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特表2024-532508抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/24 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240829BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240829BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240829BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240829BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240829BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240829BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240829BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K16/24 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P43/00
A61P11/00
A61P11/06
A61P27/02
A61P11/02
A61P17/00
A61P37/08
A61P19/02
A61P1/04
A61P25/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514061
(86)(22)【出願日】2021-12-09
(85)【翻訳文提出日】2024-03-01
(86)【国際出願番号】 CN2021136755
(87)【国際公開番号】W WO2023029280
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】202111031678.2
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520451681
【氏名又は名称】江蘇▲筌▼信生物医薬股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＱＹＵＮＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ １３１０，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｎｏ．９０７ Ｙａｏｃｈｅｎｇ Ａｖｅｎｕｅ，Ｔａｉｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ，２２５３００，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(74)【代理人】
【識別番号】100208225
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 修二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100217179
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 智史
(74)【代理人】
【識別番号】100227592
【弁理士】
【氏名又は名称】孔 詩麒
(72)【発明者】
【氏名】裘霽宛
(72)【発明者】
【氏名】陳衛
(72)【発明者】
【氏名】孔永
(72)【発明者】
【氏名】喬懷耀
(72)【発明者】
【氏名】呉亦亮
(72)【発明者】
【氏名】陳涛
(72)【発明者】
【氏名】呉美娟
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB17
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本出願は、抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体及びその使用を提供し、このモノクローナル抗体はヒトインターロイキン－３３に対して高い親和性を有し、中和活性を有しており、ヒトインターロイキン－３３が媒介する関連疾患の予防または治療に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖相補性決定領域と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖相補性決定領域とを含む、単離された抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体であって、前記ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は配列番号１に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は配列番号２に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は配列番号３に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号４に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号５に示され；及び
前記ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される、前記モノクローナル抗体。
【請求項2】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示され、且つ
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体をコードする、ことを特徴とする単離された核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸を含む、ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項5】
請求項４に記載の宿主細胞を培養して請求項１または２に記載のモノクローナル抗体を産生することを含む、ことを特徴とするモノクローナル抗体を産生する方法。
【請求項6】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項7】
ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患の治療に使用される、ことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、加齢黄斑変性症、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節炎、及び炎症性腸疾患から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
インターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１または２に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項10】
前記ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、加齢黄斑変性症、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節炎、及び炎症性腸疾患から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体医薬の技術分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ－３３）に対するモノクローナル抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）はＩＬ－１ファミリーの重要なメンバーであり、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、樹状細胞などのさまざまな細胞で発現している。ＩＬ－３３遺伝子にはシグナルペプチドが含まれていないため、分泌及び発現することができず、細胞や組織が損傷するとアラーミンとして放出され、ＩＬ－３３受容体を発現する免疫細胞に警告を発し、宿主防御、免疫調節及び炎症において重要な役割を果たす（Ｃａｙｒｏｌ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１Ｃ：３１－３７；Ｌｉｅｗ Ｆ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６７６－６８９）。
