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特表2024-532528抗がん活性を有するＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】抗がん活性を有するＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/16
A61K38/10
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514398
(86)(22)【出願日】2022-08-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-01
(86)【国際出願番号】 KR2022012886
(87)【国際公開番号】W WO2023033481
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0117046
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524077988
【氏名又は名称】パールズインマイアーズ・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＡＲＬＳＩＮＭＩＲＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】チョン，クンヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ミンヒ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA35
4C084DC50
4C084MA02
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045BA54
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗がん活性を有するＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドに関し、具体的に、特定アミノ酸配列のＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその変形物、そして、これを有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物、および抗がん補助用薬学的組成物に関する。本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、がん細胞内ＡＤＰ－リボースを蓄積させることで、細胞の均衡を崩してがん細胞を死滅に至るようにするとともに、正常細胞には毒性を現わさない優れた抗がん効果を有し、他の抗がん剤の投与や放射線抗がん治療時に併用投与される場合、抗がん剤および放射線治療に対する反応性を増進させて、抗がん補助剤としても非常に優れた効果を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１～配列番号１４からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有する、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチド。
【請求項2】
前記ペプチドは、Ｎ－末端、Ｃ－末端または両末端に細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むものである、請求項１に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチド。
【請求項3】
前記細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ、マウロカルシン（ｍａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅ）、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ポリ－アルギニン（Ｐｏｌｙ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）由来ペプチド、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ＶＰ２２、Ｈｐｈ－１、ポリ－アルギニン（Ｐｏｌｙ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｒ１１（Ｒ９）、Ｐｅｐ－１、ＨＰ４、ＬＡＨ４、Ｖｅｔｏｆｕｓｉｎｇ－１、シグナル配列基盤ペプチド、および両親媒性（Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）ペプチドからなる群から選択される一つ以上のものである、請求項２に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチド。
【請求項4】
前記ペプチドは、配列番号１５～２４からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有するものである、請求項２に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のうちいずれか一項に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項7】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
【請求項8】
請求項１～４のうちいずれか一項に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項9】
前記がんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんおよび卵巣がんからなる群から選択された１種以上の固形がんであるものである、請求項８に記載のがんの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項10】
前記組成物は、皮下または経口に投与されるものである、請求項８に記載のがんの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項11】
請求項１～４のうちいずれか一項に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、第２抗がん剤に対する反応性を増進させる、抗がん補助用薬学的組成物。
【請求項12】
前記抗がん剤は、細胞毒性抗がん剤、標的抗がん剤またはこれらの組み合わせである、請求項１１に記載の抗がん補助用薬学的組成物。
【請求項13】
前記第２抗がん剤が標的にするがんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんおよび卵巣がんからなる群から選択された１種以上の固形がんであるものである、請求項１１に記載の抗がん補助用薬学的組成物。
【請求項14】
（ｉ）請求項１～４のうちいずれか一項に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩、および（ｉｉ）第２抗がん剤を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項15】
請求項１～４のうちいずれか一項に記載のＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、放射線抗がん治療に対する反応性を増進させる、抗がん補助用薬学的組成物。
【請求項16】
前記放射線抗がん治療が標的にするがんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんおよび卵巣がんからなる群から選択された１種以上の固形がんであるものである、請求項１５に記載の抗がん補助用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗がん活性を有するＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドに関し、具体的に、特定アミノ酸配列のＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその変形物、そして、これを有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物、および抗がん補助用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ（ｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程の一つであって、ＰＡＲ重合酵素によってＡＤＰ－リボースポリマー（ｐｏｌｙ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｒｉｂｏｓｅ））がタンパク質に共有結合で付着する過程を言う。ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを通じて高分子ＡＤＰ－リボースチェーンを生成するようになり、アセチル化またはメチル化のような小さな分子的次元の変形ではなく、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）またはＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ）のような形態を示さないユニークな細胞内生化学的作用を誘導することができる。ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎの均衡は、ＤＮＡ損傷修復、転写の調節、染色質構造変更、酸化／還元恒常性、細胞内の多様なシグナル伝達、非－膜（ｎｏｎ－ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造形成、宿主－病原体相互作用およびＲＮＡ代謝調節に重要な部分を担当している（Ｊｕａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒｓ、２０２０、１２（３）：７３９）。
【0003】
ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎは、がん、ウイルス感染および神経退行を含む全身疾患の発病に関与しており、特に、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎは、ＰＡＲＰ－１の活性化に由来するため、ＰＡＲＰ－１の活性を抑制する方法で卵巣がん、前立腺がん、乳房がんおよびその他のがんを標的にする抗がん効能は、既によく知られている（Ｊ Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０１９、３０（９）：１４３７）。
【0004】
ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ媒介細胞死滅と関連した生化学的機序情報は、比較的に最近に知られるようになり、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎの活性化は、代表的に３種の主要経路を通じて細胞の死滅を誘発することができる。（Ｒｅｂｅｃｃａ Ｇｕｐｔｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１７、３１（２）：１０１）。
【0005】
ＮＡＤ＋の枯渇は、細胞エネルギー危機（ＡＴＰ枯渇）で発生する細胞代謝、特に、酸化的リン酸化過程を損傷させることができる。広範囲なＤＮＡ損傷によって誘導されたＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ活性化がＮＡＤ＋を消費し、この作用の後続効果によって細胞を死滅させることができると提案された。
【0006】
また、ＤＮＡ修復後に核から放出されたＰＡＲポリマーが細胞質内のミトコンドリア膜に束ねられている細胞死滅誘導因子を解放させて、核内部に細胞死滅誘導因子を動員させる経路を活性化させることができる。細胞死滅因子が核に移動すると、大規模ＤＮＡ断片化を媒介させて、細胞の死滅を誘導する。ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎによるエネルギー枯渇および細胞死滅誘導因子は、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路またはＭＡＰキナーゼ経路のようなタンパク質キナーゼ－フォスファターゼ経路を制御するＰＡＲのシグナル伝達と関連があると知られており、このようなＰＡＲ依存性細胞死滅過程は、相当な水準で死滅機序の複雑性に寄与している。
