特表 2024-532853 治療用パピローマウイルスワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】治療用パピローマウイルスワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/37 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 14/025 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240903BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 33/243 20190101ALI20240903BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240903BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 39/39 20060101ALN20240903BHJP

   A61K 47/46 20060101ALN20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N15/37 ZNA

C12N15/86 Z

C07K14/025

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0783

A61P31/20

A61P35/00

A61P15/08

A61P43/00 121

A61P37/04

A61K48/00

A61K45/00

A61K33/243

A61K35/761

A61K35/76

A61K39/12

A61K35/17

A61P11/02

A61K39/39

A61K47/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510296

(86)(22)【出願日】2022-08-17

(85)【翻訳文提出日】2024-04-09

(86)【国際出願番号】 EP2022073016

(87)【国際公開番号】W WO2023021116

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】21191940.2

(32)【優先日】2021-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＮＯＮＩＤＥＴ

(71)【出願人】

【識別番号】513165908

【氏名又は名称】シリオン・バイオテック・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

(71)【出願人】

【識別番号】521129303

【氏名又は名称】ウニヴェルジテート レーゲンスブルク

(71)【出願人】

【識別番号】524062375

【氏名又は名称】インプロセア・アンパーツセルスケープ

【氏名又は名称原語表記】ＩｎＰｒｏＴｈｅｒ Ａｐｓ

(71)【出願人】

【識別番号】524062386

【氏名又は名称】プロバイオジェン・アクチェンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ティリオン，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ペルトゥル，コルドゥラ

(72)【発明者】

【氏名】カルラス，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ザンディヒ，フォルカー

(72)【発明者】

【氏名】ヨルダン，インゴ

(72)【発明者】

【氏名】ホルスト，ペーター ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ラーベク ボイレセン，ディッテ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァーグナー，ラルフ

(72)【発明者】

【氏名】ネッカーマン，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】アスバッハ，ベネディクト

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065BB19

4B065BB25

4B065BB37

4B065BC03

4B065BC07

4B065CA44

4B065CA45

4C076BB11

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC10

4C076CC17

4C076CC27

4C076CC35

4C076EE57

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA341

4C084ZA811

4C084ZB091

4C084ZB261

4C084ZB331

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA76

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF11

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA12

4C086HA24

4C086HA26

4C086HA28

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA34

4C086ZA81

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB33

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BC83

4C087CA12

4C087DA32

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA34

4C087ZA81

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ６、およびＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸分子が、単一のポリタンパク質をコードする、核酸に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

パピローマウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ６、およびＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸分子が、単一のポリタンパク質をコードする、核酸。

【請求項2】

パピローマウイルスタンパク質Ｅ２をコードする核酸配列をさらに含むか、またはさらにそれからなる、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記タンパク質をコードする核酸の順序が、５’から３’へと、
（ａ）Ｅ２が存在する範囲で、
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７；もしくは
（ｉｉ）Ｅ１、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ２；
または
（ｂ）Ｅ１、Ｅ６、Ｅ７
である、請求項１または２に記載の核酸。

【請求項4】

パピローマウイルスタンパク質Ｅ６および／またはＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸配列が、点突然変異および／または欠失によって、野生型対応物と比較して改変されており、前記点突然変異および／または欠失が、
（ｉ）軟寒天アッセイにおいて形成されるコロニーを消失させ；かつ
（ｉｉ）前記改変タンパク質Ｅ６およびＥ７が、それぞれの野生型タンパク質の予測エピトープの少なくとも７０％の予測高親和性エピトープ（ＩＣ５０＜５０ｎＭ）、および少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも５８％の予測低親和性エピトープ（５０ｎＭ＜ＩＣ５０＜５μＭ）を維持する、
請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項5】

前記パピローマウイルスが、霊長類パピローマウイルス、好ましくは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１、より好ましくは、ＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはマカクパピローマウイルス、好ましくは、ＭｆＰＶ３である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項6】

コードされるタンパク質中に野生型と比較して以下の改変のみが存在し：
（ｉｉｉ）Ｅ６において：野生型Ｅ６に含まれるＰＤＺドメインによって媒介される相互作用を低減または消失させる改変；および
ａ．ＨＰＶ１６ Ｅ６において：Ｌ１１７Ｘ_１；
ｂ．ＨＰＶ１８ Ｅ６において：Ｌ１１２Ｘ_１；
ｃ．ＭｆＰＶ３ Ｅ６において：Ｌ１１０Ｘ_１；
ならびに
（ｉｖ）Ｅ７において：
ａ．ＨＰＶ１６ Ｅ７において：Ｃ２４Ｘ_２、Ｌ６７Ｘ_３、およびＣ９１Ｘ_４；
ｂ．ＨＰＶ１８ Ｅ７において：Ｃ２７Ｘ_２、Ｌ７４Ｘ_３、およびＣ９８Ｘ_４；
ｃ．ＭｆＰＶ３ Ｅ７において：Ｃ２４Ｘ_２、Ｌ７１Ｘ_３、およびＣ９５Ｘ_４；
ここで、Ｘ_１～Ｘ_４は、独立して、それらが置換するそれぞれのアミノ酸とは異なるタンパク質原性アミノ酸である、
請求項４または５に記載の核酸。

【請求項7】

前記核酸が、ＨＰＶ１６ Ｅ７におけるＤ２１Ｘ_５およびＣ５８Ｘ_６、ＨＰＶ１８ Ｅ７におけるＤ２４Ｘ_５およびＣ６５Ｘ_６、ならびにＭｆＰＶ３ Ｅ７におけるＤ２１Ｘ_５およびＣ６２Ｘ_６をコードする一方または両方の突然変異をさらに含み、ここで、Ｘ_５およびＸ_６は、独立して、それらが置換するそれぞれのアミノ酸とは異なるタンパク質原性アミノ酸である、請求項６に記載の核酸。

【請求項8】

（ｉ）Ｘ_１が、Ｑ、Ｙ、およびＮから選択され、好ましくは、Ｑであり；
（ｉｉ）Ｘ_２が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３が、Ｒ、Ｋ、およびＨから選択され、好ましくは、Ｒであり；
（ｉｖ）Ｘ_４が、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ａであり；
（ｖ）Ｘ_５が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；
（ｖｉ）Ｘ_６が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；ならびに／あるいは
（ｖｉｉ）ＰＤＺドメインによって媒介される相互作用を低減もしくは消失させる前記改変が、１～１０のＣ末端アミノ酸の欠失、好ましくは、Ｃ末端からカウントされる１～１０のＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、ＨＰＶ１６ Ｅ６におけるΔＥＴＱＬ、ＨＰＶ１８ Ｅ６におけるΔＥＴＱＶ、およびＭｆＰＶ３ Ｅ６におけるΔＥＴＥＶであるか；または前記改変が、１０個、好ましくは、４個のＣ末端アミノ酸を伴う１個、２個、３個もしくは４個の点突然変異である、請求項６または７に記載の核酸。

【請求項9】

前記ポリタンパク質におけるＣｙｓ残基の総数が、偶数である、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項10】

前記数が、その他偶数ではない場合、
（ｉｉ）ａ．Ｃ３００Ｘ_７突然変異を有するＨＰＶ１６ Ｅ２；
ｂ．Ｃ３０１Ｘ_７突然変異を有するＨＰＶ１８ Ｅ２；もしくは
ｃ．Ｃ２９７Ｘ_７突然変異を有するＭｆＰＶ３ Ｅ２
をコードする配列が、
Ｅ２をコードする配列として前記核酸に含まれ、ここで、Ｘ_７は、Ｃ以外のタンパク質原性アミノ酸であり、好ましくは、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、およびＰから選択され、より好ましくは、Ａであり；
または（ｉｉｉ）Ｃｙｓをコードするコドンが、前記核酸に挿入される、
請求項９に記載の核酸。

【請求項11】

前記核酸が、遺伝子アジュバント、好ましくは、Ｔ細胞アジュバントＭＨＣ－ＩＩ会合不変鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項12】

前記不変鎖が、
（ｉ）１回存在し、第１のＥタンパク質をコードする配列に先行するか；または
（ｉｉ）２回存在し、１つのコピーが、第１のＥタンパク質をコードする配列に先行し、第２のコピーが、Ｅ６をコードする配列、もしくは存在する範囲で、Ｅ２をコードする配列に先行する、請求項１１に記載の核酸。

【請求項13】

前記核酸が、
（ｉ）ＤＮＡ；
（ｉｉ）プラスミド；または
（ｉｉｉ）ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ
である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項14】

前記核酸が、Ｔｅｔオペレーターを含む非翻訳５’末端を含む、請求項１３（ｉ）に記載の核酸。

【請求項15】

前記核酸が、自己切断ペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、自己切断ペプチドをコードする前記核酸配列が、
（ｉ）遺伝子アジュバントをコードする少なくとも１つの核酸配列に先行するか；または
（ｉｉ）パピローマウイルスタンパク質をコードする２つの核酸配列間にかつそれに近接して位置する、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項16】

隣接している核酸配列が、１０個以下のアミノ酸長、例えば、２、３、４、または５個のアミノ酸である可撓性リンカーをコードする配列によって、１つ、複数、またはすべての場合において接続され、ここで、ＧＳおよびＧＣＳが、好ましいリンカーである、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項17】

先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルスベクター。

【請求項18】

前記ベクターが、ＤＮＡウイルスベクター、好ましくは、
（ｉ）アデノウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルスＥ１およびＥ３コード配列に関して欠損しているアデノウイルスベクターであって、前記ベクターが、より好ましくは、Ａｄ１９ａ／６４、Ａｄ５、線維置換を有するＡｄ５、例えば、Ａｄ５Ｆ３５、Ａｄ２６、Ｃｈｉｍｐ６３、もしくはｃｈＡｄＯｘ１である、アデノウイルスベクター；または
（ｉｉ）ポックスウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＣＲ１９、ＳＣＶ、ワクシニア、もしくはＦｏｗｌｐｏｘ
である、請求項１７に記載のウイルスベクター。

【請求項19】

先行する請求項のいずれかに記載の核酸もしくはベクターによってコードされるポリタンパク質、またはそれに由来する切断産物。

【請求項20】

（ｉ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸；
（ｉｉ）請求項１７もしくは１８に記載のベクター；
（ｉｉｉ）請求項１９に記載のポリタンパク質もしくはその切断産物；または
（ｉｖ）（ｉ）の核酸もしくは（ｉｉ）のベクターで形質導入された細胞であって、好ましくは、前記細胞が、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の細胞および／もしくは樹状細胞、または単球である、細胞
を含むか、またはそれからなる医薬組成物、好ましくは、ワクチン。

【請求項21】

前記ベクター、前記核酸、前記ポリタンパク質または前記細胞が、薬学的に活性な作用物質のみである、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記医薬組成物が、２つ以上の薬学的に活性な作用物質を含み、第２の薬学的に活性な作用物質が、
（ｉ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の第２の核酸；
（ｉｉ）請求項１７または１８に記載の第２のベクター；
（ｉｉｉ）請求項１９に記載の第２のポリタンパク質または切断産物；
（ｉｖ）請求項２０（ｉｖ）に定義される第２の細胞；
（ｖ）タンパク質ベースワクチン、好ましくは、パピローマウイルスに対するタンパク質ベースワクチン；および
（ｖｉ）化学療法薬、好ましくは、シスプラチン
から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記医薬組成物が、
（ｉ）請求項１８（ｉ）に定義されるアデノウイルスベクター；および
（ｉｉ）請求項１８（ｉｉ）に定義されるポックスウイルスベクター
である２つの薬学的に活性な作用物質を含み、
前記２つの薬学的に活性な作用物質が、好ましくは、任意の順序でまたは同時に、好ましくは、前記アデノウイルスベクターを含む前記医薬組成物後、好ましくは、少なくとも４週間経過した後に、前記ポックスウイルスベクターを含む医薬組成物が投与され得る２つの医薬組成物として調合される、請求項２２（ｉｉ）に記載の医薬組成物。

【請求項24】

医薬における使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ポリタンパク質または細胞。

【請求項25】

前記ワクチンが、治療用ワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。

【請求項26】

パピローマウイルス感染、低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、鼻ポリープ、またはパピローマウイルス関連悪性状態、例えば、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、および口腔咽頭扁平上皮細胞癌（ＯＰＳＣＣ）を処置または予防する方法における使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の核酸、ベクター、ポリタンパク質、細胞またはワクチン。

【請求項27】

Ｔ細胞を刺激および／または拡大増殖するインビトロまたはエクスビボの方法であって、前記方法が、インビトロまたはエクスビボで、Ｔ細胞を、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、またはポリタンパク質と接触させることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ６、およびＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸分子が、単一のポリタンパク質をコードする、核酸に関する。

【0002】

本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連すると考えられないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、すべての言及される文献は、それぞれ個々の文献が、参照により組み込まれることが具体的および個々に示されたかのような同じ程度まで、参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

子宮頸部病変のための効果的な予防用ワクチンおよびスクリーニングする可能性にもかかわらず、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染は、今もなお、２０２０年に世界中で３４０，０００超の子宮頸がん関連死の原因であった［Sung, H. et al., Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 71(3), 209-249, 2001］。

【0004】

これらの症例の８５％超は、中および低所得国で起こった（Haghshenas, M. et al. Prevalence and type distribution of high-risk human papillomavirus in patients with cervical cancer: a population-based study. Infect. Agent. Cancer 8, 20, 2013）。現在、ワクチンが標的にするＨＰＶ型に対するほぼ完全な保護を提供する３つの承認された予防用ワクチンが存在するが、それにもかかわらず、ワクチン接種は、不完全である（Brotherton, J. M. L., Zuber, P. L. F. & Bloem, P. J. N. Primary Prevention of HPV through Vaccination: Update on the Current Global Status. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 5, 210-224, 2016）。また、これらのワクチンは、それらが、感染した基底層細胞および子宮頸がん細胞において発現されない主要カプシドタンパク質Ｌ１を標的にするので、以前に感染した細胞の根絶をもたらさない（Lehtinen, M. et al. Overall efficacy of HPV-16/18 AS04-adjuvanted vaccine against grade 3 or greater cervical intraepithelial neoplasia: 4-year end-of-study analysis of the randomised, double-blind PATRICIA trial. Lancet. Oncol. 13, 89-99, 2012；Hildesheim, A. et al. Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection: a randomized trial. JAMA 298, 743-753, 2007；Schiller, J. T., Castellsague, X. & Garland, S. M. A review of clinical trials of human papillomavirus prophylactic vaccines. Vaccine 30 Suppl 5, F123-38; 2012；Hung, C.-F., Ma, B., Monie, A., Tsen, S.-W. & Wu, T.-C. Therapeutic human papillomavirus vaccines: current clinical trials and future directions. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 421-439, 2008）。そのため、治療用ワクチンなどの新規介入が所望されている。

【0005】

ほとんどのＨＰＶ感染は、数か月以内に自然に排除されるが、一部は数年間持続する（Ho, G. Y., Bierman, R., Beardsley, L., Chang, C. J. & Burk, R. D. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N. Engl. J. Med. 338, 423-428, 1998）。これらは、低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）に進行し得、これは、さらに、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）および子宮頸がんに進行し得る。ウイルスタンパク質の発現パターンは、ＳＩＬの進行の間に変化する：ＬＳＩＬにおいて、主に、初期タンパク質Ｅ１／Ｅ２が発現されるが、ＨＳＩＬおよび形質転換細胞において、Ｅ６／Ｅ７が高度に発現され、Ｅ２発現は低いまたは存在しない（Xue, Y. et al. HPV16 E2 is an immediate early marker of viral infection, preceding E7 expression in precursor structures of cervical carcinoma. Cancer Res. 70, 5316-5325, 2010；Chang, L., He, X., Yu, G. & Wu, Y. Effectiveness of HPV 16 viral load and the E2/E6 ratio for the prediction of cervical cancer risk among Chinese women. J. Med. Virol. 85, 646-654, 2013）。

【0006】

ＳＩＬの多くの症例において、しかしながら、自然退縮が、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の結果として起こる（Hibma, M. H. The Immune Response to Papillomavirus During Infection Persistence and Regression. The Open Virology Journal vol. 6, 2012）。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞が、ＬＳＩＬの間質において見出されるＣＤ４：ＣＤ８比の増加による病変退縮において主要な役割を果たすことが示されている（Monnier-Benoit, S. et al. Immunohistochemical analysis of CD4+ and CD8+ T-cell subsets in high risk human papillomavirus-associated pre-malignant and malignant lesions of the uterine cervix. Gynecol. Oncol. 102, 22-31, 2006）。遺伝学的研究は、慢性感染およびがんについての抵抗性および感受性の遺伝子座が、ＭＨＣ ＩＩ領域においてクラスター化することを示している。さらにまた、ＨＰＶ１６^＋子宮頸がん患者は、Ｅ２およびＥ６に対するメモリーＣＤ４^＋ Ｔヘルパー応答を損なっており、これは、進行の予防および病変の排除におけるＴ細胞応答の重要な役割を強調する（Brotherton et al, 2016；Lehtinen et al, 2012；Hildesheim et al, 2007；Schiller et al, 2012；Hung et al, 2008；Ho et al, 1998；Xue et al, 2010；Chang et al, 2013；Hibma, 2012；Monnier-Benoit et al, 2006；de Jong, A. et al. Human Papillomavirus Type 16-Positive Cervical Cancer Is Associated with Impaired CD4+ T-Cell Immunity against Early Antigens E2 and E6. Cancer Res. 64, 5449 LP - 5455; 2004；Woo, Y. L. et al. A prospective study on the natural course of low-grade squamous intraepithelial lesions and the presence of HPV16 E2-, E6- and E7-specific T-cell responses. Int. J. cancer 126, 133-141, 2010；Ragonnaud, E., Pedersen, A. G. & Holst, P. J. Breadth of T Cell Responses After Immunization with Adenovirus Vectors Encoding Ancestral Antigens or Polyvalent Papillomavirus Antigens. Scand. J. Immunol. 85, 182-190, 2017；Dillon, S. et al. Resolution of cervical dysplasia is associated with T-cell proliferative responses to human papillomavirus type 16 E2. J. Gen. Virol. 88, 803-813, 2007）。ＨＰＶに曝露された小児が、感染の排除後にＥ２特異的Ｔ細胞応答を有することも報告された［Koskimaa, H. M. et al. Human papillomavirus 16-specific cell-mediated immunity in children born to mothers with incident cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and to those constantly HPV negative. J. Transl. Med. 13, 1-11, 2015］。それにもかかわらず、治療用ＨＰＶワクチンに対する現在の研究は、疾患のＨＳＩＬおよびがん段階に主に集中し、癌遺伝子ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７に向けられている（Hung et al, 2008）。しかしながら、発癌前の感染を標的にすることは、がん処置に関連する罹患率および苦痛を低減する観点から有利であり、達成がより容易である可能性がある。そのため、前がん性感染を標的にするために、他の初期タンパク質が、抗原として含まれていなければならない。

【0007】

前臨床状況における持続性ＨＰＶ感染を研究するための好適な動物モデルは存在しないが、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）パピローマウイルス３型（ＭｆＰＶ３）は、ＨＰＶ１６と系統発生的および表現型的に密接な関係がある（Ragonnaud et al, 2017; Chen, Z. et al. Non-human Primate Papillomaviruses Share Similar Evolutionary Histories and Niche Adaptation as the Human Counterparts. Front. Microbiol. 10, 2093, 2019）。このウイルスによる自然に起こる感染は、長期間の持続、および繁殖中の雌カニクイザルの子宮頸部における少なくともＬＳＩＬ様病変に関連し、それらを理想的な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）動物モデルにする［Chen, Z. et al. Genomic diversity and interspecies host infection of alpha12 Macaca fascicularis papillomaviruses (MfPVs). Virology 393, 304-310, 2009；Wood, C. E., Chen, Z., Cline, J. M., Miller, B. E. & Burk, R. D. Characterization and Experimental Transmission of an Oncogenic Papillomavirus in Female Macaques. J. Virol. 81, 6339-6345 (2007)］。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

先行技術不足の観点から、本発明の根底にある技術的課題は、パピローマウイルスの根絶、ならびにパピローマウイルス関連障害の予防および治療のための改善された手段および方法の提供において見ることができる。この技術的課題は、含まれる特許請求の範囲の主題によって解決される。

【課題を解決するための手段】

【0009】

第１の態様において、本発明は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ６、およびＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸分子が、単一のポリタンパク質をコードする、核酸を提供する。

【0010】

第１の態様に従う核酸は、３つのパピローマウイルスタンパク質をコードする配列の存在を必要とする。正確に３つまたは正確に４つのいずれかのパピローマウイルスタンパク質がコードされることが好ましい。第４のタンパク質がコードされる範囲で、パピローマウイルスタンパク質のＥファミリーのさらなるタンパク質、特に、Ｅ２が好ましい。好ましいパピローマウイルス種および株は、下記にさらに開示される。ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）が特に好ましい。

【0011】

本発明に従って、対応する全長または実質的に全長タンパク質をコードするコード配列が用いられる。３つまたは４つの全長タンパク質をコードする配列の共存は、第１の態様の核酸または前記核酸を含むベクターもしくはプラスミドでワクチン接種された生物における多数の免疫原性エピトープの提示を提供する。本明細書において使用される「実質的に全長」という用語は、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個、または最大で９、８、７、６、５、４、３個、または最大で２個、または１個のアミノ酸の適宜の非存在を指す。好ましくは、これらの欠失は、Ｃ末端、Ｎ末端、および／または欠失が、免疫原性エピトープを除去しないか、もしくは、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の他の部分に存在するエピトープの免疫原性に影響を及ぼさない領域にある。前記欠失が、パピローマウイルスタンパク質の発癌可能性を低減することが特に好ましい。後者の好ましい実施形態は、下記にさらに詳述する（Ｅ６のＣ末端改変）。さらにまた、「実質的に全長」が、Ｅ６のみに適用されるが、Ｅ１、Ｅ７、および存在する範囲でＥ２は、全長であることが好ましい。

【0012】

免疫応答、例えば、３つ以上、好ましくは、４つの異なる全長タンパク質に対するＴ細胞は、パピローマウイルス感染およびそれらに関連する障害に対する相乗的活性を現す。特に、Ｅ１／Ｅ２特異的細胞免疫の成功裏の刺激は、ＬＳＩＬ段階における感染を主に排除するが、Ｅ６／Ｅ７特異的応答は、ＨＳＩＬおよびがん段階を主に標的にする。

【0013】

本発明のさらなる利点には、パピローマウイルス感染を完全に根絶する驚くべき能力、ならびに予防的だけではなく、治療的な目的のための前記核酸の有用性が含まれる。これは、パピローマウイルスの発癌可能性の観点から、特に有利である。

