定された、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣ機能
このアッセイは、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体によって誘導された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）から生じる細胞溶解を決定するために実施した。細胞傷害は、ＬｇＢｉＴ（ＬａｒｇｅＢｉＴ）及びフリマジン（基質）を含有する非溶解性検出試薬を使用して標的細胞からのＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質の放出を定量するＨｉＢｉＴ検出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。ＨｉＢｉＴ及びＬｇＢｉＴは、自発的に機能性ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）酵素に集合し、基質の存在下で定量可能な発光シグナルを発する。

【0250】

ＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦレポーター標的細胞は、実施例６に記載されているように生成した。

【0251】

手短に言えば、５０μｌの培養培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び５％超低ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を追加したＲＰＭＩ １６４０培地）中の１×１０^４細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ標的細胞を９６ウェルプレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜接着させた。翌日、５０μｌの培養培地中での段階希釈のＦｃサイレンシングされた新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８又はＣ０１１５の親抗体（ｗｔＦｃを有するＣ００８３）、及び／又はｗｔＦｃを有する参照抗体Ｃ０００８（最終濃度０．０１～１００ｎＭ）と、２人の健常なドナーからの５０μｌのヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（４×１０^５細胞／ウェル；エフェクター対標的細胞比４０：１）とを、プレートに添加した。抗体及びＰＢＭＣ添加後、プレートを加湿したインキュベーター内で、３７℃及び５％ＣＯ_２で終夜インキュベーションした。翌日、１０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｎ２４２１）を添加し、３分後に発光シグナル（ＲＬＵ、積算時間０．１ｓ）をＴｅｃａｎプレートリーダーで測定した。

【0252】

結果及び結論：Ｆｃサイレンシング（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８は、ＡＤＣＣ活性を示さないか、或いは強く低減されていることが図６から明らかである。対比して、Ｃ０１１５の親抗体（Ｃ００８３、ｗｔＦｃを有する）及びｗｔＦｃを有する対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、ヒトＩｇＧ１に対して予想されるように、ＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ細胞の抗体依存性細胞溶解を示した。したがって、Ｆｃサイレンシング（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５は、強く低減されたＡＤＣＣ活性を示す。

【0253】

図６は、ＰＢＭＣ媒介細胞毒性バイオアッセイによって決定された、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の強く低減されたＡＤＣＣ活性を示す。エフェクター細胞としてＰＢＭＣ及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦを使用する、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗体Ｃ０１１５（Ａ）及びＣ０１１８（Ｂ）によるＡＤＣＣバイオアッセイは、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８（Ｂ）及びｗｔＦｃを有するＣ０１１５の親抗ｏｘＭＩＦ抗体、すなわち、Ｃ００８３（Ａ）と比較した。２人の健常なドナーからのＰＢＭＣを使用した２回の反復の平均及びＳＥＭが示される。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした。

【0254】

実施例８：Ａ２７８０ ＭＩＦ^－／－細胞への、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８の低減された非特異的結合
材料及び方法。Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞株は、Ａ２７８０卵巣癌細胞株におけるヒトＭＩＦ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって生成した。手短に言えば、標的遺伝子配列を解析し、標的部位は、ＧｅｎＣＲＩＳＰＲ（商標）システムの標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計する通常の決まりに従って位置した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＭＩＦ遺伝子の５’領域（ＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧ、配列番号４０）を特異的に認識するように設計し、ｇＲＮＡ配列はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼを含有するＰＸ４５９（ａｄｄｇｅｎｅ社）ベクターにクローニングした。Ａ２７８０細胞は、エレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクトされ、限界希釈によって９６ウェルプレートにプレートし、同系単一クローンを生成した。内因性ＭＩＦ遺伝子が効果的に変異された同系単一クローンは、結果としてＭＩＦタンパク質の発現の低減（又は除去）を生じ、サンガーシークエンシングスクリーニングによって同定された。最終クローンは、ヒトＭＩＦ遺伝子の開始コドン後＋２の位置に１０ｂｐの欠失を示した。Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞株における内因性ヒトＭＩＦタンパク質の不在は、ポリクローナル抗ヒトＭＩＦ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって確認した。

【0255】

Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ＃２５－０５６－Ｃ１）によって剥がし、染色緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）によって洗浄し、９６ウェルのＵ底プレートにウェル当たり２×１０^５個の細胞をプレートした。細胞を、固定可能な生死判定色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、ＰＢＳ中で１：２０００希釈）によって４℃で２０分間染色し、染色緩衝液によって洗浄した。細胞を、５０μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、５０μｌの段階希釈の新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及びＣ０１１８又はそれぞれ、それらの親抗体Ｃ００８３及びＣ００９０、又は対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８若しくはアイソタイプＩｇＧ（最終濃度３７ｎＭ～９．４ｎＭ）を添加した。４℃で４０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、１００μｌの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、１：１００希釈）中に再懸濁した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中に再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ－Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で獲得した。

【0256】

データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ社）によって解析し、生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８チャンネルの平均蛍光強度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで抗体濃度に対してプロットした。

【0257】

結果及び結論：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１８及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）は、それらのＧｅｏＭｅａｎがアイソタイプＩｇＧ陰性対照のものに非常に近いため、Ａ２７８０ ＭＩＦ^－／－細胞に結合しないことが図７Ａ及びＢから明らかである。反対に、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞に顕著な結合を示したが、それらはＭＩＦを発現しないことが分かった。したがって、疎水性の低減は、Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－への、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の非特異的結合の強い低減又は除去をもたらしたが、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８は、その疎水性により細胞表面に非特異的に結合する。

【0258】

図７は、ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ ＭＩＦ^－／－細胞への新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す。新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１８及びその親抗体Ｃ００９０（Ａ）並びにＣ０１１５及びその親抗体Ｃ００８３（Ｂ）並びに対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧによるＡ２７８０ ＭＩＦ^－／－細胞の染色；生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８チャンネルの平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。