【0007】
そして、まだ明確な生化学的機序が明かになっていないが、ＰＡＲＰ－１のａｕｔｏＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを通じてＰＡＲＰ－１自体を分解させ、細胞死滅を誘導することができると報告されている。しかし、がんは、この死滅過程を防ぐために、様々なタンパク質分解酵素を活性化して、がんの生存に必要な多様な生化学的作用に関与した余剰のＰＡＲポリマーを分解することで、この死滅作用を賢く回避することができる。
【0008】
よって、既存のＰＡＲＰ－１抑制剤のようなＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ抑制のための試みとは逆に、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを活性化させるか、ＰＡＲポリマーの分解を抑制することもまた、効果的な抗がん治療法発掘のための一つの戦略になり得る。特に、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ活性化またはＰＡＲポリマーの分解抑制は、正常細胞とは異なる方式の代謝過程を経るがん細胞特異的な領域で非常に有望な標的であると見ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、新規抗がん剤を開発するために鋭意努力した結果、本発明の新規アミノ酸配列を有するペプチドがＡＤＰ－リボースとの結合を通じて最終的に細胞内の多様な分解酵素やシグナル伝達タンパク質の作用からＡＤＰ－リボースまたはＰＡＲポリマーを活用することができないようにして、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを過活性化し、ＰＡＲ重合酵素の分解過程を撹乱させることができ、この撹乱の結果として、がん細胞の死滅を誘導して、画期的な抗がん効能を出すことができることを確認して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の一つの目的は、配列番号１～配列番号１４からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有する、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドを提供することである。
【0011】
本発明の他の一つの目的は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【0012】
本発明のまた他の一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび形質転換体を提供することである。
【0013】
本発明のまた他の一つの目的は、前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物、第２抗がん剤に対する反応性を増進させる抗がん補助用薬学的組成物および放射線抗がん治療に対する反応性を増進させる抗がん補助用薬学的組成物を提供することである。
【0014】
本発明のまた他の一つの目的は、がんの予防または治療のための前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩の用途、および前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を必要とする個体に投与するステップを含む、がんの予防または治療方法を提供することである。
【発明の効果】
【0015】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、がん細胞内ＡＤＰ－リボースを蓄積させることで、細胞の均衡を崩してがん細胞を死滅に至るようにするとともに、正常細胞には毒性を現わさない優れた抗がん効果を有し、他の抗がん剤の投与や放射線抗がん治療時に併用投与される場合、抗がん剤および放射線治療に対する反応性を増進させて、抗がん補助剤としても非常に優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】配列番号１～４のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に濃度別に処理した後、細胞内ポリＡＤＰ－リボースの水準を示したものである。
【図2】配列番号５～８のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に濃度別に処理した後、細胞内ポリＡＤＰ－リボースの水準を示したものである。
【図3】配列番号９～１２のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に濃度別に処理した後、細胞内ポリＡＤＰ－リボースの水準を示したものである。
【図4】配列番号１３および１４のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に濃度別に処理した後、細胞内ポリＡＤＰ－リボースの水準を示したものである。
【図5】配列番号１、配列番号１５、配列番号２および配列番号１６のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図6】配列番号３、配列番号１７、配列番号４および配列番号１８のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図7】配列番号５、配列番号１９、配列番号６および配列番号２０のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図8】配列番号７、配列番号２１、配列番号８および配列番号２２のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図9】配列番号９、配列番号２３、配列番号１０および配列番号２４のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図10】配列番号１１、配列番号２５、配列番号１２および配列番号２６のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図11】配列番号１３、配列番号２７、配列番号１４および配列番号２８のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。上図面は細胞写真を示したものであり、下グラフは細胞生存率を示したものである。
【図12】配列番号１５～配列番号２８のペプチドをそれぞれ異なるがん細胞に処理した後、細胞の生存率を確認した結果を示したものである。
【図13】互いに異なるがん細胞にベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、左側）またはオシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ、右側）単独、または配列番号１～配列番号１４のペプチドと併用処理した後の細胞生存率を示したものである。
【図14】互いに異なるがん細胞にゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、左側）またはドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、右側）単独、または配列番号１５～配列番号２８のペプチドと併用処理した後の細胞生存率を示したものである。
【図15】互いに異なるがん細胞に２Ｇｙの放射線照射単独、または配列番号１～配列番号１４のペプチドと併用処理した後の細胞生存率を示したものである。
【図16】互いに異なるがん細胞に２Ｇｙの放射線照射単独、または配列番号１５～配列番号２８のペプチドと併用処理した後の細胞生存率を示したものである。
【図17】腫瘍移植動物モデルから配列番号１５～配列番号２８のペプチドを皮下に投与した後、時間による腫瘍体積変化を示したものである。
【図18】腫瘍移植動物モデルから配列番号１５～配列番号２８のペプチドを皮下に投与した後、確認した腫瘍組織の写真である。
【図19】腫瘍移植動物モデルから配列番号１～配列番号１４のペプチドを経口に投与した後、時間による腫瘍体積変化を示したものである。
【図20】腫瘍移植動物モデルから配列番号１～配列番号１４のペプチドを経口に投与した後、確認した腫瘍組織の写真である。
【図21】代表的に配列番号７のペプチドの正常細胞（ＣＣＤ－１８Ｃｏ）に対する毒性を評価した結果である。
【図22】代表的に配列番号７のペプチドの正常細胞（ＨＤＰＣ）に対する毒性を評価した結果である。
【図23】配列番号７のペプチドの構造を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
これを具体的に説明すれば、次のとおりである。一方、本発明において開示されているそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用され得る。すなわち、本発明において開示されている多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述された具体的な叙述によって、本発明の範疇が制限されるものとは見られない。
【0018】
前記目的を達成するための本発明の一様態は、配列番号１～配列番号１４からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有する、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドである。
【0019】
本発明において、用語「ＡＤＰ－リボース」は、分離したＡＤＰ－リボース自体およびＡＤＰ－リボース重合体（ｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）をすべて含む概念として使用され、「ＡＤＰ－リボース結合ペプチド」は、ＡＤＰ－リボースまたはＡＤＰ－リボース重合体に結合して分解を抑制する活性を有するすべてのペプチドを意味する。本発明において、前記ペプチドは、単にこれを構成するアミノ酸間のペプチド結合によって形成されただけでなく、タンパク質医薬品の観点で安定性、効能などの特性を改善させるために、一部変形された形態を有するすべての形態のペプチド類似体、誘導体などの変形物も含む。
【0020】
本発明者らは、従来ＰＡＲＰ－１抑制剤によってＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ（ｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）が抑制される側面で、抗がん効能が多数報告されたものとは全く異なる側面で、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎの活性化またはＰＡＲポリマーの分解抑制を通じても抗がん効果を期待することができるという点に注目した。特に、がん細胞は、正常細胞に比べて速い速度で分裂し続け、活発に代謝活動をするので、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを過活性化させるか、ＰＡＲポリマーの分解を抑制することで、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎを過活性化しない正常細胞には特別な影響なしにがん細胞を特異的に死滅させることができると期待した。
【0021】
本発明の配列番号１～配列番号１４（表１）からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有するＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドは、いずれもＷＷＥドメインに由来した。ＷＷＥドメインは、ｄｅｌｔｅｘ、Ｔｒｉｐ１２、ポリ－ＡＤＰ－リボース重合酵素同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）など多数のタンパク質で保存された球状ドメイン（ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であって、ドメイン内に最も多く保存された残基の名を取って命名された（Ｌ．Ａｒａｖｉｎｄ、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００１、２６（５）：２７３）。ＷＷＥドメインを有する一部タンパク質で前記ドメイン内ＡＤＰ－リボース結合モチーフが存在すると知られている。細胞内酵素のＷＷＥドメインは、主にＡＤＰ－リボースに結合して分解を誘導すると報告された。すなわち、ＷＷＥドメインを通じて特定酵素がＰＡＲまたはＡＤＰＲに結合することは、がん細胞生存のための目的が大きいと見られる（ＰＮＡＳ Ａｕｇｕｓｔ ２３、２０１１ １０８（３４）１４１０３－１４１０８）。
