特表 2024-532876 プライマリー免疫細胞を作製するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】プライマリー免疫細胞を作製するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240903BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240903BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240903BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240903BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240903BHJP

   C12N 15/38 20060101ALN20240903BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61P43/00 105

A61P37/02

A61P35/00

C12N15/09 100

C12N5/0783

C12N15/62 Z

C12N15/38

C12N15/867 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024511996

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 EP2022073626

(87)【国際公開番号】W WO2023025862

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/236,443

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】マルホトラ，ディーパリ

(72)【発明者】

【氏名】オーバーストリート，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ムーディ，ゴードン

(72)【発明者】

【氏名】コボルド，マーク

(72)【発明者】

【氏名】ボンダンザ，アッティリオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB21

4C087ZB26

(57)【要約】

本開示は、養子細胞療法用の細胞集団及び組成物を調製するための方法、細胞及び組成物に関する。特に、Ｔ細胞集団を含むプライマリー免疫細胞の増加及び増殖のための方法が本明細書中で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、
（ａ）プライマリー免疫細胞に対して１つ以上の遺伝子編集を導入し；
（ｂ）培地中で前記プライマリー免疫細胞を培養すること；
を含み、
前記培養が、前記プライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、
方法。

【請求項2】

前記１つ以上の遺伝子編集を前記プライマリー免疫細胞に導入する前に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記１つ以上の遺伝子編集を前記プライマリー免疫細胞に導入した後に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害することをさらに含む、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記内因性調節因子が、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害することをさらに含む、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記内因性免疫関連遺伝子がベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

１つ以上の遺伝子編集の導入が、抗アポトーシス因子又はウイルス由来因子をコードする１つ以上の導入遺伝子を前記プライマリー免疫細胞に導入することを含む、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記抗アポトーシス因子が、巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）又はＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）の何れかである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ウイルス由来因子が、サイミリイン・ガンマヘルペスウイルス（Ｓａｉｍｉｒｉｉｎｅ ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）２ ＳｔｐＡ Ａ１１、ヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）ＳｔｐＣヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）Ｔｉｐ又は修飾されたヘルペスウイルス・アテレス－エプスタイン－バーウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ａｔｅｌｅｓ－Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）Ｔｉｏ－ＬＭＰ１の何れか１つである、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）の発現を阻害することをさらに含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。

【請求項12】

ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の発現を阻害することをさらに含む、請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記プライマリー免疫細胞が全Ｔ細胞を含む、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記プライマリー免疫細胞が、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び／又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む、請求項１～１５の何れか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記プライマリー免疫細胞がヒトである、請求項１～１６の何れか１項に記載の方法。

【請求項18】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項１～１７の何れか１項に記載の方法。

【請求項19】

プライマリー免疫細胞の前記集団が少なくとも１００日間にわたりＴＣＲ刺激あり又はなしで培養され得る、請求項１～１８の何れか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記プライマリー免疫細胞が培養中に少なくとも約１０^６倍に増加する、請求項１～１９の何れか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記プライマリー免疫細胞が、プライマリー免疫細胞刺激を含まない培地中で培養される、請求項１～２０の何れか１項に記載の方法。

【請求項22】

（ｃ）前記プライマリー免疫細胞を再刺激することをさらに含む、請求項２又は請求項３に記載の方法。

【請求項23】

前記プライマリー免疫細胞が、培養中に少なくとも約１０^８倍に増加する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記導入遺伝子がプラスミドに基づくＤＮＡトランスポゾンを使用して導入される、請求項１～２３の何れか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記導入遺伝子がレンチウイルスプラットフォームを使用して導入される、請求項１～２３の何れか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記導入遺伝子がＣＲＩＳＰＲを介した部位特異的な組み込みを使用して導入される、請求項１～２３の何れか１項に記載の方法。

【請求項27】

複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、
（ａ）前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し
（ここで、前記内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である）；
（ｂ）前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害し
（ここで、前記内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である）；
（ｃ）前記プライマリー免疫細胞を培地中で培養すること
を含み、
前記培養が、前記プライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、方法。

【請求項28】

巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）又はＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）の何れかをコードする導入遺伝子を前記プライマリー免疫細胞に導入することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

１つ以上の遺伝子編集が前記プライマリー免疫細胞に導入される前に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記１つ以上の遺伝子編集が前記プライマリー免疫細胞に導入された後に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項２７～２９の何れか１項に記載の方法。

【請求項31】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）の発現を阻害することをさらに含む、請求項２７～３０の何れか１項に記載の方法。

【請求項32】

ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の発現を阻害することをさらに含む、請求項２７～３１の何れか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記プライマリー免疫細胞が全Ｔ細胞を含む、請求項２７～３２の何れか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、請求項２７～３２の何れか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む、請求項２７～３２の何れか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記プライマリー免疫細胞が、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び／又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む、請求項２７～３２の何れか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記プライマリー免疫細胞がヒトである、請求項２７～３６の何れか１項に記載の方法。

【請求項38】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項２７～３７の何れか１項に記載の方法。

【請求項39】

プライマリー免疫細胞の前記集団が、少なくとも１００日間培養され得る、請求項２７～３８の何れか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記プライマリー免疫細胞が培養中に少なくとも約１０^６倍に増加する、請求項２７～３９の何れか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記プライマリー免疫細胞がプライマリー免疫細胞刺激を含まない培地中で培養される、請求項２７～４０の何れか１項に記載の方法。

【請求項42】

（ｄ）前記プライマリー免疫細胞を再刺激することをさらに含む、請求項２７～４１の何れか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記プライマリー免疫細胞が培養中に少なくとも約１０^８倍に増加する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記導入遺伝子がプラスミドに基づくＤＮＡトランスポゾンを使用して導入される、請求項２７～４３の何れか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記導入遺伝子がレンチウイルスプラットフォームを使用して導入される、請求項２７～４３の何れか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記導入遺伝子がＣＲＩＳＰＲを介した部位特異的な組み込みを使用して導入される、請求項２７～４３の何れか１項に記載の方法。

【請求項47】

複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、
（ａ）前記プライマリー免疫細胞中での１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し
（内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である）；
（ｂ）培地中で前記プライマリー免疫細胞を培養すること
を含み、
前記培養が、前記プライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、方法。

【請求項48】

１つ以上の遺伝子編集が前記プライマリー免疫細胞に導入される前に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記１つ以上の遺伝子編集が前記プライマリー免疫細胞に導入された後に前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項４７又は請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害することをさらに含む、請求項４７～４９の何れか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記内因性免疫関連遺伝子が、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）の発現を阻害することをさらに含む、請求項４７～５１の何れか１項に記載の方法。

【請求項53】

ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の発現を阻害することをさらに含む、請求項４７～５２の何れか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記プライマリー免疫細胞が全Ｔ細胞を含む、請求項４７～５３の何れか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、請求項４７～５３の何れか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記プライマリー免疫細胞がＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む、請求項４７～５３の何れか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記プライマリー免疫細胞が、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び／又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む、請求項４７～５３の何れか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記プライマリー免疫細胞がヒトである、請求項４７～５７の何れか１項に記載の方法。

【請求項59】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項４７～５８の何れか１項に記載の方法。

【請求項60】

プライマリー免疫細胞の前記集団が少なくとも１００日間培養され得る、請求項４７～５９の何れか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記プライマリー免疫細胞が培養中に少なくとも約１０^６倍に増加する、請求項４７～６０の何れか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記プライマリー免疫細胞がプライマリー免疫細胞刺激を含まない培地中で培養される、請求項４７～６１の何れか１項に記載の方法。

【請求項63】

（ｃ）前記プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む、請求項４７又は請求項４８に記載の方法。

【請求項64】

前記プライマリー免疫細胞が、培養中に少なくとも約１０^８倍に増加する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記導入遺伝子がプラスミドに基づくＤＮＡトランスポゾンを使用して導入される、請求項４７～６４の何れか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記導入遺伝子がレンチウイルスプラットフォームを使用して導入される、請求項４７～６４の何れか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記導入遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲを介した部位特異的な組み込みを使用して導入される、請求項４７～６４の何れか１項に記載の方法。

【請求項68】

請求項１～６７の何れか１項に記載の方法に従い作製される、改変された免疫細胞集団。

【請求項69】

請求項６８に記載の改変された免疫細胞集団と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項70】

癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法であって、請求項６９に記載の医薬組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項71】

サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及び／又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）を発現しない、改変されたＴ細胞。

【請求項72】

巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）又はＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）の何れかをコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項７１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項73】

前記プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子を発現しない、請求項７１又は７２に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項74】

前記内因性免疫関連遺伝子が、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である、請求項７３に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項75】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）を発現しない、請求項７１～７４の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項76】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７１～７５の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項77】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はそれらの組み合わせである、請求項７１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項78】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項７１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項79】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞である、請求項７１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項80】

ヒトである、請求項７１～７９の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項81】

サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）を発現しない、改変されたＴ細胞。

【請求項82】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）を発現しない、請求項８１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項83】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８１又は請求項８２に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項84】

ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はそれらの組み合わせである、請求項８１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項85】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項８１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項86】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞である、請求項８１に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項87】

ヒトである、請求項８１～８６の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項88】

巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ＸＬ）をコードする導入遺伝子を発現する改変されたＴ細胞であって、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）及び／又はホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を発現しない、改変されたＴ細胞。

【請求項89】

プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子を発現しない、請求項８８に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項90】

前記内因性免疫関連遺伝子が、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である、請求項８９に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項91】

表面抗原分類３８（ＣＤ３８）を発現しない、請求項８８～９０の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項92】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８８～９１の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項93】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、デルタガンマＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞又はそれらの組み合わせである、請求項８８に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項94】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項８８に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項95】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞である、請求項８８に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項96】

ヒトである、請求項８８～９５の何れか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／２３６，４４３号の優先権を主張し、その開示は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。

【0002】

本開示は、養子細胞療法用の細胞集団及び組成物を調製するための、方法、細胞及び組成物に関する。特に、Ｔ細胞集団を含むプライマリー免疫細胞の増加及び増殖のための方法が本明細書中で提供される。

【背景技術】

【0003】

改変養子細胞療法は、近年、血液悪性腫瘍の患者にとって斬新なものであり、２０１７年にＦＤＡによってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく治療が最初に承認された（非特許文献１；非特許文献２）。２０１７年以来、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＣＡＲ－ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、腫瘍特異的な抗原を標的とするＴ細胞などの養子細胞療法及び他の細胞療法を試験する臨床治験の数が急増している。さらに最近では、最初のＣＡＲ－マクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）が、固形腫瘍の処置に対する臨床段階（ｃｌｉｎｉｃ）に入っている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。

【0004】

細胞療法が患者にとって根治治療となる大きな可能性がある一方で、多くの要因によって、これらの薬物の広範な開発及び投与が限定される。殆どの細胞療法は現在、自家方式で作製され、細胞製品は品質に変動があること、サイトカイン放出症候群及び他の毒性、製造時間の延長、高コスト及びこれらの治療がそれらの有効性を促進するために遺伝子修飾され得る期間が限定的であることが関連する（非特許文献１）。

【0005】

臨床段階（ｃｌｉｎｉｃ）で現在試験されている細胞療法の多くは、ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を利用するが、それは、免疫細胞のこれらのサブセットが強力な細胞傷害性を示すからである。これらの治療のために使用される成熟プライマリーヒトＴ細胞は、ヒトの血液及び二次リンパ器官中で見出され、これらは、感染性疾患及び癌から個体を防御する。Ｔ細胞は、αβ（「古典的」Ｔ細胞）及びγδサブセットから構成される。αβＴ細胞は、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞からなる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＦＨ細胞及び制御性Ｔ細胞にさらに細かく分類され得る。多くのαβＴ細胞サブセットは、細胞療法の開発のために利用されてきた強力な細胞傷害性機能を示す。

【0006】

同様に、細胞療法のために使用され得る成熟プライマリーヒトＮＫ細胞は、血液、二次リンパ器官、肝臓及び粘膜関連リンパ組織、ＮＫ細胞が病原体又は形質転換された細胞の存在について巡回する部位で見出される（非特許文献７）。Ｔ細胞のように、ＮＫ細胞は強力な細胞傷害性機能を示し、細胞療法の開発のための関心対象である。

【0007】

しかし、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などのプライマリーヒト免疫細胞はまた、インビトロ及びインビボでの増殖能が有限であるため、幅広い画一的な細胞療法の作製のために使用されるそれらの能力が限定される。さらに、成熟プライマリーヒト免疫細胞のこの限られた増殖能によって、サイトカイン放出症候群及び他の潜在的な細胞療法に関連する毒性を緩和するための、腫瘍微小環境関連の負荷を克服するための、及び患者における同種細胞療法製品の拒絶を防ぐためのそれらの遺伝子編集性が損なわれる。

