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特表2024-532784新規なＯＭＮＩ－１１５、１２４、１２７、１４４～１４９、１５９、２１８、２３７、２４８、２５１～２５３及び２５９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】新規なＯＭＮＩ－１１５、１２４、１２７、１４４～１４９、１５９、２１８、２３７、２４８、２５１～２５３及び２５９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/14 20060101AFI20240903BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240903BHJP
【ＦＩ】
C12N9/14 ZNA
C12N15/09 110
C12N15/55
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508548
(86)(22)【出願日】2022-08-12
(85)【翻訳文提出日】2024-04-09
(86)【国際出願番号】 US2022074941
(87)【国際公開番号】W WO2023019269
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】63/232,723
(32)【優先日】2021-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521476126
【氏名又は名称】エメンドバイオ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】イザール、リオル
(72)【発明者】
【氏名】マールバッハ・バール、ナダブ
(72)【発明者】
【氏名】ロッカー、リアット
(72)【発明者】
【氏名】メロン、ヌリット
(72)【発明者】
【氏名】アディブ・タル、オフィール
(72)【発明者】
【氏名】ギスパン、アリエル
(72)【発明者】
【氏名】ブッフ、イディット
(57)【要約】
この発明は、配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は当該ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、非天然組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３、１又は２～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、非天然組成物。
【請求項2】
１以上のＲＮＡ分子、又は前記１以上のＲＮＡ分子のいずれか１つをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、ここで、前記１以上のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは天然では同時に存在せず、並びに、前記１以上のＲＮＡ分子は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、及び／又は、前記１以上のＲＮＡ分子は前記複合体を標的部位に向けるように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号８２～９７からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号８２～８５及び９６からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
配列番号８６～９３及び９７からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号８２～９７からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号５２～６４からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号５２～５５からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
配列番号５６～６３からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号５２～６４からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号６５～８１からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号６５～６８及び８０からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
配列番号６９～７７及び８１からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号６５～８１からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号９８～１１４からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号９８～１０１及び１１４からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
配列番号１０２～１１１からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号９８～１１４からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項19】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１１５～１２７からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項20】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１１５～１１８からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
配列番号１１９～１２６からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１１５～１２７からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項23】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１２８～１４１からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項24】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１２８～１３１からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
配列番号１３２～１４０からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１２８～１４１からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項27】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１４２～１５５からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項28】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１４２～１４５からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
配列番号１４６～１５２及び１５５からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１４２～１５５からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項31】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１５６～１６７及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項32】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１５６～１５９からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
配列番号１６０～１６６及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１５６～１６７及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項35】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１６８～１７６からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項36】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１６８及び１６９からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項37】
配列番号１７０～１７５からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項38】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１６８～１７６からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項39】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１７７～１８５からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項40】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１７７及び１７８からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
配列番号１７９～１８４からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項42】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１７７～１８５からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項43】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１８６～２０２からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項44】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１８６～１８９及び２０１からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項45】
配列番号１９０～１９８及び２０２からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項46】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１８６～２０２からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項47】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼである、請求項１～４６のいずれか一項の組成物。
【請求項48】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼである、請求項１～４６のいずれか一項の組成物。
【請求項49】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列７に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメイン及び不活性化ＨＮＨドメインを有する触媒活性のないヌクレアーゼである、請求項１～４６のいずれか一項の組成物。
【請求項50】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２～４のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて示したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用する、請求項１～４９のいずれか一項の組成物。
【請求項51】
請求項２～５０のいずれか一項の組成物を細胞に導入することを含む、無細胞系で又は細胞のゲノム内で、ＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を改変する方法。
【請求項52】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２～４に示したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断し、及び／若しくは前記ＰＡＭ配列に相補的な配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼであり、前記ＰＡＭ配列に相補的な配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する、請求項５１に記載の方法。
【請求項54】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼであり、前記ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する、請求項５１に記載の方法。
【請求項55】
前記細胞は真核細胞又は原核細胞である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記細胞はヒト細胞である、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この出願は、米国仮出願第63/232,723号（出願日：2021年8月13日）の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
この出願全体で、カッコ内のものを含め、さまざまな刊行物を参照する。この出願で言及する全ての刊行物の開示全体は、本発明で使用できる技術及び本発明が関係する技術を補足するために、参照によりこの出願に組み込まれる。
【0003】
配列表の参照
この出願は、MS-Windows（登録商標）と互換性を有するオペレーティングシステムを使用するIBM-PC機形式で2022年8月12日に作成され、この出願の一部として2022年8月12日に提出した、サイズが575KBのXMLファイルであって、ファイル名が「210812_91769-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.xml」中のヌクレオチド配列を参照により組み込む。
この出願は、MS-Windows（登録商標）と互換性を有するオペレーティングシステムを使用するIBM-PC機形式で2022年8月12日に作成され、この出願の一部として2022年8月12日に提出した、サイズが575KBのXMLファイルであって、ファイル名が「210812_91769-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.xml」中のヌクレオチド配列を参照により組み込む。
【0004】
技術分野
本発明は、とりわけ、ゲノム編集のための組成物及び方法に関する。
本発明は、とりわけ、ゲノム編集のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0005】
細菌及び古細菌の適応免疫における、クラスター化され規則的に間隔が空いた短いパリンドローム反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat、ＣＲＩＳＰＲ）系は、タンパク質組成とゲノム遺伝子座構造の極端な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ系は、研究及びゲノム工学の重要なツールとなった。それにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ系の詳細の多くは不明であり、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの適用は、配列特異性、発現又は送達によって制限される可能性がある。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼには、サイズ、ＰＡＭサイト、オンターゲット活性、特異性、切断パターン（例．平滑末端、付着末端）及び切断後のインデル形成の顕著なパターンなどの多様な特徴がある。さまざまな特性の組合せがさまざまな用途に役立つ可能性がある。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座を標的とすることが可能であるが、別の群のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＰＡＭサイトの制限のために不可能である。さらに、現在使用されている一部のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは前免疫（pre-immunity）を示し、in vivoでの適用性が制限される可能性がある。Charlesworth et al., Nature Medicine (2019)及びWagner et al., Nature Medicine (2019)を参照。したがって、新規なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発見、実用化及び改良が重要である。
【発明の概要】
【0006】
この明細書は、ゲノム工学、エピゲノム工学、ゲノムターゲティング、細胞のゲノム編集及び／又はin vitro診断に利用できる組成物及び方法を開示する。
【0007】
開示した組成物は、ゲノムＤＮＡ配列の改変に利用してもよい。この明細書では、ゲノムＤＮＡは、対象とする細胞又は細胞群に存在する、直鎖状及び／若しくは染色体ＤＮＡ並びに／又はプラスミド若しくは他の染色体外ＤＮＡの配列を指す。いくつかの態様では、対象とする細胞は真核細胞である。いくつかの態様では、対象とする細胞は原核細胞である。いくつかの態様では、この方法は、ゲノムＤＮＡ配列の所定の標的部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、ゲノムの標的部位においてＤＮＡ配列の変異、挿入及び／又は欠失をもたらす。
【0008】
したがって、いくつかの態様では、組成物は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。
【0009】
ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
本発明は、表１に示す「ＯＭＮＩ」ヌクレアーゼと呼ぶＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを提供する。
本発明は、表１に示す「ＯＭＮＩ」ヌクレアーゼと呼ぶＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを提供する。
【0010】
この発明は、(i) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物、又は、配列番号１８～５１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子、及び、(ii) ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子、又は、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、細胞に導入することを含む、哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位でヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
【0011】
この発明は、
a) 直接の反復配列と連結した、標的配列とハイブリダイズできる、ガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
b) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；
を含むＣＲＩＳＰＲ関連系を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の相補配列の３’末端に隣接し、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成する。
a) 直接の反復配列と連結した、標的配列とハイブリダイズできる、ガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
b) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；
