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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】カーゴヌクレオチド配列を転位するための系及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12N15/54
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506884
(86)(22)【出願日】2022-09-07
(85)【翻訳文提出日】2024-03-22
(86)【国際出願番号】 US2022076059
(87)【国際公開番号】W WO2023039436
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/241,934
(32)【優先日】2021-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522185863
【氏名又は名称】メタゲノミ，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】トーマス，ブライアン シー．
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ゴルツマン，ダニエラ エス．エー．
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンダー，リサ
(72)【発明者】
【氏名】ラペリエール，サラ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
(57)【要約】
本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位するための系及び方法を提供する。これらの系及び方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、トランスポザーゼであって、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位するように構成されている、トランスポザーゼと、を含み得る。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作されたトランスポザーゼ系であって、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、
（ｂ）トランスポザーゼであって、
（ｉ）前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、
（ｉｉ）未培養微生物に由来する、トランスポザーゼと、を含む、操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項2】
前記トランスポザーゼが、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項3】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない、請求項１又は２に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項4】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項5】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項6】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項7】
前記トランスポザーゼが、触媒チロシン残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項8】
前記トランスポザーゼが、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項9】
前記トランスポザーゼが、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして前記カーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項10】
前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項11】
前記ＮＬＳが、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項12】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項13】
前記配列同一性が、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項１２に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項14】
操作されたトランスポザーゼ系であって、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、
（ｂ）トランスポザーゼであって、
（ｉ）前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、
（ｉｉ）配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスポザーゼと、を含む、操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項15】
前記トランスポザーゼが、未培養微生物に由来する、請求項１４に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項16】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない、請求項１４又は１５に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項17】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項18】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項19】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項20】
前記トランスポザーゼが、触媒チロシン残基を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項21】
前記トランスポザーゼが、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項22】
前記トランスポザーゼが、左側認識配列又は右側認識配列に適合する、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項23】
前記トランスポザーゼが、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして前記カーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項24】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項25】
前記配列同一性が、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項２４に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系をコードする、デオキシリボ核酸ポリヌクレオチド。
【請求項27】
生物における発現に最適化された操作された核酸配列を含む核酸であって、前記核酸が、トランスポザーゼをコードし、前記トランスポザーゼが、未培養微生物に由来し、前記生物が、前記未培養微生物ではない、核酸。
【請求項28】
前記トランスポザーゼが、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項29】
前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む、請求項２７又は２８に記載の核酸。
【請求項30】
前記ＮＬＳが、配列番号４５５～４７０から選択される配列を含む、請求項２９に記載の核酸。
【請求項31】
前記ＮＬＳが、配列番号４５６を含む、請求項２９又は３０に記載の核酸。
【請求項32】
前記ＮＬＳが、前記トランスポザーゼの前記Ｎ末端の近位にある、請求項３１に記載の核酸。
【請求項33】
前記ＮＬＳが、配列番号４５５を含む、請求項２９又は３０に記載の核酸。
【請求項34】
前記ＮＬＳが、前記トランスポザーゼの前記Ｃ末端の近位にある、請求項３３に記載の核酸。
【請求項35】
前記生物が、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、齧歯類、又はヒトである、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項36】
請求項２７～３５のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項37】
前記トランスポザーゼと複合体を形成するように構成されたカーゴヌクレオチド配列をコードする核酸を更に含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項38】
前記ベクターが、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、又はレンチウイルスである、請求項３６又は３７に記載のベクター。
【請求項39】
請求項３６～３８のいずれか一項のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項40】
請求項３９に記載の細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを製造する方法。
【請求項41】
カーゴ配列を含む二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法であって、（ａ）前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されたトランスポザーゼと接触させることを含み、
（ｂ）前記トランスポザーゼが、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項42】
前記トランスポザーゼが、未培養微生物に由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項44】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記トランスポザーゼが、触媒チロシン残基を含む、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記トランスポザーゼが、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記トランスポザーゼが、左側認識配列又は右側認識配列に適合する、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである、請求項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
標的核酸遺伝子座を修飾する方法であって、前記方法が、請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することを含み、前記トランスポザーゼが、前記カーゴヌクレオチド配列を前記標的核酸遺伝子座に転位するように構成されており、前記複合体が、前記複合体の前記標的核酸遺伝子座への結合時に、前記複合体が前記標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている、方法。
【請求項53】
前記標的核酸遺伝子座を修飾することが、前記標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記標的核酸遺伝子座が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項55】
前記標的核酸遺伝子座が、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記標的核酸遺伝子座が、インビトロである、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記標的核酸遺伝子座が、細胞内にある、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記細胞が、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、又は初代細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記細胞が、初代細胞である、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項60】
前記初代細胞が、Ｔ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記初代細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の核酸又は請求項３６～３８のいずれか一項に記載のベクターを送達することを含む、請求項５２～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、前記トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む、請求項５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記核酸が、前記トランスポザーゼをコードする前記オープンリーディングフレームが作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、前記トランスポザーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む、請求項５２～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む、請求項５２～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記トランスポザーゼが、前記標的核酸遺伝子座で、又は前記標的核酸遺伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する、請求項５２～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記トランスポザーゼが、前記標的遺伝子座内又は前記標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
配列番号１～３４９のうちのいずれか１つ又はそのバリアントと少なくとも７５％の配列同一性を有する異種トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、宿主細胞。
【請求項70】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項71】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項72】
前記トランスポザーゼが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１７のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項73】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項74】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、λＤＥ３リソゲンであるか、又は前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）株である、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項75】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｏｍｐＴ ｌｏｎ遺伝子型を有する、請求項７３又は７４に記載の宿主細胞。
【請求項76】
前記オープンリーディングフレームが、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ７－ｌａｃプロモーター配列、ｌａｃプロモーター配列、ｔａｃプロモーター配列、ｔｒｃプロモーター配列、ＰａｒａＢＡＤプロモーター配列、ＰｒｈａＢＡＤプロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、ｃｓｐＡプロモーター配列、ａｒａＰＢＡＤプロモーター、ファージラムダからの強い左向きプロモーター（ｐＬプロモーター）、又はそれらの任意の組み合わせに作動可能に連結されている、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項77】
前記オープンリーディングフレームが、前記トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結された親和性タグをコードする配列を含む、請求項６９～７６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項78】
前記親和性タグが、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）タグである、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項79】
前記ＩＭＡＣタグが、ポリヒスチジンタグである、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項80】
前記親和性タグが、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項81】
前記親和性タグが、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、前記トランスポザーゼをコードする前記配列にインフレームで連結されている、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項82】
前記プロテアーゼ切断部位が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項８１に記載の宿主細胞。
【請求項83】
前記オープンリーディングフレームが、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６９～８２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項84】
前記オープンリーディングフレームが、ベクター上に提供されている、請求項６９～８３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項85】
前記オープンリーディングフレームが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項６９～８３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項86】
適合する液体培地中に、請求項６９～８５のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、培養物。
【請求項87】
適合する成長培地中で、請求項６９～８５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを産生する方法。
【請求項88】
追加の化学剤又は増加された量の栄養素を添加することによって、前記トランスポザーゼの発現を誘導することを更に含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記追加の化学剤又は増加された量の栄養素が、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は追加の量のラクトースを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記培養後に前記宿主細胞を単離することと、前記宿主細胞を溶解してタンパク質抽出物を産生することとを更に含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記タンパク質抽出物をＩＭＡＣ、又はイオン親和性クロマトグラフィーに供することを更に含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記オープンリーディングフレームが、前記トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されたＩＭＡＣ親和性タグをコードする配列を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記ＩＭＡＣ親和性タグが、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、前記トランスポザーゼをコードする前記配列にインフレームで連結されている、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記プロテアーゼ切断部位が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
前記プロテアーゼ切断部位に対応するプロテアーゼを前記トランスポザーゼと接触させることによって、前記ＩＭＡＣ親和性タグを切断することを更に含む、請求項９３又は９４に記載の方法。
【請求項96】
サブトラクティブＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーを実施して、前記トランスポザーゼを含む組成物から前記親和性タグを除去することを更に含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
細胞中の遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に組成物を接触させることを含み、前記組成物が、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、
（ｂ）トランスポザーゼであって、
（ｉ）前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、
（ｉｉ）配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉｉ）細胞内でＴｎｐＡトランスポザーゼと少なくとも同等の転位活性を有する、トランスポザーゼと、を含む、方法。
【請求項98】
前記転位活性が、前記標的核酸遺伝子座を含む細胞に前記トランスポザーゼを導入し、前記細胞内の前記標的核酸遺伝子座の転位を検出することによって、インビトロで測定される、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記組成物が、２０ピコモル（ｐｍｏｌ）以下の前記トランスポザーゼを含む、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項100】
前記組成物が、１ｐｍｏｌ以下の前記トランスポザーゼを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
操作されたトランスポザーゼ系であって、前記操作されたトランスポザーゼ系が、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、
（ｂ）トランスポザーゼと、を含み、
（ｉ）前記トランスポザーゼが、前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、
（ｉｉ）前記二本鎖核酸が、前記カーゴ配列に隣接する隣接配列を含み、前記隣接配列が、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する、操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項102】
前記トランスポザーゼが、未培養生物に由来する、請求項１０１に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項103】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない、請求項１０１又は１０２に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項104】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項105】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項106】
前記トランスポザーゼが、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０１～１０５のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項107】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１０６に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項108】
前記トランスポザーゼが、触媒チロシン残基を含む、請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項109】
前記トランスポザーゼが、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項110】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される、請求項１０１～１０９のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項111】
前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項112】
前記１つ以上のＮＬＳのＮＬＳが、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１１１に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項113】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである、請求項１０１～１１２のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項114】
前記隣接配列が、配列番号３５０、３５２、３５５、３５６、３５９、３６１、３６２、及び３６７のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１０１～１１３のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項115】
前記二本鎖核酸が、前記カーゴ配列に隣接する別の隣接配列を含み、前記別の隣接配列が、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する、請求項１０１～１１４のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項116】
前記別の隣接配列が、配列番号３５１、３５３、３５４、３５７、３５８、３６０、３６３、及び３６６のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１１５に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項117】
前記隣接配列が、前記カーゴ核酸配列の左端に隣接し、前記別の隣接配列が、前記カーゴ核酸配列の右端に隣接する、請求項１１５又は１１６に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項118】
前記トランスポザーゼが、前記標的核酸遺伝子座に隣接する挿入モチーフを認識するように構成されている、請求項１０１～１１７のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項119】
前記挿入モチーフが、配列ＡＡＴＧＡＣの少なくとも３、４、５、又は６個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１１８に記載の操作されたトランスポザーゼ系。
【請求項120】
請求項１０１～１１９のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系をコードする、デオキシリボ核酸ポリヌクレオチド。
【請求項121】
カーゴ配列を含む二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法であって、前記方法が、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、前記カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されたトランスポザーゼと接触させることを含み、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、前記カーゴ配列に隣接する隣接配列を含み、前記隣接配列が、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項122】
前記トランスポザーゼが、未培養生物に由来する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項123】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない、請求項１２２に記載の方法。
【請求項124】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項125】
前記トランスポザーゼが、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する、請求項１２１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項126】
前記トランスポザーゼが、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１２１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項127】
前記トランスポザーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項128】
前記トランスポザーゼが、触媒チロシン残基を含む、請求項１２１～１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項129】
前記トランスポザーゼが、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている、請求項１２１～１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項130】
前記トランスポザーゼが、左側認識配列又は右側認識配列に適合する、請求項１２１～１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項131】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される、請求項１２１～１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１２１～１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項133】
前記１つ以上のＮＬＳのＮＬＳが、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１２１～１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項134】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである、請求項１２１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項135】
前記隣接配列が、配列番号３５０、３５２、３５５、３５６、３５９、３６１、３６２、及び３６７のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１２１～１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、前記カーゴ配列に隣接する別の隣接配列を含み、前記別の隣接配列が、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する、請求項１２１～１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項137】
前記別の隣接配列が、配列番号３５１、３５３、３５４、３５７、３５８、３６０、３６３、及び３６６のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項138】
前記隣接配列が、前記カーゴ核酸配列の左端に隣接し、前記別の隣接配列が、前記カーゴ核酸配列の右端に隣接する、請求項１３５又は１３７に記載の方法。
【請求項139】
前記トランスポザーゼが、前記標的核酸遺伝子座に隣接する挿入モチーフを認識するように構成されている、請求項１２１～１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
前記挿入モチーフが、配列ＡＡＴＧＡＣの少なくとも３、４、５、又は６個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項141】
標的核酸遺伝子座を修飾する方法であって、前記方法が、請求項１０１～１１９のいずれか一項に記載の操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することを含み、前記トランスポザーゼが、前記カーゴヌクレオチド配列を前記標的核酸遺伝子座に転位するように構成されており、前記複合体が、前記複合体の前記標的核酸遺伝子座への結合時に、前記複合体が前記標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている、方法。
【請求項142】
前記標的核酸遺伝子座を修飾することが、前記標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項143】
前記標的核酸遺伝子座が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項１４１又は１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記標的核酸遺伝子座が、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項145】
前記標的核酸遺伝子座が、インビトロである、請求項１４１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
前記標的核酸遺伝子座が、細胞内にある、請求項１４１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項147】
前記細胞が、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、又は初代細胞である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項148】
前記細胞が、初代細胞である、請求項１４６又は１４７に記載の方法。
【請求項149】
前記初代細胞が、Ｔ細胞である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項150】
前記初代細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項151】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、前記トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む、請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項152】
前記核酸が、前記トランスポザーゼをコードする前記オープンリーディングフレームが作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項153】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、前記トランスポザーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む、請求項１５１又は１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記操作されたトランスポザーゼ系を前記標的核酸遺伝子座に送達することが、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む、請求項１４１～１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記トランスポザーゼが、前記標的核酸遺伝子座で、又は前記標的核酸遺伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する、請求項１４１～１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項156】
前記トランスポザーゼが、前記標的遺伝子座内又は前記標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する、請求項１５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２１年９月８日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＳＩＮＧ ＣＡＲＧＯ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国仮特許出願第６３／２４１，９３４号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月８日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＳＩＮＧ ＣＡＲＧＯ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」と題された米国仮特許出願第６３／２４１，９３４号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
転位因子は、遺伝子の機能及び進化において重要な役割を果たす移動可能なＤＮＡ配列である。転位因子はほぼ全ての種類の生命体で見られるが、それらの保有率は生物間で異なり、真核生物ゲノムの大部分は転位因子をコードする（ヒトでは少なくとも４５％）。転位因子に関する基礎的研究は１９４０年代に行われたが、ＤＮＡ操作及び遺伝子編集の用途におけるそれらの潜在的な有用性が認識されるようになったのは近年のことである。
【0003】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年９月７日に作成された当該ＸＭＬコピーは、５５９２１－７３３６０１．ｘｍｌと名付けられ、４５２，４２１バイトのサイズである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年９月７日に作成された当該ＸＭＬコピーは、５５９２１－７３３６０１．ｘｍｌと名付けられ、４５２，４２１バイトのサイズである。
【発明の概要】
【0004】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたトランスポザーゼ系を提供し、上記操作されたトランスポザーゼ系は、カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、トランスポザーゼであって、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、未培養微生物に由来する、トランスポザーゼと、を含む。
【0005】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【0006】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたトランスポザーゼ系を提供し、上記操作されたトランスポザーゼ系は、カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、トランスポザーゼであって、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスポザーゼと、を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、左側認識配列又は右側認識配列に適合する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【0008】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の操作されたトランスポザーゼ系をコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
いくつかの態様では、本開示は、生物における発現に最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸はトランスポザーゼをコードし、トランスポザーゼは未培養微生物に由来し、生物は未培養微生物ではない。
【0010】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５６を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、トランスポザーゼのＮ末端の近位にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、トランスポザーゼのＣ末端の近位にある。いくつかの実施形態では、生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、齧歯類、又はヒトである。
【0011】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、トランスポザーゼと複合体を形成するように構成されたカーゴヌクレオチド配列をコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、又はレンチウイルスである。
【0012】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される任意のベクターを含む細胞を提供する。
【0013】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを製造する方法を提供する。
【0014】
いくつかの態様では、本開示は、カーゴ配列を含む二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法を提供し、上記方法は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されたトランスポザーゼと接触させることを含み、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、左側認識配列又は右側認識配列に適合する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。
