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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-05
(54)【発明の名称】天然分子に近いポリペプチド融合分子
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240829BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240829BHJP
C07K 14/735 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240829BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240829BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240829BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240829BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240829BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20240829BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240829BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C07K14/735
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12P21/02 A
A61K38/16
A61K47/68
A61K47/65
A61K35/76
A61K35/12
A61P35/00
G01N33/53 D
G01N33/53 G
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536349
(86)(22)【出願日】2022-08-26
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 CN2022115250
(87)【国際公開番号】W WO2023025304
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】202110990796.X
(32)【優先日】2021-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524073980
【氏名又は名称】ティーアイオーシー セラピューティクス，リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＯＣ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ７０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２１， Ｈｅｘｉａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｘｉａｓｈａ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｑｉａｎｔａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００１８， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リー，イー
(72)【発明者】
【氏名】ティアン，イェ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CE11
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD01
4B065BD14
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA23
(57)【要約】
天然状態に近いマルチドメイン融合タンパク質分子を提供する。融合タンパク質は、免疫反応のない抗体一本鎖分子および特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片からなる。これらの天然状態に近いタンパク質のドメインを混合すると、生物学的機能を有する融合タンパク質複合分子を形成し、人工的な柔軟性ペプチド鎖を導入して各ドメインを単一のポリペプチド分子に連結することで生じうる免疫原性のリスクを避けることができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されるポリペプチドを含むことを特徴とする、融合タンパク質。Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。前記柔軟性リンカーは選択できるものである。
「－」は共有結合である。）
【請求項2】
Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されることを特徴とする、融合タンパク質。Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。）
【請求項3】
前記エレメントＡ１は、抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域であることを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖ヘテロ二量体複合分子、抗体分子Ｆａｂ複合分子、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、前記ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記エレメントＡ１は、柔軟性リンカーＬを介してＴＣＲβ鎖に連結していることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記エレメントＬは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのような構造を含み、ここで、ｎは１～５の正の整数であり、好ましくは、配列番号９で示される配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示される配列を含むか、あるいは、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２と少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
構造が式ＩｃまたはＩｄで表されることを特徴とする、融合タンパク質複合分子。Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のないポリペプチド分子それぞれ独立である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用である。）
【請求項12】
前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域であり、かつ前記Ａ２エレメントは抗体の軽鎖可変領域であるか、あるいは、前記エレメントＡ１は抗体の軽鎖可変領域であり、かつ前記Ａ２元件は抗体の重鎖可変領域であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項13】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項14】
前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項15】
前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖ヘテロ二量体複合分子、抗体分子Ｆａｂ複合分子、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項16】
前記ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、前記ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項17】
前記エレメントＡ１は、柔軟性リンカーＬを介してＴＣＲβ鎖に連結していることを特徴とする、請求項１６に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項18】
前記エレメントＬは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのような構造を含み、ここで、ｎは１～５の正の整数であり、好ましくは、配列番号９で示される配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項19】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項20】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項21】
請求項２０に記載の発現ベクターまたは請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、宿主細胞。
【請求項22】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする、前記方法：（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子の生成に適する条件において、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することにより、前記融合タンパク質または前記融合タンパク質複合分子を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を精製および／または修飾する。
【請求項23】
以下：（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分
を含有することを特徴とする、免疫複合体。
【請求項24】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載の発現ベクター、請求項２１に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項25】
以下：（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列
を含む、組み換えタンパク質。
【請求項26】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質複合分子、請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載の発現ベクター、請求項２１に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の免疫複合体、請求項２４に記載の薬物組成物、または請求項２５に記載の組み換えタンパク質の使用であって、被験者において腫瘍を予防または治療する薬物を製造するためであることを特徴とする、前記使用。
【請求項27】
前記腫瘍は、乳癌、肺癌、肝臓癌、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
前記被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトであることを特徴とする、請求項２６に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学または生物製薬の技術分野に関し、より具体的に、天然分子に近いポリペプチド融合分子に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質分子は、細胞および生体において様々な生理機能を発揮する。中では、抗体、Ｔ細胞受容体、酵素や様々なサイトカインなどが含まれる。現在、大多数の生物薬の大分子は、抗体分子から様々なタンパク質工学の手段によって誘導されたものである。複数のタンパク質ドメインを組み合わせる場合、最も使用される方法は、一つのタンパク質ドメインのＣ末端を、柔軟性ペプチドを介してもう一つのドメインのＮ末端に連結するものである。たとえば、ｓｃＦｖは、柔軟性ペプチドを介して抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結することにより、一本鎖抗体を形成する。柔軟性ペプチドの最大の作用は、重鎖と相応する軽鎖を単一のポリペプチド長鎖分子に発現させることで、発現および下流の調製・処理などを便利にすることである。しかしながら、当該構造の抗体は、薬になると免疫原性のリスクが生じるため、上記リスクが避けられるように、このような生物薬は天然状態に近い分子を生成する方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の目的は、天然状態に近いマルチドメイン融合タンパク質％。を得ることである。このような天然状態に近いマルチドメイン融合タンパク質％。を構成する各エレメント、たとえば、構造が式ＩａまたはＩｂで表される融合タンパク質、エレメントＡ２、エレメントＢ２は、混合すると、生物学的機能を有するマルチドメイン融合タンパク質％になりうる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明の第一の側面では、融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されるポリペプチドを含むことを特徴とするものを提供する。
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。前記柔軟性リンカーは選択できるものである。
「－」は共有結合である。）
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。前記柔軟性リンカーは選択できるものである。
「－」は共有結合である。）
【0005】
一部の具体的な実施形態において、融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されるものを公開する。
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。）
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。）
【0006】
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質はＮ末端からＣ末端の構造が式Ｉａで表される。
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質では、Ｂ（特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）のＮ末端とＡ１（たとえば、免疫反応のない抗体一本鎖分子）のＣ末端が連結している。
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質では、Ｂ（特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）のＮ末端とＡ１（たとえば、免疫反応のない抗体一本鎖分子）のＣ末端が連結している。
【0007】
一部の具体的な実施形態において、前記の柔軟性リンカーはペプチドリンカーである。
一部の具体的な実施形態において、前記のペプチドリンカーは１～５０個のアミノ酸、好ましくは１～２０個のアミノ酸、より好ましくは１～１０個のアミノ酸、さらに好ましくは１～６個のアミノ酸を有する。
一部の具体的な実施形態において、前記のペプチドリンカーは１～５０個のアミノ酸、好ましくは１～２０個のアミノ酸、より好ましくは１～１０個のアミノ酸、さらに好ましくは１～６個のアミノ酸を有する。
【0008】
一部の具体的な実施形態において、前記のペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎの構造を有し、ここで、ｎは１～５の正の整数である。
一部の具体的な実施形態において、前記のペプチドリンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
一部の具体的な実施形態において、前記のペプチドリンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
【0009】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記抗体はＴ細胞の表面分子に結合する特性を持つものである。
一部の具体的な実施形態において、前記抗体はＴ細胞の表面分子に結合する特性を持つものである。
【0010】
一部の具体的な実施形態において、前記抗体はＵＣＨＴ１、ＯＫ３、１２Ｆ６など、またはこれらの抗体の突然変異分子でもよく、前記突然変異分子のアミノ酸配列は野生型の相応する分子のアミノ酸配列と比べて少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列である。
【0011】
一部の具体的な実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムでは、前記抗体の重鎖可変領域の４４番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に、前記抗体の軽鎖可変領域の１００番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に突然変異している。
一部の具体的な実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムでは、前記抗体の重鎖可変領域の１０５番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に、前記抗体の軽鎖可変領域の４３番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に突然変異している。
一部の具体的な実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムでは、前記抗体の重鎖可変領域の１０５番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に、前記抗体の軽鎖可変領域の４３番目のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）に突然変異している。
【0012】
一部の具体的な実施形態において、前記抗体では、前記の抗体の重鎖可変領域の４４番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステム、以下同様）のアミノ酸、たとえば、グリシン（Ｇｌｙ）および抗体の軽鎖可変領域の１００番目のアミノ酸、たとえば、グルタミンがシステイン（Ｃｙｓ）で置換されている。
【0013】
一部の具体的な実施形態において、前記抗体では、前記の抗体の重鎖可変領域の１０５５番目のアミノ酸、たとえば、グルタミン（Ｇｌｎ）および抗体の軽鎖可変領域の４３番目のアミノ酸、たとえば、アラニンがシステイン（Ｃｙｓ）で置換されている。
