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特表2024-532886ヒトCD16aに対する抗体及びその変異体
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】ヒトCD16aに対する抗体及びその変異体
(51)【国際特許分類】
   C07K 16/28 20060101AFI20240903BHJP
   C07K 19/00 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 15/62 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 15/63 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 15/13 20060101ALI20240903BHJP
   C12N 15/12 20060101ALI20240903BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP
   A61P 35/02 20060101ALI20240903BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP
   A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP
   A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP
【FI】
C07K16/28
C07K19/00 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/62
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N15/12
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 105
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024512952
(86)(22)【出願日】2022-08-25
(85)【翻訳文提出日】2024-02-22
(86)【国際出願番号】 CN2022114642
(87)【国際公開番号】W WO2023025215
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/114549
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.TRITON
(71)【出願人】
【識別番号】519241381
【氏名又は名称】ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】NANJING GENSCRIPT BIOTECH CO., LTD.
【住所又は居所原語表記】28 Yongxi Road,Jiangning Science Park, Nanjing, Jiangsu 211100 China
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン、リウ
(72)【発明者】
【氏名】ヂョンダオ、リ
(72)【発明者】
【氏名】ヂィーフェイ、ザオ
(72)【発明者】
【氏名】クイイェン、シャオ
(72)【発明者】
【氏名】ビン、リウ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジン
(72)【発明者】
【氏名】リウソン、イン
【テーマコード(参考)】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Fターム(参考)】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本出願は、結合分子を提供する。結合分子は、ナチュラルキラー(NK)細胞表面に発現するCD16a(FcγRIIIA)に特異的に結合するが、CD16b(FcγRIIIB)に結合しない。このような結合分子の、初代ヒトNK細胞の刺激及び活性化における用途をさらに開示した。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された抗体又はその抗原結合部分であって、
CDR1領域と、CDR2領域と、CDR3領域とを含むモノマー可変ドメインを含み、前記CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、
それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:14、15及び16であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:14、15及び64であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:14、15及び66であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は、
前記CDR1領域、前記CDR2領域及び前記CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項2】
前記CDR1領域、前記CDR2領域及び前記CDR3領域は、
それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくは、
それぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は、
前記CDR1領域、前記CDR2領域及び前記CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項3】
前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトCD16aに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項4】
前記抗体又はその抗原結合部分は、単一ドメイン抗体(sdAb)又はVHドメインである、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項5】
前記抗体又はその抗原結合部分は、ラクダ科、キメラ、ヒト又はヒト化である、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項6】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項7】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項8】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項9】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項10】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項11】
前記モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項12】
抗体又はその抗原結合部分であって、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノマー可変ドメインを含む、抗体又はその抗原結合部分。
【請求項13】
前記抗体はヒト化抗体であり、且つ前記モノマー可変ドメインはSEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項14】
前記抗体又はその抗原結合部分は、前記モノマー可変ドメインと融合するIgG Fc領域をさらに含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項15】
前記IgG Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域又はマウスIgG1 Fc領域である、請求項14に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項16】
請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む、二重特異性分子、免疫コンジュゲート又はキメラ抗原受容体。
【請求項17】
請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分又は請求項16に記載の二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項18】
請求項17に記載の核酸分子を含有する、発現ベクター。
【請求項19】
請求項18に記載の発現ベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項20】
請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分又は請求項16に記載の二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体、及び薬学的に許容されるキャリア剤を含む、薬物組成物。
【請求項21】
細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項20に記載の薬物組成物。
【請求項22】
被験体の癌疾患を治療するための方法であって、治療有効量の請求項20又は21に記載の薬物組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項23】
前記癌疾患は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、胃癌、神経膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌及び子宮癌からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
被験体におけるNK細胞の増殖を促進する方法であって、治療有効量の請求項20又は21に記載の薬物組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
Fcγ受容体(FcγR)は、免疫グロブリンG(IgG)のFc領域に結合する細胞表面受容体である。これらの受容体は、抗体-抗原複合体を形成し、エフェクター細胞応答において機能する。例えば、免疫複合体により架橋活性化されたFcγ受容体は、病原体の貪食作用をもたらし、直接細胞傷害性によって外因性細胞及び形質転換細胞を死滅させ、毒性物質を除去し炎症反応を引き起こす。抗体治療において、IgGは、抗原結合断片によって標的を認識し、Fcドメインにより白血球上に発現する様々なタイプのFcγRを結合して、細胞により媒介される反応を引き起こすことによって、白血病、リンパ腫、腫瘍、自己免疫性疾患及び他の疾患を治療する。
【0002】