を含むＣＲＩＳＰＲ関連系を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の相補配列の３’末端に隣接し、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成する。
【0012】
この発明は、
a) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；並びに
b) i) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合できるヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列；及び
ii) 標的ＤＮＡ配列中の配列に相補的な配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列、
の少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物も提供し、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成して、前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる複合体を形成できる。
a) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；並びに
b) i) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合できるヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列；及び
ii) 標的ＤＮＡ配列中の配列に相補的な配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列、
の少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物も提供し、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成して、前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる複合体を形成できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】図１Ａ～図１Ｄは、ｓｇＲＮＡ＿１２７、ｓｇＲＮＡ＿２３７及びｓｇＲＮＡ＿２５９からのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の予測される二次構造を示す。図１Ａは、ＯＭＮＩ-１２７のｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスを、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分とともに示す。
【図2】図２～１８は、ＯＭＮＩヌクレアーゼのin vitroのＴＸＴＬ ＰＡＭ枯渇の結果を示す。ＰＡＭロゴは欠損部位の割合を模式的に表したものである（上パネル）。ＴＸＴＬ反応のＮＧＳ後に、ＰＡＭプラスミドライブラリーからの特定のＰＡＭ配列（下のパネル、右）の枯渇率（下のパネル、左）を計算した。各ＯＭＮＩについての計算は、ＰＡＭライブラリーの８塩基対の配列に沿った４Ｎウィンドウに基づく。試験を行ったＯＭＮＩに必要とされるＰＡＭと、この反応条件でのヌクレアーゼ活性のレベルは、枯渇率から推測される。ＯＭＮＩ-１１５についてのin vitroのＰＡＭ枯渇結果を図２～１８に示す。
【図19A】図１９Ａ～１９Ｃに、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰ複合体の一部としてのＯＭＮＩ-１２７の活性とスペーサーの最適化を示す。ＯＭＮＩ-１２７ヌクレアーゼを過剰発現させて、精製した。精製されたタンパク質を合成したｓｇＲＮＡと複合化してＲＮＰを形成させた。 図１９Ａでは、in vitroアッセイでは、ＥＬＡＮＥ標的化ｇ１３５ガイド（表６に列挙）を有する漸減量のＲＮＰ（４、２、１及び０．５ｐｍｏｌ）を、ＥＬＡＮＥ ＤＮＡ標的テンプレート４０ｎｇと共にインキュベートした。活性は、線状のテンプレートを切断するＲＮＰの能力によって確認した。
【発明を実施するための形態】
【0014】
詳細な説明
本発明のいくつかの側面では、開示した組成物は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ及び／又はそれをコードする配列を含む核酸分子を含む。
本発明のいくつかの側面では、開示した組成物は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ及び／又はそれをコードする配列を含む核酸分子を含む。
【0015】
表１は、新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及び、ヌクレアーゼをニッカーゼ又は触媒活性のないヌクレアーゼに変換する各ヌクレアーゼ内の１か所以上の置換の位置を示す。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの触媒部位は、ヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有し、一本鎖ＤＮＡを切断できるように改変してもよい。あるいは、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの触媒部位は、ヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性を有さない、すなわち触媒活性のないヌクレアーゼとなるように改変してもよい。明細書全体で、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて言及しているが、これらのヌクレアーゼは、ニッカーゼ活性を有するように（つまり、二本鎖ＤＮＡを切断するのではなく一本鎖を切断するヌクレアーゼ）、又はヌクレアーゼ活性を有さないように（つまり、触媒活性のないヌクレアーゼ）改変してもよい。
【0016】
表２は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、並びに、各ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと互換性のあるｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ配列の一部を示す。したがって、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一部として表２に示すＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し標的化できるｃｒＲＮＡ分子は、表２に示すｃｒＲＮＡ配列を含んでいてもよい。同様に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一部として表２に示すＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し標的化できるｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、表２に示すｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでいてもよい。また、表２に示すＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し標的化できるシングルガイドＲＮＡ分子は、表２に示す配列を含んでいてもよい。
【0017】
例えば、ＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼ（配列番号１）のｃｒＲＮＡ分子は、配列番号５２～５５で示す配列を含んでいてもよく；ＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼのｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、配列番号５６～６３のいずれか１つに示す配列を含んでいてもよく；そして、ＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼのｓｇＲＮＡ分子は、配列番号５２～６４のいずれか１つに示す配列を含んでいてもよい。各ＯＭＮＩヌクレアーゼの他のｃｒＲＮＡ分子、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｓｇＲＮＡ分子は、表２に示した配列から同じ方法で誘導できる。
【0018】
これらのヌクレアーゼのいずれか１つは、ガイドＲＮＡ分子を介して所望のＤＮＡ標的配列を標的とすることができる。ヌクレアーゼ－ガイド複合体は、また、複合体に結合した分子を標的部位に運ぶ。したがって、この開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＤＮＡ改変ドメイン（例．デアミナーゼ、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子又は転写抑制因子ドメイン）を含む融合タンパク質、並びに疾患に関連するゲノム（例．ヒト対象のゲノム）中の変異を修正し、又はゲノム（例．ヒトゲノム）中に変異を生成して、遺伝子の発現を減少させるか防止する融合タンパク質の使用も予定している。
【0019】
いくつかの態様では、本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、酵素活性を有するタンパク質と融合してもよい。いくつかの態様では、酵素活性は標的ＤＮＡを改変する。いくつかの態様では、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、 ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性又はグリコシラーゼ活性である。場合によって、酵素活性はヌクレアーゼ活性である。場合によって、ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを二本鎖切断する。場合によって、酵素活性は、標的ＤＮＡに関連する標的ポリペプチドを改変する。場合によって、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、 ミリストイル化活性又は脱ミリストイル化活性である。場合によって、標的ポリペプチドがヒストンで、酵素活性がメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性又は脱ユビキチン化活性である。
【0020】
したがって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ニッカーゼ又は触媒活性のないヌクレアーゼのいずれか１つは、デアミナーゼ、逆転写酵素（例．プライム編集における使用はAnzaolone et al. (2019)を参照）、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素（例．メチルトランスフェラーゼ）又はヒストンの修飾因子（例．ヒストンアセチルトランスフェラーゼ）などの塩基エディターを含むがこれらには限定されない、別のＤＮＡ調節酵素又はＤＮＡ改変酵素と（例えば、直接又はリンカーを介して）融合してもよい。実際に、本願のＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、不活性ヌクレアーゼは、ＤＮＡ改変酵素又はそのエフェクタードメインと融合してもよい。ＤＮＡ調節因子の例には、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、デメチラーゼ、ホスファターゼ、転写活性化因子又は転写抑制因子が含まれるが、これらには限定されない。いくつかの態様では、本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、酵素活性を有するタンパク質と融合する。いくつかの態様では、酵素活性は、標的ＤＮＡ分子を改変する本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその融合タンパク質は、疾患に関連する遺伝子中の１以上の変異を修正若しくは生成するために、又は遺伝子の発現を増加、修正、減少若しくは防止するために使用してもよい。
【0021】
非天然組成物は、配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む。
【0022】
いくつかの態様では、組成物は、１以上のＲＮＡ分子、又は当該１以上のＲＮＡ分子のいずれか１つをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、ここで、前記１以上のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは天然では同時に存在せず、並びに、前記１以上のＲＮＡ分子は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、及び／又は、前記複合体を標的部位に向けるように構成されている。
【0023】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号５２～６４からなる群から選択される配列を含む。
【0024】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号５２～５５からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0025】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号５６～６３からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0026】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号５２～６４からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0027】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号６５～８１からなる群から選択される配列を含む。
【0028】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号６５～６８及び８０からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0029】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号６９～７７及び８１からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0030】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号６５～８１からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0031】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号８２～９７からなる群から選択される配列を含む。
【0032】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号８２～８５及び９６からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0033】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号８６～９３及び９７からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0034】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号８２～９７からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0035】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号９８～１１４からなる群から選択される配列を含む。
【0036】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号９８～１０１及び１１４からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0037】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１０２～１１１からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0038】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号９８～１１４からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0039】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１１５～１２７からなる群から選択される配列を含む。
【0040】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１１５～１１８からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0041】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１１９～１２６からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0042】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１１５～１２７からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0043】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１２８～１４１からなる群から選択される配列を含む。
【0044】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１２８～１３１からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0045】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号132～140からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0046】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１２８～１４１からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0047】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１４２～１５５からなる群から選択される配列を含む。
【0048】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１４２～１４５からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0049】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１４６～１５２及び１５５からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0050】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１４２～１５５からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0051】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１５６～１６７及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群から選択される配列を含む。
【0052】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１５６～１５９からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0053】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１６０～１６６及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0054】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１５６～１６７及びＧＣＵＵＵＡＡＧＣからなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0055】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１６８～１７６からなる群から選択される配列を含む。
