特表 2024-532705 癌を治療するための抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】癌を治療するための抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240903BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 31/5025 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 31/505 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240903BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240903BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240903BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20240903BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

C07K16/46

C07K14/55

C07K14/54

A61K47/68

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K39/395 L

A61K39/395 C

A61K38/20

A61P43/00 107

A61K35/12

A61K31/519

A61K31/5025

A61K31/505

C12N15/13

C12N15/24

C12N15/62 Z

A61K38/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506734

(86)(22)【出願日】2022-08-04

(85)【翻訳文提出日】2024-04-01

(86)【国際出願番号】 IL2022050849

(87)【国際公開番号】W WO2023012802

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】285416

(32)【優先日】2021-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】502379147

【氏名又は名称】イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アミット イド

(72)【発明者】

【氏名】ボーンスタイン－オーヴィッツ チャムタル

(72)【発明者】

【氏名】ヤリン アダム

(72)【発明者】

【氏名】モーシェ アディ

(72)【発明者】

【氏名】バーボーイ オーレン

(72)【発明者】

【氏名】ワイナー アッサーフ

(72)【発明者】

【氏名】カッツェンエレンボーゲン ヨナタン

(72)【発明者】

【氏名】ジャイティン ディエゴ

(72)【発明者】

【氏名】シェバン ファディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084AA22

4C084AA23

4C084DA12

4C084DA14

4C084DA19

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB072

4C084ZB221

4C084ZB261

4C084ZC202

4C084ZC751

4C085AA25

4C085BB11

4C085BB36

4C085CC21

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC42

4C086CB05

4C086CB06

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA05

4C087NA13

4C087ZB22

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ＴＲＥＭ２及びＧｐｎｍｂに対する抗体が提供される。また、抗体を含む組成物及びその使用方法も提供される。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片であって、前記抗原認識ドメインが、
２３Ａ１０Ａ１０
３２Ｆ９Ｅ８
３８Ｃ１１Ｈ１１
４９Ａ１２Ｄ７
５８Ｂ２Ａ７
６０Ａ４Ｆ５
６０Ｈ４Ａ３
６１Ｂ１１Ｃ９
８０Ｅ３Ｈ１１
８３Ｅ１０Ｂ１２
５４Ｈ２Ｃ１
５４Ｈ２Ｃ１Ｂ
２３Ａ１０Ｂ１０
２３Ａ１０Ｂ１１
３８Ｃ１１Ｃ１０
６０Ａ４Ｅ１０
６０Ｈ４Ｇ２
８０Ｅ３Ｃ７
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む、抗体またはその断片。

【請求項2】

前記ＴＲＥＭ２が、ヒトＴＲＥＭ２である、請求項１に記載の抗体またはその断片。

【請求項3】

前記抗原認識ドメインが、抗体５４Ｈ２Ｃの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。

【請求項4】

前記抗原認識ドメインが、抗体８０Ｅ３Ｃ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。

【請求項5】

骨髄由来マクロファージのＴＲＥＭ２を阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化マクロファージを発生させ得る、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。

【請求項6】

膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（Ｇｐｎｍｂ）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片であって、前記抗原認識ドメインが、
ｇ１－ｇ２
ｇ２－ｂ６
ｇ３－ｇ２
ｇ４－ｂ４
ｇ５－ｇ２
ｇ８－ｇ２
ｇ９－ｂ４
ｂ１－ｂ２
ｂ８－ｂ８
ｂ１０－ｂ９
ｂ１１－ｇ２
ｂ１２－ｙ８
ｂ１３－ｂ７
ｂ１５－ｂ７
ｂ１７－ｂ１７
ｂ１８－ｂ１９
ｂ２－ｂ２
ｂ２０－ｂ２１
ｂ２１－ｙ８
ｂ２２－ｂ２３
ｂ２４－ｂ２６
ｂ２５－ｂ２６
ｙ３－ｙ２２
ｙ４－ｙ３
ｙ５－ｙ５
ｙ９－ｙ６
ｙ１２－ｂ４
ｙ２０－ｙ１９
ｙ２３－ｙ２０
ｙ２５－ｙ２１
ｙ２７－ｙ２２
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む、抗体またはその断片。

【請求項7】

前記Ｇｐｎｍｂが、ヒトＧｐｎｍｂである、請求項６に記載の抗体またはその断片。

【請求項8】

ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化可能な、請求項６に記載の抗体またはその断片。

【請求項9】

少なくとも一方のアームに請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原認識ドメインを含む、二重特異性抗体。

【請求項10】

一方のアームに請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体を含み、もう一方のアームに請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

エフェクター機能が無効であるかまたはエフェクター機能を有さない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗体。

【請求項12】

ＩｇＧ１である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗体。

【請求項13】

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として製剤化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項14】

炎症性サイトカインとともに製剤化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項15】

前記炎症性サイトカインに接合されてコンジュゲートを形成する、請求項１４に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項16】

前記炎症性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される、請求項１４～１５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項17】

コンジュゲートが、ＩＬ－２を含む、請求項１６に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項18】

前記コンジュゲートが、配列番号４９６と配列番号４９８または配列番号４９７と配列番号４９９に示されるものである、請求項１５に記載の抗体もしくはその断片または二重特異性抗体。

【請求項19】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体の断片。

【請求項20】

配列番号５００に示されるものである、請求項１９に記載の抗体の断片。

【請求項21】

請求項１９または２０に記載の抗体の断片を発現する、細胞。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を含む、製品。

【請求項23】

請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片もしくは二重特異性抗体または細胞と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項24】

ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させる方法であって、有効量の請求項１～５及び９～２１のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片もしくは二重特異性抗体または細胞をミエロイド細胞と接触させることを含み、それによりミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させる、方法。

【請求項25】

ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する方法であって、有効量の請求項８に記載の抗体またはその断片をＣＤ４ Ｔ細胞と接触させることを含み、それにより前記ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する、方法。

【請求項26】

ＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞を死滅させる方法であって、有効量の請求項２１に記載の細胞を、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を含む細胞集団と接触させることを含み、それにより前記ＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞を死滅させる、方法。

【請求項27】

前記接触が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記接触が、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、それらの組み合わせ、もしくは二重特異性抗体、または細胞を前記対象に投与することを含み、それにより前記癌を治療する、方法。

【請求項30】

癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項２４に記載の方法に従ってミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させ、前記ミエロイド細胞が前記対象に由来するものである、工程と、続いて、
（ｂ）前記ミエロイド細胞を前記対象に移植して、それにより前記癌を治療する工程と
を含む、方法。

【請求項31】

癌の治療における使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体、その断片、二重特異性抗体、または細胞。

【請求項32】

前記癌が、固形癌である、請求項２８もしくは２９に記載の方法、または請求項３１に記載の使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項33】

前記固形癌が、肺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項34】

前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項３３に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項35】

前記肺癌が、小細胞肺癌である、請求項３３に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項36】

前記肝癌が、肝細胞癌である、請求項３３に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項37】

治療有効量のチェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項38】

治療有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【請求項39】

前記ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤が、イブルチニブ、アカラブルチニブ、及びスペブルチニブからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法、または使用のための抗体、その断片、二重特異性抗体、もしくは細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願：
本出願は、２０２１年８月５日に出願されたイスラエル国特許出願第２８５４１６号の優先権を主張するものであり、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表の記載
本出願の出願と同時に提出された、６４９，１２４バイトで構成される２０２２年８月４日作成の９３０６４．ｘｍｌという名称のファイルは、参照により本明細書に援用される。

【0003】

発明の分野及び背景
本発明は、そのいくつかの実施形態では、ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることにより癌を治療する方法に関し、より詳細には、限定されるものではないが、固形癌に関する。

【背景技術】

【0004】

免疫機能に不可欠な決定因子の多くは、従来の表面マーカーによって正確に特徴付けることができず、これらのシグナルの内部処理及び統合がどのように免疫の活性化、抑制、及び炎症へと転換されるのかは不明である。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内でエフェクターＴ細胞に対する抑制環境を促進し、腫瘍増殖及び免疫機能不全に加担することが公知である。ＭＤＳＣは、広範囲のヒト疾患及び癌種における治療結果に重大な影響を及ぼしているにもかかわらず、その正確な機能的役割及び分子の正体はとらえどころがなく、不明確である。ＭＤＳＣは、従来の表面マーカーに基づく分類方式には適合せず、広範なミエロイド表面マーカー、種々の細胞アッセイ、及びアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）を発現する免疫抑制性代謝経路の発現を含む代謝特性を使用して分類される。この重要かつ不均一なミエロイド細胞群を、それらの抑制性代謝能に基づいて徹底的に分子的に理解することは、それらの分子マーカー、経路、及び活性の同定につながり、最終的にはより効果的なバイオマーカー及び標的免疫療法につながる可能性がある。

【0005】

背景技術には以下が含まれる：
Kim et al., Cancers (Basel).2019 Sep；11(9): 1315、
国際公開第２０１７／０５８８６６号パンフレット、
米国特許出願公開第２０１８００４３０１４号明細書、及び
Katzenelenbogen et al., Aμｇ 20;182(4):872-885.e19.doi: 10.1016/j.cell.2020.06.032. Epub 2020 Aμｇ 11。

【発明の概要】

【0006】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片が提供され、前記抗原認識ドメインは、
２３Ａ１０Ａ１０
３２Ｆ９Ｅ８
３８Ｃ１１Ｈ１１
４９Ａ１２Ｄ７
５８Ｂ２Ａ７
６０Ａ４Ｆ５
６０Ｈ４Ａ３
６１Ｂ１１Ｃ９
８０Ｅ３Ｈ１１
８３Ｅ１０Ｂ１２
５４Ｈ２Ｃ１
５４Ｈ２Ｃ１Ｂ
２３Ａ１０Ｂ１０
２３Ａ１０Ｂ１１
３８Ｃ１１Ｃ１０
６０Ａ４Ｅ１０
６０Ｈ４Ｇ２
８０Ｅ３Ｃ７
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0007】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＲＥＭ２は、ヒトＴＲＥＭ２である。

【0008】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原認識ドメインは、抗体５４Ｈ２Ｃの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0009】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原認識ドメインは、抗体８０Ｅ３Ｃ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体またはその断片は、骨髄由来マクロファージのＴＲＥＭ２を阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化マクロファージを発生させ得る。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（Ｇｐｎｍｂ）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片が提供され、抗原認識ドメインは、
ｇ１－ｇ２
ｇ２－ｂ６
ｇ３－ｇ２
ｇ４－ｂ４
ｇ５－ｇ２
ｇ８－ｇ２
ｇ９－ｂ４
ｂ１－ｂ２
ｂ８－ｂ８
ｂ１０－ｂ９
ｂ１１－ｇ２
ｂ１２－ｙ８
ｂ１３－ｂ７
ｂ１５－ｂ７
ｂ１７－ｂ１７
ｂ１８－ｂ１９
ｂ２－ｂ２
ｂ２０－ｂ２１
ｂ２１－ｙ８
ｂ２２－ｂ２３
ｂ２４－ｂ２６
ｂ２５－ｂ２６
ｙ３－ｙ２２
ｙ４－ｙ３
ｙ５－ｙ５
ｙ９－ｙ６
ｙ１２－ｂ４
ｙ２０－ｙ１９
ｙ２３－ｙ２０
ｙ２５－ｙ２１
ｙ２７－ｙ２２
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｇｐｎｍｂは、ヒトＧｐｎｍｂである。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体またはその断片は、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化することができる。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｇｐｎｍｂは、ヒトＧｐｎｍｂである。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化可能である。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、少なくとも一方のアームに本願に記載の抗原認識ドメインを含む二重特異性抗体が提供される。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体またはその断片は、一方のアームにＴＲＥＭ２の抗体を含み、もう一方のアームに抗体Ｇｐｎｍｂを含む。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態によれば、エフェクター機能が無効であるかまたはエフェクター機能を有さない。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩｇＧ１である。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として製剤化される。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性サイトカインとともに製剤化される。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性サイトカインに接合されてコンジュゲートを形成する。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態によれば、コンジュゲートは、ＩＬ－２を含む。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態によれば、コンジュゲートは、配列番号４９６と配列番号４９８、または配列番号４９７と配列番号４９９に示されるものである。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号５００に示されるものである。

【0028】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本願に記載の抗体の断片を発現する細胞が提供される。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本願に記載の抗体または抗体断片を含む製品が提供される。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本願に記載の抗体もしくは抗体断片もしくは二重特異性抗体または細胞と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させる方法が提供され、本方法は、有効量の本願に記載の抗体もしくは抗体断片もしくは二重特異性抗体または細胞とミエロイド細胞を接触させて、それによりミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることを含む。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する方法が提供され、本方法は、有効量の請求項８に記載の抗体またはその断片とＣＤ４ Ｔ細胞を接触させて、それによりＣＤ４ Ｔ細胞を活性化することを含む。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞を死滅させる方法が提供され、本方法は、有効量の本願に記載の細胞とＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を接触させることを含む、細胞集団を接触させること、によりＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞を死滅させることを含む。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触させることは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、本方法は、有効量の本願に記載の抗体、抗体断片、それらの組み合わせ、もしくは二重特異性抗体、または細胞を対象に投与して、それにより癌を治療することを含む。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、本方法は、
（ａ）本願に記載の方法に従ってミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることであって、ミエロイド細胞が対象に由来するものである、低減させること、及びその後、
（ｂ）ミエロイド細胞を対象に移植して、それにより癌を治療すること、を含む。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、癌の治療における使用のための、本願に記載の抗体、その断片、二重特異性抗体、または細胞が提供される。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態によれば、癌は、固形癌である。

【0040】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、肺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、及び乳癌からなる群から選択される固形癌が提供される。

【0041】

本発明のいくつかの実施形態によれば、肺癌は、非小細胞肺癌である。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態によれば、肺癌は、小細胞肺癌である。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態によれば、肝癌は、肝細胞癌である。

【0044】

本発明のいくつかの実施形態によれば、方法または使用は、治療有効量のチェックポイント阻害剤をさらに含む。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態によれば、治療有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤をさらに含む。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤は、イブルチニブ、アカラブルチニブ、及びスペブルチニブからなる群から選択される。

【0047】

別段に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本願に記載されるものと類似または同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法及び／または材料が以下に記載される。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、必ずしも限定することを意図したものではない。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書において添付図面を参照して単なる例として説明される。これより、図面を詳細に具体的に参照するが、示される詳細事項は、例としてのものであり、かつ本発明の実施形態を説明的に論じる目的のものであることが強調される。この点に関して、説明を図面と併せて読むことにより、本発明の実施形態がどのように実践され得るかが当業者には明らかになる。

【0049】

図面は以下のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】図１は、ヒトＴＲＥＭ２に対するハイブリドーマ由来モノクローナル抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。二次抗体：ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃｇ断片特異的（ｍｉｎ Ｘ ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質）。

【図2】図２は、７種の抗ｈＴＲＥＭ２抗体の結合感度試験におけるＨＥＫ２９３上清ＥＬＩＳＡのＯＤ値を示す。

【図3】図３は、ビオチンコンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２抗体で染色し、続いてＡＰＣ－ストレプトアビジンでインキュベートした野性型２９３ＨＥＫ細胞（ＷＴ）及びｈＴＲＥＭ２発現ＨＥＫ２９３細胞（ｈＴＲＥＭ２）のフローサイトメーター分析を示す。

【図4】図４のＡ～Ｂは、リード抗体の同定を示す。ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）マウス及びｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウスのマウス骨髄細胞を、３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－２５）の存在下で７日間培養し、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）を生成した。ＢＭＤＭを、ビオチンコンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２リーダー抗体（８３Ｅ１０Ｂ１２、５４Ｈ２Ｃ１、８０Ｅ３Ｃ７、またはＩｇＧ対照）で染色し、続いてＡＰＣ－ストレプトアビジンでインキュベートした。Ａ．代表的なヒストグラムは、ＩｇＧ対照に対する８３Ｅ１０Ｂ１２、５４Ｈ２Ｃ１、８０Ｅ３Ｃ７の染色を示している。Ｂ．ＴＲＥＭ２ ＫＯ ＢＭＤＭまたはｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭに対する、ＩｇＧ対照、８３Ｅ１０Ｂ１２、５４Ｈ２Ｃ１、及び８０Ｅ３Ｃ７のフローサイトメトリー強度。

【図5】図５は、８３Ｅ１０Ｂ１２抗ｈＴＲＥＭ２タンパク質、５４Ｈ２Ｃ１抗ｈＴＲＥＭ２タンパク質、８０Ｅ３Ｃ７抗ｈＴＲＥＭ２タンパク質のＳＰＲ分析を示す。

【図6】図６のＡ～Ｂは、８３Ｅ１０Ｂ１２抗ｈＴＲＥＭ２抗体、５４Ｈ２Ｃ１抗ｈＴＲＥＭ２抗体、８０Ｅ３Ｃ７抗ｈＴＲＥＭ２抗体による、野性型（ＷＴ）２９３ＨＥＫ細胞及びｈＴＲＥＭ２過剰発現（ＯＥ）ＴＲＥＭ２ ２９３ＨＥＫ細胞（Ａ）、ならびにｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭまたはＫＯ ＢＭＤＭ（Ｂ）のウエスタンブロット分析を示す。二次抗体：ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（ｍｉｎ Ｘ ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、１１５－０３５－０７１）。

【図7】図７は、８３Ｅ１０Ｂ１２抗ｈＴＲＥＭ２抗体、５４Ｈ２Ｃ１抗ｈＴＲＥＭ２抗体、８０Ｅ３Ｃ７抗ｈＴＲＥＭ２抗体を用いた、ＴＲＥＭ２ ＫＯ ＢＭＤＭ及びｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭの免疫組織化学分析を示す。細胞を冷メタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄して、抗ｈＴＲＥＭ２抗体で染色した。二次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、７１５－６０６）。

【図8】図８のＡ～Ｃは、ｍＡｂ ５４Ｈ２Ｃ１及びｍＡｂ ８０Ｅ３Ｃ７がＢＭＤＭ培養物においてｈＴＲＥＭ２活性を遮断することを示す。（Ａ）ＴＲＥＭ２ ＫＯ骨髄細胞及びｈＴＲＥＭ２骨髄細胞のＢＭＤＭ培養物の単一細胞マップ。（Ｂ）ＢＭＤＭ分化中の２、３、４、５、６、７日目の単一細胞マップ上のｈＴＲＥＭ２（シアン）マウスまたはＴＲＥＭ２－ＫＯ（赤）マウス由来の細胞を強調表示する密度プロット。（ｃ）野性型細胞またはＴＲＥＭ２－ＫＯ細胞由来のＢＭＤＭ培養物の７日目のＴＲＥＭ２＋ＧＰＮＭＢ＋マクロファージ及びＴＲＥＭ２－マクロファージの定量、ならびに２日目のｍＡｂ ５４Ｈ２Ｃ１、ｍＡｂ ８０Ｅ３Ｃ７、またはＩｇＧ対照で処理した野性型細胞に関する定量。

【図9】図９は、ＭＣＡ－２０５誘発腫瘍を担持するヒト化ＴＲＥＭ２マウスにおけるビオチンコンジュゲートｈＴＲＥＭ２抗体の浸透のＥＬＩＳＡ分析を示す。

【図10】図１０のＡ～Ｂは、ｈＧＰＮＭＢタンパク質がＣＤ４ Ｔ細胞活性化を抑制することを示す。ＣＦＳＥ染色したヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、活性化及び増殖のために、プレコーティングした抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、及び抗ＣＤ２８抗体中で３日間インキュベートした。フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ強度測定、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、ＢＬＧ－４３０１０４）によるＩＦＮｇ分泌測定から複製数を算出した。

【図11】図１１は、示した抗体濃度でヒトＭ２マクロファージを染色するＥ３Ｃ７抗体（黄色）及びＩｇＧ対照（灰色）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）曲線である。ビオチン化抗体を使用し、続いてＰＥ－ストレプトアビジンを結合させた。

【図12】図１２のＡ～Ｂは、マクロファージ極性化に対するＥ３Ｃ７の効果を示す。ヒトＣＤ１４＋単球を健常ドナー３名の末梢血から精製し、ｈＭ－ＣＳＦを５日間投与することによりマクロファージに分化させ、続いてＩＬ－４投与により「Ｍ２」マクロファージに極性化させた。抗ＴＲＥＭ２抗体であるＥ３Ｃ７ Ａｂを、アッセイの３日目及び５日目に培養物に添加した。（Ａ）ｑＰＣＲ及び（Ｂ）ＥＬＩＳＡを、ＩＬ４による処理の２４時間後に実施した。

