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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】組換え抗ヒトＣＤ２５抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240903BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240903BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
G01N33/574 A
G01N33/531 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508587
(86)(22)【出願日】2022-08-09
(85)【翻訳文提出日】2024-04-05
(86)【国際出願番号】 CN2022111165
(87)【国際公開番号】W WO2023016455
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】202110907431.6
(32)【優先日】2021-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524053281
【氏名又は名称】南京▲諾▼艾新生物技▲術▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】熊 新▲輝▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲タオ▼
(72)【発明者】
【氏名】仲 ▲カイ▼
(72)【発明者】
【氏名】▲呉▼ ▲偉▼
(72)【発明者】
【氏名】黄 ▲倩▼卉
(72)【発明者】
【氏名】叶 懿
(72)【発明者】
【氏名】李 醒
(72)【発明者】
【氏名】潘 紅
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
抗ヒトＣＤ２５抗体分子又はその抗原結合断片。既存の抗ＣＤ２５抗体と比較して、提供される抗体は非ＩＬ－２阻害性であり、Ｔｒｅｇを排除し得るだけでなく、腫瘍微小環境を是正し、Ｔｅｆｆの割合及び殺傷能力を高めることができる。さらに、固形腫瘍及び血液腫瘍を治療するための薬剤の調製における抗体分子又は抗原結合断片の使用が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、以下のＣＤＲの組合せ：（１）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（３）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８６、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（４）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８７、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（５）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（６）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（７）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８９、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（８）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（９）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９３及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１０）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１１）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１２）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１３）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１４）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９６にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１５）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９７にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１６）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１７）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１８）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１９）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２０）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２１）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、並びに、
（２２）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む、抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗体分子又はその抗原結合断片がＣＤ２５に対する抗体分子又はその抗原結合断片であり、好ましくは、前記ＣＤ２５がヒトＣＤ２５である、請求項１に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記重鎖可変領域が、配列番号１～２５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１～２５のいずれか１つに示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２６～６２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６～６２のいずれか１つに示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体分子又はその抗原結合断片に含まれる前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、以下の組合せ：（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（７）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（９）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１０）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１２）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１３）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１４）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１５）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１６）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１７）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１８）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１９）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２０）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２１）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２４）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２５）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２６）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２７）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２８）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２９）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３０）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３４）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３５）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３６）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３７）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３８）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４０）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４４）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４５）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４７）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４８）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４９）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５０）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５２）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５３）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５４）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５５）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５６）配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５８に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５７）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５８）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５９）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６０）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６１）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６２）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６３）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６４）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６６）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６７）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
（６８）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体分子が、ネズミ抗体、キメラ抗体、又は完全若しくは部分的ヒト化抗体であり、前記抗原結合断片が、前記抗体分子のハーフ抗体、又はｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦｖ断片であり、好ましくは、前記抗体分子がモノクローナル抗体又は一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記抗体分子又はその抗原結合断片が、ヒト又はネズミ定常領域、好ましくはヒト又はネズミ重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含み、好ましくは、前記抗体分子又はその抗原結合断片が重鎖及び軽鎖を含み、
より好ましくは、前記抗体分子又はその抗原結合断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの重鎖定常領域、及び／又はκ型若しくはλ型の軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体分子が、モノクローナル抗体、好ましくはキメラ又はヒト化モノクローナル抗体であり、好ましくは、前記抗体分子の重鎖定常領域が、配列番号１０４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０４に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記抗体分子の軽鎖定常領域が、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０５に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記少なくとも７５％の同一性が、７５％以上の任意のパーセント同一性、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更に９９％の同一性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片に含まれる重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の核酸分子及び／又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞、又は請求項７に記載の核酸分子及び／又は請求項８に記載のベクターで形質転換若しくはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、及び／又は請求項９に記載の宿主細胞を含む、組成物であって、好ましくは、該組成物が医薬組成物であり、任意に薬学的に許容可能な担体、補助剤又は賦形剤を含む、組成物。
【請求項11】
固形腫瘍又は血液腫瘍を予防、治療及び／又は改善するための医薬品の製造における、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項12】
疾患を予防、治療及び／又は改善する方法であって、その必要がある被験体に、治療有効量の請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１０に記載の組成物、並びに任意に更なる薬剤又は手段を投与することを含み、好ましくは、前記疾患が固形腫瘍又は血液腫瘍であり、
好ましくは、前記被験体が哺乳動物であり、好ましくは、前記被験体がヒトである、方法。
【請求項13】
疾患を検出又は診断する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１０に記載の組成物を、被験体からの試料に接触させることを含み、好ましくは、前記疾患が固形腫瘍又は血液腫瘍であり、
好ましくは、前記被験体が哺乳動物であり、好ましくは、前記被験体がヒトである、方法。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１０に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本特許出願は、２０２１年８月９日に出願された中国特許出願第２０２１１０９０７４３１．６号に対する優先権及びその利益を主張し、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本特許出願は、２０２１年８月９日に出願された中国特許出願第２０２１１０９０７４３１．６号に対する優先権及びその利益を主張し、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【0002】
本発明は、抗体医薬の分野に属し、特にヒトＣＤ２５に対する抗体、及び医薬品を調製する際のその抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
癌免疫療法は、腫瘍細胞を制御及び殺傷するために、体の免疫系の力を結集させて腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を強化することである。しかしながら、悪性腫瘍（特に固形腫瘍）は、腫瘍細胞自体によって及び腫瘍微小環境内の構成要素によって媒介される様々なメカニズムを通じて免疫監視を逃れることがある。この場合、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団とエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）集団との間の複雑な相互作用が腫瘍特異的免疫応答の結果をどのように決定するのか考慮する必要がある。腫瘍特異的免疫応答において、Ｔｒｅｇは、末梢性免疫寛容の確立及び維持を促進し、免疫ホメオスタシスの媒介において重要な役割を果たし得る。しかしながら、癌の場合、それらの影響はより複雑であり、Ｔｒｅｇによる腫瘍浸潤に起因するＴｅｆｆ細胞とＴｒｅｇ細胞との不均衡（すなわち、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の不均衡）が重要な要因であると一般に認識されている（非特許文献１）。
【0004】
癌細胞は自己抗原及び腫瘍関連抗原の両方を発現するため、エフェクター細胞の応答を抑制しようとするＴｒｅｇの存在が、腫瘍の進行に寄与する可能性がある。確立された腫瘍へのＴｒｅｇの浸潤は、効果的な抗腫瘍応答及び癌全般の治療に対する主な障害の１つを象徴するものである。抑制メカニズムを使用するＴｒｅｇは、抗腫瘍応答の誘導又は増強に依存する現行の治療法、特に免疫療法の限界又は更には失敗に大きく寄与すると考えられる（非特許文献２）。腫瘍免疫療法の成功に対する主要な障害の１つであるＴｒｅｇの腫瘍浸潤は、幾つかの予後不良のヒト癌にも関連している（非特許文献３）。Ｔｒｅｇ細胞は、ネズミモデルにおける腫瘍の早期確立及び進行に寄与しており、Ｔｒｅｇ細胞が存在しない場合には腫瘍の進行が遅延する。ヒトでは、Ｔｒｅｇ細胞による高い腫瘍浸潤、そしてより重要なことに、Ｔｒｅｇ細胞に対するエフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞の比率が低いことが、複数の固形癌の思わしくない結果に関連する。逆に、高いＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比は、ヒト及びマウスの両方において免疫療法に対する好適な応答に関連する。今日まで、殆どの研究は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇又は機能調節のいずれかによる対象にすることが、特に他の免疫調節の介入、例えばワクチン及びチェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、有意な治療効果をもたらし得るという概念を支持している（非特許文献４）。
【0005】
したがって、Ｔｒｅｇ細胞への選択的干渉のための適切な標的を定義することは、効果的な治療法の開発における重要なステップである。この点に関して、ＣＤ２５が標的として提案された。ＣＤ２５はインターロイキン－２高親和性受容体α鎖（ＩＬ－２Ｒα）としても知られており、Ｔｒｅｇ細胞のマスター制御因子である転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）が発見される前に、Ｔｒｅｇ細胞を同定及び単離するために使用された最初の表面マーカーであった。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を媒介する最も広範に研究された標的でもある。ＣＤ２５はＴｒｅｇ細胞で構成的に発現し、ナイーブＴｅｆｆ細胞では存在しないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で観察されたように、Ｔｅｆｆ細胞の活性化時に一過性のアップレギュレーションが記載されている。長年市販されているバシリキシマブ及びダクリズマブは、ＩＬ－２がＣＤ２５に結合するのを阻害する抗ヒトＣＤ２５抗体である。バシリキシマブは、移植片対宿主病用に現在承認されているマウス－ヒトキメラＣＤ２５抗体であり、ダクリズマブは、多発性硬化症の治療用に承認されているヒト化ＣＤ２５抗体である。他の幾つかの抗ＣＤ２５抗体（例えば、７Ｄ４、２Ｅ４、ＭＡ２５１、７Ｇ７Ｂ６等）は、ＣＤ２５に結合するが、ＩＬ－２のＣＤ２５への結合を阻害しない。
【0006】
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を有するＣＤ２５標的化抗体は、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇを効果的に枯渇させ、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を調節し得る。さらに、ＣＤ２５はＩＬ－２の受容体のαサブユニットであり、ＩＬ－２はＴｅｆｆ応答に関する重要なサイトカインである。したがって、ＣＤ２５を標的とする抗体は、一方では腫瘍微小環境内のＴｒｅｇを効果的に枯渇させることができ、他方ではＣＤ２５を介したＩＬ－２シグナル伝達を阻害しないため、Ｔｒｅｇ細胞を機械的に除去することができるだけでなく、ＩＬ－２によってＴｅｆｆ細胞を刺激し得ることで、強力な抗腫瘍効果も発揮することができる。
【0007】
したがって、非ＩＬ－２ブロッキング性である抗ＣＤ２５抗体の開発は、腫瘍微小環境を是正し、免疫系を促進させて癌細胞を枯渇させるのに役立ち、現時点で癌患者の治療にとって重要な臨床的意義を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Nat Rev Cancer 2014, 14(11): 722-35.