【0003】
ＩＬ－３３受容体は、ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１としても知られる）とＩＬ－１Ｒアクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡｃＰ）で構成されるヘテロ二量体分子である。ＳＴ２はＩＬ－３３が結合する受容体であり、ＩＬ－１ＲＡｃＰはＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８及びＩＬ１Ｆ９の受容体の共有成分であり、結合には必要ではないが、シグナル伝達には重要である（Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２３：４７９－４９０）。ＩＬ－３３がＳＴ２に結合すると、ＩＬ－１ＲＡｃＰを動員してＩＬ－３３／ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡｃＰ三元複合体を形成し、続いてＭｙＤ８８アダプター、ＩＲＡＫ１及びＩＲＡＫ４キナーゼ、ＴＲＡＦ６を介したシグナル伝達を誘導し、最終的にＭＡＰＫ及びＮＦκＢ転写因子を活性化する（Ｃａｙｒｏｌ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２８１（１）：１５４－１６８）。
【0004】
ＩＬ－３３は炎症性疾患に関連していることが実証されており、Ｔｈ２細胞、好酸球、マスト細胞などのＳＴ２を発現する免疫細胞に作用し、２型免疫サイトカイン、特にＩＬ－５とＩＬ－３の産生を促進し、それによって、粘膜器官に重度の病理学的変化を引き起こす（Ｍｏｌｏｆｓｋｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４２：１００５－１０１９；Ｍｊｏｓｂｅｒｇ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０５５－１０６２）。ＩＬ－３３に関連する炎症性疾患には、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患などが含まれる（Ｓａｖｉｎｋｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３２：１３９２－１４００；Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：７５２－７５４；Ｂｙｅｒｓ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３９６７－３９８２）。
【0005】
ＲｅｇｅｎｅｒｏｎとＳａｎｏｆｉが共同開発したインターロイキン－３３を標的とするモノクローナル抗体薬（Ｉｔｅｐｅｋｉｍａｂ／ＲＥＧＮ３５００）は、慢性閉塞性肺疾患（臨床第ＩＩＩ相）や喘息（臨床第ＩＩ相）などの炎症性疾患の治療に使用することを目的としている。ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ社が開発したエトキマブ／ＡＮＢ０２０は、喘息や慢性副鼻腔炎（臨床第ＩＩ相）などの疾患の治療に使用することを目的としている。
【発明の概要】
【0006】
本出願は、新しい抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含む医薬組成物、及び当該モノクローナル抗体の製薬用途を提供することを目的とする。
【0007】
本出願の具体的な技術案は下記通りである。
【0008】
１．ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖相補性決定領域と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖相補性決定領域とを含む、単離された抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体であって、
前記ＣＤＲ－Ｈ１（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ１は重鎖ＣＤＲ１を表す）のアミノ酸配列は配列番号１（ＳＹＨＭＩ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ２（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ２は重鎖ＣＤＲ２を表す）のアミノ酸配列は配列番号２（ＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ３（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ３は重鎖ＣＤＲ３を表す）のアミノ酸配列は配列番号３（ＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ１（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ１は軽鎖ＣＤＲ１を表す）のアミノ酸配列は配列番号４（ＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ２（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ２は軽鎖ＣＤＲ２を表す）のアミノ酸配列は配列番号５（ＦＡＳＫＬＡＳ）に示され；及び
前記ＣＤＲ－Ｌ３（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ３は軽鎖ＣＤＲ３を表す）のアミノ酸配列は配列番号６（ＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡ）に示される、前記モノクローナル抗体。
前記ＣＤＲ－Ｈ１（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ１は重鎖ＣＤＲ１を表す）のアミノ酸配列は配列番号１（ＳＹＨＭＩ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ２（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ２は重鎖ＣＤＲ２を表す）のアミノ酸配列は配列番号２（ＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｈ３（本明細書では、ＣＤＲ－Ｈ３は重鎖ＣＤＲ３を表す）のアミノ酸配列は配列番号３（ＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ１（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ１は軽鎖ＣＤＲ１を表す）のアミノ酸配列は配列番号４（ＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳ）に示され；
前記ＣＤＲ－Ｌ２（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ２は軽鎖ＣＤＲ２を表す）のアミノ酸配列は配列番号５（ＦＡＳＫＬＡＳ）に示され；及び
前記ＣＤＲ－Ｌ３（本明細書では、ＣＤＲ－Ｌ３は軽鎖ＣＤＲ３を表す）のアミノ酸配列は配列番号６（ＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡ）に示される、前記モノクローナル抗体。
【0009】
２．重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳＳＹＨＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に示され、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８（ＡＦＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＦＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に示される、ことを特徴とする項１に記載のモノクローナル抗体。
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳＳＹＨＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に示され、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８（ＡＦＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＦＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に示される、ことを特徴とする項１に記載のモノクローナル抗体。
【0010】
３．項１または２に記載のモノクローナル抗体をコードする、ことを特徴とする単離された核酸。
