特表 2024-532604 新規ＶＡＳＨ阻害剤、その複合体、および薬物または研究ツールとしてのそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-05

(54)【発明の名称】新規ＶＡＳＨ阻害剤、その複合体、および薬物または研究ツールとしてのそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 303/48 20060101AFI20240829BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 31/336 20060101ALI20240829BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C07D303/48 CSP

C07K5/06

A61K31/336

A61K38/05

A61P25/16

A61P25/28

A61P27/06

A61P21/04

A61P15/00

A61P35/00

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536353

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-04-19

(86)【国際出願番号】 EP2022073625

(87)【国際公開番号】W WO2023025861

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】21306141.9

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】594016872

【氏名又は名称】サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス）

(71)【出願人】

【識別番号】515011944

【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ

(71)【出願人】

【識別番号】520307757

【氏名又は名称】エコール ナシオナル シュペリウール ドゥ シミ ドゥ モンペリエ

【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＳＵＰＥＲＩＥＵＲＥ ＤＥ ＣＨＩＭＩＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ

(71)【出願人】

【識別番号】524071872

【氏名又は名称】エムティ、アクト

【氏名又は名称原語表記】ＭＴ ＡＣＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100210675

【弁理士】

【氏名又は名称】下山 潤

(72)【発明者】

【氏名】クシシトフ、ロゴフスキ

(72)【発明者】

【氏名】ミュリエル、アンブラール－コーシル

(72)【発明者】

【氏名】シーム、ファン、デル、ラーン

(72)【発明者】

【氏名】ルボミール、ベゼンコフ

(72)【発明者】

【氏名】ギョーム、マルスラン

(72)【発明者】

【氏名】ヨアン、ラネ

(72)【発明者】

【氏名】カーレド、アシェド

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA14

4C084BA23

4C084BA32

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC201

4C084ZC202

4C084ZC411

4C084ZC412

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BA02

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA33

4C086ZA81

4C086ZA94

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC41

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA11

4H045EA20

4H045FA20

(57)【要約】

本発明は、式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が定義のとおりである、式（Ｉ）の化合物
【化１】

またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物、その複合体ならびに薬物または研究ツールとしてのそれらの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物

【化1】

またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物であって、
式中
Ｘが、

【化2】

であり、
Ｒ^１が、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、ＮＲ^１ａＲ^１ｂまたは

【化3】

であり、
Ｒ^１ａが、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^１ｂが、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、前記アルキルが、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはアリールで任意選択で置換され、
Ｒが、Ｏ－Ｒ^２またはＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、
Ｒ^２が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、前記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、前記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはアルキル－アリールが任意選択で置換され、
Ｒ^３が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、Ｏ－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールまたはＮＨＯＨであり、前記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、前記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリール、アルキル－ヘテロアリールまたはアルキル－アリールが任意選択で置換され、
Ｒ^４が、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖であり、最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、前記Ｃ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖が任意選択で置換され、
Ｙが、－（ＣＨ_２）_ｍ－または

【化4】

であり、
Ｒ^５が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキル－アリールまたはアルキル－ヘテロアリールが任意選択で置換され、
Ｒ^６が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、ＮＨ－ＯＨまたはＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、前記脂肪族鎖が任意選択で置換され、
Ｒ^７が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールであり、
Ｒ^８が、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＨ、ＮＨ_２またはＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｍおよびｎがそれぞれ独立して０～６の範囲の整数であり、
Ｒ^９が、Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖またはアリールであり、前記脂肪族鎖またはアリールが任意選択で置換され、
ただし、Ｘが、

【化5】

であり、Ｒ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１がＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルではなく、式（Ｉ）の化合物が、

【化6】

ではないことを条件とする
化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物。

【請求項2】

ＲがＯＲ^２である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ^２が、Ｈ、任意選択で置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルまたは任意選択で置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールである、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ^３が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖またはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、ＮＨＯＨであり、前記肪族鎖が任意選択で置換される、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^１が、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニルまたはＮＲ^１ａＲ^１ｂであり、Ｒ^１ａおよびＲ^１ｂが請求項１に定義のとおりである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ^１が、

【化7】

好ましくは

【化8】

であり、
Ｙ、Ｒ^５およびＲ^６が請求項１に定義のとおりである、
請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｙが、

【化9】

であり
Ｒ^５が、ＯＨ、Ｏ－メチルまたはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－ベンジルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルなどのＣ（Ｏ）ＮＨ－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、またはＮＨ（Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、Ｒ^９が好ましくは、非置換もしくはＯＨで置換されたフェニルまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^６が、ＯＨまたはＯ－メチル、Ｏ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルもしくはＯ－アリルである、
請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

Ｙが、－（ＣＨ_２）_ｍ－、好ましくは－（ＣＨ_２）_２－であり、Ｒ^５が、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＥｔまたはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、Ｒ^６が、ＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、Ｒ^７が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ベンジルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、またはＣＨ_２－インドール基などのＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールであり、Ｒ^８が、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、フェニルなどのアリール、インドールなどのヘテロアリール、ＳＨ、またはＳ－Ｃ（ＣＨ_３）_３などのＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｎが０、１、２または３である、請求項６に記載の化合物。

【請求項9】

Ｘが、

【化10】

好ましくは

【化11】

である、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

次式（Ｉ－Ａ’）：

【化12】

に対応する、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項11】

以下の化合物：

【化13-1】

【化13-2】

【化13-3】

【化13-4】

【化13-5】

【化13-6】

から選択される請求項１に記載の化合物ならびにその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に定義の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。

【請求項13】

薬物として使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の治療に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物または請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害が、とりわけアルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、緑内障、精神障害、神経障害、結腸がんや神経芽細胞腫などのがん、筋ジストロフィー、不妊症、網膜変性症、プルキンエ細胞疾患、乳児発症型変性、男性不妊症および繊毛病、特に、神経変性疾患、がん、および筋ジストロフィーから選択される微小管の脱チロシン化および／またはポリグルタミル化の変化が関与する障害である、請求項１４に記載の使用のための化合物または組成物。

【請求項16】

生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、バイオマーカー（例として、ローダミン、クマリン誘導体、シアニン誘導体もしくはフルオレセインなどの光標識剤）、ビオチンなどの親和性プローブ、またはサリドマイド、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ｄＢＥＴ１、ｄＦＫＢＰ１２、ＱＣＡ５７０、ＰＲＯＴＡＣ６、ＺＮＬ－０２－０９６もしくはｄ９Ａ－２などのＥ３ユビキチンリガーゼリクルーター）に結合した、請求項１～１１のいずれか一項に定義の式（Ｉ）の化合物の断片を含んでなる複合体。

【請求項17】

薬物として使用するための請求項１６に記載の複合体。

【請求項18】

特に、
－新しいＶＡＳＨ阻害剤を特定するため、かつ／またはその阻害剤効率を定量するためのインビトロおよび／またはインセルロのスクリーニングアッセイ、
－チューブリン脱チロシン化の役割、特に、その発生や、悪性度、進行など、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を研究するためのインビトロの方法、
－微小管の脱チロシン化および／またはポリグルタミル化の変化が関与するＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を特定またはモニタリングするためのインビトロ診断方法、
－ならびに前記スクリーニングアッセイおよび方法を行うための関連キット
からなる群のなかで選択される、研究および開発活動のための研究ツールとして使用するための、請求項１～１１のいずれかに記載の化合物または請求項１６に記載の複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特にＶＡＳＨペプチダーゼ関連障害の予防および／もしくは治療に、かつ／または研究ツールとして有用な新規ＶＡＳＨ阻害剤に関する。本発明はまた、上記ＶＡＳＨ阻害剤と生体分子の複合体および薬物または研究ツールとしてのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

微小管（ＭＴ）は細胞骨格要素の主要なタイプであり、特に神経細胞に多く存在する。それらはα－およびβ－チューブリンのヘテロ二量体の重合によって形成される。細胞内において、ＭＴは伸びたり縮んだりする能力を有し、この現象は動的不安定性と呼ばれている。ＭＴのこの動的挙動により、細胞内輸送、細胞運動、細胞分裂および細胞形態形成を含む多数の細胞プロセスをサポートすることが可能になる。微小管の機能的多様性は、チューブリンに影響を与える多くの様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）によるものである。既知のＰＴＭには、アセチル化、ポリグルタミル化、ポリグリシル化、リン酸化、およびチロシン化／脱チロシン化サイクルが含まれる。これらの修飾は、微小管の動態、組織化、ならびに他の細胞化合物および細胞コンパートメントとの相互作用に影響を及ぼす。

【0003】

ＭＴの機能不全は、神経発達障害および神経変性に関連する。よく知られている機能不全は、ＭＴの構成要素であるチューブリン、またはＭＴの機能を調節するＭＴ結合タンパク質（ＭＡＰ）のいずれかの変異に関連する。多くのＭＡＰの結合は、様々な翻訳後修飾を強く受けることが知られているＭＴの表面に突出するα－およびβ－チューブリンのＣ末端尾部によって媒介される。神経細胞に最も多く存在するチューブリン修飾はポリグルタミル化であり、α－およびβ－チューブリンのＣ末端に、長さの異なる複数のグルタミン酸側鎖が生成される。負に荷電したグルタミン酸はＣ末端尾部に付加され、様々なＭＴ結合タンパク質（ＭＡＰ）および分子モーターの結合部位となる。したがって、ポリグルタミル化は、数多くのＭＴ相互作用タンパク質の活性または結合を調節することが示されている。初期の研究では、アルツハイマー病のキープレーヤーであるタウなどのニューロンＭＡＰの結合がＭＴポリグルタミル化によって調節されることが示唆された。さらに最近の報告では、軸索の成長と可塑性に重要な役割を果たすスパスチンやカタニンなどのＭＴ切断酵素の活性もこの修飾によって制御されることが示されている。さらに、ポリグルタミル化は、シナプス小胞の送達に関与し、よってシナプス伝達を調節するＫＩＦ１Ａキネシンモータータンパク質の速度および処理能力を調節すると考えられている。まとめると、チューブリンポリグルタミル化は様々な重要な神経細胞プロセスを制御している。ポリグルタミル化は可逆的であり、チューブリンチロシンリガーゼ様（ＴＴＬＬ）ファミリーに属する酵素によって触媒される。対照的に、逆酵素はサイトゾルカルボキシペプチダーゼ（ＣＣＰ）ファミリーのメンバーである。したがって、特定の細胞におけるチューブリンポリグルタミル化の全体的なレベルは、両活性間の競合の結果として確立される。

【0004】

最初に発見されたチューブリン修飾は脱チロシン化であり、これはα－チューブリンに特異的であり、ＭＴのＣ末端チロシン残基の除去からなる。チロシン化／脱チロシン化サイクルは、特に神経細胞、筋細胞、分裂細胞における微小管調節に関与している。このように、微小管脱チロシン化の変化は、神経変性疾患、神経再生障害、がん、筋ジストロフィー、心疾患、血管障害、網膜変性症、不妊症または繊毛病などの障害に関わっている。

【0005】

脱チロシン化は約半世紀前に発見されているが、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）活性をもつ、脱チロシン形成に関与する酵素が明らかになったのはごく最近である（Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456; Aillaud C. et al. Science, 2017, 358(6369:1448-1453)）。バソヒビンファミリーのＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２はこの修飾を触媒する酵素である。とりわけ最近の研究は、そのタンパク質酵素活性の可逆的および不可逆的阻害剤を明らかにすることにつながり、それら阻害剤は上記の障害だけでなく、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、皮質基底核型認知症（corticobasal dementia）など）を含むがこれに限定されない神経変性障害の治療にとって特に興味深いものである（国際公開第２０１９／０１６２５９号参照）。

【0006】

クリックケミストリーと適合できる特注設計の阻害剤を用いた高親和性精製ステップを採用することによって、ＶＡＳＨをチューブリンデチロシナーゼとして特定することができた（Aillaud, C. et al., Science. 2017, 358(6369):1448-1453）。上記阻害剤のうち最も効率的なものは、化合物ＥＰＯ－Ｙと呼ばれ（Aillaud et al. 2017）、次のように表されるチロシン残基に結合したｔｒａｎｓ－エポキシコハク酸（ＴＥＳ）エチルエステルと呼ばれる活性基から構成される。

【0007】

【化1】

【0008】

当初、ＥＰＯ－Ｙ（Ｅｐｏ－Ｙとも呼ばれる）は微小管脱チロシン化の変化が関与する障害の治療の有望な候補と考えられていた不可逆的ＶＡＳＨ阻害剤である。しかし、この化合物はインセルロ（in cellulo）で約１５μＭの中程度のＩＣ_５０を示す。考えられうる生物医学的応用に照らして、理想的な阻害剤にはＶＡＳＨに対する高い特異性と効力が必要である。ＥＰＯ－Ｙなどの小さい高求電子性のエポキシド分子は、他のタンパク質やシステインプロテアーゼ活性部位に存在する遊離チオールと、特に高濃度（μＭ範囲）で相互作用する可能性がある。さらに、チロシンキナーゼ活性部位の求核性リジン残基と反応し、特異性が失われる可能性がある。注目すべきことに、パルテノリドと呼ばれ、過去に細胞ベースのスクリーニングを介して特定された他に報告されている唯一の脱チロシン化阻害剤（Fonrose et al.Cancer Res 2007;67 (7) :3371-8）は、非常に高い濃度でもインビトロでＶＡＳＨを阻害しない（Hotta T.et al., Curr.Biol., 2021, 31 (4) :900-907）。これから、観察されたパルテノライドのインセルロでの効果は、ＶＡＳＨの直接阻害を介するものではないことが示唆される。

【0009】

したがって、微小管脱チロシン化の異常が関与する障害の治療に有用な好適な候補をもたらすために、既存のＶＡＳＨ阻害剤の特異性、効力およびバイオアベイラビリティを向上させる必要がある。本発明では、神経変性疾患の治療のための可能性のある薬物として、インセルロで高効率の、低ナノモルからピコモルのＶＡＳＨ阻害剤について記載する。

【発明の概要】

【0010】

医薬品化学を用いて、化合物のライブラリーを作り、理想的な予測インビトロ系で効果を測定し、バイオインフォマティクスを用いて、化合物の生物活性の多様性の原因となる構造特性をモデル化し、理解した。そのようにして、本発明者らは、インビトロおよび／またはインセルロでの活性が、ＥＰＯ－Ｙと比較して大きく増強された新規ＶＡＳＨ阻害剤を開発した。

【0011】

したがって、本発明は、次の式（Ｉ）の化合物

【化2】

またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物であって、
式中、
Ｘが、

【化3】

であり、
Ｒ^１が、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、ＮＲ^１ａＲ^１ｂまたは

【化4】

であり、
Ｒ^１ａが、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^１ｂが、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、上記アルキルが、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはアリールで任意選択で置換され、
Ｒが、Ｏ－Ｒ^２またはＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、
Ｒ^２が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、上記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはアルキル－アリールが任意選択で置換され、
Ｒ^３が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、Ｏ－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールまたはＮＨＯＨであり、上記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリール、アルキル－ヘテロアリールまたはアルキル－アリールが任意選択で置換され、
Ｒ^４が、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖であり、最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記Ｃ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖が任意選択で置換され、
Ｙが、－（ＣＨ_２）_ｍ－または

【化5】

であり、
Ｒ^５が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキル－アリールまたはアルキル－ヘテロアリールが任意選択で置換され、
Ｒ^６が、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、ＮＨ－ＯＨまたはＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、上記脂肪族鎖が任意選択で置換され、
Ｒ^７が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールであり、
Ｒ^８が、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＨ、ＮＨ_２またはＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｍおよびｎがそれぞれ独立して、０～６の範囲の整数であり、
Ｒ^９が、Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖またはアリールであり、上記脂肪族鎖またはアリールが任意選択で置換され、
ただし、Ｘが

【化6】

以下であり、かつＲ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１がＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルではないことを条件とする
化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物
に関する。

【0012】

別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの上に定義の式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。

【0013】

別の態様によれば、本発明はまた、薬物として使用するための、上に定義の式（Ｉ）の化合物または医薬組成物に関する。

【0014】

本発明はまた、研究ツールとして使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。

【0015】

別の態様によれば、本発明はまた、生体分子に結合した式（Ｉ）の化合物を含んでなる複合体に関する。

【0016】

別の態様によれば、本発明は、薬物または研究ツールとして使用するための、上に定義の複合体に関する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】インセルロＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化アッセイ。ヒトＣＨＬ－１細胞（メラノーマ由来細胞株）におけるチューブリン脱チロシン化に対するＥｐｏ‐Ｙの濃度の増加の効果。

【図2】推定阻害剤パルテノリドはＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化を阻害しない。（Ａ）Ｅｐｏ－Ｙおよび推定デチロシナーゼ阻害剤パルテノリド（ＰＴＬ）の化学構造。（Ｂ）組み換えＶＡＳＨ１タンパク質を用いたインビトロ脱チロシン化アッセイ。ＤｅＴｙｒ、脱チロシン化。（Ｃ）ヒトＣＨＬ－１細胞におけるチューブリン脱チロシン化に対するＥｐｏ‐ＹおよびＰＴＬの濃度の増加の効果。

【図3】新たに開発された阻害剤は、ＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２およびペプチダーゼ活性を標的とする。ＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２依存性チューブリン脱チロシン化活性はともに、インビトロ脱チロシン化アッセイを用いて新たに設計された阻害剤によって阻害される。

【図4-1】ＶＡＳＨペプチダーゼ活性の細胞浸透性の強力な阻害剤。（Ａ）ＬＶ－４３（本発明の範囲外）の化学構造。（Ｂ）組み換えＶＡＳＨ１タンパク質を用いたインビトロ脱チロシン化アッセイ。（Ｃ）組み換えＶＡＳＨ１タンパク質を用いたインセルロ脱チロシン化アッセイ。（Ｄ）ＣＨＬ－１細胞を用いたインセルロ脱チロシン化アッセイ。（Ｅ）Ｅｐｏ－ＹおよびＬＶ－８０を用いてインビトロで得られた用量反応曲線の比較。（Ｆ）ヒトＣＨＬ－１細胞におけるチューブリン脱チロシン化に対するＥｐｏ－ＹおよびＬＶ－８０の濃度の増加の効果の定量。（Ｇ）ＬＶ－８０の化学構造、ならびに（Ｈ）推定結合モード（水素結合）を示すＶＡＳＨ１への分子ドッキング。

【図4-2】ＶＡＳＨペプチダーゼ活性の細胞浸透性の強力な阻害剤。（Ａ）ＬＶ－４３（本発明の範囲外）の化学構造。（Ｂ）組み換えＶＡＳＨ１タンパク質を用いたインビトロ脱チロシン化アッセイ。（Ｃ）組み換えＶＡＳＨ１タンパク質を用いたインセルロ脱チロシン化アッセイ。（Ｄ）ＣＨＬ－１細胞を用いたインセルロ脱チロシン化アッセイ。（Ｅ）Ｅｐｏ－ＹおよびＬＶ－８０を用いてインビトロで得られた用量反応曲線の比較。（Ｆ）ヒトＣＨＬ－１細胞におけるチューブリン脱チロシン化に対するＥｐｏ－ＹおよびＬＶ－８０の濃度の増加の効果の定量。（Ｇ）ＬＶ－８０の化学構造、ならびに（Ｈ）推定結合モード（水素結合）を示すＶＡＳＨ１への分子ドッキング。

