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特表2024-532836抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＴＧＦ－βＲを含む融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＴＧＦ－βＲを含む融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240903BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240903BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240903BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20240903BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240903BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240903BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240903BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/47 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/62 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/13
C07K16/30
C07K14/715
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P37/04
A61K47/68
A61K39/395 U
A61K38/17
A61K45/00
A61K31/4709
A61K31/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509425
(86)(22)【出願日】2022-08-22
(85)【翻訳文提出日】2024-04-08
(86)【国際出願番号】 CN2022113882
(87)【国際公開番号】W WO2023020625
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】202110961038.5
(32)【優先日】2021-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519063026
【氏名又は名称】中山康方生物医▲藥▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＥＳＯ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６ Ｓｈｅｎｎｏｎｇ Ｒｏａｄ，Ｔｏｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２８４３７ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ワン チョンミン
(72)【発明者】
【氏名】チャン ポン
(72)【発明者】
【氏名】リー パイヨン
(72)【発明者】
【氏名】シア ユイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA41
4C084BA44
4C084CA53
4C084DC50
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB021
4C084ZB091
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC202
4C084ZC751
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC02
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD63
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG06
4C086AA01
4C086BC28
4C086GA07
4C086GA13
4C086GA14
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB02
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＴＧＦ－βＲを含む融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び使用。具体的には、ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及びＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；を含む融合タンパク質であって、前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり；前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号３～５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８～１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；融合タンパク質が開示される。融合タンパク質は、ＴＩＧＩＴの阻害及びＴＧＦ－β濃度の減少を同時に可能にし、抗腫瘍薬の調製に対して優れた潜在能力を有する。
【選択図】図７
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及びＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号３～５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８～１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
融合タンパク質。
【請求項2】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含み；前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、及び配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む；
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；又は、
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、マウス以外の種に由来する、例えばヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８５７等）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８６１．１等）であり、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８３４等）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
リガンドＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンに対する結合能が対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ４）よりも高い、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記融合タンパク質が、ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃに対し、０．０８ｎＭ未満又は０．１０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し；好ましくは前記ＥＣ５０が間接ＥＬＩＳＡによって測定される；請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、又はＴＧＦ－β３に対し、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、好ましくは前記ＥＣ５０が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）においてＣＣＴＣＣ番号Ｃ２０２０２０８で寄託されているハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９によって製造される抗体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖定常領域が、ＥＵ番号方式に基づき、次の変異の組み合わせ：Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は、
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；
の１つを有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；好ましくは、前記ＴＧＦ－β受容体が、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩであるか、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域であるか、又はＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域の短縮断片であり；
好ましくは、前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む；
請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖が配列番号２７又は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記第１タンパク質機能領域と前記第２タンパク質機能領域とが直接又はリンカー断片を介して連結している、請求項１～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数であり、好ましくはｎが１、２、３、４、５、又は６である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域の数が、それぞれ独立に１個、２個、又はそれよりも多い個数である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ＴＧＦ－β受容体又はその細胞外断片が、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖のＣ末端に連結している、請求項１～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及びＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり、前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖が、配列番号２７又は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖のＣ末端にリンカー断片を介して連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が配列番号４４のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離核酸分子。
【請求項20】
請求項１９に記載の単離核酸分子を含む、ベクター。
【請求項21】
請求項１９に記載の単離核酸分子又は請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項22】
融合タンパク質部分及び結合物部分（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｉｅｔｙ）を含む複合体であって、前記融合タンパク質部分が請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質であり、前記結合物部分が検出可能な標識であり、好ましくは前記結合物部分が放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質、又は酵素である、複合体。
【請求項23】
試料中のＴＩＧＩＴ及び／又はＴＧＦ－βの存在又は濃度を検出するためのキットの調製における、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の複合体の使用。
【請求項24】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の複合体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項25】
１つ又は複数の抗腫瘍化学療法薬をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物であって、好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がチロシンキナーゼ阻害剤であり、より好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がアンロチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（塩酸塩等）、又はレンバチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（メシル酸塩等）である、医薬組成物。
【請求項26】
前記医薬組成物の単位用量が、前記融合タンパク質の質量ベースで１００ｍｇ～１５００ｍｇ、２００ｍｇ～１０００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～６００ｍｇ、４００ｍｇ～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、請求項２４又は２５に記載の医薬組成物。
【請求項27】
別個のパッケージ内の第１製品及び第２製品を含む組合せ製品であって、前記第１製品が、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の複合体、又は請求項２４～２６のいずれか１項に記載の医薬組成物を含み；
前記第２製品が、１つ又は複数の抗腫瘍化学療法薬を含み、好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬が、チロシンキナーゼ阻害剤であり、より好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬が、アンロチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（塩酸塩等）、又はレンバチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（メシル酸塩等）であり；
好ましくは、前記第１製品及び前記第２製品が、独立に、１つ又は複数の薬理学的に許容される副原料をさらに含み；
好ましくは、前記組合せ製品がさらに添付文書を含む；
組合せ製品。
【請求項28】
前記第１製品の単位用量が、前記融合タンパク質の質量ベースで１００ｍｇ～１５００ｍｇ、２００ｍｇ～１０００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～６００ｍｇ、４００ｍｇ～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、請求項２７に記載の組合せ製品。
【請求項29】
前記第２製品の単位用量が、活性成分の質量ベースで０．１ｍｇ～１００ｍｇ、０．５ｍｇ～５０ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、２ｍｇ～１５ｍｇ、４ｍｇ～１２ｍｇ又は８ｍｇ～１２ｍｇである、請求項２７又は２８に記載の組合せ製品。
【請求項30】
腫瘍の治療及び／又は予防のための薬剤の調製における、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の複合体の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
使用。
【請求項31】
腫瘍の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の複合体であって、好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
融合タンパク質又は複合体。
【請求項32】
腫瘍を治療及び／又は予防するための方法であって、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項２２に記載の複合体の有効量を、前記治療及び／又は予防を必要とする対象に投与する工程を含み；好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の分野に属し、抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＴＧＦ－βＲを含む融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン；ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３、又はＶＳＩＧ９としても知られる）は、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）／ネクチンファミリーのメンバーである。ＴＩＧＩＴは、細胞外免疫グロブリン可変領域（ＩｇＶ）ドメイン、Ｉ型膜貫通ドメイン、並びに、古典的な免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫グロブリンテールチロシン（ＩＴＴ）モチーフを有する細胞内ドメインからなる。ＴＩＧＩＴは、リンパ球において、特に、エフェクター及び制御ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、濾胞ヘルパーＣＤ４＋ Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞や、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において、特に高度に発現している（Yu X, Harden K, Gonzalez L C, et al., The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells.[J]. Nature immunology, 2009, 10(1):48）。
【0003】
ＣＤ１５５（ＰＶＲ、Ｎｅｃｌ５、又はＴａｇｅ４としても知られる）、ＣＤ１１２（ＰＶＲＬ２／ネクチン２としても知られる）、及びＣＤ１１３（ＰＶＲＬ３としても知られる）は、ＴＩＧＩＴが結合するリガンドであり（Martinet L, Smyth M J., Balancing natural killer cell activation through paired receptors.[J]. Nature Reviews Immunology, 2015, 15(4):243-254）、これらのうちＣＤ１５５はＴＩＧＩＴに対する高親和性のリガンドである。ＮＫ細胞では、ＴＩＧＩＴがリガンドＣＤ１５５及びＣＤ１１２へ結合すると、ＣＤ１５５及びＣＤ１１２高発現細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果が阻害される（Stanietsky N, Simic H, Arapovic J, et al., The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(42):17858-17863）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の殺傷効果は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴが同時にブロックされた場合に増強されることが報告されている（Johnston R J, Comps-Agrar L, Hackney J, et al., The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8+ T cell effector function.[J]. Cancer cell, 2014, 26(6):923-937）。近年の研究では、ＮＫ細胞の免疫チェックポイントとしてのＴＩＧＩＴが、腫瘍増殖過程においてＮＫ細胞の消耗をもたらしうることが明らかになっている。また、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体によってＮＫ細胞の消耗を逆転させることが可能であり、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、及び形質細胞腫などの各種腫瘍の免疫療法にそれら抗体を利用できることが示されている（Zhang Q, Bi J, Zheng X, et al., Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity.[J]. Nature immunology, 2018, 19(7):723-732）。
【0004】
さらに、ＴＩＧＩＴブロッカーは単独で、又はそれをＰＤ－１ブロッカー及びＣＤ９６ブロッカーと組み合わせることで、野生型及びＣＤ１５５－／－マウスモデルのＢ１６メラノーマの増殖を有意に減少させうることが報告された（Li X-Y, Das I, Lepletier A, et al., CD155 loss enhances tumor suppression via combined host and tumor-intrinsic mechanisms. J Clin Invest, 2018, 128:2613-25）。ＣＤ１１２Ｒブロッカーは単独で、又はそれにＴＩＧＩＴブロッカー及び／又はＰＤ－１ブロッカーを組み合わせることで、卵巣がん、子宮内膜がん、及び肺腫瘍におけるＴＩＬのサイトカイン産生能を高めることができた（Whelan S, Ophir E, Kotturi MF, et al., PVRIG and PVRL2 Are Induced in Cancer and Inhibit CD8+ T-cell function. Cancer Immunol Res, 2019, 7:257-68）。
【0005】
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは機能的に多様なサイトカインのクラスであり、さらにＴＧＦ－β、アクチビン、インヒビン、増殖分化因子（ＧＤＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、Ｎｏｄａｌ、Ｌｅｆｔｙ、及び抗Ｍｕｌｌｅｒｉａｎホルモンなどのサブファミリーに分けられる（表Ａ）。ＴＧＦ－βサブファミリーには３種のタンパク質、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３がそれぞれ知られており、中でもＴＧＦ－β１が最も高発現のサブタイプである。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３が受容体に結合すると、Ｓｍａｄ及び非Ｓｍａｄシグナル伝達経路を介して多様な生物学的応答が媒介される。その例として、上皮間葉移行（ＥＭＴ）、組織線維化促進（pro-tissue fibrosis）、血管新生促進（pro-angiogenesis）、腫瘍促進性免疫回避、並びに、がん阻害及び促進二重作用（cancer inhibition and promotion dual action）が挙げられる（J Massague. TGFbeta in Cancer.[J]. Cell, 2008, 134(2):215-230）。
【0006】
ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦ－βＲ）は、ヒトの正常及び腫瘍細胞表面上に広範に分布し、３種の受容体スーパーファミリーを含む。これらのうち、古典的なＴＧＦ－β受容体ファミリーＩ型はＡＬＫ１～７を含み、ＴＧＦ－βＲＩ（ＴβＲＩとも呼ばれる）はＡＬＫ５としても知られており；古典的なＴＧＦ－β受容体ファミリーＩＩ型はＴＧＦ－βＲＩＩ（ＴβＲＩＩとも記される）、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＭＨＲＩＩ、及びＢＭＰＲＩＩを含み；ＴＧＦ－β受容体スーパーファミリーＩＩＩ型はベータグリカン（ＴＧＦ－βＲＩＩＩとしても知られる）及びエンドグリンを含み；ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、及びＴＧＦ－βＲＩＩＩはそれぞれ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３に結合することができる（Pawlak John B, Blobe Gerard C, TGF-β superfamily co-receptors in cancer. DevDyn, 2021）。ＴＧＦ－βファミリー及び受容体を表Ａに示す（Carl-Henrik Heldin1 and Aristidis Moustakas. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016に基づく総説による要約）。ＴＧＦ－βＲＩ及びＴＧＦ－βＲＩＩは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ受容体である。ＴＧＦ－βＲＩＩは、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路におけるシグナル伝達の鍵となる分子として、高い親和性でＴＧＦ－βに結合して、ＴＧＦ－βＲＩ二量体とヘテロ四量体受容体を形成することができ、その後、自己リン酸化によってリン酸化されてＴＧＦ－βＲＩを活性化する。活性化されたＴＧＦ－βＲＩは、下流のＳｍａｄ経路関連タンパク質をリン酸化し、下流標的遺伝子の転写と翻訳を調節し、さらに、疾患と関連した生物学的応答を引き起こす。ＴＧＦ－βＲＩ及びＴＧＦ－βＲＩＩと比較して、ＴＧＦ－βＲＩＩＩはＴＧＦ－βに対する親和性が弱く、また、細胞内セグメントを有しない。そのため、下流シグナル伝達経路へと接続されない。ＴＧＦ－βＲＩＩＩの機能は、ＴＧＦ－βを捕捉し、ＴＧＦ－βＲＩＩに対して提示することである。他のＴＧＦ－β受容体もＴＧＦ－βに結合することができる（Sang Xiaohong et al., Advances in researches on small molecule inhibitors targeting TGF-β and receptors.[J]. Journal of Pharmacy, 2019(9)）。
【表1-1】
【表1-2】
【0007】
腫瘍の進行中には、腫瘍細胞、間葉線維芽細胞、及び他の細胞が、多量のＴＧＦ－βを腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中に分泌し、免疫抑制を媒介する。ＴＧＦ－βは、ナイーブＴ細胞が、抗腫瘍活性を媒介するＴｈ１へと分化するのを阻害し、ＴＧＦ－βＲＩＩ欠失Ｔ細胞は増強されたＴｈ１応答を有する（Eduard, Batlle, Joan, et al., Transforming Growth Factor-β Signaling in Immunity and Cancer.[J]. Immunity, 2019）。腫瘍殺傷活性を有するエフェクターＴ細胞のグランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、γ－インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、及びＦａｓＬは、ＴＧＦ－βの活性下で発現量が減少し、その結果、腫瘍細胞の免疫回避が生ずる。Ｔｒｅｇは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）による腫瘍免疫抑制を媒介する鍵となる細胞であり、腫瘍殺傷活性を有するエフェクターＴ細胞の機能を阻害することができる。腫瘍細胞によって産生されたＴＧＦ－βは、多量のＴｒｅｇをＴＭＥ中に生じさせ、腫瘍抗原に対する寛容性を高め、腫瘍免疫回避の生成を促進する（Chen Dan, Ran Yan. Advance in researches on the regulation and control of tumor cells and tumor-associated immune cells by TGF-β.[J]. Modern Medicine & Health, 2020, 36(09):1354-1358）。現在臨床試験中の、ＴＧＦ－β分子を標的とする、研究中の抗体医薬は、黒色腫、腎細胞がん、乳がん、子宮頸がん、進行性非小細胞肺がん、前立腺がん、膵管腺がん、進行性固形腫瘍、及び転移性固形腫瘍を適応症とする。
【0008】
Ｆｃ受容体は、特定の免疫細胞の表面上で発現する免疫グロブリンファミリーに属し、抗体Ｆｃ領域を認識して免疫応答を媒介する。Ｆａｂ領域が抗原を認識すると、抗体のＦｃ領域が免疫細胞（キラー細胞など）上のＦｃ受容体に結合して、その免疫細胞の応答機能、例えば食作用やＡＤＣＣなどを開始させる。
【0009】
Ｆｃ受容体が認識する抗体の種類、及び発現細胞の種類により、Ｆｃ受容体は主にＦｃγＲ、ＦｃαＲ、及びＦｃεＲの３種に分類される。ＦｃγＲはさらに、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）の４つのサブタイプに分類することができる。これらのうち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩは、ＡＤＣＣ効果と密接に関連している。ＦｃγＲＩＩＩはＡＤＣＣを媒介する最も優勢な分子であり、異なる細胞型において、高度に相同な２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂがある。ＦｃγＲＩＩＩａ集団には、高親和性のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８、及び低親和性のＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８という、一塩基多型（ＳＮＰ）の部位で区別される２つのサブタイプが存在する。ＦｃγＲＩはＩｇＧのＦｃ領域に対して高い親和性を有し、ＡＤＣＣプロセスに関与する。ＦｃγＲＩＩはＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩｃ（それぞれＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、及びＣＤ３２ｃとも称される）という３つのサブタイプを含み、これらのうちＦｃγＲＩＩａはＡＤＣＣ活性を有する。ＦｃγＲＩＩａについては、一塩基変異により、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１及びＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１という２つのサブタイプがヒトに存在する。ＦｃγＲＩＩｂは抑制性受容体であり、近傍のＩＴＡＭ経路を阻害する典型的な抑制性ＦｃγＲである。例えば、ＢＣＲへの免疫複合体の結合後、Ｆｃ断片は同じ細胞上のＦｃγＲＩＩｂへ結合し、Ｂ細胞活性化を負に調節し、抗体及びサイトカインの分泌を減少させる（Hogarth PM, Pietersz GA., 2012, NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, 11(4):311-331）。
【0010】
現在、ＴＩＧＩＴ及びＴＧＦ－βシグナル伝達経路の両者を阻害する薬物の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【0011】
本願発明者らは鋭意研究を重ね、創造的な努力を行うことによって、抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＴＧＦ－βＲを含む融合タンパク質を作製し、驚くべきことに、この融合タンパク質が、ＴＩＧＩＴ及びＴＧＦ－βに効果的に同時に結合可能であり、抗腫瘍薬の調製におけるポテンシャルを有することを見出した。本発明を以下に詳細に説明する。
【0012】
本発明の一態様は、
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号３～５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８～１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
融合タンパク質に関する。
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号３～５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８～１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
融合タンパク質に関する。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、及び配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、及び配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；又は、
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；又は、
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖抗体（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）から選択される、融合タンパク質が提供される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、マウス以外の種に由来する、例えばヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、融合タンパク質が提供される。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８５７等）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８６１．１等）であり、軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８３４等）である、融合タンパク質が提供される。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態では、リガンドＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンに対する結合能が対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ４）よりも高い融合タンパク質が提供される。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質が、ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃに対し、０．０８ｎＭ未満又は０．１０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、好ましくは前記ＥＣ５０が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、融合タンパク質が提供される。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及び／又はＴＧＦ－β３に対し、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、好ましくは前記ＥＣ５０が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、融合タンパク質が提供される。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）においてＣＣＴＣＣ番号Ｃ２０２０２０８で寄託されているハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９によって製造される抗体である、融合タンパク質が提供される。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖定常領域が、ＥＵ番号方式に基づき、次の変異の組み合わせ：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は、
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；
の１つを有する、融合タンパク質が提供される。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は、
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；
の１つを有する、融合タンパク質が提供される。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態では、
前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；
好ましくは、前記ＴＧＦ－β受容体が、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩであるか、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域であるか、又はＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域の短縮断片（ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり；
好ましくは、前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；
好ましくは、前記ＴＧＦ－β受容体が、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩであるか、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域であるか、又はＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、もしくはＴＧＦ－βＲＩＩＩの細胞外領域の短縮断片（ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり；
好ましくは、前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質が提供される。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖が配列番号２７又は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質が提供される。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１タンパク質機能領域と前記第２タンパク質機能領域とが直接又はリンカー断片を介して連結している、融合タンパク質が提供される。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態では、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数であり、好ましくはｎが１、２、３、４、５、又は６である、融合タンパク質が提供される。
【0027】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域の数が、それぞれ独立に１個、２個、又はそれよりも多い個数である、融合タンパク質が提供される。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＴＧＦ－β受容体又はその細胞外断片が、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖のＣ末端に連結している、融合タンパク質が提供される。
【0029】
本発明は、
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり、前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖が配列番号２７又は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖のＣ末端にリンカー断片を介して連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が配列番号４４のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質に関する。
ＴＩＧＩＴを標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＴＧＦ－β結合活性を有する第２タンパク質機能領域；
を含む融合タンパク質であって、
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合性断片であり、前記第２タンパク質機能領域が、ＴＧＦ－β受容体、その細胞外領域、又はＴＧＦ－β受容体機能を有するＴＧＦ－β受容体細胞外領域の短縮断片であり；
前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖が配列番号２７又は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み；
前記第２タンパク質機能領域が、前記抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖のＣ末端にリンカー断片を介して連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が配列番号４４のアミノ酸配列を含む；
融合タンパク質に関する。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は腫瘍の治療及び／又は予防のために使用され、
好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんは進行性非小細胞肺がんである。
好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんは進行性非小細胞肺がんである。
【0031】
広義には、本発明の融合タンパク質を抗体と称してよい。
【0032】
本発明の他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質をコードする、単離核酸分子に関する。
【0033】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子を含むベクターに関する。
【0034】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子又は本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【0035】
本発明のさらなる他の一態様は、融合タンパク質部分及び結合物部分（conjugated moiety）を含む複合体であって、前記融合タンパク質部分が本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質であり、前記結合物部分が検出可能な標識であり、好ましくは前記結合物部分が放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質、又は酵素である、複合体に関する。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態では、前記複合体は腫瘍の治療及び／又は予防のために使用され、
好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんは進行性非小細胞肺がんである。
好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんは進行性非小細胞肺がんである。
【0037】
本発明のさらなる他の一態様は、試料中のＴＩＧＩＴ及び／又はＴＧＦ－βの存在又は濃度を検出するためのキットの調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）における、本発明の融合タンパク質又は本発明の複合体の使用に関する。
【0038】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質又は本発明の複合体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態では、前記医薬組成物は１つ又は複数の抗腫瘍化学療法薬をさらに含み、好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬はチロシンキナーゼ阻害剤であり、より好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬はアンロチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（塩酸塩等）、又はレンバチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（メシル酸塩等）である。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態では、前記医薬組成物の単位用量が、前記融合タンパク質の質量ベースで１００ｍｇ～１５００ｍｇ、２００ｍｇ～１０００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～６００ｍｇ、４００ｍｇ～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、医薬組成物が提供される。
【0041】
本発明のいくつかの実施形態では、前記医薬組成物は注射剤である。
【0042】
本発明のさらなる他の一態様は、
別個のパッケージ内の第１製品及び第２製品を含む組合せ製品であって、
前記第１製品が、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質、本発明の複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の医薬組成物を含み；
前記第２製品が、１つ又は複数の抗腫瘍化学療法薬を含み、好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がチロシンキナーゼ阻害剤であり、より好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がアンロチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（塩酸塩等）、又はレンバチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（メシル酸塩等）であり；
好ましくは、前記第１製品及び前記第２製品が、独立に、１つ又は複数の薬理学的に許容される副原料（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）をさらに含み；
好ましくは、前記組合せ製品がさらに添付文書を含む；
組合せ製品に関する。
別個のパッケージ内の第１製品及び第２製品を含む組合せ製品であって、
前記第１製品が、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質、本発明の複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の医薬組成物を含み；
前記第２製品が、１つ又は複数の抗腫瘍化学療法薬を含み、好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がチロシンキナーゼ阻害剤であり、より好ましくは、前記抗腫瘍化学療法薬がアンロチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（塩酸塩等）、又はレンバチニブもしくはその薬理学的に許容される塩（メシル酸塩等）であり；
好ましくは、前記第１製品及び前記第２製品が、独立に、１つ又は複数の薬理学的に許容される副原料（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）をさらに含み；
好ましくは、前記組合せ製品がさらに添付文書を含む；
組合せ製品に関する。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１製品の単位用量が、前記融合タンパク質の質量ベースで１００ｍｇ～１５００ｍｇ、２００ｍｇ～１０００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～６００ｍｇ、４００ｍｇ～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、組合せ製品が提供される。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第２製品の単位用量が、活性成分の質量ベースで０．１ｍｇ～１００ｍｇ、０．５ｍｇ～５０ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、２ｍｇ～１５ｍｇ、４ｍｇ～１２ｍｇ又は８ｍｇ～１２ｍｇである、組合せ製品が提供される。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１製品及び前記第２製品が独立に注射剤である、治療用組合せ（therapeutic combination）が提供される。
【0046】
本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍の治療及び／又は予防のための薬剤の調製における、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質又は本発明の複合体の使用であって、
