特表 2024-532850 がん及びがん療法に関連する自己免疫を含む、自己免疫を処置するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】がん及びがん療法に関連する自己免疫を含む、自己免疫を処置するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/08 20190101AFI20240903BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

A61K38/08

A61P37/02

A61P11/06

A61P37/08

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P25/00

A61P13/12

A61P3/10

A61P17/06

A61P17/00

A61P19/08

A61P37/06

A61P35/00

A61K38/10

A61P37/04

A61K45/00

A61K47/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510263

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 AU2022050932

(87)【国際公開番号】W WO2023019323

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】2021902626

(32)【優先日】2021-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520448360

【氏名又は名称】インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】アグレズ，マイケル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC07

4C076CC09

4C076CC15

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC21

4C076CC27

4C076EE59

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA09

4C084BA17

4C084BA18

4C084BA24

4C084MA52

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA59

4C084ZA61

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB09

4C084ZB13

4C084ZB15

4C084ZB26

4C084ZC35

(57)【要約】

本発明は、自己免疫障害を処置するために、対象において、低レベルのＩＬ－２を含む、ＩＬ－２恒常性を維持するための方法及び組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２ＡＤｏｄ）_４－ＮＨ_２、または全残基がＤ－アミノ酸と置換され、２つもしくは４つの２Ａｄｏｄにコンジュゲートされている同じ配列を有するペプチドから選択される２－アミノ－ドデカン酸（２Ａｄｏｄ）－コンジュゲートペプチドを含む。
【選択図】図２ｇ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における自己免疫障害を処置または予防する方法であって、前記方法が、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを、前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項2】

前記自己免疫障害が、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記自己免疫障害が、ＩＬ－２媒介性障害である、請求項１または２に記載の方法

【請求項4】

前記自己免疫疾患が、調節不全のＩＬ－２及び／またはＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生と関連する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記対象が、ＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生が欠損している、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記自己免疫障害が、アレルギー性喘息、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び他のループス障害、１型インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、乾癬、強皮症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、ならびにＧＶＨＤからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記方法が、前記対象におけるＩＬ－２及び／またはＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）のレベルを決定することによって、処置のための対象を選択することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記方法が、前記対象におけるＩＦＮｇ及び／またはＩＬ－１２ｐ４０のレベルを決定することによって、処置のための対象を選択することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記対象が、がんを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記対象が、がん療法を受けている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記対象が、チェックポイント阻害剤療法を受けている、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、Ｌｃｋの活性及び／またはＧ－タンパク質シグナル伝達を調節して、前記対象におけるＩＬ－２の恒常性レベルを維持する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＩＬ－２の恒常性レベルが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞からなる群から選択される細胞によって産生される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、ＩＦＮｇ及び／またはＩＬ－１２ｐ４０を誘導しない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、経口的及び／または局所的に投与される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記ペプチドが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

対象における自己免疫障害を処置または予防する方法における、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。

【請求項18】

対象における自己免疫障害を処置するための薬品の製造における、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用。

【請求項19】

対象における自己免疫障害の処置のための、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、経口用量形態

【請求項20】

前記ペプチドが、経口的にまたは局所的に投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記ペプチドが、注射によって投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記ペプチドが、関節への注射によって投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記ペプチドが、薬学的組成物の形態で投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記薬学的組成物が、がん免疫療法と同時にまたは連続して前記対象に投与される、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、自己免疫障害を処置するために、対象において、低レベルのＩＬ－２を含む、ＩＬ－２恒常性を維持するための方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患は、組織破壊をもたらす自己抗原の産生に向けられた機能不全Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞の作用によって誘導され得る。非受容体Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）メンバーは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴの活性化及びＩＦＮｇの産生を介して自己免疫に寄与し得る炎症促進性シグナル伝達経路の重要なメディエーターである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化及びシグナル伝達は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）産生をもたらし、ＴＣＲ関連リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、Ｌｃｋは、自己免疫またはアネルギーのいずれかを回避するために、ＩＬ－２産生の微調整において重要な役割を果たす。

【0003】

自己免疫疾患に利益をもたらすレベルでのＩＬ－２の維持を提供するＩＬ－２恒常性の調節因子が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

一実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置または予防する方法であって、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２，ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを、対象に投与することを含む、当該方法を提供する。

【0005】

別の実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害である、本明細書に記載される方法を提供する。

【0006】

更なる実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、ＩＬ－２媒介性障害である、本明細書に記載される方法を提供する。

【0007】

更なる実施形態では、本発明は、自己免疫疾患が、調節不全のＩＬ－２及び／またはＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生に関連する、本明細書に記載される方法を提供する。

【0008】

更なる実施形態では、本発明は、対象が、ＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生が欠損している、本明細書に記載される方法を提供する。

【0009】

更なる実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、アレルギー性喘息、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び他のループス障害、１型インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、乾癬、強皮症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、ならびにＧＶＨＤからなる群から選択される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0010】

更なる実施形態では、本発明は、対象が、がんを有する、本明細書に記載される方法を提供する。

【0011】

更なる実施形態では、本発明は、対象が、がん療法を受けている、本明細書に記載される方法を提供する。

【0012】

更なる実施形態では、本発明は、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、Ｌｃｋの活性及び／またはＧ－タンパク質シグナル伝達を調節して、対象におけるＩＬ－２の恒常性レベルを維持する、本明細書に記載される方法を提供する。

【0013】

更なる実施形態では、本発明は、ＩＬ－２の恒常性レベルが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞からなる群から選択される細胞によって産生される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0014】

更なる実施形態では、本発明は、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、ＩＦＮｇ及び／またはＩＬ－１２ｐ４０を誘導しない、本明細書に記載される方法を提供する。

【0015】

更なる実施形態では、本発明は、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２，ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、経口的及び／または局所的に投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0016】

更なる実施形態では、本発明は、ペプチドが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、本明細書に記載される方法を提供する。

【0017】

更なる実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置または予防する方法における、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドの使用を提供する。

【0018】

更なる実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置するための薬品の製造における、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドの使用を提供する。

【0019】

更なる実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害の処置のための、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、経口用量形態を提供する。

【0020】

更なる実施形態では、本発明は、ペプチドが、経口的または局所的に投与される、本明細書に記載される使用を提供する。

【0021】

更なる実施形態では、本発明は、ペプチドが、注射によって投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0022】

更なる実施形態では、本発明は、ペプチドが、薬学的組成物の形態で投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0023】

更なる実施形態では、本発明は、薬学的組成物が、がん免疫療法と同時にまたは連続して対象に投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】Ｓｒｃファミリーキナーゼの選択的標的化。アッセイを、実施例１に記載されるように実施した。

【図2】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２を使用したＩＬ－２恒常性の維持。（ａ）（ｂ）：ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ_２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに２４時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ６９について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。データを、ＣＤ８^＋Ｔ細胞内のＣＤ６９発現（％及び平均蛍光強度、ＭＦＩ）＋ＳＥＭ、ｎ＝４内として提示した。ＩＫ１４００４（０．３１及び０．６３μＭ）の存在下で処置した培養物をｎ＝３として表す。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による混合効果分析を使用して決定される、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、平均非刺激対照群値を表す。（ｃ）ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに２４時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後、上清を収集し、ＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）についてＥＬＩＳＡによって評価した。データは、ＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として示した。試験ペプチドをビヒクル対照群と比較したダネットの事後検定による反復測定（ＲＭ）二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、非刺激対照値を表す。ＩＬ－２産生は、７２時間の時点で検出レベルを下回った。（ｄ）、（ｅ）：刺激したＰＢＭＣからのＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞におけるＣＤ２５発現。新たに単離したＰＢＭＣを、指示濃度（μＭ）の試験ペプチドＩＫ１４００４の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。データを、４人のドナーからの平均＋／－ＳＥＭとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であり、ダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して、各ペプチドの濃度をビヒクル（０）と比較した。（ｆ）ＣＤ１４＋単球を新たなＰＢＭＣから単離し、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、細胞をＣＤ２５発現についてフローサイトメトリーによって評価した。提示されたデータは、ペプチド処置後の陽性細胞の平均パーセンテージ、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｇ）単離したＴ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激し、ペプチドＩＫ１４００４とともに５濃度範囲＋ビヒクル対照（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、上清を収集し、ＩＬ－２についてＥＬＩＳＡによって評価した。提示されたデータは、平均ＩＬ－２ｐｇ／ｍＬ＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｈ）１２ウェルプレートを、ＰＢＳ中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）の溶液（総体積２５０μｌ／ウェル）でコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コーティング溶液を吸引し、コーティングされたウェルをＰＢＳ（２回、１ｍｌ、５分）で穏やかに洗浄した。ＪＣａＭ１．６細胞を「抗ＣＤ３コーティングされたウェル」に（１×１０^６細胞／ウェル）で播種し、その後、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で刺激し、また、様々な濃度のペプチドＩＫ１４００４（０、０．６２５、１．２５、及び２．５μＭ）で処置した。次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。細胞懸濁液を顕微鏡下で確認し、次いで２ｍｌの標識チューブに移し、３０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清及びペレットを各試料について分離し、上清（１００μｌ、ｎ＝３）をＩＬ－２含有量についてＥＬＩＳＡを使用して分析した。（ｉ）ＣＤ３＋Ｔ細胞を、阻害剤Ａ－７７００４１（１００ｎＭ）の存在下で、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）もしくはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３抗ＣＤ２８刺激ビーズ（細胞対ビーズ比率４：１）で刺激した。７２時間後、細胞を回収し、ＧＮＡ１１について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。ＧＮＡ１１発現を、ＰＥコンジュゲートロバＦ（ａｂ’２）抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体を使用して検出した。データを、ＣＤ４^＋Ｔ細胞内のＧＮＡ１１発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による反復測定（ＲＭ）二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、平均非刺激対照群値を表す。（ｊ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ビヒクル対照（０．１％ＤＭＳＯ）、小分子阻害剤Ａ－７７００４１（１００ｎＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３抗ＣＤ２８刺激ビーズ（細胞対ビーズ比率４：１）で７２時間刺激した。７２時間後、上清を収集し、ＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）についてＥＬＩＳＡによって評価した。データを、ＩＬ－２（ｐｇ／ｍＬ）＋／－ＳＥＭ、ｎ＝１２として示した。Ａ－７７００４１を０．１３％水ビヒクル対照と比較した対応のないｔ検定を使用して決定される、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。

【図3】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ４）による炎症促進性サイトカインの抑制。（ａ）ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。７２時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによって評価された生存率について染色した。データを、生存細胞％＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による反復測定（ＲＭ）二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、平均非刺激対照群値を表す。（ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ビヒクル対照または試験ペプチド（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、細胞対Ｄｙｎａｂｅａｄｓ比率４：１の抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激した。７２時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーを使用して評価した生存率について染色した。データを、生存細胞％＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示し、ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。赤い点線は、刺激のみを示し、青い点線は、非刺激対照を示す。（ｃ）未成熟単球由来のＤＣ（ｉＭｏＤＣ）は、Ｍｏ－ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球に由来した。ｉＭｏＤＣを、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、細胞を、フローサイトメトリーによって生存率について評価した。提示されたデータは、ペプチド処置後の生存細胞の平均パーセンテージ、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。（ｄ）未成熟単球由来のＤＣ（ｉＭｏＤＣ）は、Ｍｏ－ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球に由来した。ｉＭｏＤＣを、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、細胞を、フローサイトメトリーによって細胞内Ｋｉ６７の発現について評価した。提示されたデータは、ペプチド処置後のＫＩ６７の幾何平均ＭＦＩ、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｅ）、（ｆ）未成熟単球由来のＤＣ（ｉＭｏＤＣ）は、Ｍｏ－ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球に由来した。ｉＭｏＤＣを、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、上清を収集し、ＩＬ－１２ｐ４０レベルについてＥＬＩＳＡによって評価した。提示されたデータは、ビヒクル対照に対して正規化された平均ｐｇ／ｍＬ値及び倍率変化、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析するか、または最低試験ペプチド用量に対して正規化される場合、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｇ）、（ｈ）刺激したＰＢＭＣを、ペプチドＩＫ１４００４とともに５濃度範囲＋ビヒクル対照（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、上清を収集し、ＩＬ－１２ｐ４０についてＥＬＩＳＡによって評価した。提示されたデータは、平均ｐｇ／ｍＬ値及び倍率変化データ（ビヒクル対照に対して正規化されている）、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析するか、またはデータが正規化される場合、ペプチド濃度を最低試験ペプチド濃度と比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。点線は、正規化されたデータの平均ビヒクル対照を示す。（ｉ）刺激ＰＢＭＣアッセイ（２４時間）における、ＩＬ－１２ｐ７０産生に対するペプチドの効果。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激及びＩｎｔｅｒ Ｋペプチドとともに５濃度範囲（０～１．２５μＭ）について２４時間培養し、その後、上清を収集し、ＩＬ－１２ｐ７０についてＥＬＩＳＡによって分析した。提示されたデータは、ペプチド処置に応答する平均サイトカイン産生（ｐｇ／ｍＬ）、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。ダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡによって決定される統計的有意性はなかった。（ｊ）、（ｋ）刺激したＰＢＭＣからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ発現。新たに単離したＰＢＭＣを、指示濃度（μＭ）の試験ペプチドＩＫ１４００４の存在下で、（－ａＣＤ３）抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。データを、４人のドナーからの平均＋／－ＳＥＭとして提示する。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であり、ダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して、各ペプチドの濃度をビヒクル（０）と比較した。（ｌ）刺激したＰＢＭＣを、ペプチドＩＫ１４００４とともに５濃度範囲＋ビヒクル対照（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、上清を収集し、ＩＦＮ－γについてＥＬＩＳＡによって評価した。提示されたデータは、平均ｐｇ／ｍＬ値、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｍ）ＰＢＭＣからの単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞対ビーズ比率４：１の抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズの存在下で、ＭＱ水またはビヒクル対照中に配合された試験ペプチド（０．０８～１．２５μＭ）とともに培養した。７２時間後、上清を収集し、ＩＦＮ－γについてＥＬＩＳＡによって評価した。データを、ｐｇ／ｍＬ＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示し、ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。（ｎ）未成熟単球由来のＤＣ（ｉＭｏＤＣ）は、Ｍｏ－ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球に由来した。ｉＭｏＤＣを、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、細胞をフローサイトメトリーによってＣＤ１４及びＣＤ１１ｃの発現について評価して、ＤＣ細胞表現型を決定した。提示されたデータは、ペプチド処置に応答するＣＤ１１ｃ陽性集団内のそれぞれの平均ＣＤ１４陽性または陰性細胞集団（％）、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各ペプチド濃度をビヒクルと比較したダネットの事後検定によるＲＭ二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｏ）ＰＢＭＣを、ビヒクル対照または試験ペプチド（０．０８～１．２５μＭ）とともに２４時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後、上清を収集し、ＩＬ－１０濃度についてＥＬＩＳＡによって評価した。データを、ｐｇ／ｍＬサイトカイン濃度＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による一元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。赤い点線は、刺激培地対照のみを示し、青い点線は、非刺激対照を示す。

