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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】改変ＡＡＶカプシドおよびベクター
(51)【国際特許分類】
C07K 14/015 20060101AFI20240903BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240903BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240903BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C07K14/015 ZNA
C12N15/35
C12N15/864 100Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513133
(86)(22)【出願日】2022-08-25
(85)【翻訳文提出日】2024-04-25
(86)【国際出願番号】 AU2022051006
(87)【国際公開番号】W WO2023023779
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】2021902737
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522336937
【氏名又は名称】チルドレンズ・メディカル・リサーチ・インスティテュート
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】カバネス クレウス，マルティ
(72)【発明者】
【氏名】リソフスキー，レシェク
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC01
4B065BD15
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA15
(57)【要約】
本開示は、一般的に、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子に関する。本開示はまた、カプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、およびコードする核酸分子を含む核酸ベクター（例えば、プラスミド）、ならびにベクターを含む宿主細胞にも関する。本開示はまた、ポリペプチド、コードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞の方法および使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって：バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み；
カプシドポリペプチドが：（ｉ）配列番号２に示される配列；（ｉｉ）配列番号２の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号２の位置２０３～７３６のアミノ酸の配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド。
【請求項2】
バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって：バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み；
カプシドポリペプチドが（ｉ）配列番号４に示される配列；（ｉｉ）配列番号４の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号４の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド。
【請求項3】
バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって：バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み；
カプシドポリペプチドが：（ｉ）配列番号３４０に示される配列；（ｉｉ）配列番号３４０の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号４の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド。
【請求項4】
バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７４、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドを含む、ＡＡＶベクター。
【請求項6】
異種コード配列をさらに含む、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項7】
異種コード配列がペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項8】
ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが治療用ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項11】
プラスミド、コスミド、ファージ、およびトランスポゾンの中から選択される、請求項１０に記載のベクター。
【請求項12】
請求項５～８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、請求項９に記載の核酸分子、または請求項１０もしくは請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項13】
宿主細胞を請求項５～８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターと接触させることを含む、異種コード配列を宿主細胞に導入するための方法。
【請求項14】
宿主細胞が肝細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることが、対象にＡＡＶベクターを投与することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
インビトロまたはエクスビボである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項17】
ＡＡＶベクターを産生するための方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、請求項１～４のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドを含むカプシドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを促進するのに適した条件下で培養することを含み、カプシドが異種コード配列をカプシド化する、方法。
【請求項18】
宿主細胞が肝細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ヒト肝細胞において増強された形質導入効率を示す改変ＡＡＶベクターを産生するための方法であって：ａ）インビボでヒト肝細胞を形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定することと；
ｂ）配列番号５に対するナンバリングで、位置２６２～２７１に配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号５に対するナンバリングで、位置２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０および２７１のうちの１つ以上で改変することと；
ｃ）改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することと
を含む、方法。
【請求項20】
参照カプシドポリペプチドが、配列番号２、４または３４０に示される配列に対して、少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
改変ＡＡＶベクターの形質導入効率を、ヒト肝細胞を使用するインビボ系で評価することをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
インビボ系が、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する小動物（例えば、マウス）を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
インビボ系がｈＦＲＧマウスを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は一般的に、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドおよびコード核酸分子に関する。本開示はまた、カプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、およびコードする核酸分子を含む核酸ベクター（例えば、プラスミド）、ならびにベクターを含む宿主細胞にも関する。本開示はまた、ポリペプチド、コードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞の方法および使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は、ウイルスベクターを用いて最も一般的に研究され、達成されてきており、最近の注目すべき進歩は、アデノ随伴ウイルスベクターに基づくものである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムの長さは約４．７ｋｂである。ＡＡＶゲノムには、分子の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれており、ｒｅｐおよびｃａｐという２種のオープンリーディングフレームに隣接している。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３という３つの構造カプシドタンパク質をコードする。３つのカプシドタンパク質は通常、１：１：８～１０の比率でアセンブルして、ＡＡＶカプシドを形成するが、ＶＰ３、またはＶＰ１およびＶＰ３、またはＶＰ２およびＶＰ３のみを含むＡＡＶカプシドが生成されている。ｃａｐ遺伝子は、別のオープンリーディングフレーム由来のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）もコードする。ＡＡＰは、カプシドアセンブリを促進し、カプシドタンパク質を核小体に向けてカプシド形成を促進するように作用する。ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０という４つの既知の調節タンパク質をコードしている。これらのＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製、パッケージング、ゲノム統合、およびその他のプロセスに関与している。最近では、ＡＡＶ２ゲノムの３’末端にＸ遺伝子が同定された（Cao et al. PLoS One, 2014, 9: e104596）。コードされたＸタンパク質は、ＤＮＡ複製を含むＡＡＶのライフサイクルに関与しているようである。
【0003】
ＩＴＲは、いくつかの機能、特にＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込み、ならびにゲノムの複製およびパッケージングに関与している。ＡＡＶが宿主細胞に感染すると、ウイルスゲノムが宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれ、細胞の潜伏感染が起こる。したがって、ＡＡＶは、異種配列を細胞に導入するために活用され得る。自然界では、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、感染細胞でのＡＡＶウイルスの複製および新しいビリオンのパッケージングを可能にするタンパク質因子を提供する。アデノウイルスの場合、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスに感染すると、ＡＡＶプロウイルスがレスキューおよび増幅され、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスの両方が生成される。
【0004】
天然のＡＡＶゲノムの一部、大部分、または全てを欠き、代わりにＩＴＲが隣接する１つ以上の異種配列を含むゲノムを含むＡＡＶベクター（組換えＡＡＶ、ｒＡＡＶとも呼ばれる）は、遺伝子治療設定において首尾よく使用されてきた。これらのＡＡＶベクターは、治療目的で対象の細胞に異種核酸を送達するために広く使用され、多くの場合、治療効果を与えるのは異種核酸の発現である。現在、いくつかのＡＡＶベクターが臨床で使用されているが、治療用途に異種核酸の適切な発現を促進するために必要な初代ヒト細胞／組織のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）形質導入効率を示す数は限られている。したがって、インビボでの宿主細胞の効率的な形質導入を促進するカプシドタンパク質を含む代替ＡＡＶベクターを開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、改善された形質導入効率に関連するＡＡＶカプシド可変領域（ＶＲ）－Ｉ配列の生成および同定を部分的に前提としている。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＶＲ－Ｉ配列を含む本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクターに含まれる場合、ヒト細胞（ヒト肝細胞など）の効率的な形質導入を促進する。典型的には、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターのインビボ形質導入は、他のＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号５に示されるプロトタイプのＡＡＶ２カプシド）を含むＡＡＶベクターと比較して改善される。したがって、本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクター、特に遺伝子治療用のＡＡＶベクターを調製するのに特に有用である。同様に、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター（すなわち、本開示のカプシドポリペプチドを含むか、またはそれからなるカプシドを有する）は、遺伝子治療用途、例えば、様々な疾患および状態の治療のための異種核酸の送達に特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本開示は、バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって、バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み、カプシドポリペプチドが：（ｉ）配列番号２に示される配列；（ｉｉ）配列番号２の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号２の位置２０３～７３６のアミノ酸の配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドを提供する。
【0007】
特定の実施形態では、バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含む。
【0008】
本開示の別の態様は、バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって、バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み、カプシドポリペプチドが；（ｉ）配列番号４に示される配列（ｉｉ）配列番号４の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号４の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくとも、または約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドを提供する。
【0009】
特定の実施形態では、バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含む。
【0010】