【図5】細胞におけるＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化の完全な阻害。ＬＶ－８０またはビヒクル（ＤＭＳＯ）と２４時間インキュベートしたヒトＣＨＬ－１細胞におけるチューブリン脱チロシン化レベルの分析およびＶＡＳＨ１／２ノックアウト細胞（２ＫＯｓ）（Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456に開示）との比較。ビンキュリン、ローディングコントロール。ＤｅＴｙｒ、脱チロシン化。

【図6-1】ＶＡＳＨ酵素阻害剤の有利な安全性プロファイル。（Ａ）タキソール（パクリタキセル）およびパルテノリドを参照として用いた細胞生存試験。（Ｂ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とＣＨＬ－１細胞を２４時間インキュベートした後の細胞代謝および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の測定。２４時間処理後のＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた生ＣＨＬ－１細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の分析。ＯＣＲ速度はミトコンドリア呼吸の重要な指標であり、培養細胞における細胞代謝機能の系レベルの視点（a systems-level view）を与える。

【図6-2】ＶＡＳＨ酵素阻害剤の有利な安全性プロファイル。（Ａ）タキソール（パクリタキセル）およびパルテノリドを参照として用いた細胞生存試験。（Ｂ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とＣＨＬ－１細胞を２４時間インキュベートした後の細胞代謝および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の測定。２４時間処理後のＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた生ＣＨＬ－１細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の分析。ＯＣＲ速度はミトコンドリア呼吸の重要な指標であり、培養細胞における細胞代謝機能の系レベルの視点（a systems-level view）を与える。

【図7】新たに開発されたＶＡＳＨ阻害剤はＶＡＳＨ酵素活性に特異的である。（Ａ、Ｂ）ＶＡＳＨ阻害剤ＬＶ－８０（５０μＭ）の非存在下または存在下におけるサイトゾルカルボキシペプチダーゼ１（ＣＣＰ１）（Ａ）およびＣＣＰ５（Ｂ）媒介チューブリン脱グルタミル化の分析。ＰｏｌｙＥ、長いグルタミン酸鎖を認識する抗体；ＧＴ３３５、分岐点グルタミン酸残基に対する抗体。（Ｃ）ＬＶ－８０の特異性。ＢｚｌＳＡ、ペプチド模倣ベンジルコハク酸。

【図8】研究ツールとして新たに開発されたビオチン化バージョン。（Ａ）ヒトＣＨＬ－１細胞におけるチューブリン脱チロシン化に対するビオチン化ＬＶ－８０の濃度の増加の効果。（Ｂ）ビオチン化ＬＶ－８０を用いた内在性ＶＡＳＨのプルダウンアッセイ。（Ｃ）ビオチン化ＬＶ－８０を用いたヒト脳蛋白質溶解物由来の内在性ＶＡＳＨのプルダウンアッセイ。

【図9】ＶＡＳＨ阻害剤で処理した初代皮質ニューロンにおけるチューブリン脱チロシン化の大幅な減少。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とインキュベートしたマウス初代皮質ニューロンの溶解物の分析。ＤｅＴｙｒ、脱チロシン化されたチューブリン；ＴｙｒＴｕｂ、チロシン化されたチューブリン；ＰｏｌｙＥ、長いグルタミン酸鎖を認識する抗体；ＧＴ３３５、分岐点グルタミン酸残基に対する抗体。（Ｂ）チューブリンチロシン化の定量。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１）。（Ｃ）ｑＰＣＲで解析した脱チロシン化の状態に関連する遺伝子の転写物レベル。（Ｄ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または阻害剤とインキュベートした後の神経分化マーカーの転写物レベル。（Ｅ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または阻害剤と７日間インキュベートした後のグリアマーカーの転写物レベル。

【図10】脱チロシン化により、チューブリンはグルタミル化を受けやすくなる。ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とインキュベートしたマウス初代皮質ニューロンにおける（Ａ）チューブリングルタミル化レベル、（Ｂ）およびチューブリンアセチル化レベル。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１）。（Ｃ）チューブリン脱チロシン化とグルタミル化との間のクロストーク。（Ｄ）ドロソフィラ（Drosophila）全タンパク質抽出物の分析。

【図11】チューブリン脱チロシン化は初代皮質ニューロンのタウタンパク質結合に影響する。（Ａ）分化５日後にビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０と３日間インキュベートしたマウス初代皮質ニューロンの分析。ＤｅＴｙｒ、脱チロシン化されたチューブリン；ＴｙｒＴｕｂ、チロシン化されたチューブリン；ＰｏｌｙＥ、長いグルタミン酸鎖を認識する抗体；ＧＴ３３５、分岐点グルタミン酸残基に対する抗体。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）と同様に分化５日後にビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０と３日間インキュベートしたマウス初代皮質ニューロンにおけるチューブリンの脱チロシン化およびチロシン化のレベル（Ｂ）、およびチューブリングルタミル化レベル（Ｃ）の定量。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）。（Ｄ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とインキュベートしたマウス初代皮質ニューロンにおけるタウタンパク質とチューブリンの共局在。（Ｅ）チューブリン－陽性領域におけるタウ免疫蛍光染色の自動定量（ｎ＞１５０）。多重ｔ検定でｐ値を算出した（＊＊＊＜０．００１）。（Ｆ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＶＡＳＨ特異的阻害剤ＬＶ－８０とインキュベートしたマウス初代皮質ニューロンにおけるチューブリンの定量。陽性領域の免疫蛍光シグナルの自動定量（ｎ＞１５０）。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎｓ；有意ではない）。

【図12】Ａ．新たに開発されたプロドラッグ（ＬＶ－１０４およびＬＶ－１１１）は、ヒトＣＨＬ－１細胞において、ＶＡＳＨ依存性脱チロシン化の非常に効率的な阻害を示す。Ｂ．

【図13】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロおよびインセルロのアッセイ。Ａ．この試験は、直接的なＶＡＳＨ阻害におけるＲ３の修飾の重要性を比較することを目的とする。ＬＶ－８０、ＬＶ－１０４およびＩＢＭＴ１１を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。Ｂ．細胞ベースのアッセイを用いたＶＡＳＨ活性評価の前に、ＬＶ－８０、ＬＶ－１０４およびＩＢＭＴ１１の濃度を上げてＣＨＬ－１細胞を処理した。

【図14】処理後の細胞溶解液のバイオアナリシスにより、細胞浸透による変換が示される。２５ｕＭのＬＶ－１０４でＣＨＬ－１細胞を１時間処理した。化合物添加直後（初期）および１時間後（上清）に培養上清を集めた。細胞を洗浄し、溶解し、ＬＣ／ＭＳ読み取り（細胞）のために処理して、ＬＶ－１０４およびその生物変換形態であるＩＢＭＴ１１を検出した。

【図15】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロおよびインセルロのアッセイ。Ａ．ＬＶ－１、ＬＶ－８０、ＩＢＭＴ１１およびＩＢＭＴ２３を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。Ｂ．細胞ベースのアッセイを用いたＶＡＳＨ活性評価の前に、ＬＶ－１、ＬＶ－８０、ＬＶ－１０４およびＩＢＭＴ２３の濃度を上げてＣＨＬ－１細胞を処理した。

【図16】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロおよびインセルロのアッセイ。Ａ．ＬＶ－１、ＬＶ－８０、ＩＢＭＴ１１およびＩＢＭＴ３４、ＬＶ８０のナトリウム塩を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。Ｂ．細胞ベースのアッセイを用いたＶＡＳＨ活性評価の前に、ＬＶ－８０、ＬＶ－１０４、ＩＢＭＴ２３およびＩＢＭＴ３４の濃度を上げてＣＨＬ－１細胞を処理した。

【図17】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロおよびインセルロのアッセイ。Ａ．ＬＶ－１、ＬＶ－８０、ＩＢＭＴ１１、ＩＢＭＴ２８およびＩＢＭＴ２８ｈｙｄｒｏ（ＩＢＭＴ２８ｓａｐｏと命名）を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。Ｂ．細胞ベースのアッセイを用いたＶＡＳＨ活性評価の前に、ＬＶ－８０、ＬＶ－１０４、ＩＢＭＴ２８の濃度を上げてＣＨＬ－１細胞を処理した。

【図18】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロアッセイ。ＬＶ－１、ＬＶ－８０、およびＩＢＭＴ３８ｈｙｄｒｏ（ＩＢＭＴ３８ｓａｐｏと命名）を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。

【図19】ＶＡＳＨ阻害剤のインビトロアッセイ。ＬＶ－１／ＥｐｏＹ、ＬＶ－８０、およびＳＤ－１３９（Aillaud, C. et al. Science, 2017, 358, p.1448-1453に報告）を用いた標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて、表示の化合物の濃度をＶＡＳＨ活性について試験した。Ａ．表示の化合物を用いたアッセイ；Ｂ．ＳＤ－１３９のｔｅｒｔブチル基を鹸化した後、表示の濃度で阻害アッセイを行う前。

【発明を実施するための形態】

【0018】

定義
本発明において使用される「立体異性体」という用語は、配置立体異性体、より具体的には光学異性体を意味する。

【0019】

本発明において、光学異性体は特に、Ｘに結合した置換基の空間上の位置が異なることから生じる。したがって、置換基が結合しているＸ基の炭素原子または窒素原子は、キラル中心または不斉中心である。したがって、互いに鏡像ではない光学異性体は「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、鏡像を重ねることができない鏡像である光学異性体は「鏡像異性体」と呼ばれる。

【0020】

キラル化合物の２つの鏡像異性体の等モル混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれる。

【0021】

本発明の文脈において、Ｘ基に結合した置換基の位置に応じて、本発明の化合物は、以下に示すように、立体配置（Ｓ，Ｓ）、立体配置（Ｒ，Ｒ）、立体配置（Ｓ，Ｒ）または立体配置（Ｒ，Ｓ）のジアステレオ異性体でありうる。

【0022】

【化7】

【0023】

置換基の位置が化合物中で特定されない場合、上記化合物は、上記ジアステレオ異性体のいずれか１つ、または上記ジアステレオ異性体の混合物に相当する。

【0024】

本発明では、「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の調製に有用なもの、および薬学的使用のために一般的に安全で毒性のないものを意味するよう意図される。

【0025】

「薬学的に許容される塩および／または溶媒和物」という用語は、本発明の枠組みにおいて、上に定義のように薬学的に許容され、かつ対応する化合物の薬理活性をもつ化合物の塩および／または溶媒和物を意味するよう意図される。

【0026】

薬学的に許容される塩は、
（１）塩酸や、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸と形成される；または酢酸や、ベンゼンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシナフトエ酸（hydroxynaphtoic）、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、２－ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、コハク酸、ジベンゾイル－Ｌ２５酒石酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸と形成される酸付加塩、および
（２）化合物中に存在する酸プロトンが、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオンなどの金属イオンで置換される、または有機塩基もしくは無機塩基で配位される場合に形成される塩基付加塩
を含んでなる。許容される有機塩基は、ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメタミンなどを含んでなる。許容される無機塩基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含んでなる。

【0027】

本発明の化合物の治療用途に許容される溶媒和物には、溶媒の存在により、本発明の化合物の調製の最終段階の間に形成されるものなど、従来の溶媒和物が含まれる。一例として、水（これらの溶媒和物は水和物とも呼ばれる）またはエタノールの存在による溶媒和物を挙げることができる。

【0028】

本発明で使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、臭素、塩素またはヨウ素原子を意味する。

【0029】

「Ｃ_ｘ－Ｃ_ｙ脂肪族鎖」という用語は、ｘ～ｙ個の炭素原子、とりわけ１～１２個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を含んでなる、完全飽和または１つもしくは複数の不飽和を含むが芳香族ではない直鎖または分枝状の炭化水素鎖を意味する。本発明によれば、「脂肪族鎖」という用語は、置換または非置換の、直鎖または分枝状の、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を包含する。

【0030】

本発明で使用される場合、「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」」と言う用語は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどを含むがこれらに限定されない、１～６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝状の一価飽和炭化水素鎖を意味する。

【0031】

本発明で使用される場合、「Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル」」と言う用語は、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどを含むがこれらに限定されない、２～６個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの二重結合を含んでなる直鎖または分枝状の一価不飽和炭化水素鎖を意味する。

【0032】

本発明で使用される場合、「Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル」」と言う用語は、エチニル、プロピニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを含むがこれらに限定されない、２～６個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの三重結合を含んでなる直鎖または分枝状の一価不飽和炭化水素鎖を意味する。

【0033】

本発明で使用される場合、「アリール」」と言う用語は、好ましくは６～１２個の炭素原子を含んでなり、これらに限定されないが、例えばフェニルまたはナフチル基などの１つまたは複数の縮合環を含んでなる芳香族炭化水素を意味する。有利には、フェニル基である。

【0034】

本発明で使用される場合、「ヘテロアリール」」と言う用語は、１または数個、とりわけ１～４個、有利には１または２個の炭素原子がそれぞれ、硫黄原子、酸素原子および窒素原子から選択される、好ましくは酸素原子および窒素原子から選択されるヘテロ原子で置換されている、１または数個、とりわけ１または２個の縮合炭化水素サイクル（cycles）を含んでなる芳香族基を意味する。フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリル、イソキノリル、キノキサリルまたはインジルでありうる。

【0035】

本発明で使用される場合、「Ｃ_１－Ｃ_６－アルキルアリール」または「Ｃ_１－Ｃ_６アルキルヘテロアリール」という用語は、上に定義のアリール基または上に定義のヘテロアリール基でそれぞれ置換された、上に定義のアルキル基を意味する。有利には、「Ｃ_１－Ｃ_６－アルキルアリール」はベンジル基である。

【0036】

本発明の文脈において、「任意選択で置換される」とは、当該基が、特に、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケン、Ｃ_２－Ｃ_６アルキン、アリール、Ｎ_３、オキソ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＣＯＲ^ｃ、ＣＯ_２Ｒ^ｄ、ＣＯＮＲ^ｅＲ^ｆ、ＯＲ^ｇ、Ｎ^＋Ｒ^ｈＲ^ｉＲ^ｊ、ＣＮおよびＮＯ_２（ここでＲ^ａ～Ｒ^ｊは互いに独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはアリール、好ましくはＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル）から選択されうる１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されることを意味する。

【0037】

「Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数の水素原子が、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択されるハロゲン原子、好ましくはフッ素原子で置換されている、上に定義のＣ_１－Ｃ_６アルキル鎖を意味する。例えば、それはＣＦ_３基である。

【0038】

本発明の文脈において、「不飽和」とは、炭化水素鎖が１つまたは複数の不飽和（複数可）、すなわち二重結合Ｃ＝Ｃまたは三重結合Ｃ≡Ｃを有利には１つを含有することを意味する。

【0039】

「医薬組成物」という用語は、本発明の枠組みにおいて、予防的特性および治療的特性を有する組成物を意味する。

【0040】

「ペプチドカップリング」という用語は、アミン官能基とカルボン酸官能基との化学反応を意味する。有利には、ペプチドカップリングは、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシ－ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＡｔ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）もしくはＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）などの添加剤または塩基を任意選択で伴って、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ヘキサフルオロホスファート－２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、テトラフルオロボラート－２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）、ヘキサフルオロホスファート－Ｏ－（７－アゾベンゾトリアゾール－１イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）またはプロピルホスホン酸無水物などのカップリング剤の存在下で実施されることになる。

【0041】

本発明で使用される場合、「ＶＡＳＨ（酵素）」という用語は、神経変性障害、精神障害、神経障害、繊毛病、がん、および筋ジストロフィーに関連する微小管脱チロシン化機構に関与するチューブリンカルボキシペプチダーゼ酵素（ＴＣＰａｓｅ）を意味する。

【0042】

「生体分子」という用語は、生物学的特性を有する分子を意味する。本発明の文脈において、タンパク質、ペプチド、光標識剤などのバイオマーカー、またはＥ３ユビキチンリガーゼリクルーター（例えば、サリドマイド、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ｄＢＥＴ１、ｄＦＫＢＰ１２、ＱＣＡ５７０、ＰＲＯＴＡＣ６、ＺＮＬ－０２－０９６またはｄ９Ａ－２が挙げられるが、それらに限定されない）を意味する。

【0043】

本発明で使用される「ＰＲＯＴＡＣ」という用語はＰＲＯｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓの短縮形である。「ＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーター」は、選択的でかつ完全なタンパク質分解のためのツールとして有用なリンカーでつながった２つリガンドを含んでなる複合体である。リガンドの一方は分解対象となるタンパク質と結合するよう意図され、もう一方はユビキチンリガーゼを標的とすべきである。結果として、ＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターは、分解対象となるタンパク質とリガーゼを近接させることができ、標的タンパク質の（ポリ）ユビキチン化、すなわち、単一または複数の、小さな（８．６ｋＤａ）制御タンパク質であるユビキチンの基質タンパク質への付加をもたらす。（ポリ）ユビキチンタグは、分解対象となるタンパク質に付加され、そのタンパク質をプロテアソームによる分解に送る。「従来の」阻害剤とは違って、ＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターは、選択的なタンパク質分解を誘導し、それによりすべての生物学的機能を抑制する。本発明の文脈において、分解対象となるタンパク質はＶＡＳＨ酵素である。したがって、ＶＡＳＨ酵素と結合するよう意図されたＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターのリガンドは、式（Ｉ）の化合物の断片であり、ユビキチンリガーゼを標的とするよう意図されたリガンドは、典型的にはサリドマイドである。

【0044】

「プロドラッグ」という用語は、インセルロまたは生体内での生体内変換を経て、化学的または酵素的切断によって活性薬物を放出する、活性薬物の典型的に薬理学的に不活性な、または活性の低い誘導体に関する。「薬理学的に不活性な、または活性の低い誘導体」とは、本発明の文脈において、プロドラッグがインビトロの設定ではＶＡＳＨ活性部位の阻害に関して関連する活性を有しないことと理解される。しかし、インセルロおよび生体内のアッセイでは活性薬物を提供するために必要な変換が可能であるので、そのような試験においては活性がある。プロドラッグは、細胞浸透性の増加、溶解性、安定性の増大、バイオアベイラビリティの向上、副作用の軽減、より良い選択性など、親薬物と比べて多くの利点を提供することができる。プロドラッグの活性化には、ＣＹＰ４５０やＤＴ－ジアホラーゼのような酸化還元酵素、カルボキシルエステラーゼやβ－グルクロニダーゼのような加水分解酵素を含め、多くの酵素が関与するが、それらに限定されるものではない。