【0014】

注目すべきは、これは、優れた性能を提供する、本発明のワクチンにおける３つ、好ましくは、４つの全長抗原の共存だけではなく、特にベクターにおけるそれらの特定の順序である。驚くべきことに、本発明の順序から逸脱した順序は、４つすべての抗原の適したエピトープ提示を保証しない。言い換えれば、本発明は、抗原の数を拡大することに関するだけでなく、特に、本明細書に定義されるそれらの順序に関する。

【0015】

全長コード配列を使用するアプローチは、全長タンパク質とは対照的に、断片のみをコードする配列を用いる先行技術のワクチンよりも優れている。特に、３つまたは４つの全長ウイルスタンパク質の同時発現から生じる相乗効果は、とりわけ提供される多数の免疫原性エピトープのせいで、複数のタンパク質の断片のみの併用よりも優れている。他方で、多くの場合における免疫化のための全長タンパク質の使用は、発癌可能性を有するタンパク質が前記タンパク質中にある範囲で、さらなる尺度を必要とするであろう。そのような尺度は、下記にさらに開示されるある特定の実施形態の対象である。

【0016】

予想外の優れた性能は、本明細書に含まれる実施例によって証拠付けられる。図１７に示され、実施例４において論じられるように、本発明に従うコンストラクト（抗原の数およびそれらの順序の両方によって特徴付けられる）は、２つの抗原のみを含むコンストラクトよりも顕著に優れている。図１７Ａは、腫瘍容量の低減の劇的な改善を示し、図１７Ｂは、生存の観点からの大きな改善を示す。

【0017】

またさらに、持続性ＨＰＶ感染の事例において、Ｔ細胞の消耗が起こり得ることが公知である。そのような状況下で、Ｔ細胞応答は低減する。実施例３に示されるように、本発明のコンストラクトは、持続性ＨＰＶ感染およびＴ細胞消耗を患っている非ヒト霊長類における免疫応答を引き起こすことができる。これは、本発明のコンストラクトが、ワクチンおよび治療用ワクチンとして有用であり、優れていることを示す、さらなる驚くべき知見である。

【0018】

本発明のパピローマウイルス抗原、すなわち、Ｅ１、Ｅ６、Ｅ７、および存在する範囲でＥ２は、単一のポリタンパク質として、本発明の核酸によってコードされる。言い換えれば、それらについてのコード配列は、単一のオープンリーディングフレームの部分である。「ポリタンパク質」という用語は、前記抗原の融合物、より具体的には、それぞれのタンパク質の配列間の介在アミノ酸なしの直接融合物を含む。「ポリタンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、２つの隣接しているタンパク質の配列間に挿入されるか、またはほとんどのＮ末端Ｅタンパク質のＮ末端に置かれるか、またはほとんどのＣ末端Ｅタンパク質のＣ末端に置かれる、タンパク質も包含する。そのような挿入配列の好ましい実行は、下記に示され、特定の機能、例えば、アジュバント機能もしくは自己切断機能を提供するように、および／または近接するタンパク質間の構造的干渉を回避するように働き得る。後者の論点は、抗原をコードする核酸配列間に位置する短い可撓性リンカーをコードする配列によって対処され得る。

【0019】

本発明の核酸によってコードされる単一のポリタンパク質の概念は、そのようなポリタンパク質が、翻訳の間または翻訳完了したら、１超のタンパク質分子を生じることを排除するものではない。後者は、特に、前記パピローマウイルスタンパク質に加えて、自己切断ペプチドがコードされる、本発明の核酸の実施形態に適用される。

【0020】

「核酸」という用語は、ヌクレオチドの重縮合体を指す。ポリメラーゼおよび／またはリボソームによって認識およびプロセシングされる核酸が好ましい。好ましい実行は、ＤＮＡおよびＲＮＡであり、詳細について、下記をさらに参照されたい。あまり好ましくないが、「核酸」という用語は、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む重縮合体にも拡張される。ヌクレオチド中の改変の部位は、当技術分野において周知の部位、すなわち、糖、リン酸および塩基である。それに関する好ましい改変は、２’改変、例えば、２’ＯＭｅを含む２’Ｏ－アルキル、および２’Ｆなどの２’ハロゲン置換である。好ましいリン酸改変は、チオリン酸を含む。好ましい改変塩基は、シュードウリジンであり、例えば、Nance and Meier, ACS Cent Sci. 2021 May 26; 7(5): 748-756を参照されたい。改変塩基、糖および／またはリン酸改変は、ＲＮＡワクチン、すなわち、本発明の核酸が、ＲＮＡとして実行される文脈において特に好ましい。

【0021】

パピローマウイルスタンパク質のＥファミリーは、ウイルスのライフサイクルにおいて「初期」と称されるタンパク質である。機能的な用語では、Ｅ１は、酵素機能を有し、これは、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼであり、例えば、Bergvall et al., Virology 2013 Oct;445(1-2):35-56を参照されたい。Ｅ６は、静止している細胞において細胞分裂を誘導することができる。これは、アポトーシスおよび免疫応答を阻害し、例えば、Vande Pol and Klingelhutz, Virology 2013 Oct;445(1-2):115-37を参照されたい。Ｅ７と一緒に、これは、形質転換効果を有する。Ｅ７は、ウイルスゲノム（例えば、Roman and Munger, Virology 2013 445: 138-68を参照されたい）、およびＥ６と一緒に、形質転換細胞の複製に関与する。図９は、野生型Ｅタンパク質の本発明の好ましいＥタンパク質との複数の配列アライメントを示す。

【0022】

好ましい実施形態において、前記核酸は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ２をコードする核酸配列をさらに含むか、またはそれからさらになる。

【0023】

Ｅ２は、多機能性であり、ゲノムの複製および転写に主に関与し、例えば、McBride, Virology. 2013 Oct;445(1-2):57-79を参照されたい。

【0024】

「からさらになる」という用語は、先行する態様または実施形態のクローズドの列挙を指し、例示的に挙げられた特徴の追加によって、前記クローズドの列挙の拡張を提供し、ここで、列挙は、クローズドのままであり、前記の明示的に挙げられた追加の特徴によって拡大される前記先行する態様または実施形態の特徴に限られる。

【0025】

注目すべきは、さらなる抗原としてＥ２を加えることにより、免疫応答は損なわれず、例えば、実施例４および図１０を参照されたい。

【0026】

本発明に従う抗原配列は、以下の配列表に示される：

【0027】

ＭｆＰＶ３のＥ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４、６、および８に示される。

【0028】

ＨＰＶ１６のＥ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、１２、１４、および１６に示される。

【0029】

ＨＰＶ１８のＥ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１８、２０、２２、および２４に示される。

【0030】

これらのタンパク質についてのコード核酸は、同じ順序で、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３に示される。

【0031】

前記好ましい実施形態に従って、本発明の核酸は、ポリタンパク質として、４つのタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７をコードし、ここで、好ましくは、パピローマウイルス起源のさらなるタンパク質は、前記核酸によってコードされない。

【0032】

さらなる好ましい実施形態において、前記タンパク質をコードする核酸の順序は、５’から３’へと、（ａ）Ｅ２が存在する範囲で、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、もしくは（ｉｉ）Ｅ１、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ２；または（ｂ）Ｅ１、Ｅ６、Ｅ７である。好ましくは、これらの列挙のいずれかは、クローズドであり、すなわち、パピローマウイルス起源のさらなるタンパク質をコードするさらなる配列は存在しない。他方で、実施形態は、さらなるアミノ酸配列、好ましくは、機能的アミノ酸配列が存在する実行に拡張される（詳細について、下記をさらに参照されたい）。

【0033】

４つのタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７をコードする配列が、示された順序で（５’から３’へと）存在することが最も好ましい。また、異なる順序を有する本発明のコンストラクトが十分に機能する一方で、これは、例えば、図３Ｂにおいて、最も好ましいコンストラクトにおける順序が、Ｅ２応答の観点から、さらに良好な性能を保証することが見られ得る。

【0034】

さらに好ましい実施形態において、第１の態様の前記核酸は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ６および／またはＥ７をコードする核酸配列を含み、ここで、前記核酸配列は、点突然変異および／または欠失によって、野生型対応物と比較して改変されており、前記点突然変異および／または欠失は、（ｉ）少なくともバックグラウンドレベルまで、軟寒天アッセイにおいて形成されるコロニーを消失させ；かつ（ｉｉ）前記改変タンパク質Ｅ６およびＥ７が、好ましくはそれぞれ、各ＨＬＡについての７５％のヒトＨＬＡ多様性を一緒に含む、好ましくは最も高頻度のＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－Ｃ対立遺伝子への（予測）結合の観点から、それぞれの野生型タンパク質の予測エピトープの少なくとも７０％の予測高親和性エピトープ（ＩＣ_５０≦５０ｎＭ）、および少なくとも５０％、少なくとも５５％または少なくとも５８％の予測低親和性エピトープ（５０ｎＭ＜ＩＣ_５０≦５μＭ）を維持する。この好ましい実施形態は、さらなるパピローマウイルスタンパク質、Ｅ１、および適宜この文脈において好ましいＥ２の存在を可能にする。

【0035】

前記最も高頻度の対立遺伝子は以下の通りである：
ＨＬＡ－Ａ^＊０１：０１
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０２
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１２
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１９
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：５０
ＨＬＡ－Ａ^＊０３：０１
ＨＬＡ－Ａ^＊１１：０１
ＨＬＡ－Ａ^＊２４：０２
ＨＬＡ－Ａ^＊２４：０３
ＨＬＡ－Ａ^＊３０：０１
ＨＬＡ－Ａ^＊３０：０２
ＨＬＡ－Ａ^＊３３：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊０７：０２
ＨＬＡ－Ｂ^＊０８：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊０８：０２
ＨＬＡ－Ｂ^＊０８：０３
ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：０２
ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：０３
ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：０９
ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：１７
ＨＬＡ－Ｂ^＊１８：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊２７：０５
ＨＬＡ－Ｂ^＊２７：２０
ＨＬＡ－Ｂ^＊３５：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊３５：０３
ＨＬＡ－Ｂ^＊３９：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊４０：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊４０：０２
ＨＬＡ－Ｂ^＊４０：１３
ＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０２
ＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０３
ＨＬＡ－Ｂ^＊５１：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊５８：０１
ＨＬＡ－Ｂ^＊５８：０２
ＨＬＡ－Ｃ^＊０３：０３
ＨＬＡ－Ｃ^＊０４：０１
ＨＬＡ－Ｃ^＊０６：０２
ＨＬＡ－Ｃ^＊０７：０１
ＨＬＡ－Ｃ^＊０７：０２
ＨＬＡ－Ｃ^＊０８：０２

【0036】

特に好ましい実施形態において、前記改変Ｅ６タンパク質は、好ましくは、上記で規定されたようにして決定される、野生型Ｅ６の予測エピトープの、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の予測高親和性エピトープ（ＩＣ_５０≦５０ｎＭ）、および少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９３％の予測低親和性エピトープ（５０ｎＭ＜ＩＣ_５０≦５μＭ）を維持する。

【0037】

それに関連して、別々の態様において、本発明は、パピローマウイルスタンパク質Ｅ６および／またはＥ７をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸であって、前記核酸配列が、点突然変異および／または欠失によって、野生型対応物と比較して改変されており、前記点突然変異および／または欠失が、（ｉ）軟寒天アッセイにおいて形成されるコロニーを消失させ；かつ（ｉｉ）前記改変タンパク質Ｅ６およびＥ７が、好ましくはそれぞれ、各ＨＬＡについての７５％のヒトＨＬＡ多様性を一緒に含む、好ましくは最も高頻度のＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－Ｃ対立遺伝子への結合の観点から、それぞれの野生型タンパク質の予測エピトープの少なくとも７０％の予測高親和性エピトープ（ＩＣ_５０≦５０ｎＭ）、および少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも５８％の予測低親和性エピトープ（５０ｎＭ＜ＩＣ_５０≦５μＭ）を維持する、核酸配列を提供する。前記別々の態様の好ましい実施形態において、前記改変Ｅ６タンパク質は、好ましくは、上記で規定されたようにして決定される、野生型Ｅ６の予測エピトープの、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の予測高親和性エピトープ（ＩＣ_５０≦５０ｎＭ）および少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９３％の予測低親和性エピトープ（５０ｎＭ＜ＩＣ_５０≦５μＭ）を維持する。この態様は、存在するパピローマウイルスタンパク質をコードする任意のさらなる核酸配列を必要としない。

【0038】

上記で述べたように、タンパク質Ｅ６およびＥ７は、宿主細胞の挙動を制御および改変する際に役割を果たし、発癌または形質転換の可能性を現し得る。結果として、これらのタンパク質を免疫原として使用することは、特に、パピローマウイルス関連悪性障害の制御、根絶、予防、緩和、または処置に関する場合に、望ましく、魅力的である。他方で、それらの発癌可能性は、ワクチンまたはワクチンの構成成分としてのそれらの使用に関連する対応するリスクを引き起こす。これらの考察と合致して、上記の好ましい実施形態は、前記発癌可能性を緩和または消失させるための尺度を提供する。この文脈において、免疫原性が保持されながら発癌性が制御されるという点で、前記実施形態によってバランスがとられる。好ましくは、前記点突然変異および欠失は、最小の数である。

【0039】

発癌可能性の尺度として、軟寒天アッセイである当技術分野で確立された標準が使用され、含まれる実施例も参照されたい。

【0040】

免疫原性の尺度として、免疫原性エピトープの免疫原性および／または数を予測するインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）の方法が使用される。そのような方法には、ＭＨＣ Ｉ分子に結合するＴ細胞エピトープを予測するコンピューターアルゴリズムが含まれる。これに関する好ましいインシリコの方法は、ＩＥＤＢ分析リソースＡＮＮ（ＮｅｔＭＨＣとしても公知）、バージョン４．０［Nielsen et al., Protein Sci 12: 1007 (2003)；Lundegaard et al., Nucl Acids Res 36, W509 (2008)；Andreatta et al., Bioinformatics 32, 511 (2016)］である。少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはすべての免疫原性エピトープが、それらが対応する野生型タンパク質に存在する場合、改変Ｅ６および／またはＥ７に保持されることも好ましい。

【0041】

以下で明らかになるように、本発明は、好ましい実施形態において、対応する野生型配列と比較して、最小の改変を提供し、ここで、前記最小は、軟寒天アッセイにおける必要な性能、および対応する野生型配列の免疫原性エピトープの高パーセンテージを保持する観点の両方を達成する。

【0042】

したがって、特に好ましい実施形態において、コードされるタンパク質中に野生型と比較して以下の改変のみが存在し：
（ｉ）Ｅ６において：野生型Ｅ６に含まれるＰＤＺドメインによって媒介される相互作用を低減または消失させる改変；および
ａ．ＨＰＶ１６ Ｅ６において：Ｌ１１７Ｘ_１；
ｂ．ＨＰＶ１８ Ｅ６において：Ｌ１１２Ｘ_１；
ｃ．ＭｆＰＶ３ Ｅ６において：Ｌ１１０Ｘ_１；
ならびに
（ｉｉ）Ｅ７において：
ａ．ＨＰＶ１６ Ｅ７において：Ｃ２４Ｘ_２、Ｌ６７Ｘ_３、およびＣ９１Ｘ_４；
ｂ．ＨＰＶ１８ Ｅ７において：Ｃ２７Ｘ_２、Ｌ７４Ｘ_３、およびＣ９８Ｘ_４；
ｃ．ＭｆＰＶ３ Ｅ７において：Ｃ２４Ｘ_２、Ｌ７１Ｘ_３、およびＣ９５Ｘ_４；
ここで、Ｘ_１からＸ_４は、独立して、それらが置換するそれぞれのアミノ酸とは異なるタンパク質原性アミノ酸である。

【0043】

一般的に言えば、所与の第２のパピローマウイルス種由来のそれぞれＥ２、Ｅ６またはＥ７タンパク質中の位置に対応する所与の第１のパピローマウイルス種由来のＥ２、Ｅ６またはＥ７タンパク質中の位置は、図９に示される複数の配列アライメントを使用して決定することができる。対応する位置は、他のものの上にあるものである。言い換えれば、対応する位置の決定は、特に、任意のさらなるパピローマウイルス株由来の配列がさらなる面倒なく追加することができる前記複数の配列アライメントを使用して、異なるＨＰＶ株にわたる高度の保存を考慮して容易である。そのようなアライメントは、当業者に周知のコンピュータープログラムを用いて、好ましくは、デフォルト設定（非常に正確；ギャップオープンコスト１０．０；ギャップ拡張コスト１．０、エンドキャップコスト：任意の他のもの通り）を使用するＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン８．０．１（ＱＩＡＧＥＮ、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）を用いて、調製することができる。

【0044】

好ましくは、必須ではないが、前記核酸は、ＨＰＶ１６ Ｅ７におけるＤ２１Ｘ_５およびＣ５８Ｘ_６、ＨＰＶ１８ Ｅ７におけるＤ２４Ｘ_５およびＣ６５Ｘ_６、ならびにＭｆＰＶ３ Ｅ７におけるＤ２１Ｘ_５およびＣ６２Ｘ_６をコードする一方または両方の突然変異をさらに含み、ここで、Ｘ_５およびＸ_６は、独立して、それらが置換するそれぞれのアミノ酸とは異なるタンパク質原性アミノ酸である。

【0045】

具体的な改変の観点から、（ｉ）Ｘ_１が、Ｑ、Ｙ、およびＮから選択され、好ましくは、Ｑであり；（ｉｉ）Ｘ_２が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；（ｉｉｉ）Ｘ_３が、Ｒ、Ｋ、およびＨから選択され、好ましくは、Ｒであり；（ｉｖ）Ｘ_４が、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ａであり；（ｖ）Ｘ_５が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；（ｖｉ）Ｘ_６が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩから選択され、好ましくは、Ｇであり；ならびに／あるいは（ｖｉｉ）ＰＤＺドメインによって媒介される相互作用を低減もしくは消失させる前記改変が、１～１０のＣ末端アミノ酸の欠失、好ましくは、Ｃ末端からカウントされる１～１０のＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、ＨＰＶ１６ Ｅ６におけるΔＥＴＱＬ、ＨＰＶ１８ Ｅ６におけるΔＥＴＱＶ、およびＭｆＰＶ３ Ｅ６におけるΔＥＴＥＶであるか；または前記改変が、１０個、好ましくは、４個のＣ末端アミノ酸を伴う１個、２個、３個もしくは４個の点突然変異であることが好ましい。

【0046】

「Δ」という表記は、当技術分野で確立されており、この実施形態の文脈において、４個の示されたＣ末端残基の欠失を指す。

【0047】

さらに好ましい実施形態において、前記ポリタンパク質におけるＣｙｓ残基の総数は、偶数である。これをどのように達成するかは特に限定されない。１つまたは複数の免疫原性エピトープの喪失を引き起こさない実行が好ましい。特定の理論によって拘束されることを望まないが、偶数のＣｙｓ残基が、抗原の収量を増加させると想定される。さらに説明するために、抗原は、不変鎖（不変鎖に関する詳細について、下記をさらに参照されたい）に融合される場合、分泌経路に方向付けられる。小胞体（ＥＲ）において、シャペロン（遊離システインに結合するタンパク質－ジスルフィド－イソメラーゼなど）は、遊離Ｃｙｓを検出することができ、これは、次に、ＥＲ－ストレス応答をもたらす可能性があり、次いで、タンパク質合成の減少または停止に至り、このようにして、抗原の発現を制限する。

【0048】

特に好ましい実施形態において、前記Ｃｙｓ残基の総数が、その他偶数ではない場合、
（ｉ）ａ．Ｃ３００Ｘ_７突然変異を有するＨＰＶ１６ Ｅ２；
ｂ．Ｃ３０１Ｘ_７突然変異を有するＨＰＶ１８ Ｅ２；もしくは
ｃ．Ｃ２９７Ｘ_７突然変異を有するＭｆＰＶ３ Ｅ２
をコードする配列は、
Ｅ２をコードする配列として前記核酸に含まれ、ここで、Ｘ_７は、Ｃ以外のタンパク質原性アミノ酸であり、好ましくは、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、およびＰから選択され、より好ましくは、Ａであり；
または（ｉｉｉ）Ｃｙｓをコードするコドンは、前記核酸に挿入される。

【0049】

さらに好ましい実施形態において、前記核酸は、遺伝子アジュバント、好ましくは、Ｔ細胞アジュバントＭＨＣ－ＩＩ会合不変鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。前記不変鎖はまた、以下において「ｌｉ」と略される。Ｔ細胞アジュバントＭＨＣ－ＩＩ会合不変鎖は、いくつかの文脈において、遺伝子アジュバント（すなわち、核酸によってコードされるアジュバントであって、前記核酸は、免疫応答を上昇させるものに対する抗原をコードする核酸配列も含んでいてもよい）として成功裏に使用されており、例えば、公開された国際特許出願ＷＯ２００７／０６２６５６、ＷＯ２０１０／０５７５０１およびＷＯ ２０１８／１７２２５９を参照されたい。前記不変鎖が起源とする種の観点から、硬骨類不変鎖（例えば、ＷＯ２０２０／０７９２３４を参照されたい）、サメ不変鎖（例えば、ＷＯ ２０１５／０８２９２２を参照されたい）および哺乳類、好ましくは、ヒト不変鎖を含む脊椎動物が好ましく、上記で引用した３つのＷＯ文献を参照されたい。ヒト不変鎖が特に好ましい。

【0050】

さらに、本開示に従って使用され得る遺伝子アジュバントは、熱ショックタンパク質のカルレティキュリンおよびＣ４ｂである。

【0051】

前記不変鎖の存在は、相乗効果のおかげで予想外の性能を引き起こす。特に、癌遺伝子タンパク質Ｅ６およびＥ７とＩｉとの上記に開示した改変の組合せは、予想外の程度まで発癌性を低減する。特定の理論によって拘束されることを望まないが、これは、ｌｉによって提供される技術的効果の結果：例えば、核に優先的に局在する融合されたｌｉの非存在下で、発癌可能性が、現れ得ないか、またはより低い程度のみであり得る細胞質への、Ｅ６およびＥ７の排出であると考えられる。