【0008】

患者由来の白血病性細胞の細胞株は、細胞培養において数十年にわたり研究されており、それらの形質転換された状態によって長期増殖能が付与され、それにより様々な細胞アッセイにおけるそれらの使用を可能になっている。これは、次に、多くの治療の開発を促進してきた。しかし、これらの細胞は一般に、未成熟であるか又は機能障害性のＴ細胞クローン由来であることが多いため、成熟プライマリーヒトＴ細胞及びＮＫ細胞の強力な細胞傷害性機能を欠く。これらの細胞の形質転換された性質はまた、Ｔ細胞急性リンパ性白血病の患者で高頻度で見られる突然変異の一群上にマッピングされ得る。さらに、非ヒト霊長類からの成熟Ｔ細胞は、患者におけるプライマリーヒトＴ細胞の形質転換に関与する同じ機序のいくつかに収束する経路を通じてヘルペスウイルスによって形質転換され得る（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。

【0009】

以前の試験から、プライマリーヒトＴ細胞がテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型又はヒトＴ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－１／ＨＴＬＶ－２）転写トランス活性化因子タンパク質Ｔａｘ（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）などの因子の過剰発現を通じて、又はヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）（非特許文献８；非特許文献９）及びＨＴＬＶ－１／ＨＴＬＶ－２などのウイルスによって、不死化され得ることが示唆される一方で、これらのアプローチは、あまり再現性がなく、その結果、改変又は感染細胞の再プログラミングが起こり得る。さらに、ＴＥＲＴの過剰発現を通じて増殖寿命が増強されている細胞は、依然として、フィーダー細胞の使用又は増殖を推進するためのそれらのＴ細胞受容体を通じた広範な外因性の刺激を必要とする（非特許文献１３；非特許文献１４）。同種フィーダー細胞及び広範な反復刺激の使用は、これらの方法が、調整することが困難であり、機能不全状態へと細胞を最終的に進め得るので、成熟プライマリーヒトＴ又はＮＫ細胞のバンクを確立する場合には望ましくない。さらに、患者は免疫不全状態であることが多いので、成熟プライマリーヒトＴ又はＮＫ細胞を形質転換する能力がある感染病原体の使用によって、細胞療法の開発でのこれらの細胞の使用が制限される。

【0010】

これらの課題の観点から、同種細胞傷害性細胞の大規模製造を可能にするためのプライマリーヒト免疫細胞の増殖寿命を延長するための代替的な方法を確立することについて大きなニーズがある。本開示は、この満たされていないニーズに対処する方法及び細胞を記載する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｌａｒｓｏｎ ＆ Ｍａｕｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２１，１４５－１６１（２０２１）

【非特許文献2】Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９，５８３－５８４（２０２０）

【非特許文献3】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７，５６１（２０２０）

【非特許文献4】Ｋｌｉｃｈｉｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，９４７－９５３（２０２０）

【非特許文献5】Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９，３０８（２０２０）

【非特許文献6】ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０４６６０９２９

【非特許文献7】Ｊｉａｎｈｕａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４，５７３－５８２（２０１３）

【非特許文献8】Ｂｉｅｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９，３１１６－３１１９（１９９２）

【非特許文献9】Ｗｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，１１０４９－１１０５３（１９９３）

【非特許文献10】Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ，Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ．，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．３５６（１４０８）：５４５－６７（２００１）

【非特許文献11】Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０３（２）：３０５－１８（２００５）

【非特許文献12】Ｂａｒｓｏｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５１１，１４３－５８（２００９）

【非特許文献13】Ｒｕｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８，５９７－６０３（２００１）

【非特許文献14】Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，４２３９－４５（２０００）

【非特許文献15】Ａｋａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４，２０７１－２０８０（１９９７）

【非特許文献16】Ｇｒａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，３３５１－３３５５（１９８９）

【非特許文献17】Ｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，３４６８３－３４６９３（２０１２）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）１つ以上の遺伝子編集をプライマリー免疫細胞に導入し；（ｂ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養することを含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。

【0013】

本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、（ａ）プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し（ここで、内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である）；（ｂ）プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害し（ここで、内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である）；（ｃ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養が、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、方法も提供する。

【0014】

本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、（ａ）プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し（ここで、内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である）；（ｂ）プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害し（ここで、内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である）；（ｃ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養が、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、方法も提供する。

【0015】

本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法であって、（ａ）プライマリー免疫細胞中での１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し（ここで、内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である）；（ｂ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養が、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる、方法を提供する。

【0016】

本明細書中の開示は、記載される方法に従い作製される改変された免疫細胞集団も提供する。本明細書中の開示は、上述の改変された免疫細胞集団と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物をさらに提供する。本明細書中の開示は、癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法であって、治療的有効量の上述の医薬組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0017】

本明細書中の開示は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）を発現しない改変されたＴ細胞を提供する。

【0018】

本明細書中の開示は、巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ＸＬ）をコードする導入遺伝子を発現する改変されたＴ細胞を提供し、この改変されたＴ細胞は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）及び／又はホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を発現しない。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】［図１Ａ－１Ｂ］図１Ａ～１Ｂは、Ｂｃｌ－ｘＬ挿入が長期培養におけるＴ細胞生存に対する選択優位性を付与したことを示す。全プライマリーヒトＴ細胞（図１Ａ）又は精製プライマリーヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１Ｂ）を、図２に記載のように、単離し、刺激し、遺伝子移入し、再刺激した。

【図2】図２は、プライマリーヒトＴ細胞において生存増強導入遺伝子を同定するための方法を示す。

【図3】［図３Ａ－３Ｂ］図３Ａ～３Ｂは、細胞周期制御分子の発現の消失によって、長期培養におけるＴ細胞の増殖能が増強されたことを示す。

【図4】［図４Ａ－４Ｄ］図４Ａ～４Ｄは、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の再刺激によって、長期培養においてそれらの増殖が促進され得ることを示す。図４Ａは、経時的なＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の全体の倍数増加を示す。図４Ｂ－４Ｄは、細胞からビーズを除去（ｄｅｂｅａｄｅｄ）した後３日間、αＣＤ３又はαＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで再刺激したＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の全体の倍数増加を示す。全体の倍数増加を追跡し、経時的に休止及び処置細胞に対してグラフを作成した。矢印は、再刺激の期間を示す。黒矢印は、さらなる再刺激様式の評価の時間点を示す。図４Ａ～４Ｄは、対数スケールを示す。

【図5】［図５Ａ－５Ｂ］図５Ａ～５Ｂは、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が細胞培養における増加及び生存に対してＩＬ－２に依存することを示す。６日間にわたり組み換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）の漸増量の存在下で増殖させた２種類の異なるドナーから図３のように確立された３種類のＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株について、全体の倍数増加（図５Ａ）及び細胞生存能（図５Ｂ）を評価した。

【図6】［図６Ａ－６Ｋ］図６Ａ～６Ｋは、正常プライマリーヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞と表現型が似ているＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を示す。固定できる生存能色素並びにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＰＤ１及びＴＩＧＩＴに対する抗体のパネルでＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を染色した。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、ＣＤ３（図６Ａ）の発現を示し、高頻度のＣＤ８^＋細胞を含む（図６Ｂ）。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、Ｂｃｌ－ｘＬ過剰発現（ＧＦＰ^＋及びＧＦＰ^－細胞）に関係なく、ＰＤ１及びＴＩＧＩＴ（図６Ｃ）、ＣＤ２８（図６Ｄ）及びＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯ（図６Ｅ）などのマーカーの発現により例示されるように、ドナー又は細胞株特異的な属性を示した。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、ＣＣＲ２（図６Ｆ）、ＣＣＲ５（図６Ｇ）及びＣＸＣＲ３（図６Ｊ）の発現を示す。ＣＣＲ６（図６Ｈ）の発現は不均一であり、一方でＣＣＲ７（図６Ｉ）及びＣＸＣＲ５（図６Ｋ）の発現は、低～なしであった。

【図7】［図７Ａ－７Ｆ］図７Ａ～７Ｆは、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が細胞傷害性であることを示す。パーセント細胞溶解をエフェクター細胞及びＴ細胞エンゲージャー又は対照抗体の添加後１２時間（図７Ａ）及び２４時間（図７Ｂ）で計算した。エフェクター細胞及びＴ細胞エンゲージャーの添加後７２時間の同時培養から上清を回収し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）（図７Ｃ）、ＩＬ－２（図７Ｄ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）（図７Ｅ）及びグランザイムＢ（図７Ｆ）の存在について分析した。

【図8】［図８Ａ－８Ｇ］図８Ａ～８Ｇは、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が機能的ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を産生し得ることを示す。フローサイトメトリーを使用して、形質導入の２２日後に表面ＣＡＲ発現を評価した（図８Ａ）。エフェクター細胞の添加後、１２時間（図８Ｂ）及び２４時間（図８Ｃ）でパーセント細胞溶解を計算した。ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性に対して、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ活性を評価した。エフェクター細胞の添加後７２時間で同時培養物から上清を回収し、ＩＦＮ－γ（図８Ｄ）、ＩＬ－２（図８Ｅ）、ＴＮＦ－α（図８Ｆ）及びグランザイムＢ（図８Ｇ）の存在について分析した。

【図9】［図９Ａ－９Ｃ］図９Ａ～９Ｃは、Ｔ_ＲＥＸ細胞がプライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞と同様の位置に行き、インビボでＩＬ－２に応答することを示す。

【図10】［図１０Ａ－１０Ｂ］図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞がインビボでＩＬ－２及びＩＬ－１５に応答することを示す。

【図11】［図１１Ａ－１１Ｄ］図１１Ａ～１１Ｄは、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞がインビボで固形腫瘍を標的とすることを示す。

【図12】図１２は、ＲＥＸ編集再現性が、未修飾の同一ドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、インビトロ増殖の促進をもたらすことを示す。Ｔ_ＲＥＸ細胞又は同一ドナーのプライマリー（未編集）ＣＤ８＋Ｔ細胞の倍数増加を４名のさらなる健康なドナーについて経時的に追跡した。

【図13】［図１３Ａ－１３Ｂ］図１３Ａ及び１３Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が未修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様にＢＣＭＡ＋腫瘍細胞を標的とすることを示す。

【図14】図１４は、ＣＡＲ会合後、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ及び抗ＨＥＲ２－Ｔ_ＲＥＸ細胞が産生する炎症性サイトカインのレベルが、抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞及び抗ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低いことを示す。

【図15】図１５は、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞がＢＣＭＡ＋腫瘍細胞を標的とし、連続死滅アッセイ（ｓｅｒｉａｌ ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）で持続し、ＩＬ－２に応答することを示す。

【図16】図１６は、Ｔ_ＲＥＸ細胞表現型が、編集の異なる組み合わせを使用して作製され得ることを示す。

【図17】図１７は、Ｔ_ＲＥＸ細胞が予想される遺伝子座で編集されることを示す。

【図18】［図１８Ａ－１８Ｃ］図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃは、Ｔ_ＲＥＸ 細胞が細胞周期関連遺伝子シグネチャーに富むことを実証することを示す。

【図19】図１９は、Ｔ_ＲＥＸ細胞が生存及び増殖について、ＩＬ－２に依存することを示す。

【図20】［図２０Ａ－２０Ｂ］図２０Ａ及び２０Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が、サイトカイン産生全体がより小さい未修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様にＨＥＲ２ｈｉ腫瘍細胞を標的とすることを示す。

【図21】図２１は、ＲＥＸ編集がＣＤ４＋Ｔ_ＲＥＸ細胞の増殖能を増強することを示す。

【図22】図２２は、γδＴ_ＲＥＸ細胞がＲＥＸ編集を使用して作製され得ることを示す。

【図23】図２３は、インビトロでＴ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）アッセイにおいてγδＴ_ＲＥＸ細胞が活性であることを示す。

【図24】図２４は、複数のγδＴ細胞サブセットからγδＴ_ＲＥＸ細胞が作製され得、ＣＡＲ形質導入後に多様性が維持されることを示す。

【図25】［図２５Ａ－２５Ｂ］図２５Ａ及び２５Ｂは、γδ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が未修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様にＢＣＭＡ＋腫瘍細胞を標的とすることを示す。