【非特許文献2】Anticancer Res 2012, 32(3): 997-1003.
【非特許文献3】Shang B et al, 2015, Sci Rep. 5: 15179
【非特許文献4】Immunity 2017, 46(4): 577-586.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明によって解決されるべき技術的問題は、ハイブリドーマスクリーニング、ヒト化、組換え及び他の技法を通じて、非ＩＬ－２ブロッキング性である新たな抗ＣＤ２５抗体を得ることである。
【0010】
上記技術的問題のため、本発明の目的は、既存の抗ＣＤ２５抗体と比較して非ＩＬ－２ブロッキング性であるため、Ｔｒｅｇを枯渇させることによりＴｅｆｆの割合を増加させ得るだけでなく、ＩＬ－２がＴｅｆｆ細胞を刺激することを可能にし、それによって、Ｔｅｆｆ細胞の殺傷能力を高め、腫瘍微小環境を是正し得る、抗ＣＤ２５抗体分子又はその抗原結合断片を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本開示において記載される抗体の「断片」は、抗体の多様な機能的又は活性断片、例えばその抗原結合部分、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖを含む。
【0012】
本開示において記載される「少なくとも７５％の同一性」は、７５％以上の任意のパーセント同一性、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更に９９％の同一性である。
【0013】
一つの態様において、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）が、以下のＣＤＲの組合せ：
（１）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（３）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８６、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（４）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８７、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（５）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（６）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（７）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８９、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（８）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（９）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９３及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１０）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１１）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１２）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１３）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１４）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９６にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１５）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９７にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１６）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１７）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１８）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１９）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２０）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２１）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、並びに、
（２２）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む、抗体分子又はその抗原結合断片を提供する。
（１）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２）配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（３）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８６、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（４）配列番号６３、６６及び６５にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８７、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（５）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（６）配列番号６３、６７及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（７）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８９、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（８）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９０及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（９）配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９２、９３及び９１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１０）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１１）配列番号６３、７２及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１２）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８２、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１３）配列番号７３、７４及び６８にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号８５、８３及び８４にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１４）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９６にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１５）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９７にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１６）配列番号７５、７６及び７７にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９４、９５及び９８にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１７）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１８）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号９９、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（１９）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２０）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１００及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
（２１）配列番号７８、７９及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、並びに、
（２２）配列番号７８、８１及び８０にそれぞれ示されるＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３、及び配列番号１０２、１０３及び１０１にそれぞれ示されるＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む、抗体分子又はその抗原結合断片を提供する。
【0014】
本開示において提供される抗体分子又はその抗原結合断片は、ＣＤ２５に対する抗体分子又はその抗原結合断片である。好ましくは、ＣＤ２５はヒトＣＤ２５である。
【0015】
本開示において提供される抗体分子又はその抗原結合断片では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方が、上記のＣＤＲ及びその間のフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、それらのドメインは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のように配置される。本開示により提供される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列によれば、そこに含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は通例、当業者によって決定することができる。例えば、本開示の特定の実施の形態によれば、可変領域アミノ酸配列中のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、ＡＢＭ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームを使用して決定することができる。当該技術分野において知られる他の方法によって決定される、得られた重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ並びにそれらの組合せも本開示の範囲に含まれる。
【0016】
好ましくは、重鎖可変領域が、配列番号１～２５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１～２５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２６～６２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６～６２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0017】
さらに好ましくは、抗体分子又はその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、以下の組合せ：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（７）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（９）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１０）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１２）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１３）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１４）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１５）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１６）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１７）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１８）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１９）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２０）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２１）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２４）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２５）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２６）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２７）