【0052】

特に好ましい実施形態において、前記不変鎖は、（ｉ）１回存在し、第１のＥタンパク質をコードする配列に先行するか；または（ｉｉ）２回存在し、１つのコピーが、第１のＥタンパク質をコードする配列に先行し、第２のコピーが、Ｅ６をコードする配列、もしくは存在する範囲で、Ｅ２をコードする配列に先行する。この実施形態は、例示的なまたは好ましいコンストラクトに関し、ここで、本発明の核酸内の前記不変鎖の特定の配置に適用される。そのような例示的な実施形態は、実施するために低減されたが（本明細書に含まれる実施例を参照されたい）、本発明は、そのように限定されない。「第１のＥタンパク質」という用語は、本発明の核酸によってコードされる融合タンパク質中の、Ｅ１、Ｅ６およびＥ７、ならびに存在する場合Ｅ２から選択されるほとんどのＮ末端タンパク質を指す。Ｅ１が第１のＥタンパク質であることが好ましい。

【0053】

前記遺伝子アジュバントの代替として、またはそれに加えて、当技術分野において公知のアジュバントが使用されてもよい。そのようなアジュバントには、サイトカイン、接着分子、ケモカイン、ＣＣＲ１／５アゴニスト、ＭＩＰ－１アルファ、危険シグナル、ＬＰＳおよびその誘導体、例えば、リピドＡおよびリピドＡ誘導体、ならびにＴＬＲアゴニストが含まれる。

【0054】

さらに好ましい実施形態において、前記核酸は、（ｉ）ＤＮＡ；（ｉｉ）プラスミド；または（ｉｉｉ）ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡワクチンが開発中であり、Ｂｉｏｎｔｅｃｈ／ＰｆｉｚｅｒのＣｏｍｉｒｎａｔｙおよびＭｏｄｅｒｎａ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのｍＲＮＡ－１２７３などのいくつかは、販売承認を受けている。その固有の不安定性を考慮して、ＲＮＡは、それらの安定性を増強するために、化学的に改変されていてもよく、例えば、Hu et al., Signal Transduction and Targeted Therapy 2020, 5:101におけるｓｉＲＮＡについて記載される改変、および上記でさらに本明細書に開示される改変を参照されたい。ｍＲＮＡワクチンは、一般に、翻訳開始点にコザック配列、オープンリーディングフレームの最後に翻訳終止コドン、および３’－非翻訳領域にポリアデニル化部位を含む。

【0055】

好ましい実施形態において、前記ＤＮＡおよび前記プラスミドは、プロモーター、好ましくは、真核細胞において活性なプロモーターを含む。そのようなプロモーターには、ＣＭＶプロモーター、好ましくは、ＨＴＬＶ－１エンハンサーエレメントを有するＣＭＶプロモーター、ＵｂＣプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターが含まれる。

【0056】

好ましい実施形態において、前記プラスミドは、細菌の複製起点、例えば、ｐＵＣ ｏｒｉを含み、より好ましくは、選択マーカー、例えば、カナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子も含む。

【0057】

さらに好ましい実施形態において、前記核酸、特に前記ＤＮＡは、Ｔｅｔオペレーターを含む非翻訳５’末端を含む。公知のＴｅｔ－ＯｆｆおよびＴｅｔ－Ｏｎシステムのうち、オフスイッチが産生細胞の構成要素であり、ウイルス産物の構成要素ではないことを考えると、Ｔｅｔ－Ｏｆｆが好ましい。好ましいＴｅｔオペレーター部位は、配列番号１０５に示される。本発明によって用いられるＴｅｔシステムは、Ｔ－ＲＥｘシステムとして公知のシステムである。

【0058】

Ｔ－ＲＥｘシステムにおいて、目的の遺伝子は、上流のＣＭＶプロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター ２（ＴｅｔＯ２）部位の２つのコピーにフランキングしている。目的の遺伝子の発現は、テトラサイクリンの非存在下で、各ＴｅｔＯ２配列へのＴｅｔＲホモ二量体の高親和性結合によって抑制される。本発明において、産生細胞株は、Ｔｅｔ抑制因子ＴｅｔＲを発現するように改変された。テトラサイクリンの導入は、各ＴｅｔＲホモ二量体における１つのテトラサイクリンの結合と、それに続くＴｅｔＯ２からのＴｅｔＲホモ二量体の放出をもたらす。ＴｅｔＯ２からのＴｅｔＲホモ二量体を開放することにより、目的の遺伝子の抑制解除をもたらす。例えば、Hillen W. and Berens. Mechanisms underlying expression of Tn10 encoded tetracycline resistance, Annu Rev Microbiol. 1994;48:345-69；W Hillen, C Gatz, L Altschmied, K Schollmeier, I Meier. Control of expression of the Tn10-encoded tetracycline resistance genes. Equilibrium and kinetic investigation of the regulatory reactions, J Mol Biol. 1983 Sep 25;169(3):707-21；Kathleen Postle, Toai T. Nguyen, Kevin P. Bertrand. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Research, Volume 12, Issue 12, 25 June 1984, Pages 4849-4863；およびFeng Yao, Tor Svensjoe, Thomas Winkler, Michael Lu, Carl Eriksson, and Elof Eriksson. Tetracycline Repressor, tetR, rather than the tetR-Mammalian Cell Transcription Factor Fusion Derivatives, Regulates Inducible Gene Expression in Mammalian Cells, Human Gene Therapy. Sep 1998.1939-1950を参照されたい。

【0059】

好ましい実施形態において、前記核酸は、自己切断ペプチド、または翻訳を継続しながらリボソームにペプチド結合を形成させないペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、前記ペプチドをコードする前記核酸配列は、好ましくは、（ｉ）遺伝子アジュバントをコードする少なくとも１つの核酸配列に先行するか；または（ｉｉ）パピローマウイルスタンパク質をコードする２つの核酸配列間にかつそれに近接して位置する。

【0060】

最大数の免疫原性エピトープが存在することと考えると、自己切断ペプチドをコードする前記核酸配列を、本発明の抗原の１つをコードする核酸配列に挿入することは好ましくない。

【0061】

好ましいペプチド配列は、本明細書において「ｐ２ａ」と称される。

【0062】

本発明に従う特に好ましい核酸は、以下のポリタンパク質をコードするものである：
ｌｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７
ｌｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－ｌｉ－Ｅ６Ｅ７
Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７
ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－ｌｉ－Ｅ２
ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７

【0063】

コードされるタンパク質が、ＭｆＰＶ３タンパク質であるか、それに基づく、これらのコンストラクトをコードする核酸の配列は、同じ順序：配列番号２５、２７、２９、３１および３３であり、対応するポリタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２６、２８、３０、３２および３４に示される。

【0064】

コードされるタンパク質が、ＨＰＶ１６タンパク質であるか、それに基づく、これらのコンストラクトをコードする核酸の配列は、同じ順序：配列番号３５、３７、３９、４１および４３であり、対応するポリタンパク質配列は、それぞれ、配列番号３６、３８、４０、４２および４４に示される。

【0065】

コードされるタンパク質が、ＨＰＶ１８タンパク質であるか、それに基づく、これらのコンストラクトをコードする核酸の配列は、同じ順序：配列番号４５、４７、４９、５１および５３であり、対応するポリタンパク質配列は、それぞれ、配列番号４６、４８、５０、５２および５４に示される。

【0066】

配列番号１００～１０４はすべて、ＨＰＶ１８ ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７、より具体的には、以下：ＨＰＶ１８ ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７核酸配列（配列番号１００）、ＨＰＶ１８ ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７タンパク質配列（配列番号１０１）、さまざまなウイルスベクターに挿入されるＨＰＶ１８ ｌｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７ペイロード（配列番号１０２～１０４）に関する。

【0067】

注目すべきは、Ｅ抗原がアジュバントである範囲で、それらは、好ましくは、短い可撓性リンカー、好ましくは、ＧＳによって分離される（下記も参照されたい）。ｌｉと近接する抗原との間のリンカーは、必要ではないが、排除されない。抗原またはｌｉである近接する配列のいずれかにｐ２ａを接続するリンカーは、必要ではないが、排除されない。

【0068】

さらに好ましい実施形態において、前記パピローマウイルスは、霊長類パピローマウイルス、好ましくは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１、より好ましくは、ＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはマカクパピローマウイルス、好ましくは、ＭｆＰＶ３である。ＨＰＶ１６が特に好ましい。ＨＰＶ１６についての実験的証拠は、実施例４に見ることができる。

【0069】

さらに好ましい実施形態において、隣接している核酸配列は、Ｃｙｓ残基を含んでいてもよい、１０個以下のアミノ酸長、例えば、２、３、４、または５個のアミノ酸長である可撓性リンカーをコードする配列によって、１つ、複数、またはすべての場合において接続され、ここで、ＧＳおよびＧＣＳは、好ましいリンカーである。好ましくは、そのようなリンカーは、隣接する抗原間にのみ存在し、上記に示す本発明の最も好ましい核酸の議論も参照されたい。

【0070】

Ｃｙｓ残基を含むリンカー、例えば、ＧＣＳは、好ましくは、本発明のポリタンパク質において偶数のＣｙｓ残基を必要とする上記に開示される好ましい実施形態の文脈において検討されるべきである。言い換えれば、Ｃｙｓ含有リンカー、例えば、ＧＣＳは、一般に有用であるが、特に、本発明の核酸によってコードされるポリタンパク質が、その他奇数のＣｙｓ残基を有する事例において、それを用いることが考慮される。例えば、使用は、例えば、配列番号１００～１０４における、Ｅ１およびＥ６を接続するためのＧＣＳリンカーから構成されていてもよい。

【0071】

第２の態様において、本発明は、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルスベクターを提供する。

【0072】

好ましい実施形態において、前記ベクターは、ＤＮＡウイルスベクター、好ましくは、（ｉ）アデノウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルスＥ１およびＥ３コード配列に関して欠損しているアデノウイルスベクターであって、前記ベクターが、より好ましくは、クラスＣ、ＤもしくはＥに属するか、および／またはＡｄ１９ａ／６４、Ａｄ５、線維置換を有するＡｄ５、例えば、Ａｄ５Ｆ３５、Ａｄ２６、Ｃｈｉｍｐ６３、もしくはｃｈＡｄＯｘ１である、アデノウイルスベクター；または（ｉｉ）ポックスウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、ＭＶＡ ＣＲ１９、ＳＣＶ、ワクシニア、もしくはＦｏｗｌｐｏｘである。

【0073】

Ａｄ５は、Schiedner G, Hertel S, Kochanek S. Hum Gene Ther. 2000 Oct 10;11(15):2105-16. doi: 10.1089/104303400750001417. PMID: 11044912に記載されている。

【0074】

Ａｄ１９ａは、Ａｄ６４としても公知であり、例えば、Zhou X., Robinson C.M., Rajaiya J., Dehghan S., Seto D., Jones M.S., Dyer D.W., Chodosh J. Analysis of human adenovirus type 19 associated with epidemic keratoconjunctivitis and its reclassification as adenovirus type 64, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 53 (2012), pp. 2804-2811を参照されたい。Ａｄ１９ａはまた、Ruzsics Z, Wagner M, Osterlehner A, Cook J, Koszinowski U, Burgert HG. J Virol. 2006 Aug;80(16):8100-13. doi: 10.1128/JVI.00687-06. PMID: 16873266に記載されている。

【0075】

線維置換を有するアデノウイルスは、例えば、Shayakhmetov, D. M.; Papayannopoulou, T.; Stamatoyannopoulos, G.; Lieber, A. Efficient Gene Transfer into Human CD34+ Cells by a Retargeted Adenovirus Vector. J. Virol. 2000に記載されている。

【0076】

Ａｄ５Ｆ３５は、具体的には、Flickinger Jr JC, Singh J, Carlson R, et al. Chimeric Ad5.F35 vector evades anti-adenovirus serotype 5 neutralization opposing GUCY2C-targeted antitumor immunity, Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2020に記載されている。ここで、Ａｄ５およびＡｄ５Ｆ３５が、ナイーブマウスにおいて同等の免疫応答および腫瘍制御を誘導すること、ならびにＡｄ５Ｆ３５が、Ａｄ５感染に事前曝露されたマウスにおいてＡｄ５よりも良好な応答を誘導することが示されている。さらに、数人の患者が、Ａｄ５と比較して、Ａｄ５Ｆ３５に対する中和抗体を有することが示された。そのため、その優れた性能を考慮して、Ａｄ５Ｆ３５が特に好ましい。

【0077】

さまざまなウイルスベクターのための本発明に従う特に好ましいＤＮＡペイロード（挿入物；抗原コード配列を含む配列）は、配列番号５５～９９および１０２～１０４に示される。それぞれのベクターの具体的な特徴に関するさらなる情報について、配列表におけるそれぞれの注釈を参照されたい。

【0078】

挿入物を有するアデノウイルスベクターを生成するための手順は、当技術分野において公知であり、例えば、Ruzsics Z, Lemnitzer F, Thirion C. Methods Mol Biol. 2014;1089:143-58. doi: 10.1007/978-1-62703-679-5_11. PMID: 24132484に記載されている。

【0079】

ＭＶＡベクターの配列は、以下の配列データベースに見ることができる：
ＭＶＡ配列：ＧｅｎＢａｎｋ（リリース２４４．０）アクセッション番号：Ｕ９４８４８、バージョン番号：Ｕ９４８４８．１、リリース日２００３年４月１４日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｕ９４８４８．１；
ＭＶＡ．ＣＲ１９配列：ＧｅｎＢａｎｋ（リリース２４４．０）アクセッション番号：ＫＹ６３３４８７、バージョン番号ＫＹ６３３４８７．１、リリース日２０１７年３月２８日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＫＹ６３３４８７．１。前記ベクターを生成または増殖させる目的のために、細胞株、好ましくは、真核細胞株が用いられ得、ここで、前記細胞株は前記ベクターを含む。好適な真核細胞株には、ＨＥＫ２９３、ＰｅｒＣ６、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ（Jordan I, Vos A, Beilfuss S, Neubert A, Breul S, & Sandig V, 2009. An avian cell line designed for production of highly attenuated viruses. Vaccine 27, 748-756. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.11.066. PMID 19071186）、ＨＥＫ２９３ Ｔ－ＲＥｘおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ（それぞれ、ＨＥＫ２９３およびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸに由来する、既にＴｅｔＲを発現する）、Ａ５４９、ならびに操作されたアデノウイルスＥ１過剰発現を有するＡ５４９が含まれる。上記で述べたように、既に存在しない範囲で、前記細胞株は、好ましいが、必ずしもＴｅｔＲを発現するように改変されていない。

【0080】

ＭＶＡは、トリ細胞における複製に適合される。ＭＶＡの生成のために、したがって、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）またはアヒル網膜細胞に由来するＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸなどの宿主が好ましい。初代細胞とは対照的に、不死化（または連続）細胞株、例えば、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸは、いくつかの利点を有し、細胞物質は、局所的に貯蔵された凍結培養物から回収することができ、そのため、供給の制約への回復力に富む。さらにまた、不死化細胞株は、実際の生産プロセスにはるかに先立って、細胞バンクのレベルで外来性作用物質に対して特性評価することができる。さらにまた、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（初代材料とは対照的に）は、動物由来構成成分を含まない培地中の懸濁液において増殖する。この性質は、異なる属のポックスウイルスのための非常に効率的でスケーラブルなフェドバッチ生産プロセスを可能にする（Jordan I, Northoff S, Thiele M, Hartmann S, Horn D, Hoewing K, Bernhardt H, Oehmke S, von Horsten H, Rebeski D, Hinrichsen L, Zelnik V, Mueller W, & Sandig V, 2011. A chemically defined production process for highly attenuated poxviruses. Biologicals 39, 50-58. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2010.11.005. PMID 21237672）。

【0081】

ワクシニアウイルスは、出芽についての必要性なく、１つまたは３つの膜を有する感染性粒子に成熟する。この複雑な感染サイクルの１つの結果は、野生型ビリオンの大部分が、産生細胞と会合したままであること、および感染活性の小さな割合が、培養上清において測定され得ることである。新規株ＭＶＡ－ＣＲ１９の開発は、この観察によって誘導された［Jordan I, Horn D, John K, & Sandig V, 2013. A genotype of modified vaccinia Ankara (MVA) that facilitates replication in suspension cultures in chemically defined medium. Viruses 5, 321-339. https://doi.org/10.3390/v5010321. PMID 23337383］。ＭＶＡ－ＣＲ１９は、固有の遺伝子型を有するＭＶＡの株である［Jordan I, Horn D, Thiele K, Haag L, Fiddeke K, & Sandig V, 2019. A Deleted Deletion Site in a New Vector Strain and Exceptional Genomic Stability of Plaque-Purified Modified Vaccinia Ankara (MVA). Virol Sin. https://doi.org/10.1007/s12250-019-00176-3. PMID 31833037］。構造遺伝子における点突然変異および線状ゲノムＤＮＡの左側における逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の大部分の組換えは、ＭＶＡ－ＣＲ１９の表現型に対する広範囲の効果を有する。例えば、野生型と比較して、ＭＶＡ－ＣＲ１９は、より多くの数の感染性粒子を培養上清に放出し、より高い感染力価まで複製する。宿主の免疫応答および感染サイクルに影響を及ぼすウイルス因子は、ＩＴＲにおいてコードされる。ＭＶＡ－ＣＲ１９における組換え事象は、ワクチンベクターとしての有効性および安定性に対する正の影響を伴って、これらの因子の発現パターンを変化させた（一部は欠失され、他について、遺伝子量が重複している）。

【0082】

宿主細胞からのＭＶＡ－ＣＲ１９の潜在的に増強された放出はまた、接着細胞におけるＣＰＥにおいて見ることもできるが、野生型ＭＶＡは、細胞融合および十分に限局性のプラークとの合胞体を誘導する傾向があり、ＭＶＡ－ＣＲ１９による感染は、主なプラークからより離れたところで散在するかまたはコメット内に局在する孤立した感染細胞によって囲まれた、大きいがゆるくパッキングされた（融合していない）プラークから構成されるパターンをもたらす。

【0083】

組換えＭＶＡの作成および単離は、ウイルスゲノムの大きなサイズ（１７８ ｋｂ）に起因して複雑である。最も一般的に使用される技法は、目的の遺伝子を含有するシャトルプラスミドによる感染宿主細胞における相同組換えに依拠する。組換えウイルスは、挿入物なしの親ウイルスが混入した膨大な基礎環境から単離および精製されなければならない。ＭＶＡ－ＣＲ１９は、生産およびワクチン有効性について有利であるが、これは、複製の特質の制限が少ないことに起因して、精製がより複雑であり得る。さらにまた、野生型およびＭＶＡ－ＣＲ１９の両方について、新規配列が感染サイクルを損なう場合に、導入遺伝子の発現および維持に対する選択が生じ得る。

【0084】

そのような事例において、ＴｅｔＲを構成的に発現する細胞株、およびｔｅｔＯのコピーを含有する発現ユニットを利用して、ウイルス作成および生産の間に、導入遺伝子の発現を最小化することできる。

【0085】

第３の態様において、本発明は、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターによってコードされるポリタンパク質、またはそれに由来する切断産物を提供する。

【0086】

参照が切断産物に対して行われる範囲で、好ましくは、上記に開示される好ましい実施形態に従って、本発明の核酸によってコードされるポリタンパク質中に存在し得る自己切断配列の活性から生じる切断産物が存在する。切断が、本発明の核酸によってコードされるタンパク質によって提示されるエピトープの数に影響を及ぼさないことが理解される。そのため、コードされるポリタンパク質における切断部位は、好ましくは、抗原の配列間に位置する。

【0087】

第４の態様において、本発明は、（ｉ）第１の態様の核酸；（ｉｉ）第２の態様のベクター；（ｉｉｉ）第３の態様のポリタンパク質もしくはその切断産物；および／または（ｉｖ）（ｉ）の核酸もしくは（ｉｉ）のベクターで形質導入された細胞であって、好ましくは、前記細胞が、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の細胞および／もしくは樹状細胞、または単球である、細胞を含むか、またはそれからなる医薬組成物、好ましくは、ワクチンを提供する。

【0088】

項目（ｉｖ）に関して、細胞が、抗原をコードするコンストラクトで形質転換され、それによって、前記抗原に関連する障害に対する予防的または治療的性質を有する細胞の集団が得られ得ることは当技術分野において公知である。がんの分野における例は、Maeng et al., Journal of Clinical Oncology 37, no. 15_suppl (May 20, 2019) 2639-2639である。好ましくは、前記細胞は、処置される個体由来の自己細胞である。項目（ｉｖ）について、ベクターが使用される範囲で、Ａｄ１９ａ／６４が特に好ましい。

【0089】

投与の経路に関して、筋肉内、皮下、皮内、経膣、直腸、および／または生殖管の粘膜を含む粘膜投与が想定される。

【0090】

製剤には、ゲル剤、特に、粘膜、好ましくは、膣内投与のためのゲル剤が含まれる。

【0091】

賦形剤、希釈剤および保存剤は、当業者に周知である。

【0092】

投薬量に関して、１０^９～１０^１１感染単位が、アデノウイルスベクターについて好ましく、５×１０^６～５×１０^８感染単位が、ポックスウイルスベクターについて好ましい。一般的に言えば、好適な投薬量は、本開示、おそらくは臨床研究を考慮し、必要な場合、ワクチン接種を受ける個体の体重、年齢、性別などのようなパラメーターを考慮に入れて、さらなる面倒なく、臨床医または製造業者によって決定され得る。とはいえ、経験から、ワクチンの分野において、一般に、１つですべてに対応する投薬量または投薬レジメンが存在する。

【0093】

好ましい実施形態において、前記ベクター、前記核酸、前記ポリタンパク質または前記細胞は、唯一の薬学的に活性な作用物質である。

【0094】

代替の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、２つ以上の薬学的に活性な作用物質を含み、第２の薬学的に活性な作用物質は、（ｉ）第１の態様の第２の核酸；（ｉｉ）第２の態様の第２のベクター；（ｉｉｉ）第３の態様の第２のポリタンパク質または切断産物；（ｉｖ）上記に定義される第２の細胞；（ｖ）タンパク質ベースワクチン、好ましくは、パピローマウイルスに対するタンパク質ベースワクチン；および（ｖｉ）化学療法薬、好ましくは、シスプラチンから選択される。実施例は、本発明によるワクチンがシスプラチンと一緒に与えられた場合の相乗効果を実証する。

【0095】

タンパク質であるか、またはタンパク質に基づく、公知のパピローマウイルスワクチンが存在する。上記の項目（ｖ）に従って、そのような公知のワクチンは、本発明に従うワクチンと組み合わされてもよい。注目すべきは、本発明はまた、あまり好ましくないが、タンパク質ベースワクチンとして実行されてもよく、上記の項目（ｉｉｉ）を参照されたい。

【0096】

本発明のコンストラクト（核酸、ベクター、ポリタンパク質、細胞）と一緒の併用療法のためのさらなる作用物質には、抗体、好ましくは、免疫チェックポイントを標的にするモノクローナル抗体が含まれ、そのようなチェックポイントは、好ましくは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４である。