【0056】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１６８及び１６９からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0057】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１７０～１７５からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0058】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１６８～１７６からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0059】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１７７～１８５からなる群から選択される配列を含む。
【0060】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１７７及び１７８からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0061】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１７９～１８４からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0062】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１７７～１８５からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0063】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号１８６～２０２からなる群から選択される配列を含む。
【0064】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１８６～１８９及び２０１からなる群から選択される配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
【0065】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１９０～１９８及び２０２からなる群に示す配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
【0066】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分及び配列番号１８６～２０２からなる群から選択される配列を含む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
【0067】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼである。
【0068】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼである。
【0069】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列７に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメイン及び不活性化ＨＮＨドメインを有する触媒活性のないヌクレアーゼである。
【0070】
例えば、ＯＭＮＩ-１２７のアミノ酸配列（配列番号３）の９位のアスパラギン酸残基（Ｄ）を別のアミノ酸（例．アラニン（Ａ））に置換することによってそのＲｕｖＣドメインを不活性化し、ＯＭＮＩ-１２７ヌクレアーゼのニッカーゼを作り出せる。他のアミノ酸への置換は、表１中に別段の記載がない限り、列５～７に示したアミノ酸位置のそれぞれについて許容される。他のニッカーゼ又は触媒活性のないヌクレアーゼも、表１から同様にして作り出せる。
【0071】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２～４のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて示したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用する。
【0072】
この発明は、上記組成物のいずれか１つを細胞に導入することを含む、無細胞系で又は細胞のゲノム内で、ＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を改変する方法も提供する。いくつかの態様では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡ分子を含む。
【0073】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２～４に示したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断し、前記ＰＡＭ配列に相補的な配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する。例えば、適切な標的化ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を有するＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼは、配列ＮＮＲＹＴＴ又はＮＮＲＴＴＴに隣接する鎖で、及び配列ＮＮＲＹＴＴ又はＮＮＲＴＴＴに相補的な配列に隣接するＤＮＡ鎖で、ＤＮＡを切断できる。いくつかの態様では、ＤＮＡ鎖は細胞の核の内部にある。
【0074】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に相補的な配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する。
【0075】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸置換によって作成した不活性化ＮＨＮドメインを有するニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する。
【0076】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列７に示した位置のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの置換によって作成した不活性化ＲｕｖＣドメイン及び不活性化ＨＮＨドメインを有する触媒活性のないヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖を切断する。
【0077】
いくつかの態様では、細胞は真核細胞又は原核細胞である。
【0078】
いくつかの態様では、細胞は哺乳動物の細胞である。
【0079】
いくつかの態様では、細胞はヒトの細胞である。
【0080】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１～１７のいずれかに示す配列のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと、少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％又は８２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１８～５１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【0081】
本発明のいくつかの側面では、開示された組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ バリアントをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物又はベクター系を含む。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ バリアントをコードするヌクレオチド配列は、対象とする細胞内で作動可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの態様では、目的の細胞は真核細胞である。いくつかの態様では、目的の細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの態様では、改変されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸配列は、特定の生物の細胞で使用するためにコドン最適化されている。いくつかの態様では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は大腸菌にコドン最適化されている。いくつかの態様では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は真核細胞にコドン最適化されている。いくつかの態様では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は哺乳動物細胞にコドン最適化されている。
【0082】
いくつかの態様では、組成物は、配列番号１～１７のいずれかの配列との同一性が少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％であるＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターを含む組換え核酸を含む。それぞれの実現可能性は個別の態様である。
【0083】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１８及び３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0084】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１９及び３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0085】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２０及び３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0086】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２１及び３８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0087】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２２及び３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0088】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２３及び４０からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0089】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２４及び４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0090】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２５及び４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0091】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２６及び４３からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0092】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２７及び４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0093】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２８及び４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0094】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２９及び４６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0095】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３０及び４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0096】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３１及び４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0097】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３２及び４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0098】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３３及び５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0099】
組成物の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の同一性を有するか、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３４及び５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有する。
【0100】
いくつかの態様によれば、配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、改変された又は非天然の組成物を提供する。それぞれの実現可能性は個別の態様である。ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは改変されているか、天然に存在しない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは組換えられていてもよい。このようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、複数のソースから遺伝物質を集め、実験室の方法（分子クローニング）を使用して、他の方法では生物に見られない配列を作出される。
【0101】
ある態様では、この発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成した場合に、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、標的部位に対する特異性が増大する。
【0102】
ある態様では、この発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子の複合体は、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、標的部位のオンターゲット編集活性を少なくとも維持し、オフターゲット活性を低下させる。
【0103】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ分子）と相互作用できるＲＮＡ結合部位、及び部位特異的酵素活性を示す活性部位を更に含む。
【0104】
ある態様では、組成物は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子、又はＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、ガイド配列部分、すなわち、標的領域内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然では同時に見いだされない。
【0105】
ある態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるヌクレオチド配列を更に含む。
【0106】
この発明は、
a) 直接の反復配列と連結した、標的配列とハイブリダイズできる、ガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
b) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；
を含むＣＲＩＳＰＲ関連系を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’であり、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成する。
a) 直接の反復配列と連結した、標的配列とハイブリダイズできる、ガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
b) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；
を含むＣＲＩＳＰＲ関連系を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’であり、前記１つ以上のＲＮＡ分子は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成する。
【0107】
ある態様では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドを更に含む。
【0108】
ある態様では、組成物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートを更に含む。
【0109】
ある態様では、組成物は細胞のゲノムの標的領域を編集できる。
【0110】
いくつかの態様によれば、
(a) ＲＮＡ結合部位；及び
部位特異的酵素活性を示す活性部位
を含む、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１～１７のいずれかと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する；並びに、
(b) i) 標的ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列；及び
ii) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部位と相互作用できるタンパク質結合ＲＮＡ配列
を含む、１つ以上のＲＮＡ分子又は前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物が提供され、
ここで、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然では同時に見いだされない。それぞれの実現可能性は個別の態様である。
(a) ＲＮＡ結合部位；及び
部位特異的酵素活性を示す活性部位
を含む、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１～１７のいずれかと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する；並びに、
(b) i) 標的ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列；及び
ii) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部位と相互作用できるタンパク質結合ＲＮＡ配列
を含む、１つ以上のＲＮＡ分子又は前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物が提供され、
ここで、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然では同時に見いだされない。それぞれの実現可能性は個別の態様である。
【0111】
いくつかの態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列及びタンパク質結合ＲＮＡ配列を含むシングルＲＮＡ分子が提供され、前記ＲＮＡ分子はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成でき、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能できる。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子の長さは、最大で１０００塩基、９００塩基、８００塩基、７００塩基、６００塩基、５００塩基、４００塩基、３００塩基、２００塩基、１００塩基、５０塩基である。それぞれの実現可能性は個別の態様である。いくつかの態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ配列を含む第１のＲＮＡ分子及びタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子は、塩基対合によって相互作用するか、あるいは互いに融合してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能する１つ以上のＲＮＡ分子を形成する。
【0112】
この発明は、
a) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；並びに
