特表 2024-532758 筋ジストロフィーの治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】筋ジストロフィーの治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240903BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N5/10

C12N5/071

C12N15/35

A61K48/00

A61P21/00

A61K35/76

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508324

(86)(22)【出願日】2022-08-11

(85)【翻訳文提出日】2024-04-05

(86)【国際出願番号】 US2022040030

(87)【国際公開番号】W WO2023018854

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】63/231,720

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】521254373

【氏名又は名称】ソリッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリスティ・ジーン

(72)【発明者】

【氏名】グリーン，ジェニファー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA941

4C084ZA942

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA56

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA94

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA56

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA94

(57)【要約】

本明細書に記載の本発明は、低減されたＣｐＧ島を有するマイクロジストロフィンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド、及びＤＭＤ／ＢＭＤなどの筋ジストロフィーの治療におけるその使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２のマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチド。

【請求項2】

各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

配列番号１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

配列番号１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムであって、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、前記ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にパッケージングすることができる、前記ＡＡＶベクターゲノム。

【請求項10】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶカプシドと、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムと、を含み、前記ＡＡＶベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド内にカプシド形成される、前記ｒＡＡＶ粒子。

【請求項11】

前記ポリヌクレオチドが、転写調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項９に記載のＡＡＶベクターゲノムまたは請求項１０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項12】

前記転写調節エレメントが、プロモーターを含む、請求項１１に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項13】

前記プロモーターが、筋特異的プロモーターである、請求項１２に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項14】

前記筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５～１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である、請求項１３に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項15】

前記筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーターであり、任意選択で、前記ＣＫ８プロモーターが、配列番号３または４のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項16】

前記ベクターゲノムが、配列番号８のポリＡシグナル配列などのポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項17】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号９）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１０）、またはウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１１）を含む、請求項１６に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項18】

前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列などの３’ＩＴＲ配列を更に含む、請求項９～１７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項19】

前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列などの５’ＩＴＲ配列を更に含む、請求項９～１８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項20】

前記５’ＩＴＲ配列及び／または前記３’ＩＴＲ配列が、（１）それぞれ、配列番号１２及び１３を含むか、もしくはそれらであるか、または（２）それぞれ、配列番号２４及び２７を含むか、もしくはそれらである、請求項１８または１９に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項21】

前記ベクターゲノムが、前記マイクロジストロフィンの発現を増強するイントロン及び／またはエクソン配列を更に含む、請求項９～２０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項22】

前記イントロンが、配列番号１４を含む、請求項２１に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項23】

前記ベクターゲノムが、５’ＵＴＲ配列及び／または３’ＵＴＲ配列を更に含む、請求項９～２０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項24】

配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項９～２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項25】

前記カプシドが、ＳＬＢ－１０１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３２、またはＡＡＶｈｕ３７の血清型のものである、請求項１０～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項26】

前記カプシドが、ＳＬＢ－１０１またはＡＡＶ９の血清型のものである、請求項１０～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項27】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子であって、ＳＬＢ－１０１またはＡＡＶ９カプシドと、その中にカプシド形成されたベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、配列番号２のＭＤ５マイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項28】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項29】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のヌクレオチド配列を含み、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一である、請求項２７に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項30】

前記ベクターゲノムが、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された筋特異的制御エレメントを含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項31】

前記筋特異的制御エレメントが、配列番号３または４のヌクレオチド配列のＣＫ８プロモーターなどのＣＫ８プロモーターを含む、請求項３０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。

【請求項32】

前記ベクターゲノムが、配列番号８を含むポリＡシグナル配列などのポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス粒子。

【請求項33】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（配列番号９）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（配列番号１０）、またはウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列（配列番号１１）を含む、請求項３２に記載のＡＡＶウイルス粒子。

【請求項34】

前記ベクターゲノムが、配列番号３’ＩＴＲなどの３’ＩＴＲ配列と、配列番号５’ＩＴＲなどの５’ＩＴＲ配列と、を更に含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス粒子。

【請求項35】

配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２７～３４のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス粒子。

【請求項36】

請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、請求項９～３５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項37】

静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、もしくはくも膜下腔内投与に好適であるか、またはそれ用に製剤化される、請求項３６に記載の薬学的組成物。

【請求項38】

筋ジストロフィーの治療を必要とするヒトにおいて、それを行う方法であって、前記ヒトに、治療有効量の請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９～３５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子、または請求項３６もしくは３７に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項39】

前記筋ジストロフィーが、ジストロフィン遺伝子における変異の機能喪失を特徴とする、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖拡張型心筋症である、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、約１×１０^１２～約１×１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、または約１×１０^１３～約１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与される、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項９～３５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子を含む、宿主細胞。

【請求項43】

ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、またはＭＲＣ－５細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。

【請求項44】

前記宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞または２９３／２９３Ｔ細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／２３１，７２０号の出願日に対する優先権及びその利益を主張するものであり、任意の図面及び配列表を含むその全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、進行性衰弱及び筋肉量の損失を引き起こす疾患群である。筋ジストロフィーでは、異常遺伝子（変異遺伝子）は、健康な筋肉を形成するために必要な機能性の野生型タンパク質を産生しない。

【0003】

筋ジストロフィーは、罹患患者の生活の質を深刻に悪化させる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生男児の５，０００人に１人が罹患する最も深刻な筋肉疾患のうちの１つである。これは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の変異に起因する最もよく特徴付けられた筋ジストロフィーである。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格連結の喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。

【0004】

具体的には、ＤＭＤはＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされ、ＤＭＤのｍＲＮＡの減少、及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７－ｋＤａの筋鞘タンパク質であるジストロフィンまたは機能性ジストロフィンの欠如につながる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－９２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋肉の筋鞘において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞骨格との間に、アクチン結合タンパク質であるジストロフィン、及び、ラミニン結合タンパク質であるアルファ－ジストログリカンを介した構造的関連を形成する複数のタンパク質で構成されている。これらの構造的関連は、収縮時に筋細胞膜を安定させ、収縮による損傷を防ぐように作用する。

【0005】

ＤＭＤ遺伝子突然変異の結果としてのジストロフィンの損失により、ジストロフィン糖タンパク質複合体が破壊され、筋膜の脆弱性が増加する。筋形質へのカルシウムの流入、プロテアーゼ及び炎症促進性サイトカインの活性化、ならびにミトコンドリア機能不全を含む一連の事象は、進行性の筋変性をもたらす。更に、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の転位は、組織虚血、酸化ストレスの増加、及び修復の障害に寄与する。疾患の進行は、筋壊死、線維化、及び脂肪組織置換の増加、ならびにその後の筋生検で見られる線維サイズの変化の程度がより大きいことによって特徴付けられる。

【0006】

現在のところ、ＤＭＤの治療法はない。標準治療としては、コルチコステロイド（プレドニゾンまたはデフラザコートなど）を投与して、筋力及び機能を安定させること、独立歩行を延長させること、ならびに脊柱側彎症及び心筋症を遅延させること、ビスホスフォネート、ならびにデノスマブ及び組換え副甲状腺ホルモンが挙げられる。

【0007】

遺伝子治療の出現により、ＤＭＤ治療の研究及び臨床試験は、ジストロフィン機能を少なくとも部分的に回復させることを目的とした遺伝子置換または他の遺伝子治療に焦点を合わせている。これらには、ジストロフィン遺伝子の機能性コピー、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子の供給、またはエクソンスキッピング及びナンセンス変異抑制による欠陥ジストロフィン遺伝子産物の修復が含まれる。

【0008】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂの長さであり、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。

【0009】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の機能を有する。培養細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症状及び無症候である。更に、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染するため、インビボで多くの異なる組織を標的にすることが可能になる。更に、ＡＡＶは、分裂が遅い細胞及び非分裂細胞への形質導入を引き起こし、基本的にそれらの細胞の生涯にわたって、転写活性のある核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化されたＤＮＡとして感染性であり、これにより、組換えゲノムの構築が可能になる。更に、ＡＡＶの複製、ゲノムのカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部または全て（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡ、例えば、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットと交換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、ｔｒａｎｓで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、これが非常に安定した豊富なウイルスであるということである。アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存はそれほど重要ではない。ＡＡＶは、凍結乾燥される場合さえある。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重複感染に対して耐性はない。

【0010】

複数の研究により、筋肉では、長期（＞１．５年）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証された。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。更に、筋肉は、高度に血管形成されるため、組換えＡＡＶ形質導入は、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後、体循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。更に、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正確な抗体グリコシル化、フォールディング、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉は、分泌タンパク質治療の安定発現が可能であることを実証している。

【0011】

ＡＡＶ送達マイクロジストロフィン構築物の発現レベルを最適化するために、マイクロジストロフィンコード配列は、筋細胞などの標的細胞における最適な発現のために最適化され得る。しかしながら、多くの従来のコドン最適化プロセスは、不注意にコドン最適化コード配列にＣｐＧモチーフを導入する。メチル化ＣｐＧモチーフまたはＣｐＧ島は、遺伝子発現を抑制する傾向がある一方、非メチル化ＣｐＧモチーフは、ウイルス構築物に対する高い免疫原性を誘発する傾向がある。

【発明の概要】

【0012】

本発明の一態様は、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0013】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なる。

【0014】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0015】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0016】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0017】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0018】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

【0019】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列からなる。

【0020】

本発明の別の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムであって、本発明のポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にパッケージングすることができる、ＡＡＶベクターゲノムを提供する。

【0021】

本発明の別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶカプシドと、本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムと、を含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にカプシド形成される、ｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0022】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ポリヌクレオチドは、転写調節エレメントに作動可能に連結されている。

【0023】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、転写調節エレメントは、プロモーターを含む。

【0024】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、プロモーターは、筋特異的プロモーターである。

【0025】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、筋特異的プロモーターは、ＣＫ８プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５～１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。

【0026】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、筋特異的プロモーターは、ＣＫ８プロモーターであり、任意選択で、該ＣＫ８プロモーターは、配列番号３または４のヌクレオチド配列を含む。

【0027】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列、例えば、配列番号８のポリＡシグナル配列を更に含む。

【0028】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号９）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１０）、またはウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１１）を含む。

【0029】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ベクターゲノムは、３’ＩＴＲ配列、例えば、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列を更に含む。

【0030】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ配列、例えば、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列を更に含む。

【0031】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、５’ＩＴＲ配列及び／または３’ＩＴＲ配列は、それぞれ、配列番号１２及び１３を含むか、またはそれらである。

【0032】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ベクターゲノムは、マイクロジストロフィンの発現を増強するイントロン及び／またはエクソン配列を更に含む。

【0033】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、イントロンは、配列番号１４を含む。

【0034】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、ベクターゲノムは、５’ＵＴＲ配列及び／または３’ＵＴＲ配列を更に含む。

【0035】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0036】

ある特定の実施形態において、ウイルス粒子のカプシドは、ＳＬＢ－１０１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３２、またはＡＡＶｈｕ３７の血清型のものである。

