特表2024-532478高い熱安定性及び減弱したエフェクター機能を有するＦｃバリアント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】高い熱安定性及び減弱したエフェクター機能を有するＦｃバリアント
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240829BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240829BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00
C12N15/13 ZNA
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P37/02
A61P29/00
A61P31/00
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K47/68
A61K45/00
A61K47/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513898
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-04-04
(86)【国際出願番号】 CA2022051331
(87)【国際公開番号】W WO2023028715
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】P 2021144352
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510214045
【氏名又は名称】ザイムワークス ビーシー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】篠▲崎▼ 直也
(72)【発明者】
【氏名】牧野 智宏
(72)【発明者】
【氏名】長岡 のぶみ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC31
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB07
4C084ZB11
4C084ZB26
4C084ZB32
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
１つ以上のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドであって、バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中のＣＨ２ドメインのうちの少なくとも１つは、バリアントＣＨ２ドメインであり、かつバリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙ、またはＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎである、ポリペプチド。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドであって、前記バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、前記バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中の少なくとも１つのＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）においてアミノ酸置換を含むバリアントＣＨ２ドメインであり、前記バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙ、またはそれぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎであり、かつ前記１つ以上のバリアントＦｃ領域のそれぞれは、バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、前記ポリペプチド。
【請求項2】
前記バリアントＣＨ２ドメインの位置３２９においてアミノ酸置換を更に含み、前記バリアントＣＨ２ドメインの位置３２９のアミノ酸残基は、Ａｌａである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
位置２３４、２３５及び２６５においてアミノ酸置換を含まない親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合親和性が低下している、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ以上に対する結合が低下している、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合が低下している、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項6】
前記ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩが、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩである、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項7】
前記ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩが、カニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩである、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項8】
位置２３４、２３５、及び２６５においてアミノ酸置換を含まない親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドと比較して、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合親和性が５０％以上低下している、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項9】
前記ＦｃγＲが、ヒトＦｃγＲまたはカニクイザルＦｃγＲである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項10】
前記ＦｃγＲが、ヒトＦｃγＲである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項11】
前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩである、請求項８～１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項12】
１つ以上のバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項13】
１つのバリアントＦｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項14】
１つのバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項15】
前記バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５の前記アミノ酸残基が、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項16】
前記バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５の前記アミノ酸残基が、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項17】
前記バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が、位置２３４、２３５及び２６５においてアミノ酸置換を含まない親ＣＨ２ドメインのＴｍの１℃以内である、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【請求項18】
前記バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が、位置２３４、２３５及び２６５においてアミノ酸置換を含まない親ＣＨ２ドメインのＴｍより１℃以上高い、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項19】
前記バリアントＣＨ２ドメインの前記Ｔｍが、前記親ＣＨ２ドメインの前記Ｔｍより３℃以上高い、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項20】
抗体またはその機能性断片である、請求項１～１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項21】
前記抗体またはその機能性断片が、腫瘍抗原に結合する、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、分子。
【請求項23】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドと異種ポリペプチドとの融合タンパク質である、請求項２２に記載の分子。
【請求項24】
１つ以上の薬物または修飾剤にコンジュゲートされた請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【請求項25】
前記薬物が、化学療法剤または細胞傷害性薬剤である、請求項２４に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【請求項26】
前記修飾剤が、非タンパク質性ポリマーである、請求項２４に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【請求項27】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項28】
請求項２７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項29】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、請求項２８に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、培地中で培養することと、前記培地または前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収することとを含む、前記方法。
【請求項30】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２２もしくは２３に記載の分子、または請求項２４～２６のいずれか１項に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項31】
治療における使用のための、請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２２もしくは２３に記載の分子、または請求項２４～２６のいずれか１項に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【請求項32】
前記治療が、がん、免疫疾患、炎症性疾患または感染症の治療を含む、請求項３１に記載の使用のための、ポリペプチド、分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３日に出願された日本特許出願第２０２１－１４４３５２号の利益及び優先権を主張するものであり、その開示は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年９月３日に出願された日本特許出願第２０２１－１４４３５２号の利益及び優先権を主張するものであり、その開示は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【0002】
配列表
本出願は、ｐｄｆ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ｐｄｆのコピーは、２０２２年８月３０日に作成され、ＺＹＭＥ０８６ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｐｄｆという名称で、サイズは７１６，８００バイトである。
本出願は、ｐｄｆ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ｐｄｆのコピーは、２０２２年８月３０日に作成され、ＺＹＭＥ０８６ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｐｄｆという名称で、サイズは７１６，８００バイトである。
【0003】
分野
本開示は、ＦＣバリアントの分野、特に、バリアントＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、及び当該ポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関し、これらは、医薬として有用である。
本開示は、ＦＣバリアントの分野、特に、バリアントＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、及び当該ポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関し、これらは、医薬として有用である。
【背景技術】
【0004】
背景
抗体のＦｃ領域は、長い血中半減期及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を抗体に付与する。Ｆｃ領域が、ほとんどの抗体薬物で使用されているＩｇＧサブクラスに由来する場合、エフェクター機能は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる受容体のファミリーに対するＦｃ領域の結合に依存する。しかしながら、ＦｃγＲに対する結合活性は、急性輸液反応などの安全リスクに関与することが示唆されており（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ；５（１）：１１－５（２００８）（非特許文献１）参照）、そのため、状況によっては、医薬として使用される抗体にとって望ましくない性質となり得る。
抗体のＦｃ領域は、長い血中半減期及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を抗体に付与する。Ｆｃ領域が、ほとんどの抗体薬物で使用されているＩｇＧサブクラスに由来する場合、エフェクター機能は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる受容体のファミリーに対するＦｃ領域の結合に依存する。しかしながら、ＦｃγＲに対する結合活性は、急性輸液反応などの安全リスクに関与することが示唆されており（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ；５（１）：１１－５（２００８）（非特許文献１）参照）、そのため、状況によっては、医薬として使用される抗体にとって望ましくない性質となり得る。
【0005】
ヒトＦｃγＲへの結合活性を低下させるＩｇＧ抗体のＦｃ領域における様々なアミノ酸置換は、これまでに報告されている。例えば、国際公開番号ＷＯ１９８８／０７０８９（特許文献１）；ＷＯ１９９９／５１６４２（特許文献２）；ＷＯ２０００／４２０７２（特許文献３）；ＷＯ２０１３／０９２００１（特許文献４）；ＷＯ２０１５／１０９１３１（特許文献５）及びＷＯ２０２０／０８６７７６（特許文献６）、ならびにＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２９（１０）：４５７－６６（２０１６）（非特許文献２）、及びＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２９２（５）：１８６５－７５（２０１７）（非特許文献３）を参照されたい。
【0006】
Ｆｃ領域のＦｃγＲへの結合を低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃ領域の熱安定性の低下をもたらすことがある（例えば、国際公開番号ＷＯ２０２０／０８６７７６（特許文献６）及びＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２９２（５）：１８６５－７５（２０１７）（非特許文献３）参照）。
【0007】
国際公開番号ＷＯ２０１３／１１８８５８（特許文献７）は、熱安定性を改善し、更に、エフェクター機能を増加または減少させる、Ｆｃ領域のアミノ酸置換について記載している。ＷＯ２０１３／１１８８５８（特許文献７）は、アミノ酸置換の組み合わせについて、そのそれぞれが独立して熱安定性を改善させるが、必ずしも相加的に熱安定性を改善するとは限らないことを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】ＷＯ１９８８／０７０８９
【特許文献2】ＷＯ１９９９／５１６４２
【特許文献3】ＷＯ２０００／４２０７２
【特許文献4】ＷＯ２０１３／０９２００１
【特許文献5】ＷＯ２０１５／１０９１３１
【特許文献6】ＷＯ２０２０／０８６７７６
【特許文献7】ＷＯ２０１３／１１８８５８
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ；５（１）：１１－５（２００８）
【非特許文献2】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２９（１０）：４５７－６６（２０１６）
【非特許文献3】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２９２（５）：１８６５－７５（２０１７）
【発明の概要】
【0010】
概要
本明細書に記載されるのは、高い熱安定性及び減弱されたエフェクター機能を有するＦｃバリアントである。本開示の一態様は、１つ以上のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドであって、バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中の少なくとも１つのＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）においてアミノ酸置換を含むバリアントＣＨ２ドメインであり、バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙ、またはそれぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎであり、１つ以上のバリアントＦｃ領域のそれぞれは、バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、ポリペプチドに関する。
本明細書に記載されるのは、高い熱安定性及び減弱されたエフェクター機能を有するＦｃバリアントである。本開示の一態様は、１つ以上のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドであって、バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中の少なくとも１つのＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）においてアミノ酸置換を含むバリアントＣＨ２ドメインであり、バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙ、またはそれぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎであり、１つ以上のバリアントＦｃ領域のそれぞれは、バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、ポリペプチドに関する。
【0011】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチドを含む、分子に関する。
【0012】
本開示の別の態様は、１つ以上の薬物または修飾剤にコンジュゲートされた本明細書に記載されるポリペプチドを含む、ポリペプチド－薬物コンジュゲートに関する。
【0013】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列をコードする、核酸に関する。
【0014】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、宿主細胞に関する。
【0015】
別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で、培地中で培養することと、培地または宿主細胞からポリペプチドを回収することとを含む、方法に関する。
【0016】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、または薬物もしくは修飾剤にコンジュゲートされた当該ポリペプチドを含むポリペプチド－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【0017】
別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、または薬物もしくは修飾剤にコンジュゲートされたポリペプチドを含むポリペプチド－薬物コンジュゲートの治療における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】一般的なＩｇＧ抗体の構造を示す模式図である。ＩｇＧ抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からそれぞれなる重鎖と、ＶＬ及びＣＬからそれぞれなる軽鎖から構成される。
【図2A】ＳＰＲ法によって評価した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ２ Ｆｃ領域をヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に置き換えることによって得られたＩｇＧ１ ＷＴ；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）変異を導入することによって得られたバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を示す。