Fcγ受容体には、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIという三つのクラスがある。FcγRIIIは、CD16とも呼ばれ、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)に関与することが知られているいくつかのIgGのFc部分の低親和性受容体であり、NK細胞による標的細胞の開裂を誘発するための最も典型的な膜受容体である。ヒトFcγRIIIは、FcγRIIIA(CD16a)及びFcγRIIIB(CD16b)という二つのサブタイプで存在し、それらが、その細胞外免疫グロブリン結合領域において96%の配列同一性を有する。FcγRIIIA(CD16a)は、膜貫通受容体としてマクロファージ、マスト細胞及びNK細胞上に発現する。しかしながら、FcγRIIIB(CD16b)は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー受容体(FcγRIIIBサブタイプ)として多形核顆粒球(PMN)上に存在し、腫瘍細胞殺傷を誘発することができない。なお、FcγRIIIBは、可溶性受容体として血清に存在し、抗体に結合した後、インビボで免疫複合体を形成することによって副作用を引き起こし得る。
【0003】
FcγRを発現するエフェクター細胞は、ADCCを介して腫瘍細胞の破壊に関与することが証明されている。これは、FcγR活性の使用に関する、癌を治療するいくつかの免疫治療方法の開発をもたらす。自然免疫の細胞媒体として、NK細胞は、プロの細胞キラーであり、T細胞とは異なり、追加の(事前)刺激を必要とせずに、常に構成的に活性化された状態で存在する。これまで産生された抗CD16抗体の大部分は、FcγRIIIA及びFcγRIIIBという二つのCD16サブタイプを区別することができない。
【0004】
CD16bに対して、CD16aに特異的であり、所望の治療特性を有する抗CD16a結合分子又は抗体が必要である。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、該単離された抗体又はその抗原結合部分は、CDR1領域と、CDR2領域と、CDR3領域とを含むモノマー可変ドメインを含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び16であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び64であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び66であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は該CDR1領域、該CDR2領域及び該CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む。
【0006】
いくつかの実施例において、CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は該CDR1領域、該CDR2領域及び該CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む。
【0007】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトCD16aに特異的に結合する。
【0008】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、単一ドメイン抗体(sdAb)又はVHドメインを含むか又はそれである。
【0009】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、ラクダ科、キメラ、ヒト又はヒト化である。
【0010】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0012】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの実施例のうちのいくつかにおいて、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0013】
別の態様では、本開示は、モノマー可変ドメインを含む単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、該モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。抗体は、ヒト化抗体であってもよく、且つモノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【0014】
本明細書に開示された単離された抗体又はその抗原結合部分のうちのいずれか一つにおいて、抗体又はその抗原結合部分は、モノマー可変ドメインと融合するIgG Fc領域をさらに含んでもよい。IgG Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域又はマウスIgG1 Fc領域であってもよい。ある実施例において、ヒトIgG4 Fc領域は、SEQ ID NO:73のアミノ酸配列を含んでもよい。ある実施例において、マウスIgG1 Fc領域は、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0015】
さらなる態様では、本開示は、二重特異性分子、免疫コンジュゲート又はキメラ抗原受容体を提供し、該二重特異性分子、免疫コンジュゲート又はキメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0016】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分又はその二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供する。さらなる態様では、本開示は、上記核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。さらなる態様では、本開示は、上記発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【0017】
さらなる態様では、本開示は、薬物組成物を提供し、それは、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、又は本明細書に記載の二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体、及び薬学的に許容されるキャリア剤を含む。いくつかの実施例において、薬物は、細胞傷害性薬剤をさらに含んでもよい。さらなる態様では、本開示は、被験体の癌疾患を治療するための方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の薬物組成物を被験体に投与することを含む。癌疾患は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、胃癌、神経膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌及び子宮癌からなる群から選択される。
【0018】
さらなる態様では、本開示は、被験体におけるNK細胞の増殖を促進する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の薬物組成物を被験体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0019】
図1A-1】及び
図1A-2】本開示のいくつかの実施例における抗体とヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線を示した図である。
図2A-1】及び
図2A-2】本開示のいくつかの実施例における抗体とヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線を示した図である。
図2B-1】本開示のいくつかの実施例における抗体とヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線を示した図である。
図2B-2】本開示のいくつかの実施例における抗体とヒトCD16bタンパク質とのFACS結合親和性を示した図である。
図3】NK細胞の細胞傷害性誘発に関する、本開示のいくつかの実施例における抗体の細胞傷害性アッセイの結果を示した図である。
図4A】及び
図4B】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質との結合親和性を示した図である。
図5A】及び
図5B】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質との結合親和性を示した図である。
図6A】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図6B】これらのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図7A】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図7B】これらのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図8A】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図8B】これらのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図9A】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図9B】これらのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図10A】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図10B】これらのヒト化sdAbとヒトCD16bタンパク質とのFACS結合曲線及びデータを示した図である。
図11A】及び
図11B】NK92/CD16a-158V/V細胞を用いた、本開示のいくつかのヒト化sdAb及びヒトCD16aタンパク質の乳酸脱水素酵素(LDH)細胞傷害性アッセイの結果を示した図である。
図12】NK92/CD16a-158V/V細胞を用いた、本開示のいくつかのヒト化sdAb及びヒトCD16aタンパク質用量依存性応答のリバースADCCバイオアッセイにおける乳酸脱水素酵素(LDH)細胞傷害性アッセイの結果を示した図である。
図13A】及び
図13B】本開示のいくつかのヒト化sdAbとヒトCD16aタンパク質とのFACS Cyno結合曲線及びデータを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
一態様では、本開示は、抗CD16ラマ単一ドメイン抗体を提供し、それは、FcγRIIIA(CD16a)に対する特異性を示すが、FcγRIIIB(CD16b)に特異的に結合しない。本開示は、これらのラマsdAbに基づくヒト化sdAb及びその融合タンパク質をさらに提供する。本開示の抗体(又は結合分子)は、結合時にNK細胞を活性化することができ、且つ疾患関連細胞に対する二重特異性又は多重特異性結合分子の成分として使用され得る。
【0021】
本明細書で使用される抗体の用語「抗原結合部分」は、抗体の一つ又は複数の断片を指し、それが、抗原(例えば、CD16aタンパク質)に結合する能力を保持した。これは、単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域と、このようなドメイン及びそれに化学的に連結される別のポリペプチド断片を含む大きな分子とを含んでもよい。このような単鎖抗体は、用語「抗原結合部分」にカバーされることも意図される。