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２８）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２９）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３０）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３４）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３５）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３６）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３７）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３８）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４０）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４４）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４５）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４７）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４８）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４９）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５０）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５２）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５３）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５４）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５５）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５６）配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５７）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５８）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５９）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６０）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６１）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６２）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６３）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６４）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６６）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６７）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
（６８）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（７）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（９）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１０）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１２）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１３）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１４）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１５）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１６）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１７）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１８）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（１９）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２０）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２１）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号３９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２４）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２５）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２６）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２７）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２８）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（２９）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３０）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３４）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３５）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３６）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３７）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３８）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（３９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４０）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４４）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４５）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４７）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４８）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（４９）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５０）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５２）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５３）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５４）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５５）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５６）配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５７）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５８）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（５９）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号５９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６０）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６１）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６２）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６３）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６４）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６６）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
（６７）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
（６８）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0018】
本開示による抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に関して、「少なくとも７５％の同一性」に起因して最大２５％の相違が、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域中の任意のフレームワーク領域中に存在し得る。相違は、任意の位置におけるアミノ酸欠失、付加又は置換から生じるものであってもよく、置換は保存的置換又は非保存的置換であってもよい。
【0019】
本開示において提供される抗体分子は、ネズミ抗体、キメラ抗体、又は完全若しくは部分的ヒト化抗体であり、抗原結合断片は、抗体分子のハーフ抗体、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ジスルフィド安定化Ｆｖ断片）２（（ｄｓＦｖ）２）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片若しくは可変断片（Ｆｖ）である。好ましくは、抗体分子はモノクローナル抗体又は一本鎖抗体である。好ましくは、抗体分子又はその抗原結合断片は、ヒト又はネズミ定常領域、好ましくはヒト又はネズミ重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含む。好ましくは、抗体分子又はその抗原結合断片は重鎖及び軽鎖を含む。より好ましくは、抗体分子又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの重鎖定常領域、及び／又はκ型若しくはλ型の軽鎖定常領域を含む。好ましくは、抗体分子又はその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブタイプのものである重鎖定常領域を含み、ヒトカッパ（κ）サブタイプのものである軽鎖定常領域を含む。概して、本開示において提供される抗体分子は、モノクローナル抗体、好ましくはキメラ又はヒト化モノクローナル抗体である。好ましくは、抗体分子は、ジスルフィド結合を介して連結する２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含む。
【0020】
本開示の特定の一実施の形態によれば、抗体分子の重鎖定常領域は、配列番号１０４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体分子の軽鎖定常領域は、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0021】
別の態様において、本開示は、本開示による抗体分子又はその抗原結合断片に含まれる重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【0022】
更に別の態様において、本開示は、本開示による核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、真核発現ベクター、原核発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であり得る。
【0023】
本発明のベクター又は核酸分子は、抗体保存又は発現等のため、宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクションするか、又は任意の方法で宿主細胞に進入するために使用され得る。したがって、更なる態様において、本開示は、本発明による核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞、又は本開示による核酸分子及び／又はベクターで形質転換若しくはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞、例えば細菌又は昆虫、真菌、植物又は動物細胞であり得る。
【0024】
なお更なる態様において、本開示は、本開示による抗体分子若しくはその抗原結合断片、本開示による核酸分子、本開示によるベクター、及び／又は本開示による宿主細胞を含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物であり、任意に薬学的に許容可能な担体、補助剤又は賦形剤を含む。