【図4】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２によるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の選択的標的化。（ａ）ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝４、正常な健康なボランティアから採取）を、密度勾配分離を使用して軟膜から調製した。ＣＤ３＋全Ｔ細胞集団を、免疫磁気分離によって単離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、カタログ番号１９０５１、ロット番号１９Ｅ１０２８７６Ａ）。細胞を、ＲＰＭＩ－１０（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ－１６４０）中に０．５×１０^６／ｍＬで再懸濁し、１ウェル当たり０．５×１０^５の密度（１００μＬ）で９６ウェルの平底培養プレートにプレートした。細胞培養物を、細胞対ビーズ比率４：１の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１３１Ｄ、ロット番号００９８４６６８）で刺激し、ペプチドの存在下で７２時間培養した。培養の終わりに、細胞を回収し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｆｉｘ緩衝液Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５７８７０）を使用して固定し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８０５０）を使用して細胞内染色を可能にするように透過化した。次いで、細胞を、ホスホ－ＳＴＡＴ１タンパク質を検出する蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｓｔａｔ１（ｐＹ７０１）番号５６２０６９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ロット番号０１７０５４３））。ホスホ－ＳＴＡＴ１細胞内発現を、個々のＴ細胞集団内でフローサイトメトリーによって決定した。（ａ）ＰＢＭＣを使用してＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、単離したＴ細胞をビヒクル対照または試験ペプチド（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、細胞対ビーズ比率４：１の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激するか、または非刺激のままにした。７２時間後、細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びｐＳＴＡＴ１について染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を評価した。データを、ＣＤ４^＋Ｔ細胞％（Ａ）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のｐＳＴＡＴ１発現％（Ｂ）、及びｐＳＴＡＴ１ ＭＦＩ（Ｃ）、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される、＊ｐ＜０．０５であった。赤色の点線は、刺激のみを示し、青色の点線は、非刺激対照を示す。ｐＳＴＡＴ１－ＰＥのアイソタイプ対照値：３４５．２５ ＭＦＩ。（ｃ）軟膜試料（ｎ＝４）から回収したＰＢＭＣを使用して、免疫磁気分離によってＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を単離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、それぞれカタログ１９０５１Ｃ、１７８５２Ｃ、１７９５３Ｃ）。細胞をＲＰＭＩ－１０中に０．５×１０６／ｍＬで再懸濁し、１ウェル当たり０．５×１０５の密度（１００μＬ）で９６ウェルの平底培養プレートに播種した。細胞を、細胞対ビーズ比率４：１の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ００７８８９０１）で刺激し、ＭＱ水（ロット２１５２９０１）中に配合された試験ペプチドＩＫ１４００４の存在下で７２時間培養した。７２時間後、細胞を、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物から回収し、ＣＤ４＋Ｔ細胞画分内の細胞内ホスホＳＴＡＴ６発現についてフローサイトメトリーによって評価した。データを、平均蛍光強度（ＭＦＩ）＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示し、Ｉｎｔｅｒ－Ｋペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。（ｅ）単離したＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ_２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３抗ＣＤ２８刺激ビーズ（細胞対ビーズ比率４：１）で刺激した。７２時間後、細胞を回収し、ｐＳＴＡＴ３について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。データは、ｐＳＴＡＴ３発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）ＣＤ４＋Ｔ細胞＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を提示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による反復測定（ＲＭ）二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される統計的有意性はなかった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、平均非刺激対照群値を表す。（ｆ）、（ｇ）ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。７２時間後、細胞を回収し、ＩＬ－６Ｒ（ＣＤ１２６）について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。データを、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞内でのＣＤ１２６発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４として提示した。ペプチドをビヒクル対照と比較したダネットの事後検定による反復測定（ＲＭ）二元ＡＮＯＶＡを使用して決定される、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。赤い点線は、平均刺激培地のみの対照値を表し、青い点線は、平均非刺激対照群値を表す。

【図5】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２と同様に、Ｌｃｋを活性化し、ｃ－Ｓｒｃを阻害する。

【図6】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＭＡＰ４Ｋ１キナーゼ活性を阻害する。

【図7】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、Ｔ細胞上のＣＤ２８レベルを増加させる。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激及びＩＫ１４００４とともに５濃度範囲（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、細胞をＣＤ２８の発現についてフローサイトメトリーによって評価した。提示されたデータは、ペプチド処置に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるそれぞれの平均発現、＋／－ＳＥＭ、ｎ＝４を示した。データを、ダネットの事後検定による二元ＡＮＯＶＡによって分析し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１であった。＊＊＊は、線の下の全ての棒グラフがビヒクルと比較して有意であることを示す。赤色の点線は、非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。

【図8】Ｄアミノ酸を含むｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、再刺激時に疲弊したＣＤ４＋細胞上でＩＬ－２発現を増加させる。上清を７２時間後に培養物において収集し、多重イムノアッセイによって測定されたＩＬ－２サイトカイン産生を評価した。データを、ビヒクル対照（０）に対して正規化された４つの生物学的複製物からの平均±ＳＥＭとして提示した。＊＊Ｐ＜０．０１であり、ダン事後検定によるノンパラメトリック一元ＡＮＯＶＡ（フリードマン）を使用して、各用量レベルでの群を最低レベル（０．０８μＭ）と比較した。

【図9】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ２５＋細胞の割合を増加させる。

【図10】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＣＤ４＋細胞に対するＴｒｅｇの比率を増加させる。Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ２５＋細胞の増加した割合は、より高い濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２でのＣＤ４／Ｔｒｅｇ比率に反映される。

【図11】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ２５＋細胞の割合の増加を誘導し、Ｆｏｘｐ３発現レベルの統計的に有意な増加とは関連しない。

【図12】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）の腹腔内投与が、ルイス肺癌（ＬＣＣ）転移モデルにおいて肺の腫瘍面積を低減させることを示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２を２週間にわたって週２回腹腔内投与し（４００μｇ）、その後、Ｈ＆Ｅ切片を腫瘍浸潤の証拠について評価し、腫瘍塊を健康な肺組織のパーセンテージとして計算した。データ点は、試料当たりの肺内の腫瘍塊の平均面積を示す。ｎ＝１６、＊＊ｐ＜０．０１、対のない両側ｔ検定である。

【図13】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ルイス肺癌（ＬＬＣ）異種移植モデルにおいて異種移植腫瘍体積及び腫瘍細胞生存率を低減させることを示す。

【図14】ａ）ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞増殖を阻害しないこと、ｂ）ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ルイス肺癌細胞増殖を阻害しないことを示す。

【図15】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、転移性肺癌モデルにおいて肺結節を低減させることを示す。

【図16】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ＮＫ細胞上のＩＬ－１２受容体発現を増強することを示す。

【図17】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ＮＫ細胞上のＩＬ－１２受容体発現を増強することを示す。

【図18】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４４発現を増強することを示す。

【図19】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体発現を増強することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

非受容体Ｓｒｃキナーゼファミリー（ＳＫＦ）のメンバーは、哺乳動物において、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｆｇｒ、Ｌｙｎ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、及びＢｌｋの８つのキナーゼを含む。

【0026】

本発明は、部分的に、ｃ－Ｓｃｒ及びＬｃｋの活性に対して相反する効果を有し、これによりＩＬ－２の恒常性レベルの維持が可能になる、合成ペプチドの開発に基づく。

【0027】

具体的には、本発明者らは、実施例１において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２及びＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２が、ｃ－Ｓｒｃを阻害し、Ｌｃｋを活性化することを実証する。

【0028】

したがって、一実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置または予防する方法であって、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを対象に投与することを含む、当該方法を提供する。

【0029】

本明細書で使用される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_１－ＮＨ_２は、互換的にＩＫ１４００１またはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ１）と称される。本明細書で使用される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２は、互換的にＩＫ１４００２またはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ２）と称される。本明細書で使用される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_３－ＮＨ_２は、互換的にＩＫ１４００３またはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ３）と称される。本明細書で使用される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、互換的にＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ４）またはＩＫ１４００４と称される。

【0030】

実施例１のデータは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、Ｃｓｋ及びＳＦＫメンバーに対するその効果を考慮して、ある程度の選択性を発揮することを示唆している。本発明者らはまた、図５において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２と同様に、ｃ－Ｓｒｃを阻害し、Ｌｃｋを活性化すること、ならびにＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２が、１及び３ｕＭで、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２と同様に挙動することを実証し、実証した。（データ図示せず）。

【0031】

この結果は、驚くべきことに、部分的には、Ｓｒｃキナーゼファミリーメンバーが同様の構造を共有する非受容体チロシンキナーゼであることに起因し、これは、保存されたチロシンを介した活性化及び不活性化がＳＦＫ間で共有される特徴である可能性が高いため、課題を提示する。したがって、これまでに報告された全てのＬｃｋ活性化因子が、他のＳＦＫメンバーを活性化することが示されている。更に、免疫細胞において発現される複数のＳＦＫの存在とともにＳＦＫ阻害剤の非選択性を考慮すると、ＳＦＫファミリーの任意の所与のメンバーを特定のシグナル伝達経路に関与させて、例えば、所望のシグナル伝達経路の調節を可能にすることは依然として困難である。

【0032】

本明細書で使用される場合、「活性化すること」という用語は、一般に、少なくとも１つの標的タンパク質の活性を増加させることを指す。キナーゼの特定の文脈では、この活性化は、少なくとも１つの標的基質または部位のリン酸化の増加をもたらす。この活性化は、タンパク質キナーゼとタンパク質キナーゼの結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加させること、またはその標的に結合されるとキナーゼの活性を増加させることを含む（これらに限定されない）、任意の手段によって引き起こされ得る。そのような活性化は、インビボまたはインビトロのいずれかで行われ得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、「阻害すること」という用語は、一般に、少なくとも１つの標的タンパク質の活性を減少させることを指す。この阻害は、タンパク質キナーゼとタンパク質キナーゼの結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を低下させること、またはその標的に結合されるとキナーゼの活性を減少させることを含む（これらに限定されない）、任意の手段によって引き起こされ得る。そのような阻害は、インビボまたはインビトロのいずれかで行われ得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、治療的処置ならびに予防的処置（個体において、障害もしくは障害の症状の発症を完全に予防すること、または障害の症状の発症、もしくは前臨床的に明らかな障害の段階を遅延させることのいずれか）を含む。

【0035】

「予防すること」という用語は、個体において、障害もしくは障害の症状の発症を完全に予防すること、または障害もしくは障害の症状の発症、あるいは障害の前臨床的に明らかな障害の段階を遅延させることのいずれかを含む。これには、例えば、自己免疫疾患などの疾患を発症するリスクのある者の予防的処置が含まれる。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）の別の用語である。

【0036】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト対象を含む。好ましくは、対象は、哺乳動物である。

【0037】

本明細書で使用される場合、「自己免疫障害」は、通常、体内に存在する物質及び組織に対する身体の過活動免疫応答、例えば炎症状態から生じる疾患を指す。自己免疫疾患及び自己免疫障害という用語は、本明細書において互換的に使用される。

【0038】

本明細書で使用される「有効量」（例えば、「治療有効量」または「薬学的有効量」）は、所望の分子応答または細胞応答、例えば、ＩＬ－２恒常性をもたらす、本明細書に記載されるペプチドの量を指す。当該「有効量」は、個体の年齢及び全身状態に応じて、また、処置または予防される特定の自己免疫状態、処置の期間、過去の処置、ならびに自己免疫状態の性質及び既存の期間などの要因に応じて、対象によって変動する。有効量のペプチドは、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰または非許容毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに対象に投与され得る量であるが、本明細書全体を通して開示されるものなどの適切な技術によって評価される所望の効果を提供するのに十分な量を含む。したがって、正確な有効量を指定することは不可能であるが、当業者であれば、慣用的な実験及び背景一般知識を使用して、任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができるであろう。本文脈における治療的結果は、症状の根絶または軽減を含む。治療的結果は、状態の完全な改善（すなわち、治癒）である必要はない。

【0039】

本明細書に記載されるペプチドは、本発明の方法に従って哺乳動物に投与され得るか、または細胞は、インビトロでペプチドと接触し得る。同様に、本発明は、細胞が、対象に細胞を戻す前、対象への細胞の投与前、または対象への細胞の移植前に、対象の外部においてペプチドで処置される、エクスビボ処置を提供する。

【0040】

本明細書に記載されるペプチドは、意図される対象への投与のための、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を含む、薬学的組成物において提供され得る。ペプチドは、経口的に、鼻腔内に、吸入を介して（例えば、エアゾールスプレーによって）、静脈内に、非経口的に、直腸内に、皮下に、注入によって、局所的に、筋肉内に、腹腔内に、髄腔内に、眼内に、または対象の関節への投与を含む適切とみなされる任意の他の経路を介して投与され得る。

【0041】

好ましくは、ペプチドは、経口的及び／または局所的に投与される。

【0042】

一実施形態では、局所投与は、関節への投与を伴う。

【0043】

薬学的組成物は、例えば、液体、懸濁液、乳濁液、シロップ、クリーム、摂取可能な錠剤、カプセル、丸薬、座薬、粉末、トローチ、エリキシル、または選択された投与経路に適切な他の形態であり得る。

【0044】

本発明による方法で有用な薬学的組成物には、水性薬学的溶液が含まれる。注射可能な組成物は、注射可能性が存在する程度まで流体であり、典型的には、製造後の保管を提供するために、通常、所定の期間安定である。更に、薬学的に許容される担体は、任意の好適な従来知られている溶媒、分散媒、水、生理食塩水、及び等張調製物または溶液、界面活性剤を含み得、任意の好適な薬学的に許容される担体（例えば、経口的または局所的に許容される担体）が利用され得る。好適な分散媒は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含有し得る。具体的には、本明細書に記載されるＬｃｋ調節因子または核酸は、例えば、不活性希釈剤、同化可能な食用担体と製剤化され得、及び／または硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセルに封入され得る。

【0045】

本明細書に記載される薬学的組成物はまた、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどのインビボ及び／または局所投与に好適な１つ以上の保存剤を組み込み得る。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させるための薬剤を組成物中で使用することによって、組成物の長期吸収がもたらされ得る。本明細書に記載されるペプチドを含有する錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、もしくはアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味剤；ならびに香味剤のうちの１つ以上を含有し得る。