【0022】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。CD16aタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、CD16aタンパク質に結合しない抗体を実質的に含まない。ヒトCD16aに結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、ヒトCD16bタンパク質又は他の種からのCD16aタンパク質に結合してもよい。単離された抗体は、また他の細胞物質及び/又は化学品を実質的に含まなくてもよい。
【0023】
本明細書で使用されるように、「CD16a結合タンパク質」、「CD16a抗体」及び「抗CD16a抗体」という用語は、交換使用可能であり、VL及び/又はVHドメインと相互作用することによってCD16aに結合する(Fc媒介性結合とは異なる)複数の分子を指す。CD16a結合タンパク質の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体(例えば、2本の重鎖及び2本の軽鎖を含む)、その断片(例えば、Fab、Fab′、F(ab′)2及びFv断片)、二機能性又は多機能性抗体、単鎖抗体、融合タンパク質(例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質)、「ミニボディ(Minibodies)」(例えば、米国特許第5,837,821号を参照されたい)、並びにVL及び/又はVHドメイン又はその断片を含む他の抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0024】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一分子からなる抗体分子を有する製剤を指す。
【0025】
「単一ドメイン抗体」又は「sdAb」という用語は、三つの相補性決定領域(CDR)を有する単一モノマー可変抗体ドメインを含む単一抗原結合ポリペプチドを指し、それが、抗原に結合することができるが、対応するCDR含有ポリペプチドとペアリングしない。いくつかの場合に、単一ドメイン抗体は、ラクダ科重鎖抗体(HCAb)から操作されたものであり、且つHCAbのVHドメイン又は断片とも呼ばれる。単一ドメイン抗体は、重鎖のみの抗体の抗原結合部分である。VHは、またナノ抗体と呼ばれてもよい。ラクダ科sdAbは、既知の最小の抗原結合抗体断片の一つである(例えば、Hamers-Castermanら,Nature 363:446-8(1993)、Greenbergら,Nature 374:168-73(1995)、Hassanzadeh-Ghassabehら,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013)を参照されたい)。例として、本開示の例における特定の単一ドメイン抗体は、AR[数字及び/又は他の記号]、例えばAR8866、AR8866-1.1、AR8804、AR8804-1.1などとして言及される。
【0026】
本明細書で使用されるように、「ヒトCD16aに特異的に結合する」抗体又は分子は、ヒトCD16aタンパク質に結合するが、ヒトCD16aタンパク質ではないタンパク質に実質的に結合しない抗体又はポリペプチド分子を指す。特に、本明細書においてヒトCD16aに特異的に結合すると言及される抗体又は分子は、ヒトCD16aに対する結合親和性が、ヒトCD16bに対する結合親和性より少なくとも100倍高いものであるべきである。
【0027】
本明細書で使用されるように、「融合タンパク質(fused protein)」、「融合タンパク質(fusion protein)」、「融合抗体(fusion antibody)」又は「融合抗体(fused antibody)」という用語は、単一ドメイン抗体(例えば、VH)部分及びIgG定常領域Fc(例えば、ヒトIgG4 Fc領域又はマウスIgG1 Fc領域)を同時に含む抗体分子を指し、ここで、この二つの部分は、例えば、組換え法によって化学的に連結される。例えば、sdAbは、IgGの天然ヒンジ領域によりIgG Fc領域に直接融合してもよい。sdAbは、融合抗体におけるIgG Fcの上流にあり、即ちN末端により近く、ここで、sdAb及びIgG Fc領域にはヒンジ領域が挿入している。融合する抗体タンパク質は、その構成要素として本明細書で言及されてもよく、例えば、AR8776-sdAb-hIgG4Fcは、ヒトIgG4 Fc領域と融合するAR8776-sdAbからなる融合タンパク質又は抗体を指す。
【0028】
本明細書で使用されるように、「ラクダ科抗体」という用語は、可変領域を有する抗体(又は、さらに特に、単一ドメイン抗体又はVH断片である)を含むことが意図され、ここで、フレームワーク領域及びCDR領域は、いずれもラクダ科生殖系列の重鎖のみの抗体配列に起源する。なお、該抗体が定常領域を含有すれば、該定常領域もラクダ科生殖系列抗体配列に起源してもよい。本発明のラクダ科抗体は、ラクダ科生殖系列抗体配列によりコードされるものではないアミノ酸残基(例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的誘発により導入された突然変異又はインビボで体細胞突然変異により導入された突然変異)を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用されるように、「ラクダ科抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がラクダ科フレームワーク配列に移植された抗体を含むことが意図されていない。
【0029】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト(例えば、ラクダ科)起源の遺伝物質をヒト起源の遺伝物質と組み合わせることによって調製された抗体を指す。又は、さらに一般的には、キメラ抗体は、異なる種の遺伝物質により産生された異なる部分を有する抗体を指す。
【0030】
本明細書で使用されるように、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト(例えば、ラクダ科)種からの抗体を指し、そのタンパク質配列は、天然に産生されたヒト抗体変異体との類似性を増加させるように改変された。
【0031】
二つ又はそれ以上の核酸又はタンパク質/ペプチドの文脈において本明細書で使用される用語「同一性」パーセントは、最大の対応性のために比較及びアラインメント(必要であれば、ギャップを導入する)を行う場合、任意の保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮することなく、二つ又はそれ以上の配列又はサブ配列が、同じ特定のパーセントのヌクレオチド又はアミノ酸残基を有することを指す。配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、又は目視検査によって同一性パーセントを測定してもよい。アミノ酸又はヌクレオチド配列アラインメントを取得するために用いられ得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアは、当分野でよく知られている。これらは、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及びその変異体を含むが、それらに限らない。
【0032】
本明細書で使用されるように、「被験体」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物を含む。いくつかの実施例において、被験体は、ヒトである。
【0033】
当業者は、様々な方法/システムで抗体のCDRを定義する。これらのシステム及び/又は定義は、長年にわたって開発され改善され、且つKabat、Chothia、IMGT、AbM及びContactを含む。Kabat定義は、配列変異性に基づき、且つ一般的に使用されている。Chothia定義は、構造的ループ領域の位置に基づく。IMGTシステムは、可変ドメイン構造内の配列変異性及び位置に基づく。AbM定義は、KabatとChothiaとの間のトレードオフである。Contact定義は、利用可能な抗体結晶構造に対する分析に基づく。例示的なシステムは、KabatとChothiaとの組み合わせである。
【0034】
CD16aのタンパク質及び核酸配列は、Genbankにおいて登録番号P08637(タンパク質)及びX52645(核酸)として報告されており、SWISS-PROTにおいて登録番号CAA36870として報告されている。CD16bのタンパク質及び核酸配列は、Genbankにおいて登録番号O75015(タンパク質)及びX16863(核酸)として報告されており、SWISS-PROTにおいてCAA34753として報告されている。
ヒトCD16aを標的とする抗体(又は抗ヒトCD16a抗体)
【0035】
一態様では、本開示は、単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、該単離された抗体又はその抗原結合部分は、CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域を含有するモノマー可変ドメインを含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び16であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び64であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:14、15及び66であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は該CDR1領域、該CDR2領域及び該CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む。いくつかの実施例において、CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、それぞれSEQ ID NO:2、3及び4であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:6、7及び8であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:18、19及び20であるか、もしくはそれぞれSEQ ID NO:26、27及び28であるアミノ酸配列、又は該CDR1領域、該CDR2領域及び該CDR3領域のうちのいずれか一つ又は複数に約3つまでのアミノ酸置換が含まれる変異体を含む。
【0036】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトCD16aに特異的に結合する。
【0037】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、単一ドメイン抗体(sdAb)又はVHドメインを含むか又はそれである。
【0038】
いくつかの実施例において、抗体又はその抗原結合部分は、ラクダ科、キメラ、ヒト又はヒト化である。
【0039】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0040】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0041】
いくつかの実施例において、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの実施例のうちのいくつかにおいて、モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0042】