【0259】

実施例９：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５による強く低減されたヒトＰＢＭＣからの非特異的サイトカイン放出
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、様々な要因、例えば、感染によって誘発されうる全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の一形態である。ＣＲＳはまた、一部のモノクローナル抗体医薬品の有害作用としても知られている。ＣＲＳは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び単球を含む多くの白血球が、活性化され、病原性炎症の正のフィードバックループにおいてより多くの白血球を活性化するＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１などのような炎症性サイトカインを放出するときに生じる。この過程は、調節不全に陥ると、全身性過剰炎症、低血圧性ショック、及び多臓器不全により生命を危うくすることがある。したがって、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＰＭＢＣから炎症性サイトカインを放出させる能力を評価した。

【0260】

材料及び方法：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び抗ｏｘＭＩＦ参照抗体Ｃ０００８は、９６ウェルプレート中の１５０μｌの５％超低ＩｇＧ血清を追加したＲＰＭＩ１６４０培地において、新しく融解した３人の健常なドナーからのＰＢＭＣ（ウェル当たり４～５×１０^５個の細胞）と、又は培地のみと、７０ｎＭ、７ｎＭ、０．７ｎＭ、０．０７ｎＭでインキュベートした。加湿したインキュベーター内で３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベーションした後、プレートは、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレットとし、清澄化した上清を９６ウェルＶ底プレート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）に移した。上清は、ヒトＭＣＰ－１、ヒトＩＬ－６、及びヒトＴＮＦ－αに対して、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリービーズアッセイによって製造業者のプロトコールに従って解析した。測定は、９６ウェルプレートローダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を有するＣｙｔｏＦｌｅｘ－Ｓサイトメーターで行った。ビーズ分類チャンネルは、ＡＰＣ（レーザー６３８ｎｍからの励起、バンドパスフィルター６６０／１０ｎｍ）であったのに対し、レポーターチャンネルは、ＰＥ（黄色レーザー５６１ｎｍからの励起、バンドパスフィルター５８５／４２ｎｍ）であった。データは、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ解析ソフトウェア（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を使用して解析し、グラフをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで作成した。３人の異なるＰＭＢＣドナーからの平均＋／－ＳＥＭを示す。

【0261】

結果及び結論：可変領域に製造性突然変異及びＦｃサイレンシング突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１１５は、７０ｎＭまでの濃度で、ＰＢＭＣからのＭＣＰ－１、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出が検出できないか、又はわずかであることを示したことは、図８から明らかである。参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、疎水性により凝集傾向及び非特異的結合が高いことと一致して、最も高い濃度（７０ｎＭ）でＭＣＰ－１、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの有意な放出を誘導した。抗体治療剤の凝集は、例えわずかであっても、免疫細胞からのサイトカイン放出を強く増強することが知られている。

【0262】

図８は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、参照抗体Ｃ０００８と比較してヒトＰＢＭＣからの強く低減されたサイトカイン放出を示すことを示している。Ｆｃサイレンシング突然変異を持つ抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、広範な濃度範囲（７０ｎＭ、７ｎＭ、０．７ｎＭ、０．０７ｎＭ）にわたりヒトＰＢＭＣと終夜インキュベートし、上清のヒトＭＣＰ－１（Ａ）、ヒトＩＬ－６（Ｂ）及びヒトＴＮＦ－α（Ｃ）をＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリービーズアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）において解析した。３人の異なるＰＭＢＣドナーからのサイトカイン濃度（単位：ｐｇ／ｍｌ）の平均＋／－ＳＥＭを示す。

【0263】

実施例１０：異種移植ヒトＨＣＴ１１６大腸癌の腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び対照抗体Ｃ０００８の生体内分布
材料及び方法：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の生体内分布は、参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６の皮下腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて調べた。雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスは、全注射容積１００μｌの５０％ＰＢＳ及び５０％マトリゲル中５×１０^６個のＨＣＴ１１６細胞の皮下注射を片側に受けた。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ^３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１１５及びＣ０００８の単回静脈内投与を受けた。

【0264】

Ｃ０１１５及びＣ０００８は、製造業者の説明書に従ってＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の高ＭＷ）を使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識抗体のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１、６～８、２４、４８、７２、９６、１６８時間での標識抗体の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した。画像解析を実施し、腫瘍における抗体の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を定量した（ＲＦＵ／面積＝ＲＦＵ腫瘍面積／ｍｍ^２腫瘍面積－ＲＦＵバックグラウンド／ｍｍ^２バックグラウンド面積）。

【0265】

結果及び結論：図９は、７日までの腫瘍保持により、それぞれ、静脈内投与したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１１５及びＣ０００８の、顕著な腫瘍内分布を示す。約２４時間でピークを示した参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の腫瘍取り込みは７日にわたり強く増強及び増加されることが、図９（Ａ）及び定量画像解析（図９（Ｂ））から明らかである。

【0266】

図９は、皮下ＨＣＴ１１６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５及び参照抗体Ｃ０００８の腫瘍浸透及び保持を示す。Ａ：マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体Ｃ０１１５（上のパネル）及びＣ０００８（下のパネル）の注射後１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた；（Ｂ）デジタル画像解析によって定量されたＣ０１１５及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。３匹のマウスの平均を示す。

