▶ スージョウ チー バイオデザイン バイオテクノロジー カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】改善させたプライム編集システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240829BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240829BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
A01H1/00 A
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024514557
(86)(22)【出願日】2022-09-06
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 CN2022117258
(87)【国際公開番号】W WO2023030534
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】202111039979.X
(32)【優先日】2021-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522350368
【氏名又は名称】スージョウ チー バイオデザイン バイオテクノロジー カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓｕｚｈｏｕ Ｑｉ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】Ｕｎｉｔ Ｅ５９８， ５ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｌｅｃｈｅｎｇ Ｐｌａｚａ， Ｐｈａｓｅ ＩＩ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｎｏ． ２１８， Ｓａｎｇｔｉａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｓｕｚｈｏｕ Ａｒｅａ， Ｃｈｉｎａ （Ｊｉａｎｇｓｕ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５１２７， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ツァイシア ガオ
(72)【発明者】
【氏名】ユエン ヅォン
(57)【要約】
本発明は、改良したプライム編集システム及び前記システムでの遺伝子編集を実施するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムであって、ｉ）プライム編集融合タンパク質、及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、ここでプライム編集融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含み、
少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、融合タンパク質と複合体を形成し、融合タンパク質をゲノム内の標的配列に標的化することができ、その結果標的配列にニックを形成する、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システム。
【請求項2】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素又はその機能的バリアントである、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項4】
（ａ）逆転写酵素が、Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ２００Ｃのいずれか１つから選択される変異を含む、ここでアミノ酸位置は配列番号３に関する、（ｂ）逆転写酵素の関連配列が消失する、及び／又は
（ｃ）逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は消失する、
請求項１から３までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項5】
逆転写酵素が、配列番号９～１５のいずれか１つで示される配列を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はそれらの機能的バリアントが、Ｎ末端又はＣ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、又はインテグラーゼ（ＩＮ）と、融合タンパク質中で直接もしくはリンカーを介して融合される、請求項１から５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項7】
ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、又はプロテアーゼ（ＰＲ）が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、又はインテグラーゼ（ＩＮ）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
逆転写酵素が、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合し、かつ好ましくはＲＮａｓｅ Ｈドメインを消失させたＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の機能的フラグメントが、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合する、請求項６又は７に記載のシステム。
【請求項9】
ｐｅｇＲＮＡのガイド配列を、標的配列と十分な配列同一性を有するように配置し、塩基対形成によって標的配列の相補鎖に結合して、配列特的標的化を得ることができる、請求項１から８までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項10】
ｐｅｇＲＮＡの足場配列が、配列番号１７で示される配列を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項11】
プライマー結合配列が、標的配列の少なくとも一部に相補的であるように構成され、かつ好ましくは、プライマー結合配列が、ニックによって生じた３’遊離一本鎖の少なくとも一部に、特に３’遊離一本鎖の３’末端でヌクレオチド配列に相補的である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項12】
プライマー結合配列が、約１８～５２℃、好ましくは約２４～３６℃、より好ましくは約２８～３２℃、及び最も好ましくは約３０℃のＴｍ（融解温度）を有する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項13】
ＲＴ鋳型配列が、ニックの下流の配列に対応するように構成され、所望の改変を含み、かつ改変が、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は付加を含む、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項14】
プライム編集融合タンパク質が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のシステム。
【請求項15】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入し、それにより少なくとも１つの細胞のゲノム内の標的配列に改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え植物を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子操作の分野に関する。特に、本発明は、改善させたプライム編集システム及びプライム編集システムでの遺伝子編集方法に関する。
【0002】
背景技術
多くの重要な農業的形質はゲノム内の配列に依存する。ゲノムの特定の配列を方向的に変えることにより、新たな遺伝形質を生物に付与する可能性があり、病気の治療及び品種改良の可能性をも提供する。現在、特定の配列の編集は、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術）により達せられてよく、細胞の修復経路が活性化されて傷害部位を修復される。プライム編集（ＰＥ）システムは、標的部位の配列を正確に変更できるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術に基づくシステムである。このシステムは次の２つの部分から構成される：１）非標的鎖ニッキング活性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ）と逆転写酵素（ＲＴ）とを含む融合タンパク質、及び２）修復鋳型（ＲＴ鋳型）と３’末端の遊離一本鎖のプライマー結合部位（ＰＢＳ）とを有するｐｅｇＲＮＡ（プライム編集ｇＲＮＡ）。このシステムの動作原理は、ＰＢＳが、Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａによって生じた遊離一本鎖に結合して融合タンパク質を誘導して指定した部位に結合すること、指定した変異を含む一本鎖ＤＮＡ配列を、所与のＲＴ鋳型に従って転写すること、かつ標的部位に位置するゲノム内のＤＮＡ配列のあらゆる変更を達することができることである。
多くの重要な農業的形質はゲノム内の配列に依存する。ゲノムの特定の配列を方向的に変えることにより、新たな遺伝形質を生物に付与する可能性があり、病気の治療及び品種改良の可能性をも提供する。現在、特定の配列の編集は、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術）により達せられてよく、細胞の修復経路が活性化されて傷害部位を修復される。プライム編集（ＰＥ）システムは、標的部位の配列を正確に変更できるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術に基づくシステムである。このシステムは次の２つの部分から構成される：１）非標的鎖ニッキング活性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ）と逆転写酵素（ＲＴ）とを含む融合タンパク質、及び２）修復鋳型（ＲＴ鋳型）と３’末端の遊離一本鎖のプライマー結合部位（ＰＢＳ）とを有するｐｅｇＲＮＡ（プライム編集ｇＲＮＡ）。このシステムの動作原理は、ＰＢＳが、Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａによって生じた遊離一本鎖に結合して融合タンパク質を誘導して指定した部位に結合すること、指定した変異を含む一本鎖ＤＮＡ配列を、所与のＲＴ鋳型に従って転写すること、かつ標的部位に位置するゲノム内のＤＮＡ配列のあらゆる変更を達することができることである。
【0003】
現在の研究は、ＰＥの全体的な編集効率が低く、種々の側面で改善が必要であることを示している。Ｍ－ＭＬＶタンパク質を改変すること又は他の関連タンパク質と融合することによりＰＥタンパク質の安定性又は発現を改善することは、ＰＥ編集効率を改善するための効果的な方法である。
【0004】
発明の要約
本発明は、ｉ）逆転写酵素の点突然変異、又は冗長ドメイン、例えば逆転写酵素からのＲＮａｓｅ Ｈドメインの欠失、ｉｉ）逆転写酵素とヌクレオカプシドタンパク質ＮＣとの融合、又はｉ）とｉｉ）との組み合わせによる、プライム編集効率の改善に関する。
本発明は、ｉ）逆転写酵素の点突然変異、又は冗長ドメイン、例えば逆転写酵素からのＲＮａｓｅ Ｈドメインの欠失、ｉｉ）逆転写酵素とヌクレオカプシドタンパク質ＮＣとの融合、又はｉ）とｉｉ）との組み合わせによる、プライム編集効率の改善に関する。
【0005】
本発明は、次の実施形態を少なくとも含む。
【0006】
実施形態１： 植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムであって、
ｉ）プライム編集融合タンパク質、及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、ここで、プライム編集融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含み、
少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、融合タンパク質と複合体を形成し、融合タンパク質をゲノム内の標的配列に標的化することができ、その結果標的配列にニックが形成される、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システム。
ｉ）プライム編集融合タンパク質、及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、ここで、プライム編集融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含み、
少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、融合タンパク質と複合体を形成し、融合タンパク質をゲノム内の標的配列に標的化することができ、その結果標的配列にニックが形成される、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システム。
【0007】
実施形態２： ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ９ニッカーゼである、実施形態１に記載のシステム。
【0008】
実施形態３： 逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素又はその機能的バリアントである、実施形態１又は２に記載のシステム。
【0009】
実施形態４： （ａ）逆転写酵素が、Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ２００Ｃのいずれか１つから選択される変異を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号３に関する、