【0025】
更なる態様において、本開示は、固形腫瘍又は血液腫瘍（hematological tumor）を予防、治療及び／又は改善するための医薬品の製造における、本開示による抗体分子若しくはその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物の使用を更に提供する。
【0026】
さらに、本開示は、疾患を予防、治療及び／又は改善する方法であって、その必要がある被験体に、治療有効量の本開示による抗体分子若しくはその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物、並びに任意に更なる薬剤又は手段を投与することを含む、方法を更に提供する。好ましくは、疾患は固形腫瘍又は血液腫瘍である。更に好ましくは、被験体は哺乳動物であり、好ましくは、被験体はヒトである。
【0027】
本開示はまた、疾患を検出又は診断する方法であって、本開示による抗体分子若しくはその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物を、被験体からの試料に接触させることを含む、方法を提供する。好ましくは、疾患は固形腫瘍又は血液腫瘍である。更に好ましくは、被験体は哺乳動物であり、好ましくは、被験体はヒトである。
【0028】
さらに、本開示は、本開示による抗体分子若しくはその抗原結合断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物を含むキットを更に提供する。キットは、例えば上記の疾患を検出又は診断する方法において、検出又は診断のために使用され得る。
【0029】
本開示はＣＤ２５に対する新たな抗体を提供し、該抗体は高い親和性でヒトＣＤ２５に結合し得る。また、該抗体は、非ＩＬ－２ブロッキング抗体として、Ｔｒｅｇを枯渇させることによりＴｅｆｆの割合を増加させるだけでなく、ＩＬ－２がＴｅｆｆ細胞を刺激することを可能にし、それによって、Ｔｅｆｆ細胞の殺傷能力を高め、腫瘍微小環境を是正し得る。したがって、該抗体は重要な臨床的意義を有する。
【0030】
本発明の実施形態は、添付の図に関連して以下に詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1A】ヒトＣＤ２５へのＩＬ２の結合に対するキメラ抗体の阻害活性を示す図である。
【図1B】ヒトＣＤ２５へのＩＬ２の結合に対するキメラ抗体の阻害活性を示す図である。
【図2A】ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性を示す図である。
【図2B】ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性を示す図である。
【図2C】ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性を示す図である。
【図2D】ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性を示す図である。
【図3】Ｔｒｅｇに対するキメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷活性を示す図である。
【図4】ＩＬ２によって刺激されたＴｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に対するキメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害活性を示す図である。
【図5】ＩＬ２によって刺激されたＴｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に対するヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害活性を示す図である。
【図6】Ｔｒｅｇに対するヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷活性を示す図である。
【図7】野生型マウスにおけるヒト化抗体の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図8】ＭＣ３８大腸癌細胞を移植したヒト化マウスである動物モデルにおけるヒト化抗体の有効性を示す図である。
【図9A】ＰＤに関連するＭＣ３８大腸癌細胞を移植したヒト化マウスである動物モデルにおけるヒト化抗体の有効性を示す図である。データは、平均±ＳＥＭとして示し、ＰＢＳと比較してDunnettの多重比較検定を用いた一元配置分散分析によって分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図9B】ＰＤに関連するＭＣ３８大腸癌細胞を移植したヒト化マウスである動物モデルにおけるヒト化抗体の有効性を示す図である。データは、平均±ＳＥＭとして示し、ＰＢＳと比較してDunnettの多重比較検定を用いた一元配置分散分析によって分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図9C】ＰＤに関連するＭＣ３８大腸癌細胞を移植したヒト化マウスである動物モデルにおけるヒト化抗体の有効性を示す図である。データは、平均±ＳＥＭとして示し、ＰＢＳと比較してDunnettの多重比較検定を用いた一元配置分散分析によって分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本発明は、特定の実施例に関連して以下に例示される。これらの実施例は、本発明の単なる例示であり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定しないことが当業者には理解されるであろう。
【0033】
以下の実施例における実験法は、別に明記しない限り、全て慣用的なものである。以下の実施例で使用される原材料及び試薬は、別に明記しない限り、全て市販の入手可能な製品である。
【0034】
本開示において記載される「抗体６８６」又は「６８６」は、中国特許出願公開第１１２０２０５１４号に提示されるａＣＤ２５－ａ－６８６を指し、ａＣＤ２５－ａ－６８６の配列は当該文献の図１に示されている。
【実施例】
【0035】
実施例１：ネズミ抗体のスクリーニング及び同定
１．１：動物免疫
ＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用して、Ｃ末端に６－ヒスチジンタグを融合させたヒトＣＤ２５（ＮＰ＿０００４０８．１）（Ｍｅｔ１－Ｃｙｓ２１３）を発現させた。従来の免疫プログラムに従って、フロイントアジュバントで４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。各々２匹のマウスを含む２つのバッチのマウスで免疫化を行い、バッチ間は２週間とした。各バッチのマウスを４回免疫化し、ヒトＣＤ２５－ｈｉｓを使用したＥＬＩＳＡによって試験し、いずれのマウスも１：１０００を上回る血清力価を有する場合に最終的に免疫化しているとし、３日～４日後に脾臓を収集した。
１．１：動物免疫
ＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用して、Ｃ末端に６－ヒスチジンタグを融合させたヒトＣＤ２５（ＮＰ＿０００４０８．１）（Ｍｅｔ１－Ｃｙｓ２１３）を発現させた。従来の免疫プログラムに従って、フロイントアジュバントで４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。各々２匹のマウスを含む２つのバッチのマウスで免疫化を行い、バッチ間は２週間とした。各バッチのマウスを４回免疫化し、ヒトＣＤ２５－ｈｉｓを使用したＥＬＩＳＡによって試験し、いずれのマウスも１：１０００を上回る血清力価を有する場合に最終的に免疫化しているとし、３日～４日後に脾臓を収集した。
【0036】
１．２：Ｂ細胞のパンニング及び培養
正式な実験を行う２日前に、４枚の１０ｃｍディッシュ（Corning、カタログ番号４３０１６７）内に培養培地を使用してフィーダー細胞をプレーティングした。正式な実験の１日前に、１００００細胞／ウェル及び１００μＬ／ウェルで４０枚の９６ウェルプレート（Corning、カタログ番号３５９９）中にフィーダー細胞をプレーティングした。その間に、それらの免疫化マウスから採取したＢ細胞を、コーティングされた抗原ヒトＣＤ２５－ｈｉｓでパンニングし、その後、得られたＢ細胞を、上記のフィーダー細胞でコーティングされた９６ウェルプレート内にプレーティングした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ１０日間～１４日間培養し、ウェル中のＢ細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡ及びセルベースアッセイを介するスクリーニングのために収集した。
正式な実験を行う２日前に、４枚の１０ｃｍディッシュ（Corning、カタログ番号４３０１６７）内に培養培地を使用してフィーダー細胞をプレーティングした。正式な実験の１日前に、１００００細胞／ウェル及び１００μＬ／ウェルで４０枚の９６ウェルプレート（Corning、カタログ番号３５９９）中にフィーダー細胞をプレーティングした。その間に、それらの免疫化マウスから採取したＢ細胞を、コーティングされた抗原ヒトＣＤ２５－ｈｉｓでパンニングし、その後、得られたＢ細胞を、上記のフィーダー細胞でコーティングされた９６ウェルプレート内にプレーティングした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ１０日間～１４日間培養し、ウェル中のＢ細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡ及びセルベースアッセイを介するスクリーニングのために収集した。
【0037】
１．３：ネズミ抗体を含有する上清のスクリーニング
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓに結合するネズミ抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
上記の免疫原ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションした。続いて、プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、明らかなクローンが形成されたウェル中のＢ細胞培養上清をＥＬＩＳＡプレート内に添加し、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでヤギ抗マウス二次抗体（１：１００００）を、プレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。ネガティブコントロールのものより１０倍高いＯＤ値をポジティブの判断基準として使用し、ポジティブのクローンをＢ細胞中の抗体のシーケンシングのために採取した。
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓに結合するネズミ抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
上記の免疫原ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションした。続いて、プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、明らかなクローンが形成されたウェル中のＢ細胞培養上清をＥＬＩＳＡプレート内に添加し、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでヤギ抗マウス二次抗体（１：１００００）を、プレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。ネガティブコントロールのものより１０倍高いＯＤ値をポジティブの判断基準として使用し、ポジティブのクローンをＢ細胞中の抗体のシーケンシングのために採取した。
【0038】
実施例２：Ｂ細胞中の抗体のシーケンシング
キット中の指示に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡミニキットを使用してＢ細胞クローンからｍＲＮＡを抽出し、サブパッケージングし、－８０℃で保存した。抽出されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用し、キット中の指示に従って、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡに逆転写し、次いでこれをサブパッケージングし、－８０℃で保存した。
キット中の指示に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡミニキットを使用してＢ細胞クローンからｍＲＮＡを抽出し、サブパッケージングし、－８０℃で保存した。抽出されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用し、キット中の指示に従って、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡに逆転写し、次いでこれをサブパッケージングし、－８０℃で保存した。
【0039】
Ｅｘ Ｔａｑ酵素及び適切なプライマーを使用し、テンプレートとして上記ｃＤＮＡを用いてＶＨ配列及びＶＬ配列を増幅し、次いで、シーケンシングのため、ｐＭＤ１８Ｔベクター内に連結した。シーケンシングの際、ＶＨ配列及びＶＬ配列はそれぞれ、ｈＩｇＧ１（配列番号１０４）及びｈＫａｐｐａ（配列番号１０５）定常領域のＮ末端に構築されていた。
【0040】
実施例３：キメラ抗体の組換え発現及び活性の検出
３．１：キメラ抗体の組換え発現
同じクローン由来の軽鎖及び重鎖を対でＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、１０μｇ／ｍＬ ＭＳＸを圧スクリーニングのために添加した。細胞密度及び生存度を回復した後、細胞を流加培養（Feed-batch）発現のために接種し、発現が完了したら上清を遠心分離して、プロテインＡによって精製した。ＢＣＡ法によって抗体濃度を決定した後、得られた抗体を定量的スクリーニングのために使用した。
３．１：キメラ抗体の組換え発現