【図26】図２６は、ＮＫ細胞におけるＲＥＸ編集がＮＫ_ＲＥＸ細胞表現型を支援することを示す。

【図27】図２７は、ＮＫ_ＲＥＸ細胞が増殖及び生存に対するサイトカインに依存することを示す。

【図28】図２８は、ＮＫ_ＲＥＸ細胞が経時的にＣＡＲ発現を維持することを示す。

【図29】［図２９Ａ－２９Ｃ］図２９Ａ～２９Ｃは、ＮＫ_ＲＥＸ細胞がインビトロで細胞傷害性であり、ＣＡＲ発現が効力をさらに増強し得ることを示す。

【図30】図３０は、Ｔ_ＲＥＸ細胞がＴ細胞枯渇剤及び化学療法に感受性があることを示す。

【図31】図３１は、Ｂ２ＭＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞がＮＫ細胞介在性枯渇に感受性があり、これが抗ＣＤ３８抗体を使用して調整され得ることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本開示は、養子細胞療法のための細胞集団及び組成物を調製するための、方法、細胞及び組成物に関する。特に、Ｔ細胞集団を含むプライマリー免疫細胞の増加及び増殖のための方法が本明細書中で提供される。

【0021】

本開示に従って利用される通り、別段の指示がない限り、全ての科学技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有するように理解されるものとする。別途文脈により求められない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。

【0022】

本明細書中で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」並びにこれらの変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）という用語は、記載された構成要素、特徴、要素若しくは段階又は構成要素群、特徴群、要素群若しくは段階群を含むが、何らかの他の構成要素、特徴、要素若しくは段階又は構成要素群、特徴群、要素群若しくは段階群を除外しないことを示すと理解されるであろう。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語の何れも、それらの通常の意味を保持しながら、他の２つの用語の何れかと置き換えられ得る。

【0023】

本明細書中で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象形を含む。

【0024】

本明細書中で開示されるパーセンテージは、開示された値から±１０、２０又は３０％の量で変動し得、企図される開示の範囲内に留まる。

【0025】

別段の指示がない限り又は文脈及び当業者の理解から別段明らかとならない限り、範囲として表される本明細書中の値は、内容から別段明らかに示されない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本開示の様々な実施形態において記載される範囲内のあらゆる具体的な値又は部分範囲と見なし得る。

【0026】

本明細書中で使用される場合、範囲及び量は、「約」特定の値又は範囲として表し得る。「約」という用語は、正確な量も含む。例えば、「約５％」は、「約５％」を意味し、また「５％」も意味する。「約」という用語は、所与の値又は値の範囲の±１０％も指し得る。従って、約５％は、例えば、４．５％～５．５％をも意味する。文脈から別段明確でない限り、本明細書中で提供される全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。

【0027】

本明細書で使用する場合、「又は」及び「及び／又は」という用語は、複数の構成要素を組み合わせて又は互いに排他的に記述し得る。例えば、「ｘ、ｙ及び／又はｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ及びｚ」、「（ｘ及びｙ）又はｚ」、「ｘ又は（ｙ及びｚ）」又は「ｘ又はｙ又はｚ」を指し得る。複製老化抵抗性（ＲＲＳ）は、集団倍増の有限数につながる複製老化（ＲＳ）に抵抗性があるプライマリー免疫細胞を指す。結果として、本明細書中に記載のプライマリー免疫細胞の集団は有利に、増殖能が増加している。

【0028】

一態様では、本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法を提供し、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞への１つ以上の遺伝子編集の導入；及びｉｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養することを含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。

【0029】

一態様では、本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法を提供し、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞への巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）をコードする導入遺伝子を導入し；ｉｉ）プライマリー免疫細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及びＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）から選択される１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し；ｉｉｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。いくつかの態様では、本方法は、プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害することを含む。ある特定の態様では、内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である。いくつかの態様では、本方法は、ＣＤ３８の発現を阻害することを含む。

【0030】

一態様では、本明細書中の開示は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法を提供し、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及びＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）から選択される１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害し；ｉｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。いくつかの態様では、本方法は、プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害することを含む。ある特定の態様では、内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である。いくつかの態様では、本方法は、ＣＤ３８の発現を阻害することを含む。

【0031】

遺伝子編集は、プライマリー免疫細胞の遺伝物質に対する変化を指す。遺伝子編集は、遺伝物質が添加されるか、除去されるか又は変化させられることを含む。特定の態様では、遺伝子編集は、プライマリー免疫細胞に導入遺伝子を導入すること及び／又はプライマリー免疫細胞における遺伝子の発現を阻害することを含む。特定の態様では、１つ以上の遺伝子編集を導入することは、プライマリー免疫細胞に抗アポトーシス因子又はウイルス由来因子をコードする１つ以上の導入遺伝子を導入することを含む。

【0032】

「プライマリー免疫細胞」という用語は、Ｔ細胞、Ｂ－細胞及びＮＫ細胞、好中球及び単球／マクロファージ／樹状細胞などの一次免疫応答に関与する何れかの細胞を指し得る。いくつかの態様では、プライマリー免疫細胞は、総Ｔ細胞、ＣＤ４－陽性Ｔ細胞、ＣＤ８－陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含み得る。

【0033】

「導入遺伝子」という用語は、実験操作により細胞に導入される何らかの核酸配列を指す。導入遺伝子は、「内因性ＤＮＡ配列」又は「異種ＤＮＡ配列」であり得る。導入遺伝子は、単離され得、当技術分野で周知である１つ以上の方法を使用して適切な量で得られ得る。これらの方法及び導入遺伝子を単離するために有用な他のものが、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （前出）及びＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８７））に記載されている。

【0034】

導入遺伝子は、時間的又は細胞特異的な又は関心対象の導入遺伝子の発現増強の何れかに対して必要とされる他の制御ＤＮＡ配列とともに関心対象の遺伝子を含む「導入遺伝子コンストラクト」に組み込まれ得る。

【0035】

導入遺伝子は、当技術分野で公知の何れかの適切な方法又は技術によって細胞に導入され得る。特定の態様では、導入遺伝子は、プラスミドに基づくＤＮＡトランスポゾン、レンチウイルスプラットフォーム又はＣＲＩＳＰＲを介した部位特異的な組み込みを使用して導入される。細胞における導入遺伝子発現は、構成的又は誘導性であり得る。

【0036】

特定の態様では、導入遺伝子は、抗アポトーシス因子をコードする。「抗アポトーシス因子」は、細胞、特にストレスを受けたことがある細胞、アポトーシスを受けるためのシグナルを受けた細胞又は異常な細胞増殖が起こっている細胞のアポトーシスを防ぐために作用するタンパク質又はオリゴヌクレオチド（タンパク質又はサイレンシングヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチドであり得る）を指す。特定の態様では、抗アポトーシス因子は、巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）又はＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）である。

【0037】

特定の態様では、導入遺伝子は、ウイルス由来因子をコードする。「ウイルス由来因子」は、天然のウイルスペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の両方並びにウイルスタンパク質に対する配列同一性及び／又は類似性の度合いを示す及び／又はウイルスタンパク質の１つ以上の構造、機構又は抗原的な品質を維持する、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。特定の態様では、ウイルス由来因子は、サイミリイン・ガンマヘルペスウイルス（Ｓａｉｍｉｒｉｉｎｅ ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）２ ＳｔｐＡ Ａ１１、ヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）ＳｔｐＣ、ヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）Ｔｉｐ又は修飾されたヘルペスウイルス・アテレス－エプスタイン－バーウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ａｔｅｌｅｓ－Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）Ｔｉｏ－ＬＭＰ１由来である。

【0038】

他の態様では、導入遺伝子は、細胞における活性化シグナルに関連するタンパク質をコードする。

【0039】

いくつかの態様では、本開示の方法は、内因性調節因子の活性が排除されるか又は低減されるようにプライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性調節因子の発現を阻害することをさらに含む。本明細書中で使用される場合、「調節因子」は、細胞周期停止、細胞死又はシグナル抑制を調節することに関与するタンパク質をコードする遺伝子を指す。内因性調節因子は、当技術分野で公知の何れかの適切な方法又は技術によって、下方制御され得るか又は遮断され得る。遺伝子発現の下方制御又は因子の活性の低下のための公知の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（シトシン及びアデニン塩基エディターを含む）、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、中和抗体、低分子阻害剤、下流シグナル伝達経路を阻止する化学阻害剤などを含むが限定されない。内因性調節因子の阻害は、完全阻害、部分的阻害、遺伝子発現の下方制御又は因子の活性の低下であり得る。いくつかの態様では、内因性調節因子活性又は遺伝子発現は、１％～１００％（即ち、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）低下する。調節因子は、細胞周期停止、細胞死又はシグナル抑制の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。特定の態様では、１つ以上の内因性調節因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及び／又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）である。特定の態様では、１つ以上の内因性調節因子は、ＲＢ転写コアプレッサー１（ＲＢ１）、ＴＰ５３、オートファジー及びベクリン１調節因子１（ＡＭＢＲＡ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、チロシン－タンパク質ホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）又はサイトカインシグナル伝達１のサプレッサー（ＳＯＣＳ１）である。

【0040】

「内因性」という用語は、細胞、組織若しくは生物又は、細胞、組織若しくは生物の一部内で発生するか又はそこに起源を持つことを指す。

【0041】

いくつかの態様では、本開示の方法は、免疫関連遺伝子の活性が排除されるか又は低下させられるようにプライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子の発現を阻害することをさらに含む。本明細書中で使用される場合、「免疫関連遺伝子」という用語は、免疫反応を引き起こすことに関与するタンパク質をコードする遺伝子を指す。ある特定の態様では、免疫関連遺伝子は、宿主対移植片（ＨｖＧ）及び移植片対宿主（ＧｖＨ）同種免疫反応に関与するタンパク質をコードする。免疫関連遺伝子は、当技術分野で公知の何れかの適切な方法又は技術により、下方制御され得るか又は阻止され得る。遺伝子発現の下方制御又は免疫関連遺伝子の活性の低下のための既知の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（シトシン及びアデニン塩基エディターを含む）、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、中和抗体、低分子阻害剤、下流シグナル伝達経路を阻止する化学阻害剤などを含むが限定されない。内因性免疫関連遺伝子の阻害は、遺伝子発現の、完全阻害、部分阻害、下方制御又は因子の活性の低下であり得る。いくつかの態様では、内因性免疫関連遺伝子活性又は遺伝子発現は、１％～１００％（即ち１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）低下する。免疫関連遺伝子は、免疫反応を引き起こすことに関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。免疫関連遺伝子は、宿主対移植片（ＨｖＧ）及び移植片対宿主（ＧｖＨ）同種免疫反応に関与するタンパク質をコードし得る。特定の態様では、１つ以上の内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である。特定の態様では、１つ以上の内因性免疫関連遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原クラスＩ遺伝子（例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）、ヒト白血球抗原クラスＩＩ遺伝子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰ）、Ｔ細胞受容体（例えばαβＴ細胞受容体）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ９－１１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２７、プログラム死－１（ＰＤ－１）、ＴＩＭ３又はＴＩＧＩＴの遺伝子である。

【0042】

さらなる態様では、本明細書中で開示される方法は、ＣＤ３８の活性が排除されるか又は低下させられるようにプライマリー免疫細胞における表面抗原分類３８（ＣＤ３８）発現を阻害することを含む。ＣＤ３８は、当技術分野で公知の何れかの適切な方法又は技術によって、下方制御又は遮断され得る。遺伝子発現の下方制御又はＣＤ３８の活性の低下のための既知の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（シトシン及びアデニン塩基エディターを含む）、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、中和抗体、低分子阻害剤、下流シグナル伝達経路を阻止する化学阻害剤などを含むが限定されない。いくつかの態様では、ＣＤ３８活性又は遺伝子発現は、１％～１００％（即ち、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）低下する。

【0043】

さらなる態様では、本明細書中で開示される方法は、ＰＴＥＮの活性が排除されるか又は低下させられるようにプライマリー免疫細胞におけるホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の発現を阻害することを含む。ＰＴＥＮは、当技術分野で公知の何れかの適切な方法又は技術によって、下方制御され得るか又は遮断され得る。遺伝子発現の下方制御又はＰＴＥＮの活性の低下のための既知の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（シトシン及びアデニン塩基エディターを含む）、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、中和抗体、低分子阻害剤、下流シグナル伝達経路を遮断する化学阻害剤などを含むが限定されない。いくつかの態様では、ＰＴＥＮ 活性又は遺伝子発現は、１％～１００％（即ち、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）低下する。

【0044】

「Ｔ_ＲＥＸ」という用語は、例えば本明細書中で提供される技術及び遺伝子修飾を使用して、「再生可能に増加可能なＴ細胞」を指す。より具体的に、Ｔ_ＲＥＸ細胞は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ ＣＤＫＮ２Ｂ及びＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）のうち一部又は全ての発現が低下しているか又は切断された細胞を指す。