本開示の別の態様は、バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドポリペプチドであって、バリアントＶＲ－Ｉが、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含み、カプシドポリペプチドが：（ｉ）配列番号３４０に示される配列；（ｉｉ）配列番号３４０の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列；または（ｉｉｉ）配列番号３４０の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくとも、または約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドを提供する。
【0011】
特定の実施形態では、バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含む。
【0012】
また、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターも提供される。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、治療用ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をコードする異種コード配列などの異種コード配列を含む。
【0013】
また、本開示のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。別の態様では、前述の核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの例では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージおよびトランスポゾンの中から選択される。
【0014】
別の態様では、本開示のＡＡＶベクター、核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞が提供される。
【0015】
本開示のＡＡＶベクターと宿主細胞を接触させることを含む、異種コード配列を宿主細胞に導入するための方法もまた提供される。いくつかの例では、宿主細胞は肝細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることは、対象にＡＡＶベクターを投与することを含む。他の実施形態では、この方法はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）である。
【0016】
別の態様では、ＡＡＶベクターを産生する方法であって、本開示のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、本開示のカプシドポリペプチドを含むカプシドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを促進するのに適した条件下で培養することを含み、カプシドが異種コード配列をカプシド化する、方法が提供される。いくつかの例では、宿主細胞は肝細胞である。
【0017】
また、ヒト肝細胞において増強された形質導入効率を示す改変ＡＡＶベクターを産生するための方法であって、ａ）インビボでヒト肝細胞を形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定することと；ｂ）配列番号５に対するナンバリングで、位置２６２～２７１に配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号５に対するナンバリングで、位置２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０および２７１のうちの１つ以上で改変することと；ｃ）改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することとを含む、方法が提供される。いくつかの例では、参照カプシドポリペプチドは、配列番号２、４または３４０に示される配列に対して、少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、ヒト肝細胞を利用するインビボ系において改変ＡＡＶベクターの形質導入効率を評価することを含む。一例では、インビボ系は、ｈＦＲＧマウスなどのヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する小動物（例えばマウス）を含む。
【0019】
本開示の実施形態は、以下の図面を参照して、非限定的な例としてのみ、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】種々のＡＡＶ血清型のカプシドＶＲ－Ｉのアラインメントである。アラインメントの最初のアラニンはＡＡＶ２のＡ２４８に対応する。ＶＲ－ＩはＡＡＶ２カプシドの位置２６２～２７１にまたがっている。ＡＡＶ２のＳ２６２はＡＡＶ１とＡＡＶ３ｂのＳ２６２、ＡＡＶ９のＮ２６２、ＡＡＶ７のＳ２６３、ＡＡＶ８とＡＡＶ１０のＮ２６３に対応する。したがって、ＶＲ－Ｉは、ＡＡＶ３ｂカプシドの位置２６２～２７１、ＡＡＶ１カプシドの位置２６２～２７２、ＡＡＶ９カプシドの位置２６２～２７３、ＡＡＶ７カプシドの位置２６３～２７３、およびＡＡＶ８およびＡＡＶ１０カプシドの位置２６３～２７４にまたがっている。
【図2】ＡＡＶ２、ＡＡＶＣ１１．１１およびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨからのカプシド配列のアラインメントである。網掛けした太字のテキストは、本開示の目的のために定義したＶＲ－Ｉを表す。
【図3】実施例４に記載した二次ライブラリーからのバリアントのインビボ性能を示す（ＩＶＩｇ前免疫化なし）。（Ａ）ヒト肝細胞におけるＤＮＡ取り込み、および（Ｂ）ヒト肝細胞におけるｃＤＮＡ発現（機能的形質導入））。ｎ＝３ ＦＲＧマウス、カプシド当たり２ ＢＣ。バリアントは表１４、１６および１９に示す通りである。
【図4】実施例４（ＩＶＩｇ前免疫化）に記載した二次ライブラリーからのバリアントのインビボ性能を示す。（Ａ）ヒト肝細胞におけるＤＮＡ取り込み、および（Ｂ）ヒト肝細胞におけるｃＤＮＡ発現（機能的形質導入））。ｎ＝３ ＦＲＧマウス、カプシド当たり２ＢＣ。バリアントは表１４、１６および１９に示す通りである。
【図5】実施例４（ＩＶＩｇ前免疫化なし）に記載の二次ライブラリーからのバリアントのインビボ性能を示す。（Ａ）ヒト肝細胞におけるＤＮＡ取り込み、および（Ｂ）ヒト肝細胞におけるｃＤＮＡ発現（機能的形質導入））。ｎ＝３ ＦＲＧマウス、カプシド当たり２ＢＣ。バリアントは表１５、１７、１８および２０に示す通りである。
【図6】実施例４（ＩＶＩｇ前免疫化）に記載された二次ライブラリーからのバリアントのインビボ性能を示す。（Ａ）ヒト肝細胞におけるＤＮＡ取り込み、および（Ｂ）ヒト肝細胞におけるｃＤＮＡ発現（機能的形質導入））。ｎ＝３ ＦＲＧマウス、カプシド当たり２ ＢＣ。バリアントは表１５、１７、１８および２０に示す通りである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特に断りのない限り、開示全体を通じて参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および出版物、データベース、ウェブサイト、ならびにその他の公開された資料は、参照によりその全体が組み込まれる。用語の定義が複数ある場合は、このセクションの定義が優先される。ＵＲＬまたはその他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されてもよく、インターネット上の特定の情報は行き来してもよいが、インターネットを検索することで同等の情報を見つけることができることが理解される。識別子への言及は、そのような情報の入手可能性および一般への普及を証明する。
【0022】
本明細書で使用されるとき、単数形「１つの、ある（不定冠詞：ａ）」、「１つの、ある（不定冠詞：ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」はまた、文脈が明確に指示しない限り、複数の態様（すなわち、少なくとも１つ以上）を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、単一のポリペプチド、ならびに２種以上のポリペプチドを含む。
【0023】
本明細書の文脈において、「約」という用語は、当業者が同じ機能または結果を達成する文脈において列挙された値と等価であると考える数の範囲を指すと理解される。
【0024】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「含む」という語、ならびに「含む」および「含んでいる」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップのグループを除外するものではないことを意味すると理解される。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、ベクター内に含まれる導入遺伝子を宿主細胞に各々が送達し得る、ポリヌクレオチドベクターおよびウイルスベクターの両方への言及を含む。ベクターは、エピソームであり、すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれないか、または宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ベクターはまた、複製可能であってもまたは複製欠損であってもよい。例示的なポリヌクレオチドベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、およびトランスポゾンが挙げられる。例示的なウイルスベクターとしては、例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスベクターが挙げられる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」とは、カプシドがアデノ随伴ウイルスに由来するベクターを指し、これには限定するものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３、他のクレードもしくは分離株由来のＡＡＶが挙げられ、またはキメラカプシドタンパク質を含む、合成、生物工学的または改変されたＡＡＶカプシドタンパク質に由来する。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、本開示のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有する。ＡＡＶベクターを参照する場合、ゲノムの供給源とカプシドの供給源の両方を特定し得、ここで、ゲノムのソースは指定された最初の数であり、カプシドの供給源は指定された２番目の数である。したがって、例えば、カプシドとゲノムの両方がＡＡＶ２に由来するベクターは、より正確にはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ６由来のカプシドとＡＡＶ２由来のゲノムを有するベクターは、最も正確にはＡＡＶ２／６と呼ばれる。生物工学によるＤＪカプシドおよびＡＡＶ２由来のゲノムを有するベクターは、最も正確にはＡＡＶ２／ＤＪと呼ばれる。簡単にするために、またほとんどのベクターがＡＡＶ２由来のゲノムを使用するので、ＡＡＶ６ベクターへの言及は一般にＡＡＶ２／６ベクターを指し、ＡＡＶ２ベクターへの言及は一般にＡＡＶ２／２ベクターを指す、などが理解される。ＡＡＶベクターはまた、本明細書において「組換えＡＡＶ」、「ｒＡＡＶ」、「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶバリアント」、「組換えＡＡＶバリアント」、および「ｒＡＡＶバリアント」という用語で呼ばれることがあり、これらは交換可能に使用され、ＡＡＶゲノムをカプシド化するＡＡＶカプシドシェルを含む複製欠損ウイルスを指す。ＡＡＶベクターゲノム（ベクターゲノム、組換えＡＡＶゲノムまたはｒＡＡＶゲノムとも呼ばれる）は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する導入遺伝子を含む。典型的には、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つ以上は、ゲノムから全体または一部が、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失している。ベクターゲノムのレスキュー、複製、およびｒＡＡＶビリオンへのパッケージングには、機能的なＩＴＲ配列が必要である。
【0027】
「ＩＴＲ」という用語は、ＡＡＶゲノムのいずれかの末端における逆方向末端反復を指す。この配列はヘアピン構造を形成し得、原核生物のプラスミド由来のＡＡＶ ＤＮＡの複製およびレスキューまたは切除に関与している。本開示で使用するためのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列がｒＡＡＶの機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。
【0028】
本明細書で使用される場合、カプシドポリペプチドに関して「機能的」とは、ポリペプチドが自己アセンブルするか、または異なるカプシドポリペプチドとアセンブルして、ＡＡＶビリオンのタンパク質性シェル（カプシド）を生成し得ることを意味する。所与の宿主細胞内の全てのカプシドポリペプチドがＡＡＶカプシドにアセンブルするわけではないことを理解すべきである。好ましくは、全ＡＡＶカプシドポリペプチド分子の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％がＡＡＶカプシドにアセンブルする。この生物学的活性を測定するための適切なアッセイは、例えば、Smith-Arica and Bartlett(2001), Curr Cardiol Rep 3(1): 43-49に記載されている。
【0029】
「ＡＡＶヘルパー機能」または「ヘルパー機能」とは、ＡＡＶが宿主細胞によって複製およびパッケージ化されることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、限定するものではないが、ヘルパーウイルスとして、またはＡＡＶの複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルス遺伝子として、任意の多数の形態で提供され得る。ヘルパーウイルス遺伝子としては、限定するものではないが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡなどのアデノウイルスヘルパー遺伝子が挙げられる。ヘルパーウイルスとしては、限定するものではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、例えば、ワクシニア、およびバキュロウイルスが挙げられる。アデノウイルスには多くの異なるサブグループが含まれるが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用されている。ヒト、ヒト以外の哺乳動物、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手できるヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。寄託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウイルスが挙げられる。
【0030】
本明細書で使用する「形質導入」という用語は、１つ以上の特定の細胞型へのＡＡＶベクターの侵入、およびＡＡＶベクター内に含まれるＤＮＡの細胞への移動を指す。形質導入は、細胞または細胞集団においてＡＡＶ ＤＮＡから発現されたＡＡＶ ＤＮＡもしくはＲＮＡの量を測定することによって、および／またはＤＮＡから発現されたＡＡＶ ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む集団中の細胞の数を評価することによって評価され得る。ＲＮＡの存在または量が評価される場合、評価される形質導入のタイプは、本明細書では「機能的形質導入」、すなわちＡＡＶがＤＮＡを細胞に移し、そのＤＮＡを発現させる能力と呼ばれる。「形質導入効率」という用語およびその文法上の変形は、ＡＡＶベクターが宿主細胞に形質導入する能力、より具体的にはＡＡＶベクターが宿主細胞に形質導入する効率を指す。特定の実施形態では、形質導入効率は、インビボ形質導入効率であり、対象へのベクターの投与後に、ＡＡＶベクターがインビボで宿主細胞に形質導入する能力を指す。形質導入効率は、所定の数のベクター粒子への曝露またはその投与後に形質導入された宿主細胞の数（例えば、顕微鏡またはフローサイトメトリー技術を使用したＧＦＰまたはｅＧＦＰなどのベクターゲノムからのレポーター遺伝子の発現によって評価されるように）；所定の数のベクター粒子への曝露後の宿主細胞の集団におけるベクターＤＮＡの量（例えば、ベクターゲノムの数）；所定の数のベクター粒子への曝露後の宿主細胞集団中のベクターＲＮＡの量；ならびに所定の数のベクター粒子への曝露またはその投与後の宿主細胞集団におけるベクターゲノム中のレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）由来のタンパク質発現レベルを評価することを含む、当業者に公知である多くの方法で評価され得る。宿主細胞の集団は、特定の数の宿主細胞、組織の体積もしくは重量、または器官全体（例えば、肝臓）を表し得る。インビボ形質導入効率は、ＡＡＶベクターが肝臓の肝細胞などの宿主細胞にアクセスする能力；ＡＡＶベクターが宿主細胞に侵入する能力；および／または宿主細胞侵入時のベクターゲノムに含まれる異種コード配列の発現を反映し得る。