（ｂ）逆転写酵素の関連配列（connection sequence）が欠失する、及び／又は
（ｃ）逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は欠失する、
実施形態１から３までのいずれかに記載のシステム。
（ｂ）逆転写酵素の関連配列（connection sequence）が欠失する、及び／又は
（ｃ）逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は欠失する、
実施形態１から３までのいずれかに記載のシステム。
【0010】
実施形態５： 逆転写酵素が、配列番号９～１５のいずれか１つで示される配列を含む、実施形態４に記載のシステム。
【0011】
実施形態６： 逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はそれらの機能的バリアントが、Ｎ末端又はＣ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、又はインテグラーゼ（ＩＮ）と、融合タンパク質中で直接もしくはリンカーを介して融合する、実施形態１から５のいずれかに記載のシステム。
【0012】
実施形態７： ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、又はプロテアーゼ（ＰＲ）が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、又はインテグラーゼ（ＩＮ）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載のシステム。
【0013】
実施形態８： 逆転写酵素が、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合し、かつ好ましくはＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠失させたＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の機能的フラグメントが、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合する、実施形態６又は７に記載のシステム。
【0014】
実施形態９： ｐｅｇＲＮＡのガイド配列が、標的配列と十分な配列同一性を有するように構成され、したがって、塩基対形成によって標的配列の相補鎖に結合して、配列特的標的化を得ることができる、実施形態１から８までのいずれかに記載のシステム。
【0015】
実施形態１０： ｐｅｇＲＮＡの足場配列が、配列番号１７で示される配列を含む、実施形態１から９までのいずれかに記載のシステム。
【0016】
実施形態１１： プライマー結合配列が、標的配列の少なくとも一部に相補的であるように構成され、かつ好ましくは、プライマー結合配列が、ニックによって生じた３’遊離一本鎖の少なくとも一部に、特に３’遊離一本鎖の３’末端でヌクレオチド配列に相補的である、実施形態１から１０までのいずれかに記載のシステム。
【0017】
実施形態１２： プライマー結合配列が、約１８～５２℃、好ましくは約２４～３６℃、より好ましくは約２８～３２℃、及び最も好ましくは約３０℃のＴｍ（融解温度）を有する、実施形態１から１１までのいずれかに記載のシステム。
【0018】
実施形態１３： ＲＴ鋳型配列が、ニックの下流の配列に対応するように構成され、所望の改変を含み、かつ改変が、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は付加を含む、実施形態１から１２までのいずれかに記載のシステム。
【0019】
実施形態１４： プライム編集融合タンパク質が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１３までのいずれかに記載のシステム。
【0020】
実施形態１５： 実施形態１から１４のいずれかに記載のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入し、それにより少なくとも１つの細胞のゲノム内の標的配列に改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え植物を生産する方法。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図3】図３は、改善させた編集効率を有するスクリーニング済み構築物ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ＮＣｖ２、及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ ＨをｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換した後にアンプリコン配列解析によって得られた種々の内因性試験部位に対するプライム編集システムの編集効率を示す。
【図4】図４は、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、及び融合ＮＣと欠失ＲＮａｓｅ Ｈとの双方を組み合わせて構築した構築物ｅＰＰＥを、ｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞にそれぞれ同時形質転換した後にアンプリコン配列解析によって得られた種々の内因性試験部位に対するプライム編集システムの編集効率を示す。
【0022】
発明の詳細な説明
Ｉ． 定義
本発明において、特に明記されない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者に通常理解される意味を示す。また、本明細書において使用される用語及び実験法は、タンパク質及びヌクレオチド化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学、専門用語に属する全て、及び当該技術分野において一般に使用される慣用的な方法に関する。例えば、本明細書において使用される標準ＤＮＡ組換え及び分子クローニング技術は、当業者に周知であり、かつ以下の文献において詳細に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９。その一方で、関連する専門用語について本発明、定義及び実施例をより良く理解するために、以下を提供する。
Ｉ． 定義
本発明において、特に明記されない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者に通常理解される意味を示す。また、本明細書において使用される用語及び実験法は、タンパク質及びヌクレオチド化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学、専門用語に属する全て、及び当該技術分野において一般に使用される慣用的な方法に関する。例えば、本明細書において使用される標準ＤＮＡ組換え及び分子クローニング技術は、当業者に周知であり、かつ以下の文献において詳細に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９。その一方で、関連する専門用語について本発明、定義及び実施例をより良く理解するために、以下を提供する。
【0023】
本明細書において使用される場合に、「及び／又は」という用語は、その用語によって接続される項目の全ての組み合わせを包含し、それぞれの組み合わせは、本明細書に個別に列挙されているものとしてみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ」、「Ａ及びＢ」、並びに「Ｂ」を含む。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、及び「Ａ及びＢ及びＣ」を含む。
【0024】
「含む」という用語がタンパク質又は核酸の配列を説明するために本明細書において使用される場合に、タンパク質又は核酸は、その配列からなってよく、又はタンパク質もしくは核酸の一方もしくは双方の末端に追加のアミノ酸又はヌクレオチドを有してよいが、依然として本発明に記載の活性を有する。さらに、当業者にとって、ポリペプチドのＮ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンが、特定の実際の条件下（例えば、特定の発現系で発現させる場合）で保持されるが、ポリペプチドの機能に実質的に影響を与えないことは公知である。したがって、本願の明細書及び特許請求の範囲において特定のポリペプチドのアミノ酸配列を記載する場合に、Ｎ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンは含まれない可能性があるが、メチオニンを含む配列も包含され、それに対応して、そのコードヌクレオチド配列も開始コドンを含んでよく、逆もまた同じである。
【0025】
本明細書において使用される「ゲノム」は、核に存在する染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えば、ミトコンドリア、色素体）に存在する細胞小器官ＤＮＡも含む。
【0026】
本明細書において使用される場合に、「生物」は、ゲノム編集に適したあらゆる生物、好ましくは真核生物を含む。生物の例は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、及びネコ；家禽類、例えばニワトリ、アヒル、及びガチョウ；単子葉植物及び双子葉植物、例えばイネ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、大麦、大豆、落花生、及びシロイヌナズナを含むが、これらに限定されない。
【0027】
「遺伝子組換え生物」は、外因性ポリヌクレオチドを含む生物、又はそのゲノム内で改変した遺伝子もしくは発現調節配列を含む生物を意味する。例えば、外因性ポリヌクレオチドは、生物のゲノムに安定して組み込まれ、連続する世代に受け継がれうる。外因性ポリヌクレオチドは、ゲノムのみに組み込まれてよく、又は組換えＤＮＡ構築物の一部として組み込まれてよい。改変した遺伝子又は発現調節配列は、生物ゲノムにおいて１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び付加を含む遺伝子又は発現調節配列である。
【0028】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「核酸フラグメント」は、互換的に使用でき、一本鎖又は二本鎖であり、任意に合成、非天然又は変更したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーをいう。ヌクレオチドは、以下のようにそれらの一文字表記によって示される：（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡについて）アデニレート又はデオキシアデニレートについて「Ａ」、シチジレート又はデオキシシチジレートについて「Ｃ」、グアニレート又はデオキシグアニレートについて「Ｇ」、ウリジレートについて「Ｕ」、デオキシチミジレートについて「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）について「Ｙ」、Ｇ又はＴについて「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴについて「Ｈ」、Ａ、Ｔ又はＧについて「Ｄ」、イノシンについて「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドについて「Ｎ」。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用でき、アミノ酸残基のポリマーをいう。前記用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、及び天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」という用語は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化を含むがこれらに制限されない改変も含まれる。
【0029】
本明細書において使用される場合に、「発現構築物」は、生物における目的のヌクレオチド配列の発現に適したベクター、例えば組換えベクターをいう。「発現」は、機能的生成物の生成をいう。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（例えばｍＲＮＡ又は機能性ＲＮＡを生成するために転写すること）及び／又はタンパク質前駆体又は成熟タンパク質へのＲＮＡの翻訳を示しうる。
【0030】
本発明の「発現構築物」は、直鎖核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクター、又はある実施形態においては翻訳されうるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって生成されるｍＲＮＡであってよい。
【0031】
本発明の「発現構築物」は、異なる源に由来する目的の調節配列及びヌクレオチド配列、又は同一の源に由来するが通常天然に見出される異なる方法で配置された目的の調節配列又はヌクレオチド配列を含んでよい。
【0032】
「プロモーター」は、他の核酸フラグメントの転写を制御することが出来る核酸フラグメントを示す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターは、細胞に由来するか否かに関わらず、細胞内の遺伝子の転写を制御することができるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター又は組織特異性プロモーター又は発生調節プロモーター又は誘導性プロモーターであってよい。
【0033】