【0022】
しかし、本発明のように、ＷＷＥドメインの一部分を分離したペプチドで製造して細胞に処理したとき、逆にＡＤＰ－リボース分解が抑制され、細胞内ＡＤＰ－リボースが蓄積され、結果的に優れた抗がん効果を有するということは、全く報告されていない。
【0023】
本発明の具体的な一実施例においては、様々な種類のタンパク質内に存在するＷＷＥドメインからその断片を合成し、これらの抗がん活性を照射した。その結果、実施例１～１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチド（配列番号１～１４）を多様な種類のがん細胞に処理したとき、がん細胞内ＡＤＰ－リボースの水準が顕著に増加することを確認した（図１～図４）。さらに、前記ペプチドの処理によって細胞内ＡＤＰ－リボースの均衡が崩れてがん細胞の成長が抑制され、殆ど死滅することを試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験を通じて確認し（図５～図１１）、腫瘍移植動物モデルからも実施例１～１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを皮下または経口に投与したとき、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍組織の成長が急激に減少することを確認した（図１９および図２０）。
【0024】
また、本発明の他の具体的な一実施例においては、代表的に配列番号７のペプチドを正常細胞に処理して、正常細胞に対する細胞毒性を評価した。その結果、正常細胞には如何なる毒性も現わさないことを確認した（図２１および図２２）。
【0025】
したがって、本発明の配列番号１～１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、がん種にかかわらず、非常に優れた抗がん効果を有し、正常細胞には細胞毒性を全く現わさないので、がんの予防または治療用組成物として有用に使用され得る。
【0026】
前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、配列番号１～１４のうちいずれか一つのアミノ酸配列を有するペプチドだけでなく、これらの配列から一つ以上のアミノ酸が付加、置換または結実された配列も均等範囲に該当する場合であれば、いずれも本発明の範疇に属する。
【0027】
例えば、本発明の配列番号１～１４のうちいずれか一つのアミノ酸配列を有するペプチドと少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の相同性を有し、前記配列番号１～１４のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドと相応する効能、すなわち、ＡＤＰ－リボース結合活性および抗がん活性を示すペプチドであれば、配列番号１～１４のアミノ酸配列から一部配列が付加、置換または結実されたアミノ酸配列を有しても、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【0028】
また、配列番号１～１４のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドと相応する活性を有する場合であれば、アミノ酸配列前後の無意味な配列追加または自然的に発生し得る突然変異、あるいはその潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）も本発明の範囲内に含まれ得る。
【0029】
本発明において、用語「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセントで表示されることができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列は、「％相同性」で表示される。例えば、点数（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などの媒介変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的に、ＢＬＡＳＴ２．０を利用するか、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することで確認することができ、定義される適切な混成化条件は該当技術範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で決定されることができる。
【0030】
また、本発明のペプチドは、追加で所望の特性を改善させるために、ペプチドを構成する一つ以上のアミノ酸で化学的誘導体化などの変形を含むことができ、このような変形にもかかわらず、本発明のペプチドと同等な抗がん活性を有する限り、いずれも本発明の範疇に該当することは当業者に自明である。前記誘導体化は、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、ペギル化、および炭水化物または脂質成分、補因子などの付加を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【0031】
本発明の具体的な一様態として、前記ペプチドは、細胞透過性を高めるために、追加で細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）と融合した形態で利用されることができる。すなわち、前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、Ｎ－末端、Ｃ－末端または両末端に細胞透過性ペプチドをさらに含むことができる。このとき、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよび細胞透過性ペプチドの間にリンカーをさらに含むことができ、これは、当業者によって適切に遂行されることができる。
【0032】
本発明において、用語「細胞透過性ペプチド」は、ナノ粒子、化合物、ＤＮＡ、タンパク質など多様な物質の細胞内摂取／吸収を促進させることができる特性を有するペプチドを言う。具体的に、前記細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ、マウロカルシン（ｍａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅ）、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ポリ－アルギニン（Ｐｏｌｙ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）由来ペプチド、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ＶＰ２２、Ｈｐｈ－１、ポリ－アルギニン（Ｐｏｌｙ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｒ１１（Ｒ９）、Ｐｅｐ－１、ＨＰ４、ＬＡＨ４、Ｖｅｔｏｆｕｓｉｎｇ－１、シグナル配列基盤ペプチド、または両親媒性（Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）ペプチドであってよいが、これに制限されるものではなく、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドの細胞内移動を促進させることができるものであれば、当業者によって適切に選択されることができる。
【0033】
本発明の具体的な一実施例においては、本発明の配列番号１～１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドのＮ－末端に細胞透過性ペプチドであるＴＡＴを融合して、その抗がん活性を評価した（配列番号１５～配列番号２４、表２）。その結果、ＡＤＰ－リボース結合ペプチド単独で使用した場合よりもさらに優れている抗がん活性を有することが確認できた（図５～図１２、図１７および図１８）。したがって、本発明の配列番号１～１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドだけでなく、前記ペプチドに細胞透過性タンパク質が融合された形態もまた、がんの予防または治療用組成物として非常に有用に使用されることができる。
【0034】
さらに、当業者は、使用される細胞透過性ペプチドの種類によってこれを適用するために、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを適切に変形して使用することができる。すなわち、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、これを細胞透過性ペプチドに融合して使用する場合にも、本発明において提示するアミノ酸配列にのみ限定されるものではなく、当業者に自明な範囲、すなわち、均等範囲内で細胞透過性ペプチドの適用に適切な形態でアミノ酸配列を付加／置換／除去して使用することができる。
【0035】
また、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、細胞透過性を高めるために、細胞にタンパク質を伝達させるか、伝達効率を増進させることができる当業界に公知の試薬とともに使用され得る。前記試薬は、例えば、ＣｈａｒｉｏｔＴＭ（Ａｃｔｉｖｅ ｍｏｔｉｆ、Ｃａｔ．３００２５）、ＸｆｌｅｃｔＴＭ（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ．６３１３２４）、ＰｉｅｒｃｅＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．８９８５０）、ＰｒｏｔｅｏＪｕｉｃｅＴＭ（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．７１２８１）、ＰＵＬＳｉｎＴＭ（Ｐｏｙｌｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）などの商業的に販売される試薬だけでなく、その他の非商業的試薬をすべて含み、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを細胞に伝達させることができる限り、前記例に特に制限されるものではない。
【0036】
本発明の他の一様態は、前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【0037】
本発明のまた他の一様態は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターである。
【0038】
本発明のまた他の一様態は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体である。
【0039】
ＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、前記説明したとおりである。
【0040】
前記ポリヌクレオチドは、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上相同性を有するヌクレオチド配列を有するものであってよく、これから翻訳されたポリペプチドが本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドと相応する効能を示すものであれば、ヌクレオチド配列の５’－および／または３’－末端に無意味な配列の付加、あるいは一部配列の結実、変形、置換された場合、いずれも本発明の範囲に含まれ得る。前記ポリヌクレオチドは、公知のプロモーター配列と作動可能に連結された発現カセット、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形態で使用されることができ、ポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターの製造は、当業者が公知の方法を通じて適切に遂行することができる。プロモーターおよびベクターの種類は、特に制限されず、目的によって当業者が適切に選択することができる。また、前記ポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを宿主細胞に形質転換させて、形質転換体を製造して使用することができ、このときの形質転換方法もまた当業者が公知の方法を制限なく使用することができる。前記形質転換体は、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを発現させようとする対象体であって、微生物、植物または動物であってよく、ヒトを除いたものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0041】