好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
使用に関する。
好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
使用に関する。
【0047】
本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍を治療及び／又は予防するための方法であって、本発明のいずれかの実施形態の融合タンパク質又は本発明の複合体の有効量を、前記治療及び／又は予防を必要とする対象に投与する工程を含み；
好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
方法に関する。
好ましくは、前記腫瘍が、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、膵臓がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、形質細胞腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵管腺がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記非小細胞肺がんが進行性非小細胞肺がんである；
方法に関する。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のいずれかの実施形態の医薬組成物の有効量を、外科的治療の前もしくは後、及び／又は放射線治療の前もしくは後に、その投与を必要とする対象に投与する工程を含む方法が提供される。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態では、
本発明の融合タンパク質の単位用量が、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは１～１０ｍｇであり、又は、前記融合タンパク質の単位用量が、各対象において１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇ、もしくは２００ｍｇであり；
好ましくは前記用量が３日、４日、５日、６日、１０日、１週間、２週間、又は３週間ごとに１回投与され；
好ましくは投与経路が点滴静注又は静脈注射である；
方法が提供される。
本発明の融合タンパク質の単位用量が、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは１～１０ｍｇであり、又は、前記融合タンパク質の単位用量が、各対象において１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇ、もしくは２００ｍｇであり；
好ましくは前記用量が３日、４日、５日、６日、１０日、１週間、２週間、又は３週間ごとに１回投与され；
好ましくは投与経路が点滴静注又は静脈注射である；
方法が提供される。
【0050】
軽鎖及び重鎖の可変領域が抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含んでおり、重鎖（Ｈ）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。本発明において、ＣＤＲはＩＭＧＴ番号付けシステムによって定義される（Ehrenmann F, Kaas Q, and Lefranc M P., IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.[J]. Nucleic acids research, 2009; 38(suppl_1):D301-D307を参照）。
【0051】
以下のモノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、当業者に周知の技術的手段によって、例えばＩＭＧＴ定義に従って、分析される。結果は以下の通りである：
マウスＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ
ＨＣＤＲ１：ＧＨＳＦＴＳＤＹＡ（配列番号３）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＹＳＤＳＴ（配列番号４）
ＨＣＤＲ３：ＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹ（配列番号５）
ＬＣＤＲ１：ＱＨＶＳＴＡ（配列番号８）
ＬＣＤＲ２：ＳＡＳ（配列番号９）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１０）
マウスＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ
ＨＣＤＲ１：ＧＨＳＦＴＳＤＹＡ（配列番号３）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＹＳＤＳＴ（配列番号４）
ＨＣＤＲ３：ＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹ（配列番号５）
ＬＣＤＲ１：ＱＨＶＳＴＡ（配列番号８）
ＬＣＤＲ２：ＳＡＳ（配列番号９）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１０）
【0052】
ヒト化ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の３個のＨＣＤＲと３個のＬＣＤＲは、マウスＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のものと同一である。
【0053】
本発明において、他に定義されない限り、本明細書内で使用される科学及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されるルーチン手順である。一方、本発明の理解を促すために、関連のある語の定義及び説明を以下に提供する。
【0054】
本明細書で使用されるＥＣ５０という語は、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こしうる濃度のことを指す。
【0055】
本明細書で使用される「抗体」という語は、一般に２対のポリペプチド鎖からなる（それぞれの対が１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖を有する）免疫グロブリン分子のことを指す。抗体軽鎖はκ及びλ軽鎖へと分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεへと分類される。抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域と定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結しており、重鎖はさらに、約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への結合を、例えば免疫系の各種細胞（エフェクター細胞など）の、古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を、媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細かく分けることができ、超可変領域間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存的な領域が分布している。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて次の順番で並んだ、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。領域又はドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Bethesda M.d., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, (1987 and 1991))もしくはChothia & Lesk J. Mol. Biol., 1987; 196:901-917;Chothia et al., Nature, 1989; 342:878-883、又は、ＩＭＧＴ番号付けシステムの定義（Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P., IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.[J]. Nucleic acids research, 2009; 38(suppl_1):D301-D307における定義を参照）に基づいて行われる。
【0056】
「抗体」という語は、抗体を製造するためのいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体には、組み換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ（例えばサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭなどの、各種アイソタイプの抗体であってよい。
【0057】
本明細書で使用される「ｍＡｂ」又は「モノクローナル抗体」という語は、高度に相同な抗体分子のグループに由来する、すなわち、自然に生じうる天然の変異を例外として同一の抗体分子のグループに由来する、抗体又は抗体の断片のことを指す。モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と異なり、ポリクローナル抗体は、通常、ある抗原上の異なるエピトープを一般に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は一般に、Kohler et al.（Kohler G, Milstein C., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.[J]. Nature, 1975; 256(5517):495）によって最初に報告されたハイブリドーマ技術を用いて取得することができるが、組み換えＤＮＡ技術を用いても取得することができる（米国特許第４８１６５６７号明細書などを参照）。
【0058】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という語は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲの全体又は部分を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置き換えた場合に得られる抗体又は抗体断片のことを指し、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性、又は反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラット、もしくはウサギ）抗体であってよい。さらに、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）におけるいくつかのアミノ酸残基も、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基又は他の抗体のアミノ酸残基に置換し、抗体の性能をさらに改善又は最適化することができる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えばJones et al., Nature, 1986; 321:522-525、Reichmann et al., Nature, 1988; 332:323-329、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992; 2:593-596、及びClark, Immunol. Today, 2000; 21:397-402を参照のこと。いくつかのケースでは、抗体の抗原結合性断片はダイアボディであり、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現する。しかし、使用されるリンカーは短いため、同一鎖上の２つのドメインのペアリングは起こりえない。そのため、ドメインは他の鎖上の相補ドメインとペアリングすることとなり、２個の抗原結合部位が生成する（例えばHolliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90:6444-6448及びPoljak R.J. et al., Structure, 1994; 2:1121-1123を参照）。
【0059】
本明細書に記載する融合タンパク質は、ＤＮＡ組み換えによって２個の遺伝子を同時発現させたタンパク質産物である。抗体及び抗原結合性断片を製造及び精製するための方法は当該分野で周知であり、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressの第５～８章及び１５章に記載されている。
【0060】
本明細書で使用される「単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）」という語は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーによって連結した分子のことを指す。ＶＬ及びＶＨドメインはペアを成し、それらドメインが単一ポリペプチド鎖を生成することを可能にするリンカーによって一価の分子が形成される（例えば、Bird et al., Science, 1988; 242:423-426及びHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85:5879-5883を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は次の一般構造を有していてよい：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー断片－ＶＨ－ＣＯＯＨ、又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー断片－ＶＬ－ＣＯＯＨ。従来技術の適切なリンカーは、ＧＧＧＧＳアミノ酸配列の反復、又はそのバリアントからなる。例えば、（ＧＧＧＧＳ）４のアミノ酸配列を有するリンカーを用いてもよく、そのバリアントを用いてもよい（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90:6444-6448）。本発明において使用できる他のリンカーが、Alfthan et al., Protein Eng., 1995; 8:725-731、Choi et al., Eur. J. Immunol., 2001; 31:94-106、Hu et al., Cancer Res., 1996; 56:3055-3061、Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 1999; 293:41-56、及びRoovers et al., Cancer Immunology, Immunotherapy, 2001, 50(1):51-59.に記載されている。
【0061】
本明細書で使用される「単離される」という語は、天然状態から人為手段によって取得されることを指す。特定の「単離される」物質又は成分が天然に存在する場合に、その天然環境において変化が生ずることであってもよく、天然環境から単離されることであってもよく、その両者であってもよい。例えば、単離されていない特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが特定の動物生体中に天然に存在し、このような天然状態から高純度の同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドが単離された場合、それを単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ぶ。「単離される」という語は、前記物質の活性に影響を及ぼさない、人工もしくは合成物質、又は他の不純物の存在を除外するものではない。
【0062】
本明細書で使用される「ベクター」という語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルのことを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントが宿主細胞で発現できるように、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、例として、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ；及び、動物ウイルス；などが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用しうる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）などが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、発現を調節するための各種エレメントを含んでいてよく、それらの例として、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。
【0063】
本明細書で使用される「宿主細胞」という語は、そこにベクターを導入できる細胞のことを指し、例として、Ｅ． ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核細胞；酵母細胞もしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌細胞；Ｓ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞もしくはＳｆ９などの昆虫細胞；又は、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはヒト細胞などの動物細胞；が挙げられるが、これらに限定されない。
【0064】
本発明において、「ＡＤＣＰ」という語は、抗体依存性細胞食作用のことを指す。細胞表面抗原に結合する抗体のＦｃ断片は、マクロファージなどの食作用活性細胞のＦｃ受容体に結合し、その結果、食細胞による、抗体が結合した細胞に対する食作用が媒介される。
【0065】
本発明において、「ＡＤＣＣ」という語は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のことを指す。抗体のＦａｂ断片がウイルス感染細胞又は腫瘍細胞のエピトープに結合し、その抗体のＦｃ断片がキラー細胞（ＮＫ細胞及びマクロファージなど）表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合して、キラー細胞による標的細胞の直接殺傷を媒介する。
【0066】
本発明において、「ＣＤＣ」という語は、補体依存性細胞傷害のことを指す。抗体が、細胞膜表面上の対応する抗原に特異的に結合すると、複合体が形成され、補体系が活性化される。その後、ＭＡＣが標的細胞表面上に形成され、続いて標的細胞の溶解がおこる結果となる。補体は各種細菌及び他の病原性生物の溶解を引き起こす場合があり、病原性生物の感染に対する重要な防御メカニズムである。
【0067】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という語は、２つの分子間の非無作為的な結合反応、例えば抗体とその標的となる抗原との間の反応などのことを指す。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（又は、ある抗原に対して特異的な抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、又は１０－１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
【0068】
本明細書で使用される「ＫＤ」という語は、特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数のことを指し、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。解離平衡定数が小さいことは、抗体－抗原結合が強く、抗体と抗原との間の親和性が高いことを表す。一般に、抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、又は１０－１０Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（ＴＩＧＩＴタンパク質など）に結合する。ＫＤは、例えばＦｏｒｔｅｂｉｏシステムの使用など、当業者に公知の方法を用いて決定することができる。
【0069】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語と「ｍＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。「ポリクローナル抗体」という語と「ｐＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。また、本明細書において、アミノ酸は通常、当該分野で公知の１文字又は３文字略号を使用して表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。
【0070】
本明細書で使用される「薬理学的に許容される副原料」という語は、対象及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合した、当該分野で周知の担体及び／又は賦形剤（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）のことを指し、例として、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤の限定されない例として、リン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤の限定されない例として、陽イオン、陰イオン、又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０が挙げられ、イオン強度増強剤の限定されない例として、塩化ナトリウムが挙げられる。
【0071】
本明細書で使用される「有効量」という語は、所望の効果を得るのに、又は少なくとも部分的に得るのに、充分な量のことを指す。例えば、疾患（腫瘍など）に対する予防的有効量とは、その疾患（腫瘍など）の発症を予防、抑止、又は遅延するのに充分な量のことを指し、治療有効量とは、その疾患に罹患している患者において、疾患又はその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑止するのに充分な量のことを指す。そのような有効量を決定することは、疑いもなく当業者の能力の範囲内である。例えば、治療目的における有効量は、治療しようとする疾患の重症度；患者自身の免疫系の全体的な状態；年齢、体重、及び性別などの患者の一般的な条件；投与経路；並びに同時に行われる他の治療；などによって決まる。
【0072】
本発明において、「第１」（例えば、第１タンパク質機能領域又は第１製品）及び「第２」（例えば、第２タンパク質機能領域又は第２製品）という語は、特に断りのない限り、表現上の区別又は明瞭性のために用いられ、典型的な順序の意味は有しない。
【0073】
本発明の有益な効果
本発明は以下の技術的効果（１）～（９）のいずれか１つ以上を達成する。
（１）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＩＧＩＴの阻害及びＴＧＦ－β濃度の減少を同時に可能にする。
（２）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＩＧＩＴに極めて特異的に結合することができ、ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合を極めて効果的にブロックすることができ、生物におけるＴＩＧＩＴの免疫抑制を特異的に緩和することができる。
（３）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＧＦ－βに極めて特異的に結合することができ、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β受容体への結合を極めて効果的にブロックすることができ、生物におけるＴＧＦ－βによる免疫抑制を特異的に緩和し、免疫応答を活性化することができる。
（４）本発明の融合タンパク質が抗腫瘍薬の調製に対して高いポテンシャルを有する。
（５）本発明の融合タンパク質の第１タンパク質機能領域及び第２タンパク質機能領域が相乗効果を有し、その効果が、いずれかのタンパク質機能領域を単独で使用した融合タンパク質と比べて優れている。
（６）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、及び／もしくはＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８、及び／もしくはＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する結合活性を完全に取り除いたものであり、且つ、ＡＤＣＣ活性又はＡＤＣＰ活性を取り除いたものである。