【0016】
いくつかの態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を修飾する方法を提供し、上記方法は、本明細書に開示される操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することを含み、トランスポザーゼは、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されており、複合体は、複合体の標的核酸遺伝子座への結合時に、複合体が標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている。
【0017】
いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座を修飾することは、標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、又は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、本明細書に開示される核酸又は本明細書に開示される任意のベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームが作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的核酸遺伝子座で、又は標的核酸遺伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的遺伝子座内又は標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する。
【0018】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つ又はそのバリアントと少なくとも７５％の配列同一性を有する異種トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１７のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、λＤＥ３リソゲンであるか、又はＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｏｍｐＴ ｌｏｎ遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ７－ｌａｃプロモーター配列、ｌａｃプロモーター配列、ｔａｃプロモーター配列、ｔｒｃプロモーター配列、ＰａｒａＢＡＤプロモーター配列、ＰｒｈａＢＡＤプロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、ｃｓｐＡプロモーター配列、ａｒａＰＢＡＤプロモーター、ファージラムダからの強い左向きプロモーター（ｐＬプロモーター）、又はそれらの任意の組み合わせに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結された親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）タグである。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣタグは、ポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ベクター上に提供される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【0019】
いくつかの態様では、本開示は、適合する液体培地中に、本明細書に開示される任意の宿主細胞を含む、培養物を提供する。
【0020】
いくつかの態様では、本開示は、適合する成長培地中で、本明細書に開示される任意の宿主細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを産生する方法を提供する。
【0021】
いくつかの実施形態では、方法は、追加の化学剤又は増加された量の栄養素を添加することによって、トランスポザーゼの発現を誘導することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の化学剤又は増加された量の栄養素は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は追加の量のラクトースを含む。いくつかの実施形態では、方法は、培養後に宿主細胞を単離することと、宿主細胞を溶解してタンパク質抽出物を産生することとを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質抽出物をＩＭＡＣ、又はイオン親和性クロマトグラフィーに供することを更に含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されたＩＭＡＣ親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣ親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プロテアーゼ切断部位に対応するプロテアーゼをトランスポザーゼと接触させることによって、ＩＭＡＣ親和性タグを切断することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、サブトラクティブＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーを実施して、トランスポザーゼを含む組成物から親和性タグを除去することを更に含む。
【0022】
いくつかの態様では、本開示は、細胞中の遺伝子座を破壊する方法を提供し、上記方法は、細胞に組成物を接触させることを含み、組成物は、カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、トランスポザーゼであって、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含み、細胞内でＴｎｐＡトランスポザーゼと少なくとも同等の転位活性を有する、トランスポザーゼと、を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、転位活性は、標的核酸遺伝子座を含む細胞にトランスポザーゼを導入し、細胞内の標的核酸遺伝子座の転位を検出することによって、インビトロで測定される。いくつかの実施形態では、組成物は、２０ピコモル（ｐｍｏｌ）以下のトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ｐｍｏｌ以下のトランスポザーゼを含む。
【0024】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたトランスポザーゼ系を提供し、上記操作されたトランスポザーゼ系は、カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されている、トランスポザーゼとを含み、二本鎖核酸は、カーゴ配列に隣接する隣接配列を含み、隣接配列は、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。
【0025】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳのＮＬＳは、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、隣接配列は、配列番号３５０、３５２、３５５、３５６、３５９、３６１、３６２、及び３６７のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、カーゴ配列に隣接する別の隣接配列を含み、上記別の隣接配列は、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、別の隣接配列は、配列番号３５１、３５３、３５４、３５７、３５８、３６０、３６３、及び３６６のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、隣接配列は、カーゴ核酸配列の左端に隣接し、別の隣接配列は、カーゴ核酸配列の右端に隣接する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的核酸遺伝子座に隣接する挿入モチーフを認識するように構成されている。いくつかの実施形態では、挿入モチーフは、配列ＡＡＴＧＡＣの少なくとも３、４、５、又は６個の連続するヌクレオチドを含む。
【0026】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の操作されたトランスポザーゼ系をコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。
【0027】
いくつかの態様では、本開示は、カーゴ配列を含む二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法を提供し、上記方法は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されたトランスポザーゼと接触させることを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、カーゴ配列に隣接する隣接配列を含み、隣接配列は、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。
【0028】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１８～１９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、左側認識配列又は右側認識配列に適合する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳのＮＬＳは、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、隣接配列は、配列番号３５０、３５２、３５５、３５６、３５９、３６１、３６２、及び３６７のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、カーゴ配列に隣接する別の隣接配列を含み、上記別の隣接配列は、配列番号３５０～４５４のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、別の隣接配列は、配列番号３５１、３５３、３５４、３５７、３５８、３６０、３６３、及び３６６のうちのいずれか１つの少なくとも９０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、隣接配列は、カーゴ核酸配列の左端に隣接し、別の隣接配列は、カーゴ核酸配列の右端に隣接する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的核酸遺伝子座に隣接する挿入モチーフを認識するように構成されている。いくつかの実施形態では、挿入モチーフは、配列ＡＡＴＧＡＣの少なくとも３、４、５、又は６個の連続するヌクレオチドを含む。
【0029】
いくつかの態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を修飾する方法を提供し、上記方法は、本明細書に開示される操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することを含み、トランスポザーゼは、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されており、複合体は、複合体の標的核酸遺伝子座への結合時に、複合体が標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている。
【0030】
いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座を修飾することは、標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、又は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームが作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的核酸遺伝子座で、又は標的核酸遺伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的遺伝子座内又は標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する。
【0031】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたトランスポザーゼ系を提供し、上記操作されたトランスポザーゼ系は、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、（ｂ）トランスポザーゼであって、（ｉ）カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、（ｉｉ）未培養微生物に由来する、トランスポザーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、カーゴヌクレオチド配列は、異種配列である。いくつかの実施形態では、カーゴヌクレオチド配列は、操作された配列である。いくつかの実施形態では、カーゴヌクレオチド配列は、生物中に存在する野生型ゲノム配列ではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０からなる群からの配列と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【0032】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたトランスポザーゼ系を提供し、上記操作されたトランスポザーゼ系は、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がトランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、（ｂ）トランスポザーゼであって、（ｉ）カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、（ｉｉ）配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスポザーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムのパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬＷによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【0033】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの操作されたトランスポザーゼ系をコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。
【0034】
いくつかの態様では、本開示は、生物における発現に最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸はトランスポザーゼをコードし、トランスポザーゼは未培養微生物に由来し、生物は未培養微生物ではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５６を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、トランスポザーゼのＮ末端の近位にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、トランスポザーゼのＣ末端の近位にある。いくつかの実施形態では、生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、齧歯類、又はヒトである。
【0035】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、トランスポザーゼと複合体を形成するように構成されたカーゴヌクレオチド配列をコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、又はレンチウイルスである。
【0036】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つのベクターを含む細胞を提供する。
【0037】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを製造する方法を提供する。
【0038】
いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法を提供し、上記方法は、（ａ）二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されたトランスポザーゼと接触させることを含み、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと８０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとして転位される。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。
【0039】
いくつかの態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を修飾する方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することを含み、トランスポザーゼは、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成されており、複合体は、複合体の標的核酸遺伝子座への結合時に、複合体が標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座を修飾することは、標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、又は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、本明細書に記載される態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つの核酸、又は本明細書に記載される態様若しくは実施形態のうちのいずれか１つのベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームが作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することは、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的核酸遺伝子座で、又は標的核酸遺伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的遺伝子座内又は標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する。
【0040】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つ又はそのバリアントと少なくとも７５％の配列同一性を有する異種トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は１６のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１７のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、λＤＥ３リソゲンであるか、又はＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｏｍｐＴ ｌｏｎ遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ７－ｌａｃプロモーター配列、ｌａｃプロモーター配列、ｔａｃプロモーター配列、ｔｒｃプロモーター配列、ＰａｒａＢＡＤプロモーター配列、ＰｒｈａＢＡＤプロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、ｃｓｐＡプロモーター配列、ａｒａＰＢＡＤプロモーター、ファージラムダからの強い左向きプロモーター（ｐＬプロモーター）、又はそれらの任意の組み合わせに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結された親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）タグである。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣタグは、ポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ベクター上に提供される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞のゲノムに組み込まれている。
【0041】
いくつかの態様では、本開示は、適合する液体培地中に、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの宿主細胞を含む、培養物を提供する。
【0042】