【図13】図１３のＡ～Ｃは、ｍＡｂ Ｅ３Ｃ７が培養中のヒトマクロファージの分化におけるｈＴＲＥＭ２活性を遮断することを示す。（Ａ）ＩＬ－４サイトカインの存在下または不在下、及び抗ＴＲＥＭ２抗体／ＩｇＧ対照抗体を含むまたは含まない、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージの単一細胞マップ。（Ｂ）単一細胞マップ上のＭ－ＣＳＦ（ピンク）試料またはＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４（青）試料の細胞を強調表示した密度プロット。（Ｃ）単一細胞マップ上の抗ＴＲＥＭ２（ピンク）試料、ＩｇＧ対照（緑）試料、または抗体なし（青）試料の細胞を強調表示した密度プロット。

【図14】図１４は、ｍＡｂ Ｅ３Ｃ７が培養中のヒトマクロファージの分化におけるｈＴＲＥＭ２活性を遮断することを示す。ドットプロットの視覚化は、抗ＴＲＥＭ２ ｍＡｂ、ＩｇＧ対照のいずれかで処理したかまたは抗体処理なしの、２つの分化条件：Ｍ－ＳＣＦ分化マクロファージ、Ｍ－ＣＳＦ＋ＩＬ４分化マクロファージにおける、差次的に発現された遺伝子の発現を示している。

【図15】図１５のＡ～Ｂは、抗体Ｅ３Ｃ７がマウス腫瘍微小環境（ＴＭＥ）をリモデリングすることを示す。（Ａ）ＩｇＧ対照と比較した、Ｅ３Ｃ７処理マウスにおけるＩ型インターフェロンシグナル伝達が高いＴＡＭのパーセンテージ。（Ｂ）ＩｇＧ対照と比較した、Ｅ３Ｃ７処理マウスにおける機能不全ＣＤ８ Ｔ細胞（ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋）のパーセンテージ。

【図16】図１６は、Ｅ３Ｃ７処理マウスの腫瘍関連マクロファージにおける差次的遺伝子発現を示すボルケーノプロットである。プロットは、Ｅ３Ｃ７で処理したＴＭＥマクロファージとＩｇＧ対照で処理したＴＭＥマクロファージにおいて差次的に発現された遺伝子を示している。

【図17A】図１７Ａ及び図１７Ｂは、抗ＴＲＥＭ２抗体Ｅ３Ｃ７及び炎症性サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ－１５）が相乗してマクロファージの炎症誘発性表現型を上昇させることを示す。（Ａ）抗ＴＲＥＭ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２、または抗ＴＲＥＭ２とサイトカインのうちの１つとの組み合わせで処理した後の遺伝子発現分析。（Ｂ）抗ＴＲＥＭ２及びＩＬ－２／ＩＬ－１５サイトカインで処理した後のＭ２マクロファージサイトカイン分泌分析。

【図17B】同上

【図18】図１８のＡ～Ｂは、抗ＴＲＥＭ２抗体Ｅ３Ｃ７及び炎症性サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ－１５）が、相乗してＭ２マクロファージの炎症誘発性表現型を増加させ、結果としてＭ２マクロファージによるＣＤ８ Ｔ細胞活性化の抑制を解除することを示す。（Ａ）活性化及び増殖のためにプレコーティングした抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体中で、細胞追跡色素ＣＦＳＥで染色したヒトＣＤ８ Ｔ細胞を抗ＴＲＥＭ２抗体及びＩＬ２／ＩＬ－１５サイトカインで処理したＭ２マクロファージと３日間共培養した。フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ強度測定により算出した増殖性細胞のパーセンテージ。（Ｂ）活性化及び増殖のためにプレコーティングした抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体中、ＩＬ－２／ＩＬ－１５サイトカインの存在下で、ＣＦＳＥで染色したヒトＣＤ８ Ｔ細胞をＭ２マクロファージと３日間共培養した。フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ強度測定により算出した増殖性細胞のパーセンテージ。

【図19】図１９のＡ～Ｄは、抗ｈＴＲＥＭ２－サイトカイン融合体の結合を示すグラフである。プレートを組換えｈＴＲＥＭ２（２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、様々な濃度の組換え抗体を用いた直接ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。あるいは、ｈＭ２細胞上清を、可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質結合アッセイ（サンドイッチＥｌｉｓａ）に使用した。異なる二次抗体を使用した。Ａ、Ｃ：抗ヒトＩｇＧ、Ｂ、Ｄ：抗ｈＩＬ２（ＢＬＧ－５００３０２）。

【図20】図２０のＡ～Ｂは、本発明の実施形態による抗ｈＴｒｅｍ－ＩＬ２ Ａｂ及びそのＩＬ－２との融合体が、培養中のｈＣＤ８＋／ＣＤ４＋細胞を活性化することを示す。ｈＣＤ８／ＣＤ４＋細胞を、活性化させてまたはさせずに、抗体（１０μｇ／ｍｌ）または組換えタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに培養した。Ａ．４日目の増殖ＣＤ８＋細胞のパーセンテージ。Ｂ．２４時間時点及び４日目のＩＦＮｇの分泌（ｐｇ／ｍｌ）。

【図21】図２１は、培地中のＩＦＮｇ濃度により決定した、異なる共培養条件下でのＩＦＮｇ放出を示す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定（条件毎に１６回反復）を使用して統計学的有意性検定を行った。

【図22-1】図２２のＡ～Ｆは、ＴＲＥＭ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を示すグラフである。（Ａ）ＴＲＥＭ２＋ＨＥＫ２９３と共培養したＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイ。（Ｂ）ＴＲＥＭ２＋ＨＥＫ２９３と共培養したＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＲＥＭ２＋ＨＥＫ２９３の活性化及び死滅に関するフローサイトメトリー分析。（Ｃ）ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞及びモックＣＡＲ Ｔ細胞と２４時間共培養した後のヒトＴＡＭ様細胞のフローサイトメトリーのＦＳＣ－ＳＳＣゲーティング。（Ｄ）ヒトＴＡＭ様細胞と共培養したＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイ。（Ｅ）ヒトＴＡＭ様細胞と共培養したＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び死滅に関するフローサイトメトリー分析。（Ｆ）ヒト化ＴＲＥＭ２マウス、ＴＲＥＭ２ｋｏマウス、及びｗｔマウス由来のＢＭＤＭ及びＢＭＤＣと共培養したＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイ。

【図22-2】同上

【図23】図２３は、本発明のいくつかの実施形態によるＴＲＥＭ２キメラ抗原受容体の概略図である。

【図24】図２４は、本発明のいくつかの実施形態の抗ＴＲＥＭ２－ＩＬ２融合体の概略図及び配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本発明のいくつかの実施形態は、ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることにより癌を治療する方法に関し、より詳細には、限定されるものではないが固形癌に関する。

【0052】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるまたは実施例によって例証される詳細にその適用が必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または種々の方法で実践もしくは実行することができる。

【0053】

本発明者らは、Ａｒｇ１^＋ミエロイド細胞の直接標的化を使用して、腫瘍微小環境内の抑制性代謝回路を分析した。本発明者らは、腫瘍内のＡｒｇ１^＋ＴＲＥＭ２^＋細胞の２つの別個の集団である、腫瘍関連マクロファージ集団と、規定の表面マーカー（例えばＧｐｎｍｂ）及びシグナル伝達（低酸素を含む）により特徴付けられる独特のＭｒｅｇ集団とを同定した。本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＡｒｇ１^＋ＴＡＭ集団及びＭｒｅｇ集団の抑制性活性を実証した。本発明の知見により、ＴＲＥＭ２が抑制性ミエロイド細胞のマーカー及び潜在的な調節因子であることが同定された。マウスにおけるＴＲＥＭ２の遺伝的除去により、機能不全ＣＤ８^＋Ｔ細胞の減少ならびにＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の増加を含めた腫瘍に対する免疫反応性の増加とともに、Ｍｒｅｇ集団の劇的な減少がもたらされた。結果から、癌を治療するために、Ｍｒｅｇ集団を特異的に標的とすることが腫瘍関連マクロファージ集団を標的とすることよりも有益であることが示唆される。

【0054】

よって、本発明者らは、癌を治療するために、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）及び膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（Ｇｐｎｍｂ）を共標的化することにより制御性ミエロイド細胞集団（Ｍｒｅｇ）を調節することを既に提案してきた。本発明者らは、目下、かかる共標的化に使用することができるＴＲＥＭ２及びＧｐｎｍｂに対する抗体を同定している。

【0055】

抗ＴＲＥＭ２抗体は、スクリーニングされた抗体の存在下で骨髄由来マクロファージが活性化されてＭ１プロファイルを獲得する、独特なスクリーニングアッセイを用いることによりスクリーニングされた。この活性化は、ＴＲＥＭ２遮断（機能喪失）の直接的結果であり、以下の実施例の項に開示されるように、ＴＲＥＭ２ノックアウト表現型を模倣する。他方、抗Ｇｐｎｍｂ結合剤は、ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を抑制するＭｒｅｇを阻害する能力、及びそれによりＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する能力に基づいて選択される。

【0056】

ＣＤ４ Ｔ細胞及びマクロファージを活性化する能力により、本発明の抗体は臨床における使用、特に癌の治療における使用に有益となる。

【0057】

本発明のいくつかの実施形態の抗ＴＲＥＭ２抗体の機能的特徴付けにより、高親和性認識（低ナノモルからピコモルの範囲）と、免疫抑制性マクロファージを炎症誘発性単球様細胞へとリプログラムする能力により立証されるミエロイド細胞におけるＴＲＥＭ２機能の阻害とが示された。単細胞ＲＮＡｓｅｑの比較分析により、抗体で処理されリプログラムされたＢＭＤＭのトランスクリプトームパターンとＴＲＥＭ２^－／－マウス由来のトランスクリプトームパターンがほぼ同一であることが明らかとなった。本発明のいくつかの実施形態の抗ＴＲＥＭ２抗体は、腫瘍担持ヒト化マウスにおいて腫瘍増殖を減弱させ、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の差次的増加により立証されるように腫瘍マクロファージをリプログラムする。抗ＴＲＥＭ２抗体と炎症性サイトカインとの組み合わせ、または抗ＴＲＥＭ２抗体と炎症性サイトカインとの接合は、ミエロイドリプログラミング及びＴ細胞活性化を相乗的に増強させることが示された。加えて、本発明のいくつかの実施形態の抗体を使用して生成されたＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、効果的な細胞傷害性応答を開始し、かつヒトＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞及び免疫抑制性マクロファージを枯渇させることができる。ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の観察された効果は、ミエロイドに焦点を当てた癌免疫療法の開発に向けた重要なマイルストーンである。

【0058】

したがって、本発明の一態様によれば、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片が提供され、前記抗原認識ドメインは、
２３Ａ１０Ａ１０
３２Ｆ９Ｅ８
３８Ｃ１１Ｈ１１
４９Ａ１２Ｄ７
５８Ｂ２Ａ７
６０Ａ４Ｆ５
６０Ｈ４Ａ３
６１Ｂ１１Ｃ９
８０Ｅ３Ｈ１１
８３Ｅ１０Ｂ１２
５４Ｈ２Ｃ１
５４Ｈ２Ｃ１Ｂ
２３Ａ１０Ｂ１０
２３Ａ１０Ｂ１１
３８Ｃ１１Ｃ１０
６０Ａ４Ｅ１０
６０Ｈ４Ｇ２
８０Ｅ３Ｃ７
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0059】

ＴＲＥＭ２は、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、ミクログリア、単球、皮膚のランゲルハンス細胞、及びクッパー細胞を限定することなく含むミエロイド系統細胞上で主に発現される、免疫グロブリン様受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２は、ＤＡＰ１２と受容体－シグナル伝達複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２は、ＤＡＰ１２（ＩＴＡＭドメインアダプタータンパク質）を通じてリン酸化及びシグナル伝達を行う。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２シグナル伝達は、ＰＩ３Ｋの下流の活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２シグナル伝達は、脾臓チロシンキナーゼ（ｓｔｋ）の下流のリン酸化をもたらす。

【0060】

本開示のＴＲＥＭ２タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＣ２）、マウスＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＮＨ８）、ラットＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｄ３ＺＺ８９）、アカゲザルＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｆ６ＱＶＦ２）、ウシＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０５Ｂ５９）、ウマＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｆ７Ｄ６Ｌ０）、ブタＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｈ２ＥＺＺ３）、及びイヌＴＲＥＭ２タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｅ２ＲＰ４６）を含むがこれらに限定されない、哺乳動物ＴＲＥＭ２タンパク質を限定することなく含む。

【0061】

例示的なヒトＴＲＥＭ２アミノ酸配列は、配列番号１として後に示す。

【0062】

いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２は、シグナルペプチドを含むプレタンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２は、成熟タンパク質である。いくつかの実施形態では、成熟ＴＲＥＭ２タンパク質は、シグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、成熟ＴＲＥＭ２タンパク質は，細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２は、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）のアミノ酸残基１～１８に位置するシグナルペプチド、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）のアミノ酸残基２９～１１２に位置する細胞外免疫グロブリン様可変型（ＩｇＶ）ドメイン、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）のアミノ酸残基１１３～１７４に位置する追加の細胞外配列、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）のアミノ酸残基１７５～１９５に位置する膜貫通ドメイン、及びヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）のアミノ酸残基１９６～２３０に位置する細胞内ドメインを含有する。具体的な実施形態によれば、ＴＲＥＭ２は、ヒトＴＲＥＭ２である。

【0063】

具体的な実施形態によれば、抗原認識ドメインは、抗体５４Ｈ２Ｃの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0064】

具体的な実施形態によれば、抗原認識ドメインは、抗体８０Ｅ３Ｃ７（「Ｅ３Ｃ７」とも称される）の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0065】

具体的な実施形態によれば、抗体または抗体断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨髄由来マクロファージにおいてＴＲＥＭ２を阻害して活性化マクロファージを生じさせることができ、これはＴＲＥＭ２ノックアウトに典型的である。

【0066】

換言すれば、抗体または抗体断片または二重特異性抗体は、ＴＲＥＭ２に対する阻害性抗体である。これは、インキュベーション後の表現型がＴＲＥＭ２ノックアウト細胞と類似していることから説明され得る（実施例の項を参照されたい）。

【0067】

具体的には、本発明者らは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）が多量のＴＲＥＭ２を発現することを見出した。本発明のいくつかの実施形態の抗体は、ＴＲＥＭ２－ＢＭＤＭにも結合する。

【0068】

ＢＭＤＭは、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βなどの抑制性サイトカインを高レベルで産生することが公知である。ＢＭＤＭの抗体が経時的成熟経過に及ぼす効果は、単一細胞ＲＮＡ配列を使用して決定され得る。効果は活性化後２～７日で見ることができる。その効果は、典型的にはＭ１表現型の獲得である。したがって、以下の実施例の項に見ることができるように、野性型ｈＴＲＥＭ２ ＢＭ細胞は、７日目にＧｐｎｍｂ、Ｌｐｌ、Ａｎｘａ１、Ｍｍｐ１２、Ａｄａｍ８、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、Ｓｐｐ１、及びＬｉｌｒｂ４ａの高発現を伴うＭ２表現型を示す一方で、ＴＲＥＭ２－ＫＯ ＢＭ遺伝子型の細胞は、Ｓｅｌｅｎｏｐ、Ｍｓ４ａ４ａ、Ｆｃｇｒ２ｂ、Ｍｓ４ａ７、及びＬｙｚ２を含む活性化Ｍ１表現型を呈した（図８のＡ～Ｂ）。ＴＲＥＭ２に対する拮抗活性を有する抗体をスクリーニングするために、培養２日目及び５日目に、Ｍ－ＣＳＦ及び抗ｈＴＲＥＭ２抗体またはＩｇＧアイソタイプとともにｈＴＲＥＭ２マウス骨髄細胞を培地に培養する。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、各条件でのＭ２表現型（ＴＲＥＭ２＋Ｇｐｎｍｂ＋）とＭ１表現型（ＴＲＥＭ２－）の間の細胞分布について、７日目の細胞を特徴付け、かつ定量する。

【0069】

図８のＣに見ることができるように、ＴＲＥＭ２－ＫＯ細胞の７０％超がＭ１表現型に達し、１０％未満がＭ２表現型を示したのとは対照的に、ｈＴＲＥＭ２細胞は、４０％がＭ２表現型を示し、わずか２４％がＭ１表現型を示した。培養物にＩｇＧアイソタイプｍＡｂを添加すると、Ｍ１／Ｍ２比は著しく変化せず、未処理培養物と類似した結果が示されたが、抗ｈＴＲＥＭ２ ｍＡｂ ５４Ｈ２Ｃ１または８０Ｅ３Ｃ７を添加すると、Ｍ２表現型のパーセンテージがそれぞれ１２％及び１６％へと劇的に低減し、Ｍ１表現型は６９％及び６３％に増加し（図８のＣ）、ＴＲＥＭ２－ＫＯ細胞と極めて類似した成熟経過が示された。

【0070】

本明細書で使用される場合、「Ｍ１マクロファージ」は、Ｓｅｌｅｎｏｐ、Ｍｓ４ａ４ａ、Ｆｃｇｒ２ｂ、Ｍｓ４ａ７、及びＬｙｚ２を発現するマクロファージである。

【0071】

本明細書で使用される場合、「Ｍ２マクロファージ」は、Ｇｐｎｍｂ、Ｌｐｌ、Ａｎｘａ１、Ｍｍｐ１２、Ａｄａｍ８、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、Ｓｐｐ１、及びＬｉｌｒｂ４ａを発現するマクロファージである。

【0072】

追加的または代替的態様によれば、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（Ｇｐｎｍｂ）に結合可能な抗原認識ドメインを含む抗体またはその断片が提供され、前記抗原認識ドメインは、
ｇ１－ｇ２
ｇ２－ｂ６
ｇ３－ｇ２
ｇ４－ｂ４
ｇ５－ｇ２
ｇ８－ｇ２
ｇ９－ｂ４
ｂ１－ｂ２
ｂ８－ｂ８
ｂ１０－ｂ９
ｂ１１－ｇ２
ｂ１２－ｙ８
ｂ１３－ｂ７
ｂ１５－ｂ７
ｂ１７－ｂ１７
ｂ１８－ｂ１９
ｂ２－ｂ２
ｂ２０－ｂ２１
ｂ２１－ｙ８
ｂ２２－ｂ２３
ｂ２４－ｂ２６
ｂ２５－ｂ２６
ｙ３－ｙ２２
ｙ４－ｙ３
ｙ５－ｙ５
ｙ９－ｙ６
ｙ１２－ｂ４
ｙ２０－ｙ１９
ｙ２３－ｙ２０
ｙ２５－ｙ２１
ｙ２７－ｙ２２
からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３または重鎖及び軽鎖を含む。

【0073】

以下の表Ａ及びＢには、各抗体の配列の配列番号が列挙されている。各抗体は、個々の実施形態と見なされるべきである。

【0074】

【表1-1】

【0075】

【表1-2】

【0076】

【表1-3】

【0077】

【表1-4】

【0078】

【表1-5】

【0079】

【表1-6】

【0080】

【表1-7】

【0081】

【表1-8】

【0082】

【表1-9】

【0083】

【表1-10】

【0084】

【表1-11】

【0085】

【表1-12】

【0086】

膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）は、ヒトではＧＰＮＭＢ遺伝子によってコードされるＩＡ型細胞表面糖タンパク質である。ヒトにおいて、この遺伝子については５６０及び５７２アミノ酸アイソフォームをコードする２つの転写バリアントが特徴付けられている。４７０ａａ長の断片は、マウスの免疫に使用される細胞外ドメインである。ＧＰＮＭＢのマウス及びラットのオルソログは、それぞれＤＣ－ＨＩＬ及びオステオアクチビンとして知られている。例示的なＧＰＮＭＢは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。

【0087】

具体的な実施形態によれば、Ｇｐｎｍｂは、ヒトＧｐｎｍｂ（配列番号２）である。

【0088】

具体的な実施形態によれば、抗体、その断片、または二重特異性抗体は、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化することができる。

【0089】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体及び共刺激分子（ＣＤ２８またはＩＣＯＳなど）が、ＡＰＣ上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩＩ）ペプチド及び共刺激分子によって同時に係合されることを通じて起こる。効果的な免疫応答の産生には両方とも必要であり、共刺激の不在下では、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が単独でアネルギーをもたらす。共刺激分子の下流のシグナル伝達経路は、通常、ＰＩ３Ｋ経路に関与し、ＰＩ３Ｋ経路は、形質膜においてＰＩＰ３を生成し、ＰＫＣ－θの活性化及び最終的なＩＬ－２産生に不可欠であるＰＤＫ１などのシグナル伝達分子を含有するＰＨドメインを動員する。最適なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ４^＋シグナル伝達に依存する。ＣＤ４^＋細胞は、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞の初期抗原活性化、及び急性感染後のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の維持に有用である。したがって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の作用に有益であり得る。