【0267】

実施例１１：

【0268】

【表10-1】

【0269】

【表10-2】

【0270】

【表10-3】

【0271】

【表10-4】

【0272】

【表10-5】

【0273】

実施例１２：コラーゲンＩＩ誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおけるＣ０１１５抗体の有効性
材料及び方法：この研究では、８～９週齡の雄のＤＢＡ／１ｊ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｉｔａｌｙ）マウス（体重範囲：１８～２０グラム）を使用した。ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社，ＵＳＡ）は、４℃で穏やかに終夜撹拌することによって、０．０５Ｍ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ社，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）に２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することによって調製した。注射前に、ＣＩＩを等量のＣＦＡで乳化した。ＣＩＡを誘導するために、マウスの尾の付け根に、１００μｌのＣＩＩ及びＣＦＡを含有する得られたエマルション（１００μｇ／匹）を皮内注射した。２１日目に、２回目のＩＦＡ中のＣＩＩの追加免疫１００μｌ（１００μｇ／匹）を投与した。疾患の発症時（１から２の間の範囲の関節炎スコア）、マウスは、２０日間、ビヒクル、アイソタイプ対照ＩｇＧ１（４０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｋｇ）で週２回（ｉ．ｐ．）治療するか、又は標準治療薬としてのデキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を毎日注射した。治療終了時に、動物は、安楽死させ、血液を回収し、組織（前足及び後足）を採取した。関節炎の臨床的重症度は、体重、及び足の厚さ（４本の足の全ての、厚さ計を使用）を週に２回モニタリングすることによって評価した。足の厚さ指数は、治療の間、各マウスに対して４本の各々の足の厚さの合計の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。各マウスの４本の足の関節炎スコアは、０～４の範囲であり、以下のように評価する：０＝関節炎の徴候なし；１＝足又は１本の指の腫脹及び／又は発赤；２＝２つの関節の発症；３＝２つ超の関節の発症；４＝足及び指全体の重度の関節炎（マウス当たりの最大スコアは１２になる）。各マウスの累積疾患スコアを、治療期間にわたりスコアを合計することによって個々のマウスに対して計算した。計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行い、統計解析には、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した。

【0274】

結果及び結論：図１０により、２０ｍｇ／ｋｇでのＣ０１１５を用いた治療で、ビヒクル治療群と比較して疾患スコア（Ａ）及び足浮腫（Ｂ）の有意な改善がもたらされたことが明らかにされる。これらの効果（特に、足の厚さの低減）は、高用量の標準治療コルチコステロイド薬のデキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療に匹敵するものであった。アイソタイプ対照（ＩｇＧ）治療群は、疾患スコアが低減しなかった。全ての治療群は、疾患の経過中の体重の変動は同じ程度であった。

【0275】

図１０は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、コラーゲンＩＩ誘導ＤＢＡ／１ｊマウス関節炎モデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す。累積疾患スコア（Ａ）及び足の厚さ（Ｂ）は、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｍｌ）、標準治療コルチコステロイド薬としての高用量デキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクルを用いた治療時のマウス関節炎モデルにおいて評価した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0276】

実施例１３：糸球体腎炎（ＧＮ）ラットモデルにおけるＣ０１１５抗体の有効性
材料及び方法：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５の有効性は、ＷＫＹラットにおけるＮＴＮで評価した。このモデルは、マクロファージ浸潤、フィブリン沈着及び組織破壊を伴う疾患の急速な発症を有する（Ｔａｍ ＦＷＫ．ｅｔ ａｌ．，１９９９）。このモデルの時間経過及び形態は、ヒトにおける半月体性糸球体腎炎と非常に類似している。このモデルは、非常に堅牢であり、全ての動物が、腎毒性血清（ＮＴＳ）の注射による誘導後に腎炎を発症する。糸球体腎炎は、雄のＷＫＹラット（体重範囲：１９０～２２０グラム）に１００μｌのウサギ抗ラットＮＴＳ（腎毒性血清）を静脈注射することにより誘導した。ＮＴＳ注射後４日目及び６日目に、動物は、ビヒクル、アイソタイプ対照ＩｇＧ１、又はＣ０１１５を用いて（ｉ．ｐ．）治療した（３０ｍｇ／ｋｇ）。尿を０日目（ベースライン）、４日目（疾患の発症）及び７日目（治療後）に回収した。研究終了時（８日目）に、動物は、安楽死させ、血液及び組織（腎臓、肝臓、脾臓、及び肺）を回収した。組織学的解析（半月体数；ＥＤ－１マクロファージ染色、ラット及びウサギＩｇＧ沈着）並びに生化学的解析（タンパク尿及び血尿）を実施して、疾患の重症度を評価した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、多重検定のためのダネット補正を使用した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【0277】

結果及び結論：Ｃ０１１５を用いた治療（３０ｍｇ／ｋｇ）は、血尿、タンパク尿及び糸球体マクロファージ浸潤がビヒクル治療群と比較して低減することによって証明されるように、疾患を有意に改善した（図１１）。アイソタイプ対照ＩｇＧを用いた治療は、ビヒクル群と比較して血尿を低減させなかった。

【0278】

図１１は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、腎毒性血清（ＮＴＳ）誘導ラット糸球体腎炎モデルにおいて疾患の重症度を改善することを示す。尿中の血尿（ディップスティック）（Ａ）、タンパク尿（Ｂ）、及び糸球体マクロファージ浸潤（Ｃ）を、ラット糸球体腎炎モデルにおいて、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５、アイソタイプ対照ＩｇＧ１又はビヒクルを用いた疾患ラットの治療時に評価した。平均±ＳＥＭが示され、統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、多重検定のためのダネット補正を使用した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【0279】

実施例１４：二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）Ｃ０１３２及びＣ０１３３（抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ）のｏｘＭＩＦへの結合
材料及び方法：ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗体の段階希釈をプレートに添加し、ＥＬＩＳＡを実施例３に記載のように実施した。