（７）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、補体Ｃ１ｑに対する結合活性を完全に取り除いたものであり、且つ、ＣＤＣ活性を完全に取り除いたものである。
（８）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１及びＴＦ０２の両者が、ＴＩＧＩＴによって誘導された免疫細胞の免疫抑制を効果的にブロックすることができ、且つ、細胞のＩＬ－２分泌を誘導することができる。
（９）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、ＴＧＦ－βによって誘導された免疫細胞の免疫抑制を効果的にブロックすることができ、且つ、細胞のＩＮＦ－γ分泌を誘導することができる。
本発明は以下の技術的効果（１）～（９）のいずれか１つ以上を達成する。
（１）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＩＧＩＴの阻害及びＴＧＦ－β濃度の減少を同時に可能にする。
（２）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＩＧＩＴに極めて特異的に結合することができ、ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合を極めて効果的にブロックすることができ、生物におけるＴＩＧＩＴの免疫抑制を特異的に緩和することができる。
（３）本発明の融合タンパク質（例えばＴＦ０１又はＴＦ０２）が、ＴＧＦ－βに極めて特異的に結合することができ、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β受容体への結合を極めて効果的にブロックすることができ、生物におけるＴＧＦ－βによる免疫抑制を特異的に緩和し、免疫応答を活性化することができる。
（４）本発明の融合タンパク質が抗腫瘍薬の調製に対して高いポテンシャルを有する。
（５）本発明の融合タンパク質の第１タンパク質機能領域及び第２タンパク質機能領域が相乗効果を有し、その効果が、いずれかのタンパク質機能領域を単独で使用した融合タンパク質と比べて優れている。
（６）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、及び／もしくはＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８、及び／もしくはＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する結合活性を完全に取り除いたものであり、且つ、ＡＤＣＣ活性又はＡＤＣＰ活性を取り除いたものである。
（７）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、補体Ｃ１ｑに対する結合活性を完全に取り除いたものであり、且つ、ＣＤＣ活性を完全に取り除いたものである。
（８）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１及びＴＦ０２の両者が、ＴＩＧＩＴによって誘導された免疫細胞の免疫抑制を効果的にブロックすることができ、且つ、細胞のＩＬ－２分泌を誘導することができる。
（９）本発明の融合タンパク質、特にＴＦ０１が、ＴＧＦ－βによって誘導された免疫細胞の免疫抑制を効果的にブロックすることができ、且つ、細胞のＩＮＦ－γ分泌を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【0074】
【発明を実施するための形態】
【0075】
寄託された生物材料：
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９（ＴＩＧＩＴ－２６Ｂ１２）を、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ番号Ｃ２０２０２０８のもと、２０２０年１０月２３日付けで寄託した。寄託機関のアドレスは、郵便番号４３００７２ 中華人民共和国 武漢 武漢大学である。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９（ＴＩＧＩＴ－２６Ｂ１２）を、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ番号Ｃ２０２０２０８のもと、２０２０年１０月２３日付けで寄託した。寄託機関のアドレスは、郵便番号４３００７２ 中華人民共和国 武漢 武漢大学である。
【0076】
本発明は、次の配列１～４８に関する。
１． ２６Ｂ１２ＶＨのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＲＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＭＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１）
２． ２６Ｂ１２ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２）
３． ＨＣＤＲ１：
ＧＨＳＦＴＳＤＹＡ（配列番号３）
４． ＨＣＤＲ２：
ＩＳＹＳＤＳＴ（配列番号４）
５． ＨＣＤＲ３：
ＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹ（配列番号５）
６． ２６Ｂ１２ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＳＨＥＦＭＳＴＳＬＲＤＲＶＳＩＴＣＫＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）
７． ２６Ｂ１２ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ（配列番号７）
８． ＬＣＤＲ１：
ＱＨＶＳＴＡ（配列番号８）
９． ＬＣＤＲ２：
ＳＡＳ（配列番号９）
１０． ＬＣＤＲ３：
ＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１０）
１１． ２６Ｂ１２Ｈ１ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１１）
１２． ２６Ｂ１２Ｈ１ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１２）
１３． ２６Ｂ１２Ｈ２ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１３）
１４． ２６Ｂ１２Ｈ２ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１４）
１５． ２６Ｂ１２Ｈ３ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１５）
１６． ２６Ｂ１２Ｈ３ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１６）
１７． ２６Ｂ１２Ｈ４ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１７）
１８． ２６Ｂ１２Ｈ４ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１８）
１９． ２６Ｂ１２Ｌ１ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＫＳＬＳＴＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９）
２０． ２６Ｂ１２Ｌ１ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２０）
２１． ２６Ｂ１２Ｌ２ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２１）
２２． ２６Ｂ１２Ｌ２ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２２）
２３． ２６Ｂ１２Ｌ３ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２３）
２４． ２６Ｂ１２Ｌ３ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２４）
２５． ２６Ｂ１２Ｌ４ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＫＳＭＳＴＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２５）
２６． ２６Ｂ１２Ｌ４ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２６）
２７． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２７）
２８． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ（配列番号２８）
２９． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２９）
３０． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号３０）
３１． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）
３２． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号３２）
３３． ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域の短縮断片のアミノ酸配列
ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３３）
３４． ＴＧＦ－βＲＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＩＨＨＲＶＰＮＥＥＤＰＳＬＤＲＰＦＩＳＥＧＴＴＬＫＤＬＩＹＤＭＴＴＳＧＳＧＳＧＬＰＬＬＶＱＲＴＩＡＲＴＩＶＬＱＥＳＩＧＫＧＲＦＧＥＶＷＲＧＫＷＲＧＥＥＶＡＶＫＩＦＳＳＲＥＥＲＳＷＦＲＥＡＥＩＹＱＴＶＭＬＲＨＥＮＩＬＧＦＩＡＡＤＮＫＤＮＧＴＷＴＱＬＷＬＶＳＤＹＨＥＨＧＳＬＦＤＹＬＮＲＹＴＶＴＶＥＧＭＩＫＬＡＬＳＴＡＳＧＬＡＨＬＨＭＥＩＶＧＴＱＧＫＰＡＩＡＨＲＤＬＫＳＫＮＩＬＶＫＫＮＧＴＣＣＩＡＤＬＧＬＡＶＲＨＤＳＡＴＤＴＩＤＩＡＰＮＨＲＶＧＴＫＲＹＭＡＰＥＶＬＤＤＳＩＮＭＫＨＦＥＳＦＫＲＡＤＩＹＡＭＧＬＶＦＷＥＩＡＲＲＣＳＩＧＧＩＨＥＤＹＱＬＰＹＹＤＬＶＰＳＤＰＳＶＥＥＭＲＫＶＶＣＥＱＫＬＲＰＮＩＰＮＲＷＱＳＣＥＡＬＲＶＭＡＫＩＭＲＥＣＷＹＡＮＧＡＡＲＬＴＡＬＲＩＫＫＴＬＳＱＬＳＱＱＥＧＩＫＭ（配列番号３４）
３５． ＴＧＦ－βＲＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬ（配列番号３５）
３６． ＴＧＦ－βＲＩＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ（配列番号３６）
３７． ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ（配列番号３７）
３８． ＴＧＦ－βＲＩＩＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＴＳＨＹＶＩＡＩＦＡＬＭＳＳＣＬＡＴＡＧＰＥＰＧＡＬＣＥＬＳＰＶＳＡＳＨＰＶＱＡＬＭＥＳＦＴＶＬＳＧＣＡＳＲＧＴＴＧＬＰＱＥＶＨＶＬＮＬＲＴＡＧＱＧＰＧＱＬＱＲＥＶＴＬＨＬＮＰＩＳＳＶＨＩＨＨＫＳＶＶＦＬＬＮＳＰＨＰＬＶＷＨＬＫＴＥＲＬＡＴＧＶＳＲＬＦＬＶＳＥＧＳＶＶＱＦＳＳＡＮＦＳＬＴＡＥＴＥＥＲＮＦＰＨＧＮＥＨＬＬＮＷＡＲＫＥＹＧＡＶＴＳＦＴＥＬＫＩＡＲＮＩＹＩＫＶＧＥＤＱＶＦＰＰＫＣＮＩＧＫＮＦＬＳＬＮＹＬＡＥＹＬＱＰＫＡＡＥＧＣＶＭＳＳＱＰＱＮＥＥＶＨＩＩＥＬＩＴＰＮＳＮＰＹＳＡＦＱＶＤＩＴＩＤＩＲＰＳＱＥＤＬＥＶＶＫＮＬＩＬＩＬＫＣＫＫＳＶＮＷＶＩＫＳＦＤＶＫＧＳＬＫＩＩＡＰＮＳＩＧＦＧＫＥＳＥＲＳＭＴＭＴＫＳＩＲＤＤＩＰＳＴＱＧＮＬＶＫＷＡＬＤＮＧＹＳＰＩＴＳＹＴＭＡＰＶＡＮＲＦＨＬＲＬＥＮＮＡＥＥＭＧＤＥＥＶＨＴＩＰＰＥＬＲＩＬＬＤＰＧＡＬＰＡＬＱＮＰＰＩＲＧＧＥＧＱＮＧＧＬＰＦＰＦＰＤＩＳＲＲＶＷＮＥＥＧＥＤＧＬＰＲＰＫＤＰＶＩＰＳＩＱＬＦＰＧＬＲＥＰＥＥＶＱＧＳＶＤＩＡＬＳＶＫＣＤＮＥＫＭＩＶＡＶＥＫＤＳＦＱＡＳＧＹＳＧＭＤＶＴＬＬＤＰＴＣＫＡＫＭＮＧＴＨＦＶＬＥＳＰＬＮＧＣＧＴＲＰＲＷＳＡＬＤＧＶＶＹＹＮＳＩＶＩＱＶＰＡＬＧＤＳＳＧＷＰＤＧＹＥＤＬＥＳＧＤＮＧＦＰＧＤＭＤＥＧＤＡＳＬＦＴＲＰＥＩＶＶＦＮＣＳＬＱＱＶＲＮＰＳＳＦＱＥＱＰＨＧＮＩＴＦＮＭＥＬＹＮＴＤＬＦＬＶＰＳＱＧＶＦＳＶＰＥＮＧＨＶＹＶＥＶＳＶＴＫＡＥＱＥＬＧＦＡＩＱＴＣＦＩＳＰＹＳＮＰＤＲＭＳＨＹＴＩＩＥＮＩＣＰＫＤＥＳＶＫＦＹＳＰＫＲＶＨＦＰＩＰＱＡＤＭＤＫＫＲＦＳＦＶＦＫＰＶＦＮＴＳＬＬＦＬＱＣＥＬＴＬＣＴＫＭＥＫＨＰＱＫＬＰＫＣＶＰＰＤＥＡＣＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮＫＫＴＦＴＫＰＬＡＶＩＨＨＥＡＥＳＫＥＫＧＰＳＭＫＥＰＮＰＩＳＰＰＩＦＨＧＬＤＴＬＴＶＭＧＩＡＦＡＡＦＶＩＧＡＬＬＴＧＡＬＷＹＩＹＳＨＴＧＥＴＡＧＲＱＱＶＰＴＳＰＰＡＳＥＮＳＳＡＡＨＳＩＧＳＴＱＳＴＰＣＳＳＳＳＴＡ（配列番号３８）
３９． ＴＧＦ－βＲＩＩＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＧＰＥＰＧＡＬＣＥＬＳＰＶＳＡＳＨＰＶＱＡＬＭＥＳＦＴＶＬＳＧＣＡＳＲＧＴＴＧＬＰＱＥＶＨＶＬＮＬＲＴＡＧＱＧＰＧＱＬＱＲＥＶＴＬＨＬＮＰＩＳＳＶＨＩＨＨＫＳＶＶＦＬＬＮＳＰＨＰＬＶＷＨＬＫＴＥＲＬＡＴＧＶＳＲＬＦＬＶＳＥＧＳＶＶＱＦＳＳＡＮＦＳＬＴＡＥＴＥＥＲＮＦＰＨＧＮＥＨＬＬＮＷＡＲＫＥＹＧＡＶＴＳＦＴＥＬＫＩＡＲＮＩＹＩＫＶＧＥＤＱＶＦＰＰＫＣＮＩＧＫＮＦＬＳＬＮＹＬＡＥＹＬＱＰＫＡＡＥＧＣＶＭＳＳＱＰＱＮＥＥＶＨＩＩＥＬＩＴＰＮＳＮＰＹＳＡＦＱＶＤＩＴＩＤＩＲＰＳＱＥＤＬＥＶＶＫＮＬＩＬＩＬＫＣＫＫＳＶＮＷＶＩＫＳＦＤＶＫＧＳＬＫＩＩＡＰＮＳＩＧＦＧＫＥＳＥＲＳＭＴＭＴＫＳＩＲＤＤＩＰＳＴＱＧＮＬＶＫＷＡＬＤＮＧＹＳＰＩＴＳＹＴＭＡＰＶＡＮＲＦＨＬＲＬＥＮＮＡＥＥＭＧＤＥＥＶＨＴＩＰＰＥＬＲＩＬＬＤＰＧＡＬＰＡＬＱＮＰＰＩＲＧＧＥＧＱＮＧＧＬＰＦＰＦＰＤＩＳＲＲＶＷＮＥＥＧＥＤＧＬＰＲＰＫＤＰＶＩＰＳＩＱＬＦＰＧＬＲＥＰＥＥＶＱＧＳＶＤＩＡＬＳＶＫＣＤＮＥＫＭＩＶＡＶＥＫＤＳＦＱＡＳＧＹＳＧＭＤＶＴＬＬＤＰＴＣＫＡＫＭＮＧＴＨＦＶＬＥＳＰＬＮＧＣＧＴＲＰＲＷＳＡＬＤＧＶＶＹＹＮＳＩＶＩＱＶＰＡＬＧＤＳＳＧＷＰＤＧＹＥＤＬＥＳＧＤＮＧＦＰＧＤＭＤＥＧＤＡＳＬＦＴＲＰＥＩＶＶＦＮＣＳＬＱＱＶＲＮＰＳＳＦＱＥＱＰＨＧＮＩＴＦＮＭＥＬＹＮＴＤＬＦＬＶＰＳＱＧＶＦＳＶＰＥＮＧＨＶＹＶＥＶＳＶＴＫＡＥＱＥＬＧＦＡＩＱＴＣＦＩＳＰＹＳＮＰＤＲＭＳＨＹＴＩＩＥＮＩＣＰＫＤＥＳＶＫＦＹＳＰＫＲＶＨＦＰＩＰＱＡＤＭＤＫＫＲＦＳＦＶＦＫＰＶＦＮＴＳＬＬＦＬＱＣＥＬＴＬＣＴＫＭＥＫＨＰＱＫＬＰＫＣＶＰＰＤＥＡＣＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮＫＫＴＦＴＫＰＬＡＶＩＨＨＥＡＥＳＫＥＫＧＰＳＭＫＥＰＮＰＩＳＰＰＩＦＨＧＬＤＴＬＴＶ（配列番号３９）
４０． チラゴルマブの重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４０）
４１． チラゴルマブの軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４１）
４２． ＲＧ６０５８（ｈＧ４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）
４３． ＲＧ６０５８（ｈＧ４）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４３）
４４． リンカー断片のアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４４）
４５． 抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＥＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＴＴＹＷＩＥＷＩＫＱＲＰＧＨＳＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＤＳＴＹＹＮＥＫＶＫＧＫＶＴＦＴＡＤＡＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＧＦＹＶＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号４５）
４６． 抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＳＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＴＳＱＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＴＥＤＦＧＶＹＦＣＱＱＳＧＳＷＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４６）
４７． ＲＧ６０５８（Ｇ１ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４７）
４８． ＲＧ６０５８（Ｇ１ＤＭ）の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４８）
１． ２６Ｂ１２ＶＨのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＲＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＭＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１）
２． ２６Ｂ１２ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２）
３． ＨＣＤＲ１：
ＧＨＳＦＴＳＤＹＡ（配列番号３）
４． ＨＣＤＲ２：
ＩＳＹＳＤＳＴ（配列番号４）
５． ＨＣＤＲ３：
ＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹ（配列番号５）
６． ２６Ｂ１２ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＳＨＥＦＭＳＴＳＬＲＤＲＶＳＩＴＣＫＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）
７． ２６Ｂ１２ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ（配列番号７）
８． ＬＣＤＲ１：
ＱＨＶＳＴＡ（配列番号８）
９． ＬＣＤＲ２：
ＳＡＳ（配列番号９）
１０． ＬＣＤＲ３：
ＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１０）
１１． ２６Ｂ１２Ｈ１ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１１）
１２． ２６Ｂ１２Ｈ１ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１２）
１３． ２６Ｂ１２Ｈ２ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１３）
１４． ２６Ｂ１２Ｈ２ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１４）
１５． ２６Ｂ１２Ｈ３ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１５）
１６． ２６Ｂ１２Ｈ３ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１６）
１７． ２６Ｂ１２Ｈ４ＶＨのアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１７）
１８． ２６Ｂ１２Ｈ４ＶＨのヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１８）
１９． ２６Ｂ１２Ｌ１ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＫＳＬＳＴＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９）
２０． ２６Ｂ１２Ｌ１ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２０）
２１． ２６Ｂ１２Ｌ２ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２１）
２２． ２６Ｂ１２Ｌ２ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２２）
２３． ２６Ｂ１２Ｌ３ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２３）
２４． ２６Ｂ１２Ｌ３ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２４）
２５． ２６Ｂ１２Ｌ４ＶＬのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＫＳＭＳＴＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２５）
２６． ２６Ｂ１２Ｌ４ＶＬのヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２６）
２７． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２７）
２８． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ（配列番号２８）
２９． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＨＶＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２９）
３０． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号３０）
３１． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＨＳＦＴＳＤＹＡＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＤＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＹＧＮＹＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）
３２． ２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号３２）
３３． ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域の短縮断片のアミノ酸配列
ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３３）
３４． ＴＧＦ－βＲＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＩＨＨＲＶＰＮＥＥＤＰＳＬＤＲＰＦＩＳＥＧＴＴＬＫＤＬＩＹＤＭＴＴＳＧＳＧＳＧＬＰＬＬＶＱＲＴＩＡＲＴＩＶＬＱＥＳＩＧＫＧＲＦＧＥＶＷＲＧＫＷＲＧＥＥＶＡＶＫＩＦＳＳＲＥＥＲＳＷＦＲＥＡＥＩＹＱＴＶＭＬＲＨＥＮＩＬＧＦＩＡＡＤＮＫＤＮＧＴＷＴＱＬＷＬＶＳＤＹＨＥＨＧＳＬＦＤＹＬＮＲＹＴＶＴＶＥＧＭＩＫＬＡＬＳＴＡＳＧＬＡＨＬＨＭＥＩＶＧＴＱＧＫＰＡＩＡＨＲＤＬＫＳＫＮＩＬＶＫＫＮＧＴＣＣＩＡＤＬＧＬＡＶＲＨＤＳＡＴＤＴＩＤＩＡＰＮＨＲＶＧＴＫＲＹＭＡＰＥＶＬＤＤＳＩＮＭＫＨＦＥＳＦＫＲＡＤＩＹＡＭＧＬＶＦＷＥＩＡＲＲＣＳＩＧＧＩＨＥＤＹＱＬＰＹＹＤＬＶＰＳＤＰＳＶＥＥＭＲＫＶＶＣＥＱＫＬＲＰＮＩＰＮＲＷＱＳＣＥＡＬＲＶＭＡＫＩＭＲＥＣＷＹＡＮＧＡＡＲＬＴＡＬＲＩＫＫＴＬＳＱＬＳＱＱＥＧＩＫＭ（配列番号３４）
３５． ＴＧＦ－βＲＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬ（配列番号３５）
３６． ＴＧＦ－βＲＩＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ（配列番号３６）
３７． ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ（配列番号３７）
３８． ＴＧＦ－βＲＩＩＩのアミノ酸配列：（下線部は細胞外領域の配列）
