特表 2024-532485 ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240829BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240829BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240829BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K14/705

C07K16/00

C12N15/09 Z

C12N15/62

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63 Z

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61K39/395 T

A61P35/00

A61K48/00

A61K47/65

A61K47/64

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513933

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 US2022075846

(87)【国際公開番号】W WO2023034922

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/240,402

(32)【優先日】2021-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/327,700

(32)【優先日】2022-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521339223

【氏名又は名称】ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】ペイ，イ

(72)【発明者】

【氏名】レイ，ミン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ハイチュン

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，イック

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チャン フン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ハン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒトＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（例えば、Ｃｌａｕｄｉｎ－６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４）に結合する二重特異性結合タンパク質およびその断片、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらを生産する細胞を提供する。本開示はさらに、これらの抗体を含む治療組成物、ならびにがんの検出、予後、および抗体ベースの免疫療法のためのそれらの使用方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍関連抗原およびＣＤ１３７に結合する二重特異性結合タンパク質であって、
（ａ）前記腫瘍関連抗原に結合する第一の抗原結合部位と、前記腫瘍関連抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含む、抗体スキャフォールドモジュール、および
（ｂ）ＣＤ１３７に結合する第三の抗原結合部位を含む少なくとも一つの第一の結合モジュールを含む、二重特異性結合タンパク質。

【請求項2】

前記腫瘍関連抗原が、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、およびＮｅｃｔｉｎ－４からなる群から選択される、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項3】

前記腫瘍関連抗原がＣｌａｕｄｉｎ６である、請求項２に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項4】

前記腫瘍関連抗原がＣｌａｕｄｉｎ１８．２である、請求項２に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項5】

前記腫瘍関連抗原がＮｅｃｔｉｎ－４である、請求項２に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項6】

前記抗体スキャフォールドモジュールがＩｇＧである、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項7】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、およびＣＤＲ３：配列番号４７を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号４８、ＣＤＲ２：配列番号４９、およびＣＤＲ３：配列番号５０を含む軽鎖可変領域配列、または
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号５１、ＣＤＲ２：配列番号５２、およびＣＤＲ３：配列番号５３を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号５４、ＣＤＲ２：配列番号５５、およびＣＤＲ３：配列番号５６を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項8】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、配列番号２５または配列番号２７に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２６または配列番号２８に記載の軽鎖可変領域配列とを含む、請求項７に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項9】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、
（ｉ）配列番号２５に記載の重鎖可変領域配列、および配列番号２６に記載の軽鎖可変領域配列、または
（ｉｉ）配列番号２７に記載の重鎖可変領域配列、および配列番号２８に記載の軽鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項10】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、
ＣＤＲ１：配列番号３３、ＣＤＲ２：配列番号３４、およびＣＤＲ３：配列番号３５を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号３６、ＣＤＲ２：配列番号３７、およびＣＤＲ３：配列番号３８を含む軽鎖可変領域配列とを含む、請求項４に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項11】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１０に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項12】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、
ＣＤＲ１：配列番号５７、ＣＤＲ２：配列番号５８、およびＣＤＲ３：配列番号５９を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号６０、ＣＤＲ２：配列番号６１、およびＣＤＲ３：配列番号６２を含む軽鎖可変領域配列とを含む、請求項５に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項13】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または配列番号３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１２に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項14】

前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、
（ｉ）配列番号２９に記載の重鎖可変領域配列、および配列番号３０に記載の軽鎖可変領域配列、または
（ｉｉ）配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列、および配列番号３２に記載の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項15】

前記二重特異性結合タンパク質が、一つの第一の結合モジュールを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項16】

前記結合タンパク質が、二つの第一の結合モジュールを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項17】

前記第一の結合モジュールが、抗体断片である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項18】

前記抗体断片がｓｃＦｖである、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項19】

前記第一の結合モジュールがＣＤ１３７に結合する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項20】

前記第一の結合モジュールが、ＣＤ１３７に結合するｓｃＦＶである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項21】

前記抗体スキャフォールドモジュールが、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの重鎖配列を含み、前記抗体スキャフォールドモジュールが、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの軽鎖配列を含み、前記第一の結合モジュールが、前記抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方の前記Ｃ末端、前記抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方の前記Ｃ末端、前記抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方の前記Ｎ末端、前記抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方の前記Ｎ末端、またはそれらの組合せに共有結合され、前記第一の結合モジュールおよび前記抗体スキャフォールドモジュールが、直接的にまたはインターリンカーを介して互いに共有結合される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項22】

前記第一の結合モジュールおよび前記抗体スキャフォールドモジュールが、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を有するインターリンカーを介して互いに共有結合される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項23】

前記第一の結合モジュールが、前記抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の両方の前記Ｃ末端に共有結合される、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項24】

前記第一の結合モジュールが、前記抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の両方の前記Ｃ末端に共有結合される、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項25】

前記第一の結合モジュールが、前記抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の両方の前記Ｎ末端に共有結合される、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項26】

前記第一の結合モジュールが、ＣＤ１３７に結合し、
ＣＤＲ１：配列番号３９、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、およびＣＤＲ３：配列番号４４を含む軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項27】

前記第一の結合モジュールが、ＣＤ１３７に結合し、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２６に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項28】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖の前記Ｃ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項29】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項２８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項30】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記軽鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項２８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項31】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項３０に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項32】

前記抗体スキャフォールドモジュールの前記重鎖、前記グリシン－セリンリンカー、および前記第一の結合モジュールが、配列番号３に記載の配列を含む、請求項２８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項33】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各軽鎖の前記Ｃ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項34】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項３３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項35】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記軽鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項３３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項36】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項３５に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項37】

前記抗体スキャフォールドモジュールの前記軽鎖、前記グリシン－セリンリンカー、および前記第一の結合モジュールが、配列番号５に記載の配列を含む、請求項３６に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項38】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、配列番号２５または２７に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２６または２８に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖の前記Ｃ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項39】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項３８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項40】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記重鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項３８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項41】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項４０に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項42】

前記抗体スキャフォールドモジュールの前記重鎖、前記グリシン－セリンリンカー、および前記第一の結合モジュールが、配列番号１２、７２、または１３に記載の配列を含む、請求項４１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項43】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各軽鎖の前記Ｃ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項44】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項４３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項45】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記軽鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項４３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項46】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項４５に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項47】

前記抗体スキャフォールドモジュールの前記軽鎖、前記グリシン－セリンリンカー、および前記第一の結合モジュールが、配列番号１７に記載の配列を含む、請求項４６に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項48】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖の前記Ｎ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項49】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項４８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項50】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記軽鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項４８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項51】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項５０に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項52】

前記第一の結合モジュール、前記グリシン－セリンリンカー、および前記抗体スキャフォールドモジュールの前記重鎖が、配列番号１８に記載の配列を含む、請求項５１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項53】

前記二重特異性結合タンパク質が、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、
前記第一の抗原結合部位および前記第二の抗原結合部位が、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールがそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、
前記第一の結合モジュールが、グリシン－セリンリンカーによって、前記抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖の前記Ｃ末端に別々に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項54】

前記グリシン－セリンリンカーが、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である、請求項５３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項55】

前記第一の結合モジュール中の前記重鎖可変領域配列および前記軽鎖可変領域配列が、グリシン－セリンリンカーによって結合される、請求項５３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項56】

前記グリシン－セリンリンカーが、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である、請求項５５に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項57】

前記抗体スキャフォールドモジュールの前記重鎖、前記グリシン－セリンリンカー、および前記第一の結合モジュールが、配列番号１４に記載の配列を含む、請求項５６に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項58】

前記抗体スキャフォールドモジュールが、定常領域をさらに含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項59】

前記定常領域が、Ｆｃサイレンシング変異を含む、請求項５８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項60】

前記Ｆｃサイレンシング変異が、ＬＡＬＡまたはＮ２９７Ａである、請求項５９に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項61】

前記定常領域が、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７３を含む、請求項５８に記載の結合タンパク質。

【請求項62】

請求項１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

【請求項63】

がんを治療または予防する方法であって、請求項１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。

【請求項64】

請求項１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。

【請求項65】

請求項６４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項66】

請求項６４に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項６５に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項67】

請求項１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質の生産方法であって、請求項６６に記載の細胞を培養することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本国際特許出願は、２０２１年９月３日に出願された米国仮特許出願第６３／２４０，４０２号、および２０２２年４月５日に出願された米国仮特許出願第６３／３２７，７００号の利益を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにＸＭＬ形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むＸＬＭファイルの名前は、１２２８６３－５００７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ．２６．ｘｍｌである。このテキストファイルは、約１１１，３４５バイトであり、２０２２年８月２８日頃に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【0003】

本開示は、免疫療法の分野にあり、ヒトＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（例えば、Ｃｌａｕｄｉｎ－６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４）に結合する二重特異性結合タンパク質およびその断片、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらを生産する細胞に関する。本開示はさらに、これらの二重特異性結合タンパク質を含む治療用組成物、ならびにがんの検出、予後および抗体ベースの免疫療法のためのそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

Ｔ細胞の活性化は、抗腫瘍免疫において中心的な役割を果たす。ナイーブＴ細胞を活性化するためには、二つの主要なシグナルが必要である。シグナル１は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して提供されるのに対し、シグナル２は、共刺激のシグナルである。ＣＤ２８：Ｂ７分子は、最も研究された共刺激経路の一部であり、一次Ｔ細胞刺激が発生する主な機構であると考えられている。しかし、初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を増幅および多様化するように機能する数多くの他の分子が特定されている。これらにはＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）分子が含まれるが、この分子は４－１ＢＢ：４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）としても知られている。

【0005】

ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞と適応免疫細胞との両方の免疫細胞の活性化に続いて発現される共刺激分子である。ＣＤ１３７は、様々な免疫細胞の活性を調節する上で重要な役割を果たす。ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌシグナル伝達経路を標的とする療法は、複数のモデル系において抗腫瘍効果を有することが示されており、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体も臨床開発に入っている（Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊｕｌ．１５；２１（１４）：３１１３－２０；Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｓｅｐ．１５；２３（１８）：５３４９－５３５７）。ＣＤ１３７アゴニストは、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌、および細胞溶解活性ＣＤ８ Ｔ細胞を増強する。数多くの他の研究により、ＣＤ１３７の活性化が、マウスの腫瘍 を除去するための免疫応答を増強することが示された。臨床では、ＣＤ１３７モノクローナル抗体療法が有望な抗腫瘍効果を示しているが、全身免疫刺激は用量制限性肝毒性を誘発している（Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６５，１２４３－１２４８（２０１６）；Ｓｅｇａｌ，Ｎ．Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７，２３，１９２９－１９３６）。

【0006】

肝炎症の副作用を回避し、治療ウィンドウを広げるために、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的とする強力な共刺激を目的として、新しいＣＤ１３７アゴニスト部分が開発されている。異なるアプローチが適用される。臨床開発中の最も進行したものは、ＴＭＥ特異的にＣＤ１３７共刺激をもたらすＣＤ１３７ベースの二重特異性構築物、例えば腫瘍抗原（例えば、ＴＡＡまたはＴＳＡ）およびＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体などである。抗腫瘍活性は、宿主免疫系を腫瘍関連抗原に指向させることによって達成される可能性がある。腫瘍細胞をＣＤ１３７発現Ｔ細胞と連結して細胞性細胞傷害性を増加させることは、がん療法における有望な戦略を代表する。

【0007】

ＣＤ１３７－Ｈｅｒ２二重特異性抗体は、当該構築物の良好な忍容性を呈し、臨床活性のエビデンスを示し（Ｈｉｎｎｅｒ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９年１０月１日；２５（１９）：５８７８－５８８９；Ｐｉｈａ－Ｐａｕｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．，ＨＥＲ２＋悪性腫瘍を有する患者におけるＨＥＲ２／４－１ＢＢ二重特異性分子ＰＲＳ－３４３の第Ｉ相用量漸増試験、がん免疫療法協会の第３４回年次会議および事前会議プログラム、ナショナルハーバー、メリーランド州、２０１９）、腫瘍抗原５Ｔ４およびＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体も、良好な前臨床活性を示した（Ｎｅｌｓｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，４－１ＢＢ×５Ｔ４ ＡＤＡＰＴＩＲＴＭ二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ－５２７によって誘発された強力な腫瘍特異的Ｔ細胞活性化および腫瘍阻害、がん免疫療法協会の第３４回年次会議および事前会議プログラム、ナショナルハーバー、メリーランド州、２０１９）。

【0008】

Ｃｌａｕｄｉｎスーパーファミリーのメンバーは、密着結合の主要な構成要素であり、細胞極性を維持し、隣接細胞同士の間の空間を封止する。Ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）は、初期発生の間に発現されるが、健康な成人ヒト組織ではサイレンシングされる、癌胎児性タンパク質である。ＣＬＤＮ６発現は、小児脳腫瘍、胃腺癌および生殖細胞腫瘍、ならびに卵巣がんおよび精巣がんなどの広範な非血液がんにおいて報告されている。その発現はしばしば予後不良と相関する。Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２は、胃がん、食道がん、膵がん、肺がん、および卵巣がんを含む広範なヒト悪性腫瘍において広く発現される。Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２は、優れた標的安全性プロファイルを有する。正常な組織では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の発現は胃に限定的であり、かつ短命の分化細胞上のみに限定的である。Ｎｅｃｔｉｎファミリータンパク質は、ホモ親和性およびヘテロ親和性のトランス相互作用を介して細胞間接着を媒介し、ヘテロ親和性のトランス相互作用は、ホモ親和性のトランス相互作用よりもはるかに強い。Ｎｅｃｔｉｎタンパク質ファミリーのメンバーとして、ｎｅｃｔｉｎ－４は腫瘍形成および転移の重要な駆動因子である。がん組織におけるＮｅｃｔｉｎ－４の過剰発現は、がんの進行および予後不良と関連している。

【0009】

上皮起源のがんは、患者、その家族、および医療システムに影響を及ぼす重大かつ世界的な医療課題を代表する。ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４などの上皮腫瘍抗原を過剰発現する腫瘍を有する患者のアンメット・メディカル・ニーズに対し、ＣＤ１３７およびこれらの腫瘍抗原に結合する特異的な結合タンパク質は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて抗体ベースの免疫療法に使用でき、それゆえに潜在的に効果的かつ安全な治療的解決策が提供される。

【発明の概要】

【0010】

本開示は、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性結合タンパク質を提供することによって、上記のニーズに対処する。特定の実施形態では、本開示は、腫瘍特異的抗原のＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、またはＮｅｃｔｉｎ－４と、共刺激性ＣＤ１３７受容体とに結合する二重特異性抗体を提供する。かかる二重特異性結合タンパク質は、がんなどの疾患または障害の治療に有用であり得る。

【0011】

また本明細書において提供されるのは、腫瘍関連抗原およびＣＤ１３７に結合する二重特異性結合タンパク質であり、この二重特異性結合タンパク質は、（ａ）腫瘍関連抗原に結合する第一の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含む抗体スキャフォールドモジュール、および（ｂ）ＣＤ１３７に結合する第三の抗原結合部位を含む少なくとも一つの第一の結合モジュールを含む。

【0012】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、以下からなる群から選択される：Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、およびＮｅｃｔｉｎ－４。

【0013】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｃｌａｕｄｉｎ６である。

【0014】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２である。

【0015】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｎｅｃｔｉｎ－４である。

【0016】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、ＩｇＧである。

【0017】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、およびＣＤＲ３：配列番号４７を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号４８、ＣＤＲ２：配列番号４９、およびＣＤＲ３：配列番号５０を含む軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号５１、ＣＤＲ２：配列番号５２、およびＣＤＲ３：配列番号５３を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号５４、ＣＤＲ２：配列番号５５、およびＣＤＲ３：配列番号５６を含む軽鎖可変領域配列を含む。

【0018】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、配列番号２５または配列番号２７に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２６または配列番号２８に記載の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0019】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、（ｉ）配列番号２５に記載の重鎖可変領域配列および配列番号２６に記載の軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号２７に記載の重鎖可変領域配列および配列番号２８に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0020】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、ＣＤＲ１：配列番号３３、ＣＤＲ２：配列番号３４、およびＣＤＲ３：配列番号３５を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号３６、ＣＤＲ２：配列番号３７、およびＣＤＲ３：配列番号３８を含む軽鎖可変領域配列とを含む。

【0021】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0022】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、ＣＤＲ１：配列番号５７、ＣＤＲ２：配列番号５８、およびＣＤＲ３：配列番号５９を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号６０、ＣＤＲ２：配列番号６１、およびＣＤＲ３：配列番号６２を含む軽鎖可変領域配列とを含む。

【0023】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または配列番号３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0024】

一部の実施形態では、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、（ｉ）配列番号２９に記載の重鎖可変領域配列および配列番号３０に記載の軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列および配列番号３２に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0025】

一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、一つの第一の結合モジュールを含む。

【0026】

一部の実施形態では、結合タンパク質は、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0027】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、抗体断片である。

【0028】

一部の実施形態では、抗体断片はｓｃＦｖである。

【0029】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合する。

【0030】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合するｓｃＦＶである。

【0031】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの重鎖配列を含み、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの軽鎖配列を含む。第一の結合モジュールは、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方のＣ末端、抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方のＣ末端、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方のＮ末端、抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方のＮ末端、またはそれらの組合せに共有結合され、第一の結合モジュールと抗体スキャフォールドモジュールは、直接的にまたはインターリンカーを介して互いに共有結合される。

【0032】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールおよび抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を有するインターリンカーを介して互いに共有結合される。

【0033】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の両方のＣ末端に共有結合される。

【0034】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の両方のＣ末端に共有結合される。

【0035】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の両方のＮ末端に共有結合される。

【0036】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合し、ＣＤＲ１：配列番号３９、ＣＤＲ２：配列番号４０、およびＣＤＲ３：配列番号４１を含む重鎖可変領域配列と、ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、およびＣＤＲ３：配列番号４４を含む軽鎖可変領域配列とを含む。

【0037】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合し、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含む。

【0038】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖のＣ末端に別々に結合される。

【0039】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0040】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0041】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0042】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールは、配列番号３に記載の配列を含む。

【0043】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、配列番号２１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各軽鎖のＣ末端に別々に結合される。

【0044】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0045】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0046】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0047】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールの軽鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールは、配列番号５に記載の配列を含む。

【0048】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＣｌａｕｄｉｎ６に結合し、配列番号２５または２７に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２６または２８に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖のＣ末端に別々に結合される。

【0049】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0050】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0051】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0052】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールは、配列番号１２、１３、または７２に記載の配列を含む。

【0053】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各軽鎖のＣ末端に別々に結合される。

【0054】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0055】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0056】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0057】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールの軽鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールは、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0058】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖のＮ末端に別々に結合される。

【0059】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0060】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0061】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0062】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール、グリシン－セリンリンカー、および抗体スキャフォールドモジュールの重鎖は、配列番号１８に記載の配列を含む。

【0063】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールを含み、第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位は、どちらもＮｅｃｔｉｎ－４に結合し、配列番号２９または３１に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号３０または３２に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールはそれぞれ、配列番号２３に記載の重鎖可変領域配列と、配列番号２４に記載の軽鎖可変領域配列とを含み、第一の結合モジュールは、グリシン－セリンリンカーによって抗体スキャフォールドモジュール中の各重鎖のＣ末端に別々に結合される。

【0064】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６４）である。

【0065】

一部の実施形態では、第一の結合モジュール中の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、グリシン－セリンリンカーによって結合される。

【0066】

一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、４×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６５）である。

【0067】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールは、配列番号１４に記載の配列を含む。

【0068】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、定常領域をさらに含む。

【0069】

一部の実施形態では、定常領域は、一つまたは複数のＦｃサイレンシング変異を含む。

【0070】

一部の実施形態では、Ｆｃサイレンシング変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）単独、またはＰ３２９Ａ変異（ＬＡＬＡＰ）もしくはＮ２９７Ａとの組合せとすることができる。

【0071】

一部の実施形態では、定常領域は、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７３を含む。

【0072】

また、本明細書に開示されるのは、腫瘍関連抗原およびＣＤ１３７に結合する二重特異性結合タンパク質であり、この二重特異性結合タンパク質は、（ａ）第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位を介して腫瘍関連抗原に結合するための手段を含む抗体スキャフォールドモジュールと、（ｂ）第三の抗原結合部位を介してＣＤ１３７に結合するための手段を含む少なくとも一つの第一の結合モジュールとを含む。

【0073】

本開示はまた、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0074】

本開示はまた、がんを治療または予防する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む。

【0075】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドである。本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターまたは細胞を提供する。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される細胞を培養することを含む、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質の生産のための方法である。

【図面の簡単な説明】

【0076】

前述の概要、ならびに本開示の以下の詳細な説明は、添付図面と併せて読むとより良く理解されよう。本開示を説明する目的で、図に示されるのは、現在好ましい実施形態である。しかし、本開示は、示される正確な配置、例、および手段に限定されないことが理解されるべきである。

【0077】

【図1A-1】 図１。図１～１Ｃは、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７、およびＮｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７二重特異性体の重鎖配列および軽鎖配列のアミノ酸配列を示す。

【図1A-2】同上。

【図1B-1】同上。

【図1B-2】同上。

【図1C-1】同上。

【図1C-2】同上。

【図1C-3】同上。

【図1D-1】図１Ｄは、ＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４に結合する結合タンパク質のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を示す。ＴＡＡ／ＣＤ１３７二重特異性タンパク質の他の構成要素の配列も示されている。ＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔナンバリング）は、それらのそれぞれの可変ドメイン配列に下線を付されている。配列識別子が示されている。

【図1D-2】同上。

【図1D-3】同上。

【図1D-4】同上。

【図1D-5】同上。

【図1D-6】同上。

【0078】

【図2】 図２は、三つの例示的な二重特異性結合タンパク質フォーマットを示し、これらは、ｉ）腫瘍関連抗原に結合する二つの抗原結合部位を有する抗体スキャフォールドモジュールと、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖定常領域のＣ末端にそれぞれが別々に結合された、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュール（例えばｓｃＦｖ）とを有する第一のフォーマット（ＢｓＡｂ＿Ａ）、ｉｉ）腫瘍関連抗原に結合する二つの抗原結合部位を有する抗体スキャフォールドモジュールと、抗体スキャフォールドモジュールの軽鎖定常領域のＣ末端にそれぞれが別々に結合された、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュール（例えばｓｃＦｖ）とを有する第二のフォーマット（ＢｓＡｂ＿Ｂ）、ならびにｉｉｉ）腫瘍関連抗原に結合する二つの抗原結合部位を有する抗体スキャフォールドモジュールと、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖可変領域のＮ末端にそれぞれが別々に結合された、ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュール（例えばｓｃＦｖ）とを有する第三のフォーマット（ＢｓＡｂ＿Ｃ）を含む。

【0079】

【図3】 図３は、１９０１Ａｂ１、１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、１９２３Ａｂ４、１９１２Ａｂ１、１９１２Ａｂ２、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、１９１２Ａｂ５、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、１９２５Ａｂ３、および１９２５Ａｂ４を含めた、複数の結合タンパク質の重鎖および軽鎖の組成物を示す。

【0080】

【図4】 図４は、１９０１Ａｂ１、１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、１９２３Ａｂ４、１９１２Ａｂ１、１９１２Ａｂ２、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、１９１２Ａｂ５、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、１９２５Ａｂ３、および１９２５Ａｂ４を含めた、複数の結合タンパク質の抗体スキャフォールドモジュールおよび結合モジュール（存在する場合）の組成物を示す。

【0081】

【図5】 図５は、１９０１Ａｂ１、１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、１９２３Ａｂ４、１９１２Ａｂ１、１９１２Ａｂ２、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、１９１２Ａｂ５、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、１９２５Ａｂ３、および１９２５Ａｂ４を含めた、複数の結合タンパク質における配列の配列識別子を示す。１９０１Ａｂ２、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、１９１２Ａｂ５、１９２５Ａｂ１、および１９２５Ａｂ３について、重鎖配列は、抗体スキャフォールドモジュールの重鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールのアミノ酸配列を含む。１９０１Ａｂ３および１９２５Ａｂ２について、軽鎖配列は、抗体スキャフォールドモジュールの軽鎖、グリシン－セリンリンカー、および第一の結合モジュールのアミノ酸配列を含む。

【0082】

【図6-1】 図６Ａ～Ｂは、腫瘍抗原であるＣｌａｕｄｉｎ６に対する結合活性を示す。図６Ａは、ＮＥＣ８ ＣＬＤＮ６ノックアウト細胞と比較した場合の、ＮＥＣ８野生型細胞の細胞表面のヒトＣｌａｕｄｉｎ６に対する単一特異性抗体（１９１２Ａｂ１および１９１２Ａｂ２）および二重特異性抗体ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７（１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４）ＢｓＡｂを示す。図６Ｂは、ＮＥＣ８野生型細胞に結合するｂｓＡｂ １９１２Ａｂ５を示す。

【図6-2】図６Ｃは、１９１２Ａｂ５が、Ｃｌａｕｄｉｎ６に選択的に結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ９には結合しないことを示す。

【0083】

【図7-1】 図７Ａ～Ｂは、ＣＤ１３７結合活性を示す。図７Ａは、ＣＤ１３７に結合する１９１２Ａｂ５の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析を示す。図７Ｂは、ＨＥＫ－ＣＤ１３７細胞ベースの結合アッセイにおける１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、および１９２３Ａｂ４のヒトＣＤ１３７結合を示す。

【図7-2】図７Ｃは、ヒトＣＤ１３７との１９１２Ａｂ５およびウレルマブ－ＮＲの結合の用量応答結合曲線を示す。ウレルマブ－ＮＲは、米国特許第７，２８８，６３８号に公開された公的入手可能な情報に基づく、内部対照の抗ＣＤ１３７抗体である。

【0084】

【図8-1】 図８Ａ～Ｄは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ１３７ ＮＦＫＢレポーター細胞を使用したＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＣＤ１３７シグナル伝達のＣｌａｕｄｉｎ－６依存的な活性化を示す。図８Ａは、ＮＥＣ８野生型細胞またはＣｌａｕｄｉｎ６ノックアウトＮＥＣ８細胞の存在下での共培養アッセイにおける、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、またはベンチマーク対照のウレルマブ－ＮＲに由来する活性を示す。図８Ｂは、ＮＥＣ８野生型細胞の存在下でのシグナル伝達アッセイにおける、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、またはベンチマーク対照ウレルマブ－ＮＲの用量依存性活性を示す。