いくつかの態様では、本開示は、適合する成長培地中で、本明細書に記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つの宿主細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、追加の化学剤又は増加された量の栄養素を添加することによって、トランスポザーゼの発現を誘導することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の化学剤又は増加された量の栄養素は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は追加の量のラクトースを含む。いくつかの実施形態では、方法は、培養後に宿主細胞を単離することと、宿主細胞を溶解してタンパク質抽出物を産生することとを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質抽出物をＩＭＡＣ、又はイオン親和性クロマトグラフィーに供することを更に含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されたＩＭＡＣ親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣ親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プロテアーゼ切断部位に対応するプロテアーゼをトランスポザーゼと接触させることによって、ＩＭＡＣ親和性タグを切断することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、サブトラクティブＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーを実施して、トランスポザーゼを含む組成物から親和性タグを除去することを更に含む。
【0043】
いくつかの態様では、本開示は、細胞中の遺伝子座を破壊する方法を提供し、上記方法は、細胞に組成物を接触させることを含み、組成物は、（ａ）カーゴヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列が、トランスポザーゼと相互作用するように構成されている、二本鎖核酸と、（ｂ）トランスポザーゼであって、（ｉ）カーゴヌクレオチド配列を標的核酸遺伝子座に転位するように構成され、（ｉｉ）配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）細胞内でＴｎｐＡトランスポザーゼと少なくとも同等の転位活性を有する、トランスポザーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、転位活性は、標的核酸遺伝子座を含む細胞にトランスポザーゼを導入し、細胞内の標的核酸遺伝子座の転位を検出することによって、インビトロで測定される。いくつかの実施形態では、組成物は、２０ｐｍｏｌｅ以下のトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ｐｍｏｌ以下のトランスポザーゼを含む。
【0044】
本開示の更なる態様及び利点は、以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになり、ここで、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載される。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態をすることができ、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において改変することができる。したがって、図面及び説明は、本質的に例示とみなされるべきであり、制限としてみなされるべきではない。
【0045】
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0046】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特記して記載される。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるだろう。
【0047】
【図1A】図１Ａ及び図１Ｂは、ＭＧトランスポザーゼを示す。図１Ａは、チロシン（Ｙ１）トランスポザーゼＭＧ９２－１遺伝子座を含むトランスポゾンの組織を示す。ＭＧ９２－１は、トランスポゾンの５’端でコードされ、その後にアクセサリー転位タンパク質ＴｎｐＢ及び他のカーゴが続く。トランスポゾン端は、１６～１７ｂｐの直接反復を含有し、それらは、転位活性に関与し得る二次構造を示す。図１Ｂは、ＭＧ Ｙ１トランスポザーゼホモログの複数の配列アライメントを示す。触媒残基ＨＵＨ及びＹは、コンセンサス配列上及びＭＳＡ（ボックス）上で強調表示されている。
【図1B】図１Ａ及び図１Ｂは、ＭＧトランスポザーゼを示す。図１Ａは、チロシン（Ｙ１）トランスポザーゼＭＧ９２－１遺伝子座を含むトランスポゾンの組織を示す。ＭＧ９２－１は、トランスポゾンの５’端でコードされ、その後にアクセサリー転位タンパク質ＴｎｐＢ及び他のカーゴが続く。トランスポゾン端は、１６～１７ｂｐの直接反復を含有し、それらは、転位活性に関与し得る二次構造を示す。図１Ｂは、ＭＧ Ｙ１トランスポザーゼホモログの複数の配列アライメントを示す。触媒残基ＨＵＨ及びＹは、コンセンサス配列上及びＭＳＡ（ボックス）上で強調表示されている。
【図2】は、ＴｎｐＡタンパク質配列の系統樹を示す。この樹は、ここで回収された４１４の新規ＴｎｐＡ配列（黒い点）及び１９の参照ＴｎｐＡ配列（灰色の点）の複数の配列アライメントから構築された。参照配列の標識が含まれた。
【図3】は、例示的な挿入配列ＩＳ２００／ＩＳ６０５ ＭＧ９２－２８を示す。上のパネル：ＴｎｐＡ様トランスポザーゼ及びその関連ＴｎｐＢ様遺伝子をコードするＭＧ９２－２８挿入配列のゲノムコンテキスト。両方の遺伝子は、共分散モデルから予測されたＬＥ及びＲＥ（ボックス）に隣接している。下のパネル：ＬＥ（左上）及びＲＥ（右下）は、挿入配列の境界を描写している。共分散モデルによって予測された領域は、配列の下の矢印として注釈付けされている。ＬＥ及びＲＥの二次構造は、各端について示されている。
【図4】は、ＰｕｒｅＥｘｐｒｅｓｓで発現されたＴｎｐＡ様タンパク質のウェスタンブロットを示す。レーンは、ラダー、１：ＨｐＴｎｐＡ、２：ＨｈＴｐＡ、３：９２－２、４：９２－３、５：９２－４、６：９２－５、７：９２－６、８：９２－７、９：９２－８、１０：９２－１０、１１：９２－１１である。ＨｐＴｎｐＡ及びＨｈＴｐＡは、それぞれＨ．ｐｙｌｏｒｉ及びＨ．Ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉからの陽性対照である。分子量は、１７～２３キロダルトン（ｋＤａ）の範囲である。
【図5A】は、転位反応のＬＥのＰＣＲ産物を示す。カーゴが指定された対照レーンを除き、全ての反応物は、タンパク質及びその対の特定のカーゴを有する。レーンは、１：ラダー、２：ＨｐＴｎｐＡカーゴを有する陰性対照ＮＴＣ、３：９２－１、４：９２－２、５：９２－３、６：９２－４、７：９２－５、８：９２－６、９：９２－７、１０：９２－８、１１：９２－１０、１２：９２－１１、１３：ＨｐＴｎｐＡ、１４；ＨｈＴｎｐＡである。予想される転位産物は、ＬＥサイズに応じて２００～３００ｂｐの範囲であり得、矢印でマークされている。９２－５における＜２００ｂｐのバンドは、非特異的プライマー相互作用に関連する。
【図5B】は、転位反応のＲＥのＰＣＲ産物を示す。カーゴが指定された対照レーンを除き、全ての反応物は、タンパク質及びその対の特定のカーゴを有する。レーンは、１：ＨｐＴｎｐＡカーゴを有するＮＴＣ、２：９２－１、３：９２－２、４：９２－３、５：９２－４、６：９２－５、７：９２－６、８：９２－７、９：９２－８、１０：９２－１０、１１：９２－１１、１２：ＨｐＴｎｐＡ、１３；ＨｈＴｎｐＡ、及び１４：ラダーである。予想される転位産物は、ＲＥサイズに応じて３００～５００ｂｐの範囲であり得、矢印でマークされている。８Ｎ領域に生じる転位は、隣接配列への転位よりもはるかに弱いバンドを有するため、淡いバンドが予想される。
【図6】は、ＭＧ９２－３の転位を確認するサンガーシーケンシングデータを示す。クロマトグラムトレースは、カーゴ配列にマッピングされて示され、影付き文字はカーゴと一致する。切断点（矢印）では、トレースは代わりに標的配列（ボックス）上にマッピングされている。標的の分析により、ＬＥと標的との間で共有される配列である挿入モチーフが明らかになる。隣接する非標準塩基相互作用を有する下流のヘアピンを特定することができる。
【図7】は、ＭＧ９２－３の転位を確認するサンガーシーケンシングデータを示す。クロマトグラムトレースは、カーゴにマッピングされて示され、影付き文字はカーゴと一致する。切断点（矢印）では、トレースは代わりに標的配列（ボックス）上にマッピングされている。標的の分析により、挿入モチーフが明らかになる。推定ＲＥにおける切断位置は、ＲＥの境界を画定し、これは、ＴｎｐＡ認識及び鎖切断（点線のボックスの差し込み図）を可能にするために、標準ヘアピンに折り畳まれる。
【図8】は、ブレイクポイントを決定するために分析されたカーゴ及び標的配列接続を示すキメラＮＧＳリードの分析を示す。ｘ軸は、カーゴ配列に沿った位置であり、ｙ軸は、その位置で遷移するリードの数である。カーゴ上の２０３０ｎｔでのブレイクポイントにおける特定されたピークは、サンガーシーケンシングで特定されたブレイクポイントと一致し、ＬＥ切断の位置が確認されている。
【図9】は、ＭＧ９２－４の転位を確認するＮＧＳシーケンシングデータを示す。ＮＧＳリードは、標的にマッピングされて示され、薄い影付き文字はカーゴと一致する。切断点（矢印）では、トレースは代わりにカーゴ配列（ボックス）上にマッピングされている。推定ＲＥにおける切断位置は、ＲＥの境界を画定し、これは、ＴｎｐＡ認識及び鎖切断（点線のボックスの差し込み図）を可能にするために、標準ヘアピンに折り畳まれる。ＮＧＳリードヒストグラムは、カーゴ上のこのブレイクポイントに対応するリードの頻度を示す。
【0048】
配列表の簡単な説明
本明細書とともに提出された配列表は、本開示による方法、組成物、及び系で使用するための例示的なポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を提供する。以下は、その中の配列の例示的な説明である。
ＭＧ９２
本明細書とともに提出された配列表は、本開示による方法、組成物、及び系で使用するための例示的なポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を提供する。以下は、その中の配列の例示的な説明である。
ＭＧ９２
【0049】
配列番号１～３４９は、ＭＧ９２転位タンパク質の完全長ペプチド配列を示す。
【0050】
配列番号３５０～４５４は、ＭＧ９２トランスポゾン端の完全長ペプチド配列を示す。
核局在化配列
核局在化配列
【0051】
配列番号４５５～４７０は、本明細書に記載されるＭＧ９２転位タンパク質との使用に好適な核局在化配列（ＮＬＳ）の完全長ペプチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0052】
本発明の様々な実施形態は本明細書に示され、記載されるが、そのような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者にとって想到し得るものである。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が用いられ得ることは、理解されるべきである。
【0053】
本明細書に開示されるいくつかの方法の実践は、別段の示唆がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの技術を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。
【0054】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。更に、用語「含むこと」、「含む」、「有すること」、「有する」、「有する」、又はそのバリアントが、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含むこと」と類似した様式で包含的であることが意図される。
【0055】
用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定系の制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行によると、１又は２つ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。
【0056】
本明細書で使用される場合、「細胞」は概して生物学的細胞を指す。細胞は、生きている生物の基本的な構造、機能、及び／又は生物学的単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物を起源とし得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核生物の細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞の真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果実、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ、トウモロコシ、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、開花している植物、針葉樹、ジムノスパーム、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、コケ植物、コケ由来の細胞）、藻類の細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈなど）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、脊椎動物（例えば、フルーツフライ、クニダリアン、エキノデルム、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などが挙げられる。いくつかの場合では、細胞は、天然の生物に由来するものではない（例えば、細胞は、合成的に作製されてもよく、時には人工細胞と呼ばれることがある）。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、概して、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であってもよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はその誘導体を含み得る。かかる誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ及び７－デアザ－ｄＡＴＰ、並びにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びその誘導体を指す場合がある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなど、非標識又は検出可能に標識されてもよい。標識はまた、量子ドットを用いて行われてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２′７′－ジメトキシ－４′５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４′ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレット、シアニン及び５－（２′－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含むが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの具体的な例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、及び［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌ．から入手可能なフルオロ結合デオキシヌクレオチド、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、フルオロ結合フルオロＸ－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、及びフルオロ結合Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、及びフルオレセイン－１５－２′－ｄＡＴＰ；並びにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、及びテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドはまた、化学修飾によって標識又はマーキングされてもよい。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ビオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、及びビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）が挙げられる。
【0058】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」は、概して、一本鎖、二本鎖、又は多本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性又は内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在してもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子又はその断片であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の類似体（例えば、改変された骨格、糖、又は核酸塩基）を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与されてもよい。類似体のいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミン又はフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、クエオシン、及びワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、結合分析から定義した遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、細胞を含まないＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞を含まないＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む細胞を含まないポリヌクレオチド、核酸プローブ、並びにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
【0059】
用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクトされた」は、概して、非ウイルス又はウイルスベースの方法による細胞内への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質又はその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。
【0060】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、概して、ペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味しておらず、ペプチドが組換え技術、化学若しくは酵素合成を使用して産生されるか、又は天然に存在するかを暗示又は区別することを意図するものではない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー並びに少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに適用する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、並びに二次及び／若しくは三次の構造（例えば、ドメイン）を有する又は有さないタンパク質を含む。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、酸化、及び標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「複数のアミノ酸」という用語は、概して、修飾アミノ酸及びアミノ酸類似体を含むが、これに限定されない天然及び非天然アミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含んでもよく、これは、アミノ酸上に天然に存在しない基又は化学的部分を含むように化学的に修飾されている。アミノ酸類似体は、アミノ酸誘導体を指す場合がある。用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方を含む。
【0061】
本明細書で使用される場合、「非天然」は、概して、天然の核酸又はタンパク質では見られない核酸又はポリペプチド配列を指すことができる。非天然は、親和性タグを指してもよい。非天然は、融合物を指してもよい。非天然は、変異、挿入、及び／又は欠失を含む、天然に存在する核酸又はポリペプチド配列を指してもよい。非天然配列は、非天然配列が融合される核酸配列及び／又はポリペプチド配列によっても呈され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示し得、かつ／又はコードし得る。非天然核酸又はポリペプチド配列を、遺伝子操作によって天然に生じる核酸及び／又はポリペプチド配列（若しくはそのバリアント）に連結して、キメラ核酸又はポリペプチドをコードするキメラ核酸及び／又はポリペプチド配列を生成してもよい。