【0011】
４．項３に記載の核酸を含む、ことを特徴とする宿主細胞。
【0012】
前記核酸はベクター上に存在することができる。ベクターは、任意のタイプ、例えば、発現ベクターなどの組換えベクターであってもよい。複数の宿主細胞のいずれかを使用できる。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。
【0013】
５．項４に記載の宿主細胞を培養して項１または２に記載のモノクローナル抗体を産生することを含む、ことを特徴とするモノクローナル抗体を産生する方法。
【0014】
前記方法は、適切な宿主細胞内において前記抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）モノクローナル抗体をコードする組換えベクターを発現させ、それによって前記モノクローナル抗体を産生することを含む。特定の実施形態では、前記方法は、前記抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）モノクローナル抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、それによって前記核酸を発現させることを含む。前記方法は、宿主細胞培養物または宿主細胞培養培地から前記抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）モノクローナル抗体を回収することをさらに含み得る。
【0015】
６．項１または２に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【0016】
前記医薬組成物は、追加の治療剤（例えば、異なる抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）抗体）をさらに含んでもよい。
【0017】
７．ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患の治療に使用される、ことを特徴とする項６に記載の医薬組成物。
【0018】
８．前記ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節炎、及び炎症性腸疾患から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする項７に記載の医薬組成物。
【0019】
９．インターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における項１または２に記載のモノクローナル抗体の使用。
【0020】
１０．前記ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節炎、及び炎症性腸疾患から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする項９に記載の使用。
【0021】
１１．前記いずれか一項に記載のモノクローナル抗体または前記いずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ことを特徴とするヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法。
【0022】
１２．前記ヒトインターロイキン－３３媒介シグナル伝達に関連する疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節炎、及び炎症性腸疾患から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする項１１に記載の方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明は、新しい抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）モノクローナル抗体を提供する。これは、既存の抗ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）モノクローナル抗体（エトキマブ／ＡＮＢ０２０）と比較して、ヒトインターロイキン－３３に対する結合親和性が同等であり、細胞レベルでの中和活性もエトキマブ／ＡＮＢ０２０と同等である。
【0024】
Ｓａｎｏｆｉが開発したインターロイキン－３３を標的とするモノクローナル抗体薬（Ｉｔｅｐｅｋｉｍａｂ／ＲＥＧＮ３５００）は、慢性閉塞性肺疾患（臨床第ＩＩＩ相）や喘息（臨床第ＩＩ相）などの炎症性疾患の治療に使用することを目的としている。ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ社が開発したエトキマブ／ＡＮＢ０２０は、慢性副鼻腔炎（臨床第ＩＩ相）に使用している。
【0025】
本出願のモノクローナル抗体は、細胞レベルでエトキマブ／ＡＮＢ０２０（特許に公開された配列によって発現、調製）と同等の中和活性を示し、関連疾患の予防及び治療において良好な臨床効果を示すことが期待されている。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１は、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）一過性発現プラスミドを構築する核酸電気泳動の結果を示す図である。その中で、Ｍ：マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）；バンド１：ＰＣＲ生成物７８ＶＨ－Ｈｕ２５；バンド２：ｐＱＸ２．１、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ；バンド３：ＰＣＲ生成物７８ＶＫ－Ｈｕ３－ＣＫ；バンド４：ｐＱＸ１、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ。
【図4】図４は、組換えヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を中和するＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）及びエトキマブ／ＡＮＢ０２０の活性を示す図である。
【発明の詳細】
【0027】
本明細書に記載されている科学技術用語は、当業者が一般に理解している用語と同じ意味を有するが、矛盾する場合には、本明細書の定義に準ずる。
【0028】
一般的にいえば、本明細書で使用されている用語は、以下の意味を有する。
【0029】
本明細書において、「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離された抗体をいう。ある一部の実施形態では、抗体を９５％または９９％を超える純度に精製し、前記純度は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等電集束（ＩＥＦ）、毛細管電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって確定される。抗体の純度を評価する方法に関するレビューについて、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0030】
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同な抗体の群から得られた抗体のことであり、すなわち、該群を構成する各抗体は同一であり、及び／または同じエピトープに結合する。可能な変異体抗体（例えば、自然に存在する変異を含むものまたはモノクローナル抗体の製品の製造過程において発生するもの）を除き、このような変異体は一般に微量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む典型的なポリクローナル抗体製品と違って、モノクローナル抗体製品における各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。よって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に相同な抗体群から得られる特徴を示し、いずれか特定の方法で調製する必要のある抗体と解釈すべきではない。例えば、本出願によるモノクローナル抗体は複数の技術によって製造することができ、前記技術は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限られていない。本文は、このような方法、及びモノクローナル抗体を調製するその他の例示的な方法を記載している。
【0031】
本明細書において、「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本明細書で使用されている「結合親和性」とは、結合パートナーメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に平衡解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本分野で既知の常用方法によって測定することができる。