【図4A】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、ピークトップの温度（Ｔｍ）を表す。
【図4B】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図4C】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図4D】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＰＧバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図5】ＳＰＲ法によって評価した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ２ Ｆｃ領域をヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に置き換えることによって得られたＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ（ＬＡＬＡ－ＤＧ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎ（ＬＡＬＡ－ＤＮ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｑ（ＬＡＬＡ－ＤＱ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｔ（ＬＡＬＡ－ＤＴ）変異を導入することによって得られたバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を示す。
【図7A】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図7B】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＮバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図7C】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＱバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図7D】ＤＳＣによって測定した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＴバリアントの温度依存性熱容量の変化を示す。各ピーク近くの数字は、Ｔｍを表す。
【図8】抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴ、ＬＡＬＡバリアント、及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントをマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）投与した後の血中濃度の経時的変化を示す。図中のエラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図9A】ＳＰＲ法によって評価した、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ）変異を導入することによって得られたバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を示す。
【図10A】ＳＰＲ法によって評価した、ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ７０抗体ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を示す。
【図10B】ＳＰＲ法によって評価した、ＩｇＧ１抗体である抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１のＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を示す。
【図11A】野生型ヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７）定常領域のアミノ酸配列を表す（配列番号１）。下線部、二重下線部及び四角で囲まれた部分は、それぞれヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ならびにアミノ酸置換（変異）の位置を示す。
【図16A】抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴ軽鎖のアミノ酸配列を表す（配列番号１３）。下線部は、可変領域を示す。
【図16B】抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴ重鎖のアミノ酸配列を表す（配列番号１４）。下線部、二重下線部及び四角で囲まれた部分は、それぞれヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ならびにアミノ酸置換（変異）の位置を示す。
【図17A】抗ＣＤ７０抗体ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアントの軽鎖のアミノ酸配列を表す（配列番号１５）。下線部は、可変領域を示す。
【図18A】抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１のＩｇＧ１ ＷＴ軽鎖のアミノ酸配列を表す（配列番号１７）。下線部は、可変領域を示す。
【図19A】ヒトＦｃガンマＲＩ（アクセッション番号：Ｐ１２３１４）のアミノ酸配列を表す（配列番号１９）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図19B】ヒトＦｃガンマＲＩＩａ（Ｒ１６７）（アクセッション番号：ＡＡＡ３５８２７）のアミノ酸配列を表す（配列番号２０）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７）タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図19C】ヒトＦｃガンマＲＩＩａ（Ｈ１６７）（アクセッション番号：Ｐ１２３１８－１（Ｐ１２３１８．４））のアミノ酸配列を表す（配列番号２１）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７）タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図19D】ヒトＦｃガンマＲＩＩｂ／ｃ（アクセッション番号：Ｐ３１９９４）のアミノ酸配列を表す（配列番号２２）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＢ／Ｃ（ＣＤ３２ｂ／ｃ）タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図19E】ヒトＦｃガンマＲＩＩＩａ（アクセッション番号：ＡＡＨ１７８６５）のアミノ酸配列を表す（配列番号２３）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａタンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図19F】ヒトＦｃガンマＲＩＩＩｂ（アクセッション番号：Ｏ７５０１５）のアミノ酸配列を表す（配列番号２４）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＢ／ＣＤ１６ｂタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図20A】カニクイザルＦｃガンマＲＩ（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０９６９）のアミノ酸配列を表す（配列番号２５）。下線部は、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図20B】カニクイザルＦｃガンマＲＩＩａ（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０５９８）のアミノ酸配列を表す（配列番号２６）。下線部は、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩａ／ＣＤ３２ａタンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図20C】カニクイザルＦｃガンマＲＩＩｂ（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７１０６０）のアミノ酸配列を表す（配列番号２７）。下線部は、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＢタンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図20D】カニクイザルＦｃガンマＲＩＩＩ（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０１２１）のアミノ酸配列を表す（配列番号２８）。下線部は、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＩ／ＣＤ１６タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【図21】ヒト胎児性Ｆｃ受容体大型サブユニットｐ５１（アクセッション番号：Ｐ５５８９９）のアミノ酸配列を表す（配列番号２９）。
【図22】ベータ２－ミクログロブリン（アクセッション番号：ＮＰ＿００４０３９．１）のアミノ酸配列を表す（配列番号３０）。
【図23】ヒトＦｃガンマＲＩＩＩａ（Ｖ１７６Ｆ）（アクセッション番号：Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列を表す（配列番号３１）。下線部は、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【0020】
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、所与の値からおよそ±１０％変動することを指す。その変動が具体的に言及されているか否かにかかわらず、このような変動は常に、本明細書に示されている所与の値のいずれにも含まれることを理解されたい。
【0021】
「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、「含む」という用語とあわせて本明細書で使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたは１を超える」の意味とも一致する。
【0022】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびにこれらの文法的変形表現は、包括的、すなわちオープンエンドであり、列挙されていない追加の要素及び／または方法の工程を排除するものではない。「～から本質的になる」という用語は、本明細書において、組成物、使用または方法に関連して使用される場合、追加の要素及び／または方法の工程が存在することがあるが、これらの追加が、列挙されている組成物、方法または使用が機能する様式に実質的に影響を及ぼさないことを示す。「～からなる」という用語は、本明細書において、組成物、使用または方法に関連して使用される場合、追加の要素及び／または方法の工程の存在が除外される。本明細書に記載されている組成物、使用または方法が、特定の要素及び／または工程を含むとされている場合、特定の実施形態では、これらの要素及び／または工程から本質的になってもよく、別の実施形態では、これらの要素及び／または工程からなってもよく、これらの実施形態が具体的に言及されているか否かは問わない。
【0023】
本明細書で論述される任意の実施形態は、本明細書に開示される任意の方法、使用または組成物に関して実行され得ることが企図され、逆もまた同様である。
【0024】
本開示は、１つ以上のバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中のＣＨ２ドメインの一方または両方は、バリアントＣＨ２ドメインであり、バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙである（また任意選択により位置３２９のアミノ酸残基はＡｌａである）か、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎである（また任意選択により位置３２９のアミノ酸残基はＡｌａである）、ポリペプチドに関する。本開示は、更に、当該ポリペプチドを含む分子；当該ポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲート；当該ポリペプチド、分子、またはコンジュゲートを含む、医薬組成物；及びヒト対象を当該ポリペプチド、分子、コンジュゲート、または医薬組成物で治療するための方法に関する。特定の実施形態において、本開示は、バリアントＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、及び当該ポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関し、これらは、Ｆｃγ受容体に対して結合活性が低下しており、熱安定性が良好であり、医薬として有用である。例えば、一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインを含むポリペプチド、ポリペプチドを含む分子、及びポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートは、親ＣＨ２ドメイン（すなわち、バリアントＣＨ２ドメインに含まれる位置２３４、２３５及び２６５（及び任意選択により、位置３２９）において変異を導入する前のＣＨ２ドメイン）をそれぞれ含む親ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合活性が低下している。別の実施形態において、ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートは、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートとそれぞれ比較して、改善されたまたは同等の熱安定性を有する。別の実施形態において、ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートは、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートとそれぞれ比較して、抗原に対する結合活性を維持しており、血中半減期の低下がない。別の実施形態において、ポリペプチド、分子、またはコンジュゲートのＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチド、分子、及びコンジュゲートのそれぞれに対して、少数のアミノ酸置換（例えば、３つまたは４つのアミノ酸置換）を有し、アミノ酸置換数の増加に伴って生じ得る免疫原性リスクが小さい。
【0025】
本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域のアミノ酸残基のナンバリングは、特に記載のない限り、ＥＵインデックスに従う（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１（Ｍａｙ １５，１９６９），ｐｐ．７８－８５）。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、典型的に、約１０個以上のアミノ酸残基を含み、それらが互いにペプチド結合によって接続されている分子を意味する。本開示によるポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは合成もしくは組み換えポリペプチドに由来し得る。本開示によるポリペプチドは、例えば、本明細書に記載される、抗体またはその機能性断片、融合タンパク質などであり得る。
【0027】
一実施形態において、本開示は、上述のポリペプチドを含む分子に関する。そのような分子には、二重特異性抗体、多重特異性抗体、可溶性受容体、イムノサイトカイン、抗体もしくはその機能性断片以外の抗原または標的に結合する部分（例えば、非免疫グロブリンタンパク質、受容体、リガンド、核酸アプタマー、アンチセンス核酸分子、低分子量化合物など）が含まれるが、これらに限定されない。本開示によるポリペプチドを含む分子がそれ自体ポリペプチドである場合、その分子は、本開示による「ポリペプチド」とみなされ得、そのため、本明細書において「本開示によるポリペプチド」または「本開示によるポリペプチドを含む分子」のどちらとしても称され得る。以下に記載される「融合タンパク質」もまた、いくつかの実施形態において、それ自体がポリペプチドであり得るため、本明細書において「本開示によるポリペプチド」または「本開示によるポリペプチドを含む分子」のどちらとしても称され得る。
【0028】
一実施形態において、本開示は、上記のポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関する。薬物は、例えば、治療薬または診断薬であり得る。ポリペプチド－薬物コンジュゲートに含まれるポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、必須ではないが、抗体自体が抗腫瘍作用を有することが好ましい。ポリペプチド－薬物コンジュゲートは、通常、ポリペプチドと薬物を、リンカーを介してコンジュゲートさせることによって調製され得る。当該技術分野において知られているリンカー、例えば、糖リンカー及び／またはペプチドリンカーが使用され得る。加えて、ポリペプチド－薬物コンジュゲートの使用が意図された治療の目的に応じて、様々な医薬品が薬物として使用され得る。上記のポリペプチドが薬物にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートは、「本開示によるポリペプチドを含む分子」の他の実施形態の１つとみなすことができる。
【0029】
バリアントＦｃ領域
本開示によるポリペプチドは、バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ１／ＩｇＧ４領域（総称して「バリアントＦｃ領域」）を含む。本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を指し、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、通常、２つの重鎖のＣ末端領域がヒンジ領域によって接続されたホモ二量体またはヘテロ二量体の形態であるが、いくつかの実施形態において、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域であってもよい。Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体に由来する場合、Ｆｃ領域は、一般に、位置２３１のアミノ酸残基からＣ末端までの領域を意味するが、これに限定されない。
本開示によるポリペプチドは、バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ１／ＩｇＧ４領域（総称して「バリアントＦｃ領域」）を含む。本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を指し、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、通常、２つの重鎖のＣ末端領域がヒンジ領域によって接続されたホモ二量体またはヘテロ二量体の形態であるが、いくつかの実施形態において、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域であってもよい。Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体に由来する場合、Ｆｃ領域は、一般に、位置２３１のアミノ酸残基からＣ末端までの領域を意味するが、これに限定されない。
【0030】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインのＣ末端からＣＨ２ドメインのＮ末端までを含むＩｇＧ抗体の部分を指す。Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体に由来する場合、ヒンジは、一般に、限定するものではないが、位置約２１６のアミノ酸残基から位置約２３０のアミノ酸残基に及ぶ。上記のとおり、Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体に由来する場合、Ｆｃ領域は、一般に、重鎖の位置２３１のアミノ酸残基からＣ末端までを指すが、いくつかの実施形態において、「ヒンジ」は、Ｆｃ領域に含まれ得る。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」は、ヒンジと接続する点からＣＨ３ドメインと接続する点に及ぶ領域を含むが、これに限定されない。Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体に由来する場合、ＣＨ２ドメインは、一般に、位置約２３１のアミノ酸残基から位置約３４０のアミノ酸残基に及ぶ。ヒト野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ領域の位置２３４、２３５、２６５、及び３２９のアミノ酸残基は、ＣＨ２ドメイン中に存在する。ＣＨ２ドメインは、通常、Ｆｃ領域でループ構造を有するが、そのような構造に限定されない。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインと接続する点から重鎖のＣ末端に及ぶ領域を含むが、これに限定されない。Ｆｃ領域がＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体に由来する場合、ＣＨ３ドメインは、一般に、ＩｇＧ１の位置約３４１のアミノ酸残基から位置約４４７のアミノ酸残基に及ぶが、これに限定されない。ＣＨ３ドメインは、通常、Ｆｃ領域でループ構造を有するが、そのような構造に限定されない。
【0033】