【0031】
本明細書で使用される場合、「対応するヌクレオチド」、「対応するアミノ酸残基」または「対応する位置」とは、整列された遺伝子座で生じるヌクレオチド、アミノ酸または位置を指す。関連またはバリアントのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、当業者に公知の任意の方法によって整列される。そのような方法は、典型的には一致を最大化し（例えば、位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸）、手動アラインメントの使用および利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔｌＷ、ＣｌｕｓｔｌＷ２、ＥＭＢＯＳＳ、ＬＡＬＩＧＮ、Ｋａｌｉｇｎ、等）および当業者に公知の他のものを用いることによる方法を含む。ポリヌクレオチドの配列を整列させることにより、当業者は、対応するヌクレオチドを同定し得る。２つのＡＡＶカプシドポリペプチドを整列（例えば図２に示すように）させることにより、当技術分野の当業者は、他方のＡＡＶポリペプチド内の様々な領域または残基に対応する、一方のＡＡＶポリペプチド内の領域またはアミノ酸残基を同定することができる。例えば、配列番号５に記載されるＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置２６２のセリンは、配列番号４に記載されるＡＡＶＣ１１．１１カプシドポリペプチドの位置２６３のセリンに対応するアミノ酸である、または対応する（図２のアラインメントに示されているように）。別の例では、また図２を参照すると、ＡＡＶＣ１１．１１カプシドポリペプチドの位置７３４は、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドポリペプチドの位置７３５と整列するか、またはそれに対応し、ＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置７３４のアスパラギンは、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドポリペプチドの位置７３５のプロリンに対応するか、またはそれに対応するアミノ酸である。さらなる例では、ＡＡＶ２カプシドのＶＲ－Ｉを構成するＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置２６２～２７１の残基は、ＡＡＶ７カプシドポリペプチドの残基２６３～２７３（すなわちＡＡＶ７カプシドのＶＲ－Ｉ）およびＡＡＶＣ１１．１１カプシドポリペプチドの残基２６３～２７２（すなわちＡＡＶＣ１１．１１カプシドポリペプチドのＶＲ－Ｉ）に対応する。したがって、アミノ酸残基または位置が特定のカプシドポリペプチドに関して本明細書で言及される場合、適切な場合、別のカプシドポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基または位置にもその言及がなされていることが理解される。例えば、「配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号１２）を含むＶＲ－Ｉ」を含むカプシドポリペプチドへの言及は、本明細書で定義されるように、任意のＡＡＶカプシドポリペプチドのＶＲ－Ｉは、配列番号５に記載されるＡＡＶ２カプシドの位置２６２～２７１に対応する残基を含むという理解で、それぞれ配列番号５および４に記載され、位置２６２～２７１に配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号１２）を有するＶＲ－Ｉを有するＡＡＶ２およびＡＡＶＣ１１．１１カプシドポリペプチドだけでなく、例えば配列番号２に記載されるＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドポリペプチド（ここで、配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨを含むＶＲ－Ｉは位置２６３～２７２にある）配列番号５の位置２６２～２７１に対応する位置に配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨを含むＶＲ－Ｉを有する他のカプシドポリペプチドも包含する。別の例では、「配列ＮＲＴＧＧＧＡＴＮＤＮＡ（配列番号２３）を含むＶＲ－Ｉ」を含むカプシドポリペプチドへの言及は、配列番号５の位置２６２～２７１に対応する位置に配列ＮＲＴＧＧＧＡＴＮＤＮＡ（配列番号２３）を有するカプシドポリペプチドを包含する。理解されるように、配列ＮＲＴＧＧＧＡＴＮＤＮＡ（配列番号２３）は１２個のアミノ酸を含むため、残基の実際の位置は異なるであろう。例えば、カプシド骨格が配列番号５に記載のＡＡＶ２カプシドである場合、カプシドポリペプチドは位置２６２～２７３（これは配列番号５に記載のＡＡＶ２カプシドの位置２６２～２７１に対応する）に配列ＮＲＴＧＧＧＡＴＮＤＮＡ（配列番号２３）を含む。
【0032】
本明細書で使用される「異種コード配列」とは、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞に存在する核酸配列であって、そのポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞に天然には見出されないか、またはそのポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞に存在する位置に天然には見出されない、すなわち非天然である、核酸配列を指す。「異種コード配列」とは、ペプチドもしくはポリペプチド、またはそれ自体が機能もしくは活性を有するポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスまたは阻害オリゴヌクレオチド、例としては、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ）をコードし得る。いくつかの例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、異種コード配列が動物の細胞に導入されると、異種配列とゲノムＤＮＡとの間で相同組換えが起こり得る。一例では、異種コード配列は、欠陥／変異コピーを有する細胞への導入のための遺伝子の機能的コピーである。
【0033】
本明細書において、プロモーターおよびコード配列に関して「作動可能に連結された」という用語は、コード配列の転写がプロモーターの制御下にあるか、またはプロモーターによって駆動されることを意味する。
【0034】
「宿主細胞」という用語は、ベクターまたは他のポリヌクレオチドなどの外因性ＤＮＡが導入された哺乳動物細胞などの細胞を指す。この用語は、外因性ＤＮＡが導入された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」とは、一般に、外因性ＤＮＡでトランスフェクトまたは形質導入された細胞を指す。
【0035】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して「単離された」とは、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが由来する細胞由来の細胞物質も他の夾雑タンパク質も実質的に含まないこと、または科学的に合成された場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まないことを意味する。
【0036】
本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明から利益を得ることができる動物、特に哺乳動物、より具体的には下等霊長類を含む霊長類、さらにより具体的にはヒトを指す。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物または胚に関係なく、個体、対象、動物、患者、宿主、またはレシピエントと呼ばれてもよい。本開示は、ヒトおよび獣医学の両方の用途を有する。便宜上、「動物」には、特に牛、馬、羊、豚、ラクダ、ヤギ、およびロバなどの家畜、ならびに犬および猫などの家庭内動物が含まれる。馬に関しては、これらとしては競馬産業で使用される馬だけでなく、レクリエーションまたは畜産業で使用される馬も含まれる。実験動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターが挙げられる。ウサギおよびげっ歯類、例えば、ラットおよびマウスは、霊長類および下等霊長類と同様に、便利な試験系または動物モデルを提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【0037】
本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」または「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むベクターの特徴に有意な影響を及ぼさず、変化もさせないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該技術分野で公知の標準的な技術によって、様々な実施形態に適合するベクターに導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、カプシド内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えてもよく、変更されたカプシドは、本明細書に記載の機能アッセイを使用して指向性および／またはペイロードを送達する能力について試験され得る。
【0038】
【表1】
【0039】
上記の用語および関連する定義は、説明のみを目的として使用され、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【0040】
カプシドポリペプチド
本開示は、ＡＡＶベクターに改善された形質導入特性を付与するバリアントカプシドＶＲ－Ｉ配列の同定を部分的に前提としている。したがって、本明細書において、バリアントＶＲ－Ｉ配列を含む、単離されたカプシドポリペプチドを含むカプシドポリペプチドが提供される。本開示の目的上、ＶＲ－Ｉは、配列番号５に記載のプロトタイプＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置２６２～２７１に対応する位置の残基を含むものとして定義される。図１に示すように、この領域は、ＡＡＶ３ｂカプシドの位置２６２～２７１、ＡＡＶ１カプシドの位置２６２～２７２、ＡＡＶ９カプシドの位置２６２～２７３、ＡＡＶ７カプシドの位置２６３～２７３、およびＡＡＶ８およびＡＡＶ１０カプシドの位置２６３～２７４の残基を含む。図２に示すように、ＶＲ－Ｉは、配列番号４に記載のＡＡＶＣ１１．１１カプシドの位置２６３～２７２、配列番号２に記載のＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドの位置２６２～２７１、および配列番号３４０に記載のＡＡＶＣ１１．１２カプシドの位置２６３～２７２の残基を含む。
本開示は、ＡＡＶベクターに改善された形質導入特性を付与するバリアントカプシドＶＲ－Ｉ配列の同定を部分的に前提としている。したがって、本明細書において、バリアントＶＲ－Ｉ配列を含む、単離されたカプシドポリペプチドを含むカプシドポリペプチドが提供される。本開示の目的上、ＶＲ－Ｉは、配列番号５に記載のプロトタイプＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置２６２～２７１に対応する位置の残基を含むものとして定義される。図１に示すように、この領域は、ＡＡＶ３ｂカプシドの位置２６２～２７１、ＡＡＶ１カプシドの位置２６２～２７２、ＡＡＶ９カプシドの位置２６２～２７３、ＡＡＶ７カプシドの位置２６３～２７３、およびＡＡＶ８およびＡＡＶ１０カプシドの位置２６３～２７４の残基を含む。図２に示すように、ＶＲ－Ｉは、配列番号４に記載のＡＡＶＣ１１．１１カプシドの位置２６３～２７２、配列番号２に記載のＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドの位置２６２～２７１、および配列番号３４０に記載のＡＡＶＣ１１．１２カプシドの位置２６３～２７２の残基を含む。
【0041】
典型的には、カプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクターのカプシドに存在する場合、ヒト細胞（ヒト肝細胞など）の効率的な形質導入を促進する。バリアントＶＲ－Ｉを含むカプシドを有するＡＡＶベクターによる細胞のインビボ形質導入は、一般的に、参照ＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号５に記載のプロトタイプＡＡＶ２カプシド、またはそれぞれ配列番号２もしくは４に記載のＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドもしくはＡＡＶＣ１１．１１カプシド）を含むＡＡＶベクターと比較して増加または増強される。ＡＡＶベクターの形質導入または形質導入効率は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上増加し得、例えば、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターは、参照ＡＡＶカプシドポリペプチドと比較してインビボでの形質導入細胞で少なくとももしくは約１．２×、１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×またはそれ以上の効率であり得る。特定の例では、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において、形質導入または形質導入効率の増加が観察される。
【0042】
したがって、本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクター、特に遺伝子治療用のＡＡＶベクターを調製するのに特に有用である。例示的な実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、肝細胞、特にヒト肝細胞を形質導入するＡＡＶベクターを調製するのに特に有用であり、したがって肝臓を標的とする遺伝子治療用途に有用である。
【0043】
本開示のカプシドポリペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２で表される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含み、ここで、Ｘ１は、ＳまたはＮであり；Ｘ２は、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＴまたはＲであり；Ｘ３は、ＳまたはＴであり；Ｘ４は、Ａ、ＳまたはＴまたはアミノ酸なしであり；Ｘ５はＧまたはアミノ酸なし；Ｘ６はＧであり；Ｘ７はＡまたはＳであり；Ｘ８はＳまたはＴであり；Ｘ９はＮであり；Ｘ１０はＤであり；Ｘ１１はＮであり；およびＸ１２はＴ、ＡまたはＨであるか、またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２で表される配列の１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する配列である。特定の例では、バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２１～３３６（表２参照）のいずれか１つに示される配列、またはその１、２もしくは３個の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。特定の例では、バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４もしくは３２のいずれか１つに示される配列、またはその１、２もしくは３個の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。理解されるように、バリアントＶＲ－Ｉはカプシドポリペプチドにおいて、配列番号５に記載のプロトタイプＡＡＶ２カプシドポリペプチドの位置２６２～２７１に対応する位置に存在する（すなわち、配列番号５に記載のプロトタイプＡＡＶ２カプシドポリペプチドに対するナンバリングでカプシドポリペプチドの位置２６２～２７１）。
【0044】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0045】