ＭＴＳＨＹＶＩＡＩＦＡＬＭＳＳＣＬＡＴＡＧＰＥＰＧＡＬＣＥＬＳＰＶＳＡＳＨＰＶＱＡＬＭＥＳＦＴＶＬＳＧＣＡＳＲＧＴＴＧＬＰＱＥＶＨＶＬＮＬＲＴＡＧＱＧＰＧＱＬＱＲＥＶＴＬＨＬＮＰＩＳＳＶＨＩＨＨＫＳＶＶＦＬＬＮＳＰＨＰＬＶＷＨＬＫＴＥＲＬＡＴＧＶＳＲＬＦＬＶＳＥＧＳＶＶＱＦＳＳＡＮＦＳＬＴＡＥＴＥＥＲＮＦＰＨＧＮＥＨＬＬＮＷＡＲＫＥＹＧＡＶＴＳＦＴＥＬＫＩＡＲＮＩＹＩＫＶＧＥＤＱＶＦＰＰＫＣＮＩＧＫＮＦＬＳＬＮＹＬＡＥＹＬＱＰＫＡＡＥＧＣＶＭＳＳＱＰＱＮＥＥＶＨＩＩＥＬＩＴＰＮＳＮＰＹＳＡＦＱＶＤＩＴＩＤＩＲＰＳＱＥＤＬＥＶＶＫＮＬＩＬＩＬＫＣＫＫＳＶＮＷＶＩＫＳＦＤＶＫＧＳＬＫＩＩＡＰＮＳＩＧＦＧＫＥＳＥＲＳＭＴＭＴＫＳＩＲＤＤＩＰＳＴＱＧＮＬＶＫＷＡＬＤＮＧＹＳＰＩＴＳＹＴＭＡＰＶＡＮＲＦＨＬＲＬＥＮＮＡＥＥＭＧＤＥＥＶＨＴＩＰＰＥＬＲＩＬＬＤＰＧＡＬＰＡＬＱＮＰＰＩＲＧＧＥＧＱＮＧＧＬＰＦＰＦＰＤＩＳＲＲＶＷＮＥＥＧＥＤＧＬＰＲＰＫＤＰＶＩＰＳＩＱＬＦＰＧＬＲＥＰＥＥＶＱＧＳＶＤＩＡＬＳＶＫＣＤＮＥＫＭＩＶＡＶＥＫＤＳＦＱＡＳＧＹＳＧＭＤＶＴＬＬＤＰＴＣＫＡＫＭＮＧＴＨＦＶＬＥＳＰＬＮＧＣＧＴＲＰＲＷＳＡＬＤＧＶＶＹＹＮＳＩＶＩＱＶＰＡＬＧＤＳＳＧＷＰＤＧＹＥＤＬＥＳＧＤＮＧＦＰＧＤＭＤＥＧＤＡＳＬＦＴＲＰＥＩＶＶＦＮＣＳＬＱＱＶＲＮＰＳＳＦＱＥＱＰＨＧＮＩＴＦＮＭＥＬＹＮＴＤＬＦＬＶＰＳＱＧＶＦＳＶＰＥＮＧＨＶＹＶＥＶＳＶＴＫＡＥＱＥＬＧＦＡＩＱＴＣＦＩＳＰＹＳＮＰＤＲＭＳＨＹＴＩＩＥＮＩＣＰＫＤＥＳＶＫＦＹＳＰＫＲＶＨＦＰＩＰＱＡＤＭＤＫＫＲＦＳＦＶＦＫＰＶＦＮＴＳＬＬＦＬＱＣＥＬＴＬＣＴＫＭＥＫＨＰＱＫＬＰＫＣＶＰＰＤＥＡＣＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮＫＫＴＦＴＫＰＬＡＶＩＨＨＥＡＥＳＫＥＫＧＰＳＭＫＥＰＮＰＩＳＰＰＩＦＨＧＬＤＴＬＴＶＭＧＩＡＦＡＡＦＶＩＧＡＬＬＴＧＡＬＷＹＩＹＳＨＴＧＥＴＡＧＲＱＱＶＰＴＳＰＰＡＳＥＮＳＳＡＡＨＳＩＧＳＴＱＳＴＰＣＳＳＳＳＴＡ（配列番号３８）
３９． ＴＧＦ－βＲＩＩＩ細胞外領域のアミノ酸配列
ＧＰＥＰＧＡＬＣＥＬＳＰＶＳＡＳＨＰＶＱＡＬＭＥＳＦＴＶＬＳＧＣＡＳＲＧＴＴＧＬＰＱＥＶＨＶＬＮＬＲＴＡＧＱＧＰＧＱＬＱＲＥＶＴＬＨＬＮＰＩＳＳＶＨＩＨＨＫＳＶＶＦＬＬＮＳＰＨＰＬＶＷＨＬＫＴＥＲＬＡＴＧＶＳＲＬＦＬＶＳＥＧＳＶＶＱＦＳＳＡＮＦＳＬＴＡＥＴＥＥＲＮＦＰＨＧＮＥＨＬＬＮＷＡＲＫＥＹＧＡＶＴＳＦＴＥＬＫＩＡＲＮＩＹＩＫＶＧＥＤＱＶＦＰＰＫＣＮＩＧＫＮＦＬＳＬＮＹＬＡＥＹＬＱＰＫＡＡＥＧＣＶＭＳＳＱＰＱＮＥＥＶＨＩＩＥＬＩＴＰＮＳＮＰＹＳＡＦＱＶＤＩＴＩＤＩＲＰＳＱＥＤＬＥＶＶＫＮＬＩＬＩＬＫＣＫＫＳＶＮＷＶＩＫＳＦＤＶＫＧＳＬＫＩＩＡＰＮＳＩＧＦＧＫＥＳＥＲＳＭＴＭＴＫＳＩＲＤＤＩＰＳＴＱＧＮＬＶＫＷＡＬＤＮＧＹＳＰＩＴＳＹＴＭＡＰＶＡＮＲＦＨＬＲＬＥＮＮＡＥＥＭＧＤＥＥＶＨＴＩＰＰＥＬＲＩＬＬＤＰＧＡＬＰＡＬＱＮＰＰＩＲＧＧＥＧＱＮＧＧＬＰＦＰＦＰＤＩＳＲＲＶＷＮＥＥＧＥＤＧＬＰＲＰＫＤＰＶＩＰＳＩＱＬＦＰＧＬＲＥＰＥＥＶＱＧＳＶＤＩＡＬＳＶＫＣＤＮＥＫＭＩＶＡＶＥＫＤＳＦＱＡＳＧＹＳＧＭＤＶＴＬＬＤＰＴＣＫＡＫＭＮＧＴＨＦＶＬＥＳＰＬＮＧＣＧＴＲＰＲＷＳＡＬＤＧＶＶＹＹＮＳＩＶＩＱＶＰＡＬＧＤＳＳＧＷＰＤＧＹＥＤＬＥＳＧＤＮＧＦＰＧＤＭＤＥＧＤＡＳＬＦＴＲＰＥＩＶＶＦＮＣＳＬＱＱＶＲＮＰＳＳＦＱＥＱＰＨＧＮＩＴＦＮＭＥＬＹＮＴＤＬＦＬＶＰＳＱＧＶＦＳＶＰＥＮＧＨＶＹＶＥＶＳＶＴＫＡＥＱＥＬＧＦＡＩＱＴＣＦＩＳＰＹＳＮＰＤＲＭＳＨＹＴＩＩＥＮＩＣＰＫＤＥＳＶＫＦＹＳＰＫＲＶＨＦＰＩＰＱＡＤＭＤＫＫＲＦＳＦＶＦＫＰＶＦＮＴＳＬＬＦＬＱＣＥＬＴＬＣＴＫＭＥＫＨＰＱＫＬＰＫＣＶＰＰＤＥＡＣＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮＫＫＴＦＴＫＰＬＡＶＩＨＨＥＡＥＳＫＥＫＧＰＳＭＫＥＰＮＰＩＳＰＰＩＦＨＧＬＤＴＬＴＶ（配列番号３９）
４０． チラゴルマブの重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４０）
４１． チラゴルマブの軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４１）
４２． ＲＧ６０５８（ｈＧ４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）
４３． ＲＧ６０５８（ｈＧ４）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４３）
４４． リンカー断片のアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４４）
４５． 抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＥＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＴＴＹＷＩＥＷＩＫＱＲＰＧＨＳＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＤＳＴＹＹＮＥＫＶＫＧＫＶＴＦＴＡＤＡＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＤＧＦＹＶＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号４５）
４６． 抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＳＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＴＳＱＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＴＥＤＦＧＶＹＦＣＱＱＳＧＳＷＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４６）
４７． ＲＧ６０５８（Ｇ１ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４７）
４８． ＲＧ６０５８（Ｇ１ＤＭ）の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４８）
【0077】
詳細な説明
本発明の実施形態を、実施例を参照しながら以下に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明の単なる例証であり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないと理解するであろう。実施例中、指定された条件のない実験手順については、従来の条件又は製造業者によって推奨される条件に従って行われる。使用される試薬又は機器について、製造業者の指定のないものは、全て市販の従来の製品である。
本発明の実施形態を、実施例を参照しながら以下に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明の単なる例証であり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないと理解するであろう。実施例中、指定された条件のない実験手順については、従来の条件又は製造業者によって推奨される条件に従って行われる。使用される試薬又は機器について、製造業者の指定のないものは、全て市販の従来の製品である。
【0078】
ＢＡＬＢ／ｃマウスはＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒより購入した。
【0079】
Ｃ５７マウスはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅより購入した。
【0080】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞はＡＴＣＣより購入した。
【0081】
陽性対照抗体であるチラゴルマブは、WHO. Proposed INN: List 117. WHO Drug Information, 31(2): p104, 2017に記載される抗体に由来し、配列番号４０～４１のアミノ酸配列とそれぞれ同一の、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含む。
【0082】
本発明において、チラゴルマブとＲＧ６０５８（ｈＧ１ＷＴ）は同一の抗体である。
【0083】
陽性対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ４）は、中国特許出願公開第ＣＮ１０８２９０９４６（Ａ）号明細書に記載の抗体に由来する配列を含み、配列番号４２～４３のアミノ酸配列とそれぞれ同一の、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0084】
陽性対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ１ＤＭ）を、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社の研究室において、ロット番号２０１８０８１６にて調製した。その重鎖のアミノ酸配列を配列番号４７に示し、軽鎖の配列番号を配列番号４８に示す。
【0085】
本発明の実施例におけるアイソタイプ対照抗体であるヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ、又はヒトＩｇＧ；ｈＩｇＧと略記）の可変領域配列は、Acierno et al.“Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies”（Acierno et al., J Mol Biol., 2007; 374(1):130-46）に由来する。実施例で使用されたｈＩｇＧ１ＤＭ及びｈＩｇＧ４ＷＴは、ｈＧ１ＤＭ及びｈＧ４ＷＴ定常領域配列をそれぞれ有する、抗ＨＥＬを有したアイソタイプ対照抗体であり、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社の研究室において調製されたものである。
【0086】
ｋサブタイプの抗ＨＥＬ抗体（ヒトｈＧ４ＤＭ）の重鎖のＣ末端にＴＧＦβＲＩＩを融合することにより、抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ抗体を構築した。調製はＡｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社の研究室で行った。その重鎖のアミノ酸配列を配列番号４５に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４６に示す。
【0087】
ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃタンパク質（ロット番号２０１７１１１０）、ＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃ（ロット番号２０２００５２８）、ＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチン（ロット番号２０１７０７２１）、ＣＤ１５５－ｍＦｃ（ロット番号２０１９０７２６）、及びＣＤ１１２－ｍＦｃ（ロット番号２０１９０７２６）は、全て、公知の配列に従い、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって製造された。ｍＦｃはマウスＩｇＧのＦｃタンパク質断片を表し、ｈＦｃはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片を表す。
【0088】
ＴＧＦ－β１タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ社より、カタログ番号ＬＣ１３ＤＥ３１０８にて購入した。
【0089】
ＴＧＦ－β２タンパク質は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社より、カタログ番号０４２０３４５ Ｅ０６２０にて購入した。
【0090】
ＴＧＦ－β３タンパク質は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社より、カタログ番号０７１３４１０ Ａ０２１９にて購入した。
【0091】
本発明の以下の実施例において、使用した細胞株２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴは、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴは、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（武漢大学）のウイルス感染により調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＴＩＧＩＴＦＬ－ＢＳＤであった（ＴＩＧＩＴはＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２であり；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ ＴＯＰＯはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社よりカタログ番号Ｋ５３１５２０にて購入した）。
【0092】
本発明の以下の実施例において、使用した細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴは、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴは、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照）を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウイルス感染により調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＴＩＧＩＴＦＬ－ＢＳＤであった（ＴＩＧＩＴはＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２であり、ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ ＴＯＰＯはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社よりカタログ番号Ｋ５３１５２０にて購入した）。
【0093】
本発明の以下の実施例において、使用した細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴは、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴは、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウイルス感染により調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＴＩＧＩＴＦＬ－ＢＳＤであった（ＴＩＧＩＴはＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２であり；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ ＴＯＰＯはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社よりカタログ番号Ｋ５３１５２０にて購入した）。
【0094】
本発明の以下の実施例において、使用した細胞株ＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖは、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株ＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖは、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照）を用いて、ＨＴ－１０８０細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウイルス感染により調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ａＣＤ３ｓｃＦｖ－Ｐｕｒｏであった（抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列は抗ヒトＣＤ３ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＯＫＴ３ハイブリドーマ抗体から得た；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＰｕｒｏはＹｏｕｂｉｏ社よりカタログ番号ＶＴ１４８０にて購入した）。
【0095】
実施例１：抗ＴＩＧＩＴ抗体の調製
１． ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９の調製
抗ＴＩＧＩＴ抗体の調製に用いた抗原は、ヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃであった（ＴＩＧＩＴはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２であった）。免疫されたマウスの脾細胞をマウスのミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を調製した。ヒトＴＩＧＩＴ－ｈＦｃを抗原として、間接ＥＬＩＳＡによってハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞を得た。スクリーニングによって得られたハイブリドーマ細胞に対して限界希釈法を行い、安定ハイブリドーマ細胞株を得た。上記ハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９と名付け、この細胞株から分泌されるモノクローナル抗体を２６Ｂ１２と名付けた。
１． ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９の調製
抗ＴＩＧＩＴ抗体の調製に用いた抗原は、ヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃであった（ＴＩＧＩＴはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿７７６１６０．２であった）。免疫されたマウスの脾細胞をマウスのミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を調製した。ヒトＴＩＧＩＴ－ｈＦｃを抗原として、間接ＥＬＩＳＡによってハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞を得た。スクリーニングによって得られたハイブリドーマ細胞に対して限界希釈法を行い、安定ハイブリドーマ細胞株を得た。上記ハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９と名付け、この細胞株から分泌されるモノクローナル抗体を２６Ｂ１２と名付けた。
【0096】
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１９（ＴＩＧＩＴ－２６Ｂ１２としても知られる）を、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ番号Ｃ２０２０２０８のもと、２０２０年１０月２３日付けで寄託した。寄託機関のアドレスは、郵便番号４３００７２ 中華人民共和国 武漢 武漢大学である。
【0097】
２． 抗ＴＩＧＩＴ抗体２６Ｂ１２の調製
上記で調製した細胞株ＬＴ０１９を、化学的に定義された培地（ＣＤ培地、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有）を用いて３７℃／５％ＣＯ２で培養した。７日後、細胞培養上清を回収し、高速遠心分離、及び精密濾過膜による真空濾過を行い、ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ カラムを用いた精製によって抗体２６Ｂ１２を得た。
上記で調製した細胞株ＬＴ０１９を、化学的に定義された培地（ＣＤ培地、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有）を用いて３７℃／５％ＣＯ２で培養した。７日後、細胞培養上清を回収し、高速遠心分離、及び精密濾過膜による真空濾過を行い、ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ カラムを用いた精製によって抗体２６Ｂ１２を得た。
【0098】
実施例２：抗ＴＩＧＩＴ抗体２６Ｂ１２の配列分析
細胞／細菌全ＲＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ社、カタログ番号ＤＰ４３０）の使用説明書に記載の方法に従い、実施例１で培養した細胞株ＬＴ０１９からｍＲＮＡを抽出した。
細胞／細菌全ＲＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ社、カタログ番号ＤＰ４３０）の使用説明書に記載の方法に従い、実施例１で培養した細胞株ＬＴ０１９からｍＲＮＡを抽出した。
【0099】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲの使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲによって増幅した。
【0100】
ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ社、ＣＴ１０１）の使用説明書に従い、ＰＣＲ増幅産物から直接ＴＡクローニングを行った。
【0101】
ＴＡクローニング産物を直接シーケンシングした。シーケンシングの結果は以下の通りである。
【0102】
重鎖可変領域のヌクレオチド配列を、３６３ｂｐの長さで配列番号２に示す。コードされるアミノ酸配列を、１２１アミノ酸の長さで配列番号１に示す。重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列を、配列番号３、４、及び５にそれぞれ示す。
【0103】
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、３２１ｂｐの長さで配列番号７に示す。コードされるアミノ酸配列を、１０７アミノ酸の長さで配列番号６に示す。軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を、配列番号８、９、及び１０にそれぞれ示す。
【0104】
実施例３：抗ヒトＴＩＧＩＴヒト化抗体及び変異抗体の設計及び調製
１． 抗ヒトＴＩＧＩＴヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４の軽鎖及び重鎖の設計
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質の三次元結晶構造、及び実施例２で得られた抗体２６Ｂ１２の配列に基づき、抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４（ＮＣＢＩデータベースからの抗体定常領域配列：重鎖定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり；軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４である）の可変領域配列を設計した。
１． 抗ヒトＴＩＧＩＴヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４の軽鎖及び重鎖の設計
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質の三次元結晶構造、及び実施例２で得られた抗体２６Ｂ１２の配列に基づき、抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４（ＮＣＢＩデータベースからの抗体定常領域配列：重鎖定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり；軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４である）の可変領域配列を設計した。
【0105】
設計された可変領域配列を以下の表１に示す。
【表2】
【0106】
上記８種抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４に関して、重鎖可変領域のヌクレオチド配列の長さは３６３ｂｐであり、コードされるアミノ酸配列の長さは１２１ａａであり；軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の長さは３２１ｂｐであり、コードされるアミノ酸配列の長さは１０７ａａであった。
【0107】
また、上記８種抗体は同一のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を有していた。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列を配列番号３、４、及び５にそれぞれ示し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を配列番号８、９、及び１０にそれぞれ示す。
【0108】
２． ヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４の調製
重鎖定常領域は全てＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域は全てＩｇカッパ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４であった。
重鎖定常領域は全てＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域は全てＩｇカッパ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４であった。
