特表 2024-533065 リンパ球効力アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】リンパ球効力アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240905BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02 ZNA

C07K16/28

C12N5/10

C07K16/46

C12N15/09 100

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512040

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-02-22

(86)【国際出願番号】 US2022076028

(87)【国際公開番号】W WO2023039410

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/241,768

(32)【優先日】2021-09-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/291,655

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/391,118

(32)【優先日】2022-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520352311

【氏名又は名称】ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ベンソン， マイカ

(72)【発明者】

【氏名】シュラバック， マイケル アール．

(72)【発明者】

【氏名】ウォン， カリー

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QR04

4B063QR16

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B063QR80

4B063QR90

4B063QS36

4B063QS38

4B063QX01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BC50

4B065CA46

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

(57)【要約】

本開示は、リンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の抗腫瘍効力の測定に有用な方法及び材料に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価するための方法であって、
ＴＩＬ及び不死化細胞を共培養することであって、前記不死化細胞がＴ細胞を活性化する分子を含む、前記共培養することと、
前記ＴＩＬの効力を評価することとを含む、前記方法。

【請求項2】

前記分子がＴ細胞抗原に結合する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＴＩＬがＴ細胞抗原を発現する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｔ細胞抗原がＣＤ３抗原である、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記不死化細胞が前記分子を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記分子が抗体または抗体フラグメントである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体フラグメントが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦｖフラグメントから選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体フラグメントがｓｃＦｖである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抗体または前記抗体フラグメントが、それぞれＯＫＴ３抗体またはＯＫＴ３抗体フラグメントである、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＯＫＴ３抗体フラグメントが膜結合型ＯＫＴ３（ｍＯＫＴ３）ｓｃＦｖである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖが低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記分子が、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤよりも高い解離定数（ＫＤ）でＣＤ３に結合し、前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤが約５×１０^－１０Ｍである、請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５及びＹ５７の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｍ及びＹ５７Ａの変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも２５０倍高いＫＤでＣＤ３に結合する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔを有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍高いＫＤでＣＤ３に結合する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記分子が、細菌性スーパー抗原、任意選択でブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記分子が膜繋留分子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＴＩＬが操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記ｅＴＩＬが編集ｅＴＩＬである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記編集ｅＴＩＬがゲノム修飾を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記不死化細胞が不死化細胞のクローン集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記不死化細胞が不死化ヒト細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記不死化細胞が操作がん細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記操作がん細胞が操作黒色腫細胞、操作大腸癌細胞、操作胆管癌細胞、及び操作乳癌細胞から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記共培養の前に、前記不死化細胞が超低接着表面にプレーティングされる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記共培養の前に、前記不死化細胞がマルチウェルプレートに、任意選択で６ウェル、２４ウェル、または９６ウェルプレートにプレーティングされる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記不死化細胞が約５，０００～約１０，０００生細胞／培養物の密度でプレーティングされる、請求項２７または２８に記載の方法。

【請求項30】

前記超低接着表面が、親水性の中性荷電ヒドロゲルコーティングを含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記不死化細胞が、三次元スフェロイドを生成するために、好ましくは約２～６日間、より好ましくは約４日間培養される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記共培養の前に、前記ＴＩＬが前記不死化細胞の培養物に約２０：１～１：１のＥ：Ｔ比で加えられる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記共培養が約４時間、約８時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約３日間、約４日間、または約５日間行われ、任意選択で、前記共培養が約１日～約５日間行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記効力を評価することが、前記不死化細胞からのサイトカイン放出、任意選択でＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、及び／またはＩＬ－６放出、前記不死化細胞の細胞死及び／または生存率を測定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記効力を評価することが、前記不死化細胞の成長、細胞死、及び／または生存率を測定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記測定が、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レサズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価するための方法であって、
ＴＩＬ及び操作がん細胞のクローン集団を共培養することであって、前記操作がん細胞が抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体フラグメントを発現する、前記共培養することと、
前記操作がん細胞の死及び／または生存率を評価することとを含む、前記方法。