【0090】

具体的な実施形態によれば、抗体は、ＴＲＥＭ２に結合することができ、かつ好ましくはマクロファージの活性化により立証されるようにＴＲＥＭ２の活性を阻害することができる限り、ＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖のＣＤＲと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む上記表Ａの抗体のいずれかのホモログである。

【0091】

具体的な実施形態によれば、抗体は、Ｇｐｎｍｂに結合することができ、かつ好ましくはＣＤ４ Ｔ細胞の活性化により立証されるようにＧｐｎｍｂの活性を阻害することができる限り、ＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖のＣＤＲと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む上記表Ｂの抗体のいずれかのホモログである。

【0092】

本明細書で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」には、アラインメントされたときに同じである２つの配列内の残基への言及が含まれる。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一ではない残基位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換により異なることが認識されており、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため分子の機能的特性が変化しない。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。かかる保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると見なされる。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。典型的には、これには保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコア付けすることが伴うため、配列同一性のパーセンテージが増加する。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコアが付与され、非保存的置換にスコア０が付与される場合、保存的置換には０との間のスコアが付与される。保存的置換のスコア付けは、例えば、Henikoff S and Henikoff JG. [Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 992, 89(22): 095-9]のアルゴリズムに従って算出される。

【0093】

同一性（例えば相同性パーセント）は、デフォルトパラメータを使用するなどして、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮまたはＢｌａｓｔＰソフトウェアを含む任意の相同性比較ソフトウェアを使用して決定され得る。

【0094】

「少なくとも９０％の同一性」に言及する場合、特許請求された発明は、少なくとも９％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または００％の同一性も指し、各々が異なる実施形態を表す。

【0095】

具体的な実施形態によれば、同一性のレベルは、本願に記載のとおりに決定されるように、配列全体（本願に記載のＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖のいずれか）にわたって少なくとも９０％である。

【0096】

具体的な実施形態によれば、同一性のレベルは、本願に記載の表ＡまたはＢの抗体のＣＤＲ配列の少なくとも１つ（または少なくとも２、３、４または５つ）にわたって、少なくとも９０％、９％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。

【0097】

ヒト抗体の例示的なＣＤＲ配列ならびに完全な軽鎖及び重鎖は、上記の表ＡまたはＢに提供されている。

【0098】

本発明において使用される「抗体」という用語は、インタクト分子、ならびにそれらの機能的断片、例えば、抗原のエピトープに対するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単一ドメイン分子、例えばＶＨ及びＶＬを含む。これらの機能的抗体断片は次のとおりに定義される：（１）抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖及び１本の重鎖の一部分を生じさせることにより産生され得るＦａｂ、（２）抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元させ、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部分を生じさせることにより得ることができる抗体分子の断片であるＦａｂ’、１抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる、（３）抗体全体を酵素ペプシンで処理し、後続の還元を行わずに得ることができる抗体の断片である（Ｆａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって互いに保持された２つのＦａｂ’断片の二量体である、（４）２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片として定義されるＦｖ、（５）遺伝的に融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されている、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された分子である一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、ならびに（６）単一ドメイン抗体は、抗原に対する十分な親和性を示す単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで構成される。

【0099】

特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0100】

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ならびにそれらの断片を産生させる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に援用されるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988及び以下の実施例の項を参照されたい）。

【0101】

本発明による抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡのE. coliもしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物もしくは他のタンパク質発現系）での発現によって調製され得る。抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓ断片を提供するために、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生され得る。この断片は、３．５ＳのＦａｂ’一価断片を産生するために、チオール還元剤、及び任意選択的に、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用してさらに切断され得る。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ’断片及び１つのＦｃ断片が直接産生される。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号明細書及び同第４，３３１，６４７号明細書ならびにその中に含まれる参照文献に記載されており、これらの特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。Porter, R. R.［Biochem. J. 73: 119-126 (1959)］も参照されたい。インタクト抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖を分離して一価の軽鎖－重鎖断片を形成すること、断片をさらに切断すること、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技法が使用され得る。

【0102】

Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との会合で構成される。Inbar et al.［Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720］に記載されているように、この会合は非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結され得るか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、その後発現ベクターはE. coliなどの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを産生させるための方法は、例えば、Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991)、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)、及び全体が参照により本明細書に援用される米国特許第４，９４６，７７８号明細書によって記載されている。

【0103】

抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。かかる遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。例えば、Larrick and Fry［Methods, 2: 106-10 (1991)］を参照されたい。

【0104】

非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)、及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。

【0105】

非ヒト抗体をヒト化させるための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、典型的にはインポート可変ドメインから採られる。ヒト化は、基本的に、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、Winter及び共同研究者らの方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従って実施され得る。したがって、かかるヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも大幅に小さいものが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の近似部位由来の残基によって置換された、ヒト抗体である。

【0106】

ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む当該技術分野で公知の種々の技法を使用して産生され得る［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］。Cole et al.及びBoerner et al.の技法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されたマウスに導入することにより作製され得る。曝露させると、ヒト抗体の産生が観察され、これは遺伝子の再構成、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含めてあらゆる点でヒトにおいて見られるものとよく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、及び以下の科学刊行物：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)、Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368 812-13 (1994)、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)、及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)に記載されている。

【0107】

一実施形態によれば、抗体は、単一特異性抗体である。

【0108】

一実施形態によれば、抗体は、２つの異なる抗原であるＴＲＥＭ２及びＧｐｎｍｂを認識する二重特異性抗体、多バリアント（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｎｔ）抗体、またはキメラ抗体である。

【0109】

本発明の「二重特異性抗体」は、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合するように、２つの異なる抗原結合部位を有する。かかる抗体は、２つの異なる抗原基を認識する２つの別々の抗体もしくは抗体断片の一部を組み合わせることにより、または２つの特異性を含むように単一の抗体分子を修飾することにより生成され得る（上で詳細に論じたとおり）。

【0110】

一実施形態によれば、二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。

【0111】

一実施形態によれば、二重特異性抗体は、抗体の構造ループ領域（例えば、重鎖のＣＨ３領域）に抗原認識ドメインを含む。したがって、二重特異性抗体は、「Ｆｃａｂ」と呼ばれる抗体のＦｃ領域を含む抗体断片を含み得る。かかる抗体断片は、典型的には抗体のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃａｂは、抗体の構造ループ領域、すなわち重鎖のＣＨ３領域に少なくとも１つの修飾を含むように操作されている。かかる抗体断片は、例えば次のとおりに生成され得る：少なくとも１つの構造ループ領域（例えばＦｃ領域）を含む抗体をコードする核酸を提供し、少なくとも１つの構造ループ領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾し、修飾核酸を発現系に移入し、修飾抗体を発現させ、発現された修飾抗体をエピトープと接触させ、修飾抗体がエピトープに結合するか否かを決定する。例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第９，０４５，５２８号明細書及び同第９，１３３，２７４号明細書を参照されたい。

【0112】

より高い結合価（すなわち、３つ以上の抗原に結合する能力）を有する抗体も調製することができ、それらは多重特異性抗体と称される。

【0113】

具体的な実施形態によれば、二重特異性抗体は、その少なくとも一方のアームに、上記の抗体のいずれか１つの抗原認識ドメイン、または具体的には表ＡもしくはＢの抗体のＣＤＲ中のものを含む。

【0114】

具体的な実施形態によれば、抗体は、その一方のアームに抗ＴＲＥＭ２抗体を含み、もう一方のアームに抗Ｇｐｍｎｂ抗体を含む。

【0115】

具体的な実施形態によれば、抗体は、その一方のアームに本願に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体を含み、もう一方のアームに本願に記載の抗Ｇｐｍｎｂ抗体を含む。

【0116】

本発明のいくつかの実施形態の多重特異性抗体を産生させるために、当該技術分野で周知のとおり、本発明の部分をＦｃ領域、例えばＣＨ３ドメイン（ｋａｂａｔに準拠）において修飾することができる。かかる修飾により、多重特異性抗体が重鎖を介して確実に正しくアセンブリされる。

【0117】

したがって、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、その結果、多重特異性抗体内における他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に接する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、側鎖体積がより大きいアミノ酸残基で置き換えられることにより一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起が生成され、この突起が他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞内に位置することができ、かつ他方の重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、その結果、三価の二重特異性抗体内における第１のＣＨ３ドメインの元の界面に接する第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、側鎖体積がより小さいアミノ酸残基で置き換えられることにより第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞が生成され、その中に第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起が位置することができる（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社による「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」アプローチとしても知られている）。

【0118】

具体的な実施形態によれば、側鎖体積がより大きいアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。

【0119】

具体的な実施形態によれば、側鎖体積がより小さいアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択される。

【0120】

具体的な実施形態によれば、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによりさらに改変される。

【0121】

具体的な実施形態では、二重特異性は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ変異またはＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、使用することができる（Merchant, A. M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。したがって、別の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ変異、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＥ３５６Ｃ変異、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含むか、または二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ変異、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ変異、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（一方のＣＨ３ドメイン内の追加のＹ３４９Ｃ変異と他方のＣＨ３ドメイン内の追加のＥ３５６Ｃ変異またはＳ３５４Ｃ変異とが鎖間ジスルフィド架橋を形成している）（付番は常にＫａｂａｔのＥＵインデックスに準拠する）。但し、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている他のｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ技術も、代替的にまたは追加的に使用され得る。二重特異性抗体の具体例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ変異、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ変異、Ｅ３５７Ｋ変異である（付番は常にＫａｂａｔのＥＵインデックスに準拠する）。

【0122】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ変異、Ｋ３７０Ｅ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ変異、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む。

【0123】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ変異、Ｔ３６６Ｗ変異、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ変異、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含むか、または二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ変異、Ｔ３６６Ｗ変異、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ変異、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ変異、Ｋ３７０Ｅ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ変異、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む。

【0124】

具体的な実施形態によれば、第１のｍＡｂ（例えば抗ＴＲＥＭ２）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、第２のｍＡｂ（例えば抗Ｇｐｎｍｂ）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗが導入される（Merchant et al.,1998、Ridgway et al., 1996）。

【0125】

代替的にまたは加えて、正しい重鎖－軽鎖対形成のために、部分の少なくとも１つをＣｒｏｓｓＭａｂ形式（ＣＨ１－ＣＬスワッピング）で発現させることができる。

【0126】

ＣｒｏｓｓＭａｂ技術の基礎は、正しい鎖会合を可能にする二重特異性ＩｇＧ抗体の一方のアーム内での抗体ドメインのクロスオーバーであり、他方、重鎖の正しいヘテロ二量体化は、上記のｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ技術または電荷相互作用によって達成され得る。これは、Ｆａｂ断片内の異なるドメインを交換することにより達成され得る。Ｆａｂ断片内のＦａｂドメイン（ＣｒｏｓｓＭａｂ^Ｆａｂ形式における）、または可変ＶＨ－ＶＬドメインのみ（ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ－ＶＬ}形式）、または定常ＣＨ１－ＣＬドメイン（ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１－ＣＬ}形式）のいずれかが、この目的のために交換され得る。実際、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１－ＣＬ}形式の場合、それぞれの元の軽鎖及び新規のＶＬ－ＣＨ１軽鎖は、それぞれの元の重鎖及びＶＨ－ＣＬ含有重鎖との望ましくない相互作用を生じさせず、理論上、副産物は形成され得ない。対照的に、ＣｒｏｓｓＭａｂ^Ｆａｂフォーマットの場合、非機能性一価抗体（ＭｏＡｂ）及び非機能性Ｆａｂ断片が形成される可能性がある。これらの副産物はクロマトグラフィー技法によって除去され得る。ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ－ＶＬ}フォーマットの場合、ベンス－ジョーンズタンパク質で知られているＶＬ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬドメインの会合による望ましくない副産物が、ＶＬ－ＣＨ１含有重鎖と元の未修飾ＶＬ－ＣＬ軽鎖との間に発生し得る。野生型抗体フレームワーク内の既存の保存された電荷対に基づいて、反発する電荷対を野生型非交差Ｆａｂ断片の定常ＣＨ１及びＣＬドメインに導入することで、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ－ＶＬ＋／－}形式におけるこのベンス－ジョーンズ様副産物の形成を克服することができる。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術のさらなる詳細は、Klein et al. Methods 154, 1 February 2019, Pages 21-31cに見出すことができる。

【0127】

あるいは、本願に記載の多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体は、当該技術分野で公知の方法を使用して部分を接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）することにより調製され得る。例えば、多重特異性抗体の各部分を別々に生成し、次いで互いに接合させることができる。多様なカップリング剤または架橋剤が共有結合性接合に使用され得る。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686、Liu, M A et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:8648を参照されたい）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132、Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)、及びGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されているものが含まれる。好ましい接合剤は、ＳＡＴＡ及びスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（イリノイ州、ロックフォード）から入手可能である。

【0128】

代替的にまたは加えて、多重特異性抗体の各部分の接合は、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して行われ得る。具体的な実施形態では、ヒンジ領域は、接合前に、奇数の、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾される。

【0129】

本発明の一態様によれば、抗体を産生させる方法が提供され、本方法は、（ａ）本願に記載の抗体をコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させること、及び任意選択的に、（ｂ）宿主細胞から抗体を回収すること、を含む。

【0130】

したがって、本発明のいくつかの実施形態の抗体をコードするポリヌクレオチドは、使用される発現系に従って選択される発現構築物にクローニングされる。例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号６～２３、４２～５９、１８６～２１６、２４８～２７８に示されている。

【0131】

多様な原核細胞または真核細胞が、本発明のいくつかの実施形態の抗体を発現させるための宿主発現系として使用され得る。これらには、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した植物細胞系またはコード配列を含有するＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系も、本発明のいくつかの実施形態の抗体の発現に使用され得る。

【0132】

哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ、ｐＮＭＴ４、ｐＮＭＴ８、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、及びｐＢＫ－ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能であるｐＴＲＥＳ、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施形態によれば、使用されるベクターは、軽鎖及び重鎖についてそれぞれｐＦＵＳＥ２－ＣＬＩｇ－ｍｋ、ｐＦＵＳＥ２－ＣＨＩｇ－ｍＧ１である。具体的な実施形態によれば、抗体は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で一過性に発現される。

【0133】

レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターも使用され得る。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルス由来のベクターには、ｐＢＶ－ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバーウイルス由来のベクターには、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。

【0134】

細菌構築物の例には、E. coli発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれる［Studier et al. (990) Methods in Enzymol. 85:60-89］。

【0135】

酵母においては、米国特許出願公開第５，９３２，４４７号明細書に開示されているように、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有する多数のベクターが使用され得る。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターも使用され得る。

【0136】

植物発現ベクターが使用される場合、コード配列の発現は、多数のプロモーターによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター及び９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Brisson et al. (984) Nature 30:5-54］またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Takamatsu et al. (987) EMBO J. 6:307-3］が使用され得る。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター［Coruzzi et al. (984) EMBO J. 3:-680及びBrogli et al., (984) Science 224:838-843］または熱ショックプロモーター、例えば大豆ｈｓｐ７．５－Ｅもしくはｈｓｐ７．３－Ｂ［Gurley et al. (986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565］が使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び当業者に周知の他の技法を使用して植物細胞に導入され得る。例えば、Weissbach & Weissbach, 988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 42-463を参照されたい。

【0137】

当該技術分野で周知であり、以降にさらに説明される昆虫及び哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系も、本発明のいくつかの実施形態によって使用され得る。

【0138】

抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ系、例えば哺乳動物、例えばヤギ、ウサギなどにおいても産生され得ることが理解されよう。

【0139】

組換え抗体の回収は、適切な（培養）時間の後に行われる。「抗体を回収する」という語句は、抗体を含有する発酵培地全体を回収することを指し、分離または精製の追加的工程を含意する必要はない。上記にもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態の抗体は、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及び差次的可溶化などの多様な標準的タンパク質精製技法を使用して精製され得る。

【0140】

抗体が得られたら、上記のように活性についてそれらを試験することができる。

【0141】

いくつかの実施形態では、本願に記載の抗体は、エフェクター機能を媒介する能力を改善するための修飾を含む。かかる修飾は、当該技術分野で公知であり、アフコシル化、または活性化受容体に対する（主にＡＤＣＣの場合はＦＣＧＲ３ａ、ＣＤＣの場合はＣ１ｑに対する）Ｆｃの親和性の操作を含む。米国特許第１０，４２８，１４３号明細書の表Ｂには、エフェクター機能操作について文献中に報告されている種々の設計が要約されている。

【0142】

アミノ酸配列を改変することなく、Ｆｃグリコシル化部位（ＥＵ付番でのＡｓｎ２９７）にフコースをほとんどまたは全く含まない抗体を産生させる方法は、当該技術分野で周知である。ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ社）は、フコース生合成の細胞経路を逸らす酵素の遺伝子を、抗体産生に使用される細胞に導入することに基づくものである。これにより、抗体産生細胞によるＮ結合型抗体の炭水化物部への糖「フコース」の付加が防止される（von Horsten et al. (2010) Glycobiology. 2010 December；20 (12): 1607-18）。フコシル化レベルが低下した抗体を得るための別のアプローチは、抗体産生用の細胞株を抗体のフコシル化レベルを低下させる能力に基づいて選択することを教示している米国特許第８，４０９，５７２号明細書に見出すことができる。抗体は、完全にアフコシル化することができ（検出可能なフコースを抗体が含有しないことを意味する）、または部分的にアフコシル化することができ、これは、単離された抗体が、哺乳動物発現系によって産生される類似の抗体で通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満を含有することを意味する。

【0143】

別の具体的な実施形態によれば、抗体は、エフェクター機能が無効であるまたはエフェクター機能を有さない、Ｆｃドメインを有する。ヒト抗体のＩｇＧ１アイソフォームは、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性をほとんどまたは全く有さないことが当該技術分野で公知である。

【0144】

但し、他のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４も企図される。

【0145】

抗体は、可溶性であっても不溶性であってもよい。

【0146】

不溶性抗体は、粒子（合成もしくは非合成、例えばリポソーム）または細胞（例えば、抗体が典型的にはｓｃＦｖ断片としてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部である、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の一部であり得る。

【0147】

したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発するために使用され得る。ＣＡＲは、標的細胞（例えば、ＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞）の認識及び死滅を推進する、免疫細胞上に発現される膜貫通受容体である。ＣＡＲは、典型的には３つの基本部を含む。これらには、外部ドメイン（認識ドメインとしても知られる）、膜貫通ドメイン、及び細胞内（シグナル伝達）ドメインが含まれる。外部ドメインは、標的細胞上の細胞抗原への結合を推進し、一方細胞内ドメインは、典型的には結合した標的細胞の死滅を促進するための細胞シグナル伝達機能を含む。さらに、それらは、本願に記載の抗体可変ドメインまたはそれらの断片のうちの１つ以上を有する細胞外ドメインを有し得る。本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部も含む。ＣＡＲは、抗体、抗体可変ドメイン、及び／または抗体ＣＤＲの１つ以上のセグメントを含むように設計することができ、その結果、かかるＣＡＲが免疫エフェクター細胞上で発現されるとき、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲの抗体の一部分によって認識される任意の細胞に結合し、それを除去する。

【0148】

ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、ＭＨＣ非拘束性に、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性をリダイレクトする能力が含まれる。ＭＨＣ非拘束性の抗原認識により、抗原プロセシングとは独立して抗原を認識する能力がＣＡＲ発現Ｔ細胞に付与されるため、腫瘍回避の主な機構がすり抜けられる。さらにＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現される場合、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。

【0149】

本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍を標的とするように操作されたＣＡＲは、ＴＲＥＭ２に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、これらのＣＡＲの外部ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインまたはその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現され、「ＣＡＲ操作Ｔ細胞」または「ＣＡＲ－Ｔ」と称される場合がある。ＣＡＲ－Ｔは、１つ以上の抗体可変ドメインを有するＣＡＲ外部ドメインを用いて操作され得る。

【0150】

したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本発明の抗体配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＲＥＭ２を発現するミエロイド細胞などの標的細胞の認識及び死滅を、（例えば、ＴＲＥＭ２発現ＨＥＫ２９３細胞、ヒト化ＴＲＥＭ２骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭａｃ）系列について例証されているように）推進する、免疫細胞上に発現される膜貫通受容体である。

【0151】

本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば図２３を参照されたい）は、実施例に記載されているような周知の技法によって生成され得る。本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を死滅させるのに使用され得る。したがって、本発明は、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を死滅させる方法であって、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を含む細胞集団を、本発明のＣＡＲを含む免疫細胞、好ましくはＴ細胞と接触させることを含み、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞が死滅する、方法を包含する。

【0152】

一実施形態では、接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。

【0153】

したがって、例えば、免疫エフェクター細胞をそれを必要とする対象から回収した後、開示されたＣＡＲを発現するように細胞を遺伝子操作することができる。その後、遺伝子操作細胞を対象へと注入し戻すことができる。