b) i) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合できるヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列；及び
ii) 標的ＤＮＡ配列中の配列に相補的な配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列、
の少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成して、前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる複合体を形成できる。
a) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子；並びに
b) i) 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合できるヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列；及び
ii) 標的ＤＮＡ配列中の配列に相補的な配列を含むＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列、
の少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は、前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む非天然組成物も提供し、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成して、前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできる複合体を形成できる。
【0113】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び１つ以上のＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列を切断できるＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。
【0114】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子の少なくとも１つは、天然では同時に見いだされない。
【0115】
ある態様では:
a) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＲＮＡ結合部位及び部位特異的酵素活性を示す活性部位を含み；
b) ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；かつ
c) ヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部位と相互作用する配列を含む。
a) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＲＮＡ結合部位及び部位特異的酵素活性を示す活性部位を含み；
b) ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；かつ
c) ヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列は、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部位と相互作用する配列を含む。
【0116】
ある態様では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列及びＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列は、シングルガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）上にあり、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成して、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能できる。
【0117】
ある態様では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡのヌクレオチド配列は第１のＲＮＡ分子上に、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチド配列は第２のＲＮＡ分子上にあり、前記第１及び第２のＲＮＡ配列は、塩基対合によって相互作用するか、又は、互いに融合してＲＮＡ複合体を形成するか、若しくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してＤＮＡ標的化モジュールとして機能するｓｇＲＮＡを形成する。
【0118】
ある態様では、ｓｇＲＮＡの長さは、最大で１０００塩基、９００塩基、８００塩基、７００塩基、６００塩基、５００塩基、４００塩基、３００塩基、２００塩基、１００塩基、５０塩基である。
【0119】
ある態様では、組成物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートを更に含む。
【0120】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは天然に存在しない。
【0121】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは改変されており、非天然のアミノ酸又は合成アミノ酸を含む。
【0122】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは改変されており、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列及び／又は親和性タグの１種以上を含む。
【0123】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、真核細胞の核で検出可能な量のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。
【0124】
この発明は、本発明の組成物を細胞に導入することを含む、無細胞系で又は細胞のゲノム内で、標的部位のヌクレオチド配列を改変する方法も提供する。
【0125】
ある態様では、細胞は真核細胞である。
【0126】
別の態様では、細胞は原核細胞である。
【0127】
いくつかの態様では、１つ以上のＲＮＡ分子は、ＲＮＡヌクレアーゼと複合体を形成できるヌクレオチド分子を含むＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含む。
【0128】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、アミノ末端若しくはその近傍に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＬＳ、カルボキシル末端若しくはその近傍に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＬＳ、若しくは、アミノ末端若しくはその近傍の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＬＳ、及び、カルボキシル末端若しくはその近傍の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＬＳの組合せを含む。ある態様では、１～４のＮＬＳがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと融合している。ある態様では、ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の内部にある。
【0129】
発現タンパク質のアミノ末端若しくはその近傍、カルボキシル末端若しくはその近傍、又はＯＲＦ内においてＮＬＳを融合する方法は、当技術分野において広く知られている。一例として、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端に融合させるために、ＮＬＳの核酸配列を、ＮＬＳ融合ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの開始コドンの直後に配置する。また、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシル末端に融合させるために、ＮＬＳの核酸配列を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの最後のアミノ酸をコードするコドンの後、かつ、停止コドンの前に配置する。
【0130】
この発明では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＯＲＦに沿った位置での、ＮＬＳ、細胞透過性ペプチド配列及び／又は親和性タグの組合せが予定されている。
【0131】
本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸配列及び核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの連続するアミノ酸又は核酸配列を中断するように挿入されたＮＬＳ及び／又はＴＡＧを含んでいてもよい。
【0132】
ある態様では、１つ以上のＮＬＳがタンデムリピートになっている。
【0133】
ある態様では、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸内にある場合、１つ以上のＮＬＳは、Ｎ末端又はＣ末端に近接していると見なされる。
【0134】
検討したように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列及び／又は親和性タグの１種以上を含むように改変されてもよい。
【0135】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成した場合、その野生型と比較して、標的部位に対する特異性が増加する。
【0136】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子の複合体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、標的部位のオンターゲット編集活性を少なくとも維持し、オフターゲット活性を低下させる。
【0137】
ある態様では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含むヌクレオチド分子に作動可能に連結した異種プロモーターを含む組換え核酸分子を更に含む。
【0138】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子は天然には存在しないか、改変されている。
【0139】
この発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含むベクター系を含む、非天然又は改変された組成物も提供する。
【0140】
この発明は、対象のゲノムの標的部位においてヌクレオチド配列を改変することを含む、ゲノムの変異に関連する疾患に罹患している対象の治療のための、本発明の組成物の使用も提供する。
【0141】
この発明は、(i) 配列番号１～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物、又は、配列番号１８～５１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子、及び、(ii) ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子、又は、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、細胞に導入することを含む、哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位でヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
【0142】
いくつかの態様では、この方法はex vivoで行われる。いくつかの態様では、この方法はin vivoで行われる。いくつかの態様では、この方法のいくつかの工程はex vivoで行われ、いくつかの工程はin vivoで行われる。いくつかの態様では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【0143】
ある態様では、この方法は、(iii) ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子、又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、細胞に導入することを更に含む。
【0144】
ある態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子はｃｒＲＮＡ反復配列を含む。
【0145】
ある態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子に結合できる。
【0146】
ある態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は相互作用してＲＮＡ複合体を形成し、ＲＮＡ複合体はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性な複合体を形成できる。
【0147】
ある態様では、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子とヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに適したシングルガイドＲＮＡ分子の形で融合している。
【0148】
ある態様では、ガイド配列部分は、プロトスペーサー配列に相補的な配列を含む。
【0149】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’又は５’を二本鎖切断する。
【0150】
本願の方法のいずれかの態様では、この方法は、対象のゲノムの標的部位においてヌクレオチド配列を改変することを含む、ゲノムの変異に関連する疾患に罹患している対象を治療するためのものである。
【0151】
ある態様では、この方法は、最初に、ゲノムの変異に関連する疾患に罹患している対象を選択し、対象から細胞を得ることを含む。
【0152】
この発明は、本願の方法で得た改変細胞も提供する。ある態様では、これらの改変細胞は、子孫細胞を生み出すことができる。ある態様では、これらの改変細胞は、移植後に子孫細胞を生み出すことができる。
【0153】
この発明は、これらの改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。また、細胞を薬学的に許容される担体と混合することを含む、これを調製するin vitro又はex vivoの方法も提供する。
【0154】
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子
ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、その長さに沿って標的とされるＤＮＡ配列に部分的又は完全に相補的である。いくつかの態様では、ガイド配列部分の長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０ヌクレオチド、又は、約１７～５０、１７～４９、１７～４８、１７～４７、１７～４６、１７～４５、１７～４４、１７～４３、１７～４２、１７～４１、１７～４０、１７～３９、１７～３８、１７～３７、１７～３６、１７～３５、１７～３４、１７～３３、１７～３１、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２２、１７～２１、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２２、１８～２０、２０～２１、２１～２２若しくは１７～２０ヌクレオチドである。ガイド配列部分の全長は、その長さに沿って標的とされるＤＮＡ配列に完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡターゲティング部分として機能するガイド配列部分を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部分であってもよい。ガイド配列部分を有するＤＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列にターゲティングできる。それぞれの実現可能性は個別の態様である。ＲＮＡ分子は、所望の配列を標的とするように特別に設計できる。したがって、「ガイド配列部分」を含む分子は、ターゲティング分子の一種である。この出願全体で、用語「ガイド分子」、「ＲＮＡガイド分子」、「ガイドＲＮＡ分子」及び「ｇＲＮＡ分子」は、ガイド配列部分を含む分子と同義であり、用語「スペーサー」は「ガイド配列部分」と同義である。
ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、その長さに沿って標的とされるＤＮＡ配列に部分的又は完全に相補的である。いくつかの態様では、ガイド配列部分の長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０ヌクレオチド、又は、約１７～５０、１７～４９、１７～４８、１７～４７、１７～４６、１７～４５、１７～４４、１７～４３、１７～４２、１７～４１、１７～４０、１７～３９、１７～３８、１７～３７、１７～３６、１７～３５、１７～３４、１７～３３、１７～３１、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２２、１７～２１、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２２、１８～２０、２０～２１、２１～２２若しくは１７～２０ヌクレオチドである。ガイド配列部分の全長は、その長さに沿って標的とされるＤＮＡ配列に完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡターゲティング部分として機能するガイド配列部分を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部分であってもよい。ガイド配列部分を有するＤＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列にターゲティングできる。それぞれの実現可能性は個別の態様である。ＲＮＡ分子は、所望の配列を標的とするように特別に設計できる。したがって、「ガイド配列部分」を含む分子は、ターゲティング分子の一種である。この出願全体で、用語「ガイド分子」、「ＲＮＡガイド分子」、「ガイドＲＮＡ分子」及び「ｇＲＮＡ分子」は、ガイド配列部分を含む分子と同義であり、用語「スペーサー」は「ガイド配列部分」と同義である。
【0155】
この発明の複数の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレオチド数が１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用する場合、切断活性が最大である。
【0156】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子を使用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを所望の標的部位に向けることができる。シングルガイドＲＮＡは、ガイド配列部分と足場部分を含む。足場部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用し、ガイド配列部分と共に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを活性化して所望の標的部位に向ける。足場部分は、例えば、サイズが小さくなるように更に設計されてもよい。
【0157】
本発明のいくつかの側面では、開示した方法は、明細書に記載した組成物を、細胞に導入することを含む、無細胞系で又は細胞のゲノム中の標的部位で、ヌクレオチド配列を改変する方法を含む。
【0158】
いくつかの態様では、細胞は真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又は植物細胞である。
【0159】
本発明のいくつかの側面では、開示された方法は、対象のゲノムの標的部位においてヌクレオチド配列を改変することを含む、ゲノムの変異に関連する疾患に罹患している対象の治療のための本願の組成物の使用を含む。
【0160】
本発明のいくつかの側面では、開示された方法は、変異障害に関連するアレルを本願の組成物の標的とすることを含む、変異障害を有する対象を治療する方法を含む。
【0161】
いくつかの態様では、変異障害は、腫瘍形成、加齢黄斑変性、統合失調症、神経障害、神経変性疾患、運動障害、脆弱Ｘ症候群、セクレターゼ関連障害、プリオン関連障害、ＡＬＳ、依存症、自閉症、アルツハイマー病、好中球減少症、炎症関連障害、パーキンソン病、血液及び凝固の疾患及び障害、βサラセミア、鎌状赤血球貧血、細胞調節不全、腫瘍に関連する疾患及び障害、炎症及び免疫に関連する疾患及び障害、代謝、肝臓、高コレステロール血症、腎臓及びタンパク質の疾患及び障害、筋肉及び骨格の疾患及び障害、皮膚の疾患及び障害、神経の疾患及び障害、肺の疾患及び障害、角膜の疾患及び障害、網膜の疾患及び障害、並びに、眼の疾患及び障害のいずれかから選択される疾患又は障害に関連する。