【0032】
本明細書において、ヒトインターロイキン－３３（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３３、ｈＩＬ－３３）は、細胞核内に存在するｈＩＬ－３３がプロテアーゼによって加水分解されて成熟型ｈＩＬ－３３を形成し、細胞外に分泌されてｈＩＬ－３３の生物活性を発揮することを表し、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する。
配列番号９：
ＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ
配列番号９：
ＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ
【0033】
本明細書において、「抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体」とは、ヒトインターロイキン－３３を標的とする診断薬及び／または治療薬として使用できるように、十分な親和性でヒトインターロイキン－３３に結合することができるモノクローナル抗体を意味する。
【0034】
本出願の抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体は、標的の無関係なタンパク質に結合しない。ここで、「無関係なタンパク質」とは、標的としてのヒトインターロイキン－３３以外のタンパク質をいい、ここで、「結合しない」とは、本発明の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体と、その標的となるヒトインターロイキン－３３との結合能を１００％とした場合、本発明の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体のその無関係なタンパク質への結合能は１０％未満であり、例えば９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０であることを指す。
【0035】
本発明の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体は、ヒト及びカニクイザルのインターロイキン－３３に結合することができるが、他の動物種のインターフェロン－３３に結合しない場合がある。ここで、「他の動物種」とは、ヒト及びカニクイザル以外の動物種、例えば、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、モルモットなどを指す。ここで、本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体の種特異性を判定する際に、「結合しない」とは、本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）と、その標的となるヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）との結合能を１００％とした場合、本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体のその他の動物種のインターロイキン－３３への結合能は５％未満であり、例えば４％、３％、２％、１％または０であることを指す。
【0036】
本発明のヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【0037】
実験結果は、本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体が、ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）に特異的に結合できることを示している。
【0038】
本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体は、多くの生物学的活性において、市販されている同類のモノクローナル抗体製品と同等であるか、または市販されている同類のモノクローナル抗体製品よりも優れている。そのような生物学的活性として、例えば、組換え／天然ヒトインターロイキン－３３により誘導される細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を中和する活性、インターロイキン－３３により誘導されるＫＵ８１２細胞からのＩＬ－５の放出を中和する活性、インターロイキン－３３により誘導されるヒト全血からのＩＦＮ－γの放出を中和する活性などが挙げられる。
【0039】
一実施形態では、本出願の抗ヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１１に示される。
配列番号１０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳＳＹＨＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１１
ＡＦＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＦＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
その中で、配列番号１０と１１はいずれもヒト化された配列である。
配列番号１０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳＳＹＨＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＮＳＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＹＶＨＶＹＳＡＬＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１１
ＡＦＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＳＶＬＮＥＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＦＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＤＷＳＭＤＮＩＤＮＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
その中で、配列番号１０と１１はいずれもヒト化された配列である。
【0040】
本明細書において、「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、前記核酸分子は、染色体外、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0041】
本明細書において、「抗ヒトインターロイキン３３モノクローナル抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする１つまたは複数の核酸分子を意味し、単一のベクターまたは別個のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞に存在する１つまたは複数の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【0042】
本明細書において、「ベクター」とは、それに連結した別の核酸を増幅することができる核酸分子を意味する。この用語には、自己複製核酸構造であるベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある一部のベクターは、それらに操作可能に連結されている核酸の発現をガイドすることができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【0043】
本明細書において、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は互いに置き換えて使用することができ、外因性核酸が導入された細胞を表し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」とを含み、初代形質転換細胞とそれに由来する後代（継代数を問わず）とを含む。後代は、核酸内容物では親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択された、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代は、本明細書に含まれている。
【0044】
本明細書において、「医薬組成物」とは、その中に含まれている活性成分の生物学的活性を有効にする形を取っており、製剤が投与される被験者に対して許容できない毒性を持つ追加の成分を含まない組成物のような製品を指す。