【0046】

薬学的組成物における上述の成分及び媒体の使用は周知である。任意の従来の媒体または成分が本明細書に記載されるＬｃｋ調節因子と適合しない場合を除き、本明細書に記載される治療的及び予防的薬学的組成物におけるそれらの使用が含まれる。

【0047】

本明細書で使用される「併用療法」とは、本発明によるペプチドを、同じまたは異なる製剤で、同じまたは異なる経路によって他の薬物（複数可）に、事前、同時、または連続的に投与することを意味し、それによって、Ｌｃｋ調節因子（複数可）及び／または核酸（複数可）は、重複する治療域においてにそれらの効果（複数可）を発揮する。

【0048】

投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与量単位形態に製剤化することが特に好ましい。本明細書で使用される投与量単位形態は、処置される対象のために単位的な投与量として適した物理的に別個の単位を意味すると解釈されるべきであり、各単位が、使用される関連の担体及び／または賦形剤と関連して所望の治療的または予防的効果をもたらすように計算された本発明による所定の量の少なくとも１つのＬｃｋ調節因子または核酸を含有する。投与量単位形態が、例えば、カプセル、錠剤、または丸薬である場合、様々な成分をコーティング（例えば、セラック、糖、またはその両方）として使用して、投与量単位の物理的形態を修正するか、または対象への投与を容易にし得る。

【0049】

薬学的組成物は、一般に、少なくとも約１重量％の本明細書に記載されるペプチドを含有する。このパーセンテージは、変動し得、便宜的には、組成物または調製物の約５％～約８０％ｗ／ｗであり得る。この場合も、本発明によるペプチドの量は、提案された投与経路を考慮して、好適な有効投与量が対象に送達されるようなものである。好ましい経口薬学的組成物は、約０．１μｇ～１５ｇのペプチドを含有する。

【0050】

本発明によるＬｃｋ調節因子または核酸の投与量は、ペプチドが予防的または治療的使用のために投与されるかどうか、薬剤の投与が意図される疾患、状態、または目的、疾患または状態の重症度、対象の年齢、ならびに対象の体重及び一般的な健康状態を含む関連因子を含む、認められている原則に従って医師または随伴者によって決定され得る多くの因子に依存する。例えば、最初に低投与量が与えられ得、これはその後、対象の応答の評価後に各投与時に増加される。同様に、投与頻度は、同じように、すなわち、各投与間の対象の応答を連続的にモニタリングし、必要に応じて、投与頻度を増加させるか、または代替的に投与頻度を低減させることによって決定され得る。

【0051】

典型的には、本明細書に記載されるペプチドは、最大約１００ｍｇ／ｋｇ個体体重、より通常は最大約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、及び最も通常は約５ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のペプチドの投与量を提供するように、本発明によって具体化される方法に従って投与される。少なくともいくつかの実施形態では、ペプチドは、約５～２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、通常は約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、及びより通常は１０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲のペプチドの投与量を提供するように投与される。経口的に投与する場合、１日当たり最大約２０ｇのペプチドが投与され得る（例えば、１日当たり４回の経口用量、各用量は５ｇのペプチドを含む）。

【0052】

静脈内経路に関して、特に好適な経路は、処置される組織または特定の臓器（複数可）に供給する血管へのペプチドの全身分布のための注射を介したものである。更に、ペプチドは、任意の好適な注入または灌流技術によって送達され得る。ペプチドはまた、例えば、胸膜腔もしくは腹膜腔などの空洞内に送達され得るか、または処置される組織に直接注射され得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、配列は、単離または精製配列である。

【0054】

天然または組換え技術によって産生される配列の「単離」及び「精製」の方法は、当該技術分野、例えば、Ｃ－Ｈ Ｌｅｅ，Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；２０１７，Ｍａｒｃｈ；３２（１）：１８において既知である。更に、「単離された」または「精製された」という用語は、合成された配列及び他の人工的に産生された配列を含む。配列を合成するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、配列は、一方のアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との縮合反応によって化学的に合成される。配列の化学的合成は、溶液相技術または固相技術を使用して実行され得る。合成技術は、非天然アミノ酸配列を組み込む配列の産生、骨格修飾、及びＤ－異性体の合成を可能にし得る。

【0055】

本明細書に記載されるように、本発明者らは、本明細書に記載されるＬｃｋ調節ポリペプチドが、ＬまたはＤアミノ酸を含み、例えば、低レベルのＩＬ－２の誘導において生物学的活性を有し得ることを特定した。当該技術分野において既知であるように、アルファアミノ酸は、アルファ位置にキラル炭素を含む。その結果として、グリシンを除く全てのアルファアミノ酸は、Ｌ－またはＤ－異性体である２つの鏡像異性体のいずれかに存在し得る。一般に、Ｌ－アミノ酸のみが哺乳動物細胞において製造され、タンパク質に組み込まれる。Ｄ－アミノ酸は、人工的に合成され得るか、または細菌タンパク質中に見出され得る。Ｌ及びＤ規則は、アミノ酸の立体化学を直接指すために使用されるのではなく、むしろ、アミノ酸構成を参照して使用され、アミノ酸自体の光学活性を指すのではなく、むしろ、そのアミノ酸が合成され得るグリセルアルデヒドの異性体の光学活性を指す（Ｄ－グリセルアルデヒドは右旋性であり、Ｌ－グリセルアルデヒドは左旋性である）。

【0056】

本明細書で使用される場合、小文字は、右旋性（「デキストロ」）アミノ酸を示し、したがって、ペプチドｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、Ｄアミノ酸を含む。

【0057】

一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２またはｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、本発明の配列は、修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、配列の薬理学的特性を変化させる修飾であり得る。いくつかの実施形態では、修飾は、本発明の組成物または配列の半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、修飾は、配列（及び／または本発明の組成物）の生物活性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、修飾は、本発明の配列または組成物の選択性を増加させる修飾であり得る。

【0059】

一実施形態では、修飾は、保護基の付加である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基、または側鎖保護基であり得る。本発明の配列は、これらの保護基のうちの１つ以上を有し得る。当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための好適な技術を認識している。これらの基は、当該技術分野において既知である調製方法によって付加され得る。基は、配列上に残り得るか、または使用もしくは投与の前に除去され得る。保護基は、合成中に付加され得る。

【0060】

本発明者らは、Ｌｃｋ活性化ペプチドをアミド化することが、Ｌｃｋ活性のレベルを驚くほど増加させることを実証した。したがって、一実施形態では、本発明は、最遠位脂肪酸がアミド化されている、本明細書に記載されるペプチドを提供する。

【0061】

ポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、「ＮＨ_２」は、ポリペプチドが、アミド化されていることを示す。

【0062】

いくつかの実施形態では、配列は、そのＣ末端でアミド化されている。アミド化は、連続的なエンド及びエキソタンパク質分解によるグリシン伸長基質のＮ－酸化的開裂のプロセスを指す。酵素アミド化、組換え的に産生された配列及びタンパク質のＣ末端の化学的修飾、固相配列合成におけるアミド樹脂の使用、アンモニアの存在下でのカルボキシペプチダーゼの使用、ならびに配列のＣ末端のメチルエステルへの変換及び低温でのアンモニアの添加などの、インビトロでのアミド化配列を産生するための方法が、当該技術分野において既知である。好適な技術の開示の例としては、ＤＪ Ｍｅｒｋｌｅｒ，Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｍｉｄａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ－ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｄｅ ｔｏ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｊｕｎｅ；１６（６）：４５０－６、及びＶ Ｃｅｒｏｖｓｋｙ ａｎｄ Ｍ－Ｒ Ｋｕｌａ Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ａｍｉｄａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｏｒａｎｇｅ Ｆｌａｖｅｄｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ａｍｉｄａｓｅ；Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，１９９８，Ａｕｇｕｓｔ；３７（１３－１４）：１８８５）が挙げられる。

【0063】

Ｃ末端のアミド化は、Ｃ末端が無電荷であることをもたらすため、修飾配列は、天然タンパク質をより密接に模倣する。これは、細胞に入る配列の増強された能力；インビボでの配列の代謝安定性の改善；アミノペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、及びシンテターゼによる配列のインビボ酵素分解の減少；ならびに配列の貯蔵寿命の改善を含む、一連の利点を有し得る。

【0064】

ポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、Ａｄｏｄという用語は、アミノドデカン酸を指し、「２Ａｄｏｄ」は、２－アミノドデカン酸を指す。２つ以上の脂肪酸がカップリングされる場合、カップリングされた脂肪酸の数は、下付き文字によって示される。例えば、「（２Ａｄｏｄ）_２」は、２つの２－アミノドデカン酸を示す。したがって、本明細書に記載されるポリアミド部分の単一の単位は、１つの２－アミノドデカン酸残基（本明細書では「（２Ａｄｏｄ）_１」とも称される）に対応する。本明細書に記載されるポリアミド部分の２つの単位は、２つの２－アミノドデカン酸残基（本明細書では「（２Ａｄｏｄ）_２」とも称される）に対応する。本明細書に記載されるポリアミド部分の３つの単位は、３つの２－アミノドデカン酸残基「（２Ａｄｏｄ）_３」に対応する。本明細書に記載されるポリアミド部分の４つの単位は、４つの２－アミノドデカン酸残基「（２Ａｄｏｄ）_４」に対応する。

【0065】

本発明者らは、実施例１において、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲへの２つまたは４つの脂肪酸のカップリングが、ｃ－Ｓｒｃを阻害しなかったペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲへの１つまたは３つの脂肪酸のカップリングとは対照的に、Ｌｃｋ活性も活性化しながらｃ－Ｓｒｃ活性を阻害する能力の増加をペプチドに付与することを実証した。

【0066】

Ｌｃｋキナーゼの阻害は、自己免疫及びがんの両方に対する処置として提案されているが（Ｂｏｍｍｈａｒｄｔ Ｕ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２０１９，２０（１４）：３５００）いくつかの固形癌におけるＬｃｋの役割は依然として議論の余地がある。例えば、ＬｃｋはＮＳＣＬＣ細胞株において過剰発現されるが（Ｒｉｐｎｉｅｗｓｋａ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，９：２７３４６－２７３６２）、肺癌患者の腫瘍浸潤におけるその発現は、良好な予後に関連している（Ｄ’Ａｎｄｒｉｌｌｉ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ＆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２０１２，１５：１４８－１５１）。更に、黒色腫のゲノム分析は、Ｌｃｋ発現が生存期間の有意な改善に関連していることを示している（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｔｌａｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６１：１６８１－９６）。本明細書に提示されるデータに基づいて、本発明者らは、固形癌におけるＬｃｋの主な役割が、固有のがん細胞Ｌｃｋ異常ではなく、適切な免疫応答によって誘導される正の治療転帰を導くことであることを提案する（Ｃｒｅｅｄｅｎ ＪＦ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２０２０，２１：８８２３）。更に、本明細書に記載されるＮＫ細胞によって媒介される抗腫瘍活性は、多くの場合、Ｌｃｋを伴うサイトカイン受容体シグナル伝達経路によって調節される。例えば、ＮＫ細胞のＩＬ－２媒介性活性化は、ＮＫＧ２ＤなどのＮＫ免疫グロブリン様受容体の活性化をもたらし（Ｋｏｎｊｅｖｉｃ Ｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ，２０１０，２０（６）：４５９－６７、Ｌｅ Ｂｅｒｔ Ｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１４，９２：２３０－６、Ｈｕ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２０５、Ｓｋａｋ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，１２３（４）：５７５－５８３）、Ｌｃｋは、増強された細胞傷害性に関連するＮＫＧ２Ｄからの下流シグナル伝達の中心である（（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１６．００１７６）。

【0067】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つまたは４つの結合脂肪酸部分を含む。

【0068】

好ましい実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４及びＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。

【0069】

別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４及びＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。

【0070】

カップリングした２Ａｄｏｄは、１つの脂肪酸鎖のアミノ基置換基と次の脂肪酸の末端カルボキシル基との間にそれぞれのアミド結合を連続的に形成することによって脂肪酸を一緒にカップリングし、それによってカップリングした脂肪酸を提供することによって提供され得る。

【0071】

したがって、脂肪酸のαまたはβ炭素上にアミノ基（ＮＨ_２）置換基を有する脂肪酸は、カップリングに特に好適である。

【0072】

別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、最遠位脂肪酸は、アミド化されている。

【0073】

本発明者らは、実施例２において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がＩＬ－２産生を活性化すること、及び実施例５において、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がＩＬ－２産生を活性化することを実証した。

【0074】

重要なことに、ＩＬ－２レベルにおける低レベルの増加の維持が観察され、高レベルのＩＬ－２が回避される。

【0075】

したがって、一実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害である、本明細書に記載される方法を提供する。

【0076】

免疫系の恒常性及び活性化の間のＩＬ－２の主な役割は、十分認識されている。定常状態条件下では、低レベルのＩＬ－２は、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって維持され、二次リンパ器官では、ＩＬ－２は、免疫抑制性Ｔ調節性細胞集団（Ｔｒｅｇ）によって同じ部位で消費される。ＩＬ－２はまた、樹状細胞（ＤＣ）によって産生され、活性化されたＤＣは、隣接するエフェクター細胞にトランスで提示されるＴ細胞由来またはＤＣ由来のいずれかのＩＬ－２に結合するために、それらの細胞表面上でＣＤ２５を発現する。したがって、免疫応答中、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の拡大を制御するＩＬ－２シグナルによりＤＣ、Ｔｒｅｇ、及びＣＤ２５＋エフェクターＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞によって消費される。

【0077】

重要なことに、Ｔｒｅｇが生存のためにＩＬ－２に絶妙に依存していることを考慮すると、慢性自己免疫状態に対抗する免疫抑制性Ｔ細胞集団を維持するために、低ＩＬ－２レベルのみが必要である。更に、ＩＬ－２及び高親和性ＩＬ－２Ｒアルファ受容体鎖（ＣＤ２５）が欠損したヒトは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋免疫抑制性Ｔｒｅｇの産生障害、ならびにＳＬＥ、移植片対宿主疾患、及びＩ型糖尿病に対する低用量ＩＬ－２療法に起因して、全身的自己免疫を発症する。ＳＬＥを有する患者における低用量ＩＬ－２の皮下注射は、ＳＬＥ疾患活性指数（ＳＬＥＤＡＩ）の低下をもたらすが、ＩＬ－２の非常に短い半減期は、依然として課題である。