本明細書で使用される場合、「バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域」または「バリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域」は、２つのＣＨ２ドメインの一方または両方がバリアントＣＨ２ドメインであるＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を指す。バリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域及びバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、本明細書において「バリアントＦｃ領域」と総称されることもある。「バリアントＦｃ領域」という用語はまた、２つのＣＨ２ドメインの一方または両方がバリアントＣＨ２ドメインである混合型ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域も包含する。「バリアントＣＨ２ドメイン」は、位置２３４、２３５、及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙ；またはＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎ（すなわち、２３４Ａ、２３５Ａ、及び２６５Ｇ；または２３４Ａ、２３５Ａ、及び２６５Ｎ）であるＣＨ２ドメインを指す。一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインは、Ａｌａ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、及びＡｌａによってそれぞれ置換された位置２３４、２３５、２６５、及び３２９のアミノ酸残基（すなわち、２３４Ａ、２３５Ａ、２６５Ｇ、及び３２９Ａ）を含む。
【0034】
本開示によるポリペプチドは、ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれか１つの部分、領域、またはドメインなどの、バリアントＦｃ領域以外の別の（１つ以上の）構成要素（複数可）を含み得る。Ｆｃ領域は、好ましくは、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトまたはカニクイザル（例えば、カニクイマカク、アカゲザル、コモンマーモセット、リスザルなどを含む）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒト由来である。
【0035】
野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列の例は、配列番号１または２の１１４番目から３３０番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１１Ａ及び１１Ｂ参照）として本明細書に提供され、野生型ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の例は、配列番号３の１１１番目から３２７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１１Ｃ参照）として本明細書に提供される。上述のアミノ酸置換によって変異を導入する前のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の位置２３４、２３５、２６５、及び３２９（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、それぞれＬｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、及びＰｒｏ（すなわち、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５及びＰ３２９）である。したがって、上述のアミノ酸置換は、本明細書において、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ（ＬＡＬＡ－ＤＧ）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ）、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎ（ＬＡＬＡ－ＤＮ）として表すことができ、これらのアミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書において「ＬＡＬＡ－ＤＧバリアント」、「ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアント」及び「ＬＡＬＡ－ＤＮバリアント」とそれぞれ称され得る。変異を導入する前のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の位置２３４、２３５、２６５、及び３２９（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、位置２３４のアミノ酸残基がＰｈｅであることを除き、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と同じである（すなわち、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、及びＰ３２９）。したがって、「本開示によるＣＨ２ドメイン」がＩｇＧ４抗体に由来する場合、上述のアミノ酸置換は、本明細書において、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ（ＦＡＬＡ－ＤＧ）、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ（ＦＡＬＡ－ＤＧＰＡ）、及びＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎ（ＦＡＬＡ－ＤＮ）として表すことができ、そのため、これらのアミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書において「ＦＡＬＡ－ＤＧバリアント」、「ＦＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアント」及び「ＦＡＬＡ－ＤＮバリアント」とそれぞれ称され得る。
【0036】
本開示による「バリアントＣＨ２ドメイン」は、位置２３４、２３５、及び２６５（及び任意選択により位置３２９）において上述の特定のアミノ酸置換を含み、上述の特定のアミノ酸置換以外のアミノ酸修飾（複数可）（例えば、欠失、付加、置換、または挿入）を更に含み得る。同様に、バリアントＦｃ領域は、上述の特定のアミノ酸置換以外のアミノ酸修飾（複数可）（例えば、欠失、付加、置換、または挿入）を含み得る。Ｆｃ領域が追加のアミノ酸修飾を含む場合、追加のアミノ酸修飾は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域（含まれる場合）またはこれらの組み合わせに存在し得る。上述されるように、Ｆｃ領域は、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域が追加のアミノ酸修飾を含む場合、修飾は、対称的な修飾（両方のＣＨ２ドメイン及び／または両方のＣＨ３ドメインに同じ修飾が存在する）であってもよいし、非対称な修飾（各ＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインに異なる修飾があるか、ＣＨ２ドメインの一方及び／またはＣＨ３ドメインの一方のみに存在する）であってもよい。
【0037】
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号４または５の１１４番目から３３０番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）として本明細書に提供され、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬＡＬＡ－ＤＮバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号６または７の１１４番目から３３０番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１３Ａ及び１３Ｂ参照）として本明細書に提供され、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号８または９の１１４番目から３３０番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１４Ａ及び１４Ｂ参照）として本明細書に提供される。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＦＡＬＡ－ＤＧバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号１０の１１１番目から３２７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１５Ａ参照）として本明細書に提供され、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＦＡＬＡ－ＤＮバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号１１の１１１番目から３２７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１５Ｂ参照）として本明細書に提供され、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＦＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのアミノ酸配列の例は、配列番号１２の１１１番目から３２７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（図１５Ｃ参照）として本明細書に提供される。これらの配列は例としてのみ提供され、本開示のバリアントＣＨ２ドメインはこれに限定されないことを理解されたい。加えて、「ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアント」または「ＦＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアント」の２６５番目のＧｌｙがそれぞれＡｓｎで置換された「ＬＡＬＡ－ＤＮＰＡバリアント」及び「ＦＡＬＡ－ＤＮＰＡバリアント」も本開示に包含されることを理解されたい。
【0038】
位置２３４、２３５、及び２６５（及び任意選択により位置３２９）において上述の特定のアミノ酸置換（変異）を導入する前のＣＨ２ドメインは、本明細書において「親ＣＨ２ドメイン」と称される。親ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体の野生型ＣＨ２ドメインであり得るが、これらに限定されない。例えば、上述の特定のアミノ酸置換を導入する前に、ＣＨ２ドメインにアミノ酸修飾（複数可）が既に含まれている場合、「親ＣＨ２ドメイン」は、そのような先の修飾（複数可）を含むＣＨ２ドメインを意味する。
【0039】
同様に、上述の「親ＣＨ２ドメイン」を含むＦｃ領域は、本明細書において「親Ｆｃ領域」と称され、上述の「親ＣＨ２ドメイン」または「親Ｆｃ領域」を含むポリペプチドは、本明細書において「親ポリペプチド」と称される。親ポリペプチドは、典型的に、本開示のバリアントＣＨ２ドメインの代わりに親ＣＨ２ドメインを含むということを除き、本開示によるポリペプチドと同一または同等であるポリペプチドを指すが、これに限定されない。
【0040】
本開示によるポリペプチドは、親ＣＨ２ドメイン（複数可）に上述の特定のアミノ酸置換が導入されたバリアントＦｃ領域を含む。上記のとおり、１つのＦｃ領域には２つのＣＨ２ドメインが存在するので、バリアントＦｃ領域のアミノ酸置換は、２つの親ＣＨ２ドメインの一方にのみ導入されてもよいし、両方の親ＣＨ２ドメインに導入されてもよい。加えて、アミノ酸置換が両方の親ＣＨ２ドメインに導入される場合、同じアミノ酸置換が導入されてもよいし、異なるアミノ酸置換が導入されてもよい。例えば、バリアントＦｃ領域の２つのバリアントＣＨ２ドメインの一方がアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇを含み、他方がアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎを含んでもよい。あるいは、バリアントＦｃ領域の２つのバリアントＣＨ２ドメインの一方がアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇを含み、他方がアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａを含んでもよい。他の組み合わせも可能であり、本開示に包含される。Ｆｃ領域の２つのＣＨ２ドメインに同じアミノ酸置換が導入される場合、ドメイン及びＦｃ領域は、「ホモ二量体化」によって形成される「ホモ二量体」と称され得、Ｆｃ領域の２つのＣＨ２ドメインに異なるアミノ酸置換が導入される場合、ドメイン及びＦｃ領域は、「ヘテロ二量体化」によって形成される「ヘテロ二量体」と称され得る。「ヘテロ二量体化」は、「ノブ・イントゥー・ホール」技術（国際公開番号ＷＯ９６／０２７０１１）、「静電的ステアリング」（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５：１９６３７－４６（２０１０））、ストランド交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術（Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３（４）：１９５－２０２（２０１０））、Ｆａｂアーム交換（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１０（１３）：５１４５－５０（２０１３））ならびに国際公開番号ＷＯ２０１２／０５８７６８及びＷＯ２０１３／０６３７０２に記載されている正及び負の設計戦略を組み合わせて安定した非対称修飾のＦｃ領域を得るアプローチなどの様々な既知の技術を使用して達成することができる。更に、本開示のポリペプチドが複数の抗体を含む場合、抗体の少なくとも１つは、少なくとも１つのバリアントＣＨ２ドメインを含むものとする。更に、いくつかの実施形態において、バリアントＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの一方がＩｇＧ１抗体に由来するＣＨ２ドメインであり、他方がＩｇＧ４抗体に由来するＣＨ２ドメインであってもよい。あるいは、いくつかの実施形態において、バリアントＦｃ領域の両方のＣＨ２ドメインがＩｇＧ１抗体由来であってもよいし、両方がＩｇＧ４抗体由来であってもよい。
【0041】
一実施形態において、親ＣＨ２ドメインにアミノ酸置換ＬＡＬＡ－ＤＧ、ＬＡＬＡ－ＤＮまたはＬＡＬＡ－ＤＧＰＡが導入されたバリアントＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメイン、すなわち、位置２３４、２３５、及び２６５（及び任意選択により位置３２９）において上述の特定のアミノ酸置換を導入する前のＣＨ２ドメインと比較して、改善された熱安定性を有する。更なる実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメインと比較して、同等または改善された熱安定性を有する。別の実施形態において、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＡｌａ、Ａｌａ及びＧｌｙであるバリアントＣＨ２ドメイン、ならびに位置２３４、２３５、２６５、及び３２９（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＡｌａ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、及びＡｌａであるバリアントＣＨ２ドメインは、それぞれの親ＣＨ２ドメインと比較して、同等の熱安定性を有する。別の実施形態において、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＡｌａ、Ａｌａ及びＡｓｎであるバリアントＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＬｅｕ、Ｌｅｕ及びＡｓｐである親ＣＨ２ドメインと比較して、同等の熱安定性を有する。
【0042】
本明細書で使用される「熱安定性」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）によって決定される。熱変性中点温度（Ｔｍ）は、例えば、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）またはＤＳＦ（示差走査蛍光測定）によって測定され得る。
【0043】
一実施形態において、熱変性中点温度（Ｔｍ）は、昇温に伴う熱容量の変化を観察するＤＳＣ測定によって決定され得る。例えば、本開示によるポリペプチドの熱変性中点温度（Ｔｍ）の測定において、ＣＨ２ドメインの熱安定性の評価は、ＩｇＧ抗体、すなわち、Ｆｃ領域（すなわち、ヒンジ部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む二量体）及びＦａｂ領域を含む抗体を作製し、次いで、ＤＳＣによって抗体の熱安定性を評価することによって実施され得る（例えば、本明細書の実施例のセクションを参照）。ＩｇＧ抗体のＤＳＣ分析を実施すると、一般に、ＣＨ２ドメイン、Ｆａｂ領域、及びＣＨ３ドメインの順に、昇温に伴う熱変性のピークが観察される。本開示において、熱変性中点温度（Ｔｍ）は、熱変性のピーク温度によって決定し、これを使用して熱安定性を評価した。
【0044】
ＤＳＣによってＴｍを測定するための具体的な手順の例は、次のとおりである。まず、本開示によるポリペプチドの溶液（一般に０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）をヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、ＴＢＳなどで調製し、次いで、ポリペプチドの溶液をＤＳＣ機器の測定パンに入れる。その後、一定の昇温速度で温度を上げ、ＣＨ２ドメインの吸熱ピークを観察し、それに基づいてＴｍ値を決定する。親ポリペプチドのＤＳＣ測定を同様の方法で実施して親ポリペプチドのＴｍを決定し、次いで、本開示のポリペプチドと親ポリペプチドのＴｍ値の差（ΔＴｍ）を決定することができる。当該技術分野において一般的に使用されるＤＳＣ測定機器、例えば、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）などを使用することができる。一実施形態において、ポリペプチドの熱安定性は、本明細書の実施例５、１１または１４に記載される方法を利用して決定され得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「改善された熱安定性」とは、バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が参照ＣＨ２ドメイン（例えば、親ＣＨ２ドメイン）の熱変性中点温度（Ｔｍ）より１℃以上高いことを意味する。本明細書で使用される場合、「同等の熱安定性」とは、バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が参照ＣＨ２ドメイン（例えば、親ＣＨ２ドメイン）より１℃高くもなく１℃低くもない（すなわち、（±）１℃以内）ことを意味する。一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインがＬＡＬＡ－ＤＧバリアントである場合、Ｔｍは、野生型Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインより３℃以上または４℃以上高く、ＬＡＬＡバリアント（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の位置２３４及び２３５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基がそれぞれＡｌａ及びＡｌａであるバリアント）のＣＨ２ドメインより３℃以上高い。したがって、一実施形態において、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの熱安定性は、野生型ＣＨ２ドメインとＬＡＬＡ変異体のＣＨ２ドメインのいずれに対しても改善され、ＬＡＬＡ変異体とＬＡＬＡ－ＤＧバリアントは、位置２６５における追加の置換が１つだけ異なっている。一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメインより約０．１℃、０．５℃、１℃またはそれより高いＴｍを有する。一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメインより約１．５℃、２℃、２．５℃、３℃またはそれより高いＴｍを有する。一実施形態において、バリアントＣＨ２ドメインは、親ＣＨ２ドメインより約３．５℃、４℃、４．５℃、５℃またはそれより高いＴｍを有する。上記のとおり、位置２３４、２３５、及び２６５（任意選択により位置３２９）における特定のアミノ酸置換に加えて、他の追加のアミノ酸修飾（複数可）（欠失（複数可）、付加（複数可）、置換（複数可）など）がバリアントＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインに導入されてもよい。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定される値の±１０％を指す。