【0154】

開示されたＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、単独で、あるいは希釈剤及び／またはＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで使用または投与され得る。これらの構成成分は、タンパク質構成要素として添加され得るか、または例えば開示されたサイトカインを発現するようにＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を遺伝子操作することにより、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞によって発現され得る。

【0155】

医薬組成物は、本願に記載のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を、１種以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。

【0156】

いくつかの実施形態では、開示された方法で使用するための組成物は、静脈内投与用に製剤化される。医薬組成物は、ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を死滅させるのに適切な任意の方法で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態及び患者の疾患の重症度などの要因により決定されるが、適切な投与量は臨床試験により決定される場合がある。

【0157】

種々の実施形態では、治療量のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞が患者に投与される。「治療量」は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師により決定され得る。本願に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、例えば１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技法を使用することにより投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジームは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することにより医学分野の当業者によって容易に決定され得る。必要な場合に抗体の細胞傷害活性または治療活性を増加させることも、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の概念の使用などにより達成することができる。かかる構成において、抗体は、その毒性を増加させるかまたは抗体を検出可能にするために使用され得る異種エフェクター部分へと付着される。

【0158】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）治療用途のために開発され得る。ＡＤＣは、１つ以上のカーゴ（例えば治療剤）が、［例えば、直接またはリンカー（例えば、切断可能リンカーまたは非切断型リンカー）を介して］付着した抗体である。ＡＤＣは、１つ以上の標的細胞または標的組織への治療剤（例えば、薬物または細胞傷害性剤）の送達に有用である（Panowski, S. et al., 204. mAbs 6:, 34-45）。場合によっては、ＡＤＣは、標的細胞上の表面抗原に結合するように設計され得る。結合すると、抗体－抗原複合体全体が内部移行され、細胞リソソームへと誘導され得る。次いで、ＡＤＣが分解され、結合されたカーゴが放出され得る。

【0159】

治療剤は、小分子薬、タンパク質性薬剤（例えば、サイトカインまたはケモカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはＩＬ１２）、核酸剤、放射性同位体、及び炭水化物などであり得る。これらは、細胞傷害性剤、例えば化学療法薬として機能し得る。

【0160】

具体的な実施形態によれば、治療剤は、腫瘍に対する抗ウイルス免疫応答を誘発するためのウイルス抗原をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）である。ウイルス抗原の例には、ＣＭＶ抗原、ＥＢＶ抗原、コロナウイルス抗原などが含まれるが、これらに限定されない。

【0161】

本明細書で使用される場合、「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止する、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。

【0162】

カーゴが細胞傷害性剤である場合、標的細胞は死滅するかまたはそうでなければ無力化される。細胞傷害性剤には、細胞骨格阻害剤［例えば、チューブリン重合阻害剤及びキネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤］、ＤＮＡ損傷剤（例えば、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、及びピロロベンゾジアゼピン二量体、例えばタリリン及びテシリン）、トポイソメラーゼ阻害剤［例えば、７－エチル－０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ－３８）及びエキサテカン誘導体ＤＸｄなどのカンプトテシン化合物または誘導体］、転写阻害剤（例えば、アマニチンなどのＲＮＡポリメラーゼ阻害剤）、ならびにキナーゼ阻害剤［例えば、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤］が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0163】

チューブリン重合阻害剤には、メイタンシン（例えば、エムタンシン［ＤＭ］及びラブタンシン［ＤＭ４］）、アウリスタチン、ツブリシン、ならびにビンカアルカロイドまたはそれらの誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない。例示的なアウリスタチンには、アウリスタチンＥ（ドラスタチン－０の誘導体としても知られる）、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＦ、及びドラスタチンが含まれる。例示的なツブリシン化合物には、天然に存在するツブリシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｕ、及びＶ、ならびにプレツブリシンＤ（ＰＴｂ－Ｄ４３）及びＮ_４－デスアセトキシツブリシンＨ（Ｔｂｌ）などのツブリシン類似体が含まれる。例示的なビンカアルカロイドには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びナベルビン（ビノレルビン）が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤には、アウリスタチン誘導体［例えば、－アミノプロパン－２－イル－アウリスタチンＦ、アウリスタチンＦ－ヒドロキシプロピルアミド、アウリスタチンＦ－プロピルアミド、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）］；ツブリシン誘導体；ビンカアルカロイド誘導体［例えば、Ｎ－（３－ヒドロキシプロピル）ビンデシン（ＨＰＶ）］、ならびに米国特許第８，５２４，２４号明細書、同８，６８５，３８３号明細書、同８，８０８，９号明細書、及び同９，２５４，３３９号明細書、米国特許出願公開第２０５０３４００８号明細書、同第２０６０２２０６９６号明細書、及び同第２０６００２２８２９号明細書に記載されているもののいずれか（その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）が含まれ得る。

【0164】

この用語は、放射性同位体（例えば、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、及び^１７７Ｌｕを含むＬｕの放射性同位体、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^２２５Ａｃ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^６５Ｚｎ、^４８Ｖ、^２０３Ｐｂ、^２０９Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^１６６Ｈｏ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^２０１Ｔｌ、^１８８Ｒｅ、^１８６Ｒｅ、及び^９９ｍＴｃ）、核酸分解酵素などの酵素及びそれらの断片、抗生物質、治療用ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡデコイ、アプタマー）、ＤＮＡザイム、ならびに細菌、真菌、植物、または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素、例えば、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、リシン毒素Ａ、アブリン、ゲロニン、サポリン、コレラ毒素Ａ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びアルファ－サルシン（それらの断片及び／またはバリアントを含む）も含むことを意図している。

【0165】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗体と治療剤とを接続する１つ以上のポリマー担体をさらに含み得る（例えば、抗体－ポリマー－薬物コンジュゲート）。本明細書で使用される場合、「ポリマー担体」という用語は、１つ以上の治療剤及び／または抗体へと共有結合的に付着され得るポリマーまたは修飾ポリマーを指す。ポリマー担体は、治療剤に追加の接合部位を提供し、薬物対抗体比を増加させ、ＡＤＣの治療効果を増強させ得る。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるポリマー担体は、水溶性及び／または生分解性であり得る。かかるポリマー担体には、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、ポリ（α－アミノ酸）［例えば、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、及びポリ（（Ｎ－ヒドロキシアルキル）グルタミン）］、炭水化物ポリマー［例えば、デキストリン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、及びポリシアル酸］、糖多糖類（ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（例えば、セルロース、アミロース、デキストラン、レバン、フコイダン、カラギナン（ｃａｒｒａｇｉｎａｎ）、イヌリン、ペクチン、アミロペクチン、グリコーゲン、及びリキセナン（ｌｉｘｅｎａｎ）などのホモ多糖；またはアガロース、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、アルギン酸、及びヘパリンなどのホモ多糖）、糖脂質、複合糖質、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリ（アクリル酸）、ポリケタール、及びポリアセタール［例えば、米国特許第５，８，５０号明細書、同第５，８６３，９９０号明細書、及び同第５，９５８，３９８号明細書（その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている、ＰＨＦまたはＦＬＥＸＩＭＥＲ（登録商標）としても知られるポリ（１－ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）］ならびにそれらの誘導体、デンドリマー、コポリマー、及び混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマー担体には、ポリアセタール／ポリケタールのコポリマー（例えばＰＨＦ）、及び親水性ポリマー、例えば、ポリアクリレート、ポリビニルポリマー、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリペプチド、ならびにそれらの誘導体が含まれ得る。

【0166】

いくつかの実施形態では、治療剤は、本発明の抗体へと直接またはリンカーを介して付着（例えば、共有結合）される。いくつかの実施形態では、治療剤はポリマー担体へと直接またはリンカーを介して付着され、ポリマー担体は抗体へと直接またはリンカーを介して付着される。いくつかの実施形態では、リンカーは、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ジグリコール酸、酒石酸、グルタミン酸、フマル酸、またはアスパラギン酸の部分（アミド、イミド、またはそれらの各々の環状イミド誘導体、及び各々が任意選択的に置換されているものを含む）を含み得る。例示的なリンカーには、米国特許第８，５２４，２４号明細書、同第８，６８５，３８３号明細書、同第８，８０８，９号明細書、同第９，２５４，３３９号明細書、及び／または同第９，５５５，２号明細書（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されているいずれかのものが含まれ得る。

【0167】

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーであり得る。切断可能リンカーは、ある特定の条件下（ｐＨ、温度の変化、もしくは還元など）で分解されて、または酵素（例えば、プロテアーゼ及びグルクロニダーゼ）によって切断されて、ＡＤＣから治療剤が放出され得る。かかるリンカーは、エステル結合、アミド結合、またはジスルフィド結合などの不安定な結合を含み得る。非限定的な切断可能リンカーには、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニットアミド、チオエーテル、オルトエステル、アセタール、またはケタール）；還元感受性リンカー［例えば、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）及びＮ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン、または２，５－ジオキソピロリジン－－イル４－（－（ピリジン－２－イルジスルファニル）エチル）ベンゾアート（ＳＭＰＴ）］；光感受性リンカー；ならびに酵素的に切断可能なリンカー［例えば、バリン－シトルリン、バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ｖｃ－ＰＡＢ）、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）などのペプチドリンカー、グルクロニド－ＭＡＢＣなどのグルクロニダーゼにより切断可能なリンカー、またはエステラーゼにより切断可能なリンカー］が含まれ得る。

【0168】

他の実施形態では、リンカーは、非切断型リンカーであり得る。非切断型リンカーは、切断可能リンカーと比較してＡＤＣの血漿安定性を増加させ得る。例示的な非切断型リンカーの例には、マレイミドアルカン及びマレイミドシクロヘキサン（ＭＣＣ）が含まれる。

【0169】

本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。例えば、治療剤は、抗体上の官能基と反応可能な官能基を含有するように修飾され得る。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、２つの官能基を反応させてコンジュゲートを形成させることにより調製され得る。場合によっては、ポリマー担体は、異なる化学的条件下で治療剤上の官能基及び抗体上の官能基と反応可能な官能基を含有するように修飾され得る。抗体、ポリマー担体、及び治療剤は、連続的化学反応を通じて抗体－ポリマー－薬物コンジュゲートを形成するように連結され得る。抗体への接合には、接合部位としてリジン残基またはシステイン残基が用いられ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、追加のリジン残基またはシステイン残基を有するように操作され得る。かかるアプローチは、抗体構造（例えば、鎖間ジスルフィド結合）の破壊を回避し、かつ抗体の安定性及び／または活性を維持することができる。

【0170】

代替的にまたは加えて、抗体の治療有効性を増加させるために種々の薬剤が使用され得る。例えば、抗体を、ＴＮＦファミリーまたはＩＬ１２の炎症性サイトカインなどの炎症性サイトカイン、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１１、ＩＬ－２１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び／またはＴＮＦαと組み合わせるなどである。

【0171】

具体的な実施形態によれば、サイトカインは、抗体に接合される。

【0172】

具体的な実施形態によれば、接合は、共有結合性である。

【0173】

具体的な実施形態によれば、コンジュゲートは、抗体がサイトカインに（本願に記載のとおり、リンカーの有無を問わず、その上流または下流に）翻訳融合されたキメラタンパク質である。

【0174】

具体的な実施形態によれば、サイトカインは、ＩＬ－２である。

【0175】

具体的な実施形態によれば、コンジュゲートは、配列番号４９６及び４９８または４９７及び４９９にに示されるものである。

【0176】

具体的な実施形態によれば、サイトカインは、ＩＬ－１５である。

【0177】

本発明は、本発明の抗体を用いてミエロイドリプログラミングを増強させる使用及び方法を包含する。

【0178】

一実施形態では、本発明は、本発明の抗体及びサイトカイン、例えば、ＴＮＦファミリー、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び／またはＴＮＦαから選択されるサイトカインとＴＲＥＭ２発現細胞集団を接触させることを含む、ミエロイドリプログラミングを増強させる方法を包含する。本方法は、ＴＲＥＭ２発現細胞集団のミエロイドリプログラミングを増強させ得る。実施例において詳述されるように、本方法は、抗体とサイトカインとの相乗効果をもたらし得る。

【0179】

本発明の抗体がサイトカイン、例えば、ＴＮＦファミリー、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１１、ＩＬ－２１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び／またはＴＮＦから選択されるサイトカインに翻訳融合されたキメラタンパク質は、実施例に記載されているような周知の技法により生成され得る。キメラタンパク質は、ミエロイドリプログラミングを増強させるために使用され得る。一実施形態では、本発明は、本発明のキメラタンパク質とＴＲＥＭ２発現細胞集団を接触させることを含む、ミエロイドリプログラミングを増強させる方法を包含する。実施例において詳述されるように、本方法は、キメラタンパク質の相乗効果をもたらし得る。

【0180】

本発明のいくつかの実施形態の抗体は、免疫調節活性を備えている。

【0181】

したがって、本発明の一態様によれば、ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させる方法が提供され、本方法は、有効量の本願に記載の抗体または抗体断片または二重特異性抗体とミエロイド細胞を接触させて、それによりミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることを含む。

【0182】

別の態様によれば、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する方法が提供され、本方法は、有効量の抗体またはその断片とＣＤ４ Ｔ細胞を接触させて、それによりＣＤ４ Ｔ細胞を活性化することを含む。

【0183】

一実施形態によれば、接触させることは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。

【0184】

別の実施形態によれば、接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。

【0185】

本明細書で使用される「ミエロイド細胞」という用語は、共通ミエロイド前駆細胞（ＣＭＰ）から生じる細胞を指す。一実施形態では、ミエロイド細胞は、骨髄芽球及びその娘型（例えば、好塩基球、好中球、好酸球、単球、及びマクロファージ）の系統から生じる細胞である。ミエロイド細胞のサブグループの１つは、免疫抑制因子ミエロイド細胞である。

【0186】

具体的な実施形態によれば、ミエロイド細胞は、本発明のいくつかの実施形態の抗体（ＴＲＥＭ２に対する）とインキュベートされるとＭ１表現型を獲得するＭ２マクロファージである。

【0187】

言及したように、抗体を、前記ミエロイド細胞の特異的な部分集団（ＴＲＥＭ２とＧｐｎｍｂの両方を発現するもの）の量及び／または活性を低減させるために、対象のミエロイド細胞と接触させる。

【0188】

一実施形態では、接触させることは、ｉｎ ｖｉｖｏで実行される。

【0189】

別の実施形態では、接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏで実行される。すなわち、ミエロイド細胞を対象から取り出し、その後薬剤と接触させる。

【0190】

ミエロイド細胞は、典型的には骨髄生検により対象から取り出される。Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）及びＧ－ＣＳＦなどの動員剤が、細胞を末梢へと動員するために使用され得る。

【0191】

本発明のこの態様の抗体は、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）と膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（Ｇｐｎｍｂ）の両方を発現するマクロファージの活性を特異的に増加させる。

【0192】

一実施形態では、抗体は、両方のマーカーを発現する細胞の活性を、マーカーの一方のみを発現する細胞（すなわち、ＴＲＥＭ２のみを発現しＧｐｎｍｂを発現しない細胞、またはその逆）と比較して少なくとも２倍増強させる（活性化マクロファージ）。別の実施形態では、抗体は、両方のマーカーを発現する細胞の活性を、マーカーの一方のみを発現する細胞（すなわち、ＴＲＥＭ２のみを発現しＧｐｎｍｂを発現しない細胞、またはその逆）と比較して少なくとも５倍増強させる。別の実施形態では、抗体は、両方のマーカーを発現する細胞の活性を、マーカーの一方のみを発現する細胞（すなわち、ＴＲＥＭ２のみを発現しＧｐｎｍｂを発現しない細胞、またはその逆）と比較して少なくとも１０倍増強させる。

【0193】

本願に記載の方法は、ミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させるために使用されることから、本発明者らは、本方法を癌の治療に使用することができると考えている。

【0194】

したがって、本発明の別の態様によれば、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、本方法は、有効量の本願に記載の抗体、抗体断片、それらの組み合わせ（抗ＴＲＥＭ２及び抗Ｇｐｎｍｂ）、または二重特異性抗体を対象に投与して、それにより癌を治療することを含む。

【0195】

別の態様によれば、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、本方法は、
（ａ）上記の方法に従ってミエロイド細胞の免疫抑制活性を低減させることであって、ミエロイド細胞が対象に由来するものである、低減させること、及びその後、
（ｂ）ミエロイド細胞を対象に移植して、それにより癌を治療すること、を含む。

【0196】

本明細書で使用される場合、「低減させること」は、抗体の存在下で、対照（陰性、例えば未処理細胞）試料と比較して免疫抑制活性が少なくとも１０％、２０％、３０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍低いことを指す。

【0197】

本明細書で使用される場合、「対象」は、癌と診断された哺乳動物、例えばヒトを指す。

【0198】

「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には無制御な悪性細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すかまたは説明する。

【0199】

本発明のいくつかの実施形態に従って分析及び治療することができる癌の例には、消化管の腫瘍（結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸腺腫、遺伝性非ポリポーシス１型、遺伝性非ポリポーシス２型、遺伝性非ポリポーシス３型、遺伝性非ポリポーシス６型；結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、遺伝性非ポリポーシス７型、小腸癌及び／または大腸癌、食道癌、食道癌を合併する掌蹠角化症（ｔｙｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、膵癌、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜癌、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺癌、前立腺腺癌、腎癌（例えば、ウィルムス腫瘍２型または１型）、肝癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ））、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、トロホブラスト腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣未熟奇形腫、子宮腫瘍、上皮性卵巣腫瘍、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、成人上皮性腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｄｕｌｔ ｔｕｍｏｒ）、卵巣癌、漿液性卵巣癌、卵巣性索腫瘍、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（例えば、乳管癌、浸潤性乳管内乳癌、散発性；乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌への易罹患性、４型乳癌、乳癌－１、乳癌－３；乳癌－卵巣癌）、扁平上皮癌（例えば、頭頸部におけるもの）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫）、神経膠腫、腺癌、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌、脳悪性腫瘍（腫瘍）、他の種々の癌腫（例えば、気管支原性大細胞癌、乳管癌、Ｅｈｒｌｉｃｈ－Ｌｅｔｔｒｅ腹水癌、類表皮癌、大細胞癌、ルイス肺癌、髄様癌、粘表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘細胞癌、有棘細胞癌、移行上皮癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、上衣芽腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド、リンパ芽球）、線維肉腫、巨細胞腫、グリア腫瘍、神経膠芽腫（例えば、多形神経膠芽腫、星状細胞腫）、神経膠腫肝細胞癌（ｇｌｉｏｍａ ｈｅｐａｔｏｍａ）、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞）、副腎腫、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、リンパ肉腫、黒色腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、髄芽腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽腫、神経組織グリア腫瘍、神経組織神経細胞腫瘍、神経鞘腫、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、オステオミエローマ（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨肉腫（例えば、ユーイング骨肉腫）、乳頭腫、移行細胞、褐色細胞腫、下垂体腫瘍（浸潤性）、形質細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、Ｊｅｎｓｅｎ肉腫、骨原性肉腫、細網肉腫）、シュワン腫、皮下腫瘍、奇形癌（例えば、多能性奇形癌）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫及び毛包上皮腫、胃癌、線維肉腫、多形神経膠芽腫；多発性グロムス腫瘍、リー・フラウメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ癌ファミリー症候群ＩＩ、男性胚細胞腫瘍、肥満細胞白血病、甲状腺髄様、多発性髄膜腫、内分泌腫瘍性粘液肉腫、家族性非クロム親和性傍神経節腫、毛母腫、乳頭状、家族性及び散発性、家族性ラブドイド素因症候群、ラブドイド腫瘍、軟部組織肉腫、ならびに神経膠芽腫を合併するターコット症候群が含まれるが、これらに限定されない。

【0200】

具体的な実施形態によれば、癌は、黒色腫である。

【0201】

具体的な実施形態によれば、癌は、固形腫瘍（肺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、及び乳癌）である。

【0202】

具体的な実施形態によれば、癌は、原発腫瘍である。

【0203】

具体的な実施形態によれば、癌は、転移性である。

【0204】

具体的な実施形態によれば、癌は、続発性腫瘍である。

【0205】

具体的な実施形態によれば、肺癌は、非小細胞肺癌である。

【0206】

具体的な実施形態によれば、肺癌は、小細胞肺癌である。

【0207】

具体的な実施形態によれば、肝癌は、肝細胞癌である。

【0208】

本発明の別の態様によれば、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、本方法は、治療有効量の
（ｉ）ＴＲＥＭ２の活性を下方制御する第１の抗原認識ドメイン、及び
（ｉｉ）Ｇｐｎｍｂの活性を特異的に下方制御する第２の抗原認識ドメインを対象に投与して、それにより癌を治療することを含む。