【0078】

本明細書に記載されるＴｈ１歪曲サイトカインの抑制と組み合わせた、ＩＫ１４００４によるＬｃｋ活性の選択的増強及びＩＬ－２産生の微調整（例えば、ＩＬ－２の治療域内）は、自己免疫障害の処置及び／または予防に関連する。免疫系の恒常性の間のＩＬ－２の役割は十分に認識されており、免疫抑制性Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞は、免疫寛容を維持する上で重要である。マウスにおけるＴｒｅｇの標的化された欠失は、重度の自己免疫をもたらし、Ｔｒｅｇの産生は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によるＴＣＲ活性化によって増強される。定常状態条件下では、低レベルのＩＬ－２は、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって維持され、Ｔｒｅｇによって二次リンパ器官で消費される。自己免疫を予防するための低用量ＩＬ－２の使用は（細胞傷害性リンパ球集団を拡大するための高用量ＩＬ－２の使用とは対照的に）、ＩＬ－２及びＣＤ２５が欠損したヒトが全身的自己免疫を発症し、ＳＬＥ、移植片対宿主疾患に対する低用量ＩＬ－２療法が有望な結果をもたらす限り、臨床的証拠と一致する。

【0079】

ＩＫ１４００４がＩＦＮｇ産生を阻害するという本明細書における実証にもかかわらず、過剰なＩＬ－２産生を回避することは、ＩＬ－２応答性細胞によって産生されるＩＦＮｇなどの免疫調節因子の下流カスケードからの大きなリスクを最小限に抑え、次いで、細胞溶解メカニズムを刺激する。例えば、過剰なＩＦＮｇシグナル伝達は、マウス及びヒトにおける自己炎症性疾患に関連しており、多発性硬化症におけるＩＦＮｇのレベルの上昇は、ＩＬ－１２の効果に起因すると考えられる。

【0080】

本発明者らが提案する理論に拘束されることを望まないが、低用量ＩＬ－２免疫療法は、Ｔｒｅｇ集団を維持し、自己免疫／慢性炎症性状態／組織移植片拒絶を処置するために提案されているが、高用量のＩＬ－２投与は、細胞傷害性リンパ球集団を拡大するために使用され、自己免疫障害の処置のために回避される。

【0081】

本発明者らはまた、実施例１において、Ｌｙｎが阻害されないことを実証した。Ｌｙｎチロシンキナーゼは、Ｂ細胞及び骨髄細胞における阻害シグナル伝達を調節し、Ｌｙｎの喪失は、高活性Ｂ細胞及び骨髄増殖によるループス様自己免疫疾患をもたらし、Ｌｙｎを維持することは自己免疫を回避する。

【0082】

本発明者らは、実施例１において、Ｈｃｋが阻害されることを更に実証した。Ｈｃｋ阻害剤は、様々な悪性腫瘍及び自己免疫疾患におけるそれらの調節役割についても周知である。

【0083】

重要なことに、実施例２は、ペプチドがＬｃｋ非依存性シグナル伝達経路も刺激し得ることを実証する。

【0084】

標準的なＬｃｋ調節ＴＣＲシグナル伝達経路に加えて、免疫応答はまた、サイトカイン応答の転写活性化におけるＧタンパク質の負の調節役割を介して近位ＴＣＲシグナルを微調整することにより、Ｌｃｋ非依存性及びＬｃｋ依存性の両方の方式でグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して媒介される。

【0085】

実施例３は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が正常なヒトＴ細胞上のＧＮＡ１１の発現を増強することを実証する。

【0086】

一実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害である、本明細書に記載される方法を提供する。一実施形態では、調節不全のＩＬ－２恒常性は、炎症である。

【0087】

本明細書で使用される場合、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害は、対象における調節不全のＩＬ－２恒常性に起因する障害を含む。理論に拘束されることを望まないが、ＩＬ－２シグナルは、胸腺ｔｒｅｇの分化、ｔｒｅｇ細胞の恒常性及び機能において主要な役割を果たし、低用量のＩＬ－２がｔｒｅｇ細胞の拡大を介して疾患を処置することができることが実証されている。本発明者らは、本明細書に記載されるペプチドが、低用量のＩＬ－２を誘導し、高レベルのＩＬ－２を誘導することを回避し得ることを実証した。高用量ＩＬ－２は、重度の副作用及び効能制限に関連する。

【0088】

一実施形態では、調節不全のＩＬ－２恒常性に関連する障害は、低用量のＩＬ－２産生及びｔｒｅｇ細胞の拡大から利益を受け得る障害である。例えば、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、ＨＣＶ誘導性血管炎、１型糖尿病、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、円形脱毛症、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であり、これらは、低用量のＩＬ－２産生及びｔｒｅｇ細胞の拡大から利益を得るであろう。

【0089】

多くの自己免疫疾患は、Ｔｒｅｇの機能または頻度の低下を特徴とし、適切な炎症促進性「低Ｔｒｅｇ」慢性疾患とみなされ得る。対照的に、進行がんは、抗炎症性の「高Ｔｒｅｇ」疾患である。これらの理由から、自己免疫疾患及び進行がんは、免疫学的に正反対のものと考えられ得る。

【0090】

本発明者らは、実施例６において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、ＩＫ１４００４の存在下で、増加したＦｏｘｐ３も発現したＣＤ２５発現細胞の割合を増加させ（図９）、これが、より高いＩＫ１４００４濃度でのＣＤ４／Ｔｒｅｇ比率に反映されたことを実証した（図１０）。しかしながら、これは、Ｆｏｘｐ３発現レベルの統計的に有意な増加とは関連しなかった（図１１）。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本明細書に記載されるペプチドを使用して、免疫療法を含むがん療法を受けている対象を含む、がんを有する対象における自己免疫を処置及び／または予防する対象におけるＴｒｅｇのレベルを促進し得ることを提案する。

【0091】

好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３陽性細胞である。

【0092】

別の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。

【0093】

一実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、ＩＬ－２媒介性障害である、本明細書に記載される方法を提供する。

【0094】

本明細書で使用される場合、ＩＬ－２媒介性障害は、ＩＬ－２の投与が、単独でまたは他の介入（例えば、化学療法、免疫療法、移植など）と組み合わせて、誠実な処置選択肢及び／または治験処置選択肢である障害を含むが、障害には、限定されないが、がん、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫症、高安病、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫肝炎、硬化性胆管炎、グジェロー－シェグレン症候群、円形脱毛症、臓器（例えば、肝臓、腎臓など）または組織（例えば、骨髄）移植を必要とする障害、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）及び幹細胞移植（ＳＣＴ）で処置可能な障害（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、同種ＳＣＴを必要とする非悪性疾患などを含む）、ＨＩＶ感染、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、Ｘ連鎖血小板減少症、ネフローゼ症候群、１型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、多発性硬化症（再発寛解を含む）、筋萎縮性側索硬化症などが含まれる。

【0095】

別の態様では、本発明は、ＩＬ－２媒介性障害を処置する必要がある対象においてＩＬ－２媒介性障害を処置する方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるペプチドを含む組成物または本明細書に記載される薬学的組成物を、他の介入（例えば、免疫療法）と同時にまたは連続して投与することを含む。

【0096】

一実施形態では、本発明は、自己免疫疾患が、調節不全のＩＬ－２及び／またはＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生に関連する、本明細書に記載される方法を提供する。

【0097】

ＩＬ－２及び高親和性ＩＬ－２Ｒアルファ受容体鎖（ＣＤ２５）が欠損したヒトは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋免疫抑制性Ｔｒｅｇの産生障害ならびにＳＬＥ、移植片対宿主疾患、及びＩ型糖尿病に対する低用量ＩＬ－２療法に起因して、全身的自己免疫を発症する。

【0098】

したがって、一実施形態では、本発明は、対象が、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－２Ｒアルファ（ＣＤ２５）産生が欠損している、本明細書に記載される方法を提供する。

【0099】

低用量ＩＬ－２免疫療法は、Ｔｒｅｇ集団を維持し、自己免疫／慢性炎症性状態／組織移植片拒絶を処置するために提案されているが、高用量のＩＬ－２投与は、細胞傷害性リンパ球集団を拡大するために使用される。

【0100】

別の実施形態では、本発明は、自己免疫障害が、アレルギー性喘息、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び他のループス障害、１型インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、乾癬、強皮症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、ならびにＧＶＨＤからなる群から選択される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0101】

重要なことに、ＮＦＡＴ１のＬｃｋ媒介性リン酸化を維持することによって、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ関与時の過剰なＴｈ１サイトカイン発現の予防におけるＩＫ１４００４の調節役割と一致して、ペプチドはまた、非細胞ベースのキナーゼプロファイリングで評価されるＣａＭＫＩＶの活性を阻害する。

【0102】

活性化Ｌｃｋは、ＮＦＡＴ１をリン酸化し、これは、ＮＦＡＴ１をサイトゾルに保持し、したがって、ＩＬ－２及びＩＦＮｇの産生を予防するのに役立つ。本発明者らは、実施例４において、ＩＬ－１２ｐ４０産生及びＩＦＮｇ産生が、刺激したＰＢＭＣ及び単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物から阻害されたことを実証する。

【0103】

ＩＬ－２は、がんを含むいくつかのヒト疾患を処置するために臨床的に使用されるが、ＩＬ－２の標的外効果は、限られた臨床療法を有する。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、がん療法中のがん患者の自己免疫効果を含むがん患者における自己免疫障害が、本明細書に記載されるペプチドを使用して処置され得ることを提案する。したがって、一実施形態では、本発明は、対象が、がんを有する、本明細書に記載される方法を提供する。一実施形態では、本発明は、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２及び／またはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２を含むペプチドが、Ｌｃｋ及び／またはＧ－タンパク質シグナル伝達の活性を調節して、対象におけるＩＬ－２の恒常性レベルを維持する、本明細書に記載される方法を提供する。免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）抗がん療法に二次的な腫瘍進行及び免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の予防は、反対の免疫応答に依存する。自己免疫疾患を有する患者は、がんのリスクの増加を有し（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＪＣ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ，２０１９，３９（１）：７２－８４）、両方の状態は、一般的には共存する（Ｍａ Ｑ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １８，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ．１４５（２０１８）。免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の導入により、がんからの転帰に有意な改善が生じているが、自己免疫が、がん療法の宿敵として浮上している（Ｋｕｍａｒ Ｐ ｅｔ ａｌ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１８，９５：７７－９９、Ｂａｋａｃｓ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１９，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｓｊｉ．１２８２１、Ｌｉｍ ＳＹ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１９，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－２７９５、Ｗａｌｓｈ ＳＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１８，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０１１７２／ＪＣＩ１２１００４）。

【0104】

理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＩＫ１４００４の独自性は、この脂質ペプチドが、２つの異なるリンパ球集団において免疫応答を誘導することであり、これは、ヘルスケアにおける２つの対照的な満たされていない必要性に対処する可能性を有し、一方で、自己免疫を予防するために必要な免疫応答を依然として維持しながら、がんの発症及び進行を予防することを提案している。本発明者らは、これが、Ｔ細胞対ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対するＩＫ１４００４の異なる効果に起因して生じることを提案する。具体的には、ＩＫ１４００４は、自己免疫の抑制、すなわち、Ｔ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）によってそれぞれ産生されるＩＦＮ－ｇ及びＩＬ－１２などの炎症促進性サイトカインの産生を同時に抑制しながら、Ｔｒｅｇを維持するために必要とされるＴ細胞によるＩＬ－２の低いが重要なことには高レベルではない分泌の誘導と組み合わせた免疫抑制性Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋細胞集団（例えば、図９）の増強に向けられた同時誘導免疫応答の独自の特性を実証する。一方、ＩＫ１４００４の抗がん効果（例えば、図１２～１５を参照）は、ＮＫ細胞による抗腫瘍細胞傷害性に必要なＮＫ細胞上の受容体発現のその増強、すなわち、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－ｇ産生を推進するがん細胞によって産生されるＩＬ－１２に応答し得る増強されたＩＬ－１２受容体発現、ならびに天然細胞傷害性受容体の増強された発現を介して媒介されることが提案されている。

【0105】

例えば、図１６及び１７は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＩＬ－１２受容体発現を増強することを実証する。

【0106】

ＩＬ－２は、毒性副作用にもかかわらず、がんに対する有効性を示し（Ｓｕｎ Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３８７４（２０１９）ＮＫ細胞のその既知の活性と一致し（Ｓｕｎ Ｚ ｅｔ ａｌ，上記、Ｈｕ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２０５）腫瘍成長を抑制するのに役立つ（Ｓｐｏｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８，１８：６４８－６５９、Ｌｉａｏ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３，３８（１）：１３－２５）。ＩＬ－２の重要な役割は、がん細胞を標的とするＮＫｐ４４及びＮＫＧ２ＤなどのＮＫ細胞上の細胞傷害性受容体の活性化である。例えば、ＩＬ－２によるＮＫ細胞の活性化は、休止ＮＫ細胞上で発現されない天然細胞傷害性受容体、ＮＫｐ４４の発現を誘導し（Ｖｉｔａｌｅ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＪＥＭ，１９９８，１８７：２０６５－２０７２）、ＮＫｐ４４は、腫瘍成長因子を認識する最初の活性化ＮＫ細胞受容体である（Ｂａｒｒｏｗ Ａｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７２（３）：５３４－５４８）。更に、免疫細胞上でＮＫＧ２Ｄ発現を最大化することは、ＩＫ１４００４の使用によって達成可能であり得るがん免疫療法において依然として目標である（Ｄｕａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，２０１９，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９４３－０１９－０９５６－８、（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ ＫＳ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００８，５７（１０：１４３９－４９、Ｔａｋａｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７５（４）：２１６７－７３）。図１８は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＮＫｐ４４発現を増強することを実証する。図１９は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体発現を増強することを実証する。

【0107】

一実施形態では、対象は、がんを有する対象であり、がん療法中の自己免疫障害を処置及び／または予防するための処置のために選択される。

【0108】

一実施形態では、がんを有する対象は、がん療法を受けており、がん療法中の自己免疫障害を処置及び／または予防するための処置のために選択される。

【0109】

別の実施形態では、対象は、がん療法を受けており、免疫関連有害事象を低減するために、本明細書に記載されるペプチドまたは組成物による処置のために選択される。

【0110】

好ましい実施形態では、対象は、チェックポイント阻害剤療法を受けている。

【0111】

本明細書で使用される場合、ＩＬ－２の恒常性レベルは、自己免疫疾患の処置に有効であるが、自己免疫疾患及び／または炎症性疾患（例えば、ＩＬ－２の治療域）を悪化させるのに十分高くはないＩＬ－２のレベルを指す。高用量のＩＬ－２は、様々な自己免疫疾患及び炎症性疾患を悪化させ得ることが知られている。

【0112】

一実施形態では、本発明は、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、Ｌｃｋの活性及び／またはＧタンパク質シグナル伝達を調節し、自己免疫疾患及び／または炎症性疾患を悪化させない対象におけるＩＬ－２のレベルを維持する、本明細書に記載される方法を提供する。