カプシドポリペプチドの骨格（すなわち、ＶＲ－Ｉ領域以外の残基）は、ＮＰ４０、ＮＰ５９またはＬＫ０３などの任意の改変ＡＡＶカプシドポリペプチドを含む、任意のＡＡＶカプシドポリペプチド由来であり得る（例えば、Paulk et al, 2018, Mol Ther. 26(1):289-303；およびLisowski et al, 2014, Nature 506:382-386を参照のこと）、またはＡＡＶＣ１１．１２などの国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０２１／０５０１５８号に記載される任意の改変カプシドポリペプチド由来であり得る。カプシドポリペプチドは、全長ＶＰ１（すなわち、配列番号５に示されるＡＡＶ２カプシドの位置１～７３５に対応する）、またはＶＰ２（すなわち、配列番号５に示されるＡＡＶ２カプシドの位置１３８～７３５に対応する）もしくはＶＰ３（すなわち、配列番号５に示されるＡＡＶ２カプシドの位置２０３～７３５に対応する）のようなそのフラグメントを含み得る。
【0046】
一例において、本開示のカプシドポリペプチドは、Ｃ１１．１１骨格中の配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む（すなわち、カプシドポリペプチドは、配列番号４に示されるＣ１１．１１ポリペプチド、またはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６２および２７３～７３５が隣接するバリアントＶＲ－Ｉを含む）、または、配列番号４に示されるＣ１１．１１ポリペプチド、またはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６２および２７３～７３５によって表されるＣ１１．１１骨格と少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する骨格を有する。したがって、いくつかの例では、カプシドポリペプチドは、配列番号４に示されるＶＰ１タンパク質、配列番号４の位置１３８～７３５に記載されるＶＰ２タンパク質、または配列番号４の位置２０４～７３５に記載されるＶＰ３タンパク質と少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ここで、カプシドポリペプチドは、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む（すなわち、配列番号４に示されるＣ１１．１１ポリペプチドに対するナンバリングで、位置２６２～２７２において配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む）。
【0047】
バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
【0048】
別の例では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを、ＬＫ０３－ＲＥＤＨ骨格中に含む（すなわち、カプシドポリペプチドは、配列番号２に示されるＬＫ０３－ＲＥＤＨポリペプチドまたはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６１および２７２～７３６が隣接するバリアントＶＲ－Ｉを含む）か、または配列番号２に示されるＬＫ０３－ＲＥＤＨポリペプチド、またはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６１および２７２～７３６によって表されるＬＫ０３－ＲＥＤＨ骨格に対して、少なくとも、または約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する骨格中に含む。したがって、いくつかの例では、カプシドポリペプチドは、配列番号４に示されるＶＰ１タンパク質、配列番号２の位置１３８～７３６に記載されるＶＰ２タンパク質、または配列番号２の位置２０３～７３６に記載されるＶＰ３タンパク質と少なくとも、または約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ここで、カプシドポリペプチドは、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む（すなわち、配列番号２に示されるＬＫ０３－ＲＥＤＨポリペプチドに対するナンバリングで、位置２６２～２７１において配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む）。
【0049】
バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
【0050】
別の例では、本開示のカプシドポリペプチドは、Ｃ１１．１２骨格中の配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む（すなわち、カプシドポリペプチドは、配列番号３４０に示されるＣ１１．１２ポリペプチド、またはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６２および２７３～７３５が隣接するバリアントＶＲ－Ｉを含む）、または配列番号３４０に示されるＣ１１．１２ポリペプチド、またはそのＶＰ２もしくはＶＰ３フラグメントの残基１～２６２および２７３～７３５表されるＣ１１．１２骨格に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する骨格を有する。したがって、いくつかの例では、カプシドポリペプチドは、配列番号３４０に示されるＣ１１．１２ポリペプチド、配列番号３４０の位置１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質、または配列番号３４０の位置２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質と少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、ここで、カプシドポリペプチドは、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む（すなわち、配列番号３４０に示されるＣ１１．１２ポリペプチドに対するナンバリングで、位置２６２～２７２において配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む）。
【0051】
バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
【0052】
また、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を含む核酸分子も提供される。したがって、例えば、本明細書で提供される核酸分子の中には、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含む、本明細書に記載のカプシドポリペプチドのいずれか１つのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードするものがある。
【0053】
ベクター
本開示はまた、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むベクターを提供する。ベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有するＡＡＶベクターが挙げられる。
本開示はまた、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むベクターを提供する。ベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有するＡＡＶベクターが挙げられる。
【0054】
核酸ベクター
本開示のベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドの全てもしくは一部をコードする、ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターが挙げられる。このベクターは、エピソームベクター（すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）であってもよいし、または宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、および人工染色体が挙げられる。特定の例では、ベクターはプラスミドである。
本開示のベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドの全てもしくは一部をコードする、ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターが挙げられる。このベクターは、エピソームベクター（すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）であってもよいし、または宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、および人工染色体が挙げられる。特定の例では、ベクターはプラスミドである。
【0055】
細菌、昆虫、および哺乳動物細胞での使用に適したプラスミドなどのベクターは、広く記載されており、当該技術分野で周知である。当業者は、本開示のベクターが、原核細胞および／または真核細胞におけるベクターの複製、ベクターの選択、ならびに様々な宿主細胞における異種配列の発現に有用な追加の配列およびエレメントも含み得ることを理解するであろう。例えば、本開示のベクターは、原核レプリコン（すなわち、細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において染色体外でベクターの自律複製および維持を指向する能力を有する配列）を含んでもよい。このようなレプリコンは当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ベクターを原核生物および真核生物の両方における複製および組み込みに適したものにするシャトルエレメントを含み得る。さらに、ベクターは、その発現が検出可能なマーカー、例えば、宿主細胞の選択および維持を可能にする薬剤耐性遺伝子を付与する遺伝子も含んでもよい。ベクターはまた、蛍光または他の検出可能なタンパク質をコードする遺伝子などの報告可能なマーカーを有してもよい。核酸ベクターは、以下に記載されるベクターのうちのいずれか１つ以上を含む、他のエレメントも含む可能性が高い。最も典型的には、ベクターは、カプシドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【0056】
本開示の核酸ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡのインビトロまたは化学合成、およびＤＮＡ配列決定の標準的な技術を含むがこれらに限定されない公知の技術を使用して構築され得る。本開示のベクターは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して宿主細胞に導入され得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のベクターまたは核酸を含む宿主細胞にも関する。
【0057】
ＡＡＶベクター
本明細書において、本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、例えば、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含むＡＡＶカプシドの全部または一部を含むポリペプチドが提供される。バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
本明細書において、本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、例えば、配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むバリアントＶＲ－Ｉを含むＡＡＶカプシドの全部または一部を含むポリペプチドが提供される。バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
【0058】
カプシドタンパク質をベクター化する方法は当該技術分野で周知であり、本開示の目的のために任意の適切な方法を使用してもよい。例えば、ｃａｐ遺伝子を回収し（例えば、ＰＣＲまたはｃａｐの上流および下流を切断する酵素で消化することによって）、ｒｅｐを含むパッケージングコンストラクトにクローニングしてもよい。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３およびそれらの任意のバリアントに由来するｒｅｐ遺伝子を含む、任意のＡＡＶｒｅｐ遺伝子を使用してもよい。通常、ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐの下流にクローニングされるため、ｒｅｐ ｐ４０プロモーターがｃａｐ発現を駆動し得る。このコンストラクトにはＩＴＲを含まない。次いで、このコンストラクトは、典型的には異種コード配列に隣接するＩＴＲを含む第２のコンストラクトと共にパッケージング細胞系に導入される。ヘルパー機能またはヘルパーウイルスも導入され、ｃａｐ遺伝子から発現されたカプシドタンパク質から生成されたカプシドを含み、かつＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含むゲノムをカプシド化する組換えＡＡＶが、パッケージング細胞株の上清から回収される。パッケージング細胞株として、様々なタイプの細胞を使用してもよい。例えば、使用され得るパッケージング細胞株としては、限定するものではないが、例えば米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号に開示されているように、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。ヘルパー機能は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供され得る。アデノウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例としては、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を提供し得るＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡが挙げられる。ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野で公知であり、例えば、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科に由来するウイルスが挙げられる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例としては、限定するものではないが、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号に記載のＳＡｄＶ－１３ヘルパーウイルスおよびＳＡｄＶ－１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が挙げられる。当業者は、ＡＡＶに適切なヘルパー機能を提供し得るＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドが本明細書で使用され得ることを理解するであろう。
【0059】
場合によっては、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶビリオン産生に必要な成分のいくつかを安定して発現する細胞株を使用して産生される。例えば、本明細書に記載のように同定されたｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む核酸、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込んでもよい（パッケージング細胞）。次いで、このパッケージング細胞株は、ＡＡＶベクターおよびヘルパープラスミドでトランスフェクトするか、またはＡＡＶベクターでトランスフェクトし、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス）で同時感染してもよい。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、組換えＡＡＶの大規模生産に適していることである。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、カプシドポリペプチドをコードする核酸、およびｒｅｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入してもよい。さらに別の非限定的な例として、ＡＡＶベクターはプロデューサー細胞のＤＮＡにも安定に組み込まれ、ヘルパー機能が、野生型アデノウイルスによって提供されて組換えＡＡＶを生成し得る。
【0060】
さらなる例では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質を合成し、インビトロでカプシドをアセンブルしてパッケージングすることによって、合成的に生成される。
【0061】