【0045】

本発明の文脈において、本開示に定義のプロドラッグ化合物は、インビトロで不活性であってもよい。しかし、プロドラッグ化合物は、より高い細胞浸透性をもつ。細胞への浸透後、プロドラッグ化合物は加水分解されて、対応する活性薬物、すなわち強力なＶＡＳＨ阻害剤が得られる。

【0046】

式（Ｉ）の化合物
本発明による化合物は、立体異性体または、鏡像異性体またはジアステレオ異性体の混合物などの立体異性体の混合物、とりわけラセミ混合物の形態でありうる。特定の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、上記で定義されたように、立体配置（Ｓ，Ｓ）、立体配置（Ｒ，Ｒ）、立体配置（Ｓ，Ｒ）または立体配置（Ｒ，Ｓ）の１つのジアステレオ異性体の形態である。

【0047】

本明細書で定義される式（Ｉ）は、活性化合物、すなわち薬物とそのプロドラッグの両方を包含する。

【0048】

特に、本発明による「プロドラッグ」という用語は、Ｒ^３はＯＨではない式（Ｉ）の化合物を意味する。

【0049】

好ましくは、本発明によるプロドラッグは、Ｒ^３が、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、Ｏ－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールまたはＮＨＯＨであり、上記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位が、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリール、アルキル－ヘテロアリールまたはアルキル－アリールが任意選択で置換される式（Ｉ）の化合物である。プロドラッグでは、Ｒ^３はとりわけ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、特にＯ－エチル、またはＯ－ベンジルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリールである。

【0050】

本発明の文脈において、「薬物」という用語は、Ｒ^３がＯＨである式（Ｉ）の化合物を意味する。

【0051】

典型的には、Ｒ^３は隣接するカルボキシル基と一緒にエステル基を形成する。プロドラッグから薬物に変換される際に、隣接するカルボキシル基が一緒にＲ^３によって形成されるこのエステルは、典型的には、対応するカルボン酸中で加水分解される。

【0052】

本発明の文脈において、薬物は、プロドラッグ中に存在するエステル基が薬物中で、対応するカルボン酸に変換されるという点で、対応するプロドラッグとは異なる。好ましくは、プロドラッグは、隣接するカルボキシル基と一緒にＲ^３によって形成されているエステル基を１つだけ含んでなる。したがって、典型的には、所与のプロドラッグに対応する薬物は、Ｒ^３基を除いて、上記プロドラッグと同じ式を有する。言い換えれば、所与のプロドラッグおよびその薬物において、典型的には置換基Ｒ^１、ＸおよびＲは、それぞれ同一である。代替的には、プロドラッグは２つ以上のエステル基を含んでなることもある。そのような場合、すべてのエステル基が、対応する薬物のカルボン酸に変換される。

【0053】

好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、立体配置（Ｓ，Ｓ）のジアステレオ異性体の形態であり、次の式（Ｉ－Ａ）

【化8】

に相当する。

【0054】

より好ましい実施形態では、式（Ｉ－Ａ）の化合物は次の鏡像異性体（Ｉ－Ａ’）

【化9】

に相当する。

【0055】

好ましい実施形態では、Ｘは

【化10】

であり、好ましくは

【化11】

であり、かつＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３は本開示に定義のとおりである。

【0056】

別の特定の実施形態では、Ｘは

【化12】

であり、好ましくは

【化13】

であり、かつＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３は本開示に定義のとおりである。

【0057】

この実施形態によれば、Ｒ^４は、とりわけＨまたはＣ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖であり、最大で４つのメチレン単位は、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記Ｃ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖は１つまたは複数のＯＨ基で任意選択で置換される。特に、Ｒ^４は、Ｈ、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、（ＣＨ_２）_ｐ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＨ、（ＣＨ_２）_ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＯＨおよびＣ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＯＨからなる群のなかで選択され、ｐは１～４の整数であり、上記Ｃ_１－Ｃ_６アルキルは、とりわけメチルまたはエチル、好ましくはエチルである。

【0058】

別の特定の実施形態では、Ｘは以下であり、

【化14】

好ましくは以下であり、

【化15】

かつＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３は本開示に定義のとおりである。

【0059】

好ましい実施形態によれば、ＲはＯＲ^２である。

【0060】

いくつかの実施形態によれば、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルなどのＣ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、またはＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、上記脂肪族鎖またはアルキル－アリールは任意選択で置換される。好ましくは、Ｒ^２は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、または任意選択で置換されたベンジルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールである。Ｒ^２がメチルまたはエチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルであるとき、それは非置換であるか、またはとりわけ、１つまたは複数のハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２もしくはＮ^＋（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_３、特にＮ^＋（ＣＨ_３）_３で置換される。より好ましくは、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはベンジルである。さらにより好ましくは、Ｒ^２は、エチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルまたはベンジルである。

【0061】

いくつかの実施形態によれば、Ｒ^２がＨではないことが好ましい。そのような実施形態では、したがってＲ^２は、好ましくは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルなどのＣ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、またはＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、上記脂肪族鎖またはアルキル－アリールは任意選択で置換され、より好ましくは、Ｒ^２は、エチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルまたはベンジルである。

【0062】

別の実施形態によれば、Ｒは、ＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、Ｒ^９はＣ_１－Ｃ_６脂肪族鎖またはアリールであり、上記脂肪族鎖またはアリールは任意選択で置換される。好ましくは、Ｒ^９は、メチルもしくはエチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキル、または任意選択で置換されたアリールである。Ｒ^９がアリール、とりわけフェニルであるとき、好ましくは、非置換である、またはＯＨ、もしくはメチルもしくはエチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルで置換される。

【0063】

いくつかの他の実施形態によれば、Ｒ^３は、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、またはＮＨＯＨであり、上記脂肪族鎖は任意選択で置換される。好ましくは、Ｒ^３は、ＯＨ、任意選択で置換されたＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－アリルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルケニル、Ｏ－ベンジルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、またはＮＨＯＨである。Ｒ^３がＯ－メチルまたはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであるとき、上記アルキルはとりわけ、非置換である、または１つもしくは複数のハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２もしくはＮ^＋（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_３、特にＮ^＋（ＣＨ_３）_３で置換される。より好ましくは、Ｒ^３は、ＯＨまたはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルである。

【0064】

いくつかの実施形態によれば、Ｒ^１は、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＯ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニルであり、ただし、Ｒ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１はＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルではないことを条件とする。好ましくは、Ｒ^１は、Ｏ－メチル、Ｏ－エチルまたはＯ－アリルであり、ただし、Ｒ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１はＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルではないことを条件とする。Ｒ^１がＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであるとき、Ｒ^３は、好ましくは、非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２もしくはＮ^＋（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_３、特にＮ^＋（ＣＨ_３）_３で置換された、Ｏ－メチルまたはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである。より好ましくは、Ｒ^１がＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、とりわけＯ－エチルであるとき、Ｒ^３はＯ－エチルである。Ｒ^１がＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルのとき、Ｒ^２はＨではないことが好ましい。

【0065】

他の実施形態によれば、Ｒ^１は、ＮＲ^１ａＲ^１ｂであり、Ｒ^１ａは、ＨまたはメチルもしくはエチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒ^１ｂは、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、上記アルキルは、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはアリールで任意選択で置換される。そのような実施形態では、Ｒ^１は、ＮＨＯＨ、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＮ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２であることができ、メチル、エチル、ｎ－プロピルまたはｎ－ブチルなどの上記アルキルは、非置換であるか、またはＣ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、とりわけＣ（Ｏ）－メチルもしくはＣ（Ｏ）－エチル、もしくはフェニルなどのアリールで置換される。

【0066】

好ましい実施形態によれば、Ｒ^１は

【化16】

であり、好ましくは

【化17】

である。

【0067】

式（Ｉ）の化合物は次の式の化合物

【化18】

であることができ、式中、Ｒ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、ＸおよびＹは、本開示に定義のとおりである。

【0068】

好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次の立体配置を有する式（Ｉ－Ａ_ａ）の化合物

【化19】

であり、式中、Ｒ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、ＸおよびＹは、本開示に定義のとおりである。

【0069】

より好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次の立体配置を有する式（Ｉ－Ａ’_ａ）の化合物

【化20】

であり、式中、Ｒ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、ＸおよびＹは、本開示に定義のとおりである。

【0070】

Ｙはとりわけ

【化21】

であることができる。

【0071】

そのような実施形態では、Ｒ^５は、好ましくは、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－アリール、Ｏ－ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキル－アリールまたはアルキル－ヘテロアリールは任意選択で置換され、Ｒ^９は上に定義のとおりである。より好ましくは、Ｒ^５は、ＯＨ、Ｏ－メチルまたはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－ベンジルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルなどのＣ（Ｏ）ＮＨ－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＮＨ（Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ^９であり、Ｒ^９は好ましくは、非置換であるか、またはＯＨ、もしくはメチルもしくはエチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルで置換される。特に、Ｒ^５は、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、とりわけＯ－エチルである。

【0072】

代替的には、Ｙは－（ＣＨ_２）_ｍ－であることができ、ｍは、０～６、好ましくは０～４の整数である。より好ましくは、ｍは１または２であり、さらにより好ましくは、ｍは２である。Ｙが－（ＣＨ_２）_ｍである実施形態では、Ｒ^５は、好ましくはＣ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、上記アルキルは任意選択で置換される。より好ましくは、Ｒ^５は、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＥｔまたはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨ、特にＣＯＯＨである。

【0073】

いくつかの実施形態によれば、Ｒ^６は、ＯＨまたはＯ－メチル、Ｏ－エチルもしくはＯ－アリルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖であり、特にＹが

【化22】

のとき、とりわけＯ－エチルである。

【0074】

他の特定の実施形態によれば、Ｒ^６は、ＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、特にＹが、－（ＣＨ_２）_ｍ－であるとき、とりわけ－（ＣＨ_２）_２－である。そのような実施形態では、Ｒ^７は、好ましくはＨ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ベンジルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、またはＣＨ_２－インドール基などのＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールである。Ｒ^８は、好ましくはＣ（Ｏ）ＮＨ_２、フェニルなどのアリール、インドールなどのヘテロアリール、ＳＨ、またはＳ－Ｃ（ＣＨ_３）_３などのＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｎは、好ましくは０、１、２または３である。いくつかの実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒ^８は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２であり、ｎは０である。いくつかの他の好ましい実施形態では、Ｒ^７は、Ｈであり、Ｒ^８は、フェニルであり、ｎは、１、２または３、好ましくは１である。

【0075】

好ましい実施形態によれば、Ｒ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１は

【化23】

であり、好ましくは

【化24】

である。

【0076】

好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、上に定義の式（Ｉ－Ａ’ａ）の化合物であり、式中、Ｘ、ＲおよびＲ^３は、上に定義のとおりであり、Ｒ^１は

【化25】

であり、好ましくは

【化26】

であり、
－Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、ｍは上に定義のとおりであり、とりわけｍは２であり、Ｒ^５は、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＥｔもしくはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、Ｒ^６は、ＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、Ｒ^７は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ベンジルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、もしくはＣＨ_２－インドール基などのＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールであり、Ｒ^８は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、フェニルなどのアリール、インドールなどのヘテロアリール、ＳＨ、もしくはＳ－Ｃ（ＣＨ_３）_３などのＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｎは、０、１、２もしくは３であるか、または
－Ｙは

【化27】

であり、Ｒ^５は、ＯＨ、Ｏ－メチルもしくはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－ベンジルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、Ｒ^６は、ＯＨもしくはＯ－メチル、Ｏ－エチルもしくはＯ－アリルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖である。

【0077】

別の好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ－Ａ’）のものであり、式中、Ｘは

【化28】

であり、Ｒ^１は、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルであり、Ｒは、ＯＲ^２であり、Ｒ^２は、好ましくはＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル、特にエチルであり、Ｒ^３は、ＯＨまたはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルである。

【0078】

より好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ－Ａ’_ａ）のものであり、式中Ｘは

【化29】

であり、Ｒは、ＯＲ^２であり、Ｒ^２は、好ましくはＨ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にエチル、またはベンジルであり、Ｒ^３は、ＯＨまたはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルであり、Ｒ^１は

【化30】

であり、好ましくは

【化31】

であり、
式中、
－Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｍ－、特に－（ＣＨ_２）_２－であり、Ｒ^５はＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、Ｒ^６は、ＮＨ－ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、Ｒ^８はフェニルなどのアリールであり、ｎは、１、２もしくは３、とりわけ１であるか、または
－Ｙは

【化32】

であり、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、ＯＨまたはＯ－メチル、Ｏ－エチルもしくはＯ－アリルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、特にＯ－エチルである。

【0079】

別のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ－Ａ’）のものであり、式中、Ｘは

【化33】

であり、Ｒ^１は、ＮＲ^１ａＲ^１ｂであり、Ｒ^１ａは、好ましくはＨであり、Ｒ^１ｂは、好ましくは、メチル、エチル、ｎ－プロピルまたはｎ－ブチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、上記アルキルは、Ｃ（Ｏ）－メチルまたはＣ（Ｏ）－エチルで置換され、Ｒは、ＯＲ^２であり、Ｒ^２は、好ましくはＣ_１－Ｃ_６アルキル、特にエチルであり、Ｒ^３は、ＯＨまたはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルである。

【0080】

特定の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は次の式（Ｉ－ｂｉｓ）のもの

【化34】

またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物であり、
式中
Ｘは

【化35】

であり、
Ｒ^１は、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、ＮＨ－ＯＨ、または

【化36】

であり、
Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－アリールであり、上記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位は、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリールまたはアルキル－アリールは、任意選択で置換され、
Ｒ^３は、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６脂肪族鎖、Ｏ－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールまたはＮＨＯＨであり、上記脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位は、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記脂肪族鎖、アリール、ヘテロアリール、アルキル－ヘテロアリールまたはアルキル－アリールは、任意選択で置換され、
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖であり、最大で４つのメチレン単位は、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨまたはＮ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで任意選択で置換され、上記Ｃ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖は任意選択で置換され、
Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｍ－または

【化37】

であり、
Ｒ^５は、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリール、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルまたはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキル－アリールまたはアルキル－ヘテロアリールは、任意選択で置換され、
Ｒ^６は、ＯＨ、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ＮＨ－ＯＨまたはＮＨ－ＣＨ（Ｒ^７）－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、上記アルキルは、任意選択で置換され、
Ｒ^７は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－アリールまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル－ヘテロアリールであり、
Ｒ^８は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＨ、ＮＨ_２またはＳ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、０～６の範囲の整数であり
ただし、Ｘが

【化38】

であり、かつＲ^３がＯＨであるとき、Ｒ^１は、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルではないことを条件とする。

【0081】

特に、式（Ｉ）の化合物は以下

【化39】

ではない。

【0082】

好ましくは、式（Ｉ）の化合物は以下

【化40】

ではない。これはWilliam R. Roush et al. Synthesis, 1999, p.1500-1504に記載されている。

【0083】

好ましくは、式（Ｉ）の化合物は以下

【化41】

ではない。これはAillaud, C. et al. Science, 2017, 358, p.1448-1453, Supplementary materialに化合物ＳＤ－１３９として記載されている。

【0084】

特定の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、アミノ酸またはペプチドをベースとするＶＡＳＨ阻害剤である。本発明による「アミノ酸またはペプチドをベースとするＶＡＳＨ阻害剤」とは、１～２０個のアミノ酸から構成されるペプチド部分を含有するＶＡＳＨ阻害剤を意味し、アミノ酸または最もＣ末端のアミノ酸がＹおよびＦから選択され、チューブリンカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質の活性を少なくとも部分的に標的とし、阻害することができ、それにより微小管脱チロシン化を阻害することができる。

【0085】

「アミノ酸部分」という用語は１個のアミノ酸を意味し、「ペプチド部分」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸および最大２０個のアミノ酸を含有する部分を意味する。ペプチド部分が２つ以上のアミノ酸を含んでなる場合、上記アミノ酸はペプチド結合により一緒に結合し、化学修飾されているか否かを問わない。

【0086】

好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下

【化42-1】

【化42-2】

【化42-3】

【化42-4】

【化42-5】

【化42-6】

ならびにその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物のなかで選択される。

【0087】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、上に定義され、とりわけ以下からなる群

【化43-1】

【化43-2】

【化43-3】

のなかで選択されるプロドラッグである。

【0088】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、上に定義され、とりわけ以下からなる群

【化44-1】

【化44-2】

【化44-3】

【化44-4】

のなかで選択される薬物である。

【0089】

特定の好ましい実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、化合物ＬＶ－８０～ＬＶ－１２４およびその複合体からなる群のなかで選択される。

【0090】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、ＬＶ－８０またはその複合体である。

【0091】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、ＬＶ－９１またはその複合体である。

【0092】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、ＬＶ－１０４またはその複合体である。ＬＶ－１０４は、対応する活性薬物ＩＢＭＴ１１のプロドラッグでありうる。

【0093】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、ＬＶ－１１１またはその複合体である。ＬＶ－１１１は、対応する活性薬物のプロドラッグでありうる。

【0094】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物は、ＩＢＭＴ２３またはその複合体である。ＩＢＭＴ２３は、対応する活性薬物のプロドラッグでありうる。

【0095】

式（Ｉ）の化合物の調製方法
上記の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物は、以下のステップ
（ａ）式（ＩＩ）の化合物

【化45】

を式（ＩＩＩ）の化合物

【化46】

（式中、Ｒ^Ｚは上に定義のＲ^１またはＯＨである）
と反応させること
（ｂ）任意選択で、ＯＨであるＲ^Ｚを上に定義のＲ^１に変換すること
を含んでなる方法によって得ることができる。

【0096】

式（ＩＩＩ）の化合物は当業者に周知の方法に従って得ることができる。

【0097】

式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）の化合物間の反応は、とりわけ上に定義のペプチドカップリングである。

【0098】

式（ＩＩ）の化合物は、とりわけ

【化47】

である。

【0099】

任意選択で、式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）の化合物間の反応の前または後に、当業者に周知の保護／脱保護および／または官能化の追加の工程を行って、上記の好適な置換基をもつ式（Ｉ）の化合物を得ることができる。

【0100】

特に、Ｒ^ＺがＯＨであるとき、ステップ（ａ）で得られる化合物は以下

【化48】

とのペプチドカップリングを経て、Ｒ^１が

【化49】

である式（Ｉ）の化合物が得られる。

【0101】

式（Ｉ）の化合物の製造方法において実施される１つまたは複数のペプチドカップリングは、とりわけカップリング剤としてＰｙＡＯＰの存在下で達成される。好ましくは、ベースＤＩＥＡも使用される。

【0102】

ペプチドカップリングは、固体支持体上で、とりわけ試薬の１つであるアミン部分または酸部分が付いた樹脂を用いることによって実施することができる。そのような方法は当業者に周知である。