【0113】

Ｌｃｋの活性化は、異なるＬｃｋプールを介したＩＬ－２産生の正及び負の調節の両方に必要であり、炎症性サイトカイン、すなわち、ＩＬ－１２ｐ４０及びＩＦＮｇ（図３ｃ～ｆ及びｉ～ｌ）のＩＫ１４００４媒介性阻害と組み合わせたＩＫ１４００４の存在下で、活性化Ｔ細胞によって産生される比較的低レベルのＩＬ－２は、自己免疫性炎症応答を最小限に抑えるのに役立ち得る。

【0114】

本発明者らは、本明細書において、例えば、ＩＫ１４００４によるＬｃｋ活性化が、予想外に、ＩＬ－２レベルにおける相応の増加をもたらさないことを実証した。これは、ＩＬ－２が回避される場合、高レベルをもたらす本明細書に記載されるペプチドの二次効果があることを示唆している。

【0115】

Ｌｃｋ欠損細胞におけるＩＫ１４００４増強ＩＬ－２産生の発見（図２ｈ）と併せて、本発明者らは、理論に拘束されることを望まないが、ＧＮＡ１１を介したＩＫ１４００４媒介性シグナル伝達が、Ｇタンパク質誘導サイトカイン産生を調節することを提案する。例えば、スーパー抗原によるＰＢＭＣ及び単離した単球の刺激は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ４０、及びＩＦＮｇの産生の増加をもたらすことが示されているが、ＩＫ１４００４は、ＩＬ－１２ｐ４０及びＩＦＮｇの産生を阻害しながら、活性化Ｔ細胞からのＩＬ－２のわずかな増加のみを誘導する。

【0116】

原形質膜における活性Ｌｃｋのレベルと比較した内部Ｌｃｋプール内の活性化Ｌｃｋの優位性を考慮すると、本発明者らは、ＩＫ１４００４が、Ｌｃｋ依存性及び非依存性の両方の方式で免疫応答を調節することによって、恒常性の維持に寄与することを提案する。理論に拘束されることを望まないが、内部Ｌｃｋプール内のＬｃｋ活性の増強は、サイトゾル内にリン酸化ＮＦＡＴ１を保持し、ＩＬ－２遺伝子誘導を予防するのに役立つであろう。ＣａＭＫＩＶ活性の阻害は、ＴＣＲ活性化時及びカルシウム貯蔵の動員時に同じ目的を達成するであろう。

【0117】

Ｌｃｋが、スーパー抗原誘導Ｔ細胞活性化時のＴ細胞活性化及びサイトカイン産生の下方調節に寄与することが示されており（Ｃｒｉａｄｏ Ｇ ＆ Ｍａｄｒｅｎａｓ Ｊ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２（１）：２２２－２３０）、ＩＫ１４００４は、Ｇａ１１を伴う負の調節経路を介して、この下方調節効果を更に増強し得る。ＣａＭＫＩＶ活性に対する阻害効果（図２ｋ）は、Ｌｃｋ調節因子、例えば、ＩＫ１４００４と比較した、例えば、Ｌｃｋ阻害剤、例えば、Ａ７７００４１の存在下で観察されたＩＬ－２産生の１０倍の増加（図２ｉ、ｊ）と組み合わせて、ＩＫ１４００４誘導Ｌｃｋ活性が、休止細胞及び刺激Ｔ細胞におけるＩＬ－２の過剰産生を制限し得ることを示唆する。

【0118】

上に示すように、ＩＬ－２レベルの相応の増加をもたらすことが予想されたＬｃｋ活性の観察された増加は、ＩＬ－２の過剰な産生をもたらさなかった。代わりに、ＩＬ－２レベルにおける低レベルの増加の維持が観察され、これは、治療域におけるＩＬ－２レベルの維持を可能にする。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＩＬ－２産生をもたらすＧタンパク質を介した、またはＴＣＲを介したＬｃｋシグナル伝達が、図２に示されるＣａｍＫＩＶに対するペプチドの阻害効果によって緩和されることを提案する。

【0119】

したがって、本発明者らは、ＩＫ１４００４が、Ｔ細胞活性化時にＩＬ－２恒常性を維持するためのレオスタットとして作用し得ることを提案する。

【0120】

一実施形態では、本発明は、ＩＬ－２産生細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または樹状細胞からなる群から選択される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0121】

本発明者らは、実施例５において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害することを実証した。ＪＡＫファミリーメンバーＴｙｋ２は、ＩＬ－２３受容体シグナル伝達及びＳＴＡＴ３活性化の媒介において重要な役割を果たし、Ｔｙｋ２阻害剤は、脊椎関節炎のための有用な治療薬であるため、本明細書に記載されるペプチドは、脊椎関節炎の処置における使用に好適である。

【0122】

「機能獲得」ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３疾患の自己免疫症状の処置は、Ｊａｋｉｎｉｂ、すなわち、リウマチ性関節炎、乾癬、及び炎症性腸疾患などの状態のためのＪＡＫ阻害剤の使用によって改善されている（Ｆｏｒｂｅｓ ＬＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，１４２（５）：Ｐ１６６５－Ｐ１６６９）。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の活性化は、ＩＦＮｇの下流に生じ、この活性化は、ＳＬＥに見られるように、ＩＬ－６が自己抗体の観点から関与するＩＬ－６－ＳＴＡＴ３軸を含む正のフィードバックループによって増強される炎症において中心的な役割を果たす（Ｈｉｒａｎｏ上記参照、Ｏｇａｔａ Ａ ＆ Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｉｎｔ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２０１２，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１２／９４６０４８）。しかしながら、Ｊａｋｉｎｉｂは、とりわけ、潜伏結核の活性化（Ｍａｉｇａ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１２，２０５（１１）：１７０５－１７０８）、帯状疱疹などのウイルス感染のリスクの増加、及び貧血などの副作用がないわけではない（Ｇｉｌｈａｒ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，２０１９，３９３（１０１６９）：Ｐ３１８－Ｐ３１９、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＭ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１７．２６７）。その結果として、ＩＫ１４００４による、ｃ－Ｓｒｃ、ＩＦＮｇ、ｃ－Ｓｒｃ、ＳＴＡＴ１（小さい程度）、及びＪＡＫ１の阻害（図１ｃ、ｅ、図３ｊ～ｍ、図４ａ、ｂ）は、ＩＦＮｇがｃ－ＳｒｃとＳＴＡＴ１との間の会合を増強すること（Ｃｈａｎｇ Ｙ－Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００４，６５（３）：５８９－９８、Ｈｗａｎｇ Ｓ－Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１３，２２０（２）：１０９－１１７）及びＪＡＫ１がＳｒｃ形質転換細胞において構成的に活性化されること（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＧＳ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ，１９９７，２７２（５）：２５９１－４）を考慮すると、代替案を提供し得る。更に、ＪＡＫ２活性に対する阻害効果の非存在は、造血成長因子がＪＡＫ２を介してシグナル伝達するため、貧血の発症に関して利点を証明することができるだろう（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ、上記参照）。

【0123】

本発明者らは、実施例５において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、ＭＡＰ４Ｋ１（ＨＰＫ１）キナーゼ活性を阻害することを実証した。

【0124】

ＭＡＰ４Ｋ１（ＨＰＫ１）キナーゼ活性は、ＩＬ－２遺伝子発現をもたらすＴＣＲ誘導ＡＰ－１応答経路の負の調節因子であるため、本発明者らは、ＨＰＫ－１の阻害により、ＡＰ－１転写が核内で妨げられることなく進行することが可能になり、ＩＬ－２が治療域に維持される一方で、ＮＦＡＴ１媒介性ＩＦＮｇ誘導が抑制されることを提案する。

【0125】

例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞アネルギーは、自己免疫を予防し、調節性Ｔ細胞前駆体を生成する（Ｋａｌｅｋａｒ ＬＡ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６，１７（３）：３０４－３１４）。転写因子ＡＰ－１は、ＩＬ－２プロモーターにおける複数の調節エレメントに結合することによって、ＩＬ－２遺伝子のトランス活性化において重要な役割を果たす（Ｌｉｏｕ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００，１２（４）：３９９－４０８）。ＭＡＰキナーゼ、例えばＥＲＫの活性化は、ＡＰ－１を活性化し、ＥＲＫの活性化は、ＴＣＲでのＣＤ２８関与によって増強され、Ｌｃｋ及びＣＤ２８の両方は、このプロセスに不可欠である（Ｃａｒｅｙ ＫＤ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０２０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＭＣＢ．２０．２２．８４０９－８４１９．２０００）。したがって、ＭＡＰキナーゼの完全な活性化は、ＴＣＲ共受容体ＣＤ２８の存在を必要とし（Ｔｕｏｓｔｏ Ｌ ＆ Ａｃｕｔｏ Ｏ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｏｌ，１９９８，２８（７）：２１３１－４２）、タンパク質キナーゼＣ－Ｒａｆシグナル伝達軸またはカルシウム－カルモジュリン経路のいずれかを介したＥＲＫ１／２のＧ－タンパク質（Ｇ－アルファｑ／１１）活性化は、細胞型依存性であるようである（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＺＧ ＆ Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ＤＮ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６：３１２２－２１４２）。これと一致して、本発明者らは、実施例５において、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８レベルを増加させたことを実証した。

【0126】

更に、カルシニューリン阻害剤は、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＡＰキナーゼ経路を活性化する（Ｄａｔｔａ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０９－１４０４）。特に、末端中心キナーゼＨＰＫ１は、ＩＬ－２遺伝子誘導をもたらすＴＣＲ誘導ＡＰ－１応答経路の負の調節因子であり（Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ、上記参照）、ＡＰ－１の減少が乾癬及びＳＬＥで観察されていることを考慮すると（Ｔｒｏｐ－Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｓ ＆ Ａｚａｒ Ｙ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２０１７，３５３（３）：４７４－４８３）、ＩＫ１４００４によるＨＰＫ１及びカルシニューリンの両方の阻害（ＣａｍＫＩＶの阻害を介して）は、ＴＣＲでのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現の増強と組み合わせて、ＩＬ－２調節恒常性を達成するのに役立ち得る。総合すると、ＩＫ１４００４は、ＮＦＡＴ１－及びＡＰ－１誘導遺伝子誘導に間接的に影響を及ぼし、ＴＣＲ及び／またはＧタンパク質受容体でのシグナル伝達事象の調節を介して、特に、スーパー抗原またはエンドトキシンの存在下でＩＦＮｇを阻害しながら産生される、低量のＩＬ－２をもたらし得る。

【0127】

細菌性ＬＰＳは、自己抗原特異的Ｔ細胞が関与するいくつかの疾患において役割を果たす（Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；２０００，９９（４）：６０７－６１４、Ｇｒａｎｈｏｌｍ ＮＡ ＆ Ｃａｖａｌｌｏ Ｔ，Ｌｕｐｕｓ，１９９４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／０９６１２０３３９４００３００６１４）。ＬＰＳは、単球においてＩＬ－１２ｐ４０を誘導するが、ＩＬ－１２ｐ７０は誘導せず（Ｉｓｌｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ，Ａｍｅｒ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９８，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１６５／ａｊｒｃｍｂ．２０．２．３３１３）、ＧＶＨＤ及び乾癬におけるＩＬ－１２ｐ４０の刺激的役割は、十分に認識されている（Ｔｏｉｃｈｉ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，１７７：４９１７－４９２６、Ｃｏｏｐｅｒ ＡＭ ＆ Ｋｈａｄｅｒ ＳＡ，Ｔｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，２８（１）：３３－８、Ｗｕ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１５，２１（７）：１１９５－１２０４）。ＳＬＥの発症におけるＩＦＮｇの役割（Ｌｉｕ Ｗ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０２０／７１７６５１５）を考慮して、ドミナントネガティブＮＦＡＴ分子がＬＰＳ及びＩＦＮｇ活性化内因性ＩＬ－１２ｐ４０ ｍＲＮＡ発現を減衰させるという報告された観察と併せて（Ｚｈｕ Ｃ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ，２００３，２７８（４１）：３９３７２－３９３８２）、本発明者らは、ＤＣにおけるＩＬ－１２ｐ４０のＩＫ１４００４媒介性阻害が、ＩＦＮｇ産生の阻害に二次的であり、及び／またはＤＣの不安定化（図３ｎ）が、ペプチドの存在下で、ＩＬ－１２ｐ４０の分泌の減少において役割を果たし得ることを提案する。

【0128】

一実施形態では、本発明は、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、ＩＦＮｇ及び／またはＩＬ－１２ｐ４０を誘導しない、本明細書に記載される方法を提供する。

【0129】

一実施形態では、本発明は、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが経口的及び／または局所的に投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【0130】

一実施形態では、本発明は、ペプチドが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、本明細書に記載される方法を提供する。一実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置または予防する方法において、治療有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用を提供する。

【0131】

一実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害を処置するための薬品の製造における、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用を提供する。

【0132】

一実施形態では、本発明は、対象における自己免疫障害の処置のための、有効量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２、及びｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、経口用量形態を提供する。

【0133】

一実施形態では、本発明は、ペプチドが、経口的または局所的に投与される、本明細書に記載される方法を提供する。

【実施例】

【0134】

実施例１：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ｃ－Ｓｒｃを阻害し、Ｌｃｋを活性化する。
材料及び方法
図１ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇについて、図５：
Ｂｌｋ、Ｌｙｎを、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．１％のβ－メルカプトエタノール、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＦｉｌｔｅｒｍａｔＡ上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0135】

ｃ－Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋを、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0136】

Ｆｇｒ、Ｙｅｓを、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＦｉｌｔｅｒｍａｔＡ上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0137】

Ｌｃｋを５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、２５０μＭのＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。Ｍｇ／ＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、０．５％の濃度までのリン酸の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、０．４２５％リン酸中で４分間４回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0138】

ＣａＭＫＩＶを、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＣａＣｌ２、３０μｇ／ｍＬのカルモジュリン、３０μＭのＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ－３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0139】

ＪＡＫ１を、２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５００μＭのＧＥＥＰＬＹＷＳＦＰＡＫＫＫ、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0140】

ＪＡＫ２を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのＫＴＦＣＧＴＰＥＹＬＡＰＥＶＲＲＥＰＲＩＬＳＥＥＥＱＥＭＦＲＤＦＤＹＩＡＤＷＣ、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0141】

ＪＡＫ３を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５００μＭのＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫＫＫ、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0142】

ＴＹＫ２を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＧＧＭＥＤＩＹＦＥＦＭＧＧＫＫＫ、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、及び［γ３３Ｐ－ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）でインキュベートする。ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって、反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、３％リン酸溶液の添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、及びメタノール中で１回洗浄してから、乾燥及びシンチレーション計数を行う。