【0062】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、概して、遺伝子の転写又は発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドのヌクレオチド又はヌクレオチドの領域に隣接するか、又は重複して位置し得る調節ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含有してもよく、これは、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合を促進し、これにより、遺伝子転写をもたらす。「コアプロモーター」とも呼ばれる「基礎プロモーター」は、概して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するための全てのベーシックエレメントを含有するプロモーターを指してもよい。いくつかの実施形態では、真核生物の基礎プロモーターは、ＴＡＴＡ－ボックス及び／又はＣＡＡＴボックスを含有する。
【0063】
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、概して、核酸配列又はポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物の細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含む。
【0064】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」、「作動可能な連結」、「作動可能に連結された」、又はその文法的な均等物は、概して、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並列化を指し、ここで、エレメントは、それらが予期される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター配列及び／又はエンハンサー配列を含み得る、調節エレメントは、調節エレメントが、コード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基があってもよい。
【0065】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、概して、ポリヌクレオチドを含むか、又はポリヌクレオチドと会合する高分子又は高分子の会合を指し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、概して、標的中の遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された、遺伝子エレメント、例えば、調節エレメントを含む。
【0066】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「核酸カセット」は、一緒に発現されるか、又は発現のために作動可能に連結される核酸配列又はエレメントの組み合わせを指すために概して互換的に使用される。いくつかの実施形態では、発現カセットは、調節エレメントと、それらが発現のため作動可能に連結されている遺伝子又は複数の遺伝子との組み合わせを指す。
【0067】
ＤＮＡ又はタンパク質配列の「機能的断片」は、概して、完全長ＤＮＡ又はタンパク質配列の生物学的活性と実質的に類似した生物学的活性（機能的又は構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、完全長配列に起因する様式で発現に影響を与える能力であり得る。
【0068】
本明細書で使用される場合、「操作された」物体は、概して、物体がヒトの介入によって修飾されたことを示す。非限定的な実施例によれば、核酸は、その配列を、天然では生じない配列に改変することによって修飾されてもよく、核酸は、ライゲーションされた産物が、オリジナルの核酸に存在しない機能を有するように、天然では関連しない核酸にライゲーションすることによって修飾されてもよく、操作された核酸は、天然では存在しない配列を用いてインビトロで合成されてもよく、タンパク質は、天然では存在しない配列にそのアミノ酸配列を変更することによって修飾されてもよく、操作されたタンパク質は、新しい機能又は特性を獲得してもよい。「操作された」系は、少なくとも１つの操作された成分を含む。
【0069】
本明細書で使用される場合、「合成」及び「人工」は概して、天然に存在するヒトタンパク質と低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質又はそのドメインを指すために互換的に使用され得る。例えば、ＶＰＲドメイン及びＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。
【0070】
本明細書で使用される場合、用語「転位因子」は、ゲノム内のある位置から別の位置に移動することができる（すなわち、それらは「転位」できる）ＤＮＡ配列を指す。転位因子は、概して２つのクラスに分けることができる。クラスＩ転位因子、又は「レトロトランスポゾン」は、ＲＮＡ中間体の転写及び翻訳を介して転位され、その後、逆転写（逆転写酵素によって媒介されるプロセス）を介してゲノム内にその新しい位置に再び組み込まれる。クラスＩＩ転位因子、又は「ＤＮＡトランスポゾン」は、両側にトランスポザーゼが隣接する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの複合体を介して転位される。この酵素ファミリーの更なる特徴は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ２００８，１（１），２０４、及びＧｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８，１９（１９９），１－１２に見出すことができ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【0071】
本明細書で使用される場合、用語「ＴｎｐＡ」は、概して、ＩＳ２００／ＩＳ６０５細菌挿入配列（「ＩＳ」）ファミリーのメンバーに見られるトランスポザーゼを指す。二本鎖ＤＮＡ中間体を介してＤＮＡ転位を実行する他の記録されたＩＳトランスポザーゼとは異なり、ＴｎｐＡは、一本鎖ＤＮＡ中間体を介して進行する。ＴｎｐＡはまた、末端逆位反復ではなく隣接するサブ末端回文配列を含有するという点で、他の記録されたＩＳトランスポザーゼとは異なる。更に、ＴｎｐＡは、標的部位の重複なしに、特定のＡＴリッチのテトラヌクレオチド又はペンタヌクレオチドの３’を挿入する。最後に、ＴｎｐＡは、他のＩＳトランスポザーゼの「ＤＤＥ」スーパーファミリーではなく、酵素のＨｉｓ－疎水性－Ｈｉｓ（「ＨｕＨ」）スーパーファミリーに属する。本明細書で使用される場合、「ＴｎｐＢ」は、概して、ＩＳ２００／ＩＳ６０５細菌においてＴｎｐＡと並んで見出される、記録されていない機能（ただし、転位において調節的役割を果たすと推測される）の酵素を指す。ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポザーゼは、「Ｙ１トランスポザーゼ」であり、それらが単一の触媒チロシン残基を含む単一ドメインタンパク質であることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「ＴｎｐＡ様」は、概して、ＴｎｐＡタンパク質と共通する１つ以上の機能的、構造的、生化学的、生物物理学的、又は他の特性若しくは特徴を示すタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＴｎｐＢ様」は、概して、ＴｎｐＢタンパク質と共通する１つ以上の機能、構造的、生化学的、生物物理学的、又は他の特性若しくは特徴を示すタンパク質を指す。
【0072】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」又は「同一性パーセント」は、概して、配列比較アルゴリズムを使用して測定された場合、局所比較ウィンドウ又はグローバル比較ウィンドウにわたって最大の対応について比較及び整列されたとき、同一であるか、又は特定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ（例えば、ペアワイズアラインメントにおいて）又はそれ以上（例えば、複数の配列アラインメントにおいて）の配列を指す。ポリペプチド配列に好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、かつ３０残基より長いポリペプチド配列についての条件付き組成スコアマトリックス調整を使用したＢＬＡＳＴＰ；２のワード長（Ｗ）、１００００００の期待値（Ｅ）のパラメーター、及びオープンギャップに対して９及び３０残基より短い配列についての拡張ギャップに対して１でのＰＡＭ３０スコアリング設定ギャップコストを使用したＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴにおいてＢＬＡＳＴＰについてのデフォルトのパラメーターが存在する）；２の一致、－１のミスマッチ、及び－１のギャップのＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ；デフォルトパラメーターを用いたＭＵＳＣＬＥ；２のリツリー及び１０００の最大反復のパラメーターを用いたＭＡＦＦＴ；デフォルトパラメーターを用いたＮｏｖａｆｏｌｄ；デフォルトパラメーターを用いたＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。
【0073】
２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈で、用語「最適に整列された」は、概して、例えば、最も高い又は「最適化された」同一性パーセントのスコアを生成するアライメントによって決定される、アミノ酸残基又はヌクレオチドの最大対応に整列された２つ（例えば、ペアワイズアラインメントで）又はそれ以上（例えば、複数の配列アラインメントで）の配列を指す。
【0074】
１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する本明細書に記載される酵素のうちのいずれかのバリアントが、本開示に含まれる。こうした保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造又は機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされ得る。保存的置換は、アミノ酸を、互いに同様の疎水性、極性、及びＲ鎖長で置換することによって達成することができる。加えて、又は代わりに、異なる種由来の相同なタンパク質のアラインされた配列を比較することによって、保存的置換は、コードされたタンパク質の基本的な機能を変化させることなく、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、非保存残基）を見つけることによって特定され得る。そのような保存的に置換されたバリアントは、本明細書に記載されるトランスポザーゼタンパク質配列（例えば、本明細書に記載されるＭＧ９２ファミリートランスポザーゼ、又は本明細書に記載される任意の他のファミリートランスポザーゼ）のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような保存的に置換されたバリアントは、機能的バリアントである。そのような機能的バリアントは、トランスポザーゼの１つ以上の重要な活性部位残基の活性が破壊されないような置換を有する配列を包含することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、図１Ｂでコールアウトされる保存された残基又は機能的残基のうちの少なくとも１つの置換を欠いている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、図１Ｂでコールアウトされる保存された残基又は機能的残基の全ての置換を欠いている。
【0075】
また、本開示には、酵素の活性を減少させる又は排除するための１つ以上の触媒残基の置換を有する、本明細書に記載される酵素のうちのいずれかのバリアント（例えば、活性低下バリアント）も含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質としての活性低下バリアントは、図１Ｂでコールアウトされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全ての触媒残基の破壊的置換を含む。
【0076】
機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、様々な参考文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと））。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【0077】
概要
固有の機能性及び構造を有する新しい転位因子の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集技術を更に破壊し、速度、特異性、機能性、及び使いやすさを改善する潜在力を付与する可能性がある。微生物及びまさに多種多様な微生物種における転位因子の予測保有率と比較して、文献には機能的に特徴付けられた転位因子が比較的少ない。これは、実験室条件では、膨大な数の微生物種を容易には培養し得ないことが部分的に理由となっている。多数の微生物種を含有する天然の環境ニッチからのメタゲノムシーケンシングは、記録された新しい転位因子の数を劇的に増加させ、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見を早める潜在力を付与する可能性がある。
固有の機能性及び構造を有する新しい転位因子の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集技術を更に破壊し、速度、特異性、機能性、及び使いやすさを改善する潜在力を付与する可能性がある。微生物及びまさに多種多様な微生物種における転位因子の予測保有率と比較して、文献には機能的に特徴付けられた転位因子が比較的少ない。これは、実験室条件では、膨大な数の微生物種を容易には培養し得ないことが部分的に理由となっている。多数の微生物種を含有する天然の環境ニッチからのメタゲノムシーケンシングは、記録された新しい転位因子の数を劇的に増加させ、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見を早める潜在力を付与する可能性がある。
【0078】
転位因子は、ゲノム内で位置を変更できるデオキシリボ核酸配列であり、変異の生成又は改善をもたらすことが多い。真核生物では、ゲノムの大部分、及び細胞ＤＮＡの質量の大部分が、転位因子に起因する。転位因子は、他の遺伝子を犠牲にして自身を増殖させる「利己的な遺伝子」であるが、様々な重要な機能を果たし、ゲノム進化に重要であることが見出されている。転位因子は、それらの機構に基づいて、クラスＩ「レトロトランスポゾン」又はクラスＩＩ「ＤＮＡトランスポゾン」のいずれかに分類される。
【0079】
クラスＩ転位因子は、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を伴う二部分の「コピーアンドペースト」機構に従って機能する。まず、レトロトランスポゾンが転写される。得られたＲＮＡは、その後、逆転写酵素（一般にレトロトランスポゾン自体によってコードされる）によって変換されてＤＮＡに戻され、逆転写されたレトロトランスポゾンは、最終的にインテグラーゼによってゲノム内のその新しい位置に組み込まれる。レトロトランスポゾンは、３つの系列に更に分類される。長い末端反復（「ＬＴＲ」）を有するレトロトランスポゾンは、逆転写酵素をコードし、反復ＤＮＡの長い鎖に隣接している。長鎖散在反復配列（「ＬＩＮＥ」）を有するレトロトランスポゾンは、逆転写酵素をコードし、ＬＴＲを欠いており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。短鎖散在反復配列（「ＳＩＮＥ」）を有するレトロトランスポゾンは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されるが、逆転写酵素を欠いており、代わりに他の転位因子（例えば、ＬＩＮＥ）の逆転写機構に依存する。
【0080】
クラスＩＩ転位因子は、ＤＮＡトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を伴わない機構に従って機能する。多くのＤＮＡトランスポゾンは、トランスポザーゼがトランスポゾンに隣接する末端逆位反復（「ＴＩＲ」）に結合し、ドナー領域からトランスポゾンを切断し、それをゲノムの標的領域に挿入する「カットアンドペースト」機構を示す。「ヘリトロン」と呼ばれる他のものは、一本鎖ＤＮＡ中間体を伴い、ＨＵＨエンドヌクレアーゼ機能及び５’から３’へのヘリカーゼ活性を有すると考えられる記録されていないタンパク質によって媒介される「ローリングサークル」機構を示す。まず、ＤＮＡの環状鎖がニッキングされて、２つの単一ＤＮＡ鎖が作成される。タンパク質は、ニッキングされた鎖の５’リン酸に付着したままであり、相補鎖の３’ヒドロキシル端を露出したままにし、したがって、ポリメラーゼがニッキングされていない鎖を複製することを可能にする。複製が完了すると、新しい鎖は、解離し、それ自体が元の鋳型鎖とともに複製される。更に他のＤＮＡトランスポゾンである「ポリントン」は、「自己合成」機構を経ると理論化されている。転位は、ラケット様構造を形成する一本鎖染色体外ポリントンエレメントのインテグラーゼ切除によって開始される。ポリントンは、ＤＮＡポリメラーゼＢによる複製を受け、二本鎖ポリントンは、インテグラーゼによってゲノムへと挿入される。最後に、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーのものなどのいくつかのＤＮＡトランスポゾンは、ＴｎｐＡがドナー遺伝子のラギング鎖鋳型から一本鎖ＤＮＡの一片を（環状「トランスポゾン接続」として）切除し、それを標的遺伝子の複製フォークに再挿入する「ピールアンドペースト」機構を介して進行する。
【0081】
転位因子は、生物学的ツールとしていくつかの用途を見出したが、記録された転位因子は、可能な生物多様性及び標的可能性の全範囲を包含しておらず、全ての可能な活性を表していない場合がある。ここでは、転位因子について、多数のメタゲノムから数千ものゲノム断片を引き出した。記録された転位因子の多様性は、拡大されている可能性があり、新規な系は、高度に標的化可能で、コンパクトで、かつ正確な遺伝子編集剤へと発展している可能性がある。
ＭＧ酵素
ＭＧ酵素
【0082】
いくつかの態様では、本開示は、新規なトランスポザーゼを提供する。これらの候補は、１つ以上の新規サブタイプを表していてもよく、いくつかのサブファミリーが特定されてもよい。これらのトランスポザーゼは、長さが約５００アミノ酸未満である。これらのトランスポザーゼは、送達を単純化する可能性があり、治療用途を拡張する可能性がある。
【0083】
【0084】
一態様では、本開示は、メタゲノムシーケンシングを通して発見された操作されたトランスポザーゼ系を提供する。いくつかの実施形態では、メタゲノムシーケンシングは、試料において行われる。いくつかの実施形態では、試料は、様々な環境から収集され得る。そのような環境は、ヒトマイクロバイオーム、動物マイクロバイオーム、高温環境、低温環境であり得る。そのような環境は、堆積物を含み得る。
【0085】
一態様では、本開示は、トランスポザーゼを含む操作されたトランスポザーゼ系を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されてもよい。トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合してもよい。
【0086】
一態様では、本開示は、トランスポザーゼを含む操作されたトランスポザーゼ系を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
【0087】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと実質的に同一であってもよい。
【0088】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。
【0089】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。
【0091】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。
【0092】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物、真菌、植物、哺乳類、又はヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真菌のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、植物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、哺乳類のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するバリアントを含んでもよい。ＮＬＳは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位にあってもよい。ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントに対して、Ｎ末端又はＣ末端に付加されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５と実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５６と実質的に同一の配列を含んでもよい。
【0094】
【表1】
【0095】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９５％同一の配列を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９５％同一の配列を含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、配列は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、若しくはＭＡＦＦＴアルゴリズム、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定され得る。配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定され得る。