【0045】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」とは、医薬組成物における活性成分以外の、被験者に対して無毒である成分を意味する。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤を含むが、これらに限られていない。
【0046】
本明細書において、「モノクローナル抗体」は一般にヒト抗体であり、当業者に周知の技術を使用して調製することができる。例えば、ヒト抗体は一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－３７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
【0047】
抗体は、抗原攻撃に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷の抗体の産生を刺激するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製できる。これらの動物は通常、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部またはすべてを含み、内因性免疫グロブリン遺伝子座が置き換えられ、動物の染色体外に存在するか、動物にランダムに組み込まれている。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活性化されており、トランスジェニック動物からヒト抗体を取得する方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号に記載されているＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術、米国特許第５，７７０，４２９号に記載されているＨＵＭＡＢ（登録商標）技術、米国特許第７，０４１，８７０号に記載されているＫ－ＭＭＯＵＳＥ（登録商標）技術、及び米国特許出願公開番号ＵＳ２００７／００６１９００号に記載されているＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術をも参照されたい。このような動物から生成された無傷の抗体のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域との組み合わせによってさらに修飾することができる。
【0048】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても産生することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生に使用されるヒト骨髄腫細胞及びマウス－ヒトハイブリッド骨髄腫細胞が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１－３００５（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７），ｐｐ．５１－６３；Ｂｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６－９５（１９９１）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体は、Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。他の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生成について記載）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）；２６５－２６８（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものを含む。また、ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０：９２７－９３７（２００５）；Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７：１８５－１９１（２００５）にも記載されている。
【0049】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもでき、その後、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。
【0050】
ヒト抗体は、自己抗体ライブラリーに基づいて選択することもできる。すなわち、ヒト抗体は、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体の組み合わせライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。この方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（２００１）に概説されており、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（２００３）；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４：１１９－１３２（２００４）に記載されている。
【0051】
Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように、一部のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の完全なセットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってそれぞれクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、その後、前記ファージライブラリー内で抗原結合ファージをスクリーニングする。ファージは通常、抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして表示する。免疫化されたソースからのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性の抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、免疫化されていないレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化の非存在下で多数の非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞から再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して可変性の高いＣＤＲ３領域をコードし、それらをインビトロで再構成することによって、免疫化されていないライブラリーを合成的に生成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公開文書としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、２００５／０２６６０００号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、２００７／０２３７７６４、２００７／０２９２９３６及び２００９／０００２３６０が挙げられる。
【0052】
前記抗体はまた、二重特異性抗体などの多重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を持つモノクローナル抗体である。多重特異性抗体を生成するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－５４０（１９８３）；ＷＯ９３／０８８２９；及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９（１９９１）を参照）、及び「ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が含まれるが、これらに限定されない。また、多重特異的抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子の生成のための操作された静電的操縦効果（国際公開第２００９／０８９００４号）、２つ以上の抗体またはフラグメントの架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３（１９８５）を参照）、ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の生成(例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照）、二重特異性抗体フラグメントを生成するための「二重抗体」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８－５３７４（１９９４）を参照）、及び三重特異性抗体の調製（例えば、Ｔｕｔｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）を参照）によって生成することができる。