【0046】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合親和性が低下または減弱している。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合親和性が低下または減弱しており、それにより、ポリペプチドのエフェクター機能が親ポリペプチドと比較して低下している。特に指定のない限り、本明細書で使用される「結合親和性」及び「結合活性」は、同じ意味を有する。「Ｆｃγ受容体」（Ｆｃガンマ受容体またはＦｃγＲとも称される）という用語は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合することが可能な受容体を指す。ＦｃγＲは、ヒト、サル、またはラットなどの哺乳動物に由来し得る。一実施形態において、ＦｃγＲは、ヒトＦｃγＲまたはカニクイザルＦｃγＲである。一実施形態において、ＦｃγＲは、ヒトＦｃγＲである。ヒト受容体ファミリーには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含む）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）（アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１（Ｈ型）及びＲ１３１（Ｒ型）を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃ（ＦｃγＲＩＩｃを含む）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）、ＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ２を含む）、及びＦｃγＲＩＩＩｃ）が含まれるが、これらに限定されない。カニクイザルＦｃγ受容体ファミリーには、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩｂを除く、上記のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩ（それらのアイソフォームを含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲ受容体には、受容体のアレルバリアント及び選択的にスプライシングされた形態も含まれ得る。本明細書で使用される場合、「ＦｃγＲに対する結合親和性が低下している」とは、上記のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩの９つのアイソフォームのうちの少なくとも１つに対する活性が低下し得ることを意味し、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または全てのＦｃγＲアイソフォームに対する結合親和性が低下し得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ以上に対する結合が低下している。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合が低下している。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及び／またはＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及び／またはＦｃγＲＩＩＩ、またはカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及び／またはＦｃγＲＩＩＩであり得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つ以上に対する結合が低下している。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合が低下している。ヒト及びカニクイザル由来のＦｃγ受容体としては、本明細書の比較例及び実施例に開示される受容体を例示することができるが、これらに限定されない。
【0047】
本明細書で使用される「エフェクター機能」という用語は抗体のＦｃ領域に起因するまたはそれによって媒介される生物学的活性を指す。エフェクター機能には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、Ｆｃ受容体結合、Ｃ１ｑ結合、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びサイトカインの産生が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、位置２３４、２３５、及び２６５（及び任意選択により位置３２９）における上述の特定のアミノ酸置換によってエフェクター機能が低下し得、ここで、エフェクター機能は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性、Ｆｃ受容体結合、Ｃ１ｑ結合、細胞表面受容体の下方制御、または過剰なサイトカイン産生のうちの１つ以上であり、エフェクター機能が不要な医薬用途に有用であり得る。エフェクター機能を低下させるアミノ酸修飾は、本明細書において「エフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」と称され得る。エフェクター機能は、本明細書で開示されるものなどのＦｃγ受容体に対する結合親和性の測定と同様に、当該技術分野において知られているアッセイを使用して評価することができる。
【0048】
「Ｆｃγ受容体に対する結合親和性」は、既知の方法によって測定することができ、例えば、リガンドとアナライトとの相互作用を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定することができる。この測定は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲシステム（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して行うことができる。より具体的には、この方法では、各Ｈｉｓタグ付きＦｃγＲをリガンドとしてセンサーチップ上に直接固定化するか、センサーチップ上の抗Ｈｉｓタグ抗体で捕捉することによって固定化し、次いで、本開示のポリペプチドをアナライトとしてセンサーチップに添加する。添加したアナライトが固定化したリガンドに結合すると、固定化したリガンド分子のみかけの質量が増加する。センサーチップ表面の溶媒の屈折率の変化に依存するＳＰＲシグナルの位置シフトの量を測定する。このシフト量に基づいて、リガンド（ＦｃγＲ）に結合したアナライト（抗体）の量を結合応答の値（レゾナンスユニット、ＲＵ）として決定する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３（１１）：４００５－４０１０（２００６）などを参照）。代替的または付加的に、Ｆｃγ受容体に対する結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどによって測定することができる。一実施形態において、「Ｆｃγ受容体に対する結合親和性」は、本明細書の実施例１～４、９～１０、１２または１３に記載される方法を使用して決定することができる。
【0049】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃγ受容体に対する結合親和性が低下または減弱している」とは、Ｆｃγ受容体に対する本開示によるポリペプチドの結合親和性が、同じアッセイで決定したとき、同じＦｃγ受容体に対する参照ポリペプチド（例えば、親ポリペプチド）の結合親和性よりも低いことを意味する。結合親和性の低下または減弱は、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって決定される少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する本開示によるポリペプチドのＲＵ値が、同じアッセイによって決定される同じＦｃγ受容体に対する参照ポリペプチド（例えば、親ポリペプチド）のＲＵ値と比較して低下しているかどうかを測定することによって、決定され得る。一実施形態において、エフェクター機能を効果的に低下させるために、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドのＦｃγ受容体に対する結合親和性を１００％とみなした場合、同じＦｃγ受容体に対する本開示によるポリペプチドの結合親和性は、８０％未満、７０％未満または６０％未満に低下する。一実施形態において、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドのＦｃγ受容体に対する結合親和性を１００％とみなした場合、同じＦｃγ受容体に対する本開示によるポリペプチドの結合親和性は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満に低下する。一実施形態において、親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドのＦｃγ受容体に対する結合親和性を１００％とみなした場合、同じＦｃγ受容体に対する本開示によるポリペプチドの結合親和性は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満または０．１％未満に低下する。
【0050】
当該技術分野で知られているように、抗体の様々な領域（Ｆｃ領域を含む）のアミノ酸置換により、抗体の抗原結合活性が低下し得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して「抗原結合活性」の有意な低下を示さない。ポリペプチドの抗原結合活性は、既知の方法、例えば、ＳＰＲ法によって測定することができる（例えば、本明細書の実施例６に記載の方法を参照）。
【0051】
また、当該技術分野で知られているように、抗体の様々な領域（Ｆｃ領域を含む）のアミノ酸置換により、抗体の血中半減期が低下し得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して「血中半減期」の有意な低下を示さない。ポリペプチドの血中半減期は、既知の方法によって、例えば、本明細書の実施例８に記載される方法を使用して決定することができる。抗体またはその機能性断片の血中半減期は、化学修飾によって、例えば、ポリマーへの共有結合によって、延ばすことができる。
【0052】
また、当該技術分野で知られているように、胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する抗体の結合活性は、抗体の様々な領域（Ｆｃ領域を含む）のアミノ酸置換によって低下し得る。一実施形態において、上述の血中半減期に関して、本開示のポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して「胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合活性」の有意な低下を示さない。当該技術分野で知られているように、抗体は、投与されると、飲作用により、一定の速度で血管内皮細胞などに非特異的に取り込まれる。抗体は、低ｐＨ（約ｐＨ６．０）のエンドソーム内でＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎを介して細胞外に輸送されるため、リソソーム移行及び抗体の分解を回避することができる。したがって、ＦｃＲｎへの抗体の結合は、抗体の血中半減期を長くすることに寄与する。ＦｃＲｎに対するポリペプチドの結合活性は、既知の方法、例えば、バイオレイヤー干渉法によって測定することができる（例えば、本明細書の実施例７に記載の方法を参照）。
【0053】
抗体及びその機能性断片
一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、抗体またはその断片（例えば、機能性断片）であり得る。「抗体」は、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含み、一般に、重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域、及び軽鎖定常領域を含む、分子（免疫グロブリン）である。「抗体」は、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、その機能性断片、またはその修飾体のいずれか１つであり得る。抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、マウス、ラクダ、ラマ、サメ、ウサギなどを含む、様々な種に由来し得る。一実施形態において、抗体は、ヒトまたはカニクイザルに由来する。一実施形態において、抗体は、ヒト由来である。一実施形態において、抗体が非ヒト種に由来する場合、抗体は、よく知られている技術を使用してキメラ化またはヒト化される。一実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、抗体またはその断片（例えば、機能性断片）であり得る。「抗体」は、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含み、一般に、重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域、及び軽鎖定常領域を含む、分子（免疫グロブリン）である。「抗体」は、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、その機能性断片、またはその修飾体のいずれか１つであり得る。抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、マウス、ラクダ、ラマ、サメ、ウサギなどを含む、様々な種に由来し得る。一実施形態において、抗体は、ヒトまたはカニクイザルに由来する。一実施形態において、抗体は、ヒト由来である。一実施形態において、抗体が非ヒト種に由来する場合、抗体は、よく知られている技術を使用してキメラ化またはヒト化される。一実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。
【0054】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、「抗体の機能性断片」であり得、この断片は、上述の特定のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域を含む。「抗体の抗原結合断片」とも称される「抗体の機能性断片」は、抗原結合活性を有する抗体の部分断片を意味し、線状抗体断片（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号参照）及び多重特異性抗体断片を含むが、これらに限定されない。抗原結合断片は、全長抗体分子を適切な酵素で処理することによって生成される断片、及び遺伝子操作された抗体遺伝子を使用して適切な宿主細胞で産生されるタンパク質（すなわち、組み換えタンパク質）を含む。機能性断片はまた、例えば、ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域によく保存されているＮ結合型糖鎖による修飾を受けるアスパラギン（Ａｓｎ２９７）及び隣接するアミノ酸を含む、抗原結合断片も含む。
【0055】
一実施形態において、ポリペプチドは、「二重特異性抗体」または「多重特異性抗体」であり得る。多重特異性抗体は、複数の抗原結合ドメインを含む抗体であり得、各抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。二重特異性抗体は、２つの抗原結合ドメインを含む抗体であり、各抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。これらのいずれの場合も、アミノ酸置換は、抗体Ｆｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの一方または両方に含まれ得、両方に含まれる場合は、同じアミノ酸置換が含まれてもよいし、異なるアミノ酸置換が含まれてもよい。あるいは、多重特異性抗体は、それぞれ異なる抗原結合ドメインを有する複数の抗体が互いに結合している人工タンパク質であり得、二重特異性抗体は、異なる抗原結合ドメインを有する２つの抗体が互いに結合している人工タンパク質であり得る。これらの場合において、アミノ酸置換は、複数の抗体のうちの少なくとも１つの抗体のＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの一方または両方に含まれ得、両方に含まれる場合は、同じアミノ酸置換が含まれてもよいし、異なるアミノ酸置換が含まれてもよい。２つのＣＨ２ドメインに異なるアミノ酸置換を導入することは、２つの異なる重鎖（ヘテロ二量体）から抗体分子を作製することができる技術、例えば、「ノブ・イントゥー・ホール」技術（国際公開番号ＷＯ１９９８／０５０４３１）、「静電的ステアリング」（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５：１９６３７－４６（２０１０））、ストランド交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術（Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３（４）：１９５－２０２（２０１０））、または国際公開番号ＷＯ２０１２／０５８７６８及びＷＯ２０１３／０６３７０２に記載されている技術を使用することによって、実施することができる。二重特異性抗体または多重特異性抗体は、全長抗体またはその断片として作製することもできる（例えば、国際公開番号ＷＯ９６／１６６７３、及び米国特許第５，８３７，２３４号参照）。二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアを共発現させる方法（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３）参照）；抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）、及び当該技術分野において知られている他の方法がある。
【0056】
一実施形態において、抗体は、「キメラ抗体」であり得る。「キメラ抗体」とは、ある抗体に由来する１つ以上の領域と、１つ以上の他の抗体に由来する１つ以上の領域とを含む抗体を意味する。例えば、Ｆｃ配列は、ヒト抗体に由来し得、可変領域配列は、カニクイザルなどの非ヒト種抗体に由来し得る。
【0057】
一実施形態において、抗体は、「ヒト抗体」であり得る。「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態において、抗体の全ての可変ドメイン及び定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（「完全ヒト抗体」と称される）。これらの抗体は、ヒト重鎖及び／または軽鎖をコードする遺伝子から生じる抗体を発現するように遺伝子改変された非ヒト動物の免疫付与などの様々な方法で調製することができる。
【0058】
一実施形態において、抗体は、「ヒト化抗体」であり得る。「ヒト化抗体」は、非ヒト種で産生される抗体の抗原結合部位（１つ以上のＣＤＲなど）をヒト抗体の配列に挿入することによって作製される抗体である。ヒト化抗体には、超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性などを有する非ヒト動物の超可変領域に由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン、またはヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンが含まれる。ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されたとき、非ヒト種由来の抗体と比較して免疫応答を惹起する可能性が低く、及び／または重度の免疫応答を誘導する可能性が低い。
【0059】
一実施形態において、抗体は、「一本鎖抗体」であり得る。「一本鎖抗体」は、本来二本鎖である重鎖を、一本鎖を形成するようにリンカーによって接続した抗体を指す（例えば、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１７：２４－３１（２０１７）参照）。したがって、一本鎖抗体もまた、２つのＣＨドメインを含み、上記の特定のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインの一方または両方に導入され得る。
【0060】
一般に、抗体は、当該技術分野で一般に実施されている方法を使用して、抗原として機能するポリペプチドで動物を免疫し、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される抗体を回収及び精製することによって、得ることができる。抗原の起源はヒトに限定されず、カニクイザル、マウス、ラットなどの非ヒト動物に由来する抗原を使用して動物を免疫し、抗体を産生することもできる。抗原は、様々な抗原、例えば、サイトカイン、可溶性もしくは不溶性因子、病原体上に発現する分子、細胞上に発現する分子、またはがん細胞上に発現する分子のうちの１つであり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原である。モノクローナル抗体は、例えば、既知の方法を使用して、ミエローマ細胞を抗体産生細胞と融合させてハイブリドーマを樹立することによって得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）、Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）参照）。他の方法も当該技術分野において知られている。ヒト疾患に適用可能な抗体は、得られた異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差反応を試験することによって選択することもできる。
【0061】
培養した哺乳動物細胞で産生される抗体では、重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失し（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また重鎖カルボキシル末端のグリシン及びリジンの２つのアミノ酸残基も欠失し、カルボキシル末端に位置するプロリン残基が新たにアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかしながら、これらの重鎖配列の欠失または修飾は、抗体の抗原への結合または抗体のエフェクター機能（補体活性化及び抗体依存性細胞傷害など）の能力に影響しない。したがって、本開示による抗体には、そのような欠失または修飾を受けた抗体及びそのような抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸が欠失した欠失を有する抗体、及び欠失を有するアミド化抗体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖及びカルボキシル末端のリジン残基が欠けている重鎖）なども含まれる。しかしながら、抗原結合能力及びエフェクター機能の低下が維持される限り、抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失は、上の例に限定されない。抗体を構成する２つの重鎖は、全長抗体、上記の欠失を有する抗体、または両方の組み合わせの重鎖のいずれか１つに由来するものであり得る。それぞれの欠失の比率は、抗体を産生する培養された哺乳動物細胞の種類及び培養条件によって影響を受け得るが、一実施形態において、抗体は、２つの重鎖の両方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失したものである。