別の態様では、本開示は、モノマー可変ドメインを含む単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、該モノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:1、5、13、17、25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。抗体は、ヒト化抗体であってもよく、且つモノマー可変ドメインは、SEQ ID NO:42、44、45、47及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【0043】
本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分は、モノマー可変ドメインと融合するIgG Fc領域をさらに含んでもよい。例えば、IgG Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域又はマウスIgG1 Fc領域であってもよい。ある実施例において、ヒトIgG4 Fc領域は、SEQ ID NO:73のアミノ酸配列を含んでもよい。ある実施例において、マウスIgG1 Fc領域は、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0044】
さらなる態様では、本開示は、二重特異性分子、免疫コンジュゲート(又は抗体薬物コンジュゲート)又はキメラ抗原受容体を提供し、それは、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0045】
「二重特異性分子」という用語は、少なくとも一つの他の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質(例えば、別の抗体又は受容体リガンド)に連結される本開示の抗体を指す。二重特異性分子は、少なくとも二つの異なる結合部位又は標的分子を有してもよく、且つ三つ又はそれ以上の特異性を有する分子を含んでもよい。
【0046】
「免疫コンジュゲート」という用語は、本開示の抗体と治療剤とのコンジュゲートを指し、該治療剤は、例えば、細胞毒素、アルキル化剤、DNA副溝結合剤、DNAインターカレーティング剤、DNA架橋剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、核外搬出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼI又はII阻害剤などである。ADCでは、抗体及び治療剤は、開裂可能なリンカー(例えば、ペプチジル、ジスルフィド)を介してコンジュゲートすることができる。
【0047】
「キメラ抗原受容体」又は「CAR」という用語は、確定された特異性を免疫エフェクター細胞(典型的には、T細胞である)に移植し、T細胞機能を増強する操作された受容体を指す。次世代CARは、細胞外結合ドメインを含み、それは、単一ドメイン抗体、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン(主にCD3-ζの細胞内ドメインであり、それは、一つ又は複数の共刺激ドメインと共に、T細胞活性化シグナルを伝達する主なものである)を含む。CARはさらに、T細胞の増殖、持続性及び抗腫瘍活性を増強する因子、例えば、サイトカイン及び共刺激リガンドを有してもよい。
【0048】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の抗体(又はその抗原結合部分)又は二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体の抗体もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。核酸分子を含む発現ベクターを含有する宿主細胞(例えば、CHO細胞又はリンパ球、又は微生物、例えば、大腸菌、及び真菌、例えば、酵母)は、本開示の抗体、好ましくは単一ドメイン抗体を産生するために用いられ得る。
【0049】
単一ドメイン抗体を調製する方法は記述されている。例えば、Els Pardonら,Nature Protocol,2014;9(3):674を参照されたい。単一ドメイン抗体調製の一般的な方法は、CD16aのような目的抗原によるラクダ科種の免疫、免疫動物からのリンパ球回収、cDNAの調製、標準的なクローニングスキームによるファージディスプレイライブラリーの作成、抗原特異的結合物を濃縮するための3~4ラウンドのファージスクリーニングに関する。多様な単一ドメイン抗体ライブラリーは、また多様性を合成によりVH足場に導入することによって調製され得る。
【0050】
単一ドメイン抗体は、ラクダ科単一ドメイン抗体を発現するファージディスプレイライブラリーから単離されてもよい。ファージライブラリーのスクリーニングは、当分野に既知の様々な技術により完成され得る。例えば、CD16aタンパク質の受容体結合ドメインがコーティングされているシェードガイドを用いて数ラウンドのますます厳しくなる選択において溶液パニングを行うことによって、ラクダ科天然単一ドメイン抗体ライブラリーにおける、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する抗体をスクリーニングしてもよい。単離物は、最初に単一ドメイン抗体として発現し、ELISAによって受容体結合ドメインとの結合をスクリーニングしてもよく、且つその後、選択された単離物をクローニングし、IgG4又はIgG1 Fc領域に連結される単一ドメイン抗体として発現し、ELISA及び/又はSPRによってCD16aタンパク質との結合及び機能活性を再分析し、CHO哺乳動物細胞系においてトランスフェクトして単一ドメイン抗体を発現してもよい。
【0051】
一実施例において、本開示の単一ドメイン抗体又はその抗原結合部分をコードするDNAは、標準的な分子生物学技術により得られてもよく、一つ又は複数の発現ベクターに挿入され、遺伝子を転写及び翻訳調節配列に操作可能に連結する。「操作可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子をベクターに連結し、ベクターにおける転写及び翻訳制御配列に抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するその所期の機能を発揮させることを意味することが意図されている。「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図されている。このような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))に記述されている。哺乳動物宿主細胞の発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現をガイドするウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルスウイルス(CMV)、シミアンウイルス(Simian Virus)40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス一次進行プロモーター(AdMLP))及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーを含む。代替的に、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーター又はβ-グロビンプロモーターを用いてもよい。さらに、調節エレメントは、異なる起源の配列、例えば、SRαプロモーター系で構成され、それは、SV40初期プロモーター配列及びヒトT細胞白血病ウイルス1型からの長末端反復配列を含有する(Takebeら,(1988)Mol. Cell. Biol.8:466-472)。用いられた発現宿主細胞に適応する発現ベクター及び発現制御配列を選択する。
【0052】
DNAをコードする抗体を発現ベクターに挿入してもよい。組換え発現ベクターは、シグナルペプチドをコードすることができ、それが、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進する。抗体をコードするDNAをベクターにクローニングし、抗体をコードするDNAのアミノ末端にシグナルペプチドをフレーム内で連結してもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(即ち、非免疫グロブリン由来のシグナルペプチド)であってもよい。
【0053】
sdAb(又はsdAb-IgGFc)を発現するために、抗体鎖をコードする一つ又は複数の発現ベクターを標準的技術によって宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。「トランスフェクション」という異なる形の用語は、外因性DNAを原核又は真核宿主細胞に導入するために一般的に用いられる複数の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどをカバーすることが意図されている。本開示の抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を十分な時間培養して、宿主細胞内での抗体の発現を可能にするか、又はより好ましくは、宿主細胞が増殖する培地に抗体を分泌させることを可能にすることによって、抗体を産生する。抗体は、標準タンパク質精製方法を用いて培地から回収され得る。
薬物組成物及び治療方法
【0054】
別の態様では、本開示は、薬物組成物を提供し、それは、一つ又は複数の本発明の抗体、又は本明細書に記載の二重特異性分子、免疫コンジュゲートもしくはキメラ抗原受容体、及び従来の技術による薬学的に許容されるキャリア剤を含む。
【0055】
該組成物は、一つ又は複数の別の薬物有効成分、例えば、別の抗体、薬物、例えば、細胞傷害性薬剤又は抗腫瘍剤を含んでもよい。本発明の薬物組成物はさらに、例えば、別の抗癌剤、別の抗炎症剤などとの併用治療において投与されてもよい。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容されるキャリア剤」は、薬学的に許容されるキャリア剤、賦形剤又は安定剤を含む。これらは、生理学的に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体粘着剤、分散又は懸濁助剤、溶解度促進剤、着色剤、香味剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、防腐剤、等張剤などを含むが、それらに限らない。適切なキャリア剤の選択は、当業者の知識の範囲内にある。
【0056】
該薬物組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、表皮及び他の投与経路に適用され得る。投与経路に応じて、有効成分は、一つの材料でコーティングするか、又は他の方式で一つの材料又は構造にロードすることによって、酸及びそれを不活性化する可能性のある他の自然条件の作用から保護される。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常、注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与モードを指すことが意図され、且つ静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射と注入を含むが、それらに限らない。代替的に、本発明の抗体は、非経口経路、例えば、局所、経表皮又は経粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、経直腸、舌下又は局所によって投与されてもよい。