【請求項38】

前記ＴＩＬがＣＤ３抗原を発現する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記操作がん細胞が抗ＣＤ３抗体フラグメントを発現する、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

前記抗ＣＤ３抗体フラグメントが抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖがｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖが低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤでＣＤ３に結合し、前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤが約５×１０^－１０Ｍである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍低いＫＤでＣＤ３に結合する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔの変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３または４４に記載の方法。

【請求項46】

前記抗ＣＤ３抗体または前記抗ＣＤ３抗体フラグメントが、それぞれ膜繋留抗ＣＤ３抗体または膜繋留抗ＣＤ３抗体フラグメントである、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＴＩＬが操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記ｅＴＩＬが編集ｅＴＩＬである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記編集ｅＴＩＬがゲノム修飾を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記操作がん細胞が、操作黒色腫細胞、操作大腸癌細胞、操作胆管癌細胞、及び操作乳癌細胞から選択される、請求項３７～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記操作がん細胞が操作黒色腫細胞である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記共培養が少なくとも２４時間、任意選択で約２４～７２時間行われる、請求項３７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記測定が、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レサズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む、請求項３７～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価するための方法であって、
ＴＩＬと、不死化細胞と、Ｔ細胞を活性化し前記不死化細胞に結合する二重特異性分子とを共培養することと、
前記ＴＩＬの効力を評価することとを含む、前記方法。

【請求項55】

前記ＴＩＬがＣＤ３抗原を発現する、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記二重特異性分子がＣＤ３に結合する分子を含む、請求項５４または５５に記載の方法。

【請求項57】

前記ＴＩＬが操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記ｅＴＩＬが編集ｅＴＩＬである、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記編集ｅＴＩＬがゲノム修飾を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記不死化細胞が不死化細胞のクローン集団を含む、請求項５４～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記不死化細胞がヒト細胞である、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記不死化細胞ががん細胞である、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記がん細胞が、黒色腫細胞、大腸癌細胞、胆管癌細胞、及び乳癌細胞から選択される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記二重特異性分子がＣＤ１９に結合する分子を含む、請求項６２または６３に記載の方法。

【請求項65】

前記二重特異性分子がＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記共培養が少なくとも２４時間、任意選択で約２４～７２時間行われる、請求項５４～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記測定が、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レザズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む、請求項５４～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

ポリクローナルＴ細胞の効力を評価するための方法であって、
ポリクローナルＴ細胞及び不死化細胞を共培養することであって、前記不死化細胞がＴ細胞を活性化する分子を含む、前記共培養することと、
前記ポリクローナルＴ細胞の能力を評価することとを含む、前記方法。

【請求項69】

前記分子がＴ細胞抗原に結合する、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ポリクローナルＴ細胞が前記Ｔ細胞抗原を発現する、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記Ｔ細胞抗原がＣＤ３抗原である、請求項６９または７０に記載の方法。

【請求項72】

前記不死化細胞が前記分子を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記分子が抗体または抗体フラグメントである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記抗体フラグメントが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦｖフラグメントから選択される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記抗体フラグメントがｓｃＦｖである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記抗体または前記抗体フラグメントが、それぞれＯＫＴ３抗体またはＯＫＴ３抗体フラグメントである、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記ＯＫＴ３抗体フラグメントが膜結合型ＯＫＴ３（ｍＯＫＴ３）ｓｃＦｖである、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖが低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記分子が、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤよりも高い解離定数（ＫＤ）でＣＤ３に結合し、前記ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤが約５×１０^－１０Ｍである、請求項７１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５及びＹ５７の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項81】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｍ及びＹ５７Ａの変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも２５０倍高いＫＤでＣＤ３に結合する、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔを有するアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項84】

前記低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍高いＫＤでＣＤ３に結合する、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記分子が、細菌性スーパー抗原、任意選択でブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）から選択される、請求項６８～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記分子が膜繋留分子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記ポリクローナルＴ細胞がネオ抗原特異性Ｔ細胞を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項88】