【0062】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドが抗体である場合、抗体は、腫瘍細胞または免疫細胞を標的とする抗体である。一実施形態において、抗体は、腫瘍細胞を標的とする抗体である。一実施形態において、ポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する抗体またはその機能性断片である。一実施形態において、ポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、抗体は、次の特徴のうちの１つ以上を有する：腫瘍細胞を認識可能であること、腫瘍細胞に結合可能であること、腫瘍細胞に取り込まれて内在化することが可能であること、及び／または腫瘍細胞に損傷を与えること。
【0063】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、抗体は、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＬＰＳ抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗テネイシン－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗メソテリン抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＤＲ５抗体であり得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、抗体は、抗ＣＤ７０抗体、抗ＬＰＳ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体であり得る。そのような抗体は、既知の方法によって調製されている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）；Ｎａｔｕｒｅ ３２１１：５２２－５２５（１９８６）、及び国際公開番号ＷＯ９０／０７８６１参照）。抗ＣＤ７０抗体（国際公開番号ＷＯ２００４／０７３６５６及びＷＯ２００７／０３８６３７）、抗ＬＰＳ抗体（国際公開番号ＷＯ２０１５／０４６５０５及びＷＯ２０１９／０６５９６４）、及び抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開番号ＷＯ１９９８／０５０４３３及びＷＯ２００２／０９２７７１）についても参照されたい。
【0064】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、抗体は、パニツムマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ピジリズマブ、モガムリズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、タボリキシズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、バルリルマブ、ボルセツズマブ、またはＯ１１－１１１１であり得る。一実施形態において、本開示によるポリペプチドが腫瘍細胞を標的とする抗体である場合、抗体は、パニツムマブ、ボルセツズマブ、またはＯ１１－１１１１であり得る。
【0065】
一実施形態において、本開示によるポリペプチドは、腫瘍細胞を標的とする抗体であり得、更に、例えば、炎症性疾患、免疫疾患、感染症などの治療、または再生医療などに使用され得る。
【0066】
加えて、いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、例えば、一価抗体、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）、トリオマブ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ミニ抗体、二重親和性再標的化分子（Ｆｃ－ＤＡＲＴまたはＩｇ－ＤＡＲＴ）、ＬＵＺ－Ｙ抗体、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ抗体、二重標的化（ＤＴ）Ｉｇ抗体、ツーインワン抗体、架橋型Ｍａｂ、ｍＡｂ２、ＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ、Ｔｓ２Ａｂ、ＢｓＡｂ、ＨＥＲＣＵＬＥＳ抗体、ＴｖＡｂ、またはＳＣＯＲＰＩＯＮであり得る。
【0067】
融合タンパク質
本開示の特定の実施形態は、別のタンパク質またはポリペプチド（「異種」タンパク質またはポリペプチド）に融合された、バリアントＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドもしくは抗体部分を含む、「融合タンパク質」に関する。様々な異種タンパク質またはポリペプチドを、組み換え技術を使用してバリアントＦｃ領域、ポリペプチドまたは抗体部分に融合させて、融合タンパク質を作製することができる。例としては、受容体またはその標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、免疫サイトカイン、非免疫グロブリンタンパク質、ケモカイン、様々なタンパク質ドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、他の目的のタンパク質には、融合タンパク質を治療標的に誘導する治療剤が含まれ、そのような標的は、標的に結合する受容体タンパク質などの疾患に関連する分子であり得る。標的に結合する受容体タンパク質を含む融合タンパク質の例としては、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合体、ＴＮＦＲ－Ｆｃ融合体、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合体などが挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質はまた、ｓｃＦｖを含み得、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにＦｃ領域を融合させることによって構築することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。「融合タンパク質」は、上述の「本開示によるポリペプチドを含む分子」の一実施形態であることが理解される。
本開示の特定の実施形態は、別のタンパク質またはポリペプチド（「異種」タンパク質またはポリペプチド）に融合された、バリアントＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドもしくは抗体部分を含む、「融合タンパク質」に関する。様々な異種タンパク質またはポリペプチドを、組み換え技術を使用してバリアントＦｃ領域、ポリペプチドまたは抗体部分に融合させて、融合タンパク質を作製することができる。例としては、受容体またはその標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、免疫サイトカイン、非免疫グロブリンタンパク質、ケモカイン、様々なタンパク質ドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、他の目的のタンパク質には、融合タンパク質を治療標的に誘導する治療剤が含まれ、そのような標的は、標的に結合する受容体タンパク質などの疾患に関連する分子であり得る。標的に結合する受容体タンパク質を含む融合タンパク質の例としては、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合体、ＴＮＦＲ－Ｆｃ融合体、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合体などが挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質はまた、ｓｃＦｖを含み得、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにＦｃ領域を融合させることによって構築することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。「融合タンパク質」は、上述の「本開示によるポリペプチドを含む分子」の一実施形態であることが理解される。
【0068】
ポリペプチド－薬物コンジュゲート
本開示の特定の実施形態は、本開示によるポリペプチドが１つ以上の薬物または修飾剤にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関する。一実施形態において、本開示によるポリペプチド－薬物コンジュゲートは、修飾された抗体を包含する。例えば、抗体は、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、または様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーにコンジュゲートされ得る。ポリペプチドが薬物とポリマー（修飾剤）の両方にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートもまた、特定の実施形態に包含される。
本開示の特定の実施形態は、本開示によるポリペプチドが１つ以上の薬物または修飾剤にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートに関する。一実施形態において、本開示によるポリペプチド－薬物コンジュゲートは、修飾された抗体を包含する。例えば、抗体は、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、または様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーにコンジュゲートされ得る。ポリペプチドが薬物とポリマー（修飾剤）の両方にコンジュゲートされたポリペプチド－薬物コンジュゲートもまた、特定の実施形態に包含される。
【0069】
ポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ポリペプチドを薬物または修飾剤にリンカーを介してコンジュゲートさせることによって調製され得る。リンカーは、典型的に、抗体上の１つまたは複数の標的基と反応することが可能な官能基と、薬物または修飾剤上の標的基と反応することが可能な１つ以上の官能基とを含む。好適な官能基及びリンカーは、当該技術分野において知られており、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）及びＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄｕｃｒｙ（Ｅｄ．），２０１３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）に記載のものが含まれる。
【0070】
医薬組成物
特定の実施形態において、ポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物で提供され得る。薬学的に許容される担体には、賦形剤、不活性希釈剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、着色剤、保存剤、水性ビヒクル及び溶媒、油性ビヒクル及び溶媒、界面活性剤、分散剤、甘味料、香料、乳化剤、滑沢剤、緩衝剤、増粘剤、充填剤、抗酸化剤、安定剤などが含まれる。好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野において知られており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（旧“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
特定の実施形態において、ポリペプチド、当該ポリペプチドを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物で提供され得る。薬学的に許容される担体には、賦形剤、不活性希釈剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、着色剤、保存剤、水性ビヒクル及び溶媒、油性ビヒクル及び溶媒、界面活性剤、分散剤、甘味料、香料、乳化剤、滑沢剤、緩衝剤、増粘剤、充填剤、抗酸化剤、安定剤などが含まれる。好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野において知られており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（旧“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【0071】
一実施形態において、上記の医薬組成物はまた、１つ以上の他の「治療剤」を含んでもよいし、１つ以上の他の「治療剤」と組み合わせて使用または投与されてもよい。例えば、がん治療の目的に使用される場合、がん治療のための他の治療剤の例としては、アブラキサン、カルボプラチン、シスプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、パクリタキセル、ペメトレキセド、ソラフェニブ、ビンブラスチンまたは国際公開番号ＷＯ２００３／０３８０４３に記載の薬物、及びＬＨ－ＲＨ類似体（リュープロレリン、ゴセレリンなど）、エストラムスチンリン酸エステル、エストロゲンアンタゴニスト（タモキシフェン、ラロキシフェンなど）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタンなど）、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ、イピリムマブなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物の投与経路には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下経路を介した投与が含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤と組み合わせる場合、医薬組成物及び１つ以上の他の治療剤は、単一の組成物としてまたは別々のいずれかで、同時にまたは異なる時点で使用または投与することができる。
【0072】
使用方法
特定の実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトの治療のための方法に使用することができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、がんもしくは腫瘍、免疫疾患、炎症性疾患または感染症の治療に使用することができる。一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトにおける診断方法に使用することができる。一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトにおける腫瘍またはがんの治療のために使用することができる。腫瘍疾患及びがんには、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、黒色腫、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮体癌、精巣癌、子宮頸癌、胎盤絨毛癌、多形膠芽腫、脳腫瘍、頭頸部癌、甲状腺癌、中皮腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆嚢癌、胆管癌、副腎癌、扁平上皮癌、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫または肉腫などが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトの治療のための方法に使用することができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、がんもしくは腫瘍、免疫疾患、炎症性疾患または感染症の治療に使用することができる。一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトにおける診断方法に使用することができる。一実施形態において、ポリペプチド、それを含む分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲートは、ヒトにおける腫瘍またはがんの治療のために使用することができる。腫瘍疾患及びがんには、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、黒色腫、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮体癌、精巣癌、子宮頸癌、胎盤絨毛癌、多形膠芽腫、脳腫瘍、頭頸部癌、甲状腺癌、中皮腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆嚢癌、胆管癌、副腎癌、扁平上皮癌、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫または肉腫などが含まれるが、これらに限定されない。
【0073】
追加のアミノ酸修飾
上記の特定のアミノ酸置換（複数可）（例えば、ＬＡＬＡ－ＤＧ、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ、及びＬＡＬＡ－ＤＮ変異）に加えて、ポリペプチドは、Ｆｃ領域に追加のアミノ酸修飾（複数可）を含み得る。したがって、本開示によるポリペプチドの「バリアントＦｃ領域」もまた同様に、上記の特定のアミノ酸置換（例えば、ＬＡＬＡ－ＤＧ、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ、及びＬＡＬＡ－ＤＮ）に加えて、Ｆｃ領域に追加のアミノ酸修飾（複数可）を含み得る。追加のアミノ酸修飾は、ポリペプチドのＦｃ領域だけでなく、ポリペプチドの１つ以上の他の領域に対して行われてもよい。
上記の特定のアミノ酸置換（複数可）（例えば、ＬＡＬＡ－ＤＧ、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ、及びＬＡＬＡ－ＤＮ変異）に加えて、ポリペプチドは、Ｆｃ領域に追加のアミノ酸修飾（複数可）を含み得る。したがって、本開示によるポリペプチドの「バリアントＦｃ領域」もまた同様に、上記の特定のアミノ酸置換（例えば、ＬＡＬＡ－ＤＧ、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ、及びＬＡＬＡ－ＤＮ）に加えて、Ｆｃ領域に追加のアミノ酸修飾（複数可）を含み得る。追加のアミノ酸修飾は、ポリペプチドのＦｃ領域だけでなく、ポリペプチドの１つ以上の他の領域に対して行われてもよい。
【0074】
「アミノ酸修飾」は、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、修飾などを指し、当該技術分野において知られている様々な方法によって行うことができる。例えば、限定するものではないが、アミノ酸置換、付加、欠失、及び挿入は、よく知られている任意のＰＣＲベースの技術を使用して行うことができ、アミノ酸置換は、部位特異的変異導入によって行うことができる（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７－６５００（１９８２）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２：４８８（１９８５）参照）。アミノ酸の「修飾」の例としては、糖鎖の付加または欠失が挙げられる。
【0075】
一実施形態において、アミノ酸置換（複数可）は、「保存的アミノ酸置換（複数可）」であり得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖基を有する別のアミノ酸残基によって置換されていることを意味し、一般に、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させないものである。保存的アミノ酸置換の例は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、次のうちの１つ以上：酸性残基：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性残基：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；親水性無電荷残基：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；脂肪族無電荷残基：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；非極性無電荷残基：Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、及び芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐで表されるアミノ酸のクラス内で置換を行うことによってなされ得る。
【0076】
追加のアミノ酸修飾（複数可）は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、約２０個以下、約１０個以下、または約１～約５個のアミノ酸修飾であり得る。追加のアミノ酸修飾（複数可）が野生型配列（例えば、野生型Ｆｃ領域の配列）に対して行われる場合、バリアント配列の配列（例えば、バリアントＦｃ領域）は、対応する野生型配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の相同性を有することが好ましい。一実施形態において、バリアント配列の配列（例えば、バリアントＦｃ領域）は、対応する野生型配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。ポリペプチドの配列類似性または同一性は、既知の配列解析ソフトウエア（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ）を使用して測定することができる。
【0077】