【0280】

結果及び結論：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する、Ｃ０１３２及びＣ０１３３抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図１３に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、二価ｏｘＭＩＦ結合の参照抗体として使用した。結合曲線及び算出したＥＣ_５０値は、２つの抗ｏｘＭＩＦアームを有するｂｓＭａｂのＣ０１３３が、Ｃ０００８と類似の親和性でｏｘＭＩＦに結合する（ＥＣ_５０＝２４２ｐＭ（Ｃ０１３３）、及び１５８ｐＭ（Ｃ０００８））のに対して、抗ｏｘＭＩＦアームを１つしか有しないｂｓＭａｂのＣ０１３２が、アビディティ効果の喪失によりｏｘＭＩＦにより高いＥＣ_５０値（２５０８ｐＭ）で結合することを明確に示した。

【0281】

図１２：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）であるＣ０１３２（Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びＣ０１３３（Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の概略図。

【0282】

図１３は、固定化されたｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の結合曲線を示す。結合された抗体は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲートによって検出され、Ｃ０００８をｏｘＭＩＦへの二価結合の参照抗体として使用した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用するシグモイド４パラメーター式にフィットした（２回の反復の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【0283】

実施例１５：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、Ｃ０１３２抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂ及びＣ０１３３抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂの差次的結合
材料及び方法：抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３、参照抗ｏｘＭＩＦ ｍＡｂ Ｃ０００８、並びにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照は、マイクロプレートに４℃で終夜固定化した（ｏｘＭＩＦ二価抗体は１５ｎＭ、ｏｘＭＩＦ一価抗体は３０ｎＭ）。ブロッキングした後、ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌ（約１．３ｎＭ）のｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代理ＮＴＢ－ＭＩＦ（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とインキュベートした。捕捉したｏｘＭＩＦは、ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰによって検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって染色し、発色反応を３０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加により停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。

【0284】

結果及び結論：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対するＣ０１３２及びＣ０１３３の結合を図１４に示す。結果は、Ｃ０１３２及びＣ０１３３の両方がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しないことを明確に示した。新しく設計した抗体は、参照抗体Ｃ０００８と非常に類似したＯＤ値を示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。アイソタイプＩｇＧでは、結合は観察されなかった。したがって、抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別する能力を保持した。

【0285】

図１４は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の差次的結合を示す。Ｃ０００８を参照抗ｏｘＭＩＦ抗体として使用した。３回の反復の平均及びＳＥＭが示される。

【0286】

実施例１６：同系ＣＴ２６大腸腫瘍を持つＢａｌｂ／ｃマウスにおける新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の生体内分布

【0287】

材料及び方法：新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の生体内分布は、マウス大腸癌ＣＴ２６細胞株の皮下腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて調べた。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、全注射容積１００μｌのＰＢＳ中３×１０^６個のＣＴ２６細胞の皮下注射を片側に受けた。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ^３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１３２若しくはＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１３３又は治療なし（対照群）の単回静脈内投与を受けた。

【0288】

Ｃ０１３２及びＣ０１３３は、製造業者の説明書に従ってＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット（高ＭＷ、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識抗体のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間での標識抗体の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した（７８５ｎｍの励起波長及び８２０ｎｍの発光波長で実施）。

【0289】

結果及び結論：図１５は、７日までの腫瘍保持により、それぞれ、静脈内投与したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ０１３２及びＣ０１３３の、顕著な腫瘍内分布を示す。注入１時間後及びそれ以降の全ての画像化の時点で、腫瘍で観察された赤外線シグナルがバックグラウンドを上回ることから、腫瘍における抗体の優先的集積が示されることは、図１５から明らかである。

【0290】

図１５は、皮下同系移植ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化によって評価した、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の腫瘍浸透及び保持を示す。マウスのＩｎｆｒａ－ｒｅｄ画像は、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体の注射後１時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間で撮られた。

【0291】

実施例１７：Ｂａｌｂ／ｃマウスでの同系ＣＴ２６大腸癌マウスモデルにおける抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）のＣ０１３２及びＣ０１３３並びに^１７７Ｌｕ標識ＩＭＰ２８８を使用するＰＲＡＩＴ（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）

【0292】

この実施例では、新しく設計したＦｃサイレンシングされた二重特異性抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ抗体のＣ０１３２及びＣ０１３３の有効性を、ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８（ＵＳ２００５／００２５７０９に記載のように）及び放射性核種としての^１７７Ｌｕと共に、ＰＲＡＩＴアプローチを使用して評価した。ＩＭＰ２８８は、ＤＯＴＡコンジュゲートＤ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－ＮＨ２テトラペプチドであり、両リジン残基がε－アミノ基を介してＨＳＧ部分で誘導体化されている（図１６Ａ）。ＩＭＰ２８８のＤＯＴＡキレート基は、^１７７Ｌｕを含む放射性金属と共に使用するように特に設計される。