当業者は、多様な目的で前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドを適用／生産するために、これをコードするポリヌクレオチド、これを含むベクター、あるいは前記ベクターを含む形質転換体を製造して使用することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドあるいは前記ベクターを利用して直接的にがんに対する治療用途で使用することができ、これを含んでＡＤＰ－リボース結合ペプチドを発現する形質転換体を利用して前記ペプチドを生産するか、治療目的で使用することができるが、これに制限されるものではない。
【0042】
本発明のまた他の一様態は、前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物である。
【0043】
本発明のまた他の一様態は、がんの予防または治療のための前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩の用途、および前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を必要とする個体に投与するステップを含む、がんの予防または治療方法である。
【0044】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドががんの予防および／または治療に優れた効果を有するということは、上述のとおりである。
【0045】
本発明において、用語「がん」は、細胞の死滅調節と関連する疾病であって、正常的な細胞死滅均衡が崩れる場合、細胞が過多増殖するようになることで生じる疾病を言う。本発明において、前記がんは、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）および良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｔｕｍｏｒ）をすべて含み、例えば、脳がん、頭頚部がん、肺がん、乳房がん、胸腺腫、食道がん、大腸がん、肝がん、胃がん、膵臓がん、胆道がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、睾丸がん、生殖細胞腫、卵巣がん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、大腸がん、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄種、肉腫、悪性黒色腫または皮膚がんであってよいが、前記例によって本発明のがんの種類が限定されるものではない。本発明のがんの予防または治療用組成物は、細胞内ＡＤＰ－リボースが蓄積されることで、細胞死滅が起きることができるすべてのがんに治療効果を有する。
【0046】
一例として、前記がんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんまたは卵巣がんのような固形がんであってよいが、これに制限されるものではない。
【0047】
本発明において、用語「治療」は、疾病を有する個人または細胞の天然過程を変更させるために介入することを指称し、これは、病理状態が進行される間またはこれを予防するために遂行されることができる。目的とする治療効果には、疾病の発生または再発を予防し、症状を緩和し、疾病によるすべての直接または間接的な病理学的結果を低下させ、転移を予防し、疾病進行速度を減少させ、疾病状態を軽減または一時的に緩和させ、快方させるか予後を改善させることが含まれる。特に、本発明においては、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物の投与でがんの経過を好転させるすべての行為を含む。また、用語「予防」は、前記組成物の投与でがんの発病を抑制または遅延するすべての行為を言う。
【0048】
前記薬学的組成物に含まれるＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容される塩の重量％は、特にこれに制限されないが、最終組成物の総重量を基準に０．０００１～９０重量％、具体的に０．００１～５０重量％、より具体的に０．０１～２０重量％の含量で含まれ得る。
【0049】
前記薬学組成物は、薬剤の製造に通常的に使用される適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んで製造されることができる。具体的に、本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、経口パッチなどの経口型剤形、外用剤、外用パッチ剤、坐剤および滅菌注射液の形態で剤形化して使用され得る。
【0050】
前記薬学組成物が経口投与用として使用される場合、適切なカプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）、腸溶コーティング（ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｏａｔｉｎｇ）、ポリマーの配合などを通じて徐放性製剤で製造されることができる。
【0051】
一実施様態において、前記徐放性製剤は、長時間作用性（ｌｏｎｇ ａｃｔｉｎｇ）製剤で製造されることができる。
【0052】
一実施態様において、長時間作用性製剤には、ポリマーと脂質が適切な割合で混合されることができる。
【0053】
本発明の薬学的組成物は、がんが発病したか、または発病する危険を有する個体に投与されることができる。本発明において、用語「個体」は、ヒトを含むすべての動物を意味する。
【0054】
本発明の薬学的組成物は、対象個体に薬学的に有効な量で投与されることができる。本発明において、用語「投与」は、ある適切な方法で対象個体に本発明の薬学的組成物を導入することを言い、投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができる。投与経路の例としては、経口、筋肉、静脈、動脈、皮下、腹腔、肺、および鼻腔が含まれ、例えば、皮下または経口に投与されるものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0055】
本発明において、用語「薬学的に有効な量」は、医学的用途に適用可能な合理的な受益／危険割合でがんを予防および／または治療するに十分な量を意味する。当業界に公知の方法によって適切な投与量および投与回数が選択されることができ、実際に投与される本発明の薬学的組成物の量および投与回数は、治療しようとする症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食餌、個体の年齢、体重および疾患の重症度のような多様な因子によって適切に決定されることができる。
【0056】
本発明において、薬学的に許容可能な塩は、製薬業界において通常的に使用される塩を意味し、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リチウム、銅、マンガン、亜鉛、鉄などを始めとした無機イオンの塩と塩酸、リン酸、硫酸のような無機酸の塩があり、その外に、アスコルビン酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、グリコール酸、コハク酸、プロピオン酸、酢酸、オロト酸、アセチルサリチル酸のような有機酸の塩などと、リジン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩がある。また薬学的な反応、精製および分離過程で使用され得るテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンゼトニウムなどの有機イオンの塩がある。ただし、列挙されたこれらの塩によって、本発明において意味する塩の種類が限定されるものではない。
【0057】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、優れた抗がん活性を有するので、薬学的組成物だけでなく、機能性を有した食品組成物の形態でも製造されることができる。
【0058】
本発明の組成物が食品組成物の形態で製造される場合、前記食品組成物は食品に通常使用されて、匂い、味、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を添加することができる。前記添加物は、食品の種類によって選別されて適切な量で使用される。
【0059】
前記食品組成物は、健康機能性食品で製造されることができ、ここで、健康機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同一の用語であって、栄養供給の外にも生体調節機能が効率的に示されるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。前記健康機能性食品は、がんの改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸などの多様な形態で製造されることができる。
【0060】
本発明のまた他の一様態は、前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、第２抗がん剤に対する反応性を増進させる抗がん補助用薬学的組成物である。
【0061】
本発明のまた他の一様態は、（ｉ）前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩、および（ｉｉ）第２抗がん剤を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物である。
【0062】
ＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩に対しては、上述のとおりである。
【0063】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、単独で抗がん効果を有することに加えて、第２抗がん剤に対する反応性を増進させるための目的で抗がん補助用薬学的組成物としても非常に優れた効果を有する。したがって、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩とともに、第２抗がん剤を有効成分にして、がんの予防または治療用薬学的組成物として使用されることができる。
【0064】
本発明において、用語「第２抗がん剤」は、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを除いた任意の抗がん活性を有する薬物を言う。本発明において、前記第２抗がん剤の範囲は特に制限されず、がんの種類と進行程度によって、がんの完治、調節、症状緩和などの目的によって当業者が適切な種類を選択して使用することができる。第２抗がん剤は、例えば、細胞毒性抗がん剤、標的抗がん剤、免疫抗がん剤または代謝抗がん剤であってよいが、これに制限されない。
【0065】
本発明において、細胞毒性抗がん剤は、正常細胞に比べて速い速度で無分別に分裂するがん細胞を攻撃して抗がん効果を示す薬物であって、その意味は、本発明の属する技術分野において通常的に使用されるものと同じである。前記細胞毒性抗がん剤は、アルキル化剤、抗代謝剤（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）、天然物抗がん剤を含む。
【0066】
前記アルキル化剤は、窒素マスタード（例えば、シクロホスファミド、クロルメチン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチンなど）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、プロカルバジンなど）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなど）、白金基盤アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ジシクロプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニトラートなど）を挙げることができるが、これに制限されない。アルキル化剤は、がん細胞内ＤＮＡに結合してＤＮＡ構造を損傷させることで、がん細胞の破壊を誘発することができる。