【0103】

生体分子に結合した式（Ｉ）の化合物の断片を含んでなる複合体
本発明はまた、生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、バイオマーカー（例として、ローダミン、シアニン誘導体もしくはフルオレセインなどの光標識剤）、ビオチンなどの親和性プローブ、またはＥ３ユビキチンリガーゼリクルーター（サリドマイド、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ｄＢＥＴ１、ｄＦＫＢＰ１２、ＱＣＡ５７０、ＰＲＯＴＡＣ６、ＺＮＬ－０２－０９６もしくはｄ９Ａ－２を含むがそれらに限定されない））に結合した上記の式（Ｉ）の化合物の断片を含んでなる複合体に関する。

【0104】

「式（Ｉ）の化合物の断片」という用語は、例えばリンカーを介した生体分子への結合により一方の端が修飾される式（Ｉ）の化合物を意味する。したがって、典型的には、Ｒ^１基は上記結合を可能にするように修飾される。例えば、本発明による複合体では、式（Ｉ）の化合物の断片は以下の部分

【化50】

を意味し、
式中

【化51】

は、断片と複合体の残りの部分との間の単一結合であり、Ｒ、Ｒ^３、Ｘ、ＹおよびＲ^５は、本開示に定義のとおりである。

【0105】

特定の実施形態によれば、本発明による複合体は、次の式（Ｉ’）

【化52】

またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物を有し、
式中
Ｂは生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、バイオマーカー（例として、光標識剤）、またはＥ３リガーゼリクルーター（サリドマイドなど））であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｒ、Ｒ^３、Ｘ、ＹおよびＲ^５は上に定義のとおりである。

【0106】

好ましい実施形態によれば、式（Ｉ’）の複合体は、次の立体配置を有する式（Ｉ’－Ａ）の複合体

【化53】

である。

【0107】

特に、式（Ｉ’）の複合体は、次の立体配置を有する式（Ｉ’－Ａ_ａ）の複合体

【化54】

である。

【0108】

式（Ｉ’）、特に式（Ｉ’－Ａ_ａ）の複合体では、Ｘは好ましくは

【化55】

である。

【0109】

Ｒは、好ましくはＯＲ^２であり、Ｒ^２は、有利にはＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキル、特にエチルまたはベンジルである。Ｒ^３は、好ましくは、ＯＨまたはＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルである。

【0110】

Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｍ－または

【化56】

であることができる。

【0111】

Ｙが、－（ＣＨ_２）_ｍ－、特に－（ＣＨ_２）_２－であるとき、Ｒ^５は、好ましくはＣ（Ｏ）ＮＨＯＨであり、Ｒ^６は、好ましくはＮＨ－ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^８であり、Ｒ^８は、有利にはフェニルなどのアリールであり、ｎは、有利には１、２または３、とりわけ１である。Ｙが

【化57】

であるとき、Ｒ^５は、好ましくは、ＯＨまたはＯ－メチルもしくはＯ－エチルなどのＯ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、特にＯ－エチルである。

【0112】

いくつかの実施形態によれば、リンカーＬは、Ｃ_１－Ｃ_１２脂肪族鎖に由来する二価ラジカルに対応し、１つまたは複数のメチレン単位（複数可）は、アリレンまたは断片－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＳＯ_２－および－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）－から選択される構造リンカーで置換され、上記脂肪族鎖は、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルおよび／またはベンジル基などのＣ_１－Ｃ_６アルキルアリール基、例えばベンジル基から選択される１つまたは複数のラジカルで置換される。

【0113】

好ましくは、生体分子はＥ３リガーゼリクルーター、とりわけサリドマイドであり、したがって複合体はＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターである。

【0114】

したがって、好ましい実施形態では、複合体は、次の式（ＩＩ’）のＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーター

【化58】

であり、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^５は上に定義のとおりである。

【0115】

例えば、ＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターは

【化59】

であり、式中、Ｘは上に定義のとおりであり、特にＸは

【化60】

である。

【0116】

別の実施形態では、生体分子は、親和性プローブであり、式（Ｉ’）の複合体は

【化61】

であることができ、ここで、式（Ｉ）の化合物はビオチンに結合している。

【0117】

別の実施形態では、生体分子は光標識剤であり、式（Ｉ’）の複合体は

【化62】

であることができ、ここで、式（Ｉ）の化合物はローダミンに結合している。

【0118】

医薬組成物
本発明はまた、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤ならびに少なくとも１つの上記の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物を含んでなる医薬組成物に関する。

【0119】

本発明はまた、式（Ｉ’）の複合体、またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物など、少なくとも１つの上記の複合体、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。

【0120】

本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、眼内投与、硝子体内投与、局所投与、舌下投与を含むがこれらに限定されない）を意図することができ、好ましくは経口投与または静脈内投与である。有効成分は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物に、従来の医薬担体と混合して投与するための単位形態で投与することができる。

【0121】

経口投与の場合、医薬組成物は固体または液体（溶液または懸濁液）の形態でありうる。

【0122】

固体組成物は、錠剤、ゼラチンカプセル、粉末、顆粒などの形態であることができる。錠剤では、有効成分は、ゼラチンや、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなどの医薬ビヒクル（複数可）と混合した後、圧縮することができる。錠剤は、特に蔗糖または他の好適な材料でさらにコーティングしてもよく、またはそれらが持続もしくは遅延した活性を有するように処理してもよい。粉末または顆粒では、有効成分は、分散剤、湿潤剤または懸濁剤、および矯味矯臭剤または甘味料と混合または造粒することができる。ゼラチンカプセルでは、有効成分は、前述のような粉末もしくは顆粒の形態、または後述のような液体組成物の形態で、ソフトまたはハードゼラチンカプセルに導入することができる。

【0123】

液体組成物は、水などの溶媒中に、有効成分を甘味料、矯味剤、好適な着色料と一緒に含むことができる。さらに、液体組成物は、上記のような粉末または顆粒を、水、ジュース、牛乳などの液体に懸濁または溶解することによっても得ることができる。例えば、シロップまたはエリキシルであることができる。

【0124】

非経口投与の場合、組成物は、懸濁剤および／または湿潤剤を含有しうる水性懸濁液または溶液の形態でありうる。組成物は有利には無菌である。（特に血液と比較して）等張の溶液の形態でありうる。

【0125】

使用
治療での使用
式（Ｉ）の化合物、薬学的に許容される塩および／または溶媒和物、または本発明による医薬組成物はＶＡＳＨ阻害剤として作用し、これは、微小管の脱チロシン化を触媒するＶＡＳＨのプチダーゼ活性を阻害することができることを意味する。このＶＡＳＨペプチダーゼ活性が調節不能になり、とりわけ異常に増加すると、以下に定義するような重症な障害を引き起こす。

【0126】

Ｘが、

【化63】

である式（Ｉ）の化合物はとりわけ不可逆的なＶＡＳＨ阻害剤であり、ＶＡＳＨ酵素に共有結合する。

【0127】

Ｘが、

【化64】

である式（Ｉ）の化合物はとりわけ可逆的なＶＡＳＨ阻害剤であり、ＶＡＳＨペプチダーゼ酵素活性が回復しうることを意味する。

【0128】

本発明は、薬物として、特にＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療に使用するための、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物に関する。

【0129】

言いかえれば、本発明は、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物の使用であって、とりわけＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療を意図した薬物の製造のための、使用に関する。

【0130】

言いかえれば、本発明は、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物の使用であって、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療のための、使用に関する。

【0131】

言いかえれば、本発明は、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする人に、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／もしくは溶媒和物の有効量を投与することを含んでなる、方法に関する。

【0132】

別の態様によれば、本発明は、薬物として、特にＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療に使用するための、本発明による医薬組成物に関する。

【0133】

言いかえれば、本発明は、本発明による医薬組成物の使用であって、とりわけＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療を意図した薬物の製造のための、使用に関する。

【0134】

言いかえれば、本発明は、本発明による医薬組成物の使用であって、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療のための、使用に関する。

【0135】

言いかえれば、本発明は、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする人に、本発明による医薬組成物の有効量を投与することを含んでなる、方法に関する。

【0136】

別の態様によれば、本発明は、薬物として、特にＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療に使用するための、本発明による複合体に関する。

【0137】

言いかえれば、本発明は、本発明による複合体の使用であって、とりわけＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療を意図した薬物の製造のための、使用に関する。

【0138】

言いかえれば、本発明は、本発明による複合体の使用であって、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療のための、使用に関する。

【0139】

言いかえれば、本発明は、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする人に、本発明による複合体の有効量を投与することを含んでなる、方法に関する。

【0140】

好ましい実施形態は、薬物として、特にＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害の予防および／または治療に使用するための、とりわけ上に定義の式（Ｉ’’）の本発明によるＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターに関する。そのようなＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターは、ＶＡＳＨ酵素を選択的に標的とし、プロテアソームによるその全分解を誘導することができる。

【0141】

Ｘが、

【化65】

である式（Ｉ’’）の複合体は、とりわけ不可逆的なＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターである。

【0142】

Ｘが、

【化66】

である式（Ｉ’’）の複合体は、とりわけ可逆的なＰＲＯＴＡＣ Ｅ３リガーゼリクルーターである。

【0143】

本発明によれば、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害は、好ましくは、線維症、がんおよびチューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患から選択される。

【0144】

特に、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害は、微小管の脱チロシン化および／またはポリグルタミル化に関与する障害であり、とりわけ、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患、緑内障、精神障害、神経障害、結腸がんや神経芽細胞腫などのがん、筋ジストロフィー、不妊症、網膜変性症、プルキンエ細胞疾患、乳児発症型変性、男性不妊症および繊毛病、特に、神経変性疾患、がん、および筋ジストロフィーから選択される。

【0145】

特に、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性－関連障害は、微小管脱チロシン化の変化が関与する障害を含むが、これに限定されないチューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患である。

【0146】

特定の実施形態によれば、微小管脱チロシン化の変化が関与する障害は、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患、緑内障、精神障害、および神経障害、結腸がんや神経芽細胞腫などのがん、筋ジストロフィー、不妊症、網膜変性症および繊毛病、特に、神経変性疾患、がん、および筋ジストロフィーから選択されうる。

【0147】

別の態様では、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害は、ポリグルタミル化が関与する障害を含む、チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患である。

【0148】

特定の実施形態によれば、ポリグルタミル化が関与する障害は、神経変性、神経発達障害、プルキンエ細胞疾患、乳児発症型変性、繊毛病、男性不妊症、がん、呼吸障害、網膜変性症、出血性障害、非メンデル型遺伝障害（non-Mendelian inheretence disorders）から選択されうる。

【0149】

研究ツールとしての使用
別の態様によれば、本発明は特に、
－新規ＶＡＳＨ阻害剤を特定する、かつ／またはその阻害剤効率を定量するためのインビトロおよび／またはインセルロのスクリーニングアッセイ、
－特に、その発生や、悪性度（aggressiveness）、進行など、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害におけるチューブリン脱チロシン化の役割を研究するためのインビトロ方法、
－微小管の脱チロシン化および／またはポリグルタミル化の異常が関与するＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を特定またはモニターするためのインビトロ診断法、
－ならびに上記スクリーニングアッセイおよび方法を行うための関連キット
からなる群のなかで選択される研究および開発活動用の研究ツールとして使用するための、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体に関する。

【0150】

これらの研究開発活動は、上記式（Ｉ）の化合物またはその複合体の例示的ではあるが限定的ではない用途の例である。

【0151】

上記式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、上記インビトロまたはインセルロのスクリーニングアッセイまたは方法での陽性対照として使用される。

【0152】

上記式（Ｉ）の化合物は、例えば、蛍光色素、ＵＶ感受性色素、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、ビオチンと結合させることができるが、それらに限定されない。

【0153】

特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、式（Ｉ）の化合物が陽性対照として使用されるＶＡＳＨ阻害剤のインビトロスクリーニングアッセイ（一次スクリーニングアッセイ）に使用される。

【0154】

一例として、スクリーニングアッセイは、式（Ｉ）の化合物またはその複合体が陽性対照としてプレートにコーティングされる免疫アッセイである。

【0155】

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物またはその複合体を陽性対照として含んでなるＶＡＳＨ阻害剤の一次スクリーニングアッセイのためのインビトロキットアッセイに関する。

【0156】

別の特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、式（Ｉ）の化合物またはその複合体が陽性対照として使用されるＶＡＳＨ阻害剤（二次スクリーニングアッセイ）のインセルロスクリーニングアッセイに使用される。

【0157】

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物またはその複合体を陽性対照として含んでなるＶＡＳＨ阻害剤の二次スクリーニングアッセイのためのインセルロキットアッセイに関する。

【0158】

好ましい実施形態では、インセルロキットアッセイは、ＣＨＬ細胞株および陽性対照として式（Ｉ）の化合物を含んでなる。

【0159】

別の特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、特に、チューブリン脱チロシン化関連障害、その発生や、悪性度、進行など（例えば、がん）におけるチューブリン脱チロシン化の役割をより良く理解するためのツールとして使用される。

【0160】

よって、本発明はまた、以下のステップ
（ｉ）Ｃ末端遊離チロシンの切断および遊離（脱チロシン化）の条件下において、被験化合物の存在もしくは非存在下（陰性対照）で、または本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体の存在下（陽性対照）で、（ａ）α－チューブリンのＣ末端配列の少なくとも最後の４つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列および／または微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）と、最もＣ末端のアミノ酸残基としてチロシン（Ｙ）とを含んでなる、ＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２酵素の基質、および（ｂ）単離または組み換えＶＡＨＳ１またはＶＡＳＨ２を接触させること、
（ｉｉ）Ｃ末端遊離チロシンの切断および遊離の関連するシグナルを検出および測定するための試薬を使用すること、
（ｉｉｉ）被験化合物の存在および非存在（陰性対照）および本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体の存在下（陽性対照）で、Ｃ末端遊離チロシンのレベルを測定および比較すること、ならびに
（ｉｖ）Ｃ末端遊離チロシンのレベルが、被験化合物（ＶＡＳＨ阻害剤）の存在下で減少する化合物を選択すること、
（ｖ）任意選択で、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体（陽性対照）の存在下でＣ末端遊離チロシンのレベルと比較して、上記ＶＡＳＨ阻害剤化合物の阻害剤効率を分類すること
を含んでなる、ＶＡＳＨ阻害剤を特定するためのインビトロスクリーニングアッセイに関する。

【0161】

特定の実施形態では、ＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２酵素の基質は、精製された組み換えα－チューブリンおよび国際公開第２０２０／０１２００２号に開示の組み換え人工テロキンからなる群のなかで選択される。

【0162】

特定の実施形態では、Ｃ末端遊離チロシンを検出するステップ（ｉｉ）では、チロシナーゼを使用する比色アッセイが用いられる。

【0163】

別の特定の実施形態では、インビトロスクリーニングアッセイは免疫アッセイであり、そのステップ（ｉｉ）は、
－抗体－切断基質の複合体形成に有利な条件下で、脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された特異的標識抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）の有効量を加えること、および
－標識シグナルを明らかにするための手段、
または代替的には、
－抗体－切断基質の複合体形成に有利な条件下で、脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された一次特異的抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）の有効量を加えること、
－一次抗体－切断された基質－標識二次抗体の複合体形成に有利な条件下で、一次抗体に特異的な二次標識抗体の有効量を加えること、および
－標識シグナルを明らかにするための手段
を含んでなり、反応は可溶性（流体）相または固相で起こる。

【0164】

特に、抗体は、酵素、蛍光化合物およびフルオロフォア、（化学）発光化合物および放射性元素からなる群のなかで選択されるマーカー、好ましくは酵素、より好ましくはペルオキシダーゼで標識される。

【0165】

特に、免疫アッセイは、酵素免疫アッセイ、フルオロ免疫アッセイ、発光免疫アッセイまたはラジオ免疫アッセイ、好ましくはドットブロットまたは酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。

【0166】

特定の実施形態では、ＶＡＳＨ阻害剤を特定するためのインビトロスクリーニング免疫アッセイは固相で行われ、
－ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２の基質が、固体支持体、特に膜もしくはマイクロプレート上にコーティングされ、ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２酵素、被験化合物（複数可）および切断された基質、特に脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）（任意選択で、標識される、もしくは一次抗体に対して産生された標識二次抗体と組み合わされる）が反応溶液に加えられるか、または
－代替的には、切断された基質、特に脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）が、固体支持体、特に膜もしくはマイクロプレートにコーティングされ、ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２酵素、上記ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２の基質、被験化合物（複数可）、および切断された基質に対して産生された二次標識抗体が反応溶液に加えられるか、または
－代替的には、ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２酵素が、固体支持体、特に膜もしくはマイクロプレートにコーティングされ、上記ＶＡＳＨ１もしくはＶＡＳＨ２の基質、被験化合物（複数可）、および切断された基質、特に脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）（任意選択で、標識される、もしくは一次抗体に対して産生された標識二次抗体と組み合わされる）が反応溶液に加えられる。

【0167】

本発明はまた、上に開示のＶＡＳＨ阻害剤を特定するためのインビトロスクリーニング免疫アッセイを行うためのキットであって、
（ｉ）ＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２酵素基質、好ましくは、組み換えα－チューブリンまたは国際公開第２０２０／０１２００２号に開示の人工テロキン、
（ｉｉ）ＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２酵素、好ましくは、単離または組み換えＶＡＳＨ１またはＶＡＨＳ２、
（ｉｉｉ）切断された基質、好ましくは脱チロシン化α－チューブリンに対して産生され（ｄＴｙｒ－Ａｂ）、特に脱チロシン化α－チューブリンＳＦ９に対して産生され（ｄＴｙｒ－Ａｂ ＳＦ９）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された抗体、および任意選択で、切断基質抗体、好ましくは脱チロシン化α－チューブリン抗体に対して産生された二次抗体、
（ｉｖ）チロシン化されていない、単離または組み換えα－チューブリンまたはテロキンを含んでなる陰性対照、
（ｖ）陽性対照としての本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体、
（ｖｉ）ＶＡＳＨ１の基質もしくはＶＡＳＨ２の基質のいずれか、ＶＡＳＨ１酵素もしくはＶＡＳＨ２酵素のいずれかをコーティングまたはプレコーティングするための流体容器または代替的には固体支持体、好ましくはマイクロプレート、
（ｖｉｉ）基質切断、好ましくは脱チロシン化の反応条件における上記基質とＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２酵素の接触を可能にする試薬、
（ｖｉｉｉ）基質切断、好ましくは脱チロシン化のレベルを検出および測定するための試薬；ならびに
（ｉｘ）任意選択で使用通知書（notice of use）
を含んでなる、キットに関する。