【0293】

材料及び方法：ｐｒｅ－ＲＡＩＴのＩｎ ｖｉｖｏ有効性を、皮下ＣＴ２６マウス結腸直腸癌の腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスで評価した。
ＩＭＰ２８８（Ｇｅｎｅｐｅｐ社、Ｆｒａｎｃｅ）は、約２２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比放射能にて^１７７Ｌｕで標識され、放射化学的純度（ＲＣＰ）９５％以上を示した。簡潔に述べると、ＩＭＰ２８８は、滅菌水によって希釈して最終濃度を１ｍＭとした（１．４５ｍｇ／ｍｌ）。ＩＭＰ２８８ストック溶液の１／１０希釈は、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ５．５）で実施した。０．０４Ｎ ＨＣｌ中の５ｍＣｉ（１８５ＭＢｑ）の^１７７ＬｕＣｌ_３（ＥｎｄｏｌｕｃｉｎＢｅｔａ（登録商標）、ＩＴＧ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を放射線標識バイアルに入れ、続いて、４０μｌのＭＥＳ緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ５．５）及び０．８４ｎｍｏｌの希釈ＩＭＰ２８８溶液（８．４μｌ）を添加した。反応混合物を９５℃で１５分間インキュベートした。その後、５μｌの１０ｍＭジエチレンペンタ－ジアミン四酢酸ナトリウム塩（ＤＴＰＡ－Ｎａ）を加えて、非組み込み^１７７Ｌｕを錯体化し、溶液を０．９％ＮａＣｌ／１０ｇ／Ｌ アスコルビン酸塩／０．０５％（ｍ／ｖ）ＢＳＡ中で３７０ＭＢｑ／ｍＬに希釈した。キレート効率並びにＣ０１３２及びＣ０１３３への結合は、ｉＴＬＣ（ｉｎｓｔａｎｔ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＳＧＩ００１）によって解析した。簡潔に述べると、２２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌ及び０．０８４ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８に相当する１．６８ｎｍｏｌ／ｍｌの^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８溶液５０μｌを、１０倍モル過剰の各ｂｓＭａｂ（０．８４ｎｍｏｌ）と混合した。各反応液を、穏やかな撹拌下、３７℃で３０分間インキュベートした。^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８溶液並びに^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８－ｂｓＭａｂ溶液は、ｉＴＬＣストリップに適用し、０．１５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）：ＭｅＯＨの１：１（ｖ／ｖ）溶液で溶出した。溶出後、ｉＴＬＣプレートをリンスクリーン（ＭＳ，ＢＡＳ－ＩＰ，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ２０２５）で暴露し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＩＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及び関連ソフトウェアＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．２を使用して明らかにした。

【0294】

ＣＴ２６マウス結腸直腸癌（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－２６３８）細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃／５％ ＣＯ２にて拡大した。ＣＴ２６細胞の懸濁液を、滅菌ＰＢＳ中で１０×１０^６生存細胞／ｍＬに調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１００μＬのＰＢＳに懸濁した１×１０^６個のＣＴ２６細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍の容積が５０～１００ｍｍ^３に達したら（接種約７～９日後）、マウスを１群当たり１０匹のマウスの治療群に無作為に割り当てた。抗体（Ｃ０１３２又はＣ０１３３）を、無作為化の日（－３日目）に５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を、二重特異性ｍＡｂの注射の３日後（０日目）に、１０：１のｂｓＭＡｂ／ＨＳＧＩＭＰ２８８ハプテンモル比で静脈内経路により投与した（それぞれ１８．５ＭＢｑに相当する約４ｎｍｏｌ／ｋｇ Ｃ０１３２ ｂｓＭＡｂ又は約３ｎｍｏｌ／ｋｇ Ｃ０１３３ ｂｓＭａｂ）。更に、対照群は、事前の治療なしで０日目に３７ＭＢｑの^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８又はビヒクルのいずれかを投与した。腫瘍容積及び体重は、２１日目まで、又はマウスが１０００ｍｍ^３の腫瘍容積の人道的エンドポイントに達するまで２～３日毎に測定し、生存パーセンテージを決定した。各治療群の相対腫瘍容積（０日目の腫瘍容積＝１００％）、相対体重（０日目の体重＝１００％）、及びカプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセンテージ）は、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して時間に対してプロットした。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した。

【0295】

結果及び結論：図１６Ｂは、^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８及び^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８－ｂｓＭａｂに関するｉＴＬＣプロファイルを明らかにする。図１６Ｂに示されるように、^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８に関する移動プロフィールの変化は、ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３とインキュベーションした後に観察され、^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８がｂｓＭａｂによって結合されたことが確認された。両ｂｓＭａｂとも、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬバージョン８．２によって明らかにされたピクセル強度から計算すると、９４％超の^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドが結合していた。

【0296】

図１７Ａ～Ｂに示されるように、５ｍｇ／ｋｇのＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２及び１８．５ＭＢｑのＩＭＰ２８８を使用するＰＲＡＩＴは、強力且つ有意な腫瘍増殖阻害（図１７Ａ）が２１日間のモニタリング期間全体を通して持続した（１００％の生存、図１７Ｂ）。統計解析（通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正；^＊＊ｐ＜０．０１）は、ビヒクル群中の動物のほぼ半数を８日目後に過剰な腫瘍増殖のために屠殺しなければならなかったため、８日目のみ実施し、Ｃ０１３２／^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８治療群を^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８群と比較した。更に、図１７Ｃにより、Ｃ０１３２を使用するＰＲＡＩＴは、モニタリング期間全体（２１日間）を通して実質的な体重減少を生じないため、忍容性が良好であったことが示される。図１８から明らかなように、５ｍｇ／ｋｇのｂｓＭａｂのＣ０１３３及び１８．５ＭＢｑのＩＭＰ２８８を用いるＰＲＡＩＴは、強力且つ有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。統計解析（通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正；^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、ビヒクル群中の動物のほぼ半数を８日目後に過剰な腫瘍増殖のために屠殺しなければならなかったため、８日目のみ実施し、Ｃ０１３３／^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８治療群を^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８群と比較した。要約すると、これらの結果から、放射線標識したＨＳＧハプテンと一緒にしたＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂは、ＰＲＡＩＴとしての能力が高いことが浮き彫りにされる。
図１６は、以下を示す：（Ａ）ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８の構造並びに（Ｂ）ｂｓＭａｂのＣ０１３２及びＣ０１３３の^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドへの結合、この結合の評価は、ｉＴＬＣによるものであり、ｂｓＭａｂとインキュベーションしたときの^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８の移動プロフィールの変化に基づき、^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８ペプチドのみの移動プロフィールと比較した。

【0297】

図１７は、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２を用いたＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系移植ＣＴ２６マウス結腸直腸癌のＰＲＡＩＴを示す。Ｃ０１３２は、－３日目に投与し、続けて、３日後（０日目）に^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。（Ａ）０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；^＊＊ｐ＜０．０１対^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセント（％））、（Ｃ）０日目に測定した体重に対する体重（単位：％）。