【図8-2】図８Ｃは、ＮＥＣ８標的細胞を使用した共培養シグナル伝達アッセイにおける、１９１２Ａｂ５またはウレルマブ－ＮＲによるＮＦＫＢ活性化を示す。図８Ｄは、ＯＶ９０標的細胞を使用した共培養シグナル伝達アッセイにおける、１９１２Ａｂ５またはウレルマブ－ＮＲによるＮＦＫＢ活性化を示す。

【0085】

【図9-1】 図９は、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＩＦＮγ分泌を誘導するＣＤ８ Ｔ細胞のＣｌａｕｄｉｎ６依存的な活性化を示す。図９Ａは、ＮＥＣ８野生型細胞またはＣｌａｕｄｉｎ６ノックアウトＮＥＣ８細胞の存在下での共培養アッセイにおける、１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、またはベンチマーク対照のウレルマブ－ＮＲに由来する活性を示す。図９Ｂは、ＮＥＣ８野生型細胞の存在下での、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、およびベンチマーク対照ウレルマブ－ＮＲの用量依存的な活性を示す。

【図9-2】図９Ｃは、ＮＥＣ８野生型細胞を使用した共培養シグナル伝達アッセイにおける、１９１２Ａｂ５またはウレルマブ－ＮＲによるＩＦＮγ分泌を示す。図９Ｄは、Ｃｌａｕｄｉｎ６ノックアウトＮＥＣ８細胞を使用した共培養シグナル伝達アッセイにおける、１９１２Ａｂ５またはウレルマブ－ＮＲによるＮＦＫＢ活性化を示す。

【0086】

【図10】 図１０Ａ～Ｂは、標的細胞の殺傷であるＴ細胞由来の殺傷を示す。図１０Ａは、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７二重特異性抗体である１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４によるＮＥＣ８細胞の殺傷を示す。図１０Ｂは、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７二重特異性抗体である１９１２Ａｂ５によるＴ細胞由来ＯＶ９０細胞の殺傷を示す。

【0087】

【図11】 図１１Ａ～Ｃは、マウスＭＣ３８腫瘍モデルを使用したインビボでの有効性および安全性データを示す。図１１Ａは、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４によるインビボでのＭＣ３８－Ｃｌａｕｄｉｎ６腫瘍増殖の－Ｃｌａｕｄｉｎ６による阻害を示す。マウスの活性酵素の活性を、２１日目の血清を使用して測定した。ＡＬＴ活性を図１１Ｂに示し、ＡＳＴ活性を図１１Ｃに示す。図１１Ｄは、１９１２Ａｂ３または１９１２Ａｂ４によって事前処置され完全な腫瘍寛解を有したマウスを使用した、再曝露試験の結果を示す。

【0088】

【図12】 図１２は、０．３ｍｐｋ、１ｍｐｋ、および３ｍｐｋでの１９１２Ａｂ５の抗腫瘍増殖効果を示す。

【0089】

【図13】 図１３は、０．１ｍｐｋでの１９１２Ａｂ５および０．１ｍｐｋでのベンチマーク抗体のウレルマブ－ＮＲの抗腫瘍増殖効果を示す。

【0090】

【図14】 図１４は、定着した大きな腫瘍を治療する１９１２Ａｂ５の抗腫瘍効果を示す。

【0091】

【図15】 図１５は、対照（図１５Ａ）または１９１２Ａｂ５（図１５Ｂ）により処理した腫瘍の蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）データを示す。

【0092】

【図16】 図１６Ａ～Ｆは、対照または１９１２Ａｂ５により処理した腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球の結果を示す。データは、ＣＤ４（図１６Ａ）、ＣＤ８（図１６Ｂ）、Ｔｃｅｍ（図１６Ｃ）、Ｔｒｍ（図１６Ｄ）、疲弊Ｔ細胞（図１６Ｅ）、およびＭ２様マクロファージ細胞（図１６Ｆ）における、対照および１９１２Ａｂ５処理細胞のデータを比較する免疫細胞プロファイリングを記載する。

【0093】

【図17】 図１７は、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍の治療における１９１２Ａｂ５の抗腫瘍増殖効果を示す。

【0094】

【図18】 図１８は、ＮＵＧＣ４細胞上のヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２に対する、単一特異性の１９０１Ａｂ１およびＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３の結合活性を示す。

【0095】

【図19】 図１９は、細胞表面のヒトＣＤ１３７に対するＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３、ならびに単一特異性の抗ＣＤ１３７抗体である１９２３Ａｂ４の結合活性を示す。

【0096】

【図20】 図２０Ａ～Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ１３７レポーター細胞を使用したＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＣＤ１３７シグナル伝達のＣｌａｕｄｉｎ１８．２依存的な活性化を示す。図２０Ａは、棒グラフを示し、図２０Ｂは、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＤ１３７二重特異性抗体の用量依存性活性を示す。

【0097】

【図21】 図２１は、ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を誘導するためのＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの用量応答曲線を示す。

【0098】

【図22】 図２２は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３によるＴ細胞由来の標的細胞の殺傷を示す。

【0099】

【図23】 図２３は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９０１Ａｂ２によるインビボにおけるＭＣ３８－Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２腫瘍増殖の阻害を示す。

【0100】

【図24】 図２４は、Ｎｅｃｔｉｎ４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３のＣＨＯ細胞上のヒトＮｅｃｔｉｎ４との結合活性を、親マウスモノクローナル抗体１９２５Ａｂ４の結合活性に比べて示す。

【0101】

【図25】 図２５は、Ｎｅｃｔｉｎ４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３の細胞表面のヒトＣＤ１３７との結合活性を、親マウスモノクローナル抗体１９２５Ａｂ４の結合活性に比べて示す。

【0102】

【図26A】 図２６Ａ～Ｂは、Ｎｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂが、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ１３７レポーター細胞を使用して標的細胞依存的なＣＤ１３７アゴニズムを誘導することを示す。図２６Ａは、棒グラフを示し、図２６Ｂは、Ｎｅｃｔｉｎ４／ＣＤ１３７二重特異性抗体の用量依存性活性を示す。

【図26B】同上。

【0103】

【図27-1】 図２７Ａ～Ｃは、対照抗体、ウレルマブ－ＮＲ、または１９１２Ａｂ５の処理によって誘導された免疫細胞浸潤を示す。ＣＤ４（Ａ）、ＣＤ８（Ｂ）、およびＦ４／８０（Ｃ）によって染色されたマウス肝臓ＩＨＣ切片を用いて、Ｔ細胞浸潤およびマクロファージ浸潤を示した。

【図27-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0104】

本開示は、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。例示的なＴＡＡとしては、以下に限定されないが、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、およびＮｅｃｔｉｎ４が挙げられる。有利なことに、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は、オンターゲット毒性を克服することが可能である。例えば、腫瘍関連抗原が発現されないかまたはアクセス可能ではない肝臓などの組織では、本開示の分子は、ＣＤ１３７媒介性細胞傷害性を活性化できないため、安全となろう。対照的に、腫瘍関連抗原が過剰発現されるかまたはアクセス可能である腫瘍組織では、抗体は、腫瘍関連抗原結合依存的なＣＤ１３７シグナル伝達の活性化を受け、ＣＤ１３７媒介性の免疫細胞の活性化をもたらし、それによって腫瘍を治療する。本二重特異性結合タンパク質は、がんの治療に使用され得る。さらに、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は、より低い用量製剤を生じるがゆえに、より少ない頻度および／またはより効果的な投与をもたらし、コストの低減および効率の増加に繋がる。

【0105】

腫瘍微小環境では、完全なＴ細胞活性化は、二つのシグナルに依存するが、うち一方はＴＣＲ／ＣＤ３の活性化を介して媒介され、他方は共刺激経路によって媒介される。Ｔ細胞共刺激を提供する表面受容体の中でも、ＣＤ１３７は重要な調節因子である。腫瘍標的化ＣＤ１３７アゴニスト性抗体は、単独で、または腫瘍標的化ＣＤ３非依存性抗体と組み合わせて使用して、Ｔ細胞の増殖、生存、メモリー形成、および腫瘍殺傷機能を促進し得る。

【0106】

ＣＤ１３７共刺激（すなわち、アゴニズム）は、Ｔ細胞増殖の延長、アネルギー性Ｔ細胞の再活性化、メモリーＴ細胞の形成および維持の促進に繋がることが報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｋ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２１ Ｍａｙ １１；１３（１０）：２２８８；Ｃｈｅｓｔｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．．Ｂｌｏｏｄ ２０１８ Ｊａｎ ４；１３１（１）：４９－５７））。ＣＤ１３７をアゴニスト性抗体で活性化することは、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の治療有効性を改善するか、またはＩＣＩに対する耐性を克服する機会を提供する。さらに、ＴＡＡの存在下でのみＣＤ１３７シグナル伝達を活性化する二重特異性抗体は、肝臓常在性クッパー細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化に対するモノクローナル抗ＣＤ１３７アゴニスト性抗体を用いた臨床試験にて観察される、用量依存性肝毒性の低減に役立ち得る。したがって、本開示は、ＣＤ１３７のＴＡＡ媒介性クラスター化を介して腫瘍微小環境においてＣＤ１３７共刺激経路を活性化するように一意に設計された、新規の四価のＴＡＡ／ＣＤ１３７結合タンパク質（すなわち、二重特異性抗体）を提供する。

【0107】

本開示がより容易に理解され得るように、特定の技術用語および科学用語が以下に具体的に定義される。この文書の他の箇所で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての他の技術用語および科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

【0108】

本開示全体を通して、以下の略語が使用されるものとする。
ＢｓＡｂ－二重特異性抗体
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ－モノクローナル抗体。
ＣＤＲ－免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域。
ＶＨまたはＶＨ－免疫グロブリン重鎖可変領域。
ＶＬまたはＶＬ－免疫グロブリン軽鎖可変領域。
ＦＲ－抗体フレームワーク領域、ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域。

【0109】

用語「ＣＤ１３７」とは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである４－１ＢＢまたはＴＮＦＲＳＦ９（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９）を指し、免疫細胞（自然免疫細胞および適応免疫細胞の両方）の活性化に続いて発現される共刺激分子である。本明細書で使用される際に、４－１ＢＢは、哺乳類、例えば、ホモサピエンス（ヒト）（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１５５２）に由来し得る。本明細書に記載されるように、ＣＤ１３７という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトＣＤ１３７タンパク質に特異的な抗体は、ある場合には、ヒト以外の種由来のＣＤ１３７タンパク質と交差反応することがある。他の実施形態では、ヒトＣＤ１３７タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＤ－１３７タンパク質に完全に特異的であることもあり、種もしくは他のタイプの交差反応性を示すこともあり、ある他の種由来のＣＤ１３７と交差反応するが他の全ての種と交差反応しないこともある（例えば、サルＣＤ１３７と交差反応するがマウス４－１ＢＢとは交差反応しない）。用語「ｃｙｎｏ ＣＤ１３７」は、ＮＣＢＩ受入番号ＸＰ＿００５５４４９４５．１を有する完全アミノ酸配列などのカニクイザルＣＤ１３７を指す。用語「マウスＣＤ１３７」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０３５７４２．１を有するマウス４－１ＢＢの完全なアミノ酸配列などの、マウス配列４－１ＢＢを指す。本開示のヒトＣＤ１３７配列は、例えば、保存された変異または非保存領域内の変異を有することによって、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１５５２のヒトＣＤ１３７とは異なることがあり、本開示のＣＤ１３７は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１５５２のヒトＣＤ１３７と実質的に同じ生物学的機能を有する。

【0110】

用語「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」とは、正常細胞（すなわち、非腫瘍細胞）上で観察される量よりも多い量（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上）で腫瘍細胞の表面に発現される抗原を指す。「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」という用語は、腫瘍に特有の抗原を指す。ＴＡＡおよびＴＳＡの非限定的な例としては、ＡＦＰ、ＢＡＧＥ、ＢＣＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＤＡＭ－６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＳＬＮ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４，ＰＤ－Ｌ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６，ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭ、ＴＲＰ－２、Ｗｔ－１、ＰＳＡおよびＳＡＲＴ－１が挙げられる。

【0111】

用語「Ｃｌａｕｄｉｎ６」または「ＣＬＤＮ６」（本明細書では互換的に使用される）は、好ましくはヒトＣＬＤＮ６に関し、特に、配列表の配列番号７５によるアミノ酸配列を含むタンパク質、または当該アミノ酸配列のバリアントに関する。用語「ＣＬＤＮ６」は、翻訳後修飾バリアントおよび立体構造バリアントなどの任意のＣＬＤＮ６バリアントを含む。ヒト、カニクイザル、およびマウスのＣＬＤＮ６のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６７０１８．２（ヒト）（配列番号７５）、ＸＰ＿００５５９１０８０．１（カニクイザル（配列番号７６）、およびＮＰ＿０６１２４７．１（マウス）（配列番号７７）に示される。ＣＬＤＮ６のオルソログは、カニクイザルおよびマウスそれぞれにおいて、ヒトタンパク質と９９％超および約８８％の同一性を共有する。

【0112】

本明細書で使用される際に、用語「Ｃｌａｕｄｉｎ１８アイソフォーム２」（ＣＬＤＮ１８．２と互換的に使用される）とは、ＮＣＢＩエントリーＮＰ＿００１００２０２６．１のＣｌａｕｄｉｎ－１８アイソフォーム２に提供されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるペプチドを指し、そのようなペプチドには、正常細胞または形質転換したがん細胞の表面に存在するか、またはＣＬＤＮ１８．２遺伝子でトランスフェクトされた細胞上に発現される、翻訳後修飾バリアントおよび種ホモログが含まれる。Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２は、配列番号７２によるアミノ酸配列を有することが好ましい。

【0113】

用語「Ｎｅｃｔｉｎ－４」（Ｎ４）、または「Ｎｅｃｔｉｎ－４タンパク質」は、ヒトＮｅｃｔｉｎ－４、具体的にはＮｅｃｔｉｎ－４の天然配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、全てのホモログ、断片、および前駆体を含む。ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスのＮｅｃｔｉｎ－４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿１１２１７８．２（ヒト）（配列番号７８）、ＸＰ＿００５５４１２７７．１（カニクイザル）（配列番号７９）、ＮＰ＿００１１０２５４６．１（ラット）（配列番号８０）、およびＮＰ＿０８２１６９．２（マウス）（配列番号８１）に示される。Ｎｅｃｔｉｎ－４のオルソログは、カニクイザル、ラット、およびマウスそれぞれにおいて、ヒトタンパク質と９９％超、約９４％、および約９２％の相同性を共有する。

【0114】

「同一性割合」という用語は、比較されるべき二つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されているが、この割合は、最も良くアラインメントさせた後に得られ、完全に統計的であり、二つの配列間の差異は、ランダムにかつそれらの全長にわたって分配される。二つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適にアラインメントさせた後に比較することによって行われ、この比較は、配列類似性を有する局所的な領域を識別し比較するために、セグメントまたは「比較ウィンドウ」によって行われる。比較のための配列の最適なアライメントは、手動による他に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，：１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータープログラム（ウィスコンシン州マディソン、サイエンスドライブ５７５、ジェネティクス・コンピューター・グループのウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、生成することができる。

【0115】

本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

【0116】

本明細書の用語「抗体スキャフォールドモジュール」とは、二つの重鎖および二つの軽鎖を有するＹ字型抗体を指す。この二つの重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結される。抗体スキャフォールドは、その重鎖および／または軽鎖のうち一つまたは複数に付加された一つまたは複数の結合モジュールを有し得る。抗体結合スキャフォールドは、二つのＦａｂと、二つの定常領域配列を有するＦｃ部分とを含む。

【0117】

本明細書で使用される際に、用語「交差反応」とは、異なる種由来のＣＤ１３７またはＴＡＡにそれぞれ結合する、本明細書に記載の抗ヒトＣＤ１３７抗体または抗ヒトＴＡＡ抗体の能力を指す。例えば、本明細書に記載の抗体はまた、別の種（例えば、ラットまたはマウスのＣＤ１３７またはＴＡＡ）由来のＣＤ１３７またはＴＡＡに結合し得る。

【0118】

ＩｇＧなどの例示的な抗体は、二つの重鎖と二つの軽鎖とを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）および軽鎖定常領域からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の入り交じった、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で整列された三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

【0119】

一般に、超可変領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に参照される、軽鎖可変領域内の概ねアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の概ね３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を表す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）に由来するアミノ酸残基、ならびに／またはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７に参照される、超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域内の残基２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、および９１～９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の残基２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５３～５５（ＨＣＤＲ２）、および９６～１０１（ＨＣＤＲ３））を包含する。

【0120】

本明細書で使用される際に、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。例えば、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得るバリアント抗体を除けば、同一である、および／または同じエピトープに結合し、上記バリアント抗体は、例えば、天然に生じる変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に発生し、概して少量で存在する。ポリクローナル抗体調製物が、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むのとは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から取得される抗体の特性を示すため、いかなる方法による抗体の産生を必要とするとも解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な手法によって作製され得るが、そのような手法としては、以下に限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられ、かかる方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0121】

用語「キメラ」抗体とは、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、一方で、鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体内の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、組換え抗体ならびにその抗体の断片を指す。加えて、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を実施して、親和性または特異性を含む抗体分子の特定の特性を変化させてもよい。典型的には、可変ドメインは、齧歯類などの実験動物（「親抗体」）由来の抗体から取得され、定常ドメイン配列は、ヒト抗体から取得されるため、結果として得られるキメラ抗体は、ヒト対象においてエフェクター機能を方向付けることができ、その由来とする親（例えば、マウス）抗体よりも有害な免疫応答を誘発しにくいものとなる。

【0122】

用語「ヒト化抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と共に、可変領域に一つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含むように工学的に操作されている抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域を除いて完全にヒトである配列を含む。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト化抗体と比較して、ヒトに対する免疫原性が低く、したがって、特定の状況で治療的利益を提供する。当業者は、ヒト化抗体を認識し、その生成に適した技術も認識するものとなる。例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：３５，２００５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３，１９８９；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－３６，１９８８；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３－３７，１９８９；米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第６，１８０，３７０号、およびＳｅｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９０／０７８６１を参照されたい。

【0123】

「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、および／または当業者に公知のヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されている、抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、当技術分野に公知の様々な手法を用いて生産し得るが、そのようなものとしては、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（Ｉ）：８６－９５（１９９１）に記載された方法が挙げられる。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：３６８－７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原曝露に応答して当該抗体を産生するように改変されているが内因性遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって、例えば免疫されたＨｕＭａｂマウス（例えば、ＨｕＭａｂマウスに関するＮｉｌｓ Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９、ＷＯ９８／２４８８４、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２７、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／０３９１８、およびＷＯ０１／０９１８７を参照）、ｘｅｎｏマウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号および６，１５０，５８４を参照）、またはＴｒｉａｎｎｉマウス（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３９１、ＷＯ２０１７／０３５２５２、およびＷＯ２０１７／１３６７３４）によって、調製することができる。

【0124】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。五つの主な抗体のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

【0125】

抗体の「抗原結合ドメイン」（または単に「結合ドメイン」）という用語または類似の用語は、抗原複合体に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉ）合成リンカーによって任意に接合され得る二つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ、が挙げられる。

【0126】

抗体の「可変ドメイン」（Ｖドメイン）は、特定の抗体の結合を媒介し抗原特異性を付与する。しかし、その変動性は、可変ドメインの１１０アミノ酸範囲にわたって均等には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９～１２アミノ酸長の「超可変領域」またはＣＤＲと本明細書では称される極端に変動性のあるより短い領域によって分断された、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の広がりからなる。当業者によって理解されるように、異なるナンバリングシステム間では、ＣＤＲの正確なナンバリングおよび配置が異なる可能性がある。しかし、可変重鎖配列および／または可変軽鎖配列の開示は、関連するＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。

【0127】

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、本明細書でこれらの用語が使用される際には、特定の抗原認識を媒介することに主に関与する重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内にある短いポリペプチド配列を指す。各ＶＬおよび各ＶＨ内には、三つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される）がある。本明細書に別段の記載がない限り、ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔナンバリング則（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｉｎ：ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）に従って注釈される。

【0128】

他の実施形態では、抗体のＣＤＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２－７４５に従って決定することができる。他の実施形態では、抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ超可変領域を指すＡｂＭナンバリング則に従って決定することができ、ＡｂＭ超可変領域とは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の折衷を表し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるオックスフォード・モレキュラー社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（オックスフォード・モレキュラー・グループ社）によって使用される。ＣＤＲはまた、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｉｎ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．の配列比較によって画定されてもよいが、一方、ＨＶＬは、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７に記載されるように、可変ドメインの三次元構造に従って構造的に定義される。これら二つの方法がＣＤＲのわずかに異なる識別をもたらす場合、構造的な定義が好ましい。Ｋａｂａｔによって定義されるように、ＣＤＲ－Ｌ１は、軽鎖可変ドメイン内のおよそ残基２４～３４に、ＣＤＲ－Ｌ２はおよそ残基５０～５６に、ＣＤＲ－Ｌ３はおよそ残基８９～９７に位置付けられ、ＣＤＲ－Ｈ１は、重鎖可変ドメイン内のおよそ残基３１～３５に、ＣＤＲ－Ｈ２およそ残基５０～６５に、ＣＤＲ－Ｈ３はおよそ残基９５～１０２に位置付けられる。ＩＭＧＴおよびＮＯＲＴＨは、ＣＤＲの代替的な定義を提供する（Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ．Ｕｎｉｑｕｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９９７）１８：５０９；ａｎｄ Ｎｏｒｔｈ Ｂ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ａ，Ｄｕｎｂｒａｃｋ ＲＬＪ．Ａ ｎｅｗ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ ｌｏｏｐ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１１）４０６：２２８－５６を参照）。さらに、ＣＤＲは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＣＣＧ）ナンバリング（Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２０１１；７９：３０５０－３０６６ ａｎｄ Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２０１４；８２：１５９９－１６１０）に従って定義されてもよい。したがって、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、所与の抗体に特異的な固有かつ機能的な特性を定義する。

【0129】

「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、四つのＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。

【0130】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨのフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンのＶＬ配列またはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。概して、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），Ｖｏｌｓ．１－３にある通りのサブグループである。一実施形態では、ＶＬについては、サブグループは、前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にある通りのサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについては、サブグループは、前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にある通りのサブグループＩＩＩである。

【0131】

「ヒンジ領域」は、概して、ヒトＩｇＧ１の２１６～２３８（ＥＵナンバリング）または２２６～２５１（Ｋａｂａｔナンバリング）の広がりとして定義される。ヒンジは、上部ヒンジ、中間（例えば、コア）ヒンジ、および下部ヒンジという三つの別個の領域にさらに分けることができる。

【0132】

本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域およびバリアントのＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延在する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していても存在していなくてもよい。本明細書に別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに従うが、このシステムは、ＥＵインデックスとも呼ばれ、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載される通りのものである。

【0133】

用語「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）_２、ダイアボディ、直線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片と、結晶化し易いという能力を反映した名称を持つ残りの「Ｆｃ」断片とが産生する。Ｆａｂ断片は、軽（Ｌ）鎖全体と、重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および一本の重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ（ａｂ）_２断片が生じるが、この断片は、二価の抗原結合活性を有しかつ依然として抗原を架橋することができるジスルフィド連結された二つのＦａｂ断片にほぼ対応する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つまたは複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加的な少数の残基を有するという点で、Ｆａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学カップリングも公知である。

【0134】

「Ｆｖ」は、緊密な非共有結合性の会合状態にある、一つの重鎖可変領域ドメインと一つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。これら二つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する、六つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖からそれぞれ３ループ）が発生する。

【0135】

「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質を指す。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。一部の態様では、この領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと結合される。リンカーは、柔軟性のためにグリシンを豊富に含ませることができ、また溶解性のためにセリンまたはスレオニンを豊富に含ませることができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続するか、またはその逆とすることができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、特異的なＶＨ残基またはＶＬ残基にシステイン変異を対で導入することによって、工学的に操作することができる。これらの残基は、ＶＨおよびＶＬの境界にある。参考文献Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｏｒｍａｔ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＶＬ－ＶＨ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２５，３２１－３２９，ＮｏｖａＲｏｃｋ ｕｓｅｄ ＶＨ４４－ＶＬ１００を参照されたい。

【0136】

用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で用いられ、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を特異的にカバーするが、このＶＨ－ＶＬ単位は、ポリエピトープ特異性を有する（例えば、一つの生体分子上の二つの異なるエピトープまたは異なる生体分子上の各エピトープに結合することが可能である）。かかる多重特異性抗体としては、以下に限定されないが、完全長抗体、二つ以上のＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する抗体、二重特異性ダイアボディ、ならびにトリアボディが挙げられる。「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的上の二つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。

【0137】

「二特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」または「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、同じまたは異なる標的上の二つの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかし、二重特異性抗体とは対照的に、二特異性抗体は、アミノ酸配列において同一である二つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームは、二つの抗原を認識する能力を有する。二特異性により、抗体は、単一のＦａｂ分子またはＩｇＧ分子として、二つの異なる抗原と高い親和性で相互作用することが可能になる。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態の多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で、各エピトープに結合する。「単一特異性」とは、一つのエピトープのみに結合する能力を指す。多重特異性抗体は、完全免疫グロブリン分子に類似した構造を有するものとすることができ、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含むものとすることができる。そのような構造としては、以下に限定されないが、ＩｇＧ－Ｆｖ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２、ＤＶＤ－Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）２－（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、および（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）_２が挙げられる。ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２の場合、ｓｃＦｖは、重鎖または軽鎖のどちらかのＮ末端またはＣ末端のどちらかに付加させることができる。

【0138】

本明細書で使用される際に、用語「二重特異性抗体」（ＢｓＡｂ）は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体であって、多くの場合にヒト型であるかまたはヒト化された抗体を指す。本開示では、結合特異性のうちの一方はＣＤ１３７に、他方はＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４に向けるものとすることができる。

【0139】

本明細書で使用される際に、用語「ダイアボディ」とは、二つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を指し、この抗体では、各ポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のＶＨドメインとＶＬドメインとを分子内会合させるには短すぎるリンカー（例えば、五つのアミノ酸からなるリンカー）によって接合されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。この構成により、ホモ二量体構造を形成するように、各ドメインは別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合する。したがって、用語「トリアボディ」とは、三つのペプチド鎖を含む三価抗体を指し、そのそれぞれは、同じペプチド鎖内のＶＨドメインとＶＬドメインとの分子内会合を可能にするには短すぎるリンカー（例えば、１～２アミノ酸から構成されるリンカー）によって接合された、一つのＶＨドメインおよび一つのＶＬドメインを含有する。