【0209】

一実施形態によれば、第１の抗原認識ドメインは、ミエロイド細胞上で発現されるＴＲＥＭ２に特異的に結合する。別の実施形態によれば、第２の抗原認識ドメインは、Ｇｐｎｍｂに特異的に結合する。「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ（ｓ））」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄ（ｓ） ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という語句は、結合分子に言及する場合、ＴＲＥＭ２またはＧｐｎｍｂなどの標的分子に対して、排他的または優勢的に、中程度のまたは高度の結合親和性を有する結合分子を指す。「特異的に結合する」という語句は、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団の存在下で標的タンパク質（ＴＲＥＭ２またはＧｐｎｍｂなど）の存在を決定する結合反応を指す。したがって、定められたアッセイ条件下では、指定された結合分子は特定の標的タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ２またはＧｐｎｍｂ）に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の構成成分には意味のある量で結合しない。かかる条件下で標的タンパク質に特異的に結合するには、特定の標的タンパク質に対する特異性で選択された結合分子が必要となる場合がある。多様なアッセイ形式が、特定の標的タンパク質と特異的に反応する結合分子を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、Ｂｉａｃｏｒｅ、及びウエスタンブロットが、ＴＲＥＭ２またはＧｐｎｍｂに特異的に結合する結合分子を同定するために使用され得る。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０倍超である。結合分子が抗体であると仮定すると、「特異的に結合する」という語句は、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団における抗原（ＴＲＥＭ２またはＧｐｎｍｂなど）の存在を決定する結合反応を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する薬剤は、少なくとも約１×１０^－６～１×１０^－７、もしくは約１×１０^－８～１×１０^－９Ｍ、もしくは約１×１０^－１０～１×１０^－１１以上の解離定数（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する、及び／または所定の抗原もしくは近縁抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合の結合親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍大きい親和性で所定の抗原（例えば、ＴＲＥＭ２もしくはＧｐｎｍｂの抗原）に結合する。

【0210】

特定の実施形態によれば、ＴＲＥＭ２の量及び／または活性を減少させる抗原認識ドメインは、本明細書において拮抗抗体とも称される阻害剤抗体である。

【0211】

具体的な実施形態によれば、選択された抗体の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより決定されるように１０^－８Ｍ～１０^－１４Ｍの範囲にある（実施例の項に記載の条件を参照されたい）。

【0212】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１４Ｍである。

【0213】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍである。

【0214】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍである。

【0215】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１１Ｍである。

【0216】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍである。

【0217】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－８Ｍ～１０^－１９Ｍである。

【0218】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－９Ｍ～１０^－１４Ｍである。

【0219】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍである。

【0220】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍである。

【0221】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－９Ｍ～１０^－１１Ｍである。

【0222】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍである。

【0223】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－１０Ｍ～１０^－１３Ｍである。

【0224】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－１０Ｍ～１０^－１２Ｍである。

【0225】

いくつかの実施形態によれば、親和性範囲は、１０^－１０Ｍ～１０^－１１Ｍである。

【0226】

親和性は、多様な技法を使用して決定され、その一例はアフィニティーＥＬＩＳＡアッセイである。種々の実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ベースのアッセイ）により決定される。この方法論を使用すると、会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）が測定され得る。次いで、速度論的速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））が算出され得る。いくつかの実施形態では、親和性は、Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法により決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用すると、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））及び会合速度定数（ｋａ（Ｍ’Ｖ^１））が測定され得る。解離速度定数（ｋｄ）は、これらの値から算出され得る（ＫＤ×ｋａ）。他の実施形態では、親和性は、Kumaraswamy et al., Methods Mol. Biol., Vol. 1278:165-82, 2015に記載されておりＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）に採用されているものなどのバイオレイヤー干渉法により決定される。速度論的定数（ｋａ及びｋｄ）ならびに親和性定数（ＫＤ）は、バイオレイヤー干渉法を使用してリアルタイムで算出され得る。いくつかの実施形態では、本願に記載の抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに対するｋｄ（解離速度定数）により測定される約１０^－２、１０^－３、１０^－４、１０^－５、１０^－６、もしくはそれより低い結合親和力（値が低いほど高い結合親和力を示す）、ならびに／またはヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに対するＫＤ（平衡解離定数）により測定される約１０^－８Ｍ、約１０^－９Ｍ、約１０^－１０Ｍ、約１０^－１１Ｍ、もしくはそれより低い結合親和性（値が低いほど高い結合親和性を示す）などの望ましい特徴を示す。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、約１ｐＭ～約１００ｎＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、１００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、５０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。さらに他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、５ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でバイオレイヤー干渉法により測定した場合に、１ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２及びヒトＧｐｎｍｂに特異的に結合する。

【0227】

本発明の抗体は、それ自体で、または好適な担体もしくは賦形剤と混合された医薬組成物で対象に投与され得ることが理解されよう。

【0228】

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本願に記載の活性成分のうちの１つ以上と、生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学構成成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

【0229】

本明細書において、「活性成分」という用語は、生物学的効果を司る本発明の抗体（例えば、一の抗体（ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ））を指す。

【0230】

以下において、互換的に使用され得る「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を生じさせず、かつ投与された化合物の生物学的活性及び特性を妨げない担体または希釈剤を指す。これらの語句にはアジュバントが含まれる。

【0231】

本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例には、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類及び種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。

【0232】

薬物の製剤化及び投与のための技法は、参照により本明細書に援用される“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版に見出すことができる。

【0233】

好適な投与経路には、例えば、経口、直腸、神経外科的戦略（例えば、脳内注射、線条体内注入、もしくは脳室内注入、脊髄内、硬膜外）、経粘膜、腸管、または非経口送達（筋肉内、皮下、及び髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、心臓内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射を含む）が含まれ得る。

【0234】

あるいは、例えば患者の組織領域（例えば、脂肪組織）に医薬組成物を直接注射することにより、医薬組成物を全身的ではなく局所的な方法で投与することができる。

【0235】

好ましい実施形態によれば、抗体は、対象の脳へと投与されない。

【0236】

本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。

【0237】

したがって、本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分を薬学的に使用可能な調製物に加工することを容易にする、賦形剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。

【0238】

注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤化され得る。経粘膜投与の場合、透過すべきバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に公知である。

【0239】

経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより容易に製剤化され得る。かかる担体により、患者による経口摂取用に医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、溶液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することが可能になる。経口使用のための薬理学的調製物は、錠剤または糖衣錠芯を得るために、固体賦形剤を使用し、得られた混合物を任意選択的に粉砕し、必要に応じて好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖類などの充填剤、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル－セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などのセルロース調製物、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。必要に応じて、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。

【0240】

糖衣錠芯には好適なコーティングが施される。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択的に含有し得る、濃縮糖溶液が使用され得る。識別のために、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。

【0241】

経口使用され得る医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル（ｐｕｓｈ－ｆｉｔ ｃａｐｓｕｌｅ）、ならびにゼラチン及びグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製の密封軟カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と混合された、及び任意選択的に安定剤と混合された活性成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤を添加してもよい。経口投与用の全ての製剤は、選択された投与経路に好適な投与量であるべきである。

【0242】

頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジなどの形態をとり得る。

【0243】

経鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための活性成分は、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタン、または二酸化炭素を使用して、加圧パックまたはネブライザーから提供されるエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることにより決定され得る。ディスペンサーで使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含んで製剤化され得る。

【0244】

本願に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えばアンプルで、または防腐剤を任意選択的に添加した複数回用量容器で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであり得、かつ懸濁剤、安定化剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。

【0245】

非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水ベースの注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。

【0246】

任意選択的に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤または活性成分の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。

【0247】

あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水ベースの溶液で構成するための粉末形態であり得る。

【0248】

本発明の医薬組成物はまた、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化され得る。

【0249】

本発明の文脈における使用に好適な医薬組成物には、意図された目的（例えば、脂肪細胞の数もしくはサイズの低減、または内臓脂肪量の減少）を達成するのに有効な量で活性成分が含有されている組成物が含まれる。

【0250】

治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を踏まえると、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0251】

本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量または治療有効用量は、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び細胞培養アッセイから推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて処方され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。

【0252】

本願に記載の活性成分の毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標準的な薬学的手順により決定され得る。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を策定する際に使用され得る。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る。（例えば、Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1を参照されたい。）

【0253】

投与量及び投与間隔は、脂肪細胞の数もしくはサイズを減少させるのに、または内臓脂肪を減少させるのに十分な活性成分の組織レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）がもたらされるように個々に調整され得る。ＭＥＣは調製物ごとに変動するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴及び投与経路に依存する。血漿中濃度を決定するために検出アッセイが使用され得る。

【0254】

治療される状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回または複数回の投与であり得、治療の過程は、数日から数週間、または治癒がもたらされるかもしくは病態の軽減が達成されるまで続く。

【0255】

投与される組成物の量は、当然ながら、治療される対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医の判断などに依存する。

【0256】

本発明の組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔またはプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与に関する説明書が添付されている場合がある。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により定められた形式の、容器に関連する通知に適合していてもよく、この通知は、ヒトへの投与または獣医学的投与に関する組成物の形態が当該機関により承認されていることを表している。かかる通知は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局により承認されたラベルのもの、または承認された製品添付文書のものであり得る。適合性のある医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上でさらに詳述したように、調製され、適切な容器に入れられ、適応となる状態の治療に関するラベルを貼り付けられ得る。

【0257】

本発明者らは、追加の化学療法剤を、（ＴＲＥＭ２／Ｇｐｎｍｂ発現細胞を標的とする上記の抗体と組み合わせて）対象に投与することを企図している。かかる薬剤は、癌の治療のために上記の抗体と相乗的に作用し得る。

【0258】

治療は、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法、免疫調節薬、操作免疫細胞療法（例えばＣＡＲ－Ｔ）、及び当該技術分野で周知の他の治療レジメン（例えば、手術、細胞移植、例えば造血幹細胞移植）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の抗癌治療と組み合わせられ得る。

【0259】

本発明の化学療法剤は、シタラビン（シトシンアラビノシド、Ａｒａ－Ｃ、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）、アスプリン（ａｓｐｒｉｎ）、スリンダク、クルクミン、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロール－エタミン（ｍｅｃｈｌｏｒ－ｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル－ＣＣＮＵ））；チレンイミン（ｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅｓ）／メチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））；スルホン酸アルキル（例えばブスルファン）；トリアジン（例えばダカルバジン（ＤＴＩＣ））を含む）；葉酸類似体（例えば、メトトレキセート及びトリメトレキセート）、ピリミジン類似体（例えば、５－フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２ジフルオロデオキシシチジン）、プリン類似体（例えば、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、アザチオプリン、２’－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ））を含む、代謝拮抗剤；抗有糸分裂薬（例えばパクリタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含む）、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む、天然産物；エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン）；酵素（例えばＬ－アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－ガンマ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、及びＧＭ－ＣＳＦ）、抗血管形成因子（例えば、アンジオスタチン及びエンドスタチン）、血管新生因子の受容体の可溶性形態などのＦＧＦまたはＶＥＧＦの阻害剤（可溶性ＶＧＦ／ＶＥＧＦ受容体を含む）、白金配位錯体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン）、置換尿素（例えばヒドロキシウレア）、Ｎメチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド）；プレドニゾン及び同等物、デキサメタゾン、及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイド拮抗剤を含む、ホルモン及び拮抗剤；プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール）；エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物）；抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン）；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン薬（例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、及びロイプロリド）；非ステロイド性抗アンドロゲン薬（例えばフルタミド）；キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣物、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ｓｔａｔ阻害剤、及び受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（ＧｌｅｅｖａｃまたはＧｌｉｖａｃとして市販されている）及びＴａｒｖｅｃａとして現在市販されているエルロチニブ（ＥＧＦ受容体阻害剤））；ならびに抗ウイルス薬（例えば、リン酸オセルタミビル、アムホテリシンＢ、及びパリビズマブ）であり得るがこれらに限定されない。

【0260】

いくつかの実施形態では、本発明の化学療法剤は、シタラビン（シトシンアラビノシド、Ａｒａ－Ｃ、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）、キザルチニブ（ＡＣ２２０）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３－９００６）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、プロカルバジン、ペントスタチン、（２’デオキシコホルマイシン）、エトポシド、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、全トランスレチノイン酸、三酸化ヒ素、インターフェロン－アルファ、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン、メシル酸イマチニブ、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）、メルファラン、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、チオテパ、ブレオマイシン、白金（シスプラチン）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、５－アザシチジン、クラドリビン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、６－メルカプトプリン、メトトレキセート、６－チオグアニン、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0261】

具体的な実施形態によれば、治療は、以下に記載されるような免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされる。

【0262】

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害」は、癌免疫療法を指す。この療法は、腫瘍が免疫系による攻撃から自身を保護するために使用することができる、免疫系の作用を刺激または阻害する免疫系の主要な調節因子である免疫チェックポイントを標的とする。チェックポイント療法は、阻害性チェックポイントを遮断し、刺激機能を活性化して、それにより免疫系機能を回復することができる。現在承認されているチェックポイント阻害剤は、分子ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１を標的とする。ＰＤ－１は、膜貫通プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤＣＤ１及びＣＤ２７９とも呼ばれる）であり、ＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１リガンド１またはＣＤ２７４）と相互作用する。

【0263】

免疫チェックポイント阻害剤の例には、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム死１（ＰＤ－１）またはそのリガンド、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、Ｂ７ホモログ３（Ｂ７－Ｈ３）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７－Ｈ４）、インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、アデノシンＡ２ａ受容体、ニューリチン、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１６０、ＧＡＲＰ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＮＦＲ２５、ＣＤ５７、ＣＣＲ２、ＣＣＲＳ、ＣＣＲ６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ４、ＣＤ１８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１ｄ、ＣＤＳ、ＣＤ２１、ＴＩＭＩ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＣＤ９３、ＩｇＭ、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＣＤ３１７、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、ＩＣＡＭ－１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ、ポドプラニン、ならびにＴＩＧＩＴの免疫チェックポイント阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0264】

臨床的に承認されている免疫チェックポイント阻害剤の例には、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ニボリムマブ（Ｎｉｖｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＰＤ－１）、及びペンブロリズマブ（抗ＰＤ１）が含まれるが、これらに限定されない。

【0265】

別の実施形態によれば、治療は、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤（例えば、イブルチニブ、アカラブルチニブ、またはスペブルチニブ）と組み合わされる。

【0266】

本発明者らはまた、ＴＲＥＭ２とＧｐｎｍｂの両方を発現するミエロイド細胞の存在に基づいて治療タイプを選択することも企図している。

【0267】

したがって、本発明のなお別の態様によれば、対象における癌を治療する方法であって、
（ａ）対象の試料においてＴＲＥＭ２とＧｐｎｍｂの両方を発現するミエロイド細胞の存在を分析すること、及び
（ｂ）前記ミエロイド細胞の量が所定量を超える場合、本願に記載のＴＲＥＭ２及び／もしくはＧｐｎｍｂを標的とする治療有効量の抗体で対象を治療すること、または、前記細胞の量が所定量を下回る場合、ＴＲＥＭ２及び／もしくはＧｐｎｍｂを標的とする前記抗体以外の治療有効量の化学療法剤で対象を治療すること、
を含む方法が提供される。

【0268】

遺伝子発現プロファイルを決定する方法は、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで実施され得る。

【0269】

以下は、単一細胞レベルで複数の遺伝子の発現を分析するために使用することができる方法のより詳細な説明である。

【0270】

ＲＮＡを分析及び／または定量する方法
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物における特定のＲＮＡの検出を伴う。ＲＮＡ試料を、塩基対間の水素結合を防止する薬剤（例えば、ホルムアルデヒド）で処理することにより変性させ、折り畳まれていない直線状の立体構造を全てのＲＮＡ分子が確実に有しているようにする。次いで、個々のＲＮＡ分子を、ゲル電気泳動によりサイズに応じて分離し、変性ＲＮＡが付着するニトロセルロースまたはナイロンベースの膜に転写する。次いで、標識ＤＮＡプローブに膜を曝露させる。プローブは、放射性同位体または酵素連結ヌクレオチドを使用して標識することができる。検出には、オートラジオグラフィー、比色反応、または化学発光を使用することができる。この方法により、特定のＲＮＡ分子の量の定量と、電気泳動中のゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその正体の決定の両方が可能になる。

【0271】

ＲＴ－ＰＣＲ分析：この方法は、比較的稀なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を使用する。最初に、ＲＮＡ分子を細胞から精製し、逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴなど）及びプライマー、例えば、オリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、または遺伝子特異的プライマーを使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。次いで、遺伝子特異的プライマー及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを適用することにより、ＰＣＲ機中でＰＣＲ増幅反応を実行する。当業者は、特異的ＲＮＡ分子を検出するのに好適である遺伝子特異的プライマーの長さ及び配列ならびにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数など）を選択することができる。ＰＣＲサイクル数を調整し、増幅産物を既知の対照と比較することにより、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ反応を用いることができることが理解されよう。

【0272】

ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを、細胞中に存在するＲＮＡ分子に付着させる。一般に、細胞構造を保存し、かつＲＮＡ分子の分解を防止するために、細胞を、まず顕微鏡スライドに固定して、次いで標識プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供する。ハイブリダイゼーション緩衝液には、プローブの非特異的結合を回避しながら、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブがその標的ｍＲＮＡ分子とｉｎ ｓｉｔｕで特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にするホルムアミド及び塩（例えば、塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム）などの試薬が含まれる。当業者は、特異的プローブ及び細胞のタイプに対し、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩及びホルムアミドの濃度など）を調整することができる。ハイブリダイゼーション後、未結合のプローブを洗い流し、結合したプローブを公知の方法を使用して検出する。例えば、放射標識プローブを使用する場合、放射標識プローブを使用して生成されたシグナルを明らかにする写真乳剤にスライドを供する、プローブを酵素で標識した場合、比色反応の形成のために酵素特異的基質を添加する、プローブを蛍光標識を使用して標識する場合、蛍光顕微鏡を使用して結合したプローブを明らかにする、プローブをタグ（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチンなど）を使用して標識する場合、結合したプローブを、公知の方法を使用して検出することができるタグ特異的抗体との相互作用後に検出することができる。

【0273】

Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ－ＰＣＲ染色：この方法は、Nuovo GJ, et al.［Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90］及びKomminoth P, et al.［Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25］に記載されている。簡潔に述べると、標識ヌクレオチドをＰＣＲ反応に組み込むことにより、固定細胞上でＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する。Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社（カリフォルニア州、マウンテンビュー）から入手可能なレーザーキャプチャーマイクロダイセクションＰｉｘＣｅｌｌ Ｉ ＬＣＭシステムなどの特異的ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ－ＰＣＲ装置を使用して、反応を実行する。

【0274】

単一細胞トランスクリプトーム分析
この方法は、単一細胞のトランスクリプトームのシーケンシングに依拠する。一実施形態では、異なる細胞に由来するＲＮＡを個々にタグ付けすることで各リードの細胞識別性を保持しながら単一のライブラリを作成することが可能になる、ハイスループット法を使用する。この方法は、多数の手法で実行することができる。例えば、内容が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２０３５９７号明細書及び米国特許出願公開第２０１８０１００２０１号明細書を参照されたい。

【0275】

単一細胞トランスクリプトーム分析を実行するための１つの特定の方法を、以下に要約する。

【0276】

典型的には、細胞を、各ウェルに１つの細胞のみが存在するようにウェルに等分する。細胞及び核膜を破壊して細胞のＲＮＡをシーケンシング反応に利用できるようにする薬剤で、細胞を処理する。

【0277】

一実施形態によれば、ＲＮＡは、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写増幅プロトコルを使用して増幅される。

【0278】

（工程１）ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡ分子の合成を可能にする条件下で、末端３’末端にポリｄＴ配列、末端５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、かつポリｄＴ配列とＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列との間に位置するバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドと、単一細胞のＲＮＡを接触させる。ここで、バーコード配列は、細胞バーコード及び分子識別子を含む。

【0279】

本実施形態のポリｄＴオリゴヌクレオチドは、シーケンシングに必要なアダプター配列を任意選択的に含み得る（例えば、図５を参照されたい）。

【0280】

ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、当該技術分野で公知であり、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、例えば、ＳＣＧＡＴＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣ（配列番号３）を含む。

【0281】

好ましくは、ポリｄＴ配列は、少なくとも５ヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、ポリｄＴ配列は、約５～５０ヌクレオチド、より好ましくは約５～２５ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１２～１４ヌクレオチドである。

【0282】

バーコード配列は、多数の試料が単一の反応にプールされる場合、マルチプレックス反応中に有用である。バーコード配列は、特定の分子、試料、またはライブラリを識別するために使用され得る。バーコード配列は、ポリｄＴ配列の５’末端及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ配列の３’に付着されている。バーコード配列は、３～４００ヌクレオチド、より好ましくは３～２００ヌクレオチド、さらにより好ましくは３～１００ヌクレオチドであり得る。したがって、バーコード配列は、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、または１０ヌクレオチドであり得る。