プロモーターの例は、ポリメラーゼ（ｐｏｌ）Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含むが、これらに限定されない。ｐｏｌ Ｉプロモーターの例は、ニワトリＲＮＡ ｐｏｌ Ｉプロモーターを含む。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＲＳＶ－ＬＴＲ）プロモーター、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）最初期プロモーターを含むが、これらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、Ｕ６及びＨ１プロモーターを含む。誘導性プロモーター、例えばメタロチオネインプロモーターを使用してよい。プロモーターの他の例は、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、Ｔ３バクテリオファージプロモーター、β－ガラクトシダーゼプロモーター及びＳｐ６バクテリオファージプロモーター等を含む。植物に使用する場合に、使用できるプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉ－１プロモーター、小麦Ｕ６プロモーター、イネＵ３プロモーター、トウモロコシＵ３プロモーター、イネアクチンプロモーター等を含むが、これらに限定されない。
【0034】
生物への核酸分子（例えば、プラスミド、直鎖状核酸フラグメント、ＲＮＡなど）又はタンパク質の「導入」は、核酸又はタンパク質を使用して、生物の細胞を形質転換させ、核酸又はタンパク質が細胞内で機能することを意味する。本発明において使用される場合に、「形質転換」は、安定な形質転換及び一過性形質転換の双方を含む。「安定な形質転換」は、外来遺伝子の安定な遺伝をもたらす、ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の導入をいう。一度安定に形質転換されると、外因性核酸配列は、生物のゲノム及び任意のその連続世代に安定に組み込まれる。「一過性形質転換」は、外来遺伝子の安定な遺伝を有さないその機能を実行する、細胞への核酸分子又はタンパク質の導入をいう。一過性形質転換において、外因性核酸配列は、ゲノムに組み込まれない。
【0035】
「形質」は、細胞又は生物の生理学的、形態学的、生化学的、又は物理的特性を示す。
【0036】
ＩＩ． 改善したプライム編集システム
一態様において、本発明は、生物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムであって、
ｉ）プライム編集融合タンパク質及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、プライム編集融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む、発現構築物；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含む、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムに関する。
一態様において、本発明は、生物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムであって、
ｉ）プライム編集融合タンパク質及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、プライム編集融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む、発現構築物；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含む、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムに関する。
【0037】
いくつかの実施形態において、プライム編集融合タンパク質中のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素は、リンカーを介して連結される。
【0038】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡは、融合タンパク質と複合体を形成し、融合タンパク質をゲノム内の標的配列に標的化して、標的配列にニックをもたらすことができる。
【0039】
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含むプライム編集融合タンパク質に関する。
【0040】
一態様において、本発明は、生物ゲノムのＤＮＡ配列の標的改変における本発明のプライム編集融合タンパク質の使用に関する。
【0041】
いくつかの実施形態において、生物は植物である。
【0042】
本明細書において使用する場合に、「プライム編集システム」は、細胞内のゲノムの逆転写に基づくゲノム編集に必要な構成要素の組み合わせをいう。システムの個々の構成要素、例えばプライム編集融合タンパク質、ｇＲＮＡなどは、互いに独立して存在してよく、又は組成物として任意の組み合わせで存在してよい。
【0043】
本明細書において使用する場合に、「標的配列」は、ゲノム中の約２０ヌクレオチド長である配列をいい、５’又は３’の隣接ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列によって表される。一般に、ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその変異体及びガイドＲＮＡによって形成される複合体によって標的配列を認識するために要求される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びその変異体について、標的配列は、３’末端でＰＡＭ、例えば５’－ＮＧＧ－３’に近接している。ＰＡＭの存在に基づいて、当業者は、ゲノム内で標的化に利用できる標的配列を容易に決定してよい。さらに、ＰＡＭの位置に応じて、標的配列はゲノムＤＮＡ分子の任意の鎖に位置してよい。Ｃａｓ９又はその誘導体、例えばＣａｓ９ニッカーゼについて、標的配列は好ましくは２０ヌクレオチド長である。
【0044】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質中のＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ゲノムＤＮＡ中の標的配列内にニックを形成できる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
【0045】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）ＳｐＣａｓ９に由来し、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して少なくともアミノ酸置換Ｈ８４０Ａを含む。例示的な野生型ＳｐＣａｓ９は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質中のＣａｓ９ニッカーゼは、標的配列のＰＡＭの－３位ヌクレオチド（それぞれのＰＡＭ配列の５’末端の最初のヌクレオチドは＋１部位のヌクレオチドとみなされる）と－４位ヌクレオチドとの間にニックを形成できる。
【0046】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、改変したＰＡＭ配列を認識することができるＣａｓ９ニッカーゼバリアントである。改変したＰＡＭ配列を認識できる種々のＣａｓ９ニッカーゼバリアントは当技術分野において公知である。いくつかの好ましい実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＰＡＭ配列５’－ＮＧ－３’を認識するＣａｓ９ニッカーゼバリアントである。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列５’－ＮＧ－３’を認識するＣａｓ９ニッカーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９に対して、次のアミノ酸置換Ｈ８４０Ａ、Ｒ１３３５Ｖ、Ｌ１１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ及びＴ１３３７Ｒを含み、ここでアミノ酸のナンバリングは配列番号１に関する。
【0047】
本発明のＣａｓ９ニッカーゼによって形成されるニックは、標的配列に３’末端で遊離一本鎖（３’遊離一本鎖）及び５’末端で遊離一本鎖（５’遊離一本鎖）を形成することができる。
【0048】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質中の逆転写酵素は、異なる供給源に由来してよい。いくつかの実施形態において、逆転写酵素はウイルス由来の逆転写酵素である。例えば、いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素又はその機能的バリアントである。例示的な野生型Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素配列を配列番号３に示す。
【0049】
いくつかの実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントは、
（ａ）１５５、１５６、２００及び／又は５２４のいずれか１つから選択される位置に変異を含み、例えば、Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ２００Ｃ又はそれらの組み合わせのいずれか１つから選択される変異を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号３に関し、
（ｂ）関連配列が欠失し、及び／又は
（ｃ）ＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は欠失している。
（ａ）１５５、１５６、２００及び／又は５２４のいずれか１つから選択される位置に変異を含み、例えば、Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ２００Ｃ又はそれらの組み合わせのいずれか１つから選択される変異を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号３に関し、
（ｂ）関連配列が欠失し、及び／又は
（ｃ）ＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は欠失している。
【0050】
いくつかの好ましい実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントは、Ｄ５２４Ｎから選択される変異を含み、アミノ酸位置は配列番号３に関する。
【0051】
いくつかの好ましい実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントのＲＮａｓｅ Ｈドメインが欠失される。
【0052】
いくつかの実施形態において、関連配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む。
【0053】
いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む。
【0054】
いくつかの実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントは、配列番号９～１５のいずれか１つで示される配列を含む。
【0055】
いくつかの実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はそれらの機能的バリアントは、Ｎ末端又はＣ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、又はインテグラーゼ（ＩＮ）と、融合タンパク質中で直接もしくはリンカーを介して融合される。ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、又はインテグラーゼ（ＩＮ）は、例えばＭ－ＭＬＶに由来する。
【0056】
いくつかの実施形態において、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む。
【0057】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ（ＰＲ）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む。
【0058】
いくつかの実施形態において、インテグラーゼ（ＩＮ）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【0059】
いくつかの好ましい実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントは、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合する。
【0060】
いくつかの好ましい実施形態において、逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はその機能的バリアントは、Ｃ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合する。
【0061】
本明細書において使用される場合に、「リンカー」は、長さが１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２０～２５又は２５～５０）又はそれ以上のアミノ酸であり、二次構造以上の構造を含まない非機能性アミノ酸配列であってよい。例えば、リンカーは、可動性リンカー、例えばＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰ、（ＧＧＧＧＳ）ｘ３、ＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｘ７等であってよい。例えば、リンカーは配列番号６で示されるリンカーであってよい。
【0062】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質中のＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、逆転写酵素のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質中のＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、逆転写酵素のＣ末端に位置する。