【0014】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＡ１はＴ細胞の表面抗原、たとえば、ＣＤ３抗原に結合しないか、結合するがＴ細胞を活性化させないものである。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含む。
【0015】
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列である。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列である。
【0016】
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列である。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖ヘテロ二量体複合分子、抗体分子Ｆａｂ複合分子、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖ヘテロ二量体複合分子、抗体分子Ｆａｂ複合分子、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0017】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢはＢ１とＢ２がジスルフィド結合を介して組み合わせてなるもので、ここで、Ｂ１はＴＣＲα鎖、Ｂ２はＴＣＲβ鎖であるか、あるいは、Ｂ１はＴＣＲβ鎖、Ｂ２はＴＣＲα鎖である。
一部の具体的な実施形態において、前記二量体のα鎖またはβ鎖のＮ末端、あるいは一本鎖αβＴＣＲのＮ末端、あるいはＴＣＲα鎖のＮ末端、あるいはＴＣＲβ鎖のＮ末端、あるいは抗体分子Ｆａｂの重鎖または軽鎖のＮ末端、あるいは一本鎖抗体分子のＮ末端は、免疫反応のない抗体一本鎖分子のＣ末端のアミノ酸に連結している。
一部の具体的な実施形態において、前記二量体のα鎖またはβ鎖のＮ末端、あるいは一本鎖αβＴＣＲのＮ末端、あるいはＴＣＲα鎖のＮ末端、あるいはＴＣＲβ鎖のＮ末端、あるいは抗体分子Ｆａｂの重鎖または軽鎖のＮ末端、あるいは一本鎖抗体分子のＮ末端は、免疫反応のない抗体一本鎖分子のＣ末端のアミノ酸に連結している。
【0018】
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のエレメントＢ（すなわち、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）は特異的にｐＭＨＣに結合し、エレメントＡ１（すなわち、免疫反応のない抗体一本鎖分子）はＴ細胞の抗原分子に結合しないか、Ｔ細胞の抗原分子に結合するが、有効にＴ細胞の活性化または生理反応の発生を誘導することができない。
【0019】
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質と遊離のもう一つの免疫反応のないポリペプチドドメイン分子Ａ２を混合すると、前記融合タンパク質はＡ２と融合タンパク質－Ａ２複合分子を形成し、前記融合タンパク質－Ａ２複合分子はＴ細胞をリダイレクトし、そして有効に当該リダイレクトされたＴ細胞の活性化および免疫生理反応の発生をさせる。
【0020】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲ分子はヘテロ二量体のαβＴＣＲポリペプチド対で、ここで、前記αおよびβポリペプチドはそれぞれＴＣＲの可変領域および定常領域を含むが、ＴＣＲ膜貫通領域および細胞内領域がない。
【0021】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１における４７番目のトレオニン（Ｔｈｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５６番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0022】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の５２番目のアルギニン（Ａｒｇ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５３番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0023】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１８番目のアラニン（Ａｌａ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0024】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の９番目のチロシン（Ｔｙｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１９番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を置換してなるジスルフィド結合を介してしている。
【0025】
一部の具体的な実施形態において、前記ＴＲＡＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３４で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである。
【0026】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0027】
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示される配列、あるいは配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２と少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列を含む。
【0028】
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示される配列、あるいは配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２と少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列である。
【0029】
本発明の第二の側面では、融合タンパク質複合分子であって、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩｃまたはＩｄで表されるものを提供する。
Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のないポリペプチド分子それぞれ独立である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用である。）
一部の具体的な実施形態において、「…」はジスルフィド結合である。
Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のないポリペプチド分子それぞれ独立である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用である。）
一部の具体的な実施形態において、「…」はジスルフィド結合である。
【0030】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。たとえば、前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域で、かつ前記Ａ２エレメントは抗体の軽鎖可変領域であるか、あるいは、前記エレメントＡ１は抗体の軽鎖可変領域で、かつ前記Ａ２元件は抗体の重鎖可変領域である。本発明の前記抗体はＵＣＨＴ１、ＯＫ３、１２Ｆ６など、またはこれらの抗体の突然変異分子でもよく、前記突然変異分子のアミノ酸配列は野生型の相応する分子のアミノ酸配列と比べて少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列である。
【0031】
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含む。
【0032】
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列である。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列である。
一部の具体的な実施形態において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列である。
【0033】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
【0034】
一部の具体的な実施形態において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢはＴＣＲ分子で、前記ＴＣＲ分子のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢはＴＣＲ分子で、前記ＴＣＲ分子のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0035】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＢはＴＣＲ分子で、前記ＴＣＲ分子のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるもので、かつ前記エレメントＡ１はＬを介してＴＣＲβ鎖のＮ末端にカップリングしている。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＬは（ＧＧＧＧＳ）ｎのような構造を含み、ここで、ｎは１～５の正の整数で、好ましくは配列番号９で示される配列を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＬは（ＧＧＧＧＳ）ｎのような構造を含み、ここで、ｎは１～５の正の整数で、好ましくは配列番号９で示される配列を含む。
【0036】
本発明の第三の側面では、ポリヌクレオチドであって、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子をコードするものを提供する。
【0037】
一部の具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、エレメントＡ１、エレメントＡ２、エレメントＢ（Ｂ１、Ｂ２を含む）、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、または一本鎖抗体分子からなる群から選ばれるタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【0038】
一部の具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは配列番号２、４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、６、８、１１、１３、３１または３３で示されるヌクレオチド配列を有する。
一部の具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列番号１９、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号８、配列番号１３または配列番号３３で示されるヌクレオチド配列を有する。
一部の具体的な実施形態において、前記のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
一部の具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列番号１９、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号８、配列番号１３または配列番号３３で示されるヌクレオチド配列を有する。
一部の具体的な実施形態において、前記のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【0039】
本発明の第四の側面では、発現ベクターであって、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドを含有するものを提供する。
一部の具体的な実施形態において、前記の発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、ほかの遺伝子導入系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
好適に、前記発現ベクターはウイルスベクター、たとえば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組み合わせを含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、ほかの遺伝子導入系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
好適に、前記発現ベクターはウイルスベクター、たとえば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組み合わせを含む。
【0040】
本発明の第五の側面では、宿主細胞であって、本発明の第四の側面に記載の発現ベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれたものを提供する。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、ファージ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、ファージ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0041】
一部の具体的な実施形態において、前記原核細胞は、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、ストレプトマイセス菌、プロテウス・ミラビリス、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記真核細胞は、ピキア・パストリス、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記真核細胞は、ピキア・パストリス、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0042】
一部の具体的な実施形態において、前記真核細胞は、ツマジロクサヨトウなどの昆虫細胞、タバコなどの植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞またはＣＯＳ細胞がより好ましい。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞はピキア・パストリスである。
一部の具体的な実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞またはＣＯＳ細胞がより好ましい。
一部の具体的な実施形態において、前記の宿主細胞はピキア・パストリスである。
【0043】
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子の生成に適する条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、前記融合タンパク質または前記融合タンパク質複合分子を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を精製および／または修飾する。
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２の通りである。
（ａ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子の生成に適する条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、前記融合タンパク質または前記融合タンパク質複合分子を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を精製および／または修飾する。
一部の具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２の通りである。
【0044】
本発明の第七の側面では、以下のものを含有する免疫複合体を提供する：
（ａ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
（ａ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
【0045】
一部の具体的な実施形態において、前記の放射性核種は以下のものを含む：
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
【0046】
一部の具体的な実施形態において、前記複合部分は薬物または毒素である。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物は細胞毒性薬物である。
一部の具体的な実施形態において、前記の細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物は細胞毒性薬物である。
一部の具体的な実施形態において、前記の細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0047】
一部の具体的な実施形態において、特に有用な細胞毒性薬物の例は、たとえば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、たとえばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（たとえばＤＭ１やＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、ベンゾジアゼピン系（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）またはベンゾジアゼピン含有薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇ）（たとえばピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン系（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン系（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、またはこれらの組み合わせを含む。
【0048】
一部の具体的な実施形態において、前記の毒素は、オーリスタチン類（たとえば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、マイタンシノイド、リシン、リシンＡ－鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアミシン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0049】