【0283】

一実施形態では、バーコード配列は、細胞タイプまたは細胞源（例えば患者）を識別するために使用される。

【0284】

分子識別子は、方法の定量精度を低減させる増幅バイアスを補正するのに有用である。分子識別子は、４～２０個の塩基で構成される。分子識別子は、試料の各ＲＮＡ分子が独自の配列を有する分子識別子で類別（標識）されるような長さである。

【0285】

プライマー（例えば、ポリｄＴプライマー）をＲＮＡ試料にアニーリングさせた後、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用した逆転写によってＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを合成することができる。本発明の方法及び組成物における使用に好適なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼには、逆転写酵素（ＲＴ）が含まれる。ＲＴは当該技術分野で周知である。ＲＴの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、及び骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、または他のトリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素、ならびにそれらに由来する修飾ＲＴが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第７，０５６，７１６号明細書を参照されたい。トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ－ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ－ＲＴ）に由来する逆転写酵素などの多くの逆転写酵素は、複数の活性（例えば、ポリメラーゼ活性及びリボヌクレアーゼ活性）を含み、二本鎖ｃＤＮＡ分子の形成において機能し得る。しかしながら、いくつかの例では、ＲＮアーゼＨ活性を欠如しているか、またはＲＮアーゼＨ活性が実質的に低減したＲＴを用いることが好ましい。

【0286】

ＲＮアーゼＨ活性を欠くＲＴは当該技術分野で公知であり、これには野生型逆転写酵素の変異を含み、その変異によってＲＮアーゼＨ活性が消失しているものが含まれる。ＲＮアーゼＨ活性が低減したＲＴの例は、米国特許出願公開第２０１００２０３５９７号明細書に記載されている。これらの場合、E. coliから単離されたものなどの他の供給源からのＲＮアーゼＨの添加を、一本鎖ｃＤＮＡの形成に用いることができる。異なる非変異型ＲＴの組み合わせ、異なる変異型ＲＴの組み合わせ、及び１つ以上の非変異型ＲＴと１つ以上の変異型ＲＴとの組み合わせを含む、ＲＴの組み合わせも企図される。

【0287】

好適な酵素の例には、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、逆転写酵素は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を欠いている。

【0288】

逆転写反応に必要な追加の構成成分には、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、ならびに任意選択的にジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＭｎＣｌ_２などの還元剤が含まれる。

【0289】

合成されるｃＤＮＡを精製することができるように、ポリｄＴオリゴヌクレオチドを固体支持体（例えばビーズ）に付着させることができる。

【0290】

アニーリングの温度及びタイミングは、プライマーが鋳型にアニーリングすると予想される効率と、許容されるミスマッチの程度の両方により決定される。

【0291】

アニーリング温度は、通常、最適な効率及び特異性がもたらされるように選択され、一般に約５０℃～約８０℃、通常では約５５℃～約７０℃、より通常では約６０℃～約６８℃の範囲である。アニーリング条件は、一般に約１５秒～約３０分、通常では約３０秒～約５分の範囲の期間で維持される。

【0292】

（工程２）：ｃＤＮＡが生成されると、そのｃＤＮＡを、（本明細書で上記したものと同じ方法を使用して）他の単一細胞から生成されたｃＤＮＡからプールすることができる。

【0293】

過剰なプライマーを除去するために、エキソヌクレアーゼＩなどの酵素で試料を任意選択的に処理することができる。例えば常磁性微粒子の使用を含む、一本鎖ＤＮＡを精製する他の選択肢も企図される。これは、試料のプール後またはその前に実行することができる。

【0294】

（工程３）：第２鎖の合成。
ｃＤＮＡの第２鎖の合成は、ヌクレオチド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で試料をインキュベートすることにより行うことができる。ＲＮアーゼＨ（ＲＮＡ鎖を除去するため）などの追加の酵素及び緩衝液を含む、この工程用の市販のキットが利用可能である。この反応は、任意選択的にＤＮＡリガーゼの存在下で実施することができる。第２鎖の合成に続いて、例えば常磁性微粒子の使用を含む、当該技術分野で公知の方法を使用して産物を精製することができる。

【0295】

（工程４）：ｃＤＮＡの第２鎖の合成に続いて、対応するＲＮＡポリメラーゼとインキュベートすることによりＲＮＡを合成することができる。Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡポリメラーゼＩＶＴキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）などの市販のキットを使用することができる。

【0296】

（工程５）：増幅したＲＮＡを断片化する前に、ＤＮアーゼ酵素を使用してＤＮＡを除去することができる。断片化の前にＲＮＡを精製してもよい。ＲＮＡの断片化は、当該技術分野で公知のように実行することができる。Ａｍｂｉｏｎ断片化キットなどの断片化キットが市販されている。

【0297】

（工程６）：増幅しかつ断片化したＲＮＡの３’末端をここで標識する。このために、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をＲＮＡに本質的にライゲーションするリガーゼ反応を実施する。増幅しかつ断片化したＲＮＡを標識する他の方法は、米国特許出願公開第２０１７０１３７８０６号明細書に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。一本鎖ＤＮＡは５’末端に遊離リン酸を有しており、任意選択的に、頭部と尾部のライゲーションを防止するために３’末端にブロッキング部分を有する。ブロッキング部分の例には、Ｃ３スペーサーまたはビオチン部分が含まれる。典型的には、ｓｓＤＮＡは、１０～５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５～２５ヌクレオチドである。

【0298】

（工程７）：次いで、先行工程で使用したプライマーに相補的なプライマーを使用して逆転写を実施する。次いで、図５に図示するように、ネステッドＰＣＲ反応を通じてライブラリを完成させ、増幅することができる。

【0299】

（工程８）：増幅
本発明のアダプターポリヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにライゲーションしたら（すなわち、一本鎖ＤＮＡの伸長に続いて）、増幅反応を実施することができる。

【0300】

（工程９）：シーケンシング
配列決定のための方法は、当業者には一般に公知である。好ましいシーケンシング方法は、次世代シーケンシング法または並列ハイスループットシーケンシング法、例えば、超並列シグネチャシーケンシング（ＭＰＳＳ）である。想定されるシーケンス方法の例は、パイロシーケンシング、特に、例えばＲｏｃｈｅ ４５４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒに基づく４５４パイロシーケンシングである。この方法は、油溶液中の水滴内のＤＮＡを増幅するものであり、各液滴は、単一のプライマーでコーティングされたビーズに付着した単一のＤＮＡ鋳型を含有しており、この鋳型は後にクローン性コロニーを形成する。パイロシーケンシングでは、ルシフェラーゼを使用して、新生ＤＮＡに付加された個々のヌクレオチドを検出するための光を生成し、集約したデータを使用してシーケンスリードアウトを生成する。さらに別の想定される例は、例えば可逆的ダイターミネーターに基づくＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ技術を使用することによる、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａシーケンシングである。典型的には、局所的なクローン性コロニーが形成されるように、ＤＮＡ分子をスライド上のプライマーに付着させて増幅させる。その後、一度に１種類のヌクレオチドを付加することができ、取り込まれなかったヌクレオチドを洗い流す。その後、蛍光標識ヌクレオチドの画像を撮影することができ、色素をＤＮＡから化学的に除去して、次のサイクルが行えるようになる。さらに別の例は、ライゲーションによるシーケンシングを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉＤ技術の使用である。この方法は、シーケンシングされた位置に従って標識された、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールの使用に基づくものである。かかるオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲーションする。その後、一致する配列に対するＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションによって、典型的には、その位置のヌクレオチドに関する情報を知らせるシグナルが得られる。ＤＮＡは典型的にはエマルジョンＰＣＲによって増幅されるため、各々が同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有する得られたビーズをスライドガラス上に配置することで、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに匹敵する量及び長さの配列を得ることができる。さらなる方法は、アレイに繋留されたポリＴオリゴマーにより断片を捕捉する、Ｈｅｌｉｃｏｓ社のＨｅｌｉｓｃｏｐｅ技術に基づくものである。各シーケンシングサイクルにおいて、ポリメラーゼ及び単一の蛍光標識ヌクレオチドを添加し、アレイを画像化する。その後、蛍光タグを除去し、このサイクルを繰り返す。本発明の方法に包含されるシーケンシング技法のさらなる例は、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアの使用によるシーケンシング、顕微鏡ベースのシーケンシング技法、マイクロ流体サンガーシーケンシング、またはマイクロチップベースのシーケンシング方法である。本発明はまた、これらの技法のさらなる進展、例えば、配列決定の精度の、または生物のゲノム配列決定に必要な時間などのさらなる改善も想定している。

【0301】

一実施形態によれば、シーケンシング方法は、ディープシーケンシングを含む。

【0302】

本明細書で使用される場合、「ディープシーケンシング」という用語は、標的配列が１回の試験で複数回読み取られるシーケンシング方法を指す。１回のディープシーケンシングのランは、同じ標的配列に対して行われかつ各々が独立したシーケンスリードアウトを生成する、多数のシーケンシング反応で構成されている。

【0303】

マイクロ流体工学に依拠する方法も、単一細胞トランスクリプトーム分析を実行するために使用可能であることが理解されよう。

【0304】

したがって、ハイスループットで個々の細胞から核酸を単離し、溶解させ、バーコードを付し、かつ調製するために、分子バーコーディングとエマルジョンベースのマイクロ流体工学との組み合わせを使用することができる。マイクロ流体デバイス（例えば、ポリジメチルシロキサンで製作されたもの）、サブナノリットルの逆エマルジョン液滴。これらの液滴を、バーコード付き捕捉ビーズと核酸を共カプセル化するために使用する。例えば、各ビーズには独自のバーコードを付しているため、各液滴及びその内容物を区別することができる。核酸は、例えば、単一細胞、一対の細胞、細胞溶解物、または溶液に由来するものなど、当該技術分野で公知の任意の供給源に由来し得る。細胞は、液滴中にカプセル化される際に溶解される。単一細胞及びバーコード付きビーズをポアソン統計を用いてこれらの液滴にロードするには、約１０，０００個～１００，０００個の細胞にバーコードを付すために１００，０００個～１，０００万個のかかるビーズが必要である。この点に関して、単一細胞シーケンシングライブラリが存在し得、これには、独自のバーコードが付けられた１つのｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、直径７５～１２５μｍのエマルジョン液滴中の単一細胞と一体化させること、細胞を溶解させ、そのＲＮＡをＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上へのハイブリダイゼーションによって捕捉できるようにすること、エマルジョン液滴の内側または外側のいずれかで逆転写を実施して、細胞のｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合的に連結した第１鎖ｃＤＮＡに変換すること、全ての細胞からのｃＤＮＡ付着マイクロビーズをプールすること、ならびに本明細書で上記したように、単一の複合ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリを調製及びシーケンシングすること、が含まれ得る。この点に関して、Macosko et al., 2015, "Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets" Cell 161, 1202-1214、２０１６年３月１７日に国際公開第２０１６／０４０４７６号パンフレットとして公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９１７８号の明細書、Klein et al., 2015, "Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells" Cell 161, 1187-1201、Zheng, et al., 2016, "Haplotyping germline and cancer genomes with high-throμｇhput linked-read sequencing" Nature Biotechnology 34, 303-311、及び国際公開第２０１４２１０３５３号パンフレットを参照されたい。これら各々の全ての内容及び開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0305】

タンパク質の発現及び／または活性を検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞内で発現されるタンパク質の発現及び／または活性レベルは、当該技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。

【0306】

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、タンパク質基質を含有する試料（例えば、固定細胞またはタンパク質性溶液）をマイクロタイタープレートのウェルなどの表面に固定することを伴う。酵素とカップリングした基質特異的抗体を適用し、基質に結合させる。次いで、抗体とカップリングした酵素を用いた比色反応により、抗体の存在を検出及び定量する。この方法で一般的に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。十分に較正され、かつ応答の線形範囲内にある場合、試料中に存在する基質の量は、生じた色の量に比例する。一般に、定量精度を改善するために基質標準物質が用いられる。

【0307】

ウエスタンブロット：この方法は、アクリルアミドゲルによって基質を他のタンパク質から分離し、続いて基質を膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを伴う。次いで、基質の存在を、その基質に特異的な抗体によって検出し、次にその抗体を抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えばプロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上記のとおり放射標識してもよく、または酵素に連結させてもよい。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応、または化学発光によるものであってよい。この方法により、基質の量の定量と、電気泳動中のアクリルアミドゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその正体の決定の両方が可能になる。

【0308】

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）：１つのバージョンでは、この方法は、アガロースビーズなどの沈殿可能な担体に固定化した特異的抗体及び放射標識した抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ^１２５で標識したプロテインＡ）を用いて、所望のタンパク質（すなわち基質）を沈殿させることを伴う。沈殿したペレット内のカウント数は基質の量に比例する。

【0309】

ＲＩＡの代替バージョンでは、標識基質及び非標識の抗体結合タンパク質を用いる。未知量の基質を含有する試料を様々な量で添加する。標識基質からの沈殿カウントの減少は、添加した試料中の基質の量に比例する。

【0310】

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的抗体による細胞内の基質のｉｎ ｓｉｔｕ検出を伴う。基質特異的抗体をフルオロフォアに連結させる。各細胞が光線を通過する際に放射される光の波長を読み取る細胞選別機によって検出する。この方法では、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。

【0311】

免疫組織化学的分析：この方法は、基質特異的抗体による固定細胞内の基質のｉｎ ｓｉｔｕ検出を伴う。基質特異的抗体は、酵素に連結させてもよく、またはフルオロフォアに連結させてもよい。顕微鏡法及び主観的評価または自動評価によって検出を行う。酵素連結抗体を用いる場合、比色反応が必要になる場合がある。免疫組織化学の後に、例えばヘマトキシリン染色またはギムザ染色を使用した細胞核の対比染色が行われることが多いことが理解されよう。

【0312】

ｉｎ ｓｉｔｕ活性アッセイ：この方法によると、活性酵素を含有する細胞上に発色基質を適用し、基質が分解されて光学顕微鏡または蛍光顕微鏡により可視化される発色産物を生じる反応を酵素が触媒する。

【0313】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ：これらの方法では、細胞から抽出したタンパク質混合物において特定の酵素の活性を測定する。活性は、比色法を使用して分光光度計ウェルで測定することができ、または非変性アクリルアミドゲル（すなわち活性ゲル）で測定することもできる。電気泳動後、基質と比色試薬とを含有する溶液にゲルを浸漬する。得られた染色バンドは、目的タンパク質の酵素活性に対応する。十分に較正され、かつ応答の線形範囲内にある場合、試料中に存在する酵素の量は、生じた色の量に比例する。一般に、定量精度を改善するために酵素標準物質が用いられる。

【0314】

具体的な実施形態によれば、遺伝子発現は、トランスクリプトーム分析により決定される。

【0315】

具体的な実施形態によれば、遺伝子発現は、上記のとおり単一細胞トランスクリプトーム分析により決定される。

【0316】

したがって、特定のレベルの細胞、例えば、由来する試料のミエロイド細胞の５％超、１０％超が観察されると、対象をこれらの細胞を標的とする療法の候補者と見なすことができる。この特色のミエロイド細胞の数が不十分であることが観察された場合、対象はこの療法の候補者とは見なされない。

【0317】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。

【0318】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」という用語、及びそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。

【0319】

「からなる」という用語は、「を含み、かつこれらに限定される」を意味する。

【0320】

「から本質的になる」という用語は、組成物、方法、または構造が追加の成分、工程、及び／または一部を含み得るが、それは追加の成分、工程、及び／または一部が、特許請求された組成物、方法、または構造の根本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限られることを意味する。

【0321】

明確にするために別々の実施形態の文脈で記載される本発明のある特定の要件はまた、単一の実施形態中に組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の要件はまた、別々に、または任意の好適な副次的組み合わせで、または本発明の任意の他の記載される実施形態において好適なものとして、提供され得る。種々の実施形態の文脈で記載されるある特定の要件は、実施形態がそれらの要素なしでは作用しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な要件とは見なされない。

【0322】

上に記述され、以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的支持が見出される。

【0323】

実施例
これより、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、本発明のいくつかの実施形態を上記の説明とともに非限定的な形で例示するものである。

【0324】

一般に、本明細書で使用する命名法及び本発明で利用する実験手順には、分子的技法、生化学的技法、微生物学的技法、及び組換えＤＮＡ技法が含まれる。かかる技法は、文献中に十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、以下：米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号明細書、及び同第５，２７２，０５７号明細書、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)に記載されている方法論を参照されたく、利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８３９，１５３号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，８５０，５７８号明細書、同第３，８５３，９８７号明細書、同第３，８６７，５１７号明細書、同第３，８７９，２６２号明細書、同第３，９０１，６５４号明細書、同第３，９３５，０７４号明細書、同第３，９８４，５３３号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，０３４，０７４号明細書、同第４，０９８，８７６号明細書、同第４，８７９，２１９号明細書、同第５，０１１，７７１号明細書、及び同第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)及び"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。これらは全て、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように参照により援用される。他の一般的な参照文献は、本明細書全体にわたり提供される。その中の手順は、当該技術分野で周知であると考えられており、読者の利便性のために提供される。その中に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に援用される。

【0325】

材料及び方法
抗ヒトＴＲＥＭ２モノクローナル抗体の産生
５匹のＢａｌＢ／Ｃマウス及び５匹のＳＪＬマウスを、Ｈｉｓタグに融合したヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメインからなる組換えタンパク質（配列番号４、ＭＥＰＬＲＬＬＩＬＬＦＶＴＥＬＳＧＡＨＮＴＴＶＦＱＧＶＡＧＱＳＬＱＶＳＣＰＹＤＳＭＫＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＧＥＫＧＰＣＱＲＶＶＳＴＨＮＬＷＬＬＳＦＬＲＲＷＮＧＳＴＡＩＴＤＤＴＬＧＧＴＬＴＩＴＬＲＮＬＱＰＨＤＡＧＬＹＱＣＱＳＬＨＧＳＥＡＤＴＬＲＫＶＬＶＥＶＬＡＤＰＬＤＨＲＤＡＧＤＬＷＦＰＧＥＳＥＳＦＥＤＡＨＶＥＨＳＩＳＲＳＬＬＥＧＥＩＰＦＰＰＴＳＨＨＨＨＨＨ）で免疫した。マウスの脾臓を採取し、Ｓｐ２／０ミエローマ細胞と融合させた。Ａｂ産生クローンをＥＬＩＳＡによって選択し、ｈＴＲＥＭ２が安定的にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫ細胞に対してスクリーニングした。

【0326】

直接ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ｐＨ７．４のＰＢＳで希釈した０．５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェルのＨｉｓタグ付きｈＴＲＥＭ２でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回すすぎ、室温（ＲＴ）で１時間、１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングし、再度すすいだ。プレートを抗ｈＴＲＥＭ２抗体（１００μｌ／ウェル）とともに、示した濃度にてＲＴで２時間インキュベートした。プレートをすすぎ、ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃｇ断片特異的（ｍｉｎ Ｘ ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）とともにＲＴで２０分間インキュベートした。プレートをすすぎ、ＴＭＢ試薬（ＴＭ４５００、Ｓｃｙｔｅｋ社）とともにＲＴで２０分間インキュベートし、続いて停止溶液として２Ｎの硫酸（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２種の波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。

【0327】

上清Ｅｌｉｓａ
野性型２９３ＨＥＫ細胞またはｈＴＲＥＭ２を過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞を２４時間培養した（１０ｃｍプレート中に３００万個の細胞）。上清を回収し、９００ｇで５分間遠心分離して濾過した（０．４５μｍ）。９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ＰＢＳで希釈した０．２μｇ／ウェルの抗ヒトＴＲＥＭ２抗体（ＡＦ１８２８、Ｒ＆Ｄ社）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回すすぎ、室温（ＲＴ）で１時間、１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングし、再度すすいだ。プレートを、細胞培養上清（１００μｌ／ウェル）とともにＲＴで２時間インキュベートし、再度すすいだ。プレートを、０．１μｇのビオチン化抗ｈＴＲＥＭ２抗体とともにＲＴで２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをすすぎ、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ社）とともにＲＴで２０分間インキュベートした。プレートをすすぎ、ＴＭＢ試薬（ＴＭ４５００、Ｓｃｙｔｅｋ社）とともにＲＴで２０分間インキュベートし、続いて停止溶液として２Ｎの硫酸（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２種の波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。