【0057】
別の態様では、本開示は、被験体(例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物)の免疫媒介性疾患(例えば、癌)を治療するための方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の薬物組成物を被験体に投与することを含む。癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、胃癌、神経膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌及び子宮癌からなる群から選択されてもよい。
【0058】
別の態様では、本開示は、被験体におけるNK細胞の増殖を促進する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の薬物組成物を被験体に投与することを含む。
【0059】
被験体に組成物を投与する場合、用量プロトコルを調整することによって、最適な所望の反応(例えば、治療反応)を提供することができる。被験体、治療される疾患などに基づいて単回ボーラス又は分割用量を投与することができる。本明細書で使用される用量単位形態は、治療対象被験体の単位用量として適切な物理的離散単位を指す。各単位は所定量の有効成分を含有し、該有効成分は、計算によって、必要な薬物キャリア剤と組み合わせて所望の治療効果をもたらすことができる。徐放性製剤を使用してもよく、この場合に投与頻度を低下させる必要がある。
【0060】
本開示の抗体の投与について、用量の範囲は、被験体の体重に対して約0.0001~100mg/kgであってもよく、より一般的には、0.01~5mg/kgである。例えば、用量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重もしくは10mg/kg体重又は1~10mg/kgの範囲内であってもよい。適切な治療プロトコルは、週に一回、約二週間に一回、約三週間に一回、約四週間に一回、約一ヶ月に一回などであってもよい。本発明の抗CD16a抗体の例示的用量プロトコルは、静脈内投与される1mg/kg体重又は3mg/kg体重を含んでもよい。
【0061】
「治療有効量」又は本発明のCD16aを標的とする抗体の「治療有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患の無症候性期間の頻度及び/又は持続時間の増加、疾患の苦しみによる損傷もしくは障害の可能性の予防又は低下、又は疾患の進行の抑制又は遅延をもたらす。例えば、腫瘍を有する被験体の治療に対して、「治療有効量」の抗体組成物は、治療されていない被験体に比べて、腫瘍増殖を少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、なおさらに好ましくは少なくとも約80%抑制することができる。
【0062】
以下の例は、単に本発明的の例示であることを意図するため、いかなる方式で本発明を限定するものと見なされるべきではない。以下の具体例と詳細な記述は、説明として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。
例1:抗CD16aラマ単一ドメイン抗体(sdAb)の産生
免疫
【0063】
現行の動物福祉法に従い、組換えヒトCD16a-Hisタンパク質(Acro Biosystems、カタログ番号:CDA-H52S1)を用いてラマを免疫した。免疫に対して、抗原をPBS溶液中の形態で投与するか、又は抗原をCFA(完全フロイントアジュバント、初回免疫)又はIFA(不完全フロイントアジュバント、強化免疫)とのエマルジョンとして製剤化した。抗原を頸部で皮下投与した。動物は、6回のエマルジョン注射を受け、CFAエマルジョン中の抗原200μgで行った初回免疫、その後にIFAエマルジョン中の抗原100μgを用いて1週間の間隔で行った3回の強化免疫、その後にIFAエマルジョン中の抗原50μgを用いて1週間の間隔で行った2回の注射を含む。複数ラウンドの免疫後に、100mlの血液試料を採集した。末梢血リンパ球(PBL)を、ラマ重鎖抗体(HCAb)の遺伝子供給源として勾配遠心分離によって血液試料から単離した。AFM13からの、CD16aを標的とする可変断片(特許番号:US 9,035,026 B2、Affirmed GMBH、ドイツ)を陽性対照(及び基準抗体)としてヒトIgG4又はマウスIgG1形態に組み込み、正常なヒトIgG4又はマウスIgG1をそれぞれアイソタイプ対照とした。
ファージディスプレイライブラリーの構築
【0064】
メーカーのプロトコルに従って、TRIZOL試薬(Thermo Fisher、カタログ番号15596026)を用いて、単離されたリンパ球から全RNAを抽出し、それをRT-PCRの出発材料として用いることによって、sdAbをコードする遺伝子断片を増殖させた。遺伝子増殖に対して、メーカーのプロトコルに従って、PRIMESCRIPT第1鎖cDNAを用いてキット(Takara、カタログ番号6110A)を合成し、オリゴ(dT)20プライマーを用いて、単離されたRNAをcDNAに逆転写した。6個のフォワード及び2個のリバース特異性縮重プライマーをデザインして、VH断片を増殖させた。
【0065】
二段階PCR方法によってVH断片の可変領域を増殖させた。一回目のPCRのDNA生成物を二回目のPCRでテンプレートとして用いた。VH PCR断片を含有する増殖した第2のPCR生成物に対してゲル精製及び酵素消化を行い、その後ファージミドプラスミドに挿入した。エレクトロポレーションにより組換えプラスミドを大腸菌細胞に形質転換し、サイズが1×10より大きいファージディスプレイライブラリーを作成した。標準的プロトコルに基づいてライブラリーファージを調製し、濾過し滅菌した後に-80℃で備蓄品として保存した。
ファージディスプレイのパニング
【0066】
ヒトCD16a細胞を過剰発現するCHO-K1細胞(ATCC、カタログ番号:CCL-61)(Genscriptにより構築)を用いて、構築されたファージライブラリーをスクリーニングし、又はまずヒトCD16b細胞を過剰発現するCHO-K1細胞(Genscriptにより構築)を用いて逆スクリーニングを行い、そしてGenScriptにより開発された標準手順に従って、ヒトCD16aを過剰発現するCHO-K1細胞を用いてパニングを行った。少なくとも2ラウンドの選択を行い、各選択が出力した濃縮因子(対照に対する、溶出液に存在するファージの数)、多様性及びCD16a陽性CD16b陰性又は弱クローンのパーセントを分析した。
【0067】
これらのパラメータに基づいて、さらなるスクリーニングのために最適な選択クローンを選択し、ハイスループットスクリーニングのためにそれをライブラリーとして可溶性発現ベクターにサブクローニングした。sdAbコード配列を有するリーディングフレームにおいて、ベクターがC末端Hisタグをコードした。コロニーを選択し96ウェル深型プレート(1ml体積)で成長させ、且つIPTG及び0.1% Tritonを添加することによって上清におけるsdAb発現を誘導した。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって上清をスクリーニングした。簡単に言えば、それぞれ0.5ug/ml CD16a及びCD16bタンパク質で96ウェルプレートをコーティングし、4℃で16時間インキュベートし、そして3% MPBSでブロッキングした。各ウェルに50ul上清を添加することによって一次抗体インキュベートを行い、プレートを37℃で1時間インキュベートした。そして、100ul抗VH二次抗体(Genscript、カタログ番号:A01861)を各ウェルにピペッティングした。そして、プレートを室温(RT)で60minインキュベートした。0.05% PBSTで洗浄した後、各ウェルに100ul TMBを添加した。そして、プレートをRTで15minインキュベートし、且つ50ul 1M HCLを添加して反応を終了させた。450nm位置でプレートを読み取った。
sdAb-Fc融合タンパク質の産生
【0068】
抗CD16a sdAbとヒトIgG4(又はマウスIgG1)Fc領域を融合させることによって抗CD16a sdAb-Fc融合タンパク質コンストラクトを産生した。CHO-3E7細胞の瞬時的発現のために、コンストラクトの大量調製(maxiprep)を調製した。タンパク質Aアガロース樹脂を含有するカラムクロマトグラフィーによって、発現した抗CD16a sdAb-Fc融合タンパク質を精製した。22個の分子を産生した。
例2:抗CD16a sdAbのインビトロ特徴づけ
CD16aに対する抗CD16a sdAbの特異的親和性
【0069】
以上に記載したように、ヒトCD16は、CD16a及びCD16bという二つのサブタイプで発現することができ、それらは、高度に相同であり、それらの細胞外免疫グロブリン結合領域に96%の配列同一性を有する。なお、CD16bは、可溶性受容体として血清に存在してもよく、抗体に結合した後、インビボで免疫複合体を形成することによって副作用を引き起こし得る。CD16a特異性抗体は、疾患関連細胞に対する二重特異性又は多重特異性抗体の構築に特に有用である。この場合に、抗体は、主にNK細胞を動員し、且つサイクルの可溶性CD16bと結合するか、又は好中球もしくは活性化された好酸球に結合してNK細胞結合から移されることはない。
【0070】
CD16bではなくヒトCD16aに対する22種のsdAb結合特異性を確定するために、ヒトCD16a(Acro Biosystems、カタログ番号:CDA-H52S1)又はCD16b(Acro Biosystems、カタログ番号:CDB-H5227)をELISAプレート(0.5μg/ml、100μl)に4℃で一晩プレコーティングした。翌日、ウェルを3倍連続希釈されたsdAb融合タンパク質(hIgG4 Fc領域を有し、SEQ ID NO:73)(初期濃度が1.0μg/mlである)と共にインキュベートし、そしてHRPコンジュゲーションヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Rockland)と共にインキュベートして、基質TMB発色反応を行った。450nm位置の光密度リードを用いて、結合を定量した。ヒトCD16aに対して特異的親和性を示すが、CD16bに対して親和性を示さないか又は無視できるほど低い親和性を有するsdAbを選択してさらにスクリーニングした。結果(図1A-1、図1A-2、図2A-1、図2A-2)に基づいて、合計7個のsdAb分子、即ちAR8804、AR8820、AR8776、AR8875、AR8866、AR8887、AR8861(SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、25)を選択してさらに検証した。そして、これらの選択されたリーダー配列を、さらなる研究のためにマウスIgG1 Fcと融合させた。
例3:sdAbのNK細胞傷害性誘発効果
【0071】