追加のアミノ酸修飾の例としては、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｒ、Ｐ２３８Ｉ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｑ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｋ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｙ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｗ、Ｅ２６９Ａ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｄ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｔ及びＥ２６９Ｈ（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）などのアミノ酸置換が挙げられ、これらは、国際公開番号ＷＯ２０１３／１１８８５８に記載されているように、抗体ＦｃのＴｍを親ポリペプチドよりも増加させることが示されている。
【0078】
一実施形態において、Ｆｃγ受容体結合活性を更に低下させるアミノ酸置換が使用され得る。Ｆｃγ受容体に対する結合活性を低下させる追加のアミノ酸置換の例としては、国際公開番号ＷＯ２０１１／１２０１３４に示されるように、例えば、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２３９Ｅ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７／Ａ３２７／Ａ３３０Ｉ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）などのアミノ酸置換が挙げられる。
【0079】
一実施形態において、追加のアミノ酸修飾には、タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、酸化に対する感受性を低下させる置換、結合親和性を変化させてタンパク質複合体を形成するための置換、そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与または変更する置換、脱アミド反応を抑制する修飾などが含まれる。
【0080】
調製方法
本開示のポリペプチドは、当該技術分野において知られている組み換えタンパク質法によって調製され得る。以下の方法に限定されるものではないが、本開示によるポリペプチドは、次のステップを含む方法によって得ることができる：まず、上記のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを設計すること、次いで、ＤＮＡを化学合成し、ＤＮＡをベクターなどに挿入すること、続いて、ＤＮＡ／ベクターを宿主細胞に導入すること、ポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及び培地または細胞からポリペプチドを回収すること。バリアントＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターは、例えば、野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチドに適切な変異を、例えば、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｔｏｙｏｂｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を製造者の説明書に従って使用して導入することによって、調製することができる。ポリペプチドが上記以外の他の目的のアミノ酸修飾（例えば、付加、欠失、置換など）を含む場合、上記のバリアントＦｃ領域の特定のアミノ酸置換及び他の目的のアミノ酸修飾（複数可）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計し、上記と同じ方法でポリペプチドを得ることができる。加えて、本開示のポリペプチドは、組み換え法に加えて、ペプチド合成、化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳などによって調製することもできる。
本開示のポリペプチドは、当該技術分野において知られている組み換えタンパク質法によって調製され得る。以下の方法に限定されるものではないが、本開示によるポリペプチドは、次のステップを含む方法によって得ることができる：まず、上記のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを設計すること、次いで、ＤＮＡを化学合成し、ＤＮＡをベクターなどに挿入すること、続いて、ＤＮＡ／ベクターを宿主細胞に導入すること、ポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及び培地または細胞からポリペプチドを回収すること。バリアントＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターは、例えば、野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチドに適切な変異を、例えば、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｔｏｙｏｂｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を製造者の説明書に従って使用して導入することによって、調製することができる。ポリペプチドが上記以外の他の目的のアミノ酸修飾（例えば、付加、欠失、置換など）を含む場合、上記のバリアントＦｃ領域の特定のアミノ酸置換及び他の目的のアミノ酸修飾（複数可）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計し、上記と同じ方法でポリペプチドを得ることができる。加えて、本開示のポリペプチドは、組み換え法に加えて、ペプチド合成、化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳などによって調製することもできる。
【0081】
したがって、一実施形態において、本開示は、上記のバリアントＦｃ領域またはその一部、例えば、重鎖または軽鎖を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一実施形態において、本開示は、当該核酸を含むベクターに関する。一実施形態において、本開示は、上に記載されるバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞に関する。一実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドを産生するための方法であって、例えば、当該バリアントＦｃ領域またはそれを含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、バリアントＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドの発現に好適な条件下で培地中で培養するステップと、培地または細胞からバリアントＦｃ領域またはポリペプチドを回収するステップとを含む、方法に関する。
【0082】
実施形態
本開示の例示的な非限定的実施形態には、以下が含まれる。
本開示の例示的な非限定的実施形態には、以下が含まれる。
【0083】
［１］１つ以上のバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、前記バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、前記バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中の前記ＣＨ２ドメインの一方または両方は、バリアントＣＨ２ドメイン（複数可）であり、前記バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＧｌｙである、前記ポリペプチド。
【0084】
［２］前記バリアントＣＨ２ドメインの位置３２９のアミノ酸残基がＡｌａである、［１］に記載のポリペプチド。
【0085】
［３］１つ以上のバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、前記バリアントＦｃ領域のそれぞれは、２つのＣＨ２ドメインを含み、前記バリアントＦｃ領域のうちの少なくとも１つの中の前記ＣＨ２ドメインの一方または両方は、バリアントＣＨ２ドメイン（複数可）であり、前記バリアントＣＨ２ドメインの位置２３４、２３５、及び２６５（位置は全てＥＵナンバリングによって表される）のアミノ酸残基は、それぞれＡｌａ、Ａｌａ、及びＡｓｎである、前記ポリペプチド。
【0086】
［４］前記バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が、変異を導入する前の親ＣＨ２のＴｍより１℃以上高い、［１］または［２］に記載のポリペプチド。
【0087】
［５］前記バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が、前記親ＣＨ２のＴｍより３℃以上高い、［４］に記載のポリペプチド。
【0088】
［６］前記バリアントＣＨ２ドメインの熱変性中点温度（Ｔｍ）が、変異を導入する前の親ＣＨ２のＴｍより１℃高くなく、変異を導入する前の前記親ＣＨ２のＴｍより１℃低くない、［３］に記載のポリペプチド。
【0089】
［７］変異を導入する前の親ＣＨ２ドメインを含む親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する結合親和性が低下している、［１］～［６］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0090】
［８］前記親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する結合親和性が５０％以上低下している、［７］に記載のポリペプチド。
【0091】
［９］前記少なくとも１つのＦｃγ受容体が、ヒトＦｃγ受容体及びカニクイザルＦｃγ受容体から選択される少なくとも１つである、［７］または［８］に記載のポリペプチド。
【0092】
［１０］前記Ｆｃγ受容体が、ヒトＦｃγ受容体である、［９］に記載のポリペプチド。
【0093】
［１１］前記Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩである、［７］～［１０］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0094】
［１２］１つ以上のバリアントＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0095】
［１３］抗体またはその機能性断片である、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0096】
［１４］前記抗体またはその機能性断片が、腫瘍抗原に結合する、［１３］に記載のポリペプチド。
【0097】
［１５］［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、分子。
【0098】
［１６］前記分子が、［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドではないポリペプチドとの融合タンパク質である、［１５］に記載のポリペプチド。
【0099】
［１７］［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチドが、薬物にコンジュゲートされている、ポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【0100】
［１８］［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【0101】
［１９］［１８］に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【0102】
［２０］［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチド、［１５］もしくは［１６］に記載の分子、または［１７］に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【0103】
［２１］治療における使用のための、［１］～［１４］のいずれか１つに記載のポリペプチド、［１５］もしくは［１６］に記載の分子、または［１７］に記載のポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【0104】
［２２］前記治療が、がん、免疫疾患、炎症性疾患または感染症の治療を含む、［２１］に記載の使用のための、ポリペプチド、分子、またはポリペプチド－薬物コンジュゲート。
【実施例】
【0105】
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の範囲をいかなる形でも限定する意図はない。
【0106】
比較例１：既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩに対する結合活性の評価。
既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入した抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩ（ｈＦｃγＲＩ）に対する結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して評価した。本来ヒトＩｇＧ２抗体である抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＦｃ領域をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に置き換え、得られた抗体をＩｇＧ１ ＷＴと呼ぶ。ＩｇＧ１ ＷＴの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３及び１４によって表される（図１６Ａ及び１６Ｂ参照）。ＩｇＧ１ ＷＴ及び次のバリアント：ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（国際公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載のＬＡＬＡ－ＰＧ）変異を導入することによって得られたバリアントを評価した。記載の変異をＦｃ領域の両方のＣＨ２ドメインに導入した。これらの抗ＥＧＦＲ抗体（「抗ＥＧＦＲ抗体のバリアント」とも称される）は、抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培地中で培養することにより、宿主細胞に当該細胞中でＤＮＡを発現させることによって得た。配列番号１９の位置１６のＧｌｎ残基から位置２８８のＰｒｏ残基まで（図１９Ａ参照）を含み、カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグを加えた、組み換えヒトＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、アクセッション番号：Ｐ１２３１４）からなるＨｉｓタグ付きヒトＦｃγＲＩをリガンドとして使用した。抗Ｈｉｓ抗体を固定化したセンサーチップ上にＦｃγＲＩリガンドを捕捉させた。次いで、様々な抗ＥＧＦＲ抗体をアナライトとしてセンサーチップに加え、リガンドとアナライトとの間の相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した。
既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入した抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩ（ｈＦｃγＲＩ）に対する結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して評価した。本来ヒトＩｇＧ２抗体である抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＦｃ領域をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に置き換え、得られた抗体をＩｇＧ１ ＷＴと呼ぶ。ＩｇＧ１ ＷＴの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３及び１４によって表される（図１６Ａ及び１６Ｂ参照）。ＩｇＧ１ ＷＴ及び次のバリアント：ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（国際公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載のＬＡＬＡ－ＰＧ）変異を導入することによって得られたバリアントを評価した。記載の変異をＦｃ領域の両方のＣＨ２ドメインに導入した。これらの抗ＥＧＦＲ抗体（「抗ＥＧＦＲ抗体のバリアント」とも称される）は、抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培地中で培養することにより、宿主細胞に当該細胞中でＤＮＡを発現させることによって得た。配列番号１９の位置１６のＧｌｎ残基から位置２８８のＰｒｏ残基まで（図１９Ａ参照）を含み、カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグを加えた、組み換えヒトＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質ＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、アクセッション番号：Ｐ１２３１４）からなるＨｉｓタグ付きヒトＦｃγＲＩをリガンドとして使用した。抗Ｈｉｓ抗体を固定化したセンサーチップ上にＦｃγＲＩリガンドを捕捉させた。次いで、様々な抗ＥＧＦＲ抗体をアナライトとしてセンサーチップに加え、リガンドとアナライトとの間の相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した。
【0107】
簡潔に述べると、抗６Ｘ Ｈｉｓタグ抗体［ＡＤ１．１．１０］（Ａｂｃａｍ ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を製造者の説明書に従ってセンサーチップＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に固定化し、次いで、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で１０μｇ／ｍＬに調製した組み換えヒトＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をセンサーチップと１０μＬ／分で６０秒間接触させることによって捕捉した。次いで、ＨＢＳ－ＥＰ＋で所与の各濃度に調製した抗ＥＧＦＲ抗体を、センサーチップに３０μＬ／分の流量で１２０秒間加えた。図２Ａは、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対してプロットした結合応答（レゾナンスユニット、ＲＵ）のグラフを示す。以下の表１は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0108】
【表1】
【0109】
上の表１に示されるように、エフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むバリアントは全て、ヒトＦｃγＲＩへの結合の指標であるＲＵ値がＩｇＧ１ ＷＴよりも低かった。バリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ＞ＬＡＬＡ－ＰＧ＞ＬＡＬＡ－ＤＡの順であった。
【0110】
比較例２：既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む抗ＥＧＦＲ抗体の様々なヒトＦｃγＲに対する結合活性の評価
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００を使用して、比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。ヒトＦｃγＲをリガンドとしてセンサーチップ上に直接固定化した後、様々な抗ＥＧＦＲ抗体をアナライトとしてセンサーチップに加え、リガンドとアナライトとの間の相互作用をＳＰＲ法によって測定した。カルボキシル末端に１０×Ｈｉｓタグまたは６×Ｈｉｓタグのいずれかをそれぞれ含み、全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した、次のＦｃγＲ：組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７）タンパク質（アクセッション番号：ＡＡＡ３５８２７、配列番号２０の位置３６のＡｌａ残基から位置２１８のＩｌｅ残基まで（図１９Ｂ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ１２３１８－１（Ｐ１２３１８．４）、配列番号２１の位置３４のＡｌａ残基から位置２１８のＩｌｅ残基まで（図１９Ｃ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＢ／Ｃ（ＣＤ３２ｂ／ｃ）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ３１９９４、配列番号２２の位置４６のＡｌａ残基から位置２１７のＰｒｏ残基まで（図１９Ｄ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａタンパク質（アクセッション番号：ＡＡＨ１７８６５、配列番号２３の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図１９Ｅ参照）を含み、６×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ０８６３７、配列番号３１の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図２３参照）を含み、６×Ｈｉｓタグを含む）、及び組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＢ／ＣＤ１６ｂタンパク質（アクセッション番号：Ｏ７５０１５、配列番号２４の位置２０のＴｈｒ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図１９Ｆ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）を使用した。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００を使用して、比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。ヒトＦｃγＲをリガンドとしてセンサーチップ上に直接固定化した後、様々な抗ＥＧＦＲ抗体をアナライトとしてセンサーチップに加え、リガンドとアナライトとの間の相互作用をＳＰＲ法によって測定した。カルボキシル末端に１０×Ｈｉｓタグまたは６×Ｈｉｓタグのいずれかをそれぞれ含み、全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した、次のＦｃγＲ：組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７）タンパク質（アクセッション番号：ＡＡＡ３５８２７、配列番号２０の位置３６のＡｌａ残基から位置２１８のＩｌｅ残基まで（図１９Ｂ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ１２３１８－１（Ｐ１２３１８．４）、配列番号２１の位置３４のＡｌａ残基から位置２１８のＩｌｅ残基まで（図１９Ｃ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＢ／Ｃ（ＣＤ３２ｂ／ｃ）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ３１９９４、配列番号２２の位置４６のＡｌａ残基から位置２１７のＰｒｏ残基まで（図１９Ｄ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａタンパク質（アクセッション番号：ＡＡＨ１７８６５、配列番号２３の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図１９Ｅ参照）を含み、６×Ｈｉｓタグを含む）、組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）タンパク質（アクセッション番号：Ｐ０８６３７、配列番号３１の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図２３参照）を含み、６×Ｈｉｓタグを含む）、及び組み換えヒトＦｃガンマＲＩＩＩＢ／ＣＤ１６ｂタンパク質（アクセッション番号：Ｏ７５０１５、配列番号２４の位置２０のＴｈｒ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図１９Ｆ参照）を含み、１０×Ｈｉｓタグを含む）を使用した。