【0140】

本明細書に開示される様々な抗体を説明するために使用される際に、用語「単離抗体」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収された抗体を意味する。単離された抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の生産、精製、および／または保存の間に発生する一つまたは複数の翻訳後修飾を有する抗体または抗体断片のバリアントを含み得る。その天然環境の汚染物質成分は、ポリペプチドの診断または治療の用途に典型的には干渉する材料である。それらは、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。一部の実施形態では、単離された抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）法またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）法によって決定されるような、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することによって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列のうち少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた非還元または還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。

【0141】

標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、測定できる程度に非特異的相互作用とは異なる、結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合と比較して決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、過剰量の非標識の標的など、標的に類似した対照分子との競合によって決定することができる。この場合では、標識された標的とプローブとの結合が、過剰な未標識の標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が標示される。本明細書で使用される際の、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば１０^－４Ｍ以下、あるいは１０^－５Ｍ以下、あるいは１０^－６Ｍ以下、あるいは１０^－７Ｍ以下、あるいは１０^－８Ｍ以下、あるいは１０^－９Ｍ以下、あるいは１０^－１０Ｍ以下、あるいは１０^－１１Ｍ以下、あるいは１０^－１２Ｍ以下の標的に対するＫｄ、または１０^－４Ｍ～１０^－６Ｍ、もしくは１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、もしくは１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍの範囲にあるＫｄを有する分子によって示すことができる。当業者によって理解されるように、親和性とＫＤ値は反比例する。抗原に対する高い親和性は、低いＫＤ値により測定される。一実施形態では、用語「特異的結合」とは、分子が、いかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、ＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４（またはＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、もしくはＮｅｃｔｉｎ－４のエピトープ）に結合するという結合を指す。

【0142】

本明細書で使用される際に、用語「ＣＤ１３７に結合する」、「ＣＬＤＮ６に結合する」、「ＣＬＤＮ１８．２に結合する」、「Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する」は、ヒトＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、もしくはＮｅｃｔｉｎ－４が正常細胞もしくは悪性細胞の表面に発生する場合に、またはＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、もしくはＮｅｃｔｉｎ－４をそれぞれ過剰発現するように工学的に操作された組換え宿主細胞の表面に発生する場合に、内因性ヒトＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、もしくはＮｅｃｔｉｎ－４を認識して結合する抗体または抗原結合断片の能力を指す。

【0143】

本明細書に使用される際に、用語「親和性」とは、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって与えられ、式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの文献は、参照により本明細書に全体を組み込まれている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の標準的な方法の一つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置を用いた分析によるなど）の使用である。

【0144】

「エピトープ」とは、抗体とその抗原との間の相互作用の一つまたは複数の部位を示す。Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ，Ｊｒ．，Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｒｔ ＩＩ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ３－ ８．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．に記載されるところでは、「抗体は一般に、タンパク質などの高分子の表面の小さな領域のみを認識し・・・ ［特定のエピトープ］は、タンパク質フォールディングによって合わさった［抗原］ポリペプチド鎖の異なる部分に由来するアミノ酸から構成されやすい。この種の抗原決定基は、認識される構造が抗原のアミノ酸配列では不連続であるが三次元構造では合わさったタンパク質のセグメントから構成されるため、立体構造または不連続のエピトープとして知られている。対照的に、ポリペプチド鎖の単一のセグメントから構成されるエピトープは、連続的または線状のエピトープと呼ばれる」（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ｊｒ．，Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｒｔ ＩＩ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ３－８．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．）。

【0145】

本明細書で使用される際に、用語「ＫＤ」とは、ｋｄとｋａとの比（例えば、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現される平衡解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好適な方法としては、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）分析であって好ましくはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ装置を使用するもの、表面プラズモン共鳴法であってＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用するもの、またはフローサイトメトリーおよびスキャチャード分析が挙げられる。

【0146】

本明細書で使用される際に、用語「ＫＤ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。これは、以下の式によって計算される。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ＝ＫＤ。結合カイネティクスは、抗体がその標的にどの程度速く結合するか（Ｋｏｎ）、および抗体がその標的からどの程度速く解離するか（Ｋｏｆｆ）を記述する。抗体のその標的上の、例えばＣＤ１３７上の滞留時間は、これらの動力学的特徴によって決定される（Ｓｃｈｕｅｔｚ，ＤＡ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｄｒｉｖｅｎ ｅｆｆｏｒｔ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ２２：８９６－９１１）。

【0147】

本明細書で使用される際に、用語「ＩＣ_５０」は、それが結合する抗原の生物活性の５０％を中和するために必要な本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質の有効濃度を指すことが意図される。

【0148】

作用物質および具体的な活性（例えば、細胞への結合、酵素活性の阻害、免疫細胞の活性化または阻害）に関する「ＥＣ_５０」とは、かかる活性に関するその最大の応答または効果の５０％を生じる作用物質の効率的な濃度を指す。作用物質および特定の活性に関する「ＥＣ_１００」とは、かかる活性に関してその実質的に最大の応答を生じる作用物質の効率的な濃度を指す。

【0149】

本明細書で使用される際に、用語「抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）」とは、合成リンカーを介して細胞傷害剤（ペイロードとして知られる）に共有結合された組換えモノクローナル抗体からなる免疫コンジュゲートを指す。免疫複合体（抗体－薬剤複合体、ＡＤＣ）は、非常に強力な抗体ベースのがん治療剤のクラスである。ＡＤＣは、合成リンカーを介して細胞傷害剤（ペイロードとして知られる）に共有結合された組換えモノクローナル抗体からなる。ＡＤＣは、モノクローナル抗体の特異性と低分子化学療法剤の効力とを組み合わせて、細胞傷害性の高い小分子薬剤部分を腫瘍細胞へ標的送達することを促進する。

【0150】

本明細書で使用される際に、用語「エンドサイトーシス」とは、真核細胞が形質膜片、細胞表面受容体、および細胞外液由来成分を内部移行させるプロセスを指す。エンドサイトーシス機構としては、受容体媒介性エンドサイトーシスが挙げられる。用語「受容体媒介性エンドサイトーシス」とは、リガンドがその標的に結合すると、膜の陥入および挟み込みを惹起し、内部移行されてサイトゾル内に送達されるか、または適切な細胞内区画に移されるという生物学的機構を指す。

【0151】

用語「バイスタンダー効果」とは、抗体薬剤コンジュゲートにより標的とされる腫瘍細胞に隣接する健康な細胞の、標的細胞媒介性の殺傷を指す。バイスタンダー効果は、一般に、疎水性の細胞傷害剤の細胞性流出によって引き起こされ、この流出により、抗原陽性の標的細胞から隣接する抗原陰性の健康な細胞への拡散が可能となる。バイスタンダー効果の有無は、免疫複合体を生成するために使用されるリンカーおよびコンジュゲーションの化学物質の態様に起因し得る。

【0152】

ある特定のＦｃ受容体との抗体Ｆｃ領域の相互作用に由来する「エフェクター機能」という用語には、以下に限定されないが、Ｃｌｑ結合能、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合能、ＡＤＣＣなどのＦｃｙＲ介在性エフェクター機能、抗体依存性細胞媒介性貪食能（ＡＤＣＰ）、Ｔ細胞依存性細胞性細胞傷害性（ＴＣＤＤ）、および細胞表面受容体の下方制御が含まれる。かかるエフェクター機能は、一般に、抗原結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。

【0153】

本明細書で使用される際に、「抗体ベースの免疫療法」および「免疫療法」という用語は、ＣＤ１３７およびＣＬＤＮ６、ＣＤ１３７およびＣＬＤＮ１８．２、またはＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する結合タンパク質の標的化特異性に依存して、ＣＤ１３７、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、および／またはＮｅｃｔｉｎ－４の発現細胞に対する直接的または間接的な効果を媒介する、任意の形態の療法を広く指すために使用される。

【0154】

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する抗体受容体を記述し、この受容体は、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞を含めた、ある特定の免疫細胞の膜に位置する抗原認識に関与する。ＩｇＧのＦｃ部分を認識するＦｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる。ＦｃγＲファミリーには、これらの受容体の対立遺伝子性バリアントおよび選択的スプライシング体が含まれる。ＩｇＧ結合の構造、機能、および親和性の差異に基づいて、ＦｃγＲは、三つの主要な群、すなわち ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ（ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂ）、ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）に分類される。中でも、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａのγサブユニット内、またはＦｃγＲＩＩａの細胞質側の尾部内に、シグナル伝達モチーフ、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する活性化受容体である。抗原－抗体複合体の結合後、活性化Ｆｃγ受容体（ヒト：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびマウス：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶ）は、免疫エフェクター機能を惹起する。対照的に、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）は阻害性受容体である。ＦｃγＲＩＩｂの架橋は、免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化および阻害性のシグナル伝達をもたらす（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：２２３）。

【0155】

用語「Ｆｃサイレンシングされた」とは、ＦｃγＲおよび補体との結合活性を最小化し／消失させ、Ｆｃ媒介性エフェクター機能のサイレンシングまたは排除に繋がるように工学的に操作されたＦｃ領域を指す。Ｆｃを工学的に操作するための戦略としては、Ｆｃグリコシル化の改変、ＩｇＧサブクラスのハイブリッドの使用、またはヒンジ領域および／もしくはＣＨ２領域への一つまたは複数の変異の導入が挙げられる。残基はエフェクター機能に重要であり、Ｆｃをサイレンシングするそれぞれの変異は、当技術分野で、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ ２４２、国際特許出願公開公報ＷＯ２０１７／００８１６９Ａ１およびＷＯ２０２１／０５５６６９に公知である。

【0156】

ヒトＩｇＧ１ Ｆｃをサイレンシングするように工学的に操作できる部位の非限定的な具体例としては、全てＥＵナンバリングで、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９、Ｐ３３１が挙げられる。

【0157】

本明細書で使用される際に、用語「二重特異性」とは、抗体スキャフォールドモジュールと第一の結合モジュールとを含む結合タンパク質を指し、これらのモジュールは、二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体および／または受容体タンパク質に由来する。一実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を有し、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７（例えば、ヒトＣＤ１３７）に対する結合特異性を有する。

【0158】

標的分子への二重特異性結合タンパク質の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、測定できる程度に非特異的相互作用とは異なる、結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合と比較して決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば過剰の非標識標的などとの競合によって決定することができる。この場合では、標識された標的とプローブとの結合が、過剰な未標識の標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が標示される。本明細書で使用される際の、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば１０^－４Ｍ以下、あるいは１０^－５Ｍ以下、あるいは１０^－６Ｍ以下、あるいは１０^－７Ｍ以下、あるいは１０^－８Ｍ以下、あるいは１０^－９Ｍ以下、あるいは１０^－１０Ｍ以下、あるいは１０^－１１Ｍ以下、あるいは１０^－１２Ｍ以下の標的に対するＫｄ、または１０^－４Ｍ～１０^－６Ｍ、もしくは１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、もしくは１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍの範囲にあるＫｄを有する分子によって示すことができる。当業者によって理解されるように、親和性とＫＤ値は反比例する。抗原に対する高い親和性は、低いＫＤ値により測定される。一実施形態では、用語「特異的結合」とは、分子がいかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する、結合を指す。

【0159】

本明細書に使用される際に、用語「親和性」とは、エピトープへの二重特異性結合タンパク質の結合の強度を意味する。二重特異性結合タンパク質の親和性は、［二重特異性結合タンパク質］×［Ａｇ］／［二重特異性結合タンパク質－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって与えられ、式中、［二重特異性結合タンパク質－Ａｇ］は、二重特異性結合タンパク質－抗原複合体のモル濃度であり、［二重特異性結合タンパク質］は、非結合の二重特異性結合タンパク質のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合の抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。結合タンパク質の親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３），ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの文献は、参照により本明細書に全体を組み込まれている。二重特異性結合タンパク質の親和性を決定するための当技術分野で周知の標準的な方法の一つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置を用いた分析によるなど）の使用である。

【0160】

用語「リンカー」とは、二つの化学実体間に共有結合を形成する少なくとも一つの原子を指す。用語「リンカー」とは、スキャフォールドモジュールと結合モジュールへの別の共有結合との間に共有結合を形成する、少なくとも一つの原子を指し得る。スキャフォールドモジュールと結合モジュールとがペプチド結合のみを介して連結される場合、リンカーは、「ペプチドリンカー」と呼ばれる。そうでなければ、リンカーは「化学リンカー」と呼ばれる。さらに、「可撓性ペプチドリンカー」は、大抵は小さな、非極性または極性のアミノ酸を含み、一方で「剛性ペプチドリンカー」は、アルファ－ヘリックス形成配列を含む、および／またはプロリン残基が豊富である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９）。

【0161】

ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）は、活性化Ｔ細胞上およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現される誘導性共刺激受容体である。４－１ＢＢタンパク質は、四つの細胞外システインリッチ偽リピート（ＣＲＤ）ドメインＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３、およびＣＲＤ４を有する（以下の表のアミノ酸配列およびＣＲＤ領域を参照）。Ｔ細胞上の４－１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）三量体による４－１ＢＢ三量体クラスターの形成は、抗アポトーシス分子の上方制御、サイトカインの分泌、およびエフェクター機能の強化をもたらすシグナル伝達カスケードを惹起する。ＮＫ細胞上では、４－１ＢＢシグナル伝達は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を増加させることができる。

【0162】

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ１３７は、Ｔ細胞によって活性化される誘導性分子として最初に特定された（Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１９６３－１９６７）。その後の研究では、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、肥満細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ならびに内皮および平滑筋細胞などの非造血起源の細胞を含む、多くの他の免疫細胞も４－１ＢＢを発現することが示された（Ｖｉｎａｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，２０１１，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，２８１－２８４）。異なる細胞型における４－１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体のトリガリングなどの様々な刺激シグナル、ならびに炎症促進性サイトカインの共刺激分子または受容体を介して誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８，３７５５－３７６２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，２７５８－２７６７）。

【0163】

４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３，２６３１－２６４１）。４－１ＢＢＬの発現は、Ｂ細胞、ＤＣ、およびマクロファージなどの専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上では制限されていたことが示されている。４－１ＢＢＬの誘導発現は、αβＴ細胞サブセットおよびγδＴ細胞サブセットの両方を含めたＴ細胞、ならびに内皮細胞の特徴である（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，２０１１，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ８９，２１－２９）。

【0164】

４－１ＢＢ受容体を介した共刺激（例えば、４－１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４^＋サブセットおよびＣＤ８^＋サブセットの両方）内の複数のシグナル伝達カスケードを活性化し、Ｔ細胞の活性化を強力に増強する（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５）。ＴＣＲのトリガリングと併せて、アゴニスト性４－１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカインの分泌を刺激し、活性化誘導性細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２４４，１９７－２１７）。この機序は、がん免疫療法における概念の最初の証明としてさらに進められた。前臨床モデルでは、腫瘍担持マウスにおける４－１ＢＢに対するアゴニスト性抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ ３，６８２－６８５）。その後、エビデンスの蓄積により、４－１ＢＢが、通常は、他の免疫調節化合物、化学療法薬、腫瘍特異的ワクチン接種、または放射線療法との併用で投与された場合にのみ、抗腫瘍剤としてその効力を発揮することが示された（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ５，１１７）。

【0165】

４－１ＢＢを標的とするアゴニスト性モノクローナル抗体は、がん免疫療法のための４－１ＢＢシグナル伝達を利用するように開発されている。前臨床の結果では、様々な誘導性腫瘍モデルおよび自然発生腫瘍モデルにおいて、アゴニスト抗体を用いて４－１ＢＢを標的化することが、腫瘍のクリアランスおよび持続的な抗腫瘍免疫性をもたらし得ることが示唆された。さらに、４－１ＢＢリガンドの細胞外ドメインの一つと単鎖抗体断片とから構成される融合タンパク質（Ｈｏｍｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５，４１８－４２９；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３１，７１４－７２２）、または重鎖のＣ末端に融合された単一の４－１ＢＢリガンド（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，２７５８－２７６７）が作製されている。ＷＯ２０１０／０１００５１では、互いに連結されて抗体部分に融合された三つのＴＮＦリガンド外部ドメインからなる融合タンパク質の生成が開示されている。

【0166】

ウレルマブおよびウトミルマブなどの第一世代免疫アゴニストＣＤ１３７抗体は、臨床において所望の有効性を達成していない。Ｔ細胞共刺激アゴニストががん療法として機能するためには、標的係合親和性、結合カイネティクス、結合価、クラスター形成、Ｆｃ受容体媒介性活性などの多くの因子を考慮する必要がある。目的に適う腫瘍抗原－ＣＤ１３７の構成のデザインは、開示された二重特異性抗体の効力および安全性を改善するために用いられてきた。具体的には、高度に特異的な腫瘍抗原結合抗体が、腫瘍細胞の係合のために選択され、腫瘍抗原結合のための二価が、標的係合を最大化するために用いられた。２）Ｔ細胞の準最適な活性化では、Ｔ細胞の消耗がより少なく、抗腫瘍効果が長期間持続するものと考えられた（Ｓｔｏｎｅ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２６（２）：１６５－１７６）。高速オンおよび高速オフの特徴を有するＣＤ１３７抗体は、Ｔ細胞への一定の刺激シグナルを回避し、したがって低速オフの抗体よりも良好に機能するものと予想された（Ｇａｒｂｌｅ Ｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９，３－５（２０２０））。さらに、クラスター化依存性を有するＣＤ１３７アゴニズムは、循環Ｔ細胞の全身活性化を回避し、腫瘍細胞を経たＴ細胞のみを腫瘍部位で活性化することができる。これは、腫瘍抗原クラスター依存性ＣＤ１３７アゴニズムを用いることによって達成された。さらに、エフェクター機能を排除するためのＦｃのサイレンシング、およびＦｃ媒介性受容体クラスターの形成は、クファー細胞活性化由来の肝毒性をさらに低減することができる。

【0167】

Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質ファミリー
Ｃｌａｕｄｉｎ（ＣＬＤＮ）ファミリーは、２７のメンバーから構成され、細胞型および組織型に選択的な様式で別個の発現パターンを呈する。Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮および内皮の密着結合（ＴＪ）内に位置する膜内在性タンパク質である。ＣＬＤＮは、同じ細胞中（シス相互作用）および隣接細胞同士上（トランス相互作用）の両方で互いに相互作用し、その結果、組織特異的バリア機能を有するＴＪの構成を生じる。個々の細胞型は、Ｃｌａｕｄｉｎファミリーメンバーのうちの二つ以上を発現する。正常な生理では、Ｃｌａｕｄｉｎは、複数のタンパク質と相互作用し、密着結合部への、および密着結合部からのシグナル伝達に密接に関与する（Ｌａｌ－Ｎａｇ，Ｍ ａｎｄ Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０：２３５，２００９）。

【0168】

ＣＬＤＮタンパク質は、四つの膜貫通（ＴＭ）ヘリックス（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、およびＴＭ４）と二つの細胞外ループ（ＥＬＩおよびＥＬ２）とを含む。隣接細胞同士に由来するＣｌａｕｄｉｎの細胞外ループが、互いに相互作用して細胞シートを密封し、管腔と基底側腔との間の傍細胞輸送を調節する。Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質の構造は、異なるファミリーメンバー間で高度に保存されている。ＣＬＤＮ６は、２２０アミノ酸を含み、２３ｋＤａのサイズであり、Ｃｌａｕｄｉｎ型タンパク質構造を呈する。

【0169】

最初のＣｌａｕｄｉｎタンパク質ファミリーは、１９９８年に初めてクローニングされ、密着結合の重要な構造的および機能的な構成要素として命名された。ファミリーとして、Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮細胞および内皮細胞のバリア機能、ならびに細胞骨格の維持に関与する四回膜貫通タンパク質の多重遺伝子ファミリーである（Ｆｕｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４１（７）：１５３９－５０，１９９８）。Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮細胞シートまたは内皮細胞シートに見られるものなど、分極細胞型において最頂端の細胞間接着接合部である密着結合部の主要な構造タンパク質を含む、一体型膜タンパク質である。

【0170】

Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質の第一の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、典型的には約５０アミノ酸からなるのに対し、第二のＥＣＤは、約２２アミノ酸より小さい（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２１（１０）：１７１１－１７１８，２０１６）。Ｎ末端は、通常は非常に短い（例えば、約４～１０アミノ酸）のに対し、Ｃ末端は、２１～約６３アミノ酸の範囲にあり、密着結合部におけるこのタンパク質の局在化に必要とされる。

【0171】

多くの場合に密着接合の透過性が正常組織よりも腫瘍組織で高いという観察があったことから、腫瘍細胞上のＣｌａｕｄｉｎタンパク質が、インタクトな密着結合を有する正常組織よりもアクセス性が高い可能性があることが推測される。また、この観察ゆえに、Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質は、がんへの治療介入のための魅力的な標的となっている。

【0172】

ヒトにおけるＣｌａｕｄｉｎタンパク質ファミリーは、少なくとも２７のメンバーからなり、サイズは２２～３４ｋＤａに及ぶ。全てのＣｌａｕｄｉｎは、両方のタンパク質末端が膜の細胞内面上に位置するテトラスパニントポロジーを有し、その結果、二つの細胞外（ＥＣ）ループ、ＥＣ１およびＥＣ２の形成を生じる。典型的には、ＥＣ１は、約５０～６０アミノ酸のサイズであり、ＥＣ２は、ＥＣ１よりも小さく、通常はおよそ２５アミノ酸を含む。ＥＣループは、ヘッド・ツー・ヘッドのホモ親和性の相互作用を媒介し、Ｃｌａｕｄｉｎの特定の組合せについては、密着結合の形成を導くヘテロ親和性の相互作用を媒介する。

【0173】

Ｃｌａｕｄｉｎ－６
広範に発現される大多数のＣｌａｕｄｉｎタンパク質とは異なり、ＣＬＤＮ６は選択的発現という特徴がある（Ｈｅｗｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，６：１８６，２００６）。ＣＬＤＮ６は、いくつかのタイプの胚性上皮細胞で発現される癌胎児性の密着結合分子である。

【0174】

密着結合の障害および密着結合分子の調節不全は、がん細胞の高頻度にみられる特徴であり、悪性の形質転換としばしば関連する。ＣＬＤＮ６の発現は、胃、肺および卵巣の腺癌、子宮内膜および胚性の癌、脳の小児腫瘍（例えば、異型奇形腫／ラブドイド腫瘍）、ならびに生殖細胞腫瘍を含めた様々ながんの型において、異常に活性化される（Ｈａｓｓｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３６８：１７９－１８６，２０１９；Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ ２０２０，１２，２７４８）。いくつかのヒト悪性腫瘍におけるＣＬＤＮ６の発現の増加は、卵巣がんおよび胃がんなどの予後不良と関連している（Ｚａｖａｌａ－Ｚｅｎｄｅｊａｓ ＶＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２９：１－１１．２０１１；Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｇｎ Ｐａｔｈｏｌ．８：１９０２０１３．）を参照されたい。したがって、ＣＬＤＮ６は、ＣＡＲＴおよびＴ細胞係合型二重特異性抗体などの腫瘍標的化治療薬のための、有望な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0175】

腫瘍関連抗原として、ＣＬＤＮ６は、上皮分化およびバリア形成に重要となる、上皮形態形成の初期段階中のその発現に起因して、分化抗原として分類することができる。がん組織では明瞭であるが正常成体組織ではそうでないというＣＬＤＮ６の発現パターンと、抗体へのがん細胞表面のアクセス性とを組み合わせると、ＣＬＤＮ６は、広く多様ながんの型における診断上ならびに免疫療法上のアプローチのための有望な標的として適格性がある。

【0176】

ＣＬＤＮ６と他のＣｌａｕｄｉｎタンパク質との間には、高度な配列保存性がある。このＣＬＤＮ６と他のＣｌａｕｄｉｎタンパク質（例えば、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ４、およびＣＬＤＮ３）との高い相同性ゆえに、特異性、親和性、および安全性などの治療用途に適した特性を有するＣＬＤＮ６抗体を提供することは困難である。

【0177】

ＣＬＤＮ６は、概して、ヒトにおいて２２０アミノ酸の前駆体タンパク質として発現され、最初の２１アミノ酸はシグナルペプチドを構成する。ＣＬＤＮ６前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトでＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６７０１８．２として公的に利用可能であり、配列番号７５として本明細書に示されている。

【0178】

発現ＣＬＤＮ６は、精上皮種、胚性がん、および卵嚢腫瘍を含む生殖細胞腫瘍、ならびに胃腺癌、肺腺癌、卵巣腺癌、および子宮内膜癌の一部の事例において高度に発現される（Ｕｓｈｉｋｕ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６１（６）：１０４３－１０５６，２０１２，Ｈｅｗｉｔｔ ＫＪ，Ａｇａｒｗａｌ Ｒ，Ｍｏｒｉｎ ＰＪ．Ｔｈｅ ｃｌａｕｄｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２００６；６；１８６；Ｍｉｃｋｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ａｎｄ １８．２ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １３５，２２０６－２２１４；Ｌａｌ－Ｎａｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌａｕｄｉｎ－６：ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＣＰＥ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ １，ｅ３３；Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，１９９２）。

【0179】

ヒトＣＬＤＮ６タンパク質は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）中のヒトＣＬＤＮ９タンパク質配列と非常に密接に関連し、ＥＣＤ１では＞９８％の同一性を有し、ＥＣＤ２では＞９１％の同一性を有する。ヒトＣＬＤＮ４も、ＥＣＤ配列中のヒトＣＬＤＮ６に密接に関連しており、ＥＣＤ１では＞８４％の同一性を有し、ＥＣＤ２では＞７８％の同一性を有する。ＣＬＤＮ６に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の探索は、内因的に発現しているＣｌａｕｄｉｎ－９（ＣＬＤＮ９）の高い相同性が妨げとなっており、ＣＬＤＮ９は、ＣＬＤＮ６とは細胞外ドメインで３アミノ酸（ＥＣＤ１では２アミノ酸、およびＥＣＤ２では１アミノ酸）しか異なっていない。カニクイザルのＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、およびＣＬＤＮ９タンパク質の推定タンパク質ＥＣＤ配列は、それぞれのヒトＥＣＤ配列と１００％同一である。さらに、Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子は、異なる種間で高度に保存され、例えば、ヒトおよびマウスの遺伝子は、ＤＮＡおよびタンパク質のレベルで８８％の相同性を示す。