一部の具体的な実施形態において、前記複合部分は検出可能なマーカーである。
一部の具体的な実施形態において、前記複合部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ）、または任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記複合部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ）、または任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
【0050】
本発明の第八の側面では、以下のものを含有する薬物組成物を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第四の側面に記載の発現ベクター、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせ；
（ｉｉ）任意に、エレメントＡ２；ならびに
（ｉｉｉ） 薬学的に許容される担体。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第四の側面に記載の発現ベクター、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせ；
（ｉｉ）任意に、エレメントＡ２；ならびに
（ｉｉｉ） 薬学的に許容される担体。
【0051】
一部の具体的な実施形態において、前記エレメントＡ２は、抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
一部の具体的な実施形態において、前記の免疫複合体の複合部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は注射の剤形である。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は、さらに、腫瘍を治療するほかの薬物を含有する。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は、腫瘍を予防および／または治療する薬物を製造するためのものである。
一部の具体的な実施形態において、前記の免疫複合体の複合部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は注射の剤形である。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は、さらに、腫瘍を治療するほかの薬物を含有する。
一部の具体的な実施形態において、前記の薬物組成物は、腫瘍を予防および／または治療する薬物を製造するためのものである。
【0052】
本発明の第九の側面では、疾患を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、本発明の第八の側面に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
一部の具体的な実施形態において、前記の対象は哺乳動物、たとえば、ヒト、キヌザルを含む。
一部の具体的な実施形態において、前記の対象は哺乳動物、たとえば、ヒト、キヌザルを含む。
【0053】
本発明の第十の側面では、以下のものを有する組み換えタンパク質を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
一部の具体的な実施形態において、前記のタグ配列はＦｃタグ、ＨＡタグおよび６Ｈｉｓタグを含む。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
一部の具体的な実施形態において、前記のタグ配列はＦｃタグ、ＨＡタグおよび６Ｈｉｓタグを含む。
【0054】
本発明の第十一の側面では、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質複合分子、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第四の側面に記載の発現ベクター、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、本発明の第八の側面に記載の薬物組成物、本発明の第十の側面に記載の組み換えタンパク質の使用であって、被験者において腫瘍を予防および／または治療する薬物を製造するための使用を提供する。
【0055】
一部の具体的な実施形態において、前記腫瘍は、乳癌、肺癌、肝臓癌、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一部の具体的な実施形態において、前記被験者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
一部の具体的な実施形態において、前記被験者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【0056】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図33a】図３３ａはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４二ドメイン融合分子（ＶＨ－ＴＣＲβ、ＶＬ－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ２陽性、ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、乳癌細胞系）に対する殺傷を示す。
【図33b】図３３ｂはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４二ドメイン融合分子（ＶＨ－ＴＣＲβ、ＶＬ－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ２陽性、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、乳癌細胞系）に対する殺傷を示す。
【図34a】図３４ａはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４二ドメイン融合分子（ＶＨ－ＴＣＲβ、ＶＬ－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系に対する殺傷を示す。
【図34b】図３４ｂはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４二ドメイン融合分子（ＶＨ－ＴＣＲβ、ＶＬ－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対する殺傷を示す。
【図35a】図３５ａはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４マルチドメイン融合分子（ＶＨ４４－ＴＣＲβ、ＶＨ１０５－ＴＣＲβ、ＶＬ４３－ＴＣＲβ、ＶＬ１００－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対する殺傷を示す。
【図35b】図３５ｂはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４マルチドメイン融合分子（ＶＨ４４－ＴＣＲβ、ＶＨ１０５－ＴＣＲβ、ＶＬ４３－ＴＣＲβ、ＶＬ１００－ＴＣＲβの様態）が仲介するＣＤ８＋細胞のＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系に対する殺傷を示す。
【図36a】図３６ａはＬＤＨ法によって検出された１Ｇ４マルチドメイン融合分子（ＶＨ４４－ＴＣＲβ、ＶＨ１０５－ＴＣＲβ）が仲介するＣＤ８＋細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ２陽性、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、乳癌細胞系）に対する殺傷を示す。
【発明を実施するための形態】
【0058】
本発明者は、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて意外に、１種類の免疫反応のない抗体一本鎖分子Ａ１と特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、またはその断片ＢがＬを介してカップリングしてなる融合タンパク質（たとえば、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表される融合タンパク質）を見出したが、前記融合タンパク質はエレメントＡ２（好ましくは免疫反応のないエレメントＡ２）と簡単に混合すると二重生物学的機能を有する融合タンパク質複合分子（たとえば、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩｃまたはＩｄで表される融合タンパク質複合分子）を形成することができ、当該融合タンパク質複合分子は天然状態に近いマルチドメイン融合分子で、短いペプチド断片（たとえば、５アミノ酸のＧＧＧＧＳ）がなくても、あるいはそれのみでエレメントＡ１（好ましくは免疫反応のないエレメントＡ１）と特異的にｐＭＨＣ抗原に結合するエレメントＢを連結すればよいため、従来の融合タンパク質において人工的な柔軟性ペプチド鎖（通常、５アミノ酸超）を導入して各ドメインを単一のポリペプチド分子に連結することで生じうる免疫原性のリスクを避けることができる。本発明の融合タンパク質複合分子は、生成が簡便で、天然状態に近いものである。これにより、本発明が完成された。
【0059】
具体的に、本発明において、発明者は、Ｔ細胞の活性化を誘発しないように、突然変異した免疫反応のない抗体の重鎖可変領域ＶＨまたは免疫反応のない抗体の軽鎖可変領域ＶＬをＧＧＧＧＳを介してＴＣＲ β鎖のＮ末端にカップリングした後、ＴＣＲ α鎖と混合して適切な条件において融合タンパク質を形成する。しかしながら、上記分子と免疫反応のない抗体の軽鎖可変領域ＶＬまたは免疫反応のない抗体の重鎖可変領域ＶＨを混合すると、復元、再生、透析を経てもう１種類の融合タンパク質複合分子が得られる。実験の結果から、前記融合タンパク質複合分子は多くの腫瘍細胞（たとえば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞系、ＮＣＩ－Ｈ１２９９肺癌細胞系およびＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系など）を殺傷するようにＣＤ８＋Ｔ細胞をリダイレクトさせる能力を有する。
【0060】
用語
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
【0061】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【0062】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）ＦＲと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２， 卷Ｉ，６４７－６６９頁（１９９１）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【0063】
当業者に知られるように、免疫複合体および融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素およびほかの診断または治療分子と本発明の抗体またはその断片が結合してなる複合体を含む。
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができ、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができ、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
【0064】
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つの相補性決定領域を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つの相補性決定領域を含む。
【0065】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれ、４つのＦＲのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その中のＦＲで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるＣＤＲおよび相応の軽鎖におけるＣＤＲが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がＦＲあるいはＣＤＲ領域を構成するか確認することができる。
【0066】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原結合に関与するため、特に注目されている。そのため、ＣＤＲ含有モノクローナル抗体の重鎖可変領域鎖を有する分子は、そのＣＤＲはここで同定されるＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を持つものであれば、本発明に含まれる。
【0067】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【0068】
本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（i）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、あるいは（ii）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（iii）成熟のポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのような、ポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、あるいは（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質前駆体配列、あるいは６Ｈｉｓタグと形成した融合タンパク質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
【0069】
当該ポリペプチドの変異の様態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低い厳格さの条件において本発明の抗体のコードＤＮＡと交雑が可能なＤＮＡがコードするタンパク質、および抗本発明の抗体の抗血清で得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【0070】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的変異ポリペプチドは、表１のようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【表1】
【0071】
典型的に、本発明において、免疫反応のない抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間で人工的にシステインを導入するような様態で鎖間ジスルフィド結合が形成しているため、安定した二量体が得られる。
【0072】
具体的に、本発明の一つの好適な例において、システインで重鎖可変領域のＧｌｙ４４および軽鎖可変領域のＧｌｎ１００を置換することによって重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合による連結を構築する。本発明のもう一つの好適な例において、システインで重鎖可変領域のＡｌａ４３および軽鎖可変領域のＧｌｎ１０５を置換することによって重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合による連結を構築する。このように、抗体の重鎖と軽鎖の間に１５～３０アミノ酸の柔軟性ペプチドを導入する必要がなく、非ヒト分子または非ヒト生体タンパク質表面抗原決定基になって免疫応答を誘発することが避けられ、当該二重機能分子の免疫原性のリスクが軽減される。
【0073】
Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）
ＴＣＲは国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）で記述することができる。天然のαβヘテロ二量体のＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。広義的に、各鎖は、可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、さらに可変領域と連結領域の間に短い多変領域を含むが、この多変領域は通常連結領域の一部と見なされる。独特なＩＭＧＴのＴＲＡＪおよびＴＲＢＪでＴＣＲの連結領域を、ＩＭＧＴのＴＲＡＣおよびＴＲＢＣでＴＣＲの定常領域を同定する。
ＴＣＲは国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）で記述することができる。天然のαβヘテロ二量体のＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。広義的に、各鎖は、可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、さらに可変領域と連結領域の間に短い多変領域を含むが、この多変領域は通常連結領域の一部と見なされる。独特なＩＭＧＴのＴＲＡＪおよびＴＲＢＪでＴＣＲの連結領域を、ＩＭＧＴのＴＲＡＣおよびＴＲＢＣでＴＣＲの定常領域を同定する。
【0074】
各可変領域は、フレームワーク配列に嵌っているＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。ＩＭＧＴ命名法において、ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶの異なる番号はそれぞれ異なるＶαのタイプおよびＶβのタイプを指す。ＩＭＧＴシステムにおいて、α鎖の定常ドメインは、ＴＲＡＣ＊０１という記号を有し、ここで、「ＴＲ」はＴ細胞受容体遺伝子を、「Ａ」はα鎖遺伝子を、Ｃは定常領域を、「＊０１」は対立遺伝子１を表す。β鎖の定常ドメインは、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１という記号を有し、ここで、「ＴＲ」はＴ細胞受容体遺伝子を、「Ｂ」はβ鎖遺伝子を、Ｃは定常領域を、「＊０１」は対立遺伝子１を表す。α鎖の定常領域は唯一のものになっており、β鎖の様態において、二つの可能な定常領域の遺伝子「Ｃ１」および「Ｃ２」が存在する。当業者は公開されているＩＭＧＴデータベースを通してＴＣＲαおよびβ鎖の定常領域の遺伝子配列を得ることができる。
【0075】