【0111】
簡潔に述べると、ヒトＦｃγＲのそれぞれを製造者の説明書に従ってセンサーチップＣＭ５上に固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で所与の各濃度に調製した抗ＥＧＦＲ抗体を、センサーチップに３０μＬ／分の流量で１２０秒間加えた。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂをリガンドとして使用した場合の各抗体濃度（０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。表１は、抗体濃度４．７μＭで得られた、様々なヒトＦｃγＲに対するＲＵ値を示す。
【0112】
表１からわかるように、エフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むバリアントは全て、各ヒトＦｃγＲへの結合の指標であるＲＵ値がＩｇＧ１ ＷＴよりも低かった。バリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ＞ＬＡＬＡ－ＰＧの順であり、ＬＡＬＡ－ＤＡは、ＬＡＬＡ－ＰＧと実質的に同じであった。
【0113】
比較例３：既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性の評価
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩ（ｃＦｃγＲＩ）に対する結合活性を比較例１と同じように評価した。カニクイザルＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０９６９、配列番号２５の位置１１のＶａｌ残基から位置２８８のＰｒｏ残基まで（図２０Ａ参照）を含み、カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグが付加されている：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をカニクイザルＦｃγＲとして使用した。図３Ａは、抗体の各濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表２は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩ（ｃＦｃγＲＩ）に対する結合活性を比較例１と同じように評価した。カニクイザルＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４タンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０９６９、配列番号２５の位置１１のＶａｌ残基から位置２８８のＰｒｏ残基まで（図２０Ａ参照）を含み、カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグが付加されている：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をカニクイザルＦｃγＲとして使用した。図３Ａは、抗体の各濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表２は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0114】
【表2】
【0115】
上の表２に示されるように、エフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むバリアントは全て、カニクイザルＦｃγＲＩへの結合を示すＲＵ値がＩｇＧ１ ＷＴよりも低かった。バリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ＞ＬＡＬＡ－ＰＧ＞ＬＡＬＡ－ＤＡの順であった。
【0116】
比較例４：既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む抗ＥＧＦＲ抗体の様々なカニクイザルＦｃγＲに対する結合活性の評価
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合活性を、比較例２と同じように評価した。カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグをそれぞれ含み、全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した、次のカニクイザルＦｃγＲ：組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０５９８、配列番号２６の位置２９のＴｈｒ残基から位置２１１のＩｌｅ残基まで（図２０Ｂ参照）を含む）、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＢタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７１０６０、配列番号２７の位置４６のＡｌａ残基から位置２１７のＰｒｏ残基まで（図２０Ｃ参照）を含む）、及び組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＩ／ＣＤ１６タンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０１２１、配列番号２８の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図２０Ｄ参照）を含む）を使用した。上の表２は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合活性を、比較例２と同じように評価した。カルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグをそれぞれ含み、全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した、次のカニクイザルＦｃγＲ：組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０５９８、配列番号２６の位置２９のＴｈｒ残基から位置２１１のＩｌｅ残基まで（図２０Ｂ参照）を含む）、組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＢタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７１０６０、配列番号２７の位置４６のＡｌａ残基から位置２１７のＰｒｏ残基まで（図２０Ｃ参照）を含む）、及び組み換えカニクイザルＦｃガンマＲＩＩＩ／ＣＤ１６タンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２７０１２１、配列番号２８の位置１７のＧｌｙ残基から位置２０８のＧｌｎ残基まで（図２０Ｄ参照）を含む）を使用した。上の表２は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0117】
上の表２に示されるように、エフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むバリアントは全て、各カニクイザルＦｃγＲへの結合を示すＲＵ値がＩｇＧ１ ＷＴよりも低かった。バリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ＞ＬＡＬＡ－ＰＧ＞ＬＡＬＡ－ＤＡの順であった。
【0118】
比較例５：既知のエフェクター低減変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性の評価
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して評価した。各抗ＥＧＦＲ抗体を、２５ｍＭ ヒスチジン及び５％ｗ／ｖ ソルビトール（ｐＨ６．０）で抗体濃度０．５ｍｇ／ｍＬに調製し、６０℃／時間の加熱速度で２０℃から１２０℃まで昇温したときの熱容量Ｃｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃）の変化を調べた。熱容量の変化を示す曲線のピークは、抗体の各ドメインの熱変性を示し、熱変性のピークは、一般に、ＣＨ２ドメイン、Ｆａｂ、及びＣＨ３ドメインの順に観察される（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５：７５１－７５７（２００７））。図４Ａ～４Ｄは、ＩｇＧ１ ＷＴならびにそのＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ－ＤＡ、及びＬＡＬＡ－ＰＧバリアントの熱容量の変化及びピークトップ温度（Ｔｍ）を示す。観察された２つのピークのうち、低いほうの温度のピークは、ＣＨ２ドメインの熱変性を示す。高いほうの温度のピークは、Ｆａｂ領域及びＣＨ３ドメインのピークが重なっていることを示すと考えられる。以下の表３は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値及び各バリアントとＩｇＧ１ ＷＴとの間のＴｍ値の差（ΔＴｍ）を示す。
比較例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して評価した。各抗ＥＧＦＲ抗体を、２５ｍＭ ヒスチジン及び５％ｗ／ｖ ソルビトール（ｐＨ６．０）で抗体濃度０．５ｍｇ／ｍＬに調製し、６０℃／時間の加熱速度で２０℃から１２０℃まで昇温したときの熱容量Ｃｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃）の変化を調べた。熱容量の変化を示す曲線のピークは、抗体の各ドメインの熱変性を示し、熱変性のピークは、一般に、ＣＨ２ドメイン、Ｆａｂ、及びＣＨ３ドメインの順に観察される（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５：７５１－７５７（２００７））。図４Ａ～４Ｄは、ＩｇＧ１ ＷＴならびにそのＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ－ＤＡ、及びＬＡＬＡ－ＰＧバリアントの熱容量の変化及びピークトップ温度（Ｔｍ）を示す。観察された２つのピークのうち、低いほうの温度のピークは、ＣＨ２ドメインの熱変性を示す。高いほうの温度のピークは、Ｆａｂ領域及びＣＨ３ドメインのピークが重なっていることを示すと考えられる。以下の表３は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値及び各バリアントとＩｇＧ１ ＷＴとの間のＴｍ値の差（ΔＴｍ）を示す。
【0119】
【表3】
【0120】
表３からわかるように、ＬＡＬＡバリアントのＴｍ値は、ＩｇＧ１ ＷＴより０．６℃高かったが、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＰＧバリアントのＴｍ値は、ＩｇＧ１ ＷＴよりそれぞれ１．９℃及び１．０℃低かった。
【0121】
実施例１：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩに対する結合活性の評価
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例１と同じように評価した。本来ヒトＩｇＧ２抗体である抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＦｃ領域をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に置き換えた（ＩｇＧ１ ＷＴ）。評価に使用したバリアントは、ＩｇＧ１ ＷＴのＬＡＬＡ－ＤＡバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ（ＬＡＬＡ－ＤＧ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎ（ＬＡＬＡ－ＤＮ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｑ（ＬＡＬＡ－ＤＱ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｔ（ＬＡＬＡ－ＤＴ）変異を導入することによって得られたバリアントであった。記載の変異をＦｃ領域の両方のＣＨ２ドメインに導入した。図５は、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表４は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例１と同じように評価した。本来ヒトＩｇＧ２抗体である抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＦｃ領域をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に置き換えた（ＩｇＧ１ ＷＴ）。評価に使用したバリアントは、ＩｇＧ１ ＷＴのＬＡＬＡ－ＤＡバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ（ＬＡＬＡ－ＤＧ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｎ（ＬＡＬＡ－ＤＮ）変異を導入することによって得られたバリアント；ＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｑ（ＬＡＬＡ－ＤＱ）変異を導入することによって得られたバリアント；及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｔ（ＬＡＬＡ－ＤＴ）変異を導入することによって得られたバリアントであった。記載の変異をＦｃ領域の両方のＣＨ２ドメインに導入した。図５は、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表４は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0122】
【表4】
【0123】
表４に示されるように、ヒトＦｃγＲＩに対する結合活性に関して、抗体濃度４．７μＭで得られたＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＮバリアントのＲＵ値は、それぞれＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの約１／１０及び約１／４であった。ＬＡＬＡ－ＤＱバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの約２倍であった。
【0124】
実施例２：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体の様々なヒトＦｃγＲに対する結合活性の評価
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を、比較例２と同じように評価した。上の表４は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を、比較例２と同じように評価した。上の表４は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0125】
表４からわかるように、抗体濃度４．７μＭで得られたヒトＦｃγＲに対するＲＵ値は、ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）を除き、各バリアントでほぼ同じであった。ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）に対するＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、他のバリアントの半分以下であった。
【0126】
実施例３：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性の評価
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例３と同じように評価した。図６は、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表５は、抗体濃度４．７μＭのＲＵ値を示す。
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例３と同じように評価した。図６は、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。以下の表５は、抗体濃度４．７μＭのＲＵ値を示す。
【0127】
【表5】
【0128】
表５からわかるように、抗体濃度４．７μＭで得られたＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの約１／１０であり、ＬＡＬＡ－ＤＮバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの約１／４であった。一方、ＬＡＬＡ－ＤＱ及びＬＡＬＡ－ＤＴバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアントの１．４倍以上であった。
【0129】
実施例４：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体の様々なカニクイザルＦｃγＲに対する結合活性の評価
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合活性を、比較例４と同じように評価した。上の表５は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合活性を、比較例４と同じように評価した。上の表５は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0130】
表５からわかるように、抗体濃度４．７μＭで得られたカニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩに対するＲＵ値は、各バリアントでほぼ同じであった。
【0131】
実施例５：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性の評価
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴ及びバリアントの各ＣＨ２ドメインの熱安定性を、比較例５と同じように評価した。図７Ａ～７Ｄは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、ＬＡＬＡ－ＤＮバリアント、ＬＡＬＡ－ＤＱバリアント、及びＬＡＬＡ－ＤＴバリアントのＣＨ２ドメインの熱容量の変化及びＴｍ値を示す。以下の表６は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値及び各バリアントとＩｇＧ１ ＷＴとの間のＴｍ値の差（ΔＴｍ）を示す。
実施例１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴ及びバリアントの各ＣＨ２ドメインの熱安定性を、比較例５と同じように評価した。図７Ａ～７Ｄは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、ＬＡＬＡ－ＤＮバリアント、ＬＡＬＡ－ＤＱバリアント、及びＬＡＬＡ－ＤＴバリアントのＣＨ２ドメインの熱容量の変化及びＴｍ値を示す。以下の表６は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値及び各バリアントとＩｇＧ１ ＷＴとの間のＴｍ値の差（ΔＴｍ）を示す。
【0132】
【表6】
【0133】
表６に示されるように、ＬＡＬＡ－ＤＱバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＴバリアントのＴｍ値は、ＬＡＬＡ－ＤＡバリアントと同様に、ＩｇＧ１ ＷＴより約２℃低かった。ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＴｍ値は、ＩｇＧ１ ＷＴより４．５℃高く、ＬＡＬＡ－ＤＮバリアントのＴｍ値は、ＩｇＧ１ ＷＴより０．３℃高かった。
【0134】