【0180】

Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２
タンパク質のＣｌａｕｄｉｎファミリーの別のメンバーである密着結合分子Ｃｌａｕｄｉｎ－１８は、通常は胃粘膜および腸上皮の細胞性密着結合に見られる。肺（ＣＬＤＮ１８．１）および胃（ＣＬＤＮ１８．２）に限定された発現を呈する別個のアイソフォームをコードする、プロモーター依存性の様式で選択的にスプライシングされた二つのヒトＣｌａｕｄｉｎ１８転写バリアント（Ｎｉｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．細胞。Ｂｉｏｌ．２１：７３８０－９０，２００１）が、以前に記載されている。これらのスプライスバリアントの主要タンパク質の配列は、Ｎ末端細胞内領域と第一の膜貫通領域（ＴＭＤ１）と細胞外ループ１（ＥＣＬ１）とを含むＮ末端部分で異なっている。ＣＬＤＮ１８．２は、一つの細胞系統に厳格に制限されるヒトＣｌａｕｄｉｎファミリーの少数のメンバーのうちの一つである（Ｔｕｒｅｃｉ ｅｔ ａｌ．）。より具体的には、短い寿命の分化上皮細胞に限定されかつ胃腺の幹細胞ゾーンには存在しないという発現パターンを有する、高度に選択的な胃系統（例えば、胃細胞特異的）マーカーを提供する（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（２３）７６２４－７６３４，２００８）。

【0181】

ＣＬＤＮ１８．２は、悪性の形質転換において保持され、原発性腫瘍のかなりの部分およびその転移において発現される。Ｓａｈｉｎらはまた、ＣＬＤＮ１８．２が膵がん、胃がん、食道がん、肺がん、および卵巣がんを含めたいくつかの異なる型のがんにおいて高頻度で過剰発現され、ＣＬＤＮ１８．１がそうではないことを報告した。したがって、がんという文脈では、ＣＬＤＮ１８．２は胃細胞系統に限定されない（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．）。まとめて考えると、公表された報告の知見により立証されるのは、ＣＬＤＮ１８．２が、上皮細胞由来の腫瘍に関連する疾患のがん免疫療法の開発のための、診断ツールと薬剤開発に繋がる標的との両方を提供するということである。

【0182】

多くの場合に密着接合の透過性が正常組織よりも腫瘍組織で高いことが報告されており、それゆえに、腫瘍細胞上のＣｌａｕｄｉｎタンパク質が、インタクトな密着結合を有する正常組織よりもアクセス性が高い可能性があることが推測される。この可能性により、Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質は、がんへの治療介入のための魅力的な標的となっている。さらに、公表された発現プロファイリングの結果から、ＣＬＤＮ１８．２を標的とするがん療法は、正常な代謝回転および恒常性維持のプロセスにより二日～七日毎に胃腸上皮細胞が補充されるため、好ましい全身毒性プロファイルを有することが示唆されている（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ）。限られた期間の一時的な胃腸毒性は、がん免疫療法の一般的で管理可能な有害事象である。

【0183】

膵がんおよび胃食道がんは、アンメット・メディカル・ニーズが最も高い悪性腫瘍の一つである（Ｓａｈｉｎ，ｅｔ ａｌ）。胃がんおよび膵がんが重大ながん関連罹患率および死亡率に寄与するという事実があるものの、治療選択肢は限られている。そのため、上皮細胞由来の原発性および転移性の固形腫瘍に関連するがんの免疫療法で使用するための抗ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体および結合剤に対するニーズが存在する。

【0184】

ＣＬＤＮ１８．２は、二つの小さな細胞外ループを有する四つの膜貫通ドメイン（疎水性領域１および疎水性領域２によって包囲されたループ１と、疎水性領域３および４によって包囲されたループ２）を含む。ＣＬＤＮ１８．２は膜貫通タンパク質であり、それゆえ、その細胞外ループ内に存在するかまたはその細胞外ループによって形成されるエピトープは、抗体ベースのがん免疫療法の望ましい標的を表す。しかし、ＣＬＤＮ１８．１が、毒性に非常に関連性の高い組織である正常な肺組織中の肺胞上皮細胞によって発現されることを考慮すると、排他的スプライスバリアントへの特異性は、抗体ベースのがん免疫療法にＣＬＤＮ１８．２特異的抗体を使用するための必要条件であるものと認識された。Ｓａｈｉｎらは、ＣＬＤＮ１８．２に排他的に結合するがＣＬＤＮ１８．１には結合しない抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）の単離に基づき、ＣＬＤＮ１８．２をがん免疫療法の薬剤開発に繋がる標的として検証した、コンセプト検証の結果を初めて報告した（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（２３）７６２４－７６３４，２００８）。

【0185】

ＣＬＤＮ１８．２は、胃がん、食道がん、膵がん、非小細胞肺がんなどの肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝がん、頭頸部がん、および胆嚢がんを含めた、複数の原発性腫瘍およびその転移において発現される。Ｃｌａｕｄｉｎの発現の調節不全は、多くのがんで検出され、腫瘍形成およびがん侵襲性に寄与し得る（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１０；２０１０：５４１９５７）。ＣＬＤＮ１８．２の発現は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２０１１；５９：９４２－９５２）、食道腫瘍、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００８；１４：７６２４－７６３４））、および胆管腺癌（Ｋｅｉｒａ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．２０１５；４６６：２６５－２７７）において特に上昇する。

【0186】

胃がんが重大ながん関連罹患率および死亡率に寄与するという事実があるものの、胃がんのための治療選択肢は限られている。Ｃｌａｕｄｉｎは、正常組織、良性新生物、過形成状態、およびがんに存在する（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇ．Ｒｅｓ．５：３６７－３７５（２０１３））。Ｃｌａｕｄｉｎの発現パターンは、高度に組織特異的であり、ほとんどの組織は、複数のＣｌａｕｄｉｎを発現する。Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質は、ホモ型またはヘテロ型の様式で隣接細胞由来のＣｌａｕｄｉｎと相互作用して、密着結合を形成することができる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）。Ｃｌａｕｄｉｎの発現経路およびシグナル伝達経路の変化は、がんの発生と関連していることが知られており、密着結合の障害と腫瘍の進行との間の関連が広く報告されている。

【0187】

ネクチンタンパク質ファミリー
ネクチン（「接続する」ことを意味するラテン語「ｎｅｃｔｏ」に由来する）は、そのＥＣＤのＩｇ様Ｖドメインを介して他の細胞表面分子上のネクチンと相互作用する。ネクチンは、まず結合して、同じ細胞上でシス二量体を形成し、次いで、隣接細胞同士上でネクチンまたは免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の他のメンバーと共にホモ親和性またはヘテロ親和性のトランス二量体を形成することによって、細胞接着を促進するように機能する（Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２７：５９０，２００７）。ヘテロ親和性のトランス二量体は、ホモ親和性のトランス二量体よりも強い細胞間相互作用を形成することが報告されている 結合の特異性は、各ネクチンについて異なる（例えば、Ｎｅｃｔｉｎ－４はそれ自体およびＮｅｃｔｉｎ－１に結合する）。

【0188】

ヒトネクチンファミリーは、９個のホモログ（Ｎｅｃｔｉｎ－１からＮｅｃｔｉｎ－４およびＮｅｃｔｉｎ様１から５）からなる（Ｄｕｒａｉｖｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，１０：９４３４，２０２０）。ネクチンタンパク質（Ｎｅｃｔｉｎ－１、Ｎｅｃｔｉｎ－２、Ｎｅｃｔｉｎ－３、およびＮｅｃｔｉｎ－４）は、カルシウム非依存性免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）細胞接着分子であり、この分子は、ホモ親和性またはヘテロ親和性のトランス相互作用を生じ、上皮細胞における接着結合部で細胞間接着を媒介する。正常な上皮では、接着結合部は、腫瘍形成中に失われることの多い特性である細胞極性を画定する。

【0189】

Ｎｅｃｔｉｎ－１、－２、－３、および－４は、シングルパスＩ型糖タンパク質として発現され、Ｎ末端Ｉｇ様可変ドメイン（Ｄ１）として配置された三つのタンデム免疫グロブリン様ドメイン／ループを有する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、それに続く二つのＩｇ様定常ドメイン（Ｄ２およびＤ３）とからなる、共通したドメイン編成によって特徴付けられる。ネクチンは、Ｖドメイン同士の結合相互作用を介して相互に作用し合い、それによって、細胞間接着を支持するトランスヘテロ相互作用ネットワークを作り出す。Ｎｅｃｔｉｎ－３／Ｎｅｃｔｉｎ－１、Ｎｅｃｔｉｎ－３／Ｎｅｃｔｉｎ－２、Ｎｅｃｔｉｎ－１／Ｎｅｃｔｉｎ－４の間のヘテロ親和性相互作用が報告されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９（９）：９０６－９１５，２０１２）。細胞間接着におけるそれらの役割に加えて、ネクチンは、様々な生理的な細胞活性の調節、ウイルスの侵入、および免疫の調節において、重要な役割を果たしている。

【0190】

ネクチンファミリーのメンバーは、シングルパスＩ型糖タンパク質として発現され、細胞外ドメイン内の三つのＩｇ様ドメイン（膜遠位ＩｇＶドメインとそれに続く二つのＩｇＣドメイン）と、膜貫通領域と、アダプタータンパク質アファディンを介してアクチン細胞骨格に結合する細胞質ドメイン（Ｓａｍａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，７２（４）：６４５－６５８，２０１５）とからなる、共通したドメイン編成によって特徴付けられる。

【0191】

多くのウイルスは、ＩｇＳＦメンバータンパク質を利用して、ウイルスの指向性、付着、およびそれに続く宿主細胞への侵入を促進する。ネクチンファミリーのいくつかのメンバーは、細胞接着分子としての生理学的機能が見出される前に、ウイルス受容体として同定された。当初、ネクチンファミリーのメンバーは、独立して、複数のグループによりウイルス侵入受容体として同定され、観察された機能に基づき名称を割り当てられた。Ｎｅｃｔｉｎ－１、－２、および－３は、元々はポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ｎｅｃｌ－５、ＣＤ１５５）に相同な分子として記載され、ゆえにポリオウイルス受容体関連（ＰＲＲ）タンパク質（ｎｅｃｔｉｎ１／ＰＲＲ１／ＣＤ１１１、ｎｅｃｔｉｎ２／ＰＲＲ２／ＣＤ１１２、およびｎｅｃｔｉｎ３／ＰＲＲ３）と命名され（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）、その後、それぞれＣＤ１１１、ＣＤ１１２、およびＣＤ１１３と命名された。続いてＮｅｃｔｉｎ－４は、麻疹ウイルス血球凝集素（ＭＶ－Ｈ）を認識し、麻疹ウイルス侵入のための上皮細胞受容体として機能することが示された（Ｓａｍａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，７２（４）：６４５－６５８，２０１５）。

【0192】

ネクチンは、まず細胞表面にホモシス二量体を形成し、次いで、ホモ親和性およびヘテロ親和性の両方の様式で隣接細胞同士上にトランス二量体を形成することによって、細胞接着分子として機能する。結合の特異性は、各ネクチンについて異なる。Ｎｅｃｔｉｎ－４は、それ自体およびＮｅｃｔｉｎ－１に結合する（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１，Ｆａｂｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７（３０）：２７００６－２７０１３，２００２）。細胞間の接触は、隣接細胞同士上のネクチン間の相互作用によって開始されると考えられる。その後、カドヘリン－カテニン複合体が、ネクチンベースの細胞間接着の部位にリクルートされ、隣接細胞同士上のカドヘリンのトランス相互作用が発生して、それにより接着接合部が形成される（Ｂｏｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８（６）：９７１７－９７３８，２０１７）。

【0193】

ネクチンタンパク質の外部ドメインは、３０～５５％のアミノ酸配列同一性を共有する。ネクチンは、その細胞質ドメインの結合モチーフを介してアクチン細胞骨格アファディン（Ｆ－アクチン結合タンパク質）に接続され、上皮および内皮の結合部の編成に関与する。他の細胞接着分子（ＣＡＭ）およびシグナル伝達分子との複雑な相互作用では、例えば移動、増殖、生存、分化、分極、およびウイルス侵入などのいくつかの多様な生理学的細胞活性を調節する。

【0194】

追加的な細胞表面分子と相互作用するというネクチンファミリーメンバーの能力により、哺乳動物において当該メンバーの相互作用ネットワークは著しく拡張される。ネクチンは、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、プロラクチン受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４などの他の細胞表面膜受容体、ならびにインテグリンαｖβ３およびインテグリンα６β４などのインテグリンとシス相互作用することが知られており、細胞間接着だけでなく、細胞の移動、増殖、分化、および生存も調節する（Ｋｅｄａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，９：１８９９７，２０１９）。

【0195】

ネクチンファミリーの一部のメンバーは、免疫グロブリンスーパーファミリーの別のメンバーとのヘテロ親和性トランス相互作用の結果、免疫調節機能を発揮し得る。これらの相互作用は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、樹状細胞（ＤＣ）、およびＴリンパ球を含む多様な免疫細胞のタイプの機能に影響を与えることが知られている。公知のネクチンファミリー相互作用物質であるＩｇＳＦメンバーのいくつかだけでなく、ネクチンのいくつかが、共通の結合パートナーを認識することが知られている。例えば、Ｎｅｃｔｉｎ－２およびＰＶＲは、どちらもＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、およびＮｅｃｔｉｎ－３を認識する（Ｄｕｒａｉｖｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，１０：９４３４，２０２０）。

【0196】

タンパク質を機能的に関連するファミリーに分類するためのアルゴリズムを用いたバイオインフォマティクス分析では、五つの追加的なＩｇＳＦメンバーであるＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ、ＶＳＴＭ３）、ＣＲＴＡＭ、およびＣＤ２００が、ネクチンおよびネクチン様タンパク質に機能的および進化的に関連し、ネクチンファミリーのメンバーの結合パートナーを表す可能性があることが予測された（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１（５）：７６６－７７６，２０１３）。今日まで、ＣＤ２００を除いて、これらのタンパク質の全てが、ネクチン／ネクチン様ファミリーのメンバーに結合することが報告されている（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ ）。

【0197】

追加的な細胞表面分子と相互作用するというネクチンファミリーメンバーの能力により、当該メンバーの相互作用ネットワークは著しく拡張される。ネクチンファミリーのいくつかのメンバーは、ＩｇＳＦの別のメンバーとのヘテロ親和性のトランス相互作用の結果、免疫調節機能を発揮し得る。これらの相互作用は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、樹状細胞（ＤＣ）、およびＴリンパ球を含む多様な免疫細胞のタイプの機能に影響を与えることが知られている。公知のネクチンファミリーパートナーであるＩｇＳＦメンバーのいくつかだけでなく、ネクチンのいくつかが、共通の結合パートナーを認識することが知られている。例えば、Ｎｅｃｔｉｎ－２およびＰＶＲは、どちらもＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、およびＮｅｃｔｉｎ－３を認識する（Ｄｕｒａｉｖｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，１０：９４３４，２０２０）。

【0198】

Ｎｅｃｔｉｎ－４
Ｎｅｃｔｉｎ－４（ポリオウイルス受容体様４、ＰＶＲＬ４としても知られる）は、まず既知のネクチンタンパク質細胞外ドメイン由来の配列を用いてバイオインフォマティクス検索を介して特定され、関連配列が特定された（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）。ヒトＮｅｃｔｉｎ－４は、ヒト気管からクローニングされ、正常ヒト組織における発現パターンが制限されている抗原として記載された。より具体的には、Ｖドメイン相互作用を介してＮｅｃｔｉｎ－１とトランス相互作用するが、Ｎｅｃｔｉｎ－２、Ｎｅｃｔｉｎ－３、またはＲＶＲとは相互作用しない、ネクチンファミリーのアファディン関連メンバーとして記載されている（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）。

【0199】

Ｒｅｙｍｏｎｄらは、自分達による以下の知見に基づきＮｅｃｔｉｎ－４をＮｅｃｔｉｎ－１の新規リガンドとして特定した（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）：ｉ）可溶性キメラ組換えＮｅｃｔｉｎ－４細胞外ドメイン（Ｎｅｃｔｉｎ－４－Ｆｃ）は、Ｎｅｃｔｉｎ－１を発現する細胞と相互作用するが、ＰＶＲ／ＣＤ１５５、Ｎｅｃｔｉｎ－２、またはＮｅｃｔｉｎ－３を発現する細胞とは相互作用せず、逆に、Ｎｅｃｔｉｎ－１Ｆｃは、Ｎｅｃｔｉｎ－４を発現する細胞に結合する、ｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ－１－Ｆｃは、ＣＯＳ細胞に発現されるＮｅｃｔｉｎ－４を沈殿させる、ｉｉｉ）Ｎｅｃｔｉｎ－４－Ｆｃ可溶性組換えタンパク質とＮｅｃｔｉｎ－１－Ｆｃ可溶性組換えタンパク質との間に、インビトロでの相互補完的な物理的相互作用が観察された（Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｎ ｅｔ ａｌ．）。Ｎｅｃｔｉｎ－４－Ｆｃ／Ｎｅｃｔｉｎ－４－Ｆｃ相互作用も検出されたが、このことは、Ｎｅｃｔｉｎ－４がホモ親和性の特性およびヘテロ親和性の特性の両方を有することを示す。

【0200】

ヒトＮｅｃｔｉｎ－４遺伝子は、５１０アミノ酸を含有する５５．５ｋＤａタンパク質であるＮｅｃｔｉｎ－４接着受容体をコードする九つのエクソンを含有する。タンパク質知識データベースＵｎｉＰｒｏｔＫｂによると、Ｎｅｃｔｉｎ－４（Ｑ９６ＮＹ８）は、Ｎ末端シグナルペプチド（１～３１アミノ酸）、三つの免疫グロブリン様サブドメイン（Ｖ－１型３２～１４４アミノ酸、Ｃ２－１型１４８～２３７アミノ酸、Ｃ２－２型２４８～３３１アミノ酸）を有する細胞外ドメイン（３２～３４９アミノ酸）、膜貫通ドメイン（３５０～３７０アミノ酸）、および細胞質ドメイン（３７１～５１０アミノ酸）を含有する。

【0201】

Ｎｅｃｔｉｎ－４のＶ様ドメインがＮｅｃｔｉｎ－１とのそのトランス相互作用を媒介するのに十分であること、ならびに膜近位Ｎｅｃｔｉｎ－４ Ｃ様ドメインがトランス相互作用の親和性の増加に寄与することが報告されている（Ｆａｂｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７（３０）：２７００６－２７０１３，２００２）。Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＮｅｃｔｉｎ－３は、Ｎｅｃｔｉｎ－１ Ｖ様ドメインにおいて共通の結合領域を共有する（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９（９）：９０６－９１５，２０１２）。

【0202】

また、Ｎｅｃｔｉｎ－１のＶ様ドメインにエピトープが局在する抗Ｎｅｃｔｉｎ－１モノクローナル抗体（Ｒ１．３０２）によって、Ｎｅｃｔｉｎ－４／Ｎｅｃｔｉｎ－１トランス相互作用が遮断されることも報告されている（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）。以降の刊行物では、Ｎｅｃｔｉｎ－４のＩｇ様Ｖドメインに特異的なモノクローナル抗体が、ヒトＮｅｃｔｉｎ－４（ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ５）を過剰発現するように工学的に操作された卵巣がん細胞株とＮｅｃｔｉｎ－１との接着を遮断することが確定された（Ｂｏｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８（６）：９７１７－９７３８，２０１７）。

【0203】

Ｎｅｃｔｉｎ－４は、様々な上皮細胞がん、例えば、乳がん（Ｆａｂｒｅ－Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，７：７３，２００７）、肺がん（Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（１６）：６６９４－０３，２００９）、卵巣がん（Ｄｅｒｙｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，５：８３５－８４５，２０１０）、膵がん（Ｎｉｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３４（１）：３０，２０１５）、胆嚢がん（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，３７５：１７９－１８９，２０１６）、および胃がん（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ，７２：１０７－１１６，２０１８）などで上方制御されることが報告されている。これらのがんは、Ｎｅｃｔｉｎ－４遺伝子座のコピー数の増加または局所的な増幅を高頻度で有する（Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，２：ｅ００３５８，２０１３）。

【0204】

最近では、ネクチンが腫瘍形成と転移を促進する機能とに寄与することを示すエビデンスが蓄積されている。特に、Ｎｅｃｔｉｎ－４は、がん細胞の接着、遊走、増殖、および上皮間葉転換に関与している。乳がん、膵臓がん、および肺がんでは、患者血清中のＮｅｃｔｉｎ－４の過剰発現、または検出もしくは可溶性Ｎｅｃｔｉｎ－４は、腫瘍進行および／または生存不良と関連することが報告されている（Ｆａｂｒｅ－Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，７：７３，２００７，Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（１６）：６６９４－０３，２００９，Ｄｅｒｙｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，５：８３５－８４５，２０１０，Ｎｉｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３４（１）：３０，２０１５，ａｎｄ Ｌａｔｔａｎｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，３：ｅ１１８，２０１４）。

【0205】

がん免疫療法のための腫瘍関連抗原の標的化
過去数年で、密着結合ががん細胞の増殖、形質転換、および転移において役割を果たすことのさらに多くの証拠が確立されている。Ｃｌａｕｄｉｎの調節不全は、上皮細胞における密着結合の崩壊につながり、次いで、細胞極性の喪失および上皮の完全性の減損をもたらす。腫瘍細胞によるＣｌａｕｄｉｎ６および／またはＣｌａｕｄｉｎ１８．２の過剰発現は、腫瘍細胞の脱分化の結果としてＣｌａｕｄｉｎの局在が調節不全となること、または異常な血管形成を伴う腫瘍塊内の栄養素を効率的に吸収するためにがん性組織が急速に成長する必要があることと関連し得る（Ｍｏｒｉｎ ＰＪ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１；６５（２１）：９６０３－６，２００５）。細胞間接着の減少およびがん細胞の可動性の増加は、がんの進行および転移における重要なステップである上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の主要な事象であることが示唆される。

【0206】

Ｎｅｃｔｉｎ－４は、膀胱がんにおけるｍＲＮＡ発現のレベルが高いため、抑制サブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて、潜在的な標的として同定された（Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７６（１０）：３００３－１３，２０１６）。初期の刊行物では、Ｎｅｃｔｉｎ－４の発現がヒト胎盤内の内皮細胞に限定されること（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１）、正常成人組織で発現が欠落しており、乳がん、卵巣がん、膵がん、および肺がんを含めた様々ながん組織で再発現すること（Ｆａｂｒｅ－Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，７：７３，２００７，Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（１６）：６６９４－０３，２００９，Ｄｅｒｙｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，５：８３５－８４５，２０１０，Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，２：ｅ００３５８，２０１３， Ｎｉｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３４（１）：３０，２０１５，Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７６（１０）：３００３－１３，２０１６）が報告されていたことから、Ｎｅｃｔｉｎ－４は、元々は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）として記載されていた。

【0207】

ヒトＮｅｃｔｉｎ－４の細胞外ドメインを指向するマウス抗体（Ｍ２２－２４４ｂ３）および正常ヒト組織標本のパネル（３６個のヒト器官を表す）を使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果では、以前に報告されたものよりも低いレベルから中程度のレベルで正常組織においてさらに広範な発現が呈示され（Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．）、オンターゲットの対Ｎｅｃｔｉｎ－４毒性を誘発するリスクが増加した可能性のある正常組織が同定された。ヒト皮膚ケラチノサイト、皮膚付属器官（汗腺および毛包、ならびに膀胱、胃、乳房、食道、および唾液腺（管）の上皮では、弱から中程度という低レベルの均質な染色があることが報告されており（Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（４６）：４３２０５－１５，２００１，Ｂｒａｎｃａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎ，８７：２６５－２７３，２０１０）、このことは、Ｎｅｃｔｉｎ－４が、ＴＳＡというよりはむしろ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であることを示唆している。

【0208】

Ｎｅｃｔｉｎ－４は、複数のがん、特に尿路上皮がん、肺がん、膵がん、乳がん、および卵巣がんにおいて過剰発現される（Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７６（１０）：３００３－１３，２０１６，Ｆａｂｒｅ－Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，７：７３，２００７，Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（１６）：６６９４－０３，２００９，Ｄｅｒｙｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，５：８３５－８４５，２０１０）。７つの異なる適応症（例えば、膀胱がん、乳がん、膵がん、肺がん、卵巣がん、頭頸部がん、および食道がん）を代表する３４種の腫瘍を表すヒトがん腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）における、Ｎｅｃｔｉｎ－４発現の広範な免疫組織化学では、評価されたがん適応症全体で、ＴＭＡ標本の６９％がＮｅｃｔｉｎ－４陽性であることが確認された。最も高い頻度でＮｅｃｔｉｎ－４の全体的な発現が、膀胱、乳房、および膵臓の腫瘍について観察された。卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、および食道がんの試料では、中程度から強い染色を有するＮｅｃｔｉｎ－４陽性試料の有病率は、総じて比較的低かった（Ｃｈａｌｉｔｔｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．）。比較的高いＮｅｃｔｉｎ－４発現レベルががんに観察されることから、理論的には、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４標的ＡＤＣおよび抗体ベースの免疫療法に対し、許容可能な安全性プロファイルを特徴とする治療ウィンドウが提供される（Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７６（１０）：３００３－１３，２０１６、およびＳｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０（３）：３６０，２０２０）。

【0209】

上皮がんの進行の初期段階は、細胞外マトリックス足場の非存在下で生存および増殖する能力を付与する遺伝子変化を特徴とする。足場の喪失に耐容性を有するというがん細胞の能力は、がん細胞の生存および腫瘍形成の病理学的進行（例えば、下部にある間質の浸潤、血管への血管外遊走、および遠位部位としての転移性増殖）に重要である（Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，２：ｅ００３５８，２０１３）。Ｎｅｃｔｉｎ－４は、ＴＬ－ＨＭＥＣにおけるマトリックス足場に依存しない細胞増殖を可能にする遺伝子の機能獲得スクリーニングで同定された（ＳＶ４０ラージＴ抗原を形質導入されたｈＴＥＲＴ不死化ヒト乳腺上皮細胞）（Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，２：ｅ００３５８，２０１３）。

【0210】

Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．はさらに、Ｎｅｃｔｉｎ－４が、懸濁液中の多細胞クラスターへのＴＬ－ＨＭＥＣの迅速な会合を駆動し、Ｎｅｃｔｉｎ－４の細胞外ドメインを指向する抗体を用いて、観察可能なクラスター形成を阻止できることを報告した。細胞クラスター形成は、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体の存在下で完全に抑制された。同様に、Ｎｅｃｔｉｎ－１の細胞外領域を標的とする抗体も、Ｎｅｃｔｉｎ－４誘導性の細胞クラスター形成を阻害した。