【0063】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含んでよい。一般に、融合タンパク質中の１つ以上のＮＬＳは、その編集機能を実現できる量の細胞の核への融合タンパク質の蓄積を促進するために十分な強度を有していなければならない。一般に、核局在化活性の強度は、融合タンパク質中のＮＬＳの数、融合タンパク質中のＮＬＳの位置、融合タンパク質に使用される１つ以上の特定のＮＬＳ、又はこれらの因子の組み合わせによって決定される。
【0064】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む。
【0065】
本発明の少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡにおけるガイド配列（シード配列又はスペーサー配列とも言われる）は、塩基対形成を介して標的配列の相補鎖に結合することによって配列特異的標的化を達成できるように、標的配列に対して十分な配列同一性（好ましくは１００％の同一性）を有するように構成される。
【0066】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に基づくゲノム編集に適しているｇＲＮＡの様々な足場配列は、当技術分野において公知であり、本発明のｐｅｇＲＮＡにおいて使用してよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの足場配列は配列番号１７で示される。
【0067】
いくつかの実施形態において、プライマー結合配列は、標的配列の少なくとも一部に相補的である（好ましくは、標的配列の少なくとも一部と完全に対合する）ように構成されており、好ましくは、プライマー結合配列は、標的配列が位置するＤＮＡ鎖におけるニックによって生じる３’遊離一本鎖の少なくとも一部に相補的であり（好ましくは３’遊離一本鎖の少なくとも一部と完全に対合し）、特に、３’遊離一本鎖の３’末端のヌクレオチド配列に相補的である（好ましくは完全に対合している）。鎖の３’遊離一本鎖が塩基対形成によってプライマー結合配列に結合すると、３’遊離一本鎖はプライマーとして機能し、かつプライマー結合配列に隣接する逆転写（ＲＴ）鋳型配列は、融合タンパク質における逆転写酵素による逆転写のための鋳型として機能し、かつ逆転写（ＲＴ）鋳型配列に対応するＤＮＡ配列は伸長によって得られる。
【0068】
プライマー結合配列は、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼによって標的配列内に形成された遊離一本鎖の長さに依存するが、特異的結合を確実にできる最小限の長さを有さなければならない。いくつかの実施形態において、プライマー結合配列は、４～２０ヌクレオチド長、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０ヌクレオチド長であってよい。
【0069】
いくつかの実施形態において、プライマー結合配列は、約５２℃以下のＴｍ（融解温度）を有するように構成される。いくつかの実施形態において、プライマー結合配列のＴｍ（融解温度）は、約１８℃～５２℃、好ましくは約２４℃～３６℃、より好ましくは約２８℃～３２℃、最も好ましくは約３０℃である。
【0070】
核酸配列のＴｍを計算するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌオンライン分析ツールを計算のために使用してよい。計算式の例は、Ｔｍ＝ＮG:C ＊＜４＋ＮA:T ＊＜２であり、ここで、ＮG:Cは配列中のＧ塩基及びＣ塩基の数であり、ＮA:Tは配列中のＡ塩基及びＴ塩基の数である。適したＴｍは、適したＰＢＳ長を選択することにより得られてよい。代わりに、適切なＴｍは、適切な標的配列を選択することにより得られてよい。
【0071】
いくつかの実施形態において、ＲＴ鋳型配列は、任意の配列であってよい。上記逆転写により、その配列情報は、標的配列が存在するＤＮＡ鎖（すなわち、標的配列のＰＡＭを含む鎖）に組み込まれてよく、そして、ＲＴ鋳型の配列情報を含むＤＮＡ二本鎖が、細胞のＤＮＡ修復によって形成される。いくつかの実施形態において、ＲＴ鋳型配列は、所望の改変を含む。例えば、所望の改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
【0072】
いくつかの実施形態において、ＲＴ鋳型配列は、標的配列のニックの下流の配列に対応する（例えば、標的配列のニックの下流の配列の少なくとも一部に相補的である）ように構成され、かつ所望の改変を含む。例えば、所望の改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
【0073】
いくつかの実施形態において、ＲＴ鋳型配列は、約１～３００ヌクレオチド長以上、例えば１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、約１０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、約４０ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約７５ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１２５ヌクレオチド長、約１５０ヌクレオチド長、約１７５ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約２２５ヌクレオチド長、約２５０ヌクレオチド長、約２７５ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長又はそれ以上のヌクレオチド長であってよい。好ましくは、ＲＴ鋳型配列は、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長及び２３ヌクレオチド長である。
【0074】
いくつかの実施形態でにおいて、プライム編集システムは、ニッキングｇＲＮＡ（ニッキングｇＲＮＡは追加のニックを生成するために使用される）及び／又はニッキングｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物をさらに含み、ここでニッキングｇＲＮＡは、ガイド配列及び足場配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ニッキングｇＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）鋳型配列及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含まない。
【0075】
本発明のニッキングｇＲＮＡにおけるガイド配列（シード配列又はスペーサー配列とも言われる）は、ゲノム中のニッキング標的配列に対して十分な配列同一性（好ましくは１００％の同一性）を有するように構成されており、その結果、本発明の融合タンパク質が、ニッキング標的配列を標的としてニッキング標的配列にニックをもたらし、その際、ニッキング標的配列及びｐｅｇＲＮＡによって標的化される標的配列（ｐｅｇＲＮＡ標的配列）は、ゲノムＤＮＡの逆鎖に位置する。いくつかの実施形態において、ニッキングＲＮＡによって形成されるニックとｐｅｇＲＮＡによって形成されるニックは、約１～約３００ヌクレオチド以上離れており、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド又はそれ以上離れている。いくつかの実施形態において、ニッキングＲＮＡによって形成されるニックは、ｐｅｇＲＮＡによって形成されるニックの上流又は下流に位置する（上流又は下流とは、ｐｅｇＲＮＡ標的配列が位置するＤＮＡ鎖をいう）。いくつかの実施形態において、ニッキングｇＲＮＡ中のガイド配列は、編集事象が発生した後の反対鎖上のｐｅｇＲＮＡ標的配列（改変したｐｅｇＲＮＡ標的配列）に対して十分な配列同一性（好ましくは１００％の同一性）を有し、その結果、ニッキングｇＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ誘発配列ターゲティング及び改変の後に生じるニッキング標的配列のみを標的とする。いくつかの実施形態において、ニッキング標的配列のＰＡＭは、ｐｅｇＲＮＡ標的配列の相補配列内に位置する。
【0076】
いくつかの実施形態において、ｐｅｇＲＮＡ及び／又はニッキングｇＲＮＡの配列は、自己プロセシングシステムを使用することによって正確にプロセシングされてよい。いくつかの特定の実施形態において、ｐｅｇＲＮＡ及び／又はニッキングｇＲＮＡの５’末端は、第１のリボザイムの３’末端に連結され、ここで第１のリボザイムは、ｐｅｇＲＮＡ及び／又はニッキングｇＲＮＡの５’末端で融合体を切断するように設計されており、かつ／又はｐｅｇＲＮＡ及び／又はニッキングｇＲＮＡの３’末端が第２のリボザイムの５’末端に連結されており、ここで第２のリボザイムは、ｐｅｇＲＮＡ及び／又はニッキングｇＲＮＡの３’末端で融合体を切断するように設計されている。第１又は第２のリボザイムの設計は、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｇａｏら、ＪＩＰＢ，ａｐｒ，２０１４；Ｖｏｌ ５６，Ｉｓｓｕｅ ４，３４３－３４９を参照されたい。ｇＲＮＡを正確にプロセシングする方法については、例えば、国際公開第２０１８／１４９４１８号を参照されたい。
【0077】
いくつかの実施形態において、プライム編集システムは、少なくとも１対のｐｅｇＲＮＡ、及び／又は少なくとも１対のｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を含む。いくつかの実施形態において、ｐｅｇＲＮＡ対のうちの２つのｐｅｇＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの同一の鎖上の異なる標的配列を標的とするように構成される。いくつかの実施形態において、ｐｅｇＲＮＡ対のうちの２つのｐｅｇＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの異なる鎖上の標的配列を標的とするように構成される。いくつかの実施形態において、ｐｅｇＲＮＡ対の一方のｐｅｇＲＮＡの標的配列のＰＡＭはセンス鎖上に位置し、他方のｐｅｇＲＮＡのＰＡＭはアンチセンス鎖上に位置する。いくつかの実施形態において、２つのｐｅｇＲＮＡの誘導されたニックは、それぞれ改変される部位の両側に位置する。いくつかの実施形態において、センス鎖のｐｅｇＲＮＡ誘導ニックは、改変される部位の上流（５’方向）に位置し、かつアンチセンス鎖のｐｅｇＲＮＡ誘導ニックは、改変される部位の下流（３’方向）に位置する。「上流」又は「下流」とは、センス鎖をいう。いくつかの実施形態において、２つのｐｅｇＲＮＡによって誘導されるニックは、約１～約３００ヌクレオチド以上離れており、例えば、１～１５ヌクレオチド離れている。
【0078】
いくつかの実施形態においては、ｐｅｇＲＮＡ対における２つのｐｅｇＲＮＡは、同一の所望の改変を導入するように構成される。例えば、一方のｐｅｇＲＮＡはセンス鎖にＡからＧへの置換を導入するように構成され、もう一方のｐｅｇＲＮＡはアンチセンス鎖の対応する位置にＴからＣへの置換を導入するように構成されている。他の例として、一方のｐｅｇＲＮＡはセンス鎖に２つのヌクレオチド欠失を導入するように構成され、もう一方のｐｅｇＲＮＡは同様にアンチセンス鎖の対応する位置に２つのヌクレオチド欠失を導入するように構成されている。他のタイプの改変を同様の方法で行ってよい。適切なＲＴ鋳型配列の設計は、２つの異なる鎖を標的とするｐｅｇＲＮＡを、同一の所望の改変を達成できるようにする。
【0079】
いくつかの実施形態において、本発明のｐｅｇＲＮＡは、ｅｐｅｇＲＮＡである。ｅｐｅｇＲＮＡの構築物は、Ｊａｍｅｓ Ｗ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｅｇＲＮＡｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ４０，４０２－４１０（２０２２）（参照を持って本明細書に組み込まれたものとする）を参照してよい。いくつかの実施形態において、ｅｐｅｇＲＮＡは、３’－ｔｅｖｏｐｒｅＱ１－８ｎｔリンカー改変を有するｅｐｅｇＲＮＡである。
【0080】
異なる生物において効率的な発現を得るために、本発明のいくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ゲノムが改変されるべき生物種に対してコドン最適化をうける。
【0081】
コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンを有する天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）を置換することにより、目的の宿主細胞における発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを示す。種々の種が、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定のバイアスを示す。種々の種が、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン利用における差異）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これはとりわけ翻訳されるコドンの性質及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整されてよい。コドン使用表は、例えばwww. kazusa. orjp/codon/で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（コドン使用データベース）」で容易に入手でき、前記表は、多くの方法で適合されてよい。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙら、“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。
【0082】
ＩＩＩ． 細胞ゲノムにおいて標的配列を改変するための方法
他の態様において、本発明は、本発明のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入し、少なくとも１つの細胞のゲノム内の標的配列に改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え細胞を生産する方法を提供する。改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