【0067】
前記抗代謝剤は、ピリミジン誘導体（例えば、５－フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビンなど）、フォレート誘導体（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドなど）、プリン誘導体（例えば、メルカプトプリンなど）を挙げることができるが、これに制限されない。抗代謝剤は、ＤＮＡ複製および細胞生存に必要な代謝を抑制することで、がん細胞死滅を誘導することができる。
【0068】
前記天然物抗がん剤としては、トポイソメラーゼ抑制剤（例えば、カンプトテシン、エピポドフィロトキシン、タキサン系列薬物（ドセタキセル、パクリタキセル））、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、フレオマイシン、イダルビシン、ミトキサントロンＨＣｌなど）を挙げることができるが、これに制限されない。
【0069】
本発明において、標的抗がん剤は、がんの成長に関与するターゲットタンパク質（受容体または酵素）を抑制することで、がん細胞の死滅を誘導する抗がん剤であって、その意味は、本発明の属する技術分野において通常的に使用されるものと同じである。前記細胞毒性抗がん剤は、標的タンパク質（チロシンキナーゼなど）抑制低分子化合物および単クローン抗体を含む。
【0070】
一例として、前記標的抗がん剤は、ＶＥＧＦ－ＡおよびＥＧＦＲからなる群から選択された一つ以上のターゲットを標的する受容体チロシンキナーゼ抑制剤であってよい。
【0071】
一実施態様において、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドと併用投与されることができる標的抗がん剤は、ＶＥＧＦ－Ａ抑制剤である。本発明において、ＶＥＧＦ－Ａ抑制剤は、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）のような単クローン抗体、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）のような低分子化合物を挙げることができるが、これに制限されるものではない。
【0072】
一実施態様において、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドと併用投与されることができる標的抗がん剤は、ＥＧＦＲ抑制剤である。本発明において、ＥＧＦＲ抑制剤は、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、ブリグチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、イコチニブ（ｉｃｏｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）のような低分子化合物とともに、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）のような単クローン抗体を挙げることができるが、これに制限されない。
【0073】
以外にも、本発明の標的抗がん剤はまた、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ネラチニブ（ｎｅｒａｔｉｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）のようなＨＥＲ２標的抗がん剤、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）のようなＢｃｒ－Ａｂｌ標的抗がん剤；ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）のようなＳｒｃ標的抗がん剤；レスタウルチニブ（ｌｅｓｔａｕｒｔｉｎｉｂ）、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、パクリチニブ（ｐａｃｒｉｔｉｎｉｂ）のようなＪＡＫ標的抗がん剤；コビメチニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｈｉｎｉｂ）、セルメチニブ（ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、ビニメチニブ（ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）のようなＭＡＰ２ Ｋｉｎａｓｅ標的抗がん剤；セリチビン（ｃｅｒｉｔｉｂｉｎ）、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）のようなＭＥＬ４－ＡＬＫ標的抗がん剤などを含み、その種類に特に制限されない。
【0074】
また、本発明の第２抗がん剤は、一つ以上の細胞毒性抗がん剤および／または標的抗がん剤の組み合わせであってよく、これらは、同時にまたは異時に投与されてよい。
【0075】
本発明において、免疫抗がん剤は、人体の免疫系を活性化させてがん細胞と戦わせる薬物を言う。本発明において、免疫抗がん剤は、免疫チェックポイント抑制剤、免疫細胞治療剤、抗がんワクチン、抗体－薬物接合体を含み、がんの種類と進行程度によって、がんの完治、調節、症状緩和のために適切な種類を選択することができる。
【0076】
一実施態様において、免疫抗がん剤は、免疫チェックポイント抑制剤であってよく、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＣＤ２８抗体、ＫＩＲ抗体、ＴＣＲ抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＴＩＭ－３抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、Ａ２ａＲ抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＯＸ４０抗体、４－１ＢＢ抗体およびＧＩＴＲ抗体からなる群から選択された一つ以上であってよい。例えば、前記免疫チェックポイント抑制剤は、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）のようなＰＤ－１抗体；アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒａｌｕｍａｂ）のようなＰＤ－Ｌ１抗体；イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）のようなＣＴＬＡ－４抗体であってよいが、これに制限されるものではない。
【0077】
一実施態様において、免疫抗がん剤は免疫細胞治療剤であってよく、チサゲンレクロイセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）、アキシカブタゲンシロルユーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）のようなＣＡＲ－Ｔ治療剤、またはＣＡＲ－ＮＫ治療剤であってよいが、これに制限されるものではない。
【0078】
本発明において、代謝抗がん剤は、がん細胞に栄養を供給するなど、がん細胞の成長および生存に関与するか、必須な様々な代謝作用に関与してがん細胞を死滅させる薬物を言う。前記代謝抗がん剤は、例えば、ＩＭ－１５６、３－ブロモピルビン酸（３ＢＰ）、ＮＹＨ８１７１００、ＷＺＢ１１７、ＧＮＥ－１４０、ＡＺ９３、ＡＺＤ３９６５、ＣＰＩ－６１３、ＭＫＴ－０７７、ＣＢ－８３９、ＣＢ－１１５８、ＣＰＩ－４４４、ＴＶＢ－２６４０、ＮＤＩ－０１０９７６、ＴＣＤ－７１７、ＡＤＩ－ＰＥＧ２０、エパカドスタット（Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）、インドキシモド（Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）、ＰＸ４７８、ＣＰＩ－０６１０、ＲＴＡ４０２、ＡＰＯ８６６、ＧＭＸ１７７８、ＡＧ－２２１またはＡＧ－１２０などであってよいが、これに制限されるものではない。
【0079】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、がん細胞内ＡＤＰ－リボースの均衡を崩して第２抗がん剤に対する反応性を増進させる効果を有して抗がん補助剤として使用され得るので、使用される第２抗がん剤の種類やがんの種類に特に制限されない。一例として、前記がんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんまたは卵巣がんのような固形がんであってよいが、これに制限されるものではない。
【0080】
本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、第２抗がん剤と独立して存在する形態で併用投与されることができるだけでなく、目的によって、公知の任意の方法で第２抗がん剤と物理／化学的な結合を形成した状態で投与されることができる。例えば、ＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、第２抗がん剤と直接結合された状態で使用されるか、または公知のリンカーを通じて第２抗がん剤と連結された状態で使用されることができ、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドが第２抗がん剤とともに作用して相乗した抗がん効果を示す限り、その適用方法に特に制限されない。
【0081】
本発明の具体的な一実施例においては、低濃度のベバシズマブ、オシメルチニブ、ゲムシタビン、ドセタキセルとともに、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドをそれぞれ異なるがん種に処理した場合、すべてのがん細胞で抗がん剤に対する反応性が増進されることを確認した（図１３および図１４）。したがって、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、第２抗がん剤の反応を増進させることができ、抗がん補助用途として非常に有用に使用されることができ、第２抗がん剤を低濃度で処理しても優れた抗がん活性を有するので、第２抗がん剤によって発生し得る副作用を最小化することができる。
【0082】
本発明のまた他の一様態は、前記ＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、放射線抗がん治療に対する反応性を増進させる抗がん補助用薬学的組成物である。
【0083】
ＡＤＰ－リボース結合ペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩は、上述のとおりである。
【0084】
本発明において、用語「放射線抗がん治療」は、がん細胞を死滅させるための目的であって、がん細胞または腫瘍組織に放射線を照射する治療行為を言う。一般的に、切開不可能または手術不可能な腫瘍、または腫瘍転移を制御するための標準治療法であって、標的部位に伝達された放射線が再生性細胞（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）の死滅を招くという原理に基づく。本発明において、放射線抗がん治療は、イオン化放射線療法（ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、電磁気放射線療法（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、近接放射線療法（ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）または外部放射線療法（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｂｅａｍ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0085】
本発明に係るＡＤＰ－リボース結合ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物は、放射線療法と併用される場合、相乗的抗がん効果を示すので、放射線療法に対する抗がん補助剤または放射線敏感度を向上させる放射線敏感化剤として有用に活用されることができ、適用可能ながんの種類に特に制限されない。一例として、前記がんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、乳房がん、大腸がん、腎臓がん、胃がんおよび卵巣がんのような固形がんであってよいが、これに制限されるものではない。