前記ポリクローナルＴ細胞が末梢血に由来する、請求項６８に記載の方法。

【請求項89】

前記ポリクローナルＴ細胞が骨髄に由来する、請求項６８に記載の方法。

【請求項90】

前記不死化細胞が不死化細胞のクローン集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記不死化細胞が不死化ヒト細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項92】

前記不死化細胞が操作がん細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項93】

前記操作がん細胞が操作黒色腫細胞、操作大腸癌細胞、操作胆管癌細胞、及び操作乳癌細胞から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項94】

前記共培養が少なくとも４時間行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

前記効力を評価することが、前記不死化細胞からのサイトカイン放出、任意選択でＩＦＮ－γ及び／またはＩＬ－６放出、前記不死化細胞の細胞死及び／または生存率を測定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

前記効力を評価することが、前記不死化細胞の成長、細胞死、及び／または生存率を測定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

前記測定が、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レサズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

ポリクローナルＴ細胞の効力を評価するための方法であって、
ポリクローナルＴ細胞と、不死化細胞と、Ｔ細胞を活性化し前記不死化細胞に結合する二重特異性分子とを共培養することと、
前記ポリクローナルＴ細胞の能力を評価することとを含む、前記方法。

【請求項99】

前記ポリクローナルＴ細胞がＣＤ３抗原を発現する、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記二重特異性分子がＣＤ３に結合する分子を含む、請求項９８または９９に記載の方法。

【請求項101】

前記ポリクローナルＴ細胞がネオ抗原特異性Ｔ細胞を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項102】

前記ポリクローナルＴ細胞が末梢血に由来する、請求項９９に記載の方法。

【請求項103】

前記ポリクローナルＴ細胞が骨髄に由来する、請求項９９に記載の方法。

【請求項104】

前記不死化細胞が不死化細胞のクローン集団を含む、請求項９８～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

前記不死化細胞がヒト細胞である、請求項９８～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

前記不死化細胞ががん細胞である、請求項９８～１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

前記がん細胞が、黒色腫細胞、大腸癌細胞、胆管癌細胞、及び乳癌細胞から選択される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記二重特異性分子がＣＤ１９に結合する分子を含む、請求項１０６または１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記二重特異性分子がＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記共培養が少なくとも２４時間、任意選択で約２４～７２時間行われる、請求項９８～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記測定が、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レサズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む、請求項９８～１１０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国仮出願第６３／２４１，７６８号（２０２１年９月８日出願）、米国仮出願第６３／２９１，６５５号（２０２１年１２月２０日出願）、及び米国仮出願第６３／３９１，１１８号（２０２１年７月２１日出願）の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、これらの各出願は、参照により全体として本明細書に援用される。

【0002】

電子配列表
電子配列表（Ｋ０７１３７００１８ＷＯ００－ＳＥＱ－ＨＪＤ．ｘｍｌ、サイズ：２１，５６８バイト、作成日：２０２２年９月７日）の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。

【0003】

本開示は、リンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の抗腫瘍効力の評価に有用な方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

リンパ球は、免疫系に不可欠な白血球である。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とは、血流を離れ腫瘍に向かって移動した白血球のことであり、Ｔ細胞及びＢ細胞がこれに含まれる。腫瘍内にリンパ球が存在することは、臨床転帰の改善と関連することが多く、実際に、ＴＩＬなどのリンパ球が腫瘍細胞の殺滅に関与している。リンパ球は、ある特定のタイプのがんの治療に養子細胞療法（ＡＣＴ）として普通に使用されている。例えば、ＴＩＬの養子移入は、特に予後不良の患者においては、肥大した難治性がんの治療に対する強力なアプローチである。ＡＣＴでは細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡大しており、患者に再び注入する前にその効力を特性評価しなければならない。