【0168】

別の特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性を定量するためのインセルロ方法で使用される。

【0169】

本発明はまた、ＶＡＳＨ阻害剤を特定するためのインセルロスクリーニングアッセイであって、
（ｉ）ＣＨＬ－１細胞を培養し、それらをマルチウェル培養皿に播くこと、
（ｉｉ）ＣＨＬ－１細胞を、被験推定ＶＡＳＨ阻害剤の非存在（陰性対照）もしくは存在下、または本発明による式（Ｉ）の化合物もしくはその複合体（陽性対照）の存在下においてタキソールで処理すること、
（ｉｉｉ）抗体－切断基質の複合体形成に有利な条件下で、脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された特異的標識抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）および標識シグナルを明らかにするための手段を用いてタンパク質試料に含まれる脱チロシン化活性を検出すること、
（ｉｖ）被験化合物の存在および非存在下（陰性対照）ならびに本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体（陽性対照）の存在下で、タキソール誘導脱チロシン化のレベルを測定および比較すること、
（ｖ）タキソール誘導脱チロシン化のレベルが、被験化合物の存在下で減少している化合物（ＶＡＳＨ阻害剤）を選択すること、
（ｖｉ）任意選択で、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体（陽性対照）の存在下におけるタキソール誘導脱チロシン化レベルの減少と比較して、上記ＶＡＳＨ阻害剤化合物の阻害剤効率を分類すること
を含んでなる、アッセイに関する。

【0170】

本発明はまた、ＶＡＳＨ阻害剤を特定するためのインセルロスクリーニングアッセイを行うためのキットであって、
（ｉ）ＣＨＬ－１細胞、
（ｉｉ）タキソール、
（ｉｉｉ）脱チロシン化α－チューブリンに対して産生された抗体（ｄＴｙｒ－Ａｂ）、
（ｉｖ）陽性対照としての本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体、
（ｖ）ＣＨＬ－１細胞をコーティングまたはプレコーティングするための流体容器または代替的には固体支持体、好ましくはマイクロプレート、
（ｖｉ）脱チロシン化の反応条件におけるタキソールで前処理した上記ＣＨＬ－１細胞と、被験化合物または陽性対照との接触を可能にする試薬、
（ｖｉｉ）タキソール誘導脱チロシン化レベルの減少を検出および測定するための試薬、ならびに
（ｖｉｉｉ）任意選択で使用通知書
を含んでなる、キットに関する。

【0171】

別の特定の実施形態では、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその複合体は、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性関連障害を検出するためのインビトロ診断法に使用される。

【0172】

よって、本発明はまた、式（Ｉ）の化合物またはその複合体が陽性対照として使用されるインビトロ診断法のためのキットアッセイに関する。

【実施例】

【0173】

１）合成
略語：
Ａａｄ：α－アミノアジピン酸
Ａｌｌ：アリル基
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＮＭＰ：Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＰｙＡＯＰ：７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＲＭ：反応混合物
ＲＴ：室温（１８℃～２５℃）
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＴＥＳ：Ｔｒａｎｓ－エポキシコハク酸
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴｉＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｙｒ：チロシン

【0174】

１．１）材料
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護アミノ酸および１－［Ｂｉｓ（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）はすべて、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨから得た。ピペリジン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＴＦＡ、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）およびエチルエーテル（Ｅｔ_２Ｏ）はシグマアルドリッチから得た。ＡｍｐｈｉＳｐｈｅｒｅｓ４０ ＲＡＭ ０．３８ｍｍｏｌ／ｇ ７５～１５０μｍ樹脂はアジレント・テクノロジーから購入した。ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳに使用した溶媒はＨＰＬＣグレードであった。

【0175】

ＳＰＰＳの手順
標準的なＳＰＰＳプロトコールを用いてペプチド合成を行った。各合成は、Ｆｍｏｃ－ＲｉｎｋアミドＡｍｐｈｉＳｐｈｅｒｅｓ４０樹脂（０．３７ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて行った。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）、ＨＡＴＵ（４当量）およびＤＩＥＡ（６当量）をシリンジ反応器に加え、混合物を室温で１時間撹拌した。各カップリング反応後、ペプチド－樹脂をＤＭＦ／ピペリジン８０／２０（体積／体積）溶液での２回の５分間脱保護サイクルに供した。

【0176】

化合物の精製
粗化合物はすべて、Ｃ１８逆相カラム（Ｃ１８ Ｄｅｌｔａｐａｋカラム、１００ｍｍ×４０ｍｍ、１５μｍ、１００Å）で、勾配モードのＨ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡおよびＣＨ_３ＣＮ＋０．１％ＴＦＡの混合物を５０ｍＬ／分の流速で、ＵＶ検出２１４ｎｍによる分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ４０００装置）で精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、凍結乾燥した。

【0177】

ＬＣ／ＭＳ分析
０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水（５０／５０体積／体積）混合物中で試料を調製した。ＬＣ／ＭＳシステムはＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０ ＨＰＬＣとＭｉｃｒｏｍａｓｓ（マンチェスター、英国）のＺＱスペクトロメーター（エレクトロスプレーイオン化モード、ＥＳＩ＋）で構成された。分析はすべて、Ｃ１８ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ２５×４．６ｍｍカラムを用いて行った。流量３ｍｌ／分、０～１００％のアセトニトリルを、Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＨＣＯＯＨとＣＨ_３ＣＮ＋０．１％ＨＣＯＯＨの混合物を２１４ｎｍのＵＶ検出による勾配モードで５分間かけて勾配。１００～２００μｌ／分の溶媒流速で陽イオンエレクトロスプレーマススペクトルを得た。噴霧ガスと乾燥ガスの両方に窒素を用いた。０．１秒間隔で２００～１７００ｍ／ｚの範囲のスキャンモードでデータを得た。１０回のスキャンを合計して最終スペクトルを得た。分単位で保持時間を示す。ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳに用いた溶媒はＨＰＬＣグレードであった。

【0178】

１．２）合成および特徴付け
１．２．１）本発明による式（Ｉ）の化合物の合成
化合物１の合成

【0179】

【化67】

【0180】

Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｂｎ）－ＯＨ（２ｇ、５．４ｍｍｏｌ、ＦＬＵＫＡ ＡＧ）を３ｍｌの無水ＤＭＦに溶かし、続いてＣｓ_２ＣＯ_３（１．８ｇ、５．４ｍｍｏｌ）に溶かした。ＲＭをＲＴで５分間攪拌した後、臭化アリル（６９６．６μｌ、８．１ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＴで２時間反応させた後、ＲＭをブラインおよびＥｔＯＡｃで希釈し、次いで２回抽出した。次いで、再び集めた有機相を、１Ｍ ＫＨＳＯ_４溶液で２回、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液で２回、ブラインで２回洗浄し、次いで有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｂｎ）－ＯＡｌｌ（２．４５ｇ、収率：１１０％、ｔ_Ｒ＝２．１９、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４１２．３［Ｍ＋Ｈ］^＋）を得た。生成物をさらに精製することなく、そのまま次のステップに使用した。

【0181】

Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｂｎ）－ＯＡｌｌ（２，２２ｇ、５，４ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶かし、それ続いて１５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ ９５／２．５／２．５（体積／体積／体積）に溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで１時間１０分撹拌した。ＲＭを濃縮乾燥し、残留油を冷エーテルで沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧乾燥して、化合物１を白色固体として得た。生成物をさらに精製することなくそのまま使用した。
予想質量：２．３７ｇ
得られた質量：２．８３ｇ
収率：定量的、若干の不純物が存在
ｔ_Ｒ＝１．３８、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝３１２．２［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0182】

化合物２の合成

【化68】

【0183】

（２Ｓ，３Ｓ）－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（６６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＮＭＰに溶かし、それに続いて化合物１（２１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３７４μｌ、２ｍｍｏｌ）に溶かした。ＲＭを攪拌し、２６０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のＰｙＡＯＰを加えた。ＲＭを室温で２０分間攪拌し、次いで５０ｍｌの冷水に注ぎ、沈殿が現れるまで氷中に保った。沈殿物を濾過によって除去し、濾液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌ溶液で３に調整した。次いで、濾液をＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を１Ｍ ＨＣｌ溶液で３回、ブラインで１回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、エバポレーション乾燥させ、１００ｍｇの化合物２を透明な油として得た。生成物をさらに精製することなくそのまま使用した。
予想質量：２１２．５ｍｇ
得られた質量：１００ｍｇ
収率：４７％
ＨＰＬＣ 純度＝９５％、ｔ_Ｒ＝３．３３、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４２６．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、（予想ｍ／ｚ＝４２６．１６）

【0184】

化合物３の合成

【化69】

【0185】

Ｆｍｏｃ－Ａａｄ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（１ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＮＭＰに溶かし、それに続いて２－フェニルエタン－１－アミン（３１６μｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１７５ｍｌ、６．８３ｍｍｏｌ）に溶かした。ＲＭを攪拌し、ＰｙＡＯＰ（１．１８ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＭをＲＴで１５分間攪拌した。次いで、５０ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、水／ブライン５０／５０（体積／体積）混合物で１回、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液で３回、１Ｍ ＨＣｌ溶液で３回、ブラインで１回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮乾燥して、１．２４ｇの化合物３を透明な油として得た。化合物をさらに精製することなく使用した。
予想質量：１．２３５ｇ
得られた質量：１．２４ｇ
収率：定量的
ＨＰＬＣ 純度＝９５％、ｔ_Ｒ＝４．２８、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝５４３．３［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0186】

化合物４の合成

【化70】

【0187】

化合物３（５４２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＮＭＰに溶かし、続いてジエチルアミン（２０８μｌ、２ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ＲＭをＲＴで１時間撹拌した。次に、ＲＭを５０ｍｌの水に注ぎ、ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨ溶液で１１に調整した。次いで、水相をＥｔＯＡｃで３回抽出し、再び集めた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２_ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮乾燥させて、２９４ｍｇの化合物４を透明な油として得た。生成物をさらに精製することなく使用した。
予想質量：３２０ｍｇ
得られた質量：２９４ｍｇ
収率：９２％
ｔ_Ｒ＝２．２８、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝３２１．２［Ｍ＋Ｈ］＋

【0188】

中間体Ａの合成

【化71】

【0189】

化合物４のｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－５－アミノ－６－オキソ－６－（フェネチルアミノ）ヘキサノエート（１３１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）および化合物２のＨＯ－ＴＥＳ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－ＯＡｌｌ（１７４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶かし、続いてＤＩＥＡ（１３９μｌ、０．８２ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（１７３ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、抽出によって生成物を単離した。次いで、得られた白色粉末を０．２ｍｂａｒで一晩乾燥させて、２６０ｍｇの中間体Ａを白色固体として得た。
予想質量：２６０ｍｇ／得られた質量：３００ｍｇ／粗収率：８６％
ｔ_Ｒ＝２．１８、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝７２８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0190】

化合物５の合成

【化72】

【0191】

（＋，－）－ｔｒａｎｓ－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（２００ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、ＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を５ｍｌのＮＭＰに溶かし、続いてＨＣｌ．Ｈ－Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）－ＯｔＢｕ（５００ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）およびＤＩＥＡ（１．３４０ｍｌ、８ｍｍｏｌ）に溶かした。次いで、ＰｙＡＯＰ（７９２ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物（ＲＭ）を室温（ＲＴ）で８０分間攪拌した。次いで、ＲＭを１８０ｍｌの冷水に注いだ。得られた沈殿物を濾過によって除去した。次いで、濾液のｐＨを１Ｍ ＫＨＳＯ_４溶液で３に調整し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を再び集め、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮乾燥させて、４３３ｍｇの化合物５を透明な油として得た。
予想質量：６１８ｍｇ
得られた質量：４３３ｍｇ
収率：７０％
ｔ_Ｒ＝３．４、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４０８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0192】

ＬＶ－８０の合成

【化73】

【0193】

中間体Ａ（１００ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶かし、それに続いて１５ｍｌのＴＦＡ／ＴｉＳ／Ｈ_２Ｏに溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで３０分間撹拌した。ＲＭを濃縮乾燥し、残留油を冷ＥｔＯＥｔで沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧乾燥した。次に、沈殿物を１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶かし、Ｐｄ^０テトラキス（５．１５ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ）およびＰｈＳｉＨ_３（３７μｌ、０．３ｍｍｏｌ）で処理してアリルエステルを除去した。２０分後、ＲＭを２０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶かし、１Ｍ ＨＣｌ溶液で１回、ブラインで１回洗浄し、濃縮乾燥させた。次いで、得られた沈殿物を分取ＨＰＬＣで精製して、４１ｍｇのＬＶ－８０を白色固体として得た。
予想質量：９１ｍｇ／得られた質量：４１ｍｇ／粗収率：４５％
ｔ_Ｒ＝３．１０、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝６３２．４［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0194】

ＬＶ－８６の合成

【化74】

【0195】

中間体Ａ（１００ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶かした、続いて１５ｍｌのＴＦＡ／ＴｉＳ／Ｈ_２Ｏに溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで３０分撹拌した。ＲＭを濃縮乾燥し、残留油を冷Ｅｔ_２Ｏで沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧乾燥して、中間体Ｂを得た。

【0196】

中間体Ｂ（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をＮＭＰに溶かし、続いて炭酸セシウム（７．１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）およびヨードエタン（２．３４μｌ、０．０２９ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ＲＭをＲＴで１時間撹拌した。次に、ＲＭを３０ｍｌの水に注いだ。水相をＥｔＯＡｃで３回抽出した。再び集めた有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３で３回、ＫＨＳＯ_４ １Ｍで３回洗浄し、次いでブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾燥させ、１７ｍｇの白色固体を得た。次に、白色固体を１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶かし、Ｐｄ^０テトラキス（１ｍｇ、０．０００８７ｍｍｏｌ）、ＰｈＳｉＨ_３（３μｌ、０．０２４ｍｍｏｌ）で処理してアリルエステルを除去した。２０分後、ＲＭを２０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶かし、１Ｍ ＫＨＳＯ_４溶液で１回、ブラインで１回洗浄し、濃縮乾燥させた。次いで、得られた沈殿物を分取ＨＰＬＣで精製して、８．１ｍｇのＬＶ－８６を白色固体として得た。
予想質量：１５，８ｍｇ／得られた質量：８，１ｍｇ／粗収率：５１％
ｔ_Ｒ＝３．４９、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝６６０［Ｍ＋Ｈ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ ８．７０（ｓ， １Ｈ）， ８．６０（ｓ， １Ｈ）， ８．１８（ｔ， Ｊ ＝ ５．５， １Ｈ）， ７．４４（ｄ， Ｊ ＝ ７．５， ２Ｈ）， ７．３８（ｔ， Ｊ ＝ ７．４， ２Ｈ）， ７．３２（ｔ， Ｊ ＝ ７．３， １Ｈ）， ７．２７（ｔ， Ｊ ＝ ７．５， ２Ｈ）， ７．２１ － ７．１６（ｍ， ２Ｈ）， ７．１４（ｄ， Ｊ ＝ ８．３， ２Ｈ）， ６．９３（ｄ， Ｊ ＝ ８．２， ２Ｈ）， ５．０５（ｓ， ２Ｈ）， ４．３８（ｄ， Ｊ ＝ ４．６， １Ｈ）， ４．２３（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．６， ７．６， １Ｈ）， ４．０４（ｑ， Ｊ ＝ ７．１， ２Ｈ）， ３．５７（ｄ， Ｊ ＝ ５．１， ２Ｈ）， ３．２２（ｔｄ， Ｊ ＝ １３．０， ６．９， ２Ｈ）， ３．０２（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ４．４， １Ｈ）， ２．８４（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ９．４， １Ｈ）， ２．６９（ｔ， Ｊ ＝ ７．２， ２Ｈ）， ２．２４（ｔ， Ｊ ＝ ７．２， ２Ｈ）， １．５７（ｍ， Ｊ ＝ ６．７， １Ｈ）， １．５０（ｍ， １Ｈ）， １．４５（ｍ， Ｊ ＝ １６．４， ８．０， ３Ｈ）， １．１７（ｔ， Ｊ ＝ ７．１， ３Ｈ）
^１３ＣＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ １７２．６３， １７２．５０， １７０．６７， １６５．６５， １６５．４９， １５７．１１， １３９．３３， １３７．２０， １３０．２３， １２９．５７， １２８．７３， １２８．４６， １２８．３２， １２７．８５， １２７．７９， １２６．１５， １１４．５２， ６９．１５， ５９．８０， ５３．９５， ５２．５８， ５２．４６， ５２．３５， ５０．６３， ３５．７７， ３５．０４， ３３．０９， ３１．５２， ２０．８０， １４．１７

【0197】

ＬＶ－８７の合成

【化75】

【0198】

中間体Ｂ（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶かした。Ｎ－メチルモルホリン（３，８２μＬ、０．０３０ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。次いで、反応混合物を－１５℃に冷やし、５分間攪拌した。クロロギ酸イソブチル（１，９４μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を－１５℃で１０分間攪拌した。Ｏ－トリチルヒドロキシルアミン（８．２５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を加え、－１５℃で１５分間、室温で３０分間攪拌を続けた。その後、混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に注ぎ、１Ｍ ＫＳＨＯ_４、ＮａＨＣＯ_３の飽和溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮乾燥させて、１４ｍｇの中間体Ｃを白色粉末として得た。
予想質量：１４ｍｇ／得られた質量：１８ｍｇ／粗収率：定量的

【0199】

中間体Ｃ（１３．９２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＣＭに溶かし、続いて１０ｍｌのＴＦＡ／ＴｉＳ／Ｈ_２Ｏに溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで３０分撹拌した。ＲＭを濃縮乾燥し、残留油を冷ＥｔＯＥｔで沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧乾燥した。次に、沈殿物を０．５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶かし、Ｐｄ^０テトラキス（１ｍｇ、０．０００８７ｍｍｏｌ）、ＰｈＳｉＨ_３（２．２μｌ、０．０１７５ｍｍｏｌ）で処理してアリルエステルを除去した。２０分後、ＲＭを２０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶かし、１Ｍ ＨＣｌ溶液で１回、ブラインで１回洗浄し、濃縮乾燥させた。次いで、得られた沈殿物を分取ＨＰＬＣで精製して、２ｍｇのＬＶ－８７を白色固体として得た。
予想質量：１１ｍｇ／得られた質量：２ｍｇ／粗収率：１７％
ｔ_Ｒ＝２．９３、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝６４７．３［Ｍ＋Ｈ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ ８．８０（ｄ， Ｊ ＝ ８．０， １Ｈ）， ８．７０（ｓ， １Ｈ）， ８．６１（ｄ， Ｊ ＝ ８．１， １Ｈ）， ８．１７（ｔ， Ｊ ＝ ５．６， １Ｈ）， ７．４４（ｄ， Ｊ ＝ ７．２， ２）， ７．３８（ｄ， Ｊ ＝ １４．８， ２Ｈ）， ７．３２（ｔ， Ｊ ＝ ７．３， １Ｈ）， ７．２９ － ７．２６（ｍ， ２Ｈ）， ７．２０ － ７．１７（ｍ， ３Ｈ）， ７．１５（ｄ， Ｊ ＝ ８．６， ２Ｈ）， ６．９４（ｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２Ｈ）， ５．０６（ｓ， ２Ｈ）， ４．４４ － ４．３８（ｍ， １Ｈ）， ４．２６ － ４．１９（ｍ， １Ｈ）， ３．５８（ｓ， ２Ｈ）， ３．２６ － ３．２０（ｍ， ２Ｈ）， ３．０２（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ４．６， １Ｈ）， ２．８４（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．９， ９．４， １Ｈ）， ２．７２ － ２．６７（ｍ， ２Ｈ）， １．９０（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．０， ６．６， ２Ｈ）， １．６０ － １．５３（ｍ， １Ｈ）， １．４９ － １．４３（ｍ， ２Ｈ）， １．４２ － １．３７（ｍ， １Ｈ）
^１３ＣＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ １７２．５０， １６８．７５， １６５．７５， １６５．４５， １５７．１４， １３９．３２， １３７．１８， １３０．２０， １２８．７１， １２８．４５， １２８．３５， １２７．８４， １２７．７８， １２６．１５， １１４．４３， ６９．１４， ５３．８２， ５２．５３， ５２．３７， ４８．５０， ３５．０７， ３１．９８， ３１．７９， ３０．１４， ２１．６３