【0162】
疾患及び治療
本発明のある態様は、遺伝子編集、処置又は治療方法の一形態として、ヌクレアーゼを、疾患又は障害に関連する特定の遺伝子座にターゲティングする。例えば、遺伝子の編集又はノックアウトを誘導するために、特別に設計したガイドＲＮＡ分子を使用して、明細書に開示した新規なヌクレアーゼを、遺伝子の病原性変異アレルに特異的にターゲティングしてもよい。ヌクレアーゼのＰＡＭ要件を最初に考慮してガイドＲＮＡ分子を設計することが好ましく、このことは、明細書で示すように、遺伝子編集が行われる系にも依存する。例えば、ＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼを標的部位に向けるように設計されたガイドＲＮＡ分子は、ＯＭＮＩ-１１５ ＰＡＭ配列（例．「ＮＮＲＹＴＴ」又ハ「ＮＮＲＴＴＴ」）ニ隣接するＤＮＡ二本鎖領域のＤＮＡ鎖に相補的なスペーサー領域を含むように設計される。ガイドＲＮＡ分子は、好ましくは、ヌクレアーゼの特異的活性を増大させ、オフターゲット効果を減少させるために、十分かつ好ましくは最適な長さのスペーサー領域（すなわち、標的アレルと相補的なガイドＲＮＡ分子の領域）を含むように更に設計される。
本発明のある態様は、遺伝子編集、処置又は治療方法の一形態として、ヌクレアーゼを、疾患又は障害に関連する特定の遺伝子座にターゲティングする。例えば、遺伝子の編集又はノックアウトを誘導するために、特別に設計したガイドＲＮＡ分子を使用して、明細書に開示した新規なヌクレアーゼを、遺伝子の病原性変異アレルに特異的にターゲティングしてもよい。ヌクレアーゼのＰＡＭ要件を最初に考慮してガイドＲＮＡ分子を設計することが好ましく、このことは、明細書で示すように、遺伝子編集が行われる系にも依存する。例えば、ＯＭＮＩ-１１５ヌクレアーゼを標的部位に向けるように設計されたガイドＲＮＡ分子は、ＯＭＮＩ-１１５ ＰＡＭ配列（例．「ＮＮＲＹＴＴ」又ハ「ＮＮＲＴＴＴ」）ニ隣接するＤＮＡ二本鎖領域のＤＮＡ鎖に相補的なスペーサー領域を含むように設計される。ガイドＲＮＡ分子は、好ましくは、ヌクレアーゼの特異的活性を増大させ、オフターゲット効果を減少させるために、十分かつ好ましくは最適な長さのスペーサー領域（すなわち、標的アレルと相補的なガイドＲＮＡ分子の領域）を含むように更に設計される。
【0163】
限定するものではない例として、ガイドＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷時に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が誘導されて、フレームシフト変異の導入による変異アレルのサイレンシングがもたらされるように、ヌクレアーゼを変異アレルの特定の領域、例えば、開始コドンの近傍、を標的とするように設計してもよい。ガイドＲＮＡ分子を設計するこのアプローチは、ドミナントネガティブ変異の作用を変化させ、それによって対象を治療するのに特に有用である。別の非限定的な例として、ガイドＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷時に相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が誘導されて、変異アレルのテンプレートを介した修正がもたらされるように、変異したアレルの特定の病原性変異を標的とするように設計してもよい。ガイドＲＮＡ分子を設計するこのアプローチは、変異アレルのハプロ不全作用を変化させ、それによって対象を治療するのに特に有用である。
【0164】
疾患又は障害を治療するために改変の標的としてもよい遺伝子の限定するものではない例を以下に示す。変異障害を誘発する疾患関連遺伝子と変異が文献に記載されている。そのような変異は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことによってＤＮＡ修復経路を誘導してアレルを改変し、それによって変異障害を治療するＣＲＩＳＰＲ組成物を、疾患関連遺伝子のアレルを標的とするＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子を設計するために使用できる。
【0165】
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、好中球減少症に関連している。したがって、ＥＬＡＮＥを標的とする本発明の態様は、好中球減少症に罹患した対象の治療方法で、無制限に使用してもよい。
【0166】
ＣＸＣＲ４は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）感染における共受容体である。したがって、ＣＸＣＲ４を標的とする本発明の態様は、ＨＩＶ－１に罹患した対象を治療する方法、又はＨＩＶ－１感染に対する耐性を対象に付与する方法において、無制限に使用してもよい。
【0167】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の破壊は、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞による死滅を促進し、ＰＤ－１ががん治療の標的となる可能性がある。したがって、ＰＤ－１を標的とする本発明の態様は、がんに罹患した対象の治療方法で、無制限に使用してもよい。ある態様では、治療は、ＰＤ－１欠損となるように本発明に従って改変されたＴ細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。
【0168】
また、ＢＣＬ１１Ａはヘモグロビン産生抑制に関与する遺伝子である。ＢＣＬ１１Ａを阻害することによって、グロビン産生を増加させ、サラセミアや鎌状赤血球貧血などの疾患を治療してもよい。例えば、国際公開第2017/077394号、米国特許出願公開第2011/0182867号；Humbert et al. Sci. Transl. Med. (2019)及びCanver et al. Nature (2015)を参照。したがって、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサーを標的とする本発明の態様は、βサラセミア又は鎌状赤血球貧血に罹患した対象の治療方法で、無制限に使用してもよい。
【0169】
本発明は、以下の表Ａ又は表Ｂに列挙した疾患又は障害の研究、改変又は治療において、疾患関連遺伝子を標的とするために使用してもよい。実際、遺伝子座を有する疾患関連遺伝子は、本明細書に開示のヌクレアーゼを使用して、適切な疾患関連遺伝子、例えば米国特許出願公開第2018/0282762号及び欧州特許第3079726号（Ｂ１）に列挙されているものを標的とすることによって、研究、改変又は治療してもよい。
【0170】
【表A】
【0171】
【表B-1】
【0172】
【表B-2】
【0173】
【表B-3】
【0174】
別段の定義がある場合を除き、この明細書で使用する全ての技術用語及び／又は学術用語は、本発明に関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料が本発明の態様の実施又は試験に使用できるが、代表的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む明細書が優先される。また、材料、方法及び実施例は単に説明のためのもので、必ずしも限定することを意図したものではない。
【0175】
考察において特に言及しない限り、本発明の態様の特徴の状態又は関連性を変更する「実質的に」及び「約」などの形容詞は、状態又は関連性が、意図された用途の態様の動作に許容可能な範囲内に定義されることを意味すると理解される。特に示さない限り、明細書及び特許請求の範囲における「又は」という用語は、排他的な「又は」ではなく包括的な「又は」と見なされ、結合する項目の少なくとも１つ及び任意の組合せを示す。
【0176】
本明細書における用語「１つ（a、an）」は、列挙された構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。特に断りのない限り、単数形の使用が複数形を含むことは、当業者には明らかである。したがって、用語「１つ（a、an）」及び「少なくとも１つ」は、この出願では同じ意味である。
【0177】
この教示をより理解し、かつ、決して教示の範囲を限定しないために、特に断りのない限り、量、割合又は比率を示す全ての数字、及び明細書や特許請求の範囲で使用する他の数値は、全ての場合において、用語「約」で修飾されると理解すべきである。したがって、反する指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載の数値は、得ようとする所望の特性に応じて変化する可能性がある近似値である。少なくとも、各数値は、報告された有効桁数を考慮し、通常の丸め手法を適用して解釈する必要がある。
【0178】
この明細書で数値範囲を記載する場合、本発明は、別段の説明をする場合を除き、上限と下限との間の各整数（上限及び下限を含む）を意図するものと理解される。
【0179】
この明細書及び特許請求の範囲において、動詞「含有する」、「含む」及び「有する」並びにそれらの活用形のそれぞれは、動詞の目的語が必ずしも動詞の主語の成分、要素又は部分の完全なリストではないことを示すために使用される。本明細書の他の用語は、当該技術分野において周知の意味であることを意味する。
【0180】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、同じ意味である。それらは、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかであるヌクレオチドのポリマーの形態を指す。ポリヌクレオチドの三次元構造はいずれであってもよく、既知又は未知の機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析で確定した遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離したＤＮＡの配列、単離したＲＮＡの配列、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化したヌクレオチドやその類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後で行われてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド要素で中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に標識成分との結合などで更に修飾してもよい。
【0181】
用語「ヌクレオチド類似体」又は「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素含有塩基（例．シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）若しくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））の中若しくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例．リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖類縁体又は開環糖類縁体）の中若しくは上に、又はリン酸部分に、１つ以上のさまざまな化学修飾（例．置換）を含むヌクレオチドを指す。本明細書に記載のＲＮＡ配列のそれぞれは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。
【0182】
この明細書では、以下のヌクレオチド識別子が、ヌクレオチド塩基を表すために使用される：
【0183】
【表C】
【0184】
この明細書では、用語「ターゲティング配列」又は「ターゲティング分子」は、特定の標的配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列を含む分子を指し、例えば、ターゲティング配列は、その長さに沿って、ターゲティングされる配列に少なくとも部分的に相補的である。ターゲティング配列又はターゲティング分子は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のターゲティング部分として機能するターゲティング配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが複合体を形成できるターゲティングＲＮＡ分子の一部であってもよい。ターゲティング配列を有する分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的配列にターゲティングできる。それぞれの実現可能性は個別の態様である。ターゲティングＲＮＡ分子は、所望の配列を標的とするように特別に設計できる。
【0185】
この明細書では、用語「標的」は、ターゲティング配列又はターゲティング分子の、標的ヌクレオチド配列を有する核酸との優先的なハイブリダイゼーションを指す。用語「標的」は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の優先的なターゲティングが存在するが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加えて意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じ得るような、可変のハイブリダイゼーションを包含することが理解される。ＲＮＡ分子が配列を標的とする場合、ヌクレアーゼ活性により、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子の複合体が配列を標的にすることが理解される。
【0186】
複数の細胞に存在するＤＮＡ配列を標的とする場合、ターゲティングは、ＲＮＡ分子のガイド配列部分と１つ以上の細胞における配列のハイブリダイゼーションを包含し、ＲＮＡ分子と複数の細胞中の全てではない細胞における標的配列のハイブリダイゼーションも包含することが理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞内の配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞内で標的配列とハイブリダイズすると理解され、全てではない細胞で標的配列とハイブリダイズしてもよいことも理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞の標的配列とハイブリダイゼーションして、二本鎖切断を導入し、かつ、全てではない細胞の標的配列とハイブリダイゼーションして、二本鎖切断を導入してもよいことが理解される。この明細書では、用語「改変細胞」は、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわちオンターゲットハイブリダイゼーションの結果として、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体によって二本鎖切断された細胞を指す。
【0187】
この明細書では、用語「野生型」は、当業者が理解する技術用語で、バリアント又は変種とは区別される、自然界に存在する生物、株、遺伝子又は特性の代表的な形態を意味する。したがって、この明細書では、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列が野生型の配列を指す場合、バリアントは、例えば置換、欠失、挿入を含む、その配列のバリアントを指す。この発明の複数の態様では、改変されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１に示すいずれかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例．置換、削除及び／又は挿入）を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのバリアントである。
【0188】
用語「非天然」、「天然に存在しない」又は「人工」は、同じ意味で使用され、人間による改変を示す。核酸分子又はポリペプチドで使用する場合、この用語は、核酸分子又はポリペプチドが、自然界で自然に関連付けられており、かつ、自然界で見いだされる少なくとも１つの成分を少なくとも実質的に含まないことを意味してもよい。
【0189】
この明細書では、用語「アミノ酸」は、天然及び／又は非天然若しくは合成アミノ酸を含み、グリシン及びＤ又はＩの光学異性体、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣物が含まれる。
【0190】
この明細書では、「ゲノムＤＮＡ」は、対象とする細胞又は細胞群に存在する、直鎖状及び／若しくは染色体ＤＮＡ並びに／又はプラスミド若しくは他の染色体外ＤＮＡの配列を指す。いくつかの態様では、対象とする細胞は真核細胞である。いくつかの態様では、対象とする細胞は原核細胞である。いくつかの態様では、この方法は、ゲノムＤＮＡ配列の所定の標的部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、ゲノムの標的部位においてＤＮＡ配列の変異、挿入及び／又は欠失をもたらす。
【0191】
「真核」細胞は、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【0192】
この明細書では、用語「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断できる酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然の供給源から単離又は誘導されてもよい。天然の供給源は、任意の生物であってもよい。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を有する修飾タンパク質又は合成タンパク質であってもよい。
【0193】
この明細書では、用語「ＰＡＭ」は、標的ＤＮＡ配列の近傍に位置し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが認識する標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を指す。ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼによって異なっていてもよい。
【0194】
この明細書では、用語「変異障害」又は「変異疾患」は、変異によって生じる遺伝子の機能障害に関連する障害又は疾患を指す。変異障害として現れる機能不全遺伝子は、そのアレルの少なくとも１つに変異を含み、「疾患関連遺伝子」と呼ばれる。変異は、疾患関連遺伝子の任意の部分、例えば、調節部分、コード部分又は非コード部分に存在してもよい。変異は、置換、挿入又は欠失といった変異であってもよい。疾患関連遺伝子の変異は、劣性、ドミナントネガティブ、機能獲得、機能喪失又は遺伝子産物のハプロ不全につながる変異など、任意の変異メカニズムに従って、障害又は疾患として現れてもよい。
【0195】
当業者は、この発明の態様が、例えばプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する対象とする標的ゲノムＤＮＡ配列と結合するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子を開示することを理解する。ヌクレアーゼは、その後、標的ＤＮＡの切断を介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生成する。
【0196】
この発明の複数の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びターゲティング分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列を切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、更なる別のｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。
【0197】
用語「タンパク質結合配列」又は「ヌクレアーゼ結合配列」は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成できる配列を指す。当業者は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成できるｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質又はヌクレアーゼ結合配列を含むことを理解する。
【0198】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「ＲＮＡ結合部分」は、ＲＮＡ分子に結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよいＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレアーゼ結合配列を指す。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「活性部分」は、例えばＤＮＡターゲッテングＲＮＡ分子と複合体を形成する場合に、ＤＮＡ分子を二本鎖切断するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分を指す。
【0199】