同じクローン由来の軽鎖及び重鎖を対でＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、１０μｇ／ｍＬ ＭＳＸを圧スクリーニングのために添加した。細胞密度及び生存度を回復した後、細胞を流加培養（Feed-batch）発現のために接種し、発現が完了したら上清を遠心分離して、プロテインＡによって精製した。ＢＣＡ法によって抗体濃度を決定した後、得られた抗体を定量的スクリーニングのために使用した。
【0041】
キメラ抗体は、キメラ抗体の軽鎖及び重鎖（Ｈ＋Ｌ）の由来元である細胞クローン番号にちなんで名付けた。例えば、キメラ抗体「２０４６－２Ｈ１Ｌ１」は、２０４６－２と番号付けられた細胞クローン由来のキメラ抗体を表し、その重鎖は２０４６－２Ｈ１であり、その軽鎖は２０４６－２Ｌ１である。
【0042】
３．２：ヒトＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性の検出
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションした。続いて、プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｎｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ヒト二次抗体（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を表１に示す。表１から分かるように、得られたキメラ抗体はヒトＣＤ２５に対する結合活性を有し、これは６８６のものに匹敵する。
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションした。続いて、プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｎｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ヒト二次抗体（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を表１に示す。表１から分かるように、得られたキメラ抗体はヒトＣＤ２５に対する結合活性を有し、これは６８６のものに匹敵する。
【0043】
【表1】
【0044】
３．３：ヒトＣＤ２５へのＩＬ２の結合に対するキメラ抗体の阻害活性の検出
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓタンパク質をコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、冷蔵庫内、４℃で一晩コーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液をプレート内に１００μＬ／ウェルで添加した後、室温で１時間インキュベーションし、続いてプレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄した。ビオチン－ＩＬ２（下記方法で調製した：スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン及びＩＬ２分子をモル比１０：１で均一に混合し、次いで室温で３０分間反応させ、得られた標識化溶液をＰＢＳ中で限外濾過にかけ、過剰な標識剤を除去し、次いで小包装して、超低温冷蔵庫内で凍結保存した）を１５０ｎｇ／ｍＬに希釈溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、各キメラ抗体を、開始濃度１０μｇ／ｍＬとなるように希釈溶液で希釈し、次いで３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得た。希釈したビオチン－ＩＬ２及び各希釈したキメラ抗体を１：１の比率で混合し、次いで混合物を９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、続いて室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。９６ウェルプレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を図１に示す。図１から分かるように、６８６（中国特許出願公開第１１２０２０５１４号）と同様に、得られたキメラ抗体は全て、非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
ヒトＣＤ２５－ｈｉｓタンパク質をコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、冷蔵庫内、４℃で一晩コーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液をプレート内に１００μＬ／ウェルで添加した後、室温で１時間インキュベーションし、続いてプレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄した。ビオチン－ＩＬ２（下記方法で調製した：スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン及びＩＬ２分子をモル比１０：１で均一に混合し、次いで室温で３０分間反応させ、得られた標識化溶液をＰＢＳ中で限外濾過にかけ、過剰な標識剤を除去し、次いで小包装して、超低温冷蔵庫内で凍結保存した）を１５０ｎｇ／ｍＬに希釈溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、各キメラ抗体を、開始濃度１０μｇ／ｍＬとなるように希釈溶液で希釈し、次いで３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得た。希釈したビオチン－ＩＬ２及び各希釈したキメラ抗体を１：１の比率で混合し、次いで混合物を９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、続いて室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。９６ウェルプレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を図１に示す。図１から分かるように、６８６（中国特許出願公開第１１２０２０５１４号）と同様に、得られたキメラ抗体は全て、非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
【0045】
３．４：ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対するキメラ抗体の結合活性の検出
適切な量のＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５細胞を収集し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで細胞を２．５×１０６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、１００μｌを９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに添加した。２０μｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内の細胞に１００μＬ／ウェルで添加した。抗体及び細胞を十分に混合すると、得られた混合物には、それぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬ、３．３３μｇ／ｍＬ、１．１１μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ｍＬ、０．１２μｇ／ｍＬ、０．０４１μｇ／ｍＬ、０．０１４μｇ／ｍＬ、及び０．００４６μｇ／ｍＬで抗体が含まれる。一次抗体を含まないウェルをネガティブコントロールとして設定した。４℃での６０分間のインキュベーション後、インキュベーションした細胞懸濁液を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し（２００μｌ／ウェル）、次いで細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで再懸濁した。ＦＩＴＣ標識化ロバ抗ヒト二次抗体（Jackson、カタログ番号７０９－０９５－０９８）を５μｇ／ｍｌで細胞に添加し、十分に混合し、４℃で６０分間インキュベーションした。次いでインキュベーションした細胞懸濁液を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を再び２００μｌ／ウェルのＰＢＳで再懸濁した。フローサイトメーターを使用して検出を行い、結果を表２及び図２に示す。表２及び図２から分かるように、８つのキメラ抗体では、抗体２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２及び２０４７－１０Ｈ１Ｌ２が、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対する結合活性を有し、これは６８６のものよりも明らかに高く、それらの４つのキメラ抗体が６８６よりも優れたｈＣＤ２５結合活性を有することが示された。
適切な量のＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５細胞を収集し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで細胞を２．５×１０６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、１００μｌを９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに添加した。２０μｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内の細胞に１００μＬ／ウェルで添加した。抗体及び細胞を十分に混合すると、得られた混合物には、それぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬ、３．３３μｇ／ｍＬ、１．１１μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ｍＬ、０．１２μｇ／ｍＬ、０．０４１μｇ／ｍＬ、０．０１４μｇ／ｍＬ、及び０．００４６μｇ／ｍＬで抗体が含まれる。一次抗体を含まないウェルをネガティブコントロールとして設定した。４℃での６０分間のインキュベーション後、インキュベーションした細胞懸濁液を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し（２００μｌ／ウェル）、次いで細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで再懸濁した。ＦＩＴＣ標識化ロバ抗ヒト二次抗体（Jackson、カタログ番号７０９－０９５－０９８）を５μｇ／ｍｌで細胞に添加し、十分に混合し、４℃で６０分間インキュベーションした。次いでインキュベーションした細胞懸濁液を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を再び２００μｌ／ウェルのＰＢＳで再懸濁した。フローサイトメーターを使用して検出を行い、結果を表２及び図２に示す。表２及び図２から分かるように、８つのキメラ抗体では、抗体２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２及び２０４７－１０Ｈ１Ｌ２が、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ２５に対する結合活性を有し、これは６８６のものよりも明らかに高く、それらの４つのキメラ抗体が６８６よりも優れたｈＣＤ２５結合活性を有することが示された。
【0046】
【表2】
【0047】
３．５：キメラ抗体の親和性の検出
ＢＩＡｃｏｒｅ計器Ｘ１００を使用して、キメラ抗体とヒトＣＤ２５－ｈｉｓとの間の相互作用を測定する実験を行った。実験は全てＨＢＳ－ＥＰ（１×）緩衝液中、２５℃で操作した。抗ヒスチジン抗体をアミノカップリング法によってＣＭ５チップの表面に固定化し、次いで濃度１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ２５－ｈｉｓを充填し、６０秒間捕捉した。５０ｎＭから出発して、抗ＣＤ２５抗体を含有する各溶液を２倍に希釈して、合計６つの濃度の段階希釈物を得た。希釈物を注入し、会合を１８０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターした。ｐＨ１．５のグリシン溶液を注入することによってチップを再生させた。１：１結合モデルを使用して動態データを分析した。具体的な結果を表３に示す。表３から分かるように、キメラ抗体２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２等は６８６よりも明らかに高い親和性を有する。
ＢＩＡｃｏｒｅ計器Ｘ１００を使用して、キメラ抗体とヒトＣＤ２５－ｈｉｓとの間の相互作用を測定する実験を行った。実験は全てＨＢＳ－ＥＰ（１×）緩衝液中、２５℃で操作した。抗ヒスチジン抗体をアミノカップリング法によってＣＭ５チップの表面に固定化し、次いで濃度１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ２５－ｈｉｓを充填し、６０秒間捕捉した。５０ｎＭから出発して、抗ＣＤ２５抗体を含有する各溶液を２倍に希釈して、合計６つの濃度の段階希釈物を得た。希釈物を注入し、会合を１８０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターした。ｐＨ１．５のグリシン溶液を注入することによってチップを再生させた。１：１結合モデルを使用して動態データを分析した。具体的な結果を表３に示す。表３から分かるように、キメラ抗体２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２等は６８６よりも明らかに高い親和性を有する。
【0048】
【表3】
【0049】
３．６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞を殺傷する際のキメラ抗体の活性