【0097】

一般的に言えば、併用療法の構成成分は、おそらく異なる投薬レジメンに従って、一緒にまたは任意の順序で別々に投与され得る。

【0098】

特に好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、（ｉ）上記に定義されるアデノウイルスベクター；および上記に定義されるポックスウイルスベクターである２つの薬学的に活性な作用物質を含み、前記２つの薬学的に活性な作用物質は、好ましくは、任意の順序でまたは同時に、好ましくは、前記アデノウイルスベクターを含む前記医薬組成物後、好ましくは、少なくとも４週間経過した後に、前記ポックスウイルスベクターを含む医薬組成物が投与され得る２つの医薬組成物として調合される。

【0099】

この好ましい実施形態は、本発明に従って、好ましいプライム／ブーストスキームを定義する。そのため、前記２つの別個のベクターが、２回の投与間で時間が経過するのを可能にする様式で投与されることが好ましい。好ましい期間は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間または少なくとも８週間である。前記期間についての好ましい上限は、６週間、７週間、８週間、３か月、４か月、５か月または６か月である。

【0100】

第５の態様において、本発明は、医薬における使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ポリタンパク質または細胞を提供する。

【0101】

好ましくは、前記ワクチンは、治療用ワクチンである。注目すべきは、本発明に従う全長抗原の組合せは、ウイルスの根絶のために提供する。そのため、前記ワクチンは、予防的適用だけを有するのでなく、治療剤でもある。

【0102】

第６の態様において、本発明は、パピローマウイルス感染、またはパピローマウイルス誘導障害、例えば、疣贅、悪性細胞変化もしくはがんを処置、軽減または予防する方法における使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ポリタンパク質、細胞、またはワクチンを提供する。感染および関連障害は、各種の部位、例えば、鼻腔－口腔、皮膚、生殖器（内部および外部）で起こり得る。最も公知のパピローマウイルス関連悪性腫瘍およびがんの一部は、低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、鼻ポリープ、またはパピローマウイルス関連悪性状態、例えば、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、および口腔咽頭扁平上皮細胞癌（ＯＰＳＣＣ）である。

【0103】

一般的に言えば、これらの障害が、パピローマウイルス関連であることが理解される。原因因子として頻繁に関与するパピローマウイルス株は、当技術分野において公知であり、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１が含まれる。例を示すと、鼻ポリープは、ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１による感染から生じ得る。

【0104】

下記の表１は、いくつかの悪性および非悪性障害に関連するＨＰＶ株の概略を提供する。

【0105】

【表1】

【0106】

第７の態様において、本発明は、Ｔ細胞を刺激および／または拡大増殖するインビトロまたはエクスビボの方法であって、前記方法が、インビトロまたはエクスビボで、Ｔ細胞を、本発明の先行する態様のいずれか１つの核酸、ベクター、またはポリタンパク質と接触させることを含む、方法を提供する。

【0107】

好ましい実施形態において、前記接触は、抗原提示細胞の存在下で達成される。そのような抗原提示細胞は、好ましくは、樹状細胞、単球、マクロファージ、またはＢリンパ球である。抗原提示細胞の提示は、ＭＨＣ拘束性である拡大増殖されたＴ細胞を提供する。

【0108】

前記Ｔ細胞は、エクスビボであること、すなわち、個体または患者から得られることが好ましい。前記Ｔ細胞は、それらが拡大増殖されると、同じ患者または個体に戻すことが想定される。拡大増殖されたＴ細胞のそのような再導入は、養子免疫療法として当技術分野において公知である。

【0109】

それらに関連して、本発明は、さらなる態様において、Ｔ細胞、好ましくは、第７の態様の方法によって得られるＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】着想されたＭｆＰＶ３抗原変異体の略図。 ＭｆＰＶ３抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７のすべて、またはｐ２ａペプチドによって連結されたＥ１とＥ２およびＥ６とＥ７融合タンパク質のいずれかを含み、それぞれ、ＭＨＣ－ＩＩ不変鎖（Ｉｉ）に融合された、融合タンパク質として設計された。参照のために、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７は、Ｉｉコード配列なしで、単一のオープンリーディングフレームとして融合された。理論分子量（ｋＤａ）をアミノ酸配列から計算した。略語：Ｉｉ：ＭＨＣ－ＩＩ会合不変鎖、ＧＳ：グリシン－セリンリンカー、２ａ：共翻訳的分離のためのｐ２ａペプチド、Ｍｙｃ：抗体検出のためのｍｙｃタグ配列、ｋＤａ：キロダルトン。

【図2】ＭｆＰＶ３抗原の発現分析。 Ａ．さまざまなＭｆＰＶ３抗原を発現する等量のｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンによるトランスフェクション４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ｍｙｃ（上側パネル）および抗ｐ２ａペプチド（中央パネル）抗体を用いて検出した。チューブリンレベルを、ローディング対照（下側パネル）として抗チューブリン抗体を使用してモニターした。Ｂ．ｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンによるトランスフェクション４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。細胞内染色を、抗ｍｙｃ抗体を用いて行った。３回の独立した実験の平均の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が表される。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。Ｃ．それぞれ、Ｈ２Ｋｂ単独またはｐＵＲＶａｃ Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬもしくはＩｉ－Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬと一緒とのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共トランスフェクション、およびＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ２Ｋｂ複合体を認識する抗体を使用するフローサイトメトリーによる４８時間後の細胞表面におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ２Ｋｂの分析。６回の独立した実験の平均のＨ２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ陽性細胞のパーセンテージが表される。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。明灰色のバーは、それぞれ、陰性対照および陽性対照である。

【図3】非近交系ＣＤ１マウスにおけるＥ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７をコードするさまざまなｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンによって誘導されるＴ細胞応答。 ＣＤ１マウス（群あたり５匹）を、示されるＭｆＰＶ３初期抗原をコードするｐＵＲＶａｃ ＤＮＡの０．５μｇのＤＮＡを用いて、１週間間隔で４回、免疫した。マウスを最後の免疫の７日後に屠殺し、脾臓を回収し、Ｅ１（Ａ）およびＥ２（Ｂ）に対するＣＤ８（上パネル）およびＣＤ４（下パネル）Ｔ細胞免疫応答を、ＩＣＳおよびフローサイトメトリーを使用して測定した。陰性対照群は、インビトロ再刺激のために使用されるペプチドプールにカバーされない抗原をコードするｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンで免疫されたすべてのマウスからなる。群間のアスタリスクは、バックグラウンド応答の減算後の応答レベルにおける有意差を示す。各記号は１匹のマウスを表し、水平のバーは中央値を表す。参照試料（それぞれ、Ｉｉに連結された個々の抗原のみを含有するｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンでワクチン接種されたマウス）は、統計分析（多重比較調整）に含めない。

【図4】ｒＡｄシャトル化ＭｆＰＶ３抗原コンストラクトの発現分析。 Ａ．ＭｆＰＶ３抗原変異体Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２およびＩｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７の略図。ＭｆＰＶ３抗原は、それぞれ、ＭＨＣ－ＩＩ不変鎖（Ｉｉ）およびＥ２に融合されていてもよい、両Ｅ１、Ｅ６およびＥ７のすべてを含み、融合タンパク質として設計された。理論分子量（ｋＤａ）をアミノ酸配列から計算した。Ｂ．３０のＭＯＩで、ｒＡｄｓによる形質導入４８時間後のＡ５４９細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ｍｙｃ（上側パネル）および抗ｐ２ａペプチド（中央パネル）抗体を用いて検出した。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（下側パネル）。Ｃ．３０のＭＯＩで、さまざまなＭｆＰＶ３抗原を発現するｒＡｄｓによる形質導入４８時間後のＡ５４９細胞のフローサイトメトリー分析。細胞内染色を、抗ｍｙｃ抗体を用いて行った。細胞を、非感染細胞においてゲーティングした。３回の独立した実験の平均の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が表される。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。

【図5】アデノウイルスベクターによるマウスの免疫化は、強力な細胞免疫応答を誘導する。 ＣＤ１マウス（ＡおよびＢ）、またはＯＦ１マウス（ＣおよびＤ）を、示された通り、さまざまなＭｆＰＶ３初期抗原をコードするｒＡｄワクチン（２×１０^７ＩＦＵ）で免疫した。マウスを１４日目に屠殺し、脾臓を回収し、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７に対するＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞免疫応答を、ＩＣＳおよびフローサイトメトリーを使用して測定した。陰性対照群は、インビトロ再刺激のために使用されるペプチドプールにカバーされない抗原をコードするｒＡｄで免疫されたすべてのマウスからなる。各記号は１匹のマウスを表し、水平のバーは中央値を表す。陽性対照試料（Ｉｉに連結された関連抗原のみを含有するｒＡｄでワクチン接種されたマウス）は、統計分析（多重比較調整）に含めない。

【図6】ユビキチン化および分解に対するＩｉの影響。 Ａ～Ｃ．ｐＵＲＶａｃ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７、ｐＵＲＶａｃ Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７または空プラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を、ＭＧ１３２、または対照としてＤＭＳＯで、６時間処理した。Ｍｙｃタグ付けタンパク質を、免疫沈降し、抗ユビキチン抗体（Ａ）および抗ｍｙｃ抗体（Ｂ）を使用するウエスタンブロットによって分析した。チューブリンレベルを、ローディング対照（Ｃ）として抗チューブリン抗体を使用してモニターした。Ｄ～Ｅ．ｐＵＲＶａｃ Ｉｉ－Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ｐＵＲＶａｃ Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬまたは空プラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を、ＭＧ１３２またはＤＭＳＯで、６時間処理した。試料を、抗ｍｙｃ抗体（Ｄ）および抗チューブリン抗体（Ｅ）を使用するウエスタンブロットによって分析した。

【図7】近交系マウスにおける免疫応答およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）細胞傷害性。 Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、示されるＭｆＰＶ３初期抗原をコードするｒＡｄベクター化ワクチンで免疫した。ワクチン接種１４日後、免疫応答を、Ｅ１ペプチドでパルスされた細胞（Ｂ）の特異的死滅に関して、ＩＣＳ（Ａ）またはインビボ細胞傷害性によって分析した。各記号は１匹のマウスを表す。２匹の非ワクチン接種マウスを、陰性対照として含めた。（Ｃ）インビボ細胞傷害性の代表的プロット。

【図8】足場依存性成長の特性評価。Ａ．抗Ｅ２、抗Ｅ６、および抗Ｅ７抗体を用いるウエスタンブロット分析によるポリクローナルＮＩＨ－３Ｔ３細胞株の導入遺伝子発現の分析。抗チューブリンパネルは、均一なローディングを確認する。Ｂ．軟寒天形質転換アッセイにおける足場依存性コロニー成長。アッセイにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を、各ＮＩＨ－３Ｔ３細胞株について示す。３回の独立した実験からの３回の技術的反復の平均とＳＥＭが表される。個々の群を、両側のパラメーター化された対応のないＴ検定を使用して比較した。

【図9】好ましい種由来のＥ２、Ｅ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列アライメント。アライメントは、本発明に従った好ましい改変を持つ本明細書に開示される抗原配列（「ｗｔ」という修飾語句なし）と整列された好ましいパピローマウイルス種の野生型（ｗｔ）アミノ酸配列を示す。好ましい改変は、ボックスを用いて強調する。

【図10】上パネル：ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるＡｄ１９ａ／６４プライムは、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定される、プライム後１４日後のＮＨＰにおいて、ＩＦＮ産生ＭｆＰＶ特異的Ｔ細胞を誘導した。下パネル：ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるＡｄ１９ａ／６４プライム、ＭＶＡブーストワクチン接種は、ＩＣＳおよびフローサイトメトリーによって測定される、ブーストの日（プライム６週間後）およびブースト１４日後のＮＨＰにおいて、ＩＦＮ産生ＭｆＰＶ特異的Ｔ細胞を誘導した。

【図11】ワクチン接種されたＭｆＰＶ３感染雌マカクを、それらが公知の持続性感染を有していた（赤色）または有していなかった（青色）かどうかによって階層化した。持続性感染は、図１および表１に示されるように、スクリーニング、再スクリーニング、および確認試験の両方でＭｆＰＶ３陽性である動物によって定義した。ワクチン試験に登録する前に１回、子宮頸部ＭｆＰＶ３の存在についてのみ試験された動物を、不明な持続性段階として分類し、ワクチン試験における非感染対照群を含めることが優先されていなかったので、比較群として選択した。動物を、図３Ａに示されるようにして免疫した。各ドットは、個々の動物を表す。プロットの右側の「ｎｓ」は、それらのＭｆＰＶ３感染持続状態に応じた動物の比較を指す。プロットの上のアスタリスクは、それらのＭｆＰＶ３感染持続状態に関わりなく、特定の時点（ＡおよびＢ）での、または特定の抗原に対する（Ｃ）すべてのワクチン接種された動物のＴ細胞応答の比較を指す。Ａ：免疫化前およびプライム免疫化１４日後のペプチド刺激１８～２０時間後のＥＬＩＳｐｏｔによって測定されたＩＦＮ－γ産生ＰＢＭＣの誘導。Ｂ：ブースト免疫化前およびブースト免疫化１４日後のペプチド刺激１２～１６時間後のＩＣＳおよびフローサイトメトリーによって測定されたＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞。Ｃ：ＣＤ８＋ Ｔ細胞の機能性を、ＩＦＮ－γシグナルの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した。バーは、それらのＭｆＰＶ３感染持続状態に関わりなく、すべてのワクチン接種動物の幾何平均を表す。

【図12】経時的なＮＨＰの子宮頸部におけるＭｆＰＶ３ウイルス量。ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるＡｄ１９ａ／６４プライム、ＭＶＡブーストワクチン接種は、ＰＢＳ注射された陰性対照ＮＨＰの６匹のうちの３匹における自発的クリアランスと比較した、すべてのワクチン接種動物における感染を排除した。

【図13】ＣＤ１マウス（Ａ～Ｅ）、示される異なる非近交系マウス（Ｆ～Ｉ）またはＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊ～Ｐ）を、示されるように、さまざまなＨＰＶ１６初期抗原をコードするＡｄワクチン（２×１０^７ＩＦＵ）で免疫した。マウスを示された時点で屠殺し、脾臓を回収し、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫応答を、細胞内染色およびフローサイトメトリーを使用して測定した。各記号は１匹のマウスを表し、バーは幾何平均を表す。２匹のＥ７レスポンダーマウス（Ｅ）について、ＣＤ４４＋ＩＦＮ－γ＋集団、ならびにＴＮＦ－α＋およびＩＦＮ－γ＋ ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞の集団を示す。

【図14】１×１０^６個のＣ３細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹にｓ．ｃ．注射し、マウスは、それぞれ２日目および２０日目に、腫瘍と同じ側に、ｉ．ｍ．でＡｄ１９ａ／６４－およびＡｄ５－ベクター化ワクチンを受けた。腫瘍成長（ＡおよびＢ）および生存（Ｃ）。丸を伴うピンク色曲線は、治療用ワクチン群を表す。四角を伴う灰色線は、陰性対照ワクチン接種マウスを表す。緑色の矢印は、ワクチン接種の時を示す。

【図15】１×１０^６個のＣ３細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹にｓ．ｃ．注射し、マウスは、それぞれ１０日目および２４日目に、腫瘍と同じ側に、ｉ．ｍ．でＡｄ１９ａ／６４－およびＡｄ５－ベクター化ワクチンを受けた。平均腫瘍成長とＳＥＭ（Ａ）、個々のマウスについての腫瘍成長（Ｂ）および生存（Ｃ）を評価した。図Ｄ～Ｆにおいて、すべてのマウスは、１０、１７および２４日目に、シスプラチンで追加的に処置された（緑色の菱形）。 治療用ワクチンまたは陰性対照ワクチン単独を受けているマウスの腫瘍を、腫瘍が１０００ｍｍ^３を超えたか、または試験の最後（４２日目）のいずれかで回収し、ＣＤ８＋細胞を免疫組織化学的検査によって検出した。Ｇ：腫瘍１ｍｍ^２あたりのＣＤ８＋スポットの総数。Ｈ：腫瘍のコア対周縁における腫瘍１ｍｍ^２あたりのＣＤ８＋スポットの比。Ｉ：ワクチン接種マウス（左）または陰性対照ワクチン接種マウス（右）のいずれかからの腫瘍の免疫組織化学的染色の代表画像。写真は、周縁（写真の左下側）およびコアの小片（写真の右上側）を示す。Ｊ：マウスを示された時点で屠殺し、腫瘍を回収し、腫瘍のミックスの得られた単一細胞懸濁液および免疫細胞を、追加のＨＰＶ１６ペプチドの存在なしで、５時間インキュベートした。ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出した。Ｋ：マウスを示された時点で屠殺し、脾臓を回収し、Ｅ１およびＥ７ペプチド刺激後のＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を、細胞内染色およびフローサイトメトリーを使用して測定した。ＬおよびＭ：シスプラチンで処置され、陰性対照ワクチンの治療用ワクチンでワクチン接種されたマウスについて、ＩＦＮ－γの平均蛍光強度（Ｌ）、および全ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＩＦＮ－γ＋脾細胞のうちのＴＮＦ－α＋のパーセンテージ。Ｎ：腫瘍を示された時に回収し、単一細胞懸濁液を調製し、ＤＣの割合（ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４／８０－ＣＤ８－ＣＤ４－ＣＤ４５．２＋ＴＥＲ１１９－生）を、表面染色およびフローサイトメトリーによって評価した。 ピンク色の丸は、治療用ワクチン群を表す。灰色の四角は、陰性対照ワクチン接種マウスを表す。緑色の矢印は、ワクチン接種の時を示す。緑色の菱形は、シスプラチン注射の時点を示す。Ｇ～Ｎ：黒色バーは、幾何平均を示す。図Ａ～Ｆは、２回の独立した実験からプールされたデータを示す。

【図16】Ｔ１×１０６個のＣ３細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹にｓ．ｃ．注射し、マウスは、それぞれ１０日目および２４日目に、腫瘍と同じ側に、ｉ．ｍ．でＡｄ１９ａ／６４－およびＡｄ５－ベクター化ワクチンを受けた。シスプラチン処置を、１０、１７および２４日目にｉ．ｐ．で与えた。Ａ：２０、２３および２６日目に、ＣＤ４枯渇（緑色の破線、菱形）もしくはＣＤ８枯渇（青色、白丸）、またはアイソタイプ対照抗体（ピンク色、丸）でｉ．ｐ．処置されたマウスの平均腫瘍成長とＳＥＭ。灰色の曲線は、比較のための陰性対照ワクチン接種マウスを示す（これは、図４Ｄに表されたものと同じデータであり、２回の独立した実験からプールされたものであることに留意されたい）。緑色の矢印は、ワクチン接種の時を示す。緑色の菱形は、シスプラチン注射の時点を示す。Ｂ：シスプラチンとの共処置ありまたはなしの、マウスＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７（ピンク色の丸）または陰性対照（灰色の四角）ワクチン接種における腫瘍浸潤性ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ４５．２＋ＴＥＲ１１９生細胞におけるＦｏｘＰ３発現。腫瘍浸潤細胞を、細胞内染色およびフローサイトメトリーによって、２４日目（併用処置群）または３０日目（ワクチン接種単独）に分析した。

【図17】１×１０６個のＣ３細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹にｓ．ｃ．注射し、マウスは、１０日目および２４日目に、腫瘍と同じ側に、ｉ．ｍ．でＡｄ１９ａ／６４－およびＡｄ５－ベクター化ワクチン、または逆の脇腹にｓ．ｃ．でペプチドベースワクチンを受けた。シスプラチン処置を、１０、１７および２４日目にｉ．ｐ．で与えた。ＡおよびＢ：ペプチドワクチン（青色、菱形）、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７^＊（ピンク色、丸）または陰性対照^＊（灰色、四角）の平均腫瘍成長とＳＥＭ（Ａ）および生存曲線（Ｂ）。^＊これは、図１５Ｄに表されたものと同じデータであり、２回の独立した実験からプールされたものであることに留意されたい。緑色の矢印は、ワクチン接種の時を示す。緑色の菱形は、シスプラチン注射の時点を示す。ＣおよびＤ：細胞内染色およびフローサイトメトリーを使用する、２２日目にＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７（ピンク色の丸）またはペプチド（青色の菱形）ワクチン接種マウスの血液において測定されたＥ１（Ｃ）およびＥ７（Ｄ）に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ＋ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｂ２２０－生細胞）。

【図18】Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＨＰＶ１６ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７をコードするｒＡｄ５またはＡｄ５Ｆ３５で下肢において免疫した。両ワクチンは、類似の大きさおよび質のＥ１およびＥ７に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導し、Ａｄ５Ｆ３５が、ワクチン特異的Ｔ細胞応答の誘導に等しく有効であることを示す。

【図19】ｒＡｄシャトル化ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８抗原コンストラクトの発現分析。 Ａ．１００のＭＯＩで、ｒＡｄｓによる形質導入４８時間後のＡ５４９細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ＨＰＶ１６－Ｅ２（左上側パネル）および抗ＨＰＶ１６－Ｅ６（左下側パネル）、抗ＨＰＶ１６－Ｅ７（右上側パネル）抗体を用いて検出した。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（右下側パネル）。Ｂ．１００のＭＯＩで、ｒＡｄｓによる形質導入４８時間後のＡ５４９細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ＨＰＶ１８－Ｅ２（左上側パネル）および抗ＨＰＶ１８－Ｅ６（左下側パネル）、抗ＨＰＶ１８－Ｅ７（右上側パネル）抗体を用いて検出した。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（右下側パネル）。

【図20】ＭＶＡシャトル化ＭｆＰＶ３、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８抗原コンストラクトの発現分析。 Ａ．１０のＭＯＩで、ＤｅｌＩＩＩ遺伝子座またはＴＫ遺伝子座におけるＭｆＰＶ３抗原を含有する組換えＭＶＡまたはＭＶＡ－ＣＲ１９による形質導入２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ｍｙｃ抗体を用いて検出した（上側パネル）。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（下側パネル）。Ｂ．１のＭＯＩで、ＤｅｌＩＩＩ遺伝子座におけるＨＰＶ１６ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７を含有するＭＶＡ－ＣＲ１９による形質導入２４時間後のＡＧＥ１．ＣＲ－ｐＩＸ細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ＨＰＶ１６－Ｅ２（左上側パネル）および抗ＨＰＶ１６－Ｅ６（左下側パネル）、抗ＨＰＶ１６－Ｅ７（右上側パネル）抗体を用いて検出した。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（右下側パネル）。Ｃ．１のＭＯＩで、ＤｅｌＩＩＩ遺伝子座におけるＨＰＶ１８ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７を含有するＭＶＡ－ＣＲ１９による形質導入２４時間後のＡＧＥ１．ＣＲ－ｐＩＸ細胞溶解物のウエスタンブロット分析。抗原を、抗ＨＰＶ１８－Ｅ２（左上側パネル）および抗ＨＰＶ１８－Ｅ６（左下側パネル）、抗ＨＰＶ１８－Ｅ７（右上側パネル）抗体を用いて検出した。ローディング対照として、チューブリンレベルを、抗チューブリン抗体を使用してモニターした（右下側パネル）。