ＲＮＡ分子は、塩基対形成によってｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子と十分に相補的な配列を含んでいてもよい（例えば、米国特許第8,906,616号）。この発明の複数の態様では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を更に含んでいてもよい。
【0200】
この発明の複数の態様では、ターゲティング分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を更に含んでいてもよい。そのような態様は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する、ＲＮＡ分子のガイド部分（ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成融合体として設計されてもよい（Jinek et al., Science (2012)参照）。この発明の複数の態様は、別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む別個のＲＮＡ分子を利用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。そのような態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、塩基対形成によりＲＮＡ分子とハイブリダイズしてもよく、明細書に記載した本発明の特定の応用において有利であってもよい。
【0201】
この発明の複数の態様において、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の構造を更に特定する可能性がある「ネクサス」領域及び／又は「ヘアピン」領域を含んでいてもよい（Briner et al., Molecular Cell (2014)参照）。
【0202】
この明細書では、用語「直接反復配列」は、ヌクレオチド配列の特定のアミノ酸配列の２つ以上の反復を指す。
【0203】
この明細書では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと「相互作用する」又は「結合する」ことができるＲＮＡ配列又は分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するＲＮＡ配列又は分子の能力を指す。
【0204】
この明細書では、用語「作動可能に連結された」は、意図した方法で機能することを可能にする２つの配列又は分子の関係（すなわち、融合、ハイブリダイゼーション）を指す。この発明の複数の態様では、ＲＮＡ分子がプロモーターに作動可能に連結している場合、ＲＮＡ分子及びプロモーターが意図した方法で機能できる。
【0205】
この明細書では、用語「異種プロモーター」は、天然では、発現される分子と、又は、促進される経路において、同時に見いだされないプロモーターを指す。
【0206】
この明細書では、分子の配列間のＸ％の塩基又はアミノ酸が同じで、同じ相対位置にある場合、配列又は分子は、それぞれの配列又は分子に対してＸ％の「配列同一性」を有する。例えば、第２のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも９５％の第１のヌクレオチド配列は、他の配列と同一の相対位置で少なくとも９５％の塩基を有する。
【0207】
核局在化配列
用語「核局在化配列」及び「ＮＬＳ」は、関連付けられたタンパク質の、細胞質から核膜バリアを通過する輸送を指示するアミノ酸配列／ペプチドを示し、同じ意味で使用される。用語「ＮＬＳ」は、特定のペプチドの核局在化配列だけではなく、細胞質ポリペプチドの核膜バリアを通過する移行を指示できるその誘導体も包含することを意図している。ＮＬＳは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の両者に付着した場合、ポリペプチドの核移行を指示できる。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列中にランダムに位置するアミノ酸の側鎖にＮ末端又はＣ末端で連結したＮＬＳを有するポリペプチドが移行する。通常、ＮＬＳはタンパク質表面に露出した正に帯電したリジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列で構成されるが、他のタイプのＮＬＳも知られている。ＮＬＳの非限定的な例には、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ｃ-ｍｙｃ、ｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来のＩＢＢドメイン、筋腫Ｔタンパク質、ヒトｐ５３、マウスｃ-ａｂｌ ＩＶ、インフルエンザウイルスＮＳ１、肝炎ウイルスδ抗原、マウスＭｘ１タンパク質、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド由来のＮＬＳ配列が含まれる。
用語「核局在化配列」及び「ＮＬＳ」は、関連付けられたタンパク質の、細胞質から核膜バリアを通過する輸送を指示するアミノ酸配列／ペプチドを示し、同じ意味で使用される。用語「ＮＬＳ」は、特定のペプチドの核局在化配列だけではなく、細胞質ポリペプチドの核膜バリアを通過する移行を指示できるその誘導体も包含することを意図している。ＮＬＳは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の両者に付着した場合、ポリペプチドの核移行を指示できる。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列中にランダムに位置するアミノ酸の側鎖にＮ末端又はＣ末端で連結したＮＬＳを有するポリペプチドが移行する。通常、ＮＬＳはタンパク質表面に露出した正に帯電したリジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列で構成されるが、他のタイプのＮＬＳも知られている。ＮＬＳの非限定的な例には、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ｃ-ｍｙｃ、ｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来のＩＢＢドメイン、筋腫Ｔタンパク質、ヒトｐ５３、マウスｃ-ａｂｌ ＩＶ、インフルエンザウイルスＮＳ１、肝炎ウイルスδ抗原、マウスＭｘ１タンパク質、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド由来のＮＬＳ配列が含まれる。
【0208】
送達
本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ組成物は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター又はそれらの組合せとして送達されてもよい。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は化学修飾を含む。適切な化学修飾の限定的するものではない例には、2'-O-メチル（Ｍ）、2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（ＭＳ）又は2'-O-メチル-3'-チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、シュードウリジン及び1-メチルシュードウリジンがある。それぞれの実現可能性はこの発明の個別の態様である。
本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ組成物は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター又はそれらの組合せとして送達されてもよい。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は化学修飾を含む。適切な化学修飾の限定的するものではない例には、2'-O-メチル（Ｍ）、2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（ＭＳ）又は2'-O-メチル-3'-チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、シュードウリジン及び1-メチルシュードウリジンがある。それぞれの実現可能性はこの発明の個別の態様である。
【0209】
本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又はそれをコードするポリヌクレオチド、並びに、場合によっては、追加のタンパク質（例．ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、転写因子、制限酵素）及び／又はガイドＲＮＡなどのヌクレオチド分子は、適切な手段で標的細胞に送達されてもよい。標的細胞は、単離されているか否か、培養中であるか、in vitro、ex vivo、in vivo又はin plantaであるかといった任意の環境における、真核細胞又は原核細胞などの任意の細胞であってもよい。
【0210】
いくつかの態様では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びドナーテンプレートを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、及び例えば相同性修復による遺伝子編集用のドナーテンプレートを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びドナーテンプレートを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び、例えば相同性修復による遺伝子編集用のドナーテンプレートを含む。
【0211】
ＲＮＡ組成物は、適切なウイルスベクター系を使用して送達できる。従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、細胞（例．哺乳動物細胞、植物細胞など）及び標的組織に導入できる。そのような方法はまた、in vitroでコードされた核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質を細胞に投与するために使用できる。ある態様では、核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、in vivo又はex vivoでの遺伝子治療のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、裸の核酸、及びリポソーム又はポロキサマーといった送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。遺伝子治療の手順の総説については、Anderson, Science (1992); Nabel and Felgner, TIBTECH (1993)；Mitani and Caskey, TIBTECH (1993)；Dillon, TIBTECH (1993)；Miller, Nature (1992)；Van Brunt, Biotechnology (1988)；Vigne et al., Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer and Perricaudet, British Medical Bulletin (1995)；Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1995)及びYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照。
【0212】
核酸及び／又はタンパク質の非ウイルス送達法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、パーティクルガン加速、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン若しくは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン、及び薬剤による核酸の取込み促進が含まれ、又は、バクテリア若しくはウイルス（例．アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）sp. NGR234、シノリゾボイウム メリロティ（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、キャッサバベインモザイクウイルス）によって植物細胞に送達できる。例えばChung et al. Trends Plant Sci. (2006)を参照。例えば、Sonitron 2000システム（Rich-Mar）を使用したソノポレーションも、核酸の送達に使用できる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性脂質媒介送達も、in vivo又はin vitro送達方法として予定されている。Zuris et al., Nat. Biotechnol. (2015)、Coelho et al., N. Engl. J. Med. (2013)；Judge et al., Mol. Ther. (2006)及びBasha et al., Mol. Ther. (2011)を参照。
【0213】
トランスポゾンベースの系（例．組換えSleeping Beautyトランスポゾン系又は組換えPiggyBacトランスポゾン系）といった非ウイルスベクターも、標的細胞に送達して、標的細胞で組成物の分子のポリヌクレオチド配列又は組成物の分子をコードするポリヌクレオチド配列の転移に利用してもよい。
【0214】
別の代表的な核酸送達系には、Amaxa（登録商標）Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）及びCopernicus Therapeutics Inc.（例えば、米国特許第6,008,336号を参照）が提供するものが含まれる。リポフェクチンは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号及び米国特許第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例．Transfectam（登録商標）、Lipofectin（登録商標）及びLipofectamine（登録商標）RNAiMAX）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性及び中性脂質は、国際公開第91/17424号及び同第91/16024号に開示のものが含まれる。細胞（ex vivo投与）又は標的組織（in vivo投与）への送達が可能である。
【0215】
免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に広く知られている（例えば、Crystal, Science (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Gao and Huang, Gene Therapy (1995)；Ahmad and Allen, Cancer Res., (1992)；米国特許第4,186,183号；同第4,217,344号；同第4,235,871号；同第4,261,975号；同第4,485,054号；同第4,501,728号；同第4,774,085号；同第4,837,028号及び同第4,946,787号を参照）。
【0216】
別の送達方法には、EnGeneIC送達ビヒクル（ＥＤＶ）中に送達される核酸のパッケージングを使用することが含まれる。ＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対して特異性を有し、もう一方のアームがＥＤＶに対して特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達する。抗体はＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いで、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞に入ると、内容物が放出される（MacDiamid et al., Nature Biotechnology (2009)参照）。
【0217】
核酸を送達するためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、高度に進化した方法を利用して、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスのペイロードを核に輸送する。ウイルスベクターは、患者に直接投与でき（in vivo）、又は、in vitroで細胞を処理するために使用することもでき、改変細胞を患者に投与する（ex vivo）。核酸を送達するためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づく系には、遺伝子導入のための組換えレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス及び単純ヘルペスウイルスのベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。しかし、本願のＲＮＡ組成物の送達にはＲＮＡウイルスが好ましい。また、さまざまな細胞及び標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。本発明の核酸は、非組込みレンチウイルスによって送達してもよい。必要に応じて、レンチウイルスによるＲＮＡ送達が利用される。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びドナーテンプレートを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡ、及び／又は、例えば相同性修復による遺伝子編集用のドナーテンプレートを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びドナーテンプレートを含む。場合によっては、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。場合によっては、レンチウイルスはヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び例えば相同性修復による遺伝子編集用のドナーテンプレートを含む。
【0218】
これまでに説明したように、本願の組成物は、非組込みレンチウイルス粒子法（例．LentiFlash（登録商標）系）を使用して標的細胞に送達できる。そのような方法は、標的細胞へのＲＮＡの送達が標的細胞の内部で本願組成物のアセンブリをもたらすように、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡを標的細胞に送達するために使用してもよい。国際公開第2013/014537号、同第2014/016690号、同第2016/185125号、同第2017/194902号、同第2017/194903号も参照。
【0219】
レトロウイルスのトロピズム（tropism）は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更でき、標的細胞の潜在的な標的を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染できるレトロウイルスベクターであり、通常、高いウイルス力価を生み出す。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングできるシス作用性の長い末端反復配列で構成されている。最小限のシス作用ＬＴＲが、ベクターの複製とパッケージングに十分で、その後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで、恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、Buchscher Panganiban, J. Virol. (1992)；Johann et al., J. Virol. (1992)；Sommerfelt et al., Virol. (1990)；Wilson et al., J. Virol. (1989)；Miller et al., J. Virol. (1991)；国際公開第94/26877号を参照）。
【0220】
臨床試験において、現在、少なくとも６種のウイルスベクター法が遺伝子導入に利用でき、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を含む方法を利用して、形質導入剤を生成する。
【0221】
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood (1995)；Kohn et al., Nat. Med. (1995)；Malech et al., PNAS (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療で使用された最初の治療用ベクターである（Blaese et al., Science (1995)）。ＭＦＧ－Ｓパッケージ化ベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ellem et al., Immunol Immunother. (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. (1997)）。
【0222】