【0211】

Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．はさらに、Ｎｅｃｔｉｎ－４が、隣接細胞上のＮｅｃｔｉｎ－１受容体を係合することによる腫瘍細胞の相互のクラスター形成と、マトリクス付着に依存しない様式でのインテグリンβ４／ＳＨＰ－２／ｃ－Ｓｒｃ活性化を惹起する相互作用とを促進することを示した。Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．が提示したモデルでは、Ｎｅｃｔｉｎ－４／Ｎｅｃｔｉｎ－１相互作用を介した腫瘍特異的な細胞間接触およびシグナル伝達は、細胞－マトリックスのシグナル伝達の代替を提供し、アノイキス（すなわち、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および隣接細胞への付着を喪失した際の細胞におけるアポトーシスの誘導）の回避を可能にするという生存上の利点を付与する。

【0212】

卵巣がんの進行（すなわち、細胞接着、スフェロイド形成、遊走および増殖）の基礎をなす細胞機能におけるＮｅｃｔｉｎ－４の生物学的意義を決定するために実施された研究の結果では、Ｎｅｃｔｉｎ－４のＩｇＶ様ドメインに対するｍＡｂが、Ｎｅｃｔｉｎ－１への卵巣がん細胞接着をほぼ完全に遮断したことを示すインビトロデータが報告されている（Ｂｏｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８（６）：９７１７－９７３８，２０１７）。Ｂｏｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．が、乳がんのマウス異種移植片モデルに同じ抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体を使用し、対照ＩｇＧで処理された腫瘍に比べて腫瘍細胞接着の崩壊および腫瘍増殖の減少をインビボで観察したことに注目し、それらを組み合わせた結果に基づき、Ｎｅｃｔｉｎ－４細胞接着の遮断が、がん免疫療法に使用される抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体の治療有効性の重要な構成要素であり得ると推測している（Ｂｏｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0213】

Ｎｅｃｔｉｎ－４発現腫瘍の治療に対する単独療法としての抗Ｎｅｃｔｉｎ－４ ＡＤＣの使用を評価した前臨床試験の結果を報告した発表では、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体ベースの免疫療法の臨床開発が実証された。例えば、ＡＧＳ－２２Ｍ６Ｅ ＡＤＣ単独療法は、ヒトの膀胱がん、膵臓がん、乳がん、および肺がんの四つのマウス異種移植片モデルにおいて、腫瘍の成長を阻害することが報告された。続くＭ－Ｒａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．による発表では、Ｎｅｃｔｉｎ－４が原発性および転移性のトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の治療標的として確定されたが、この知見は、異なる抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体を使用して調製されたＡＤＣ（Ｎ４１ ｍＡｂ－ｖｃＭＭＡＥ）（ＷＯ ２０１７／０４２２１０）が、免疫不全ＮＳＧマウスで開発されたＴＮＢＣの三つのモデル、すなわち原発性腫瘍、転移性病変、および局所再発に対するモデルにおいて、インビトロおよびインビボで完全かつ持続的な応答を誘導したという観察に基づく（Ｍ－Ｒａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２８（４）：７６９－７７６，２０１７）。

【0214】

ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質
本開示は、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原ならびにその断片に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。例えば、腫瘍特異的抗原は、非腫瘍細胞上よりも多い量で腫瘍細胞の表面に発現される任意の抗原であり得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４であり得る。

【0215】

ＴＡＡおよびＣＤ１３７に結合する二重特異性結合タンパク質は、（ａ）ＴＡＡに結合する第一の抗原結合部位およびＴＡＡに結合する第二の抗原結合部位を含む抗体スキャフォールドモジュールと、（ｂ）ＣＤ１３７に結合する第三の抗原結合部位を含む少なくとも一つの第一の結合モジュールと、を含み得る。

【0216】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原およびＣＤ１３７に結合する二重特異性結合タンパク質は、（ａ）第一の抗原結合部位および第二の抗原結合部位を介して腫瘍関連抗原に結合するための手段を含む抗体スキャフォールドモジュールと、（ｂ）第三の抗原結合部位を介してＣＤ１３７に結合するための手段を含む少なくとも一つの第一の結合モジュールと、を含む。

【0217】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、二つの重鎖および二つの軽鎖を有するＹ字型抗体である。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールはＩｇＧであり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４が挙げられる。一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ｓｃＦｖなどの抗体断片である。さらに別の実施形態では、ｓｃＦｖは、ジスルフィド結合の導入によって安定化される。

【0218】

一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合し、アゴニスト活性を有する。

【0219】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、二価モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、完全長抗体である。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、マウス抗体またはヒト抗体である。他の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、キメラ抗体、二重特異性抗体、またはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、対称（例えば、ホモ二量体）または非対称（例えば、ヘテロ二量体）である。

【0220】

他の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、抗体断片であり、そのようなものとしては例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、および単鎖抗体（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗体断片が挙げられる。抗体スキャフォールドモジュールは、キメラ抗体または二重特異性抗体であってもよい。代替的な実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、ポリペプチドにＴＡＡ選択的結合を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドであってもよい。は、ヒト抗体である。

【0221】

一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの重鎖配列と、Ｃ末端とＮ末端とをそれぞれが有する二つの軽鎖配列とを含む。一部の実施形態では、第一の結合モジュールは、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方のＣ末端、抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方のＣ末端、抗体スキャフォールドモジュール重鎖配列の一方もしくは両方のＮ末端、抗体スキャフォールドモジュール軽鎖配列の一方もしくは両方のＮ末端、またはそれらの組合せに共有結合される。さらに別の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールおよびＴＡＡに結合する抗体スキャフォールドモジュールは、直接的にまたはインターリンカーを介して、互いに共有結合される。一実施形態では、第一の結合モジュールは、ヒト型であってもヒト化されていてもよい。

【0222】

抗体スキャフォールドモジュールおよび第一の結合モジュールは、直接的にコンジュゲート（例えば、融合）されてもよいし、またはリンカーによって間接的にコンジュゲートされてもよい。例示的なリンカーとしては、例えば、３×Ｇ４Ｓリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６４））および４×Ｇ４Ｓリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５））を含めたグリシン－セリンリンカーが挙げられる。

【0223】

様々な実施形態では、本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質は、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または修飾を有する抗体スキャフォールドモジュールを含んでいてもよく、そのような置換または修飾としては、アミノ酸残基の置換、変異、および／または修飾が挙げられるが限定はない。これらの結果として、以下に限定されないが、薬物動態の変化、血清中半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の低下、生産性の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃリガンドの結合の変化、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、ＴＤＣＣの増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の改変、ならびに結合特異性の改変を含めた、好適な性質を有する化合物が生じる。

【0224】

いくつかの刊行物では、最適化されたＦｃｇＲ結合プロファイルと、細胞媒介性エフェクター機能を最適化するのに適した活性化／阻害（Ａ：Ｉ）比とを有する、バリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＣＨ領域）を設計するためのタンパク質工学戦略の使用に成功したことが報告されている。具体的には、低親和性受容体ＦｃγＩＩＩａに対するＦｃドメインの親和性を増加させることに焦点を当てて取り組みが行われてきた。Ｆｃドメイン内のいくつかの変異が、Ｆｃ受容体の結合を直接的または間接的に増強し、結果として細胞性細胞傷害性を有意に増強することが特定されている（Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．ＰＮＡＳ １０３：４００５－４０１０（２００６）；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４（２００１）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２４：６７１－６７８（２０１１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７：２５１７－２５７５（２００８））。

【0225】

抗体スキャフォールドモジュールは、Ｆｃ領域（例えば、二つの抗体重鎖定常領域）を含み得る。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも一つのＦｃサイレンシング変異を含み、そのようなものとしては、例えば、Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ、またはＮ２９７Ａが挙げられる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、重鎖の二量体形成を促進するために、ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）変異を有する一つの重鎖定常領域を含んでいてもよい。本明細書に開示される抗体スキャフォールドモジュールで使用するための例示的なＦｃ定常領域は、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７３に記載される。本明細書に開示される抗体スキャフォールドモジュールの軽鎖の例示的な定常領域は、配列番号７０および配列番号７１に記載される。

【0226】

一実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、抗ＣＤ１３７抗体またはその断片に由来するＣＤＲを含む。例えば、第一の結合モジュールは、表１に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含み得る。一実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合する抗体の重鎖ＨＣＤＲを含み、そのようなものとしては例えば、配列番号２３に記載の可変重鎖ドメインを含む抗体が挙げられる。

【表1】

【0227】

一実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、抗ＣＤ１３７抗体またはその断片に由来するＣＤＲを含む。例えば、第一の結合モジュールは、表１に開示されるＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬを含み得る。一実施形態では、第一の結合モジュールは、ＣＤ１３７に結合する抗体のＬＣＤＲを含み、そのようなものとしては例えば、配列番号２４に記載の可変軽鎖ドメインを含む抗体が挙げられる。

【表2】

【0228】

一実施形態では、第一の結合モジュールは、以下からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨおよびＶＬの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３９、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４。

【0229】

一実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、抗ＣＤ１３７抗体またはその断片に由来するＣＤＲを含む。例えば、第一の結合モジュールは、表１に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨと、表２に開示されるＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬとを含み得る。

【0230】

別の実施形態では、第一の結合モジュールは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。別の実施形態では、第一の結合モジュールは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、第一の結合モジュールは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。

【0231】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、１～１０ｎＭ以下のＫＤを有する、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールを含む。結合会合定数ｋａは、１～１０×１０^６（１／Ｍｓ）である。結合会合定数ｋｄは、１～１０×１０^－２（１／Ｓ）である。

【0232】

抗体スキャフォールドモジュールは、ＴＡＡに特異的な抗体由来のＣＤＲのセットを含んでいてもよい。

【0233】

一実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合し、表３に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合し、表４に開示されるＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）のセットを有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、表３に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨと、表４に開示されるＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬとを含む。

【表3】

【表4】

【0234】

ある実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、以下からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４８、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号５０、および
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５１、ＣＤＲ２：配列番号５２、ＣＤＲ３：配列番号５３、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号５４、ＣＤＲ２：配列番号５５、ＣＤＲ３：配列番号５６。

【0235】

別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５または配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２６または配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。

【0236】

一実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、表５に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、表６に開示されるＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）のセットを有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、表５に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨと、表６に開示されるＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬとを含む。

【表5】

【表6】

【0237】

一実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、以下からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３３、ＣＤＲ２：配列番号３４、ＣＤＲ３：配列番号３５、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３６、ＣＤＲ２：配列番号３７、ＣＤＲ３：配列番号３８。

【0238】

別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。

【0239】

一実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合し、表７に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合し、表８に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、表７に開示されるＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨと、表８に開示されるＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬとを含む。

【表7】

【表8】

【0240】

一実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、以下からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５７、ＣＤＲ２：配列番号５８、ＣＤＲ３：配列番号５９、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号６０、ＣＤＲ２：配列番号６１、ＣＤＲ３：配列番号６２。

【0241】

別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９または配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３０または配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。

【0242】

別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、以下の組合せから選択される一対の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む：
ｉ）配列番号２１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、ならびに
ｉｉ）配列番号２３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｉｉｉ）配列番号２５と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２６と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｉｖ）配列番号２７と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２８と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｖ）配列番号２９と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号３０と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｖｉ）配列番号３１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号３２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列。
当業者はさらに、可変軽鎖および可変重鎖が、独立して選択されるかまたは混合し適合されて、上記に特定した対合とは異なる可変重鎖および可変軽鎖の組合せを含む抗ＣＬＤＮ６抗体を調製してもよいことを理解するものとなる。

【0243】

一部の実施形態では、本二重特異性結合タンパク質は、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含む。当業者は、保存的なアミノ酸置換が、例えば類似の側鎖など、類似の構造的または化学的な特性を有する別のアミノ酸による一アミノ酸の置換であることを認識するものとなる。例示的な保存された置換は、当技術分野において、例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（１９８７）に記載されている。

【0244】

「保存的な改変」とは、アミノ酸配列を含有する二重特異性結合タンパク質の結合特性に著しく影響しないかまたは変化させないアミノ酸改変を指す。保存的な改変には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。保存的な置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるというものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および硫黄含有側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基は、アラニンスキャニング変異誘発につき前述されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）、アラニンにより置換されていてもよい。本開示の二重特異性結合タンパク質へのアミノ酸置換は、公知の方法、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって作製されてもよい。

【0245】

一部の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２３の可変重鎖配列を含むＣＤ１３７に結合する結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２３の可変重鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を重鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２３の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0246】

特定の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２３に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、ＣＤ１３７に結合しかつ配列番号２３に記載の可変重鎖配列と配列番号２４に記載の可変軽鎖配列とを含む第一の結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0247】

一部の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２４の可変軽鎖配列を含むＣＤ１３７に結合する結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２４の可変軽鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を軽鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２４の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0248】

特定の実施形態では、ＣＤ１３７に結合する第一の結合モジュールは、配列番号２４に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、配列番号２３に記載の可変重鎖配列と配列番号２４に記載の可変軽鎖配列とを含む第一の結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0249】

一部の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５または２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５または２７の可変重鎖配列を含むＣｌａｕｄｉｎ６に結合する結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５または２７の可変重鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を重鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２５または２７の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0250】

特定の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２５または２７に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合しかつ配列番号２５または２７に記載の可変重鎖配列と配列番号２６または２８に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0251】

一部の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２６または２８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２６または２８の可変軽鎖配列を含むＣｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２６または２８の可変軽鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を軽鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２６または２８の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0252】

特定の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２６または２８に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、配列番号２５または２７に記載の可変重鎖配列と配列番号２６または２８に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0253】

一部の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１の可変重鎖配列を含むＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１の可変重鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を重鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２１の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0254】

特定の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２１に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合しかつ配列番号２１に記載の可変重鎖配列と配列番号２２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0255】

一部の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２２の可変軽鎖配列を含むＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２２の可変軽鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を軽鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２２の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0256】

特定の実施形態では、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２２に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、配列番号２１に記載の可変重鎖配列と配列番号２２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0257】

一部の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９または３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９または３１の可変重鎖配列を含むＮｅｃｔｉｎ－４に結合する結合モジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９または３１の可変重鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を重鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号２９または３１の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0258】

特定の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２９または３１に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合しかつ配列番号２９または３１に記載の可変重鎖配列と配列番号３０または３２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0259】

一部の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３０または３２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３０または３２の可変軽鎖配列を含むＮｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。さらに別の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３０または３２の可変軽鎖配列を含み、一つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１～２個、１～３個、１～４個、または１～５個の保存的なアミノ酸置換を軽鎖可変配列に有する。さらに別の実施形態では、上記一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換は、配列番号３０または３２の一つまたは複数のフレームワーク領域内に含まれる（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）。

【0260】

特定の実施形態では、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号３０または３２に記載の可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に一つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含み（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づく）、配列番号２９または３１に記載の可変重鎖配列と配列番号３０または３２に記載の可変軽鎖配列とを含む抗体スキャフォールドモジュールの結合および／または機能的活性を保持する。

【0261】

一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３および配列番号２（１９０１ Ａｂ２）、配列番号４および配列番号５（１９０１ Ａｂ３）、配列番号１２および配列番号９（１９１２ Ａｂ３）、配列番号１３および配列番号１１（１９１２ Ａｂ４）、配列番号７２および配列番号９（１９１２ Ａｂ５）、配列番号１４および配列番号１５（１９２５ Ａｂ１）、配列番号１６および配列番号１７（１９２５ Ａｂ２）、または配列番号１８および配列番号１５（１９２５ Ａｂ３）を含む。

【0262】

他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３および配列番号２（１９０１ Ａｂ２）を含み、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４および配列番号５（１９０１ Ａｂ３）を含み、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２および配列番号９（１９１２ Ａｂ３）を含み、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１３および配列番号１１（１９１２ Ａｂ４）を含み、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７２および配列番号９（１９１２ Ａｂ５）を含み、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１４および配列番号１５（１９２５ Ａｂ１）を含み、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１６および配列番号１７（１９２５ Ａｂ２）を含み、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する。他の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１８および配列番号１５（１９２５ Ａｂ３）を含み、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する。

【0263】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによってＦｃ定常鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0264】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つのＦｃ定常鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの重鎖はどちらも、配列番号３に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号２に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの軽鎖を含む。

【0265】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって軽鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0266】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つの軽鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの軽鎖は、それぞれ別々に、配列番号５に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号４に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの重鎖を含む。

【0267】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによってＦｃ定常鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0268】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つのＦｃ定常鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの重鎖は、それぞれ別々に、配列番号１２または配列番号７２に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号９に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの軽鎖を含む。

【0269】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって軽鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0270】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つの軽鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの軽鎖は、それぞれ別々に、配列番号１１に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの重鎖を含む。

【0271】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによってＦｃ定常鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0272】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つのＦｃ定常鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの重鎖は、それぞれ別々に、配列番号１４に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの軽鎖を含む。

【0273】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって軽鎖のＣ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0274】

一部の実施形態では、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、二つの軽鎖のＣ末端に結合され、３×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、第一の結合モジュール中のＶＨのＮ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュール、３×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および第一の結合モジュールからなる二つの軽鎖は、それぞれ別々に、配列番号１７に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの重鎖を含む。

【0275】

一実施形態では、ＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する二重特異性結合タンパク質は、
ｉ）Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体スキャフォールドモジュールであって、抗体スキャフォールドモジュールが、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有するＩｇＧであり、ＩｇＧが、Ｎ末端およびＣ末端を有する二つの定常鎖を含むＦｃ領域を含む、抗体スキャフォールドモジュール、ならびに
ｉｉ）ＣＤ１３７に結合する二つの第一の結合モジュールであって、第一の結合モジュールが、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって連結されたＶＨとＶＬとを含み、第一の結合モジュールのそれぞれが、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーによって二つの重鎖のＮ末端に別々に結合される、二つの第一の結合モジュールを含む。

【0276】

一部の実施形態では、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーは、Ｎ末端およびＣ末端を有し、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＣ末端は、二つの重鎖のＮ末端に結合され、４×（Ｇ４Ｓ）リンカーのＮ末端は、第一の結合モジュール中のＶＬのＣ末端に結合されている。ｓｃＦｖは安定化されていてもよい。一部の実施形態では、第一の結合モジュール、４×（Ｇ４Ｓ）リンカー、および抗体スキャフォールドモジュールの二つの重鎖は、それぞれ別々に、配列番号１８に記載のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体スキャフォールドモジュールは、配列番号１５に記載のＮ末端からＣ末端のアミノ酸配列をそれぞれが有する二つの軽鎖を含む。

【0277】

本開示の二重特異性結合タンパク質の治療上の価値は、その有効性および効力を向上させる細胞傷害薬または細胞傷害剤とのコンジュゲーションによって増強させることができるが、そのような細胞傷害性薬剤としては、例えば、放射性同位体、薬剤、または細胞毒などの細胞傷害性エフェクター剤が挙げられる。

【0278】

一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は、以下の構造的および機能的な特徴のうちの一つまたは複数を、単独でまたは組み合わせて示す：
（ａ）ヒトＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することが可能であること、
（ｂ）カニクイザルＣＤ１３７と、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のうちの一つとに交差反応すること、
（ｃ）ＣＤ１３７に結合するヒトＣＤ１３７Ｌを阻止（例えば、低減または防止）すること、
（ｄ）ＣＤ１３７に対し高速オンおよび高速オフの特性を示すこと、
（ｅ）ＣＤ１３７シグナル伝達に対しＴＡＡ依存的なアゴニスト活性を有すること、
（ｆ）ＴＡＡ依存的な様式でＴ細胞を活性化すること、および
（ｇ）ＣＤ８ Ｔ細胞を活性化することによってＴＡＡ発現細胞を殺傷すること。

【0279】

一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下の構造的および機能的な特徴のうちの一つまたは複数を単独でまたは組み合わせて示す、Ｃｌａｕｄｉｎ－６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂである：
（ａ）Ｃｌａｕｄｉｎ６結合のための二価性、
（ｂ）高速オン／高速オフのＣＤ１３７結合カイネティクス、
（ｃ）腫瘍においてリンパ球浸潤を強化すること、
（ｄ）腫瘍においてＴ細胞の増殖／活性化を促進すること、
（ｅ）腫瘍においてＴ細胞を枯渇から保護すること、
（ｆ）腫瘍を経たＴ細胞からのＴ細胞メモリーの形成を促進すること、
（ｇ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）においてＴｒｅｇ／ＣＤ８比を減少させること、および
（ｈ）ＴＭＥにおいてＭ２様マクロファージを減少させること。

【0280】

スキャフォールドモジュールまたは結合モジュールとして使用するためのモノクローナル抗体を生産する方法
ＣＤ１３７およびＴＡＡに結合する二重特異性結合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製されてもよい。例えば、レシピエントは、可溶性組換えＣＤ１３７タンパク質またはその担体タンパク質とコンジュゲートされたＣＤ１３７ペプチドの断片で免疫されてもよい。同様に、レシピエントは、可溶性組換えＴＡＡタンパク質またはその担体タンパク質とコンジュゲートされた腫瘍関連抗原ペプチドの断片で免疫されてもよい。任意の適切な免疫方法を使用することができる。かかる方法としては、アジュバント、他の免疫刺激剤、反復ブースター免疫、および一つまたは複数の免疫経路の使用を挙げることができる。抗体から得られたＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬは、抗体スキャフォールドモジュールおよび／または第一の結合モジュールで使用され得る。

【0281】

ヒトＣＤ１３７またはＴＡＡの任意の適切な供給源を、本明細書に開示される組成物および方法の非ヒトまたはヒトの抗ＣＤ１３７抗体および／または抗ＴＡＡ抗体を生成するための免疫原として、使用することができる。

【0282】

ＣＤ１３７および／またはＴＡＡの異なる形態を使用して、生物学的に活性な抗ＣＤ１３７抗体または抗ＴＡＡ抗体を同定するための免疫応答を誘発させてもよい。そのため、誘発性のＣＤ１３７抗原またはＴＡＡは、単一エピトープ、複数のエピトープ、もしくタンパク質全体のみであってもよいし、一つまたは複数の免疫原性賦活化剤と組み合わせたものであってもよい。一部の態様では、誘発性抗原は、単離された可溶性完全長タンパク質、または完全長配列よりも小さな可溶性タンパク質である（例えば、ＣＤ１３７もしくはＴＡＡの細胞外ドメイン／ループ、ＥＣＤ１および／もしくはＥＣＤ２を含むペプチドを単独でまたは組み合わせて免疫する）。本明細書で使用される際に、用語「部分」とは、必要に応じて、目的の抗原の免疫原性エピトープを構成する最小数のアミノ酸または核酸を指す。目的の細胞の形質転換に適した任意の遺伝子ベクターが採用され得るが、そのようなものとしては、以下に限定されないが、アデノウイルスベクター、プラスミド、およびカチオン性脂質などの非ウイルスベクターが挙げられる。

【0283】

マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどの様々な哺乳類宿主からモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。かかるモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Ｓｔｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｎｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に見出され得る。典型的には、所望の抗原で免疫された動物に由来する脾臓細胞は、通常は骨髄腫細胞との融合によって不死化される。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９を参照されたい。不死化の代替的な方法としては、エプスタインバールウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で公知の他の方法が挙げられる。例えば、Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．１９９４および定期増補版）ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照されたい。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、このような細胞の産生するモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含めた様々な技術によって増強され得る。あるいは、例えばＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１により概説された一般プロトコールに従って、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。このように、抗体は、当業者によく知られている様々な技術によって取得され得る。

【0284】

他の適切な技術としては、ファージ、酵母、ウイルス、または類似のベクター中の抗体のライブラリの選択が挙げられる。例えば、前掲のＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６を参照されたい。本明細書に開示されるポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含めて、改変の有無にかかわらず使用され得る。多くの場合、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合的にまたは非共有結合的に結合することによって標識されるものとなる。多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が公知であり、科学文献および特許文献の両方に広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。こうしたラベルの使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが産生されてもよい。Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号、およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００２３を参照されたい。あるいは、トランスジェニックマウスで作製された場合には、Ｎｉｌｓ Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９、およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６；ＴＲＡＮＳＧＥＮＩＣ ＡＮＩＭＡＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ （ＷＯ２０１２／６２１１８）、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｔｒｉａｎｎｉ、Ａｂｇｅｎｉｘ、Ａｂｌｅｘｉｓ、ＯｍｉｎｉＡｂ、Ｈａｒｂｏｕｒ、および他の技術を参照されたい。

【0285】

一部の実施形態では、産生抗体がＣＤ１３７またはＴＡＡに結合する能力は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＦｏｔｅＢｉｏ（ＢＬＩ）、Ｇａｔｏｒ（ＢＬＩ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、または内部移行アッセイなどの標準的な結合アッセイを使用して評価することができる。

【0286】

ハイブリドーマまたは宿主細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーは典型的な精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４の重鎖に基づく抗体を精製することができる（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３を参照）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトガンマ３に対して推奨される（例えば、Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７－１５７５を参照）。アフィニティリガンドが結合するマトリックスは、最も多くの場合にアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの物理的に安定なマトリクスにより、アガロースで達成できるよりも速い流量および短い処理時間が実現される。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿なども、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0287】

任意の予備精製工程に続いて、目的の抗体および汚染物質を含む混合物は、典型的には低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で実施される、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されてもよい。

【0288】

ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
他の実施形態は、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該二重特異性結合タンパク質の生産のための組換え技術を包含する。単離ポリヌクレオチドは、その構成要素、例えば、スキャフォールドモジュールおよび／または第一の結合モジュールなどを含む、任意の所望の形態の二重特異性結合タンパク質をコードし得る。

【0289】

一実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３９、ＣＤＲ２：配列番号４０、ＣＤＲ３：配列番号４１、およびＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４２、ＣＤＲ２：配列番号４３、ＣＤＲ３：配列番号４４から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む、第一の結合モジュールをコードする。

【0290】

一実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合し、かつＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４５、ＣＤＲ２：配列番号４６、ＣＤＲ３：配列番号４７、およびＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４８、ＣＤＲ２：配列番号４９、ＣＤＲ３：配列番号５０から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む、抗体スキャフォールドモジュールをコードする。

【0291】

一実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、Ｃｌａｕｄｉｎ６に結合し、かつＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５１、ＣＤＲ２：配列番号５２、ＣＤＲ３：配列番号５３、およびＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号５４、ＣＤＲ２：配列番号５５、ＣＤＲ３：配列番号５６から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む、抗体スキャフォールドモジュールをコードする。

【0292】

一実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合し、かつＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３３、ＣＤＲ２：配列番号３４、ＣＤＲ３：配列番号３５、およびＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３６、ＣＤＲ２：配列番号３７、ＣＤＲ３：配列番号３８から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む、抗体スキャフォールドモジュールをコードする。

【0293】

一実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、Ｎｅｃｔｉｎ－４に結合し、かつＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５７、ＣＤＲ２：配列番号５８、ＣＤＲ３：配列番号５９、およびＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号６０、ＣＤＲ２：配列番号６１、ＣＤＲ３：配列番号６２から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のセットを有するＶＨとＶＬとの組合せを含む、抗体スキャフォールドモジュールをコードする。