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離した。キメラ抗体を９６ウェルプレート内で希釈し、３８４ウェル白色／透明底細胞培養プレート（Corning、カタログ番号３７６５）内に２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２に置いた。ＡＤＣＣエフェクター細胞（ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞）を計数し、適切な量の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで培養培地内で再懸濁して、２．４×１０６細胞／ｍｌの密度を得た。密度４×１０５細胞／ｍｌのＴｒｅｇ細胞の懸濁液を、密度２．４×１０６細胞／ｍｌのＡＤＣＣエフェクター細胞の懸濁液と体積比１：１で混合した結果、得られた懸濁液中、Ｔｒｅｇ細胞の密度は２×１０５細胞／ｍｌ、ＡＤＣＣエフェクター細胞の密度は１．２×１０６細胞／ｍｌとなった。細胞（Ｅ：Ｔ＝６：１）を３８４ウェル白色／透明細胞培養プレートに２０μｌ／ウェルで添加し、これに抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（２２時間～２４時間）インキュベーションした。インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍをプレート内に４０μｌ／ウェルで添加し、マイクロプレートリーダーにおいて化学発光値を検出した。具体的な結果を表４及び図３に示す。表４及び図３から分かるように、キメラ抗体２０４６－２Ｈ１Ｌ１、２０４６－３６Ｈ２Ｌ１、２０４６－６１Ｈ１Ｌ２、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－１０Ｈ１Ｌ２等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇを殺傷する際に６８６よりも明らかに優れた活性を有する。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離した。キメラ抗体を９６ウェルプレート内で希釈し、３８４ウェル白色／透明底細胞培養プレート（Corning、カタログ番号３７６５）内に２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２に置いた。ＡＤＣＣエフェクター細胞（ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞）を計数し、適切な量の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで培養培地内で再懸濁して、２．４×１０６細胞／ｍｌの密度を得た。密度４×１０５細胞／ｍｌのＴｒｅｇ細胞の懸濁液を、密度２．４×１０６細胞／ｍｌのＡＤＣＣエフェクター細胞の懸濁液と体積比１：１で混合した結果、得られた懸濁液中、Ｔｒｅｇ細胞の密度は２×１０５細胞／ｍｌ、ＡＤＣＣエフェクター細胞の密度は１．２×１０６細胞／ｍｌとなった。細胞（Ｅ：Ｔ＝６：１）を３８４ウェル白色／透明細胞培養プレートに２０μｌ／ウェルで添加し、これに抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（２２時間～２４時間）インキュベーションした。インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍをプレート内に４０μｌ／ウェルで添加し、マイクロプレートリーダーにおいて化学発光値を検出した。具体的な結果を表４及び図３に示す。表４及び図３から分かるように、キメラ抗体２０４６－２Ｈ１Ｌ１、２０４６－３６Ｈ２Ｌ１、２０４６－６１Ｈ１Ｌ２、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－１０Ｈ１Ｌ２等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇを殺傷する際に６８６よりも明らかに優れた活性を有する。
【0050】
【表4】
【0051】
３．７：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ２によって刺激されたＴｒｅｇ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を阻害する際のキメラ抗体の活性
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、１．５ｍｌのＥＰチューブ内で培養した。抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブをネガティブコントロールとして使用し、６８６をポジティブコントロールとして使用した）をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで希釈して、１０μｇ／ｍｌの濃度を得た。抗体をＥＰチューブに２００μｌ／チューブで添加し、３０分間インキュベーションした。次いでチューブ内の上清を遠心分離によって除去し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－２ ２００μｌを各チューブに添加し、次いでこれを３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、チューブを事前に準備した氷浴上に置いて、反応を停止させ、その間に、予冷のために遠心分離機を４℃に設定した。次いでチューブ内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、その上清を廃棄した。その後、細胞を氷上で予冷したＰＢＳ＋３％ＦＢＳで１回洗浄し、１．５％パラホルムアルデヒド（４℃で予冷し、これを１００μｌ／チューブで細胞に添加した）で２０分間固定した。その後、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を洗浄し、次いで遠心分離し、上清を廃棄した。次に、－２０℃で一晩予冷した氷冷メタノールを１００μｌ／チューブでチューブに添加し、次いでこれを氷上に置いて５分間透過処理を行った。次いで、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて、固定及び透過処理したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。再び５００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を１回洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞を１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７マウス抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）抗体を細胞に５μｌ／チューブで添加した。細胞及び抗体を十分に混合し、暗所、室温で３０分～１時間インキュベーションした。上清を遠心分離によって除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いでオンマシン検出を行った。結果を図４に示す。図４から分かるように、６８６と同様に、得られたキメラ抗体は全て非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、１．５ｍｌのＥＰチューブ内で培養した。抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブをネガティブコントロールとして使用し、６８６をポジティブコントロールとして使用した）をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで希釈して、１０μｇ／ｍｌの濃度を得た。抗体をＥＰチューブに２００μｌ／チューブで添加し、３０分間インキュベーションした。次いでチューブ内の上清を遠心分離によって除去し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－２ ２００μｌを各チューブに添加し、次いでこれを３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、チューブを事前に準備した氷浴上に置いて、反応を停止させ、その間に、予冷のために遠心分離機を４℃に設定した。次いでチューブ内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、その上清を廃棄した。その後、細胞を氷上で予冷したＰＢＳ＋３％ＦＢＳで１回洗浄し、１．５％パラホルムアルデヒド（４℃で予冷し、これを１００μｌ／チューブで細胞に添加した）で２０分間固定した。その後、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を洗浄し、次いで遠心分離し、上清を廃棄した。次に、－２０℃で一晩予冷した氷冷メタノールを１００μｌ／チューブでチューブに添加し、次いでこれを氷上に置いて５分間透過処理を行った。次いで、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて、固定及び透過処理したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。再び５００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を１回洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞を１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７マウス抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）抗体を細胞に５μｌ／チューブで添加した。細胞及び抗体を十分に混合し、暗所、室温で３０分～１時間インキュベーションした。上清を遠心分離によって除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いでオンマシン検出を行った。結果を図４に示す。図４から分かるように、６８６と同様に、得られたキメラ抗体は全て非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
【0052】
３．８：マウス及びカニクイザルＣＤ２５に対するキメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性
マウスＣＤ２５－ｈｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５９０、Ｍｅｔ１－Ｌｙｓ２１３）及びカニクイザルＣＤ２５－ｈｉｓ（ＮＣＢＩ－Ｈ６ＷＳ５４、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２１３）をコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションし、次いで再びＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｎｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ヒト二次抗体（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。次いで、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を表５に示す。表５から分かるように、得られたキメラ抗体は、カニクイザルＣＤ２５に対する交差反応性を有するが、マウスＣＤ２５に対する交差反応性は有しない。
マウスＣＤ２５－ｈｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５９０、Ｍｅｔ１－Ｌｙｓ２１３）及びカニクイザルＣＤ２５－ｈｉｓ（ＮＣＢＩ－Ｈ６ＷＳ５４、Ｍｅｔ１－Ａｒｇ２１３）をコーティング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングしたプレートを取り、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液を使用して室温で１時間インキュベーションし、次いで再びＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｎｇ／ｍＬから出発して、各キメラ抗体を３倍に希釈して、合計８つの濃度の段階希釈物を得て、次いでこれを９６ウェルプレート内に５０μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ヒト二次抗体（１：１００００）を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に添加し、続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。次いで、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間発色させた。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加して、反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。結果を表５に示す。表５から分かるように、得られたキメラ抗体は、カニクイザルＣＤ２５に対する交差反応性を有するが、マウスＣＤ２５に対する交差反応性は有しない。
【0053】
【表5】
【0054】
実施例４：キメラ抗体のヒト化
８つのキメラ抗体２０４６－２Ｈ１Ｌ１、２０４６－３６Ｈ２Ｌ１、２０４６－６１Ｈ１Ｌ２、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２、及び２０４７－１０Ｈ１Ｌ２をヒト化設計用に選択した。
８つのキメラ抗体２０４６－２Ｈ１Ｌ１、２０４６－３６Ｈ２Ｌ１、２０４６－６１Ｈ１Ｌ２、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２、及び２０４７－１０Ｈ１Ｌ２をヒト化設計用に選択した。
【0055】