実施例６：抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの抗原結合活性の評価
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００を使用して、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴならびにＬＡＬＡ及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＥＧＦＲ結合活性を評価した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定化したセンサーチップ上に抗ＥＧＦＲ抗体をリガンドとして捕捉し、ＥＧＦＲをアナライトとして流した。次いで、リガンドとアナライトとの間の相互作用をＳＰＲ法によって測定した。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００を使用して、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＩｇＧ１ ＷＴならびにＬＡＬＡ及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＥＧＦＲ結合活性を評価した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定化したセンサーチップ上に抗ＥＧＦＲ抗体をリガンドとして捕捉し、ＥＧＦＲをアナライトとして流した。次いで、リガンドとアナライトとの間の相互作用をＳＰＲ法によって測定した。
【0135】
簡潔に述べると、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）に含まれる抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を製造者の説明書に従ってセンサーチップＣＭ５上に固定し、次いで、ＨＢＳ－ＥＰ＋で２μｇ／ｍＬに調製した各抗ＥＧＦＲ抗体をセンサーチップと１０μＬ／分の流量で３０秒間接触させることによって捕捉した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で濃度１２、３７、１１０、３３０、１０００ｐＭに調製したヒトＥＧＦＲタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を、センサーチップに３０μＬ／分の流量で１２０秒間加え、次いで、１５００秒間解離させた。ＥＧＦＲに対する各抗体の解離定数ＫＤを、得られたセンサーグラムからシングルサイクルカイネティクス解析法によって算出した。結果を以下の表７に示す。
【0136】
【表7】
【0137】
表７からわかるように、ＥＧＦＲに対する抗体のＫＤ値は、ＩｇＧ１ ＷＴ、ＬＡＬＡバリアント、及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのそれぞれについて２７、２４、及び２６ｎＭであり、変異の有無及びその種類にかかわらず、ほぼ同じであった。
【0138】
実施例７：抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントの胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合活性の評価
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、実施例６に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃＲｎ（ヒト胎児性受容体大型サブユニットｐ５１／アクセッション番号：Ｐ５５８９９／配列番号２９／図２１）及びベータ２－ミクログロブリン（アクセッション番号：ＮＰ＿００４０３９．１／配列番号３０／図２２）に対する結合活性を評価した。バイオレイヤー干渉法を使用して、ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉させたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を抗ＥＧＦＲ抗体の溶液と接触させたときの抗体とＦｃＲｎとの間の結合反応を測定し、バイオセンサーを、抗体を含まない別の溶液に移したときの抗体とＦｃＲｎとの間の解離反応を測定した。結合反応と解離反応の両方をｐＨ６．０の緩衝液で実施し、得られた結合反応及び解離反応のセンサーグラムからｐＨ６．０での解離定数ＫＤを算出した。加えて、ｐＨ６．０の緩衝液で結合反応を実施し、ｐＨ７．４の緩衝液で解離反応を実施した。得られた解離反応のセンサーグラムからｐＨ７．４での解離速度定数ｋｄを算出した。以下の表８は、抗ＥＧＦＲ抗体について算出されたＫＤ値及びｋｄ値を示す。抗ＥＧＦＲ抗体溶液の濃度は、３点、すなわち、１．７、６．９及び２８ｎＭに設定した。２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０の溶液（ｐＨ６．０または７．４）を緩衝液として使用した。
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、実施例６に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃＲｎ（ヒト胎児性受容体大型サブユニットｐ５１／アクセッション番号：Ｐ５５８９９／配列番号２９／図２１）及びベータ２－ミクログロブリン（アクセッション番号：ＮＰ＿００４０３９．１／配列番号３０／図２２）に対する結合活性を評価した。バイオレイヤー干渉法を使用して、ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉させたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を抗ＥＧＦＲ抗体の溶液と接触させたときの抗体とＦｃＲｎとの間の結合反応を測定し、バイオセンサーを、抗体を含まない別の溶液に移したときの抗体とＦｃＲｎとの間の解離反応を測定した。結合反応と解離反応の両方をｐＨ６．０の緩衝液で実施し、得られた結合反応及び解離反応のセンサーグラムからｐＨ６．０での解離定数ＫＤを算出した。加えて、ｐＨ６．０の緩衝液で結合反応を実施し、ｐＨ７．４の緩衝液で解離反応を実施した。得られた解離反応のセンサーグラムからｐＨ７．４での解離速度定数ｋｄを算出した。以下の表８は、抗ＥＧＦＲ抗体について算出されたＫＤ値及びｋｄ値を示す。抗ＥＧＦＲ抗体溶液の濃度は、３点、すなわち、１．７、６．９及び２８ｎＭに設定した。２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０の溶液（ｐＨ６．０または７．４）を緩衝液として使用した。
【0139】
【表8】
【0140】
表８からわかるように、ＩｇＧ１ ＷＴ、ＬＡＬＡバリアント、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアント全てのｐＨ６．０でのＫＤ値は、５～６ｎＭであった。加えて、ｐＨ７．４でのｋｄ値は、ほぼ同じであり、すなわち、ＩｇＧ１ ＷＴについては、２．１（１／ｓ）であり、バリアントについては、それぞれ２．８、２．２、２．３（１／ｓ）であった。
【0141】
実施例８：マウスにおける抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの薬物動態試験
実施例６に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態試験をマウスで実施した。各抗ＥＧＦＲ抗体を３ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与し、次いで、１、６、２４、７２、１６８、３３６及び３６０時間後に、イソフルラン麻酔下でヘパリン処理済みヘマトクリットチューブを使用して尾静脈から採血し、続いて、４℃及び１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿中の抗ＥＧＦＲ抗体の量を、全自動イムノアッセイプラットフォームＧｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。抗ＥＧＦＲ抗体の捕捉にはビオチン標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用し、検出にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用した。図８は、抗ＥＧＦＲ抗体の血中濃度を投与後の時間に対してプロットしたグラフを示す。
実施例６に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態試験をマウスで実施した。各抗ＥＧＦＲ抗体を３ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与し、次いで、１、６、２４、７２、１６８、３３６及び３６０時間後に、イソフルラン麻酔下でヘパリン処理済みヘマトクリットチューブを使用して尾静脈から採血し、続いて、４℃及び１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿中の抗ＥＧＦＲ抗体の量を、全自動イムノアッセイプラットフォームＧｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。抗ＥＧＦＲ抗体の捕捉にはビオチン標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用し、検出にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用した。図８は、抗ＥＧＦＲ抗体の血中濃度を投与後の時間に対してプロットしたグラフを示す。
【0142】
図８からわかるように、マウスにおける抗ＥＧＦＲ抗体のＩｇＧ１ ＷＴ、ＬＡＬＡ及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの血中濃度の経時変化に有意な差は観察されなかった。
【0143】
実施例９：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃγＲＩに対する結合活性の評価
抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ）変異を導入することによって得たバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例１と同じように評価した。図９Ａは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント（実施例１参照）及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントについて、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。
抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブのＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＩｇＧ１ ＷＴのＦｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡ）変異を導入することによって得たバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例１と同じように評価した。図９Ａは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント（実施例１参照）及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントについて、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。
【0144】
図９Ａからわかるように、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントは、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントよりもヒトＦｃγＲＩに対して低いＲＵ値を示した。
【0145】
実施例１０：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性の評価
実施例９に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例３と同じように評価した。図９Ｂは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント（実施例１参照）及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントについて、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。
実施例９に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のカニクイザルＦｃγＲＩに対する結合活性を、比較例３と同じように評価した。図９Ｂは、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント（実施例１参照）及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントについて、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。
【0146】
図９Ｂからわかるように、カニクイザルＦｃγＲＩに対するＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントよりも低かった。
【0147】
実施例１１：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｇ／Ｐ３２９Ａ変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性の評価
実施例９に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性を、比較例５と同じように評価した。以下の表９は、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのそれぞれのＣＨ２ドメインのＴｍ値を示す。ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、表６と同じである。
実施例９に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の熱安定性を、比較例５と同じように評価した。以下の表９は、抗ＥＧＦＲ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのそれぞれのＣＨ２ドメインのＴｍ値を示す。ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、表６と同じである。
【0148】
【表9】
【0149】
表９に示されるように、ＬＡＬＡ－ＤＧＰＡバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントより１℃低かった。
【0150】
実施例１２：抗ＣＤ７０抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアントの様々なヒトＦｃγ受容体に対する結合活性の評価
ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ７０抗体ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を得、比較例１と同じように評価した。ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアントの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１６によって表される（図１７Ａ及び１７Ｂ参照）。図１０Ａは、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。加えて、比較例２に記載の方法を使用して、これらの抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。表１０は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ７０抗体ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を得、比較例１と同じように評価した。ボルセツズマブのＬＡＬＡバリアントの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１６によって表される（図１７Ａ及び１７Ｂ参照）。図１０Ａは、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。加えて、比較例２に記載の方法を使用して、これらの抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。表１０は、抗体濃度４．７μＭで得られたＲＵ値を示す。
【0151】
【表10】
【0152】
抗体濃度４．７μＭで得られたヒトＦｃγＲＩに対するＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡバリアントの約１／２００であった。加えて、抗体濃度４．７μＭで得られた他のヒトＦｃγＲに対するＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡバリアントよりも低かった。
【0153】
実施例１３：抗ＬＰＳ抗体のＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγ受容体に対する結合活性の評価
ＩｇＧ１抗体である抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１のＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を得、比較例１と同じように評価した。０１１－１１１１抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１８によって表される（図１８Ａ及び１８Ｂ参照）。図１０Ｂは、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。加えて、比較例２に記載の方法を使用して、これらの抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。上の表１０は、抗体濃度４．７μＭのＲＵ値を示す。
ＩｇＧ１抗体である抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１のＬＡＬＡバリアント及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのヒトＦｃγＲＩに対する結合活性を得、比較例１と同じように評価した。０１１－１１１１抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１８によって表される（図１８Ａ及び１８Ｂ参照）。図１０Ｂは、各試験抗体濃度（０．３、０．４、０．６、０．９、１．３、２．０、３．１、及び４．７μＭ）に対するＲＵ値をプロットしたグラフを示す。加えて、比較例２に記載の方法を使用して、これらの抗体のヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合活性を評価した。上の表１０は、抗体濃度４．７μＭのＲＵ値を示す。
【0154】
表１０からわかるように、抗体濃度４．７μＭで得られたヒトＦｃγＲＩに対するＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡバリアントの約１／３００であった。加えて、抗体濃度４．７μＭで得られた他のヒトＦｃγＲに対するＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＲＵ値は、ＬＡＬＡバリアントよりも低かった。
【0155】
実施例１４：ＬＡＬＡ－ＤＧ変異を含む様々な抗体の熱安定性の評価
次の抗体の熱安定性を比較例５と同じように評価した。評価した抗体は、抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１の親抗体（ＩｇＧ１ ＷＴ）、ならびに抗ＣＤ７０抗体の親抗体（ＩｇＧ１ ＷＴ）、これらの各抗体のＬＡＬＡ及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、更に、あらゆるＦａｂ領域を欠いている当該バリアントから誘導される抗体であった。Ｆａｂを欠くＬＡＬＡバリアント及びＦａｂを欠くＬＡＬＡ－ＤＧバリアントは、それぞれ配列番号１６の２２２番目から４４８番目のアミノ酸及び配列番号５の１０４番目から３３０番目のアミノ酸（図１７Ｂ及び１２Ｂ参照）からなる。表１１は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値を示す。
次の抗体の熱安定性を比較例５と同じように評価した。評価した抗体は、抗ＬＰＳ抗体Ｏ１１－１１１１の親抗体（ＩｇＧ１ ＷＴ）、ならびに抗ＣＤ７０抗体の親抗体（ＩｇＧ１ ＷＴ）、これらの各抗体のＬＡＬＡ及びＬＡＬＡ－ＤＧバリアント、更に、あらゆるＦａｂ領域を欠いている当該バリアントから誘導される抗体であった。Ｆａｂを欠くＬＡＬＡバリアント及びＦａｂを欠くＬＡＬＡ－ＤＧバリアントは、それぞれ配列番号１６の２２２番目から４４８番目のアミノ酸及び配列番号５の１０４番目から３３０番目のアミノ酸（図１７Ｂ及び１２Ｂ参照）からなる。表１１は、各試験抗体のＣＨ２ドメインのＴｍ値を示す。
【0156】
【表11】
【0157】
表１１に示されるように、抗ＣＤ７０抗体に関して、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、ＬＡＬＡバリアントより３．９℃高かった。抗ＬＰＳ抗体に関して、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、ＩｇＧ１ ＷＴより３．７℃高く、ＬＡＬＡバリアントより３．３℃高かった。Ｆａｂを欠くＦｃ領域に関して、ＬＡＬＡ－ＤＧバリアントのＣＨ２ドメインのＴｍ値は、ＬＡＬＡバリアントより３．６℃高かった。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図19F】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】