【0294】

別の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号２９または配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含む抗体スキャフォールドモジュールをコードする。別の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号３０または配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体スキャフォールドモジュールをコードする。さらに別の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む抗体スキャフォールドモジュールをコードする。さらに別の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む抗体スキャフォールドモジュールをコードする。

【0295】

別の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、以下の組合せから選択される可変重鎖配列と可変軽鎖配列との対を含む抗体スキャフォールドモジュールをコードする：
ｉ）配列番号２１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、ならびに
ｉｉ）配列番号２３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｉｉｉ）配列番号２５と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２６と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｉｖ）配列番号２７と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号２８と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｖ）配列番号２９と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号３０と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列、
ｖｉ）配列番号３１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列、および配列番号３２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列。

【0296】

一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号３および配列番号２（１９０１ Ａｂ２）、配列番号４および配列番号５（１９０１ Ａｂ３）、配列番号１２および配列番号９（１９１２ Ａｂ３）、配列番号１３および配列番号１１（１９１２ Ａｂ４）、配列番号７２および配列番号９（１９１２ Ａｂ５）、配列番号１４および配列番号１５（１９２５ Ａｂ１）、配列番号１６および配列番号１７（１９２５ Ａｂ２）、または配列番号１８および配列番号１５（１９２５ Ａｂ３）を含む二重特異性結合タンパク質をコードする。

【0297】

他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号３および／または配列番号２（１９０１ Ａｂ２）を含み、かつＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号４および／または配列番号５（１９０１ Ａｂ３）を含み、かつＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１２および／または配列番号９（１９１２ Ａｂ３）を含み、かつＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１３および／または配列番号１１（１９１２ Ａｂ４）を含み、かつＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号７２および／または配列番号９（１９１２ Ａｂ５）を含み、かつＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１４および／または配列番号１５（１９２５ Ａｂ１）を含み、かつＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１６および／または配列番号１７（１９２５ Ａｂ２）を含み、かつＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１８および／または配列番号１５（１９２５ Ａｂ３）を含み、かつＣＤ１３７およびＮｅｃｔｉｎ－４に結合する、二重特異性結合タンパク質をコードする。

【0298】

また、本開示の二重特異性結合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列によって表されるヌクレオチド配列の全てまたは一部（例えば、可変領域をコードする部分）には、本明細書に定義されるように、低、中、および高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、典型的には、少なくとも１５個（例えば、２０個、２５個、３０個、または５０個）のヌクレオチド長である。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、二重特異性結合タンパク質のポリペプチド鎖（例えば、抗体スキャフォールドモジュールおよび／もしくは第一の結合モジュールの重鎖もしくは軽鎖の可変領域）またはその相補鎖をコードする核酸の一部または全ての配列に対し、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。本明細書に記載されるタイプのハイブリダイズ核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、または診断プローブとして使用することができる。

【0299】

本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の一つまたは複数の調節配列または制御配列に融合することができ、当技術分野で公知の適切な発現ベクターまたは細胞に含有させることができる。抗体結合スキャフォールドの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードする各ポリヌクレオチド分子は、独立して、ヒト定常ドメインなどの定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に融合されて、抗体スキャフォールドモジュールを形成することができる。あるいは、ポリヌクレオチドまたはその一部は、合わせて融合され、第一の結合モジュールの生産のための鋳型を提供することができる。

【0300】

組換え生産のために、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質（例えば、二つの重鎖および二つの軽鎖を含むその抗体スキャフォールドモジュール、ならびに第一の結合モジュール）をコードするポリヌクレオチドは、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入される。二重特異性結合タンパク質を発現するための多くの適切なベクターが利用可能である。ベクター構成要素は概して、シグナル配列、複製起点、一つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない。

【0301】

二重特異性結合タンパク質（例えば、二つの重鎖および二つの軽鎖を含むその抗体スキャフォールドモジュール、ならびに第一の結合モジュール）はまた、融合ポリペプチドとして生産されてもよく、この場合に二重特異性結合タンパク質は、シグナル配列などの異種ポリペプチド、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドと融合される。選択される異種シグナル配列は、典型的には、宿主細胞によって認識およびプロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。二重特異性結合タンパク質シグナル配列を認識およびプロセッシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列は、原核シグナル配列によって置換することができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーなどとしてもよい。酵母の分泌については、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼアルファ因子（サッカロミセスおよびクルイベロミセスのα因子リーダーを含む）、酸ホスファターゼ、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼから得られたリーダー配列、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルにより置換することができる。哺乳類細胞では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。このような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内で、二重特異性結合タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、二つの重鎖および二つの軽鎖を含むその抗体スキャフォールドモジュール、ならびに第一の結合モジュール）にライゲーションされる。

【0302】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、ベクターが一つまたは複数の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。概して、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にし、複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母、およびウイルスについて、そのような配列が周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２－υプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、およびＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。概して、複製要素の起点は、哺乳類発現ベクターに必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するという理由のみで典型的に使用され得る）。

【0303】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、発現を容易に識別できるようにするための選択マーカーをコードする遺伝子を含有していてもよい。典型的な選択マーカー遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、あるいは相補的な栄養要求性の欠損体であるタンパク質をコードするか、または他の代替では、複合培地中に存在しない特定の栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、バシラスのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などがある。

【0304】

また、二重特異性結合タンパク質をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞も本明細書に提供される。本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を生産するために使用される細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムＦ１０（シグマアルドリッチ社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、シグマアルドリッチ社）、ＲＰＭＩ－１６４０（シグマアルドリッチ社）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマアルドリッチ社）などの市販培地は、宿主細胞の培養に適している。これらの培地または他の培地のいずれも、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシンなど）、微量元素（通常はマイクロモル以下の範囲の最終濃度で存在する無機化合物など）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて補充されてもよい。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に既知であるものと思われる適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された細胞と共に以前に使用されたものを含み、当業者には明らかとなろう。

【0305】

非治療用途
本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質は、アフィニティ精製剤として有用である。このプロセスでは、二重特異性結合タンパク質は、当技術分野で周知の方法を使用して、プロテインＡ樹脂などの固相上に固定化される。固相化された二重特異性結合タンパク質を、精製されるＣＤ１３７およびＴＡＡタンパク質（またはその断片）を含有する試料と接触させ、次いで、固相化された二重特異性結合タンパク質に結合されたＣＤ１３７およびＴＡＡタンパク質を除いて試料中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒で、支持体を洗浄した。最後に、支持体は、ＣＤ１３７およびＴＡＡタンパク質を二重特異性結合タンパク質から遊離させる別の適切な溶媒で洗浄される。

【0306】

本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質はまた、例えば、特定の細胞、組織、または血清中のＣＤ１３７および／またはＴＡＡの発現を検出するなど、ＣＤ１３７および／またはＴＡＡのタンパク質を検出および／または定量化するための診断アッセイにも有用である。二重特異性結合タンパク質は、例えば、臨床検査手順の一部として疾患の発生または進行をモニタリングして、例えば、所与の治療および／または予防レジメンの有効性を決定するために、診断的に使用することができる。検出は、検出可能な物質に二重特異性結合タンパク質をカップリングすることによって促進することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材、発光材、生物発光材、放射性材、様々な陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本開示による診断として使用するために二重特異性結合タンパク質にコンジュゲートすることのできる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。

【0307】

二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡに関連する障害（例えば、ＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡの異常発現を特徴とする障害）を診断する方法、または対象がＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡに関連する障害を発症するリスクが高いかどうかを決定するための方法において使用することができる。かかる方法は、対象由来の生体試料を本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質と接触させること、ならびにＣＤ１３７および／またはＴＡＡへの分子の結合を検出することを含む。「生体試料」は、個体、細胞株、組織培養物、またはＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡを潜在的に発現する細胞の他の供給源から得られた、任意の生体試料を意図する。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当技術分野で周知である。

【0308】

一部の実施形態では、本方法は、患者試料中のＣＤ１３７および／またはＴＡＡのレベルを対照試料（例えば、ＣＤ１３７および／またはＴＡＡに関連する障害を有していない対象）と比較して、患者がＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡに関連する障害を有するか、またはＣＤ１３７および／もしくはＴＡＡに関連する障害を発症するリスクがあるかを決定することをさらに含み得る。

【0309】

一部の実施形態では、例えば、検出可能部分により二重特異性結合タンパク質を標識することが、診断目的のために有利となる。放射性同位体、蛍光標識、酵素基質標識などを含む、多数の検出可能な標識が利用可能である。標識は、様々な公知の技術を使用して、二重特異性結合タンパク質と間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、二重特異性結合タンパク質は、ビオチンとコンジュゲートすることができ、上述の三つの広範なカテゴリーの標識のいずれかは、アビジンとコンジュゲートすることもまたはその逆とすることもできる。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、それゆえに、標識は、この間接的な様式で二重特異性結合タンパク質とコンジュゲートすることができる。あるいは、二重特異性結合タンパク質との標識の間接的なコンジュゲートを達成するために、二重特異性結合タンパク質は、小さなハプテン（ジゴキシンなど）とコンジュゲートすることができ、上述の異なるタイプの標識のうちの一つは、抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。したがって、標識と二重特異性結合タンパク質との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。

【0310】

例示的な放射性同位体標識としては、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、および^１３１Ｉが挙げられる。二重特異性結合タンパク質は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，１９９１，Ｃｏｌｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．に記載される技術を用いて、放射性同位体により標識化することができる。放射活性は、例えば、シンチレーション計数によって測定することができる。

【0311】

例示的な蛍光標識としては、希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄに由来する標識が挙げられ、入手可能である。蛍光標識は、既知の技術、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示される技術などを介して、二重特異性結合タンパク質にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。

【0312】

当技術分野で公知の様々なよく特徴の解明された酵素－基質標識がある（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号を参照）。酵素は一般に、様々な技術を使用して測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、変化は、分光光度法で測定できる基質の色変化であり得る。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化するための技術は上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって次第に電子的に励起され、次いで、例えば化学発光計を用いて、測定可能な光を放射し得るか、または蛍光アクセプターにエネルギーを提供する。

【0313】

酵素標識の例としては、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなど）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素をタンパク質性分子にコンジュゲートするための技術は、例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ ＆ Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，７３：１４７－１６６に記載されている。

【0314】

酵素－基質の組合せの例としては、例えば、基質として水素ペルオキシダーゼを有し、該水素ペルオキシダーゼがオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３，５，５－テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）などの染料前駆体を酸化する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）；発色基質としてパラニトロフェニルホスフェートを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼなどの蛍光発生基質を有するβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（β－Ｄ－Ｇａｌ）または４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼなどの発色基質を有するβ－Ｄ－Ｇａｌが挙げられる。

【0315】

別の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は、非標識で使用され、二重特異性結合タンパク質に結合する標識化抗体により検出される。

【0316】

本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどに用いられてもよい。例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい。

【0317】

本明細書に開示の二重特異性結合タンパク質を使用して、ＣＤ１３７および／またはＴＡＡのそれぞれの受容体への結合を阻害することができる。かかる方法は、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を細胞（例えば、哺乳類細胞）または細胞環境に投与し、それによって受容体により媒介されるシグナル伝達を阻害することを含む。これらの方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。「細胞環境」は、細胞を囲む組織、培地、または細胞外マトリックスが意図されている。

【0318】

治療組成物および治療方法
本開示はまた、例えば、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物を含む組成物を提供する。このような組成物は、がんなどの疾患または障害の治療、予防、または改善のための多数の治療用途を有する。

【0319】

ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体によるＴＭＥにおけるＣＤ１３７の活性化は、患者におけるがん細胞への免疫応答を増強することができる。本開示の二重特異性抗体によって増殖が阻害され得るがんとしては、典型的に免疫療法に応答するがんと典型的に免疫療法に応答しないがんとが挙げられ、そのようなものとしては、免疫チェックポイント抵抗性腫瘍が挙げられる。がんは、固形腫瘍または液体腫瘍であり得る。

【0320】

治療のためのがんの非限定的な例としては、骨がん、皮膚がん、子宮がん、扁平上皮癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠腫、胃腸がん、腎がん、卵巣がん、肝がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸癌、頭頸部がん、生殖細胞腫瘍、黒色腫、精巣がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸管の癌、膣の癌、外陰部の癌、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、尿管のがん、腎盂の癌、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、全てのタイプの白血病、リンパ腫、および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）など、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽細胞白血病（Ｍｌ）、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、単細胞性Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／ＴＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系統の造血腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）、骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無痛性骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、および多発性骨髄腫など、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫、ならびに上記がんの任意の組合せが挙げられる。

【0321】

本明細書に記載の抗体はまた、転移性がん、切除不能および／または不応性のがん（例えば、以前の免疫療法に不応性であるがん）、ならびに再発がんの治療に使用され得る。特定の実施形態では、ＴＡＡ－ＣＤ１３７ Ａｂは、以前の治療、例えば免疫腫瘍薬を用いた以前の治療などに対して不十分な応答を示したがんを有する患者、または本質的に不応性もしくは抵抗性のどちらか（例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニストに対して不応性）の不応性もしくは抵抗性のがんを有する患者、または抵抗性もしくは不応性状態を獲得したがんを有する患者に投与される。例えば、第一の療法に応答しないかもしくは十分に応答しないか、または治療、例えば抗ＰＤ－１治療の後に疾患が進行する対象は、ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体を単独で、または別の療法（例えば、抗ＰＤ－１療法）と併用して投与することによって治療されてもよい。ある特定の実施形態では、ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体は、免疫腫瘍学剤、例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニストを以前に受けていない（すなわち、それで治療された）患者に投与される。ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体は、標準治療処置と併せて投与されてもよい。ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することが意図される療法として投与されてもよい。抗ＧＩＴＲ抗体は、別の治療、例えば、放射線、手術、または化学療法と併せて投与されてもよい。

【0322】

ヒトでは、黒色腫などの一部の腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＣＤ１３７の活性化を介してＴ細胞の活性化の閾値を低下させることによって、宿主内の腫瘍応答を活性化することができ、非免疫原性腫瘍または免疫原性が制限された腫瘍の治療が可能になる。

【0323】

一部の実施形態では、例えば、がんを有する患者の治療のための治療薬として使用するための、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物を含む、組成物が提供される。具体的な一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、腫瘍細胞を殺傷するためにがん患者に投与される。例えば、本明細書に記載の組成物は、腫瘍関連抗原を発現または過剰発現するがん細胞の存在を特徴とする固形腫瘍を有する患者を治療するために使用することができる。一部の態様では、開示された組成物は、乳がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、膵がん、胃がん、胆嚢がん、および尿路上皮がんを治療するために使用することができる。

【0324】

本開示はまた、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を含む組成物または製剤と、任意選択的に別の免疫ベースの療法とを、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの治療または予防のための方法を提供する。

【0325】

開示された二重特異性結合タンパク質はまた、単独で（例えば、単剤療法として）、または他の免疫療法剤および／もしくは化学療法と組み合わせて、がんの治療方法に有用である。

【0326】

二重特異性結合タンパク質は、単独で、または免疫媒介性炎症性障害もしくは自己免疫疾患の治療に有用な他の組成物と組み合せて、投与することができる。

【0327】

一部の態様では、医薬組成物、例えば、本明細書に開示される一つまたは複数の二重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５に開示されるものなどの従来の手法に従って、医薬的に許容可能な担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤と合わせて製剤化され得る。

【0328】

典型的には、注射による投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、医薬品はまた、注射部位の痛みを軽減するために、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。一般的に、成分は、例えば、活性薬剤の量を標示するアンプルまたはサシェなどの密封容器中に乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々に、または単位剤形で一緒に混合されて供給される。薬剤が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで分注することができる。医薬品が注射によって投与される場合、滅菌済みの注射用水または生理食塩水のアンプルが提供され得るため、成分は投与前に混合され得る。

【0329】

本明細書で使用される際に、「医薬的に許容可能な担体」としては、生理学的に適合性のある任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊椎投与、または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二重特異性結合タンパク質は、化合物を不活化し得る酸の作用および他の自然条件から化合物を保護するために、材料でコーティングされていてもよい。

【0330】

組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化するものとなる。二重特異性結合タンパク質は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出製剤などの急速な放出から化合物を保護する担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、概ね当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0331】

医薬組成物中の二重特異性結合タンパク質の投与量レベルは、対象に毒性となることなく特定の対象、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な二重特異性結合タンパク質の量を得るように変えられてもよい。選択された投与量レベルは、様々な薬物動態上の要因に依存するものとなり、そのような要因としては、採用される具体的な組成物の活性、投与経路、投与時間、採用される具体的な化合物の排泄速度、治療期間、採用される具体的な組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、および以前の病歴、ならびに医療分野で周知の同様の要因が挙げられる。

【0332】

本明細書に記載の医薬組成物は、有効量で投与され得る。「有効量」とは、単独で、または追加的な用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する これは、疾患の進行を遅らせること、特に、疾患の進行を中断または逆転させることを含む。

【0333】

一部の態様では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載されるものなど様々な障害を治療または予防するために、例えばインビボで、患者に投与される。好適な患者としては、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を投与することによって矯正または寛解され得る障害を有するヒト患者が挙げられる。

【0334】

一部の態様では、従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、本明細書に記載されるように、二重特異性結合タンパク質をコードする核酸を、哺乳類細胞または標的組織に導入することができる。かかる方法を用いて、二重特異性結合タンパク質をコードする核酸を細胞にインビトロで投与することができる。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボの遺伝子療法の使用のために投与される。他の実施形態では、遺伝子送達技術を用いて、細胞ベースまたは動物モデルにおける二重特異性結合タンパク質の活性を研究する。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。このような方法は当技術分野で周知である。

【0335】

二重特異性結合タンパク質をコードする核酸の非ウイルス送達方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤強化性取込みが挙げられる。リポフェクション方法およびリポフェクション試薬は、当技術分野で周知である（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対するものとすることができる。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である。

【0336】

本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする核酸の送達のためのＲＮＡウイルスベースまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接的に投与することもできるし（インビボ）、細胞をインビトロで処理するために使用することもでき、改変された細胞は患者に投与される（エクスビボ）。本開示の二重特異性結合タンパク質の送達のための従来のウイルスベースの系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。ウイルスベクターは、現在、標的の細胞および組織における遺伝子導入の最も効率的かつ多用途の方法である。宿主ゲノム内への組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入方法により可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。

【0337】

治療方法の一つでは、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物は、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質にコンジュゲートされているかまたはコンジュゲートされていない、治療剤または毒性剤をさらに含み得る。具体的な一実施形態では、ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原に結合する二重特異性結合タンパク質を用いて、腫瘍関連抗原を発現および／または過剰発現する腫瘍に対し、細胞傷害性ペイロードを有するＡＤＣを標的化する。

【0338】

本開示の広範な範囲は、本開示を特定の実施形態に限定することを意図されていない以下の実施例を参照して、最もよく理解される。本明細書に記載される特定の実施形態は、例示として提供されているに過ぎず、本開示は、添付の特許請求の範囲の文言によって、ならびにかかる特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲によって、限定されるものとなる。

【実施例】

【0339】

一般的な方法
免疫沈降、クロマトグラフィー、および電気泳動を含むタンパク質精製の方法は記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生産、およびタンパク質のグリコシル化は記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ｐｐ．４５－８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産、精製、および断片化は記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；前掲のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ。

【0340】

本明細書に開示される抗体タンパク質を含有するハイブリドーマまたは細胞の培養上清を、製造業者の手順に従ってＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ社、カタログ番号１７０４０４０１）を介して精製した。簡潔に述べると、上清をＤＰＢＳ（ギブコ、カタログ番号１４１９０－１３６）で５ＣＶにわたり平衡化し、周囲温度および３分の滞留時間でシリンジ／注入ポンプ（Ｌｅｇａｔｏ ２００、ＫＤサイエンティフィック社）を介してロードした。カラムを５ＣＶのＤＰＢＳで洗浄し、溶出を４ＣＶのｐＨ２．８溶出緩衝液（フィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号ＰＩ２１００４）で行った。溶出物を分画し、画分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．５（フィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号５０－８４３－２７０）で中和し、Ａ２８０（Ｄｒｏｐｓｅｎｓｉｔｉ９６、トリニアン（Ｔｒｉｎｅａｎ）社）によりアッセイした。ピーク画分をプールし、緩衝液をＤＰＢＳに交換した。遠心分離フィルター（ＥＭＤミリポア社、カタログ番号ＵＦＣ８０３０２４）を、ＤＰＢＳ中、４，０００×ｇで２分間平衡化した。精製した試料をロードし、ＤＰＢＳを添加し、総ＤＰＢＳ体積が６ＤＶ以上に達するまで、試料を４，０００×ｇで５～１０分間スピンした。最終プールをＡ２８０により分析した。

【0341】

分子生物学における標準的な方法は記載されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．にも掲載されており、この文献には、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、糖コンジュゲートおよびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）が記載されている。

【0342】

エレクトロポレーションベースのトランスフェクションを用いて、本明細書に開示されるＴＳＡ／ＴＡＡタンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１ベースのプラスミドを、選択された宿主細胞（すなわち、ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクトすることによって、本明細書に開示される標的ＴＳＡ／ＴＡＡを発現する安定細胞株を生成した。ジェネティシンを使用して、組込み細胞を選抜した。７～１０日間のジェネティシン選抜後、安定クローンをＦＡＣＳにより単離した。拡大増殖後、安定クローンを、ＴＳＡ／ＴＡＡ標的の発現についてフローサイトメトリーによりさらに確認した。

【0343】

本明細書で「ウレルマブ－ＮＲ」と称される抗ＣＤ１３７抗体（ウレルマブ）に基づく内部対照の抗ＣＤ１３７抗体を、米国特許第７，２８８，６３８号（該特許中の配列番号３のＶＨおよび配列番号６のＶＬ）に公開されている公的に入手可能な情報に基づいて調製した。

【0344】

ハイブリドーマクローンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を、以下に記載されるように決定した。キアゲン社（米国メリーランド州ジャーマンタウン）のＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、１～２×１０^６個のハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。タカラバイオ社（米国カリフォルニア州マウンテンビュー）のＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’Ｋｉｔを使用して５’ＲＡＣＥ反応を実施することによって、ｃＤＮＡを生成した。ＮＥＢラボラトリーズ社（米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）のＱ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを実施し、Ｔａｋａｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを適切な免疫グロブリンの３’マウス定常領域の遺伝子特異的プライマーと組み合わせて用いて重鎖および軽鎖由来の可変領域を増幅した。重鎖および軽鎖の増幅された可変領域を、２％アガロースゲル上で泳動させ、適切なバンドを切り出し、次いでキアゲン社のＭｉｎｉ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を、インビトロジェン（米国カリフォルニア州カールスバッド）のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングし、タカラバイオ社のＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃｅｌｌｓに形質転換し、ＬＢ 寒天＋５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンプレート上に播種した。ダイレクトコロニーサンガーシーケンシングは、ジーンウィズ社（米国ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）により行われた。結果として得られたヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して分析して、生産性のある再構成体を特定し、翻訳されたタンパク質配列を分析した。ＣＤＲの決定は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくものとした。

【0345】

組換えのモノクローナルまたは二重特異性の結合タンパク質を以下のように発現し精製した：それぞれの重鎖または軽鎖をＰＣＲ増幅または合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベースの発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）またはヒトカッパ軽鎖（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８３４）またはヒトラムダ軽鎖（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０ＤＯＹ２）に由来する定常領域を保有する。Ｅｘｐｉ２９３細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に対し、重鎖発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドの対を、供給業者のＥｘｐｉ２９３発現システムのプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの五日後、培養上清を遠心分離により採集した。プロテインＡカラムおよび緩衝液を用いた１ステップのアフィニティ精製によって、抗体を精製し、２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０、またはＰＢＳ ｐＨ７．２に交換した。

【0346】

蛍光活性化細胞ソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含めた、フローサイトメトリーについての方法が入手可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば診断試薬として使用するための、核酸のプライマーおよびプローブを含めた核酸、ポリペプチド、ならびに抗体を改変するのに適した蛍光試薬が入手可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．

【0347】

リガンド／受容体相互作用の特徴を解析するための標準的な技術が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特定の作用機序を有する抗体の特性解析に適した抗体機能の特性解析の標準的な方法も、当業者に周知である。

【0348】

例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、ＣＤＲアノテーション、グリコシル化部位、および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。

【0349】

本明細書で利用される参照配列を表９に示す。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【0350】

実施例１：ＣＤ１３７およびＣｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４に結合する結合タンパク質の生成
ヒト抗体のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を発現するヒトＩｇトランスジェニックマウスであるＴｒｉａｎｎｉマウス（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３９１、ＴＲＩＡＮＮＩ（登録商標）マウスを参照）を免疫することによって、完全ヒト型の抗ヒトＣＤ１３７抗体、抗ヒトＣｌａｕｄｉｎ６抗体、および抗ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を生成した。

【0351】

上述の免疫用ＴＲＩＡＮＮＩマウスを、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）、尾基部、または足蹠への注射を介して組換えヒトタンパク質、標的タンパク質を発現する安定細胞株、またはＤＮＡのいずれかを注射することによって免疫した。

【0352】

マウス抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）、または尾基部、もしくは足蹠のいずれかへの注射により、組換えヒトＮｅｃｔｉｎ－４タンパク質で免疫することによって作製した。

【0353】

免疫応答を後眼窩採血によりモニタリングした。血漿を、（以下に記載されるように）ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、またはイメージングによってスクリーニングした。十分な抗ＣＤ１３７、抗Ｃｌａｕｄｉｎ６、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、または抗Ｎｅｃｔｉｎ－４の力価を有するマウスを融合に使用した。マウスを免疫原により腹腔内、尾基部、足蹠、または静脈内でブーストした後に屠殺し、脾臓およびリンパ節を摘出した。

【0354】

ＣＤ１３７、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫マウスから得た血清を、それぞれヒトＣＤ１３７、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４タンパク質への結合について、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはイメージングによってスクリーニングした。

【0355】

ＥＬＩＳＡについては、簡潔に述べると、組換えヒトＣＤ１３７またはＮｅｃｔｉｎ－４でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、免疫マウス由来の血清の希釈物と共に室温で一時間インキュベートし、アッセイプレートを洗浄した。特異的な抗体結合は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社、カタログ番号：１１５－０３６－０７１）と共に室温で一時間保ち、洗浄し、次いでＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ社、カタログ番号：ＡＢＴＳ－１０００）により室温で３０分間インキュベートすることにより検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（バイオテック）を使用してプレートを読み取った。