通常、本開示のＡＡＶベクターは、異種コード配列も含む。異種コード配列は、配列の発現を促進するためにプロモーターに作動可能に連結され得る。異種コード配列は、治療用ペプチドまたはポリペプチドなどのペプチドもしくはポリペプチドをコードしてもよいし、またはアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ）を含む、アンチセンスまたは阻害性のオリゴヌクレオチドなどの機能または活性を有するポリヌクレオチドまたはその転写物自体をコードしてもよい。いくつかの例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、この異種コード配列が動物の細胞に導入されると、異種コード配列とゲノムＤＮＡとの間の相同組換えが起こり得る。理解されるように、異種コード配列の性質は、本開示にとって必須ではない。特定の実施形態では、異種コード配列を含むベクターは、遺伝子治療に使用される。
【0062】
特定の例では、異種コード配列は、例えば、疾患または障害の治療のためなど、その発現が治療用途であるペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする。例えば、治療用ペプチドまたはポリペプチドの発現は、欠陥のあるペプチドまたはポリペプチドの内因性形態の機能を回復または置換するのに役立ち得る（すなわち、遺伝子置換療法）。他の例では、異種配列由来の治療用ペプチドもしくはポリペプチド、またはポリヌクレオチドの発現は、宿主細胞における１つ以上の他のペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドのレベルおよび／または活性を変化させるのに役立つ。したがって、特定の実施形態によれば、本明細書に記載のベクターによって宿主細胞に導入された異種コード配列の発現を使用して、疾患または障害の症状を改善する治療量のペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供することができる。他の例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、この異種配列が動物の細胞に導入されると、異種コード配列とゲノムＤＮＡとの間の相同組換えが発生する場合がある。したがって、本明細書に記載のＡＡＶベクターによる異種配列の宿主細胞への導入は、ゲノムＤＮＡの突然変異を修正するために使用され得、これは次に疾患または障害の症状を改善し得る。
【0063】
非限定的な例において、異種コード配列は、対象、特に対象の肝臓に送達されると、肝臓関連の疾患または状態を処置する発現産物をコードする。例示的な実施形態では、肝臓関連の疾患または状態は、尿素サイクル障害（ＵＣＤ；Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症（ＮＡＧＳＤ）、カルバミルリン酸シンテターゼ１欠損症（ＣＰＳ１Ｄ）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣＤ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ欠損症（ＡＳＳＤ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬＤ）、アルギナーゼ１欠損症（ＡＲＧ１Ｄ）、シトリンまたはアスパラギン酸／グルタミン酸キャリア欠損症、および高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群（ＨＨＨ症候群）を引き起こすミトコンドリアオルニチントランスポーター１欠損症）、有機酸症（または有機アカデミア、例としては、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症、およびメープルシロップ尿症）、アミノアシドパシー、グリコーゲン症（Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ型）、ウィルソン病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性高シュウ酸尿症、補体障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｏｐａｔｈｙ）、凝固障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ））、クリグラー・ナジャー症候群、家族性高コレステロール血症、α－１アンチトリプシン欠乏症、ミトコンドリア呼吸鎖肝障害、およびシトリン欠乏症の中から選択される。当業者は、そのような疾患を治療するのに有用な適切な異種コード配列を容易に選択することができるであろう。いくつかの例では、異種コード配列は、表３に示す遺伝子の全てもしくは一部など、疾患に関連する遺伝子の全てもしくは一部を含む。肝臓へのそのような配列の導入は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用する、遺伝子置換または遺伝子編集／修正に使用され得る。特定の例では、異種コード配列は、表３に示される遺伝子などの疾患に関連する遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする。
【0064】
【表3】
【0065】
ＡＡＶベクターの異種コード配列は、３’および５’ＡＡＶ ＩＴＲが隣接している。本開示のベクターで使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３を含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。そのようなＩＴＲは、当該技術分野で周知である。
【0066】
当業者には理解されるように、ＡＡＶを精製するのに適した任意の方法を、本明細書に記載の実施形態で使用してＡＡＶベクターを精製してもよく、そのような方法は当該技術分野で周知である。例えば、ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞および／またはパッケージング細胞の上清から単離および精製してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＣｓＣｌまたはイオジキサノール勾配遠心分離を使用する分離方法によって精製される。他の実施形態では、ＡＡＶ付着を媒介する人工受容体または受容体様分子が固定化されたマトリックスを含む固体支持体を使用して、米国特許出願公開第２００２０１３６７１０号に記載のようにＡＡＶを精製する。
【0067】
ベクターの追加のエレメント
本開示のベクターはプロモーターを含んでもよい。ベクターがカプシドポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ベクターである場合、プロモーターは、カプシドポリペプチドをコードする核酸の発現を促進し得る。ベクターがＡＡＶベクターである場合、プロモーターは、上記のように、異種コード配列の発現を促進し得る。
本開示のベクターはプロモーターを含んでもよい。ベクターがカプシドポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ベクターである場合、プロモーターは、カプシドポリペプチドをコードする核酸の発現を促進し得る。ベクターがＡＡＶベクターである場合、プロモーターは、上記のように、異種コード配列の発現を促進し得る。
【0068】
いくつかの例では、プロモーターは、ｐ５、ｐ１９またはｐ４０プロモーターなどのＡＡＶプロモーターである。他の例では、プロモーターは他の供給源に由来する。構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（適宜ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（適宜ＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在、または細胞の複製のみによって調節され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、およびラパマイシン誘導系が挙げられる。この文脈において有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または細胞の複製のみによって調節されるものである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの非限定的な例としては、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0069】
ベクターはまた、転写エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含んでもよい。転写終結シグナルの例としては、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリ（Ａ）配列、およびその任意のバリアントが挙げられる。いくつかの実施形態では、転写終結領域は、転写後調節エレメントの下流に位置する。いくつかの実施形態では、転写終結領域は、ポリアデニル化シグナル配列である。
【0070】
ベクターは、様々な転写後調節エレメントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、ウイルスの転写後調節エレメントであってもよい。ウイルス転写後調節エレメントの非限定的な例としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント、およびそれらの任意のバリアントが挙げられる。ＲＴＥは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、例えばレンチウイルスＲＲＥであり得る。非限定的な例は、ウシ免疫不全ウイルスｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である。いくつかの実施形態では、ＲＴＥは、構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）である。ＣＴＥの例としては、限定するものではないが、メイソン・ファイザー・モンキー・ウイルスＣＴＥおよびトリ白血病ウイルスＣＴＥが挙げられる。
【0071】
哺乳動物細胞由来のポリペプチドの分泌を提供するために、シグナルペプチド配列をベクターに含めてもよい。シグナルペプチドの例としては、限定するものではないが、ＨＧＨの内因性シグナルペプチドおよびそのバリアント；Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型インターフェロンのシグナルペプチドならびにそのバリアントを含む、インターフェロンおよびそのバリアントのための内因性シグナルペプチド；ならびに公知のサイトカインおよびそのバリアントの内因性シグナルペプチド、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ＴＧＦ－β１、ＴＮＦ、ＩＬ１－α、およびＩＬ１－βのシグナルペプチド、ならびにそれらのバリアントが挙げられる。典型的には、シグナルペプチドのヌクレオチド配列は、ベクター中の異種配列のすぐ上流に位置する（例えば、目的のタンパク質のコード領域の５’で融合）。
【0072】
さらなる例では、ベクターは、例えば、単一のｍＲＮＡ由来の複数のタンパク質の翻訳を可能にする調節配列を含み得る。そのような調節配列の非限定的な例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド部位（Ｆ２Ａ配列）などの２Ａ自己プロセシング配列が挙げられる。
【0073】
宿主細胞
また、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も本明細書に提供される。場合によっては、宿主細胞を使用して、ポリヌクレオチドまたはベクターを増幅、複製、パッケージング、および／または精製してもよい。他の例では、宿主細胞は、ＡＡＶベクター内にパッケージされた配列のような異種配列を発現するために使用される。例示的な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞が挙げられる。場合によっては、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。本開示のポリヌクレオチド、ベクターまたはｒＡＡＶビリオンの発現、増幅、複製、パッケージングおよび／または精製のために適切な宿主細胞を選択することは、十分に当業者の技術の範囲内である。例示的な哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｕＨ－７細胞、およびＨｅｐＧ２細胞が挙げられる。特定の例では、宿主細胞は、肝細胞または肝細胞由来の細胞株である。
また、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も本明細書に提供される。場合によっては、宿主細胞を使用して、ポリヌクレオチドまたはベクターを増幅、複製、パッケージング、および／または精製してもよい。他の例では、宿主細胞は、ＡＡＶベクター内にパッケージされた配列のような異種配列を発現するために使用される。例示的な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞が挙げられる。場合によっては、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。本開示のポリヌクレオチド、ベクターまたはｒＡＡＶビリオンの発現、増幅、複製、パッケージングおよび／または精製のために適切な宿主細胞を選択することは、十分に当業者の技術の範囲内である。例示的な哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｕＨ－７細胞、およびＨｅｐＧ２細胞が挙げられる。特定の例では、宿主細胞は、肝細胞または肝細胞由来の細胞株である。
【0074】
組成物
本開示の核酸分子、ポリペプチドおよび／またはベクターを含む組成物もまた提供される。特定の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。この組成物は、希釈剤、安定剤、賦形剤、およびアジュバントなどの追加の成分も含んでもよい。
本開示の核酸分子、ポリペプチドおよび／またはベクターを含む組成物もまた提供される。特定の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。この組成物は、希釈剤、安定剤、賦形剤、およびアジュバントなどの追加の成分も含んでもよい。
【0075】
担体、希釈剤およびアジュバントとしては、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化物質；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０残基未満）；血清ａＡＡＶＣ．ｕｍｉｎ、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／あるいはＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。
【0076】
方法
本開示のＡＡＶベクター、およびＡＡＶベクターを含有する組成物は、宿主細胞への異種コード配列の導入のための方法において使用され得る。そのような方法は、宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることを含む。これは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行ってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）である。
本開示のＡＡＶベクター、およびＡＡＶベクターを含有する組成物は、宿主細胞への異種コード配列の導入のための方法において使用され得る。そのような方法は、宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることを含む。これは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行ってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）である。
【0077】
この方法がエクスビボまたはインビボで実施される場合、典型的には宿主細胞への異種配列の導入は治療目的のためであり、この異種配列の発現は疾患または状態の治療をもたらす。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に記載される異種配列によってコードされるタンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドによる治療に修正可能な疾患または状態を有する対象など、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与され得る。
【0078】