【0328】

細胞ベースＥＬＩＳＡ
野性型２９３ＨＥＫ細胞またはｈＴＲＥＭ２を過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞を、ポリＬリジンでコーティングした９６組織培養プレートに播種し、ＭＭＰ阻害剤ＧＭ－６００１（２５μＭ、Ｅｎｚｏ社）の存在下で４８時間培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＴで２時間ブロッキングした（５％ ＦＢＳ、１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液）。細胞を１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液で洗浄し、０．１μｇ（または示した量）のビオチン化抗ｈＴＲＥＭ２抗体とともにＲＴで４時間インキュベートした。インキュベーション後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ社）とともに細胞をＲＴで２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＴＭ４５００、Ｓｃｙｔｅｋ社）とともにＲＴで３０分間インキュベートし、続いて停止溶液として２Ｎの硫酸（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２種の波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を製造業者の指示に従って使用して、抗体のビオチン化を行った。

【0329】

ＴＲＥＭ２検出のためのウエスタンブロット（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）
細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ社）を補充した冷低張溶解緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ）に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を液体窒素中で急速冷凍し、解凍して、４℃、１６，０００ｇで４５分間遠心分離した。ペレットをＳＴＥ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートして、４℃、１６，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を回収し、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定した。タンパク質（５０μｇ）を１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に転写した。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎで希釈した３％ ＢＳＡを用いて、室温で１時間膜をブロッキングした。膜を抗ｈＴＲＥＭ２抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに４℃で一晩インキュベートした。二次抗体として、ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧを使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、１１５－０３５－０７１）。ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ Ｅｌｉｔｅ ＥＣＬ試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して、結合した抗体を視覚化した。

【0330】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の分化
ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）マウス及びｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウスのマウス骨髄細胞を、３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－２５）の存在下で７日間培養し、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）を生成した。

【0331】

フローサイトメトリー分析
ＴＲＥＭ２ ＫＯ ＢＭＤＭ及びｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭをＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ ＢＳＡ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、ビオチンコンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２抗体（１０μｇ／ｍＬ）で染色し、続いてＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＡＰＣ－ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、４０５２０７）でインキュベートして、次いでフローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ社）によって分析した。

【0332】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
シリーズＳ センサーチップＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ社）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器で実行したＳＰＲによって、親和性測定値を得た。ｈＴＲＥＭ２－Ｈｉｓタンパク質をチップに捕捉し、抗ｈＴＲＥＭ２抗体を分析物として使用した。定常状態の親和性結合を使用してセンソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）をフィッティングさせ、平衡解離定数（ＫＤ）値を得た。

【0333】

免疫蛍光分析
ＴＲＥＭ２ ＫＯ ＢＭＤＭ及びｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭを、ポリＬリジンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、冷メタノールで固定し、洗浄して、５％ ＦＢＳのＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。細胞を抗ｈＴＲＥＭ２抗体（２μｇ／ｍｌ）とともに４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて二次抗体染色（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、７１５－６０６）及びＤＡＰＩを行った。

【0334】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）分化撹乱アッセイ
マウス骨髄細胞を、示したようにマクロファージに分化させ、一方、培養２日目及び５日目に抗ｈＴＲＥＭ２抗体を培養培地に添加した（１０μｇ／ｍＬ）。

【0335】

ビオチンコンジュゲートｈＴＲＥＭ２抗体の浸透のＥＬＩＳＡ分析
ＭＣＡ－２０５細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、皮下注射した（１００μｌ ＰＢＳ中に５０万細胞／マウス）。マウスの側腹部を事前に剃毛し、皮下（ｓ．ｃ）注射した。９日目に、マウスをビオチンコンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２抗体（７０μｇ／マウス）で腹腔内（ｉ．ｐ．）処理し、２４時間後に屠殺した。ＥＬＩＳＡ分析用に、示した器官を採取して、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液で均質化することにより全タンパク質を抽出した。試料を氷上に２０分間放置し、４℃、１３，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、ＢＣＡ法を使用してタンパク質濃度を決定した。１００μｇのタンパク質を、プレコーティング及びブロッキング（１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液）したｈＴＲＥＭ２タンパク質上にロードし、続いて５回洗浄して、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを結合させた。プレートをすすぎ、ＴＭＢ試薬（ＴＭ４５００、Ｓｃｙｔｅｋ社）とともにＲＴで２０分間インキュベートし、続いて停止溶液として２Ｎの硫酸（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２種の波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。

【0336】

抗ヒトＧＰＮＭＢモノクローナル抗体の産生
５匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｈｉｓタグに融合したヒトＧＰＮＭＢの細胞外ドメインからなる組換えタンパク質（配列番号５、ＭＥＣＬＹＹＦＬＧＦＬＬＬＡＡＲＬＰＬＤＡＡＫＲＦＨＤＶＬＧＮＥＲＰＳＡＹＭＲＥＨＮＱＬＮＧＷＳＳＤＥＮＤＷＮＥＫＬＹＰＶＷＫＲＧＤＭＲＷＫＮＳＷＫＧＧＲＶＱＡＶＬＴＳＤＳＰＡＬＶＧＳＮＩＴＦＡＶＮＬＩＦＰＲＣＱＫＥＤＡＮＧＮＩＶＹＥＫＮＣＲＮＥＡＧＬＳＡＤＰＹＶＹＮＷＴＡＷＳＥＤＳＤＧＥＮＧＴＧＱＳＨＨＮＶＦＰＤＧＫＰＦＰＨＨＰＧＷＲＲＷＮＦＩＹＶＦＨＴＬＧＱＹＦＱＫＬＧＲＣＳＶＲＶＳＶＮＴＡＮＶＴＬＧＰＱＬＭＥＶＴＶＹＲＲＨＧＲＡＹＶＰＩＡＱＶＫＤＶＹＶＶＴＤＱＩＰＶＦＶＴＭＦＱＫＮＤＲＮＳＳＤＥＴＦＬＫＤＬＰＩＭＦＤＶＬＩＨＤＰＳＨＦＬＮＹＳＴＩＮＹＫＷＳＦＧＤＮＴＧＬＦＶＳＴＮＨＴＶＮＨＴＹＶＬＮＧＴＦＳＬＮＬＴＶＫＡＡＡＰＧＰＣＰＰＰＰＰＰＰＲＰＳＫＰＴＰＳＬＡＴＴＬＫＳＹＤＳＮＴＰＧＰＡＧＤＮＰＬＥＬＳＲＩＰＤＥＮＣＱＩＮＲＹＧＨＦＱＡＴＩＴＩＶＥＧＩＬＥＶＮＩＩＱＭＴＤＶＬＭＰＶＰＷＰＥＳＳＬＩＤＦＶＶＴＣＱＧＳＩＰＴＥＶＣＴＩＩＳＤＰＴＣＥＩＴＱＮＴＶＣＳＰＶＤＶＤＥＭＣＬＬＴＶＲＲＴＦＮＧＳＧＴＹＣＶＮＬＴＬＧＤＤＴＳＬＡＬＴＳＴＬＩＳＶＰＤＲＤＰＡＳＰＬＲＭＡＮＨＨＨＨＨＨ）で免疫した。マウスの脾臓を採取し、フローサイトメトリーによってＧＰＮＭＢ結合について単一Ｂ細胞を分析し、ＢＣＲシーケンシング用に選別した。抗体産生のために、生産性を有するＢＣＲをＯＧ５２７（ＩｇＧ）及びＯＧ５２８（Ｉｇｋ）にクローニングした。

【0337】

抗ヒトＧＰＮＭＢモノクローナル抗体の結合スクリーニング
抗ヒトＧＰＮＭＢ抗体を、ｈＧＰＮＭＢ発現２９３ＨＥＫ及びヒト末梢血由来マクロファージとの結合について、直接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによりスクリーニングする。

【0338】

抗ヒトＧＰＮＭＢモノクローナル抗体の機能スクリーニング
フィコール分離によってヒト白血球を末梢血から抽出した。ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０４５－１０１）を使用してＣＤ４ Ｔ細胞を単離した。プレコーティングした抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ２抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９１－４４１）中で、ＣＤ４細胞を組換えｈＧＰＮＭＢタンパク質とともに１～３日間インキュベートした。フローサイトメトリーを使用したＣＦＳＥ染色により複製数を測定した。ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、ＢＬＧ－４３０１０４）によりＩＦＮｇ分泌を測定した。抗ｈＧＰＮＭＢ抗体のＣＤ４ Ｔ細胞活性化抑制能試験を、Ｔ細胞インキュベーション中に１０μｇ／ｍＬの抗体を添加することにより実施する。

【0339】

ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）及びヒト単球由来樹状細胞（ｈＭＤＣ）の分化
ＣＤ１４＋単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社 ＃１３０－０５０２０１）を使用して、ＣＤ１４＋細胞をヒト血液から単離した。細胞を３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－２５）の存在下で５日間培養し、続いて２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４を投与してＭ２マクロファージを生成した。ｈＭＤＣを生成するために、細胞を３０ｎｇ／ｍＬのｈＧＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－０３）の存在下で７日間培養した。

【0340】

ｈＭＤＭの刺激
初代ｈＭＤＭを上記のとおりに生成した。１０μｇ／ｍＬの抗ＴＲＥＭ２及び／または２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２もしくはＩＬ１５サイトカインを、３日目、５日目、及び６日目に培養物に添加した。

【0341】

遺伝子発現分析
遺伝子発現分析用に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、６１０１２）によりＲＮＡを精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、１８０８００４４）を製造業者の指示に従って使用してｃＤＮＡを生成した。

【0342】

ｑＰＣＲ分析を、サイバーグリーン（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｏｃｈｅ社、０４－８８７－３５２）試薬及び以下のプライマー（表Ｃ）を用いて行った。

【0343】

【表2】

【0344】

サイトカイン分泌分析
Ｍ２極性化プロセスの２４時間後にマクロファージ上清で行ったサイトカイン分泌分析。上清を１：２０に希釈し、ＣＢＡヒト炎症性サイトカインキット（ＢＤ５５１８１１）を製造業者の指示に従って用いてサイトカイン値の測定を行った。

【0345】

ヒトＴ細胞及びｈＭＤＭの単離、活性化、及び共培養
初代ｈＭＤＭを前述のとおりに生成した。ＣＤ１４＋細胞の選択後、マクロファージ分化の間、ＣＤ１４－を凍結した。６日後、細胞を解凍し、ヒトＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｔｅｃ社、１３０－０４５－２０１）によってＣＤ８ Ｔ細胞を選択した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、増殖追跡色素（６５－０８４２－８５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で染色し、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ、ＯＫＴ、ＢＬＧ－３１７３２６）及び抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ、ＢＬＧ－３０２９３４）でプレコーティングしたプレート上に播種した。分化させ処理したＭ２マクロファージを、１：３（マクロファージ：Ｔ細胞）の比で共培養物に添加した。４日後、細胞の増殖速度をフローサイトメトリーにより分析した。

【0346】

組換え抗体結合アッセイ
直接Ｅｌｉｓａを前述のとおりに実施した。簡潔に述べると、組換えヒトＴＲＥＭ２（２μｇ／ｍｌ）でＥｌｉｓａプレートをコーティングした。ブロッキング後、プレートを様々な濃度の組換え抗体とともにインキュベートした。抗体の検出には、次の二次抗体を使用した：抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（７０９－０３５－１４９、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ヒトＩＬ２（ＢＬＧ－５００３０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、続いて抗ラットＩｇＧ－ＨＲＰ（ａｂ９７０５７、Ａｂｃａｍ社）。上清Ｅｌｉｓａを前述のとおりに実施した。抗ＴＲＥＭ２抗体ＡＦ１８２８（Ｒ＆Ｄ社）を捕捉抗体として使用し、続いてブロッキングし、ｈＭＤＭの上清とともにインキュベートした。抗ＴＲＥＭ２組換え抗体を検出抗体として使用し、続いて二次抗体による検出を行った（抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（７０９－０３５－１４９、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ヒトＩＬ２（ＢＬＧ－５００３０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、続いて抗ラットＩｇＧ－ＨＲＰ（ａｂ９７０５７、Ａｂｃａｍ社））。

【0347】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の分化及び処理
ｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウス（雌、１２週齢）のマウス骨髄細胞を、大腿骨及び脛骨から抽出し、３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－２５）の存在下で９６ウェル非組織培養用プレートに播種して（１００μｌのＣ１０培地中に２０Ｋ個の細胞）、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）を生成した。２日目に、３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦ（対照）または３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦ＋１０μｇ／ｍｌの様々な抗体（ｒｅｃＥ３Ｃ７（組換え抗ヒトＴＲＥＭ２）、Ｅ３Ｃ７（抗ヒトＴＲＥＭ２）、ｒｅｃＥ３Ｃ７－ロング－ＩＬ２、ｒｅｃＥ３Ｃ７－ショート－ＩＬ２、もしくはＩｇＧ（アイソタイプ対照））を供給した１００μｌのＣ１０培地と、培地を交換した（表１を参照されたい）。５日目に、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、２１４－１４）の添加を全ての条件に加えて、２日目の手順を繰り返した。７日目に、培地を吸引し、細胞を２００μｌのＰＢＳ（－／－）で１回洗浄し、４４Ｋ個の活性化汎Ｔ細胞を、無添加Ｃ１０培地１００μｌ中の異なる条件のＢＭＤＭに添加した。

【0348】

マウスＴ細胞の単離及び活性化
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社（カタログ番号１３０－０９５－１３０）マウス汎Ｔ細胞単離キットを使用して、ＷＴマウスの脾臓（雌、１２週齢）からＴ細胞を単離した。単離したＴ細胞を、Ｕ字型９６ウェル組織培養プレート（０．５μｇ／ウェルの抗マウスＣＤ３（ＢＬＧ－１００３４０）でプレコーティング済み）中で培養した（２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ２８（ＢＬＧ－１０２１１６）を供給した２００μｌのＣ１０培地中に３×１０^５細胞）。細胞を２４時間培養し続けた。対照として、３×１０^５細胞のナイーブＴ細胞を、ＣＤ３コーティングをせず、かつ培地にＣＤ２８を添加せずに、同じプレート内の異なるウェルで培養した。細胞を２４時間培養し続けた。

【0349】

Ｔ細胞とＢＭＤＭの共培養
Ｔ細胞活性化から１日後、活性化Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞をピペットでウェルから取り出し、１５ｍｌチューブに別々に移した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、次いで１００μｌあたり４４Ｋ個の細胞の濃度でＣ１０培地に再懸濁させた。ＰＢＳ（－／－）で洗浄したＢＭＤＭのウェル（１００μｌ容量中に４４Ｋ個の細胞）に、活性化Ｔ細胞を添加した。活性化Ｔ細胞／ナイーブＴ細胞のみの対照として、活性化Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞をＵ字型９６ウェル組織培養プレートに播種した（Ｃ１０ １００μｌあたり４４Ｋ個の細胞）。４２時間後、ＩＦＮｇ放出を測定するために全てのウェルから上清を回収した。

【0350】

マウスインターフェロンガンマ分泌測定
マウスＩＦＮ－γ（ＢＧＬ－４３０８０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びヒトＩＦＮ－γ（ＢＬＧ－４３０１１５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）用のＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔを使用して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）濃度を測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ＰＢＳで希釈した０．２μｇ／ウェルの抗マウスＩＦＮ－γ抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０のＰＢＳ溶液で３回すすぎ、室温（ＲＴ）で１時間、１％ ＢＳＡのＰＢＳようえ気でブロッキングし、再度すすいだ。コーティングしたプレートを、細胞培養上清（１００μｌ／ウェル）とともにＲＴで２時間インキュベートし、再度すすいだ。プレートを、０．１μｇのビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ抗体とともにＲＴで２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをすすぎ、ストレプトアビジン－ＨＲＰとともにＲＴで２０分間インキュベートした。プレートをすすぎ、溶液Ｆ基質（ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とともにＲＴで１０分間インキュベートし、続いて停止溶液として２Ｎの硫酸（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２種の波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。

【0351】

抗ヒトＴＲＥＭ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の設計及びクローニング
抗ヒトＴＲＥＭ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の設計のために、抗ヒトＴＲＥＭ２抗体＃８０Ｅ３Ｃ７の認識ドメインの配列で、ＭＳＧＶ－１Ｄ３－２８Ｚ Ａｌｌ ＩＴＡＭｓ ｉｎｔａｃｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ社 ＃１０７２２６）内の対応するドメインを置き換えた。ＴＲＥＭ２ ＣＡＲ構築物の可変領域配列全体とＴ２Ａ－ＢＦＰとを含むｇｂｌｏｃｋを発注し、制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ社 ＃Ｒ３１９３Ｓ）及びＳａｌＩ（ＮＥＢ社 ＃Ｒ３１３８Ｓ）を使用してＭＳＧＶ－１Ｄ３－２８Ｚにクローニングした。

【0352】

抗ヒトＴＲＥＭ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の産生
６ウェルプレートまたは１０ｃｍプレートで７０～８０％コンフルエントに増殖させたレトロウイルスパッケージングＰＬＡＴ－Ｅ細胞をトランスフェクトすることにより、レトロウイルス粒子を産生させた。トランスフェクションの５時間前に、ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない補充ＤＭＥＭをＰＬＡＴ－Ｅ細胞に提供した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社 ＃１１６６８０２７）を製造業者の指示の下で使用して実施し、レトロウイルスパッケージングベクターＰｃｌ－Ｅｃｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ社 ＃１２３７１）及びレトロウイルスＣＡＲ Ｔ発現プラスミドを含めた。トランスフェクションの５～１３時間後に培地を交換した。４８時間後、蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクション効率を調査した。レトロウイルス粒子を含有する培地をトランスフェクションの４８～７２時間後に回収した。Ｔ細胞を、マウス汎Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社 ＃１３０－０９５－１３０）を使用して、８～１２週齢の雌ＷＴマウスの脾臓から単離した。細胞を、２５０ｎｇ／ウェルの抗ＣＤ３ｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社 ＃１６－００３１－８２）でコーティングした２４組織培養プレート上で、１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ２及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社 ＃１０２１０２）を補充したＲＰＭＩ培地でインキュベートした。レトロウイルス粒子をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社 ＃Ｔ１００Ａ）でコーティングした２４ウェル非組織培養用プレートに添加し、３２℃、２０００ｇで２時間遠心分離することにより、Ｔ細胞へのレトロウイルス形質導入を実施した。Ｔ細胞をウイルススープ（ｖｉｒａｌ ｓｏｕｐ）の上部に添加し、続いて４００ｇで１０分間遠心分離した。細胞を２～５日間さらに増殖させ、十分な細胞数に到達させた。

【0353】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及び骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の分化
ＷＴマウス、ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）マウス、及びｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウスのマウス骨髄細胞を、３０ｎｇ／ｍＬのｈＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－２５）の存在下で７日間培養し、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）を生成した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を生成するために、細胞を３０ｎｇ／ｍＬのｈＧＭ－ＣＳＦサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３００－０３）の存在下で７日間培養した。

【0354】

ＴＲＥＭ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の共培養
ＴＲＥＭ２ ＣＡＲ Ｔ細胞を、野性型２９３ＨＥＫまたはｈＴＲＥＭ２過剰発現２９３ＨＥＫ、ＣＤ１４＋由来のｈＭ２及びｈＤＣ、ならびにＷＴマウス、ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）マウス、またはｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウス由来のＢＭＤＭまたはＢＭＤＣと１：１の比で共培養した。ＢＦＰ発現Ｔ細胞を、Ｔ細胞応答のａｃ対照（ａｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。全ての細胞を、ポリＬリジンでコーティングした９６組織培養プレートに播種し、２４時間培養した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ用に上清を採り、フローサイトメトリーを使用したさらなる分析のために細胞を採った。

【0355】

ヒトインターフェロンガンマ分泌測定
ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社 ＃４３０８０４）を使用してＥＬＩＳＡを行った。９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ＰＢＳで希釈した０．２μｇ／ウェルの抗マウスＩＦＮ－γ抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ中の０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０で３回すすぎ、室温（ＲＴ）で１時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロッキングし、再度すすいだ。プレートを、細胞培養上清（１００μｌ／ウェル）とともにＲＴで２時間インキュベートし、再度すすいだ。プレートを、０．１μｇのビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ抗体とともにＲＴで２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをすすぎ、ストレプトアビジン－ＨＲＰとともにＲＴで２０分間インキュベートした。プレートをすすぎ、ＴＭＢ試薬とともにＲＴで２０分間インキュベートし、続いてＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２Ｎ Ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ（ＤＹ９９４、Ｒ＆Ｄ社）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、２波長（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）でＯＤを測定した。

【0356】

フローサイトメトリー分析－ＣＡＲＴ分析
マウスＴ細胞を回収し、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ８ａ抗体、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５抗体、ＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ１０７抗体、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ２７９（ＰＤ１）抗体で染色し、続いてＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いでフローサイトメーター（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｓ６ ＢＤ社）によって分析した。