【0045】

いくつかの態様では、１つ以上の内因性調節因子の発現の阻害は、１つ以上の導入遺伝子を細胞に導入した後に起こる。いくつかの態様では、１つ以上の導入遺伝子が導入されているプライマリー免疫細胞は、１つ以上の内因性調節因子の阻害が行われる前に、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日間培養される。さらなる態様では、ＰＴＥＮの発現の阻害は、１つ以上の導入遺伝子を細胞に導入した後に起こる。いくつかの態様では、本方法は、次の連続段階、ｉ）１つ以上の導入遺伝子を免疫細胞に導入し、次いでこの細胞を少なくとも２日、５日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日間培養し；ｉｉ）１つ以上の内因性調節因子を阻害し、少なくとも２日、５日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日間この細胞を培養し；ｉｉｉ）ＰＴＥＮ発現を阻害する、段階を含む。

【0046】

プライマリー免疫細胞は、増殖及び増加を促進するために適切な条件下で培養される。培養段階を使用したインビトロ増加は、プライマリー免疫細胞の増殖を活性化及び誘導して、治療での使用のための数に十分なプライマリー免疫細胞を含む拡大された集団を得る。

【0047】

本明細書中で開示される方法は、この方法が生物の外で行われることを意味するエクスビボで行われる。エクスビボでの免疫細胞の処置は、インビトロで、好ましくは無菌状態下で、ある特定の生物学的分子に細胞を曝露することを意味する。一部の場合では、エクスビボの方法は、同じ又は異なるヒト対象に投与し戻す前に、ヒトから単離されている免疫細胞を培養することをさらに含む。

【0048】

この開示の拡大された集団及び／又は改変されたＴ細胞を含むプライマリー免疫細胞は、総Ｔ細胞、ＣＤ４－陽性Ｔ細胞、ＣＤ８－陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はナチュラルキラー Ｔ（ＮＫＴ）細胞を含み得る。Ｔ細胞は、それらの表面上でＣＤ４を発現する細胞（ＣＤ４陽性細胞とも呼ばれる）及びそれらの表面上でＣＤ８を発現する細胞（ＣＤ８陽性細胞とも呼ばれる）に広く分けられる。本明細書中で提供される方法による使用に適切なＴ細胞は、ヒトドナーの骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）又は臍帯血（ＣＢ）由来の単核リンパ球である。これらの細胞は、ＢＭ、ＰＢ若しくはＣＢから直接、又は同種若しくは自己ドナーへの成長因子及び／又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）又は顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのサイトカインの投与を介した動員又は刺激後に、回収され得る。当業者は、末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するための多くの確立されたプロトコールがあることを認めるであろう。ＰＢＭＣの単離は、通常は、血液中の他の要素からのリンパ球の分離のためにＦｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｈｙｐａｑｕｅ又はＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配遠心分離技術を使用する密度勾配分離プロトコールにより促進され得る。好ましくは、ＰＢＭＣ単離は、無菌状態下で行われる。ＰＢＭＣの単離はまた陰性選択キットも使用し得る。或いは、単核細胞集団を分離するために、細胞水簸（ｃｅｌｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）法を使用し得る。いくつかの態様では、プライマリー免疫細胞はヒトである。

【0049】

いくつかの場合において、この開示の方法は、活性化されたＴ細胞に遺伝子改変された抗原受容体又はキメラ抗原受容体を導入することをさらに含み、この方法はそれにより、遺伝子改変された抗原受容体又はキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を含む拡大された集団を生成させる。キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体及びキメラ免疫受容体としても知られるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞上に特異性を移植する改変された受容体である。一般に、キメラ抗原受容体は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサー及び膜貫通ドメインを介して融合される標的－抗原結合ドメインを有する膜貫通タンパク質である。ＣＡＲがその標的抗原に結合するとき、活性化シグナルがＴ細胞に伝達される。一実施形態では、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドがプライマリー細胞に導入される。一実施形態では、キメラ抗原受容体又は遺伝子改変された受容体をコードする核酸ベクターがＴ細胞に導入され、それにより、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体を発現する。いくつかの態様では、ＣＡＲは、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（（ＨＥＲ２）；Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）としても知られる）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する。ある特定の態様では、ＣＡＲは、免疫療法での使用のための何れかの標的に結合し得る。

【0050】

ＣＡＲコンストラクトの設計：本開示のＣＡＲコンストラクトは、いくつかの構成要素を有し得、それらの多くは、結果として生じるＣＡＲコンストラクトの所望されるか、又は洗練された機能に基づいて選択され得る。抗原結合ドメインに加えて、ＣＡＲコンストラクトは、スペーサードメイン、ヒンジドメイン、シグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激ドメインを有し得る。１つの構成要素をその他の構成要素から選択すること（即ち１つの受容体由来の特定の共刺激ドメインを異なる受容体由来の共刺激ドメインに対して選択すること）は、臨床的有効性及び安全性のプロファイルに影響を及ぼし得る。

【0051】

抗原結合ドメイン：本明細書中で企図される抗原結合ドメインは、抗体又はその１つ以上の抗原結合断片を含み得る。一実施形態では、ＣＡＲコンストラクトは、ＧＰＣ３を標的とする。一実施形態では、ＣＡＲコンストラクトは、ＢＣＭＡを標的とする。一実施形態では、ＣＡＲコンストラクトは、ＨＥＲ２を標的とする。一実施形態では、ＣＡＲコンストラクトは、免疫療法において有用な何れかの分子を標的とする。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、直接一緒に連結されるか又はフレキシブルリンカー（例えば、１、２、３又はそれを超える反復を有するＧ４Ｓのリピート）を介して一緒に連結されるかの何れかのＧＰＣ３、ＢＣＭＡ又はＨＥＲ２に特異的な１つ以上の抗体からの軽鎖及び重鎖可変領域を含有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。

【0052】

スペーサードメイン：ＣＡＲコンストラクトは、標的細胞上の標的抗原への結合を促進するための立体配座の自由を提供するためのスペーサードメインを有し得る。スペーサードメインの最適の長さは、標的細胞表面に対する結合エピトープの近接性に依存し得る。例えば、近位エピトープは、より長いスペーサーを必要とし得、遠位エピトープはより短いエピトープを必要とし得る。ＣＡＲの標的抗原への結合を促進することに加えて、ＣＡＲ細胞と癌細胞との間の最適距離を達成することもまた、ＣＡＲ細胞と標的癌細胞との間に形成される免疫学的シナプスからの大きな阻害分子を立体的に閉塞させるのに役立ち得る。ＣＡＲは、長いスペーサー、中間スペーサー又はより短いスペーサーを有し得る。長いスペーサーは、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）又はＩｇＧ４（天然であるか又はＳ２２８Ｐ変異などの治療用抗体に共通の修飾を有するかの何れか）のＣＨ２ＣＨ３ドメイン（約２２０個のアミノ酸）を含み得る一方、ＣＨ３領域は、それ自体で中間スペーサー（約１２０個のアミノ酸）を構築するために使用され得る。より短いスペーサーは、ＣＤ２８、ＣＤ８α、ＣＤ３又はＣＤ４のセグメント（＜６０個のアミノ酸）に由来し得る。短いスペーサーは、ＩｇＧ分子のヒンジ領域にも由来し得る。これらのヒンジ領域は、何れかのＩｇＧアイソタイプに由来し得、上記のＳ２２８Ｐ変異などの治療用抗体に一般的な変異を含んでもよいし又は含まなくてもよい。

【0053】

ヒンジドメイン：ＣＡＲは、ヒンジドメインも有し得る。フレキシブルなヒンジドメインは、腫瘍細胞上の標的抗原への結合を容易にするために立体配座の自由を提供する短いペプチド断片である。それは、単独で又はスペーサー配列と一緒に使用され得る。「ヒンジ」及び「スペーサー」という用語は、多くの場合、交換可能に使用され、例えば、ＩｇＧ４配列は、「ヒンジ」及び「スペーサー」の両方の配列（即ちヒンジ／スペーサー配列）と考えられ得る。

【0054】

シグナルペプチド：ＣＡＲコンストラクトは、シグナルペプチドを含む配列をさらに含み得る。シグナルペプチドは、細胞を促してＣＡＲを細胞膜に移行させる役割を果たす。例としては、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、Ｉｇカッパ又はラムダ軽鎖シグナルペプチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体２（ＧＭ－ＣＳＦＲ２又はＣＳＦＲ２）シグナルペプチド、ＣＤ８ａシグナルポリペプチド又はＣＤ３３シグナルペプチドが挙げられる。

【0055】

膜貫通ドメイン：ＣＡＲコンストラクトは、膜貫通ドメインを含む配列をさらに含み得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがる疎水性αヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインの特性は、ＣＡＲコンストラクトの他の態様ほど細かくは研究されていないが、潜在的に、ＣＡＲ発現、及び内因性膜タンパク質との結合に影響を及ぼし得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８α又はＣＤ２８に由来し得る。

【0056】

共刺激ドメイン：ＣＡＲコンストラクトは、共刺激ドメインを形成する１つ以上の配列をさらに含み得る。共刺激ドメインは、免疫エフェクター細胞の応答を増強又は調整可能なドメインである。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ（又はＣＤ３ｚ）、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＩＬ－２Ｒβ、及びＭｙＤ８８／ＣＤ４０の１つ以上由来の配列を含み得る。共刺激ドメインの選択は、ＣＡＲ細胞の表現型及び代謝シグネチャーに影響する。例えば、ＣＤ２８の共刺激は、細胞溶解能、インターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌、及び解糖のレベルが高い、強力ではあるが短命なエフェクター様の表現型をもたらす。対照的に、４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲにより修飾されたＴ細胞は、インビボで増殖し、且つより長く存続する傾向があり、酸化代謝が増し、消耗しにくく、且つセントラルメモリーＴ細胞を生成する能力が増す。

【0057】

特定の態様では、本明細書中で開示される方法は、１つ以上の遺伝子編集の細胞への導入前にその細胞が周期内にあることを確実にするために、プライマリー免疫細胞の初期刺激を損なう。他の態様では、本明細書中で開示される方法は、プライマリー免疫細胞の後期刺激（「再刺激」とも呼ばれる）を損なう。プライマリー免疫細胞が細胞周期から脱したら、細胞が再刺激されて、細胞が細胞周期に再び入る（即ち増殖）。

【0058】

特定の態様では、本明細書中で開示される方法は、プライマリー免疫細胞への１つ以上の遺伝子編集の導入前にプライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む。特定の態様では、プライマリー免疫細胞は、プライマリー免疫細胞への１つ以上の遺伝子編集の導入前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも５日前、少なくとも１０日前、少なくとも１５日前、少なくとも２０日前又は少なくとも３０日前に刺激される。従って、特定の態様では、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法が本明細書中で提供され、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞を刺激し；ｉｉ）１つ以上の遺伝子編集をプライマリー免疫細胞に導入し；ｉｉｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。

【0059】

特定の態様では、本明細書中で開示される方法は、プライマリー免疫細胞への１つ以上の遺伝子編集の導入後に、プライマリー免疫細胞を刺激することをさらに含む。特定の態様では、プライマリー免疫細胞は、プライマリー免疫細胞への１つ以上の遺伝子編集の導入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日又は少なくとも３０日後に刺激される。従って、特定の態様では、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法が本明細書中で提供され、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞に１つ以上の遺伝子編集を導入し；ｉｉ）培地中でプライマリー免疫細胞を培養し；ｉｉｉ）プライマリー免疫細胞を刺激し；ｉｖ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養すること、を含み；この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。さらなる態様では、プライマリー免疫細胞は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回又は少なくとも５回再刺激される。従って、特定の態様では、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を作製する方法が本明細書中で提供され、この方法は、ｉ）プライマリー免疫細胞に１つ以上の遺伝子編集を導入し；ｉｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養し；ｉｉｉ）このプライマリー免疫細胞を刺激し；ｉｖ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養し；ｖ）このプライマリー免疫細胞を再刺激し；ｖｉ）培地中でこのプライマリー免疫細胞を培養することを含み、この培養は、このプライマリー免疫細胞の増殖を誘導して、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）があるプライマリー免疫細胞の集団を生じさせる。当技術分野で公知の何れかの適切な刺激は、免疫細胞を刺激するために使用され得る。

【0060】

特定の態様では、プライマリー免疫細胞において、培養中に、少なくとも約５０倍の増加、少なくとも約５００倍の増加、少なくとも約５０００倍の増加、少なくとも約２５０，０００倍の増加、少なくとも約５００，０００倍の増加、少なくとも約１０^６倍の増加、少なくとも約１０^７倍の増加、少なくとも約１０^８倍の増加、少なくとも約１０^９倍の増加又は少なくとも約１０^１０倍の増加が起こる。特定の態様では、増加させられたプライマリー免疫細胞の集団は、複製老化抵抗性がある。さらに、これらの細胞は、長期増加後に機能的に疲弊せず、Ｔ細胞エンゲージャー抗体によるそれらのＴＣＲの会合を通じて又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の会合を通じて（又は天然若しくは遺伝子導入されたＴＣＲを通じて）細胞傷害性機能を遂行するように向けられ得る。