【0005】

ＴＩＬ効力アッセイは、ＴＩＬに特異的に意義のある直接的または間接的な生物学的活性を測定するものであり、ＴＩＬ／腫瘍特異性が患者間で広く不均一であることを考えると、このアッセイは、ＴＩＬを使用するＡＣＴには特に重要である。さらに、ＴＩＬ効力アッセイは、ＡＣＴに使用され得る個々のＴＩＬ製品の品質を保証するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により義務付けられている。

【0006】

重要なことには、全てのＴＩＬ効力アッセイが、アッセイの生物学的文脈またはアッセイのエンドポイントによって生物学的に意義があるとみなされるとは限らない。規制ガイドラインの増加により、臨床的有効性に至るためには、ＴＩＬの効力アッセイ値がｉｎ ｖｉｖｏ機能（例えば、腫瘍認識及び細胞死）と相関することが要求される。アッセイは、非細胞ベースＴＩＬ刺激アプローチを使用し、細胞毒性の代用となるＴ細胞の性質に基づくこともあるが（例えば、ＴＩＬ効力の評価にインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）放出アッセイを使用）、腫瘍細胞媒介性ＴＩＬ活性化に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＩＬ効力アッセイはＴＩＬ効力をより正確に表現することができ、細胞毒性またはＩＦＮ－γ放出を含む代替的エンドポイントが使用される場合、このアッセイは、当技術分野では、最も臨床的有効性との相関が明らかであると考えられている（例えば、ｄｅ Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１８ Ｍａｙ；２０（５）：６０１－６２２を参照）。現状、このような生物学的に意義のあるＴＩＬ効力アッセイは、この分野内では限られている。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、臨床的に適切な抗腫瘍応答を生成するリンパ球の能力を評価するために使用できるリンパ球効力アッセイ（例えば、ＴＩＬ効力アッセイ（本明細書ではＴＩＬ抗腫瘍効力アッセイとも称される））を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、リンパ球を活性化する分子（例えば、Ｔ細胞を活性化する分子（例えば、Ｔ細胞抗原に結合する分子））を含む不死化細胞（例えば、腫瘍細胞）を提供する。不死化細胞（例えば、腫瘍細胞）とリンパ球との間のこの相互作用を使用して、例えば、がんに対する抗腫瘍療法としてのリンパ球の効力を評価することができる。本明細書に記載のアッセイの前に、リンパ球（例えば、ＴＩＬ）効力アッセイの大部分は、リンパ球活性の尺度としての非細胞ベースリンパ球活性化及びサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）放出アッセイに基づき、細胞溶解機能を調べるための生理学的に無関係な刺激としてみなされ得るにとどまった。

【0008】

本開示は、膜関連抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体を発現するように操作された腫瘍細胞（例えば、ヒト黒色腫Ａ３７５細胞）が、例えば、ＴＩＬの抗腫瘍機能の活性化に使用できることを示すデータを提供する。ＯＫＴ３は、リンパ球の活性化に使用される活性化抗体であり、可溶性形態をとるか、またはビーズに結合し磁気ビーズに繋留されている。予想外なことに、ＴＩＬに対する膜関連結合ドメインの親和性を低下させるＯＫＴ３抗体に変異を組み込むことによってＴＩＬに対するＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞の親和性を減少させる方法は、例えば三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍スフェロイド機能アッセイにおいて、ＴＩＬの効力を評価するためのアッセイの有用性を改善する役割を果たす。

【0009】

また、本開示は、いくつかの実施形態では、二次元単層細胞培養物が、リンパ球の抗腫瘍活性の評価により良好に適している一方で、いくつかの実施形態では、三次元多層スフェロイド培養が、異なるリンパ球集団（例えば、編集ＴＩＬ及び未編集ＴＩＬ）の機能的特性の評価により良好に適していることを示すデータを提供する。本明細書に記載のスフェロイド設定により、ＴＩＬの機能／生物学の複数の態様（細胞毒性、サイトカイン産生、増殖、及び表現型の変化を含む）の特定及び評価が可能になった。標的側では、スフェロイド寸法は、ｉｎ ｖｉｖｏで発生するものにより近い、より高いレベルの細胞間接触及び相互作用を提供する。理論に束縛されるものではないが、本明細書で提供される効力アッセイは、形態学的特性及び他の細胞特性の変化を比較及び対照させるために用いる、洗練されていながら複雑な細胞微小環境を提供する。