【実施例1】

【0357】

モノクローナル抗ＴＲＥＭ２結合のスクリーニング
本発明者らは、マウス抗ヒトＴＲＥＭ２（ｈＴＲＥＭ２）モノクローナル抗体を産生させ、精製し（上記を参照されたい）、これらのｍＡｂのｈＴＲＥＭ２に対する感度及び特異性結合についてスクリーニングした。スクリーニングは、最初にＴＲＥＭ２組換えタンパク質の結合を測定し（表２、図５）、加えてｈＴＲＥＭ２発現２９３ＨＥＫ細胞に対するｍＡｂ結合能をＷＴと比較することにより実行した（表３、図２～図３、図６のＡ～Ｂ）。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）が多量のＴＲＥＭ２を発現することが見出された。本発明者らは、ヒトＴＲＥＭ２（ｈＴＲＥＭ２）トランスジェニックマウスから骨髄細胞を抽出し、それらを骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の分化に使用した。ｈＴＲＥＭ２ ＢＭＤＭを抗体の追加の結合スクリーニングに使用した（図４のＡ～Ｂ、図６のＡ～Ｂから図７）。

【0358】

表１
ヒトＴＲＥＭ２タンパク質に対する１８種のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の要件の概要。
純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定する。エンドトキシンの量（ＥＵ／ｍｇ）はＬＡＬアッセイにより測定する。力価は直接ＥＬＩＳＡにより測定し、表題の値（ｔｉｔｌｅ ｖａｌｕｅ）はＳ／Ｂ（シグナル／ブランク）が≧２．１である最高希釈である。

【0359】

【表3】

【0360】

表２
ヒトＴＲＥＭ２タンパク質に対する１８種のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の直接ＥＬＩＳＡ分析
コーティング抗原：Ｈｉｓ－ＴＲＥＭ２、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４、１００μｌ／ウェル。
抗体ストック濃度：１ｍｇ／ｍＬ
二次抗体：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆｃｇ断片特異的（ｍｉｎ Ｘ ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質）
力価はＳ／Ｂ（シグナル／ブランク）が≧２．１である最高希釈である。

【0361】

【表4】

【0362】

表３－２９３ＨＥＫ細胞をｈＴＲＥＭ２遺伝子に安定的に感染させ、続いてピューロマイシン選択を行った。
Ａ．細胞培養上清（Ｓｕｐ）を、直接ＥＬＩＳＡによる１８種のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質結合能試験に使用した。
Ｂ．細胞を９６ウェルプレートに捕捉し、１８種のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の細胞ベースのＥＬＩＳＡに使用した。
陽性細胞（ｈＴＲＥＭ２発現ＨＥＫ２９３）及び陰性細胞（野性型ＨＥＫ２９３）のＯＤ値を表に示す。

【0363】

【表5】

【実施例2】

【0364】

モノクローナル抗ＴＲＥＭ２拮抗剤のスクリーニング
ＴＲＥＭ２の機能喪失がいくつかのマウス同系腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の低減を示したため、本発明者らは、抗ＴＲＥＭ２モノクローナル抗体の遮断活性を効果的にスクリーニングするためのアッセイを設計した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βなどの抑制性サイトカインを高レベルで産生することが公知である（Wang, BMC Immunology 2013 14:6）。ＴＲＥＭ２がＢＭＤＭ細胞の成熟及び抑制機能において役割を果たしているか否かを決定するために、本発明者らは、ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）マウス及びｈＴＲＥＭ２トランスジェニック（ｈＴＲＥＭ２）マウスの大腿骨及び脛骨由来の骨髄細胞をＭ－ＳＣＦの存在下で７日間培養し（方法）、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して経時的成熟経過を特徴付けた。各時点／遺伝子型からの細胞のクラスタリング分析及び２ｄ投影により、５日目に始まり７日目に最大の表現型を示す、ＴＲＥＭ２－ＫＯ遺伝子型とｈＴＲＥＭ２の経過との間で相違している明確な成熟経過が示された。野性型ｈＴＲＥＭ２ ＢＭ細胞は、７日目にＧｐｎｍｂ、Ｌｐｌ、Ａｎｘａ１、Ｍｍｐ１２、Ａｄａｍ８、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、Ｓｐｐ１、及びＬｉｌｒｂ４ａの高発現を伴うＭ２表現型を示す一方で、ＴＲＥＭ２－ＫＯ ＢＭ遺伝子型は、Ｓｅｌｅｎｏｐ、Ｍｓ４ａ４ａ、Ｆｃｇｒ２ｂ、Ｍｓ４ａ７、及びＬｙｚ２を含む活性化Ｍ１表現型を呈した（図８のＡ～Ｂ）。ＴＲＥＭ２に対する拮抗活性を有する抗体をスクリーニングするために、本発明者らは、ｈＴＲＥＭ２マウス骨髄細胞をＭ－ＣＳＦとともに培養し、培養２日目及び５日目に抗ｈＴＲＥＭ２抗体またはＩｇＧアイソタイプを培地に添加した（１０μｇ／ｍＬ）。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、７日目に細胞を特徴付け、各条件でのＭ２表現型（ＴＲＥＭ２＋Ｇｐｎｍｂ＋）とＭ１表現型（ＴＲＥＭ２－）の間の細胞分布を特徴付けた。ＴＲＥＭ２－ＫＯ細胞の７０％超がＭ１表現型に達し、１０％未満がＭ２表現型を示したのとは対照的に、ｈＴＲＥＭ２細胞は、４０％がＭ２表現型を示し、わずか２４％がＭ１表現型を示した。培養物にＩｇＧアイソタイプｍＡｂを添加すると、Ｍ１／Ｍ２比は著しく変化せず、未処理培養物と類似した結果が示されたが、抗ｈＴＲＥＭ２ ｍＡｂ ５４Ｈ２Ｃ１または８０Ｅ３Ｃ７を添加すると、Ｍ２表現型のパーセンテージがそれぞれ１２％及び１６％へと劇的に低減し、Ｍ１表現型は６９％及び６３％に増加し（図８のＣ）、ＴＲＥＭ２－ＫＯ細胞と極めて類似した成熟経過が示された。

【0365】

ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍関連マクロファージ及びＭｒｅｇに対する抗ｈＴＲＥＭ２ ｍＡｂの結合特異性を定量するために、本発明者らは、ＭＣＡ－２０５誘発腫瘍を担持するヒト化ＴＲＥＭ２マウスにおいて、ビオチンコンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２である５４Ｈ２Ｃ１、８０Ｅ３Ｃ７、及び８３Ｅ１０Ｂ１２ ｍＡｂのＥＬＩＳＡ分析を実施した。ｍＡｂ ５４Ｈ２Ｃ１、８０Ｅ３Ｃ７について、本発明者らは、ＬＮ、肝臓、腎臓、肺、心臓、脳、及び脾臓と比較して、腫瘍ＴＭＥにおけるｍＡｂ濃度が２倍超濃縮されていることを検出した。ｍＡｂ ８０Ｅ３Ｃ７は、大部分が肝臓及び腎臓に集中していた（図９～図１０のＡ～Ｂを参照されたい）。

【実施例3】

【0366】

本発明のいくつかの実施形態の抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒト単球由来マクロファージをリプログラムする
ヒトミエロイド細胞における拮抗剤ＴＲＥＭ２ Ａｂ Ｅ３Ｃ７の効果を調査するために、健常ドナー３名の血液から精製したＣＤ１４＋単球を５日間、ヒトＭ－ＣＳＦの存在下でマクロファージに分化させた。得られた単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を「Ｍ２」活性化サイトカインＩＬ４で２４時間刺激し、ＴＡＭ様細胞へのＭＤＭ極性化を生じさせた。それらＴＡＭ様細胞の細胞表面へのＴＲＥＭ２ Ａｂの抗体結合のフローサイトメトリー分析により、ＴＲＥＭ２の発現を調査した（図１１）。細胞培養物を３日目からＴＲＥＭ２ Ａｂまたは同等のＩｇＧ対照で処理し、続いて単球からＴＡＭへの経過マーカー（ｑＰＣＲ）及びタンパク質分泌（ＥＬＩＳＡ）を分析した。

【0367】

３つの主要なカテゴリ：（ａ）Ｉ型インターフェロン活性－ＩＦＩ６（インターフェロンアルファ誘導性タンパク質６）、（ｂ）炎症誘発性ケモカインＩＬ－８及びＣＣＬ２３、（ｃ）炎症時に活発に放出され、白血球動員を刺激し、サイトカイン分泌を誘導することにより重大な役割を果たす、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８及びＡ９（Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９）から、代表的な遺伝子を選択した。図１２のＡ～Ｂに示すように、Ｅ３Ｃ７による細胞培養物の処理により、試験したドナー３名中３名でＣＣＬ２３、ＩＦＩ６、Ｓ１００Ａ８、及びＳ１００Ａ９の発現（Ａ）、ならびにＩＬ８の分泌上昇（Ｂ）が誘導された。

【0368】

結果から、拮抗剤ＴＲＥＭ２ ＡｂがＭＤＭ分化に干渉し、免疫抑制性ＴＡＭを炎症誘発性単球様細胞（本明細書では「Ｍ１様マクロファージ」とも称される）にリプログラムすることが実証される。

【0369】

抗ＴＲＥＭ２ ｍＡｂで処理した単球由来マクロファージに対する抗ＴＲＥＭ２ ｍＡｂの効果をさらに特徴付けるために、２つの分化条件（Ｍ－ＣＳＦのみまたはＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４）及び３つの処理（抗ＴＲＥＭ２ Ｅ３Ｃ７、ＩｇＧ対照、またはｍＡｂなし）による単一細胞ＲＮＡシーケンシングを使用してＭＤＭ培養をプロファイリングした。６つの条件からの細胞の２ｄ投影により、特異的なＩＬ－４効果及び特異的な抗ＴＲＥＭ２効果が示された（図１３のＡ～Ｃ）。抗ＴＲＥＭ２ ｍＡｂで処理した細胞では、Ｓ１００Ａ８、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２３、及び他の炎症誘発性遺伝子の発現増加が観察され、より免疫活性の高いＭ１様マクロファージへの強力なリプログラミングが示された（図１４）。

【実施例4】

【0370】

抗ＴＲＥＭ２抗体は腫瘍増殖を減弱させ、腫瘍マクロファージをリプログラムする
ＴＲＥＭ２遮断がｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージをリプログラムするか否かを試験するために、腫瘍担持マウス（ＭＣＡ２０５同系モデル）を抗ＴＲＥＭ２抗体（Ｅ３Ｃ７）またはＩｇＧ対照で処理した。５００Ｋ個のＭＣＡ－２０５細胞を、ヒト化ＴＲＥＭ２マウスに皮下注射し、６日目及び９日目にマウスを抗ＴＲＥＭ２抗体またはＩｇＧ対照で処理し、１０日目に腫瘍を採取し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用してＣＤ４５＋陽性細胞をシーケンシングした。抗ＴＲＥＭ２（Ｅ３Ｃ７）で処理したマウスは、対照と比較してＩ型インターフェロンＴＡＭの割合の増加を示し、一方でＣＤ８機能不全Ｔ細胞（高ＰＤＣＤ１及びＬＡＧ３）は、Ｅ３Ｃ７処理動物において対照と比較して低減した（図１５のＡ～Ｂ）。ＩｇＧ対照と比較したＥ３Ｃ７処理の腫瘍マクロファージの差次的遺伝子発現分析により、Ｃｃｌ７、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ６、及びＣｃｌ１２ケモカインに加えて、Ｉｆｉｔ１、Ｉｆｉｔ２、Ｉｒｆ７などのＩ型ＩＦＮ遺伝子の増加が明らかとなった（図１６）。

【実施例5】

【0371】

抗ＴＲＥＭ２抗体のサイトカインコンジュゲーションはミエロイドリプログラミング及びＴ細胞活性化を増強させる
抗ｈＴＲＥＭ２抗体と炎症性サイトカインの相乗効果を調査するために、分化中にヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）を抗ＴＲＥＭ２抗体、ヒトＩＬ２（２００－０２－５０、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、ヒトＩＬ１５（２００－１５－５０、ｐｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、ヒトＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＡＦ－３１５－０３－１０００）、ヒトＩＬ１２（Ｒ＆Ｄ社、１００１８－ＩＬ）、または抗ＴＲＥＭ２とサイトカインのうちの１つとの組み合わせのいずれかで処理した（図１７のＡ～Ｂ）。遺伝子発現分析（図１７のＡ）は、単球遺伝子（Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８）及び炎症関連遺伝子（ＣＣＬ２３、ＩＦＩ６、ＣＣＬ１８）が抗ＴＲＥＭ２処理後に上昇し、抗ＴＲＥＭ２とＩＬ２またはＩＬ１５との組み合わせによる処理後に増加したことを示している。加えて、炎症性サイトカイン（図１７のＢ）の分泌は、抗ＴＲＥＭ２またはサイトカインの投与後に上昇し、抗ＴＲＥＭ２とＩＬ２またはＩＬ１５との組み合わせによる処理後に増加した。

【0372】

図１８のＡ～Ｂにおける増殖性Ｔ細胞のパーセンテージの上昇によって見ることができるように、抗ＴＲＥＭ２で処理したｈＭＤＭは、Ｔ細胞抑制能の低減を示す。さらに、この低減は、Ｍ２マクロファージまたはＴ細胞－マクロファージ共培養系のいずれかにＩＬ２またはＩＬ１５サイトカインを添加した後に増殖させる。

【0373】

組換え抗ヒトＴＲＥＭ２抗体を、ヒトＩＬ２サイトカインに接合させずにまたは接合させてのいずれかで生成した（図２４の表は２つのバージョンを示しており、１つはショートリンカーを有し、もう１つはロングリンカーを有しており、それぞれ配列番号４９６及び４９８または配列番号４９７及び４９９である）。

【0374】

ＴＲＥＭ２に対する生成した抗体の結合特性を試験した（図１９のＡ～Ｄ）。コンジュゲート抗体は、組換え抗ｈＴＲＥＭ２抗体と同様に、組換えＴＲＥＭ２（図１９のＡ）及び可溶性ＴＲＥＭ２（図１９のＤ）の両方に結合することが示された。生成した分子上のサイトカインの存在を確認するために、ｈＴＲＥＭ２に結合した抗体上でｈＩＬ２を検出した（ＢＬＧ－５００３０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、図１９のＢ及びＥ）。

【0375】

次に、初代ヒトＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞を活性化する能力について、コンジュゲート抗体を試験した（図２０のＡ～Ｂ）。細胞を、活性化させてまたはさせずに、抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下でまたは組換えタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに培養した。

【0376】

増殖ＣＤ８＋細胞のパーセンテージは、組換えＩＬ２による刺激と同様に、ＩＬ２コンジュゲート抗体によって上昇することが見出された（図２０のＡ）。これは、活性化ＣＤ８＋細胞と非活性化ＣＤ８＋細胞の両方に当てはまった。組換え非コンジュゲート抗ｈＴＲＥＭ２による刺激は、増殖に影響を及ぼさなかった。ＩＬ２コンジュゲート抗体は、組換えＩＬ２による刺激と同様に、シミュレーションの２４時間後及び４日後に抗ＴＲＥＭ２抗体と比較してＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ－ｇ分泌を刺激した（図２０のＢ）。同様に、ＩＬ２コンジュゲート抗体は、２４時間時点で抗ＴＲＥＭ２抗体と比較してＣＤ４＋細胞によるＩＦＮ－ｇ分泌を刺激した（図２０のＢ）。

【0377】

ＴＲＥＭ２発現マクロファージにＩＬ２サイトカインを送達して所望の活性を発揮する（Ｔ細胞応答を強化する）抗体の能力を検証するために、次のとおりにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施した。ヒト化ＴＲＥＭ２マウスから骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を単離した。２つの時点で、これらの細胞を抗ヒトＴＲＥＭ２抗体（ヒトＩＬ２に接合したものと接合していないものの両方）で処理し、次いで様々な処理を行ったＢＭＤＭがＴ細胞応答を抑制／活性化する能力を試験した。

【0378】

ＩＬ－４で刺激した骨髄由来マクロファージは、免疫抑制性表現型（Ｍ２状態）を有するため、Ｔ細胞応答を阻害する。Ｔ細胞によるＩＦＮｇ放出は、Ｔ細胞の活性及び応答の直接的指標であり、Ｔ細胞はＩＦＮｇを放出するほど活性化されており、逆もまた同様である。したがって、本結果は、未処理ＢＭＤＭと共培養した活性化Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞のみの対照と比較して実際により阻害されたことを示している。さらに、抗ヒトＴＲＥＭ２（ｒｅｃＥ３Ｃ７とＥ３Ｃ７の両方）で処理したＢＭＤＭは、未処理対照ほど、次いでアイソタイプＩｇＧ対照ほどＴ細胞を阻害せず、ＩｇＧアイソタイプ対照は同じ効果を生じさせなかった（図２１）。さらに、結果から、コンジュゲート抗ＴＲＥＭ２－ＩＬ２処理（ヒトＩＬ２のショート型及びロング型の両方）が、ｒｅｃＥ３Ｃ７ ＢＭＤＭと共培養した活性化Ｔ細胞と比較した場合、Ｔ細胞応答を４．２～５倍高く強化したことが示された（図２１）。

【実施例6】

【0379】

ＴＲＥＭ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の標的化
ＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞を認識し枯渇させることを目的としたＣＡＲＴ細胞を産生させた。この設定では、８０Ｅ３Ｃ７モノクローナルＡｂの高親和性（低ナノモルからピコモルの範囲）認識ドメインを使用した。結果から、ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞が、効果的な細胞傷害性応答を開始し、かつヒトＴＲＥＭ２発現ミエロイド細胞及び免疫抑制性マクロファージを枯渇させることができることが実証された。

【0380】

最初に、ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＲＥＭ２を認識することを検証するために、ＴＲＥＭ２発現細胞株を使用した。ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＲＥＭ２を過剰発現するＨＥＫ２９３と１：１の比で共培養した（図２２のＡ～Ｂ）。陽性対照として、活性化ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ ＴをＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとともに使用し、またＣＤ１９－ＣＡＲ培養物をＡ２０細胞株とともに使用した。さらに、モックＣＡＲを形質導入したＴ細胞（ＢＦＰ Ｔ細胞）及びＴＲＥＭ２発現のないＨＥＫ２９３を使用した。２４時間後にＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを実施したところ、ＴＲＥＭ２を過剰発現するＨＥＫ２９３と共培養した場合にＣＡＲ－ＴＲＥＭ２ Ｔ細胞の劇的なＩＦＮ－γ分泌が示された。ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞及びビーズ活性化にのみ一致する有意な増加を示す活性化（ＣＤ２５及びＰＤ１）及び死滅（ＣＤ１０７）に関するマーカーを用いたフローサイトメトリーを使用して、結果を検証した。ＨＥＫ２９３との非特異的応答は観察されなかった。これらの結果から、ＴＲＥＭ２に対するＣＡＲ－ＴＲＥＭ２ Ｔ細胞の応答が非常に特異的かつ強力であることが示された。

【0381】

この知見をヒト環境で検証するために、ＣＤ１４＋単球をヒト血液から精製し、細胞を１週間にわたりＴＡＭ様細胞及び樹状細胞に分化させた。ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、両方の産物及び未分化ヒトＣＤ１４＋とともに１：１の比で培養した（図２２のＣ～Ｅ）。陽性対照として、活性化ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとともに使用し、またＨＥＫ２９３ ＴＲＥＭ２＋とともに培養した。先と同様に、モックＣＡＲを形質導入したＴ細胞（ＢＦＰ Ｔ細胞）を陰性対照として使用した。図２２のＣに示すように、２４時間後、ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞とともに培養したヒトＴＡＭ様細胞を呈する全てのマクロファージが完全に一掃されたことが観察されたが、モックＴ細胞は何らの応答も示さなかった。ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析を上記のとおりに再度実施した。本結果は、ヒト環境においても、ヒトＴＡＭ様細胞を枯渇させる際のＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性及び細胞傷害性能が高いことを示す。

【0382】

ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性及び効力をさらに検証するために、ヒト化ＴＲＥＭ２マウス、ＴＲＥＭ２^ＫＯマウス、及びｗｔマウスの骨髄由来細胞から分化させたＢＭＤＭ及びＢＭＤＣ（図１２のＦ）を比較した。上記と同様の実験設定を使用した。本結果から、ＴＲＥＭ２－ＣＡＲ Ｔ細胞をヒト化ＴＲＥＭ２マウス由来の分化細胞とともに培養した場合のみ、有意に強力な殺傷応答が示された。

【0383】

本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替例、修正例、及び変形例が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広範な範囲内に入る全てのかかる代替例、修正例、及び変形例が包含されることが意図される。

【0384】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個々に示されているのと同程度まで、その全体が参照により本明細書に援用される。加えて、本出願における任意の参照文献の引用または特定は、かかる参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されてはならない。セクション見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。

【0385】

加えて、本出願の任意の優先権書類は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【国際調査報告】