【0037】

ある特定の実施形態において、カプシドは、ＳＬＢ－１０１またはＡＡＶ９の血清型のものである。

【0038】

本発明の別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子であって、ＳＬＢ－１０１またはＡＡＶ９カプシドと、その中にカプシド形成されたベクターゲノムと、を含み、該ベクターゲノムが、配列番号２のＭＤ５マイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。

【0039】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

【0040】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のヌクレオチド配列を含み、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一である。

【0041】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された筋特異的制御エレメントを含む。

【0042】

ある特定の実施形態において、筋特異的制御エレメントは、配列番号３または４のヌクレオチド配列のＣＫ８プロモーターなどのＣＫ８プロモーターを含む。

【0043】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号８を含むポリＡシグナル配列などのポリアデニル化シグナル配列を更に含む。

【0044】

ある特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（配列番号９）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（配列番号１０）、またはウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列（配列番号１１）を含む。

【0045】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号３’ＩＴＲなどの３’ＩＴＲ配列と、配列番号５’ＩＴＲなどの５’ＩＴＲ配列と、を更に含む。

【0046】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0047】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドと、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

【0048】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、もしくはくも膜下腔内投与に好適であるか、またはそれ用に製剤化される。

【0049】

本発明の別の態様は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒトにおいて、それを行う方法であって、ヒトに、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子、または本発明の薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0050】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子における変異の機能喪失を特徴とする。

【0051】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖拡張型心筋症である。

【0052】

ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、約１×１０^１２～約１×１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、または約１×１０^１３～約１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与される。

【0053】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。

【0054】

ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、またはＭＲＣ－５細胞である。

【0055】

ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞または２９３／２９３Ｔ細胞である。

【0056】

本明細書に記載の本発明の任意の一実施形態は、例にのみ記載されるか、または上記もしくは以下のセクションのうちの１つにのみ記載されるそれらの実施形態を含む本発明の任意の１つ以上の追加の実施形態、あるいは本発明の一態様と組み合わせることができることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】配列番号２をコードする天然（コドン最適化されていない）ヒトマイクロジストロフィンコード配列について、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによって１つのＣｐＧ島が特定された。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。

【図2】配列番号２をコードする第１のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列について、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによって９つのＣｐＧ島が特定された。コドン最適化を、Ｇｅｎｅ Ａｒｔを使用して行った。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。

【図3】配列番号２をコードする第１のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列において９つの特定されたＣｐＧ島を除去することから生じる、配列番号１についてのＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによってＣｐＧ島は特定されなかった。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。

【図4】配列番号２をコードする第２のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列について、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによって４つのＣｐＧ島が特定された。コドン最適化は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔを使用して行った。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。

【図5】配列番号２をコードする第３のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列について、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによって１１のＣｐＧ島が特定された。コドン最適化は、ＤＮＡ２．０を使用して行った。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。

【図6】配列番号２をコードする第４のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列について、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールから出力された結果を示す。オンラインツールによって１０のＣｐＧ島が特定された。コドン最適化は、第１のコドン最適化ヒトマイクロジストロフィンコード配列（Ｇｅｎｅ Ａｒｔによって最適化されたコドン）を入力として使用して、ＤＮＡ２．０を使用して行った。選択されたパラメータ：ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０。したがって、異なる方法を使用した連続コドン最適化ラウンドは、ＣｐＧ島を排除しなかった。

【図7】実施例２に記載したＴＬＲ９アッセイの概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0058】

１．概要
本明細書に記載の本発明は、ある特定のコドン最適化マイクロジストロフィンコード配列のＣｐＧ島が低減された、または実質的に排除されたバージョン、ならびに望ましくない宿主免疫及び／または発現サイレンシングを誘発するリスクを最小限に抑えたその使用を提供する。

【0059】

本発明は、哺乳類細胞における最適な発現のために最適化されたある特定のコドン最適化配列が、不注意にＣｐＧモチーフまたはＣｐＧ島を導入し、そのようなＣｐＧモチーフが、コドン最適化に起因する増強された発現を実質的に維持しながら、望ましくない宿主免疫応答を誘発することを回避するために実質的に低減または排除され得るという発見に部分的に基づいている。

【0060】

ＣｐＧモチーフは、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）、続いてグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含む。間の「ｐ」は、連続したヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指す。これらのＣｐＧモチーフがメチル化される場合、それらは、メチル化されたＣｐＧモチーフを含むかまたはそれに隣接するコード配列からの発現を抑制し得る。他方では、ＣｐＧモチーフが非メチル化されている場合、それらは、望ましくない宿主免疫応答を誘導し得る免疫刺激剤として作用し得る。

【0061】

ＣｐＧモチーフは、微生物ゲノム中に存在するが、脊椎動物ゲノム中では希少であるため、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）とみなされる。ＣｐＧ ＰＡＭＰは、ヒト及び他の高等霊長類のＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）においてのみ構成的に発現されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識される。非メチル化ＣｐＧモチーフによるＴＬＲ９の結合及び活性化は、非臨床モデルにおけるＡＡＶベクターに対するＣＴＬ応答を促進する。非メチル化ＣｐＧを含むポリヌクレオチドは、強い細胞免疫応答を刺激するためにワクチン開発におけるアジュバントとして使用されている。一方、異なるコドン修飾戦略を使用する多くの遺伝子療法試験は、それぞれのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において広範囲のＣｐＧ含有量（野生型の０～５倍）をもたらし、低いＣｐＧ含有量と長期発現との間に強い相関が見出されている。

【0062】

ＣｐＧ二量体の数及び位置の変動を伴う多数の配列、ならびにＣｐＧ二量体に隣接する正確な塩基配列がＴＬＲ ９を刺激することが示されている。その結果、ＣｐＧモチーフは、その配列、二次構造、及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への影響に基づいて、およそ５つのクラスまたはカテゴリーに分類することができる。

【0063】

例えば、合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用して、ＯＤＮを含むクラスＡのＣｐＧモチーフは、（１）５’末端、３’末端、またはその両方におけるポリＧ配列の存在、（２）内部回文配列、（３）内部回文内に含まれるＧＣジヌクレオチド、及び（４）部分的にＰＳ修飾された骨格、の構造的特徴を有する。このクラスのＯＤＮは大量のＩ型インターフェロン（最も重要なものはＩＦＮαである）の産生を刺激し、形質細胞様樹状細胞の成熟を誘導する。クラスＡのＯＤＮはまた、間接サイトカインシグナル伝達を介したＮＫ細胞の強力な活性化因子である。

【0064】

対照的に、ＯＤＮを含むクラスＢ ＣｐＧモチーフは、以下の構造的特徴：（１）１つ以上の６量体ＣｐＧモチーフ５’－Ｐｕ Ｐｙ Ｃ Ｇ Ｐｙ Ｐｕ－３’、（２）完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ修飾された）骨格、及び（３）一般的に１８～２８ヌクレオチド長、を有する。クラスＢのＯＤＮ（すなわち、ＯＤＮ ２００７）は、ヒトＢ細胞及び単球成熟の強力な刺激物質である。これらはまた、ｐＤＣの成熟を刺激するが、クラスＡのＯＤＮ及び非常に少量のＩＦＮαよりも程度が低い。

【0065】

宿主に様々な免疫応答を引き起こす可能性のある異なるクラスのＣｐＧモチーフの存在を予測するための、当業者に既知のソフトウェアまたはオンラインツールがある。例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔは、入力ヌクレオチド配列を必要とするＵＲＬ ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｅｑｓｔａｔｓ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｃｐｇｐｌｏｔのオンラインツールである。典型的なパラメータは、約１００ｎｔのウィンドウサイズ、約２００ｎｔの最小長（いくつかの実施形態では、例えば１００に調整することができる）、約０．６の最小観測値、及び約５０の最小パーセンテージ（％）を含む。リターンには、推定されるＣｐＧ島またはその欠如を含むいくつかの結果が含まれる。

【0066】

配列番号２のマイクロジストロフィンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを検査することによって、配列番号２をコードする結果として生じる配列の能力を維持しながら、多数の潜在的なＣｐＧモチーフを特定し、手動で排除した。

【0067】

本発明の１つの例示的なポリヌクレオチドは、以下のセクションに記載されるように、多数のそのようなヌクレオチド配列の変化を、以下に記載するように「大文字のヌクレオチド」として含む。そのような大文字のヌクレオチドの収集は、任意のＣｐＧモチーフの影響を低減するために、配列番号１におけるヌクレオチド配列変化のシグネチャーを構成する。同じシグネチャー変化を含む本発明の他のポリヌクレオチドは、それらが多数の他のヌクレオチドにおいて配列番号１と異なる、例えば、約７０％の配列同一性まで異なるにもかかわらず、依然として、コドン縮重により、配列番号２をコードすることができる。

【0068】

したがって、一態様において、本発明は、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0069】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なる。

【0070】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＣｐＧ島、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島を実質的に欠く。ＣｐＧモチーフまたは島の有無は、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔオンラインツールなどの当該技術分野で認識されているソフトウェアを使用して、ポリヌクレオチド配列に基づいて予測することができる。

【0071】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0072】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0073】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0074】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0075】

本発明の別の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムであって、本発明のポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にパッケージングすることができる、ＡＡＶベクターゲノムを提供する。

【0076】

本発明の別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶカプシドと、本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムと、を含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にカプシド形成される、ｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0077】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、転写調節エレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、転写調節エレメントは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、または筋特異的プロモーターを含む。

【0078】

ＣＫ８プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５～１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）を含むがこれらに限定されない、多数の筋特異的プロモーターを使用して、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化ポリヌクレオチドを発現させることができる。

【0079】

ある特定の実施形態において、筋特異的プロモーターは、ＣＫ８プロモーターである。

【0080】

ある特定の実施形態において、ＣＫ８プロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。

【0081】

ある特定の実施形態において、ＣＫ８プロモーターは、追加のエンハンサーエレメントを含む修飾されたＣＫ８プロモーターである。ある特定の実施形態において、修飾されたＣＫ８プロモーターは、配列番号６（基底ＣＫ８プロモーター、配列番号３のＣＫ８プロモーターの２６９ｂｐ断片）、ならびに５’末端に１３０ｂｐエンハンサー（配列番号５）の１つの追加のコピーを含む。ある特定の実施形態において、修飾されたＣＫ８プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むＣＫ８ｅプロモーターである。

【0082】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列を更に含む。

【0083】

ある特定の実施形態において、ポリＡシグナル配列は、配列番号８を含む。

【0084】

ある特定の実施形態において、ポリＡシグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号９）を含む。

【0085】

ある特定の実施形態において、ポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１０）を含む。

【0086】

ある特定の実施形態において、ポリＡシグナル配列は、ウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列（例えば、配列番号１１）を含む。

【0087】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、３’ＩＴＲ配列を更に含む。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列などの任意のＡＡＶからであり得る。

【0088】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ配列を更に含む。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列などの任意のＡＡＶからであり得る。

【0089】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を更に含む。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ５’及び３’ＩＴＲ配列などの任意のＡＡＶからであり得る。