【0053】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、「タコ抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された改変抗体も含む（例えば、米国特許第２００６／００２５５７６号を参照）。
【0054】
本明細書の抗体はまた、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１０／１４５７９３、ＷＯ２０１１／１１７３３０、ＷＯ２０１２／０２５５２５、ＷＯ２０１２／０２５５３０、ＷＯ２０１３／０２６８３５、ＷＯ２０１３／０２６８３１、ＷＯ２０１３／１６４３２５、またはＷＯ２０１３／１７４８７３に記載の多重特異性抗体も含むことができる。
【0055】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合には、抗体変異体であってもよい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換を含む。最終構築物が抗原結合などの所望の特性を有する限り、最終構築物を得るように欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができる。したがって、特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供され、置換変異の対象部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれ、例えば、アミノ酸置換を対象抗体に導入し、保持／改善された抗原結合性、低下した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣなど、必要な活性を有する生成物をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【0056】
以下、実施例を通して本出願をより具体的に説明する。本出願はこれらの実施例に限られていないことを理解されたい。
【0057】
実施例１ 抗ヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体ＱＸ００７Ｎの調製
ニュージーランドウサギの免疫のためのヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）を上海近岸科技有限公司から購入し、Ｂ細胞クローニング技術を使用して抗原結合特異的抗体クローンを得、さらにヒトインターロイキン－３３阻害活性を有する、ヒトインターロイキン－３３に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングした。まず、Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを利用して細胞上清を検出し、ヒトインターロイキン－３３に結合するクローンを選択した後、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３レポーター遺伝子細胞法を検出に使用し、ヒトインターロイキン－３３阻害活性を有するクローンを選択した。上記の免疫及びスクリーニングプロセスは、商業会社に委託されて完成された。
ニュージーランドウサギの免疫のためのヒトインターロイキン－３３（ｈＩＬ－３３）を上海近岸科技有限公司から購入し、Ｂ細胞クローニング技術を使用して抗原結合特異的抗体クローンを得、さらにヒトインターロイキン－３３阻害活性を有する、ヒトインターロイキン－３３に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングした。まず、Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを利用して細胞上清を検出し、ヒトインターロイキン－３３に結合するクローンを選択した後、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３レポーター遺伝子細胞法を検出に使用し、ヒトインターロイキン－３３阻害活性を有するクローンを選択した。上記の免疫及びスクリーニングプロセスは、商業会社に委託されて完成された。
【0058】
組換え発現のために１２のクローンを選択してシーケンシングした。測定した結果、７８＃が最も優れた細胞中和活性を有していることが判明した。７８＃をヒト化した。ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔを使用してヒトＩｇＧ生殖系列配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の同一性アラインメントを行い、ＩｇＧＨＶ３－６６＊０１を重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとして選択して、７８＃クローン重鎖のＣＤＲ領域（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号２）、及びＣＤＲ－Ｈ３（配列番号３））をＩｇＧＨＶ３－６６＊０１のフレームワーク領域に移植し、ＩＧＫＶ１－１２＊０１を選択して軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、７８＃クローン軽鎖のＣＤＲ領域（すなわち、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号５）、及びＣＤＲ－Ｌ３（配列番号６））をＩＧＫＶ１－１２＊０１のフレームワーク領域に移植した。フレームワーク領域の特定の部位に対して復帰変異を行って本出願のモノクローナル抗体ＱＸ００７Ｎ可変領域を得た。最後に、ヒト化された重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示され、ヒト化された軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される。
【0059】
上記の重鎖可変領域（配列番号７）の遺伝子及び軽鎖全長（配列番号１１）の遺伝子は、ＰＣＲ増幅により得られた。ＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩを使用して重鎖発現プラスミドｐＱＸ２．１を二重消化させ、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを使用して一過性発現プラスミドｐＱＸ１を二重消化させ、インフュージョンリコンビナーゼを使用して、ＰＣＲ増幅遺伝子を、対応する発現プラスミドに挿入し、重鎖発現プラスミドｐＱＸ２．１－７８ＶＨ－Ｈｕ２５及び軽鎖発現プラスミドｐＱＸ２．２－７８ＶＫ－Ｈｕ３を構築した。ここで、ｐＱＸ２．２とは、軽鎖を発現するｐＱＸ１プラスミドを指す。
【0060】
プラスミドの二重消化を核酸電気泳動で検出した結果を図１に示す。図１の結果から分かるように、抗体の重鎖可変領域と軽鎖全長のＰＣＲ増幅の結果、及び重鎖と軽鎖の発現プラスミドを二重消化させた結果、重鎖と軽鎖のプラスミドのサイズは約５０００ｂｐであり、重鎖可変領域は約４８０ｂｐであり、軽鎖全長は約７８１ｂｐである。
【0061】
配列が正しい重鎖発現プラスミドｐＱＸ２．１－７８ＶＨ－Ｈｕ２５（それによって発現される重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号１０に示される）と軽鎖発現プラスミドｐＱＸ２．２－７８ＶＫ－Ｈｕ３（それによって発現される軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号１１に示される）をＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクションの前日、トランスフェクション前の継代のために、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を３×１０６細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクション当日、細胞密度を６×１０６細胞／ｍｌに希釈し、トランスフェクションのために２５ｍｌの細胞を１２５ｍｌの振とうフラスコに入れた。トランスフェクションと発現のプロセスを図２に示す。
【0062】