【発明を実施するための形態】

【0111】

実施例は、本発明を説明する。

【実施例】

【0112】

［実施例１］
本発明のコンストラクトおよびそれらの性能
方法
抗原配列
抗原の部分を、Ｇｅｎｅａｒｔ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で合成した。ｇｅｎｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズムを使用して、配列相同性を最小化し、ヒトコドン使用頻度に配列を適合させた。すべてのコンストラクトを、標準的な分子生物学の方法を使用してクローニングした。簡潔には、抗原を、製造業者の指示に従って、融合ＰＣＲ、ＩＩ型エキソカッター部位（ＢｓａＩ－ＨＦ ｖ２、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）またはＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨＩＦＩ ＤＮＡアセンブリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）を用いてアセンブルした。コンストラクトを、ＡｇｅＩ－ＨＦおよびＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）を使用して、異なるプラスミド骨格にクローニングした。配列の正確さを、サンガーシークエンシングによって検証した。プラスミドを、量に応じて、アルカリ溶解、または製造業者の指示に従って市販キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｐｌｕｓ、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて、調製した。抗原Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７（図１）の配列を、Ｉｉ（ＮＭ＿００４３５５．３）のアミノ酸配列をＭｆＰＶ３（ＥＦ５５８８３９．２）のＥ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７と接続することによって、アセンブルした。Ｅ２の後に、ブタテッショウウイルス１の２Ａ配列（Liu, Z. et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci. Rep. 7, 2017）を挿入し、第２のＩｉ配列に続いた。Ｅ１をＥ２に、およびＥ６をＥ７に、それぞれ、ＧＳリンカーを介して連結した。突然変異を、Ｅ６およびＥ７に導入して、発癌可能性：Ｅ６におけるＬ１１０ＱおよびＣ末端ＥＴＥＶの欠失；Ｄ２４Ｇ、Ｌ７１Ｒ、Ｃ９５Ａを不活性化し、Ｃ２９７Ａを、Ｅ２に導入して、ＤＮＡ結合を不活性化した。この融合タンパク質をコードする配列を、最適化し、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズム（Raab, D., Graf, M., Notka, F., Schoedl, T. & Wagner, R. The GeneOptimizer Algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequence optimization. Syst. Synth. Biol. 4, 215-225, 2010）によってヒトコドン使用頻度に適合させ、ＧｅｎｅＡｒｔ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成し、ｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした。他のコンストラクト（図１）を、テンプレートとして上記のコンストラクトを使用する標準的な分子クローニング技法を使用することによって構築し、所望のプラスミド骨格にクローニングした。ワクチン接種目的のためのＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して生成した。

【0113】

細胞株、トランスフェクションおよびウイルス感染
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＡ５４９細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）が補充されたダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で維持し、成長させた。９Ｅ１０ ｍｙｃｌハイブリドーマ細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２ｍＭのグルタミン（Ｐａｎ）が補充されたＲＰＭＩ中で培養した。すべての細胞株を、非加湿インキュベーターにおいて、３７℃および５％のＣＯ_２で維持した。

【0114】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）法（Boussif, O. et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7297 LP - 7301, 1995）を使用してトランスフェクトした。ＰＥＩトランスフェクションのために、４×１０^５個の細胞を、トランスフェクションの前の日に６ウェルプレートに播種した。細胞を、任意の補充なしのＤＭＥＭ中の２．５μｇのプラスミド（等量、空ベクターで満たした）および７．５μｇのＰＥＩを用いてトランスフェクトした。６時間のインキュベーション後、培地を、１０％のＦＣＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭに交換した。

【0115】

サブコンフルエントなＡ５４９細胞に、任意の補充なしのＤＭＥＭ中、３０のＭＯＩでＡｄ１９ａ／６４ベクターを感染させた。感染２時間後、培地を、１０％のＦＣＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭに交換した。

【0116】

アデノウイルスベクターの作成
血清型Ａｄ１９ａ／６４のＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターを、以前に記載されたようにして作成した［Ruzsics, Z., Lemnitzer, F. & Thirion, C. Engineering Adenovirus Genome by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Technology BT - Adenovirus: Methods and Protocols. in (eds. Chillon, M. & Bosch, A.) 143-158 (Humana Press, 2014). doi:10.1007/978-1-62703-679-5_11］。簡潔には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）－（図１）を、ＣＭＶプロモーターの制御下のシャトルベクターｐＯ６－１９ａ－ＨＣＭＶ－ＭＣＳにクローニングした。次いで、ＣＭＶ－ＧＯＩ－ＳＶ４０－ｐＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＦｌｐ組換えを介して、Ｅ１／Ｅ３遺伝子が欠失した複製欠損Ａｄ系ベクターのゲノムを含有するＢＡＣベクター（Ruzsics, Z. et al, 2014）に移入した。組換えウイルスＤＮＡを、ＰａｃＩによる制限消化によって、精製ＢＡＣ－ＤＮＡから放出させた。得られた線状ＤＮＡを、ウイルス繁殖のために、上記に開示された産生細胞株にトランスフェクトした。組換えウイルスを、デオキシコール酸ナトリウム処理を介して、細胞から放出させた。残った遊離ＤＮＡを、ＤＮａｓｅ Ｉによって消化した。その後、ベクターを、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離法、それに続いてＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国）を介した１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および４％のスクロースへの緩衝液交換によって精製した。タイトレーションを、抗ヘキソン抗体［Ｎｏｖｕｓ、アデノウイルス抗体（８Ｃ４）］による免疫組織化学的染色を介した感染した産生細胞の検出によるＲａｐｉｄＴｉｔｅｒ法を使用して行った。挿入物の完全性を、精製されたベクターから抽出されたＤＮＡ中のＧＯＩのＰＣＲ増幅によって確認した。

【0117】

抗体および抗体精製
ｍｙｃ（９Ｅ１０）に対する抗体を、ハイブリドーマ細胞上清から得た。９Ｅ１０ ｍｙｃｌハイブリドーマ細胞を、１％のＦＣＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２ｍＭのグルタミンが補充されたＲＰＭＩ中、１ｍｌあたり５×１０^５個細胞で播種した。上清を、播種５日後に回収し、抗体を、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国）を介して精製した。カラムをＰＢＳで洗浄した後、抗体を、０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．２）を用いて溶出させ、０．０２５容量の１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。

【0118】

使用された他の抗体は以下であった：マウス抗ｐ２ａペプチド（３Ｈ４、１：２０００、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、マウス抗チューブリン（ＤＭ１α、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、マウス抗ユビキチン－ビオチン（ｅＢｉｏＰ４Ｄ１、１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）、ヤギ抗マウス－ＨＲＰ（１１５－０３６－００３、１：５０００、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、米国）、ヤギ抗ウサギ－ＨＲＰ（Ｐ０４４８、１：２０００、Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、米国）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１１０８９１５３００１、１：５０００、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）、ラット抗マウス－ＰＥ（Ａ８５－１、１：１００、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）。

【0119】

ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を、以前に記載されたようにして行った（Kiener, R. et al. Vaccine vectors based on Adenovirus 19a/64 exhibit broad cellular tropism and potently restimulate HCMV-specific T cell responses ex vivo. Sci. Rep. 8, 1474, 2018）。簡潔には、目的の細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）が補充されたＴＤＬＢ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、１％のＮｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ－４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）に溶解した。上清の総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（タンパク質アッセイ、ＢｉｏＲａｄ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）によって測定した。タンパク質を、還元条件下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ウエスタンブロット分析のために、ニトロセルロース膜上でブロッティングした。標的を、上記に列挙した一次抗体および二次抗体を用いて検出した。ＨＲＰ標識二次抗体および増強された化学発光基質またはＦｅｍｔｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）を、Ｃｈｅｍｉｌｕｘ Ｐｒｏデバイス（Ｉｎｔａｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）において、検出のために使用した。ローディング対照のために、膜を、チューブリンに対する抗体で再検出した。

【0120】

細胞株のフローサイトメトリー分析
抗原の細胞内染色を、標準的な方法（Kiener et al., 2018）を使用して行った。細胞を、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（４％のＰＦＡ、１％のサポニン、ＰＢＳ中）を用いて透過処理した。すべての洗浄工程は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（０．１％のサポニンを含有するＰＢＳ）を用いて行った。細胞を、それぞれ３０分間、抗ｍｙｃ抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に希釈）およびラット抗マウス－ＰＥ（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ－緩衝液に１：１００希釈）を用いて染色した。

【0121】

フローサイトメトリーアッセイを、４８８ｎｍの励起フィルターおよび５７４／２６ｎｍの発光フィルターを用いるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）を使用して行った。細胞を、染色されたモックトランスフェクト細胞に対してゲーティングした。データの評価を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを使用して行った。

【0122】

ユビキチン化の分析
ユビキチン化タンパク質を分析するために、トランスフェクション２４時間後、細胞を、１０μＭのＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤で６時間処理した。その後、細胞を、ＰＢＳ中で回収し、２回洗浄した。脱ユビキチン化酵素の不活性化のために、新たに調製されたストック溶液からの２０ｍＭのＮ－エチルマレイミドを、ＴＤＬＢ溶解緩衝液に添加した。溶解物を、上記に記載されたようにして作成した。免疫沈降の前に、プロテインＧダイナビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）を、１０μｇのプルダウン抗体とともにロードした。これらのビーズを使用して、標的タンパク質を、ゆっくりとした回転下、４℃で終夜、５００μｇの細胞溶解物から免疫沈降した。ビーズをＰＢＳで４回洗浄した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液を、９５℃で１０分間加熱する前に、ビーズに添加した。試料を、上記に記載されたようにして、ウエスタンブロット分析のために使用した。

【0123】

動物および免疫化
Ｂａｌｂ／ＣおよびＣＤ１雌マウスをＥｎｖｉｇｏ（Ｈｏｒｓｔ、オランダ）から、ＯＦ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（フランス）から入手した。すべての動物を、Ｐａｎｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎにおいて飼育した。すべての実験は、マウスを少なくとも１週間気候順化させた後に開始した。実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒａｔｅ（Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ、ライセンス番号２０１６－１５－０２０１－０１１３１）によって承認され、国のガイドラインに従って行った。

【0124】

ＤＮＡ免疫化を、Ｈｅｌｉｏｓ Ｇｅｎｅｇｕｎシステム（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）を使用して、１．６μｍの金マイクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）上にコーティングされた０．５ｇのＤＮＡを用いて、皮内（ｉ．ｄ．）で行った。マウスは、それぞれ１週間の間隔で、４回のＤＮＡ免疫化を受けた。１つの群は、１部位に、４つのプラスミドの混合物をそれぞれ０．５μｇ受けた。

【0125】

アデノウイルスベクターによる免疫化を、５０μＬのＰＢＳに希釈された２×１０^７ＩＦＵのＡｄ１９ａ／６４を用いて、筋肉内（ｉ．ｍ．）で行った。マウスは、Ａｄ１９ａ／６４注射の前に、イソフルランで麻酔した。１つの群は、１部位に、４つのＡｄ１９ａ／６４の混合物をそれぞれ２×１０^７ＩＦＵ受けた。

【0126】

脾細胞のフローサイトメトリー
脾細胞の単一細胞懸濁液を、ＨＡＮＫｓにおける器官回収によって得て、それに続いて７０μｍの細胞ストレーナーを通した。細胞を、１μｇ／ｍＬの関連ペプチドありまたはなしで、３μＭのモネンシン中、５時間インキュベートした。細胞を表面マーカー：ＡＰＣ－Ｃｙ７またはＢＶ４２１ ＣＤ８（５３－６．７、１：２００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、ＰＥ－Ｃｙ７ ＣＤ４（ＲＭ４－５、１：８００、ＢＤ）、ＦＩＴＣ ＣＤ４４（ＩＭ７、１：１００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）およびＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２、１：２００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）に対して染色した。表面染色後、細胞を、１％のＰＦＡ中で固定し、０．５％のサポニン中で透過処理し、ＡＰＣ ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２、１：１００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）およびＰＥ ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２、１：１００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）抗体を使用して細胞内染色した。

【0127】

使用されたペプチドは、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７抗原全体をカバーする１１アミノ酸が重複する１６－ｍｅｒであった。ペプチドを、それぞれ、Ｉｉ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７ペプチドを含有する５つの別々のプールにプールした。ペプチドは、ＫａｒｅＢａｙ、Ｔｏｗｎ、中国から入手した。

【0128】

フローサイトメトリーをＦｏｒｔｅｓｓａ ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて行い、データ分析をＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。エピトープ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を、Ｂ２２０^－、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋、ＣＤ４４^＋、ＩＦＮ－γ^＋細胞として測定し、器官あたりの細胞の総数で表した。ＩＦＮ－γ^＋応答の質を、ＩＦＮ－γのＭＦＩ、およびＩＦＮ－γ^＋ ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋集団における二重陽性細胞（ＩＦＮ－γおよびＴＮＦの両方を発現する）の割合によって評価した。

【0129】

インビボ細胞傷害性
アッセイを、以前に記載されたものと同様に行った（Nielsen, K. N., Steffensen, M. A., Christensen, J. P. & Thomsen, A. R. Priming of CD8 T cells by adenoviral vectors is critically dependent on B7 and dendritic cells but only partially dependent on CD28 ligation on CD8 T cells. J. Immunol. 193, 1223-1232, 2014）。簡潔には、ナイーブＢａｌｂ／Ｃマウス由来の脾細胞を、ＭｆＰＶ３ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６もしくはＥ７ペプチドプールとともに、またはペプチドなしで、３０分間、３７℃、５％ ＣＯ_２、２．５μｇの各ペプチド／ｍＬでインキュベートし、その後、０．４または５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ、ならびに０．２および２．５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ； ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）の組合せにより、１０分間、３７℃、５％ ＣＯ_２で染色した。パルスおよび染色された脾細胞を、１：１：１：１：１の比で混合し、合計で２．５×１０^７個の細胞を、Ａｄ１９ａ／６４ワクチン接種レシピエントＢａｌｂ／Ｃマウスに静脈内注射した。５時間後、脾臓を回収し、標的細胞を、ＣＦＳＥ／ＣＴＶ染色によって、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて同定した。死滅のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した。

【0130】

【数1】

【0131】

ＭＨＣ－ＩにおけるＥ１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）提示の分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＥＩトランスフェクションを使用して、２．５～３．５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を、ＰＥ抗Ｈ２ＫＢ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（２５－Ｄ１．１６、１：１６０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）で染色し、細胞表面におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ２Ｋｂ提示の存在を、Ｅ１提示についての代理として、ＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて検出した。すべての試料は、生物学的に６反復で実行し、実験は、少なくとも２回繰り返した。

【0132】

エクスビボ免疫原性データのグラフ表示および統計分析
非刺激試料をバックグラウンド対照として使用し、それらの応答値を、対応する動物のペプチド刺激試料から減算した後、統計分析およびグラフ表示を行った。

【0133】

統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用して行った。バックグラウンド減算された値を使用して、多重比較のために、ボンフェローニ補正を用いるマンホイットニー検定を使用して個々の群を比較した。陽性対照群は、多重比較分析に含めなかった。

【0134】

結果の視覚的表示を支援するために、我々は、非刺激バックグラウンド試料に対するＢ２２０^－、ＣＤ８^＋、ＣＤ４４^＋、ＩＦＮ－γ^＋カウントの平均数に基づく応答についての閾値を適用した。バックグラウンド試料の平均＋２×ＳＤよりも低いカウントを有するすべての試料を、応答なしと見なし、したがって、それらを、グラフ表示のために、１００の値に手作業で調整した。すべての統計分析は、非調整値において行った。

【0135】

二重陽性の割合の分析（すべてのＩＦＮ－γ^＋のうちのＴＮＦ^＋ ＩＦＮ－γ^＋％）およびＩＦＮ－γ^＋のＭＦＩを、レスポンダー（ＩＦＮ－γ^＋カウント＞非刺激試料の平均＋２×ＳＤ）においてのみ行った。

【0136】

各記号は１匹のマウスを表す。バーは中央値を示す。有意性レベルは、^＊（ｐ＜０．０５）、^＊＊（ｐ＜０．０１）、^＊＊＊（ｐ＜０．００５）によってマークする。

【0137】

結果
抗原の設計
非ヒト霊長類における既存のパピローマウイルス感染を排除することができる治療用ワクチンの作成を目的として、内因性Ｔ細胞アジュバントＩｉに連結されたＭｆＰＶ３のＥ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７を含む抗原コンストラクトを設計した。８つの異なる構成を着想して（図１）、さらなる開発のための最も強力で広範な応答を誘発するものを選択した。第１の複合抗原において、順序はＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７であったが、Ｅ１／Ｅ２およびＥ６／Ｅ７の順序は、（ｉ）抗原の順序の影響を試験するため、および（ｉｉ）導入遺伝子発現のレベルに対して、Ｉｉに対する位置の影響を決定するために、Ｉｉ＿Ｅ６Ｅ７Ｅ１Ｅ２において逆転させた。両事例において、すべてのタンパク質は、人工融合ポリペプチドとして発現されたが、個々のタンパク質は、短い可撓性ＧＳリンカーによって分離されて、融合タンパク質の安定性および蓄積を促進し（Chen, X., Zaro, J. L. & Shen, W.-C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1357-1369, 2013）、Ｉｉは、Ｔ細胞アジュバントとしてＮ末端に融合された（Holst, P. J. et al. MHC Class II-Associated Invariant Chain Linkage of Antigen Dramatically Improves Cell-Mediated Immunity Induced by Adenovirus Vaccines. J. Immunol. 180, 3339-3346, 2008）。ＩｉのＴ細胞アジュバント効果を評価するための参照として、Ｉｉなしの変異体Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７を設計した。Ｉｉアジュバント効果が、より短い抗原に融合された場合に、より顕著であったかを調べるために、Ｅ１Ｅ２を、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７においてｐ２ａペプチドによってＥ６Ｅ７から分離した（Kim, J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One 6, 2011）。２つの不変鎖間のヌクレオチド配列相同性を、相同組換えを妨げる多様なコドンを使用することによって最小化した。加えて、４つのウイルスタンパク質のそれぞれを、ベンチマークおよび参照として機能するＩｉ融合物としてそれら自身上で作成した。ＭｆＰＶ３初期タンパク質に対する抗体の欠如を理由として、すべてのコンストラクトを、Ｃ末端ｍｙｃタグを含有するように改変した。

【0138】

Ｅ６およびＥ７は、非常に強力な腫瘍性タンパク質であるので、形質転換欠損変異体のみが、安全性を確実にするために、ワクチンの状況において使用されなければならない。ＨＰＶ１６に対する相同性に基づいて、腫瘍性タンパク質Ｅ６を、Ｌ１１０Ｑ置換を導入して、Ｅ６のＥ６ＢＰへの結合、したがって腫瘍抑制因子ｐ５３の結合および分解を防止することによって不活性化した（Liu, Y. et al. Multiple Functions of Human Papillomavirus Type 16 E6 Contribute to the Immortalization of Mammary Epithelial Cells. 73, 7297-7307, 1999）。加えて、Ｃ末端ＰＤＺドメインを欠失させて（ΔＥＴＥＶ）、テロメラーゼおよび他のＬｘｘＬＬタンパク質の結合を消失させた（Wieking, B. G. et al. A Non-oncogenic HPV 16 E6/E7 Vaccine Enhances Treatment of HPV Expressing Tumors. Cancer Gene Ther. 19, 667-674, 2013）。Ｅ７を、それぞれ、中央ＬｘＣｘＥモチーフを不活性化して、形質転換活性およびｐＲＢ結合を低減し、Ｍｉ２β結合を低減し、二量化を阻害する、置換Ｃ２４Ｇ、Ｌ７１Ｒ、およびＣ９５Ａを導入することによって不活性化した（Wieking, 2013; Edmonds, C. & Vousden, K. H. A Point Mutational Analysis of Human Papillomavirus Type 16 E7 Protein. 63, 2650-2656, 1989）。Ｅ２の保存されたＤＮＡ結合ドメインを、Ｃ２９７Ａによって改変して、偶数のシステインを有するポリタンパク質を作成し、ＤＮＡ結合を低減させた。

【0139】

初期の生化学的および免疫学的特性評価のために、コンストラクトを、抗原がヒトＴ細胞白血病ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）調節エレメント（Barouch, D. H. et al. A human T-cell leukemia virus type 1 regulatory element enhances the immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 DNA vaccines in mice and nonhuman primates. J. Virol. 79, 8828-8834, 2005）と組み合わされたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリＡターミネーターの制御下にある、さまざまなＮＨＰおよび臨床試験における証明された成績を有するＤＮＡワクチンベクターの誘導体であるｐＵＲＶａｃにクローニングした［Asbach, B. et al. Priming with a Potent HIV-1 DNA Vaccine Frames the Quality of Immune Responses prior to a Poxvirus and Protein Boost. J. Virol. 93, 2019；Sarwar, U. N. et al. Safety and immunogenicity of DNA vaccines encoding Ebolavirus and Marburgvirus wild-type glycoproteins in a phase I clinical trial. J. Infect. Dis. 211, 549-557, 2015；Joseph, S. et al. A Comparative Phase I Study of Combination, Homologous Subtype-C DNA, MVA, and Env gp140 Protein/Adjuvant HIV Vaccines in Two Immunization Regimes. Front. Immunol. 8, 149, 2017；Pantaleo, G. et al. Safety and immunogenicity of a multivalent HIV vaccine comprising envelope protein with either DNA or NYVAC vectors (HVTN 096): a phase 1b, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet HIV 6, e737-e749, 2019］。