他の態様において、本発明は、本発明のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入し、少なくとも１つの細胞のゲノム内の標的配列に改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え細胞を生産する方法を提供する。改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
【0083】
他の態様において、本発明は、本発明のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入することを含む、遺伝子組換え細胞を生産する方法も提供する。
【0084】
他の態様において、本発明は、本発明の方法によって生産した遺伝子組換え細胞、及び細胞の子孫を含む遺伝子組み換え生物も提供する。
【0085】
本発明において、改変されるべき標的配列は、ゲノム内、例えば機能的遺伝子内、例えばタンパク質をコードする遺伝子内の任意の位置に位置してよく、又は、例えば遺伝子発現調節領域、例えばプロモーター領域又はエンハンサー領域に配置してよく、それにより、遺伝子の機能改変又は遺伝子発現改変が達せられる。細胞の標的配列における改変は、Ｔ７ＥＩ、ＰＣＲ／ＲＥ又はシーケンシング法によって検出されうる。
【0086】
本発明の方法において、プライム編集システムは、当業者に周知の種々の方法により細胞に導入されてよい。
【0087】
本発明のプライム編集システムを細胞に導入するために使用できる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス感染（例えば、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及び他のウイルス）、遺伝子銃法、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換を含むが、これらに限定されない。
【0088】
本発明の方法によって遺伝子編集されてよい細胞は、例えば、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、及びネコ；家禽類、例えばニワトリ、アヒル、及びガチョウ；及び単子葉植物及び双子葉植物を含む植物、例えばイネ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、大麦、大豆、落花生、及びシロイヌナズナに由来してよい。
【0089】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。例えば、細胞は、単離した細胞、又は単離した組織もしくは器官における細胞である。
【0090】
いくつかの他の実施形態において、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよい。例えば、細胞は、生物内の細胞であり、本発明のシステムが、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばウイルス又はアグロバクテリウム媒介法によって導入されうる。
【0091】
ＩＶ． 遺伝子改変した植物を製造する方法
他の態様において、本発明は、本発明のプライム編集システムを少なくとも１つの植物に導入し、少なくとも１つの植物のゲノムに改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え植物を生産する方法を提供する。改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
他の態様において、本発明は、本発明のプライム編集システムを少なくとも１つの植物に導入し、少なくとも１つの植物のゲノムに改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え植物を生産する方法を提供する。改変は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む。例えば、改変は、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＣからＡへの置換、ＧからＴへの置換、ＧからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＴからＣへの置換、ＴからＧへの置換及びＴからＡへの置換から選択される１つ以上の置換を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１～約１００ヌクレオチド以上の欠失、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの欠失を含み；及び／又は１ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１から約１００以上のヌクレオチドの挿入、例えば１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド以上の挿入、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドの挿入を含む。
【0092】
いくつかの実施形態において、前記方法は、少なくとも１つの植物から所望の改変を有する植物をスクリーニングするステップを含む。
【0093】
本発明の方法において、プライム編集システムは、当業者に周知の種々の方法で植物に導入されてよい。本発明のゲノム編集システムを植物に導入するために使用される方法は、遺伝子銃法、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、花粉管経路、及び子房注入法を含むが、これらに制限されない。好ましくは、プライム編集システムは、一過性形質転換によって植物に導入される。本発明の方法において、ゲノムの改変は、植物細胞においてプライム編集融合タンパク質及びｇＲＮＡを導入及び製造することによってのみ達成されてよく、かつ前記改変は、植物に編集システムの構成成分をコードする外因性ポリヌクレオチドを安定して形質転換することなく安定して遺伝させてよい。これにより、安定して存在する（継続的に生産される）ゲノム編集システムによる潜在的なオフターゲット効果が回避され、かつ植物ゲノムへの外来ヌクレオチド配列の組み込みも回避され、それによってより優れたバイオセーフティを提供する。
【0094】
いくつかの好ましい実施形態において、導入を選択圧の非存在下で実施して、植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の組み込みを妨げる。
【0095】
いくつかの実施形態において、導入は、本発明のゲノム編集システムを単離した植物細胞又は組織に形質転換すること、そして形質添加した植物細胞又は組織をインタクトな植物に再生することを含む。好ましくは、再生は、選択圧の非存在下で実施され、すなわち、発現ベクター上の選択遺伝子のための選択剤は、組織培養中に使用されない。選択剤の使用を避けることは、植物の再生効率を高めることができ、外因性ヌクレオチド配列を有さない改変植物を得ることができる。
【0096】
他の実施形態において、本発明のプライム編集システムは、インタクトな植物上の特定の部位、例えば葉、茎端、花粉管、幼穂、又は胚軸に形質転換されてよい。これは、組織培養での再生が困難である植物の形質転換に特に適している。
【0097】
本発明のいくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現したタンパク質及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡ分子（例えば発現構築物がｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡ分子である）は、植物に直接形質転換される。タンパク質及び／又はＲＮＡは、植物細胞においてゲノム編集を実施することができ、続いて、細胞によって分解されて、植物ゲノムでの外因性ヌクレオチド配列の組み込みを妨げる。
【0098】
したがって、いくつかの実施形態において、植物の遺伝子改変及び育種のための本発明の方法を使用することは、外因性ポリヌクレオチドの組み込みを有さないゲノムを有する植物、すなわち導入遺伝子フリーの改変植物を得ることができる。
【0099】
いくつかの実施形態において、前記方法は、プライム編集システムを導入した植物細胞、組織又は全植物を高温、例えば、３７℃で培養することをさらに含む。
【0100】
本発明のいくつかの実施形態において、改変したゲノム領域は、植物の形質、例えば農業形質と関連しており、その結果、改変は、野生型植物と比較して、変化した（好ましくは改善された）形質、例えば農業形質を有する植物をもたらす。
【0101】
いくつかの実施形態において、前記方法は、所望の改変、及び／又は所望の形質、例えば農業形質をスクリーニングするステップを含む。
【0102】
本発明のある実施形態において、前記方法は、さらに、遺伝子改変植物の子孫を得ることを含む。好ましくは、遺伝子改変植物又はそれらの子孫は、所望の改変及び／又は所望の形質、例えば農業形質を有する。
【0103】
他の態様において、本発明は、遺伝子改変植物又はそれらの子孫もしくは部位も提供し、ここで、植物は前記した本発明による方法により得られる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変した植物又はそれらの子孫もしくは部位は、導入遺伝子を有さない。好ましくは、遺伝子改変植物又はそれらの子孫は、所望の遺伝子改変及び／又は所望の形質、例えば農業形質を有する。
【0104】
他の態様において、本発明は、本発明の前記方法により得られた第一の遺伝子改変植物を、改変を含まない第二の植物と交雑させて、それにより前記遺伝子改変を該第二の植物に導入することを含む、植物の育種方法を提供する。好ましくは、第一の遺伝子改変植物は、所望の形質、例えば農業形質を有する。
【0105】
「農学形質」は、葉の緑色、収量、成長速度、バイオマス、成熟時の生体重、成熟時の乾燥量、果実収量、種子収量、全植物窒素含有量、果実窒素含有量、種子窒素含有量、栄養組織における窒素含有量、全植物遊離アミノ酸含有量、果実遊離アミノ酸含有量、種子遊離アミノ酸含有量、栄養組織における遊離アミノ酸含有量、全植物タンパク質含有量、果実タンパク質含有量、種子タンパク質含有量、栄養組織におけるタンパク質含有量、耐干性、窒素吸収、根の倒伏、収穫指数、葉柄の倒伏、草高、穂高、穂長、耐病性、耐寒性、耐塩性、及び分げつ数等を含むがこれらに限定されない測定可能なパラメータである。
【0106】
Ｖ． キット
本発明は、本発明の方法において使用するためのキットも含み、キットは、本発明のプライム編集システム又はプライム編集融合タンパク質の発現構築物を少なくとも含む。前記キットは、ｐｅｇＲＮＡを生成するための発現構築物及び関連試薬も含む。前記キットは、プライム編集システムを生物又は生物細胞に導入するための試薬も含んでよい。前記キットは、キット内の内容物の使用の目的及び／又は方法を示すラベルも含む。ラベルという用語は、キット上又はキットと共に提供されるか、そうでなければキットと共に提供されるあらゆる書面又は記録された資料を含む。
本発明は、本発明の方法において使用するためのキットも含み、キットは、本発明のプライム編集システム又はプライム編集融合タンパク質の発現構築物を少なくとも含む。前記キットは、ｐｅｇＲＮＡを生成するための発現構築物及び関連試薬も含む。前記キットは、プライム編集システムを生物又は生物細胞に導入するための試薬も含んでよい。前記キットは、キット内の内容物の使用の目的及び／又は方法を示すラベルも含む。ラベルという用語は、キット上又はキットと共に提供されるか、そうでなければキットと共に提供されるあらゆる書面又は記録された資料を含む。
【0107】
実施例
材料及び方法
１． ベクター構築
ＰＰＥ－Ｆ１５５Ｙ、ＰＰＥ－Ｆ１５５Ｖ、ＰＰＥ－Ｆ１５６Ｙ、ＰＰＥ－Ｄ５２４Ｎ、ＰＰＥ－Ｎ２００Ｃ、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ－ΔＣｏｎｎｅｃｔｉｏｎをコードする遺伝子フラグメントを、それぞれポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＰＥ（配列番号１８）をコードする遺伝子フラグメントにおけるＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の対応する部位の対応するフラグメントを点変異又は欠失することによって得て、そして得られたフラグメントを、ギブソン法により連結して、対応する最終プラスミドを得た。Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、及びＮ２００Ｃを含むＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の配列を、それぞれ配列番号９～１３に示した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素ΔＲＮａｓｅ Ｈの配列を、配列番号１４に示した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素ΔＲＮａｓｅ Ｈ－ΔＣｏｎｎｅｃｔｉｏｎの配列を、配列番号１５に示した。
材料及び方法
１． ベクター構築
ＰＰＥ－Ｆ１５５Ｙ、ＰＰＥ－Ｆ１５５Ｖ、ＰＰＥ－Ｆ１５６Ｙ、ＰＰＥ－Ｄ５２４Ｎ、ＰＰＥ－Ｎ２００Ｃ、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ－ΔＣｏｎｎｅｃｔｉｏｎをコードする遺伝子フラグメントを、それぞれポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＰＥ（配列番号１８）をコードする遺伝子フラグメントにおけるＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の対応する部位の対応するフラグメントを点変異又は欠失することによって得て、そして得られたフラグメントを、ギブソン法により連結して、対応する最終プラスミドを得た。Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、及びＮ２００Ｃを含むＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の配列を、それぞれ配列番号９～１３に示した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素ΔＲＮａｓｅ Ｈの配列を、配列番号１４に示した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素ΔＲＮａｓｅ Ｈ－ΔＣｏｎｎｅｃｔｉｏｎの配列を、配列番号１５に示した。