【0061】

特定の態様では、プライマリー免疫細胞は、支援的なサイトカインを含むがプライマリー免疫細胞刺激を含まない培地中で培養される。特定の態様では、プライマリー免疫細胞は、フィーダー細胞又はＣＤ３及び／又はそれらの抗原受容体を通じた刺激の非存在下での培養中に増加が起こる。開示される方法の、大規模なＴ細胞再刺激又はフィーダー細胞の非存在下で免疫細胞を生成させる能力によって有利に、本方法のスケールアップ及び、免疫細胞の機能障害集団の生成の課題が取り除かれる。

【0062】

本明細書中で開示される方法は有利に、長期培養において数百万倍に増加する、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じた再刺激の非存在下で実質的な期間にわたり増殖するための能力を有するヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞、ヒト制御性Ｔ細胞ヒトガンマ－デルタＴ細胞又はヒトナチュラルキラーＴ細胞を含む、拡大されたプライマリー免疫細胞の集団を提供する。特定の態様では、プライマリー免疫細胞の集団は、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも３００日又は少なくとも４００日間培養される。

【0063】

さらなる態様では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及び／又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）を発現しない巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ＸＬ）をコードする導入遺伝子を発現する改変されたＴ細胞が本明細書中で提供される。

【0064】

さらなる態様では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）及び／又はＳ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）を発現しない改変されたＴ細胞が本明細書中で提供される。

【0065】

さらなる態様では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）及び／又はホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を発現しない巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ＸＬ）をコードする導入遺伝子を発現する改変されたＴ細胞が本明細書中で提供される。

【0066】

ある特定の態様では、本明細書中で開示されるような改変されたＴ細胞は、プライマリー免疫細胞における１つ以上の内因性免疫関連遺伝子を発現しない。いくつかの態様では、内因性免疫関連遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＴ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）である。

【0067】

ある特定の態様では、本明細書中で開示されるような改変されたＴ細胞は、表面抗原分類３８（ＣＤ３８）を発現しない。

【0068】

さらなる態様では、本明細書中の開示は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）、Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体αコンスタント（ＴＲＡＣ）、表面抗原分類３８（ＣＤ３８）及び／又はホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を発現しない改変されたＴ細胞を提供する。

【0069】

ある特定の態様では、開示されるような改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、グリピカン３（ＧＰＣ３）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）又はヒト上皮増殖因子受容体２（（ＨＥＲ２）；Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）としても知られる）に結合する。

【0070】

ある特定の態様では、本明細書中で開示されるような改変されたＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はそれらの組み合わせである。

【0071】

いくつかの態様では、改変されたＴ細胞は、複製老化抵抗性（ＲＲＳ）である。いくつかの態様では、改変されたＴ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、改変されたＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、改変されたＴ細胞はヒトである。

【0072】

本明細書中で開示される拡大されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞療法、養子細胞療法（ＡＣＴ）及びＣＡＲ Ｔ細胞療法を含むが限定されない細胞免疫療法に有用である。

【0073】

本明細書中で開示されるＴ細胞集団の拡大された集団は、癌（例えば、血液悪性腫瘍、例えばリンパ腫又は白血病など、又は固形腫瘍、例えばメラノーマ又は腎臓癌など）、自己免疫疾患又は感染性疾患、例えばＨＩＶ、などの様々な障害を処置又は予防するために有用である。

【0074】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を指す。処置が必要な者としては、癌を有する対象並びに癌を有する傾向がある対象又は癌を予防すべき対象が挙げられる。いくつかの態様では、本明細書中で開示される方法、組成物及び組み合わせは、癌の処置のために使用され得る。他の態様では、処置を必要とする者としては、腫瘍を有する対象並びに腫瘍を有する傾向がある対象又は腫瘍を予防すべき対象が挙げられる。ある特定の態様では、本明細書中で開示される方法、組成物及び組み合わせは、腫瘍の処置のために使用され得る。他の態様では、腫瘍の処置には、腫瘍成長の阻害、腫瘍減少の促進又は腫瘍成長の阻害及び腫瘍減少の促進の両方が含まれる。

【0075】

いくつかの場合において、本明細書中で提供される方法により得られるＴ細胞は、治療剤（即ち治療適用用）としてＴ細胞の治療的有効量を含む医薬組成物として投与され得る。

【0076】

「医薬組成物」又は「治療組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、対象に適切に投与されるとき、所望の治療効果を誘導することが可能な化合物又は組成物を指す。いくつかの態様では、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の少なくとも１つの本開示の免疫細胞と、を含む医薬組成物を提供する。

【0077】

「薬学的に許容可能な担体」又は「生理学的に許容可能な担体」という用語は、本明細書中で使用される場合、本開示の１つ以上の免疫細胞の送達を達成又は増強するのに好適な１つ以上の処方材料を指す。

【0078】

「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物、特に哺乳類、を含むことが意図される。ある特定の態様では、対象は、ヒト患者である。

【0079】

本明細書中で使用される場合、「投与」又は「投与すること」という用語は、所望の効果を達成するために、何れかの適切な経路により、１種又は複数種の化合物を提供すること、接触させること、及び／又は送達することを指す。投与には、経口、舌下、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内又は頭蓋内の注射）、経皮、局所、頬側、経直腸、経膣、経鼻、経眼、吸入によるもの及び埋め込みが含まれ得るが限定されない。

【0080】

本開示を限定することなく、本開示のいくつかの態様が例示目的で本明細書に記載される。

【実施例】

【0081】

以下の実施例は、本開示の具体的な態様、及びそれらの様々な使用を例示する。それらは、あくまで説明を目的として記載され、決して本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0082】

実施例１：抗アポトーシス又はウイルス由来因子の過剰発現は、長期培養における遺伝子移入されたＴ細胞に対する選択的な生存の長所を提供し得る。
フローサイトメトリーを使用して６６～１３７日間にわたりＴ細胞サブセットにおいてトランスポゾン頻度を評価した。全プライマリーヒトＴ細胞を健康なドナーの血液から単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ヒトＴ－活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８）で７２時間活性化し、次いで、蛍光レポーターに加えて抗アポトーシス因子、ウイルス由来因子、突然変異サイトカイン受容体、突然変異シグナル伝達分子及び／又は突然変異細胞周期調節分子をコードするトランスポゾンを含有するプラスミドで遺伝子移入した。トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に同時に遺伝子移入して、転位因子の染色体組み込みを可能にした。合計で、様々なスクリーニングにわたり、５２種類のトランスポゾンコンストラクトを処理した。遺伝子移入から４～８日後に、フローサイトメトリーを使用してベースライントランスポゾン組み込みに対して細胞を評価した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓで細胞を周期的に再刺激して、増殖を通じてそれらを推進し、フローサイトメトリーを使用してトランスポゾン濃縮を評価した。増加Ｔ細胞の生存を促進する分子は、ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞で実証されるように全Ｔ細胞プール内でそれらの開始頻度にわたり濃縮すると予想される。（図１、図２）。これらのスクリーニングから、抗アポトーシス因子、巨大Ｂ細胞性リンパ腫（Ｂｃｌ－ｘＬ）が、拡大されたインビトロ培養の期間にわたり複数回の増殖を通じて推進されたＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方で一貫して濃縮されたことが明らかになり、これによって、それを過剰発現する成熟Ｔ細胞の生存を促進するためにこの因子が作用し得ることが示唆される（図１）。Ｂｃｌ－２及びウイルス由来タンパク質ＳｔｐＡ Ａ１１（サイミリイン・ガンマヘルペスウイルス２）（Ｓａｉｍｉｒｉｉｎｅ ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２）、ＳｔｐＣ及びＴｉｐ（ヘルペスウイルス・サイミリ）（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）及び修飾されたＴｉｏ－ＬＭＰ１（ヘルペスウイルス・アテレス、エプスタイン－バーウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ａｔｅｌｅｓ，Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ））などの他の因子も、Ｔ細胞サブセットにおいて濃縮を示した（図１）。

【0083】

内因性抗アポトーシス因子（Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ）又はウイルス由来因子（ＳｔｐＡ Ａ１１、ＳｔｐＣ及びＴｉｐ及び修飾されたＴｉｏ－ＬＭＰ１）をコードする導入遺伝子を発現する細胞が、同じウェルでの遺伝子移入していない対照細胞と比較して、それらのＴＣＲを通じた反復刺激を伴う長期培養における生存能の促進を明らかにした一方で、これらの細胞は、その増殖能において大きく持続的なブーストを示さなかった。これらのデータから、Ｔ_ＲＥＸ細胞の所望の表現型を与えるためにさらなる編集が求められ得ることが示唆される。

【0084】

実施例２：ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ及びＭＴＡＰの発現の消失は、長期培養においてプライマリーヒトＴ細胞の増殖能を実質的に上昇させる。
様々な細胞アッセイを行うために、研究室において患者由来の白血病細胞株が何年にもわたって使用されてきた。これらの細胞の形質転換された性質は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者でも頻繁に見られる一群の突然変異においてマッピングされ得る（表１）。Ｔ－ＡＬＬ患者における突然変異は、それぞれが表現型及びＴ－ＡＬＬ細胞の生成におそらく寄与するいくつかの大きいクラスに分けられ得る：活性化シグナルの獲得、シグナル抑制因子の喪失、細胞周期停止調節因子の喪失並びに、転写因子、エピジェネティックな調節因子及び他の細胞機構などの多面的因子の修飾。

【0085】

【表1】

【0086】

上述のように、Ｂｃｌ－ＸＬなどの生存因子の提供に加えて、所望の表現型を生成させるために上述の遺伝子の一群のＴ細胞発現を修飾することが必要であり得る（表１）。従って、全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を健康なドナーの血液から単離し、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して活性化し、７２時間後に、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする導入遺伝子を精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団的プールに挿入した。次に、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた再活性化及び続く白血病Ｔ細胞株及びＴ－ＡＬＬ患者から同定された因子の発現の消失の前に、これらの細胞を１７日間にわたり増加させた。増殖能の上昇は、Ｔ_ＲＥＸ細胞に対して操作しようとした主要な特徴の１つ、従って「細胞周期停止」ビンからの分子の発現切断の効果、であり：サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）及びＣＤＫＮ２Ｂをこれらの細胞において試験した（図３Ａ）。Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）は、ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂに染色体上で隣接しており、ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂを欠く患者においても欠損していることが多い。従って、ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂと連動したＭＴＡＰの発現除去の効果（図３Ａ）を試験した。これらのＢｃｌ－ＸＬ及びＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ／ＭＴＡＰ編集細胞は、以後、「Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ」細胞（表２）と呼び、ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ／ＭＴＡＰ編集（Ｂｃｌ－ＸＬなし）は、「Ｔ_ＲＥＸ」細胞と呼ぶ。

【0087】

【表2】

【0088】

Ｂｃｌ－ｘＬ－編集、Ｂｃｌ－ｘＬ及びＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ－編集及びＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を、それらのＴＣＲを通じたさらなる刺激なく、ほぼ１００日間にわたり培養において維持し、各集団の全体の倍数増加を評価した（図３Ａ）。これらの編集の導入からおよそ３１日後、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の増殖は、他の群から離れ、さらなるＴＣＲ刺激の非存在下でＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞増加を持続し、この期間中に４００，０００倍超の増加を達成した。その一方、Ｂｃｌ－ｘＬ－編集及びＢｃｌ－ｘＬ／ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ－編集ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、この時点で７３～２８６倍というより低い増加レベルを達成した（図３Ａ、表３）。さらに、未編集又はＢｃｌ－ｘＬ－編集細胞が、増殖を推進するためにαＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いてそれらのＴＣＲを通じて繰り返し再刺激された場合でも、これらは、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞をはるかに下回る低レベルの全体の倍数増加しか達成しなかった（図１Ａ、表３）。