【0090】

逆位末端反復（ＩＴＲ）配列は、ウイルスＤＮＡ複製の開始及びアデノ随伴ウイルスゲノムの環化に重要である。ＩＴＲ配列内では、二次構造（例えば、回文配列によって形成されるステム及びループ）は、ウイルス複製及び／またはパッケージングにおいて重要な１つ以上のＩＴＲ機能である。そのような配列エレメントとしては、ＲＢＥ配列（Ｒｅｐ結合エレメント）、ＲＢＥ’配列、及びＴＲＳ（末端分解配列）が挙げられる。

【0091】

ある特定の実施形態において、５’及び／または３’ＩＴＲ配列は、野生型配列である。

【0092】

ある特定の実施形態において、５’及び／または３’ＩＴＲ配列は、修飾されたＩＴＲ配列である。例えば、野生型ＩＴＲ配列の最も５’末端または最も３’末端は欠失し得る。欠失は、最大１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドであり得る。

【0093】

ある特定の実施形態において、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の最も５’末端のヌクレオチドの最大１５（例えば、正確に１５）ヌクレオチド、及び／または最も３’末端のヌクレオチドの最大１５（例えば、正確に１５）ヌクレオチドが欠失してもよい。

【0094】

したがって、５’及び／または３’修飾されたＩＴＲ（複数可）は、１４５ｎｔの野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の最大１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、または１２７ｎｔ（１３０ヌクレオチドなど）を含み得る。

【0095】

ある特定の実施形態において、修飾されたＩＴＲ配列は、ＲＢＥ配列、ＲＢＥ’配列、及び／またはｗｔ ＩＴＲ配列のＴＲＳを含む。

【0096】

ある特定の実施形態において、修飾されたＩＴＲ配列は、ＲＢＥ配列及びＲＢＥ’配列の両方を含む。

【0097】

ある特定の実施形態において、修飾されたＩＴＲ配列は、プラスミド産生中の安定性など、細菌中のＡＡＶベクターゲノム（以下を参照されたい）を含む本発明のプラスミドの安定性を付与する。

【0098】

ある特定の実施形態において、修飾されたＩＴＲは、ＡＡＶベクターゲノムを含む本発明のプラスミドの配列決定の検証を妨げない。

【0099】

ある特定の実施形態において、修飾された５’ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ５’ＩＴＲ配列の一部ではない５’異種配列を含む。ある特定の実施形態において、修飾された３’ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ３’ＩＴＲ配列の一部ではない３’異種配列を含む。

【0100】

ある特定の実施形態において、修飾された５’ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ（例えば、ｗｔ ＡＡＶ２）５’ＩＴＲ配列の一部ではない５’異種配列を含み、修飾された３’ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ（例えば、ｗｔ ＡＡＶ２）３’ＩＴＲ配列の一部ではない３’異種配列を含み、５’異種配列及び３’異種配列は、互いに相補的である。

【0101】

ある特定の実施形態において、５’異種配列及び３’異種配列はそれぞれ、Ｓｓｅ８３８７Ｉの認識配列（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、またはＰａｃＩの認識配列（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）などのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。

【0102】

ある特定の実施形態において、５’異種配列は、ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧ（配列番号１９）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、３’異種配列は、配列番号１９の逆相補体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0103】

ある特定の実施形態において、５’異種配列は、ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧ（配列番号２２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、３’異種配列は、配列番号２２の逆相補体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0104】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、両方ともフリップＩＴＲである。

【0105】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、両方ともフロップＩＴＲである。

【0106】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、独立して、フリップまたはフロップＩＴＲである。

【0107】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲはフリップＩＴＲであり、３’ＩＴＲはフロップＩＴＲである。

【0108】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲはフロップＩＴＲであり、３’ＩＴＲはフリップＩＴＲである。

【0109】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲはフリップＩＴＲであり、３’ＩＴＲはフリップＩＴＲである。

【0110】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、フロップＩＴＲであり、３’ＩＴＲはフロップＩＴＲである。

【0111】

本明細書で使用される場合、５’フリップＩＴＲは、Ｂ：Ｂ’セグメントがＣ：Ｃ’セグメントよりも５’末端に近い。３’フリップＩＴＲは、Ｂ：Ｂ’セグメントがＣ：Ｃ’セグメントよりも３’末端に近い。５’フロップＩＴＲは、Ｃ：Ｃ’セグメントがＢ：Ｂ’セグメントよりも５’末端に近い。３’フロップＩＴＲは、Ｃ：Ｃ’セグメントがＢ：Ｂ’セグメントよりも３’末端に近い。

【0112】

ある特定の実施形態において、修飾された５’ＩＴＲ及び修飾された３’ＩＴＲは両方ともフロップＩＴＲであり、修飾された５’ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列（配列番号１９または２２など）の一部ではない５’異種配列を含み、修飾された３’ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列の一部ではない３’異種配列を含み、５’異種配列及び３’異種配列は互いに相補的であり、各々が、Ｓｓｅ８３８７ＩまたはＰａｃＩの認識配列などのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含み、任意選択で、該修飾された５’ＩＴＲ配列は、１１ｎｔ欠失ＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣ（配列番号２３）などのＣ：Ｃ’セグメントにおいて欠失を更に含む。

【0113】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号１２を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号１２）

【0114】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号２４を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号２４）

【0115】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号２５を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号２５）

【0116】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号２６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号２６）

【0117】

ある特定の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号１３を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号１３）

【0118】

ある特定の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号２７を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号２７）

【0119】

ある特定の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号２８を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号２８）

【0120】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号１２であるか、または配列番号１２を含み、３’ＩＴＲ配列は、配列番号１３であるか、または配列番号１３を含む。

【0121】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号２４であるか、または配列番号２４を含み、３’ＩＴＲ配列は、配列番号２７であるか、または配列番号２７を含む。

【0122】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの最も３’ヌクレオチドの最大１４１ｎｔ（例えば、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの最も５ ’末端の４個以上の欠失）を含む。

【0123】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの最も３’ヌクレオチドの最大１３０ｎｔ（例えば、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの最も５’末端の１５個以上の欠失）を含む。

【0124】

ある特定の実施形態において、３’ＩＴＲは、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの最も５’ヌクレオチドの最大１４１ｎｔ（例えば、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの最も３’末端の４個以上の欠失）を含む。

【0125】

ある特定の実施形態において、３’ＩＴＲは、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの最も５’ヌクレオチドの最大１３０ｎｔ（例えば、１４５ｎｔのｗｔ ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの最も３’末端の１５個以上の欠失）を含む。

【0126】

ある特定の実施形態において、５’及び３’ＩＴＲ配列は、トリプルトランスフェクションに基づく哺乳類細胞におけるＡＡＶ産生に適合する。

【0127】

ある特定の実施形態において、５’及び３’ＩＴＲ配列は、バキュロウイルスベクターに基づく昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）におけるＡＡＶ産生に適合する（以下を参照されたい）。

【0128】

ある特定の実施形態において、５’及び３’ＩＴＲ配列は、ＨＳＶベクターに基づく哺乳類細胞におけるＡＡＶ産生に適合する（以下を参照されたい）。

【0129】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、マイクロジストロフィンの発現を増強するイントロン及び／またはエクソン配列を更に含む。ある特定の実施形態において、イントロン／エクソンは、マイクロジストロフィンの発現を最大２～１０倍増加させる。

【0130】

ある特定の実施形態において、イントロンは、β－グロビンスプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプターキメライントロンの配列を含む（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＣＭＶＴｎＴベクター（カタログ番号Ｌ５６２０）におけるキメライントロンを参照されたい）。

【0131】

ある特定の実施形態において、イントロンは、配列番号１４を含む。
ｇｔａｔｃａａｇｇｔｔａｃａａｇａｃａｇｇｔｔｔａａｇｇａｇａｃｃａａｔａｇａａａｃｔｇｇｇｃｔｔｇｔｃｇａｇａｃａｇａｇａａｇａｃｔｃｔｔｇｃｇｔｔｔｃｔｇａｔａｇｇｃａｃｃｔａｔｔｇｇｔｃｔｔａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号１４）

【0132】

ある特定の実施形態において、プロモーターは、発現を増強する４８ｂｐ（配列番号７）または５０ｂｐ（配列番号８）のＭＣＫ ＵＴＲエクソン配列を含むＣＫ８ｅプロモーター（以下）である。

【0133】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、マイクロジストロフィンの発現を潜在的に増強するイントロン及び／またはエクソン配列を含まない。イントロン／エクソン配列を排除することは、パッケージング効率を改善し、他の配列エレメントのパッケージング容量を増加させ得る。

【0134】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、５’ＵＴＲ配列及び／または３’ＵＴＲ配列を更に含む。

【0135】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、５’から３’まで、以下の配列エレメント：（１）５’ＩＴＲ（野生型または修飾されたＡＡＶ２ ５’ＩＴＲなど、例えば、１４５ｎｔの野生型ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、または１４１ｎｔの修飾されたＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号１２など））、（２）筋特異的プロモーター（ＣＫ８プロモーター（例えば、配列番号３）または本明細書に記載されるＣＫ８ｅなどの修飾されたＣＫ８タンパク質（配列番号４）など）、（３）本発明のＣｐＧ低減／排除されたコドン最適化ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ（配列番号１またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、または９９．９％と同一であるヌクレオチド配列など）、（４）ポリＡシグナル配列（配列番号８～１１のうちのいずれか１つなど）、及び（５）３’ＩＴＲ（野生型または修飾されたＡＡＶ２ ３’ＩＴＲなど、例えば、１４５ｎｔの野生型ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ、または１４１ｎｔの修飾されたＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号１３など））、またはＡＡＶベクターゲノムと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一であるヌクレオチド配列、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、（３）の直前に、ＡＴＧ開始コドンのすぐ５’にＡＣＣを含むＫＯＺＡＫ配列が存在する。

【0136】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、５’から３’まで、以下の配列エレメント：（１）５’ＩＴＲ（配列番号１２など）、（２）ＣＫ８プロモーター（例えば、配列番号３）、（３）本発明のＣｐＧ低減／排除されたコドン最適化ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ（配列番号１など）、（４）ポリＡシグナル配列（配列番号８など）、及び（５）３’ＩＴＲ（配列番号１３など）、またはＡＡＶベクターゲノムと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、（３）の直前に、ＡＴＧ開始コドンのすぐ５’にＡＣＣを含むＫＯＺＡＫ配列が存在する。

【0137】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0138】

ある特定の実施形態において、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、ＳＬＢ－１０１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３２、またはＡＡＶｈｕ３７の血清型のカプシドを含む。

【0139】

ある特定の実施形態において、血清型は、ＳＬＢ－１０１（例えば、ＶＰ１カプシド配列は配列番号２１である）またはＡＡＶ９（例えば、ＶＰ１カプシド配列は配列番号２０である）である。

【0140】

本発明の別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子であって、ＳＬＢ－１０１またはＡＡＶ９カプシドと、その中にカプシド形成されたベクターゲノムと、を含み、該ベクターゲノムが、配列番号２のＭＤ５マイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。

【0141】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含む。

【0142】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のヌクレオチド配列を含み、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なる。

【0143】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧ島（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0144】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された筋特異的制御エレメントを含む。

【0145】

ある特定の実施形態において、筋特異的制御エレメントは、配列番号３または４のヌクレオチド配列のＣＫ８プロモーターなどのＣＫ８プロモーターを含む。

【0146】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号８～１１のうちのいずか１つなどのポリアデニル化シグナル配列を更に含む。