【0143】

図１ｄについて、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）コンジュゲートペプチドをＡｕｓｐｅｐから入手し、１０ｍｇ／ｍＬの脱イオン水中で再構成し、更に精製せずに使用した。ペプチドを、０．１Ｍ（ｐＨ５．５）酢酸アンモニウム緩衝液において１０００倍過剰なペプチドで^６４Ｃｕとともに３７℃で４５分間インキュベートした。各溶液の１μＬの試料を採取し、５０ｍＭのＥＤＴＡと１：１で混合した。ＥＤＴＡでインキュベートした試料またはニート溶液をＴＬＣ紙（シリカゲルを含浸させたＡｇｉｌｅｎｔ ｉＴＬＣ－ＳＧガラスマイクロファイバークロマトグラフィー紙）上でスポットし、５０：５０のＨ２Ｏ：エタノールで実行した。次いで、放射性同位体蛍光体スクリーンを使用して、ＢｒｕｋｅｒインビボＭＳ ＦＸ Ｐｒｏ画像化システム上で画像化することによって、放射性標識種の移動の検出を達成した。品質管理のために遊離^６４Ｃｕ及びＥＤＴＡに結合した^６４Ｃｕの溶出プロファイルをモニタリングするために、対照実験を行った。全ての試料は、１００％の放射性標識純度を示した。次いで、標識されたペプチドを、投与前に脱イオン水中で希釈して、必要な比活性を達成した。

【0144】

全体にわたって全ての注射及び画像化手順について、マウスを、Ｏ_２中の２％のイソフルオランを使用して麻酔をかけた。雌のＣ５７マウス（約８週齢）に、放射性標識ペプチドを腹腔内注射した（２９Ｇ針、５０μＬ水溶液、３．５ＭＢｑ［^６４Ｃｕ］ＮＯＴＡ－ペプチド）。

【0145】

ＰＥＴ－ＣＴ画像化は、呼吸プローブ（ＢｉｏＶｅｔ（商標）システム、ｍ２ｍ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して達成された生理学的モニタリングを備えたＳｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ－ＣＴスキャナーを利用した。動的ＰＥＴ－ＣＴ画像を、ペプチド投与の５分後から４５分間入手した。次いで、静止画像を、投与後８及び２４時間後（各３０分）に入手した。各ＰＥＴ入手後、解剖学的相互位置合わせのためにマイクロＣＴスキャンを入手した。電圧が８０ｋＶに設定され、電流が５００μＡに設定されたＸ線源を介してマウスのＣＴ画像を入手した。スキャンは、低倍率及びビニング係数が４である１２０の回転工程で３６０°回転を使用して実施した。曝露時間は２４０ｍｓであり、有効画素サイズは１０６μｍであった。全体のＣＴスキャンプロセスに約１５分かかった。ＣＴ画像は、Ｆｅｌｄｋａｍｐ再構築ソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して再構築した。

【0146】

ＰＥＴ画像を、順序付き部分集合期待値最大化（ＯＳＥＭ２Ｄ）アルゴリズムを使用して再構築し、ＣＴ及びＰＥＴ画像の融合及び関心領域（ＲＯＩ）の定義を可能にするＩｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅソフトウェア（ＩＲＷ４．１）（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して分析した。動的トレーサー取り込みプロファイルを、データセットを５分間のフレームに再構築することによって得た。各個々の動物のＣＴ及びＰＥＴデータセットを、ＩＲＷソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して整合し、目的とする臓器の良好な重複を確実にした。３次元ＲＯＩを、形態学的ＣＴ情報を使用して全身、ならびに心臓、腎臓、肺、膀胱、肝臓、脾臓、及び腫瘍などの目的となる全ての臓器内に配置して、臓器を描写した。ボクセル当たりの活性を、ＰＥＴスキャナーの効率を考慮するために^６４Ｃｕの既知の活性で充填された円筒形のファントムをスキャンすることによって得られた変換係数を使用してｎｃｉ／ｃｃに変換した。次いで、活性濃度を、組織１ｃｍ^３当たりの崩壊補正された注射活性のパーセントとして表し、これは、注射用量／ｇ（ＩＤ／ｇ％）のパーセンテージと近似のものであり得る。図１ｈについて、野生型Ｌｃｋタンパク質の発現のためのプラスミドは、ＮＳＷ大学のカタリーナ・ガウス教授の研究室によって好意的に提供された。プラスミドは、Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙレポーターによるＬｃｋ野生型タンパク質の哺乳動物細胞発現についてコードした。ツインストレップタグを、精製のためにＬｃｋ－ＷＴのＮ末端に組み込み、ｃ－ｍｙｃエピトープタグを、タンパク質発現の検出のためにｍＣｈｅｒｒｙの後、Ｃ末端に配置した。プラスミドのｍｉｄｉｐｒｅｐ ＤＮＡ調製を、Ｍａｃｈａｒｅｙ－Ｎａｇａｌ ｍｉｄｉキットを製造業者の指示に従って使用して実施した。一過性トランスフェクションのために、プラスミドＤＮＡを、３００万細胞ｍＬ－１の濃度で２μｇのＤＮＡｍＬ－１細胞を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトした。ＤＮＡを、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のポリエチレンイミン－Ｐｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）と、ＤＮＡ（μｇ）対ＰＥＩ（μＬ）比率１：４（ｗ：ｖ）で１５分間複合体化した後、懸濁液適応ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、化学的に定義されたＣＨＯ培地（ＣＤ－ＣＨＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、３７℃、７．５％のＣＯ_２、７０％の湿度で、１３０ｒｐｍで６時間振盪させながら培養した後、７．５％のＣＤ ＣＨＯ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、７．５％のＣＤ－ＣＨＯ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び０．４％の抗凝集剤（Ｇｉｂｃｏ）を供給し、３２℃、７．５％のＣＯ_２、７０％の湿度で、１３０ｒｐｍで２日間振盪させながら培養を継続した。トランスフェクション後、細胞を、５２５０ｇで３０分間遠心分離することによってペレット化した。細胞を、Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ ＶＣ５０５ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ）を使用して、３０秒のオン／オフの２つのパルスで短時間超音波処理した。細胞を５２５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集し、０．２２μｍ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を介して濾過した。Ｌｃｋ－ＷＴタンパク質を、５ｍＬのＳｔｒｅｐ－Ｔｒａｐカラム（ＧＥ）を使用して、清澄化した上清から精製した。タンパク質を、デスティオビオチンを使用して溶出した。

【0147】

ＬＣＫ－ペプチド結合ＥＬＩＳＡ。ペプチドＩＫ１４００４を１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに再構成した。各ペプチドストックをＰＢＳ中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬをｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに添加した。ウェルを４０℃で２０時間コーティングした。異なる濃度の精製Ｌｃｋ－ＷＴタンパク質の結合のために３つのウェルを使用した。コーティング後、ウェルを２００μＬの２％Ｍｉｌｋ－ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングした。次いで、ブロック剤をデカントし、ＰＢＳ中で希釈した１００μＬのＬｃｋ－ＷＴを添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴ（１ウェル／１回洗浄当たり２００μＬ）で４回洗浄し、ブロック溶液中で１／５０００に希釈された１００μＬのＨＲＰ ａｎｔｉ－ｍｙｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を室温で１時間添加した。次いで、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄し、１ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を１０分間添加した。２Ｍの硫酸１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの波長でＳｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して吸光度値を記録した。

【0148】

本発明者らは、飽和ドデカン酸に基づく単一の脂質ペプチド残基、すなわち、炭素２位（２Ａｄｏｄ１）（ＩＫ０００１１と称される）で超分岐した単一の脂質ペプチド残基と、直線配列で一緒に連結された３つの残基（２Ａｄｏｄ３）（ＩＫ０００３１と称される）を含む脂質ペプチドとの効果を、ｃ－Ｓｒｃ活性の阻害に対するＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ１４０００と称される）の既知の効果と比較しようとした（Ａｇｒｅｚ ｅｔ ａｌ）。期待に反して、単一の残基（ＩＫ０００１１）も３つの連結した残基（ＩＫ０００３１）も、ｃ－Ｓｒｃを阻害するＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ１４０００と称される）（図１ａ）と比較して、ｃ－Ｓｒｃ活性を増強しなかった。

【0149】

したがって、１０ｍｅｒのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲを、それぞれ、ＩＫ０００１１及びＩＫ０００３１にコンジュゲートし、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ３）（ＩＫ１４００３と称される）は、１ｕＭを超えるｃ－Ｓｒｃ活性を刺激したが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ１）（ＩＫ１４００１と称される）は刺激しなかった（図１ｂ）。脂質ペプチドの数の増加で観察されたこのｃ－Ｓｒｃ活性化傾向を確認するために、４つの残基を１０ｍｅｒ、すなわちＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ４）（ＩＫ１４００４と称される）にコンジュゲートし、更なる残基は、不溶性のため、付加することができなかった。１ｕＭを超える濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ３）（ＩＫ１４００３と称される）の存在下でのｃ－Ｓｒｃ活性化とは対照的に、ＩＫ１４００４は、ＩＫ１４００３にも見られるように、ｃ－Ｓｒｃ活性を誘導した４つの残基を含む非コンジュゲート脂質ペプチド（ＩＫ０００４１）と比較して、これらの濃度でｃ－Ｓｒｃ活性を効果的に阻害した（図１ｂ）。

【0150】

これらのＩＫ１４００４の阻害性インビトロ濃度がインビボで達成可能であるかどうかを決定するために、Ｃｕ６４標識ＮＯＴＡ－ＩＫ１４００４の肺内での取り込みを、倫理的承認後に、補足注釈書に詳述されている方法に従って、様々な投与経路後の血中濃度と比較した。それぞれ、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、及び経口強制（ＯＧ）、すなわち、２００ｕｇのＳＣ／ＩＰ及び１ｍｇのＯＧによって与えられたＩＫ１４００４の良好な耐容用量は、キナーゼプロファイリングアッセイにおけるＩＫ１４００４の低いｃ－Ｓｒｃ阻害濃度（０．３ｕＭ～３Ｍ）が、ＩＫ１４００４の単回用量の２４時間後のインビボで相応の組織レベルで達成可能であることを示した（図１ｄ）（以下のキナーゼ活性グラフの灰色の陰影ゾーンによって示されるように）。次いで、ＳＦＫメンバーについてのキナーゼ活性に対するＩＫ１４００４の効果を決定し、驚くべきことに、ＩＫ１４００４は、Ｌｃｋのみの活性化を誘導した（図１ｅ－表）。Ｌｃｋ活性は、２つの調節チロシンキナーゼ、Ｔｙｒ３９４、及び阻害性残基Ｔｙｒ５０５のリン酸化及び脱リン酸化に主に依存する立体配座変化によって厳密に制御され、ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）がＴｙｒ５０５残基をリン酸化すると、Ｌｃｋを不活性または「閉鎖」立体配座でロックする分子内配置をもたらす（Ｒｏｓｓｙ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１２．００１６７）。Ｌｃｋ活性化とは対照的に、ＩＫ１４００４は、Ｃｓｋ活性に対するわずかな用量依存性阻害効果を誘導し（図１ｆ）、これは、ＩＫ１４００４がＬｃｋを活性状態に維持するように作用することを示唆した。更に、コンジュゲートペプチドＩＫ１４００４は、１０ｍｅｒのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ１４０００と称される）も４つの脂質ペプチド残基（ＩＫ０００４１と称される）もＬｃｋを活性化しなかったため、相乗的にＬｃｋ活性を増強した（図１ｇ）。ＩＫ１４００４媒介性Ｌｃｋ活性化のメカニズムは決定されなかったが、Ｌｃｋに対するＩＫ１４００４の直接活性化効果は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ１４０００）とは対照的に、ＩＫ１４００４のＬｃｋへの濃度依存性結合を示した結合アッセイによって示唆された（図１ｈ）。

【0151】

これらのデータは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がｃ－Ｓｒｃを阻害し、Ｌｃｋを活性化することを示す。

【0152】

図５は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２と同様に、ｃ－Ｓｒｃを阻害し、Ｌｃｋを活性化することを実証する。本発明者らはまた、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_２－ＮＨ_２が、１及び３ｕＭでＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２と同様に挙動することを実証した（データ図示せず）。

【0153】

実施例２：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現、ならびにＬｃｋ非依存性ＩＬ－２産生を誘導する。
本発明者らは、健康なボランティアから得た軟膜から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の抗ＣＤ３抗体活性化後に、ＩＫ１４００４がＴ細胞上で活性化マーカーの発現を誘導したかどうかを決定しようとした。

【0154】

簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに２４時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激するか、または非刺激のままにした。２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ６９について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。

【0155】

ＩＫ１４００４は、フローサイトメトリーによって評価されたＣＤ６９及びＣＤ２５の発現の用量依存性増加を誘導した（図２ａ、ｂ、ｄ、ｅ）。

【0156】

ＩＫ１４００４がＩＬ－２産生を誘導するかどうかを決定するために、２４時間及び７２時間後に、刺激された抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣ培養物から得られた上清をＥＬＩＳＡによって評価した。

【0157】

簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに２４時間及び７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で刺激するか、または非刺激のままにした。２４時間及び７２時間後、上清を収集し、ＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ及び倍率変化）についてＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ－２産生における倍率変化は、刺激培地のみの対照に対する正規化によって決定した。

【0158】

７２時間後にペプチドの非存在下でＩＬ－２は検出されず（データ図示せず）、２４時間後に検出可能なＩＬ－２分泌はＩＫ１４００４の存在下で増強されなかった（図２ｃ）。

【0159】

これが、混合したＰＢＭＣ集団内の様々な細胞サブセット上で発現した高親和性ＩＬ－２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）によるＩＬ－２の結合及び取り込みを反映した可能性があることを考慮して、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞及び単球上でのＣＤ２５発現を調査した。

【0160】

簡潔に述べると、新たに単離したＰＢＭＣを、指示濃度（μＭ）の試験ペプチドＩＫ１４００４の存在下で、（－ａＣＤ３）抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）を用いてまたは用いずに２４時間刺激した。ＣＤ１４＋単球を新たなＰＢＭＣから単離し、試験ペプチドの存在下で、５点濃度曲線＋ビヒクル（０～１．２５μＭ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）について７２時間培養した。７２時間後、細胞をＣＤ２５、Ｋｉ６７、ＩＬ－１２Ｒβ１、及びＩＬ－１２Ｒβ２発現についてフローサイトメトリーによって評価した。

【0161】

ＣＤ２５発現をＰＢＭＣ培養物においてＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞及び単球（図２ｄ、ｅ、ｆ）について確認した。