【0098】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたトランスポザーゼ系をコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。
【0099】
一態様では、本開示は、操作された核酸配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、操作された核酸配列は、生物における発現に最適化されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、生物は、未培養生物ではない。
【0100】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
【0101】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと実質的に同一であってもよい。
【0102】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。
【0103】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。
【0105】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。
【0106】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物、真菌、植物、哺乳類、又はヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真菌のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、植物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、哺乳類のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するバリアントを含んでもよい。ＮＬＳは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位にあってもよい。ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントに対して、Ｎ末端又はＣ末端に付加されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５と実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５６と実質的に同一の配列を含んでもよい。
【0108】
いくつかの実施形態では、生物は、原核生物である。いくつかの実施形態では、生物は、細菌である。いくつかの実施形態では、生物は、真核生物である。いくつかの実施形態では、生物は、真菌である。いくつかの実施形態では、生物は、植物である。いくつかの実施形態では、生物は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、生物は、齧歯類である。いくつかの実施形態では、生物は、ヒトである。
【0109】
一態様では、本開示は、操作されたベクターを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたベクターは、トランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。
【0110】
いくつかの実施形態では、操作されたベクターは、本明細書に記載される核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸は、本明細書に記載されるデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、又はレンチウイルスである。
【0111】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細胞を提供する。
【0112】
一態様では、本開示は、トランスポザーゼを製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を培養することを含む。
【0113】
一態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位する方法を提供する。方法は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドをトランスポザーゼと接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。
【0114】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。
【0115】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。
【0117】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳類、齧歯類、又はヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。
【0118】
一態様では、本開示は、標的核酸遺伝子座を修飾する方法を提供する。方法は、本明細書に記載される操作されたトランスポザーゼ系を標的核酸遺伝子座に送達することを含み得る。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の標的核酸遺伝子座への結合時に、複合体が標的核酸遺伝子座を修飾するように構成されている。
【0119】
いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座を修飾することは、標的核酸遺伝子座を結合、ニッキング、切断、マーキング、修飾、又は転位することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、霊長類細胞、又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
【0120】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系の標的核酸遺伝子座への送達は、本明細書に記載される核酸又は本明細書に記載されるベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系の標的核酸遺伝子座への送達は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームは、プロモーターに作動可能に連結されている。
【0121】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系の標的核酸遺伝子座への送達は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含有するキャッピングされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系の標的核酸遺伝子座への送達は、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたトランスポザーゼ系の標的核酸遺伝子座への送達は、リボ核酸（ＲＮＡ）ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結された操作されたガイドＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的遺伝子座で、又は標的伝子座の近位で、一本鎖切断又は二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的遺伝子座内又は標的遺伝子座の５’に互い違いの一本鎖切断を誘導する。
【0123】
一態様では、本開示は、異種トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
【0124】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと実質的に同一であってもよい。
【0125】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。
【0126】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。
【0128】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。
【0129】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１６のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９５％同一の配列を含む。
【0130】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも７５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１７のうちのいずれか１つのバリアント、又はそのバリアントと少なくとも９５％同一の配列を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、λＤＥ３リソゲンであるか、又はＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｏｍｐＴ ｌｏｎ遺伝子型を有する。
【0132】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ７－ｌａｃプロモーター配列、ｌａｃプロモーター配列、ｔａｃプロモーター配列、ｔｒｃプロモーター配列、ＰａｒａＢＡＤプロモーター配列、ＰｒｈａＢＡＤプロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、ｃｓｐＡプロモーター配列、ａｒａＰＢＡＤプロモーター、ファージラムダからの強い左向きプロモーター（ｐＬプロモーター）、又はそれらの任意の組み合わせに作動可能に連結されている。
【0133】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結された親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）タグである。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣタグは、ポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせである。
【0134】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ベクター上に提供される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【0135】
一態様では、本開示は、適合する液体培地中に、本明細書に記載される宿主細胞を含む培養物を提供する。
【0136】
一態様では、本開示は、適合する成長培地中で、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む、トランスポザーゼを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、追加の化学剤又は増加された量の栄養素を添加することによって、トランスポザーゼの発現を誘導することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の化学剤又は増加された量の栄養素は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は追加の量のラクトースを含む。いくつかの実施形態では、方法は、培養後に宿主細胞を単離することと、宿主細胞を溶解してタンパク質抽出物を産生することとを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質抽出物をＩＭＡＣ、又はイオン親和性クロマトグラフィーに供することを更に含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されたＩＭＡＣ親和性タグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＭＡＣ親和性タグは、プロテアーゼ切断部位をコードするリンカー配列を介して、トランスポザーゼをコードする配列にインフレームで連結されている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プロテアーゼ切断部位に対応するプロテアーゼをトランスポザーゼと接触させることによって、ＩＭＡＣ親和性タグを切断することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、サブトラクティブＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーを実施して、トランスポザーゼを含む組成物から親和性タグを除去することを更に含む。
【0137】
一態様では、本開示は、細胞における遺伝子座を破壊する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、トランスポザーゼを含む組成物を細胞に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、細胞内でＴｎｐＡトランスポザーゼと少なくとも同等の転位活性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
【0138】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１～３４９のうちのいずれか１つと実質的に同一であってもよい。
【0139】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＢトランスポザーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＡトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＴｎｐＢトランスポザーゼと約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の配列同一性を有する。
【0140】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、触媒チロシン残基を含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、サブ末端回文配列を含む左側領域及びサブ末端回文配列を含む右側領域に結合するように構成されている。
【0142】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、一本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドとしてカーゴヌクレオチド配列を転位するように構成されている。
【0143】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物、真菌、植物、哺乳類、又はヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真核生物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、真菌のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、植物のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、哺乳類のゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ヒトのゲノムポリヌクレオチド配列と相補的である配列を含む。
【0144】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するバリアントを含んでもよい。ＮＬＳは、トランスポザーゼのＮ末端又はＣ末端の近位にあってもよい。ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントに対して、Ｎ末端又はＣ末端に付加されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５～４７０のうちのいずれか１つと実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５５と実質的に同一の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４５６と実質的に同一の配列を含んでもよい。
【0145】
いくつかの実施形態では、転位活性は、標的核酸遺伝子座を含む細胞にトランスポザーゼを導入し、細胞内の標的核酸遺伝子座の転位を検出することによって、インビトロで測定される。いくつかの実施形態では、組成物は、２０ピコモル（ｐｍｏｌ）以下のトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ｐｍｏｌ以下のトランスポザーゼを含む。
【0146】
本開示の系は、例えば、核酸編集（例えば、遺伝子編集）、核酸分子への結合（例えば、配列特異的結合）などの様々な用途に使用され得る。そのような系は、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた変異に対処する（例えば、除去又は置換する）ため、遺伝子を細胞におけるその機能を確認するために不活性化するため、疾患を引き起こす遺伝子エレメントを検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡ若しくは疾患を引き起こす変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的とし検出するためのプローブと組み合わせた不活性化酵素として、ウイルスゲノムを標的化することによってウイルスを不活性化するか、若しくは宿主細胞に感染できないようにするため、価値ある低分子、高分子、若しくは二次代謝産物を生じるように生物を操作するための遺伝子を加えるか、若しくは代謝経路を修正するため、進化的選択のための遺伝子駆動エレメントを確立するため、バイオセンサーとして外来低分子及びヌクレオチドによる細胞の摂動を検出するために、使用され得る。
【実施例】
【0147】
ＩＵＰＡＣの慣例に従って、以下の略語が実施例を通して使用される。
Ａ＝アデニン
Ｃ＝シトシン
Ｇ＝グアニン
Ｔ＝チミン
Ｒ＝アデニン又はグアニン
Ｙ＝シトシン又はチミン
Ｓ＝グアニン又はシトシン
Ｗ＝アデニン又はチミン
Ｋ＝グアニン又はチミン
Ｍ＝アデニン又はシトシン
Ｂ＝Ｃ、Ｇ、又はＴ
Ｄ＝Ａ、Ｇ、又はＴ
Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ
Ｖ＝Ａ、Ｃ、又はＧ
Ａ＝アデニン
Ｃ＝シトシン
Ｇ＝グアニン
Ｔ＝チミン
Ｒ＝アデニン又はグアニン
Ｙ＝シトシン又はチミン
Ｓ＝グアニン又はシトシン
Ｗ＝アデニン又はチミン
Ｋ＝グアニン又はチミン
Ｍ＝アデニン又はシトシン
Ｂ＝Ｃ、Ｇ、又はＴ
Ｄ＝Ａ、Ｇ、又はＴ
Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ
Ｖ＝Ａ、Ｃ、又はＧ
【0148】
実施例 １－新しいタンパク質のメタゲノム分析の方法
メタゲノム試料を、堆積物、土壌、及び動物から収集した。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、Ｚｙｍｏｂｉｏｍｉｃｓ ＤＮＡミニプレップキットを用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００で配列決定した。試料を、所有者の同意を得て収集した。公的供給源からの更なる生配列データには、動物マイクロバイオーム、堆積物、土壌、温泉、熱水通気孔、海洋、泥炭、パーマフロスト、及び下水の配列が含まれていた。メタゲノム配列データを、記録されたトランスポザーゼタンパク質配列に基づいて生成された隠れマルコフモデルを使用して検索し、新しいトランスポザーゼを特定した。検索によって特定した新規トランスポザーゼタンパク質を、記録されたタンパク質に対して整列させて、潜在的な活性部位を特定した。このメタゲノムワークフローは、本明細書に記載されるＭＧ９２ファミリーの描写をもたらした。
メタゲノム試料を、堆積物、土壌、及び動物から収集した。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、Ｚｙｍｏｂｉｏｍｉｃｓ ＤＮＡミニプレップキットを用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００で配列決定した。試料を、所有者の同意を得て収集した。公的供給源からの更なる生配列データには、動物マイクロバイオーム、堆積物、土壌、温泉、熱水通気孔、海洋、泥炭、パーマフロスト、及び下水の配列が含まれていた。メタゲノム配列データを、記録されたトランスポザーゼタンパク質配列に基づいて生成された隠れマルコフモデルを使用して検索し、新しいトランスポザーゼを特定した。検索によって特定した新規トランスポザーゼタンパク質を、記録されたタンパク質に対して整列させて、潜在的な活性部位を特定した。このメタゲノムワークフローは、本明細書に記載されるＭＧ９２ファミリーの描写をもたらした。
【0149】
実施例 ２－トランスポザーゼのＭＧ９２ファミリーの発見
実施例１のメタゲノム分析からのデータの分析により、これまでに記述されていない、１つのファミリー（ＭＧ９２）を含む推定トランスポザーゼ系の新しいクラスターが明らかになった。これらの新しい酵素及びそれらの例示的なサブドメインに対応するタンパク質配列を、配列番号１～３４９として示す。