【0147】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号１３などの３’ＩＴＲ配列と、配列番号１２などの５’ＩＴＲ配列と、を更に含む。

【0148】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドと、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

【0149】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、もしくはくも膜下腔内投与に好適であるか、またはそれ用に製剤化される。

【0150】

本発明の別の態様は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒトにおいて、それを行う方法であって、ヒトに、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子、または本発明の薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0151】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子における変異の機能喪失を特徴とする。

【0152】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖拡張型心筋症である。

【0153】

ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、約１×１０^１２～約１×１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、または約１×１０^１３～約１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与される。

【0154】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。

【0155】

ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、またはＭＲＣ－５細胞である。

【0156】

ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞または２９３／２９３Ｔ細胞である。

【0157】

本発明を上で一般的に説明したが、以下のセクションは、本発明の特定の態様についてより詳細な説明を提供する。したがって、実施例または特許請求の範囲にのみ記載されるものを含む、本明細書に記載の任意の一実施形態は、明示的に否認されるか、または不適切でない限り、本発明の任意の１つ以上の追加の実施形態と組み合わせることができる。

【0158】

２．ＣｐＧコンドン最適化ポリヌクレオチドコードマイクロジストロフィンＡＡＶベクターゲノム
一態様において、本明細書に記載の本発明は、配列番号２のマイクロジストロフィンタンパク質をコードし、ＣｐＧ部位／島の数が低減しているか、またはＣｐＧ島を実質的に排除している、配列番号１などのコドン最適化ポリヌクレオチド配列を提供する。配列番号１のポリヌクレオチド配列及び配列番号２のタンパク質配列を以下に提供する。
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ＭＬＷＷＥＥＶＥＤＣＹＥＲＥＤＶＱＫＫＴＦＴＫＷＶＮＡＱＦＳＫＦＧＫＱＨＩＥＮＬＦＳＤＬＱＤＧＲＲＬＬＤＬＬＥＧＬＴＧＱＫＬＰＫＥＫＧＳＴＲＶＨＡＬＮＮＶＮＫＡＬＲＶＬＱＮＮＮＶＤＬＶＮＩＧＳＴＤＩＶＤＧＮＨＫＬＴＬＧＬＩＷＮＩＩＬＨＷＱＶＫＮＶＭＫＮＩＭＡＧＬＱＱＴＮＳＥＫＩＬＬＳＷＶＲＱＳＴＲＮＹＰＱＶＮＶＩＮＦＴＴＳＷＳＤＧＬＡＬＮＡＬＩＨＳＨＲＰＤＬＦＤＷＮＳＶＶＣＱＱＳＡＴＱＲＬＥＨＡＦＮＩＡＲＹＱＬＧＩＥＫＬＬＤＰＥＤＶＤＴＴＹＰＤＫＫＳＩＬＭＹＩＴＳＬＦＱＶＬＰＱＱＶＳＩＥＡＩＱＥＶＥＭＬＰＲＰＰＫＶＴＫＥＥＨＦＱＬＨＨＱＭＨＹＳＱＱＩＴＶＳＬＡＱＧＹＥＲＴＳＳＰＫＰＲＦＫＳＹＡＹＴＱＡＡＹＶＴＴＳＤＰＴＲＳＰＦＰＳＱＨＬＥＡＰＥＤＫＳＦＧＳＳＬＭＥＳＥＶＮＬＤＲＹＱＴＡＬＥＥＶＬＳＷＬＬＳＡＥＤＴＬＱＡＱＧＥＩＳＮＤＶＥＶＶＫＤＱＦＨＴＨＥＧＹＭＭＤＬＴＡＨＱＧＲＶＧＮＩＬＱＬＧＳＫＬＩＧＴＧＫＬＳＥＤＥＥＴＥＶＱＥＱＭＮＬＬＮＳＲＷＥＣＬＲＶＡＳＭＥＫＱＳＮＬＨＳＹＶＰＳＴＹＬＴＥＩＴＨＶＳＱＡＬＬＥＶＥＱＬＬＮＡＰＤＬＣＡＫＤＦＥＤＬＦＫＱＥＥＳＬＫＮＩＫＤＳＬＱＱＳＳＧＲＩＤＩＩＨＳＫＫＴＡＡＬＱＳＡＴＰＶＥＲＶＫＬＱＥＡＬＳＱＬＤＦＱＷＥＫＶＮＫＭＹＫＤＲＱＧＲＦＤＲＳＶＥＫＷＲＲＦＨＹＤＩＫＩＦＮＱＷＬＴＥＡＥＱＦＬＲＫＴＱＩＰＥＮＷＥＨＡＫＹＫＷＹＬＫＥＬＱＤＧＩＧＱＲＱＴＶＶＲＴＬＮＡＴＧＥＥＩＩＱＱＳＳＫＴＤＡＳＩＬＱＥＫＬＧＳＬＮＬＲＷＱＥＶＣＫＱＬＳＤＲＫＫＲＬＥＥＱＳＤＱＷＫＲＬＨＬＳＬＱＥＬＬＶＷＬＱＬＫＤＤＥＬＳＲＱＡＰＩＧＧＤＦＰＡＶＱＫＱＮＤＶＨＲＡＦＫＲＥＬＫＴＫＥＰＶＩＭＳＴＬＥＴＶＲＩＦＬＴＥＱＰＬＥＧＬＥＫＬＹＱＥＰＲＥＬＰＰＥＥＲＡＱＮＶＴＲＬＬＲＫＱＡＥＥＶＮＴＥＷＥＫＬＮＬＨＳＡＤＷＱＲＫＩＤＥＴＬＥＲＬＱＥＬＱＥＡＴＤＥＬＤＬＫＬＲＱＡＥＶＩＫＧＳＷＱＰＶＧＤＬＬＩＤＳＬＱＤＨＬＥＫＶＫＡＬＲＧＥＩＡＰＬＫＥＮＶＳＨＶＮＤＬＡＲＱＬＴＴＬＧＩＱＬＳＰＹＮＬＳＴＬＥＤＬＮＴＲＷＫＬＬＱＶＡＶＥＤＲＶＲＱＬＨＥＡＨＲＤＦＧＰＡＳＱＨＦＬＳＴＳＶＱＧＰＷＥＲＡＩＳＰＮＫＶＰＹＹＩＮＨＥＴＱＴＴＣＷＤＨＰＫＭＴＥＬＹＱＳＬＡＤＬＮＮＶＲＦＳＡＹＲＴＡＭＫＬＲＲＬＱＫＡＬＣＬＤＬＬＳＬＳＡＡＣＤＡＬＤＱＨＮＬＫＱＮＤＱＰＭＤＩＬＱＩＩＮＣＬＴＴＩＹＤＲＬＥＱＥＨＮＮＬＶＮＶＰＬＣＶＤＭＣＬＮＷＬＬＮＶＹＤＴＧＲＴＧＲＩＲＶＬＳＦＫＴＧＩＩＳＬＣＫＡＨＬＥＤＫＹＲＹＬＦＫＱＶＡＳＳＴＧＦＣＤＱＲＲＬＧＬＬＬＨＤＳＩＱＩＰＲＱＬＧＥＶＡＳＦＧＧＳＮＩＥＰＳＶＲＳＣＦＱＦＡＮＮＫＰＥＩＥＡＡＬＦＬＤＷＭＲＬＥＰＱＳＭＶＷＬＰＶＬＨＲＶＡＡＡＥＴＡＫＨＱＡＫＣＮＩＣＫＥＣＰＩＩＧＦＲＹＲＳＬＫＨＦＮＹＤＩＣＱＳＣＦＦＳＧＲＶＡＫＧＨＫＭＨＹＰＭＶＥＹＣＴＰＴＴＳＧＥＤＶＲＤＦＡＫＶＬＫＮＫＦＲＴＫＲＹＦＡＫＨＰＲＭＧＹＬＰＶＱＴＶＬＥＧＤＮＭＥＴＤＴＭ（配列番号２）

【0159】

本明細書で使用される場合、「コドン最適化」ポリヌクレオチドコード配列は、結果として生じるコドンが、特定の細胞、宿主、またはシステム、例えば、特定の哺乳類（ヒト）細胞型、例えば、筋細胞における発現に最適であるように、いくつかの点で変更された／変化したポリヌクレオチド配列を指す。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、コドン最適化ポリヌクレオチドコード配列を変更せず、コドン最適化が行われた天然配列は、同じアミノ酸配列をコードする。

【0160】

配列番号１などの本発明のポリヌクレオチドは、「マイクロＤ５」、「ＭＤ５」、または「μＤ５」として知られるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする（配列番号２を参照されたい）。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋収縮時の筋膜を安定させる。例えば、マイクロジストロフィンは、筋収縮時に衝撃吸収材として機能する。ＭＤ５は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジ領域１（Ｈ１）、スペクトリン様反復Ｒ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４、ヒンジ領域４（Ｈ４）、ならびにヒト完全長ジストロフィンタンパク質のＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含む、特異的に操作された５反復マイクロジストロフィンタンパク質である。この５反復マイクロジストロフィン及び関連するジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質配列は、ＵＳ１０，４７９，８２１及びＷＯ２０１６／１１５５４３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0161】

上に示される配列番号１において、ある特定のヌクレオチドは、大文字として印を付けられ、これらのヌクレオチドは、本明細書において「配列番号１の大文字のヌクレオチド」と総称される。具体的には、配列番号１の大文字のヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２６４、２７３、２８２、２９１、２９７、３０３、５４３、５５５、５５８、６２７、１１１０、１１１３、１１２２、１６５６、１６６５、１６７８、１６８１、１７２２、１８１５、１８３０、１８３３、１９８９、２０３１、２０５２、２０５５、２０７９、２０９７、２１１５、２１５７、２１８１、２２９０、２３１６、２３４３、２３４６、２３５６、２３６４、２３６７、２４０６、２５３２、２５５０、２５５９、２８４４、２８８１、２８８９、２８９６、３０８１、３０９９、３３３９、３３５４、３３６３、３３８４、３４０５、及び３７３５を含む。

【0162】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、同じタンパク質（すなわち、配列番号２）をコードするだけでなく、配列番号１の大文字のヌクレオチドの同じセットを共有するが、それらは、配列番号１の大文字のヌクレオチド以外のヌクレオチド位置で配列番号１とは異なる。

【0163】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、大文字のヌクレオチド以外の配列番号１の位置において、追加の配列変化（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、または９９．９％の全体的な配列同一性をもたらす）にもかかわらず、配列番号１の大文字のヌクレオチドで同じタンパク質（すなわち、配列番号２）をコードするだけでなく、配列番号１と実質的に同一である。ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なる。

【0164】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードし、更に、本発明のポリヌクレオチドは、（１）各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なり、及び／または（２）ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0165】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードし、更に、本発明のポリヌクレオチドは、（１）各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なり、及び／または（２）ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0166】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードし、更に、本発明のポリヌクレオチドは、（１）各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なり、及び／または（２）ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0167】