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般的に、それぞれ２つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインと定常ドメインを有するとされている。可変ドメインは連結した可変領域と連結領域で構成される。そのため、本願の明細書および請求の範囲において、「ＴＣＲのα鎖の可変ドメイン」とは連結したＴＲＡＶとＴＲＡＪ領域を、同様に、「ＴＣＲのβ鎖の可変ドメイン」とは連結したＴＲＢＶとＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域を指す。ＴＣＲα鎖の可変ドメインの３つのＣＤＲはそれぞれＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αで、ＴＣＲβ鎖の可変ドメインの３つのＣＤＲはそれぞれＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βである。本発明のＴＣＲの可変ドメインのフレームワーク配列はネズミ由来のものでもヒト由来のものでもよいが、ヒト由来のものが好ましい。
ＴＣＲの定常ドメインは、細胞内部分、膜貫通領域および細胞外部分を含む。
ＴＣＲの定常ドメインは、細胞内部分、膜貫通領域および細胞外部分を含む。
【0076】
本発明の一つの好適な例において、ＴＣＲ部分はヘテロ二量体で、ここで、前記αおよびβポリペプチドはＴＣＲ分子の可変領域および定常領域を含むが、細胞内領域および膜貫通領域がない。当該ヘテロ二量体は人工的に導入された鎖間ジスルフィド結合を介して連結している。具体的に、αおよびβポリペプチドの定常領域は、ＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＴｈｒ４７とＴＲＢＣ＊０１のエクソン１におけるＳｅｒ５６を置換したシステインの間のジスルフィド結合を介して連結している。
【0077】
好ましくは、本発明に係るＴＣＲ分子はヘテロ二量体のαβＴＣＲポリペプチド対で、ここで、前記αおよびβポリペプチドはそれぞれＴＣＲの可変領域および定常領域を含むが、ＴＣＲ膜貫通領域および細胞内領域がない。
より好ましくは、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列とはＴＣＲの細胞外のアミノ酸配列のことである。
より好ましくは、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列とはＴＣＲの細胞外のアミノ酸配列のことである。
【0078】
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１における４７番目のトレオニン（Ｔｈｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５６番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0079】
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の５２番目のアルギニン（Ａｒｇ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５３番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0080】
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１８番目のアラニン（Ａｌａ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0081】
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の９番目のチロシン（Ｔｙｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１９番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を置換してなるジスルフィド結合連結を介してしている。
【0082】
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0083】
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＡＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３４で示されるものである（図１８を参照する）。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである（図１９を参照する）。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである（図２０を参照する）。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである（図１９を参照する）。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである（図２０を参照する）。
【0084】
融合タンパク質
本明細書で用いられるように、融合タンパク質とは前記タンパク質分子の遺伝子コードが連続的で、かつ単一のｍＲＮＡで翻訳される２つまたは２つ以上のドメインからなる単一の融合したタンパク質のポリペプチド鎖で、そして非自然状態のドメインの間の融合を指す。
本明細書で用いられるように、融合タンパク質とは前記タンパク質分子の遺伝子コードが連続的で、かつ単一のｍＲＮＡで翻訳される２つまたは２つ以上のドメインからなる単一の融合したタンパク質のポリペプチド鎖で、そして非自然状態のドメインの間の融合を指す。
【0085】
本発明では、融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されるものを提供する。
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のない抗体一本鎖分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。）
Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のない抗体一本鎖分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。）
【0086】
好ましくは、前記融合タンパク質はＮ末端からＣ末端の構造が式Ｉａで表される。
好ましくは、前記融合タンパク質では、Ｂ（特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）のＮ末端とＡ１（免疫反応のない抗体一本鎖分子）のＣ末端が連結している。
好ましくは、前記融合タンパク質では、Ｂ（特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）のＮ末端とＡ１（免疫反応のない抗体一本鎖分子）のＣ末端が連結している。
【0087】
好ましくは、前記の柔軟性リンカーはペプチドリンカーである。
好ましくは、前記のペプチドリンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
好ましくは、前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。
好ましくは、前記のペプチドリンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
好ましくは、前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。
【0088】
本発明のもう一つの好適な実施例において、前記抗体では、前記の抗体の重鎖可変領域の４４番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステム、以下同様）のグリシン（Ｇｌｙ）および抗体の軽鎖可変領域の１００番目のグルタミン（Ｇｌｎ）がシステイン（Ｃｙｓ）で置換されている。
【0089】
本発明の一つの好適な実施例において、前記抗体では、前記の抗体の重鎖可変領域の１０５５番目のグルタミン（Ｇｌｎ）および抗体の軽鎖可変領域の４３番目のアラニン（Ａｌａ）がシステイン（Ｃｙｓ）で置換されている。
本発明の一つの好適な実施例において、前記エレメントＡ１が結合するのはＣＤ３抗原である。
本発明の一つの好適な実施例において、前記抗体は、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、１２Ｆ６からなる群から選ばれる。
本発明の一つの好適な実施例において、前記エレメントＡ１が結合するのはＣＤ３抗原である。
本発明の一つの好適な実施例において、前記抗体は、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、１２Ｆ６からなる群から選ばれる。
【0090】
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示されるものである。
【0091】
典型的に、前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の一つの好適な実施例において、前記エレメントＢはＢ１とＢ２がジスルフィド結合を介して組み合わせてなるもので、ここで、Ｂ１はＴＣＲα鎖、Ｂ２はＴＣＲβ鎖であるか、あるいは、Ｂ１はＴＣＲβ鎖、Ｂ２はＴＣＲα鎖である。
本発明の一つの好適な実施例において、前記エレメントＢはＢ１とＢ２がジスルフィド結合を介して組み合わせてなるもので、ここで、Ｂ１はＴＣＲα鎖、Ｂ２はＴＣＲβ鎖であるか、あるいは、Ｂ１はＴＣＲβ鎖、Ｂ２はＴＣＲα鎖である。
【0092】
典型的に、本発明において、ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の免疫反応のない重鎖または軽鎖可変領域のドメインが連結していてもよい。
本発明の一つの実施形態において、ＴＣＲ β鎖のＮ末端が一つのペンタペプチドのリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号９）を介して抗体の重鎖（重鎖可変領域）のＣ末端に連結している。
本発明の一つの実施形態において、ＴＣＲ β鎖のＮ末端が一つのペンタペプチドのリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号９）を介して抗体の軽鎖（軽鎖可変領域）のＣ末端に連結している。
本発明の一つの実施形態において、ＴＣＲ β鎖のＮ末端が一つのペンタペプチドのリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号９）を介して抗体の重鎖（重鎖可変領域）のＣ末端に連結している。
本発明の一つの実施形態において、ＴＣＲ β鎖のＮ末端が一つのペンタペプチドのリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号９）を介して抗体の軽鎖（軽鎖可変領域）のＣ末端に連結している。
【0093】
本発明の一つの好適な実施例において、前記二量体のα鎖またはβ鎖のＮ末端、あるいは一本鎖αβＴＣＲのＮ末端、あるいはＴＣＲα鎖のＮ末端、あるいはＴＣＲβ鎖のＮ末端、あるいは抗体分子Ｆａｂの重鎖または軽鎖のＮ末端、あるいは一本鎖抗体分子のＮ末端は、免疫反応のない抗体一本鎖分子のＣ末端のアミノ酸に連結している。
【0094】
本発明の一つの好適な実施例において、前記融合タンパク質のエレメントＢ（すなわち、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片）は特異的にｐＭＨＣに結合し、エレメントＡ１（すなわち、免疫反応のない抗体一本鎖分子）はＴ細胞の抗原分子に結合しないか、Ｔ細胞の抗原分子に結合するが、有効にＴ細胞の活性化または生理反応の発生を誘導することができない。
【0095】
本発明の一つの好適な実施例において、前記融合タンパク質と遊離のもう一つの免疫反応のないポリペプチドドメイン分子Ａ２を混合すると、前記融合タンパク質はＡ２と融合タンパク質－Ａ２複合体を形成し、前記融合タンパク質－Ａ２複合体はＴ細胞をリダイレクトし、そして有効に当該リダイレクトされたＴ細胞の活性化および免疫生理反応の発生をさせる。
【0096】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲ分子はヘテロ二量体のαβＴＣＲポリペプチド対で、ここで、前記αおよびβポリペプチドはそれぞれＴＣＲの可変領域および定常領域を含むが、ＴＣＲ膜貫通領域および細胞内領域がない。
【0097】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１における４７番目のトレオニン（Ｔｈｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５６番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0098】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の５２番目のアルギニン（Ａｒｇ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における５３番目のセリン（Ｓｅｒ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0099】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１８番目のアラニン（Ａｌａ）を置換してなるジスルフィド結合を介して連結している。
【0100】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲ分子のαおよびβポリペプチドの定常領域は、システイン（Ｃｙｓ）でＴＲＡＣ＊０１のエクソン１におけるＩＭＴＧ番号付け法の９番目のチロシン（Ｔｙｒ）とＴＲＢＣ＊０１またはＴＲＢＣ＊０２のエクソン１における１９番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を置換してなるジスルフィド結合連結を介してしている。
【0101】
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＡＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３４で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０１のアミノ酸配列は配列番号３５で示されるものである。
本発明の一つの好適な例において、前記ＴＲＢＣ＊０２のアミノ酸配列は配列番号３６で示されるものである。
【0102】
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0103】
本発明のもう一つの好適な実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示されるものである。
【0104】
融合タンパク質複合分子
本明細書で用いられるように、融合タンパク質複合分子とは二つまたは二つ以上の遺伝子によってそれぞれコードされ、かつ二つまたは二つ以上のｍＲＮＡによって翻訳される二つまたは二つ以上のタンパク質のポリペプチド鎖が細胞外において非共有および／または共有結合の様態で一体に組み合わせた、単一または二つまたは二つ以上の生理または生物物理機能を有する複合分子で、そして非自然状態のポリペプチド複合分子を指す。
本明細書で用いられるように、融合タンパク質複合分子とは二つまたは二つ以上の遺伝子によってそれぞれコードされ、かつ二つまたは二つ以上のｍＲＮＡによって翻訳される二つまたは二つ以上のタンパク質のポリペプチド鎖が細胞外において非共有および／または共有結合の様態で一体に組み合わせた、単一または二つまたは二つ以上の生理または生物物理機能を有する複合分子で、そして非自然状態のポリペプチド複合分子を指す。
【0105】
本明細書で用いられるように、用語「融合タンパク質複合分子」、「天然状態に近いマルチドメイン融合分子」、「マルチドメイン融合分子」、「融合タンパク質－Ａ２複合体」は同様の意味を持ち、入れ替えて使用することができ、いずれも二つのエレメントＡ１、Ａ２と、Ｌ、Ｂからなる、二重生物学的機能を有する融合タンパク質複合分子（たとえば、Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩｃまたはＩｄで表される融合タンパク質複合分子）を指す。好ましくは、エレメントＡ１、Ａ２は免疫反応のないものである。
好ましくは、本発明の融合タンパク質複合分子は融合タンパク質Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）またはＢ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）とエレメントＡ２で組み立てて得られるものである。
好ましくは、本発明の融合タンパク質複合分子は融合タンパク質Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）またはＢ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）とエレメントＡ２で組み立てて得られるものである。
【0106】
好ましくは、前記融合タンパク質はＮ末端からＣ末端の構造が式ＩｃまたはＩｄで表される。
Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のない抗体一本鎖分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用、好ましくはジスルフィド結合である。）
Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のない抗体一本鎖分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用、好ましくはジスルフィド結合である。）
【0107】
好ましくは、前記エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。より好ましくは、前記エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のない抗体の重鎖可変領域、免疫反応のない抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。
【0108】
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示されるものである。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示されるものである。
【0109】
典型的に、前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
典型的に、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
典型的に、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
典型的に、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるものである。
典型的に、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0110】
典型的に、前記エレメントＢはＴＣＲ分子で、前記ＴＣＲ分子のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
典型的に、前記エレメントＢはＢ１とＢ２がジスルフィド結合を介して組み合わせてなるもので、ここで、Ｂ１はＴＣＲα鎖、Ｂ２はＴＣＲβ鎖であるか、あるいは、Ｂ１はＴＣＲβ鎖、Ｂ２はＴＣＲα鎖である。