【0089】

【表3】

【0090】

Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が、同じドナーからの対照ＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して、実質的に増強された増殖能を示した一方で、Ｔ－ＡＬＬ患者において高頻度に突然変異しているシグナルサプレッサーの発現除去により、これらの編集が他のドナーにおける同様の表現型を付与し得るか否か、及びＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ表現型をさらに促進することが可能か否かを試験するために、さらなる実験を行った（表１）。ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）遺伝子座は、患者由来の白血病細胞株及びＴ－ＡＬＬ患者において高頻度の機能喪失突然変異を示し、細胞周期進行を負に調節することが知られている（表１）。２つの異なるドナー（４０Ａ３０及び４０Ｂ３０）から上記のようにＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を作製し、「トリプレックス」編集のおよそ２週間後、これらのＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞株のうち１つ（４０Ｂ３２）においてＰＴＥＮの発現を除去した（図３Ｂ）。健康なドナー由来のＴ_ＲＥＸ細胞（ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ／ＭＴＡＰを欠失）の両セットがさらなるＴＣＲ刺激の非存在下で実質的な増殖能を示し、培養の第１１８日までに＞３．７ｅ８及び＞１．８ｅ７の全体の倍数増加を達成した。さらに、ＡＫＴシグナル伝達の制御を通じた細胞周期進行の負の調節におけるその確立された役割と一致して、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞におけるＰＴＥＮ発現の消失は、ドナーＢ－２Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の増殖能をさらに増強して、培養の第１１８日までに＞２．０ｅ８全体の倍数増加をこれらの細胞が達成することを可能にした（図３Ｂ）。ＰＴＥＮ発現の消失の追加の効果が出現するために４９日かかり、これは、低い初期編集効率又は細胞が＞３ｅ６倍に増加した後のこの編集の後期の競合的な優位性を反映する。

【0091】

インタクトなＰＴＥＮ発現があるＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞がさらなるＴＣＲ刺激の非存在下で劇的に増加した一方で、それらの増殖は最終的に、ＰＴＥＮ発現を欠くＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞と比較して遅かった（図３Ｂ）。さらに、ＰＴＥＮを欠くＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞さえも、最終的に増殖速度の低下を示した（図３Ｂ）。同時刺激の存在又は非存在下でのＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の再刺激がＰＴＥＮ発現の消失に対する実行可能な代替又は補完的なアプローチとなり得るか否かを判断するために、αＣＤ３又はαＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓが細胞周期へと細胞を復活させ得るか否かについてこれを試験した（図４）。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ又はＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を未処理のままにするか又は上記のようにＤｙｎａｂｅａｄｓで再刺激し、ビーズを除去し（ｄｅｂｅａｄｅｄ）、各集団の全体の倍数増加を追跡した（図４）。再刺激は実質的に、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株の増加能を増強させた。

【0092】

実施例３：Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、サイトカイン依存性及び細胞表現型に関してプライマリーヒトＴ細胞と類似している。
プライマリーＴ細胞は、インビトロ及びインビボで生存及び増殖についてＩＬ－２などのサイトカインに依存するが、いくつかの白血病細胞の細胞株はＩＬ－２と独立に増殖する。ＩＬ－２を含有する培地中で、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を作製した。培養中６日間、一連のＩＬ－２濃度にわたり細胞増殖及び生存を追跡することによって、これらの細胞がサイトカイン依存性に関して正常なプライマリーヒトＴ細胞と依然として類似しているか否かを調べた（図５）。正常Ｔ細胞と一致して、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、増殖及び生存の両方についてＩＬ－２によく依存した。

【0093】

Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が修飾及びインビトロ培養での増加後に正常Ｔ細胞と同様の表現型を維持するか否か又はこれらの状態がＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を疲弊した表現型に追いやるか否かも試験した（図６）。全部で３つのＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株が、細胞表面ＣＤ３及びＣＤ８の発現を維持した（図６Ａ及び６Ｂ）。さらに、これらは、ＰＤ１及びＴＩＧＩＴなどの活性化マーカーを様々なレベルで発現し（図６Ｃ）、ドナー依存性にＣＤ２８の発現を維持した（図６Ｄ）。最終的に、これらのＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、ドナー依存的に辿ったＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７の表面発現により定義される分化表現型を示した（図６Ｅ）。これらのデータは、実質的な増殖及びインビトロ培養の持続時間の増加にもかかわらず、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が正常Ｔ細胞に類似しており、機能障害性状態と関連する表面表現型を示さないことを示唆する。

【0094】

ケモカイン受容体は、炎症部位への免疫細胞の輸送にとって重要である。従って、フローサイトメトリーを用いて、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞、ＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞、再刺激を受けたＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及び再刺激を受けたＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を、ケモカイン受容体、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ５の発現について分析した（図６Ｆ～Ｋ）。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、ＣＣＲ２（図６Ｆ）、ＣＣＲ５（図６Ｇ）及びＣＸＣＲ３（図６Ｊ）の発現を示した。ＣＣＲ６の発現（図６Ｈ）は、不均一であり、一方でＣＣＲ７（図６Ｉ）及びＣＸＣＲ５（図６Ｋ）の発現は、低いか又はなかった。従って、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、それらが炎症部位へ輸送されることを可能にする重要なケモカイン受容体の発現を維持する。

【0095】

実施例４：Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は細胞傷害性がある。
Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株が正常プライマリーヒトＴ細胞と類似していることが裏付けられたので、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が長期培養及び増加後に強力な細胞傷害性機能を維持するか否かを判定した。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の細胞傷害性機能を定量するために、標的腫瘍細胞及びインピーダンスに基づくｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームの存在下でＴ細胞エンゲージャーを使用した（図７）。第８０日にＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、Ｔ細胞エンゲージャーの存在下で、未修飾プライマリー全Ｔ細胞及び未修飾プライマリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と同等である、標的腫瘍細胞溶解能を明らかにした（図７Ａ及び７Ｂ）。エフェクター細胞及び活性Ｔ細胞エンゲージャー又は対照Ｔ細胞エンゲージャー分子の添加後７２時間でこれらの同時培養からの上清を回収し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）及びグランザイムＢの存在について分析した（図７Ｃ～７Ｆ）。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、未修飾プライマリーＴ細胞と比較して、抗原依存性に標的細胞を溶解する能力が同様であるにもかかわらず、これらのサイトカインの産生レベルがより低かった。これらのデータから、８０日後でさえも、培養及び実質的な増加において、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が機能的に消耗せず、それらの細胞傷害能を維持することが示される。

【0096】

実施例５：Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、機能的なＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞を生成させ得る。
Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を有望な細胞療法へと発展させるために、これらの細胞は、それらの細胞傷害性機能を指示するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの標的指向性の分子を発現可能でなければならない。上記のように作製された３つのＴ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の細胞株に対して、グリピカン３（ＧＰＣ３）を認識するＣＡＲをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行った。フローサイトメトリーを使用して、ＧＰＣ３ ＣＡＲの表面発現をその後に測定した（図８Ａ）。各Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ株は、正常なプライマリー全Ｔ細胞及び正常なプライマリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と同様のレベルでＧＰＣ３ ＣＡＲを良好に発現することが分かった（図８Ａ）。

【0097】

様々な抗原発現度の標的腫瘍細胞を用いてインピーダンスに基づくｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイを行うことによって、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞のＣＡＲに対する細胞傷害性機能を評価した：ＯＥ２１（抗原陰性）、ＨｕＨ－７（抗原－中）及びＨｅｐ３Ｂ（抗原－高）（図８Ｂ及び８Ｃ）。Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、正常なＣＡＲ－Ｔ細胞及び正常なＣＡＲ－ＣＤ８^＋Ｔ細胞と同様のレベルでＣＡＲ特異的及び抗原特異的に標的腫瘍細胞を急速に溶解させた（図８Ｂ及び８Ｃ）。Ｔ細胞添加の７２時間後、これらの同時培養から上清を回収し、続いてＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びグランザイムＢの分泌について分析した（図８Ｄ～８Ｇ）。それらの強力な細胞傷害性機能と一致して、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、正常なＣＡＲ－Ｔ細胞及び正常なＣＡＲ－ＣＤ８^＋Ｔ細胞と同等のエフェクターサイトカイン分泌能を示した（図８Ｄ～８Ｇ）。しかし、概して、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αレベルは、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞においてより低いことが分かった。

【0098】

これらのデータから、顕著なインビトロ増加後でさえも、Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ及びＰＴＥＮ欠失Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞が、ＣＡＲを発現し、抗原依存性にＣＡＲに対する細胞傷害性機能を遂行することが可能であることが確認される。

【0099】

実施例６：Ｔ_ＲＥＸ細胞は、プライマリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と同様の位置へ行き、インビボでＩＬ－２に応答性である。
ヒト及びマウスＴ細胞の活性及び増加を調整するために、サイトカインの合図が使用され得るので（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２２ Ｄｅｃ ２０２１，Ｖｏｌ １３，Ｉｓｓｕｅ ６２５；Ａｓｐｕｒｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２２ Ｄｅｃ ２０２１，Ｖｏｌ １３，Ｉｓｓｕｅ ６２５）、Ｔ_ＲＥＸ細胞をインビボでの異なるヒトサイトカインに対するその応答能について評価した。簡潔に述べると、プライマリーヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞又は２７８日齢のＴ_ＲＥＸ細胞をルシフェラーゼレポーターで標識し、組み換えヒトＩＬ－２ 融合タンパク質の補充あり又はなしで、３Ｅ６ルシフェラーゼ発現細胞をＮＳＧマウスに注入した。ルシフェラーゼを発現するＴ細胞を検出するために、ＩＶＩＳ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用して、マウスの撮像を行った（図９Ａ及び９Ｂ）。図９Ａで示されるように、２１６時間での画像は、マウスにおけるプライマリーヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴ_ＲＥＸ細胞の同様の局在を示した。さらに、組み換えヒトＩＬ－２ 融合タンパク質を補充されたマウスでは、Ｔ_ＲＥＸ細胞の増殖が促進されたことが明らかになった（図９Ａ、右）。腹側の放射輝度を経時的にグラフ化し（図９Ｂ）、同様にＴ_ＲＥＸ細胞がインビボで外から補充されるＩＬ－２に応答する能力を示した。養子細胞移入の１０日後にマウスを屠殺し、プライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞又はＴ_ＲＥＸ細胞の存在について、それらの血液、脾臓及び骨髄を評価した（図９Ｃ）。Ｔ_ＲＥＸ細胞がプライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞と同様の器官で見出された一方で（図９Ｃ）、それらはより遅い崩壊動態を示し、組み換えヒトＩＬ－２融合タンパク質の投与によって、処置したマウスの血液及び骨髄においてＴ_ＲＥＸ細胞数がさらに増強され得る。これらのデータから、Ｔ_ＲＥＸ細胞がプライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞と同様の部位に誘導され、外因性のサイトカインの合図に対する応答性を維持することが示唆される。

【0100】

実施例７：ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、インビボでＩＬ－２及びＩＬ－１５に応答する。
ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞を、インビボでの様々なヒトサイトカインに対するそれらの応答能について評価した。ＮＳＧ、ｈＩＬ－２ ＮＯＧ又はｈＩＬ－１５ ＮＯＧマウスに対してＧＰＣ３を発現するＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞を接種した。腫瘍を確立したら、マウスを未処置のままにするか又は１０Ｅ６個のＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞で処置した。ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞は、注入時に１２１日であった。ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞注入の８日後にマウスを屠殺し、体重を測定したところ（図１０Ａ）、識別可能な相違は観察されず、毒性がないことが示された。腫瘍、血液及び脾臓を回収し、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞の存在について分析した（図１０Ｂ）。腫瘍を保有するｈＩＬ－２ ＮＯＧ及びｈＩＬ－１５ ＮＯＧマウスにおいてＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞数が増強され、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ＋Ｂｃｌ－ｘＬ細胞がインビボで外因性サイトカインの合図に応答可能であることが示される。増加プロファイルは、提供された特定のサイトカイン支援に特異的であった（図１０Ｂ）。

【0101】

実施例８：ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞はインビボで固形腫瘍を標的とする。
ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が固形腫瘍を制御する能力を判定した。ＮＳＧマウスにおいてＨｅｐ３Ｂ腫瘍を確立し、次いで９２日齢の精製ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞（図１１Ａ）をマウスに注入した。１０Ｅ６ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞又は２Ｅ６ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入し、次に腫瘍体積を測定し、経時的にグラフ化した（図１１Ｂ、左）。ＣＡＲ－ＴＲＥＸ細胞は、腫瘍成長阻害及びＨｅｐ３Ｂ腫瘍の制御を示した。ＣＡＲ－ＴＲＥＸ細胞移入の１８日後、マウスを屠殺し、さらなる分析のために、腫瘍、血液及び脾臓を回収した（図１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄ）。腫瘍内ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ 細胞表現型を調べ（図１１Ｂ）、これらの様々な組織においてＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞数を決定した（図１１Ｃ）。ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、マウスの腫瘍において最大数で見出され、これらの細胞は活性化された表現型を示し、エフェクターサイトカインを能動的に分泌し、脱顆粒していた（図１１Ｄ）。Ｔ_ＲＥＸ細胞はさらに、インビトロでの増殖能の増強を示し、数百万倍に増加され得、それらのＴＣＲを通じたさらなる刺激なく、１００日間超にわたり培養において維持され得る（図１２）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて健康なドナーＣＤ８^＋Ｔ細胞において上述の標的遺伝子を同時に編集した場合、これらの編集によって、様々なドナーにわたり再現性よくＲＥＸ表現型が付与された（図１２）。