任意の２つ以上の関連もしくは無関係のポリヌクレオチド間、または任意の２つ以上の関連もしくは無関係のタンパク質配列間の配列パーセンテージ同一性をアラインメントすることができ、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基間の一致のパーセンテージを、それぞれ、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）などの任意の当該技術分野に認識されている方法を使用して計算することができ、これは、クエリ及びデータベースの種類に応じて、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトなどのオンラインソースから入手可能である。同様のウェブベースのツールは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩウェブサイトに見出すことができる。

【0168】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＣｐＧ島（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔ分析に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0169】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、実施例２に記載されるインビトロアッセイにおけるような、ＴＬＲ９の活性化を実質的に誘導することができない。

【0170】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0171】

本発明の別の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムであって、本発明の任意のポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にパッケージングすることができる、ＡＡＶベクターゲノムを提供する。

【0172】

典型的なＡＡＶのパッケージング容量は、一般的に、約０．２～０．３ｋｂの５’及び３’ＩＴＲ配列を含む約４．７ｋｂであり、そのうちの少なくとも１つ（おそらく両方）は、ＡＡＶベクターゲノムをカプシドにパッケージングするために必要な構造エレメントである。

【0173】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）、ＴＲ内の内部ヘアピン（ＲＢＥ’）、及び末端分解部位（ＴＲＳ）などのある特定のＩＴＲ構造エレメントを含む。

【0174】

本発明の別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶカプシドと、本発明の任意のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムと、を含み、ＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド内にカプシド形成される、ｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0175】

ある特定の実施形態において、（ＣｐＧコドン最適化）ポリヌクレオチドは、転写調節エレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、転写調節エレメントは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーター（例えば、筋特異的プロモーター）（以下）を含む。例示的なプロモーターは、ＣＫ８またはその変異体（以下）である。

【0176】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列、例えば、配列番号８～１１のうちのいずか１つのなどのポリＡシグナル配列（以下）を更に含む。

【0177】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、３’ＩＴＲ配列、例えば、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列を更に含む。ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ配列、例えば、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列を更に含む。ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲ配列及び／または３’ＩＴＲ配列は、それぞれ、配列番号１２及び１３を含むか、またはそれらである。

【0178】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、マイクロジストロフィンの発現を増強するイントロン及び／またはエクソン配列を更に含む。ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、マイクロジストロフィンの発現をさもなければ増強するイントロン及び／またはエクソン配列を含まない。

【0179】

ある特定の実施形態において、ベクターゲノムは、５’ＵＴＲ配列及び／または３’ＵＴＲ配列を更に含む。

【0180】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、５’から３’まで、以下の配列エレメント：（１）５’ＩＴＲ（野生型または修飾されたＡＡＶ２ ５’ＩＴＲなど、例えば、１４５ｎｔの野生型ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、または１４１ｎｔの修飾されたＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ）、（２）筋特異的プロモーター（ＣＫ８プロモーターまたは本明細書に記載されるＣＫ８ｅなどの修飾されたＣＫ８タンパク質など）、（３）本発明のＣｐＧ低減／排除されたコドン最適化ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ（配列番号１またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、または９９．９％と同一であるヌクレオチド配列など）、（４）ポリＡシグナル配列（配列番号８～１１のうちのいずれか１つなど）、及び（５）３’ＩＴＲ（野生型または修飾されたＡＡＶ２ ３’ＩＴＲなど、例えば、１４５ｎｔの野生型ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ、または１４１ｎｔの修飾されたＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ）、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0181】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％同一のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＧＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＣＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＧＡＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＧＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号１５）

【0182】

３．プロモーター
ある特定の実施形態において、コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列は、本発明のマイクロジストロフィンコード配列に作動可能に連結されており、その転写を駆動することができるプロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている。転写調節エレメントは、本発明のＣｐＧ低減されたポリヌクレオチドによってコードされるマイクロジストロフィンの発現を増強する１つ以上のイントロンまたはエクソンを更に含み得る。

【0183】

ある特定の実施形態において、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＢプロモーター、またはそれらの誘導体を含む。

【0184】

ある特定の実施形態において、転写調節エレメントは、筋特異的制御エレメントを含む。

【0185】

例えば、筋特異的制御エレメントは、ＣＫ８プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５～１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、緩徐収縮トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）であり得る。

【0186】

ある特定の実施形態において、筋特異的制御エレメントは、本発明のマイクロジストロフィンコード配列の５’である異種イントロン配列（マイクロジストロフィン発現を増強した）の５’であり、これは、翻訳停止コドン（ＴＡＧなど）、ポリＡアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡなど）、及びｍＲＮＡ切断部位（ＣＡなど）を含む任意選択の３’－ＵＴＲ領域の５’である。

【0187】

ある特定の実施形態において、筋特異的制御エレメントは、ＣＫ８プロモーター、例えば、以下の配列を有するものなどを含む。
ＴＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡ（ＣＫ８プロモーター、配列番号３）

【0188】

ある特定の実施形態において、ＣＫ８プロモーターは、５’末端に追加のＣ、及び／または３’末端に追加のジヌクレオチドＧＣを含み得る。ＣＫ８プロモーターは、５’末端１３０ｂｐエンハンサーエレメント、続いて２６９ｂｐの基底ＣＫ８プロモーター、続いてＣＫ８プロモーターの最も３’末端に４８ ｂｐまたは５０ｂｐのＭＣＫエクソン１ ＵＴＲ配列を含む。５’末端１３０ｂｐエンハンサーエレメントは、更なるエンハンサー転写のために複製することができる（例えば、ＣＫ８における１つのコピーと比較して２つのタンデムコピーを有する）。

【0189】

したがって、ある特定の実施形態において、ＣＫ８プロモーターは、配列番号５の１３０ｂｐエンハンサーの２つのコピー、配列番号３の基底ＣＫ８プロモーターの２６９ｂｐ断片（配列番号６）、及び４８ｂｐまたは５０ｂｐのＭＣＫエクソン１ ＵＴＲ領域配列（配列番号７または１６）を含むＣＫ８ｅプロモーター（配列番号４）として修飾される。
ＴＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＴＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡ（配列番号４）
ｔａｇａｃｔａｇｃａｔｇｃｔｇｃｃｃａｔｇｔａａｇｇａｇｇｃａａｇｇｃｃｔｇｇｇｇａｃａｃｃｃｇａｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｔａｔａａｔｔａａｃｃｃａｇａｃａｔｇｔｇｇｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃａａｃａｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔａａａａａｔａａｃｃｃｔｇｃａｔｇ（配列番号５、１３０ｂｐのエンハンサー）
ｃｃａｔｇｔｔｃｃｃｇｇｃｇａａｇｇｇｃｃａｇｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｃｃａｇｃｔａｇａｃｔｃａｇｃａｃｔｔａｇｔｔｔａｇｇａａｃｃａｇｔｇａｇｃａａｇｔｃａｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇｃａｇｃｃｃａｔａｃａａｇｇｃｃａｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇｃａａｇｃｔｇｃａｃｇｃｃｔｇｇｇｔｃｃｇｇｇｇｔｇｇｇｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｇｇｇｃａａｃｇａｇｃｔｇａａａｇｃｔｃａｔｃｔｇｃｔｃｔｃａｇｇｇｇｃｃｃｃｔｃｃｃｔｇｇｇｇａｃａｇｃｃｃｃｔｃｃｔｇｇｃｔａｇｔｃａｃａｃｃｃｔｇｔａｇｇｃｔｃｃｔｃｔａｔａｔａａｃｃｃａｇｇｇｇｃａｃａｇｇｇｇｃｔｇｃｃｃｔｃ（配列番号６、２６９ｂｐの基底ＣＫ８プロモーター）
ａｔｔｃｔａｃｃａｃｃａｃｃｔｃｃａｃａｇｃａｃａｇａｃａｇａｃａｃｔｃａｇｇａｇｃｃａｇｃｃａ（ＵＴＲ ４８ｂｐのＭＣＫエクソン１、配列番号７）。
ａｔｔｃｔａｃｃａｃｃａｃｃｔｃｃａｃａｇｃａｃａｇａｃａｇａｃａｃｔｃａｇｇａｇｃｃａｇｃｃａｇｃ（ＵＴＲ ５０ｂｐのＭＣＫエクソン１、配列番号１６）

【0190】

ある特定の実施形態において、筋特異的制御エレメントは、ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。

【0191】

ＷＯ２０１７／１８１０１５（配列番号１７）の配列番号１０：

【化1】

【0192】

ＷＯ２０１７／１８１０１５（配列番号１８）の配列番号１１：

【化2】

【0193】

ある特定の実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＭＣＫエンハンサーのヌクレオチド配列（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０を参照されたい）及び／またはＭＣＫプロモーター配列（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１１を参照されたい）を含む筋特異的制御エレメントに作動可能に連結され得る。

【0194】

４．ポリＡシグナル配列、イントロン、エクソン、ＵＴＲ
ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、転写ｍＲＮＡにポリアデニル化（ポリＡ）配列を挿入するためのポリＡシグナル配列を更に含む。

【0195】

ある特定の実施形態において、ポリＡシグナル配列は、配列番号８であり、ＡＡＴＡＡＡ配列は、大文字で二重下線が引かれている。

【化3】

【0196】

ある特定の実施形態において、ポリＡ配列は、１９７ｂｐのＳＶ４０ポリＡシグナル配列である。

【化4】

【0197】

ある特定の実施形態において、ポリＡ配列は、２３０ｂｐのｂＧＨポリＡシグナル配列である。

【化5】

【0198】

ある特定の実施形態において、ポリＡ配列は、１２７ｂｐのｒＢＧポリＡシグナル配列である。

【化6】

【0199】

５．ＡＡＶ及びカプシド
本明細書で使用される、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な省略形である。アデノ随伴ウイルスは、共感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。

【0200】

ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。

【0201】

これら２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）の選択的スプライシングを伴って、該ｒｅｐ遺伝子由来の４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。

【0202】

ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのインフレーム翻訳カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。

【0203】

単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、該ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

【0204】

特徴付けられているＡＡＶには少なくとも１３の血清型が存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型は、遺伝子レベルでも構造的及び機能的の両方に非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原則が更なるＡＡＶの血清型に適用されることが十分に予想される。例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい。例えば、全てのＡＡＶの血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、全てが、ＡＡＶ２で発現されるような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。近縁性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖分析、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似の自己アニーリングセグメントの存在によって更に示唆される。類似の感染性パターンもまた、各血清型の複製機能が類似の調整制御下にあることを示唆する。

【0205】

「ＡＡＶベクター」または「（ＡＡＶ）ベクターゲノム」は、本明細書で同義的に使用される場合、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ＡＡＶウイルス粒子にパッケージングされ得る。

【0206】

本発明の組換えＡＡＶベクターゲノムは、本発明の核酸分子と、本発明の核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲと、を含む。

【0207】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成ポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類（筋肉）細胞に送達するための、主題のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型には、「ＡＡＶベクター／ウイルス粒子」と称される。したがって、そのようなベクターはＡＡＶウイルス粒子内に含まれるため、ＡＡＶウイルス粒子の産生はＡＡＶベクターの産生を必ず含む。