【0162】

ＩＬ－２分泌を調査するために、単離したＴ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激し、ペプチドＩＫ１４００４とともに５濃度範囲＋ビヒクル対照（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、上清を収集し、ＩＬ－２についてＥＬＩＳＡによって評価した。７２時間後のＰＢＭＣ培養物からの上清中のＩＬ－２の非存在とは対照的に、ＩＫ１４００４は、単離した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ＣＤ３＋Ｔ細胞によってＩＬ－２産生を有意に増強した（図２ｇ）。

【0163】

ＴＣＲを介したＴ細胞活性化の従来のパラダイムは、Ｌｃｋがこのシグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たすと述べている（Ｃｒｉａｄｏ Ｇ ＆ Ｍａｄｒｅｎａｓ Ｊ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２（１）：２２２－２３０）。歴史的に、これは、機能的Ｌｃｋチロシンキナーゼ、すなわち、Ｊｕｒｋａｔ ＣａＭ１．６細胞の発現に欠陥を有する体細胞変異型白血病Ｔ細胞株において確認されており、ＪＣａＭ１．６におけるＬｃｋ ｃＤＮＡの発現は、ＴＣＲを介した正常なシグナル伝達にＬｃｋが必要であることを示すＴＣＲ刺激に応答する細胞株の能力を回復させる（Ｓｔｒａｕｓ ＤＢ ＆ Ｗｅｉｓｓ Ａ，Ｃｅｌｌ，１９９２，７０（４）：５８５－９３）。プレート結合抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８で活性化されたＪ．ＣａＭ１．６細胞を使用して、ＩＫ１４００４への曝露がＩＬ－２産生を増強しないことを確認した。

【0164】

簡潔に述べると、１２ウェルプレートを、ＰＢＳ中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）の溶液（総体積２５０μｌ／ウェル）でコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コーティング溶液を吸引し、コーティングされたウェルをＰＢＳ（２回、１ｍｌ、５分）で穏やかに洗浄した。ＪＣａＭ１．６細胞を「抗ＣＤ３コーティングされたウェル」に（１×１０６細胞／ウェル）で播種し、その後、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で刺激し、また、様々な濃度のペプチドＩＫ１４００４（０、０．６２５、１．２５、及び２．５μＭ）で処置した。次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。細胞懸濁液を顕微鏡下で確認し、次いで２ｍｌの標識チューブに移し、３０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清及びペレットを各試料について分離し、上清（１００μｌ、ｎ＝３）をＩＬ－２含有量についてＥＬＩＳＡを使用して分析した。

【0165】

予想外に、ＩＫ１４００４は、ペプチドがＬｃｋ非依存性シグナル伝達経路も刺激し得ることを示す用量依存性様式でＩＬ－２産生を増強した（図２ｈ）。

【0166】

実施例３：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、正常なヒトＴ細胞上のＧＮＡ１１の発現を増強し、ＩＬ－２レベルを治療域内に維持する。
Ｇタンパク質は、免疫細胞上に遍在して発現され、Ｌｃｋ欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、スーパー抗原の存在下で、Ｇタンパク質媒介性ＩＬ－２産生に関与するＧタンパク質受容体ＧＮＡ１１を発現することが知られている（Ｂｕｅｎｏ Ｃ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００６，２５：６７－７８）。

【0167】

本発明者らは、ＩＫ１４００４が正常なヒトＴ細胞上のＧＮＡ１１の発現を増強するかどうかを決定しようとした。

【0168】

簡潔に述べると、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、阻害剤Ａ－７７００４１（１００ｎＭ）の存在下で、ビヒクル対照（０．１３％Ｈ２Ｏ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）またはＩＫ１４００４（０．０８～１．２５μＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３抗ＣＤ２８刺激ビーズ（細胞対ビーズ比率４：１）で刺激した。７２時間後、細胞を回収し、ＧＮＡ１１について染色し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。ＧＮＡ１１発現を、ＰＥコンジュゲートロバＦ（ａｂ’２）抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体を使用して検出した。

【0169】

ＧＮＡ１１発現における用量依存性増加が、７２時間後に、刺激された単離ＣＤ３＋Ｔ細胞培養物内のＣＤ４＋Ｔ細胞上で観察された（図２ｉ）。これは、スーパー抗原及びＬｃｋ阻害剤の存在下で見られるように、Ｔ細胞活性化の負の調節経路を発揮することが知られている活性Ｌｃｋの内部プールに対するＩＫ１４００４媒介性Ｌｃｋ非依存性効果の可能性を高めた（Ｃｒｉａｄｏ Ｇ ＆ Ｍａｄｒｅｎａｓ Ｊ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２（１）：２２２－２３０、Ｂａｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１７，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８７１２３）。重要なことに、内部Ｌｃｋプールは、ＴＣＲよりも多くの活性化Ｌｃｋを含有する（Ｗｅｉ Ｑ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２０２０，１１７（２７）：１５８０９－１５８１７）。

【0170】

休止Ｔ細胞及びＴＣＲ活性化細胞内の活性化Ｌｃｋの異なるプールの反対の役割（膜結合Ｌｃｋの正の調節プールに対する内部の負の調節Ｌｃｋプール）を考慮して、本発明者らは、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物におけるＩＬ－２産生に対するＬｃｋ阻害剤、Ａ－７７００４１の効果を調査した。

【0171】

簡潔に述べると、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ビヒクル対照（０．１％ＤＭＳＯ）、小分子阻害剤Ａ－７７００４１（１００ｎＭ）とともに７２時間培養し、可溶性抗ＣＤ３抗ＣＤ２８刺激ビーズ（細胞対ビーズ比率４：１）で７２時間刺激した。７２時間後、上清を収集し、ＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）についてＥＬＩＳＡによって評価した。

【0172】

ＩＫ１４００４によって誘導されるＩＬ－２分泌の３０％の増加（図２ｇ）と比較して、Ｌｃｋ阻害剤は、ビヒクル対照値を上回る３００％の増加を誘導した（図２ｊ）。特に、活性化されたＬｃｋは、ＧＮＡ１１発現のＩＫ１４００４媒介性増強がＡ－７７００４１の存在下ではそれほど顕著ではないことを考慮すると（図２ｉ）、Ｇタンパク質発現に寄与するように見えた。

【0173】

活性Ｌｃｋの内部の負の調節プールは、活性化Ｔ細胞、ＮＦＡＴの核因子の転写因子を介して、ＩＬ－２、ＩＦＮｇ、及びＴＮＦアルファなどの様々な誘導性遺伝子を間接的に制御する（Ｋｉａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０００，９８（５）：１４８０－８、Ｔｅｉｘｅｉｒａ ＬＫ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７５（９）：５９３１－９）。活性化Ｌｃｋは、ＮＦＡＴ１をリン酸化し、これは、ＮＦＡＴ１をサイトゾルに保持し、したがって、ＩＬ－２及びＩＦＮｇの産生を予防するのに役立つ（Ｂａｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ、上記参照）。一方、ＴＣＲ媒介性シグナル伝達は、カルシウムカルモジュリンキナーゼ（ＣａＭＫＩＶ）を介したカルシニューリンの活性化をもたらし（Ｌｉｕ ＪＯ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００９，２２８（１）：１８４－１９８）、ＮＦＡＴ１を脱リン酸化して核へのその転座をもたらす。したがって、本発明者らは、ＩＫ１４００４がＣａＭＫＩＶ活性に影響を及ぼすかどうかを決定しようとした。ＮＦＡＴ１のＬｃｋ媒介性リン酸化を維持することによって、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ関与時の過剰なＴｈ１サイトカイン発現の予防におけるＩＫ１４００４の調節役割と一致して、ペプチドはまた、非細胞ベースのキナーゼプロファイリングで評価されるＣａＭＫＩＶの活性を阻害する（図２ｋ）。

【0174】

これらの結果は、ＩＬ－２産生をもたらすＧタンパク質を介した、またはＴＣＲを介したＬｃｋシグナル伝達が、ＣａｍＫＩＶに対するペプチドの阻害効果によって緩和され、ＩＬ－２の低レベルの増加をもたらし、高レベルのＩＬ－２を回避することを示唆している。

【0175】

実施例４：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＩＬ－１２ｐ４０及びＩＦＮｇを阻害する。
本発明者らは、ＩＫ１４００４が、単離したＤＣ（図３ｄ）の増殖の増強を含む、培養したＰＢＭＣ、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞、及び単離した未成熟単球由来樹状細胞（ＤＣ）（図３ａ、ｂ、ｃ）の生存率に影響を及ぼさないことを確認した。

【0176】

自己免疫疾患における治療標的としてのＩＬ－１２及びＩＦＮｇサイトカインの役割は、最近、より明確になっており（Ｓｕｎ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１５，７５（２）：２４９－５５、Ｌｉｕ Ｗ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ７１７６５１５、Ｓｃｈｕｒｉｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１８，５７（２）：２４６－２５４、Ａｄｏｒｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＭＬＳ，１９９９，５５：１６１０－１６２５）、現在、ＩＬ－１２ｐ７０の代わりにＩＬ－１２ｐ４０が、自己免疫疾患に関連する病理学の背後にある主要な推進力であることが提案されている（Ｋｈａｄｅｒ ＳＡ ＆ ＴｈｉｒｕｎａｖｕｋｋａｒａｓｕＳ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９，２０２（３）：６２９－６３０）。したがって、自己免疫疾患に関してＩＬ－１２及びＴヘルパー細胞分化に起因する特徴は、ｐ４０サブユニットに依存しているようである（Ｋｒｅｙｍｂｏｒｇ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００５，９（６）：１１２３－１１３６）。したがって、本発明者らは、単離した単球及び抗ＣＤ刺激ＰＢＭＣ培養物のＩＬ－１２産生に対するＩＫ１４００４の効果を比較しようとしたが、ＩＬ－１２ｐ４０は阻害され（図３ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）、ＩＬ－１２ｐ７０の産生は影響を受けなかった（図３ｉ）。

【0177】

ＩＬ－１２は、Ｔ細胞によるＩＦＮｇ産生の強力な誘導因子として作用し（Ｍａ Ｘ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９６，１８３：１４７－１５７、Ｔｕｇｕｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２０１５，２２：２３７－２４６）、ＩＦＮｇは、正のフィードバックループで作用して、転写レベルでＩＬ－１２を誘導する（Ｍａ ｅｔ ａｌ、上記参照、Ｂｈａｔ Ｐ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ，２０１７，８（６）：ｅ２８３６）。

【0178】

したがって、本発明者らは、ＩＦＮｇ産生に対するＩＫ１４００４の効果を評価し、ＩＬ－１２ｐ４０と同様に、刺激したＰＢＭＣ及び単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物からＩＦＮｇ産生の用量依存性阻害を観察した（図３ｊ、ｋ、ｌ、ｍ）。

【0179】

ＩＬ－１２とは対照的に、ＩＬ－１０の主な役割は、恒常性状態を維持することである（Ｍａ Ｘ ｅｔ ａｌ，Ｆ１０００Ｒｅｓ，２０１５，ｄｏｉ：１０．１２６８８／ｆ１０００ｒｅｓｅａｒｃｈ．７０１０．１）。ＩＬ－１０は、主に病原体活性化抗原提示細胞によって産生され、炎症性及び自己免疫性病理の予防において重要な役割を果たす（Ｉｙｅｒ ＳＳ ＆ Ｃｈｅｎｇ Ｇ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，３２（１）：２３－６３）。加えて、ＤＣが寛容原性応答または炎症性応答のいずれかを誘導する可能性は、十分に認識されている（Ｌｉ Ｈ ＆ Ｓｈｉ Ｂ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１２：２４－３０）。寛容原性の未成熟ＤＣは、より低い表面レベルのＭＨＣクラスＩＩ及び共刺激分子を特徴とする（Ｗａｋｋａｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００３，１８（５）：６０５－６１７、Ｌｉ Ｈ ＆ Ｓｈｉ Ｂ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１２：２４０３０）。

【0180】

これらの抗炎症経路のいずれかが関与し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、ＤＣ表現型（ＣＤ１４＋発現）及びＩＬ－１０産生に対するＩＫ１４００４の効果を調査した。興味深いことに、生存単球集団は、生存ＤＣ集団（ＣＤ１４－／ＣＤ１１ｃ＋）を犠牲にして増加した（ＣＤ１４＋／ＣＤ１１＋）（図３ｎ）。更に、ＩＬ－１０の産生は、ペプチドの存在下では影響を受けず（図３ｏ）、ＤＣ集団の抑制が、ＩＬ－１２の産生の阻害に関してより関連し得ることを示唆した。

【0181】

実施例５：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害する。
ＩＦＮｇ産生に対するＩＫ１４００４の効果の観点から、本発明者らは、ＳＴＡＴ１のＩＦＮｇ誘発リン酸化が、ＪＡＫ１－ＪＡＫ２及びＪＡＫ１／２－ＳＴＡＴ１の相互作用を促進し、ＪＡＫによるＳＴＡＴ１のリン酸化をもたらすことを考慮して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に対するペプチドの効果を評価しようとした（Ｉｇａｒａｓｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ，１９９４，２６９（２０）：Ｐ１４３３３－Ｐ１４３３６、Ｈｏｒｖａｔｈ ＣＭ，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ，２００４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｔｋｅ．２６０２００４ｔｒ８、Ｗｅｉ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１５０１１１１）。

【0182】

ＩＫ１４００４媒介性ＩＦＮｙ抑制が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路における標的外効果と関連していないことを確認するために、ＳＴＡＴ１リン酸化及びＪＡＫのキナーゼ活性を、それぞれ、単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物及びキナーゼプロファイリングアッセイにおいて評価した。ＩＫ１４００４は、ｐＳＴＡＴ１のわずかな阻害を誘導し（図４ａ）、３つのＪＡＫキナーゼのうち、最大の活性阻害がＪＡＫ１について観察された（図４ｂ）。ＳＴＡＴ６の喪失が自己免疫疾患を促進することを考慮して（Ｌａｕ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１２，３９（４）：、３８８－９７）ＳＴＡＴ活性化に対する可能な標的外効果を更に探求するために、ＳＴＡＴ６リン酸化に対するペプチドの効果を調査した。ＳＴＡＴ１とは対照的に、ＩＫ１４００４は、用量依存性様式でＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ６リン酸化を増強した（図４ｃ）。