【0298】

図１８は、Ｆｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３３を用いたＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系移植ＣＴ２６マウス結腸直腸癌のＰＲＡＩＴを示す。Ｃ０１３３は、－３日目に投与し、続けて、３日後（０日目）に^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。図は、０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）を示す。平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；^＊＊＊ｐ＜０．００１対^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。

【0299】

実施例１８：Ｂａｌｂ／ｃマウスでの同系ＣＴ２６大腸癌マウスモデルにおける抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）のＣ０１３２及びＣ０１３２適用５日後に^１７７Ｌｕ標識ＩＭＰ２８８を使用するＰＲＡＩＴ（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）

【0300】

この実施例では、新しく設計したＦｃサイレンシングされた二重特異性抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ抗体のＣ０１３２の有効性を、ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８（ＵＳ２００５／００２５７０９に記載のように）及び放射性核種としての^１７７Ｌｕと共に、ＰＲＡＩＴアプローチを使用して評価した。

【0301】

材料及び方法：ＲＲＡＩＴのＩｎ ｖｉｖｏ有効性を、皮下ＣＴ２６マウス結腸直腸癌の腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスで評価した。研究は、実施例１６に記載されるように実施し、いくつかの改変を加えた。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ＢｙＪ、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ社、Ｆｒａｎｃｅ）は、１００μＬのＰＢＳに懸濁した１×１０^６個のＣＴ２６細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍増殖は、接種７日後まで目視観測及び触診によって管理した。Ｉｎ ｖｉｖｏ治療研究は、腫瘍サイズが、３つの治療群（１群当たり１０匹のマウス）で約１００～２００ｍｍ^３及び１つの対照群（１群当たり１０匹のマウス）で約４００～５００ｍｍ^３に達したとき開始した。ｂｓＭａｂのＣ０１３２を２用量：２．５ｍｇ／ｍｌ、及び５ｍｇ／ｍｌでｉ．ｖ．注射する一方で、^１７７Ｌｕ標識ＩＭＰ２８８をＣ０１３２の投与５日後（実施例１６では３日後に対して）（０日目）にｉ．ｖ．注射した。Ｃ０１３２／放射線標識したＨＳＧ ＩＭＰ２８８ハプテンモル比を１０／１で一定に保つ（実施例１６と同じ）ことは、^１７７Ｌｕ標識ＩＭＰ２８８がそれぞれ２ｎｍｏｌ／ｋｇ（９．３ＭＢｑ）、及び４ｎｍｏｌ／ｋｇ（１８．５ＭＢｑ）で投与されたことを意味する。対照群は、マウスがｂｓＭａｂを用いて事前に治療されることなく０日目に^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を８ｎｍｏｌ／ｋｇ（３７ＭＢｑ）で投与された１コホートからなった。投与後２１日間にわたり、動物の体重及び腫瘍容積を２～３日毎に評価した。腫瘍容積は、デジタルノギスを用いて腫瘍の長さ、幅、及び深さを測定することによって決定した。腫瘍容積は、以下の式：腫瘍容積＝（長さ×幅×深さ）×０．５を使用して算出した。マウスを２１日目まで、或いはマウスが所定の実験エンドポイント：腫瘍容積＞１５００ｍｍ^３又は体重減少２０％超に達するまでモニターした。各治療群の相対腫瘍容積（０日目の腫瘍容積＝１００％）、及びカプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセンテージ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して時間に対してプロットした。統計解析（通常の一元ＡＮＯＶＡ及び多重検定のためのダネット補正、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、対照群中の動物（^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８、ｂｓＭａｂなし）を１１日目後に過剰な腫瘍増殖のために屠殺しなければならなかったため、８日目及び１０日目のみＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施し、２つのＣ０１３２治療群の各々を対照群（^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８のみ、ｂｓＭａｂなし）と比較した。

【0302】

結果及び結論：Ｃ０１３２を２．５及び５ｍｇ／ｍｌで用いたプレ標的化治療が有意な腫瘍退縮（図１９Ａ）、及び生存利益（図１９Ｂ）をもたらすことは、図１９から明らかである。Ｃ０１３２を５ｍｇ／ｍｌで投与した場合に、最大２１日間のモニタリングの間持続する最良の生存パーセンテージ（１００％）を達成できた。

【0303】

図１９は、Ｂａｌｂ／ｃで、ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞を同系移植したマウスにおける、ＰＲＡＩＴアプローチを使用した抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２の有効性を示す。Ｃ０１３２は、－５日目に２．５ｍｇ／ｍｌ、及び５ｍｇ／ｍｌで投与し、続けて、５日後（０日目）に^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。（Ａ）０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；^＊＊＊ｐ＜０．００１対^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線（単位：生存パーセント（％））。

【0304】

実施例１９：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスでの異種移植ＣＦＰＡＣ－１膵臓癌マウスモデルにおける抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体（ｂｓＭａｂ）のＣ０１３２及びＣ０１３２適用５日後に^１７７Ｌｕ標識ＩＭＰ２８８を使用するＰＲＡＩＴ（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）
この実施例では、新しく設計したＦｃサイレンシングされた二重特異性抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ抗体のＣ０１３２の有効性を、膵臓癌の異種移植モデルにおいて、ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８（ＵＳ２００５／００２５７０９に記載のように）及び放射性核種としての^１７７Ｌｕと共に、ＰＲＡＩＴアプローチを使用して評価した。