実施例１のメタゲノム分析からのデータの分析により、これまでに記述されていない、１つのファミリー（ＭＧ９２）を含む推定トランスポザーゼ系の新しいクラスターが明らかになった。これらの新しい酵素及びそれらの例示的なサブドメインに対応するタンパク質配列を、配列番号１～３４９として示す。
【0150】
実施例 ３－インテグラーゼインビトロ活性（予測的）
インテグラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物ベースの発現系（例えば、ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における発現を介して行うことができる。インビトロ試験に必要な成分は、３つのプラスミド、すなわち、Ｔ７プロモーター下のトランスポゾン遺伝子を有する発現プラスミド、標的プラスミド、並びにカーゴ遺伝子（例えば、Ｔｅｔ耐性遺伝子）の周りの転位に必要な左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）のＤＮＡ配列を含有するドナープラスミドである。溶解物ベースの発現産物、標的ＤＮＡ、及びドナーＤＮＡをインキュベートして、転位が起こるようにする。転位は、ＰＣＲを介して検出される。加えて、転位産物を、Ｔ５でタグメントし、ＮＧＳを介して配列決定して、転位事象の集団上の挿入部位を決定する。あるいは、インビトロ転位産物を、抗生物質（例えば、Ｔｅｔ）選択下でＥ．ｃｏｌｉへと形質転換することができ、この場合、成長には、転位カーゴがプラスミドへと安定して挿入されることが必要である。単一コロニー又はＥ．ｃｏｌｉの集団のいずれかを配列決定して、挿入部位を決定することができる。
インテグラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物ベースの発現系（例えば、ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における発現を介して行うことができる。インビトロ試験に必要な成分は、３つのプラスミド、すなわち、Ｔ７プロモーター下のトランスポゾン遺伝子を有する発現プラスミド、標的プラスミド、並びにカーゴ遺伝子（例えば、Ｔｅｔ耐性遺伝子）の周りの転位に必要な左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）のＤＮＡ配列を含有するドナープラスミドである。溶解物ベースの発現産物、標的ＤＮＡ、及びドナーＤＮＡをインキュベートして、転位が起こるようにする。転位は、ＰＣＲを介して検出される。加えて、転位産物を、Ｔ５でタグメントし、ＮＧＳを介して配列決定して、転位事象の集団上の挿入部位を決定する。あるいは、インビトロ転位産物を、抗生物質（例えば、Ｔｅｔ）選択下でＥ．ｃｏｌｉへと形質転換することができ、この場合、成長には、転位カーゴがプラスミドへと安定して挿入されることが必要である。単一コロニー又はＥ．ｃｏｌｉの集団のいずれかを配列決定して、挿入部位を決定することができる。
【0151】
組み込み効率は、組み込まれたカーゴを有する標的ＤＮＡの実験アウトプットのｄｄＰＣＲ又はｑＰＣＲを介して測定することができ、同じくｄｄＰＣＲを介して測定される未修飾の標的ＤＮＡの量に対して正規化される。
【0152】
このアッセイはまた、溶解物ベースの発現からではなく、精製されたタンパク質成分で行われてもよい。この場合、タンパク質は、Ｔ７誘導性プロモーター下でＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損Ｂ株で発現され、細胞は超音波処理を用いて溶解され、目的のＨｉｓタグ付きタンパク質は、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）Ｎｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを用いて精製される。純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）クマシー染色アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分解されたタンパク質バンドのＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）における密度測定を用いて決定される。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール、ｐＨ７．５で構成される保存緩衝液中（又は最大安定性について決定された他の緩衝液）で脱塩し、－８０℃で保存する。精製後、トランスポゾン遺伝子を、反応緩衝液、例えば、２６ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、４．２ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２ｍＭのＡＴＰ、２．１ｍＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２８ｍＭのＮａＣｌ、２１ｍＭのＫＣｌ、１．３５％のグリセロール（最終ｐＨ７．５）に１５ｍＭのＭｇＯＡｃ２を補充したものにおいて、上述の標的ＤＮＡ及びドナーＤＮＡに添加する。
【0153】
実施例 ４－ゲルシフトを介したトランスポゾン端の検証（予測的）
トランスポゾン端は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を介してトランスポザーゼ結合について試験される。この場合、潜在的なＬＥ又はＲＥは、ＤＮＡ断片（１００～５００ｂｐ）として合成され、ＦＡＭ標識プライマーを用いたＰＣＲを介してＦＡＭで端標識される。トランスポザーゼタンパク質を、インビトロ転写／翻訳系（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ）で合成する。合成後、１μＬのタンパク質を、結合緩衝液（例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２．５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０６２５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＴＣＥＰ、０．００５％のＢＳＡ、１μｇ／ｍＬのポリ（ｄＩ－ｄＣ）、及び５％のグリセロール）中の１０μＬ反応物中の５０ｎＭの標識されたＲＥ又はＬＥに添加する。結合を３０°で４０分間インキュベートし、次いで、２μＬの６Ｘローディング緩衝液（６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７，６、５０％グリセロール）を添加する。結合反応物を５％ＴＢＥゲル上で分離し、可視化する。トランスポザーゼタンパク質の存在下でのＬＥ又はＲＥのシフトは、結合の成功に起因し得、トランスポザーゼ活性を示す。このアッセイはまた、トランスポザーゼのトランケーション又は変異で、並びにＥ．ｃｏｌｉ抽出物又は精製タンパク質を使用して、実施することができる。
トランスポゾン端は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を介してトランスポザーゼ結合について試験される。この場合、潜在的なＬＥ又はＲＥは、ＤＮＡ断片（１００～５００ｂｐ）として合成され、ＦＡＭ標識プライマーを用いたＰＣＲを介してＦＡＭで端標識される。トランスポザーゼタンパク質を、インビトロ転写／翻訳系（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ）で合成する。合成後、１μＬのタンパク質を、結合緩衝液（例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２．５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０６２５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＴＣＥＰ、０．００５％のＢＳＡ、１μｇ／ｍＬのポリ（ｄＩ－ｄＣ）、及び５％のグリセロール）中の１０μＬ反応物中の５０ｎＭの標識されたＲＥ又はＬＥに添加する。結合を３０°で４０分間インキュベートし、次いで、２μＬの６Ｘローディング緩衝液（６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７，６、５０％グリセロール）を添加する。結合反応物を５％ＴＢＥゲル上で分離し、可視化する。トランスポザーゼタンパク質の存在下でのＬＥ又はＲＥのシフトは、結合の成功に起因し得、トランスポザーゼ活性を示す。このアッセイはまた、トランスポザーゼのトランケーション又は変異で、並びにＥ．ｃｏｌｉ抽出物又は精製タンパク質を使用して、実施することができる。
【0154】
実施例 ５－ドナーＤＮＡの切断の検証（予測的）
トランスポザーゼがドナーＤＮＡの切断に関与することを確認するために、最大１０ｂｐで分離されたＲＥ－ＬＥ接合部を含有する短い（約１４０ｂｐ）断片を、ＦＡＭ標識プライマーを用いたＰＣＲを介して、両端でＦＡＭで標識する。標識されたＤＮＡ断片をインビトロ転写／翻訳トランスポザーゼ産物でインキュベートし、ＤＮＡを変性ゲル上で分析する。接合部の各端での切断は、ゲル上で異なる比率で移動する２つの標識された一本鎖断片をもたらし得る。
トランスポザーゼがドナーＤＮＡの切断に関与することを確認するために、最大１０ｂｐで分離されたＲＥ－ＬＥ接合部を含有する短い（約１４０ｂｐ）断片を、ＦＡＭ標識プライマーを用いたＰＣＲを介して、両端でＦＡＭで標識する。標識されたＤＮＡ断片をインビトロ転写／翻訳トランスポザーゼ産物でインキュベートし、ＤＮＡを変性ゲル上で分析する。接合部の各端での切断は、ゲル上で異なる比率で移動する２つの標識された一本鎖断片をもたらし得る。
【0155】
実施例 ６－Ｅ．ｃｏｌｉにおけるインテグラーゼ活性（予測的）
操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を、トランスポゾン遺伝子を発現するプラスミドと、組み込みのための左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）トランスポゾンモチーフに隣接した選択可能なマーカーを有する温度感受性複製起点を含有するプラスミドとで形質転換する。トランスポザーゼ成分によるドナーｓｓＤＮＡ優先性を確認するためには、ｓｓＤＮＡプラスミド超らせん形成をドナーとして使用することができる。次いで、これらの遺伝子の発現のために誘導された形質転換体を、プラスミド複製のための制限温度での選択によってゲノム標的へのマーカーの移行についてスクリーニングし、ゲノム内のマーカー組み込みをＰＣＲによって確認する。
操作されたＥ．ｃｏｌｉ株を、トランスポゾン遺伝子を発現するプラスミドと、組み込みのための左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）トランスポゾンモチーフに隣接した選択可能なマーカーを有する温度感受性複製起点を含有するプラスミドとで形質転換する。トランスポザーゼ成分によるドナーｓｓＤＮＡ優先性を確認するためには、ｓｓＤＮＡプラスミド超らせん形成をドナーとして使用することができる。次いで、これらの遺伝子の発現のために誘導された形質転換体を、プラスミド複製のための制限温度での選択によってゲノム標的へのマーカーの移行についてスクリーニングし、ゲノム内のマーカー組み込みをＰＣＲによって確認する。
【0156】
組み込みは、不偏アプローチを使用してスクリーニングされる。簡潔に述べると、精製されたｇＤＮＡは、Ｔｎ５でタグメントされ、次いで目的のＤＮＡは、Ｔｎ５タグメンテーション及び選択可能なマーカーに特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。次いで、アンプリコンをＮＧＳシーケンシングのために調製する。得られた配列の分析をトランスポゾン配列からトリミングし、隣接配列をゲノムにマッピングして挿入位置を決定し、挿入比率を決定する。
【0157】
あるいは、４２℃で欠陥のあるＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）を産生するｐｏｌＡ変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＭ３８３を使用して、前述のように組み込みを検出する（Ｂｒａｎｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。４２℃での成長後の選択可能なマーカーに対する耐性は、ドナーＤＮＡの染色体への組み込みを示す。ドナーなしのｐＵＣ１９プラスミドを、抗生物質選択なしで４２℃で２４時間成長させた後の対照として使用する。
【0158】
選択培地で正常に成長するＥ．ｃｏｌｉ株は、カーゴ耐性遺伝子をコードするドナーＤＮＡを組み込んだものと推定される。抗生物質選択プレートで成長するコロニーは、カーゴの存在について遺伝子型決定され、全ゲノム配列のＮＧＳが実施される。
【0159】
実施例 ７－哺乳類細胞におけるインテグラーゼ活性（予測的）
哺乳類細胞における標的化及び切断活性を示すために、トランスポゾンタンパク質の各々を、タンパク質配列のいずれかの末端上の２つのＮＬＳペプチドで精製する。選択可能なネオマイシン耐性マーカー（ＮｅｏＲ）、又は左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）モチーフに隣接した蛍光マーカーを含有するプラスミドを合成する。次いで、細胞を、プラスミドでトランスフェクトし、４～６時間回収し、その後、トランスポゾンタンパク質でエレクトロポレーションする。ゲノムへの抗生物質耐性組み込みは、Ｇ４１８－耐性コロニー数によって定量化され、蛍光マーカーによる陽性転位は、蛍光活性化細胞サイトメトリーによってアッセイされる。共トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡが、抽出され、ＮＧＳ－ライブラリの調製に使用される。組み込み頻度は、Ｔｎ５タグメンテーションによってアッセイされる。
哺乳類細胞における標的化及び切断活性を示すために、トランスポゾンタンパク質の各々を、タンパク質配列のいずれかの末端上の２つのＮＬＳペプチドで精製する。選択可能なネオマイシン耐性マーカー（ＮｅｏＲ）、又は左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）モチーフに隣接した蛍光マーカーを含有するプラスミドを合成する。次いで、細胞を、プラスミドでトランスフェクトし、４～６時間回収し、その後、トランスポゾンタンパク質でエレクトロポレーションする。ゲノムへの抗生物質耐性組み込みは、Ｇ４１８－耐性コロニー数によって定量化され、蛍光マーカーによる陽性転位は、蛍光活性化細胞サイトメトリーによってアッセイされる。共トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡが、抽出され、ＮＧＳ－ライブラリの調製に使用される。組み込み頻度は、Ｔｎ５タグメンテーションによってアッセイされる。
【0160】
実施例８－インシリコ分析
微生物、ウイルス、及び真核生物のゲノムの広範なアセンブリ駆動型メタゲノムデータベースを引き出して、ｓｓＤＮＡトランスポザーゼ機能を有する予測タンパク質を得た。４００を超える予測タンパク質が、挿入配列ＩＳ２００／ＩＳ６０５のＴｎｐＡトランスポザーゼに対して有意なｅ値（＜１×１０－５）を有した。完全なＯＲＦをフィルタリングし、触媒残基（Ｙ１及びＨｕＨ）の存在を確認した後、ＴｎｐＡ様タンパク質配列を、パラメーターＧ－ＩＮＳＩ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ３０，７７２－７８０（２０１３））でＭＡＦＦＴで整列させ、アライメントを使用して、ＦａｓｔＴｒｅｅ２で系統樹を推測した（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ５，ｅ９４９０（２０１０））。ＴｎｐＡトランスポザーゼの系統的分析により、ＩＳ２００／ＩＳ６０５挿入配列に関連する新規ＴｎｐＡ様タンパク質配列の高い多様性が明らかになった（図２）。
微生物、ウイルス、及び真核生物のゲノムの広範なアセンブリ駆動型メタゲノムデータベースを引き出して、ｓｓＤＮＡトランスポザーゼ機能を有する予測タンパク質を得た。４００を超える予測タンパク質が、挿入配列ＩＳ２００／ＩＳ６０５のＴｎｐＡトランスポザーゼに対して有意なｅ値（＜１×１０－５）を有した。完全なＯＲＦをフィルタリングし、触媒残基（Ｙ１及びＨｕＨ）の存在を確認した後、ＴｎｐＡ様タンパク質配列を、パラメーターＧ－ＩＮＳＩ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ３０，７７２－７８０（２０１３））でＭＡＦＦＴで整列させ、アライメントを使用して、ＦａｓｔＴｒｅｅ２で系統樹を推測した（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ５，ｅ９４９０（２０１０））。ＴｎｐＡトランスポザーゼの系統的分析により、ＩＳ２００／ＩＳ６０５挿入配列に関連する新規ＴｎｐＡ様タンパク質配列の高い多様性が明らかになった（図２）。
【0161】
挿入配列の左端及び右端（ＬＥ及びＲＥ）を予測するために、ＩＳＦｉｎｄｅｒデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ－ｉｓ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／）で利用可能な活性なＬＥ配列及びＲＥ配列から共分散モデルを構築した。具体的には、ＬＥ配列及びＲＥ配列の複数の配列アライメント（ＭＳＡ）を、パラメーターＸ－ＩＮＳＩ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ３０，７７２－７８０（２０１３））でＭＡＦＦＴで構築し、アライメントの二次構造を、パラメーター－ｐ－－ａｌｎ－ｓｔｋ（Ｖｉｅｎｎａ Ｐａｃｋａｇｅ）でＲＮＡａｌｉｆｏｌｄ ２．５．０でＭＳＡから推測した。共分散モデルをＩｎｆｅｒｎａｌパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｄｄｙｌａｂ．ｏｒｇ／ｉｎｆｅｒｎａｌ／）で構築し、候補ＴｎｐＡトランスポザーゼを含有するゲノム断片を、Ｉｎｆｅｒｎａｌコマンド「ｃｍｓｅａｒｃｈ」で共分散モデルを使用して検索した。共分散モデルは、７０を超える候補ＩＳ２００／ＩＳ６０５挿入配列についてＬＥ及びＲＥを予測した（図３）。
【0162】
実施例９－ｓｓＤＮＡカーゴの生成
各ＴｎｐＡ様候補は、メタゲノムコンティグで特定された推定の左端（ＬＥ）配列及び右端（ＲＥ）配列を含む固有のカーゴを有した。これらの推定のＬＥ配列及びＲＥ配列をクローニングして、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを介してカナマイシン（Ｋａｎ）耐性カーゴ遺伝子に隣接させた。ｓｓＤＮＡカーゴを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ（ＮＥＢ）を用いた標準サイクル条件を使用して、フォワードプライマーＧＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴ及び５’－リン酸修飾リバースプライマーＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡを用いたＬＥ／ＲＥ領域の外側の共通プライマーによるＫａｎカーゴプラスミドのＰＣＲを介して生成した。ＰＣＲ増幅後、ラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を使用してＤＮＡ下部鎖を分解し、残りの上部鎖を、ｓｓＤＮＡを精製するために製造業者が推奨する変更を有するＤＣＣ－５スピンカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。一本鎖ＤＮＡを、アガロースゲル上でチェックしてｄｓＤＮＡの完全な変換を検証し、ｓｓＤＮＡ Ｑｕｂｉｔキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって定量し、２０ｎＭの平均濃度を得た。
各ＴｎｐＡ様候補は、メタゲノムコンティグで特定された推定の左端（ＬＥ）配列及び右端（ＲＥ）配列を含む固有のカーゴを有した。これらの推定のＬＥ配列及びＲＥ配列をクローニングして、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを介してカナマイシン（Ｋａｎ）耐性カーゴ遺伝子に隣接させた。ｓｓＤＮＡカーゴを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ（ＮＥＢ）を用いた標準サイクル条件を使用して、フォワードプライマーＧＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴ及び５’－リン酸修飾リバースプライマーＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡを用いたＬＥ／ＲＥ領域の外側の共通プライマーによるＫａｎカーゴプラスミドのＰＣＲを介して生成した。ＰＣＲ増幅後、ラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を使用してＤＮＡ下部鎖を分解し、残りの上部鎖を、ｓｓＤＮＡを精製するために製造業者が推奨する変更を有するＤＣＣ－５スピンカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。一本鎖ＤＮＡを、アガロースゲル上でチェックしてｄｓＤＮＡの完全な変換を検証し、ｓｓＤＮＡ Ｑｕｂｉｔキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって定量し、２０ｎＭの平均濃度を得た。
【0163】
実施例１０－ＴｎｐＡインビトロ発現構築物の設計