典型的に、前記エレメントＢはＢ１とＢ２がジスルフィド結合を介して組み合わせてなるもので、ここで、Ｂ１はＴＣＲα鎖、Ｂ２はＴＣＲβ鎖であるか、あるいは、Ｂ１はＴＣＲβ鎖、Ｂ２はＴＣＲα鎖である。
【0111】
本発明の一つの好適な実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示されるものである。
本発明のもう一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
本発明のもう一つの好適な実施例において、前記のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、前記のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【0112】
本発明のもう一つの好適な実施例において、前記エレメントＢはＴＣＲ分子で、前記ＴＣＲ分子のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示されるもので、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は配列番号３で示されるもので、かつ前記エレメントＡ１はＬを介してＴＣＲβ鎖のＮ末端にカップリングしている。
【0113】
典型的に、前記エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。好ましくは、エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のない抗体の重鎖可変領域、免疫反応のない抗体の軽鎖可変領域からなる群から選ばれる。
【0114】
ポリヌクレオチド、宿主細胞
また、本発明は、上記融合タンパク質、エレメントＡ１、エレメントＡ２、エレメントＢ（Ｂ１、Ｂ２を含む）、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、または一本鎖抗体分子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
また、本発明は、上記融合タンパク質、エレメントＡ１、エレメントＡ２、エレメントＢ（Ｂ１、Ｂ２を含む）、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、抗体分子Ｆａｂ、または一本鎖抗体分子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
【0115】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
【0116】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。そして、ハイブリダイズできるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0117】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列あるいはの断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。適用できる方法として、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成する。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。また、重鎖のコード配列を発現タグ（たとえば６Ｈｉｓ）一体に融合させ、融合タンパク質を形成してもよい。
【0118】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。本発明に係る生物分子（核酸、タンパク質など）は単離の形態で存在する生物分子を含む。
【0119】
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0120】
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【0121】
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、ミバエＳ２若しくはＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞のような動物細胞などがある。
【0122】
ＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
【0123】
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
【0124】
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【0125】
免疫複合体
本発明の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子は単独に使用してもよく、検出可能なマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子は単独に使用してもよく、検出可能なマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0126】
本発明の抗体と結合または複合することができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物毒素、３．サイトカイン、たとえばＩＬ－２など、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．磁性ナノ粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））などを含むが、これらに限定されない。
【0127】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子、ならびに薬学的に許容される担体を含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子、ならびに薬学的に許容される担体を含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
【0128】
本発明の薬物組成物は直接ＣＤ８＋Ｔ細胞をリダイレクトして多くの腫瘍細胞を殺傷するのに使用することができるため、腫瘍の治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
【0129】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子（またはその免疫複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【0130】
薬物組成物の使用時、安全有効量の融合タンパク質および／または融合タンパク質複合分子（またはその免疫複合体）を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約３０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【0131】
腫瘍
用語「腫瘍」とは病理学的分類や侵入の段階にかかわらず、すべての種類の癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性転化細胞、組織または器官を含む。腫瘍の実施例は固形腫瘍、軟部組織腫瘍や転移性病巣を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は様々な器官・系の悪性腫瘍、たとえば肉腫、肺扁平上皮癌や癌を含む。たとえば、感染した前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸（たとえば結腸）、および尿生殖路（たとえば腎臓、上皮細胞）、咽頭が挙げられる。肺扁平上皮癌は悪性腫瘍、たとえば大半の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌や食道癌を含む。上記癌の転移性病巣は同様に本発明の方法および組成物で治療および予防することができる。
用語「腫瘍」とは病理学的分類や侵入の段階にかかわらず、すべての種類の癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性転化細胞、組織または器官を含む。腫瘍の実施例は固形腫瘍、軟部組織腫瘍や転移性病巣を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は様々な器官・系の悪性腫瘍、たとえば肉腫、肺扁平上皮癌や癌を含む。たとえば、感染した前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸（たとえば結腸）、および尿生殖路（たとえば腎臓、上皮細胞）、咽頭が挙げられる。肺扁平上皮癌は悪性腫瘍、たとえば大半の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌や食道癌を含む。上記癌の転移性病巣は同様に本発明の方法および組成物で治療および予防することができる。
【0132】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１）本発明の融合タンパク質では、ｓｃＦＶ分子のように柔軟性ポリペプチドリンカーを導入することを避けられるため、天然抗体分子の天然状態により近い。
（２）本発明の融合タンパク質では、ポリペプチド柔軟性リンカーの導入による免疫原性のリスクが低減される。
（１）本発明の融合タンパク質では、ｓｃＦＶ分子のように柔軟性ポリペプチドリンカーを導入することを避けられるため、天然抗体分子の天然状態により近い。
（２）本発明の融合タンパク質では、ポリペプチド柔軟性リンカーの導入による免疫原性のリスクが低減される。
【0133】
以下の具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第三版）（２００１） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。
【0134】
実施例１～７における１Ｇ４ ＴＣＲはＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子に提示されるＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３７）短鎖ペプチドに結合する。
実施例１
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号５（図３ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号６（図３ｂ）は配列番号５に相応する核酸配列である。
実施例１
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号５（図３ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号６（図３ｂ）は配列番号５に相応する核酸配列である。
【0135】
図２３はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号５で示される抗体の重鎖可変領域を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の重鎖はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号７（図４ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号８（図４ｂ）は配列番号７に相応する核酸配列である。
配列番号８（図４ｂ）は配列番号７に相応する核酸配列である。
【0136】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号８（図４ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号８（図４ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0137】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0138】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0139】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0140】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0141】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0142】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図２９（Ａ）に示された通りである。レーン１：非復元状態における１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）；レーン２：分子量マーカー；レーン３：復元状態における１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）。
【0143】
実施例２
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１０（図６ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１（図６ｂ）は配列番号１０に相応する核酸配列である。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１０（図６ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１（図６ｂ）は配列番号１０に相応する核酸配列である。
【0144】
図２４はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号１０で示される抗体の軽鎖を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の軽鎖はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号１２（図７ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号１３（図７ｂ）は配列番号１２に相応する核酸配列である。
配列番号１３（図７ｂ）は配列番号１２に相応する核酸配列である。
【0145】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号１３（図７ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号１３（図７ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0146】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0147】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0148】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0149】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0150】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0151】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図２９（Ｂ）に示された通りである。レーン１：非復元状態における１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）；レーン２：分子量マーカー；レーン３：復元状態における１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合タンパク質（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）。
【0152】
実施例３
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）および１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）の性質
二重機能融合分子は特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができることはすでにいくつかの研究で報告されている。その基本原理は、応答機能を発揮するようにＴ細胞を活性化させる重要なシグナルを模擬し、その高親和の特異的ＴＣＲによって腫瘍細胞の表面のｐＭＨＣ複合体を認識すると同時に、そのＣＤ３抗体末端によってＴ細胞で活性化する下流のシグナル経路を活性化させることで、特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができる。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）および１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合した融合分子（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）の性質
二重機能融合分子は特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができることはすでにいくつかの研究で報告されている。その基本原理は、応答機能を発揮するようにＴ細胞を活性化させる重要なシグナルを模擬し、その高親和の特異的ＴＣＲによって腫瘍細胞の表面のｐＭＨＣ複合体を認識すると同時に、そのＣＤ３抗体末端によってＴ細胞で活性化する下流のシグナル経路を活性化させることで、特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができる。
【0153】
以下の実施例では、本発明の抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域のみが融合した融合分子は標的細胞系を殺傷するようにＣＤ８＋Ｔ細胞をリダイレクトすることができないことが証明されている。当該試験は５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験で、定量的に細胞分解後放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定するものである。３０分間カップリングの酵素反応によって培地に放出されたＬＤＨを検出するが、酵素反応においてＬＤＨは一種のテトラゾリド（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に変換させることができる。生成した赤色産物の量は分解した細胞数に正比例する。標準の９６ウェルプレートリーダーによって４９０ ｎｍの可視光の吸光値のデータを収集することができる。
【0154】