【0108】
さらに、ヌクレオカプシドタンパク質ＮＣ（配列番号６）、プロテアーゼＰＲ（配列番号７）、又はインテグラーゼＩＮ（配列番号８）をコードする遺伝子フラグメントを、植物のためにコドン最適化し、それぞれＰＰＥのＭ－ＭＬＶをコードする遺伝子フラグメントの５’末端又は３’末端に融合し、そして得られたフラグメントを、ギブソン法により構築して、対応する最終プラスミドを得た。同様に、ヌクレオカプシドタンパク質ＮＣをコードする遺伝子フラグメントを植物のためにコドン最適化し、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ ＨのＭ－ＭＬＶ逆転写酵素ΔＲＮａｓｅ Ｈをコードする遺伝子フラグメントの５’末端に融合させて、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ－ＮＣ（強化型ＰＰＥ、ｅＰＰＥ、及び配列番号１９に示したアミノ酸配列）を得た。続いて、それをギブソン法によって構築し、対応する最終ベクターを得た。特定のベクターを図１に示した。
【0109】
ｐｅｇＲＮＡフラグメント（ＲＴ及びＰＢＳ配列を含む）を、ギブソン法を使用することによってＯｓＵ３プロモーターにより駆動したベクターに構築し、イネにおける使用に適したＯｓＵ３－ｐｅｇＲＮＡ構築物を得た。
【0110】
２． プロトプラストの単離及び形質転換
本発明において使用したプロトプラストは、イネ種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１に由来した。
本発明において使用したプロトプラストは、イネ種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１に由来した。
【0111】
２．１ イネ苗の栽培
イネ種はＺｈｏｎｇｈｕａ １１であった。種子を最初に７５％エタノールで１分間洗浄し、そして４％次亜塩素酸ナトリウムで３０分間処理し、滅菌水で５回以上洗浄した。処理した種子をＭ６培地で２６℃で３～４週間栽培し、光から保護した。
イネ種はＺｈｏｎｇｈｕａ １１であった。種子を最初に７５％エタノールで１分間洗浄し、そして４％次亜塩素酸ナトリウムで３０分間処理し、滅菌水で５回以上洗浄した。処理した種子をＭ６培地で２６℃で３～４週間栽培し、光から保護した。
【0112】
２．２ イネプロトプラストの単離
（１） イネ茎を切り落とし、その中間部分を刃物で０．５～１ｍｍのフィラメント状に切断した。そのフィラメントを、暗所で１０分間０．６Ｍマンニトール溶液で処理し、フィルターで濾過し、５０ｍＬの酵素分解溶液（０．４５μｍ膜で濾過した）に入れ、３０分間真空にし（圧力強度約１５Ｋｐａ）、取り出してシェーカー（１０ｒｐｍ）上に置き、室温で５時間酵素分解した。
（２） 酵素分解生成物を、３０～５０ｍＬのＷ５を添加することにより希釈し、７５μｍナイロンフィルター膜で濾過して丸底遠心管（５０ｍＬ）に入れた。
（３） 上清を廃棄する前に、遠心分離を２３℃で３分間２５０ｇ（ｒｃｆ）で実施した。
（４） 細胞を２０ｍＬのＷ５で軽く懸濁し、ステップ（３）を繰り返した。
（５） 適量のＭＭＧを添加し、形質転換のための細胞を懸濁した。
（１） イネ茎を切り落とし、その中間部分を刃物で０．５～１ｍｍのフィラメント状に切断した。そのフィラメントを、暗所で１０分間０．６Ｍマンニトール溶液で処理し、フィルターで濾過し、５０ｍＬの酵素分解溶液（０．４５μｍ膜で濾過した）に入れ、３０分間真空にし（圧力強度約１５Ｋｐａ）、取り出してシェーカー（１０ｒｐｍ）上に置き、室温で５時間酵素分解した。
（２） 酵素分解生成物を、３０～５０ｍＬのＷ５を添加することにより希釈し、７５μｍナイロンフィルター膜で濾過して丸底遠心管（５０ｍＬ）に入れた。
（３） 上清を廃棄する前に、遠心分離を２３℃で３分間２５０ｇ（ｒｃｆ）で実施した。
（４） 細胞を２０ｍＬのＷ５で軽く懸濁し、ステップ（３）を繰り返した。
（５） 適量のＭＭＧを添加し、形質転換のための細胞を懸濁した。
【0113】
２．３ プロトプラストの形質転換
（１） 形質転換するベクター１０μｇを２ｍＬの遠心管に添加し、そしてよく混合した。プロトプラスト２００μＬをチップを付けたピペットで採取し、はじいてよく混合した。ＰＥＧ４０００溶液２２０μＬを添加し、はじいてよく混合し、続いて光の非存在下で室温で２０～３０分間形質転換を誘導した。
（２） ８８０μＬのＷ５を添加し、軽く反転することによって混合し、２５０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心分離し、上清を捨てた。
（３） ＷＩ溶液１ｍＬを添加し、穏やかに反転させることによってよく混合した後、フローチューブに穏やかに移し、暗所で室温で約４０時間培養した。
（１） 形質転換するベクター１０μｇを２ｍＬの遠心管に添加し、そしてよく混合した。プロトプラスト２００μＬをチップを付けたピペットで採取し、はじいてよく混合した。ＰＥＧ４０００溶液２２０μＬを添加し、はじいてよく混合し、続いて光の非存在下で室温で２０～３０分間形質転換を誘導した。
（２） ８８０μＬのＷ５を添加し、軽く反転することによって混合し、２５０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心分離し、上清を捨てた。
（３） ＷＩ溶液１ｍＬを添加し、穏やかに反転させることによってよく混合した後、フローチューブに穏やかに移し、暗所で室温で約４０時間培養した。
【0114】
３． フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析のためのＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置は、次の特定の操作手順を有する：
（１） シースタンク及びエタノールタンク中の液量が十分であるかどうか確認し、廃液タンクを空にした。安定化電圧供給をオンにし、機器の電源をオンにし、蛍光スイッチをオンにして、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ ソフトウェアを起動して、スタートアップ手順に入った。
（２） 空気及び流体のラインを切り離し、そしてシースタンクに接続し、閉じたループノズルがフローセルの対応する位置にあることを確認し、起動プロセスを実行する。
（３） 適したサイズのノズルを交換し、実際のノズルに一致するようにソフトウェアモードを設定し、レーザーをオンにして流れを開始した。
（４） 「新しいプロトコル」をクリックして、適した実験プロトコルを作成した。
（５） 「密度プロット」を選択して、ＦＳＣ／ＳＳＣ散布図及びＧＦＰ／ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ散布図を描画した。
（６） 散布図の中央にドットが現れるようにＦＳＣ／ＳＳＣ電圧を調整した。ＦＬ１電圧を、野生型対照のプロトプラスト集団が散布図の中央に表示されるように調整し、そして、実験グループのプロトプラスト集団（例えばＧＦＰ蛍光タンパク質で形質転換したプロトプラスト）が、ＧＦＰ蛍光チャネルシグナルがより高い場所に出現する。必要に応じて、２つの集団がより明確になるように、補正した規制を行った。
（７） ゲートの閾値を対照群に基づいて決定し、実験群のプロトプラスト集団が閾値内に位置し、対照群のプロトプラスト集団が閾値外に位置することを確実にした。
（８） ソートする細胞集団をクリックし、「左ソート」を選択し、実験のニーズ及び対象細胞の割合に従って分析条件及び分析モードを設定した。
（９） データを読み取るために試料を適切な順序でロードし、関連データを記録した。
（１０） 流れを止め、閉ループノズルを交換し、フローセルをＦＡＣＳ清浄液及び滅菌水で洗浄し、ソフトウェアと機器の電源をオフにし、安定化電圧供給をオフにし、そして機器の圧力を排出した。
フローサイトメトリー分析のためのＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置は、次の特定の操作手順を有する：
（１） シースタンク及びエタノールタンク中の液量が十分であるかどうか確認し、廃液タンクを空にした。安定化電圧供給をオンにし、機器の電源をオンにし、蛍光スイッチをオンにして、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ ソフトウェアを起動して、スタートアップ手順に入った。
（２） 空気及び流体のラインを切り離し、そしてシースタンクに接続し、閉じたループノズルがフローセルの対応する位置にあることを確認し、起動プロセスを実行する。
（３） 適したサイズのノズルを交換し、実際のノズルに一致するようにソフトウェアモードを設定し、レーザーをオンにして流れを開始した。
（４） 「新しいプロトコル」をクリックして、適した実験プロトコルを作成した。
（５） 「密度プロット」を選択して、ＦＳＣ／ＳＳＣ散布図及びＧＦＰ／ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ散布図を描画した。
（６） 散布図の中央にドットが現れるようにＦＳＣ／ＳＳＣ電圧を調整した。ＦＬ１電圧を、野生型対照のプロトプラスト集団が散布図の中央に表示されるように調整し、そして、実験グループのプロトプラスト集団（例えばＧＦＰ蛍光タンパク質で形質転換したプロトプラスト）が、ＧＦＰ蛍光チャネルシグナルがより高い場所に出現する。必要に応じて、２つの集団がより明確になるように、補正した規制を行った。
（７） ゲートの閾値を対照群に基づいて決定し、実験群のプロトプラスト集団が閾値内に位置し、対照群のプロトプラスト集団が閾値外に位置することを確実にした。
（８） ソートする細胞集団をクリックし、「左ソート」を選択し、実験のニーズ及び対象細胞の割合に従って分析条件及び分析モードを設定した。
（９） データを読み取るために試料を適切な順序でロードし、関連データを記録した。
（１０） 流れを止め、閉ループノズルを交換し、フローセルをＦＡＣＳ清浄液及び滅菌水で洗浄し、ソフトウェアと機器の電源をオフにし、安定化電圧供給をオフにし、そして機器の圧力を排出した。
【0115】
４． プロトプラストＤＮＡの抽出及びアンプリコン配列分析
４．１ プロトプラストＤＮＡの抽出
プロトプラストを２ｍＬ遠心分離管に収集し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐ超微分光光度計によって測定した濃度（３０～６０ｎｇ／μＬ）のプロトプラストＤＮＡ（約３０μＬ）をＣＴＡＢ法により抽出し、－２０℃で保存した。
４．１ プロトプラストＤＮＡの抽出
プロトプラストを２ｍＬ遠心分離管に収集し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐ超微分光光度計によって測定した濃度（３０～６０ｎｇ／μＬ）のプロトプラストＤＮＡ（約３０μＬ）をＣＴＡＢ法により抽出し、－２０℃で保存した。
【0116】
４．２ アンプリコン配列分析
（１） ＰＣＲ増幅を、ゲノムプライマーを使用して、プロトプラストＤＮＡ鋳型に対して実施した。２０μＬ増幅システムは、５ｘＦａｓｔｐｆｕバッファー４μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）１．６μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．４μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）０．４μＬ、ＦａｓｔＰｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）０．４μＬ、及びＤＮＡ鋳型（約６０ｎｇ）２μＬを含んだ。増幅条件は以下であった：９５℃で５分間の前変性；９５℃で３０秒間の変性、５０～６４℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を３５サイクル；７２℃で５分間完全伸長、１２℃でインキュベート。
（２） 上記増幅産物を１０倍に希釈し、増幅産物１μＬを第２のＰＣＲ増幅鋳型とし、増幅プライマーはバーコードを含む配列決定プライマーであった。増幅システム５０μＬは、５×Ｆａｓｔｐｆｕバッファー１０μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）１μＬ、ＦａｓｔＰｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）１μＬ及びＤＮＡ鋳型１μＬを含んだ。増幅条件は上記と同様であり、増幅サイクル数は３５サイクルであった。
（３） ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して目的のフラグメントのゲル抽出を実施し、そして得られた生成物をＮａｎｏＤｒｏｐ超微分光光度計を使用して定量分析した。回収した生成物１００ｎｇを、採取し、混合し、そしてアンプリコン配列決定ライブラリーの構築及びアンプリコン配列分析のためにＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に送った。
（４） 配列決定が完了した後に、元のデータを配列決定用プライマーに従って分割し、そしてＷＴを対照として使用し、３回の反復試験で異なる遺伝子標的遺伝子座における産物の編集タイプ及び編集効率を比較及び分析した。
（１） ＰＣＲ増幅を、ゲノムプライマーを使用して、プロトプラストＤＮＡ鋳型に対して実施した。２０μＬ増幅システムは、５ｘＦａｓｔｐｆｕバッファー４μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）１．６μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．４μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）０．４μＬ、ＦａｓｔＰｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）０．４μＬ、及びＤＮＡ鋳型（約６０ｎｇ）２μＬを含んだ。増幅条件は以下であった：９５℃で５分間の前変性；９５℃で３０秒間の変性、５０～６４℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を３５サイクル；７２℃で５分間完全伸長、１２℃でインキュベート。