【0356】

ＦＡＣＳについては、簡潔に述べると、ＣＤ１３７、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞もしくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、または親のＨＥＫ２９３Ｔ細胞もしくはＣＨＯ－Ｋ１細胞を、免疫マウス由来の血清の希釈物と共に４℃で２時間インキュベートした。細胞を、２％ＰＦＡ（アルファエイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、カタログ番号：Ｊ６１８９９）により４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。４℃で一時間インキュベートした後、特異的抗体結合をＡｌｅｘａ ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号：Ａ２１２３５）により検出した。フローサイトメトリー分析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、ザルトリウス社）上で行った。

【0357】

さらに、マウス血清をイメージングによって試験した。簡潔に述べると、ＣＤ１３７、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞もしくはＣＨＯ－Ｋ１細胞を、免疫マウス由来の血清の希釈物とインキュベートした。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドにより固定し、洗浄し、特異的抗体結合を二次Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ（インビトロジェン）により検出した。プレートをスキャンし、イメージング装置（Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５、バイオテック）上で分析した。

【0358】

ＣＤ１３７、Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、またはＮｅｃｔｉｎ－４に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、脾細胞およびリンパ節細胞を免疫マウスから単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合した。結果として得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。例えば、免疫マウス由来の脾細胞、リンパ節細胞の単一細胞懸濁液を、同数のマウスＩｇＧ非分泌性骨髄腫細胞Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１）に電気融合により融合した。細胞を平底９６ウェル組織培養プレートに播種した後、選択培地（ＨＡＴ培地）中で約一週間のインキュベーションを行い、次いで、ハイブリドーマ培養培地に置換した。細胞播種のおよそ１０～１４日後、個々のウェルから得た上清を、上述のようにＥＬＩＳＡ、イメージング、またはＦＡＣＳによってスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、再びスクリーニングして、抗ＣＤ１３７、抗Ｃｌａｕｄｉｎ６、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、または抗Ｎｅｃｔｉｎ－４が依然として陽性であった場合に、陽性ハイブリドーマを、単一細胞ソーターを用いたソーティングによってサブクローニングした。サブクローンを、上述のようにＥＬＩＳＡ、イメージング、またはＦＡＣＳにより再度スクリーニングした。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、精製および特性解析のために少量の抗体を生成した。

【0359】

マウス抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体を、ＣＤＲ移植によってヒト化した。簡潔に述べると、１９２５Ａｂ４のＶＨおよびＶＬをそれぞれクエリーとして使用して、最も類似したヒトフレームワーク領域についてヒト抗体生殖系列配列を検索した。マウスＣＤＲ（Ｋａｂａｔナンバリングに基づく）を、特定したヒト抗体フレームワークに移植した。複数の対のヒト化ＶＨおよびＶＬのバリアントを発現および精製し、ヒトＮｅｃｔｉｎ－４に対し最も高い結合親和性を有する１対（１９２５Ａｂ４ ＶＨ（Ｈｚ）および１９２５Ａｂ４ ＶＬ（Ｈｚ））を使用して、二重特異性抗体を構築した。

【0360】

実施例２：ＴＡＡ／ＣＤ１３７二重特異性体（ＢｓＡｂ＿Ａ）の分子設計および生産
ＴＡＡに結合する結合タンパク質の代表的な例として、図３および図４に要約されるサブユニット／構成成分を含む、図２に示される分子フォーマットによって特徴付けられる相称的な二重特異性体（Ｃｌａｕｄｉｎ ６×ＣＤ１３７）ＢｓＡｂ＿Ａを調製した。
１９１２Ａｂ３
１．重鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体の重鎖、リンカー、および抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ（ＣＣを有するＶＨ－ＶＬ）（Ｎ→Ｃ）という構成成分を含む配列番号１２、ならびに
２．軽鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体軽鎖を含む配列番号９

【0361】

１９１２Ａｂ３の重鎖構成成分をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１２）を有するＤＮＡセグメント１を発現ベクターに挿入し、１９１２Ａｂ３の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号９）を有するＤＮＡセグメント２を上記発現ベクターに挿入した。
１９１２Ａｂ５
１．重鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体の重鎖、リンカー、および抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ（ＣＣを有するＶＨ－ＶＬ）（Ｎ→Ｃ）という構成成分を含む配列番号７２、ならびに
２．軽鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体軽鎖を含む配列番号９。

【0362】

代替的な一例では、１９１２Ａｂ５の重鎖構成成分をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７２）を有するＤＮＡセグメント１を発現ベクターに挿入し、１９１２Ａｂ５の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号９）を有するＤＮＡセグメント２を上記発現ベクターに挿入した。

【0363】

構築された発現ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞（サイエンティフィック社）中で一過性に発現させ、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃の条件下で５日間、Ｅｘｐｉ２９３発現培地中で培養した。二重特異性抗体を、組換えプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社）によって、また必要に応じてイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーによる第二の工程の精製によって、細胞培養上清から精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（バイラッド（ＢｉＲａｄ）社）、ＳＥ－ＨＰＬＣカラム（東ソー社、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）を用いたサイズ排除ＨＰＬＣ（アジレントテクノロジー社、１１００シリーズ）分析、およびＣＥ－ＳＤＳ（サイエックス（ＳＣＩＥＸ）社、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ）を実施して、二重特異性抗体のサイズおよび純度を検出および確認した。精製したタンパク質を所望の緩衝液に緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ３０Ｋ装置を使用した限外濾過により濃縮し、ドロップセンス（アンチェインドラブス（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂ）社）を用いてタンパク質濃度を推定した。一過性トランスフェクションは、２ベクター系において、または一つの単一ベクター中に重鎖成分と軽鎖成分との両方を含有する１ベクター系を用いて、使用可能であった。あるいは、二重特異性抗体は、ＣＨＯ安定発現細胞株の上清から精製することができた。

【0364】

実施例３：ＴＡＡ／ＣＤ１３７二重特異性体（ＢｓＡｂ＿Ｂ）の分子設計および生産
ＴＡＡに結合する結合タンパク質の代表的な例として、図３および図４に要約されるサブユニット／成分を含む、図２に示される分子フォーマットによって特徴付けられる相称的な二重特異性体（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２×ＣＤ１３７）ＢｓＡｂ＿Ｂを調製した。
１９０１Ａｂ３
１．重鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖という構成成分を含む配列番号４、および
２．軽鎖：抗Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２抗体の軽鎖、リンカー、および抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ（ＣＣを有するＶＨ－ＶＬ）（Ｎ→Ｃ）を含む配列番号５

【0365】

１９０１Ａｂ３の重鎖構成成分をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４）を有するＤＮＡセグメント１を発現ベクターに挿入し、１９０１Ａｂ３の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号５）を有するＤＮＡセグメント２を上記発現ベクターに挿入した。

【0366】

構築された発現ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞（サイエンティフィック社）中で一過性に発現させ、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃の条件下で５日間、Ｅｘｐｉ２９３発現培地中で培養した。二重特異性抗体を、組換えプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社）によって、また必要に応じてイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーによる第二の工程の精製によって、細胞培養上清から精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（バイラッド（ＢｉＲａｄ）社）、ＳＥ－ＨＰＬＣカラム（東ソー社、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）を用いたサイズ排除ＨＰＬＣ（アジレントテクノロジー社、１１００シリーズ）分析、およびＣＥ－ＳＤＳ（サイエックス（ＳＣＩＥＸ）社、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ）を実施して、二重特異性抗体のサイズおよび純度を検出および確認した。精製したタンパク質を所望の緩衝液に緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ３０Ｋ装置を使用した限外濾過により濃縮し、ドロップセンス（アンチェインドラブス（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂ）社）を用いてタンパク質濃度を推定した。一過性トランスフェクションは、２ベクター系において、または一つの単一ベクター中に重鎖成分と軽鎖成分との両方を含有する１ベクター系を用いて、使用可能であった。あるいは、二重特異性抗体は、ＣＨＯ安定発現細胞株の上清から精製することができた。

【0367】

実施例４：ＴＡＡ／ＣＤ１３７二重特異性体（ＢｓＡｂ＿Ｃ）の分子設計および生産
ＴＡＡに結合する結合タンパク質の代表的な例として、図３および図４に要約されるサブユニット／成分を含む、図２に示される分子フォーマットによって特徴付けられる相称的な二重特異性体（Ｎｅｃｔｉｎ－４×ＣＤ１３７）ＢｓＡｂ＿Ｃを調製した。
１９２５Ａｂ３
１．重鎖：抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ（ＣＣを有するＶＨ－ＶＬ）（Ｎ→Ｃ）、リンカー、およびヒト化抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体の重鎖という構成成分を含む配列番号１８、ならびに
２．軽鎖：ヒト化Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体軽鎖を含む配列番号１５

【0368】

１９２５Ａｂ３の重鎖構成成分をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を有するＤＮＡセグメント１を発現ベクターに挿入し、１９２５Ａｂ３の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１５）を有するＤＮＡセグメント２を上記発現ベクターに挿入した。

【0369】

構築された発現ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞（サイエンティフィック社）中で一過性に発現させ、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃の条件下で５日間、Ｅｘｐｉ２９３発現培地中で培養した。二重特異性抗体を、組換えプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社）によって、また必要に応じてイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーによる第二の工程の精製によって、細胞培養上清から精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（バイラッド（ＢｉＲａｄ）社）、ＳＥ－ＨＰＬＣカラム（東ソー社、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）を用いたサイズ排除ＨＰＬＣ（アジレントテクノロジー社、１１００シリーズ）分析、およびＣＥ－ＳＤＳ（サイエックス（ＳＣＩＥＸ）社、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ）を実施して、二重特異性抗体のサイズおよび純度を検出および確認した。精製したタンパク質を所望の緩衝液に緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ３０Ｋ装置を使用した限外濾過により濃縮し、ドロップセンス（アンチェインドラブス（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂ）社）を用いてタンパク質濃度を推定した。一過性トランスフェクションは、２ベクター系において、または一つの単一ベクター中に重鎖成分と軽鎖成分との両方を含有する１ベクター系を用いて、使用可能であった。あるいは、二重特異性抗体は、ＣＨＯ安定発現細胞株の上清から精製することができた。

【0370】

実施例５：細胞表面のＣｌａｕｄｉｎ６へのＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの結合
二重特異性ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７結合タンパク質を、実施例４に記載されるように生成し、生産し、精製した。ＢｓＡｂ １９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４のＣｌａｕｄｉｎ６への結合活性を調べるために、細胞表面に内因性ヒトＣｌａｕｄｉｎ６を発現するＮＥＣ８ ＷＴ細胞またはＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞を使用して、免疫蛍光結合アッセイを行った。Ｃｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって生成した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養した。実験日に、細胞を採集し、洗浄し、ＢｓＡｂ １９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４、ならびにｍＡｂ １９１２Ａｂ１および１９１２Ａｂ２を用いて４℃で２時間染色した後、室温で１５分間細胞を固定した。固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）を用いて室温で１時間染色した。結合シグナルを、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（ザルトリウス社、ミシガン州）を使用して蛍光強度を定量化することにより評価した。

【0371】

図６Ａに示されるように、１０μｇ／ｍｌの濃度で、１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４を含む開示された二重特異性結合タンパク質は、単一特異性対照抗体１９１２Ａｂ１および１９１２Ａｂ２と比較して、ＮＥＣ８細胞の細胞表面のヒトＣｌａｕｄｉｎ６に同様に結合した。Ｃｌａｕｄｉｎ ６遺伝子がＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって欠失された場合、結合は検出されなかった。この結果では、ＮＥＣ８ ＷＴ細胞上の二重特異性結合タンパク質の結合が、ＮＥＣ８細胞の細胞表面に発現するＣｌａｕｄｉｎ６を通して特異的であることが確認された。Ｃｌａｕｄｉｎ６に対する１９１２Ａｂ５の濃度依存性結合曲線を、図６Ｂに示す。１９１２Ａｂ５は、１．５ｎＭの結合ＥＣ_５０値でＮＥＣ８細胞に結合する。

【0372】

Ｃｌａｕｄｉｎ６とＣｌａｕｄｉｎ９との間には高い相同性があること、およびＣｌａｕｄｉｎ９が正常細胞に発現するというプロファイルを示すことから、がんを治療し安全性の問題を最小にするためには、高度に選択的なＣｌａｕｄｉｎ６抗体が望ましい。Ｃｌａｕｄｉｎ６の結合選択性がＣｌａｕｄｉｎ９を上回ることを評価するために、Ｃｌａｕｄｉｎ６またはＣｌａｕｄｉｎ９のいずれかを過剰発現する二つのＣＨＯ細胞株を、画像ベースの細胞結合アッセイに使用した。図６Ｃに示されるように、１９１２Ａｂ５は、ＣＨＯ－Ｃｌａｕｄｉｎ９細胞に結合せず、ＣＨＯ－Ｃｌａｕｄｉｎ６細胞に結合する。

【0373】

実施例６：ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂのＣＤ１３７への結合
Ｃｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７ ＢｓＡｂのＣＤ１３７との結合を、ＳＰＲアッセイおよび免疫蛍光イメージングアッセイによって測定した。図７Ａに示されるように、１９１２Ａｂ５は、ヒトＣＤ１３７に結合する際に、所望の高速オンと高速オフのカイネティクスを有する。三つの実験から、１９１２Ａｂ５は、１．３３Ｅ＋０６（１／Ｍｓ）の平均ｋａ値、および４．６２Ｅ－０２（１／ｓ）の平均ｋｄ値を有した。平均ＫＤは３．４６Ｅ＋０８Ｍであった。断続的な結合は、Ｔ細胞を過剰に刺激しＴ細胞の消耗を引き起こすリスクを低下させる可能性がある。

【0374】

ヒトＣＤ１３７発現構築物により安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞ベースの結合アッセイに使用して、ＣＤ１３７結合親和性を評価した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含む完全培地に播種し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。試験抗体を用いて細胞を４℃で２時間染色した後、細胞を室温で１５分間固定した。固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）を用いて室温で１時間染色した。細胞をイメージングし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（バイオテック、バーモント州）を使用して蛍光強度を定量化することによって、結合シグナルを評価した。

【0375】

図７Ｂに示される結果では、二重特異性抗体１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４、ならびに単一特異性対照抗体１９２３Ａｂ４が、１０μｇ／ｍｌの濃度で、同様のレベルでヒトＣＤ１３７に結合したことが示された。１９１２Ａｂ５の濃度依存性結合曲線を、図７Ｃに示す。１９１２Ａｂ５は、０．２８ｎＭの結合ＥＣ_５０値でＨＥＫ２９３－Ｃｌａｕｄｉｎ６細胞に結合し、ベンチマーク対照のウレルマブ－ＮＲの結合ＥＣ_５０は０．２２ｎＭであった。

【0376】

実施例７：ＣＤ１３７シグナル伝達のＣｌａｕｄｉｎ６依存的な活性化
Ｃｌａｕｄｉｎ６依存的なＣＤ１３７アゴニズムを誘導する能力について、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂを評価した。簡潔に述べると、ＣＤ１３７を安定的に発現しＮＦｋＢ－Ｌｕｃレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞株を、ＣＤ１３７シグナル伝達を定量化するために使用し、また、細胞表面に内因性Ｃｌａｕｄｉｎ６を発現させたＮＥＣ８ ＷＴ細胞を、Ｃｌａｕｄｉｎ６を提供する標的細胞として使用した。Ｃｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞を陰性対照として使用して、Ｃｌａｕｄｉｎ６依存性を示した。開示された抗体１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４は、Ｃｌａｕｄｉｎ６およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。単一特異性抗体のウレルマブ－ＮＲは、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。Ｊｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞を、ＮＥＣ８ ＷＴ細胞またはＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ細胞のいずれかと共培養し、開示された結合タンパク質により３７℃、５％ＣＯ_２で１６時間刺激した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（プロメガ社、カタログ番号Ｅ６１３０）を添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。発光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダー（バイオテック）によって測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。図８Ａは、ウレルマブ－ＮＲのみが、ＮＥＣ８ ＷＴおよびＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ標的細胞の両方においてＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したことを示す。１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４は、ＮＥＣ８ ＷＴ細胞の存在下で、ウレルマブ－ＮＲよりも強いＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。Ｃｌａｕｄｉｎ６ノックアウトＮＥＣ８細胞では、バックグラウンド活性のみが検出された。

【0377】

ＮＥＣ８ ＷＴ細胞の存在下でＣＤ１３７シグナル伝達を誘導する１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、およびウレルマブ－ＮＲの用量応答曲線を、図８Ｂに示した。１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、およびウレルマブ－ＮＲのＥＣ_５０値（効力）は、それぞれ０．２０ｎＭ、０．１８ｎＭ、および０．３１ｎＭであった。１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４の両方が、ウレルマブ－ＮＲよりも良好な有効性（より高いＥｍａｘ）を示した。

【0378】

同様に、１９１２Ａｂ５およびウレルマブ－ＮＲを、ＮＥＣ８細胞（図８Ｃ）またはＯＶ９０細胞（図８Ｄ）のいずれかを用いたＣＤ１３７シグナル伝達アッセイで評価した。図に示されるように、１９１２Ａｂ５は、それぞれ０．０６６ｎＭおよび０．０６４ｎＭのＥＣ_５０値（効力）で用量依存的なＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。対照抗体のウレルマブ－ＮＲは、それぞれ０．２８ｎＭおよび０．６２ｎＭのＥＣ_５０値を示した。１９１２Ａｂ５は、ウレルマブ－ＮＲよりもＴ細胞のＣＤ１３７シグナル伝達において強いアゴニズムを示した。

【0379】

実施例８：ＣＤ８ Ｔ細胞のＣｌａｕｄｉｎ６依存的な活性化
共培養実験を用いて、Ｃｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＴ細胞の活性化を測定した。健康なドナー由来ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＥＣ８細胞を、それぞれエフェクター細胞および標的細胞として使用した。これらの二つの細胞を、１０％ＦＢＳおよび０．５ｕｇ／ｍｌのマウス抗ｈＣＤ３クローンＯＫＴ３（バイオレジェンド社、カタログ番号３１７３２５）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で共培養した。開示された結合タンパク質を添加して、Ｔ細胞を刺激した。開示された抗体１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４は、Ｃｌａｕｄｉｎ６およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。単一特異性抗体のウレルマブ－ＮＲは、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。５％ＣＯ_２共存下３７°Ｃで３日間、プレートをインキュベートした。７２時間のインキュベーション後、上清を採集し使用して、製造業者の指示によるプロトコールを用いてＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、カタログ番号ＡＬ２１７Ｃ／Ｆ）により、分泌されたＩＦＮγを測定した。ＩＦＮγの量は、Ｔ細胞の活性化を表す。

【0380】

図９Ａは、ウレルマブ－ＮＲが、Ｃｌａｕｄｉｎ６発現とは独立してＴ細胞の活性化を刺激することを示す。ＣＤ８ Ｔ細胞をＮＥＣ８ ＷＴ細胞またはＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞と共培養したときに、同様のレベルのＩＦＮγが検出された。しかし、１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４は、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化をＮＥＣ８ ＷＴ細胞の存在下でのみ刺激するが、Ｃｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞の存在下では刺激しない。この結果は、開示された二重特異性結合タンパク質のＣｌａｕｄｉｎ６依存的なＴ細胞活性化活性を確定するものである。

【0381】

ＮＥＣ８ ＷＴ細胞の存在下でＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を誘導するための１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、およびウレルマブ－ＮＲの用量応答曲線を図９Ｂに示す。１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、およびウレルマブ－ＮＲのＥＣ_５０値（効力）は、それぞれ０．０４２ｎＭ、０．１５ｎＭ、および０．９ｎＭであった。１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４の両方が、ウレルマブ－ＮＲよりも、Ｔ細胞活性化の顕著な特徴であるＩＦＮγ産生を誘導するための効力および有効性（より高いＥｍａｘ）を高く示した。

【0382】

同様に、１９１２Ａｂ５およびウレルマブ－ＮＲを、ＮＥＣ８細胞（図９Ｃ）またはＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞（図９Ｄ）のいずれかを使用して、Ｔ細胞活性化アッセイで評価した。図に示されるように、１９１２Ａｂ５は、ＮＥＣ８野生型細胞の存在下でのみ、０．１７ｎＭのＥＣ_５０値（効力）で用量依存的なＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。対照的に、対照抗体のウレルマブ－ＮＲは、ＮＥＣ８野生型の試験およびＣｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ ＮＥＣ８細胞の試験の両方で活性を示し、ＥＣ_５０値はそれぞれ０．８２ｎＭおよび０．９９ｎＭであったが、このことは、その活性がＣｌａｕｄｉｎ６の発現とは独立していることを示している。１９１２Ａｂ５は、Ｔ細胞活性化試験において、標的腫瘍抗原が利用可能である場合にのみ、ウレルマブ－ＮＲよりも高いアゴニズムレベルを示した。

【0383】

実施例９：ＢｓＡｂ ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７によって誘導されるＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍殺傷活性
共培養実験を実施して、ＢｓＡｂ １９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４によって媒介されるＴ細胞由来腫瘍殺傷活性（ＴＤＣＣ）を評価した。簡潔に述べると、健康なドナー由来のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤（ステムセル社、カタログ番号１０９７１）で２日間、予め活性化した。活性化細胞を洗浄して、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化剤を除去した。次いで、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現構築物で安定的にトランスフェクトされたＮＥＣ８腫瘍細胞と共培養し、開示された二重特異性結合タンパク質で１０８時間処理した。開示された抗体１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４は、Ｃｌａｕｄｉｎ６およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（バイオテック、バーモント州）を使用して測定した緑色蛍光細胞の面積により、細胞数を測定した。殺傷の割合を、以下の式によって計算した。
殺傷の％＝（結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰ細胞の面積－結合タンパク質で処理されたウェル由来のＧＦＰ細胞の面積）／結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰ細胞の面積＊１００％

【0384】

図１０Ａは、１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４が強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。腫瘍細胞の約８０％が、ＢｓＡｂを用いた１０８時間の処理時にＣＤ８ Ｔ細胞によって殺傷された。１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４のＥＣ_５０値は、それぞれ０．１１ｎＭおよび０．１６ｎＭであった。

【0385】

ＢｓＡｂ １９１２Ａｂ５のＴＤＣＣ効果を評価するために、類似の共培養実験を実施した。簡潔に述べると、健康なドナー由来のＣＤ８ Ｔ細胞を、マウス抗ｈＣＤ３クローンＯＫＴ３（バイオレジェンド社、カタログ番号３１７３２５）の存在下でＧＦＰを安定的にトランスフェクトされた卵巣がん細胞株ＯＶ９０細胞と共培養した。共培養細胞を、ＢｓＡｂ １９１２Ａｂ５または対照で１４４時間処理した。開示された抗体１９１２Ａｂ５は、Ｃｌａｕｄｉｎ６およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（バイオテック、バーモント州）を使用して、生細胞数を測定した。殺傷の割合を、以下の式によって計算した：
殺傷の％＝（結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰ細胞の面積－結合タンパク質で処理されたウェル由来のＧＦＰ細胞の面積）／結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰ細胞の面積＊１００％

【0386】

図１０Ｂは、１９１２Ａｂ５が強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。腫瘍細胞の約７０％が、ＢｓＡｂを用いた１４４時間の処理時にＣＤ８ Ｔ細胞によって殺傷された。１９１２Ａｂ５のＥＣ_５０値は０．０３６ｎＭであった。

【0387】

実施例１０：ヒト化Ｂ－ｈ４－１ＢＢマウスの皮下同系ＭＣ３８－ｈＣｌａｕｄｉｎ ６マウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖に対するＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの効果
１６～２０ｇの体重の６～８週齢のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウス（バイオサイトジェン社）を、試験登録前に７日間順応させた。ＭＣ３８マウス結腸がん細胞株を遺伝子改変して、ヒトＣｌａｕｄｉｎ６を過剰発現させた。細胞を、５％雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中の単層培養としてインビトロで維持した。細胞を採取し、１００μｌのＰＢＳ中の５×１０^５個の細胞を、腫瘍発生のために右前脇腹に皮下移植した。７日目に、腫瘍担持マウスを、およそ１００～１５０ｍｍ^３の平均腫瘍サイズを有する３つの試験群に無作為に登録した。各群は６頭のマウスから構成された。腫瘍サイズはキャリパーを用いて二次元で週二回測定し、体積は以下の式を使用してｍｍ^３で表した。Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２であって、式中、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長寸法および短寸法である。７日目、１１日目、１４日目、および１８日目に、マウスを、５ｍｇ／ｋｇの１９１２Ａｂ３、１９１２Ａｂ４、または陰性対照としてＰＢＳの腹腔内注射により処置した。試験は２８日目に終了した。

【0388】

図１１Ａは、三つの治療群についての腫瘍増殖曲線を示す。１９１２Ａｂ３および１９１２Ａｂ４の両方が、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖を有意に阻害した。１９１２Ａｂ３を注射した全てのマウス、および１９１２Ａｂ４を注射した６頭中５頭のマウスは、２８日目に完全な腫瘍寛解を示した。

【0389】

肝毒性は、２１日目の血清試料由来のマウス血清中のＡＬＴおよびＡＳＴの活性を測定することによってモニタリングされている。図１１Ｂに示されるように、ＡＬＴレベルは、処置群と対照群とを比較して有意な増加がない。同様に、図１１Ｃに示されるように、ＡＳＴレベルは、処置群からは有意な増加がなく、このことは抗体由来肝毒性のリスクが低いことを示している。

【0390】

完全な腫瘍寛解を有するマウスにおいて、ｂｓＡｂ Ｃｌａｕｄｉｎ６／ＣＤ１３７が腫瘍免疫を誘導できるか否かを評価するため。四頭のマウスを予め１９１２Ａｂ３により処置し、１９１２Ａｂにより処置した四頭のマウスを、事前処置の最後の投与の４５日後、ＭＣ３８－Ｃｌａｕｄｉｎ６腫瘍に再曝露した。本試験では、四頭のナイーブマウスを対照群として使用した。図１１Ｄに示されるように、全てのナイーブマウスが腫瘍を発症したが、完全な腫瘍寛解を有する事前処置されたマウスはいずれも、再曝露後に腫瘍を発症しなかった。

【0391】

抗体１９１２Ａｂ５の有効用量を探索するために、用量滴定試験を実施した。バイオサイトジェン社（マサチューセッツ州ボストン）のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウスに、５×１０^５個の生細胞のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを３つの群に無作為化し、腹腔内注射による処置を開始した。第１群はビヒクル対照を受け、第２群は０．３ｍｐｋの１９１２Ａｂ５抗体を受け、第３群は１ｍｐｋの１９１２Ａｂ５抗体を受け、第４群は３ｍｐｋの１９１２Ａｂ５抗体を受けた。処置を２週間にわたって週二回投与した。