【0109】
２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ２の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ３の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ３Ｌ３の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ１Ｌ４の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ４の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、及び２６Ｂ１２Ｈ４Ｌ４の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡを、別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により提供）ベクターにクローニングし、
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ１；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ４、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ１；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ２；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ２；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ３；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ３；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ４；及び
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ４、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ４；
を得た。
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ１；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ４、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ１；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ２；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ２；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ３；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ３；
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ４；及び
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｈ４、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－２６Ｂ１２Ｌ４；
を得た。
【0110】
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition)に記載の標準的な技術を参照し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化によって合成された重鎖及び軽鎖全長遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ１、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ４、ｐｃＤＮＡ３．１－１２６Ｂ１２Ｈ２、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ２、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ３、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ３、及びｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ４を得て、組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子をさらにシーケンシングした。その後、対応する軽鎖及び重鎖組換えプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ１／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ４／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ２、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ３／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ２、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ３、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ３／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ３、ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ１／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ４、及びｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｈ４／ｐｃＤＮＡ３．１－２６Ｂ１２Ｌ４）を含む、設計した遺伝子の組み合わせを、別々に２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、培養物を回収及び精製した。配列を確認した後、エンドトキシンフリーの発現プラスミドを調製し、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞に対して一過性トランスフェクションを行った。培養７日後に細胞培養物を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム上で親和性精製を行い、ヒト化抗体を得た。
【0111】
ヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２を、本明細書において２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）とも呼ぶ。
【0112】
３． ヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）及び２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の設計
発明者は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２の重鎖定常領域において、２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を（ＥＵ番号付けシステムによる；以下同様）、また、２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入することにより、変異定常領域を有するヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）を得た。２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖２６Ｂ１２Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）のアミノ酸配列を配列番号３１に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
発明者は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２の重鎖定常領域において、２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を（ＥＵ番号付けシステムによる；以下同様）、また、２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入することにより、変異定常領域を有するヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）を得た。２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖２６Ｂ１２Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）のアミノ酸配列を配列番号３１に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
【0113】
発明者は、Ｉｇガンマ－４鎖Ｃ領域（アクセッション：Ｐ０１８６１．１）を重鎖定常領域として用い、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２の重鎖定常領域において、２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を、また、２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入し、一方で抗体可変領域を一定とすることにより、変異定常領域を有するヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）を得た。２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖２６Ｂ１２Ｈ２（ｈＧ４ＤＭ）のアミノ酸配列を配列番号２７に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
【0114】
ヒト化抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）及び２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）は、上記工程２に記載の方法によって調製した。
【0115】
実施例４：抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の配列設計及び調製
１． 配列設計
抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の構成を、次の表２に示す。
１． 配列設計
抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の構成を、次の表２に示す。
【表3】
【0116】
ＴＧＦ－β受容体部分は２個のペプチド鎖を有し、それぞれがＩｇＧ部分の重鎖Ｃ末端にリンカー断片を介して連結する。
【0117】
２．抗体の発現及び精製
ＴＦ０１及びＴＦ０２の重鎖ｃＤＮＡ配列及び軽鎖ｃＤＮＡ配列を、ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供）に別々にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０１Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０２Ｈ、又は、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０１Ｌ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０２Ｌをそれぞれ得た。
ＴＦ０１及びＴＦ０２の重鎖ｃＤＮＡ配列及び軽鎖ｃＤＮＡ配列を、ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供）に別々にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０１Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０２Ｈ、又は、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０１Ｌ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０２Ｌをそれぞれ得た。
【0118】
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０１Ｈ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ ＴＦ０１Ｌ、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＴＦ０２Ｈ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ ＴＦ０２Ｌをそれぞれ消化（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）し、電気泳動で単離した重鎖及び軽鎖を別々にベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培養物を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。その結果、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質、ＴＦ０１及びＴＦ０２が調製された。
【0119】
実施例５：ＴＦ０１及びＴＦ０２の、抗原又はＴＧＦ－βへの結合活性のＥＬＩＳＡ分析
１． ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）の、抗原ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃへの結合活性の間接ＥＬＩＳＡ分析
１． ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）の、抗原ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃへの結合活性の間接ＥＬＩＳＡ分析
【0120】
方法は次の通りである。
マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１１５－００５－０７１）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、マイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、１μｇ／ｍＬのＴＩＧＩＴ－ｍＦｃを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表３に示す）を加えた。試験抗体を含むマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）の二次抗体ワーキング溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１１５－００５－０７１）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、マイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、１μｇ／ｍＬのＴＩＧＩＴ－ｍＦｃを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表３に示す）を加えた。試験抗体を含むマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）の二次抗体ワーキング溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0121】
【0122】
図より、ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）が、用量依存的に、抗原ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃに効果的に結合できたことが分かる。全用量に対するＥＣ５０値を表３に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティングによって得られた結果によれば、ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）（対照）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．０６７ｎＭ、０．０９１ｎＭ、０．０４６ｎＭ、及び０．０５５ｎＭであった。
【0123】
上記実験結果は、ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）が、ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃに効果的に結合する活性を有していたことを示している。
【0124】
２． ＴＦ０１、ＴＦ０２、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃの、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３に対するの結合活性の間接ＥＬＩＳＡ分析
【0125】
方法は次の通りである。
３枚のマイクロプレートを、それぞれ１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び１μｇ／ｍＬの、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃを加えた。試験抗体及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃを含むマイクロプレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１１５－０３５－０７１）の二次抗体ワーキング溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
３枚のマイクロプレートを、それぞれ１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び１μｇ／ｍＬの、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃを加えた。試験抗体及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃを含むマイクロプレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１１５－０３５－０７１）の二次抗体ワーキング溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0126】
【0127】
結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティングによって得られた結果によれば、ＴＦ０１のＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３への結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．２０７ｎＭ、０．４７７ｎＭ、及び０．２１５ｎＭであり、ＴＦ０２のＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３への結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．２２４ｎＭ、０．５９４ｎＭ、及び０．２３４ｎＭであり、ＴＧＦ－βＲ２－ｍＦｃ（陽性対照）のＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３への結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．３５６ｎＭ、１．０２９ｎＭ、及び０．４０２ｎＭであった。
【0128】
結果は、ＴＦ０１及びＴＦ０２が、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３に、用量依存的に、効果的に結合する活性を有することを示す。結果はさらに、ＴＦ０１、ＴＦ０２、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃのそれぞれが、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３にそれぞれ効果的に結合でき、また、ＴＦ０１及びＴＦ０２は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３への結合能がＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃよりも高いことを示す。
【0129】
実施例６：ヒトＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する、ＴＦ０１及びＴＦ０２の活性のＥＬＩＳＡ分析
実験工程：２枚のマイクロプレートを、２μｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３でそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、抗原でコートされたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回リンスし、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃをマイクロプレートに加えた。ＴＧＦ－β１のマイクロプレートについては、室温で６０分間インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンを加えて室温で１０分間インキュベートした。ＴＧＦ－β３のマイクロプレートについては、３７℃で３０分間インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンを加えて３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：４０００の割合で希釈したＳＡ－ＨＲＰワーキング溶液を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて４分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
実験工程：２枚のマイクロプレートを、２μｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３でそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、抗原でコートされたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回リンスし、ブロッキング溶液として１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃをマイクロプレートに加えた。ＴＧＦ－β１のマイクロプレートについては、室温で６０分間インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンを加えて室温で１０分間インキュベートした。ＴＧＦ－β３のマイクロプレートについては、３７℃で３０分間インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンを加えて３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：４０００の割合で希釈したＳＡ－ＨＲＰワーキング溶液を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて４分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0130】
ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する抗体の結果を表７及び８、並びに図５及び６に示す。吸光度ｖｓ．抗体濃度の曲線をフィッティングし、ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する抗体のＥＣ５０値を算出した。結果を以下の表７及び８に示す。
【表8】
【表9】
【0131】