【0140】

ＭｆＰＶ３抗原の生化学的および細胞生物学的特性評価
最初に、抗原コンストラクトの発現の性質を評価した。抗ｍｙｃ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって検出される予想サイズのバンドを有するすべての抗原を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた（図２Ａ；図１）。分離されていないＩｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７に対するより高い分子量のバンドは、Ｃ末端断片を検出する抗ｍｙｃウエスタンブロットにおいても、Ｎ末端断片が検出される抗ｐ２ａウエスタンブロットにおいても検出できなかった。これは、ポリタンパク質がｐ２ａ部位で完全に分離されたという証拠を提供する。一部の事例において、特に高いシグナル強度を有するタンパク質について、計算値と比較してより高いまたはより低い分子量のバンドが観察できた。それらのサイズに基づいて、より高い分子量のバンドは、不完全に還元されたタンパク質と似ていることがあり、これは、Ｉｉがシステイン連結三量体を形成すると思われるので、完全に驚くべきことではない（Fougeroux, C., Turner, L., Bojesen, A. M., Lavstsen, T. & Holst, P. J. Modified MHC Class II-Associated Invariant Chain Induces Increased Antibody Responses against Plasmodium falciparum Antigens after Adenoviral Vaccination . J. Immunol. 202, 2320-2331, 2019）。より低い分子量のバンドは、推定上、断片サイズに基づいて、Ｉｉ内で最も切断されそうなＮ末端分解産物と似ている。Ｉｉが、その連結されたカーゴの一部をエンドソームコンパートメントに輸送し、そこでタンパク質分解が起こるので、部分的分解が予想される。

【0141】

異なるサイズのタンパク質が異なるブロッティング条件を示すので、ウエスタンブロット分析は、定量的であると仮定できず、そのため、シグナル強度は、実際の発現レベルを反映しないことがある。したがって、タンパク質レベルを、抗ｍｙｃ抗体による細胞内染色後、フローサイトメトリーによって定量化した（図２Ｂ）。異なるＭｆＰＶ３抗原の発現レベルは、Ｉｉ－Ｅ７を除いて、わずかにのみ異なり、これは、すべての他の抗原と比較して、２～３倍高いＭＦＩ値を示した。

【0142】

ＭＨＣクラスＩ拘束ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープは、Ｅ１融合タンパク質からプロセシングされ、インビトロでＭＨＣ－Ｉ分子上に豊富に存在する
ウシパピローマウイルス１ Ｅ１型が、それ自身、パピローマウイルス感染細胞内でユビキチン化され、迅速に分解される不安定なタンパク質であることが報告されている［Malcles, M.-H., Cueille, N., Mechali, F., Coux, O. & Bonne-Andrea, C. Regulation of bovine papillomavirus replicative helicase e1 by the ubiquitin-proteasome pathway. J. Virol. 76, 11350-11358, 2002；Mechali, F., Hsu, C.-Y., Castro, A., Lorca, T. & Bonne-Andrea, C. Bovine papillomavirus replicative helicase E1 is a target of the ubiquitin ligase APC. J. Virol. 78, 2615-2619 (2004)］。構造的分解は、我々が、ＨＰＶ感染細胞および組織におけるタンパク質レベルでのＥ１発現の検出を報告するどんな研究も見出すことができなかった理由、ならびにＥ１が抗体に関して免疫原性が乏しい理由を説明する可能性がある（Ewaisha, R., Panicker, G., Maranian, P., Unger, E. R. & Anderson, K. S. Serum Immune Profiling for Early Detection of Cervical Disease. Theranostics 7, 3814-3823, 2017）。しかしながら、自然ＨＰＶ感染における乏しい免疫原性にもかかわらず、治療用ワクチンによって標的化可能であるための要件である、Ｅ１由来ペプチドが、感染細胞においてＭＨＣ－Ｉ上に提示されることが確認されなければならない。Ｅ１由来ペプチドの提示を検出するために、我々は、最小Ｈ２－ｋｂ拘束性ＯＶＡエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを有する配列においてＭｆＰＶ３をコードするＤＮＡコンストラクトを設計した［Dersh, D., Yewdell, J. W. & Wei, J. A SIINFEKL-Based System to Measure MHC Class I Antigen Presentation Efficiency and Kinetics. Methods Mol. Biol. 1988, 109-122 (2019)］。Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬコンストラクトのトランスフェクション後、ＭＨＣ－Ｉにおける導入遺伝子の提示を、Ｈ２－Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的抗体を使用して評価した（図２Ｃ）。プロセシングされ、提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは、Ｉｉに連結された場合および単独で送達された場合の両方で、細胞表面上のＭＨＣ－Ｉにおいて検出できた。これは、Ｅ１由来ペプチドが、感染細胞の表面で提示されると予想され得るので、治療用ワクチンに含まれる関連抗原としてのＥ１の選択をサポートする。

【0143】

抗原コンストラクトのＤＮＡワクチン接種は、ＭｆＰＶ３初期抗原に対するＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を誘導する
非近交系ＣＤ１マウスの皮内（ｉ．ｄ．）ＤＮＡ免疫化は、Ｅ１および／またはＥ２をコードするすべてのｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンが、ＩＣＳおよびフローサイトメトリー分析によって測定されるＥ１およびＥ２特異的ＩＦＮ－γ^＋ ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞を誘導したことを確認した（図３）。より詳細には、すべてのＤＮＡワクチン候補は、陽性対照と同程度のＥ１応答を提供したが、Ｉｉ－Ｅ２陽性対照についてより高い応答の傾向があった。ワクチンは、これらの２つの抗原についての陽性対照を含む、このマウスの非近交系系統においてＥ６またはＥ７に対する応答を誘導した。重要なことには、ポリタンパク質として４つの抗原すべてをコードするすべてのワクチンは、個々の抗原（Ｉｉ－Ｅ１、Ｉｉ－Ｅ２、Ｉｉ－Ｅ６、Ｉｉ－Ｅ７）をコードする４つのワクチンのミックスによって誘導される応答と同等の応答を生じた。これは、総合的に、免疫原性が、単一ｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンから、ポリタンパク質としてＭｆＰＶ３初期抗原を送達することによって失われなかったことを示唆する。まとめると、４つの異なるポリタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、Ｔ細胞応答を誘導し、これは、Ｅ１およびＥ２特異的ＩＦＮ－γ^＋ ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞の頻度に関して統計学的な差を示さなかった。これは、（ｉ）ＩｉがＥ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７に融合されるかどうか、（ｉｉ）ポリタンパク質における初期抗原の順序、および（ｉｉｉ）Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７からＩｉ－Ｅ１Ｅ２を分離するためのｐ２ａ部位の使用に関する事例である。Ｔ細胞応答の質は、すべてのワクチンにわたって同等であり、ＩＦＮ－γのＭＦＩおよびＩＦＮ－γ^＋ Ｔ細胞のＴＮＦ産生によって評価された。予想されるように、Ｉｉは、ヒトＩｉがマウスにおいてアロジェニックであるので、ほとんどのマウスにおいてＣＤ８応答、および一部のマウスにおいてＣＤ４応答を生じさせる。

【0144】

２つのｐ２ａが分離したＩｉ連結抗原配列（Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７）およびＩｉ－Ｅ６Ｅ７Ｅ１Ｅ２を有するワクチンは、有意な応答および陰性対照群に対する有意差によって示される、Ｅ１に対するわずかに良好なＣＤ４応答を誘発すると思われた（図３Ａ）。

【0145】

アデノウイルスベクターの特性評価
抗原に対する細胞免疫応答を増加させるために、ウイルスベクターを、その後、抗原デリバリーのために使用した。血清型１９ａ／６４（ｒＡｄ）由来のアデノウイルスベクターは、カニクイザルにおける高いＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を誘導することができたＭｆＰＶ３抗原のデリバリーのための好適なベクターであることが示されている（Ragonnaud, E. et al. Replication deficient human adenovirus vector serotype 19a/64: Immunogenicity in mice and female cynomolgus macaques. Vaccine 36, 6212-6222, 2018）。組換えＭｆＰＶ３抗原の改変セットを含むｒＡｄベクターの精密パネルを作成した。Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７Ｅ１Ｅ２は、それが他のポリペプチドよりも優れていなかったので、除いた。単独で投与された場合のＥ２に対するより高い応答の傾向は、我々に、Ｅ２を個々にＩｉに連結させ、別々のドメインとして発現させることが有利であるかどうかを推測させた。それ故に、参照としてＥ２なしのＥ１、Ｅ６およびＥ７に連結されたＮ末端Ｉｉをコードするワクチン（Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７）、およびＩｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７抗原が自己分離ｐ２ａペプチドを介したＩｉ－Ｅ２融合によって拡張されたバージョン（Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２）を設計した。コードされる抗原の適した発現を確認するために、ウエスタンブロット分析を、アデノウイルスで形質導入されたＡ５４９細胞を用いて行った。すべてのベクターは、予想される位置で検出されるそれぞれの融合タンパク質に似ているバンドを有する抗原を容易に発現した（図４Ａ、図１および２）。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７に関しては、より高い分子量断片は、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２について検出できず、ｐ２ａ部位での完全な分離が、アデノウイルスベクターが送達する抗原の状況においても働くことが明らかになった。フローサイトメトリーを使用するＡ５４９細胞におけるアデノウイルスで送達される抗原の定量的比較は、Ｉｉ－Ｅ７融合タンパク質のより高い発現を除いて、異なるＭｆＰＶ３抗原コンストラクトの類似の発現レベルを確認した（図４Ｂ）。全体像は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＵＲＶａｃ ＤＮＡワクチンベクターのデリバリー後、観察された発現とかなり類似していた。

【0146】

アデノウイルスデリバリーは、非近交系マウスにおけるＨＰＶ初期抗原に対する強力な細胞免疫応答を誘導する
非近交系ＣＤ１マウスの筋肉内免疫化は、ワクチンのＡｄ１９ａ／６４製剤が、Ｅ１およびＥ２抗原に対するＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答の両方を誘導したことを確認した（図５ＡおよびＢ）。とりわけ、Ｉｉを含むワクチンは、Ｉｉをコードしないワクチンよりも非常に大きな応答の傾向を示した（図５ＡおよびＢ：Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７を他のワクチンと比較した）。応答のＩｉ媒介増強の傾向が、一部のワクチン構成について、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の両方について観察されたが、差は、Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７と比較して、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７によって誘導されるＥ２特異的ＣＤ８応答についてのみ有意であった（図５Ｂ、上側パネル）。これは、アデノウイルスワクチンデリバリーの文脈においてＴ細胞応答をブーストするＩｉの能力を強調した。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７抗原が、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７抗原よりも高いＥ１応答の傾向を追加的に示したので、以後の実験を行ったが、しかしながら、コンストラクト間の抗原免疫原性階層における一貫した差を実証することができなかった（データは示さない）。ＩＦＮ－γおよびＴＮＦの両方を分泌することができる二重陽性Ｔ細胞の割合、ならびにＩＦＮ－γのＭＦＩ値によって評価される、Ｔ細胞応答の質の差は検出されなかった。

【0147】

Ｅ１およびＥ２に対する活発なＴ細胞応答（図５ＣおよびＤ）以外に、我々は、実際に、Ｅ６に対する確かなＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答を理解した（図５Ｄ）。数匹のマウスも、Ｅ６に対して反応するＣＤ８^＋ Ｔ細胞を有しており、我々のワクチンコンストラクトのプロセシングおよび免疫原性を確認した。数匹のマウスのみがＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を有しており、これらの応答が低かったので、真の応答が存在したか、または単に高いバックグラウンドに起因したかどうか疑問視した。図５Ｃに表される代表的なマウスは、真の応答の様に挙動するＣＤ４４^＋ ＩＦＮ－γ^＋集団を示す。さらにまた、ＩＦＮ－γ^＋細胞の大部分は、同様にＴＮＦを産生し、活性化表現型を確認した。

【0148】

全体として、ワクチンのＡｄ１９ａ／６４デリバリーは、試験された４つのＭｆＰＶ３ポリタンパク質抗原すべてに対してＴ細胞を効果的に誘導し、抗原の免疫原性は、Ｉｉの包含によって増強された。

【0149】

Ｉｉ融合は、ユビキチン化およびプロテアソーム分解を増強した
ＩｉのＴ細胞アジュバント効果の基本メカニズムは、まだ完全に明らかではないが（Fougeroux et al, 2019）、示唆される作用メカニズムの１つは、連結された抗原のプロテアソーム分解、およびそれによって、増強されたＭＨＣ－Ｉ提示をもたらす、Ｉｉのユビキチン化である［Esposito, I. et al. MHC class II invariant chain-adjuvanted viral vectored vaccines enhances T cell responses in humans. Sci. Transl. Med. 12, (2020)］。このメカニズムもＩｉ連結ＭｆＰＶ３抗原に対するＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答の増強の主な原因であるかを調べるために、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７およびＥ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７トランスフェクト細胞を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の非存在下または存在下で培養した。免疫沈降ｍｙｃタグ付けポリペプチドの抗ユビキチンウエスタンブロット分析は、ＩｉなしのＥ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７と比較して、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７についてのより高いユビキチン依存性シグナル強度を明らかにした（図６Ａ）。この効果は、ＭＧ１３２が存在した場合に、さらにより顕著であった。Ｍｙｃ特異的シグナルは、免疫沈降（ＩＰ）手順の忠実度を確認し、抗チューブリンウエスタンブロットによるＩＰ上清の分析は、同等の量の細胞溶解物がＩＰ手順において使用されたことを明らかにした（図６ＢおよびＣ）。より高いレベルのユビキチン化は、一般に、より速い分解に関連する。これは、それぞれ、ＭＧ１３２の非存在下または存在下で、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと融合したＩｉ－Ｅ１およびＥ１を一過性に発現させることによって例示的に実証できた（図６ＤおよびＥ）。ＭＧ１３２なしで、Ｉｉ－Ｅ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬは、検出が困難であったが、顕著なシグナルは、ＭＧ１３２が添加された場合に視覚化できた。より低い分子量のシグナルは、分解産物を示す。この効果は、ＩｉなしのＥ１について観察されず、これは、Ｉｉがプロテアソーム分解の加速を誘導したことを示唆した。

【0150】

アデノウイルスデリバリーは、インビボで標的細胞の特異的死滅を誘導する
ｒＡｄ送達抗原によって誘導される細胞応答が細胞傷害能を有していたことを保証するために、我々は、近交系Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫し、１４日後、これらのマウスを、ペプチドパルスした事前染色同系標的細胞でチャレンジした。ワクチンは、Ｅ１に対するＣＤ８^＋応答を誘導したが（図７Ａ）、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて他の抗原に対して誘導しなかった（データは示さない）一方で、ＣＤ４応答が、Ｅ１、Ｅ２およびＥ６に対して生じた。Ｉｉなしのワクチンが、この近交系マウスモデルにおいて任意の検出可能なＥ１特異的ＣＤ８^＋応答を生じなかったので、Ｉｉは、再び、アジュバントとしてのその関連性を証明した（図７Ａ）。インビボ細胞傷害性アッセイは、Ｅ１標識細胞の特異的死滅を示し（図７ＢおよびＣ）、特異的死滅能の階層は、ＩＦＮ－γ^＋ ＣＤ８^＋ Ｅ１特異的Ｔ細胞の数に対応する。我々は、設計されたｒＡｄワクチンが、強力な細胞傷害性応答を誘導し、このワクチン設計が既存のＭｆＰＶ３感染を除去することができるという我々の仮説をサポートすると結論付けることができる。

【0151】

［実施例２］
本発明に従って改変されたＥ６およびＥ７の発癌性の評価
材料および方法
細胞株
ＮＩＨ－３Ｔ３細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＰＳ）が補充されたＤＭＥＭ中、５％のＣＯ_２で３７℃で培養した。ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、１０％～７０％のコンフルエンスで維持して、成熟および分化を防止した。

【0152】

ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターの生成
ＡｇｅＩ－ＨＦおよびＮｏｔＩ－ＨＦ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）制限酵素を使用することによって、それぞれ、ＨＰＶ１６抗原およびＨＰＶ１６ Ｅ６ｗｔを、ｐＬＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏにクローニングし、ＨＰＶ１６ Ｅ７ｗｔおよびＧＦＰを、ｐＬＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏにクローニングした。両ｐＬＶベクターは、ＣＭＶプロモーターと、それに続くＭＣＳ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびピューロマイシンまたはネオマイシンのいずれかに対する抗生物質耐性遺伝子を含有する。

【0153】

３．９×１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔ７５フラスコに播種した。播種２４時間後、培地を、添加物なしのＤＭＥＭに交換し、細胞を、９ｍｌの最終容量中、ＰＥＩ法［Boussif, O., Lezoualc'h, F., Zanta, M. A., Mergny, M. D., Scherman, D., Demeneix, B., & Behr, J. P. (1995). A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92(16), 7297 LP - 7301. https://doi.org/10.1073/pnas.92.16.7297］を使用して、３．７５μｇの抗原を含有するｐＬＶおよび３．７５μｇのレンチウイルスパッケージングミックス（１：１：１；ｐＭＤＬ－Ｇａｇ：ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＲＥＶ）でトランスフェクトした。トランスフェクション５時間後、１０％のＦＣＳおよび１％のＰＳを含有する４ｍｌのＤＭＥＭを、フラスコに添加した。レンチウイルスベクターを、１０００×ｇで５分間の遠心分離によって、トランスフェクション４８時間後に回収し、上清を、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、アリコートで、－８０℃で貯蔵した。

【0154】

ＮＩＨ－３Ｔ３細胞の形質導入および抗生物質選択
１×１０^５個のＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、Ｔ２５フラスコに播種した。播種２４時間後、培地を吸引し、細胞を、１０μｇ／ｍｌのポリブレン（ＴＲ－１００３－Ｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）の存在下、２ｍｌのそれぞれのレンチウイルスベクターを含有する各上清で形質導入した。６時間後、４ｍｌの１０％のＦＣＳおよび１％のＰＳを含有するＤＭＥＭを添加した。７２時間後、形質導入された細胞を、形質導入のために使用されたレンチウイルスベクターに応じて、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＣＰ１１．３、Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）および／または２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ａｎｔ－ｐｒ－１、ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を介して選択した。細胞を、すべての形質導入されていない細胞が死亡するまで、抗生物質選択下に少なくとも２週間おいた。

【0155】

抗体
以下の抗体を使用した：抗Ｅ２（ＴＶＧ－２７１、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗Ｅ６（ＧＴＸ１３２６８６、１：２０００、Ｂｉｏｚｏｌ、Ｅｃｈｉｎｇ、ドイツ）、抗Ｅ７（ＮＭ２、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗チューブリン（ＤＭ１α、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、ヤギ抗マウス－ＨＲＰ（１１５－０３６－００３、１：５０００、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、米国）およびヤギ抗ウサギ－ＨＲＰ（Ｐ０４４８、１：２０００、Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、米国）。

【0156】

ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を、以前に記載されたようにして行った［Kiener, R., Fleischmann, M., Schwegler, C., Ruzsics, Z., Thirion, C., Schroedel, S., Asbach, B., & Wagner, R. (2018). Vaccine vectors based on Adenovirus 19a/64 exhibit broad cellular tropism and potently restimulate HCMV-specific T cell responses ex vivo. Scientific Reports, 8(1), 1474. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19874-1］。簡潔には、目的の細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）が補充されたＴＤＬＢ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）に溶解した。上清の総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（タンパク質アッセイ、ＢｉｏＲａｄ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）によって測定した。タンパク質を、還元条件下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ウエスタンブロット分析のために、ニトロセルロース膜上でブロッティングした。標的を、上記に列挙した一次抗体および二次抗体を用いて検出した。ＨＲＰ標識二次抗体および増強された化学発光基質またはＦｅｍｔｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）を、Ｃｈｅｍｉｌｕｘ Ｐｒｏデバイス（Ｉｎｔａｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）において、検出のために使用した。ローディング対照のために、膜を、剥がし［ストリッピング緩衝液（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ、２％のＳＤＳ、０．１Ｍのβ－メルカプトエタノール、ｐＨ６．６）、５０℃で３０分間］、チューブリンに対する抗体で再検出した。

【0157】

軟寒天形質転換アッセイ
軟寒天形質転換アッセイを、以下のマイナーな改変を用いて、以前に記載されたようにして行った［Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., & Winn, R. A. (2014). The Soft Agar Colony Formation Assay. JoVE, 92, e51998. https://doi.org/doi:10.3791/51998］。６ウェルプレートを、それぞれ、１０％のＦＣＳ、１％のＰＳ、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ_３、３．８ｇ／ｌのＤ－グルコース、０．５％の低融点アガロース（６３５１．２、Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および／または２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する、２ｍｌのＤＭＥＭ（フェノールレッドなし、低グルコース）（Ｄ２９０２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）で満たし、培地が固化するまで、室温でインキュベートした。５×１０^３個のレンチウイルスで形質導入されたポリクローナルＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、事前処理された６ウェルプレートにおいて、３７℃に事前に温められた、それぞれ、１０％のＦＣＳ、１％のＰＳ、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ_３、３．８ｇ／ｌのＤ－グルコース、０．３５％の低融点アガロース、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および／または２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭに播種し、培地が固化するまで、室温でインキュベートした。プレートを、３７℃および５％のＣＯ_２で、２１日間インキュベートした。この期間内に、細胞に、週に２回、１０％のＦＣＳおよび１％のＰＳが補充された２００μｌのＤＭＥＭを供給した。２１日後、各ウェルを、１００μｌの４％のＰＦＡで固定し、１０％のメタノール中の０．００５％のクリスタルバイオレット（ｖ／ｖ）を用いて、室温で１時間染色した。写真を、５．６の絞り値、および２．８８の焦点で、ａｌｐｈａｉｍａｇｅｒ ＨＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、米国）において撮った。コロニーを、ＩｍａｇｅＪを用いてカウントした［Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J.-Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., & Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676-682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019］。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用して行った。個々の群を、両側のパラメーター化された対応のないＴ検定を使用して比較した。各記号は１反復を表し、バーは平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。有意性レベルは、^＊（ｐ＜０．０５）、^＊＊（ｐ＜０．００５）、ｎｓ（有意でない）によってマークする。

【0158】

結果
抗原発現は、足場依存性成長を引き起こさない
足場依存性成長は、形質転換細胞が固相への付着とは無関係に成長することが可能なので、発癌の顕著な特徴である（Borowicz et al., 2014）。形質転換についての最もストリンジェントな試験の１つは、軟寒天形質転換アッセイであり、これは、軟寒天における固相依存性成長を特性評価する。このために、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、それぞれ、以下のＨＰＶ１６抗原：Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ６Ｅ７、Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７、Ｉｉ－Ｅ２、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７、Ｅ６ｗｔ、およびＥ７ｗｔをコードするＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターで形質導入した（図１Ａ）。対照の目的で、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、それぞれ、ＧＦＰをコードするＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターおよび導入遺伝子を欠くレンチウイルスベクターで形質導入した。加えて、１つのポリクローナルＮＩＨ－３Ｔ３細胞株を、ＨＰＶ１６－Ｅ６ｗｔおよびＨＰＶ１６－Ｅ７ｗｔをコードするレンチウイルスベクターの両方による形質導入によって作成した。