【0208】

ＡＡＶには複数の血清型があり、該ＡＡＶの血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４５：５５５－５６４（１９８３）に示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正された。ともに参照により本明細書に組み込まれる。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６（参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２（参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６（参照により本明細書に組み込まれる）及びＡＸ７５３２４９（参照により本明細書に組み込まれる）にそれぞれ提供され（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号及び第７，７９０，４４９号も参照されたい）、ＡＡＶ－９のゲノムは、参照により本明細書に組み込まれるＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムは、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムは、参照により本明細書に組み込まれるＶｉｒｏｌｏｇｙ ３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、参照により本明細書に組み込まれるＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。

【0209】

ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２、ＡＡＶｒｈ３４、及びＡＡＶ－２ｉ８を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。

【0210】

ある特定の実施形態では、骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ．７４が使用され得る。

【0211】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するか、またはカプシドは、配列番号２０のポリペプチド（ＡＡＶ９ ＶＰ１）を有する。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号２０）

【0212】

疑型ｒＡＡＶ及びその産生もまた、本発明に好適であり、例えば、ＷＯ０１／８３６９２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される。

【0213】

他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドの突然変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。

【0214】

ある特定の実施形態において、カプシドは、ＳＬＢ－１０１カプシドであり、ＶＰ１カプシドは、配列番号２１の配列を有する。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＲＧＤＬＧＬＳＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号２１）

【0215】

６．ｒＡＡＶ及び宿主細胞の産生
主題のＣｐＧ枯渇コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子及びベクターゲノムは、典型的には産生細胞株を使用して、任意の標準的なｒＡＡＶ産生方法によって産生され得る。

【0216】

ｒＡＡＶ産生の一般的な原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５３３－１５３９，１９９２及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９，１９９２））に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２，１９８４、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６４６６，１９８４、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１，１９８５、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３，１９８８、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９，１９８８、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８，１９８９、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０，１９９５、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５，１９９３、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２，１９９６、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、ｒＡＡＶ産生に関連する文書のセクションに特に重点を置いて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0217】

全体として、原理が異なるいくつかの戦略がｒＡＡＶ産生に使用されており、その全てを使用して、主題のｒＡＡＶを産生することができる。

【0218】

ある特定の実施形態において、主題のｒＡＡＶは、２９３細胞などの好適な宿主細胞中の全てのシス及びトランス成分（アデノウイルスから単離されたヘルパー遺伝子とともに、ベクタープラスミド及びパッケージングプラスミド）を用いた、ヘルパーウイルスを含まない一過性トランスフェクション法に基づいて産生される。一過性トランスフェクション法は、ベクタープラスミド構築が簡単であり、アデノウイルスを含まない高力価ＡＡＶベクターを生成する。ＶＰ１カプシドタンパク質は、産生細胞株の一過性トランスフェクションに使用されるプラスミドのうちの１つによってコードされ得る。

【0219】

したがって、ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムを含むＤＮＡプラスミドを含む。そのようなＤＮＡプラスミドを標準的なトリプルトランスフェクション法で使用して、ｒＡＡＶを産生することができる。具体的には、本発明のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅｌ欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）での感染が許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、ｒＡＡＶゲノムに含まれない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が単一の細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ３４、またはＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。ある特定の実施形態において、カプシドは、ＳＬＢ－１０１などの修飾されたカプシドである。

【0220】

パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクション
特に、ある特定の実施形態では、該ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを使用して産生される。これは、ヒト胚性ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションを含む、最も確立されたＡＡＶ産生方法である。典型的には、ＨＥＫ２９３細胞は、ベクタープラスミド（目的の遺伝子、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子及び１つ以上の更なるコード配列の両方をコードする主題のポリヌクレオチドを含む）、及び１つまたは２つのヘルパープラスミドによって、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して同時にトランスフェクトされる。

【0221】

該ヘルパープラスミド（複数可）は、４つのＲｅｐタンパク質、ＡＡＶの３つの構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、ＡＡＰ、及びアデノウイルス補助機能Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡＲＮＡの発現を可能にする。ｒＡＡＶ複製に必要な更なるアデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ補因子は、ＨＥＫ２９３産生細胞で発現される。Ｒｅｐ－ｃａｐ及びアデノウイルスヘルパー配列は、２つの別個のプラスミドにクローニングされるか、または１つのプラスミドに結合されるかのいずれかのため、トランスフェクションのための３つのプラスミド系及び２つのプラスミド系の両方が可能である。３つのプラスミドのプロトコルは、ある血清型から別の血清型に容易に切り替えることができるｃａｐ遺伝子を備えた汎用性を提供する。

【0222】

プラスミドは通常、従来の技術により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、細菌起源の抗生物質耐性遺伝子を使用して、またはミニサークル技術によって産生される。

【0223】

接着性のＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶベクターの大規模製造に使用されている。最近では、ＨＥＫ２９３細胞はまた、長期にわたり経済的に実行可能な浮遊条件にも適応している。

【0224】

ＨＥＫ２９３株は、無血清浮遊Ｆ１７、Ｅｘｐｉ２９３、または他の製造元の特殊培地で維持される浮遊ＨＥＫ２９３細胞を除き、通常、Ｌ－グルタミン、５％～１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンで完成されるＤＭＥＭで増殖させる。接着細胞の場合、動物由来成分による汚染を制限するため、ＡＡＶ産生中にＦＢＳのパーセンテージを低減することができる。

【0225】

一般的に、ｒＡＡＶベクターは、血清型に応じて、プラスミドのトランスフェクションの４８～７２時間後に細胞ペレット及び／または上清から回収される。

【0226】

ｒＨＳＶベクターによる哺乳類細胞の感染
ＨＳＶは、許容細胞でのＡＡＶの複製用のヘルパーウイルスである。したがって、ＨＳＶは、ヘルパーとして、及びＡＡＶゲノムの複製及び産生細胞へのパッケージングを支援する必須のＡＡＶ機能を送達するためのシャトルとしての両方の役割を果たし得る。

【0227】

ｒＨＳＶとの共感染に基づくＡＡＶ産生では、大量のｒＡＡＶを効率的に生成することができる。高い総収量（最大１．５×１０^５ｖｇ／細胞）に加えて、方法は、ウイルス力価の改善によって測定される明らかに品質が向上したｒＡＡＶストックを創出する点で更に有利である。

【0228】

本方法では、細胞、通常はハムスターＢＨＫ２１細胞株またはＨＥＫ２９３及び派生体に、１つはＡＡＶのＩＴＲで囲まれた目的の遺伝子を搭載し（ｒＨＳＶ－ＡＡＶ）、２つ目は所望の血清型のＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＯＲＦを有する（ｒＨＳＶｒｅｐｃａｐ）２つのｒＨＳＶを感染させる。２～３日後、細胞及び／または培地を収集し、ｒＡＡＶを複数の精製ステップで精製して、細胞不純物、ＨＳＶ由来の混入物、及びパッケージングされていないＡＡＶのＤＮＡを除去する。

【0229】

したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＶは、ＡＡＶ感染のヘルパーウイルスとしての役割を果たす。いくつかの実施形態において、ＡＡＶの成長は、ＩＣＰ２７が欠失したＨＳＶの非複製変異体を使用して達成される。

【0230】

哺乳類細胞で組換えＡＡＶウイルス粒子を産生するある特定の方法は、当技術分野で知られており、過去１０年間で改善されてきた。例えば、米国出願公開第２００７０２０２５８７号は、２つ以上の複製欠損組換えＨＳＶベクターによる細胞の共感染に基づく、哺乳類細胞における組換えＡＡＶ産生について記載している。米国出願公開第２０１１０２２９９７１号及びＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（８）：８６１－８７０，２００９）は、浮遊適応哺乳類細胞の組換えＨＳＶ１型共感染を使用する拡張可能な組換えＡＡＶ産生方法を記載している。Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（１）：１－１４，２０１７）は、該ＨＳＶ系を用いた無血清浮遊製造プラットフォームでのＡＡＶ産生方法の改良を記載している。

【0231】

ある特定の他の実施形態において、主題のｒＡＡＶは、組換え単純ヘルペスウイルス（ｒＨＳＶ）ベクターベースのＡＡＶ産生系を使用して産生され、これは、ＡＡＶベクターならびにＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子（すなわち、本発明の修飾されたＶＰ１カプシド遺伝子）を産生細胞にもたらすｒＨＳＶベクターを利用する。修飾されたｃａｐ遺伝子は、ｒＡＡＶゲノムを有し得るｒＨＳＶベクター内に存在し得る。

【0232】

ある特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、ＨＳＶプラットフォームを使用した高力価及び高品質のアデノ関連９型ベクターの産生のための拡張可能な方法である、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により産生される。これは、完全単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースの産生及び精製プロセスであり、１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫのＨＥＫ２９３産生細胞当たり１×１０^１４を超えるｒＡＡＶ９ベクターゲノム、または最終的な完全に精製された産物中、細胞当たり１×１０^５を超えるベクターゲノムを生成することが可能である。これは、トランスフェクションベースの方法に比べて５～１０倍の増加を表す。更に、この方法によって産生されたｒＡＡＶベクターは、トランスフェクションベースの産生と比較して、高い形質導入単位対ベクターゲノム比及び低い空対充実比によって示される総カプシドタンパク質量の減少によって示される感染性の増加を含む、改善された生物学的特徴を実証した。この方法は、前臨床及び臨床研究を可能にし、後期段階及び商業的生産に向けて構築するためのプラットフォームを提供するために、ｒＡＡＶ９ベクターの大規模な適正検査基準（ＧＬＰ）及び適正製造基準（ＧＭＰ）生産に容易に適合させることもできる。

【0233】

組換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の感染
ある特定の更なる実施形態において、主題のｒＡＡＶは、ＡＡＶベクターカセットならびにＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子（すなわち、本発明の修飾されたＶＰ１カプシド遺伝子）を送達するために、いくつかのバキュロウイルスベクターを用いた昆虫細胞の同時感染を必要とするバキュロウイルス系を使用して産生される。

【0234】

バキュロウイルスＳｆ９のプラットフォームは、哺乳類細胞におけるＧＭＰ準拠の拡張可能な代替ＡＡＶ産生方法として確立されている。これは、粗製収穫物で細胞当たり最大２×１０^５ベクターゲノム（ｖｇ）を生成することができる。

【0235】

現在のプロトコルは、２つの組換えバキュロウイルス、すなわち、Ｒｅｐ７８／５２及びＣａｐの合成を可能にするバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）、及びＡＡＶのＩＴＲに隣接する目的の遺伝子を運ぶ組換えバキュロウイルスによるＳｆ９昆虫細胞の感染を伴う。いくつかの無血清培地を、浮遊でのＳｆ９細胞の成長に適応させる。

【0236】

デュアルバキュロウイルスＳｆ９産生系は、これらの安全性の問題に関して、他の産生プラットフォームよりも多くの利点を有する：（１）無血清培地の使用、（２）Ｓｆ細胞株での外来ウイルス転写産物の発見にもかかわらず、昆虫に感染するウイルスのほとんどは、哺乳類細胞では能動的に複製しない、及び（３）バキュロウイルス以外に、昆虫細胞でのｒＡＡＶ産生にヘルパーウイルスは必要ない。