トランスフェクション後５日目に、培養上清を採取し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使用してワンステップで精製した。精製された抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で検出し、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）と名付けた。当該抗体をタンパク質電気泳動で検出した結果を図３に示す。タンパク質電気泳動は変性還元ゲルで検出され、図３に示される結果から分かるように、２つのバンドがあり、２つのバンドのサイズはそれぞれ約５０ｋＤａと２５ｋＤａであり、重鎖（４９．３ｋＤａ）と軽鎖（２３．４ｋＤａ）の理論上の分子量と一致している。
【0063】
実施例２ 平衡解離定数（ＫＤ）の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用してＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）とヒトインターロイキン－３３の親和性を検出し、すべてのプロセスを２５℃で行った。市販のＰｒｏｔｅｉ Ａタンパク質チップを使用し、Ｒｍａｘが約５０ＲＵ、捕捉流量が１０μｌ／分になるように、捕捉法によって適切な量の抗体を固定した。抗原を段階的に希釈し、機器の流量を３０μｌ／分に切り替え、濃度が低いものから高いものへの順番で参照チャネルと抗体固定チャネルを流し、ネガティブ対照として緩衝液を流した。各結合と解離が完了した後、ｐＨ１．５グリシンでチップを再生した。機器に付属されているソフトウェアを使用して、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ項目における１：１結合モデルに従ってフィッティングさせ、抗体の結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤの値を計算した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用してＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）とヒトインターロイキン－３３の親和性を検出し、すべてのプロセスを２５℃で行った。市販のＰｒｏｔｅｉ Ａタンパク質チップを使用し、Ｒｍａｘが約５０ＲＵ、捕捉流量が１０μｌ／分になるように、捕捉法によって適切な量の抗体を固定した。抗原を段階的に希釈し、機器の流量を３０μｌ／分に切り替え、濃度が低いものから高いものへの順番で参照チャネルと抗体固定チャネルを流し、ネガティブ対照として緩衝液を流した。各結合と解離が完了した後、ｐＨ１．５グリシンでチップを再生した。機器に付属されているソフトウェアを使用して、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ項目における１：１結合モデルに従ってフィッティングさせ、抗体の結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤの値を計算した。
【0064】
また、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）と、ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ社が開発したヒトインターロイキン－３３モノクローナル抗体エトキマブ／ＡＮＢ０２０との親和性を比較した。既知の抗体に対する検出方法は、ＱＸ００７Ｎに対する検出方法と同じであった。結果を表１に示す。ここで、エトキマブ／ＡＮＢ０２０は、特許ＷＯ２０１５１０６０８０Ａ２によって提供されるＡＰＥ４９０９配列に基づき、発現プラスミドを構築して、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を一時的にトランスフェクトすることによって発明者に作成された。
【0065】
【表1】
【0066】
さらに、上記と同様の検出方法に基づいて、エトキマブ／ＡＮＢ０２０はカニクイザル及びアカゲザルのインターロイキン－３３に結合でき、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）はカニクイザルのインターロイキン－３３に結合できるが、アカゲザルのインターロイキン－３３には結合しないことも判明した。
【0067】
実施例３ ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を中和する活性の検出
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞は、ヒトＩＬ１ＲＬ１遺伝子でヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３を安定的にトランスフェクトすることによって生成され、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βに対する応答がブロックされるため、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞はＩＬ－３３細胞に特異的に応答する。インターロイキン－３３は細胞表面ＩＬ－１ＲＬ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰに結合してシグナル伝達カスケードを引き起こし、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達及び分泌型アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＳＥＡＰ）の生成を引き起こし、これによってインターロイキン－３３の生物活性の検出または抗体スクリーニングを行う。
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞は、ヒトＩＬ１ＲＬ１遺伝子でヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３を安定的にトランスフェクトすることによって生成され、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βに対する応答がブロックされるため、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞はＩＬ－３３細胞に特異的に応答する。インターロイキン－３３は細胞表面ＩＬ－１ＲＬ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰに結合してシグナル伝達カスケードを引き起こし、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達及び分泌型アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＳＥＡＰ）の生成を引き起こし、これによってインターロイキン－３３の生物活性の検出または抗体スクリーニングを行う。
【0068】
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞を使用して、ヒトインターロイキン－３３に対するＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）の中和活性を測定した。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞をウェルあたり４×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。抗体を０～５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に希釈し、希釈液を２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－３３と均一に混合して１時間インキュベートし、インキュベート終了後、細胞に添加して３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。細胞培養上清を回収し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｒｅｐ－ｑｂｓ２）を１：１０の割合で加え、３７℃で１時間反応させ、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ６３０ｎｍ値を検出し、ｓｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して、４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図４）、さらに抗体の拮抗活性を解析した。
【0069】
図４に示す結果から分かるように、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）は、組換えヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を阻害でき、そのＩＣ５０は６．６７ｎｇ／ｍｌであるに対して、エトキマブ／ＡＮＢ０２０については、同じ方法を使用して測定されたＩＣ５０は６．０５ｎｇ／ｍｌであった。