【0159】

抗生物質選択後、ポリクローナルＮＩＨ－３Ｔ３細胞株の導入遺伝子発現を、ウエスタンブロット分析によって検証した。すべての細胞株について、正確なサイズでの予想バンドを、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２を除いて、検出した（図８Ａ）。この細胞株の作成は、３回試行して失敗したので、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２を、さらなる分析から除いた。５×１０^３個の細胞を、方法セクションに記載されたようにして、軟寒天に播種した。播種３週間後、プレートを染色し、コロニーをＩｍａｇｅＪを用いてカウントした。軟寒天において多数のコロニーを容易に形成したＥ７ｗｔおよびＥ６ｗｔ＋Ｅ７ｗｔで形質導入された細胞を除いて（図８Ｂ）、陰性対照（ＧＦＰおよび空ベクターで形質導入されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞）と比較してコロニーの数に差はなかった。総合すれば、これは、ＨＰＶ１６抗原の形質転換の潜在力の機能的不活性化を確認し、したがって、抗原は安全であると考えることができる。

【0160】

［実施例３］
アカゲザルにおけるＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７の免疫原性
材料および方法
細胞株、トランスフェクションおよびウイルス感染
懸濁液中で成長させたＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ細胞を、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および組換えインスリン様成長因子（ＬＯＮＧ－Ｒ^３ ＩＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度、Ｓｉｇｍａ）が補充された化学的に定義されたＣＤ－Ｕ６培地（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）中で維持し、オービタルシェーカー（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｐｒｏ，Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）において、８％のＣＯ_２で、１８０ｒｐｍの振とう速度でインキュベートした。接着成長のために、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ細胞を、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。接着細胞株を、加湿インキュベーターにおいて、３７℃および８％のＣＯ_２で維持した。

【0161】

組換えＭＶＡベクターの作成
組換えＭＶＡベクターを、以前に記載されたようにして作成した［Jordan, I., Horn, D., Thiele, K., Haag, L., Fiddeke, K., Sandig, V., Virol Sin. 2020 Apr; 35(2): 212-226. doi: 10.1007/s12250-019-00176-3.］。簡潔には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）－（図１）を、ＭＶＡ Ｅ／Ｌプロモーターの制御下のＭＶＡの欠失部位ＩＩＩへのＧＯＩの組み込みに好適なシャトルベクターＳＰ－ＣＲ１９ＩＩＩ－ｔｅｔＯにクローニングした。異なるＧＯＩをコードする組換えＭＶＡを、Ｔｅｔシステム（上記を参照されたい）の利点を取ることによって、組換えＭＶＡの作成および繁殖の間のＧＯＩの望ましくない発現を防止する接着ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ細胞における相同組換えによって作成した。したがって、６ウェルプレートに播種された培養単層に、０．０５のＭＯＩで、ＭＶＡまたはＭＶＡ－ＣＲ１９を感染させ、製造業者の指示に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して、２μｇの個々のシャトルベクターでトランスフェクトした。感染／トランスフェクトされた培養物を、感染／トランスフェクション２～３日後に回収し、超音波処理し、６ウェルプレートフォーマットにおける細胞単層の感染のために使用した。得られたプラークをＰＣＲによって検証し、反復プラーク精製手順を、正確なＧＯＩ発現カセットなしのＭＶＡがもはや存在しなくなるまで（通常、５～８ラウンド以内のプラーク精製）、開始した。

【0162】

プラーク精製ＭＶＡの繁殖のために、細胞回収材料を、Ｖｉａｌ Ｔｗｅｅｔｅｒ（２０秒の１００％のサイクルおよび９０％の振幅に設定、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ、ドイツ）を使用して超音波処理し、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ［ＣＤ－Ｕ４およびＣＤ－ＶＰ４（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の１：１混合物中、１ｍｌあたり２×１０^６個細胞の懸濁液中で成長］に、０．０５のＭＯＩで、個々の組換えＭＶＡベクターを接種した。最後に、ＭＶＡを、感染４８時間～７２時間後に回収し、ＴＣＩＤ_５０力価を決定した。

【0163】

動物
カニクイザルの使用のための倫理審査による承認は、Ｂｏｇｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩＡＣＵＣにおける霊長類研究センター（動物のケアおよび使用委員会）によって登録された。６～１０歳の３～５ｋｇの体重の雌カニクイザルを、結核、サルＴ細胞白血病ウイルスおよびサルレトロウイルスについて陰性、ならびにＭｆＰＶ３について子宮頸部の陽性に基づいて、この研究における使用のために選択した。選択された動物を、ワクチン接種前１か月間気候順化させた。動物を、群に収容し、１日２回、ｍｏｎｋｅｙ ｃｈｏｗ（Ｃｈａｒｏｅｎ Ｐｏｋｐａｎｄ、タイ）を与えた。

【0164】

すべての手順は、高度に訓練された獣医師、動物技術者および世話人によって行った。ワクチン接種および採血、子宮頸部スワブなどのすべての手順の前に、動物を、ケタミン（１０～１５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．５～１ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した。手順の前後に、マカクを、痛み、苦痛、体温および体重についてモニターした。採血は、実験の期間にわたって許容される最大容量に制限した。実験は依然として進行中であるが、すべての動物は、他の実験または採血プログラムにおける使用のために、研究の最後に共同体に戻した。

【0165】

子宮頸部スワブからのＤＮＡ精製およびｑＰＣＲによるＭｆＰＶ３検出
簡潔には、子宮頸部試料を、小さい子宮頸部サイトブラシ（ｃｙｔｏｂｒｕｓｈ）を使用して得、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５；５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ）と呼ばれる保存液に入れた。ＤＮＡを、製造業者の手順に従って、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて子宮頸部試料から抽出し、１００ｍＬ中に溶出した。

【0166】

ＭｆＰＶ３陽性カニクイザルの選択、および治療用ワクチン接種試験の間のＭｆＰＶ３感染レベルの決定は、以下のプライマーおよびプローブのセット：５’ＦＡＭ－ａａａｔｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｇｃａｔａｃｇａｃｃ－３’ＢＨＱ１、ｇｇｇａａｃｃａｃｃｔｇａａｔｇｇａｔａおよびｇｇｃｇｃａａｔｃｃｔｔｃａｃａｔａｔｔを用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、Ｂｏｇｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）において行った。

【0167】

ワクチン接種
動物に、０日目にＰＢＳまたはＡｄ１９ａ／６４ベクター化ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７のいずれかで、および４２日目にＭＶＡベクター化ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７でワクチン接種した。ワクチンは、各経路で、両方ともｉ．ｍ．、ｉ．ｒｅｃ．およびｉ．ｖａｇ、２×１０^８ＩＦＵ（Ａｄ１９ａ／６４）またはＴＣＩＤ５０（ＭＶＡ）を与えた。

【0168】

ＥＬＩＳｐｏｔ
各々のワクチン接種されたカニクイザルからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）によって、血液から精製した。新たに精製されたＰＭＢＣからのワクチン抗原特異的Ｔ細胞を、２ｍｇ／ｍＬの関連ペプチドプールの存在下、３７℃および５％のＣＯ２での１８～２０時間のインキュベーション後、サルＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴｐｌｕｓキット（ＭＡＢＴＥＣＨ、番号３４２１Ｍ－４ＨＳＴ－２）を使用して、ＩＦＮ－γ産生によって測定した。スポット形成単位（ＳＦＵ）を、ＩＲＩＳ機器において読み取り、ＥＬＩＳｐｏｔ Ｂｉｇ強調アルゴリズムを使用してカウントした。非刺激試料からのバックグラウンド応答を、グラフ表示の前に減算した。

【0169】

ＮＨＰ ＰＢＭＣのフローサイトメトリー
各々のワクチン接種されたカニクイザルからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）によって、血液から精製した。細胞を、２μｇ／ｍＬの関連ペプチドありまたはなしで、２０ｕｇ／ｕＬのブレフェルジンＡ中、５時間インキュベートした。細胞を、表面マーカー：ＡＰＣ－ＣＤ３（クローンＳＰ３４－２、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５－ＣＤ４（クローンＬ２００、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ－ＣＤ８（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および固定可能生存色素ｅＦｌｏｕｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に対して染色した。表面染色後、細胞を、固定し、ＢＤｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ中で透過処理し、ＦＩＴＣ－ＩＦＮ－γ（クローンＭＤ－１、ＵＣｙ－Ｔｅｃｈ）およびＰＥ／Ｃｙ７－ＴＮＦ－α（クローンｍＡｂ１１、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を使用して、細胞内染色した。

【0170】

使用されたペプチドは、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７抗原全体をカバーする１１アミノ酸が重複する１６－ｍｅｒであった。ペプチドを、それぞれ、Ｉｉ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７ペプチドを含有する５つの別々のプールにプールした。ペプチドは、ＫａｒｅＢａｙ、Ｔｏｗｎ、中国から入手した。

【0171】

フローサイトメトリーをＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯフローサイトメーターにおいて行い、データ分析をＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。エピトープ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を、生存ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋、ＩＦＮ－γ^＋細胞として測定した。バックグラウンド（非刺激試料から）を、プロットおよび分析の前に減算した。０．０１％を下回るすべての応答を、検出限界未満と見なし、最適な視覚化表示のために手作業で０．０１に調整した。

【0172】

結果
ＥＬＩＳｐｏｔによって測定されたプライムワクチン接種後の応答
すべてのワクチン接種動物は、ＰＢＳ（偽／陰性対照）ワクチン接種動物と比較して、Ｅ１ペプチドプールに対して強く応答する（図１０）。Ｅ１よりも低い頻度であるが、すべてのワクチン接種動物においてＥ２応答が存在し、Ｅ６／Ｅ７応答は、２匹のワクチン接種動物において見られる。

【0173】

これは、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７ Ａｄ１９ａ／６４ワクチンが、サルにおいて免疫原性であるという証拠を提供する。

【0174】

細胞内染色およびフローサイトメトリーによって測定されるブーストワクチン接種後の応答
非常に低いＴ細胞応答が、ブースト前に検出されたが（図１０、中央パネル）、ＭＶＡブースト９日後に、Ｔ細胞応答は、再増幅された。すべてのワクチン接種サルは、ＰＢＳ対照とは対照的に、少なくとも１つのワクチン抗原（Ｅ１を含む）に対する強いＣＤ８およびＣＤ４応答を示し、Ｅ２およびＥ７に対するＣＤ８応答は、同様に多くのワクチン接種動物において検出される（図１０、下パネル）。

【0175】

ウイルスベクター化ＭｆＰＶ３ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７ワクチンが、ＭｆＰＶ３感染サルにおいて免疫原性であることを確認する以外に、これは、ワクチンが、ＮＨＰにおける既存のＭｆＰＶ３感染を治癒することができる強い兆候も提供する。

【0176】

すべてのワクチン接種動物における５６日目でのＭｆＰＶ３感染のクリアランス
図１２に見られるように、２匹のワクチン接種動物のみが、４２日目（プライム後６週間）に検出可能なＭｆＰＶ３ワクチン接種を有しており、すべてのワクチン接種動物は、ＰＢＳが注射された陰性対照動物の６匹のうち３匹のみと比較して、５６日目（ブースト後２週間）で感染が排除された。ワクチン群における１匹の動物および陰性対照群の１匹の動物が、０日目に検出可能なＭｆＰＶ３を有していなかったことに留意されたい（各記号は１匹の動物を表す）。しかしながら、０日目に検出可能な感染を有していない陰性対照動物は、４２日目に検出可能なウイルス血症を有しており、したがって、感染と見なされ、クリアランス速度が、それぞれ、ワクチン群およびＰＢＳ群について、５／５および３／６であり、ｐ値＝０．１８（フィッシャーの正確確率検定）をもたらす。

【0177】

ワクチン誘導Ｔ細胞応答は持続性ＭｆＰＶ３感染を有する動物において機能的であると思われる
ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の消耗は、持続性ＨＰＶ感染を有する人々において起こり得、機能消失によって、および最終的に抗原特異的Ｔ細胞の排除によって特徴付けられる。そのため、治療用ワクチンが、感染の持続的な存在の状況で抗原特異的免疫応答を誘導し得ることは重要である。

【0178】

ｈＡｄ１９ａ／６４ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるプライム免疫化は、実際に、すべてのワクチン接種動物において、ワクチン抗原に対するＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を誘導した（図１１Ａ）。とりわけ、持続性ＭｆＰＶ３感染を有するワクチン接種動物とＨＰＶ感染の期間が知られていなかった動物との間の観察された差は存在しなかった。

【0179】

ＭＶＡベクター化Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７による４２日目の免疫化は、Ｅ１およびＥ２に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をブーストしたが、Ｅ６およびＥ７に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、ブースティングによって増強されるように見えなかった（図１１Ｂ）。

【0180】

高レベルのエフェクターサイトカインを産生する能力は、高い機能性および消耗の非存在のマーカーである。平均ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞の評価は、Ｅ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、Ｅ７と比較して、有意に高いレベルのＩＦＮ－γを有していたことを明らかにした（図１１Ｃ）。これは、消耗が、Ｅ１特異的Ｔ細胞集団と比較して、Ｅ７特異的Ｔ細胞集団においてより蔓延し得ることを示す。

【0181】

［実施例４］
ＨＰＶ１６ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７抗原を用いる異なるコンストラクト設計の性質、ならびにＨＰＶ１６ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７の腫瘍保護有効性
材料および方法
動物、免疫化、シスプラチン注射および腫瘍チャレンジ
Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＤ１マウスをＥｎｖｉｇｏ（Ｈｏｒｓｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、ＯＦ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（フランス）から、ＨＳｄ－ＯｌａマウスをＥｎｖｉｇｏ（英国）から入手した。すべての動物は、６～８週齢の雌であり、Ｐａｎｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎにおいて飼育した。すべての実験は、マウスを少なくとも１週間気候順化させた後に開始した。実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒａｔｅ（Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ、ライセンス番号２０１６－１５－０２０１－０１１３１）によって承認され、国のガイドラインに従って行った。

【0182】

腫瘍細胞株Ｃ３を、ＨＰＶ１６ゲノムおよび活性化ｒａｓ癌遺伝子によるマウス胚細胞のトランスフェクションによって発展させた（Feltkamp et al, Eur J Immunol 1993）。細胞株のデータ確認を、ＨＰＶ１６ Ｅ７の存在のフローサイトメトリー検出によって行った。インビボでの抗腫瘍有効性を評価するために、２００ｕＬのＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡ中の１Ｅ＋０６個のＣ３腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に、 皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍サイズは、週に３回、長さおよび幅を測定し、腫瘍容量を、長さ×幅^２×０．５２３６として計算した（Janik et al, Cancer Res 1975）。動物を、腫瘍が１０００ｍｍ^３を超えたか、または示された時点で、頸椎脱臼によって屠殺した。

【0183】

確立された腫瘍の処置のために（ｄ１０免疫化）、マウスを、処置直前のそれらの腫瘍サイズに基づいて処置群に割り当てて、処置の開始時でのすべての処置群についての等しい平均腫瘍サイズを確保した。

【0184】

マウスが、下肢において免疫化された場合に、３０μＬのＰＢＳ中の２×１０^７ＩＦＵのＡｄ５またはＡｄ５Ｆ３５で全身と皮膚の混合経路の図１８を除いて、アデノウイルスベクターによる免疫化を、５０μＬのＰＢＳに希釈された２×１０^７ＩＦＵのｒＡｄを腫瘍注射と同じ部位の大腿部の筋肉内（ｉ．ｍ．）で行った。ＳＬＰワクチン（ＨＰＶ１６ Ｅ７４３－７７およびＨＰＶ１６ Ｅ６４１－６５、Ｓｃｈａｆｅｒ）による免疫化を、５０ｕｇの各ペプチドで、腫瘍注射の逆の脇腹において、ｓ．ｃ．で行った。ＳＬＰワクチンは、凍結乾燥ペプチドをＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬに溶解すること、およびＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬへのさらなる希釈によって調製した。これを、１：１の比で、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に乳化し、２００ｕＬの総容量を、マウスごとに注射した。

【0185】

シスプラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．９％のＮａＣｌ_２溶液中１ｍｇ／ｍＬに溶解し、３ｍｇ／ｋｇマウス体重を、週に１回、３回、腹腔内注射した。

【0186】

マウスを、腫瘍が１０００ｍｍ^３を超えた、壊死性創傷の出現、またはマウスの移動性が著しく低減した場合に、安楽死させた。

【0187】

脾臓、リンパ節、血液および腫瘍内免疫細胞の細胞内染色およびフローサイトメトリー分析
脾細胞およびリンパ節の単一細胞懸濁液を、ＨＡＮＫｓにおける器官回収によって得て、それに続いて７０μｍの細胞ストレーナーを通した。腫瘍組織を、回収後に重量測定し、製造業者のプロトコールを使用して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉマウス腫瘍解離キット（カタログ番号１３０－０９６－７３０）およびＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離剤を使用して処理した。血液をＥＤＴＡ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に回収し、赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して溶解した。

【0188】

細胞を、１μｇ／ｍＬの関連ペプチド（ＪＰＴ ＨＰＶ１６ ｐｅｐｍｉｘ）ありまたはなしで、３μＭのモネンシン中、５時間インキュベートした。細胞を、表面マーカー（すべての抗体は、注記されない限り、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国製であった）：ＡＰＣ－Ｃｙ７またはＢＶ４２１ ＣＤ８（５３－６．７、１：２００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）、ＰＥ－Ｃｙ７ ＣＤ４（ＲＭ４－５、１：８００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）、ＦＩＴＣ ＣＤ４４（ＩＭ７、１：１００）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２、１：２００）、固定可能生存色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＢＶ５１０ ＰＤ－１（２９Ｆ．１Ａ１２、１：１００）に対して染色した。表面染色後、細胞を、１％のＰＦＡ中で固定し、０．５％のサポニン中で透過処理し、ＡＰＣ ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２、１：１００）およびＰＥ ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２、１：１００）抗体を使用して細胞内染色した。

【0189】

フローサイトメトリーをＦｏｒｔｅｓｓａ ３またはＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて行い、データ分析をＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を、Ｂ２２０^－、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋、ＣＤ４４^＋、ＩＦＮ－γ^＋細胞として測定し、脾臓あたりの細胞の総数、血液１ｍＬあたりの細胞の総数、腫瘍１ｇあたりの細胞の総数、またはそれぞれの図に記載される集団の割合として表した。ＩＦＮ－γ^＋応答の質を、ＩＦＮ－γのＭＦＩ、およびＩＦＮ－γ^＋ ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋集団における二重陽性細胞（ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの両方を発現する）の割合によって評価した。

【0190】

腫瘍内免疫細胞の系統染色およびフローサイトメトリー分析
腫瘍組織を、回収後に重量測定し、製造業者のプロトコールを使用して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉマウス腫瘍解離キット（カタログ番号１３０－０９６－７３０）およびＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離剤を使用して処理し、表面マーカー（注記されない限り、すべて１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）：ＢＶ６５０ ＣＤ８（５３－６．７）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ ＣＤ４（ＲＭ４－５）、ＰＥ／Ｃｙ７ ＣＤ４５．２（１０４）、ＡＰＣ Ｆ４／８０（ＢＭ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、ＡＦ４８８ ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、ＢＶ４２１ ＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、ＢＶ５１０ ＰＤ１（２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、ＡＦ７００ ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ－１１９）および固定可能生存色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対して染色した。表面染色後、細胞を、固定し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セットを使用して透過処理し、ＰＥ ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内染色した。

【0191】

フローサイトメトリーをＦｏｒｔｅｓｓａ ５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて行い、データ分析をＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。

【0192】

免疫細胞枯渇
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇を、１００ｕＬのＰＢＳ中のマウスあたり０．２５ｍｇの抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５；番号ＢＥ０００３－１；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、０．１ｍｇの抗マウスＣＤ８（２．４３；番号ＢＥ００６１；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）または０．１ｍｇのラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（ＬＴＦ－２；番号ＢＥ００９０；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）のｉ．ｐ．注射によって行った。枯渇抗体を、Ｃ３腫瘍チャレンジ後、２０、２３および２６日目に与えた。枯渇を、２８日目に、ＢＶ４２１ ＣＤ８（５３－６．７、１：２００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ ＣＤ４（ＲＭ４－５、１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）、ＰＥ／Ｃｙ７ ＣＤ４５．２（１０４、１：１００ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）および固定可能生存色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、血液試料における表面染色およびフローサイトメトリーによって検証した。フローサイトメトリーをＦｏｒｔｅｓｓａ ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、米国）フローサイトメーターにおいて行い、データ分析をＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。

【0193】

腫瘍組織の免疫組織化学的染色
腫瘍組織を、屠殺時に注意深く回収し、４％の冷ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）中で固定した。固定液を、およそ２４時間後に、７０％のエタノールで交換した。固定された組織をパラフィンに包埋し、スライドをＰＥおよびＣＤ８αについてのＤＡＢ（Ｄ４Ｗ２Ｚ、１：６００、ｐＨ＝９、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で染色した。

【0194】

組織を、Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）を使用してスキャンし、Ｚｅｎ ３．４ソフトウェアを使用して分析した（カットオフ面積：１０～１８０ｕｍ^２。カットオフ真円度：０．５～１．０）。

【0195】

結果
Ａｄ１９ａ／６４ベクター化ワクチン接種は、Ａｄ５によってブーストされ得る非近交系マウスおよび近交系マウスの両方において、頑強なＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
Ａｄ１９ａ／６４ベクター化ワクチンの単回用量による非近交系ＣＤ１マウスの筋肉内免疫化は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答がＥ１に対して検出され（図１３Ａ）、かつＣＤ４＋応答がＥ１（図１３Ｂ）およびＥ２（図１３Ｃ）に対して測定されたので、インビボでの異なる抗原コンストラクトの免疫原性を確認した。

【0196】

免疫応答をさらに増強するために、ブースターワクチンとしてヒトＡｄ５をコードするＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７を送達する異種プライム－ブースト免疫化を適用した。これは、Ｅ１に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増加させ（図１３Ａと比較した図１３Ｄ）、同様にＥ７に対する一部の応答を誘導した（図１３Ｅ）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、Ｅ１およびＥ２に対して一貫して検出され、Ｅ６およびＥ７に対して散発的に検出された（データは示さない）。我々は、ＣＤ１マウスにおいてＥ２またはＥ６に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を検出せず、これは、むしろ少数の樹立マウスに起因して、推定で非近交系ＣＤ１マウスモデルにおける限定的なＭＨＣ多様性を潜在的に反映した（Yalcin et al. 2010）。したがって、我々は、ＣＤ１とは独立して由来する選択された他の非近交系マウス系統（ＯＦ１およびＨｓｄ－Ｏｌａ）において、Ａｄ１９ａ／６４－Ａｄ５プライムブーストレジメンにおけるＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７ワクチンを評価するために選択した（Yalcin et al. 2010）。ここで、我々は、少なくとも１つのマウス系統において４つの抗原すべてに対するワクチン誘導ＣＤ８＋応答（図１３Ｆ～Ｉ）、ならびにＥ１、Ｅ２およびＥ７に対するＣＤ４＋応答（データは示さない）を検出した。