結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティングによって得られた結果によれば、ＴＧＦ－β１への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する、ＴＦ０１、ＴＦ０２、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃの結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ５．５７９ｎＭ、７．４６９ｎＭ、及び６．４７５ｎであり、ＴＧＦ－β３への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する、ＴＦ０１、ＴＦ０２、及びＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃの結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ３．５６９ｎＭ、３．８７９ｎＭ、及び２．８０８ｎＭであった。
【0132】
結果は、ＴＦ０１及びＴＦ０２が、ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３に、用量依存的に、効果的に結合できることを示す。また、ＴＦ０１は、ＴＧＦ－β１に対する結合能がＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンよりも高い。ＴＦ０１は、ＴＧＦ－β１への結合に関してＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｈｉｓ－ビオチンと競合する能力がＴＧＦ－βＲＩＩ－ｍＦｃよりも高かった。
【0133】
実施例７：ヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃへの結合に関してＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンと競合する、ＴＦ０１及びＴＦ０２の活性のＥＬＩＳＡ分析
マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃ（ＴＩＧＩＴ ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ－７７６１６０．２）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、マイクロプレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを３回洗浄し、乾燥した。抗体を、２０．１８ｎＭ（最終濃度１０．０９ｎＭ）を開始濃度として、希釈プレート上で、１：３の勾配率にて７種の濃度に段階希釈し、また、ブランク対照を設定した。その後、４μｇ／ｍＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）のヒトＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチン溶液を等量加え、系をよく混合した。その後、混合物を室温で２０分間インキュベートした。その後、コートしたマイクロプレートに反応後の混合物を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した。ＳＡ－ＨＲＰ（ＫＰＬ、１４－３０－００）ワーキング溶液を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを４回洗浄し、乾燥した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃ（ＴＩＧＩＴ ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ－７７６１６０．２）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、マイクロプレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを３回洗浄し、乾燥した。抗体を、２０．１８ｎＭ（最終濃度１０．０９ｎＭ）を開始濃度として、希釈プレート上で、１：３の勾配率にて７種の濃度に段階希釈し、また、ブランク対照を設定した。その後、４μｇ／ｍＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）のヒトＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチン溶液を等量加え、系をよく混合した。その後、混合物を室温で２０分間インキュベートした。その後、コートしたマイクロプレートに反応後の混合物を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した。ＳＡ－ＨＲＰ（ＫＰＬ、１４－３０－００）ワーキング溶液を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを４回洗浄し、乾燥した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0134】
結果を図７に示す。全用量に対するＯＤ値を表９に示す。結合した抗体の吸光度（absorbance intensity）の定量分析に基づき、カーブフィッティングによって抗体の結合効率ＥＣ５０値を得た（表９）。
【表10】
【0135】
ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃが、そのリガンドＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンへ結合するのをブロックするための、ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）（対照）のＥＣ５０値は、それぞれ、１．４６３ｎＭ、１．９６３ｎＭ、１．４２３ｎＭ、及び１．６７５ｎＭであった。
【0136】
結果は、抗原であるヒトＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンがその受容体であるヒトＴＩＧＩＴ－ｍＦｃに結合するのを、ＴＦ０１、ＴＦ０２、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）（対照）が用量依存的に、効果的にブロックできることを示す。ＴＦ０１は、ＴＩＧＩＴ－ｍＦｃがそのリガンドＣＤ１５５－ｈＦｃ－ビオチンへ結合するのをブロックする能力が、対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ４）よりも高かった。
【0137】
実施例８：２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ膜表面上のＴＩＧＩＴへの、ＴＦ０１の結合活性のＦＡＣＳ分析
対数増殖期の２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ細胞を採取し、透明なＶ底９６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルで移した。３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。１％ＰＢＳＡで希釈した抗体１００μＬ（それぞれ、１００ｎＭ、３３．３３ｎＭ、１１．１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．０４１ｎＭ、０．００４１ｎＭ、及び０．０００４１ｎＭの最終濃度）を、それぞれ加えた。系を穏やかに均一に混合し、混合物を氷上で１時間インキュベートした。その後、３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。３５０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加え、再懸濁して均一に混合し、混合物を暗所にて氷上で０．５時間インキュベートした。３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。そして、４００μＬのＰＢＳＡを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、得られた混合物をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ分析のためのフローチューブ（flow tube）に移した。
対数増殖期の２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ細胞を採取し、透明なＶ底９６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルで移した。３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。１％ＰＢＳＡで希釈した抗体１００μＬ（それぞれ、１００ｎＭ、３３．３３ｎＭ、１１．１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．０４１ｎＭ、０．００４１ｎＭ、及び０．０００４１ｎＭの最終濃度）を、それぞれ加えた。系を穏やかに均一に混合し、混合物を氷上で１時間インキュベートした。その後、３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。３５０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加え、再懸濁して均一に混合し、混合物を暗所にて氷上で０．５時間インキュベートした。３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。そして、４００μＬのＰＢＳＡを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、得られた混合物をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ分析のためのフローチューブ（flow tube）に移した。
【0138】
【0139】
２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ細胞に結合するＴＦ０１及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）のＥＣ５０値は、同一実験条件下で、それぞれ１．５４０ｎＭ及び１．６１２ｎＭであった。
【0140】
結果は、ＴＦ０１が、２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ膜表面上のＴＩＧＩＴに対して用量依存的に、効果的に結合する活性を有し、対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ４）よりも高い結合能を有することを示した。
【0141】
実施例９：細胞膜表面上の抗原ＴＩＧＩＴへの結合に関してＣＤ１５５又はＣＤ１１２と競合するＴＦ０１の、競合フローサイトメトリーによる分析
２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ細胞を従来法で消化し、各ウェルが３００，０００細胞となるようにいくつかの試料に分割して、その後、遠心分離と洗浄を行った。次いで、勾配希釈された対応する抗体を各ウェルに１００μＬ加え、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。その後、１００μＬのＣＤ１５５／ＣＤ１１２－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１９０７２６／２０１９０７２６）を各ウェルに加え、系を良く混合して、最終濃度１０ｎＭ／３０ｎＭにした。その後、混合物を氷上で１時間インキュベートした。次いで、３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。１：３００の割合で希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０５３０８）を各ウェルに１００μＬ加え、１％ＰＢＳＡをブランク試料に１００μＬ加えて、系をよく混合した。その後、混合物を暗所にて氷上で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離、洗浄、及び再懸濁を行った後、フローサイトメトリーチューブに移して試験を行った。
２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ細胞を従来法で消化し、各ウェルが３００，０００細胞となるようにいくつかの試料に分割して、その後、遠心分離と洗浄を行った。次いで、勾配希釈された対応する抗体を各ウェルに１００μＬ加え、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。その後、１００μＬのＣＤ１５５／ＣＤ１１２－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１９０７２６／２０１９０７２６）を各ウェルに加え、系を良く混合して、最終濃度１０ｎＭ／３０ｎＭにした。その後、混合物を氷上で１時間インキュベートした。次いで、３５０ｇの１％ＰＢＳＡを加え、混合物を５分間遠心分離して、上清を除去した。１：３００の割合で希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０５３０８）を各ウェルに１００μＬ加え、１％ＰＢＳＡをブランク試料に１００μＬ加えて、系をよく混合した。その後、混合物を暗所にて氷上で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離、洗浄、及び再懸濁を行った後、フローサイトメトリーチューブに移して試験を行った。
【0142】
結果を図９及び１０に示し、ＥＣ５０値を表１１に示す。蛍光定量分析及びカーブフィッティングにより、抗原への結合に関して競合するＴＦ０１のＥＣ５０値は、それぞれ１．２７２０ｎＭ及び０．７４４５ｎＭと算出された。
【表12】
【0143】
結果は、２９３Ｔ－ＴＩＧＩＴ宿主細胞表面上のＴＩＧＩＴへのＣＤ１５５及び／又はＣＤ１１２の結合を、ＴＦ０１抗体が用量依存的に、効果的にブロックできることを示す。
【0144】
実施例１０：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩに対する、ＴＦ０１の親和性の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩに対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩに対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
【0145】
ＦｃγＲＩに対する対応する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩ溶液（Ｓｉｎｏｂｉｏ社より購入）をＨＩＳ１Ｋセンサーに加え、センサー表面上にＦｃγＲＩを５０秒間固定した。ＦｃγＲＩへの抗体の結合及び解離定数の両者を、３．１２～５０ｎＭ（２倍段階希釈）の抗体濃度の緩衝液中で測定した。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度（frequency）は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0146】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩの親和性定数に関する結果を表１２及び図１１～１２に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表13】
【0147】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩに６．５１Ｅ－０９Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃγＲＩに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0148】
結果は、ＦｃγＲＩに対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0149】
実施例１１：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ及びそのサブタイプに対する、ＴＦ０１の親和性の分析
（１）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｖ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＡＤＣＣ効果を媒介する。実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
（１）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｖ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＡＤＣＣ効果を媒介する。実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
【0150】
対応する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８を、ＨＩＳ１Ｋセンサー上に６０秒間固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の、３１．２５～５００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0151】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の親和性定数に関する結果を、表１３及び図１３～１４に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表14】
【0152】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に５．５４Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0153】
結果は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0154】
（２）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｆ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＡＤＣＣ効果を媒介する。実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｆ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＡＤＣＣ効果を媒介する。実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
【0155】
ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８を、ＨＩＳ１Ｋセンサー上に１２０秒間固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の、３１．２５～５００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0156】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８の親和性定数に関する結果を、表１４及び図１５～１６に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表15】
【0157】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に９．９７Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0158】
結果は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0159】
実施例１２：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ及びそのサブタイプに対する、ＴＦ０１の親和性の分析
（１）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｈ１３１としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対する試験抗体の結合能を評価した。
（１）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｈ１３１としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対する試験抗体の結合能を評価した。
【0160】
ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１を、ＮＴＡセンサー上に約１．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の、１２．５～２００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0161】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の親和性定数に関する結果を、表１５及び図１７～１８に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表16】
【0162】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に３．９０Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0163】
結果は、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0164】
（２）ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｒ１３１としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対する試験抗体の結合能を評価した。
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｒ１３１としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対する試験抗体の結合能を評価した。
【0165】
ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１を、ＮＴＡセンサー上に約１．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の、１２．５～２００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。抗体を緩衝液中で６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0166】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の親和性定数に関する結果を、表１６及び図１９～２０に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表17】
【0167】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に３．２２Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0168】
結果は、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0169】
実施例１３：ＴＦ０１に対する、ＦｃγＲＩＩｂの親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂとしても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができる。実験において、ＦｃγＲＩＩｂに対する試験抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対するＴＦ０１の結合能を評価した。
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂとしても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができる。実験において、ＦｃγＲＩＩｂに対する試験抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対するＴＦ０１の結合能を評価した。
【0170】
ＦｃγＲＩＩｂに対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩｂを、ＮＴＡセンサー上に約１．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ｈＦＣＧＲ２Ｂ－ｈｉｓの、１２．５～２００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。抗体を緩衝液中で６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。
【0171】
ＴＦ０１に対するＦｃγＲＩＩｂの親和性定数に関する結果を、表１７及び図２１～２２に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表18】