インビボで使用される場合、対象に投与されるＡＡＶベクターの力価は、例えば、特定の組換えウイルス、治療される疾患または障害、投与様式、治療目標、処置される個体、および目標とされている細胞型に応じて変化し、当業者に周知の方法によって決定され得る。正確な投与量は個々に決定されるが、ほとんどの場合、典型的には、本開示の組換えウイルスは、組換えウイルスが、対象の１ｋｇ当たり１×１０１０から１ｋｇ当たり１×１０１４の間のゲノムコピーという用量で対象に投与され得る。他の例では、１×１０１０未満のゲノムコピーが治療効果に十分であり得る。他の例では、治療効果のために１×１０１４を超えるゲノムコピーが必要になる場合がある。
【0079】
投与経路は特に限定されない。例えば、治療有効量のＡＡＶベクターは、例えば、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、表皮、皮内、直腸、眼内、肺、頭蓋内、骨内、経口、口腔内、または経鼻のルートで対象に投与してもよい。ＡＡＶベクターは、単回投与または複数回投与として、様々な間隔で投与され得る。
【0080】
また、上記および本明細書に記載のＡＡＶベクター、すなわち、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターを産生する方法も提供される。そのような方法は、本開示のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを容易にするのに適した条件下で培養することを含み、このカプシドが異種コード配列をカプシド化する。
【0081】
さらなる態様では、改変ＶＲ－Ｉが配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含むように参照カプシドポリペプチドのＶＲ－Ｉを改変することにより、ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を高める方法が提供される。バリアントＶＲ－Ｉは、配列番号２５３、２５１、１９６、２７４、３１９、２８８、１９４、２３１、１９３、２６６、２０７、２７３、２４３、２８６、２０９、２５６、３１０、２２０、１９８、２８３、２７５、２２３、２１２、３２８、２５４、６７、１５７、１２９、６４、１１７、１６６、４５、３５、１６４または３２のいずれか１つに示される配列を含んでもよい。
【0082】
したがって、増強した形質導入効率を示す改変ＡＡＶベクターを産生する方法であって、配列番号５に対するナンバリングで、位置２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０および２７１のうちの１つ以上の位置で参照カプシドポリペプチドの配列を改変する（すなわち、１つ以上のアミノ酸を置換および／または挿入することによって、配列番号５に対するナンバリングで位置２６２～２７１に配列番号２１～３３６のいずれか１つに示される配列を含む改変カプシドポリペプチドを産生するステップを含む、方法が提供される。
【0083】
任意の改変または改変の組合せ、例えば、アミノ酸の置き換えまたは置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入は、参照カプシドポリペプチドと比較して改変カプシドポリペプチドのアミノ酸の配列の変化をもたらすことが理解される。したがって、例えば、改変への言及には、その範囲内に、１つのアミノ酸残基が同じアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換も、アミノ酸欠失がその欠失アミノ酸の挿入も伴う場合は、改変も含まず、その結果、参照カプシドポリペプチド配列と比較して改変カプシドポリペプチドのアミノ酸配列に違いはなく、すなわち、改変カプシドポリペプチドのアミノ酸配列は、参照カプシドポリペプチド配列のアミノ酸配列と同じであってはならない（または異なっていなければならない）。
【0084】
典型的には、この本方法は、インビボでヒト肝細胞を形質導入するための参照カプシドポリペプチドを最初に同定する最初のステップを含む。参照カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２もしくはＡＡＶ１３カプシドポリペプチド、または合成もしくはキメラカプシドポリペプチドなどの任意のＡＡＶポリペプチドであってもよい。例示的な実施形態では、参照ポリペプチドは、配列番号２または４に示される配列に対して、少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。参照カプシドポリペプチドには、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質またはＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチドが含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、参照カプシドポリペプチドは、配列番号２または４に示される配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ１タンパク質の全部または一部：配列番号２のアミノ酸１３８～７３６または配列番号４のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ２タンパク質の全部または一部：および配列番号２のアミノ酸２０３～７３６または配列番号４のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ３タンパク質の全部または一部を含む。
【0085】
参照カプシドポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列を改変して、改変カプシドポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生成するための方法は当該技術分野で周知であり、本開示の方法を実施するために任意のそのような方法を利用してもよい。例えば、改変カプシドポリヌクレオチドを生成するための参照カプシドポリヌクレオチドの配列の改変は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）および／またはインビトロで（部分的または全体的に）実施される組換えおよび合成法を含む、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して実施してもよい。特定の例で、配列の改変はインシリコで行われ、続いて、改変された配列を有する改変カプシドポリヌクレオチドのデノボ合成が行われる（例えば、重複オリゴヌクレオチドの化学合成、その後の遺伝子アセンブリを含むものなどの遺伝子合成法による）。
【0086】
改変カプシドポリヌクレオチドは、その後の発現、複製、増幅および／または操作のために、プラスミドなどの核酸ベクターに含まれ得る。細菌、昆虫、および哺乳動物細胞での使用に適したベクターは、広く記載されており、当該技術分野で周知である。当業者は、このベクターが、原核細胞および／または真核細胞におけるベクターの複製、ベクターの選択、および様々な宿主細胞における異種配列の発現に有用な追加の配列およびエレメントも含み得ることを理解するであろう。例えば、ベクターは、細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において染色体外で自律複製およびベクターの維持を指示する能力を有する配列である原核レプリコンを含み得る。そのようなレプリコンは、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ベクターを原核生物および真核生物の両方における複製および組み込みに適したものにするシャトルエレメントを含んでもよい。さらに、ベクターはまた、その発現が、宿主細胞の選択および維持を可能にする薬剤耐性遺伝子などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含み得る。ベクターはまた、蛍光または他の検出可能なタンパク質をコードする遺伝子などの報告可能なマーカーを有し得る。核酸ベクターは、以下に記載するエレメントのいずれか１つ以上を含む、他のエレメントも含む可能性が高い。最も典型的には、ベクターは、カプシドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【0087】
核酸ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡのインビトロまたは化学合成、およびＤＮＡ配列決定の標準技術を含むがこれらに限定されない公知の技術を使用して構築してもよい。改変カプシドポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して宿主細胞に導入してもよい。
【0088】
改変後、改変カプシドは次にベクター化される。カプシドポリペプチドをベクター化する方法は当該技術分野で周知であり、非限定的な例は上記に記載されている。
【0089】
これらの方法によって産生されるＡＡＶベクターは、典型的には、参照カプシドポリペプチドを含むカプシドを有する参照ＡＡＶベクターと比較して増強された形質導入効率を有する。形質導入効率のレベルは、少なくとも、または約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上増強することができ、例えばＡＡＶベクターの形質導入効率は、インビボでの未改変ＡＡＶベクター（すなわち、参照カプシドを含むＡＡＶベクター）からの形質導入効率と比較して、少なくとも、または約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上であり得る。いくつかの例では、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する小動物（例えばマウス）（例えばｈＦＲＧマウス）のような、ヒト肝細胞を利用するインビボ系で評価される。
【0090】
したがって、本開示の方法によって産生されるＡＡＶベクターも提供される。
【0091】
本発明が容易に理解され、実際に効果を発揮できるようにするために、特定の好ましい実施形態を、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【0092】
本明細書における先行刊行物（またはそれから派生した情報）、または知られている任意の事項への言及は、その先行刊行物（またはそこから派生した情報）または既知の事項は、本明細書が関係する努力傾注分野における共通の一般知識の一部を形成するという示唆の確認としても承認としてもなんらの形態としても解釈されるべきではない。
【実施例】
【0093】
［実施例１］
【0094】
ライブラリーの生成－一般的方法
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ合成
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡ合成は、改変することなく、以前（Cabanes-Creus, 2020, Sci Transl Med 12）に詳細に記載したように行った。簡単に述べると、ＤＮＡは標準的なフェノール：クロロホルムプロトコルを用いて抽出し、ＲＮＡはＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌキット（Ｚｙｍｏｇｅｎ Ｃａｔ＃Ｒ２０６２）を用いて抽出した。
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ合成
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡ合成は、改変することなく、以前（Cabanes-Creus, 2020, Sci Transl Med 12）に詳細に記載したように行った。簡単に述べると、ＤＮＡは標準的なフェノール：クロロホルムプロトコルを用いて抽出し、ＲＮＡはＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌキット（Ｚｙｍｏｇｅｎ Ｃａｔ＃Ｒ２０６２）を用いて抽出した。
【0095】
ＡＡＶベクターのパッケージングおよびウイルス産生
ＡＡＶ構築物は、ＨＥＫ２９３細胞およびヘルパーウイルスフリーの系を用いて、先に記載したようにＡＡＶカプシドにパッケージングした（Xiao et al., 1998,J Virol 72,2224-2232）。ゲノムは、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子と特定のキャップを保有するパッケージングプラスミド構築物を用いてカプシドバリアントにパッケージングした。全てのベクターは、先に記載したようにヨウジキサノール勾配超遠心法を用いて精製した（Khan et al., 2011, Nat Protoc 6, 482-501）。
ＡＡＶ構築物は、ＨＥＫ２９３細胞およびヘルパーウイルスフリーの系を用いて、先に記載したようにＡＡＶカプシドにパッケージングした（Xiao et al., 1998,J Virol 72,2224-2232）。ゲノムは、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子と特定のキャップを保有するパッケージングプラスミド構築物を用いてカプシドバリアントにパッケージングした。全てのベクターは、先に記載したようにヨウジキサノール勾配超遠心法を用いて精製した（Khan et al., 2011, Nat Protoc 6, 482-501）。
【0096】
マウス試験
全ての動物実験手順およびケアは、合同Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＭＲＩ）およびＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｔ Ｗｅｓｔｍｅａｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉl２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウス（Azuma et al.,2007,Nat Biotechnol 25,903-910）は、最近記載された（Cabanes-Creuset al., 2020, Mol Ther Methods Clin Dev 17,1139-1154）ように繁殖させ、飼育し、生着させ、モニターした。ヒト細胞の生着レベルは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｅ８０－１２９）を用いて、末梢血中のヒトアルブミンの存在を測定することにより推定した。ＡＡＶ形質導入能を評価するため、マウスを１０％ ＮＴＢＣに置き、採取までこの状態に維持した。マウスを無作為に実験に割り付け、指示されたベクター用量で静脈注射（側尾静脈）により形質導入した。場合によっては、マウスはまず５ｍｇの可溶性ＩＶＩｇの注射で受動免疫された。マウスは形質導入の１週間後にＣＯ２吸入により安楽死させた。異種移植したマウス肝臓からマウスおよびヒトの単一細胞懸濁液を得るために、最近記載されたのと同じコラゲナーゼ灌流手順に従った（Cabanes-Creus et al.,2020,Sci Transl Med 12）。全ての実験において、細胞はフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒト－ＨＬＡ－ＡＢＣ（クローンＷ６／３２、Invitrogen 12-9983-42;1:20）、ビオチンコンジュゲート抗マウス－Ｈ－２Ｋｂ（クローンＡＦ６－８８．５、BD Pharmigen 553568;1:100）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート－ストレプトアビジン（eBioscience 17-4317-82;1:500）で標識した。ＧＦＰ陽性標識サンプルは、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒを用いて最小９５％の純度にソーティングした。フローサイトメトリーは、Ｗｅｓｔｍｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＭＲ）、Ｗｅｓｔｍｅａｄ、ＮＳＷ、ＡｕｓｔｒａｌｉａのＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。データはＦｌｏｗＪｏ ７．６．１（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて分析した。