該部分では、AR8776、AR8804、AR8820、AR8861、AR8866、AR8875及びAR8887 sdAbをマウスIgG1 Fc形態(SEQ ID NO:74)に再連結し、CD16aに対する親和性特異性をELISAにより検証した。簡単に言えば、CD16a結合アッセイに対して、ヒトCD16a(Acro Biosystems、カタログ番号:CDA-H52S1)をELISAプレート(1μg/ml、100μl)に4℃で一晩プレコーティングした。翌日、ウェルを3倍連続希釈されたsdAb融合タンパク質(mIgG1 Fcを有する)(初期濃度が1.0μg/mlである)と共にインキュベートし、そしてHRPコンジュゲーションヤギ抗マウスIgG(H+L)(Rockland、カタログ番号:610-103-121)と共にインキュベートし、基質TMB発色反応を行った。CD16b結合アッセイに対して、CD16b(Acro Biosystems、カタログ番号:CDB-H5227)をELISAプレート(1μg/ml、100μl)に4℃で一晩プレコーティングした。翌日、ウェルを単回用量1.0μg/mlのsdAb融合タンパク質(mIgG1 Fcを有する)と共にインキュベートし、そしてHRPコンジュゲーションヤギ抗マウスIgG(H+L)(Rockland、カタログ番号:610-103-121)と共にインキュベートし、基質TMB発色反応を行った。再連結された分子は、CD16aに対する親和性特異性を保持した(図2B-1、図2B-2)。AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mLCK-IgG1又はAFM13-CD16a-mIgG1とも呼ばれる)は基準対照試料として用いられたが、マウスIgGはアイソタイプ対照として用いられた。11H1D3は、ヒトCD16aに対する内部mAb-マウスIgG1抗体であり、ヒトCD16bに対して高い親和性を有すると証明され、本実験において陽性試料として用いられた。ELISA実験後にリバースADCCアッセイを行うことによって、これらの分子がNK細胞の細胞傷害性を誘発する強度を測定した。簡単に言えば、10,000個のヒトNK-92 158V/V細胞を、5ug/ml sdAbを用いて前処理されたマウスP815標的細胞(SailyBio、上海)と5:1のE/T比で4時間共培養した。そして、LDH細胞傷害性キット(Roche)を用いて、特異的開裂のパーセントを計算した。AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mLCK-IgG1とも呼ばれる)は基準対照試料として用いられたが、マウスIgGはアイソタイプ対照として用いられた。結果によると、AR8887を除いて、全てのsdAbは、いずれも顕著な細胞傷害性誘発活性を示し、ここで、分子AR8861、AR8866及びAR8875は、基準抗体よりも優れた細胞傷害性誘発活性を示した(図3)。そのため、AR8804、AR8820、AR8861、AR8866及びAR8875分子を選択してヒト化を行った。
例4:ヒト化抗体の産生及び分析
候補抗体のヒト化デザイン
【0072】
抗体の機能アッセイにおける効果及びその可変ドメイン配列に基づいて、CDR、HVループ及びFRを分析し、相同性モデリングを行うことによって、AR8804、AR8820、AR8861、AR8866及びAR8875のsdAbのモデリング構造を得た。フレームワーク残基の溶媒接触表面積を計算した。結果に基づいて、埋め込まれたフレームワーク残基(即ち溶媒接触表面積<15%)を同定した。いくつかのVHのヒト受容体を選択し、それらは、ラマ対照物と最も高い配列の同一性を有する。ラマ抗体のCDRをヒト受容体フレームワーク上に直接移植することによって、移植抗体の配列を得た。開発可能性評価によって、移植配列における、脱アミド、異性化酸化及びグリコシル化などを含む翻訳後修飾及び化学分解を分析した。PTMホットポイント、例えば、N-グリコシル化部位、異常なプロリン残基、脱アミド部位、異性化部位、酸化部位及びペアリングされていないシステイン残基などを同定し、それらは、移植抗体の結合活性及び調製可能性に影響を及ぼし得る。ヒト化抗体をコードするDNA配列を合成した。抗体特徴を比較して最適な候補抗体を選択した。これらのヒト化分子の産生に成功した。
ヒト化抗体
【0073】
ヒト化抗体の産生について、本発明者らは、ヒト化抗CD16a sdAbをヒトIgG4(又はマウスIgG1)Fc領域のN末端に融合さセルことによって、抗CD16a sdAb-Fc融合タンパク質を産生した。各抗CD16a sdAb-Fc融合タンパク質を発現するDNA配列をpTT5ベクターにおけるEcoRIとHindIII限制部位との間に挿入した。37℃及び100rpm下で、発現プラスミドによりトランスフェクトされたこれらのCHO-3E7細胞を6に日間培養した。上清部分を遠心分離によって収集し、且つタンパク質Aカラムによってタンパク質を精製した。
ヒト化抗体の特異的結合の親和性分析ELISA
【0074】
上記のように、CD16a特異性抗体は、疾患関連細胞に対する二重特異性又は多重特異性抗体の構築に特に有用である。ELISAによってヒト化sdAbのタンパク質結合特異性を測定するために、精製された誘導された41種のヒト化sdAb-mIgG1 Fc融合タンパク質をELISAプレート(0.5μg/ml、100μl)に4℃で一晩プレコーティングした。翌日、ウェルを1.0μg/mlの一次抗体と共にインキュベートし、そしてHRPコンジュゲーションヤギ抗マウスIgG(H+L)(Rockland、カタログ番号:610-103-121)と共にインキュベートし、基質TMB発色反応を行った。450nm位置の光密度リードを用いて、抗体-CD16a及びCD16b結合(図4A-4B、図5A-5B)を定量し、CD16aに対して特異的親和性を有する候補物を選択して、さらなるスクリーニングを行った。AFM-CD16a-mIgG1は基準対照試料として用いられたが、マウスIgGはアイソタイプ対照として用いられた。
【0075】
ヒトCD16aに対して顕著な親和性を有するが、ヒトCD16bに対して親和性を示さないか又は無視できるほど低い親和性を有する合計34種のヒト化分子を選択して、FACSによってさらに確認した。簡単に言えば、sdAb生成物の細胞表面CD16a結合EC50を測定するために、ヒトCD16aを発現するHEK293細胞(Genscriptにより構築)を収穫し、連続希釈された抗CD16a sdAb(最大濃度:100nM、3倍希釈)と共にインキュベートし、そして蛍光団(iFluor 647)により標識されたヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(Jackson immuno research、カタログ番号:115-605-062)と共にインキュベートした。そしてフローサイトメトリーで試料を分析した。GraphPad Prism v6.02ソフトウェアを用いて生データをプロットし、4パラメータベストフィット値プログラムでEC50を分析した。AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mIgG1)は基準対照試料として用いられたが、マウスIgGはアイソタイプ対照として用いられた。結果(図6A/6B/7A/7B/8A/8B/9A/9B/10A/10B)は、選択された分子の親和性特異性を証明した。しかしながら、分子AR8866からの全ての誘導体(合計10個)は、他の親分子からのものよりもはるかに弱い親和性を示した。
ヒト化sdAbのNK細胞傷害性誘発効果
【0076】
以上に記載したように、リバースADCCアッセイによって、ヒト化sdAbがNK細胞の細胞傷害性を誘発する強度を測定した。簡単に言えば、10,000個のヒトNK-92 158V/V細胞を、0.008μg/ml sdAb-mIgG1 Fc融合タンパク質(pTT5ヒト化sdAb-m IgG1Fc)を用いて前処理されたマウスP815標的細胞(SailyBio、上海)と5:1のE/T比で4時間共培養した。そして、LDH細胞傷害性キット(Roche)を用いて、特異的開裂のパーセントを計算した。AFM13-CD16a-mIgG1は基準対照として用いられたが、マウスIgGはアイソタイプ対照として用いられた。図11A及び図11Bに示すように、結果によると、16種の分子は、pTT5-AR8861-1.1mIgG1Fc、pTT5-AR8861-1.2mIgG1Fc、pTT5-AR8861-2.1mIgG1Fc、pTT5-AR8861-2.2mIgG1Fc、pTT5-AR8861-1.3mIgG1Fc、pTT5-AR8861-4.1mIgG1Fc、pTT5-AR8861-4.2mIgG1Fc、pTT5-AR8861-5.1mIgG1Fc、pTT5-AR8861-5.2mIgG1Fc、pTT5-AR8861-6mIgG1Fc、pTT5-AR8804-3.1mIgG1Fc、pTT5-AR8804-3.3mIgG1Fc、pTT5-AR8804-1.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.1mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.3mIgG1Fc及びpTT5-AR8820-3.1mIgG1Fcを含み、NK細胞の細胞傷害性を誘発するのに顕著な効果を示した(図11A/11B)。
【0077】
インビトロ活性をさらに証明するために、そのうちのいくつかの抗ヒトCD16a sdAbリーダー配列を選択して、リバースADCCバイオアッセイの用量依存性応答を行った。簡単に言えば、10,000個のヒトNK-92 158V/V細胞を、5倍連続希釈された試料(初期濃度1.0μg/mlから希釈)を用いて前処理されたマウスP815標的細胞(SailyBio、上海)と5:1のE/T比で4時間共培養した。そして、LDH細胞傷害性キット(Roche)を用いて、特異的開裂のパーセントを計算した。図12に示すように、選択されたリーダー配列pTT5-AR8804-3.1mIgG1Fc、pTT5-AR8804-3.3mIgG1Fc及びpTT5-AR8820-1.3mIgG1Fcは、AFM13-CD16a-mIgG1の基準抗体よりはるかに多くの活性を示した。
抗CD16aヒト化抗体及びカニクイザルCD16aタンパク質の種間反応
【0078】
抗体生成物の交差反応を確定するために、カニクイザルCD16aを発現するHEK293細胞(Genscriptにより構築)を収穫し、それぞれ連続希釈された抗CD16aヒト化sdAb-mIgG1Fc(最大濃度:100nM、3倍希釈)と共にインキュベートし、そして蛍光団(iFluor 647)により標識されたヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(Jackson immuno research、カタログ番号:115-605-062)と共にインキュベートした。そしてフローサイトメトリーで試料を分析した。GraphPad Prism v6.02ソフトウェアを用いて生データをプロットし、4パラメータベストフィット値プログラムでEC50を分析した。pTT5-AR8804-3.2mIgG1Fc、pTT5-AR8804-3.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.1mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.2mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-2.1mIgG1Fc、pTT5-AR8820-2.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-3.1mIgG1Fc及びpTT5-AR8820-3.3mIgG1Fcの分子は、カニクイザルCD16aタンパク質との良好な交差反応を示した(図13)。