【0172】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩｂに４．１２Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＦｃγＲＩＩｂに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0173】
結果は、ＦｃγＲＩＩｂに対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0174】
実施例１４：Ｃ１ｑに対する、ＴＦ０１の親和性の分析
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＣＤＣ効果を媒介する。Ｃ１ｑに対する治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、Ｃ１ｑに対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＣＤＣ活性を評価した。
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、ＣＤＣ効果を媒介する。Ｃ１ｑに対する治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。実験において、Ｃ１ｑに対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＣＤＣ活性を評価した。
【0175】
Ｃ１ｑに対する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定する方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）であった。５０μｇ／ｍＬの抗体を、ＦＡＢ２Ｇセンサー上に約２．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化抗体の、０．６２５～１０ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗原Ｃ１ｑに対する結合を６０秒間測定した。抗原－抗体を緩衝液中で６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、頻度は５．０Ｈｚであった。データを１：１モデルでフィッティング及び分析することにより、親和性定数を得た。データ取得ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０であった。
【0176】
Ｃ１ｑに対するＴＦ０１の親和性定数に関する結果を、表１８及び図２３～２４に示す。
Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は、抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【表19】
【0177】
結果は、２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＣ１ｑに１．２８Ｅ－０９Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＴＦ０１についてはＣ１ｑに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。
【0178】
結果は、Ｃ１ｑに対するＴＦ０１の結合活性が効果的に排除されたことを示す。
【0179】
実施例１５：ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴに対する、ＴＦ０１の抗体依存性細胞食作用活性
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を検出するため、エフェクター細胞としてマウスマクロファージを用い、標的細胞としてＴＩＧＩＴを過剰発現する細胞株を用いた。細胞に媒介されるＡＤＣＰ効果を試験した。
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を検出するため、エフェクター細胞としてマウスマクロファージを用い、標的細胞としてＴＩＧＩＴを過剰発現する細胞株を用いた。細胞に媒介されるＡＤＣＰ効果を試験した。
【0180】
凍結保存したマウス骨髄由来マクロファージ（ＭＢＭＭ）（Ｃ５７マウス由来）を取り出し、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、カタログ番号３１５－０２）を加えて、混合物を１２００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を回収し、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ培地を加え、細胞を一晩融解させた。
【0181】
標的細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ）を回収し、１７０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。トリパンブルーを加えて計数を行った。５（６）－カルボキシフルオレセイン Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４２３８０１）をＰＢＳで２．５μＭに希釈し、細胞を再懸濁した（染色密度：１０，０００，０００細胞／ｍＬ）。適量の細胞を細胞インキュベーター内で２０分間インキュベートした。６ｍＬのＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳを含む）を加えて染色を停止させた。混合物を１７０×ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を加え、細胞をインキュベーター中で１０分間インキュベートした。抗体を、ＤＭＥＭ完全培地で所望の濃度まで希釈し、アイソタイプ対照抗体を設計した。標的細胞（１５０，０００細胞／ウェル）を９６ウェルＶ底プレートに加えた後、抗体（１００μＬ）を加え、系をよく混合した。混合物を氷上で４０分間インキュベートし、１７０×ｇで５分間遠心分離し、２回洗浄した。マクロファージ（ＭＢＭＭ）を回収し、７５０×ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。細胞を計数し、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁して、マクロファージの濃度を調整した（５０，０００細胞／１００μＬ）。その後、標的細胞を含む９６ウェルＶ底プレートに前記細胞を加え、再懸濁及び混合を行った。混合物をインキュベーター中で３７℃にて２時間インキュベートした。室温の１００μＬの１％ＰＢＳＡを各ウェルに加えた。混合物を７５０×ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。細胞を２００μＬのＰＢＳＡで１回洗浄した。ＡＰＣ抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号１０１２１２）（ＰＢＳＡで５００倍希釈）を、対応する試料に１００μＬ／ウェルで加え、系をよく混合した。その後、混合物を氷上で４０分間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの１％ＰＢＳＡを加えた。混合物を７５０×ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。細胞を、各ウェルにつき２００μＬのＰＢＳＡで１回洗浄した。各ウェルに２００μＬの１％ＰＢＳＡを加えて再懸濁し、試験を行った。系内のマクロファージはＡＰＣ陽性であり、食作用に関与するマクロファージはＡＰＣ及びＣＦＳＥ二重陽性であった。食作用率を、ＡＰＣ陽性細胞の数に対する二重陽性細胞の数の割合として決定し、それによりＡＤＣＰ活性を評価した。各群のＡＤＣＰ活性をＰ％で表し、それを次の式で算出した。
【数1】
【0182】
結果を図２５に示す。
【0183】
結果は、同一濃度においてＲＧ６０５８（ｈＧ１ＷＴ）、ＲＧ６０５８（ｈＧ４）、及び２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＷＴ）がＡＤＣＰ効果を有すること、そして、同一濃度においてＴＦ０１の食作用率がアイソタイプ対照抗体群と同程度であることを示し、ＴＦ０１がＡＤＣＰ効果を有しないことが示された。
【0184】
結果は、ＴＦ０１によって導入されたアミノ酸変異がＡＤＣＰ効果を効果的に排除できたことを示す。
【0185】
実施例１６：同時培養系でのＩＬ－２分泌に対するＣＤ１１２／ＣＤ１５５阻害への、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質のブロッキング活性の評価
１． Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＴＨＰ－１細胞同時培養系でのＩＬ－２分泌に対するＣＤ１１２阻害への、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質のブロッキング活性の評価
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３５９９）を、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１７０８３０）で、３７℃にて２時間コートした。その後、コーティング溶液を除去し、予冷したＰＢＳ（３００μＬ）でプレートを１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。抗体を実験設計に従って加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ１１２－ｈＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１８０２０９）を実験設計に従って加えた。ＴＨＰ－１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号３１３１Ｃ０００１０００７０００５７）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。プレートをインキュベーター内で４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
１． Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＴＨＰ－１細胞同時培養系でのＩＬ－２分泌に対するＣＤ１１２阻害への、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質のブロッキング活性の評価
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３５９９）を、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１７０８３０）で、３７℃にて２時間コートした。その後、コーティング溶液を除去し、予冷したＰＢＳ（３００μＬ）でプレートを１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。抗体を実験設計に従って加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ１１２－ｈＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１８０２０９）を実験設計に従って加えた。ＴＨＰ－１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号３１３１Ｃ０００１０００７０００５７）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。プレートをインキュベーター内で４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
【0186】
結果を図２６に示す。結果は、ＣＤ１１２がＩＬ－２分泌に対して有意な阻害効果を有することを示す。抗体２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ４ＤＭ）、ＴＦ０１、ＴＦ０２、ＲＧ６０５８（ｈＧ１ＤＭ）、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）は、系内のＩＬ－２分泌に対するＣＤ１１２阻害を効果的にブロックすることができ、ＴＦ０１及びＴＦ０２は、陽性対照抗体ＲＧ６０５８（ｈＧ１ＤＭ）及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）よりも強い活性を有していた。
【0187】
２． Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＴＨＰ－１細胞同時培養系でのＩＬ－２分泌に対するＣＤ１５５阻害への、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質のブロッキング活性の評価
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３５９９）を、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１７０８３０）で、３７℃にて２時間コートした。その後、コーティング溶液を除去し、予冷したＰＢＳ（３００μＬ）でプレートを１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。実験デザインに従って抗体を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ１５５－ｈＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１８０２０９）を実験設計に従って加えた。ＴＨＰ－１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号３１３１Ｃ０００１０００７０００５７）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。プレートをインキュベーター内で４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３５９９）を、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１７０８３０）で、３７℃にて２時間コートした。その後、コーティング溶液を除去し、予冷したＰＢＳ（３００μＬ）でプレートを１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。実験デザインに従って抗体を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ１５５－ｈＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による調製；ロット番号２０１８０２０９）を実験設計に従って加えた。ＴＨＰ－１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号３１３１Ｃ０００１０００７０００５７）を計数し、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルにて加えた。プレートをインキュベーター内で４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
【0188】
結果を図２７に示す。結果は、ＣＤ１５５がＩＬ－２分泌に対して有意な阻害効果を有することを示す。抗体ＴＦ０１及びＲＧ６０５８（ｈＧ１ＤＭ）は、系内のＩＬ－２分泌に対するＣＤ１５５阻害を効果的にブロックすることができ、同程度の活性を有していた。
【0189】
実施例１７：Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖ細胞同時培養系でのＩＬ－２分泌の促進における、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の生物活性の評価
対数増殖期のＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を採取及び計数し、各ウェルが５０，０００個のＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞、及び各ウェルが１０，０００個のＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖ細胞となるようにした。希釈した抗体（抗体勾配：３ｎＭ、３０ｎＭ、３００ｎＭ）を加えた。可溶性抗ヒトＣＤ２８抗体（３μｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号ＭＡＢ３４２－５００）を加えた。混合物をインキュベーターで４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
対数増殖期のＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を採取及び計数し、各ウェルが５０，０００個のＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞、及び各ウェルが１０，０００個のＨＴ１０８０－ａＣＤ３ｓｃＦｖ細胞となるようにした。希釈した抗体（抗体勾配：３ｎＭ、３０ｎＭ、３００ｎＭ）を加えた。可溶性抗ヒトＣＤ２８抗体（３μｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号ＭＡＢ３４２－５００）を加えた。混合物をインキュベーターで４８時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０２０２）を用いてＩＬ－２含量を試験した。
【0190】
結果を図２８に示す。
【0191】
結果は、抗体ＴＦ０１、ＴＦ０２、及びＲＧ６０５８（ｈＧ４）が、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ及びＨＴ１０８０－ｓｃＦｖ細胞同時培養系でのＩＬ－２分泌を効果的に促進でき、同程度の活性を有することを示す。
【0192】
実施例１８：ＣＭＶ抗原へのＰＢＭＣ二次免疫応答の過程における、ＩＦＮ－γ分泌に対するＴＧＦ－β１阻害への、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質のブロッキング活性の評価
ＰＢＭＣ（健常ドナー由来）を融解し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）上に播種して、インキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取及び計数して細胞生存率を決定し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３７９９）上に２００，０００細胞／ウェルで播種した。一方、勾配希釈した抗体、ＣＭＶ（最終濃度０．０２μｇ／ｍＬ、Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６１９－１）、及びＴＧＦ－β１（最終濃度３ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｚ０３４１１）を実験設計に従って加え、最終容量２００μＬとした。（ＴＧＦ－β１及び抗体は３７℃で１０分間インキュベートした。）混合物をインキュベーター内で４日間インキュベートした。４日後、細胞培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０００２）を用いてＩＦＮ－γ含量を試験した。
ＰＢＭＣ（健常ドナー由来）を融解し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）上に播種して、インキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取及び計数して細胞生存率を決定し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３７９９）上に２００，０００細胞／ウェルで播種した。一方、勾配希釈した抗体、ＣＭＶ（最終濃度０．０２μｇ／ｍＬ、Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６１９－１）、及びＴＧＦ－β１（最終濃度３ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｚ０３４１１）を実験設計に従って加え、最終容量２００μＬとした。（ＴＧＦ－β１及び抗体は３７℃で１０分間インキュベートした。）混合物をインキュベーター内で４日間インキュベートした。４日後、細胞培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社、カタログ番号１１１０００２）を用いてＩＦＮ－γ含量を試験した。
【0193】
結果を図２９に示す。結果は、ＣＭＶ抗原が、ＰＢＭＣ二次免疫応答によるＩＦＮ－γの分泌を引き起こすことができ、系内のＩＦＮ－γ分泌に対してＴＧＦ－β１が有意な阻害効果を有することを示す。抗体ＴＦ０１、抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ、及び抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ＋２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の併用により、系内のＩＦＮ－γ分泌に対するＴＧＦ－β１阻害を効果的にブロックすることができ、この効果は２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）を単独で用いた場合には達成されなかった。ＴＦ０１のブロッキング活性は、対照抗体抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβのものよりも優れており、抗ＨＥＬ＆ＴＧＦβ＋２６Ｂ１２Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と同程度であった。
【0194】
実施例１９：マウス腫瘍細胞皮下異種移植モデルにおける、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の薬力学的評価
抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏで測定するため、まず、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣより購入）を、６．７１～９．５７週齢の雌のＳｃｉｄ Ｂｅｉｇｅマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）の乳房脂肪体に皮下接種した。接種の１７日後、マウスを腫瘍容積によりランダムに８個体ずつの３群に分けた。各マウスにヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）を腹腔内注射し、投与を行って、グループ分けの日をＤ０と定義した。投与経路は腹腔内注射であり、週１回の注射を６週間行った。ｈＰＢＭＣの腹腔内注射をグループ分けの８日後に行った。モデリングと具体的なレジメンを表１９に示す。投与後、各群の腫瘍の長さ及び幅を測定し、腫瘍容積を算出した。
抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質の抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏで測定するため、まず、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣより購入）を、６．７１～９．５７週齢の雌のＳｃｉｄ Ｂｅｉｇｅマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）の乳房脂肪体に皮下接種した。接種の１７日後、マウスを腫瘍容積によりランダムに８個体ずつの３群に分けた。各マウスにヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）を腹腔内注射し、投与を行って、グループ分けの日をＤ０と定義した。投与経路は腹腔内注射であり、週１回の注射を６週間行った。ｈＰＢＭＣの腹腔内注射をグループ分けの８日後に行った。モデリングと具体的なレジメンを表１９に示す。投与後、各群の腫瘍の長さ及び幅を測定し、腫瘍容積を算出した。
【表20】
【0195】
結果を図３０に示す。結果は、アイソタイプ対照抗体と比べ、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＧＦ－βＲの融合タンパク質ＴＦ０１が、マウスにおける腫瘍の成長を効果的に阻害できたことを示す。
【0196】
また、図３１に示すように、担がんマウスは試験薬剤ＴＦ０１に対して耐性が高く、各群の担がんマウスの体重への影響は無かった。
【0197】
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載したが、当業者は、開示されたあらゆる教示に従い、それらの詳細に対して各種改変及び置換を行いうることを理解するであろう。これらの変更は全て本発明の保護範囲内に含まれる。本発明の完全な範囲が、添付の請求の範囲及びその任意の等価物によって提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】