（２） 上記増幅産物を１０倍に希釈し、増幅産物１μＬを第２のＰＣＲ増幅鋳型とし、増幅プライマーはバーコードを含む配列決定プライマーであった。増幅システム５０μＬは、５×Ｆａｓｔｐｆｕバッファー１０μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）１μＬ、ＦａｓｔＰｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）１μＬ及びＤＮＡ鋳型１μＬを含んだ。増幅条件は上記と同様であり、増幅サイクル数は３５サイクルであった。
（３） ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して目的のフラグメントのゲル抽出を実施し、そして得られた生成物をＮａｎｏＤｒｏｐ超微分光光度計を使用して定量分析した。回収した生成物１００ｎｇを、採取し、混合し、そしてアンプリコン配列決定ライブラリーの構築及びアンプリコン配列分析のためにＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に送った。
（４） 配列決定が完了した後に、元のデータを配列決定用プライマーに従って分割し、そしてＷＴを対照として使用し、３回の反復試験で異なる遺伝子標的遺伝子座における産物の編集タイプ及び編集効率を比較及び分析した。
【0117】
５． プロトプラストタンパク質の抽出及びウェスタンブロット
５．１． プロトプラストタンパク質の抽出
（１） ４８時間培養後のプロトプラスト試料を調製し、反転することにより均一に混合し、そして１２０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。上清をデカントし、新たに調製したタンパク質抽出溶液５０μＬを添加し、そしてボルテックスにより均一に混合した。
（２） 前のステップで得た１．５ｍＬ遠沈管を氷上に３０分間置き、ボルテックスして均一に混合した。
（３） １．５ｍＬ遠心分離管を低温遠心分離機で１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。
（４） 上清をピペットで取り、新しい１．５ｍＬ遠沈管に移した。
（５） 遠心管から２μＬをピペットで取り、新しい１．５ｍＬ遠心管に移し、再蒸留水１８μＬを添加することにより希釈した。
（６） Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ１ｍＬを前記系に添加し、ボルテックスで均一に混合した後５分間放置し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び核酸タンパク質光度計でタンパク質濃度を予め測定した。
（７） 異なる試料の濃度をタンパク質抽出バッファーで調整し、ローディングバッファー１０μＬを添加してボルテックスで均一に混合し、１００℃の金属浴で５分間変性させた。
（８） 得られたものを１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清をピペットで取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。
５．１． プロトプラストタンパク質の抽出
（１） ４８時間培養後のプロトプラスト試料を調製し、反転することにより均一に混合し、そして１２０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。上清をデカントし、新たに調製したタンパク質抽出溶液５０μＬを添加し、そしてボルテックスにより均一に混合した。
（２） 前のステップで得た１．５ｍＬ遠沈管を氷上に３０分間置き、ボルテックスして均一に混合した。
（３） １．５ｍＬ遠心分離管を低温遠心分離機で１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。
（４） 上清をピペットで取り、新しい１．５ｍＬ遠沈管に移した。
（５） 遠心管から２μＬをピペットで取り、新しい１．５ｍＬ遠心管に移し、再蒸留水１８μＬを添加することにより希釈した。
（６） Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ１ｍＬを前記系に添加し、ボルテックスで均一に混合した後５分間放置し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び核酸タンパク質光度計でタンパク質濃度を予め測定した。
（７） 異なる試料の濃度をタンパク質抽出バッファーで調整し、ローディングバッファー１０μＬを添加してボルテックスで均一に混合し、１００℃の金属浴で５分間変性させた。
（８） 得られたものを１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清をピペットで取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。
【0118】
５．２． ウェスタンブロット
（１） ８％の下層分離ゲル及び５％の上層スタッキングゲルを準備した。試料をロードし、１２０Ｖで１．５時間電気泳動を実施した。
（２） ＮＣメンブレン及び濾紙を予めカットし、メンブレントランスファーバッファーに十分に浸した。
（３） 膜への転写操作をセミドライ法で実施した。浸漬濾紙、浸漬ＮＣメンブレン、電気泳動後に得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、浸漬濾紙を下から上に配置した。５０ｍＬ丸底遠心分離管を使用して前後に回転させ、全ての気泡を追い出した。
（４） ２００ｍＡの定電流を１時間印加してタンパク質を転写した。
（５） ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーに入れ、室温で５分間シェーカーで振盪しながらメンブレントランスファーバッファーを洗い流した。
（６） バッファーをデカントし、適量の５％無脂肪乳（ＴＢＳＴ配合）を添加し、メンブレンをゆっくりと振盪し、シェーカー上で室温で２時間インキュベートしてブロッキングした。
（７） ブロッキング溶液をデカントし、適切な比率で希釈した一次抗体を新鮮な５％無脂肪乳に添加し、そしてメンブレンをシェーカー上で４℃、低速で一晩インキュベートした。
（８） 一次抗体をデカントし、ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーで５分間ずつ３回洗浄した。
（９） 希釈した対応する二次抗体を含む乳を添加し、メンブレンを室温で数時間インキュベートした。
（１０） 二次抗体をデカントし、ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーで５分間ずつ３回洗浄し、そしてＮＣメンブレンを専用のビニール袋でシールした。
（１１） 同量の展開液Ａ及び現像液Ｂ（Ｔｉａｎｇｅｎ）を均一に混合し、上記ビニール袋に添加し、メンブレンを３分間インキュベートした。
（１２） 現像液をビニール袋からデカントし、暗フォルダーに置き、暗室で現像し、タンパク質の存在量に従って現像時間を調整した。
（１） ８％の下層分離ゲル及び５％の上層スタッキングゲルを準備した。試料をロードし、１２０Ｖで１．５時間電気泳動を実施した。
（２） ＮＣメンブレン及び濾紙を予めカットし、メンブレントランスファーバッファーに十分に浸した。
（３） 膜への転写操作をセミドライ法で実施した。浸漬濾紙、浸漬ＮＣメンブレン、電気泳動後に得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、浸漬濾紙を下から上に配置した。５０ｍＬ丸底遠心分離管を使用して前後に回転させ、全ての気泡を追い出した。
（４） ２００ｍＡの定電流を１時間印加してタンパク質を転写した。
（５） ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーに入れ、室温で５分間シェーカーで振盪しながらメンブレントランスファーバッファーを洗い流した。
（６） バッファーをデカントし、適量の５％無脂肪乳（ＴＢＳＴ配合）を添加し、メンブレンをゆっくりと振盪し、シェーカー上で室温で２時間インキュベートしてブロッキングした。
（７） ブロッキング溶液をデカントし、適切な比率で希釈した一次抗体を新鮮な５％無脂肪乳に添加し、そしてメンブレンをシェーカー上で４℃、低速で一晩インキュベートした。
（８） 一次抗体をデカントし、ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーで５分間ずつ３回洗浄した。
（９） 希釈した対応する二次抗体を含む乳を添加し、メンブレンを室温で数時間インキュベートした。
（１０） 二次抗体をデカントし、ＮＣメンブレンをＴＢＳＴバッファーで５分間ずつ３回洗浄し、そしてＮＣメンブレンを専用のビニール袋でシールした。
（１１） 同量の展開液Ａ及び現像液Ｂ（Ｔｉａｎｇｅｎ）を均一に混合し、上記ビニール袋に添加し、メンブレンを３分間インキュベートした。
（１２） 現像液をビニール袋からデカントし、暗フォルダーに置き、暗室で現像し、タンパク質の存在量に従って現像時間を調整した。
【0119】
実施例１： レポーターシステムでの種々の構築物のスクリーニング
前記複数の改変により改善した効率を有する構築物を迅速かつ視覚的にスクリーニングするために、イネのプロトプラストにおけるＢＦＰ－ＧＦＰレポーターシステムで予備スクリーニングを実施した。フローサイトメトリー分析による結果を図２に示し、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、及びＰＰＥ－ＮＣｖ２の編集効率が元のＰＰＥと比較して改善したことを示した。したがって、これら３つの構築物を内因性標的の追跡試験のために選択した。
前記複数の改変により改善した効率を有する構築物を迅速かつ視覚的にスクリーニングするために、イネのプロトプラストにおけるＢＦＰ－ＧＦＰレポーターシステムで予備スクリーニングを実施した。フローサイトメトリー分析による結果を図２に示し、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、及びＰＰＥ－ＮＣｖ２の編集効率が元のＰＰＥと比較して改善したことを示した。したがって、これら３つの構築物を内因性標的の追跡試験のために選択した。
【0120】
実施例２：種々のＰＰＥタンパク質修飾によるプライム編集システムの編集効率の改善
プライム編集システムに対して前記で選択した構築物の効果を試験するために、イネの１６個の内因性標的を試験した。これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図３に示し、これはほとんどの試験部位で、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ＮＣｖ２、及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈが、ＰＰＥと比較して効率の改善の度合いが異なったことを示す。ＰＰＥ－ＮＣｖ１が最も高い改善度を達成し、ＰＰＥ－ＮＣｖ２及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈが２番目となった。
プライム編集システムに対して前記で選択した構築物の効果を試験するために、イネの１６個の内因性標的を試験した。これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図３に示し、これはほとんどの試験部位で、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ＮＣｖ２、及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈが、ＰＰＥと比較して効率の改善の度合いが異なったことを示す。ＰＰＥ－ＮＣｖ１が最も高い改善度を達成し、ＰＰＥ－ＮＣｖ２及びＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈが２番目となった。
【0121】
実施例３：種々のＰＰＥタンパク質修飾の組み合わせによるプライム編集システムの編集効率のさらなる改善
プライム編集システムの効率が、ＮＣとの融合及びＲＮａｓｅ Ｈ（ｅＰＰＥ）の欠失の組み合わせによってさらに改善されるかどうかを試験するために、１２個の部位を選択して試験した。これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図４に示し、これはほとんどの部位でｅＰＰＥ（ＰＰＥ－ＮＣｖ１＋ΔＲＮａｓｅ Ｈ）の編集効率が最も高く、編集効率は高から低の順でｅＰＰＥ＞ＰＰＥ－ＮＣｖ１＞ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ＞ＰＰＥであったことを示す。
プライム編集システムの効率が、ＮＣとの融合及びＲＮａｓｅ Ｈ（ｅＰＰＥ）の欠失の組み合わせによってさらに改善されるかどうかを試験するために、１２個の部位を選択して試験した。これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図４に示し、これはほとんどの部位でｅＰＰＥ（ＰＰＥ－ＮＣｖ１＋ΔＲＮａｓｅ Ｈ）の編集効率が最も高く、編集効率は高から低の順でｅＰＰＥ＞ＰＰＥ－ＮＣｖ１＞ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ＞ＰＰＥであったことを示す。
【0122】
実施例４：種々の修飾ＰＰＥタンパク質のタンパク質発現の試験
前記修飾ＰＰＥタンパク質が元のＰＰＥタンパク質と比較してタンパク質発現が増加し、その結果プライム編集効率が改善したかどうかを試験するために、対応するタンパク質をイネのプロトプラストに形質転換し、ウェスタンブロットのためにプロトプラストタンパク質を抽出した。結果を図５に示し、これは、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ＮＣｖ２、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、及びｅＰＰＥタンパク質の発現が元のＰＰＥタンパク質の発現よりも有意に高く、かつｅＰＰＥタンパク質の発現は最も高く、その主要な編集効率に対応していたことを示す。