【0183】

ＪＡＫファミリーメンバーの中で、Ｔｙｋ２は、ＩＬ－２３受容体シグナル伝達及びＳＴＡＴ３活性化の媒介において重要な役割を果たし、Ｔｙｋ２阻害剤は、脊椎関節炎のための次の超大型治療薬として提案されている（Ｈｒｏｍａｄｏｖａ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．２０２１，ｄｏｉ．ｏｒｇ：１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０２１．６８５２８０）。Ｔｙｋ２抑制は、その生物学的活性が、ＩＬ－２３のｐ４０サブユニットを介して媒介されるように見えることを考慮して、関連性を有する（Ｈａｍｚａ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２０１０，１１（３）：７８９－８０６）。非細胞ベースのアッセイ及び単離したＣＤ３＋Ｔ細胞培養物におけるＴｙｋ２キナーゼ活性及びＳＴＡＴ３活性に対するＩＫ１４００４の効果をそれぞれ調査した。ＩＫ１４００４へのＴｙｋ２の曝露は、１ｕＭのＩＣ５０を明らかにし（図４ｄ）、ＳＴＡＴ３リン酸化に対して、統計的に有意ではないにもかかわらず、わずかな阻害傾向を誘導した（図４ｅ）。更に、インターロイキン－６（ＩＬ－６）媒介性ＣＤ４＋Ｔ細胞ＳＴＡＴ３活性化はまた、リウマチ性関節炎における疾患活性に関連している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＥ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ，２０１６，７５（２）：４６６－７３）。したがって、本発明者らは、ＩＬ－６受容体発現に対するペプチドの効果を調査しようとし、ＳＴＡＴ３活性化に対する効果の欠如と一致して、ＩＫ１４００４は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－６受容体発現を阻害した（図４ｆ、ｇ）。

【0184】

図６は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がＭＡＰ４Ｋ１（ＨＰＫ１）キナーゼ活性を阻害することを実証する。ＨＰＫ１、ヒト造血前駆キナーゼは、ＪＮＫ／ＳＡＰＫキナーゼカスケードを活性化する。

【0185】

ＭＡＰ４Ｋ１（ＨＰＫ１）キナーゼ活性は、ＩＬ－２遺伝子発現をもたらすＴＣＲ誘導ＡＰ－１応答経路の負の調節因子であるため、本発明者らは、ＨＰＫ－１の阻害により、ＡＰ－１転写が核内で妨げられることなく進行し、ＩＬ－２が治療域に維持される一方で、ＮＦＡＴ１媒介性ＩＦＮｇ誘導が抑制されることを提案する。

【0186】

ＭＡＰキナーゼの完全な活性化は、ＴＣＲ共受容体の存在を必要とするため、本発明者らは、Ｔ細胞上のＣＤ２８の発現を調査しようとした。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激及びＩＫ１４００４とともに５濃度範囲（０～１．２５μＭ）について７２時間培養し、その後、細胞をＣＤ２８の発現についてフローサイトメトリーによって評価した。図７は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８レベルを増加させたことを実証する。

【0187】

Ｄアミノ酸を含むペプチドの能力が低レベルのＩＬ－２を誘導することを調査するために、再刺激時に疲弊したＣＤ４＋細胞におけるＩＬ－２発現を調査した。簡潔に述べると、実験ごとに単一の脾臓をＭＢＰ－Ｔｒａｃｋｅｒマウスから除去し、処理して、脾細胞の単一細胞懸濁液を生成した。細胞を、３ｘ１０^６／ｍＬで再懸濁し、ＷＴ－ＭＢＰ（対照、非疲弊細胞）またはＡＰＬ－ＭＢＰ（疲弊細胞を生成する）で刺激した。細胞を７２時間刺激した。刺激後、Ｔ細胞をフィコール密度勾配によって精製し、その後、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２中で２×１０^６／ｍＬで４日間再プレートした。４日後、細胞を収集し、再懸濁し（４ｘ１０^５／ｍＬ、ウェル当たり最終２×１０^４）、照射ＡＰＣ（Ｂ１０ＰＬｘＣ５７ＢＬ／６マウスから、４×１０^６／ｍＬ、ウェル当たり最終２×１０^５）、単回投与のＡＰＬ－ＭＢＰペプチドを使用して、試験もしくは参照物質または適切な対照とともに、７２時間再刺激した。培養後、上清を収集し、製造業者の指示に従って実行したＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘカスタムマウス４ Ｐｌｅｘアッセイ（ロット番号１４１５５４０００、有効期限２０１７年６月３０日）を使用した多重化イムノアッセイによるＩＬ－２サイトカイン産生上清のその後の評価のために凍結保管した（－２０℃）。

【0188】

図８は、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（Ｄアミノ酸を含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２）が再刺激時に疲弊したＣＤ４＋細胞上でＩＬ－２発現を増加させることを実証する。

【0189】

実施例６：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、Ｆｏｘｐ３も発現したＣＤ２５発現細胞の割合を増加させる。
ＩＦＮ－γは、Ｔｒｅｇ脆弱性を推進することが知られている。

【0190】

ＩＦＮｇ産生に対するＩＫ１４００４の効果の観点から、本発明者らは、７２時間後に刺激したＰＢＭＣ培養物内のＴｒｅｇに対するＩＫ１４００４の効果を評価しようとした。

【0191】

固定及び透過化（Ｆｏｘｐ３転写因子固定緩衝液；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）後、ＣＤ４＋／ＣＤ１２７^低／ＣＤ２５＋Ｔ細胞内で抗Ｆｏｘｐ３（ＰＥコンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞の染色を実施した。

【0192】

Ｆｏｘｐ３も発現したＣＤ２５発現細胞の割合は、ＩＫ１４００４の存在下で増加し（図９）、これは、より高いＩＫ１４００４濃度でのＣＤ４／Ｔｒｅｇ比率に反映された（図１０）。しかしながら、これは、Ｆｏｘｐ３発現のレベルの統計的に有意な増加とは関連しなかった（図１１）。

【0193】

このデータは、含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２がＴｒｅｇ細胞の割合を増加させることを実証する。

【0194】

実施例７：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、肺癌における腫瘍面積及び腫瘍体積を低減させる。
ルイス肺癌（ＬＬＣ）マウスにおける異種移植腫瘍を調節するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。

【0195】

試料を２４時間ブワン溶液中に入れ、次いで、７０％エタノール中に入れた後に、ＦＦＰＥブロックに処理した。ブロックを４μｍの厚さで切片化し、次いで、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド上に取り付けた後に、６０℃で一晩乾燥させた。切片をキシレン中で脱ろうし、段階的なアルコールを通して再水和し、次いで、以下のプロトコルを使用して染色した。
１．ヘマトキシリンを６分間、
２．酸アルコール簡易洗浄、
３．スコット水道水代替物を１分間、
４．水性エオシンＹを２０秒間。

【0196】

次いで、スライドを段階的なアルコール及びキシレンを介して脱水し、次いで、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃａｎ Ｚ１スライドスキャナーを使用してスキャンした（スライド全体）。

【0197】

各々に８匹のマウスを含む２つの処置群が存在した。ビヒクル（水１００μＬ、腹腔内注射、週２回；及びＩＫ１４００４（１００μＬ水中４００μｇ、腹腔内注射、週２回）。

【0198】

各データポイントは、マウス当たりの６つのセクションからの肺面積の平均パーセンテージを示す。パーセンテージ面積は、ＩｍａｇｅＪを使用して腫瘍数を決定するために周囲に描かれた領域から各腫瘍の総面積を推定することによって決定した。データは、両側対応のないｔ検定＊＊ｐ＜０．０１によって決定されるように、２つの群間の統計的差異を示す。

【0199】

ルイス肺癌細胞株を約７０％コンフルエンスまで培養した後、細胞を収集し、計数し、滅菌ＨＢＳＳ中で５×１０６／ｍＬで再懸濁した。マウスの右脇腹に５×１０５個の細胞（１００μｌ）を皮下注射した。マウスを、腫瘍細胞移植の５日後に、平均腫瘍サイズが２つの群間でほぼ等しいように、処置群に無作為に割り当てた。試験物質ＩＫ１４００４（４００μｇ／２００ｍＬ）、またはビヒクル滅菌水２００μＬ）を、腫瘍細胞移植後５日目から、ビヒクル処置群で腫瘍の直径が平均１０ｍｍに達するまで、腹腔内（ｉ．ｐ）注射を介して毎週２回（月曜日及び木曜日）投与した。腫瘍を、処置群に盲検化された科学者によって、デジタルキャリパーを使用して毎週３回（月曜日、水曜日、及び金曜日）測定した。ビヒクル群の平均腫瘍サイズが直径１０ｍｍに達すると、マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍及び脾臓を収集した。

【0200】

腫瘍体積を、以下の０．５×腫瘍長×幅×幅の計算を使用して推定した。データは、群平均＋／－ＳＥＭ、ｎ＝８を有する個々のデータポイントとして提示される。群を、シダックの多重比較による二元ＡＮＯＶＡによって比較した、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【0201】

図１２及び１３は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、ルイス肺癌（ＬＬＣ）異種移植モデルにおける異種移植腫瘍体積及び腫瘍細胞生存率を低下させることを示す。

【0202】

このデータは、自己免疫疾患の処置のためにＩＬ－２の恒常性レベルを維持することに加えて、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が異種移植腫瘍体積及び腫瘍細胞生存率を低下させることを示す。

【0203】

ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２ががん細胞を直接標的とするかどうかを決定するために、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２のＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞及びルイス肺癌細胞に対する効果を調査した。

【0204】

細胞（またはルイス肺ＬＬ／２）を、完全細胞培養培地中の９６ウェルプレート（１０００細胞／ウェル）に播種し、２４時間付着させた（３７℃、空気中５％ＣＯ_２）。次に、等体積の細胞培養培地のみ、または細胞培養培地中に溶解した薬物の２倍の濃度のいずれかを、５つの複製ウェル（技術的複製物）の各々に添加して、細胞を０、０．３１、０．６３、１．２５、及び２．５μＭの濃度に曝露した。加えて、２．５μＭのドキソルビシンを、陽性対照として、５つの複製ウェルで試験した。細胞を、薬物または対照の存在下で更に７２時間培養した後、細胞培養培地を除去し、付着した細胞を氷冷トリクロロ酢酸に固定した。固定した細胞をスルフォロダミンＢ（ＳＲＢ）で染色し、次いで１％の酢酸で洗浄して、非結合染料を除去した。保持された染料を１０ｍＭのトリス塩基溶液中で可溶化し、５５０ｎｍでの吸光度を測定し、ベースライン（細胞を含まない培地のみ）を差し引き、最大増殖（１００％、薬物を含まない細胞）と開始細胞密度（薬物を添加する前の０％の細胞）との間でデータを正規化した。各実験を２つの独立した機会（生物学的複製）に実施し、ｌｏｇ（阻害剤）対応答の非線形適合を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９においてデータを分析した。

【0205】

図１４は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が細胞増殖の減少を引き起こさなかったことを実証し、図１２及び１３に実証されたＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２の効果が、腫瘍細胞に対するペプチドの直接的な効果によって引き起こされないことを示す。

【0206】

ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が免疫調節によって作用するかどうかを決定するために、転移性肺癌モデルにおける肺結節に対するＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２の効果を調査した。

【0207】

簡潔に述べると、ペプチドを、ガラスバイアル中の予め計量された試料として供給し、使用するまで－２０℃で保管した。バイアル（９．８ｍｇ）を２．４５ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁して、４ｍｇ／ｍｌの溶液（４００μｇの用量レベル）を得た。この保管物を４０μｇの用量レベルのためにＨ２Ｏ中で１／１０に希釈した。次いで、溶液を使用するまで４℃で保管した。

【0208】

２４匹の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＷＥＨＩ、８週齢）に、２０１７年８月５日（１日目）に、ＰＢＳ中の１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞を静脈内接種させた。

【0209】

マウスを８匹のマウスの３つの群に無作為化した後、０．１ｍｌのＨ２０またはＩＫ－１４００４（４０μｇまたは４００μｇ／マウス）をＩＰ注射した。処置を行い、マウスの一般的な健康状態を週に２回、２週間にわたってモニタリングした。１５日目にマウスを安楽死させ、肺を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に、フェケテの溶液に固定した。次いで、肺腫瘍結節の存在について肺を計数した。データは、ダネットの事後検定に従う一元ＡＮＯＶＡを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。

【0210】

図１５は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）が、免疫調節の結果として、転移性肺癌モデルにおいて、肺結節を低減させることを実証する。

【0211】

これらのデータは、ＩＫ１４００４が、薬物動態データ（図示せず）に基づいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＫ１４００４を投与した２４時間後に、肺または血中のいずれかでＩＫ１４００４の濃度を超える２．５ｕＭのインビトロ濃度において、いずれのがん細胞株の増殖に対しても阻害効果をもたらさないことを示す。特に、陽性対照であるドキソルビシンは、両方の細胞株に対してインビトロで１００％殺傷を誘導した。ヒト免疫細胞で試験した場合、インビトロで中ナノモル濃度のＩＫ１４００４に見られた免疫調節効果と併せて、マウスモデルにおけるＩＫ１４００４媒介性腫瘍成長抑制は、免疫系に対するその効果に起因するものであり、がん細胞自体に対する直接的な効果に起因するものではないと仮定される。

【0212】

実施例８：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２は、ＮＫ細胞による抗腫瘍細胞傷害性に必要な受容体の発現を増強する。
免疫調節を介したＩＫ１４００４の抗がん効果を調査するために、ＮＫ細胞上の受容体発現を調査した。

【0213】

図１６及び１７は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＩＬ－１２受容体発現を増強することを実証する。

【0214】

したがって、ＩＫ１４００４の抗がん効果（例えば、図１２～１５を参照）は、ＮＫ細胞による抗腫瘍細胞傷害性に必要なＮＫ細胞上の受容体発現のその増強、すなわち、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－ｇ産生を推進するがん細胞によって産生されるＩＬ－１２に応答し得る増強されたＩＬ－１２受容体発現を介して媒介されることが提案されている。

【0215】

ＮＫ細胞による抗腫瘍細胞傷害性に必要なＮＫ細胞上の受容体発現の増強を調査するために、ＮＫ細胞上の受容体発現を更に調査した。

【0216】

ＩＬ－２の重要な役割は、がん細胞を標的とするＮＫｐ４４及びＮＫＧ２ＤなどのＮＫ細胞上の細胞傷害性受容体の活性化である。例えば、ＩＬ－２によるＮＫ細胞の活性化は、休止ＮＫ細胞上で発現されない天然細胞傷害性受容体、ＮＫｐ４４の発現を誘導し、ＮＫｐ４４は、腫瘍成長因子を認識する最初の活性化ＮＫ細胞受容体である。

【0217】

図１８は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＮＫｐ４４発現を増強することを実証する。図１９は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２（「ＩＫ１４００４」）がＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体発現を増強することを実証する。

【0218】

これらのデータは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ－（２Ａｄｏｄ）_４－ＮＨ_２が、ＮＫ細胞による抗腫瘍細胞傷害性に必要な受容体の発現を増強することを示す。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図1h】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図2j】

【図2k】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

【図3g】

【図3h】

【図3i】

【図3j】

【図3k】

【図3l】

【図3m】

【図3n】

【図3o】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図4g】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】