【0200】

ＬＶ－８１の合成

【化76】

【0201】

Ｈ－Ａａｄ（ｔＢｕ）Ｐｈｅ－配列を０．５ｍｍｏｌ／ｇのシスタミン－Ｔｒｔ樹脂（ＣＡ）上でＳＰＰＳを介して合成した。次に、ＲＴで一晩、ＰｙＡＯＰ（９５ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７７μｌ、０．４５０ｍｍｏｌ）の活性化を介して、アミド結合によって化合物ＨＯ－ＴＥＳ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－ＯＡｌｌ（９５ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）に固体支持配列を結合させた。２時間後、Ｐｄテトラキス（８．６６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）およびＰｈＳｉＨ_３を加え、ＯＡｌｌエステルの脱保護を導いた。ＴＦＡ／ＤＣＭ／Ｈ_２Ｏ／ＴｉＳ（５０／５０／２．５／２．５）による２時間の長時間処理によって、ＬＶ－８０チオール化バージョンを樹脂から切断した。次いで、濾液を濃縮乾燥させて褐色油を得、これを冷Ｅｔ_２Ｏで沈殿させて白色固体を得、濾過して単離した。次いで、化合物を分取ＨＰＬＣで精製して、３２ｍｇのＬＶ－８１を白色固体として得た。
予想質量：５５ｍｇ／得られた質量：３２ｍｇ／粗収率：５８％

【0202】

中間体Ｄの合成

【化77】

【0203】

ＨＣｌ．Ｈ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ（１００ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ）および（２Ｓ，３Ｓ）－ｔｒａｎｓ－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（８０．８ｍｇ、０．６１１ｍｍｏｌ）を１．５ｍＬのＮＭＰに溶かし、それに続いてＤＩＥＡ（１．６２８ｍｍｏｌ、３７４μＬ）を加えた。混合物を攪拌し、ＨＡＴＵ（３０９．５ｍｇ、０．８１４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２０分間攪拌した。反応混合物をＮａ_２ＣＯ_３ １Ｍ溶液に注ぎ、３０ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出した。水相ＫＨＳＯ４ １Ｍで酸性化し、結果として得られた溶液を３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。有機層をあわせ、ブラインで洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、中間体Ｄを黄色油として得た。生成物をさらに精製することなくそのまま使用した。
予想質量：１３１ｍｇ／得られた質量：１０４ｍｇ／収率：７９，３％
ＨＰＬＣ 純度＝９８％、ｔ_Ｒ＝１．２分、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝３２４．３［Ｍ＋Ｈ］＋、（予想ｍ／ｚ＝３２４．３１）

【0204】

ＬＶ－１１１の合成

【化78】

【0205】

Ｃｓ_２ＣＯ_３（３１４ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦに溶かした中間体Ｄ（１０４ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ）に加え、反応物を１５分間攪拌した。ヨードエタン（７７．６μＬ、０，９６６ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応物を室温で一晩攪拌し、ＨＰＬＣでモニターした。溶液を３０ｍＬの水に注ぎ、３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、次いでＮａＨＣＯ_３ １Ｍの溶液で３回、ＫＨＳＯ_４ １Ｍの溶液で３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、所望の生成物を白色結晶として得た。次いで、生成物を分取クロマトグラフィーで精製して、５１．５ｍｇのＬＶ－１１１を白色固体として得た。
予想質量：１２１．６６ｍｇ／得られた質量：５１．５ｍｇ／収率：４２％
ＨＰＬＣ 純度＝９８％、ｔ_Ｒ＝２．１分、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝３８０．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、（予想ｍ／ｚ＝３８０．１６）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ ８．７８（ｄ， Ｊ ＝ ７．９， １Ｈ）， ７．０７（ｄ， Ｊ ＝ ８．３， ２Ｈ）， ６．７８（ｄ， Ｊ ＝ ８．２， ２Ｈ）， ４．４２（ｄｄ， Ｊ ＝ １４．２， ８．４， １Ｈ）， ４．１７ － ３．８９（ｍ， ６Ｈ）， ３．６１（ｓ， １Ｈ）， ３．４０（ｓ， １Ｈ）， ２．９３（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ５．７， １Ｈ）， ２．８３（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．７， ９．２， １Ｈ）， １．２９ － １．０５（ｍ， ９Ｈ）
^１３ＣＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ １７１．４０，１６７．４３， １６５．４９， １５７．８１， １３０．６６， １２８．９０， １１４．６０， ６３．３２， ６２．０６， ６１．２４， ５４．２０， ５３．０６， ５１．６９， ３６．１７， １５．１４， １４．３４
ＨＲＭＳ（ｍｉｃｒＯＴＯＦ－Ｑ）：Ｃ_１９Ｈ_２５ＮＯ_７［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値：３８０．１６３１、実測値：３８０．１７０４

【0206】

ＬＶ－１０１の合成

【化79】

【0207】

ＨＣｌ．Ｈ－Ｔｙｒ－ＯＥｔ（１００ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ）および（２Ｓ，３Ｓ）－ｔｒａｎｓ－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（２７ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）を１．５ｍＬのＮＭＰに溶かし、それに続いてＤＩＥＡ（１．６２８ｍｍｏｌ、３７４μＬ）に溶かした。混合物を５分間攪拌し、ＨＡＴＵ（１５４．７ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２０分間攪拌した。溶液を酢酸エチルで３回抽出した。有機層をＫＨＳＯ_４ １ＭおよびＮａＨＣＯ_３ １Ｍで３回、次いでブラインで１回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、所望の生成物を白色粉末として得た。
ＨＰＬＣ 純度＝９８％、ｔ_Ｒ＝１．４２分、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝５１５．２０［Ｍ＋Ｈ］^＋、（予想ｍ／ｚ＝５１５．２０）

【0208】

ＬＶ－１０４の合成

【化80】

【0209】

Ｃｓ_２ＣＯ_３（１２６．８ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦに溶かしたＬＶ－１０１（１００ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）に加え、反応物を１５分間攪拌した。ヨードエタン（４７．０μＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応物を室温で一晩攪拌し、ＨＰＬＣでモニターした。溶液を３０ｍＬの水に注ぎ、３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、次いでＮａＨＣＯ_３ １Ｍの溶液で３回、ＫＨＳＯ_４ １Ｍの溶液で３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、所望の生成物を白色粉末として得た。次いで、生成物を分取クロマトグラフィーで精製して、７５．６ｍｇのＬＶ－１０４を白色粉末として得た。
予想質量：１１１．１５ｍｇ／得られた質量：７５．６ｍｇ／収率：６８％
ＨＰＬＣ 純度＝９９％、ｔ_Ｒ＝３．８１分、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝５７１．３［Ｍ＋Ｈ］^＋、（予想ｍ／ｚ＝５７１．２６）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ ８．８７（ｄ， Ｊ ＝ ７．７， ２Ｈ）， ７．０７（ｄ， Ｊ ＝ ８．２， ４Ｈ）， ６．７８（ｄ， Ｊ ＝ ８．１， ４Ｈ）， ４．３８（ｄｄ， Ｊ ＝ １４．２， ８．３， ２Ｈ）， ４．０２（ｑ， Ｊ ＝ ７．１， ４Ｈ）， ３．９３（ｑ， Ｊ ＝ ６．９， ４Ｈ）， ３．４５（ｓ， ２Ｈ）， ２．９２（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ５．７， ２Ｈ）， ２．８２（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ９．２， ２Ｈ）， １．２５（ｔ， Ｊ ＝ ６．９， ６Ｈ）， １．０８（ｔ， Ｊ ＝ ７．１， ６Ｈ）
^１３ＣＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）δ １７０．９７， １６５．５０， １５７．２９， １３０．２５， １２８．３６， １１４．１４， ６２．７０， ６０．６２， ５３．７９， ５２．１７， ３５．５１， １４．６２， １３．９１
ＨＲＭＳ（ｍｉｃｒＯＴＯＦ－Ｑ）：Ｃ_３０Ｈ_３８Ｎ_２Ｏ_９［Ｍ＋Ｈ］＋の理論値：５７１．６３９０、実測値：５７１．２６５０

【0210】

中間体Ｅの合成
カルボニルジイミダゾールＣＤＩ（１１３．６ｍｇ；１．２当量）を最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭを－１０℃に置いた。Ｂｏｃ－ＮＨ－ＮＨ_２（９２．５ｍｇ；１．２当量）も最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭに加え、次いで－１０℃で３０分間攪拌した。この後、ＴＦＡ．ＨＴｙｒ（ＯＥｔ）ＯＥｔ（２０３．６ｍｇ；１当量）も最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭに加え、それに続いてＥｔ_３Ｎ（１６８μＬ）を加えた。次いで、ＲＭを室温で２時間５０分撹拌した。ワークアップのステップでは、蒸留水およびＡｃＯＥｔをＲＭに加え、分液漏斗に入れた。次いで、有機相を、ＨＣｌ １Ｍ（×２）、飽和ＮａＨＣＯ_３（×２）およびブライン（×２）で洗浄した。次いで、得られた溶液をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、油（１５４．３ｍｇ；収量：５６％）を得た。この得られた油をＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（９５／２．５／２．５）溶液に溶かし、室温で３０分間撹拌し、次いで濃縮乾燥させて、中間体Ｅを粗油として得た。化合物をさらに精製することなく使用した。

【0211】

ＬＶ－１１９の合成

【化81】

【0212】

ＣＤＩ（６３．３ｍｇ；１．２当量）を最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭを－１０℃に置いた。中間体Ｅ（１５９．７ｍｇ；１．２当量）も最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭに加え、次いで－１０℃で３０分間攪拌した。数滴のＥｔ_３ＮでｐＨを８に調整した。この後、ＴＦＡ．ＨＴｙｒ（ＯＥｔ）ＯＥｔ（１１５．９ｍｇ；１当量）も最小限のＤＭＦに溶かし、ＲＭに加え、それに続いてＥｔ_３Ｎ（１０２．２μＬ；２．２当量）を加えた。次いで、ＲＭを室温で３時間撹拌した。ワークアップのステップでは、蒸留水およびＡｃＯＥｔをＲＭに加え、分液漏斗に入れた。次いで、有機相を、ＨＣｌ １Ｍ（×２）、飽和ＮａＨＣＯ_３（×２）およびブライン（×２）で洗浄した。次いで、得られた溶液をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、油を得た。

【0213】

次いで、その未精製の生成物をＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥して、非常に明るい白色結晶（４３．９ｍｇ；収量：２４％；純度：＞９６％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ６．９９（ｄ，Ｊ ＝ ８．５， ４Ｈ）， ６．７５（ｄ，Ｊ ＝ ８．６， ４Ｈ）， ６．５０（ｓ， ２Ｈ）， ６．０５（ｄ，Ｊ ＝ ８．１， ２Ｈ）， ４．６０（ｄｄ，Ｊ ＝ １４．３， ６．６， ２Ｈ）， ４．１６ － ４．０４（ｍ， ４Ｈ）， ３．９２（ｑ，Ｊ ＝ ７．０， ４Ｈ）， ３．０３ － ２．８９（ｍ， ４Ｈ）， １．３８ － １．２８（ｍ， ６Ｈ）， １．１８（ｔ，Ｊ ＝ ７．１， ６Ｈ）

【0214】

中間体Ｆの合成

【化82】

【0215】

Ｂｏｃ－５－Ａｖａ－ＯＨ（１ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶かし、ＥｔＯＨ（１．３ｍｌ、２３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ＤＭＡＰ（５６．４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（６０５μｌ、５．５ｍｍｏｌ）、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（６５３．７ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｉ（１．１ｇ、５．９８ｍｍｏｌ）をこの順で加えた。ＲＭをＲＴで２時間０５分攪拌した。ＡｃＯＥｔ抽出を３回行った。次いで、有機層を、ＮＡＨＣＯ_３（飽和）、ＫＨＳＯ_４（１Ｍ）、およびブラインで各３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させた。
予想質量：１．１３ｇ；得られた質量：９６６．３ｍｇ；収率：８６％

【0216】

中間体Ｇの合成

【化83】

【0217】

中間体Ｆ（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７００μｌ）に溶かし、続いてＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ ９５／２．５／２．５（体積／体積／体積）（６６３μｌ）に溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで１時間撹拌し、濃縮乾燥させた。予想質量：１０６．２ｍｇ；得られた質量：２８６．０２ｍｇ；粗収率：２６９％

【0218】

ＩＢＭＴ２３の合成

【化84】

【0219】

中間体Ｇ（１０６．２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）およびＩＢＭＴ７（４９．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（９１１μｌ）に溶かした。次いで、ＤＭＡＰ（１．２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（１２７．６μｌ、１．１６ｍｍｏｌ）、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（１９．９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｉ（３４．５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）をこの順で加えた。ＲＭをＲＴで一晩攪拌した。ＡｃＯＥｔ抽出を３回行った。次いで、有機層を、ＮＡＨＣＯ_３（飽和）、ＫＨＳＯ_４（１Ｍ）、およびブラインで各３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させて、４７．０３ｍｇの所望の生成物を得た。粗生成物を逆相分取ＨＰＬＣで精製した。
予想質量：６６．９ｍｇ；得られた質量：３３．４ｍｇ；収率：５０％；純度：１００％（ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４７９．０［Ｍ＋Ｈ］^＋；時間＝３．１２分）（予想ｍ／ｚ＝４７９．５５）

【0220】

中間体Ｈの合成

【化85】

【0221】

Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＮＨ_２）－ＯＨ（１００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（６９１μｌ）に溶かし、ＤＢＵ（５４μｌ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。ヨードエタン（２９μｌ、０．３６ｍｍｏｌ）を予め０℃にしておき、次いで反応混合物を滴下した。ＲＴで３０分間撹拌した後、Ｈ_２ＯおよびＡｃＯＥｔを加え、次いで分液漏斗に注いだ。ＡｃＯＥｔ抽出を３回行い、次いで、有機層をＫＨＳＯ_４（１Ｍ）およびブラインで各３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させた。
予想質量：１１０．９ｍｇ；得られた質量：６７．５ｍｇ；粗収率：６１％

【0222】

中間体Ｉの合成

【化86】

【0223】

中間体Ｈ（４７．９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１３９μｌ）に溶かし、ピリジン（７８μｌ、０．９６ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、Ｍｓ－Ｃｌ（３７μｌ、０．４８ｍｍｏｌ）を加え、ＲＭをＲＴで１時間攪拌した。Ｈ_２ＯおよびＡｃＯＥｔを加え、次いで分液漏斗に注いだ。ＡｃＯＥｔ抽出を３回行った。次いで、有機層をＮＡＨＣＯ_３（飽和）、ＫＨＳＯ_４（１Ｍ）、およびブラインで各３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させた。
予想質量：６１．８ｍｇ；得られた質量：１９．８ｍｇ；粗収率：３２％

【0224】

中間体Ｊの合成

【化87】

【0225】

中間体Ｉ（１９．８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００μｌ）に溶かし、続いてＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ ９５／２．５／２．５（体積／体積／体積）（１２２μｌ）。次いで、ＲＭをＲＴで１時間撹拌し、濃縮乾燥させた。
予想質量：２０ｍｇ；得られた質量：２４．４ｍｇ；粗収率：１２２％

【0226】

ＩＢＭＴ３５の合成

【化88】

【0227】

中間体Ｊ（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２４０μｌ）に溶かし、それに続いて（２Ｓ，３Ｓ）－ｔｒａｎｓ－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（６．６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６１．２μｌ、０．３５ｍｍｏｌ）に溶かした。ＲＭを攪拌し、ＨＡＴＵ（１９．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＭを室温で３時間攪拌した。次いで、ＲＭをＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を、ＨＣｌ（１Ｍ）で３回、ブラインで１回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾燥させて、１と２の１８ｍｇ混合物を得た。粗生成物を逆相分取ＨＰＬＣで精製した。
（ＩＢＭＴ３５）予想質量：１６．７ｍｇ；得られた質量：３．２ｍｇ；収率：１９％；純度：９８％（ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝６６９．０［Ｍ＋Ｈ］^＋；時間＝２．６４分）（予想ｍ／ｚ＝６６８．７）

【0228】

中間体Ｋの合成

【化89】

【0229】

Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＮＨ_２）－ＯＨ（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）をＮａＯＨ（１Ｍ）の溶液に懸濁し、ＲＭを０℃に置いた。次いでＴｓ－Ｃｌを加え、ＲＭを０℃で２時間攪拌した。ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨ２～３になるまで酸性化を行い、ＲＭをＡｃＯＥｔで３回抽出した。次いで、有機層を、ＫＨＳＯ_４（１Ｍ）で３回、ブラインで２回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させた。
予想質量：７８．１ｍｇ；得られた質量：７６．９ｍｇ；収率：９８％

【0230】

中間体Ｌの合成

【化90】

【0231】

中間体Ｋ（７８．１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．２ｍｌ）に溶かし、ＥｔＯＨ（６２．６μｌ、１．０８ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ＤＭＡＰ（２．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（２４．２μｌ、０．２２ｍｍｏｌ）、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（２５．６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｉ（４４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をこの順で加えた。ＲＭをＲＴで４０分間攪拌した。ＡｃＯＥｔ抽出を３回行った。次いで、有機層を、ＮＡＨＣＯ_３（飽和）、ＫＨＳＯ_４（１Ｍ）、およびブラインで各３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾燥させた。
予想質量：８３．３ｍｇ；得られた質量：６９．４ｍｇ；収率：８３％

【0232】

中間体Ｍの合成

【化91】

【0233】

中間体Ｌ（６９．４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４００μｌ）に溶かし、続いてＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ ９５／２．５／２．５（体積／体積／体積）（３６５μｌ）に溶かした。次いで、ＲＭをＲＴで１時間撹拌し、濃縮乾燥させ、ジエチルエーテル中で沈殿させた。
予想質量：７１．５ｍｇ；得られた質量：６９．８ｍｇ；粗収率：９８％

【0234】

ＩＢＭＴ３８の合成

【化92】

【0235】

中間体Ｍ（６９．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３８５μｌ）に溶かし、続いて（２Ｓ，３Ｓ）－ｔｒａｎｓ－オキシラン－２，３－ジカルボン酸（１３．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６３．８μｌ、０．３８ｍｍｏｌ）に溶かした。ＲＭを攪拌し、ＨＡＴＵ（５７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＭを室温で２時間２０分攪拌した。次いで、ＲＭをそのまま、逆相分取ＨＰＬＣで精製した。
（ＩＢＭＴ３８）予想質量：６１．５ｍｇ；得られた質量：８．３ｍｇ；収率：１３％；純度：９１％（ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝８２１．０［Ｍ＋Ｈ］^＋；時間＝３．６４分）（予想ｍ／ｚ＝８２０．９）