【0086】
一実施様態として、前記固形がんは、放射線療法に対して耐性を示すものであってよい。放射線治療の抗がん効果は、ＤＮＡ切断の形成で示されるため、放射線治療に対する耐性は、一般的に放射線治療によって誘導されるＤＮＡ損傷を修復できる機序によって決定される。放射線治療の抗がん効能を相乗させる方法として、ＤＮＡ修復機序抑制のための多くの試みがあり、破壊されたＤＮＡ鎖の修理が遮断されると、放射線治療の感度が高くなり得る。ＤＮＡ損傷の二つの主要形態は、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ）とＤＳＢ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ）である。よって、ＳＳＢおよびＤＳＢを対象とする二つの修復経路の範疇で説明することができる。ＢＥＲ（Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ）は、選択された類型のＤＮＡ ＳＳＢの修復に関与する様々な経路のうち一つである。
【0087】
ＰＡＲＰ１は、ＡＤＰ－リボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と知られている工程を通じて、ＤＮＡ ＳＳＢのＢＥＲで重要な役割を果たす。核においてＰＡＲＰ１は、ＳＳＢ ＤＮＡの損傷を感知し、修理のためにＳＳＢ部位にＡＤＰ－リボシル化を通じてＤＮＡ修復複合体を募集する。ＰＡＲＰ－１活性によるＡＤＰ－リボシル化を通じて合成されたポリ－ＡＤＰ－リボースの過蓄積は、最終的に細胞の死滅に繋がるため、がん細胞は、この現象を防ぐためにＰＡＲＧやＡＲＨ３などのようなプロテアソームを通じてポリ－ＡＤＰ－リボースの分解を活性化して、生存シグナル伝達活動を活性化する。本発明者らは、がん細胞内ＡＤＰ－リボースやＡＤＰ－リボース重合体の蓄積ががん細胞のこのような生化学的生存機序を撹乱させることができる媒介体として作用することができ、放射線治療耐性を克服する重要な抗がん補助剤として活用できることに着眼した。
【0088】
本発明の具体的な一実施例においては、それぞれ異なるがん種で低線量の放射線照射とともに、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを併用処理した場合、すべてのがん種で放射線治療に対する反応性が増進されることを確認した（図１５および図１６）。したがって、本発明のＡＤＰ－リボース結合ペプチドは、放射線治療の反応を増進させることができ、抗がん補助用途として非常に有用に使用されることができ、放射線を耐性線量で照射しても、優れた抗がん活性を有するので、放射線によって発生し得る副作用を最小化することができる。
【0089】
本発明の実施形態は、様々な他の形態に変形されることができ、本発明の範囲が以下に説明する実施形態に限定されるものではない。また本発明の実施形態は、当該技術分野において平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。さらに、明細書全体において、ある構成要素を「含む」ということは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができるということを意味する。
【0090】
［発明の実施のための形態］
以下、実施例を通じて本発明の構成および効果をより詳しく説明しようとする。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
以下、実施例を通じて本発明の構成および効果をより詳しく説明しようとする。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【0091】
実施例１－１４．ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース結合ペプチドの製造
様々な種類のタンパク質内に存在するＷＷＥドメインから実施例１～実施例１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを合成し、これを実験に使用した。使用されたペプチドの具体的な情報は、下記表１に示した。
様々な種類のタンパク質内に存在するＷＷＥドメインから実施例１～実施例１４のＡＤＰ－リボース結合ペプチドを合成し、これを実験に使用した。使用されたペプチドの具体的な情報は、下記表１に示した。
【0092】
【表1】
【0093】
また、前記実施例１～１４のペプチドのＮ－末端に細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を結合して、実施例１５～２８のペプチドを製造した。実施例１５～２８のペプチド配列を表２に示した。
【0094】
【表2】
【0095】
実験例１：がん細胞内ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－リボース水準変化確認
本発明の実施例１～２８のペプチドは、ポリＡＤＰ－リボースの分解酵素作用を抑制することができるように設計されたものである。実験例１においては、細胞実験を通じて各ペプチドによってポリＡＤＰ－リボースの分解が抑制されて、がん細胞内に蓄積されるかを確認した。
本発明の実施例１～２８のペプチドは、ポリＡＤＰ－リボースの分解酵素作用を抑制することができるように設計されたものである。実験例１においては、細胞実験を通じて各ペプチドによってポリＡＤＰ－リボースの分解が抑制されて、がん細胞内に蓄積されるかを確認した。
【0096】
１－１．Ｕ－８７ＭＧ細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例１（配列番号１）または実施例８（配列番号８）のペプチドを処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例１（配列番号１）または実施例８（配列番号８）のペプチドを処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0097】
図１の左上および図２の右下は、Ｕ－８７ＭＧ細胞で実施例１または８のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチド２種とも濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0098】
１－２．Ｈ１９７５細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例２のペプチド（配列番号２）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例２のペプチド（配列番号２）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0099】
図１の右上および図３の左上は、Ｈ１９７５細胞で実施例２または実施例９のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0100】
１－３．Ａｓｐｃ－１細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例３のペプチド（配列番号３）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例３のペプチド（配列番号３）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0101】
図１の左下および図３の右上は、Ａｓｐｃ－１細胞で実施例３または実施例１０のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0102】
１－４．Ｈｅｐ Ｇ２細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＨｅｐ Ｇ２細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ培地に実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例４のペプチド（配列番号４）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＨｅｐ Ｇ２細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ培地に実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例４のペプチド（配列番号４）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0103】
図１の右下および図３の左下は、Ｈｅｐ Ｇ２細胞で実施例４または実施例１１のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0104】
１－５．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例５のペプチド（配列番号５）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例５のペプチド（配列番号５）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0105】
図２の左上および図３の右下は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で実施例５または実施例１２のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0106】
１－６．ＨＣＴ１１６細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例６のペプチド（配列番号６）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例６のペプチド（配列番号６）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0107】
図２の右上および図４の左側は、ＨＣＴ１１６細胞で実施例６または実施例１３のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0108】
１－７．Ｃａｋｉ－１細胞内ＡＤＰ－リボース水準の変化
５×１０５個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例７のペプチド（配列番号７）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
５×１０５個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で実施例ペプチドを処理しないグループおよび０．２、１、２、４、８、１６、３２μＭの実施例７のペプチド（配列番号７）を処理したグループに分けて、２４時間培養した。培養された細胞の培地を除去し、ＲＩＰＡバッファーおよび１％ＳＤＳを処理した。準備された上層液をＥＬＩＳＡ分析に活用して、ＡＤＰ－リボースを検出分析した。
【0109】
図２の左下および図４の右側は、Ｃａｋｉ－１細胞で実施例７または実施例１４のペプチド処理によって対照群グループ対比ＡＤＰ－リボース増加量を倍数変化で示したものであって、処理しないグループに比べて処理されたペプチドの濃度依存的にＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加していることを示している（＊＊ｐ＜０．００１）。
【0110】
実験例２：実施例のペプチド処理によるがん細胞生存率の変化
細胞は、生化学的恒常性を維持するとともに、ＡＤＰ－リボースの生成および分解の均衡を合わせており、がん細胞は、持続的に分裂して急激に成長するため、このような均衡が崩れる場合、正常細胞に比べて生存に大きく影響を受けることができる。
細胞は、生化学的恒常性を維持するとともに、ＡＤＰ－リボースの生成および分解の均衡を合わせており、がん細胞は、持続的に分裂して急激に成長するため、このような均衡が崩れる場合、正常細胞に比べて生存に大きく影響を受けることができる。
【0111】
前記実験例１の結果によると、本発明の実施例ペプチドをがん細胞に処理する場合、細胞内ＡＤＰ－リボースの量が顕著に増加するので、これを通じてがん細胞の恒常性均衡が崩れることある。よって、実験例２においては、実施例１～２８のペプチド処理によるがん細胞の生存率を測定した。