【0237】

ある特定の実施形態では、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質を発現する安定なＳｆ９昆虫細胞株が使用されるため、感染性ｒＡＡＶベクターを高収率で産生するためには１つのみの組換えバキュロウイルスの感染が必要とされる。

【0238】

哺乳類安定細胞株。
ｒＡＡＶベクターはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を安定的に発現する安定した哺乳類産生細胞を使用して、効率的かつ拡張可能に産生され得る。そのような細胞は、野生型のＡｄ５ヘルパーウイルス（これは遺伝的に安定しており、高力価で容易に産生することができる）に感染し、高レベルのｒｅｐ及びｃａｐの発現を誘導することができる。感染性ｒＡＡＶベクターは、これらのパッケージング細胞株に野生型Ａｄ５型を感染させ、プラスミドのトランスフェクションによって、または組換えＡｄ／ＡＡＶハイブリッドウイルスによる感染後のいずれかでｒＡＡＶゲノムを提供することで生成され得る。

【0239】

別の方法として、Ａｄを、ヘルパーウイルスとしてのＨＳＶ－１で置き換えることもできる。

【0240】

好適な安定した哺乳類産生細胞としては、ＨｅＬａ由来の産生細胞株、Ａ５４９細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられ得る。好ましいＨｅＬａ細胞株は、ＨｅＬａＳ３細胞、すなわち、浮遊に適応させたＨｅＬａサブクローンである。

【0241】

本明細書に記載の方法を使用して、動物成分を含まない培地中で、好ましくは２５０－Ｌ規模、または２，０００－Ｌの商業規模で、本主題のＡＡＶベクターを製造することができる。

【0242】

本発明のｒＡＡＶウイルス粒子がどのように産生されるかにかかわらず、結果として生じるｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によるものなどの当該技術分野において標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９，１９９９、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７－４４３，２００２、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。

【0243】

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング／産生細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、安定的に形質転換されたがん細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥｌで形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞）である。

【0244】

ある特定の実施形態において、主題のｒＡＡＶは、安定的にＡＡＶ Ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を有する、例えば、ＨｅＬａまたはＡ５４９またはＨＥＫ２９３細胞に由来するある特定のＡＡＶ産生細胞株に基づいて産生される。ＡＡＶベクターカセットは、宿主ゲノムに安定的に組み込まれ得るか、またはカセットを含むアデノウイルスによって導入され得るかのいずれかである。

【0245】

ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ産生のためのそのような産生細胞株は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶプロウイルスを含み、ｒＡＡＶプロウイルスは、ｒＡＡＶ産生のための産生細胞株のゲノムに組み込まれる。

【0246】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての成分を安定的に発現する細胞株を創出することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶベクターゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）は、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：２０７７－２０８１，１９８２）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３：６５－７３，１９８３）、または直接的な平滑断端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４６６１－４６６６，１９８４）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株をアデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であること、及びｒＡＡＶの大規模生産に好適であることである。

【0247】

好適な方法の他の例では、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。

【0248】

したがって、パッケージング細胞のいずれも、ポリヌクレオチド、ＡＡＶベクターゲノム、または本発明のＡＡＶウイルス粒子を含む本発明の宿主細胞の範囲内である。

【0249】

７．ｒＡＡＶを使用した筋ジストロフィーの治療
本発明の別の態様は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒトにおいて、それを行う方法であって、ヒトに、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド、本発明のｒＡＡＶベクターゲノムもしくはｒＡＡＶウイルス粒子、または本発明の薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0250】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子における変異の機能喪失を特徴とする。

【0251】

ある特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＸ連鎖拡張型心筋症である。

【0252】

したがって、本発明の関連する態様は、筋ジストロフィー（ＤＭＤ及びＢＭＤなど）の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、マイクロジストロフィン遺伝子などの筋ジストロフィーに欠損する遺伝子の機能的バージョンをコードする治療有効量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター（ＡＡＶ９またはＳＬＢ－１０１カプシドにカプシド形成されるものなど）を対象に投与することを含み、ｒＡＡＶベクターゲノムは、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化ポリヌクレオチド（配列番号１など）のいずれかを含む、方法を提供する。

【0253】

ある特定の実施形態において、マイクロジストロフィン遺伝子は、全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４スペクトリン様反復（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されるものなど）のコード配列を含む。

【0254】

ある特定の実施形態において、マイクロジストロフィン遺伝子は、配列番号２のマイクロジストロフィンタンパク質のコード配列を含み、コード配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．８％、または９９．９％同一のヌクレオチド配列を含む。任意選択で、コード配列は、各大文字のヌクレオチドで配列番号１と同一であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下の大文字のヌクレオチドだけ異なり、更に任意選択で、コード配列は、ＣｐＧ島（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のＣｐＧ島）を実質的に欠く。

【0255】

ある特定の実施形態において、方法は、そのように産生されたｒＡＡＶを対象に投与する前に、主題のｒＡＡＶを産生することを更に含む。

【0256】

本発明の方法のいずれかでは、該ｒＡＡＶベクターは、筋肉注射または静脈内注射によって投与することができる。

【0257】

本発明の方法のいずれかでは、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、全身投与され得る。例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入、または移植による非経口投与である。

【0258】

８．薬学的組成物及びその使用
本発明の別の態様は、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかを含む、薬学的組成物などの組成物を提供する。

【0259】

ある特定の実施形態において、組成物は、治療適合性担体、賦形剤、希釈剤、及び／またはアジュバントを更に含み得る薬学的組成物である。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに無毒であり、好ましくは、用いられる用量及び濃度で不活性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン、単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0260】

別の実施形態において、本発明は、ジストロフィン異常症、または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはベッカー型筋ジストロフィーに罹患している対象の治療に使用するための、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含む、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかを含む組成物を提供する。

【0261】

本発明の組成物（例えば、医薬組成物）は、筋肉注射または静脈内注射用に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、全身投与、例えば、注射、注入、または移植による非経口投与用に製剤化され得る。更に、組成物のいずれかは、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患している対象に投与するために製剤化される。

【0262】

更なる実施形態において、本発明は、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患している対象を低減するための薬剤の調製のための、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかの使用を提供する。

【0263】

本発明は、ＤＭＤと診断された患者に投与するための薬剤の調製のための、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかの使用を企図する。

【0264】

また、本発明は、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶ、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかを、筋ジストロフィーに罹患している対象に投与するための薬剤の調製のために、本発明のＣｐＧ低減コドン最適化マイクロジストロフィンコード配列を含むｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、及びベクターゲノムのいずれかを使用することを企図する。

【0265】

本発明の使用のいずれかでは、該薬剤は、筋肉注射用に製剤化することができる。更に、薬剤のいずれかは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患している対象に投与するため調製され得る。

【0266】

９．投薬及び投与
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある。

【0267】

標的細胞にインビボまたはインビトロでｒＡＡＶを形質導入する方法は、本発明によって企図される。インビボ法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（排除するか、または低減する）、障害／疾患状態への進行を遅延させるか、もしくは予防する、障害／疾患状態の進行を遅延させるか、もしくは予防する、疾患の程度を減少させる、疾患の寛解（部分的または完全）をもたらす、及び／または生存期間を延長する用量である。

【0268】

投与に関して、有効量及び治療有効量（本明細書では用量とも呼ばれる）は、最初は、インビトロアッセイ及び／または動物モデルでの試験の結果に基づいて推定され得る。例えば、用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報は、目的の対象での有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。

【0269】

組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、治療される感染症及び／または疾患状態、ならびに１つ以上のコード配列及び／またはマイクロジストロフィンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択する、及び／または一致させることができる。

【0270】

具体的には、本明細書に記載の製剤は、限定されないが、注射、注入、灌流、吸入、洗浄、及び／または摂取によって投与され得る。投与経路としては、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、小胞内、心膜内、臍内、眼内、粘膜、経口、皮下、及び／または結膜下を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0271】

本発明は、本発明の併用療法を含む本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与または全身投与を提供する。例えば、全身投与は循環系への投与であり、そのため全身が影響を受ける。全身投与には、経腸投与、例えば、消化管からの吸収、及び注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。

【0272】

特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、動物の標的組織、例えば、骨格筋に該ｒＡＡＶ組換えベクターを輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与には、筋肉、血流、及び／または直接肝臓への注射が含まれるが、これに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するだけで、筋組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと共投与することができる担体または他の成分に対する制限は知られていない（ただし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶでは普通に回避するべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが目的の特定の標的組織、例えば、筋肉を標的とするように修飾され得る。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。

【0273】

医薬組成物は、注射製剤または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするための任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

【0274】

本明細書に開示する方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。

【0275】

特定の対象に投与される実際の投与量は、医師、獣医、または研究者によって、体重、状態の重症度、疾患の型、以前のまたは併用される治療的介入、該対象の特発性疾患、及び／または投与経路を含めた物理的及び生理的因子等であるが、これらに限定されないパラメータを考慮して決定される場合もある。

【0276】

投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、または約１×１０^１５以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）（すなわち、それぞれ１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４ｖｇ、１×１０^１５ｖｇ）の単位で表されてもよい。投薬量はまた、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ）で表されてもよい。ＡＡＶを滴定するための方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１０３１－１０３９，１９９９に記載されている。

【0277】

例示的な用量は、約１×１０^１０～約１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム体重に及び得る。いくつかの実施形態において、用量は、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ体重、または１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ体重を含み得る。用量は、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ／日、または１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ／日を含み得る。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日または０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５μｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１μｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。他の非限定的な例において、用量は、１μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２００μｇ／ｋｇ／日、３５０μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、３５０ｍｇ／ｋｇ／日、５００ｍｇ／ｋｇ／日、または１０００ｍｇ／ｋｇ／日を含み得る。治療有効量は、治療計画の過程（すなわち、数日、数週間、数ヶ月等）において、単回投与または複数回投与により達成され得る。

【0278】

いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、少なくとも１．６×１０^１３のベクターゲノムを有する水溶液１０ｍＬの剤形である。いくつかの実施形態において、投薬量は、１ミリリットル当たり少なくとも２×１０^１２のベクターゲノムの効力を有する。いくつかの実施形態において、投薬量は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む無菌水溶液を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む１０ｍＬの無菌水溶液の剤形に含まれ、少なくとも１．６×１０^１３のベクターゲノムを有する。

【0279】

いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１×１０^１０～１×１０^１５のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０^１１～１×１０^１４のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０^１２～２×１０^１３のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、または約１．６×１０^１３以上のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液を含む剤形であり得る。いくつかの実施形態において、水溶液は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む無菌水溶液である。いくつかの実施形態において、投薬量は、１ミリリットル当たり約１×１０^１１超のベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）、約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ超、約２×１０^１２ｖｇ／ｍＬ超、約３×１０^１２ｖｇ／ｍＬ超、または約４×１０^１２ｖｇ／ｍＬ超の効力を有する。