【0236】

１．２．２）本発明による式（Ｉ’）の複合体の合成
ＬＶ－８２の合成

【化93】

【0237】

化合物８１（７．３５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を８００μｌのＤＭＦに溶かし、続いてビオチン－マレイミド（４．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）および４００μｌのＰＢＳ溶液を加えた。両方の試薬を溶かすために、混合物を軽く熱し、次いでＲＴで１時間撹拌した。次いで、ＲＭを分取ＨＰＬＣで直接精製して、７ｍｇのＬＶ－８２を白色固体として得た。
予想質量：１１．８５ｍｇ／得られた質量：７ｍｇ／収率：５９％
ｔ_Ｒ＝２．８９、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝１１８６．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、５９３．７［Ｍ＋２Ｈ］^２＋

【0238】

１．２．３）比較例ＬＶ－４３の合成

【化94】

【0239】

Ｆｍｏｃ－Ａａｄ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（８８ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を、標準的なＳＰＰＳ ＨＡＴＵ（８２ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡ（５０μｌ、０．２８８ｍｍｏｌ）活性化を介して結合させた。ＲＭを、固相合成反応器に０．３７ｍｍｏｌ／ｇで入れた２００ｍｇのｒｉｎｋアミド（ＲＡ）樹脂と２時間攪拌した。標準的な洗浄後、１０分間のＤＭＦ／Ｐｉｐ ８０／２０（体積／体積）処理を２回行い、Ｆｍｏｃ保護を除去した。次のステップとして、化合物５（８８ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を、ＰｙＡＯＰ（１１３ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５４５μｌ、０．６３ｍｍｏｌ）の活性化を介して遊離アミンに結合させた。一晩反応させた後、樹脂をＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回洗浄し、阻害剤を２０ｍｌのＴＦＡ処理で５０分間切断した。次いで、ＴＦＡ濾液を含有する生成物を蒸発乾燥させ、ペプチドをＥｔＯＥｔで沈殿させ、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥して、１０．７ｍｇのＬＶ－４３を白色固体として得た。
予想質量：３１．４ｍｇ
得られた質量：１０．７ｍｇ
収率：３４％
ＨＰＬＣ 純度＝１００％、ｔＲ＝０．８４、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ＝４３８，２０［Ｍ＋Ｈ］^＋（予想ｍ／ｚ＝４３８．１５）

【0240】

２）生物学的結果
２．１）実験モデル
細胞培養
ヒトＣＨＬ－１細胞（メラノーマ由来細胞株、Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456）を１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含有するＤＭＥＭ中でよく使われる方法で培養し、３７℃でインキュベートした。試験の前に、ＣＨＬ－１細胞を適切なプレート（９６、４８、２４、１２または６ウェル）に３０％のコンフルエンシーで播種した。翌日、細胞を処理し、更なる分析のために採取した（免疫ブロッティング、ｑＰＣＲ、免疫蛍光）のために集めた。

【0241】

皮質細胞培養は、ガラスカバースリップまたは０．１ｍｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－リジン（シグマ）をコートしたプラスチックプレート上に、～１０^５細胞／ｃｍ^２、または低密度培養の場合は２×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。ニューロンを、１０％（体積／体積）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含有するＤＭＥＭ中に播き、１～２時間後に、培地を、２％Ｂ２７、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、０．６％グルコースおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（すべてライフテクノロジーズ製の試薬）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に交換した。

【0242】

ドロソフィラ・メラノガステル（Drosophila Melanogaster）
ドロソフィラを２５℃で飼育した。ｙｗハエを対照として用いた（ｙｗはαＴｕｂ８４ＢΔ３変異体である）。全雄をｌａｅｍｌｉローディングバッファーで破壊し、煮沸し、超音波処理し、免疫ブロッティングに載せた。

【0243】

２．２）方法の詳細
タンパク質の発現と精製
国際公開第２０２０／０１２００２号に開示の方法を用いた。
ポリヒスチジンタグをもつ発現ベクターにヒトＶＡＳＨ１（ｈＶＡＳＨ１）をクローニングした。細菌を形質転換し、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で一晩または４時間誘導した。細菌を集め、ＨＴＵ－ＤＩＧＩ－Ｆプレス（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）を用いて破砕した。組み換えタンパク質は、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて、製造元のプロトコール（ＧＥヘルスケア）に従って精製した。

【0244】

インビトロ脱チロシン化アッセイ
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ９細胞を培養し、溶解し、アフィニティークロマトグラフィーによるチューブリン精製に使用した。タキソールを用いて微小管を得て、使用するまで保存した。組み換えｈＶＡＳＨ１を用いて脱チロシン化活性のインビトロ解析を行った。０．５μＭの微小管の存在下で脱チロシン分析を行った。反応を、変性ローディングバッファーの添加およびそれに続く９５℃での５分間のインキュベーションによって止め、試料を免疫ブロット分析のためにＳＤＳ ＰＡＧＥに載せた。

【0245】

標準化されたインビトロ脱チロシン化ＥＬＩＳＡベースアッセイ
国際公開第２０２０／０１２００２号に開示の方法に従って、９６ウェルフォーマットの標準化された一次ＥＬＩＳＡベースインビトロ脱チロシン化アッセイが開発されている。簡単に説明すると、ＶＡＳＨ酵素の基質を作製し、各ウェルに１００μＬの酵素混合物（酵素と阻害剤）を加え、プレートを３７℃で５分間インキュベートする。一次（ウサギ抗脱チロシン化チューブリン）を１時間インキュベートし、洗浄後、二次（抗ウサギ）抗体を各ウェルに加える。プレートを室温で１時間インキュベートする。顕色は、各ウェルにＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を加え、室温で３０分間インキュベートすることからなる。０．５Ｍ硫酸の添加によって発色を止める。４５０ｎｍでＯＤを測定する。

【0246】

脱グルタミル化アッセイおよびチューブリン精製
脱グルタミル化アッセイを既報（Rogowski et al. , Cell, 2010, 143(4):564-78）のとおりに行った。

【0247】

ヒト細胞のトランスフェクション
プラスミドトランスフェクションを行い、トランスフェクションの２４時間後に細胞を集め、免疫ブロッティングおよび免疫蛍光分析を行った。

【0248】

定量的ＰＣＲ
トータルＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）で単離した。逆転写はランダムなヘキサヌクレオチドを用いて実施した。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ装置（ロシュ）でＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ混合物を用いて定量的ＰＣＲアッセイを実施した。使用したプライマーはすべてイントロン貫通型であった。複数の内部対照遺伝子の幾何平均することによる正規化によって標的ｃＤＮＡの相対量を得た。

【0249】

免疫蛍光標識
メタノールで固定したＣＨＬ－１細胞およびマウス皮質ニューロンを、標準的な免疫蛍光実験の後に、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ａｐｏｔｏｍｅ顕微鏡を用いて分析した。簡単に説明すると、試料を一次抗体と一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、次の二次抗体と１時間インキュベートした：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ラット、ヤギ抗マウスおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５結合ヤギ抗ウサギ（インビトロジェン）。インキュベートした後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、マウントした。

【0250】

顕微鏡法
Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ ＲＩＯ Ｉｍａｇｉｎｇ施設で顕微鏡画像の取得を行い、ＯＭＥＲＯを用いて画像を処理した。

【0251】

ＬＣ－ＭＳによるヒト細胞における化合物の浸透および変換のバイオアナリシス
血清中のペプチドの安定性 ヒト血清反応試料は、２５０μｌの熱不活性化ヒト血清（シグマアルドリッチ）および７５０μＬのＲＰＭＩ培地１６４０（シグマアルドリッチ）を含有した。５０μＬの化合物（ＤＭＳＯ中のｍＭストック溶液中）を加えることよって反応を開始した。測定は３７℃の振盪ウォーターバスで行った。１００μｌの試料を既知の時間間隔で採取し、２００μｌのアセトニトリル１‰ＴＦＡに加え、血清タンパク質を沈殿させた。濁った試料を４℃に１５分間冷却し、次いで１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿した血清タンパク質をペレットにした。１５０μｌの透明な上清を採取し、最後にペプチドをＲＰＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳで分析した。

【0252】

２．３）結果
２．３．１ インセルロＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化アッセイ
チューブリン脱チロシン化がＶＡＳＨのみによって触媒されるヒトＣＨＬ－１細胞を使用した。これらの細胞では、脱チロシン化は主にＶＡＳＨ依存性である（Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456）。細胞をタキソールで前処理した後、Ｅｐｏ－Ｙとインキュベートした。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。

【0253】

ＣＨＬ－１細胞を用いて、タキソール誘導脱チロシン化を減少させるためのＥｐｏ－Ｙの使用を分析した。細胞を、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で標準的な加湿組織培養インキュベーター内でよく使われる方法で培養し、６ウェル培養皿に播いた。細胞をＥｐｏ－Ｙの非存在下または存在下においてタキソールで２時間処理した。

【0254】

ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％（体積／体積）ＮＰ－４０、０．５％（重量／体積）デオキシコール酸ナトリウム、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で細胞を集め、ＢＣＡキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて総タンパク質の定量を行った。全細胞抽出物の２０μｇタンパク質試料を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移し、各抗体でプローブした。ウェスタンブロット分析から、ＣＨＬ－１細胞におけるタキソール処理（２時間）の顕著な減少とそれに伴うチューブリン脱チロシン化が示された。図１に示されるように、ＣＨＬ－１細胞をタキソールとインキュベートすると、チューブリン脱チロシン化およびアセチル化レベルが顕著に増加したが、それはおそらくＭＴ安定化によるものである可能性が高い。さらに、チューブリン脱チロシン活性は、既報のＶＡＳＨ阻害剤であるＥｐｏ－Ｙによって用量依存的に阻害された。

【0255】

よって、ＣＨＬ－１細胞およびタキソールを用いたこのインセルロスクリーニングアッセイは、ＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化の推定阻害剤を特定するための適切なスクリーニングアッセイである。

【0256】

２．３．２ 推定阻害剤パルテノリドはＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化を阻害しない
ＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化に対するパルテノリド（ＰＴＬ）の阻害効果を検討するために、国際公開第２０２０／０１２００２号に開示の、以前に開発されたインビトロ脱チロシン化アッセイを用いた。反応物を阻害剤とインキュベートし、停止し、表示の抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。図２に示されるように、ＭＴが入った反応混合物に１０μＭのＥｐｏ－Ｙを加えると、ＶＡＳＨ１媒介チューブリン脱チロシン化が完全に阻害された（図２Ｂ）。逆に、同じアッセイにおいて、はるかに高いＰＴＬ濃度（５０および１００μＭ）を加えても、ＶＡＳＨ１－依存性チューブリン脱チロシン化の検出可能な阻害はまったく生じなかった（図２Ｂ）。解析をさらに拡張するために、チューブリン脱チロシン化がＶＡＳＨによってのみ触媒されるヒトＣＨＬ－１細胞（Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456）を使用した。これらの細胞では、脱チロシン化は主にＶＡＳＨ依存性である（Nieuwenhuis J. et al. Science, 2017, 358(6369):1453-1456）。細胞をタキソールで前処理した後、Ｅｐｏ－ＹまたはＰＴＬとインキュベートした。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。ＣＨＬ－１細胞をタキソールとインキュベートすると、チューブリン脱チロシン化およびアセチル化レベルが顕著に増加したが、それはおそらくＭＴ安定化によるものである可能性が高い（図２Ｃ）。これにより、タキソールとインキュベートした細胞でのＥｐｏ－ＹおよびＰＴＬ阻害効力を直接比較することが可能であった。予想どおり、Ｅｐｏ－Ｙはチューブリンアセチル化に影響することなく、用量依存的にチューブリン脱チロシン化を減少させた。インビトロデータ（図２Ｂ）と一致して、チューブリン脱チロシン化は、使用した最高濃度でもＰＴＬによって阻害されなかった（図２Ｃ）。ＰＴＬはＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化の阻害剤ではないと結論付けた。

【0257】

２．３．３ 新たに開発された阻害剤は、ＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２およびプチダーゼ活性を標的とする
図３は、０．２５～０５μＭの範囲の濃度でのＶＡＳＨ１とＶＡＳＨ２を介したチューブリン脱チロシン化の両方に対する、新たに設計された様々なＶＡＳＨ阻害剤の阻害効率の例を示す。

【0258】

２．３．４ 細胞浸透性の強力なＶＡＳＨペプチダーゼ活性阻害剤
Ｅｐｏ－Ｙなどの小さくて反応性の高いエポキシドベースの分子は、ＶＡＳＨ以外のタンパク質に存在する遊離チオールまたはチロシンキナーゼの活性部位にある求核性リシン残基と相互作用する可能性がある。したがって、反復的化学的変化（iterative chemical variations）および標準化されたインビトロアッセイによる分析を通して、化合物を特定し、ＬＶ－４３と名付けた（図４Ａ）。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。図示されているように、ＬＶ－４３はＥｐｏ－Ｙよりも強力なＶＡＳＨ１酵素活性のインビトロ阻害を有する（図４Ｂ）。しかし、タキソール処理ＣＨＬ－１細胞を含む細胞ベースのアッセイで試験したところ、ＬＶ－４３はＥｐｏ－Ｙよりもはるかに効率が悪かった（図４Ｃ）。インビトロとインセルロのデータ間の不一致は、Ｅｐｏ－Ｙと比較してＬＶ－４３の細胞浸透が少ないことを示唆する。したがって、新しい一連の化合物を生成し、細胞透過性および酵素親和性が向上するように疎水性芳香族官能基を付加した。インビトロアッセイにおいて、表示の阻害剤を反応混合物に加え、次いで表示の抗体を用いた免疫ブロッティングにより脱チロシン化を分析した。そのインビトロＩＣ５０（ＬＶ８０の２８ｎＭ対Ｅｐｏ－Ｙの３２０ｎＭ）によって示されるように、ＬＶ－８０は、ＶＡＳＨ１媒介チューブリン脱チロシン化を、ＬＶ－４３やＥｐｏ－Ｙよりも強力に阻害することがわかった（図４Ｄ～Ｅ）。ＣＨＬ－１細胞におけるタキソール誘導脱チロシン化アッセイを用いたインセルロＩＣ５０の測定により、細胞内においてもＥｐｏ－ＹよりもＬＶ－８０の効力が大きいことが確認された（ＬＶ－８０の６７６ｎＭ対Ｅｐｏ－Ｙの３μＭ）（図４Ｆ）。最後に、ＶＡＳＨ１の利用可能な構造データを用いて、分子ドッキングを行って、水素結合の形成を考慮してＬＶ－８０阻害剤の最も可能性の高い結合様式を可視化した（図４Ｈ）。まとめると、チューブリン脱チロシン化の機能解析に適した、低ナノモル範囲のインビトロＩＣ５０をもつ特異的細胞浸透性ＶＡＳＨ阻害剤を設計し、生成した。

【0259】

２．３．５ 細胞におけるＶＡＳＨ媒介チューブリン脱チロシン化の完全な阻害
内因性脱チロシン化活性に対するＬＶ－８０の効力を試験するために、ＬＶ－８０とインキュベートした野生型ＣＨＬ－１細胞を、ＶＡＳＨ１とＶＡＳＨ２の両方を欠くダブルノックアウトＣＨＬ－１細胞（２ＫＯｓ）と比較した。細胞を集め、表示の抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。ＬＶ－８０と２４時間インキュベーションした後、ウェスタンブロット分析で示されるように、脱チロシン化のレベルは処理したＣＨＬ－１およびＣＨＬ－１ ２ＫＯｓ細胞で同等であった（図５）。これにより、インセルロＶＡＳＨ媒介脱チロシン化を完全に阻害するために新たに設計された化合物の有効性が示された。さらに、ビヒクルＬＶ－８０とインキュベートした細胞における免疫蛍光によってチューブリン脱チロシン化を分析した。阻害剤で処理した細胞では、脱チロシン化チューブリンのシグナルがないことが確認された（データは示されていない）。

【0260】

２．３．６ ＶＡＳＨ酵素阻害剤の有利な安全性プロファイル
次に、ＬＶ－８０存在下での潜在的な代謝毒性および細胞生存率の変化を評価するために、広く使用されているＭＴＴベースの比色アッセイを選択した。ＭＴＴベースアッセイ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を、表示の化合物とのインキュベーションの４８時間後に行って、細胞生存率をモニターした。

【0261】

０．１μＭタキソールおよび１０μＭ ＰＴＬと２４時間培養すると、結果として細胞生存率は有意に低下した。逆に、はるかに高い濃度のＬＶ－８０（１００μＭ）で培養しても、細胞生存率に有意な影響はなく、ビヒクルと培養した細胞の細胞生存率と同様であった（図６Ａ）。広く認められ、よく受け入れられているアッセイを用いてミトコンドリア機能を分析したところ、ＬＶ－８０とインキュベートした細胞において酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の有意な変化はまったくみられず、この化合物の優れた安全性プロファイルが強調された（図６Ｂ）。

【0262】

２．３．７ 新たに開発されたＶＡＳＨ阻害剤はＶＡＳＨ酵素活性に特異的である
次に、チューブリンＣ末端尾部を標的とし、チューブリン脱グルタミラーゼとして作用するプロテアーゼの別のファミリーであるサイトゾルカルボキシペプチダーゼ（ＣＣＰ）に対するＬＶ－８０阻害活性を試験した。この阻害剤はＣＣＰ１およびＣＣＰ５活性に影響しなかった。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。ＧＦＰ－ＣＣＰ１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に由来するタンパク質溶解物の存在下で、ポリグルタミル化脳チューブリンをインキュベートすると、長いグルタミン酸鎖に対するＣＣＰ１依存性脱グルタミル化活性は、ＬＶ－８０の添加によって影響されないことが観察された（図７Ａ）。同様の結果は、このアッセイを用いてグルタミン酸残基のＣＣＰ５媒介脱グルタミル化を評価したときにも認められた（図７Ｂ）。全体として、これらの観察結果は、脱チロシン化ＶＡＳＨ活性に対するＬＶ－８０特異性を示した。次いで、ＭＴおよびチューブリンのインビトロ脱チロシン化に広く使用される酵素であるカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）の活性に対するその効果を試験することによってＬＶ－８０の特異性を分析した。ＶＡＳＨ特異的阻害剤はカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）依存性チューブリン脱チロシン化に影響しなかった。一方、特異的ＣＰＡ阻害剤はＶＡＳＨ活性に影響しなかった。実際、１０μＭのＬＶ－８０を加えると、結果として、インビトロでＶＡＳＨ１とＶＡＳＨ２を介した脱チロシン化の両方が完全に消失したが、ＣＰＡ活性には検出可能な影響はなかった（図７Ｃ）。逆に、ペプチドミメティックベンジルコハク酸（ＢｚｌＳＡ）は、ＣＰＡ依存性脱チロシン化を完全に消失させたが、ＶＡＳＨ１またはＶＡＳＨ２を介した脱チロシン化ではそうではなかった。