【0112】
２－１．Ｕ－８７ＭＧ細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0113】
図５の左上および図８の右上は、Ｕ－８７ＭＧ細胞に実施例１、１５、８および２２のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＵ－８７ＭＧ細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＵ－８７ＭＧ細胞の成長が抑制され、死滅している形態を観察することができる。特に、細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）が付着した実施例１５および２２のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0114】
２－２．Ｈ１９７５細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0115】
図５の右上および図９の左上は、Ｈ１９７５細胞に実施例２、１６、９、２３のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＨ１９７５細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＨ１９７５細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、ＣＰＰが付着した実施例１６および２３のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0116】
２－３．Ａｓｐｃ－１細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0117】
図６の左上および図９の右上は、Ａｓｐｃ－１細胞に実施例３、１７、１０、２４のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＡｓｐｃ－１細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＡｓｐｃ－１細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、細胞透過性ペプチドＣＰＰが付着した実施例１７および２４のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0118】
２－４．Ｈｅｐ Ｇ２細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨｅｐ Ｇ２細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨｅｐ Ｇ２細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0119】
図６の右上および図１０の左上は、Ｈｅｐ Ｇ２細胞に実施例４、１８、１１、２５のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＨｅｐ Ｇ２細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＨｅｐ Ｇ２細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、細胞透過性ペプチドＣＰＰが付着した実施例１８および２５のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0120】
２－５．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0121】
図７の左上および図１０の右上は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に実施例５、１９、１２、２６のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、ＣＰＰが付着した実施例１９および２６のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0122】
２－６．ＨＣＴ１１６細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0123】
図７の右上および図１１の左上は、ＨＣＴ１１６細胞に実施例６、２０、１３、２７のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＨＣＴ１１６細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＨＣＴ１１６細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、細胞透過性ペプチドＣＰＰが付着した実施例２０および２７のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0124】
２－７．Ｃａｋｉ－１細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0125】
図８の左上および図１１の右上は、Ｃａｋｉ－１細胞に実施例７、２１、１４、２８のペプチドをそれぞれ処理したグループと処理しないグループの代表的な顕微鏡写真である。共通的に、ペプチドを処理しないグループではＣａｋｉ－１細胞が急激に成長している形態を観察することができる一方、本発明の実施例ペプチドを処理したグループではＣａｋｉ－１細胞の成長が抑制されて死滅している形態を観察することができる。特に、ＣＰＰが付着した実施例２１および２８のペプチドを処理したグループではがん細胞が完全に死滅したことを確認した。
【0126】
２－８．ＳＮＵ－１細胞およびＯＶＣＡＲ－３細胞でＡＤＰ－リボース結合ペプチド処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＳＮＵ－１細胞またはＯＶＣＡＲ－３細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに９６時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＳＮＵ－１細胞またはＯＶＣＡＲ－３細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、何も処理しないか、１６μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに９６時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0127】
その結果、実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ処理したグループは、ＳＮＵ－１細胞およびＯＶＣＡＲ－３細胞の両方でがん細胞を殆ど死滅させることを確認した（図１２）。
【0128】
実験例３：実施例のペプチドおよび低濃度の抗がん剤併用処理によるがん細胞生存率の変化
既存の抗がん剤によるがん細胞生存の減少などで代表される抗がん効果は、ＡＤＰ－リボースのシグナルによって相乗することができるので、既存の抗がん剤を処理し、ＡＤＰ－リボースの蓄積を誘導すると、がん細胞に既存の抗がん剤を必要濃度以下で処理しても、相乗した抗がん効果を示すと期待した。前記実験例１で確認したように、本発明の実施例ペプチドは、がん細胞内でＡＤＰ－リボースの量を顕著に増加させるので、実験例３においては、実施例ペプチドと低濃度の抗がん剤を併用処理したとき、相乗した抗がん効果が示されるかを確認しようとした。
既存の抗がん剤によるがん細胞生存の減少などで代表される抗がん効果は、ＡＤＰ－リボースのシグナルによって相乗することができるので、既存の抗がん剤を処理し、ＡＤＰ－リボースの蓄積を誘導すると、がん細胞に既存の抗がん剤を必要濃度以下で処理しても、相乗した抗がん効果を示すと期待した。前記実験例１で確認したように、本発明の実施例ペプチドは、がん細胞内でＡＤＰ－リボースの量を顕著に増加させるので、実験例３においては、実施例ペプチドと低濃度の抗がん剤を併用処理したとき、相乗した抗がん効果が示されるかを確認しようとした。
【0129】
３－１．Ｕ－８７ＭＧ細胞で実施例ペプチドと低濃度ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）の併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１８ｍＭのベバシズマブ単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＵ－８７ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１８ｍＭのベバシズマブ単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0130】
その結果、Ｕ－８７ＭＧ細胞にベバシズマブを単独で処理したとき、全がん細胞の約４９％が生存していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、低濃度のベバシズマブでもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１３の左側）。
【0131】
３－２．Ｈ１９７５細胞で実施例ペプチドと低濃度オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）の併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１ｎＭのオシメルチニブ単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１ｎＭのオシメルチニブ単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0132】
その結果、Ｈ１９７５細胞に１ｎＭのオシメルチニブを単独で処理したとき、全がん細胞の約４９％が生存していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、低濃度のオシメルチニブでもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１３の右側）。
【0133】
３－３．Ａｓｐｃ－１細胞で実施例ペプチドと低濃度ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）の併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のａｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１μＭのゲムシタビン単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のａｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、１μＭのゲムシタビン単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0134】
その結果、ａｓｐｃ－１細胞にゲムシタビンを単独で処理したとき、全がん細胞の約５０％が生存していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、低濃度のゲムシタビンでもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１４の左側）。
【0135】
３－４．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で実施例ペプチドと低濃度ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）の併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、５０μＭのドセタキセル単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、５０μＭのドセタキセル単独、または０．２、１または８μＭ濃度の実施例１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0136】