当業者には、ＬＤＨの放出実験で細胞の機能を検出する方法は熟知されているものである。本実施例のＬＤＨ実験に使用された標的細胞系は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性、乳癌細胞系）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性、乳癌細胞系）およびＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性、肺癌細胞系）、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性、肺癌細胞系）である。
【0155】
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系とＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は５：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は１×１０６／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
【0156】
ＮＣＩ－Ｈ１２９９肺癌細胞系またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞系を標的細胞とした場合、１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合したタンパク質（ＶＨ－ＴＣＲ βの様態）および１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合したタンパク質（ＶＬ－ＴＣＲ βの様態）はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍに希釈した。
【0157】
９６ウェル丸底プレートを用意した後、ウェルに５０ μｌのエフェクター細胞、５０ μｌのマルチドメイン二重機能融合分子タンパク質および１００ μｌの標的細胞を入れ、同時に標的細胞最大分解ウェル、標的細胞自発ウェル、エフェクター細胞自発ウェル、培地自発ウェルおよび培地＋分解液の自発ウェルを設け、各ウェルの最終体積がいずれも２００ μｌで、かつそれぞれ３つの重複ウェルがあった。細胞が添加された９６ウェル丸底プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４ｈ培養した。その後、９６ウェル丸底細胞培養プレートを遠心機に入れ、２５０×ｇで４ ｍｉｎ遠心した。５０ μｌの上清を９６ウェル平底プレートに取り、そして５０ μｌの基質液を入れ、光を避けて常温で３０ ｍｉｎ反応させた。反応終了後、５０ μｌの停止液を入れ、すぐにマイクロプレートリーダーで４９０ ｎｍにおける吸光値を測定した。製品の説明書に従い、特異的殺傷効率＝ （実験ウェル－エフェクター細胞自発ウェル－標的細胞自発ウェル）／（標的細胞最大分解ウェル－標的細胞自発ウェル）を計算した。
【0158】
結果は図３３ａ、図３３ｂおよび図３４ａ、図３４ｂに示されるように、抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域のみが融合した様態の融合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対する殺傷を仲介せず、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系も殺傷できない。
【0159】
実施例４
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＨ４４－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１４（図８ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４４でその元の配列のＧｌｙ４４を置換した配列である。
配列番号１５（図８ｂ）は配列番号１４に相応する核酸配列である。
配列番号１６（図９ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１００でその元の配列のＧｌｎ１００を置換した配列である。
配列番号１７（図９ｂ）は配列番号１６に相応する核酸配列である。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＨ４４－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１４（図８ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４４でその元の配列のＧｌｙ４４を置換した配列である。
配列番号１５（図８ｂ）は配列番号１４に相応する核酸配列である。
配列番号１６（図９ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１００でその元の配列のＧｌｎ１００を置換した配列である。
配列番号１７（図９ｂ）は配列番号１６に相応する核酸配列である。
【0160】
図２５はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号１４で示される抗体の重鎖可変領域および配列番号１６で示される抗体の軽鎖可変領域を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の重鎖はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号１８（図１０ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号１９（図１０ｂ）は配列番号１８に相応する核酸配列である。
配列番号１９（図１０ｂ）は配列番号１８に相応する核酸配列である。
【0161】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号１９（図１０ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号１７（図９ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号１９（図１０ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号１７（図９ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0162】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0163】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0164】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0165】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0166】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0167】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図３０に示された通りである。レーン１：非復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子Ｖｈ４４－ＴＣＲ βの様態；レーン３：分子量マーカー；レーン４：復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子Ｖｈ４４－ＴＣＲ βの様態。
【0168】
実施例５
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号２０（図１１ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１０５でその元の配列のＧｌｎ１０５を置換した配列である。
配列番号２１（図１１ｂ）は配列番号２０に相応する核酸配列である。
配列番号２２（図１２ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４３でその元の配列のＡｌａ４３を置換した配列である。
配列番号２３（図１２ｂ）は配列番号２２に相応する核酸配列である。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号２０（図１１ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１０５でその元の配列のＧｌｎ１０５を置換した配列である。
配列番号２１（図１１ｂ）は配列番号２０に相応する核酸配列である。
配列番号２２（図１２ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４３でその元の配列のＡｌａ４３を置換した配列である。
配列番号２３（図１２ｂ）は配列番号２２に相応する核酸配列である。
【0169】
図２６はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号２０で示される抗体の重鎖および配列番号２２で示される抗体の軽鎖を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の重鎖はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号２４（図１３ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号２５（図１３ｂ）は配列番号２４に相応する核酸配列である。
配列番号２５（図１３ｂ）は配列番号２４に相応する核酸配列である。
【0170】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２５（図１３ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号２３（図１２ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体重鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２５（図１３ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号２３（図１２ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0171】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0172】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0173】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0174】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0175】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0176】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図３０に示された通りである。レーン２：非復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態；レーン３：分子量マーカー；レーン５：復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態。
【0177】
実施例６
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖ののＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＬ４３－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号２２（図１２ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４３でその元の配列のＡｌａ４３を置換した配列である。
配列番号２３（図１２ｂ）は配列番号２２に相応する核酸配列である。
配列番号２０（図１１ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１０５でその元の配列のＧｌｎ１０５を置換した配列である。
配列番号２１（図１１ｂ）は配列番号２０に相応する核酸配列である。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖ののＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合したマルチドメイン融合タンパク質複合分子（ＶＬ４３－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号２２（図１２ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４３でその元の配列のＡｌａ４３を置換した配列である。
配列番号２３（図１２ｂ）は配列番号２２に相応する核酸配列である。
配列番号２０（図１１ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１０５でその元の配列のＧｌｎ１０５を置換した配列である。
配列番号２１（図１１ｂ）は配列番号２０に相応する核酸配列である。
【0178】
図２７はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号２２で示される抗体の軽鎖および配列番号２０で示される抗体の重鎖を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の軽鎖はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号２６（図１４ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号２７（図１４ｂ）は配列番号２６に相応する核酸配列である。
配列番号２７（図１４ｂ）は配列番号２６に相応する核酸配列である。
【0179】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２７（図１４ｂ）、ならびに抗体の重鎖をコードする配列番号２１（図１１ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２７（図１４ｂ）、ならびに抗体の重鎖をコードする配列番号２１（図１１ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0180】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0181】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体重鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体重鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体重鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体重鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0182】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0183】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0184】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0185】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図３１（Ａ）に示された通りである。レーン１：非復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＬ４３－ＴＣＲ βの様態；レーン２：分子量マーカー；レーン３：復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＬ４３－ＴＣＲ βの様態。
【0186】
実施例７
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖ののＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合したマルチドメイン二重機能融合分子（ＶＬ１００－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１６（図９ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１００でその元の配列のＧｌｎ１００を置換した配列である。
配列番号１７（図９ｂ）は配列番号１６に相応する核酸配列である。
配列番号１４（図８ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４４でその元の配列のＧｌｙ４４を置換した配列である。
配列番号１５（図８ｂ）は配列番号１４に相応する核酸配列である。
１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖ののＮ末端に抗体の軽鎖可変領域が融合したマルチドメイン二重機能融合分子（ＶＬ１００－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号１（図１ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６２でそのＴＲＡＣの定常領域のＴｈｒ４７が置換されている。
配列番号２（図１ｂ）は配列番号１に相応する核酸配列である。
配列番号３（図２ａ）は１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ１６８でそのＴＲＢＣの定常領域のＳｅｒ５６が置換されている。
配列番号４（図２ｂ）は配列番号３に相応する核酸配列である。
配列番号１６（図９ａ）は抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ１００でその元の配列のＧｌｎ１００を置換した配列である。
配列番号１７（図９ｂ）は配列番号１６に相応する核酸配列である。
配列番号１４（図８ａ）は抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列においてＣｙｓ４４でその元の配列のＧｌｙ４４を置換した配列である。
配列番号１５（図８ｂ）は配列番号１４に相応する核酸配列である。
【0187】
図２８はブロック図の形で配列番号１で示されるα鎖および配列番号３で示されるβ鎖、そして配列番号１６で示される抗体の軽鎖および配列番号１４で示される抗体の重鎖可変領域を含有する、マルチドメイン融合分子の構造を示す。前記抗体の軽鎖可変領域はリンカーを介して配列番号３で示されるＴＣＲ β鎖のＮ末端に融合しており、配列が配列番号２８（図１５ａ）で示されるものである。リンカーの配列はＧＧＧＧＳ（配列番号９）である。
配列番号２９（図１５ｂ）は配列番号２８に相応する核酸配列である。
配列番号２９（図１５ｂ）は配列番号２８に相応する核酸配列である。
【0188】
ベクターの構築