【0392】

図１２に示されるように、単剤の１９１２Ａｂ５は強力な有効性を示した。０．３ｍｐｋの用量では、腫瘍接種後３２日目に９７．７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈し、１ｍｐｋでの１９１２Ａｂ５は、腫瘍接種後３２日目に１０６．２％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈し、３ｍｐｋでの１９１２Ａｂ５は、腫瘍接種後３２日目に１０６．４％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈した。

【0393】

Ａｂ １９１２Ａｂ５の効力を、ベンチマークのＣＤ１３７ Ａｂであるウレルマブ－ＮＲと比較するために、追跡試験を実施した。バイオサイトジェン社（マサチューセッツ州ボストン）のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウスに、５×１０^５個の生細胞のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを３つの群に無作為化し、腹腔内注射による処置を開始した。第１群はビヒクル対照を受け、第２群は０．１ｍｐｋの１９１２Ａｂ５抗体を受け、第３群は０．１ｍｐｋのウレルマブ－ＮＲを受けた。処置を２週間にわたって週二回投与した。

【0394】

図１３に示されるように、単剤の１９１２Ａｂ５は、ベンチマーク抗体のウレルマブ－ＮＲと比較して優れた有効性を示した。０．１ｍｐｋの用量では、１９１２Ａｂ５は、腫瘍接種後２７日目に７７．２％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈したのに対し、０．１ｍｐｋでのウレルマブ－ＮＲは、３６．６％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を呈したのみであった。

【0395】

Ｃｌａｕｄｉｎ６／ＣＤ１３７二重特異性Ａｂが、定着した大きな腫瘍の治療に使用できるか否かを調べるため。バイオサイトジェン社（マサチューセッツ州ボストン）のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウスに、５×１０^５個の生細胞のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍サイズがおよそ４００ｍｍ^３に達したとき、マウスを二つの群に無作為化し、１週間にわたって週２回処置した。第１群はビヒクル対照を受け、第２群は２ｍｐｋ １９１２Ａｂ５抗体の二回投与を受けた。図１４に示されるように、１９１２Ａｂ５は、腫瘍接種後３５日目に強力な有効性、すなわち６２．７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示した。

【0396】

実施例１１：Ｃｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７抗体により処理した腫瘍の免疫構成解析
マルチプレックス蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）試験および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析を実施して、Ｃｌａｕｄｉｎ６／ＣＤ１３７ ｂｓＡｂ処置後の腫瘍における免疫細胞の内容を評価した。

【0397】

バイオサイトジェン社（マサチューセッツ州ボストン）のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウスに、５×１０^５個の生細胞のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを二つの群、一つの群当たり８頭のマウスに無作為化し、１５日目および１９日目の２回処置した。第１群をビヒクル対照によって処理し、第２群を１ｍｐｋ １９１２Ａｂ５によって処理した。腫瘍接種後２６日目に、マウスを安楽死させ、ＩＨＣおよびＴｉｌ試験のために新鮮な腫瘍を採取した。

【0398】

各治療群由来の二つの腫瘍をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。蛍光ＩＨＣを、５ｍｍのＦＦＰＥ組織切片を用いて行った。脱パラフィン後、マルチプレックス免疫細胞プロファイリングのために、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８を検出する一次抗体によってスライドを染色した。代表的な画像を図１５に示す。１９１２Ａｂ５処置腫瘍は、ビヒクル対照（図１５Ａ）と比較して、リンパ球の浸潤、ならびにＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤を有意に増加させた（図１５Ｂ）。

【0399】

各治療群から得た６個の新鮮な腫瘍を用いて、腫瘍浸潤リンパ球分析を実施した。腫瘍を解離させるために、酵素ベースの方法を用いた。消化された腫瘍から得た細胞を濾過し、洗浄し、マルチプレックスフローサイトメトリーに使用した。Ｔ細胞集団を活性のＣＤ４５＋ＣＤ３＋によりゲーティングし、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－によりゲーティングし、ＣＤ８ Ｔ細胞を活性のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋によりゲーティングし、疲弊Ｔ細胞を活性のＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔｉｍ－３＋によりゲーティングし、セントラルメモリーＴ細胞をＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋高ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌによりゲーティングし、常在性メモリーＴ細胞を活性のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋によりゲーティングし、Ｍ２様マクロファージ細胞を活性のＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋＋ＣＤ２０６＋によりゲーティングした。

【0400】

図１６に示されるように、１９１２Ａｂ５処置された全ての腫瘍において、ＣＤ４細胞（図１６Ａ）およびＣＤ８細胞（図１６Ｂ）の両方が増加し、このことはＴ細胞由来の腫瘍殺傷の強化を示唆している。さらに、メモリーＴ細胞であるセントラルメモリーＴ細胞（図１６Ｃ）および常在性メモリーＴ細胞（図１６Ｄ）が、１９１２Ａｂ５処置動物（図１１Ｄ）に観察された腫瘍免疫に伴って有意に増加し、このことはＣｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂによる処置が抗腫瘍メモリーの形成を促進し得ることを示唆している。さらに、疲弊Ｔ細胞の減少（図１６Ｅ）およびＭ２様マクロファージの低減（図１６Ｆ）は、Ｃｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂの腫瘍微小環境調節効果を示す。

【0401】

本明細書に開示されるデータに基づくと、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂ処置の抗腫瘍効果によりＴＭＥの調節がもたらされ、リンパ球浸潤の増加により抑制性ＴＭＥが炎症性ＴＭＥへと転換することが予想される。腫瘍細胞依存的なＣＤ１３７の活性化は、腫瘍を経たＴ細胞活性化を特異的に増強し、Ｔメモリー形成を促進するものとなり、ｂｓＡｂの高速オフのカイネティクスは、Ｔ細胞の疲弊の低減に役立ち得る。低減されたＭ２マクロファージは、ＴＭＥにおける抑制性サイトカイン放出を低減し、したがってＴ細胞の活性化を改善する。

【0402】

実施例１２：ＰＤ１抵抗性モデルＢ１６Ｆ１０におけるＣｌａｕｄｉｎ６－ＣＤ１３７抗体の評価
ＰＤ１抵抗性患者におけるＣｌａｕｄｉｎ６／ＣＤ１３７抗体治療の治療的可能性を予測するために、ＰＤ１抵抗性腫瘍モデルであるＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルを使用して、抗体１９１２Ａｂ５の有効性を評価した。バイオサイトジェン社（マサチューセッツ州ボストン）の六～七週齢のメスホモ接合性Ｂ－ｈ４－１ＢＢマウスに、１×１０^５個の生細胞のＢ１６－Ｆ１０細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍サイズが７５～１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを二つの群に無作為化し、腹腔内注射による処置を開始した。第１群はビヒクル対照を受け、第２群は３ｍｐｋ １９１２Ａｂ５抗体を受けた。処置を２週間にわたって週二回投与した。

【0403】

体重を週に二回測定した。腫瘍体積を、異なる時点で式Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ×Ｗを用いて決定した。式中、Ｌは異種移植片の長寸法であり、Ｗは短寸法である。２５００ｍｍ^３を超える腫瘍があればどのマウスも屠殺した。マウスの生存を、腫瘍移植後２７日までモニタリングした。

【0404】

図１７に示されるように、３ｍｐｋ １９１２Ａｂ５抗体処置群に由来するマウスは、腫瘍移植後２０日目に６７．１％のＴＧＩ値を有し、有意な有効性を示した。

【0405】

実施例１３：細胞表面上Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２へのＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの結合
二重特異性ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７抗体を、実施例３に記載されるように生成し、生産し、精製した。これらの結合タンパク質のＣｌａｕｄｉｎ１８．２への結合活性を調べるために、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４細胞を、免疫蛍光結合アッセイに使用した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で培養した。実験日に、細胞を採集し、洗浄し、ＢｓＡｂ １９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３、ならびに単一特異性の抗ＣＬＤＮ１８．２対照抗体１９０１Ａｂ１を用いて４℃で２時間染色し、続いて室温で１５分間、パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。モノクローナル抗体１９０１Ａｂ１は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に特異的に結合する。次いで、固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）で細胞を室温で１時間染色した。結合シグナルを、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（ザルトリウス社、ミシガン州）を使用して蛍光強度を定量化することにより評価した。

【0406】

図１８に示されるように、１０μｇ／ｍｌの濃度で、１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３を含む開示された二重特異性結合タンパク質は、対照モノクローナル抗体１９０１Ａｂ１と比較して、ＮＵＧＣ４細胞上のヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２に同様に結合した。

【0407】

実施例１４：細胞表面のＣＤ１３７へのＣＬＤＮ１８／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの結合
ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３の結合親和性を、免疫蛍光イメージングアッセイを使用して評価した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ１３７を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＣＤ１３７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含有する完全培地に播種し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。細胞をＢｓＡｂと４℃で２時間結合させた後、細胞をパラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した。単一特異性抗体１９２３Ａｂ４は、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）を用いて室温で１時間染色した。細胞をイメージングし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（バイオテック、バーモント州）を使用して蛍光強度を定量化することによって、結合シグナルを評価した。

【0408】

図１９に示されるように、１０μｇ／ｍｌの濃度で、開示された二重特異性結合タンパク質１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３は、それらのモノクローナル抗体対照１９２３Ａｂ４と同様に、細胞表面のヒトＣＤ１３７に結合した。

【0409】

実施例１５：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＣＤ１３７シグナル伝達の標的細胞依存的な活性化
抗ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３も、標的細胞依存的なＣＤ１３７アゴニズムを誘導する能力について評価した。簡潔に述べると、ＣＤ１３７を安定的に発現しＮＦｋＢ－ｌｕｃレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞株を用いて、ＣＤ１３７シグナル伝達を定量した。細胞表面に内因性Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現したＮＵＧＣ４細胞を標的細胞として使用した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞を、ＮＵＧＣ４標的細胞と共培養するかまたはＮＵＧＣ４標的細胞不含で培養し、開示される結合タンパク質により３７℃、５％ＣＯ_２で１６時間刺激した。次いで、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（プロメガ社、カタログ番号Ｅ６１３０）を添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。単一特異性抗体のウレルマブ－ＮＲ（公的に入手可能な配列情報に基づいてノバロックバイオセラピューティック（ＮｏｖａＲｏｃｋ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）社により生成）は、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。発光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダー（バイオテック）によって測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0410】

図２０Ａは、予想通り、ウレルマブ－ＮＲが、ＮＵＧＣ４標的細胞の存在とは独立してＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したことを示している。対照的に、１９０１Ａｂ２は、ＮＵＧＣ４標的細胞の存在下でのみＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。さらに、１９０１Ａｂ２は、ＮＵＧＣ４標的細胞の存在下で、ウレルマブ－ＮＲよりも強固なＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。この結果は、１９０１Ａｂ２が、ＮＵＧＣ４細胞の細胞表面に発現するＣｌａｕｄｉｎ１８．２と係合したときにのみ、該結合タンパク質がＣＤ１３７アゴニズムを示したことを確定するものである。ＮＵＧＣ４細胞の非存在下では、１９０１Ａｂ２のアゴニスト活性は検出されなかった。

【0411】

ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ１３７シグナル伝達を誘導する１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲの用量応答曲線を、図２０Ｂに示した。１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲのＥＣ_５０値（効力）は、それぞれ０．０４７ｎＭ、０．１０ｎＭ、および０．２１ｎＭであった。１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３の両方が、ウレルマブ－ＮＲよりも、ＣＤ１３７シグナル伝達を誘導するための良好なＥＣ_５０値と高いシグナル伝達強度（Ｅ_ｍａｘ）とを示した。

【0412】

実施例１６：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＣＤ８ Ｔ細胞の活性化
共培養実験を用いて、ＴＣＲシグナル伝達の存在下でのＢｓＡｂ １９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３によるＴ細胞の活性化を測定した。健康なドナー由来ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＵＧＣ４細胞を、エフェクター細胞および標的細胞として使用した。これらの二つの細胞を、１０％ＦＢＳと、ＴＣＲシグナル伝達をもたらす０．５ｕｇ／ｍｌのマウス抗ｈＣＤ３クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３１７３２５）とを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で共培養した。開示された結合タンパク質を添加して、Ｔ細胞を刺激した。５％ＣＯ_２共存下３７°Ｃで３日間、プレートをインキュベートした。７２時間のインキュベーション後、上清を採集し使用して、製造業者の指示によるプロトコールを用いてＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、カタログ番号ＡＬ２１７Ｃ／Ｆ）により、分泌されたＩＦＮγを測定した。ＩＦＮγの量は、Ｔ細胞の活性化を表す。

【0413】

ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を誘導するための１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲの用量応答曲線を図２１に示す。１９０１Ａｂ２、１９０１Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲのＥＣ_５０値は、それぞれ０．０８１ｎＭ、０．１２ｎＭ、および０．５１ｎＭであった。１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３の両方が、ウレルマブ－ＮＲよりも、Ｔ細胞活性化の顕著な特徴であるＩＦＮγ産生を誘導するための良好な効力と高いＥｍａｘとを示した。

【0414】

実施例１７：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによって誘導されるＣＤ８ Ｔ細胞由来の腫瘍殺傷活性
ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３で処理されたＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍殺傷活性を測定するために、共培養実験を実施した。簡潔に述べると、健康なドナー由来のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤（ステムセル社、カタログ番号１０９７１）で２日間、予め活性化した。次に、活性化細胞を洗浄して、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化剤を除去した。次いで、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＧＦＰで安定的にトランスフェクトされたＮＵＧＣ４腫瘍細胞と共培養し、開示された二重特異性結合タンパク質で９６時間処理した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（バイオテック、バーモント州）を使用して緑色蛍光強度によって、細胞数を測定した。殺傷の割合を、以下の式によって計算した：
殺傷の％＝（結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰシグナル－抗体で処理したウェル由来のＧＦＰシグナル）／結合タンパク質処理のないウェル由来のＧＦＰシグナル＊１００％

【0415】

図２２は、１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３が強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。開示された二重特異性結合タンパク質を用いて９６時間処理すると、腫瘍細胞の約７５％がＣＤ８ Ｔ細胞によって殺傷された。１９０１Ａｂ２および１９０１Ａｂ３のＥＣ_５０値は、それぞれ０．０４３ｎＭおよび０．０３３ｎＭである。

【0416】

実施例１８：ヒト化Ｂ－ｈ４－１ＢＢマウスの皮下同系ＭＣ３８－ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２マウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖に対するＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂ １９０１Ａｂ２の効果
１６～２０ｇの体重の６～８週齢のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウス（バイオサイトジェン社）を、試験登録前に７日間順応させた。ＭＣ３８マウス結腸がん細胞株を遺伝子改変して、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現させた。細胞を、５％雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中の単層培養としてインビトロで維持する。細胞を採取し、１００μｌのＰＢＳ中の５×１０^５個の細胞を、腫瘍発生のために右前脇腹に皮下移植した。７日目に、腫瘍担持マウスを、およそ１００～１５０ｍｍ^３の平均腫瘍サイズを有する３つの試験群（各群は６頭のマウスを含む）に無作為に登録した。腫瘍サイズはキャリパーを用いて二次元で週二回測定し、体積は以下の式を使用してｍｍ^３で表した。Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２であって、式中、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長寸法および短寸法である。７、１０、１４、および１７日目に、マウスに、腹腔内注射によって５ｍｇ／ｋｇの１９０１Ａｂ２またはＰＢＳ対照を処置した。試験は３４日目に終了した。

【0417】

図２３は、二つの治療群についての腫瘍増殖曲線を示す。１９０１Ａｂ２は、ＰＢＳ処置対照と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。１９０１Ａｂ２を注射した６頭中４頭のマウスは、３４日目に完全な腫瘍寛解を示した。

【0418】

実施例１９：細胞表面のＮｅｃｔｉｎ４へのＮｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの結合
二重特異性Ｎｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７結合タンパク質を、実施例４に記載されるように生成し、生産し、精製した。Ｎｅｃｔｉｎ４に対するＢｓＡｂの１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３の結合活性を調べるために、ヒトＮｅｃｔｉｎ４を発現するＣＨＯ細胞を免疫蛍光結合アッセイに使用した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＦ１２Ｋ培地中で培養した。実験の日に、細胞を採集し、洗浄し、結合タンパク質により４℃で２時間染色した後、パラホルムアルデヒドにより室温で１５分間、細胞を固定した。開示された抗体１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３は、Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。単一特異性抗体１９２５Ａｂ４（親マウス抗体）は、Ｎｅｃｔｉｎ－４にのみ結合し、対照抗体として使用される。次いで、固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）を用いて細胞を室温で１時間染色した。結合シグナルを、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（ザルトリウス社、ミシガン州）を使用して蛍光強度を定量化することにより評価した。

【0419】

図２４に示されるように、１０μｇ／ｍｌの濃度で、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３を含む開示された二重特異性結合タンパク質は、対照モノクローナル抗体１９２５Ａｂ４と比較して、ＣＨＯ細胞上のヒトＮｅｃｔｉｎ４に同様に結合した。

【0420】

実施例２０：細胞表面のＣＤ１３７へのＮｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの結合
ＢｓＡｂ １９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３の結合親和性を、免疫蛍光イメージングアッセイを使用して評価した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ１３７を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ－ｈｕＣＤ１３７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含有する完全培地に播種し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、開示された結合タンパク質と４℃で２時間結合させた後、パラホルムアルデヒドで室温で１５分間、細胞を固定した。開示された抗体１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３は、Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。単一特異性抗ＣＤ１３７抗体１９２３Ａｂ４は、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。固定細胞をＰＢＳで三回洗浄した後、検出のためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン、カタログ番号Ａ－１１０１３）を用いて室温で１時間染色した。細胞をイメージングし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（バイオテック、バーモント州）を使用して蛍光強度を定量化することによって、結合シグナルを評価した。

【0421】

図２５に示されるように、１０μｇ／ｍｌの濃度で、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２および１９２５Ａｂ３を含めた開示された二重特異性結合タンパク質は、それらのモノクローナル抗体対照１９２３Ａｂ４と同様に、細胞表面のヒトＣＤ１３７に結合した。

【0422】

実施例２１：Ｎｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂによるＣＤ１３７シグナル伝達の標的細胞依存的な活性化
Ｎｅｃｔｉｎ－４／ＣＤ１３７ ＢｓＡｂの１９２５Ａｂ１，１９２５Ａｂ２，１９２５Ａｂ３を、標的細胞依存的なＣＤ１３７アゴニズムを誘導する能力について評価した。簡潔に述べると、ＣＤ１３７を安定的に発現しＮＦｋＢ－ｌｕｃレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞株を用いて、ＣＤ１３７シグナル伝達を定量した。ヒトＮｅｃｔｉｎ４で安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４）を標的細胞として用いた。Ｊｕｒｋａｔ Ｔレポーター細胞を、ＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４標的細胞と共培養するかまたはＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４標的細胞不含で培養し、開示される結合タンパク質により３７℃、５％ＣＯ_２で１６時間刺激した。次いで、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（プロメガ社、カタログ番号Ｅ６１３０）を添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。開示された抗体１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３は、Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＣＤ１３７の両方に結合する二重特異性抗体である。単一特異性抗体のウレルマブ－ＮＲは、ＣＤ１３７にのみ結合し、対照抗体として使用される。発光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダー（バイオテック）によって測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0423】

ウレルマブ－ＮＲは、公的に入手可能なウレルマブの配列に基づいて、ノバロックバイオセラピューティック社により生成された。図２６Ａは、予想通り、ウレルマブ－ＮＲが、ＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４標的細胞の存在とは独立してＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したことを示している。対照的に、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３は、ＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４標的細胞の存在下でのみＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。さらに、１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３は、ＮＵＧＣ４標的細胞の存在下で、ウレルマブ－ＮＲよりも強固なＣＤ１３７シグナル伝達を誘導した。この結果は、開示された二重特異性結合タンパク質が、ＣＨＯ細胞の細胞表面に発現するＮｅｃｔｉｎ４と係合したときにのみ、該結合タンパク質がＣＤ１３７アゴニズムを示したことを確定するものである。これらの開示された二重特異性結合タンパク質のアゴニスト活性は、ＣＨＯ－Ｎｅｃｔｉｎ４細胞の非存在下では検出されなかった。

【0424】

ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ１３７シグナル伝達を誘導する１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、１９２５Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲの用量応答曲線を、図２６Ｂに示した。１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、１９２５Ａｂ３、およびウレルマブ－ＮＲのＥＣ_５０値（効力）は、それぞれ０．０２７ｎＭ、０．０８０ｎＭ、０．０４９ｎＭ、および０．２６ｎＭであった。１９２５Ａｂ１、１９２５Ａｂ２、および１９２５Ａｂ３を含む開示された二重特異性結合タンパク質は、ウレルマブ－ＮＲよりも、ＣＤ１３７シグナル伝達を誘導するための良好なＥＣ_５０値と高いシグナル伝達強度（Ｅ_ｍａｘ）とを示した。

【0425】

実施例２２：マウス肝臓における抗体由来の免疫細胞浸潤の評価
肝毒性は、初期のいくつかのＣＤ１３７アゴニスト抗体治療薬の公知の副作用となってきた。ウレルマブは、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の用量で炎症性肝毒性を誘導し、最大許容用量（ＭＴＤ）は０．１ｍｇ／ｋｇであり、その治療ウィンドウを制限することが報告されている（Ｓｅｇａｌ ＮＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７；２３（８）：１９２９－１９３６）。研究では、ウレルマブによる肝毒性が、肝臓における免疫細胞の浸潤および血清ＡＬＴレベルの有意な上昇によって標示される肝炎症によるものであることが示されている（Ｚｈａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０；８）。

【0426】

ＣＤ１３７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗体は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的とする強力な共刺激という利点と、肝炎症／肝毒性のリスクの減少とをもたらし、これらにより治療ウィンドウを広げることができる。

【0427】

開示された二重特異性ＴＡＡ－ＣＤ１３７抗体がより低い肝毒性を有することを実証するために、１６～２０ｇの体重を有する６～８週齢のメスＢ－ｈ４－１ＢＢマウス（バイオサイトジェン社）を、試験登録前に７日間順応させた。Ｂ－ｈ４－１ＢＢマウスを三つの試験群に無作為に登録した。各群は６頭のマウスから構成された。０、３、７、および１０日目に、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇのウレルマブ－ＮＲ、１９１２Ａｂ５、または陰性対照としてＰＢＳの腹腔内注射により処置した。試験は１３日目に終了した。各治療群由来の肝臓をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。蛍光ＩＨＣを、５ｍｍのＦＦＰＥ組織切片を用いて行った。脱パラフィン後、免疫細胞の同定のためにＣＤ４、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびマクロファージを検出する一次抗体によってスライドを染色した。

【0428】

図２７では、マウスＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ）、およびマウスマクロファージ（Ｃ）の浸潤は、ウレルマブ－ＮＲ処置マウスでのみ有意に増加したが、１９１２Ａｂ５処置マウスでは有意に増加しなかった。

【0429】

実施例１０、図１１Ｂおよび図１１Ｃと一致して、１９１２Ａｂ５により誘導された免疫細胞浸潤の欠如は、ＣＬＤＮ６／ＣＤ１３７ ｂｓＡｂ由来の肝毒性のリスクが低いことを示す。

【0430】

別途示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表現する全ての数は、全ての場合において用語「約」によって修正されるものと理解されたい。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本開示によって取得されることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定しようとするのではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数を考慮して、かつ通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

【0431】

本開示の広範な範囲を記載する数値範囲およびパラメータが近似であるとはいえ、特定の実施例に記載の数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いかなる数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。

【0432】

本開示を記述する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の言及は、本明細書において別段に指示がない限り、または文脈により明確に矛盾しない限り、単数形と複数形との両方を網羅するものと解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に収まる別々の各値に個別に言及する簡潔な方法として機能することが意図される。本明細書に別段の指示がない限り、別々の各値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意のおよび全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより良く明らかにすることが意図されており、別様に特許請求の範囲に記載される本開示の範囲に限定を生じない。本明細書中のいかなる文言も、本開示の実践に必須の任意の非請求要素を示すものと解釈されるべきではない。

【0433】

本明細書に開示される本開示の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、または本明細書に見出されるグループの他のメンバーもしくは他の要素との任意の組合せで、参照し特許請求の範囲に記載することができる。あるグループの一つまたは複数のメンバーは、利便性および／または特許性の理由で、あるグループに含まれるかまたはグループから削除することができることが予想される。そのような包含または欠失が発生した際に、本明細書は、改変されたものとしてそのグループを含むものと考えられ、それゆえに、添付の特許請求の範囲で用いられる全てのマーカッシュグループの書面による説明を満たす。

【0434】

本開示の特定の実施形態は、本開示を実施するための発明者らに既知の最良のモードを含めて、本明細書に記載されている。言うまでもなく、これらの記載された実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになるものとなる。発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変形を採用するものと期待し、発明者らは、本明細書に具体的に記載されたもの以外の方法で本開示が実践されることを意図する。したがって、本開示は、適用法で許容されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形における上述の要素の任意の組合せは、本開示によって包含される。

【0435】

本明細書に開示される特定の実施形態は、言語「からなる」か、または「から本質的になる」を用いて、特許請求の範囲にさらに限定され得る。特許請求の範囲に使用される際に、出願時であっても補正毎に追加されるときであっても、移行用語「からなる」は、特許請求の範囲に指定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。移行用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、指定された材料または工程、ならびに基本的および新規の特徴に実質的に影響を与えない材料または工程に限定する。そのように特許請求の範囲に記載される本開示の実施形態は、本明細書に本質的にまたは明示的に記載され、有効化される。

【0436】

本明細書に開示される本開示の実施形態は、本開示の原理の例示であることを理解されたい。採用可能な他の修正は、本開示の範囲内である。したがって、例として、しかし限定ではないが、本開示の代替的な構成は、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本開示は、正確に示され説明されるようなものに限定されない。

【0437】

本開示は、様々な特定の材料、手順、および実施例を参照することによって本明細書に説明および図示されているが、本開示は、その目的のために選択される材料および手順の具体的な組合せに限定されないことを理解されたい。当業者によって理解されるものとなるように、このような詳細の複数の変形が含意され得る。本明細書および実施例は、例示に過ぎないものと考えられ、本開示の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。本願に言及される全ての参考文献、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図1A-1】

【図1A-2】

【図1B-1】

【図1B-2】

【図1C-1】

【図1C-2】

【図1C-3】

【図1D-1】

【図1D-2】

【図1D-3】

【図1D-4】

【図1D-5】

【図1D-6】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27-1】

【図27-2】

【配列表】

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【国際調査報告】