【0280】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＡＶベクターは、医薬組成物の一部として提供される。薬学的組成物は、例えば、少なくとも０．１％ｗ／ｖのＡＡＶベクターを含み得る。いくつかの他の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的組成物の重量当たり２％～７５％の化合物、または薬学的組成物の重量当たり２５％～６０％の化合物を含み得る。

【0281】

いくつかの実施形態では、該剤形はキットに含まれる。キットは更に、投薬量の使用説明書を含んでもよい。

【0282】

筋肉注射の目的のため、無菌水溶液だけでなく、ゴマ油もしくは落花生油等のアジュバント溶液または水性プロピレングリコール溶液も使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝することができ、希釈液は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で調製され得る。通常の保存条件及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。これに関連して、用いられる無菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技法で容易に得られる。

【0283】

いくつかの実施形態では、注射用に、製剤は水溶液として、例えば、限定されないが、ハンクス液、リンゲル液、及び／または生理食塩水を含む緩衝液として作製され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤などの配合剤を含んでもよい。代替的に、製剤は、使用前に好適なビヒクル対照（例えば、パイロジェンフリーの無菌水）で構成するために、凍結乾燥状態及び／または粉末形態であってもよい。

【0284】

本明細書に開示する任意の製剤は、有利には、研究、予防、及び／または治療処置用であるかどうかにかかわらず、投与の利益を上回る可能性のある重大な副反応、アレルギー反応、または他の有害反応を生じさせないものを含む、任意の他の医薬的に許容される担体（複数可）を含み得る。例示的な薬学的に許容される担体及び製剤は、それに関連する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に開示されている。更に、製剤は、米国ＦＤＡのＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ及び／または他の関連する米国及び外国の規制機関によって要求される、無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たすように調製され得る。

【0285】

例示的な一般的に使用される医薬的に許容される担体は、増量剤もしくは充填剤、溶媒もしくは共溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、及びビタミンＥ）、防腐剤、等張剤、吸収遅延剤、塩、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／または滑沢剤を含み得るが、これらに限定されない。

【0286】

例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及び／またはトリメチルアミン塩を含み得るが、これらに限定されない。

【0287】

例示的な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベン等）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び／または３－ペンタノールを含み得るが、これらに限定されない。

【0288】

例示的な等張剤は、三価以上の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及び／またはマンニトール）を含むがこれらに限定されない多価糖アルコールを含み得る。

【0289】

例示的な安定剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー、及び／または多糖類を含み得るが、これらに限定されない。

【0290】

製剤はまた、デポー製剤でもよい。いくつかの実施形態において、そのような長時間作用型製剤は、限定されないが、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉注射によって投与され得る。したがって、例えば、化合物は、好適なポリマー及び／または疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションとして）もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化され得る。

【0291】

更に、様々な実施形態では、該ＡＡＶベクターは、持続放出システム、例えば、該ＡＡＶベクターを含む固体ポリマーの半透性マトリックスを使用して送達され得る。様々な徐放性材料が確立されており、当業者には周知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に応じて、投与後数週間から最大１００日以上にわたってベクターを放出し得る。

【0292】

注射用途に好適な医薬担体、希釈剤、または賦形剤としては、無菌注射剤溶液または分散体の即時調製用の無菌水溶液または分散体及び無菌粉末が挙げられる。全ての場合で、形態は、無菌でなければならず、容易にシリンジを通過する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、溶媒または分散媒であってもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射剤組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0293】

無菌注射剤溶液は、必要量のｒＡＡＶを、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散体は、無菌の活性成分を、基本的な分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射剤溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技法であり、これにより、活性成分に加えて任意の更なる所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。

【0294】

ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行われる場合もある。一実施形態において、所望の標的筋細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、同系または異種筋細胞を使用することができ、これらの細胞は、対象において不適切な免疫応答を生じない。

【0295】

形質導入された細胞の対象への形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶを筋細胞と、例えば、適切な培地中で組み合わせることによって、ならびにサザンブロット及び／またはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを保有するそれらの細胞をスクリーニングすることによって、インビトロで形質導入することができる。次いで、形質導入細胞は、薬学的組成物に製剤化することができ、組成物は、様々な技法、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射、または例えば、カテーテルを使用した平滑筋及び心筋への注射により、対象に導入され得る。

【0296】

本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、該１つ以上の更なるコード配列及びマイクロジストロフィンの持続的な共発現をもたらす。本発明は、したがって、該１つ以上の更なるコード配列及びマイクロジストロフィンを共発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、組織（筋肉などの組織、肝臓及び脳などの器官、ならびに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を本発明の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、筋特異的制御エレメントによって指示される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供し、制御エレメントとしては、限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来のもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６１－７６６，１９９１参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２，１９９１）、ヒト骨格アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：４０８９－４０９９，１９８７）、心筋型アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：３３９３－３３９９，１９８９）、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメントに由来する制御エレメント、骨格速収縮トロポニンＣ遺伝子、緩徐収縮心臓トロポニンＣ遺伝子、及び緩徐収縮トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント、低酸素誘導性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６８０－５６８４，１９９１）、ステロイド誘導性エレメント及びグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５６０３－５６０７，１９９３を参照されたい）、ならびに他の制御エレメントが挙げられる。

【0297】

筋肉組織は、それが重要器官ではなく、かつ近づきやすいため、インビボでのＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡ及びマイクロジストロフィンの持続的な共発現を企図する。

【0298】

本明細書で使用される、「筋細胞」または「筋組織」は、あらゆる種類の筋肉に由来する細胞または細胞群を意味する（例えば、骨格筋及び平滑筋、例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織）。そのような筋細胞は、分化していても未分化でもよく、例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞であり得る。

【0299】

「形質導入」という用語は、該１つ以上の更なるコード配列及び該マイクロジストロフィンのコード領域を、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエント細胞による該１つ以上の更なるコード配列及びマイクロジストロフィンの共発現をもたらす本発明の複製欠損性のｒＡＡＶを介して、該レシピエント細胞に投与／送達することを指すために使用される。

【0300】

したがって、本発明は、該１つ以上の更なるコード配列及びマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（または複数回用量、本質的に同時に投与されるか、または間隔を置いて投与される）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。

【実施例】

【0301】

実施例１ 従来のコドン最適化導入ＣｐＧ島
様々な従来のコドン最適化アプローチがあり、全て、特定の宿主細胞においてコドン最適化されるコード配列の発現レベルを改善することを目的としている。しかしながら、これらのアプローチは、プロセス中にＣｐＧ島を導入する。

【0302】

ＥＢＩウェブサイト、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔのオンラインツールを使用して、特定の入力ヌクレオチド配列におけるＣｐＧ島の数及び位置を予測することが可能である。この分析の結果は、全ての一般的に使用されるコドン最適化アプローチが、それらのそれぞれの出力配列（すなわち、コドン最適化ポリヌクレオチド）に多くのＣｐＧ島を導入したことを示したが、ＣｐＧ島を除去するためにコドン最適化ポリヌクレオチドの１つに基づいて編集された配列番号１は、もはやオンラインツールによってＣｐＧ島を予測していない。

【0303】

具体的には、配列番号２のマイクロジストロフィンをコードする天然の、コドン最適化されていないマイクロジストロフィンコード配列を、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔを使用して、ウィンドウサイズ＝１００、最小長＝１００、最小観測値＝０．６、最小パーセンテージ＝５０のパラメータを使用して分析した。この分析の出力を図１に示した。天然ヒト配列が、ヌクレオチド２４００～２５００の間に１つのＣｐＧ島のみを有することは明らかである。

【0304】

次いで、この天然ヒトＭＤ５コード配列を、Ｇｅｎｅ Ａｒｔを使用してコドン最適化して、配列番号２の同じマイクロジストロフィンタンパク質についての第１のコドン最適化コード配列を生成した。ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔは、このコドン最適化配列において９つのＣｐＧ島を特定した。図２を参照されたい。

【0305】

この最初のコドン最適化コード配列は、配列番号１の大文字のヌクレオチドで出願人によって修飾され、配列番号１に到達した。ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔは、このコドン最適化配列においてＣｐＧ島を特定しなかった。図３を参照されたい。

【0306】

次に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔを使用して同じ天然のヒトＭＤ５をコドン最適化し、配列番号２の第２のコドン最適化コード配列を生成した。ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔは、このコドン最適化配列において４つのＣｐＧ島を特定した。図４を参照されたい。

【0307】

同じプロセスを更に別のコドン最適化アプローチＤＮＡ２．０に対して繰り返した。ＥＭＢＯＳＳ Ｃｐｇｐｌｏｔは、このコドン最適化配列において１１のＣｐＧ島を特定した。図５。

【0308】

興味深いことに、図２のＧｅｎｅ Ａｒｔコドン最適化コード配列（９つのＣｐＧ島を有する）を、ＤＮＡ２．０を使用したコドン最適化の第２ラウンドの入力として使用して、他のＤＮＡ２．０産生コドン最適化配列と同様に、１０のＣｐＧ島を有するコード配列を得た。図６を参照されたい。

【0309】

これらのデータは、従来のコドン最適化アプローチが全て、結果として生じるコドン最適化コード配列においてＣｐＧ島を創出する傾向があることを示した。異なるアプローチを使用した複数ラウンドのコドン最適化は、ＣｐＧ島を排除しなかった。

【0310】

実施例２ ＴＬＲ９活性化アッセイ
ＣｐＧ ＰＡＭＰは、ヒト及び他の高等霊長類のＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）においてのみ構成的に発現されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識される。非メチル化ＣｐＧモチーフによるＴＬＲ９の結合及び活性化は、非臨床モデルにおけるＡＡＶベクターに対するＣＴＬ応答を促進する。

【0311】

このアッセイ（概略図を図７に提供する）を使用して、所与のポリヌクレオチドコード配列の可能性及び程度を評価し、ＣｐＧ島の存在に起因する所望されない宿主の免疫反応を誘発することができる。

【0312】

簡潔に述べると、潜在的なＣｐＧ島を有する試験ポリヌクレオチドを受けるようにスケジュールされた、健康なドナーの血液試料から単離されたヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。９６ウェル組織培養プレートに、細胞を５×１０^４（５Ｅ４）細胞／ウェル／１００μＬ細胞培養培地で播種した。抗ＡＡＶカプシド（例えば、抗ＡＡＶ９）ＩｇＧ３抗体を添加し、続いて、試験品またはビヒクル対照を添加した。組織培養プレートを３７℃で約２２時間インキュベートした。次いで、細胞培養上清を収集し、ＴＬＲ９活性化の読み出しとしてのＩＦＮ－αの存在及び量をＥＬＩＳＡで測定した。

【0313】

このアッセイを使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むベクターゲノムをカプシド形成するＡＡＶ９ウイルス粒子が、ＴＬＲ９依存性ＩＦＮ－α産生を増加させることが示された（データ図示せず）。更に、カプシド形成ベクターゲノムなしの空のＡＡＶ９カプシドは、ＴＬＲ９活性化を誘発しなかった。したがって、このアッセイを利用して、修飾されたＣｐＧ島を含むベクターゲノムをカプシド形成するＡＡＶ９ウイルス粒子に対する自然免疫応答を調べることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】