全ての動物実験手順およびケアは、合同Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＭＲＩ）およびＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｔ Ｗｅｓｔｍｅａｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉl２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウス（Azuma et al.,2007,Nat Biotechnol 25,903-910）は、最近記載された（Cabanes-Creuset al., 2020, Mol Ther Methods Clin Dev 17,1139-1154）ように繁殖させ、飼育し、生着させ、モニターした。ヒト細胞の生着レベルは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｅ８０－１２９）を用いて、末梢血中のヒトアルブミンの存在を測定することにより推定した。ＡＡＶ形質導入能を評価するため、マウスを１０％ ＮＴＢＣに置き、採取までこの状態に維持した。マウスを無作為に実験に割り付け、指示されたベクター用量で静脈注射（側尾静脈）により形質導入した。場合によっては、マウスはまず５ｍｇの可溶性ＩＶＩｇの注射で受動免疫された。マウスは形質導入の１週間後にＣＯ２吸入により安楽死させた。異種移植したマウス肝臓からマウスおよびヒトの単一細胞懸濁液を得るために、最近記載されたのと同じコラゲナーゼ灌流手順に従った（Cabanes-Creus et al.,2020,Sci Transl Med 12）。全ての実験において、細胞はフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒト－ＨＬＡ－ＡＢＣ（クローンＷ６／３２、Invitrogen 12-9983-42;1:20）、ビオチンコンジュゲート抗マウス－Ｈ－２Ｋｂ（クローンＡＦ６－８８．５、BD Pharmigen 553568;1:100）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート－ストレプトアビジン（eBioscience 17-4317-82;1:500）で標識した。ＧＦＰ陽性標識サンプルは、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒを用いて最小９５％の純度にソーティングした。フローサイトメトリーは、Ｗｅｓｔｍｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＭＲ）、Ｗｅｓｔｍｅａｄ、ＮＳＷ、ＡｕｓｔｒａｌｉａのＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。データはＦｌｏｗＪｏ ７．６．１（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて分析した。
【0097】
肝臓摘出
肝臓摘出物は、常温肝灌流および解剖学的分割を用いて調製した。灌流系は、市販の肝臓灌流装置（Ｌｉｖｅｒ ａｓｓｉｓｔ、Ｏｒｇａｎ Ａｓｓｉｓｔ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を改造した。透析膜、２台の長期酸素供給器、およびガスブレンダーが、臓器の生存性を確保するために系に加えられている。灌流液は赤血球、２単位の新鮮凍結血漿、およびアルブミンを含み、３６℃に維持されている。移植片にはタウロコール酸（７．７ｍｇ／時間）、メチルプレドニゾロン（５０ｍｇ／２４時間）、非経口栄養（２０ｍＬ／時間）、および滴定インスリンおよびグルカゴンが注入される。生存率の要求が全て満たされる場合、灌流から２０時間後、肝臓全体が解剖学的に分割された。これらは、乳酸＜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ならびに胆汁産生、動脈ｐＨ＞７．３、グルコース代謝の証拠、均一な灌流、および胆汁ｐＨ＞７．４のうち２つ以上であった。ＡＡＶライブラリーは左葉の門脈に注入された。注入２日後にコア生検を行い、ＡＡＶ単離のためにＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。
肝臓摘出物は、常温肝灌流および解剖学的分割を用いて調製した。灌流系は、市販の肝臓灌流装置（Ｌｉｖｅｒ ａｓｓｉｓｔ、Ｏｒｇａｎ Ａｓｓｉｓｔ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を改造した。透析膜、２台の長期酸素供給器、およびガスブレンダーが、臓器の生存性を確保するために系に加えられている。灌流液は赤血球、２単位の新鮮凍結血漿、およびアルブミンを含み、３６℃に維持されている。移植片にはタウロコール酸（７．７ｍｇ／時間）、メチルプレドニゾロン（５０ｍｇ／２４時間）、非経口栄養（２０ｍＬ／時間）、および滴定インスリンおよびグルカゴンが注入される。生存率の要求が全て満たされる場合、灌流から２０時間後、肝臓全体が解剖学的に分割された。これらは、乳酸＜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ならびに胆汁産生、動脈ｐＨ＞７．３、グルコース代謝の証拠、均一な灌流、および胆汁ｐＨ＞７．４のうち２つ以上であった。ＡＡＶライブラリーは左葉の門脈に注入された。注入２日後にコア生検を行い、ＡＡＶ単離のためにＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。
【0098】
配列決定
同義コドンバーコードおよびＶＲ－Ｉライブラリーを囲む領域を、表２２に以下に示すＮＧＳ－ＦおよびＮＧＳ－Ｒプライマーを用いて次世代シーケンシングで分析した。ＮＧＳ分析は、プラスミドライブラリー、ベクターライブラリー、および形質導入肝細胞（ＤＮＡおよびｃＤＮＡ）に対して行った。ＮＧＳライブラリーの調製および２×１５０ペアエンド構成を用いた配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置を用いてＧｅｎｅｗｉｚ（Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）が行った。ワークフローをＳｎａｋｅｍａｋｅ（５．６）（Koster et al.,2018,Bioinformatics 34, 3600）で記述し、リードの処理およびバーコードのカウントを行った。ペアリードは、ＢＢＭｅｒｇｅを使用してマージし、次にＢＢＤｕｋ（いずれもＢＢＴｏｏｌｓ ３８．６８（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）からの２回目のパスで予想される長さのリードをフィルターした。マージされ、フィルターされたｆａｓｔｑファイルは、ＡＡＶバリアントに対応するバーコードを同定するＰｙｔｈｏｎ（３．７）スクリプトに渡された。ＤＮＡおよびｃＤＮＡ集団からのＮＧＳリードは、前注入混合物からのリードに対して正規化された。
同義コドンバーコードおよびＶＲ－Ｉライブラリーを囲む領域を、表２２に以下に示すＮＧＳ－ＦおよびＮＧＳ－Ｒプライマーを用いて次世代シーケンシングで分析した。ＮＧＳ分析は、プラスミドライブラリー、ベクターライブラリー、および形質導入肝細胞（ＤＮＡおよびｃＤＮＡ）に対して行った。ＮＧＳライブラリーの調製および２×１５０ペアエンド構成を用いた配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置を用いてＧｅｎｅｗｉｚ（Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）が行った。ワークフローをＳｎａｋｅｍａｋｅ（５．６）（Koster et al.,2018,Bioinformatics 34, 3600）で記述し、リードの処理およびバーコードのカウントを行った。ペアリードは、ＢＢＭｅｒｇｅを使用してマージし、次にＢＢＤｕｋ（いずれもＢＢＴｏｏｌｓ ３８．６８（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）からの２回目のパスで予想される長さのリードをフィルターした。マージされ、フィルターされたｆａｓｔｑファイルは、ＡＡＶバリアントに対応するバーコードを同定するＰｙｔｈｏｎ（３．７）スクリプトに渡された。ＤＮＡおよびｃＤＮＡ集団からのＮＧＳリードは、前注入混合物からのリードに対して正規化された。
【0099】
ｈＦＲＧマウスにおけるライブラリーのバリアントの分析
ＶＲ－ＩライブラリーをｈＦＲＧマウスに注入した後のバリアントの性能を評価するために、バリアントが肝細胞に入る能力（ＤＮＡの分析；「物理的形質導入」）、および入った後に発現する能力（ｃＤＮＡの分析；「機能的形質導入」）を反映する一連の計算を行った。
ＶＲ－ＩライブラリーをｈＦＲＧマウスに注入した後のバリアントの性能を評価するために、バリアントが肝細胞に入る能力（ＤＮＡの分析；「物理的形質導入」）、および入った後に発現する能力（ｃＤＮＡの分析；「機能的形質導入」）を反映する一連の計算を行った。
【0100】
各バリアントについて、以下のスコアを３連で計算した：
侵入インデックス＝ｌｏｇ２ ［ＤＮＡにおける％リード］／［ウイルスライブラリーにおける％リード］
発現インデックス＝ｌｏｇ２［ｃＤＮＡにおける％リード］／［ウイルスライブラリーにおける％リード］
侵入インデックス＝ｌｏｇ２ ［ＤＮＡにおける％リード］／［ウイルスライブラリーにおける％リード］
発現インデックス＝ｌｏｇ２［ｃＤＮＡにおける％リード］／［ウイルスライブラリーにおける％リード］
【0101】
バリアントをランク付けするために、一貫した性能（すなわち、同義コドンとは独立した３つ組にわたる所与のバリアントの性能の類似性）を最大にすることを目的とした戦略が利用された。そのために適合性スコアが作成された：
侵入適合性＝侵入インデックス０１＋侵入インデックス０２＋侵入インデックス０３
発現適合性＝発現インデックス０１＋発現インデックス０２＋発現インデックス０３
侵入適合性＝侵入インデックス０１＋侵入インデックス０２＋侵入インデックス０３
発現適合性＝発現インデックス０１＋発現インデックス０２＋発現インデックス０３
【0102】
同様に、異なる同義コドンで異なる性能を示すバリアントはペナルティを受けた。これを行うために、侵入と発現インデックスの両方の標準偏差を決定し、高い標準偏差を持つバリアントにペナルティを与える補正式を適用した：
補正適合性＝適合性（０．５×偏差２）。
補正適合性＝適合性（０．５×偏差２）。
【0103】
次に、合計スコアを、補正された侵入適合性と補正された発現適合性との合計として計算した。
［実施例２］
［実施例２］
【0104】
ＶＲ－Ｉライブラリーの生成
ＶＲ－Ｉライブラリーを、ＬＫ０３－Ｒ５９４Ｅ＋Ｄ５９８Ｈカプシド骨格（ＬＫ０３－ＲＥＤＨとも称する；配列番号１（ｎｔ）および配列番号２（ａａ）に示されるカプシド配列）上およびＣ１１．１１カプシド骨格（配列番号３（ｎｔ）および配列番号４（ａａ）に示されるカプシド配列）上に構築した。ＬＫ０３－ＲＥＤＨは、ＬＫ０３（それ自体がＡＡＶ３Ｂ様カプシドポリペプチドである）に基づくカプシドであるが、Ｒ５９４ＥおよびＤ５９８Ｈ変異をさらに含む。ＶＲ－Ｉ周辺の相同性を考えると、異なるライブラリーをクローニングするプロセスは同じであった。
ＶＲ－Ｉライブラリーを、ＬＫ０３－Ｒ５９４Ｅ＋Ｄ５９８Ｈカプシド骨格（ＬＫ０３－ＲＥＤＨとも称する；配列番号１（ｎｔ）および配列番号２（ａａ）に示されるカプシド配列）上およびＣ１１．１１カプシド骨格（配列番号３（ｎｔ）および配列番号４（ａａ）に示されるカプシド配列）上に構築した。ＬＫ０３－ＲＥＤＨは、ＬＫ０３（それ自体がＡＡＶ３Ｂ様カプシドポリペプチドである）に基づくカプシドであるが、Ｒ５９４ＥおよびＤ５９８Ｈ変異をさらに含む。ＶＲ－Ｉ周辺の相同性を考えると、異なるライブラリーをクローニングするプロセスは同じであった。
【0105】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０カプシドのＶＲ－Ｉの配列を整列させた（図１）。ＡＡＶ２の位置２６２は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、およびＡＡＶ９カプシド（およびＬＫ０３－ＲＥＤＨ）の位置２６２に対応し、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ１０カプシド（およびＣ１１．１１）の位置２６３に対応する。ＡＡＶ２カプシドと比較すると、ＡＡＶ１およびＡＡＶ７カプシドはＶＲ－Ｉ内に１つのアミノ酸挿入を有し、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０カプシドは、ＶＲ－Ｉ内に２つのアミノ酸挿入を有する。位置２６２～２７１（配列番号５に示されるＡＡＶ２カプシドに対するナンバリングで）のそれぞれについて、表４に示されるように、いずれかのＡＡＶに存在するアミノ酸がリストアップされた。したがって、ライブラリーのバリアントは、表４（ＡＡＶ２カプシドに対するナンバリングで最上段に示す）に示す残基（または欠失）の任意の組合せで、この領域に１０、１１、または１２個のアミノ酸のいずれかを含むように構築された。
【0106】
【表4】
【0107】
各位置について、「ＡＡ－Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ」ツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｕｉｎｅｖｅｒｅ．ｏｔａｇｏ．ａｃ．ｎｚ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ａｅｆ／ＡＡ－Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｐｌ）（Ｆｉｒｔｈ， ２００８）を使用して、選択したアミノ酸をコードする最適コドンを検索した。縮退コドンを選択する基準は以下の通りである：１）ストップコドンを避ける；２）ＡＡＶに天然に存在するアミノ酸を全て含む；３）コードされたコドンの数が少ない。遺伝暗号の制限により＃２が不可能な場合は、次のような縮退コドンが選ばれた：４）コードされたアミノ酸の数が少ない、および５）コードされたコドンの数が少ない。例えば、位置２６２の場合、天然に存在するアミノ酸はＡｓｎ（Ｎ）およびＳｅｒ（Ｓ）である。トリヌクレオチドＡＲＴまたはＡＲＣは、ＡＲＹより先に選択されるが、これは後者が４つのコドンをコードすることからコドンレベルでのライブラリーの複雑さが増加するためである。いくつかの例では、例えば位置２６３については、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｅのみをコードする縮退コドンを見つけることができなかった。したがって、以下に例示するように、選択された野生型バリアントには存在しない他のアミノ酸が含まれた。トリヌクレオチドＶＶＷが選ばれたのは、ストップコドンをコードせず、アミノ酸の数を１２に、コドンの数を１８に最小化したためである。表５は、各位置で選択された縮退コドン（イタリック体）と、それらの縮退コドンがコードするアミノ酸（ＡＡ）を要約したものである。選択した野生型ＡＡＶのいずれにも存在しないが、ライブラリーに含まれるアミノ酸も（括弧内に）示した。
【0108】
【表5】
【0109】
ＶＲ－Ｉ周辺の領域がＣ１１．１１とＬＫ０３－ＲＥＤＨのカプシド間で共通であることから、それぞれについて同じクローニング戦略を用いた。カプシドインサートを囲むＳｗａ－ＩおよびＮｓｉ－Ｉ制限部位を用いてカプシド領域をトリメトプリム耐性のクローニングプラスミドにクローニングした。ストップコドンをＱ２６３（配列番号２に示されるＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドに対するナンバリング）にクローニングし、バックグラウンドプラスミドコードのパッケージングを減少させた。次いで、ＰＣＲベースの戦略をクローニングに利用し、ＶＲ－Ｉ領域の下流のカプシド領域に整列する共通領域を有する３つのフォワードプライマーと、上記の表に一致する縮退コドンとを用いた。各フォワードプライマー（Ｆｗｄ １０ａａ、Ｆｗｄ １１ａａ、およびＦｗｄ １２ａａ）を共通のリバースプライマー（Ｒｅｖ ｃｏｍｍｏｎ １）と共に、異なるＰＣＲ反応で使用した（配列は表２２参照）。各フォワードプライマーはＱ２６３＿Ｓｔｏｐ－コドンを「固定」している。さらに、直鎖ＰＣＲ産物はギブソンアセンブリに適合する相補的な末端を持ち、したがって自己アニールして機能的プラスミドを生成することができる。ＰＣＲを個別に行い、産物を別々に精製、維持して個々のバリアント間の分子の違いを最小限にした。１１ａａ／１２ａａのＰＣＲ産物は１０ａａ産物の６倍のバリアントを含む。これらの違いを考慮し、ギブソンアセンブリを行う前にＰＣＲ産物を１：６：６のモル比（１０／１１／１２ ａａ）で混合した。反応は製造者の指示に従い、合計１ｐｍｏｌを混合して行った。
【0110】
ライブラリー選択に伴うノイズを減少させるために、動物内複製を生成する新規な戦略を開発した。その目的で、上記と全く同じプロトコルに従って、リバースプライマーのみを変更することにより、各カプシド骨格についてさらに２つの独立したＶＲ－Ｉライブラリーをクローニングした。Ｒｅｖ ｃｏｍｍｏｎ ２およびＲｅｖ ｃｏｍｍｏｎ ３（表２２参照）を生成した。アミノ酸ＴＹＮＮはＬＫ０３－ＲＥＤＨおよびＣ１１．１１の位置２５０～２５３に存在する。ＴＹＮＮを維持するがＤＮＡレベルでの「バーコード化」を可能にする同義コドンは、この領域をカバーするＲｅｖ ｃｏｍｍｏｎ ２およびＲｅｖ ｃｏｍｍｏｎ ３で利用された。
【0111】
その後、３つのライブラリーをパッケージングステップで混合し、同義コドンバーコードとライブラリー自体の両方を取り囲むＰＣＲプライマーを用いて、単一フラグメントの１５０－ＰＥＩｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングによって分析した。
【0112】