配列表

下線が付けられているアミノ酸配列はそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3である。
ラクダ科sdAb

> AR8804
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKERELVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLEPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)
AR8804のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8820
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQGPGKERELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKSTVLLQMNSLKPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)
AR8820のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820のCDR2:VVRITGSPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8776
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRGGSITNYADSVKGRFAISRDNAKNTIYLQMNNLRPEDTAQYSCARGDSTYSRLSAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)
AR8776のCDR1:NYAMS(SEQ ID NO:10)
AR8776のCDR2:SINRGGSITNYADSVKG(SEQ ID NO:11)
AR8776のCDR3:GDSTYSRLSAAY(SEQ ID NO:12)

> AR8875
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFAISRDNAKNTMYLQMNNLRPEDTARYVCARGDSTYSRLTAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)
AR8775のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8775のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775のCDR3:GDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:16)

> AR8866
QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:17)
AR8866のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8887
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFLYYSIGWFRQAPGKEREWVSCISRSGAGTSYANSVKGRSTISRDNDKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCARRATSSCTATMTRGQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:21)
AR8887のCDR1:YSIG(SEQ ID NO:22)
AR8887のCDR2:CISRSGAGTSYANSVKG(SEQ ID NO:23)
AR8887のCDR3:RATSSCTATMTRGQYDY(SEQ ID NO:24)

> AR8861
AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:25)
AR8861のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