【0197】

最後に、我々は、ＨＰＶ１６治療用ワクチンの分野において標準的なマウスモデルであるＣ５７ＢＬ／６において、免疫原性を確認しようとした。我々は、すべての抗原設計についてＥ１に対してＣＤ８＋ Ｔ細胞が応答することを見出し（図１３Ｊ）、同様にＥ７特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１３Ｋ）、およびＥ１に対するＣＤ４＋応答（データは示さない）を検出した。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７は、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ６Ｅ７－ｐ２ａ－Ｉｉ－Ｅ２ワクチンよりも有意に強いＥ７応答を与え、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７も、Ｉｉをコードしないワクチンよりも強いＥ７応答を与えるように見えた（ｐ＝０．０７７）。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７のこの利点は、誘導されたＴ細胞応答の大きさおよび質と組み合わせて、ＩＦＮ－γ陽性細胞の統合平均蛍光強度（ｉＭＦＩ）を見る場合に、さらにサポートされた（Shoostari et al. 2010）。この分析において、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７は、Ｉｉをコードしないワクチンおよびｐ２ａ－Ｉｉに直接連結されたＥ７をコードするワクチンと比較して、Ｅ７に対する応答を有意に増強した（図１３Ｍ）。さらにまた、Ｅ１応答は、同様に、非Ｉｉワクチンと比較して、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７についてより高い傾向であった（図１３Ｌ、ｐ＝０．０６）。我々は、以前に報告されたＥ６エピトープ（ａａ４８－５７、ＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ）（Peng et al. 2004）にもかかわらず、任意のＥ２またはＥ６特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を検出しなかった。Ｅ６エピトープに対する応答が、Ｅ６単独をコードするワクチンについてのみ以前に記載されており、Ｅ６エピトープが、優位なＥ７エピトープ（ａａ４９－５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（Feltkamp et al. 1993）よりも免疫原性が低いと報告されているので、これは、免疫優性に起因し得る。

【0198】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける優れたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答、ならびに非近交系マウスモデルにおける劣性の欠如および陽性傾向に基づいて、我々は、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７抗原設計を前進させると決定した。

【0199】

最後に、我々は、Ａｄ１９ａ／６４プライミング後の異種Ａｄ５－ベクター化ブースティングが、Ａｄ１９ａ／６４プライミング単独と比較して、リコールワクチン特異的応答を誘導したが、Ａｄ１９ａ／６４による同種ブースティングは誘導しなかったことを確認した（図１３Ｎ～Ｐ）。Ａｄ１９ａ／６４および抗原を含有しないＡｄ５ベクターの陰性対照群は、応答がワクチン特異的であったことを確認するために含めた。

【0200】

腫瘍接種直後のＡｄベクターワクチン接種は、単一薬剤腫瘍制御および生存の増加を提供する
我々のＨＰＶワクチンの治療効果を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、同系Ｃ３腫瘍細胞を注射した。Ｃ３細胞株を、ＨＰＶ１６ゲノムおよび活性化ｒａｓ癌遺伝子によるマウス胚細胞のトランスフェクションによって確立し（Feltkamp et al. 1993）、腫瘍は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７のみを含有する通常使用されるＴＣ－１腫瘍モデル（Lin et al. 1996）とは対照的に、すべてのＨＰＶ１６抗原を発現することができる（Schmitt and Pawlita et al. 2011）。Ｃ３腫瘍細胞株が、Sluis et al. 2015（それらの捕捉図１を参照）によって示されるように、一般に、ＴＣ－１モデルよりも成長が遅く、処置耐性がより高く、Ｃ３モデルにおいてそれが治療効果を示すことをより困難にすることを言及する価値がある。

【0201】

最初の実験において、マウスを、腫瘍チャレンジ２日後に、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７または無関係の抗原（陰性対照）をコードするＡ１９ａ／６４ベクターで処置した。２０日目に、同じ抗原を含有するＡｄ５ベクターによる別の処置を行って、応答をブーストした。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７処置は、腫瘍成長を有意に低減し（図１４Ａ）、１０匹のマウスのうち３匹で腫瘍を完全に除去し（図１４Ｂ）、生存を有意に増加させ（図１４Ｃ、４１日目に３／１０対１０／１０の死亡）、処置が、小さな腫瘍に対して有効であることを示した。

【0202】

Ａｄベクター化ワクチン接種は、確立された腫瘍の単一薬剤制御を提供し、シスプラチン共処置と相乗的に働く
治療用ワクチンによるＣ３腫瘍の早期処置が、ワクチンレジメン単剤療法のように良好な効果を有していたことを確認して、我々は、確立された腫瘍に対する効力の調査に進んだ。明白な腫瘍が存在したら（１０日目）、マウスを、治療用ワクチンで処置し、これは、一部の動物における腫瘍成長の低減（図１５ＡおよびＢ）、有意に増加した生存（図１５Ｃ）を示した。シスプラチンは、臨床におけるＨＰＶ＋がんの標準的な処置であり、ＨＰＶ標的化治療用ワクチンとの相乗作用を以前に示している（Sluis et al. 2015）。Nejad et al. 2016によって以前に記載されたように、治療用ワクチンを３回の週に１回のシスプラチン注射と組み合わせることで、シスプラチン処置および対照ワクチン接種と比較して、ならびに治療用ワクチン単独と比較して（データは示さない）、腫瘍制御（図１５ＤおよびＥ）および生存（図１５Ｆ）は劇的に増加した。

【0203】

腫瘍組織の免疫組織化学的染色は、治療用ワクチンが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数（図１５Ｇおよび１５Ｉ）、さらにより重要なことには、腫瘍実質の中心へのこれらのＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤のレベル（図１５Ｈおよび１５Ｉ）を有意に増加させたことを明らかにした。シスプラチンとの共処置は、免疫組織化学的検査によって視覚化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤に対して任意の明らかな効果を有するように見えなかった（データは示さない）。

【0204】

観察された治療効果の原因をさらに調べるために、我々は、それぞれの処置の組合せについて、治療効果が始動し始めた時点で腫瘍およびリンパ器官を回収した。器官回収を、ワクチンおよびシスプラチンを組み合わせて処置されたマウスについて２４日目に（図１５Ｄ）、およびワクチン単独で処置されたマウスについて３０日目に（図１５Ａ）行った。腫瘍浸潤性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分析は、ワクチン接種マウスが、両方の時点で、エクスビボで腫瘍細胞とインキュベートされた場合にＩＦＮ－γを産生するより多くの腫瘍反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有していたことを示した（図１５Ｊ）。脾臓応答を見ると、ワクチンは、これらの腫瘍保持マウスにおいてＥ１およびＥ７特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特異的に誘導し（図１５Ｋ）、以前に分析された非腫瘍チャレンジマウスに対応した（図１３）。シスプラチン処置単独（陰性対照＋シスプラチン、ｄ２４、図１５Ｋ）は、主にＥ７に対する、および一部のマウスにおいてＥ１への、一部の抗ＨＰＶ応答性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導するように見えたが、細胞あたりのＩＦＮ－γのレベル（図１５Ｌ）、およびＴＮＦも産生することができるＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞の量は、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７処置マウスと比較して、明らかに劣っていた（図１５Ｍ）。

【0205】

表面染色分析は、シスプラチン処置が、免疫組織化学的検査の知見をサポートする腫瘍におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の量に対する効果を有するように思われなかったが（データは示さない）、治療用ワクチンが、２４日目および３０日目の両方で、腫瘍における抗原提示ＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を有意に増加させた（図１５Ｎ）ことを明らかにした。我々はまた、Nejad et al. 2016によって報告されたものと同様に、シスプラチン処置を受けたマウスの腫瘍におけるより高いレベルの樹状細胞（ＤＣ）の傾向を理解したが、この差は、分析が、それぞれ、２４日目および３０日目に行われたという事実にも起因し得る。

【0206】

腫瘍制御はＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される
ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、治療用ワクチンおよび腫瘍治療効果に関連するように見えたので、我々は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、実際に、主要なエフェクター細胞型であったかどうかを確認しようとした。明白な腫瘍を有するマウス（１０日目）を、治療用ワクチンおよびシスプラチンで処置し、その後、抗腫瘍応答のエフェクター段階に主に対処するために、２０日目から抗体－細胞枯渇抗体で処置した。我々は、ＣＤ８枯渇が、治療用ワクチンの抗腫瘍効果を完全に消失させたことを理解した（図１６Ａ）。対照的に、我々は、腫瘍微小環境におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞の免疫抑制表現型を潜在的に示す、腫瘍制御の増加をもたらすＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇の傾向（図１６Ａ）を理解した。実際に、我々は、腫瘍浸潤性ＣＤ４＋集団が、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の持続的存在を示す、ほぼＦｏｘＰ３＋サブタイプであり、これが治療用ワクチンによって増加したことを見出した（シスプラチン共処置状況においてのみ有意であった）（図１６Ｂ）。

【0207】

Ａｄベクター化Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７ワクチンは、シスプラチンと組み合わせて、２つのＥ６／Ｅ７合成長鎖参照ペプチドと比較して、増強された生存を提供する
以前の研究は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で製剤化されたＥ７ペプチド、Ｅ７_{４３～７７}による免疫化によって、Ｃ３腫瘍に対する有効性を示した（Sluis et al. 2015；Nejad et al. 2016；Sluis et al. 2015；Zwaveling et al. 2002）。このペプチドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて免疫優性である十分に確立されたＥ７エピトープを含む（Feltkamp et al. 1993）。別のエピトープは、Ｅ６^３４においても報告されているが、これは、優位性が低い。ＨＰＶ＋ Ｃ３腫瘍に対するペプチドワクチンにおける以前に公開された研究は、Ｅ７_{４３～７７}ペプチドのみを含むが、我々は、同様に、我々のワクチン接種比較において、Ｅ６_{４１～６５}ペプチドを含むように選択した。２つのペプチドはまた、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７全体をカバーする１３ペプチドからなる複雑な合成長鎖ペプチドワクチン（臨床開発下の名称ＩＳＡ１０１）の一部でもあり（Melief et al. 2020）、（ｉ）近交系マウス系統とのそれらの適合性に起因して、および（ｉｉ）参照目的のために、選択した（Sluis et al. 2015；Nejad et al. 2016；Sluis et al. 2015；Zwaveling et al. 2002）。

【0208】

マウスを、明白な腫瘍が存在したら（１０日目）、シスプラチン、およびＩＦＡ中で製剤化された２つのペプチドまたは我々のＡｄベクター化Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７のいずれかによる治療用ワクチンで処置した。Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７ワクチンは、ペプチドワクチンよりも高い程度まで腫瘍成長を低減し（図１７Ａ）、有意に良好な生存をもたらした（図１７Ｂ）。Ｅ１に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるワクチン接種後に検出し、予想通り、２つのＥ６／Ｅ７ペプチドによるワクチン接種後には検出しなかった（図１７Ｃ）。両ワクチンは、同様のレベルのＥ７特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導し（図１７Ｄ）、検出可能なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導しなかった（データは示さない）。

【0209】

Ａｄ５Ｆ３５ベクター化ＨＰＶ１６ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７によるワクチン接種は、マウスにおいてＡｄ５と同様の大きさおよび質のＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導する
Ａｄ５Ｆ３５が、ブースターベクターとしてＡｄ５に対する有用な代替であることを確認するために、近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２×１０^７ＩＦＵのＨＰＶ１６ Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７をコードするＡｄ５またはＡｄ５Ｆ３５ベクターのいずれかで免疫した。ＨＰＶ１６ Ｅ１およびＥ７に対する脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって、免疫１４日後に分析した。

【0210】

図１８に示されるように、Ａｄ５Ｆ３５は、Ｅ１およびＥ７反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を作成することができ、ＩＦＮ－γシグナルの強度によって評価される（図１８ＥおよびＦ）大きさ（図１８ＡおよびＢ）および質、ならびにＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの両方を産生する能力（図１８ＣおよびＤ）は、Ａｄ５ベクター化ワクチンによって誘導される応答と類似していた。これは、Ａｄ５Ｆ３５が、治療効果に影響を及ぼすことなく、治療用プライム－ブースト免疫化レジメンにおいてＡｄ５を置き換えることができるという証拠を提供する。

【0211】

［実施例５］
本発明の追加のウイルスベクターおよびそれらの発現制御
材料および方法
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＡ５４９細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）が補充されたダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で維持し、成長させた。９Ｅ１０ ｍｙｃｌハイブリドーマ細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２ｍＭのグルタミン（Ｐａｎ）が補充されたＲＰＭＩ中で培養した。これらの細胞株を、非加湿インキュベーターにおいて、３７℃および５％のＣＯ_２で維持した。

【0212】

接着ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞を、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養し、非加湿インキュベーターにおいて、３７℃および８％のＣＯ_２で維持した。

【0213】

サブコンフルエントなＡ５４９細胞に、任意の補充なしのＤＭＥＭ中、１００のＭＯＩでＡｄ１９ａ／６４ベクターを感染させた。感染２時間後、培地を、１０％のＦＣＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭに交換した。

【0214】

サブコンフルエントなＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、任意の補充なしのＤＭＥＭ中、１０のＭＯＩでＭＶＡおよびＭＶＡ－ＣＲ１９ベクターを感染させた。感染２時間後、培地を、１０％のＦＣＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭに交換した。

【0215】

サブコンフルエントなＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞に、任意の補充なしのＤＭＥＭ中、１のＭＯＩでＭＶＡおよびＭＶＡ－ＣＲ１９ベクターを感染させた。感染２時間後、培地を、５％のＦＣＳが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて、ＤＭＥＭに交換した。

【0216】

アデノウイルスベクターの作成
血清型Ａｄ１９ａ／６４のＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターを、以前に記載されたようにして作成した［Ruzsics, Z., Lemnitzer, F. & Thirion, C. Engineering Adenovirus Genome by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Technology BT - Adenovirus: Methods and Protocols. in (eds. Chillon, M. & Bosch, A.) 143-158 (Humana Press, 2014). doi:10.1007/978-1-62703-679-5_11］。簡潔には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）－（図１）を、ＣＭＶプロモーターの制御下のシャトルベクターｐＯ６－１９ａ－ＨＣＭＶ－ＭＣＳにクローニングした。次いで、ＣＭＶ－ＧＯＩ－ＳＶ４０－ｐＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＦｌｐ組換えを介して、Ｅ１／Ｅ３遺伝子が欠失した複製欠損Ａｄ系ベクターのゲノムを含有するＢＡＣベクター（Ruzsics, Z. et al, 2014）に移入した。組換えウイルスＤＮＡを、ＰａｃＩによる制限消化によって、精製ＢＡＣ－ＤＮＡから放出させた。得られた線状ＤＮＡを、ウイルス繁殖のために、上記に開示された産生細胞株にトランスフェクトした。組換えウイルスを、デオキシコール酸ナトリウム処理を介して、細胞から放出させた。残った遊離ＤＮＡを、ＤＮａｓｅ Ｉによって消化した。その後、ベクターを、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離法、それに続いてＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国）を介した１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および４％のスクロースへの緩衝液交換によって精製した。タイトレーションを、抗ヘキソン抗体［Ｎｏｖｕｓ、アデノウイルス抗体（８Ｃ４）］による免疫組織化学的染色を介した感染した産生細胞の検出によるＲａｐｉｄＴｉｔｅｒ法を使用して行った。挿入物の完全性を、精製されたベクターから抽出されたＤＮＡ中のＧＯＩのＰＣＲ増幅によって確認した。

【0217】

組換えＭＶＡベクターの作成
組換えＭＶＡベクターを、以前に記載されたようにして作成した［Jordan, I., Horn, D., Thiele, K., Haag, L., Fiddeke, K., Sandig, V., Virol Sin. 2020 Apr; 35(2): 212-226. doi: 10.1007/s12250-019-00176-3.］。簡潔には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）－（図１）を、ＭＶＡ Ｅ／Ｌプロモーターの制御下のＭＶＡの欠失部位ＩＩＩ（ＤｅｌＩＩＩ）へのＧＯＩの組み込みに好適なシャトルベクターＳＰ－ＣＲ１９ＩＩＩ－ｔｅｔＯにクローニングしたか、またはＭＶＡ ＳＳＰプロモーターの制御下のＭＶＡのチミジンキナーゼ遺伝子座（ＴＫ）へのＧＯＩの組み込みに好適なシャトルベクターＬＺＡＷ１－ｔｅｔＯにクローニングした。異なるＧＯＩをコードする組換えＭＶＡを、Ｔｅｔシステム（上記を参照されたい）の利点を取ることによって、組換えＭＶＡの作成および繁殖の間のＧＯＩの望ましくない発現を防止する接着ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ細胞における相同組換えによって作成した。したがって、６ウェルプレートに播種された培養単層に、０．０５のＭＯＩで、ＭＶＡまたはＭＶＡ－ＣＲ１９を感染させ、製造業者の指示に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して、２μｇの個々のシャトルベクターでトランスフェクトした。感染／トランスフェクトされた培養物を、感染／トランスフェクション２～３日後に回収し、超音波処理し、６ウェルプレートフォーマットにおける細胞単層の感染のために使用した。得られたプラークをＰＣＲによって検証し、反復プラーク精製手順を、正確なＧＯＩ発現カセットなしのＭＶＡがもはや存在しなくなるまで（通常、５～８ラウンド以内のプラーク精製）、開始した。

【0218】

プラーク精製ＭＶＡの繁殖のために、細胞回収材料を、Ｖｉａｌ Ｔｗｅｅｔｅｒ（２０秒の１００％のサイクルおよび９０％の振幅に設定、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ、ドイツ）を使用して超音波処理し、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ－Ｔ－ＲＥｘ［ＣＤ－Ｕ４およびＣＤ－ＶＰ４（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の１：１混合物中、１ｍｌあたり２×１０^６個細胞の懸濁液中で成長］に、０．０５のＭＯＩで、個々の組換えＭＶＡベクターを接種した。最後に、ＭＶＡを、感染４８時間～７２時間後に回収し、ＴＣＩＤ_５０力価を決定した。

【0219】

抗体および抗体精製
ｍｙｃ（９Ｅ１０）に対する抗体を、ハイブリドーマ細胞上清から得た。９Ｅ１０ ｍｙｃｌハイブリドーマ細胞を、１％のＦＣＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２ｍＭのグルタミンが補充されたＲＰＭＩ中、１ｍｌあたり５×１０^５個細胞で播種した。上清を、播種５日後に回収し、抗体を、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国）を介して精製した。カラムをＰＢＳで洗浄した後、抗体を、０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．２）を用いて溶出させ、０．０２５容量の１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。

【0220】

使用された他の抗体は以下であった：抗ＨＰＶ１６－Ｅ２（ＴＶＧ－２７１、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗ＨＰＶ１６－Ｅ６（ＧＴＸ１３２６８６、１：２０００、Ｂｉｏｚｏｌ、Ｅｃｈｉｎｇ、ドイツ）、抗ＨＰＶ１６－Ｅ７（ＮＭ２、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗ＨＰＶ１８－Ｅ２（２Ｅ７、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、イングランド）、抗ＨＰＶ１８－Ｅ６（Ｃ１Ｐ５、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗ＨＰＶ１８－Ｅ７（Ｆ－７、１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、抗チューブリン（ＤＭ１α、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、ヤギ抗マウス－ＨＲＰ（１１５－０３６－００３、１：５０００、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、米国）およびヤギ抗ウサギ－ＨＲＰ（Ｐ０４４８、１：２０００、Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、米国）。

【0221】

ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を、以前に記載されたようにして行った（Kiener, R. et al. Vaccine vectors based on Adenovirus 19a/64 exhibit broad cellular tropism and potently restimulate HCMV-specific T cell responses ex vivo. Sci. Rep. 8, 1474, 2018）。簡潔には、目的の細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）が補充されたＴＤＬＢ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、１％のＮｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ－４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）に溶解した。上清の総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（タンパク質アッセイ、ＢｉｏＲａｄ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）によって測定した。タンパク質を、還元条件下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ウエスタンブロット分析のために、ニトロセルロース膜上でブロッティングした。標的を、上記に列挙した一次抗体および二次抗体を用いて検出した。ＨＲＰ標識二次抗体および増強された化学発光基質またはＦｅｍｔｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）を、Ｃｈｅｍｉｌｕｘ Ｐｒｏデバイス（Ｉｎｔａｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）において、検出のために使用した。ローディング対照のために、膜を、チューブリンに対する抗体で再検出した。

【0222】

結果
ＭｆＰＶ３抗原の最初の結果に基づいて、組換えＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８抗原のセットを含むｒＡｄベクターの精密パネルを作成した。コードされる抗原の適した発現を確認するために、ウエスタンブロット分析を、アデノウイルスで形質導入されたＡ５４９細胞を用いて行った。すべてのベクターは、予想される位置でＥ２、Ｅ６およびＥ７に対する抗体を用いて検出されるそれぞれの融合タンパク質に似ているバンドを有する抗原を容易に発現した（ＨＰＶ１６抗原 図１９Ａ、ＨＰＶ１８抗原 図１９Ｂ）。特に、ＨＰＶ１６抗原について、より低い分子量バンドによって示される分解産物が観察できた。

【0223】

ＭｆＰＶ３（Ｉｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７、Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７）、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８（両方ともＩｉ－Ｅ１Ｅ２Ｅ６Ｅ７）の選択された抗原を、それぞれ、ＭＶＡまたはＭＶＡ－ＣＲ１９のＤｅｌＩＩＩ遺伝子座またはＴＫ遺伝子座への組み込みのために、 シャトルベクターにクローニングした。組換えポックスウイルスベクターを、相同組換えによって作成し、コードされる抗原の適した発現を、ウエスタンブロット分析によって検証した（図２０）。すべてのベクターは、予想される位置で、ｍｙｃに対する抗体（ＭｆＰＶ３、図２０Ａ）、または型特異的なＥ２、Ｅ６およびＥ７に対する抗体を用いて検出されるそれぞれの融合タンパク質に似ているバンドを有する抗原を容易に発現した（ＨＰＶ１６抗原 図２０Ｂ、ＨＰＶ１８抗原 図２０Ｃ）。特に、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８抗原について、より低い分子量バンドによって示される分解産物が観察できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【国際調査報告】