前記修飾ＰＰＥタンパク質が元のＰＰＥタンパク質と比較してタンパク質発現が増加し、その結果プライム編集効率が改善したかどうかを試験するために、対応するタンパク質をイネのプロトプラストに形質転換し、ウェスタンブロットのためにプロトプラストタンパク質を抽出した。結果を図５に示し、これは、ＰＰＥ－ＮＣｖ１、ＰＰＥ－ＮＣｖ２、ＰＰＥ－ΔＲＮａｓｅ Ｈ、及びｅＰＰＥタンパク質の発現が元のＰＰＥタンパク質の発現よりも有意に高く、かつｅＰＰＥタンパク質の発現は最も高く、その主要な編集効率に対応していたことを示す。
【0123】
実施例５：ｅＰＰＥタンパク質が１５ｂｐ超のフラグメントの欠失又は挿入の編集効率を効果的に改善させうる
プライム編集システムが数塩基の置換又は欠失又は挿入に効率的であることを考慮して、さらに元のＰＰＥタンパク質と比較して、より大きなフラグメントの挿入又は欠失に対するｅＰＰＥの効率を試験した。１８部位を試験のために選択し、これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図６に示し、これは、試験した部位において、ｅＰＰＥの編集効率が最も高く、１８～３４ｂｐのフラグメントの挿入及び１５～９０ｂｐのフラグメントの欠失を効果的に達成できたことを示している。
プライム編集システムが数塩基の置換又は欠失又は挿入に効率的であることを考慮して、さらに元のＰＰＥタンパク質と比較して、より大きなフラグメントの挿入又は欠失に対するｅＰＰＥの効率を試験した。１８部位を試験のために選択し、これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図６に示し、これは、試験した部位において、ｅＰＰＥの編集効率が最も高く、１８～３４ｂｐのフラグメントの挿入及び１５～９０ｂｐのフラグメントの欠失を効果的に達成できたことを示している。
【0124】
実施例６：ｅＰＰＥタンパク質がプライム編集システムの範囲を効果的に拡大しうる
ＳｐＧヌクレアーゼと融合したｅＰＰＥの他のＰＡＭに対する標的効果を元のＰＰＥタンパク質と比較して試験するために、４部位のＮＧＣ、ＮＧＡ、ＮＧＧ ＰＡＭを試験のために選択し、これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図７に示し、ｅＰＰＥの編集効率により、試験した部位でのプライム編集効果が効果的に拡大される可能性を示す。
ＳｐＧヌクレアーゼと融合したｅＰＰＥの他のＰＡＭに対する標的効果を元のＰＰＥタンパク質と比較して試験するために、４部位のＮＧＣ、ＮＧＡ、ＮＧＧ ＰＡＭを試験のために選択し、これらの構築物をｐｅｇＲＮＡでイネのプロトプラスト細胞に同時形質転換し、アンプリコン配列解析によりプライム編集システムの編集効率を解析した。結果を図７に示し、ｅＰＰＥの編集効率により、試験した部位でのプライム編集効果が効果的に拡大される可能性を示す。
【0125】
実施例７：イネカルスにおけるｅＰＰＥの編集効率
安定した形質転換イネカルスにおけるｅＰＰＥの変異効率をさらに試験するために、イネにおける４つの標的を試験のために選択した。耐性カルスの同定後の結果を図８に示し、カルスにおけるｅＰＰＥの編集効率が、プロトプラストで試験したその編集効率と一致しており、どちらもコントロールＰＰＥ編集効率よりも高く、編集効率は最大３１．５％であった。
安定した形質転換イネカルスにおけるｅＰＰＥの変異効率をさらに試験するために、イネにおける４つの標的を試験のために選択した。耐性カルスの同定後の結果を図８に示し、カルスにおけるｅＰＰＥの編集効率が、プロトプラストで試験したその編集効率と一致しており、どちらもコントロールＰＰＥ編集効率よりも高く、編集効率は最大３１．５％であった。
【0126】
実施例８：ｅＰＰＥによる除草剤耐性イネ植物の作出
イネＯｓＡＬＳ遺伝子のＷ５４８部位を標的としてＷ５４８Ｍの変異を生じさせることにより、ｅＰＰＥによる変異効率が１１．３％であるのに対し、ＰＰＥによる変異効率がわずか０．６％であることが判明した。ヘテロ接合変異体を除草剤耐性について試験し、ニコスルフロン及びイマザピック、並びにそれらの組み合わせに対して良好な耐性を有することが判明した。結果を図９において示した。
イネＯｓＡＬＳ遺伝子のＷ５４８部位を標的としてＷ５４８Ｍの変異を生じさせることにより、ｅＰＰＥによる変異効率が１１．３％であるのに対し、ＰＰＥによる変異効率がわずか０．６％であることが判明した。ヘテロ接合変異体を除草剤耐性について試験し、ニコスルフロン及びイマザピック、並びにそれらの組み合わせに対して良好な耐性を有することが判明した。結果を図９において示した。
【0127】
実施例９：ｅＰＥでのブタ細胞における編集
他の種におけるｅＰＰＥの編集効率を試験するために、ブタ細胞の３つの標的を試験のために選択した（ｅＰＥと命名する）。結果を図１０において示した。実際にｅＰＥは、元のＰＥでの処理と比較して、異なる程度の効率改善を示した。
他の種におけるｅＰＰＥの編集効率を試験するために、ブタ細胞の３つの標的を試験のために選択した（ｅＰＥと命名する）。結果を図１０において示した。実際にｅＰＥは、元のＰＥでの処理と比較して、異なる程度の効率改善を示した。
【0128】
実施例１０：プライム編集におけるｅＰＰＥタンパク質のオフターゲット現象
ｅＰＰＥがオフターゲット編集の効率を大幅に改善させたかどうかを判断するために、ｐｅｇＲＮＡのミスマッチに対するｅＰＰＥの耐性及び試験した内因性部位と１～３個のミスマッチを有する潜在的なゲノムオフターゲット部位の編集効率をそれぞれ試験した。内因性標的及び潜在的なオフターゲット部位におけるプライム編集システムの編集効率を、アンプリコン配列分析によって分析した。結果を図１１において示した。ｅＰＰＥは、ＰＰＥと比較して、ほとんどの部位でオフターゲット編集現象を大幅に増加させなかった。
ｅＰＰＥがオフターゲット編集の効率を大幅に改善させたかどうかを判断するために、ｐｅｇＲＮＡのミスマッチに対するｅＰＰＥの耐性及び試験した内因性部位と１～３個のミスマッチを有する潜在的なゲノムオフターゲット部位の編集効率をそれぞれ試験した。内因性標的及び潜在的なオフターゲット部位におけるプライム編集システムの編集効率を、アンプリコン配列分析によって分析した。結果を図１１において示した。ｅＰＰＥは、ＰＰＥと比較して、ほとんどの部位でオフターゲット編集現象を大幅に増加させなかった。
【0129】
実施例１１：ｅＰＰＥと塩基編集の比較
塩基変異導入の観点から、ｅＰＰＥの編集効率を慣用的に使用される塩基エディターと比較するために、７つのイネ内在性標的を選択し、ｅＰＰＥをそれぞれＡ３Ａ－ＰＢＥ及びＰＡＢＥ８ｅと比較した。アンプリコン配列解析の結果を図１２に示した。ＰＡＭの制限により、他の編集部位のＣ又はＡを含まない場合に、プライム編集は標的部位を正確に編集する上で大きな利点を示し、ｅＰＰＥと塩基編集は機能的に相補的であり、植物ゲノム編集においてより柔軟な応用をもたらした。
塩基変異導入の観点から、ｅＰＰＥの編集効率を慣用的に使用される塩基エディターと比較するために、７つのイネ内在性標的を選択し、ｅＰＰＥをそれぞれＡ３Ａ－ＰＢＥ及びＰＡＢＥ８ｅと比較した。アンプリコン配列解析の結果を図１２に示した。ＰＡＭの制限により、他の編集部位のＣ又はＡを含まない場合に、プライム編集は標的部位を正確に編集する上で大きな利点を示し、ｅＰＰＥと塩基編集は機能的に相補的であり、植物ゲノム編集においてより柔軟な応用をもたらした。
【0130】
実施例１２：ｅＰＰＥとｐｅｇＲＮＡ最適化ストラテジーとを組み合わせることによるプライム編集効率のさらなる改善
植物のプライム編集効率をさらに改善するために、ｅＰＰＥタンパク質をデュアルｐｅｇＲＮＡストラテジー及びｅｐｅｇＲＮＡストラテジーと組み合わせた。結果を図１３において示した。異なるｅｐｅｇＲＮＡに対する評価により、ＰＰＥ及びｅＰＰＥによる３’－ｔｅｖｏｐｒｅＱ１－８ｎｔリンカー修飾を有するデュアルｐｅｇＲＮＡでプロトプラストを同時形質転換することを決定した。ｅＰＰＥとデュアルｐｅｇＲＮＡストラテジー及びｅｐｅｇＲＮＡｓストラテジーとを組み合わせたプライム編集効率がさらに改善し、かつｅＰＰＥ－ｄｕａｌ－ｅｐｅｇＲＮＡの組み合わせが、ＰＰＥ－ｄｕａｌ－ｐｅｇＲＮＡの組み合わせより７．９倍高かった。
植物のプライム編集効率をさらに改善するために、ｅＰＰＥタンパク質をデュアルｐｅｇＲＮＡストラテジー及びｅｐｅｇＲＮＡストラテジーと組み合わせた。結果を図１３において示した。異なるｅｐｅｇＲＮＡに対する評価により、ＰＰＥ及びｅＰＰＥによる３’－ｔｅｖｏｐｒｅＱ１－８ｎｔリンカー修飾を有するデュアルｐｅｇＲＮＡでプロトプラストを同時形質転換することを決定した。ｅＰＰＥとデュアルｐｅｇＲＮＡストラテジー及びｅｐｅｇＲＮＡｓストラテジーとを組み合わせたプライム編集効率がさらに改善し、かつｅＰＰＥ－ｄｕａｌ－ｅｐｅｇＲＮＡの組み合わせが、ＰＰＥ－ｄｕａｌ－ｐｅｇＲＮＡの組み合わせより７．９倍高かった。
【0131】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムの標的改変のためのプライム編集システムであって、ｉ）プライム編集融合タンパク質、及び／又はプライム編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、ここでプライム編集融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及び逆転写酵素を含む；及び／又は
ｉｉ）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
を含み、
ここで、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、５’から３’の方向に、ガイド配列、足場配列、逆転写（ＲＴ）鋳型配列、及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含み、
少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡが、融合タンパク質と複合体を形成し、融合タンパク質をゲノム内の標的配列に標的化することができ、その結果標的配列にニックを形成する、
植物ゲノムの標的改変のためのプライム編集システム。
【請求項2】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素又はその機能的バリアントである、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
（ａ）逆転写酵素が、Ｆ１５５Ｙ、Ｆ１５５Ｖ、Ｆ１５６Ｙ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ２００Ｃのいずれか１つから選択される変異を含む、ここでアミノ酸位置は配列番号３に関する、（ｂ）逆転写酵素の関連配列が消失する、及び／又は
（ｃ）逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈドメインが変異又は消失する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
逆転写酵素が、配列番号９～１５のいずれか１つで示される配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
逆転写酵素、例えばＭ－ＭＬＶ逆転写酵素、又はそれらの機能的バリアントが、Ｎ末端又はＣ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、又はインテグラーゼ（ＩＮ）と、融合タンパク質中で直接もしくはリンカーを介して融合される、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、又はプロテアーゼ（ＰＲ）が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、又はインテグラーゼ（ＩＮ）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
逆転写酵素が、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合し、かつ好ましくはＲＮａｓｅ Ｈドメインを消失させたＭ－ＭＬＶ逆転写酵素の機能的フラグメントが、Ｎ末端でヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）と直接又はリンカーを介して融合する、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
ｐｅｇＲＮＡのガイド配列を、標的配列と十分な配列同一性を有するように配置し、塩基対形成によって標的配列の相補鎖に結合して、配列特的標的化を得ることができる、請求項１に記載のシステム。
【請求項10】
ｐｅｇＲＮＡの足場配列が、配列番号１８で示される配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
プライマー結合配列が、標的配列の少なくとも一部に相補的であるように構成され、かつ好ましくは、プライマー結合配列が、ニックによって生じた３’遊離一本鎖の少なくとも一部に、特に３’遊離一本鎖の３’末端でヌクレオチド配列に相補的である、請求項１に記載のシステム。
【請求項12】
プライマー結合配列が、約１８～５２℃、好ましくは約２４～３６℃、より好ましくは約２８～３２℃、及び最も好ましくは約３０℃のＴｍ（融解温度）を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項13】
ＲＴ鋳型配列が、ニックの下流の配列に対応するように構成され、所望の改変を含み、かつ改変が、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は付加を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項14】
プライム編集融合タンパク質が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項15】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のプライム編集システムを少なくとも１つの細胞に導入し、それにより少なくとも１つの細胞のゲノム内の標的配列に改変をもたらすことを含む、遺伝子組換え植物を生産する方法。
【国際調査報告】