８つのキメラ抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を、ＩＭＧＴデータベース中のｂｌａｓｔ検索によってヒト生殖系列配列と比較した。重複遺伝子、及び非対称形成システインを含むものをヒト生殖系列遺伝子から除去した。最もマッチしたフレームワーク及びＣＤＲ領域を有する残りのものの中のヒト生殖系列遺伝子を選択し、それらのフレームワーク領域をヒトアクセプターフレームワークとして使用した。ＩＧＨＪ／ＩＧＪＫ生殖系列遺伝子の配列類似性に基づいてＦＲ－４を選択した。８つのキメラ抗体２０４６－２Ｈ１Ｌ１、２０４６－３６Ｈ２Ｌ１、２０４６－６１Ｈ１Ｌ２、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１、２０４６－２４Ｈ２Ｌ１、２０４６－１１１Ｈ２Ｌ１、２０４７－３Ｈ８Ｌ２、及び２０４７－１０Ｈ１Ｌ２について得られるヒト化配列をそれぞれ表６～表１３に示し、ＨＺ０型はＣＤＲのみを移植したものを表し、ＨＺ１型は導入された逆突然変異（複数の場合もある）を有し、ＨＺ２型及び更なる型は配列中に存在するＰＴＭ部位で試みられた突然変異（複数の場合もある）を有し、それぞれのＣＤＲ（改良Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭによって定義される）を下線で示す。
【0056】
【表6】
【0057】
【表7】
【0058】
【表8】
【0059】
【表9】
【0060】
【表10】
【0061】
【表11】
【0062】
【表12】
【0063】
【表13】
【0064】
実施例５：ヒト化抗体の組換え発現
配列番号１０４に示されるような重鎖定常領域及び配列番号１０５に示されるような軽鎖定常領域を使用して、軽鎖及び重鎖を構築し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞内に対で同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、１０μｇ／ｍＬ ＭＳＸを圧スクリーニングのために添加した。細胞密度及び生存性を回復した後、細胞を流加培養発現のために接種し、発現が完了したら上清を遠心分離して、プロテインＡによって精製した。ＢＣＡ法によって抗体濃度を決定した後、得られた抗体を定量的スクリーニングのために使用した。
配列番号１０４に示されるような重鎖定常領域及び配列番号１０５に示されるような軽鎖定常領域を使用して、軽鎖及び重鎖を構築し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞内に対で同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、１０μｇ／ｍＬ ＭＳＸを圧スクリーニングのために添加した。細胞密度及び生存性を回復した後、細胞を流加培養発現のために接種し、発現が完了したら上清を遠心分離して、プロテインＡによって精製した。ＢＣＡ法によって抗体濃度を決定した後、得られた抗体を定量的スクリーニングのために使用した。
【0065】
ヒト化抗体、並びにこのヒト化抗体に含まれる対の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を、表１４～表２１に示す。「ｉｘ」が末尾に付け加えられた名称を有する抗体は、それに応じたキメラ抗体である。
【0066】
【表14】
【0067】
【表15】
【0068】
【表16】
【0069】
【表17】
【0070】
【表18】
【0071】
【表19】
【0072】
【表20】
【0073】
【表21】
【0074】
実施例６：ヒト化抗体の親和性の検出
ＢＩＡｃｏｒｅ計器Ｘ１００を使用して、ヒト化抗体とヒトＣＤ２５－ｈｉｓとの間の相互作用を測定する実験を行った。実験は全てＨＢＳ－ＥＰ（１×）緩衝液中、２５℃で操作した。抗ヒスチジン抗体をアミノカップリング法によってＣＭ５チップの表面に固定化し、次いで濃度１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ２５－ｈｉｓを充填し、６０秒間捕捉した。５０ｎＭから出発して、抗ＣＤ２５抗体を含有する各溶液を２倍に希釈して、合計６つの濃度の段階希釈物を得た。希釈物を注入し、会合を１８０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターした。ｐＨ１．５のグリシン溶液を注入することによってチップを再生させた。１：１結合モデルを使用して動態データを分析した。具体的な結果を表２２に示す。
ＢＩＡｃｏｒｅ計器Ｘ１００を使用して、ヒト化抗体とヒトＣＤ２５－ｈｉｓとの間の相互作用を測定する実験を行った。実験は全てＨＢＳ－ＥＰ（１×）緩衝液中、２５℃で操作した。抗ヒスチジン抗体をアミノカップリング法によってＣＭ５チップの表面に固定化し、次いで濃度１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ２５－ｈｉｓを充填し、６０秒間捕捉した。５０ｎＭから出発して、抗ＣＤ２５抗体を含有する各溶液を２倍に希釈して、合計６つの濃度の段階希釈物を得た。希釈物を注入し、会合を１８０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターした。ｐＨ１．５のグリシン溶液を注入することによってチップを再生させた。１：１結合モデルを使用して動態データを分析した。具体的な結果を表２２に示す。
【0075】
【表22】
【0076】
実施例７：ＩＬ２によって刺激されたＴｒｅｇ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する際のヒト化抗体の活性
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、１．５ｍｌのＥＰチューブ内で培養した。抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブをネガティブコントロールとして使用し、６８６をポジティブコントロールとして使用した）をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで希釈して、１０μｇ／ｍｌの濃度を得た。抗体をＥＰチューブに２００μｌ／チューブで添加し、３０分間インキュベーションした。次いでチューブ内の上清を遠心分離によって除去し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－２ ２００μｌを各チューブに添加し、次いでこれを３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、チューブを事前に準備した氷浴上に置いて、反応を停止させ、その間に、予冷のために遠心分離機を４℃に設定した。次いでチューブ内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、その上清を廃棄した。その後、細胞を氷上で予冷したＰＢＳ＋３％ＦＢＳで１回洗浄し、１．５％パラホルムアルデヒド（４℃で予冷し、これを１００μｌ／チューブで細胞に添加した）で２０分間固定した。その後、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を洗浄し、次いで遠心分離し、上清を廃棄した。次に、－２０℃で一晩予冷した氷冷メタノールを１００μｌ／チューブでチューブに添加し、次いでこれを氷上に置いて５分間透過処理を行った。次いで、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて、固定及び透過処理したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。再び５００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を１回洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞を１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７マウス抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）抗体を細胞に５μｌ／チューブで添加した。細胞及び抗体を十分に混合し、暗所、室温で３０分～１時間インキュベーションした。上清を遠心分離によって除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いでオンマシン検出を行った。結果を図５に示す。図５から分かるように、６８６と同様に、得られたヒト化抗体は全て非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、１．５ｍｌのＥＰチューブ内で培養した。抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブをネガティブコントロールとして使用し、６８６をポジティブコントロールとして使用した）をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで希釈して、１０μｇ／ｍｌの濃度を得た。抗体をＥＰチューブに２００μｌ／チューブで添加し、３０分間インキュベーションした。次いでチューブ内の上清を遠心分離によって除去し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ－２ ２００μｌを各チューブに添加し、次いでこれを３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、チューブを事前に準備した氷浴上に置いて、反応を停止させ、その間に、予冷のために遠心分離機を４℃に設定した。次いでチューブ内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、その上清を廃棄した。その後、細胞を氷上で予冷したＰＢＳ＋３％ＦＢＳで１回洗浄し、１．５％パラホルムアルデヒド（４℃で予冷し、これを１００μｌ／チューブで細胞に添加した）で２０分間固定した。その後、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を洗浄し、次いで遠心分離し、上清を廃棄した。次に、－２０℃で一晩予冷した氷冷メタノールを１００μｌ／チューブでチューブに添加し、次いでこれを氷上に置いて５分間透過処理を行った。次いで、９００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて、固定及び透過処理したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。再び５００μｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳを加えて細胞を１回洗浄し、次いで３００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞を１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７マウス抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）抗体を細胞に５μｌ／チューブで添加した。細胞及び抗体を十分に混合し、暗所、室温で３０分～１時間インキュベーションした。上清を遠心分離によって除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いでオンマシン検出を行った。結果を図５に示す。図５から分かるように、６８６と同様に、得られたヒト化抗体は全て非ＩＬ２ブロッキング抗体である。
【0077】
実施例８：Ｔｒｅｇ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで殺傷する際のヒト化抗体の活性
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離した。ヒト化抗体を９６ウェルプレート内で希釈し、３８４ウェル白色／透明底細胞培養プレート（Corning、カタログ番号３７６５）内に２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２に置いた。ＡＤＣＣエフェクター細胞（ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞）を計数し、適切な量の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで培養培地内で再懸濁して、２．４×１０６細胞／ｍｌの密度を得た。密度４×１０５細胞／ｍｌのＴｒｅｇ細胞の懸濁液を、密度２．４×１０６細胞／ｍｌのＡＤＣＣエフェクター細胞の懸濁液と体積比１：１で混合した結果、得られた懸濁液中、Ｔｒｅｇ細胞の密度は２×１０５細胞／ｍｌ、ＡＤＣＣエフェクター細胞の密度は１．２×１０６細胞／ｍｌとなった。細胞（Ｅ：Ｔ＝６：１）を３８４ウェル白色／透明細胞培養プレートに２０μｌ／ウェルで添加し、これに抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（２２時間～２４時間）インキュベーションした。インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍをプレート内に４０μｌ／ウェルで添加し、マイクロプレートリーダーにおいて化学発光値を検出した。具体的な結果を表２３及び図６に示す。分かるように、ヒト化抗体２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの殺傷において６８６よりも明らかに優れた活性を有し、これは６８６のものよりも１．８５倍高かった。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞をヒトＰＢＭＣから単離した。ヒト化抗体を９６ウェルプレート内で希釈し、３８４ウェル白色／透明底細胞培養プレート（Corning、カタログ番号３７６５）内に２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２に置いた。ＡＤＣＣエフェクター細胞（ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞）を計数し、適切な量の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで培養培地内で再懸濁して、２．４×１０６細胞／ｍｌの密度を得た。密度４×１０５細胞／ｍｌのＴｒｅｇ細胞の懸濁液を、密度２．４×１０６細胞／ｍｌのＡＤＣＣエフェクター細胞の懸濁液と体積比１：１で混合した結果、得られた懸濁液中、Ｔｒｅｇ細胞の密度は２×１０５細胞／ｍｌ、ＡＤＣＣエフェクター細胞の密度は１．２×１０６細胞／ｍｌとなった。細胞（Ｅ：Ｔ＝６：１）を３８４ウェル白色／透明細胞培養プレートに２０μｌ／ウェルで添加し、これに抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（２２時間～２４時間）インキュベーションした。インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍをプレート内に４０μｌ／ウェルで添加し、マイクロプレートリーダーにおいて化学発光値を検出した。具体的な結果を表２３及び図６に示す。分かるように、ヒト化抗体２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの殺傷において６８６よりも明らかに優れた活性を有し、これは６８６のものよりも１．８５倍高かった。