【0305】

材料及び方法：ＰＲＡＩＴのＩｎ ｖｉｖｏ有効性を、皮下ＣＦＰＡＣ－１膵管腺癌の腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃヌードマウスで評価した。研究は、基本的に実施例１６及び１７に記載されるように実施し、いくつかの改変を加えた。ヒト膵管腺癌細胞、ＣＦＰＡＣ－１は、ＡＴＣＣから提供された（Ｃａｔ＃ＣＲＬ－１９１８）。細胞は、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ＣＦＰＡＣ－１細胞の懸濁液を、滅菌ＰＢＳ中で５０×１０^６細胞／ｍＬに調製した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ＢｙＡｎＮＲｊ－Ｆｏｘｎ１^{ｎｕ／ｎｕ}）は、１００μＬのＰＢＳに懸濁した５×１０^６個のＣＦＰＡＣ－１細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍増殖は、接種４日後まで目視観測及び触診によって管理した。Ｉｎ ｖｉｖｏ治療研究は、腫瘍サイズが、治療群（１群当たり１０匹のマウス）で約１５０～３００ｍｍ^３及び２つの対照群（１群当たり１０匹のマウス）で約３５０～５００ｍｍ^３に達したとき開始した。治療群は最初に５ｍｇ／ｋｇ用量のＢｓＭＡｂのＣ０１３２を投与した（－５日目）。５日後（０日目）、放射線標識したＩＭＰ２８８は、１０：１の固定ＢｓＭＡｂ／ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８モル比を用いて、つまり、^１７７Ｌｕ標識ＨＳＧハプテンＩＭＰ２８８をそれぞれ４ｎｍｏｌ／ｋｇ（１８．５ＭＢｑ）で投与した。対照群は、マウスが^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を８ｎｍｏｌ／ｋｇ（３７ＭＢｑ）で投与されたが、ＢｓＭＡｂを投与されなかった１コホートと、マウスが^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８の希釈に使用されるビヒクルのみを投与された１コホートと、からなった。投与後２８日間にわたり、動物の体重及び腫瘍容積を２～３日毎に評価した。腫瘍容積は、デジタルノギスを用いて腫瘍の長さ、幅、及び深さを測定することによって決定した。腫瘍容積は、以下の式：腫瘍容積＝（長さ×幅×深さ）×０．５を使用して算出した。マウスを２８日目まで、或いはマウスが所定の実験エンドポイント：腫瘍容積＞１５００ｍｍ^３又は体重減少２０％超に達するまでモニターした。各治療群の相対腫瘍容積（０日目の腫瘍容積＝１００％）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して時間に対してプロットした。統計解析（通常の一元ＡＮＯＶＡ及び多重検定のためのダネット補正；^＊＊ｐ＜０．０１）は、１４日目のみを対象にしてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において実施し、Ｃ０１３２治療群をビヒクル群と比較した。

【0306】

結果及び結論：Ｃ０１３２を５ｍｇ／ｍｌで用いたプレ標的化治療が有意な腫瘍退縮（図２０）をもたらすことは、図２０から明らかである。

【0307】

図２０は、ＣＦＰＡＣ－１膵臓腺癌細胞を異種移植したＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、ＰＲＡＩＴアプローチを使用した抗ｏｘＭＩＦ×抗ＨＳＧ ｂｓＭａｂのＣ０１３２の有効性を示す。Ｃ０１３２は、－５日目に５ｍｇ／ｍｌで投与し、続けて、５日後（０日目）に^１７７Ｌｕ－ＩＭＰ２８８を投与した。０日目に測定した腫瘍容積に対する腫瘍容積（単位：％）；平均±ＳＥＭが示される（ｎ＝最大１０）。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、通常の一元ＡＮＯＶＡ、及び多重検定のためのダネット補正を使用して実施した；^＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクル。

【0308】

実施例２０：ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルにおける、グルココルチコイド（ＧＣ）と組み合わせたＣ０１１５抗体の有効性
グルココルチコイド（デキサメタゾンなど）は、ヒト患者におけるリウマチ性疾患を制御するための長期療法として一般的に使用される強力な免疫抑制剤であるが、様々な副作用を伴う。この実施例では、Ｃ０１１５の有効性を単独治療として、又はデキサメタゾンと組み合わせて評価した。

【0309】

材料及び方法：この研究では、８～９週齡の雄のＤＢＡ／１ｊ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｉｔａｌｙ）マウス（体重範囲：１８～２０グラム）を使用した。ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社，ＵＳＡ）は、４℃で穏やかに終夜撹拌することによって、０．０５Ｍ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）は、結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ社，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）に２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することによって調製した。注射前に、ＣＩＩを等量のＣＦＡで乳化した。ＣＩＡを誘導するために、マウスの尾の付け根に、１００μｌのＣＩＩ及びＣＦＡを含有する得られたエマルション（１００μｇ／匹）を皮内注射した。２１日目に、２回目のＩＦＡ中のＣＩＩの追加免疫１００μｌ（１００μｇ／匹）を投与した。疾患の発症時に、マウスは、ビヒクルを用いた治療、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｋｇ）を単独で用いた治療、又はＣ０１１５（２０ｍｇ／ｋｇ）を低用量のデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の毎日の注射との組合せで用いた治療を、週に２回（ｉ．ｐ．）、２０日間行った。マウスの対照群は、標準治療薬として高用量のデキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を毎日注射した。治療終了時に、動物は、安楽死させ、血液を回収し、更なる組織学的解析のために組織（前足及び後足）を採取した。関節炎の臨床的重症度は、体重、及び足の厚さ（４本の足の全ての、厚さ計を使用）を週に２回モニタリングすることによって評価した。各マウスの４本の足の関節炎スコアは、０～４の範囲であり、以下のように評価した：０＝関節炎の徴候なし；１＝足又は１本の指の腫脹及び／又は発赤；２＝２つの関節の発症；３＝２つ超の関節の発症；４＝足及び指全体の重度の関節炎（マウス当たりの最大スコアは１２になる）。各マウスの累積疾患スコアを、治療期間にわたりスコアを合計することによって個々のマウスに対して計算した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて、通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用して行った。
結果及び結論：図２１により、Ｃ０１１５を用いた治療（２０ｍｇ／ｋｇ）で、ビヒクル治療群と比較した累積疾患スコアによって示される臨床的関節炎徴候の有意な改善がもたらされたことが明らかにされる。更に、Ｃ０１１５（２０ｍｇ／ｋｇ）と低用量のデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）との組合せ治療は、高用量のデキサメタゾン（０．３ｍｇ／ｋｇ）の有効性に匹敵し、単剤としての治療と比較して臨床的関節炎徴候が更に改善された。