パッケージングされる細胞は、宿主細胞に感染できるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスＡＡＶをパッケージする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージするｐｓｉ．２細胞又はＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用するウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって得られる。ベクターは、通常、パッケージングとその後の宿主への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列、発現されるタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられる他のウイルス配列を含む。不足しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用するＡＡＶベクターは、通常、パッケージングと宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノムの末端逆方向反復（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐとｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージ化されているが、ＩＴＲ配列は欠いている。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染している。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠如しているので大量にパッケージ化されていない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性である熱処理によって低減できる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して臨床で使用する規模で生成できる（米国特許第7,479,554号参照）。
【0223】
多くの遺伝子治療において、遺伝子治療ベクターが特定の組織に高い特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上にウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、目的の細胞に対して特異性を有するように改変できる。リガンドは、対象とする細胞に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変でき、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞のペアに拡張できる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例．ＦＡＢ又はＦｖ）を提示するように改変できる。この説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原則が非ウイルスベクターにも適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みを促進する取込み配列を含むように改変できる。
【0224】
遺伝子治療ベクターは、通常、以下に説明する全身投与（例．静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用により、個々の患者に投与することでin vivo送達できる。あるいは、ベクターは、個々の患者から移植した細胞（例．リンパ球、骨髄吸引液、生検組織）やユニバーサルドナーの造血幹細胞といった細胞にex vivo送達でき、次いで、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に患者に再移植される。いくつかの態様では、ｍＲＮＡのin vivo及びex vivo送達、並びにＲＮＰの送達を利用してもよい。
【0225】
診断、研究又は遺伝子治療（例．宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入による）のためのex vivo細胞トランスフェクションは、当業者に広く知られている。好ましい態様では、細胞は、対象生物から単離され、ＲＮＡ組成物がトランスフェクトされ、対象生物（例．患者）に再注入される。ex vivoトランスフェクションに適したさまざまな細胞は、当業者に周知である（例えば、Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" (6th edition, 2010)と、その患者から細胞を単離し培養する方法についての考察で引用されている参考文献を参照）。
【0226】
適切な細胞には、真核及び原核細胞及び／又は細胞株が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような細胞又はそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例．ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例．ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）及びｐｅｒＣ６細胞、任意の植物細胞（分化又は未分化）、並びにツマジロクサヨトウ（Spodopterafugiperda）（Ｓｆ）といった昆虫細胞、又は、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）及びシゾサッカロミセス（chizosaccharomyces）といった真菌細胞が含まれる。ある態様では、細胞株はＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、初代細胞を単離し、ヌクレアーゼ（例．ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）又はヌクレアーゼ系（例．ＣＲＩＳＰＲ）で処理した後に、治療対象に再導入するために、ex vivoで使用してもよい。適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及びＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞などであるがこれらには限定されない血球のサブセットが含まれる。適切な細胞には、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞及び間葉系幹細胞などの幹細胞も含まれる。
【0227】
ある態様では、幹細胞を、細胞のトランスフェクション及び遺伝子治療のex vivo手順で使用する。幹細胞を使用する利点は、in vitroで他の細胞型に分化できること、又は骨髄に生着する哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入できることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαなどのサイトカインを使用して、in vitroでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法が知られている（限定するものではない例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照）。
【0228】
幹細胞は、公知の方法で形質導入及び分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）並びにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの不要な細胞に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることで、骨髄細胞から単離される（限定するものではない例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照）。いくつかの態様では、改変した幹細胞も使用できる。
【0229】
特に、本願のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、有糸分裂後の細胞又は活発に分裂していない細胞（例．停止細胞）のゲノム編集に適している可能性がある。本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して編集してもよい有糸分裂後の細胞の例には、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及びニューロンが含まれるが、これらには限定されない。
【0230】
治療用ＲＮＡ組成物を含有するベクター（例．レトロウイルス、リポソーム等）は、in vivoでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＲＮＡ又はｍＲＮＡを投与できる。投与は、血液又は組織細胞との最終的な接触で分子を導入するために通常使用される、注射、注入、局所適用及びエレクトロポレーションが含まれるが、これらには限定されない経路による。そのような核酸を投与する適切な方法が利用可能で、かつ、当業者に周知であって、特定の組成物を投与する複数の経路が使用できるが、多くの場合、特定の経路が、他の経路よりも迅速かつ効果的な反応が得られる。
【0231】
導入遺伝子の免疫細胞（例．Ｔ細胞）への導入に適したベクターには、非組込みレンチウイルスベクターが含まれる。例えば米国特許出願公開第2009/0117617号を参照。
【0232】
薬学的に許容される担体は、投与される組成物により、及び、組成物を投与するために用いる方法により、部分的に決まる。したがって、利用可能な医薬組成物の適切な製剤は多種多様であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい。
【0233】
相同組換えによるＤＮＡ修復
用語「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」は、例えば、ＤＮＡの二本鎖及び一本鎖切断の修復中の、細胞内のＤＮＡ損傷を修復するメカニズムを指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「核酸テンプレート」（この明細書では同じ意味で使用される核酸テンプレート又はドナーテンプレート）を使用して、二本鎖又は一本鎖の切断が生じた配列（例．ＤＮＡ標的配列）を修復する。これは、例えば、核酸テンプレートからＤＮＡ標的配列への遺伝情報の伝達をもたらす。核酸テンプレート配列がＤＮＡ標的配列と異なり、核酸テンプレートポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの一部又は全部がＤＮＡ標的配列に組み込まれる場合、ＨＤＲは、ＤＮＡ標的配列（例．挿入、削除、変異）の変更につながる可能性がある。いくつかの態様では、核酸テンプレートポリヌクレオチドの全体若しくは一部分、又は核酸テンプレートのコピーが、ＤＮＡ標的配列の部位に組み込まれる。
用語「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」は、例えば、ＤＮＡの二本鎖及び一本鎖切断の修復中の、細胞内のＤＮＡ損傷を修復するメカニズムを指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「核酸テンプレート」（この明細書では同じ意味で使用される核酸テンプレート又はドナーテンプレート）を使用して、二本鎖又は一本鎖の切断が生じた配列（例．ＤＮＡ標的配列）を修復する。これは、例えば、核酸テンプレートからＤＮＡ標的配列への遺伝情報の伝達をもたらす。核酸テンプレート配列がＤＮＡ標的配列と異なり、核酸テンプレートポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの一部又は全部がＤＮＡ標的配列に組み込まれる場合、ＨＤＲは、ＤＮＡ標的配列（例．挿入、削除、変異）の変更につながる可能性がある。いくつかの態様では、核酸テンプレートポリヌクレオチドの全体若しくは一部分、又は核酸テンプレートのコピーが、ＤＮＡ標的配列の部位に組み込まれる。
【0234】
用語「核酸テンプレート」及び「ドナー」は、ゲノムに挿入又はコピーされるヌクレオチド配列を指す。核酸鋳型は、標的核酸に付加される、標的核酸の変化を鋳型とする、又は標的配列の改変に使用してもよい、例えば１つ以上のヌクレオチドの配列を含む。核酸テンプレート配列の長さは、任意、例えば２～１０，０００ヌクレオチド（又はその間若しくはそれらを超える任意の整数）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド（又はその間の任意の整数）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチドである。核酸テンプレートは、一本鎖核酸、二本鎖核酸であってもよい。いくつかの態様では、核酸テンプレートは、例えば目標位置の、標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、核酸テンプレートは、例えば目標位置の、標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のリボヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、核酸テンプレートは修飾リボヌクレオチドを含む。
【0235】
例えば、変異遺伝子の修正又は野生型遺伝子の発現増加のための、外因性配列（「ドナー配列」、「ドナーテンプレート」又は「ドナー」ともいう）の挿入も実行できる。ドナー配列は、通常、それが配置されるゲノム配列と同一ではないということは容易に明らかである。ドナー配列は、対象とする位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同領域が隣接する非相同配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン中の対象領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同な不連続な領域を含むことができる。例えば、対象領域には通常存在しない配列を標的挿入するために、前記配列はドナー核酸分子中に存在でき、対象領域の配列と相同な領域に隣接できる。
【0236】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、線状又は環状の形態で細胞に導入してもよい。例えば、米国特許出願公開第2010/0047805号；同第2011/0281361号；同第2011/0207221号及び同第2019/0330620号を参照。線形の形態で導入する場合、ドナー配列の末端は、当業者に知られている方法で（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護できる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を線状分子の３’末端に付加し、及び／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方の末端又は両末端に連結する。例えば、Chang and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)；Nehls et al., Science (1996)を参照。外因性のポリヌクレオチドを分解から保護する他の方法には、末端アミノ基の付加、及び修飾ヌクレオチド間結合（例．ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、及びO-メチルリボース又はデオキシリボース残基）の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0237】
したがって、修復にドナー鋳型を使用する本発明の態様は、線状又は環状の形態で細胞に導入できる一本鎖及び／又は二本鎖のドナーテンプレートである、ＤＮＡ又はＲＮＡを使用してもよい。本発明の態様において、遺伝子編集組成物は、(1) 修復前に遺伝子を二本鎖切断するガイド配列を含むＲＮＡ分子、及び、(2) 修復のためのドナーＲＮＡテンプレートを含み、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は第１のＲＮＡ分子で、ドナーＲＮＡテンプレートは第２のＲＮＡ分子である。いくつかの態様では、ガイドＲＮＡ分子及びテンプレートＲＮＡ分子は、１つの分子の一部としてつながっている。
【0238】
ドナー配列は、オリゴヌクレオチドであってもよく、遺伝子修正又は内在性配列の標的化による改変に使用してもよい。オリゴヌクレオチドは、ベクターにより細胞に導入しもよく、細胞にエレクトロポレーションしてもよく、又は当該技術分野において知られている他の方法で導入してもよい。オリゴヌクレオチドは、内因性遺伝子（例．βグロビンの鎌状変異）の変異配列の「修正」のために使用でき、又は、内因性遺伝子座に所望の目的で配列を挿入するために使用してもよい。
【0239】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入できる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソーム、ポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入でき、又は組換えウイルス（例．アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達できる。
【0240】
ドナーは、一般に、その発現が組込み部位の内因性プロモーター、すなわちドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかし、ドナーがプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば構成的プロモーター又は誘導性若しくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことは明らかである。
【0241】
ドナー分子は、内因性遺伝子の全て若しくは一部が発現するように、又は全く発現しないように、内因性遺伝子に挿入されてもよい。例えば、本願の導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合物として、内因性配列の一部（導入遺伝子のＮ末端及び／又はＣ末端）が発現されるか、又は全く発現されないように、内因性遺伝子座に挿入されてもよい。他の態様では、導入遺伝子（例．内因性遺伝子などの追加のコード配列の有無によらない）は、セーフハーバー遺伝子座（例．ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られている）遺伝子、アルブミン遺伝子又はRosa遺伝子）など、任意の内因性遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許第7,951,925号及び同第8,110,379号；米国特許出願公開第2008/0159996号；同第20100/0218264号；同第2010/0291048号；同第2012/0017290号；同第2011/0265198号；同第2013/0137104号；同第2013/0122591号；同第2013/0177983号及び同第2013/0177960号、並びに米国仮出願第61/823,689号を参照）。
【0242】
内因性の配列（内因性又は導入遺伝子の一部）を導入遺伝子と共に発現させる場合、内因性配列は全長配列（野生型又は変異体）であっても部分配列であってもよい。好ましくは、内因性配列は機能的である。これらの全長又は部分配列の機能の非限定的な例には、導入遺伝子（例：治療遺伝子）によって発現され、及び／又は担体として作用するポリペプチドの半減期の増加が含まれる。
【0243】
さらに、発現に必須ではないものの、外因性の配列は、転写又は翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。
【0244】
ある態様では、ドナー分子は、タンパク質をコードする遺伝子（例．細胞若しくは個体で欠けているタンパク質をコードするコード配列、又はタンパク質をコードする遺伝子の別のバージョン）、調節配列及び／又はマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡといった構造核酸をコードする配列からなる群から選択される配列を含む。
【0245】
これまでに説明した態様は互いに適用可能であることが意図されている。例えば、本発明のＲＮＡ分子又は組成物は、本発明の方法で利用してもよいことが理解される。
【0246】
この明細書では、全ての見出しは単に整理のためであって、いかなる方法でも開示を制限することを意図するものではない。個々の項の内容は、全ての項に等しく適用できる。
【0247】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、限定を意図しない以下の実施例を検討することで、当業者に明らかになる。さらに、これまでに説明し、また、特許請求の範囲に記載する本発明のさまざまな態様及び側面のそれぞれは、以下の実施例で実験的に裏付けられている。
【0248】
明確にするために、別々の態様として説明する本発明の特徴は、一つの態様で組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、一つの態様として説明する本発明のさまざまな特徴は、別個に、適切なサブコンビネーションとして、又は本発明の他の態様で適切に提供されてもよい。態様がそれらの要素がなくては機能しない場合を除き、さまざまな態様として記述した特定の特徴は、それらの態様の本質的な特徴であると考えるべきではない。