以下はヒト化sdAbである
> AR8861-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29)
AR8861-1.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
AR8861-1.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-2.1
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31)
AR8861-2.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-2.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)
AR8861-2.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLVWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
AR8861-3のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-3のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-3のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861~4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
AR8861~4.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861~4.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861~4.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861~4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
AR8861~4.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861~4.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861~4.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-5.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)
AR8861-5.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-5.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)
AR8861-5.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-6
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVADISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)
AR8861-6のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-6のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-6のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8804-1.1
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKGRELVSVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:39)
AR8804-1.1のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
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> AR8804-1.3
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> AR8804-2.3
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> AR8804-3.1
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> AR8804-3.2
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> AR8804-3.3
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> AR8820-1.1
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> AR8820-1.2
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> AR8820-1.3
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> AR8820-2.3
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> AR8820-3.1
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> AR8820-3.2
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> AR8820-3.3
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> AR8866-1.1
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AR8866-1.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-1.2
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> AR8866-2.1
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)
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AR8866-2.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-2.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)
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AR8866-2.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-2.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLVWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:57)
AR8866-3のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-3のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-3のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)
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AR8866-4.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:59)
AR8866-4.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-4.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-4.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-5.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)
AR8866-5.1のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-5.1のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-5.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-5.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)
AR8866-5.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-5.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-5.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-6
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVADISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:62)
AR8866-6のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-6のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-6のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8875-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLVWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:63)
AR8875-1.1のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-1.1のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-1.1のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLVWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:65)
AR8875-1.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-1.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-1.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:67)
AR8875-2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-2のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-3.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 68)
AR8875-3.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-3.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-3.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 69)
AR8875-4.1のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-4.1のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-4.1のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 70)
AR8875-4.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-4.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-4.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-5
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVASIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 71)
AR8875-5のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-5のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-5のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-6
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 72)
AR8875-6のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-6のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-6のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)
ヒトIgG4 Fc
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:73)
マウスIgG1 Fc
VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:74)
図1A
図2A
図2B
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
【配列表】
2024532886000001.xml
【手続補正書】
【提出日】2024-02-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0078
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0078】
抗体生成物の交差反応を確定するために、カニクイザルCD16aを発現するHEK293細胞(Genscriptにより構築)を収穫し、それぞれ連続希釈された抗CD16aヒト化sdAb-mIgG1Fc(最大濃度:100nM、3倍希釈)と共にインキュベートし、そして蛍光団(iFluor 647)により標識されたヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(Jackson immuno research、カタログ番号:115-605-062)と共にインキュベートした。そしてフローサイトメトリーで試料を分析した。GraphPad Prism v6.02ソフトウェアを用いて生データをプロットし、4パラメータベストフィット値プログラムでEC50を分析した。pTT5-AR8804-3.2mIgG1Fc、pTT5-AR8804-3.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.1mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.2mIgG1Fc、pTT5-AR8820-1.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-2.1mIgG1Fc、pTT5-AR8820-2.3mIgG1Fc、pTT5-AR8820-3.1mIgG1Fc及びpTT5-AR8820-3.3mIgG1Fcの分子は、カニクイザルCD16aタンパク質との良好な交差反応を示した(図13)。

配列表

下線が付けられているアミノ酸配列はそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3である。
ラクダ科sdAb

> AR8804
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKERELVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLEPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)
AR8804のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8820
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQGPGKERELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKSTVLLQMNSLKPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)
AR8820のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820のCDR2:VVRITGSPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8776
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRGGSITNYADSVKGRFAISRDNAKNTIYLQMNNLRPEDTAQYSCARGDSTYSRLSAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)
AR8776のCDR1:NYAMS(SEQ ID NO:10)
AR8776のCDR2:SINRGGSITNYADSVKG(SEQ ID NO:11)
AR8776のCDR3:GDSTYSRLSAAY(SEQ ID NO:12)

> AR8875
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFAISRDNAKNTMYLQMNNLRPEDTARYVCARGDSTYSRLTAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)
AR8775のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8775のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775のCDR3:GDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:16)

> AR8866
QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:17)
AR8866のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8887
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFLYYSIGWFRQAPGKEREWVSCISRSGAGTSYANSVKGRSTISRDNDKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCARRATSSCTATMTRGQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:21)
AR8887のCDR1:YSIG(SEQ ID NO:22)
AR8887のCDR2:CISRSGAGTSYANSVKG(SEQ ID NO:23)
AR8887のCDR3:RATSSCTATMTRGQYDY(SEQ ID NO:24)

> AR8861
AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:25)
AR8861のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

以下はヒト化sdAbである
> AR8861-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29)
AR8861-1.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
AR8861-1.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-2.1
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31)
AR8861-2.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-2.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)
AR8861-2.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLVWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
AR8861-3のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-3のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-3のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861~4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
AR8861~4.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861~4.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861~4.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861~4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
AR8861~4.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861~4.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861~4.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-5.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)
AR8861-5.1のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.1のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.1のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-5.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)
AR8861-5.2のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.2のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.2のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8861-6
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVADISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)
AR8861-6のCDR1:IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-6のCDR2:DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-6のCDR3:GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)

> AR8804-1.1
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AR8804-1.1のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-1.1のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8804-1.3
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AR8804-1.3のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-1.3のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-1.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8804-2.3
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AR8804-2.3のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-2.3のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-2.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8804-3.1
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AR8804-3.1のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-3.1のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-3.1のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8804-3.2
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AR8804-3.2のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-3.2のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-3.2のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8804-3.3
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AR8804-3.3のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-3.3のCDR2:VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-3.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)

> AR8820-1.1
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQAPGKGRELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:45)
AR8820-1.1のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-1.1のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-1.1のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-1.2
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AR8820-1.2のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-1.2のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-1.2のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-1.3
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQAPGKGRELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:47)
AR8820-1.3のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-1.3のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-1.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-2.1
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> AR8820-2.3
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AR8820-2.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-3.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQAPGKGRELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)
AR8820-3.1のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-3.1のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-3.1のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-3.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQAPGKGREWVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)
AR8820-3.2のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-3.2のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-3.2のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8820-3.3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQAPGKGRELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)
AR8820-3.3のCDR1:RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820-3.3のCDR2:VVRITGPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820-3.3のCDR3:GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)

> AR8866-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)
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AR8866-1.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)
AR8866-1.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-1.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-1.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-2.1
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)
AR8866-2.1のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-2.1のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-2.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-2.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)
AR8866-2.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-2.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-2.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLVWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:57)
AR8866-3のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-3のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-3のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)
AR8866-4.1のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-4.1のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-4.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:59)
AR8866-4.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-4.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-4.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-5.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)
AR8866-5.1のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-5.1のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-5.1のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-5.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)
AR8866-5.2のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-5.2のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-5.2のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8866-6
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVADISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:62)
AR8866-6のCDR1:VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866-6のCDR2:DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866-6のCDR3:GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)

> AR8875-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLVWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:63)
AR8875-1.1のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-1.1のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-1.1のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLVWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:65)
AR8875-1.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-1.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-1.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:67)
AR8875-2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775-2のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-3.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 68)
AR8875-3.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-3.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-3.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 69)
AR8875-4.1のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-4.1のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-4.1のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 70)
AR8875-4.2のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-4.2のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-4.2のCDR3:SDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:66)

> AR8875-5
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVASIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 71)
AR8875-5のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-5のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-5のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)

> AR8875-6
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARADSTYSRLTAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 72)
AR8875-6のCDR1:NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-6のCDR2:SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-6のCDR3:ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)
ヒトIgG4 Fc
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:73)
マウスIgG1 Fc
VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:74)
【国際調査報告】