【0078】
【表23】
【0079】
実施例９：野生型マウスにおけるヒト化抗体の薬物動態学
順応期間後、３０匹のマウスを、各５匹のマウスの６つの群にランダムに分けた。グループ分けに従ってマウスに腹腔内投与し、投与時間を記録した。各群のマウスの血液を、投与前（０時間）、並びに投与の４時間後、８時間後、２４時間後（１日後）、７２時間後（３日後）、１２０時間後（５日後）、１６８時間後（７日後）、２４０時間後（１０日後）、２８８時間後（１２日後）、及び３３６時間後（１４日後）にサンプリングし、血清を収集して－６０℃～－８０℃で保存した。
順応期間後、３０匹のマウスを、各５匹のマウスの６つの群にランダムに分けた。グループ分けに従ってマウスに腹腔内投与し、投与時間を記録した。各群のマウスの血液を、投与前（０時間）、並びに投与の４時間後、８時間後、２４時間後（１日後）、７２時間後（３日後）、１２０時間後（５日後）、１６８時間後（７日後）、２４０時間後（１０日後）、２８８時間後（１２日後）、及び３３６時間後（１４日後）にサンプリングし、血清を収集して－６０℃～－８０℃で保存した。
【0080】
マウスにおけるＰＫ研究のための血液薬剤濃度を以下のように検出した。
（１）コーティング。ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをＰＢＳ（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、次いでフィルムで密封した。プレートを２℃～８℃で１５時間～２０時間置き、次いでＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４）を含む）で３回洗浄した。
（２）ブロッキング及び乾燥。プレートを、２００μＬ／ウェルのＮ５０２で、室温で１時間～２時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を吸い取った後、プレートを２５℃で１時間超、インキュベーター中で乾燥させ、次いで、直ちに使用するか、又はフィルムで密封し、２℃～８℃で保存した。
（３）標準曲線のプロット及び品質管理に使用される標準の調製。マウス血漿（ＥＤＴＡ－Ｋ）を使用して、抗体試料を１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した後、１５ｎｇ／ｍＬまで、２倍勾配希釈した（１０００ｎｇ／ｍＬを含めて７つの濃度）。加えて、標準曲線をプロットするために使用されたものと同じ抗体試料を、それぞれ１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び２０ｎｇ／ｍＬの濃度まで定量的に希釈することで、これらの希釈物を品質管理（ＱＣ）として使用した。
（４）検出される試料の調製。異なる血液サンプリング時点の試料を得て、標準曲線をプロットするために使用される濃度範囲内の濃度にマウス血漿で希釈した。
（５）標準、品質管理及び試料の希釈。標準、品質管理及び試料を０．１％カゼイン（ＰＢＳで調製、ｐＨ６．２）で１０倍希釈（例えば１０μＬを９０μＬで希釈）し、乾燥したプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、試料あたり２つの複製物を作製した。プレートをフィルムで密封し、室温で２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４））で３回洗浄した。
（６）二次抗体とのインキュベーション。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを１０％ヤギ血清で５００００倍希釈し、プレートに５０μＬ／ウェルで添加し、次いでこれを密封し、室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４））で３回洗浄した。
（７）発色。室温に温めておいたＴＭＢを５０μＬ／ウェルでプレートに添加して、暗所で２０分間発色させた。
（８）反応停止及びＯＤ値の読み取り。２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルでプレート内に添加し、次いで軽く叩いて硫酸を均一に混合した。６５０ｎｍを参照として、４５０ｎｍで測定されたＯＤ読み取り値を使用して、試験した各試料の濃度を計算した。
（１）コーティング。ヒトＣＤ２５－ｈｉｓをＰＢＳ（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、次いでフィルムで密封した。プレートを２℃～８℃で１５時間～２０時間置き、次いでＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４）を含む）で３回洗浄した。
（２）ブロッキング及び乾燥。プレートを、２００μＬ／ウェルのＮ５０２で、室温で１時間～２時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を吸い取った後、プレートを２５℃で１時間超、インキュベーター中で乾燥させ、次いで、直ちに使用するか、又はフィルムで密封し、２℃～８℃で保存した。
（３）標準曲線のプロット及び品質管理に使用される標準の調製。マウス血漿（ＥＤＴＡ－Ｋ）を使用して、抗体試料を１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した後、１５ｎｇ／ｍＬまで、２倍勾配希釈した（１０００ｎｇ／ｍＬを含めて７つの濃度）。加えて、標準曲線をプロットするために使用されたものと同じ抗体試料を、それぞれ１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び２０ｎｇ／ｍＬの濃度まで定量的に希釈することで、これらの希釈物を品質管理（ＱＣ）として使用した。
（４）検出される試料の調製。異なる血液サンプリング時点の試料を得て、標準曲線をプロットするために使用される濃度範囲内の濃度にマウス血漿で希釈した。
（５）標準、品質管理及び試料の希釈。標準、品質管理及び試料を０．１％カゼイン（ＰＢＳで調製、ｐＨ６．２）で１０倍希釈（例えば１０μＬを９０μＬで希釈）し、乾燥したプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、試料あたり２つの複製物を作製した。プレートをフィルムで密封し、室温で２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４））で３回洗浄した。
（６）二次抗体とのインキュベーション。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを１０％ヤギ血清で５００００倍希釈し、プレートに５０μＬ／ウェルで添加し、次いでこれを密封し、室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４））で３回洗浄した。
（７）発色。室温に温めておいたＴＭＢを５０μＬ／ウェルでプレートに添加して、暗所で２０分間発色させた。
（８）反応停止及びＯＤ値の読み取り。２Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルでプレート内に添加し、次いで軽く叩いて硫酸を均一に混合した。６５０ｎｍを参照として、４５０ｎｍで測定されたＯＤ読み取り値を使用して、試験した各試料の濃度を計算した。
【0081】
実験結果は、６つの抗体が１５０時間より長い半減期を有することを示した。具体的な結果を図７に示す。
【0082】
実施例１０：ＭＣ３８大腸癌細胞を移植したＢ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウスである動物モデルにおけるヒト化抗体の有効性試験
１０．１：腫瘍阻害の分析
ＰＢＳ中に再懸濁させたＭＣ３８細胞を、Ｂ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウス（Biocytogen）の右脇腹領域に、５×１０５細胞／０．１ｍＬ、マウス１匹当たり０．１ｍＬの濃度で皮下接種した。平均腫瘍体積が１５０±５０ｍｍ３に達したら、腫瘍体積及びマウスの体重に基づき適切なマウスを選択し、各群に６匹のマウスを含む６つの実験群に均等に分配した。投与はグループ分け当日より開始した（５ｍｇ／ｋｇ、週１回、計３回腹腔内注射した）。グループ分けの後、ノギスを使用して腫瘍体積を週に２回測定し、マウスを安楽死させる前にも測定した。各腫瘍の長径及び短径を測定し、腫瘍体積＝０．５×長径×短径２により腫瘍体積を算出した。結果から、対照群と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群及び６８６を投与した群が最も優れた阻害効果を示し、腫瘍増殖阻害率が８０％を超え、これに続いて２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２及び２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群ではいずれも腫瘍増殖阻害率がおよそ７０％となることが示された。具体的な結果を図８に示す。
１０．１：腫瘍阻害の分析
ＰＢＳ中に再懸濁させたＭＣ３８細胞を、Ｂ－ｈＩＬ２ＲＡヒト化マウス（Biocytogen）の右脇腹領域に、５×１０５細胞／０．１ｍＬ、マウス１匹当たり０．１ｍＬの濃度で皮下接種した。平均腫瘍体積が１５０±５０ｍｍ３に達したら、腫瘍体積及びマウスの体重に基づき適切なマウスを選択し、各群に６匹のマウスを含む６つの実験群に均等に分配した。投与はグループ分け当日より開始した（５ｍｇ／ｋｇ、週１回、計３回腹腔内注射した）。グループ分けの後、ノギスを使用して腫瘍体積を週に２回測定し、マウスを安楽死させる前にも測定した。各腫瘍の長径及び短径を測定し、腫瘍体積＝０．５×長径×短径２により腫瘍体積を算出した。結果から、対照群と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群及び６８６を投与した群が最も優れた阻害効果を示し、腫瘍増殖阻害率が８０％を超え、これに続いて２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２及び２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群ではいずれも腫瘍増殖阻害率がおよそ７０％となることが示された。具体的な結果を図８に示す。
【0083】
１０．２：腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の分析
グループ分けの２１日後、マウスの腫瘍内にリンパ球浸潤が観察された。ＴＩＬを分析するために腫瘍を採取し、結果を図９に示す（図中、ｍはマウスを意味する）。対照群（ＰＢＳ）と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群、６８６を投与した群、及び２０４７－１０Ｈ２Ｌ２を投与した群は全て、明らかに少ないＴｒｅｇを示した。これは抗体がＴｒｅｇを枯渇させるメカニズムと一致するものである。更なる分析により、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群及び２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群におけるＴｒｅｇ数の減少がより顕著であったことが示された。さらに、対照群と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群、６８６を投与した群、及び２０４７－１０Ｈ２Ｌ２を投与した群はいずれも、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ及びグランザイムＢ＋ＣＤ８＋Ｔｅｆｆの数の一定の増加を示し、これによってこれらの非ＩＬ２ブロッキング性抗ＣＤ２５抗体が、Ｔｒｅｇを枯渇させることに加えて、腫瘍微小環境を是正し、またＴｅｆｆの割合及び殺傷能力を高めることができることが示された。
グループ分けの２１日後、マウスの腫瘍内にリンパ球浸潤が観察された。ＴＩＬを分析するために腫瘍を採取し、結果を図９に示す（図中、ｍはマウスを意味する）。対照群（ＰＢＳ）と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群、６８６を投与した群、及び２０４７－１０Ｈ２Ｌ２を投与した群は全て、明らかに少ないＴｒｅｇを示した。これは抗体がＴｒｅｇを枯渇させるメカニズムと一致するものである。更なる分析により、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群及び２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群におけるＴｒｅｇ数の減少がより顕著であったことが示された。さらに、対照群と比較して、２０４６－１８Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－１１１Ｈ１Ｌ１－ｍ２を投与した群、２０４６－３６Ｈ１Ｌ１を投与した群、６８６を投与した群、及び２０４７－１０Ｈ２Ｌ２を投与した群はいずれも、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ及びグランザイムＢ＋ＣＤ８＋Ｔｅｆｆの数の一定の増加を示し、これによってこれらの非ＩＬ２ブロッキング性抗ＣＤ２５抗体が、Ｔｒｅｇを枯渇させることに加えて、腫瘍微小環境を是正し、またＴｅｆｆの割合及び殺傷能力を高めることができることが示された。
【0084】
本発明の実施形態に関する以上の説明は、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で本発明に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【配列表】
【国際調査報告】