【0263】

２．３．８ 研究ツールとしての、新たに開発された阻害剤のビオチン化バージョン
脱チロシン化レベルは特に脳で高いので、ビオチンに融合したＬＶ－８０を使用してヒト脳抽出物からＶＡＳＨ１をプルダウンできるかどうかを試験した。細胞をタキソールで前処理した後、ビオチン化ＬＶ－８０とインキュベートした。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。まず、ビオチン化ＬＶ－８０がインビトロでＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２媒介脱チロシン化に対する阻害特性を保持していることを確認し（図８Ａ）、野生型および２ＫＯｓ ＣＨＬ－１を対照として用いるプルダウン方法論を検証した（図８Ｂ）。野生型および二重ＶＡＳＨノックアウト細胞から得たタンパク質溶解物を用いてプルダウン実験を行った。ＨＥＫ２９３細胞タンパク質溶解物を対照として載せた。表示の抗体を用いて試料を免疫ブロットした。次に、ヒト脳タンパク質抽出物を用いて、ＶＡＳＨ１を効率的にプルダウンし（図８Ｃ）、関連するヒト組織における標的の関与を示した。インプット、フロースルー（ＦＴ）およびプルダウン（Ｐｄ）画分を、表示のタンパク質に対する抗体を用いて免疫ブロットした。

【0264】

２．３．９ ＶＡＳＨ阻害剤で処理した初代皮質ニューロンにおけるチューブリン脱チロシン化の大幅な減少
マウス胚の大脳皮質組織から精製した初代皮質ニューロンの分化におけるチューブリン脱チロシン化の機能的役割を評価することにした。解離させ、濾過した後、ＬＶ－８０の存在下または非存在下で細胞を７日間分化させた。細胞を集め、表示の抗体を用いてイムノブロット分析した。試料を免疫ブロッティングで分析し、３つの独立したアッセイで相対光学密度を測定した（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１）。特異的抗体を用いたチューブリン翻訳後修飾レベルの解析（図９Ａ～Ｂ）から、ＬＶ－８０と初代ニューロンをインキュベートすると、チューブリン脱チロシン化レベルが著しく減少し、それに伴ってチロシン化が増加することが示された（図９Ｂ）。ＬＶ－８０の存在下では、対照（ＤＭＳＯ）と比較して、チューブリン脱チロシン化は７０％減少し、チロシン化チューブリンは５０％増加し、わずかな差は抗体の個々の親和性を反映している。チューブリン脱チロシン化のレベルの減少は、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図９Ｃ）で評価したＶＡＳＨ１／２またはＳＶＢＰ発現の変化によるものではなく、ＶＡＳＨの酵素活性が直接阻害された結果である。次いで、ＬＶ－８０またはビヒクルとインキュベートしたニューロンの分化状態を、神経分化マーカーおよびグリアマーカーのパネルのｑＰＣＲ定量によって分析した。初期神経分化のマーカーであるＤｃｘおよびＮｅｕｒｏｄ１、ならびに後期分化段階のマーカーであるＳｙｐ、Ｍａｐ２およびＤｌｇ４のｍＲＮＡレベルは、条件間で同等であった（図９Ｄ）。同様に、Ｓｏｘ２およびＧｆａｐの発現レベル（グリアマーカー）は両条件で同等であった（図９Ｅ）。

【0265】

２．３．１０ 脱チロシン化により、チューブリンはグルタミル化を受けやすくなる
試料を免疫ブロッティングで分析し、３つの独立したアッセイで相対光学密度を測定した（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１）。

【0266】

注目すべきことに、処理したニューロンではアセチル化レベルは影響を受けないままであった（図１０Ｂ）。一方で、ポリグルタミル化は、２つの異なるポリグルタミル化特異的抗体：長いグルタミン酸鎖を認識するＰｏｌｙＥおよび分岐点グルタミン酸残基に特異的なＧＴ３３５で示されるように、大幅に減少した（図１０Ａ）。この観察から、チューブリン脱チロシン化とポリグルタミル化の間にクロストークが存在することが示唆された。この仮説を検証するために、ＨＥＫ２９３細胞において野生型または酵素的に不活性なＶＡＳＨ２（ＶＡＳＨ２Ｄ）をＴＴＬＬ４またはＴＴＬＬ６グルタミラーゼと共過剰発現させた。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型ＶＡＳＨ２または死（dead）バリアント（ＶＡＳＨ２Ｄ）およびＴＴＬＬ４またはＴＴＬＬ６グルタミラーゼと共トランスフェクションした。細胞を集め、表示の修飾に対する抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。チューブリン脱チロシン化レベルの増加はＴＴＬＬ６を刺激したが、ＴＴＬＬ４のポリグルタミル化活性は刺激しなかった（図１０Ｃ）。このことから、ＴＴＬＬ６活性はａ－チューブリンのＣ末端チロシン残基の存在に感受性があることが示された。この結果は、脱チロシン化により、チューブリンがいくつかのポリグルタミラーゼに許容的になることを示し、それらの経路間のクロストークが明らかになった。次に、ドロソフィラにおいてチューブリン脱チロシン化およびポリグルタミル化の間のクロストークが存在するかどうかを調べた。両修飾は、精子形成中に精子軸索上に蓄積する雄で特に顕著である。ドロソフィラにはＶＡＳＨホモログがなく、脱チロシン化は未知の酵素によって触媒される。脱チロシン化を模倣するために、チロシンを含む最後の３つのアミノ酸残基を欠く主要α－チューブリンアイソタイプａＴｕｂ８４Ｂの短縮形態（ａＴｕｂ８４ＢΔ３変異体１３）を発現するように遺伝子操作したハエを用いた。試料を集め、表示の修飾に対する抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。ａＴｕｂ８４ＢΔ３雄は、野生型雄と比較してポリグルタミル化レベルの著しい増加を示す（図１０Ｄ）。したがって、Ｃ末端アミノ酸残基は生体内でポリグルタミル化レベルに影響する。これらの結果は、脱チロシン化とポリグルタミル化の間の保存されたクロストークが存在することと一致した。

【0267】

２．３．１１ チューブリン脱チロシン化は、初代皮質ニューロンにおけるタウタンパク質結合に影響する
ＭＴとＭＴ結合タンパク質（ＭＡＰ）の相互作用の調節におけるチューブリン脱チロシン化の役割を調べるために、最初に５日間のＶＡＳＨ阻害剤の非存在下での皮質ニューロンの分化を完了させ、それに続いて３日間の処理を行った。このアプローチは、細胞分化とは無関係にタウタンパク質の細胞分布をモニターすることを可能にする。細胞を集め、表示の抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。ＬＶ－８０と皮質ニューロンの３日間のインキュベーションは、チューブリン脱チロシン化レベルを効率的に減少させ、チロシン化チューブリンレベルを有意に増加させた（図１１Ａ～Ｂ）。試料を免疫ブロッティングで分析し、３つの独立したアッセイで相対光学密度を測定した（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。多重ｔ検定でｐ値を算出した（ｎ＝３、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）。阻害剤とインキュベートした細胞では、ＰｏｌｙＥおよびＧＴ３５５シグナルが有意に減少することによって示されるように、脱チロシン化－ポリグルタミン酸化クロストークが確認された（図１１Ｃ）。全体として、タウのレベルは、免疫ブロット（図１１Ａ）およびタウｍＲＮＡ（Ｍａｐｔ遺伝子によってコードされる）のｑＲＴ－ＰＣＲ定量（示されていない）によって確認されたように、条件間で有意な差はなかった。次に、ビヒクルで処理したニューロンおよびＬＶ８０で処理したニューロンのタウおよびチューブリンを染色して、定量分析を行った。特異的にチューブリン染色されている領域を選び、ビヒクル処理および阻害剤処理した初代皮質ニューロンの同じ領域で、正確にタウタンパク質の免疫蛍光シグナルを測定した。チューブリンの染色と定量は条件間で有意差はなかった一方で、タウの細胞分布は投射（projections）において有意に変化し（図１１Ｄ～Ｆ）、本発明者らのＶＡＳＨ阻害剤とインキュベートした細胞では特に減少した（データは示されていない）。これは、ＭＴとタウ蛋白質間の相互作用を調節する上で、チューブリンの脱チロシン化が役割を果たしていることを示唆する。まとめると、初代皮質ニューロンにおけるチューブリン脱チロシン化の阻害がタウの局在化に直接影響することが示された。

【0268】

２．３．１２． 新たに設計された低ｎＭのインセルロＶＡＳＨ阻害剤
図１２に示されるように、インセルロにおけるＩＣ５０が低ｎＭである効率的な、細胞浸透性がある非常に有効なプロドラッグ（ＬＶ－１０４やＬＶ－１１１のような例を含む）のセットを設計した。

【0269】

化合物をタキソール処理前に加えた。ＣＨＬ－１細胞において低ｎＭ範囲でＶＡＳＨ媒介脱チロシン化が消失した。定量すると、ＬＶ－１０４およびＬＶ－１１１（ＩＣ５０はそれぞれ８ｎＭおよび２０ｎＭ）がＬＶ－８０（ＩＣ５０は５００ｎＭ）よりも細胞に対してはるかに効率的であることが示された。

【0270】

プロドラッグ化合物（ＬＶ－１０４およびＬＶ－１１１）および直接ＶＡＳＨ阻害剤の２つの例。プロドラッグはどちらも、インビトロアッセイの状況ではＶＡＳＨ１およびＶＡＳＨ２に影響を全く及ぼさなかった。

【0271】

これらの結果を考慮して、本発明者らは、ＶＡＳＨペプチダーゼ活性を標的とすることは、アルツハイマー病のような神経変性疾患だけでなく、がん、筋ジストロフィーおよび繊毛病の治療にも、安全で忍容性の高い仕組みであることを提案する。興味深いことに、これらの化合物は、チューブリンのグルタミル化に強い効果を有し、例えば、乳児発症型神経変性または緑内障におけるチューブリンのＴＴＬ依存性修飾を減少させるためにも使用できる可能性がある。

【0272】

脱チロシン化の阻害剤として広く使用されているパルテノリドは、インビトロでもインセルロでもＶＡＳＨ活性を阻害しないことを示した。このことは、脱チロシン化に対するパルテノリドの効果が間接的で、チューブリンへの共有結合によって引き起こされる微小管ダイナミクスの変化に起因する可能性が高いことを示した最近発表された研究（Hotta et al. Curr Biol. 2021, Volume 31, Issue 4, Pages 900-907）と一致している。さらに重要なことに、本発明者らはＥｐｏ－Ｙ化合物の医薬品化学に基づく最適化について報告し、特異性が高くかつ細胞透過性の新規ＶＡＳＨ阻害剤の開発につながった。本発明者らは、新たに開発した化合物（有効成分）が、ＶＡＳＨ活性を完全に阻害する能力を有し、パルテノリドとは対照的に、検出可能な毒性を示さないことを示した。さらに、初代神経細胞培養にＶＡＳＨ阻害剤を適用することによって、チューブリンの脱チロシン化と、ポリグルタミル化と呼ばれる別の重要なチューブリン修飾との間に、これまで知られていなかったクロストークがあることを発見した。これら２つの修飾の間の新たに明らかになったつながりは、神経細胞の極性の確立およびタウと呼ばれる主な神経微小管結合タンパク質の局在に、広範囲にわたって影響をもたらす。全体として、これらの化合物は、医薬品開発および研究目的での使用に大きな可能性をもっている。

【0273】

２．３．１３ ＩＢＭＴ１１インビトロおよびインセルロの脱チロシン化アッセイ
化合物を上記の反応培地（パート２．２を参照）に加えることによって、ＩＢＭＴ１１のインビトロ阻害活性を試験し、次いで表示の抗体を用いた免疫ブロッティングで脱チロシン化を分析した。

【0274】

ＬＶ－１０４はインビトロでＶＡＳＨを阻害しなかった一方で、インビトロでのＩＣ５０（ＩＢＭＴ－１１の０．６ｕＭ対Ｅｐｏ－Ｙの１０ｕＭ）によって示されるように、ＩＢＭＴ－１１は、Ｅｐｏ－Ｙよりも強力にＶＡＳＨ１媒介チューブリンの脱チロシン化を阻害することがわかった（図１３．Ａ）。これらの結果は、ＬＶ－１０４がインビトロ活性を有しないことも示している。

【0275】

タキソールで処理したＣＨＬ－１細胞を含む細胞ベースのアッセイで試験したところ、ＩＢＭＴ１１は弱い阻害活性を有することがわかった（図１３．Ｂ）。これは、ＩＢＭＴ１１が細胞浸透を低下させ、一方でＬＶ‐１０４はＶＡＳＨの非常に効率的な阻害を生じたことを示唆する。

【0276】

２．３．１４． ヒト細胞内部でのＬＶ１０４からＩＢＭＴ１１への変換
化合物ＬＶ－１０４の浸透および変換のバイオアナリシスは、ヒト細胞で上記のプロトコールを用いて達成された（パート２．２参照）。結果を図１４に示す。

【0277】

ヒト細胞内部でプロドラッグＬＶ－１０４がＩＢＭＴ１１に完全に変換されることが確認されている。若干の変換が細胞の培養培地（上清）中で起こるが、ＬＶ１０４は細胞（細胞）内では検出されなかった。これらのデータは、特にＲ^３に対応する位置に、エステルなどの極性の低い基が存在することにより、それらの細胞浸透を有意に増加するという仮説を裏付ける。いったん細胞内に入ると、化合物は加水分解され、例えばエステルがカルボン酸に変換され、強力なＶＡＳＨ阻害剤がもたらされる。

【0278】

したがって、ＩＢＭＴ１１はプロドラッグＬＶ－１０４の対応薬物である。実際、Ｒ^３およびＲ^６に対応する基はＬＶ－１０４ではエチルエステルであるのに対し、ＩＢＭＴ１１ではカルボン酸である。そのため、ＬＶ－１０４はインビトロ活性を出すことができず、ＩＢＭＴ－１１はインセルロ活性が低い。また、その逆で、ＩＢＭＴ－１１はインビトロで非常に効率的であり、ＬＶ－１０４はインセルロで強力なＶＡＳＨ阻害剤である。

【0279】

２．３．１５． 本発明による化合物のインビトロおよびインセルロのアッセイ
ａ）ＩＢＭＴ２３
ＩＢＭＴ２３は、インビトロ脱チロシン化アッセイ（上記のプロトコールを使用）で試験した場合不活性であるが（図１５．Ａ）、ヒトＣＨＬ１細胞では優れたインセルロＶＡＳＨ阻害活性を有することがわかった（図１５．Ｂ）。インビトロアッセイではＬＶ８０、ＩＢＭＴ１１、ＥＰＯ－Ｙ（ＬＶ１と命名）の活性、インセルロアッセイではＬＶ８０、ＬＶ１０４、およびＥＰＯ－Ｙの活性との比較で、活性を表した。ＩＢＭＴ２３は培養細胞ではＬＶ８０より強力で、生体内ではＬＶ－１０４と同様の活性を有することがわかった。これらの結果は上記の仮説と一致している。ＩＢＭＴ２３はＲ^３の位置にエチルエステルを有するプロドラッグである。したがって、そのようなプロドラッグは細胞内部で加水分解されて、ＶＡＳＨ阻害活性をもたらす、対応するカルボン酸を生じる。このため、ＩＢＭＴ２３はインビトロ活性を有しないが、優れたインセルロ活性を示す。

【0280】

ｂ）ＩＢＭＴ３４
ＩＢＭＴ３４はＬＶ８０のナトリウム塩である。インビトロおよびインセルロでは、対応するベースのＬＶ－８０と同じ活性を有するが、水またはＰＢＳ溶液への溶解性が劇的に増加していることがわかった（図１６．Ａおよび図１６．Ｂ参照）。

【0281】

ｃ）ＩＢＭＴ２８およびＩＢＭＴ２８ｈｙｄｒｏ
ＩＢＭＴ２８は、インビトロ脱チロシン化アッセイ（上記のプロトコールを使用）で試験した場合不活性であるが（図１７．Ａ）、ヒトＣＨＬ１細胞では優れたインセルロＶＡＳＨ阻害活性を有することがわかった（図１７．Ｂ）。インビトロアッセイではＬＶ８０、ＩＢＭＴ１１、ＥＰＯ－Ｙ（ＬＶ１と命名）の活性、インセルロアッセイではＬＶ８０およびＬＶ１０４の活性との比較で、活性を表した。ＩＢＭＴ２３は生体内ではＬＶ８０と同じくらい強力であることがわかる。これらの結果は、上記の仮説と一致している。ＩＢＭＴ２８はＲ^３の位置にエチルエステルを有するプロドラッグである。したがって、そのようなプロドラッグは細胞内部で加水分解されて、ＶＡＳＨ阻害活性をもたらす、対応するカルボン酸ＩＢＭＴ２８ｈｙｄｒｏを生じる。このため、ＩＢＭＴ２８はインビトロ活性を有しないが、優れた生体内活性を示す。ＩＢＭＴ２８ｈｙｄｒｏのインビトロ活性を図１７．Ａで評価した。

【0282】

ｄ）ＩＢＭＴ３８ｈｙｄｒｏ
ＩＢＭＴ３８ｈｙｄｒｏを、上記のようにインビトロ脱チロシン化アッセイで試験した。ＬＶ８０と同程度良好なインビトロ活性を有することがわかった（図１８参照）。

【0283】

２．３．１６． インビトロＩＣ _５０ の計算
以下の化合物を、上記のようにインビトロ脱チロシン化アッセイで試験し、それらのＩＣ_５０を計算し、化合物ＬＶ－８０のＩＣ_５０と比較した。「倍率変化」の列は、各化合物ＩＣ_５０（化合物）／ＩＣ_５０（ＬＶ８０）の比に相当する。

【0284】

【表1-1】

【表1-2】

【0285】

２．３．１７． ＳＤ－１３９の比較例

【化95】

【0286】

Aillaud, C. et al. Science, 2017, 358, p.1448-1453で以前に記載のとおりにＳＤ１３９を合成した。

【0287】

１５０ｍＭ ＮａＯＨと５分間インキュベートし、次いで１５０ｍＭ ＨＣｌで中和して、ＳＤ１３９ｈｙｄｒｏを得た。

【0288】

ＳＤ－１３９およびＳＤ－１３９ｈｙｄｒｏ（ＳＤ－１３９ｓａｐｏとも呼ぶ）をインビトロ脱チロシン化アッセイで試験し、ＬＶ－８０およびＥＰＯ－Ｙの活性と比較した（図１９．Ａおよび１９．Ｂを参照）。ＳＤ－１３９とＳＤ－１３９ｓａｐｏはともに、ＬＶ－８０より非常に効力が弱く、ＥＰＯ－Ｙよりさらに効力が弱いことがわかった。したがって、ＳＤ－１３９は、ＶＡＳＨ依存性脱チロシン化の阻害という観点で、最小要件を示さない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】