インビトロ活性のために、各ＴｎｐＡ様タンパク質遺伝子を、Ｔ７プロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ翻訳のためにコドン最適化されたｐＥＴ２１（＋）中で合成し、ＨＡタグを欠く９２－１を除き、Ｃ末端ＨＡタグ及びＨｉｓタグに隣接させた。次いで、ＴｎｐＡ様タンパク質プラスミドを、Ｔ７プロモーターの上流及びＴ７ターミネーターの下流の約１５０ｂｐに結合するプライマー（プライマーＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧ及びＣＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧ）を使用して増幅し、ＳＰＲＩビーズクリーンアップ（ＭａｇＢｉｏ ＨｉｇｈＰｒｅｐ）を介して精製して最終鋳型濃度＞８０ｎｇ／μＬを得た。
インビトロ活性のために、各ＴｎｐＡ様タンパク質遺伝子を、Ｔ７プロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ翻訳のためにコドン最適化されたｐＥＴ２１（＋）中で合成し、ＨＡタグを欠く９２－１を除き、Ｃ末端ＨＡタグ及びＨｉｓタグに隣接させた。次いで、ＴｎｐＡ様タンパク質プラスミドを、Ｔ７プロモーターの上流及びＴ７ターミネーターの下流の約１５０ｂｐに結合するプライマー（プライマーＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧ及びＣＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧ）を使用して増幅し、ＳＰＲＩビーズクリーンアップ（ＭａｇＢｉｏ ＨｉｇｈＰｒｅｐ）を介して精製して最終鋳型濃度＞８０ｎｇ／μＬを得た。
【0164】
実施例１１－インビトロ転位活性
インビトロ活性のために、ＴｎｐＡ様タンパク質候補を、まず、製造業者が推奨する条件に従って、３７℃で２時間、８ｎｇ／μＬの最小鋳型濃度（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ，ＮＥＢ）でインビトロ転写－翻訳（ＩＶＴＴ）キットで発現させた。発現をＨＡタグに対するウェスタンブロットを介して検証したが、このタグを欠く９２－１は除いた。（図４）。１０μＬの反応物当たり添加された１μＬのＩＶＴＴ産物、平均５ｎＭのｓｓＤＮＡカーゴ、及び反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＴＣＥＰ、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．５μｇ／ｍＬのポリ－ｄＩｄＣ、及び２０％のグリセロール）中で８Ｎ無作為化配列を含有する５０ｎＭの１６１ｎｔ「標的」ｓｓＤＮＡを用いて、転位アッセイをセットアップした。対照反応には、Ｔｒｉｓ緩衝液をＰＣＲ鋳型の代わりにＩＶＴＴに添加した、ＩＶＴＴの鋳型なし対照（ＮＴＣ）反応が含まれていた。反応物を３７℃で１時間インキュベートして、転位を発生させ、次いで反応物を水中で１０倍希釈し、ＰＣＲを介して転位を検出した。ＬＥ接合部は、標的の５’端のフォワードプライマー及びＫａｎカーゴ内のリバースプライマーを介して検出され、ＲＥ接合部は、Ｋａｎカーゴ内のフォワードプライマー及び標的の３’端のリバースプライマーを介して検出された。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で実行して転位を検出し（図５Ａ及び図５Ｂ）、サンガー及びＮＧＳシーケンシングを介して配列決定した。標的及びカーゴ配列の両方を含有するキメラリードを分析して、転位の接合部、挿入モチーフ、及びカーゴ上の切断部位を決定した（図６～図９）。
インビトロ活性のために、ＴｎｐＡ様タンパク質候補を、まず、製造業者が推奨する条件に従って、３７℃で２時間、８ｎｇ／μＬの最小鋳型濃度（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ，ＮＥＢ）でインビトロ転写－翻訳（ＩＶＴＴ）キットで発現させた。発現をＨＡタグに対するウェスタンブロットを介して検証したが、このタグを欠く９２－１は除いた。（図４）。１０μＬの反応物当たり添加された１μＬのＩＶＴＴ産物、平均５ｎＭのｓｓＤＮＡカーゴ、及び反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＴＣＥＰ、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．５μｇ／ｍＬのポリ－ｄＩｄＣ、及び２０％のグリセロール）中で８Ｎ無作為化配列を含有する５０ｎＭの１６１ｎｔ「標的」ｓｓＤＮＡを用いて、転位アッセイをセットアップした。対照反応には、Ｔｒｉｓ緩衝液をＰＣＲ鋳型の代わりにＩＶＴＴに添加した、ＩＶＴＴの鋳型なし対照（ＮＴＣ）反応が含まれていた。反応物を３７℃で１時間インキュベートして、転位を発生させ、次いで反応物を水中で１０倍希釈し、ＰＣＲを介して転位を検出した。ＬＥ接合部は、標的の５’端のフォワードプライマー及びＫａｎカーゴ内のリバースプライマーを介して検出され、ＲＥ接合部は、Ｋａｎカーゴ内のフォワードプライマー及び標的の３’端のリバースプライマーを介して検出された。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で実行して転位を検出し（図５Ａ及び図５Ｂ）、サンガー及びＮＧＳシーケンシングを介して配列決定した。標的及びカーゴ配列の両方を含有するキメラリードを分析して、転位の接合部、挿入モチーフ、及びカーゴ上の切断部位を決定した（図６～図９）。
【0165】
ＬＥ ＰＣＲ産物については、挿入モチーフは、カーゴと標的との間の重複配列同一性から特定することができる。例えば、ＭＧ９２－３の標的とＬＥとの間の接合部は、標的及びカーゴの配列がもはや重複しなくなる点として特定される（図６）。挿入モチーフは、転位を伴わない標的ＤＮＡの隣接配列の分析を介して特定することができる。８Ｎへの挿入の場合、標的モチーフを、ＲＥリードではなく、ＬＥリードでのみ曖昧さなしに特定することができる。ＭＧ９２－３については、挿入モチーフを、ＡＡＴＧＡＣ又はその中のヌクレオチドのサブセット、例えばＴＧＡＣとして特定した（図６～図７）。ＲＥ ＰＣＲ産物については、ＲＥ接合部を、カーゴとターゲットへのマッピング間でリードが切り替わるブレイクポイントを介して特定する（図７）。ＬＥ接合部及びＲＥ接合部のシーケンシングは、同じ挿入位置を示す。ＬＥ接合部は、ＮＧＳを介して更に確認され、これはサンガーシーケンシングを介して決定されたＬＥ内の同じ切断点を特定した（図８）。
【0166】
これらのデータから、ＬＥ境界を以下のように決定することができる。ＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＣＴＡＴＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＧＣＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＡＧＴ。これは、完全なＭＧ９２－３ ＬＥのサブセットであり、認識モチーフＡＡＴＧＡＣ又はその中のヌクレオチドのサブセットに隣接した場合にのみ、ＭＧ９２－３によって認識される。同様に、ＲＥ境界を以下のように特定することができる。ＧＴＴＴＧＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＴＣＴＡＴＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＣＡＣ、そのいくつか又は全ては、ＴｎｐＡ様タンパク質による認識、切除、及び挿入に必要である。両方の配列は、Ｃｅｌｌ １３２，２０８－２２０（２００８）及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，８５０３－８５１２（２０１１）に記載されるように、ＴｎｐＡ及びＴｎｐＡ様タンパク質が認識する非標準塩基対形成相互作用に隣接するＴｎｐＡ様タンパク質認識の予測ヘアピンを含有する（図６～７）。
【0167】
同様に、ＭＧ９２－４の活性は、ＮＧＳ検出を介して確認され、サンガーシーケンシングでは検出可能ではない弱いシグナルを有し、ＲＥ切断及び挿入を示した（図９）。このシグナルはＮＧＳによってのみ検出可能であったため、これらの結果は、この挿入モチーフが可能であるが、最適な挿入配列ではない可能性があることを示唆している。
【0168】
実施例１２－インビトロ切除アッセイ（予測的）
インビトロ切除活性を決定するために、ＴｎｐＡ様タンパク質候補を、製造業者が推奨する条件に従って、３７℃で２時間、８ｎｇ／μＬの最小鋳型濃度（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ，ＮＥＢ）でインビトロ転写－翻訳（ＩＶＴＴ）キットで発現させた。１０μＬの反応物当たり添加された１μＬのＩＶＴＴ産物、及びＴｎｐＡ反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＴＣＥＰ、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．５ｍｇのポリ－ｄＩｄＣ、及び２０％のグリセロール）中で３７℃で６０分間の１００ｎｇのＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥ ｓｓＤＮＡ（約２．２ｋｂ）を用いて、切除アッセイを設定する。反応を、０．１％ＳＤＳを添加し、３７℃で更に１５分間インキュベーションすることによって終了させる。その後、反応物をＲＮａｓｅ処理し、ＤＮＡアガロースゲル上で実行して、ＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥ ｓｓＤＮＡの切除が起こったかどうかを決定する。次いで、切除されたＫａｎ配列を、ゲル抽出し、ＬＥ及びＲＥ切断モチーフを決定するためのシーケンシングに供する。
インビトロ切除活性を決定するために、ＴｎｐＡ様タンパク質候補を、製造業者が推奨する条件に従って、３７℃で２時間、８ｎｇ／μＬの最小鋳型濃度（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ，ＮＥＢ）でインビトロ転写－翻訳（ＩＶＴＴ）キットで発現させた。１０μＬの反応物当たり添加された１μＬのＩＶＴＴ産物、及びＴｎｐＡ反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＴＣＥＰ、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．５ｍｇのポリ－ｄＩｄＣ、及び２０％のグリセロール）中で３７℃で６０分間の１００ｎｇのＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥ ｓｓＤＮＡ（約２．２ｋｂ）を用いて、切除アッセイを設定する。反応を、０．１％ＳＤＳを添加し、３７℃で更に１５分間インキュベーションすることによって終了させる。その後、反応物をＲＮａｓｅ処理し、ＤＮＡアガロースゲル上で実行して、ＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥ ｓｓＤＮＡの切除が起こったかどうかを決定する。次いで、切除されたＫａｎ配列を、ゲル抽出し、ＬＥ及びＲＥ切断モチーフを決定するためのシーケンシングに供する。
【0169】
実施例１３－インビボ切除アッセイ（予測的）
インビボ切除アッセイはまた、一方がＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥカーゴ及び他方がＴｎｐＡを含有する２つのプラスミドでＥ．ｃｏｌｉを共形質転換することによって実施される。形質転換及び一晩成長させた後、切除は、一晩培養のミニプレップ及びＤＮＡゲル上でＫａｎ配列が除去された再閉鎖ドナー骨格分子の検出によって決定される。この実験の対照には、単一のプラスミドの形質転換、又はＴｎｐＡ含有プラスミド及び逆複製起点を有するカーゴプラスミドの両方の形質転換が含まれる。切除されたＤＮＡ骨格を、ゲル抽出し、シーケンシングに供して、ＴｎｐＡトランスポゾンのＲＥ境界及びＬＥ境界を得る。挿入モチーフは、切除された骨格に留まり、シールされた接合部でも特定され得る。
インビボ切除アッセイはまた、一方がＬＥ－Ｋａｎ－ＲＥカーゴ及び他方がＴｎｐＡを含有する２つのプラスミドでＥ．ｃｏｌｉを共形質転換することによって実施される。形質転換及び一晩成長させた後、切除は、一晩培養のミニプレップ及びＤＮＡゲル上でＫａｎ配列が除去された再閉鎖ドナー骨格分子の検出によって決定される。この実験の対照には、単一のプラスミドの形質転換、又はＴｎｐＡ含有プラスミド及び逆複製起点を有するカーゴプラスミドの両方の形質転換が含まれる。切除されたＤＮＡ骨格を、ゲル抽出し、シーケンシングに供して、ＴｎｐＡトランスポゾンのＲＥ境界及びＬＥ境界を得る。挿入モチーフは、切除された骨格に留まり、シールされた接合部でも特定され得る。
【0170】
実施例１４－挿入部位特異性の変更（予測的）
挿入認識部位の操作は、ＴｎｐＡタンパク質の操作を必要とすることなく、Ｃｅｌｌ １３２，２０８－２２０（２００８）によって実証されている。本明細書に記載されるメタゲノミクス由来ＴｎｐＡ様タンパク質によって認識される挿入部位は、挿入部位モチーフに対する配列変異及びＬＥヘアピン配列に隣接するＬＥ ｓｓＤＮＡにおける塩基対形成パートナーに対する代償的変異を介して修飾される。一連の単一、二重、及び三重配列変異が、挿入部位及びＬＥ配列の合理的に設計された位置に導入される。野生型ＴｎｐＡ様タンパク質による変異挿入部位の認識及び切断を、上述の切除／挿入アッセイ及びその後のシーケンシング工程を使用して、野生型ＬＥ挿入配列と同時に試験し、活性レベルを比較する。
挿入認識部位の操作は、ＴｎｐＡタンパク質の操作を必要とすることなく、Ｃｅｌｌ １３２，２０８－２２０（２００８）によって実証されている。本明細書に記載されるメタゲノミクス由来ＴｎｐＡ様タンパク質によって認識される挿入部位は、挿入部位モチーフに対する配列変異及びＬＥヘアピン配列に隣接するＬＥ ｓｓＤＮＡにおける塩基対形成パートナーに対する代償的変異を介して修飾される。一連の単一、二重、及び三重配列変異が、挿入部位及びＬＥ配列の合理的に設計された位置に導入される。野生型ＴｎｐＡ様タンパク質による変異挿入部位の認識及び切断を、上述の切除／挿入アッセイ及びその後のシーケンシング工程を使用して、野生型ＬＥ挿入配列と同時に試験し、活性レベルを比較する。
【0171】
実施例１５－ＴｎｐＡは、プログラム可能な組み込みのために配列特異的エンドヌクレアーゼとともに使用することができる（予測的）
ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポゾンは、特定の標的部位に組み込まれる移動性遺伝子エレメントの一種である。これらのトランスポゾンは、それらのコードされたＴｎｐＡ様トランスポザーゼ、チロシン（Ｙ）トランスポザーゼのファミリーに属する酵素によって動員される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３，（２０１５）で論評されている）。ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポゾン動員の機構は、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＡ様タンパク質によるその切除、続いて、標的部位が複製フォークでｓｓＤＮＡとしてアクセス可能な場合、宿主複製中に認識された標的部位でのその組み込みを伴う（Ｃｅｌｌ １４２，３９８－４０８（２０１０））。
ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポゾンは、特定の標的部位に組み込まれる移動性遺伝子エレメントの一種である。これらのトランスポゾンは、それらのコードされたＴｎｐＡ様トランスポザーゼ、チロシン（Ｙ）トランスポザーゼのファミリーに属する酵素によって動員される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３，（２０１５）で論評されている）。ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポゾン動員の機構は、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＡ様タンパク質によるその切除、続いて、標的部位が複製フォークでｓｓＤＮＡとしてアクセス可能な場合、宿主複製中に認識された標的部位でのその組み込みを伴う（Ｃｅｌｌ １４２，３９８－４０８（２０１０））。
【0172】
ＴｎｐＡ様タンパク質と共有される標的部位への特定の配列特異的（例えば、Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼエフェクターのＲＮＡガイド結合能力は、Ｒループの形成を通してｓｓＤＮＡ及び標的部位を利用可能にすることによって、所望のカーゴのＴｎｐＡ様エフェクター介在性組み込みを補助し得る。具体的には、ＴｎｐＡ様認識可能なＬＥ及びＲＥに隣接した所望のカーゴ（例えば、蛍光マーカー遺伝子）は、ＴｎｐＡ又はＴｎｐＡ様エフェクターによってドナー鋳型から切除され、（融合された）配列特異的エンドヌクレアーゼの結合によって利用可能になる所望の標的部位（ＴｎｐＡ又はＴｎｐＡ様タンパク質認識可能モチーフを含有する）へと組み込まれる。配列特異的エンドヌクレアーゼは、触媒的に死滅するか、又は低減若しくは改変されたエンドヌクレアーゼ（例えば、ニッカーゼ）活性を有するように操作されてもよい。したがって、ＴｎｐＡ様タンパク質は、融合され、操作された（例えば、死滅した又はニッカーゼ）配列特異的エンドヌクレアーゼエフェクターによって利用可能にされたＴＡＭ依存性標的部位へと所望のカーゴを挿入するように「プログラム」され得る。
【0173】
実施例１６－ｄｓＤＮＡ中のＲループへのＴｎｐＡ様挿入のインビトロ試験（予測的）
ｄｓＤＮＡ中のＲループとして生成されたｓｓＤＮＡに挿入するＴｎｐＡ様タンパク質の能力は、インビトロで特定された活性ＴｎｐＡ様タンパク質、並びにそれらの対応するＬＥ配列及びＲＥ配列を使用して試験することができる。Ｒループは、ＩＶＴＴ反応で発現されるか、又は精製されたＲＮＰとして添加されるＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ死滅酵素又はニッカーゼなどの配列特異的エンドヌクレアーゼを介して生成することができる。ＴｎｐＡ様タンパク質は、標的ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡ及びＲＮＰによって置き換えられることを除いて、インビトロ挿入アッセイに記載されるように試験される。挿入活性は、ＬＥ接合部又はＲＥ接合部のいずれかに隣接するｄｓＤＮＡ標的及びｓｓＤＮＡカーゴ内のプライマーを用いてＰＣＲを介してアッセイされる。挿入部位の最適な位置は、Ｒループに沿った様々な位置に挿入モチーフを配置して、ＴｎｐＡ様タンパク質による最良のアクセス性を有する部位を決定することによって試験される。ミスマッチＤＮＡ鎖がアニーリングされるｄｓＤＮＡ中のｓｓＤＮＡバブルへの挿入も試験することができる。
ｄｓＤＮＡ中のＲループとして生成されたｓｓＤＮＡに挿入するＴｎｐＡ様タンパク質の能力は、インビトロで特定された活性ＴｎｐＡ様タンパク質、並びにそれらの対応するＬＥ配列及びＲＥ配列を使用して試験することができる。Ｒループは、ＩＶＴＴ反応で発現されるか、又は精製されたＲＮＰとして添加されるＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ死滅酵素又はニッカーゼなどの配列特異的エンドヌクレアーゼを介して生成することができる。ＴｎｐＡ様タンパク質は、標的ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡ及びＲＮＰによって置き換えられることを除いて、インビトロ挿入アッセイに記載されるように試験される。挿入活性は、ＬＥ接合部又はＲＥ接合部のいずれかに隣接するｄｓＤＮＡ標的及びｓｓＤＮＡカーゴ内のプライマーを用いてＰＣＲを介してアッセイされる。挿入部位の最適な位置は、Ｒループに沿った様々な位置に挿入モチーフを配置して、ＴｎｐＡ様タンパク質による最良のアクセス性を有する部位を決定することによって試験される。ミスマッチＤＮＡ鎖がアニーリングされるｄｓＤＮＡ中のｓｓＤＮＡバブルへの挿入も試験することができる。
【0174】
【表2-1】
【0175】
【表2-2】
【0176】
【表2-3】
【0177】
【表2-4】
【0178】
【表2-5】
【0179】
【表2-6】
【0180】
【表2-7】
【0181】
【表2-8】
【0182】
【表2-9】
【0183】
【表2-10】
【0184】
【表2-11】
【0185】
【表2-12】
【0186】
【表2-13】
【0187】
【表2-14】
【0188】
【表2-15】
【0189】
【表2-16】
【0190】
【表2-17】
【0191】
【表2-18】
【0192】
【表2-19】
【0193】
【表2-20】
【0194】
【表2-21】
【0195】
【表2-22】
【0196】
【表2-23】
【0197】
【表2-24】
【0198】
【表2-25】
【0199】
【表2-26】
【0200】
【表2-27】
【0201】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されてきたが、そのような実施形態が例示の目的でのみ提供されていることは、当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることは意図されていない。本発明は前述の説明を参照して記載されているが、本明細書の実施形態の記載及び説明は、限定された意味で解釈されることを意図していない。多数の変形、変更、及び置換は、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じるであろう。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成又は相対的割合に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施に用いられ得ることは、理解されるべきである。したがって、本発明は、こうした任意の代替、修正、変形、又は均等物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内の方法及び構造がそれによって包含されることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】