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２９（図１５ｂ）、ならびに抗体の重鎖をコードする配列番号６（図３ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
１Ｇ４ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号２（図１ｂ）および抗体軽鎖融合１Ｇ４ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号２９（図１５ｂ）、ならびに抗体の重鎖をコードする配列番号６（図３ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0189】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0190】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体重鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体重鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体軽鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体重鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および軽鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体重鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0191】
精製
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の３ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0192】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0193】
最後に、もう一度陰イオン交換による精製を行い、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前の工程で精製されたサンプルを予め冷却しておいた１０ ｍＭ Ｔｒｉｓで２０倍希釈した後、仕込んだ。先にＡ液で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0194】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図３１（Ｂ）に示された通りである。レーン１：非復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＬ１００－ＴＣＲ βの様態；レーン２：分子量マーカー；レーン３：復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＬ１００－ＴＣＲ βの様態。
【0195】
実施例８
ＡＦＰ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖が融合したマルチドメイン二重機能融合分子（ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号３０（図１６ａ）はＡＦＰ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ２００でそのＴＲＡＣの定常領域のＰｒｏ８８が置換されている。
配列番号３１（図１６ｂ）は配列番号３０に相応する核酸配列である。
配列番号３２（図１７ａ）はＡＦＰ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｇｌｎ１０５Ｃｙｓ）が融合しており、そしてＣｙｓ２５７でそのＴＲＢＣの定常領域のＡｌａ１８を置換したものである。
配列番号３３（図１７ｂ）は配列番号３２に相応する核酸配列である。
本実施例におけるＡＦＰ ＴＣＲはＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子に提示されるＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号３８）短鎖ペプチドに結合することができる。
ＡＦＰ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖が融合したマルチドメイン二重機能融合分子（ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態）の調製
配列番号３０（図１６ａ）はＡＦＰ ＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列で、ここで、Ｃｙｓ２００でそのＴＲＡＣの定常領域のＰｒｏ８８が置換されている。
配列番号３１（図１６ｂ）は配列番号３０に相応する核酸配列である。
配列番号３２（図１７ａ）はＡＦＰ ＴＣＲ β鎖のＮ末端に抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｇｌｎ１０５Ｃｙｓ）が融合しており、そしてＣｙｓ２５７でそのＴＲＢＣの定常領域のＡｌａ１８を置換したものである。
配列番号３３（図１７ｂ）は配列番号３２に相応する核酸配列である。
本実施例におけるＡＦＰ ＴＣＲはＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子に提示されるＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号３８）短鎖ペプチドに結合することができる。
【0196】
ベクターの構築
ＡＦＰ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号３１（図１６ｂ）および抗体重鎖融合ＡＦＰ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号３３（図１７ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号２３（図１２ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
ＡＦＰ ＴＣＲ α鎖をコードする配列番号３１（図１６ｂ）および抗体重鎖融合ＡＦＰ ＴＣＲ β鎖をコードする配列番号３３（図１７ｂ）、ならびに抗体の軽鎖をコードする配列番号２３（図１２ｂ）の遺伝子をそれぞれ発現プラスミドｐＥＴ－２８ａにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３菌株において高レベルで標的遺伝子を発現させるように、当該プラスミドはＴ７プロモーターを含有する。
【0197】
発現
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
構築されたプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換させ、カナマイシン耐性の単一のクローンがＬＢ培地（カナマイシン５０ μｇ／ｍｌ）において３７℃でＯＤ６００が１．０程度になるように生長すると、１ ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。誘導から３時間後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＥＲＡＥＵＳ Ｘ１Ｒ遠心機において４０００ ｇで１５分間遠心して細胞を収集した。２０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させた後、室温で２０ ｍｉｎ振とう処理を行った後、冷却しておいた高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去した。さらに１０ ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れ、ボルテックス振とうして菌体を再懸濁させ、室温で５ ｍｉｎ振とう処理を行った。さらにそれに３０ ｍｌの１０倍のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れ、数回上下して液体を均一に混合し、さらに高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨てた後、３０ ｍｌの１０倍希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れ、ボルテックス振とうして沈殿を再懸濁させ、高速遠心機に入れ、６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。清液を捨て、前の工程を２回繰り返した。上清を捨て、３０ ｍｌのＰＢＳを入れて封入体を再懸濁させ、そして６０００ ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、６ Ｍの塩化グアニジニウムを入れて封入体を溶解させた。精製された封入体を勾配希釈した後、サンプリングしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによってその純度を検出してその収量を推定し、そしてすべての封入体に対してタンパク質の定量を行い、そして分けて容器に入れ、－８０℃で保存した。
【0198】
再生
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
ＴＣＲの再生緩衝液（５ Ｍウレア、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．１、０．４ Ｍ Ｌ－アルギニン、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、６．５ ｍＭ システアミン、１．８７ ｍＭ シスタミン）を調製し、そして予め４℃に冷却しておいた。凍結保存液から約１２ ｍｇのＴＣＲ α鎖および１１．２ ｍｇの抗体重鎖－ＴＣＲ β鎖、６ ｍｇの抗体軽鎖の封入体を解凍した。それぞれ６ ｍｌの６ Ｍ塩化グアニジニウム溶液に入れ、そして最終濃度が１５ ｍＭになるようにＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに置いて４０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベートされたＴＣＲ α鎖および重鎖－ＴＣＲ β鎖、ならびに抗体軽鎖の封入体をそれぞれＴＣＲの再生緩衝液に入れ、そして冷蔵庫で３０ ｍｉｎ反応させた。１０ ｋＤａの透析バッグを用意し、反応後の再生液を透析バッグに入れた後、予め冷却しておいた脱イオン水に入れ、冷蔵庫で一晩透析した。翌日、透析バッグを予め冷却しておいた２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して透析を行った。夜、さらに透析バッグを予め冷却しておいた２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに移して一晩透析した。
【0199】
精製
下記の２ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
下記の２ステップの精製方法によって可溶性でかつ正確にフォルディングしたマルチドメイン融合分子をフォルディングが間違ったもの、分解物および不純物と分離した。
まず、陰イオン交換で精製した。再生・透析ができたサンプルを予め冷却しておいた高速遠心機に入れ、８０００×ｇ、４℃で１５ ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、そしてさらに０．４５ μｍのろ膜で上清をろ過した。陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（登録商標） Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生されたサンプルを精製した。先にＡ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４倍カラム体積で洗浄した後、さらに流速５ ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを仕込んだ。サンプルが全部仕込まれた後、さらにＡ液で約４倍カラム体積でカラムを洗浄し、伝導度およびＵＶ２８０の両者が安定した時点で勾配溶離を開始し、０－１００％のＢ液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＨ ８．０）をセットし、時間が５０ ｍｉｎで、３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でサンプルを溶離させ、ＵＶ２８０が明らかに向上した時点で収集を開始し、各管で１ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。
【0200】
その後、さらに分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。前の工程で精製されたサンプルを１０ ｋＤａの限外ろ過チューブで濃縮し、３５００×ｇ、４℃で５００ μｌまで濃縮した後、分子篩による精製を行った。分子篩を先に脱イオン水で平衡化した後、さらにＰＢＳで平衡化した。５００ μｌの仕込みリングを洗浄して試料を仕込み、仕込みが終わった後、さらにＰＢＳで平衡化および溶離を行い、流速が１ ｍｌ／ｍｉｎで、各管で０．４ ｍｌ収集した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってピーク成分を分析し、そして合併した。そしてＰＢＳ緩衝液で緩衝液置換を行い、そしてその濃度を測定した後、分けて－８０℃で保存した。
【0201】
精製されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの様子は図３２に示された通りである。レーン１：分子量マーカー；レーン２：非復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態；レーン３：復元状態のマルチドメイン二重機能融合分子ＶＨ１０５－ＴＣＲ βの様態。
【0202】
実施例９
ＶＨ－ＴＣＲ βまたはＶＬ－ＴＣＲ βの様態のマルチドメイン二重機能融合分子の性質
二重機能融合分子は特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができることはすでにいくつかの研究で報告されている。その基本原理は、応答機能を発揮するようにＴ細胞を活性化させる重要なシグナルを模擬し、その高親和の特異的ＴＣＲによって腫瘍細胞の表面のｐＭＨＣ複合体を認識すると同時に、そのＣＤ３抗体末端によってＴ細胞で活性化する下流のシグナル経路を活性化させることで、特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができる。
ＶＨ－ＴＣＲ βまたはＶＬ－ＴＣＲ βの様態のマルチドメイン二重機能融合分子の性質
二重機能融合分子は特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができることはすでにいくつかの研究で報告されている。その基本原理は、応答機能を発揮するようにＴ細胞を活性化させる重要なシグナルを模擬し、その高親和の特異的ＴＣＲによって腫瘍細胞の表面のｐＭＨＣ複合体を認識すると同時に、そのＣＤ３抗体末端によってＴ細胞で活性化する下流のシグナル経路を活性化させることで、特異的に腫瘍細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトすることができる。
【0203】
以下の実施例では、本発明の抗体のマルチドメイン二重機能融合分子は標的細胞系を殺傷するようにＣＤ８＋Ｔ細胞をリダイレクトすることができることが証明されている。当該試験は５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験で、定量的に細胞分解後放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定するものである。３０分間カップリングの酵素反応によって培地に放出されたＬＤＨを検出するが、酵素反応においてＬＤＨは一種のテトラゾリド（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に変換させることができる。生成した赤色産物の量は分解した細胞数に正比例した。標準の９６ウェルプレートリーダーによって４９０ ｎｍの可視光の吸光値のデータを収集することができる。
【0204】
当業者には、ＬＤＨの放出実験で細胞の機能を検出する方法は熟知されているものである。本実施例のＬＤＨ実験に使用された標的細胞系は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性、乳癌細胞系）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性、乳癌細胞系）およびＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性、肺癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性、肝臓癌細胞系）、ＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陰性、肺癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ｇｐ１００陽性、肝臓癌細胞系）、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（Ａ２陰性、ｇｐ１００陽性、肺癌細胞系）である。
【0205】
９．１ ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４のマルチドメイン二重機能融合分子によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞のリダイレクト
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系とＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は５：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は１×１０６／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系とＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は５：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は１×１０６／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
【0206】
ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とした場合、ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４マルチドメイン二重機能融合分子と対照分子（ＶＨ－ＴＣＲ β－１Ｇ４の免疫活性のない二量体融合分子）のタンパク質はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍに希釈した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系を標的細胞とした場合、ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４マルチドメイン二重機能融合分子と対照分子（ＶＨ－ＴＣＲ β－１Ｇ４の免疫活性のない二量体融合分子）のタンパク質はいずれも培地で４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍ、４×１０－１３ Ｍに希釈した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系を標的細胞とした場合、ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４マルチドメイン二重機能融合分子と対照分子（ＶＨ－ＴＣＲ β－１Ｇ４の免疫活性のない二量体融合分子）のタンパク質はいずれも培地で４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍ、４×１０－１３ Ｍに希釈した。
【0207】
９６ウェル丸底プレートを用意した後、ウェルに５０ μｌのエフェクター細胞、５０ μｌのマルチドメイン二重機能融合分子タンパク質および１００ μｌの標的細胞を入れ、同時に標的細胞最大分解ウェル、標的細胞自発ウェル、エフェクター細胞自発ウェル、培地自発ウェルおよび培地＋分解液の自発ウェルを設け、各ウェルの最終体積がいずれも２００ μｌで、かつそれぞれ３つの重複ウェルがあった。細胞が添加された９６ウェル丸底プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４ｈ培養した。その後、９６ウェル丸底細胞培養プレートを遠心機に入れ、２５０×ｇで４ ｍｉｎ遠心した。５０ μｌの上清を９６ウェル平底プレートに取り、そして５０ μｌの基質液を入れ、光を避けて常温で３０ ｍｉｎ反応させた。反応終了後、５０ μｌの停止液を入れ、すぐにマイクロプレートリーダーで４９０ ｎｍにおける吸光値を測定した。製品の説明書に従い、特異的殺傷効率＝ （実験ウェル－エフェクター細胞自発ウェル－標的細胞自発ウェル）／（標的細胞最大分解ウェル－標的細胞自発ウェル）を計算した。
【0208】
結果は図３５および図３６に示されるように、ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態のマルチドメイン二重機能融合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対する殺傷を仲介することができるが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陰性、Ａ２陽性）乳癌細胞系およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を殺傷することができない。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトで各ウェルにおいて観察された殺傷百分率をタンパク質濃度に対してブロッティングし、ＥＣ５０値を決定した。中では、ＶＨ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態はＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系に対するＥＣ５０値が２．９ｅ－１２、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対するＥＣ５０値が５．７ｅ－１１で、ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態はＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）乳癌細胞系に対するＥＣ５０値が２．７ｅ－１２、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対するＥＣ５０値が２．４ｅ－１１であった。
【0209】
９．２ ＶＬ４３－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態のマルチドメイン二重機能融合分子によるＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を殺傷するＣＤ８＋細胞のリダイレクト
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は５：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は１×１０６／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
ＶＬ４３－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態のマルチドメイン二重機能融合分子と対照分子（ＶＬ－ＴＣＲ β－１Ｇ４の免疫活性のない二量体融合分子）のタンパク質濃度はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍに希釈した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は５：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は１×１０６／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
ＶＬ４３－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態のマルチドメイン二重機能融合分子と対照分子（ＶＬ－ＴＣＲ β－１Ｇ４の免疫活性のない二量体融合分子）のタンパク質濃度はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍに希釈した。
【0210】
９６ウェル丸底プレートを用意した後、ウェルに５０ μｌのエフェクター細胞、５０ μｌのマルチドメイン二重機能融合分子タンパク質および１００ μｌの標的細胞を入れ、同時に標的細胞最大分解ウェル、標的細胞自発ウェル、エフェクター細胞自発ウェル、培地自発ウェルおよび培地＋分解液の自発ウェルを設け、各ウェルの最終体積がいずれも２００ μｌで、かつそれぞれ３つの重複ウェルがあった。細胞が添加された９６ウェル丸底プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４ ｈ培養した。その後、９６ウェル丸底細胞培養プレートを遠心機に入れ、２５０×ｇで４ ｍｉｎ遠心した。５０ μｌの上清を９６ウェル平底プレートに取り、そして５０ μｌの基質液を入れ、光を避けて常温で３０ ｍｉｎ反応させた。反応終了後、５０ μｌの停止液を入れ、すぐにマイクロプレートリーダーで４９０ ｎｍにおける吸光値を測定した。製品の説明書に従い、特異的殺傷効率＝ （実験ウェル－エフェクター細胞自発ウェル－標的細胞自発ウェル）／（標的細胞最大分解ウェル－標的細胞自発ウェル）を計算した。
【0211】
結果は図３５に示されるように、ＶＬ４３－ＴＣＲ β－１Ｇ４、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態のマルチドメイン二重機能融合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対する殺傷を仲介することができるが、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陰性）肺癌細胞系を殺傷することができない。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトで各ウェルにおいて観察された殺傷百分率をタンパク質濃度に対してブロッティングし、ＥＣ５０値を決定した。中では、ＶＬ４４－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態はＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対するＥＣ５０値が１．７ｅ－１０で、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－１Ｇ４の様態はＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性、Ａ２陽性）肺癌細胞系に対するＥＣ５０値が３．４ｅ－１０であった。
【0212】
９．３ ＶＬ１００－ＴＣＲ β－ＡＦＰの様態のマルチドメイン二重機能融合分子によるＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性、肝臓細胞系）を殺傷するＣＤ８＋細胞のリダイレクト
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性）肝臓癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は１：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－ＡＦＰの様態のマルチドメイン二重機能融合分子のタンパク質濃度はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍ、４×１０－１３ Ｍに希釈した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし、ＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性）肝臓癌細胞系を標的細胞とし、選ばれたエフェクター標的比は１：１である。必要なエフェクター細胞および標的細胞はいずれも必要な細胞数に応じて培地で希釈され、必要なエフェクター細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌで、一方、必要な標的細胞の細胞密度は２×１０５／ｍｌである。同時にＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陰性）肺癌細胞系を陰性対照標的細胞として使用した。
ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－ＡＦＰの様態のマルチドメイン二重機能融合分子のタンパク質濃度はいずれも培地で４×１０－７ Ｍ、４×１０－８ Ｍ、４×１０－９ Ｍ、４×１０－１０ Ｍ、４×１０－１１ Ｍ、４×１０－１２ Ｍ、４×１０－１３ Ｍに希釈した。
【0213】
９６ウェル丸底プレートを用意した後、ウェルに５０ μｌのエフェクター細胞、５０ μｌのマルチドメイン二重機能融合分子タンパク質および１００ μｌの標的細胞を入れ、同時に標的細胞最大分解ウェル、標的細胞自発ウェル、エフェクター細胞自発ウェル、培地自発ウェルおよび培地＋分解液の自発ウェルを設け、各ウェルの最終体積がいずれも２００ μｌで、かつそれぞれ３つの重複ウェルがあった。細胞が添加された９６ウェル丸底プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４ ｈ培養した。その後、９６ウェル丸底細胞培養プレートを遠心機に入れ、２５０×ｇで４ ｍｉｎ遠心した。５０ μｌの上清を９６ウェル平底プレートに取り、そして５０ μｌの基質液を入れ、光を避けて常温で３０ ｍｉｎ反応させた。反応終了後、５０ μｌの停止液を入れ、すぐにマイクロプレートリーダーで４９０ ｎｍにおける吸光値を測定した。製品の説明書に従い、特異的殺傷効率＝ （実験ウェル－エフェクター細胞自発ウェル－標的細胞自発ウェル）／（標的細胞最大分解ウェル－標的細胞自発ウェル）を計算した。
【0214】
結果は図３７に示されるように、ＶＬ１００－ＴＣＲ β－ＡＦＰマルチドメイン二重機能融合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性）肝臓癌細胞系に対する効率的な殺傷を仲介することができるが、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（Ａ２陽性、ＡＦＰ陰性）肺癌細胞系に対する殺傷効率が低い。タンパク質が安全な投与量（＜１×１０－９ Ｍ）において、陰性標的細胞を殺傷しない。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトで各ウェルにおいて観察された殺傷百分率をタンパク質濃度に対してブロッティングし、ＥＣ５０値を決定した。ＶＨ１０５－ＴＣＲ β－ＡＦＰはＨｅｐＧ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陽性）肝臓癌細胞系に対するＥＣ５０値が１．０５ｅ－８で、ＮＣＩ－Ｈ１２９９－Ａ２（Ａ２陽性、ＡＦＰ陰性）肺癌細胞系に対するＥＣ５０値が２．７ｅ－６であった。
【0215】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図16a】
【図16b】
【図17a】
【図17b】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33a】
【図33b】
【図34a】
【図34b】
【図35a】
【図35b】
【図36a】
【図36b】
【図37】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端の構造が式ＩａまたはＩｂで表されるポリペプチドを含むことを特徴とする、融合タンパク質。Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉａ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１ （Ｉｂ）
（ただし、
エレメントＡ１は、免疫反応のないポリペプチド分子である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。前記柔軟性リンカーは選択できるものである。
「－」は共有結合である。）
【請求項2】
前記エレメントＡ１は、抗体の重鎖可変領域または抗体の軽鎖可変領域であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４、配列番号２０または配列番号５で示される配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１６、配列番号２２または配列番号１０で示される配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記エレメントＢは、ＴＣＲ分子、一本鎖αβＴＣＲ、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖ヘテロ二量体複合分子、抗体分子Ｆａｂ複合分子、一本鎖抗体分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、前記ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２で示される配列を含むか、あるいは、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号７、配列番号１２または配列番号３２と少なくとも９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
構造が式ＩｃまたはＩｄで表されることを特徴とする、融合タンパク質複合分子。Ａ２…Ａ１－Ｌ－Ｂ （Ｉｃ）
Ｂ－Ｌ－Ａ１…Ａ２ （Ｉｄ）
（ただし、
エレメントＡ１、Ａ２は、それぞれ独立に、免疫反応のないポリペプチド分子それぞれ独立である。
エレメントＢは、特異的にｐＭＨＣエピトープに結合するポリペプチド受容体分子またはその構成部分、その断片である。ならびに
エレメントＬは、柔軟性リンカーである。
「－」は共有結合である。
「…」はジスルフィド結合またはタンパク質ドメインの間の非共有結合相互作用である。）
【請求項9】
前記エレメントＡ１は抗体の重鎖可変領域であり、かつ前記Ａ２エレメントは抗体の軽鎖可変領域であるか、あるいは、前記エレメントＡ１は抗体の軽鎖可変領域であり、かつ前記Ａ２元件は抗体の重鎖可変領域であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質複合分子。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項12】
請求項１１に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、宿主細胞。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする、前記方法：（ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子の生成に適する条件において、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することにより、前記融合タンパク質または前記融合タンパク質複合分子を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた融合タンパク質または融合タンパク質複合分子を精製および／または修飾する。
【請求項14】
以下：（ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分
を含有することを特徴とする、免疫複合体。
【請求項15】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子、またはこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項16】
請求項１１に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項17】
請求項１２に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項18】
以下：（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子；ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列
を含む、組み換えタンパク質。
【請求項19】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項８または９に記載の融合タンパク質複合分子の使用であって、被験者において腫瘍を予防または治療する薬物を製造するためであることを特徴とする、前記使用。
【請求項20】
前記腫瘍は、乳癌、肺癌、肝臓癌、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項21】
前記被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトであることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項22】
請求項１１に記載の発現ベクターの使用であって、被験者において腫瘍を予防または治療する薬物を製造するためであることを特徴とする、前記使用。
【請求項23】
請求項１２に記載の宿主細胞の使用であって、被験者において腫瘍を予防または治療する薬物を製造するためであることを特徴とする、前記使用。
【国際調査報告】