【0310】

実施例２１：大腸炎のＴ細胞移入マウスモデルにおける、Ｃ０１１５抗体の有効性及びグルココルチコイド（ＧＣ）と組み合わせたＣ０１１５抗体の有効性
この実施例では、単剤としてのＣ０１１５抗体、又は低用量のデキサメタゾンと組み合わせたＣ０１１５抗体の有効性は、慢性腸炎症時に評価した。

【0311】

材料及び方法：この研究では、８～９週齡の雌のＢＡＬＢ／ｃ及びＣ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤ（Ｅｎｖｉｇｏ社，Ｓａｎ Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ，Ｕｄｉｎｅ，Ｉｔａｌｙ）マウス（体重範囲：１８～２０グラム）を使用した。

【0312】

大腸炎を誘導するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞をＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス（Ｂ細胞及びＴ細胞を欠く）に移植した。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／Ｃマウスから単離された脾細胞を、４μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞の磁気選択によって単離され、細胞調製物を、生死判定色素（７－アクチノマイシン－Ｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＢＤ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ２５抗体（ＢＤ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してフローサイトメトリーによって純度制御した（ＣＤ４＋ＣＤ２５－ゲートでの９５％超の生存Ｔ細胞）。単離したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞は、最終容量０．２ｍｌの生理食塩水中に５００，０００細胞の濃度でＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．注射した。Ｔ細胞移入の１週間後、マウスは、ビヒクル、単剤としてのＣ０１１５（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は低用量のデキサメタゾン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の毎日の注射と組み合わせたＣ０１１５（１０ｍｇ／ｋｇ）で、８３日間治療した（週に２回；ｉ．ｐ．）。マウスの対照群は、標準治療薬として高用量のデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を毎日注射した。治療終了時に、血液、便及び結腸組織を、更なる解析のために回収した。大腸炎の臨床的重症度は、体重変化及び便の硬さの定期的なモニタリングによって評価した。各マウスの累積便スコアは、毎日の便スコアを合計することによって決定した（０＝よく形成されたペレット；１＝軟便；２＝下痢）。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．４において、一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用した。

【0313】

結果及び結論：図２２により、Ｃ０１１５を用いた治療（１０ｍｇ／ｋｇ）で、ビヒクル治療群と比較した累積便スコア（Ａ）の有意な低減によって証明される疾患の重症度の有意な改善がもたらされたことが示され、これは高用量のデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）に匹敵するものであった。１０ｍｇ／ｋｇのＣ０１１５と低用量のデキサメタゾン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）との組合せ治療は、累積便スコアの更なる有意な低減によって証明されるように、疾患の重症度を更に改善した。驚くべきことに、１０ｍｇ／ｋｇのＣ０１１５と低用量のデキサメタゾン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）との組合せ治療は、治療終了時（８３日目）にビヒクル治療群及び標準治療コルチコステロイド薬のデキサメタゾンを用いた治療と比較して体重が有意に増加することによって評価された大腸炎の更なる改善をもたらした。

【0314】

図２２は、新しく設計したＦｃサイレンシングされた抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１１５が、単剤及びＧＣとの組合せで大腸炎モデルのＴ細胞移入マウスにおいて疾患の重症度を改善することを示す。実験終了時のＤ８３での体重変化（Ａ）及び累積便スコア（Ｂ）は、Ｃ０１１５（１０ｍｇ／ｋｇ）を単独若しくは低用量０．０１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンとの組合せで用いた治療の場合、標準治療コルチコステロイド薬としてデキサメタゾンを低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で用いた治療の場合、又はビヒクル対照治療の場合で評価した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、統計解析を通常の一元ＡＮＯＶＡ、続けて、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用して行った（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。

【0315】

実施例２２：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集傾向及び低減された疎水性、並びに固定化されたｏｘＭＩＦとのその結合の保持（Ｋ_Ｄ推定）

【0316】

【表11】

【0317】

疎水性及び凝集を評価するため、新しく設計した抗体を、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８とのｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ比較で、ゲル濾過（ＳＥＣ）によって、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって解析する。

【0318】

ＳＥＣのため、抗体を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用する。分離及び平衡は、室温で、１×ＰＢＳ中で実施する。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析する。結果は、メインピークの保持容量（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けする。

【0319】

ＨＩＣ解析のため、抗体を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８を使用して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈する。１ｍｇの各抗体は、１ｍｌローディングループを使用して１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラムに注入し、カラム流速を室温で１ｍｌ／ｍｉｎに維持する。ピークの分離は、０～１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容積（ＣＶ）で実行する。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析する。結果は、各ピークについて、最大ピークでのＶｒ（ｍｌ）で報告する。

【0320】

ｏｘＭＩＦへの結合（見かけの親和性）を評価するため、新しく設計した抗体をＥＬＩＳＡで分析する。簡潔に述べると、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化する（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加する。最後に、結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出する。発色反応を３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで測定する。見かけの親和性（Ｋ_Ｄ）を表すＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して４パラメーターフィットによって決定する。

【0321】

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【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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【国際調査報告】