【0070】
実施例４ 天然ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を中和する活性の検出
天然ヒトインターロイキン－３３を調製し、天然ヒトインターロイキン－３３に対するＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）の中和活性を検証した。ＨＦＬ－１細胞を培養し、２００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αで２４時間誘導培養した後、細胞を回収し、凍結融解を繰り返して溶解させ、細胞溶解液の上清を回収した。上清にはヒトインターロイキン－３３が含まれており、その活性をＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞によって検証した。
天然ヒトインターロイキン－３３を調製し、天然ヒトインターロイキン－３３に対するＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）の中和活性を検証した。ＨＦＬ－１細胞を培養し、２００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αで２４時間誘導培養した後、細胞を回収し、凍結融解を繰り返して溶解させ、細胞溶解液の上清を回収した。上清にはヒトインターロイキン－３３が含まれており、その活性をＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞によって検証した。
【0071】
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞をウェルあたり４×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。抗体を０～１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に希釈し、希釈液と天然ヒトインターロイキン－３３を添加し、均一に混合してから細胞に添加して３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。細胞培養上清を回収し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）検出試薬を１：１０の割合で加え、３７℃で１時間反応させ、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ６３０ｎｍ値を検出し、ｓｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図５）、さらに抗体の中和活性を解析した。
【0072】
図５に示す結果から分かるように、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）は、天然ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達を阻害でき、そのＩＣ５０は３．９１ｎｇ／ｍｌであるに対して、エトキマブ／ＡＮＢ０２０については、同じ方法を使用して測定されたＩＣ５０は２．５ｎｇ／ｍｌであった。
【0073】
実施例５ ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＫＵ８１２（ヒト末梢血好塩基球性白血病細胞）からのＩＬ－５の放出を中和する活性の検出
ＫＵ８１２（ヒト末梢血好塩基球性白血病細胞）からのＩＬ－５放出を誘導するヒトインターロイキン３３を指標として、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）のヒトインターロイキン３３中和活性を評価した。ＫＵ８１２細胞（２×１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、抗体及び組換えヒトインターロイキン－３３（最終濃度４ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養し、細胞培養上清を収集し、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－５ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２０５）を使用して上清中のＩＬ－５の発現量を検出し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍ値を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図６）、さらに抗体の中和活性を解析した。
ＫＵ８１２（ヒト末梢血好塩基球性白血病細胞）からのＩＬ－５放出を誘導するヒトインターロイキン３３を指標として、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）のヒトインターロイキン３３中和活性を評価した。ＫＵ８１２細胞（２×１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、抗体及び組換えヒトインターロイキン－３３（最終濃度４ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養し、細胞培養上清を収集し、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－５ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２０５）を使用して上清中のＩＬ－５の発現量を検出し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍ値を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図６）、さらに抗体の中和活性を解析した。
【0074】
図６に示す結果から分かるように、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）は、ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるＫＵ８１２（ヒト末梢血好塩基性白血病細胞）からのＩＬ－５放出活性を中和することができ、そのＩＣ５０は５．８７ｎｇ／ｍｌであるに対して、エトキマブ／ＡＮＢ０２０については、同じ方法を使用して測定されたＩＣ５０は４４ｎｇ／ｍｌであった。
【0075】
実施例６ ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるヒト全血からのＩＦＮ－γの放出を中和する活性の検出
測定基準としてヒト全血中の単球を使用し、測定指標としてＩＦＮ－γを使用してＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）の中和活性をさらに特徴付けた。健康なボランティアからの全血をプレーティング（１００μＬ／ウェル）し、抗体と組換えヒトインターロイキン－３３（最終濃度４ｎｇ／ｍｌ）を加え、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍ値を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図７）、さらに抗体の中和活性を解析した。
測定基準としてヒト全血中の単球を使用し、測定指標としてＩＦＮ－γを使用してＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）の中和活性をさらに特徴付けた。健康なボランティアからの全血をプレーティング（１００μＬ／ウェル）し、抗体と組換えヒトインターロイキン－３３（最終濃度４ｎｇ／ｍｌ）を加え、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ多機能マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍ値を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して４パラメーター曲線を使用して解析データをフィッティングし（図７）、さらに抗体の中和活性を解析した。
【0076】
図７に示す結果から分かるように、ＱＸ００７Ｎ（ＨＺＤ７８－７０）は、ヒトインターロイキン－３３によって誘導されるヒト全血からのＩＦＮ－γの放出活性を中和することができ、そのＩＣ５０は１６ｎｇ／ｍｌであるに対して、エトキマブ／ＡＮＢ０２０については、同じ方法を使用して測定したＩＣ５０は３１．９ｎｇ／ｍｌであった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】