その結果、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にドセタキセルを単独で処理したとき、全がん細胞の約５２％が生存していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、低濃度のドセタキセルでもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１４の右側）。
【0137】
実験例４：実施例のペプチドおよび放射線併用処理によるがん細胞生存率の変化
放射線治療は、遺伝物質の損傷による死滅作用を通じて抗がん効果を期待することができるが、がん細胞は、これを克服するために、ＡＤＰ－リボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と知られている工程を通じてＤＮＡの鎖を持続的に修復する。しかし、放射線照射による修復作用で一時的にのみ増加するＡＤＰ－リボースを持続的に蓄積されるように補助すると、耐性線量の放射線を照射しても、相乗した抗がん効果があると期待した。前記実験例１において確認したように、本発明の実施例ペプチドは、がん細胞内でＡＤＰ－リボースの量を顕著に増加させるので、実験例４においては、実施例ペプチドと耐性線量の放射線照射を併用した際に相乗した抗がん効果が示されるかを確認しようとした。
放射線治療は、遺伝物質の損傷による死滅作用を通じて抗がん効果を期待することができるが、がん細胞は、これを克服するために、ＡＤＰ－リボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と知られている工程を通じてＤＮＡの鎖を持続的に修復する。しかし、放射線照射による修復作用で一時的にのみ増加するＡＤＰ－リボースを持続的に蓄積されるように補助すると、耐性線量の放射線を照射しても、相乗した抗がん効果があると期待した。前記実験例１において確認したように、本発明の実施例ペプチドは、がん細胞内でＡＤＰ－リボースの量を顕著に増加させるので、実験例４においては、実施例ペプチドと耐性線量の放射線照射を併用した際に相乗した抗がん効果が示されるかを確認しようとした。
【0138】
４－１．Ｈ１９７５細胞で実施例ペプチドと耐性線量の放射線併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＨ１９７５細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0139】
その結果、Ｈ１９７５細胞に２Ｇｙ線量の放射線を単独で処理したとき、処理しないグループに対比してがん細胞の約７６％が生存する耐性を示していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、耐性線量の放射線照射でもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１５の左側）。
【0140】
４－２．Ａｓｐｃ－１細胞で実施例ペプチドと耐性線量の放射線併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＡｓｐｃ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１～１４のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0141】
その結果、Ａｓｐｃ－１細胞に２Ｇｙ線量の放射線を単独で処理したとき、処理しないグループに対比してがん細胞の約８６％が生存する耐性を示していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、耐性線量の放射線照射でもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１５の右側）。
【0142】
４－３．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で実施例ペプチドと耐性線量の放射線併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0143】
その結果、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に２Ｇｙ線量の放射線を単独で処理したとき、処理しないグループに対比してがん細胞の約８６％が生存する耐性を示していたが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、耐性線量の放射線照射でもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１６の左側）。
【0144】
４－４．Ｃａｋｉ－１細胞で実施例ペプチドと耐性線量の放射線併用処理による生存率の変化
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
９６－ウェルプレートに３×１０３個のＣａｋｉ－１細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した後、２Ｇｙ線量の放射線単独、または１．６または３．２μＭの配列番号１５～２８のペプチドと併用処理した。次いで３７℃、５％ＣＯ２条件でさらに２４時間培養した後、１０μｌの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド試薬を各ウェルに入れて、１時間反応させた。反応を終えた試薬を除去した後、ジメチルスルホキシドを各ウェルに２００μｌずつ入れた後、吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【0145】
その結果、Ｃａｋｉ－１細胞に２Ｇｙ線量の放射線を単独で処理したとき、処理しないグループに対比してがん細胞の約９６％が生存する耐性を示しているが、実施例ペプチドと併用処理したすべての場合に、耐性線量の放射線照射でもがん細胞の生存率が顕著に減少すると確認された（＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１６の右側）。
【0146】
実験例５：動物モデルを利用した実施例ペプチドの投与経路による抗がん効能効果比較および検証
５－１．実施例ペプチドを皮下経路に注射した動物モデルから腫瘍体積の変化
５週齢のｂａｌｂ／ｃヌードマウスにａｓｐｃ－１細胞（１×１０７）をマウスの脇腹後ろに接種し、無処理対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ皮下経路に注射する１５種群に分類した。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３まで成長したとき、各実施例ペプチドを週３回２０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。デジタルケリファーで腫瘍サイズを測定して、腫瘍体積の変化結果を群別に比較した。
５－１．実施例ペプチドを皮下経路に注射した動物モデルから腫瘍体積の変化
５週齢のｂａｌｂ／ｃヌードマウスにａｓｐｃ－１細胞（１×１０７）をマウスの脇腹後ろに接種し、無処理対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ皮下経路に注射する１５種群に分類した。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３まで成長したとき、各実施例ペプチドを週３回２０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。デジタルケリファーで腫瘍サイズを測定して、腫瘍体積の変化結果を群別に比較した。
【0147】
その結果、最終投薬後の対照群腫瘍の最終体積は約３１３６ｍｍ３に大きく成長したが、実施例１５～２８のペプチドをそれぞれ皮下経路に注射したすべての群では腫瘍の成長が顕著に抑制されることを確認した（＊＊ｐ＜０．００１；図１７）。
【0148】
図１８は、すべての群で剖検後に獲得した代表的な腫瘍写真を示したものであって、対照群と対比した際に本発明の実施例ペプチドを皮下注射したすべての群で腫瘍組織の成長が顕著に抑制されたことが観察された。
【0149】
５－２．実施例ペプチドを口腔投与経路に注射した動物モデルから腫瘍体積の変化
５週齢のｂａｌｂ／ｃヌードマウスにａｓｐｃ－１細胞（１×１０７）をマウスの脇腹後ろに接種し、無処理対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例１～１４のペプチドをそれぞれ口腔投与する１５種群に分類した。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３まで成長したとき、各実施例ペプチドを週５回２０ｍｇ／ｋｇの用量で口腔投与した。デジタルケリファーで腫瘍サイズを測定して、腫瘍体積の変化結果を群別に比較した。
５週齢のｂａｌｂ／ｃヌードマウスにａｓｐｃ－１細胞（１×１０７）をマウスの脇腹後ろに接種し、無処理対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例１～１４のペプチドをそれぞれ口腔投与する１５種群に分類した。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３まで成長したとき、各実施例ペプチドを週５回２０ｍｇ／ｋｇの用量で口腔投与した。デジタルケリファーで腫瘍サイズを測定して、腫瘍体積の変化結果を群別に比較した。
【0150】
その結果、最終投薬後の対照群腫瘍の最終体積は約３５１７ｍｍ３で大きく成長したが、実施例１～１４のペプチドをそれぞれ口腔投与したすべての群では腫瘍の成長が顕著に抑制されることを確認した（＊＊ｐ＜０．００１；図１９）。
【0151】
図２０は、すべての群で剖検後に獲得した代表的な腫瘍写真を示したものであって、対照群と対比した際に本発明の実施例ペプチドを口腔投与したすべての群で腫瘍組織の成長が顕著に抑制されたことが観察された。
【0152】
実験例６：実施例ペプチドの正常細胞での細胞毒性確認
次に、本発明のペプチドが正常細胞でも細胞毒性を示すか否かを追加で確認した。試験のために、正常細胞としてヒト大腸纖維芽細胞（ｃｏｌｏｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＣＣＤ－１８Ｃｏおよびヒト皮膚乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ）であるＨＤＰＣを使用し、本発明の実施例ペプチドとして、代表的に配列番号７のペプチドを使用した。
次に、本発明のペプチドが正常細胞でも細胞毒性を示すか否かを追加で確認した。試験のために、正常細胞としてヒト大腸纖維芽細胞（ｃｏｌｏｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＣＣＤ－１８Ｃｏおよびヒト皮膚乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ）であるＨＤＰＣを使用し、本発明の実施例ペプチドとして、代表的に配列番号７のペプチドを使用した。
【0153】
先ず、９６－ウェルプレートに５×１０３個の各正常細胞を接種した後、ＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した。各ウェルをペプチドを処理しないグループ（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）および配列番号７のペプチドを処理したグループ（それぞれ２５、５０および１００μＭ）に区分して実験を遂行した。
【0154】
実験結果、ペプチドを処理したすべてのグループ（処理後２４時間、４８時間または７２時間）で未処理対照群と有意な差を全く見出すことができなかった（図２１および図２２）。したがって、本発明の実施例のペプチドは、がん細胞では強力な抗がん活性を示す一方、正常細胞では全く細胞毒性を現わさないため、抗がん用途として非常に優れた効果を有するということを確認した。
【0155】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに、他の具体的な形態で実施され得ることを理解できるはずである。これと関連して、上述した実施例は、すべての面で例示的なものであって限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そして、その等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解析されなければならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】