【0102】

実施例９：臨床プロファイルのためのさらなる遺伝子編集
ＲＥＸ編集がＴ_ＲＥＸ細胞製品の増殖の促進をもたらす一方で、患者の免疫系によるＴ_ＲＥＸ細胞製品の拒絶を遅延させるためにＢ２Ｍ及びＣＤ３８遺伝子座でのさらなる編集を行った。Ｂ２Ｍは、ヒトにおける１５番染色体上の遺伝子によりコードされる１１９個のアミノ酸のタンパク質である。これは、主要組織適合性クラス（ＭＨＣ）Ｉ分子の構成成分でもあり、ＣＤ１などの非古典的なＭＨＣ Ｉ様分子、ＭＲ１、新生児Ｆｃ受容体及びＱａ－１とも関連する。ＭＨＣ遺伝子座の外に位置するにもかかわらず、有核細胞の表面上での古典的及び非古典的ＭＨＣ Ｉ分子の良好な発現のためにはＢ２Ｍが必要とされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＴ_ＲＥＸ細胞においてＢ２Ｍ発現を排除することによって、この細胞が患者ＣＤ８＋Ｔ細胞から遮蔽される。さらに、Ｂ２Ｍ発現の消失及び結果的にＴ_ＲＥＸ細胞製品によるＭＨＣ－Ｉ発現によって、患者ＮＫ細胞による拒絶に対してそれが感受性になる。Ｔ_ＲＥＸ細胞製品におけるＣＡＲ（例えばＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ）の標的化のノックインと同時にＢ２Ｍのノックアウトを行った。

【0103】

ＮＫ細胞は、ＣＤ３８を高レベルで発現し、ダラツムマブ及びイサツキシマブなどの抗ＣＤ３８モノクローナル抗体が投与されるある種の癌の患者、例えば多発性骨髄腫の患者ではＮＫ細胞が枯渇している。患者においてこの同種細胞集団の持続性を延長させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＴ_ＲＥＸ細胞のＣＤ３８をノックアウトし、ダラツムマブ又はイサツキシマブをＴ_ＲＥＸ細胞とともに同時投与し得る（図３０及び３１を参照）。

【0104】

同種ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団のように、Ｔ_ＲＥＸ細胞は、それらのＴＣＲを通じてＨＬＡ不一致患者の健康な細胞を標的とすることが可能であると予想され、その結果、ＧｖＨＤとなる。この病態の進展を防ぐために、ＴＣＲα鎖をコードするＴ細胞受容体アルファコンスタント（ＴＲＡＣ）遺伝子座でＴ_ＲＥＸ細胞集団を編集した。ＴＲＡＣのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集は、ＴＣＲα鎖の発現喪失につながり、続いてＴ_ＲＥＸ細胞によるＴＣＲの表面発現を妨げる。

【0105】

【表4】

【0106】

実施例１０：抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ同種細胞療法
Ｔ_ＲＥＸ細胞（即ち、ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂ／ＭＴＡＰを欠く細胞）においてＢＣＭＡを標的とするＣＡＲを発現させた（図１３Ａ）。抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞のゲノムをさらに編集して、それぞれＢ２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子の不活性化によりヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を除去し、それぞれ宿主対移植片（ＨｖＧ）及び移植片対宿主（ＧｖＨ）同種応答を最小化した。さらに、抗ＣＤ３８枯渇モノクローナル抗体に対する抵抗性を細胞に付与するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞においてＣＤ３８遺伝子を不活性化させた。これらの３つの遺伝子の不活性化によって、末梢血ＣＤ８^＋Ｔ細胞の全インビトロ増加能が促進され、下流細胞集団数が未編集末梢血ＣＤ８^＋Ｔ細胞により達成可能なものをはるかに超えるようになる。この細胞は、プライマリーＴ細胞の特徴的な増殖特性を保持するが（増加／生存に対するＴＲＡＣ不活性化前の抗ＣＤ３刺激及びＩＬ－２の両方への依存）、増加の可能性がより高くなる。抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、細胞傷害性機能を維持するが、混合されたＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞集団から構成される従来のＣＡＲ－Ｔ細胞調製物と比較して、サイトカイン放出の低下を示す。

【0107】

抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞の評価は、サイトカイン放出の低減及び潜在的に軽減されるＣＲＳのリスクの形式で潜在的に改善された安全性プロファイルを示すと同時に、これらの細胞が、プライマリー抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様にＢＣＭＡ発現腫瘍を制御すると思われることを示す（図１３Ｂ）。簡潔に述べると、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞とともに抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞及び抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を培養した。腫瘍細胞溶解物は、様々なエフェクター：標的細胞比で、同時培養開始後の異なる時点で測定した（図１３Ｂ、一番上の列）。同時培養開始の７２時間後に上清を回収し、ＭＳＤによってＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２のレベルを決定した（図１３Ｂ、下の列）。

【0108】

ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞とともに抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞（培養において８２日）又は抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を培養した。同時培養開始の７２時間後に上清を回収し、ＭＳＤキットを使用してＩＦＮ－γのレベルについて評価した（図１４、左）。データから、腫瘍細胞の同様の制御にもかかわらず、抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞との同時培養よりも抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞との同時培養（培養において８３日）においてＩＦＮ－γレベルが９０％低いことが示される。これらのデータから、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＣＲＳのリスクがより低くなり得るサイトカイン分泌プロファイルを示すことが明らかになる。

【0109】

抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞（培養において１１２日）をＩＬ－２支援あり又はなしで連続死滅アッセイ（ｓｅｒｉａｌ ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）においてそれらの持続能について評価した。簡潔に述べると、１：１のエフェクター：標的細胞比でＢＣＭＡを発現するＪＪＮ３細胞とともに、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞又は抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を連続的に培養した。腫瘍細胞制御（％細胞溶解）、エフェクター細胞数及びエフェクターサイトカイン分泌を同時培養の各ラウンド後に測定し、グラフ化した（図１５）。抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、この連続死滅アッセイ（ｓｅｒｉａｌ ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）において抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等のラウンド数を持続し、細胞培養培地中にＩＬ－２を含むことによって、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞及び抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞増殖を制御し得るラウンド数をさらに増加させた。抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞及び抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＬ－２に応答して増殖の増強を示し、培地中にＩＬ－２が含まれた同時培養においてより長い持続時間にわたりエフェクターサイトカイン分泌が維持された（図１５上の列対下の列）。これらのデータから、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞がインビトロで抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して同様の細胞傷害性を明らかにし、外因性ＩＬ－２に対する同様の応答能も示すことが指摘される。さらに、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、同等な腫瘍制御にもかかわらず、ＣＡＲ－エンゲージメント後に抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低いレベルのエフェクターサイトカインを分泌した。

【0110】

実施例１１：抗ＨＥＲ２－Ｔ_ＲＥＸ同種細胞療法
ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するために、Ｔ_ＲＥＸ細胞又はプライマリーＴ細胞（図２０Ａ）においてＨＥＲ２を標的とするＣＡＲを発現させた。抗ＨＥＲ２－Ｔ_ＲＥＸ細胞及び抗ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して、様々なエフェクター：標的細胞比でＨＥＲ２を過剰発現するＯＥ２１細胞を標的とするそれらの能力について評価した（図２０Ｂ、左）。抗ＨＥＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、３つの異なるプライマリーＴ細胞ドナーから作製される抗ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞の同等な又は改善された制御を明らかにした。同時培養開始の７２時間後に上清を回収し、続いてエフェクターサイトカインの存在について調べた（図２０Ｂ、右）。以前に観察されたように、腫瘍細胞制御が同等であるか又は改善されているにもかかわらず、抗ＨＥＲ２－Ｔ_ＲＥＸ細胞は、分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２）のレベルが抗ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低く、このことから、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が患者においてＣＲＳを引き起こす傾向がより小さくなり得ることが示唆される。さらに、抗ＢＣＭＡ－Ｔ_ＲＥＸ細胞に対して上で示されるように、抗ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞との同時培養からの上清と比較した場合、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞及び抗ＨＥＲ２－Ｔ_ＲＥＸ細胞の同時培養から得られた上清におけるＩＦＮ－γの分泌低下も観察された（図１４、右）。これらのデータから、再び、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＣＲＳリスクが低くなり得るサイトカイン分泌プロファイルを示すことが明らかになる。

【0111】

実施例１２：Ｔ_ＲＥＸ細胞表現型は、編集の異なる組み合わせを使用して作製され得る。
２名のドナー（Ｇ及びＨとして示す）からの単離ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＲＥＸ表現型を付与するためのＢｃｌ－ｘＬ及び様々なＲＥＸ標的遺伝子の過剰発現の要件を評価した。簡潔に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞を陰性選択し、次いで３日間、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化した。いくつかの細胞にＢｃｌ－ｘＬを導入し、一方で他の細胞を培養し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＲＥＸ標的遺伝子の様々な組み合わせをノックアウトした（図１６）。細胞増加を監視し、経時的にグラフ化した。（ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ａ’は単一対複数アイソフォームの標的化を反映する）。３つのＲＥＸ標的遺伝子がドナーにわたって一貫した表現型を得た一方で、Ｂｃｌ－ｘＬは、ＲＥＸ表現型に不必要であることが分かった（図１６、右）。

【0112】

実施例１３：Ｔ_ＲＥＸ細胞は、標的とされる遺伝子座で編集される。
ウエスタンブロット分析によって、ＲＥＸ標的遺伝子の発現の消失について、Ｔ_ＲＥＸ 細胞及びγδＴ_ＲＥＸ細胞を調べた（図１７、左及び中央のパネル）。予想されるように、これらの細胞は、ＭＴＡＰ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１４）、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）及びＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５）の発現の喪失を示した。対照的に、ドナーが一致する未編集対照細胞においてこれらの遺伝子の発現が維持された。さらに、サンガーシーケンシングデータから、編集されたＴＲＥＸ細胞におけるこれらの３つの遺伝子座で挿入欠失を有する率が高いことが示される（図１７、右）。

【0113】

実施例１４：Ｔ_ＲＥＸ細胞は、細胞周期関連遺伝子シグネチャーの濃縮を示す。
Ｂｃｌ－ｘＬを過剰発現するＴ_ＲＥＸ細胞及び同一ドナーの未編集対照ＣＤ８^＋Ｔ細胞を長時間培養した。様々な点で作製された細胞ペレットにおいてＲＮＡｓｅｑ分析を行い、遺伝子シグネチャーをＢｃｌ－ｘＬ Ｔ_ＲＥＸ細胞及び対照細胞において評価し；予想されるように、ＴＲＥＸ細胞は、Ｅ２Ｆ標的遺伝子及びＧ２Ｍチェックポイント標的遺伝子などの細胞周期と関連する遺伝子シグネチャーの濃縮を示した（図１８Ａ）。Ｂｃｌ－ｘＬ Ｔ_ＲＥＸ 細胞は、これらの細胞の観察された増殖速度と一致して、ＭＹＣ標的遺伝子のより高レベルの発現も示した（図１８Ｂ）。さらに、Ｂｃｌ－ｘＬ Ｔ_ＲＥＸ細胞は、複数の細胞周期関連遺伝子の発現の調整を示した（図２２Ｃ）。これらのデータから、ＲＥＸ表現型が細胞周期進行及び増殖向上と関連することが確認される。

【0114】

実施例１５：Ｔ_ＲＥＸ細胞は、生存及び増殖についてＩＬ－２に依存する。
１２～１４日間にわたり様々な量のＩＬ－２とともにＴ_ＲＥＸ細胞を培養した。細胞増加を追跡し、この時間にわたりグラフ化した（図１９）。Ｂｃｌ－ｘＬ Ｔ_ＲＥＸ細胞に対して上記で示されるように（例えば図５を参照）、Ｔ_ＲＥＸ細胞は、インビトロで増殖及び生存についてＩＬ－２に大きく依存する。Ｔ_ＲＥＸ細胞は、ＩＬ－２に反応して用量依存的な増殖を示し；ＩＬ－２の非存在下では、Ｔ_ＲＥＸ細胞は、生存の急激な低下を示し、６０％超のＴ_ＲＥＸ細胞が最初の４日以内に排除された。