ライブラリーは、表４に存在する全ての可能なアミノ酸の組合せからなる１４９７６のバリアントを含む。ＡＡＶ２／３ｂからの１０ａａのＶＲ－Ｉ領域を含むＣ１１．１１およびＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシドと比較して、ライブラリー中のいくつかのバリアントは、位置２６４の後に１アミノ酸または２アミノ酸の挿入を含む（ＡＡＶ２カプシドに対するナンバリングで）。その結果、ライブラリーは１０、１１または１２アミノ酸のＶＲ－Ｉを有するバリアントからなる。
【0113】
ライブラリーは、以前に記載されたように、機能的形質導入プラットフォーム（肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を保有する）にクローニングされ、パッケージングされた（Ｃabanes-Creus et al., 2020,Methods Clin Dev, 17:1139-1154；第ＰＣＴ／ＡＵ２０１９／０５１１３３号も参照されたい、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
［実施例３］
［実施例３］
【0114】
改善された形質導入を有するバリアントの同定
ライブラリーを、高度に生着したｈＦＲＧマウスに注入した（実施例１）。具体的には、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨおよびＡＡＶＣ１１．１１ライブラリーを、２匹の高度にヒト化されたＦＲＧマウス、およびＡＡＶ注射の２４時間前に５ｍｇのＩＶＩｇで受動免疫された１匹の高度にヒト化されたＦＲＧマウスで個別にスクリーニングした。ＤＮＡおよびｃＤＮＡは、注射の１週間後に選別したヒト肝細胞から抽出した。
ライブラリーを、高度に生着したｈＦＲＧマウスに注入した（実施例１）。具体的には、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨおよびＡＡＶＣ１１．１１ライブラリーを、２匹の高度にヒト化されたＦＲＧマウス、およびＡＡＶ注射の２４時間前に５ｍｇのＩＶＩｇで受動免疫された１匹の高度にヒト化されたＦＲＧマウスで個別にスクリーニングした。ＤＮＡおよびｃＤＮＡは、注射の１週間後に選別したヒト肝細胞から抽出した。
【0115】
ライブラリーはまた、灌流系中のヒト肝臓摘出片の左葉において共同でスクリーニングされた（実施例１を参照）。ＤＮＡとｃＤＮＡは、ライブラリー注入の２日後に回収した。ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨとＡＡＶＣ１１．１１を区別するために、ヒト摘出物に入ったライブラリーは、Ｉ２４０でさらに以下のようにバーコード化した（ＬＫ０３－ＲＥＤＨのナンバリング）：
【0116】
【表6】
【0117】
肝臓摘出物からのＮＧＳ用プライマーは、それぞれ配列番号３３７および配列番号２０のフォワードおよびリバースプライマー配列であった；表２２参照）。
【0118】
肝臓から単離したヒト肝細胞中のベクターＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）レベルをＮＧＳにより評価し（それぞれ配列番号１９および２０のフォワードおよびリバースプライマー配列を使用；表２２を参照のこと）、種々の侵入スコアおよび発現スコア、ならびに合計スコアを、上記のように計算した。次いで、バリアントを、それらの合計スコアに基づいて１から１４９７６までランク付けした。
【0119】
表６は、ＩＶＩｇを用いないｈＦＲＧマウスでスクリーニングした、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ骨格に基づくライブラリーからの上位４０のバリアントを提供する。興味深いことに、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨからの野生型ＶＲ－Ｉ（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ；配列番号１２）を含むベクターは１９３２位にランクされた。重要なことに、このベクターでは発現スコアよりも比較的高い侵入スコアが観察され、これはＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨで観察されたことと一致している。表７は、ＩＶＩｇなしの別々のｈＦＲＧマウスでスクリーニングしたこのライブラリーの上位４０バリアントを示し；表８は、ＩＶＩｇありのｈＦＲＧマウスでスクリーニングしたこのライブラリーの上位４０バリアントを示し；表９は、肝臓摘出物でスクリーニングしたこのライブラリーの上位４０バリアントを示す。表１０～１３は、２つの別々のｈＦＲＧマウス（ＩＶＩＧなし）およびＩＶＩｇを用いたｈＦＲＧマウス、ならびに肝臓摘出物でそれぞれスクリーニングした、ＡＡＶＣ１１．１１骨格に基づくライブラリーからの上位４０バリアントを示す。
【0120】
【表7】
【0121】
【表8】
【0122】
【表9】
【0123】
【表10】
【0124】
【表11】
【0125】
【表12】
【0126】
【表13】
【0127】
【表14】
【0128】
二次（２ｙ）ライブラリーの生成
ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシド骨格上とＡＡＶＣ１１．１１骨格骨格上の２つのセカンダリー（２ｙ）ライブラリーを構築した。
ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨカプシド骨格上とＡＡＶＣ１１．１１骨格骨格上の２つのセカンダリー（２ｙ）ライブラリーを構築した。
【0129】
ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーは、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ＶＲ－Ｉライブラリーについて表６～９に記載された上位４０のバリアントを含むように構築されたが、バリアント「ＳＴＴＳＧＡＳＮＤＮＡ」は例外であり、これは、ｈＦＲＧマウス（ＩＶＩｇなし）の複製２（表７）でスクリーニングしたＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ＶＲ－Ｉライブラリーの上位４０バリアントの中にあり、ｈＦＲＧマウス（ＩＶＩｇあり）でスクリーニングしたＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ＶＲ－Ｉライブラリーの上位４０バリアントの中にあった（表８）。
【0130】
ＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーは、ＡＡＶＣ１１．１１ ＶＲ－Ｉライブラリーについて表１０～１３に記載された上位４０バリアントを含むように構築された。したがって、ＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーは１５９の選択されたバリアントを含み、ＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーは１６０の選択されたバリアントを含んでいた。
【0131】
同義コドンに従った戦略と同様に、２ｙライブラリーの各バリアントは、２つの複製（バリアント当たり２オリゴヌクレオチド）として注文された。それらを複製物として使用できるように、２つのオリゴヌクレオチドのうちの最初のものは、ヒトで最も頻繁に使用されるコドンで構築され、２つのオリゴヌクレオチドのうちの２番目のものは、ヒトで２番目に頻繁に使用されるコドンで構築された。一例として、野生型ＶＲ－Ｉ（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ；配列番号１２）に対して最も頻繁に使用されるコドンを有する第１のオリゴヌクレオチドの配列は、ＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣ（配列番号３４１）であり、野生型ＶＲ－Ｉ（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ；配列番号１２）に対して２番目に頻繁に使用されるコドンを有する第２のオリゴヌクレオチドの配列は、ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴ（配列番号３４２）である。
【0132】
２ｙライブラリーはいずれもオリゴヌクレオチドとして合成されたので、各ライブラリーについて、野生型ＶＲ－Ｉ配列「ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ」（配列番号１２）、以前の４つの選択（ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）複製１、ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）複製２、ｈＦＲＧ＋ＩＶＩｇ、および肝臓摘出物）のそれぞれについて２つの陰性ＶＲ－Ｉ対照（未選択バリアント）、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０のＶＲ－Ｉアミノ酸領域、ならびにストップコドンのみを保有するバリアントに対応する対照のセットが含まれた。合成されたオリゴヌクレオチドは、ＶＲ－Ｉ領域の上流（５’－ＡＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣ；配列番号３３８）と下流（５’－ＴＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＴＧＧ；配列番号３３９）の２つの相同性領域も保有していた。各２ｙライブラリーをギブソンアセンブリでそれぞれのバックグランドカプシドにクローニングした。
【0133】
共同で注入されるＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨとＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーを区別するために、各ライブラリーをＩ２４０で以下のようにさらにバーコード化した（ＬＫ０３－ＲＥＤＨのナンバリング）：
【0134】
【表15】
【0135】
両方の２ｙライブラリーを個別にパッケージングし、１：１で混合し、そして４つの異なるマウスモデルに注入した：１）肝臓摘出物；２）ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）；３）ｈＦＲＧ＋実施例３に示すＩＶＩｇ；および４）ＰｘＢ（ＩＶＩｇなし）。ＦＲＧと同様に、ＰｘＢマウスもヒト化肝臓を有するキメラマウスである。（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ）ＤＮＡおよびｃＤＮＡは、注射後１カ月のＦＲＧおよびＰＸＢマウスから、および注射後２、４、６および８日目の肝臓摘出物から回収した。
【0136】
ＤＮＡ（侵入）レベルでの肝臓摘出モデルからのＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーの上位にランク付けされたバリアントは、以下の基準に基づいて決定された：１）同義コドンの複製物が両方とも上位１００バリアントの中にあった；および２）同義コドンの複製物が両方とも４日のうち少なくとも３日に存在した。侵入ランクに基づく上位バリアントを表１４に示す。バリアントはＬＢ１１ ２ｙ１～ＬＢ１１ ２ｙ８と命名した（野生型はｗｔ＿ＬＢ１１と命名）。これらのバリアントはまたＡＡＶＣ１１．１２カプシド骨格にクローニングされた（そして対応してＬＢ１２ ２ｙ１－ＬＢ１２ ２ｙ８と命名された）。
【0137】
【表16】
【0138】
肝臓摘出モデルからの発現ｃＤＮＡリードからは、２つのトップカプシドバリアントのみを得た。発現レベルでの同等のランクを表１５に示す。バリアントをＬＢ１１ ２ｙ９～ＬＢ１１ ２ｙ１０と命名した。これらのバリアントはＡＡＶＣ１１．１２カプシド骨格にもクローニングされた（そして対応してＬＢ１２ ２ｙ９－ＬＢ１２ ２ｙ１０と命名された）。
【0139】
【表17】
【0140】
ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）（表１６）、ｈＦＲＧ＋ＩＶＩｇ（表１７）およびＰｘＢ（ＩＶＩｇなし）（表１８）モデルからのＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーの上位バリアントもまた、それらの侵入および発現ランクに基づいて選択した。これらのバリアントもＡＡＶＣ１１．１２カプシド骨格にクローニングした。バリアントＬＢ１１ ２ｙ １１～ＬＢ１１ ２ｙ １４（表１６）を、その発現ランクに基づいて選択した。バリアントＬＢ１１ ２ｙ ３、７～９、およびＬＢ１１ ２ｙ １５～１７（表１７）は、その発現ランクに基づいて選択され、バリアントＬＢ１１ ２ｙ １、１２、および１８～２０（表１７）は、その侵入ランクに基づいて選択された。バリアントＬＢ１１ ２ｙ ２１～ＬＢ１１ ２ｙ ２４（表１８）はその発現ランクに基づいて選択され、バリアントＬＢ１１ ２ｙ ２５（表１８）はその侵入ランクに基づいて選択された。
【0141】
【表18】
【0142】
【表19】
【0143】
【表20】
【0144】
ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）（表１９）、ｈＦＲＧ＋ＩＶＩｇ（表２０）およびＰｘＢ（ＩＶＩｇなし）（表２１）モデルからのＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーのためのいくつかの上位バリアントも、その侵入および発現ランクに基づいて選択された。これらのバリアントはＡＡＶＣ１１．１２カプシド骨格にはクローニングされなかった。バリアントＲＥＤＨ ２ｙ １～ＲＥＤＨ ２ｙ ４（表１９）はその発現ランクに基づいて選択された。バリアントＲＥＤＨ ２ｙ ５および６（表２０）は、その発現ランクに基づいて選択された。バリアントＲＥＤＨ ２ｙ ７～ＲＥＤＨ ２ｙ ９（表２１）はその発現ランクに基づいて選択され、バリアントＲＥＤＨ ２ｙ １０（表２１）はその侵入ランクに基づいて選択された。
【0145】
【表21】
【0146】
【表22】
【0147】
【表23】
【0148】
ＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙライブラリーおよびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーのために選択／生成されたバリアント、およびＡＡＶＣ１１．１２カプシド骨格上にクローンニングされたバリアント、合計６０を全て、２つのバーコード化ＩＴＲ２－ＬＳＰ１－ｅＧＦＰ－バーコード化－ＷＰＲＥ－ＩＴＲ２導入遺伝子でベクター化した。ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶ－ＬＫ０３およびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨを対照として用いた。
【0149】
選択／生成された６０のカプシドバリアントは、ｈＦＲＧマウスにおける検証のために２つの群に分けられた。群１（３４バリアント）には、ＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙおよびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーの両方について、肝臓摘出物およびｈＦＲＧ ＋ ＩＶＩｇモデルから上位にランク付けされたバリアントと、対応するＡＡＶＣ１１．１２ ２ｙバリアントが含まれた。群２（２６バリアント）には、ＡＡＶＣ１１．１１ ２ｙおよびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ ２ｙライブラリーの両方について、ｈＦＲＧ（ＩＶＩｇなし）およびＰｘＢモデルから上位にランク付けされたバリアント、ならびに対応するＡＡＶＣ１１．１２ ２ｙバリアントが含まれた。
【0150】
２つの選択／生成されたカプシドバリアント群の各々を、ＩＶＩｇの有無にかかわらずｈＦＲＧマウスのいずれかに注射し（群当たりｎ＝３、カプシドバリアント群当たり合計６匹のｈＦＲＧマウス）、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶ－ＬＫ０３およびＡＡＶ－ＬＫ０３－ＲＥＤＨ対照と比較した。肝臓から単離したヒト肝細胞のベクターＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）レベルをＮＧＳで評価し、注入前混合物に対して正規化し、次にＡＡＶ－Ｃ１１．１２の性能に対して正規化し、以下のように計算してデータを提示した：（カプシドｉ ＤＮＡ％／カプシド ｉ 前混合物％）／（カプシドＣ１１．Ｃ１２ ＤＮＡ％／カプシド Ｃ１１．Ｃ１２前混合物％）。結果を図３～図６に示す。Ｃ１１．Ｃ１２は１として表示され、残りのカプシドは、各条件につきｎ＝３のＦＲＧについてＣ１１．Ｃ１２と比較した場合の平均倍数変化を示す。
【0151】
【表24】
【0152】
【表25-1】
【表25-2】
【表25-3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】