【0249】
一般に、この明細書で使用する命名法及びこの発明で利用する実験の手順には、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1989)；Ausubel, R. M. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren et al. (Eds.), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,192,659号及び同第5,272,057号に示された方法；Cellis, J. E. (Ed.), "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III (1994)；Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" Third Edition, Wiley-Liss, N. Y. (1994)；Coligan J. E. (Ed.), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III (1994)；Stites et al. (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (Eds.), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；Clokie and Kropinski (Eds.), "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (2009)を参照、これらは全て参照により組み込まれる。他の一般的な参考資料は、この明細書全体で提供している。
【0250】
本発明の完全な理解を容易くするために、以下に実施例を提供する。以下の実施例は、本発明を製造し、実施する代表的な様式を説明するものである。しかし、この発明の範囲は、これらの実施例に開示された特定の態様に限定されるものではなく、これらは例示のみを目的とするものである。
【実施例】
【0251】
実験の詳細
本発明のより完全な理解を容易にするために、以下に実施例を示す。以下の実施例は、本発明を生み出し、実施する例示的な様式を説明するものである。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例に開示された特定の態様に限定されるものではなく、これらは例示のみを目的とする。
本発明のより完全な理解を容易にするために、以下に実施例を示す。以下の実施例は、本発明を生み出し、実施する例示的な様式を説明するものである。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例に開示された特定の態様に限定されるものではなく、これらは例示のみを目的とする。
【0252】
ＣＲＩＳＰＲ反復（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ヌクレアーゼのポリペプチド（ＯＭＮＩ）及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を、環境サンプルの配列のさまざまなメタゲノムのデータベースから予測した。
【0253】
ＯＭＮＩヌクレアーゼポリペプチドの構築
新規なヌクレアーゼポリペプチド（ＯＭＮＩ）を構築するために、いくつかのＯＭＮＩのオープンリーディングフレームを、ヒト細胞系での発現のためにコドン最適化した。ＯＲＦを、細菌発現プラスミドｐＥＴ９ａ及び哺乳動物発現プラスミドｐｍＯＭＮＩにクローニングした（表４）。
新規なヌクレアーゼポリペプチド（ＯＭＮＩ）を構築するために、いくつかのＯＭＮＩのオープンリーディングフレームを、ヒト細胞系での発現のためにコドン最適化した。ＯＲＦを、細菌発現プラスミドｐＥＴ９ａ及び哺乳動物発現プラスミドｐｍＯＭＮＩにクローニングした（表４）。
【0254】
ｓｇＲＮＡの予測及び構築
各ＯＭＮＩについて、それぞれの細菌ゲノムでＣＲＩＳＰＲ反復配列及びトランス活性化ｃｒＲＮＡを検出することにより、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を予測した。in silicoにおいて、ネイティブで未成熟のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列をテトラループ「ｇａａａ」と接続し、ＲＮＡ二次構造予測ツールを使用して、デュプレックスの二次構造要素を予測した。
各ＯＭＮＩについて、それぞれの細菌ゲノムでＣＲＩＳＰＲ反復配列及びトランス活性化ｃｒＲＮＡを検出することにより、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を予測した。in silicoにおいて、ネイティブで未成熟のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列をテトラループ「ｇａａａ」と接続し、ＲＮＡ二次構造予測ツールを使用して、デュプレックスの二次構造要素を予測した。
【0255】
全デュプレックスＲＮＡ要素（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ）の予測した二次構造を、ｓｇＲＮＡの設計のための可能なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の特定に使用した。考えられるｓｇＲＮＡ足場を、上部ステムの異なる位置でデュプレックスを短縮することで構築した（全てのＯＭＮＩのｓｇＲＮＡ設計を表２に示す）。さらに、転写及び構造による制約を克服し、ヒト細胞でのｓｇＲＮＡ足場の可塑性を評価するために、場合によって、考えられるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列に小さな変更を加えた（図１、表２）。最後に、各ＯＭＮＩについて、最大で３バージョンの設計可能な足場を合成し、下流に２２ヌクレオチドの万能で独特なスペーサー配列（Ｔ２、配列番号２６８）を接続し、哺乳動物発現用のＵ６プロモーターと組み合わせた誘導性Ｔ７プロモーターの下で、細菌発現プラスミドにクローニングした（pShuttleGuide、表４）。
Ｔ２ － GGAAGAGCAGAGCCTTGGTCTC（配列番号２６８）
Ｔ２ － GGAAGAGCAGAGCCTTGGTCTC（配列番号２６８）
【0256】
ＴＸＴＬによるin vitro枯渇アッセイ
in vitroでのＰＡＭ配列の枯渇をMaxwell et al, Methods. 2018に示された方法で追跡した。簡潔に述べると、ＯＭＮＩヌクレアーゼを発現する線形ＤＮＡとＴ７プロモーター下のｓｇＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを発現する線形構築物と共に無細胞転写翻訳in vitro系（ＴＸＴＬミックス、Arbor Bioscience）に加えた。ＴＸＴＬミックスでのＲＮＡの発現とタンパク質翻訳により、ＲＮＰ複合体が形成される。線状のＤＮＡを使用したため、Ｃｈｉ６ ＤＮＡ配列をＴＸＴＬ反応ミックスに加えて、ＲｅｃＢＣＤのエキソヌクレアーゼ活性を阻害し、直鎖状ＤＮＡを分解から保護した。ｓｇＲＮＡスペーサーは、ＰＡＭ配列の８Ｎランダム化セットに隣接する標的となるプロトスペーサー（ｐｂＰＯＳＴ２ライブラリー、表４）を含むプラスミドのライブラリーを標的とするように設計されている。切断されたライブラリーと非標的ｇＲＮＡを発現する対照ライブラリーの両者に、必要なアダプターとインデックスを追加するために、ＰＣＲを使用して、ライブラリーからのＰＡＭ配列の枯渇を、ハイスループットシーケンシングによって測定した。ディープシーケンシングの後、ＯＭＮＩヌクレアーゼによる機能的ＤＮＡの切断を示す、対照での出現と比較した、同じＰＡＭ配列を有する枯渇配列の割合により、in vitroでの活性を確認した（図２～１８、表３）。
in vitroでのＰＡＭ配列の枯渇をMaxwell et al, Methods. 2018に示された方法で追跡した。簡潔に述べると、ＯＭＮＩヌクレアーゼを発現する線形ＤＮＡとＴ７プロモーター下のｓｇＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを発現する線形構築物と共に無細胞転写翻訳in vitro系（ＴＸＴＬミックス、Arbor Bioscience）に加えた。ＴＸＴＬミックスでのＲＮＡの発現とタンパク質翻訳により、ＲＮＰ複合体が形成される。線状のＤＮＡを使用したため、Ｃｈｉ６ ＤＮＡ配列をＴＸＴＬ反応ミックスに加えて、ＲｅｃＢＣＤのエキソヌクレアーゼ活性を阻害し、直鎖状ＤＮＡを分解から保護した。ｓｇＲＮＡスペーサーは、ＰＡＭ配列の８Ｎランダム化セットに隣接する標的となるプロトスペーサー（ｐｂＰＯＳＴ２ライブラリー、表４）を含むプラスミドのライブラリーを標的とするように設計されている。切断されたライブラリーと非標的ｇＲＮＡを発現する対照ライブラリーの両者に、必要なアダプターとインデックスを追加するために、ＰＣＲを使用して、ライブラリーからのＰＡＭ配列の枯渇を、ハイスループットシーケンシングによって測定した。ディープシーケンシングの後、ＯＭＮＩヌクレアーゼによる機能的ＤＮＡの切断を示す、対照での出現と比較した、同じＰＡＭ配列を有する枯渇配列の割合により、in vitroでの活性を確認した（図２～１８、表３）。
【0257】
ヒト細胞での内因性のゲノム標的に対する活性
ＯＭＮＩのヒト細胞におけるゲノムの特定の位置の編集を促進する能力もアッセイした。この目的のために、各ＯＭＮＩごとに、対応するＯＭＮＩ-Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（表４）を、ヒトゲノムの特定の位置を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡと共に、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした（ｐＳｈｕｔｔｌｅガイド－表４、スペーサー配列－表５）。７２時間後に、細胞を回収した。得られた細胞の半分を、マーカーとしてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を使用するＦＡＣＳによるトランスフェクション効率の定量に使用した。得られた細胞の残りの半分を溶解し、そのゲノムＤＮＡを使用して、対応する推定ゲノム標的をＰＣＲ増幅した。アンプリコンを次世代配列決定（ＮＧＳ）し、得られた配列を使用して、各標的部位における編集率を計算した。切断部位の周囲での短い挿入又は欠失（インデル）は、ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断後のＤＮＡ末端の修復の典型的な結果である。したがって、編集率の計算は、各アンプリコン内の配列を含有するインデルの割合から推定した。
ＯＭＮＩのヒト細胞におけるゲノムの特定の位置の編集を促進する能力もアッセイした。この目的のために、各ＯＭＮＩごとに、対応するＯＭＮＩ-Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（表４）を、ヒトゲノムの特定の位置を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡと共に、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした（ｐＳｈｕｔｔｌｅガイド－表４、スペーサー配列－表５）。７２時間後に、細胞を回収した。得られた細胞の半分を、マーカーとしてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を使用するＦＡＣＳによるトランスフェクション効率の定量に使用した。得られた細胞の残りの半分を溶解し、そのゲノムＤＮＡを使用して、対応する推定ゲノム標的をＰＣＲ増幅した。アンプリコンを次世代配列決定（ＮＧＳ）し、得られた配列を使用して、各標的部位における編集率を計算した。切断部位の周囲での短い挿入又は欠失（インデル）は、ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断後のＤＮＡ末端の修復の典型的な結果である。したがって、編集率の計算は、各アンプリコン内の配列を含有するインデルの割合から推定した。
【0258】
それぞれが異なるゲノム上の位置を標的とするように設計された少なくとも６つのｓｇＲＮＡのパネルを使用して、各ＯＭＮＩのゲノム活性を評価した。これらの実験の結果を表５にまとめる。この表（列６、「インデル率」）から理解できるように、いくつかのＯＭＮＩは、試験を行った大部分又は一部の標的部位における編集レベルが高く、意味があった。
【0259】
ＲＮＰ複合体の一部としてのＯＭＮＩ-１２７の別の結果
ＯＭＮＩ-１２７タンパク質の精製
ｐＥＴ２８ａ中のＯＭＮＩ-１２７構築物をＢＬ－２１細胞（ＮＥＢ）中で発現させた。細胞をＡＩＭ＋０．４％グリセロール中で増殖させ、３７℃で２３時間かけて発現させた。細胞を化学的に溶解し、透明な溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂で精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ溶出画分をＣＥＸ（ＳＯ３フラクトゲル）樹脂で精製し、続いてSuperdex（登録商標）200 Increase 10/300 GL, AKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）によりＳＥＣ精製した。ＯＭＮＩ-１２７タンパク質を有する画分をプールし、２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。
ＯＭＮＩ-１２７タンパク質の精製
ｐＥＴ２８ａ中のＯＭＮＩ-１２７構築物をＢＬ－２１細胞（ＮＥＢ）中で発現させた。細胞をＡＩＭ＋０．４％グリセロール中で増殖させ、３７℃で２３時間かけて発現させた。細胞を化学的に溶解し、透明な溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂で精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ溶出画分をＣＥＸ（ＳＯ３フラクトゲル）樹脂で精製し、続いてSuperdex（登録商標）200 Increase 10/300 GL, AKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）によりＳＥＣ精製した。ＯＭＮＩ-１２７タンパク質を有する画分をプールし、２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。
【0260】
in vitroでのＯＭＮＩ-１２７ＲＮＰの切断活性
３’末端及び５’末端に３つの2'-O-メチル3'-ホスホロチオエート（Agilent）を有するＯＭＮＩ-１２７のｓｇＲＮＡを合成した。
３’末端及び５’末端に３つの2'-O-メチル3'-ホスホロチオエート（Agilent）を有するＯＭＮＩ-１２７のｓｇＲＮＡを合成した。
【0261】
ＥＬＡＮＥｇ１３５ガイドを用い、in vitroでＯＭＮＩ-１２７ＲＮＰの活性を分析した（表６、図２Ａ）。簡潔に説明すると、ＯＭＮＩ-１２７ヌクレアーゼ１０ｐｍｏｌと合成したガイド２０ｐｍｏｌを混合した。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を４、２、１、０．５ｐｍｏｌに段階希釈し、抽出したゲノムＤＮＡからＥＬＡＮＥｇ１３５標的を増幅することで調製した線状ＤＮＡテンプレート４０ｎｇと反応させた。ＯＭＮＩ-１２７は、ＥＬＡＮＥテンプレートを完全に切断し、高い切断活性が示された（図１９Ａ）。
【0262】
Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰの編集活性によるＯＭＮＩ-１２７のガイド最適化
哺乳動物細胞でスペーサー長を最適化した。さまざまなスペーサー長（２０～２４ヌクレオチド、表６）の合成ガイド１２０ｕＭ及びＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）１００ｕＭと、ヌクレアーゼ１００ｕＭを混合して、ＲＮＰを組み立てた。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を予め洗浄したＵ２ＯＳ細胞２００，０００個と混合し、Lonza SE Cell Line 4D-NucleofectorTM X KitとＤＮ１００を使用して、製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。対応するゲノム標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンを次世代配列決定（ＮＧＳ）し、得られた配列を使用して、編集率を計算した。図１９Ｂ及び表７から理解できるように、ＯＭＮ１－１２７は、全てのスペーサー長で編集レベルが高かった。
哺乳動物細胞でスペーサー長を最適化した。さまざまなスペーサー長（２０～２４ヌクレオチド、表６）の合成ガイド１２０ｕＭ及びＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）１００ｕＭと、ヌクレアーゼ１００ｕＭを混合して、ＲＮＰを組み立てた。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を予め洗浄したＵ２ＯＳ細胞２００，０００個と混合し、Lonza SE Cell Line 4D-NucleofectorTM X KitとＤＮ１００を使用して、製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。対応するゲノム標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンを次世代配列決定（ＮＧＳ）し、得られた配列を使用して、編集率を計算した。図１９Ｂ及び表７から理解できるように、ＯＭＮ１－１２７は、全てのスペーサー長で編集レベルが高かった。
【0263】
ヒト細胞におけるＲＮＰ複合体の一部としてのＯＭＮＩ-１２７編集活性
ＲＮＰ複合体の一部としてのＯＭＮＩ-１２７タンパク質の活性がＵ２ＯＳ細胞で観察され（表７、図１９Ｃ）、同等の活性がＨＳＣ－ＭＬＰ２細胞でも観察された（表８）。ＨＳＣ実験では、合成ガイド（表６）１２０ｕＭ及びＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）１００ｕＭと、ヌクレアーゼ１００ｕＭを混合して、ＲＮＰを組み立てた。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を予め洗浄したＨＳＣ－ＭＬＰ２細胞２５０，０００個と混合し、Lonza P3 Cell Line 4D-NucleofectorTM X KitとCA137を使用して、製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。７２時間後に細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡ標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＮＧＳし、得られた配列を使用して、編集率を計算した。ＯＭＮＩ-１２７を、ＥＬＡＮＥ－ｇ１３５及びｇ１３６のガイドを用いて試験した。ＯＭＮＩ-１２７は、２つのＥＬＡＮＥガイド（ｇ１３５、ｇ１３６）で編集を示した。
ＲＮＰ複合体の一部としてのＯＭＮＩ-１２７タンパク質の活性がＵ２ＯＳ細胞で観察され（表７、図１９Ｃ）、同等の活性がＨＳＣ－ＭＬＰ２細胞でも観察された（表８）。ＨＳＣ実験では、合成ガイド（表６）１２０ｕＭ及びＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）１００ｕＭと、ヌクレアーゼ１００ｕＭを混合して、ＲＮＰを組み立てた。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を予め洗浄したＨＳＣ－ＭＬＰ２細胞２５０，０００個と混合し、Lonza P3 Cell Line 4D-NucleofectorTM X KitとCA137を使用して、製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。７２時間後に細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡ標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＮＧＳし、得られた配列を使用して、編集率を計算した。ＯＭＮＩ-１２７を、ＥＬＡＮＥ－ｇ１３５及びｇ１３６のガイドを用いて試験した。ＯＭＮＩ-１２７は、２つのＥＬＡＮＥガイド（ｇ１３５、ｇ１３６）で編集を示した。
【0264】
【表1-1】
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【表1-2】
【0266】
【表2-1】
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【表2-2】
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【表5-1】
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【表5-2】
【0276】
【表6】
【0277】
【表7】
【0278】
【表8】
【0279】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】