【0115】

実施例１７：ＲＥＸ編集は、ＣＤ４＋Ｔ_ＲＥＸ細胞の増殖能を支える。
ＲＥＸ編集は、再現性よく、ＣＤ８^＋Ｔ細胞において複製老化抵抗性の増強を付与する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の複製老化抵抗性を促進するためのＲＥＸ標的遺伝子（ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ及びＭＴＡＰ）の発現消失能を判定した。３名の健康なドナーからＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離し、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して刺激し、次いでこれらの遺伝子座で編集した。ＣＤ４^＋Ｔ_ＲＥＸ細胞及び同一ドナーの未編集ＣＤ４^＋Ｔ細胞対照の増殖を経時的に追跡し、グラフ化した。（図２１）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて以前明らかにされたように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞においてＲＥＸ遺伝子を標的とすることによって、これらの細胞の増殖能を再現性よく支え、それらに複製老化抵抗性を与えた。

【0116】

実施例１８：ＲＥＸ編集を使用して、γδＴ_ＲＥＸ細胞を作製し得る。
γδＴ細胞は、Ｔ細胞の別の細胞傷害性サブセットである。８つの異なるドナーからのγδＴ細胞を使用して、γδＴ細胞においてＲＥＸ編集がＴ_ＲＥＸ細胞表現型を付与する能力を調べた（図２２）。γδＴ細胞を単離し、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ又はαＣＤ３抗体で刺激し、その後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＲＥＸ遺伝子座を編集した。γδＴ細胞及びγδＴ_ＲＥＸ細胞増殖を監視し、経時的にグラフ化した。ＲＥＸ編集は、γδＴ細胞の複製老化抵抗性を再現性よく促進し、γδＴ_ＲＥＸ細胞表現型の生成に至った。

【0117】

γδＴ_ＲＥＸ細胞株が複製老化抵抗性の促進を示すことが確立されたので、γδＴ_ＲＥＸ細胞が長期培養及び増加後に強力な細胞傷害性機能を維持するか否かを判定した。γδＴ_ＲＥＸ細胞の細胞傷害性機能を定量するために（図２３）、Ｔ細胞エンゲージャーを標的腫瘍細胞及びインピーダンスに基づくｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームの存在下で使用した。第７９日及び第８８日に、未修飾プライマリーＣＤ８^＋Ｔ細胞としてのＴ細胞エンゲージャーの存在下で、γδＴ_ＲＥＸ細胞株は、同等の標的腫瘍細胞溶解能を明らかにした（図２３、上）。エフェクター細胞及び活性Ｔ細胞エンゲージャー又は対照Ｔ細胞エンゲージャー分子の添加の７２時間後にこれらの同時培養からの上清を回収し、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αの存在について分析した（図２３、下）。γδＴ_ＲＥＸ細胞株は、抗原依存性に標的細胞を溶解する能力が同様であるにもかかわらず、これらのサイトカインの産生レベルは、未修飾プライマリーＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも低かった。これらのデータから、培養及び続く増加において７９日後でさえも、γδＴ_ＲＥＸ細胞は、機能が消耗せず、それらの細胞傷害性能を維持することが示される。

【0118】

γδＴ細胞は一般的に、特にＶδ１、Ｖδ２、Ｖδ３及びＶδ５を含む複数のサブセットから構成された（Ｌａｗａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０ Ｊｕｎｅ ２０１７）。ヒトにおいて、Ｖδ１及びＶδ２は、γδＴ細胞の大部分を構成し、Ｖδ２細胞は主に血液中で見られ、Ｖδ１細胞は組織において見られる。

【0119】

γδＴ_ＲＥＸ細胞、γδＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞及びドナーが同一の未編集γδＴ細胞を染色し、Ｖδ１及びＶδ２の発現について分析した（図２４）。ＦＡＣＳ分析により、γδＴ_ＲＥＸ細胞は、複数のγδＴ細胞サブタイプ（Ｖδ１、Ｖδ２及びＶδ１^－Ｖδ２^－）から構成されたことが明らかになり、このことから、ＲＥＸ編集によって複数のγδＴ細胞サブタイプに対して複製老化抵抗性が促進され得ることが示された。さらに、γδＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞においてγδＴ細胞サブタイプの多様性が維持された（図２８、下）。

【0120】

次にγδＴ_ＲＥＸ細胞に対して、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲなどの腫瘍を標的とする部分から指令を受けるそれらの能力について調べた（図２５）。γδＴ_ＲＥＸ細胞に対して形質導入を行い、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲを発現させ（図２５Ａ）、様々なエフェクター：標的細胞比でＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞とこれらの細胞を同時培養した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームを使用して腫瘍細胞溶解を経時的に監視し（図２５Ｂ）、同時培養開始の７２時間後に上清を回収した。γδＴ_ＲＥＸ細胞は、プライマリーＣＡＲ－Ｔ細胞対照と同様のＢＣＭＡ発現腫瘍細胞制御能を示したが、しかしこれらは一般に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を含むエフェクターサイトカインの分泌レベルがより低かった（図２５Ｂ、下）。これらのデータから、γδＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞が腫瘍を標的とするＣＡＲから指示を受けることが可能であり、プライマリーＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＣＲＳを引き起こす可能性もより低いものであり得ることが示される。

【0121】

実施例１９：ＮＫ細胞におけるＲＥＸ編集は、ＮＫ_ＲＥＸ細胞表現型を支援する。
ＲＥＸ編集は、Ｔ細胞の複製老化抵抗性を増強させるが、しかし、それらがＮＫ_ＲＥＸ細胞表現型を支援するか否かは不明であった。従って、ＮＫ細胞を３名の異なるドナーから単離し、ＩＬ－２又はＩＬ－２及びＩＬ－１５の組み合わせを含有する培地中で培養した。次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＲＥＸ遺伝子座でＮＫ細胞を編集し、ＮＫ_ＲＥＸ細胞及び同一ドナーの未編集ＮＫ細胞の増殖を経時的に監視した（図２６）。全てのドナー及びサイトカイン条件において、ＲＥＸ編集は再現性よくＮＫ_ＲＥＸ細胞の複製老化抵抗性を促進可能であった（図２６）。未編集ＮＫ細胞が増加できず、８０日以内に死滅した一方で、ＮＫ_ＲＥＸ細胞は、９０日にわたり培養され得、＞１０^６～＞１０^１０倍に増加する。

【0122】

複製老化抵抗性の増強を考慮すると、ＮＫ_ＲＥＸ細胞がサイトカイン支援へのそれらの依存性を維持したか否かを判定することは重要であった。ＮＫ_ＲＥＸ細胞は、ＩＬ－２又はＩＬ－２及びＩＬ－１５の組み合わせを含有する培地中で作製された。サイトカインが増殖培地から除去された実験において、これらのサイトカインにおけるＮＫ_ＲＥＸ細胞依存性を判定し、３７日間にわたりＮＫ_ＲＥＸ細胞数を監視した。ＮＫ_ＲＥＸ細胞は、サイトカイン除去後に増殖できず、これらの細胞は、細胞生存能及び生存可能な細胞直径の急速な下落を示し、ＲＥＸ遺伝子の編集にもかかわらずサイトカイン支援へのそれらの依存性を強めた（図２７）。

【0123】

これらの細胞が腫瘍を標的とするＣＡＲを安定して発現可能であったか否かを判定するために、ＮＫ_ＲＥＸ細胞に対して形質導入を行って、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲを発現させた（図２８）。経時的にＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞においてＣＡＲ発現が維持され、発現レベル（平均蛍光強度、ＭＦＩ）は精製ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるレベルと同様であった。これらのデータは、ＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞がＣＡＲを安定して発現し得、その発現レベルが標準的なＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であることを示す。

【0124】

ＮＫ_ＲＥＸ細胞が長期にわたり培養中で増加し得る一方で、１）それらの細胞傷害能が持続性の増殖後に維持されたか否か；及び２）それらが腫瘍を標的とするＣＡＲの指示を受け得るか否かは、不明であった。従って、ＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞を２つの異なるＮＫ_ＲＥＸ株から作製した（図２９Ａ）。これらのＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ株のうち１つは、＞９５％ＣＡＲ^＋ＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ株を生成させるためにＣＡＲ発現に基づいて精製した（図２９Ａ、右下）。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイにおいてＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞を溶解させるそれらの能力についてドナー５０－１及び４７－１からのＮＫ_ＲＥＸ及びＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ株を試験した（図２９Ｂ）。培養において７８及び８６日後でも、ＮＫ_ＲＥＸ及びＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞は強力に細胞傷害性であった。これらの株は、ＢＣＭＡを発現する標的細胞を急速に溶解させ、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞よりも急速により高い制御レベルを達成した（図２９Ｂ）。より低いエフェクター：標的細胞比で、おそらくＮＫ_ＲＥＸ及びＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞における活性化受容体の会合ゆえに、ＮＫ_ＲＥＸ細胞がＣＡＲ発現とは独立に腫瘍細胞を溶解可能であった一方で、ドナー５０－１及び４７－１の両方について、ＣＡＲに対する細胞傷害性の寄与が観察され得た。同時培養の４８時間後に上清を回収し、ＭＳＤを使用してＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αのレベルを決定した（図２９Ｃ）。ＮＫ_ＲＥＸ細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞よりもこれらのサイトカイン分泌レベルが低く、ＣＡＲ－Ｔ_ＲＥＸ細胞のこれらの因子の分泌は最大レベルであった（図２９Ｃ）。これらのデータから、ＣＡＲ－ＮＫ_ＲＥＸ細胞が腫瘍を標的とするＣＡＲを安定して発現し、腫瘍を標的とするＣＡＲから指示を受けることが可能であることが示される。さらに、これらの細胞は急速に腫瘍細胞を溶解させ、同時培養上清中でより低レベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αを蓄積する。

【0125】

実施例２０：Ｔ_ＲＥＸ細胞は、Ｔ細胞枯渇剤及び化学療法剤に感受性がある。
Ｔ^ＲＥＸ細胞は、それらの複製老化抵抗性を向上させるために修飾されている。しかし、これらの細胞は、正常なＴ細胞の特徴を示した。Ｔ_ＲＥＸ細胞を制御する能力をより詳細に理解するために、活性化されて細胞周期に入った未編集の全Ｔ細胞と比較した、標準的Ｔ細胞枯渇剤及び化学療法剤に対するそれらの感受性を決定した（図３０）。未編集の活性化されたばかりの全Ｔ細胞又はＴ_ＲＥＸ細胞を１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ５２及び１０％ヒト補体（図３０、左上）又は１０％ウサギ補体（図３０、左下）とともにインキュベートした。３時間後、細胞タイターＧｌｏアッセイを使用して細胞生存を評価した。未編集の活性化されたばかりの全Ｔ細胞又はＴ_ＲＥＸ細胞をまた、指定量のメルファラン（図３０、右上）又はクロラムブシル（図３０、右下）と共にインキュベートし、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを使用して２日後に細胞生存を測定した。全ての場合において、Ｔ_ＲＥＸ細胞は、これらの薬剤に対して、未編集の活性化されたばかりの総Ｔ細胞と同等の感受性を示した。

【0126】

実施例２１：Ｂ２Ｍ^ＫＯＴ_ＲＥＸ細胞は、ＮＫ細胞が介在する枯渇に対して感受性があり、これは、抗ＣＤ３８抗体を使用して調整され得る。
同種間の細胞製品として、Ｂ２Ｍ遺伝子座でＴ_ＲＥＸ細胞を修飾し、ＮＫ細胞が介在する枯渇に対するそれらの影響され易さを向上させる。これらの細胞は、抗ＣＤ３８抗体によるそれらの枯渇を制限するためにＣＤ３８遺伝子座でさらに修飾され得る。Ｔ_ＲＥＸ 細胞株及びＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して作製した。健康なドナーから単離されたＰＢＭＣとともにＴ_ＲＥＸ細胞及びＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞を同時培養した。Ｔ_ＲＥＸ細胞は、ＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞が予想されるようにＮＫ細胞が介在する溶解に対して影響を受け易かった一方で、ＰＢＭＣとの同時培養の際には数の減少を示さなかった（図３１、上）。ＮＫ細胞は高レベルのＣＤ３８を発現し、ＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ総Ｔ細胞又はＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞との同時培養前にＣＤ３８を標的とする抗体ダラツママブ（Ｄａｒａ）とともにＮＫ細胞を予めインキュベートした場合、これにより、細胞溶解が＞５０％減少した。これらのデータから、ＣＤ３８^ＫＯＢ２Ｍ^ＫＯ Ｔ_ＲＥＸ細胞はＮＫ細胞が介在する溶解から影響を受け易いこと、及びこの枯渇に対する感受性が抗ＣＤ３８抗体の投与を通じて調節され得ることが示される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図6-9】

【図6-10】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29-1】

【図29-2】

【図29-3】

【図30】

【図31】

【国際調査報告】