【0010】

本開示の態様は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の効力を評価するための方法であって、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）及び不死化細胞を共培養することであって、不死化細胞がリンパ球（例えば、Ｔ細胞）を活性化する分子を含む、共培養することと、リンパ球の効力を評価することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、リンパ球は操作されていない（例えば、天然でないゲノム修飾を含まない）。

【0011】

本開示の他の態様は、ＴＩＬの効力を評価するための方法であって、ＴＩＬ及び操作腫瘍細胞を共培養することであって、操作腫瘍細胞がＴ細胞を活性化する分子を含む、共培養することと、ＴＩＬの効力を評価することとを含む、方法を提供する。

【0012】

本開示のまた他の態様は、ポリクローナルＴ細胞の効力を評価するための方法であって、ポリクローナルＴ細胞及び不死化細胞を共培養することであって、不死化細胞がＴ細胞を活性化する分子を含む、共培養することと、ポリクローナルＴ細胞の効力を評価することとを含む、方法である。

【0013】

いくつかの実施形態において、分子はＴ細胞抗原に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬはＴ細胞抗原を発現する。いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞はＴ細胞抗原を発現する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞抗原はＣＤ３抗原である。いくつかの実施形態において、不死化細胞は分子を発現する。

【0014】

いくつかの実施形態において、分子は抗体または抗体フラグメントである。例えば、抗体フラグメントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦｖフラグメントから選択され得る。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、それぞれＯＫＴ３抗体またはＯＫＴ３抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、ＯＫＴ３抗体フラグメントは膜結合型ＯＫＴ３（ｍＯＫＴ３）ｓｃＦｖである。例えば、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖは低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントであり得る。

【0015】

いくつかの実施形態において、分子はｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤでＣＤ３に結合し、ここで、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤは約５×１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５及びＹ５７の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｍ及びＹ５７Ａの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも２５０倍低いＫＤでＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍低いＫＤでＣＤ３に結合する。

【0016】

いくつかの実施形態において、分子は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）から選択される。いくつかの実施形態において、分子は細菌性スーパー抗原、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。いくつかの実施形態において、分子は膜繋留分子である。

【0017】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、ｅＴＩＬは編集ｅＴＩＬである。いくつかの実施形態において、編集ｅＴＩＬはゲノム修飾を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞はネオ抗原特異性Ｔ細胞を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞は末梢血に由来する。

【0020】

いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞は骨髄に由来する。

【0021】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は不死化細胞のクローン集団を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞は不死化ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、不死化細胞は操作（例えば、ヒト）がん細胞である。いくつかの実施形態において、操作がん細胞は、操作黒色腫細胞、操作大腸癌細胞、操作胆管癌細胞、及び操作乳癌細胞から選択される。

【0022】

いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも４時間（例えば、約４～６時間、約４～８時間、約４～１２時間、約４～１８時間、または約４～２４時間）行われる。いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも１２時間行われる。いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間行われる。いくつかの実施形態において、共培養は約１日間、約１～３日間、約１～４日間、約１～５日間、約１～６日間、または約１～７日間行われる。

【0023】

いくつかの実施形態において、効力の評価は、腫瘍に対するＴＩＬ反応性の代理マーカー（エフェクターサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）の放出またはＣＤ１０７ａの発現を含む）を測定することを含む。いくつかの実施形態において、効力の評価は、不死化細胞の成長を測定することを含む。いくつかの実施形態において、効力の評価は、不死化細胞の細胞死及び／または生存率を測定することを含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、測定は、細胞生存率アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態において、測定は、細胞毒性アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態において、測定は、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レザズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む。

【0025】

本開示のさらなる態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価するための方法であって、ＴＩＬ及び操作がん細胞のクローン集団を共培養することであって、操作がん細胞が抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体フラグメントを発現する、共培養することと、操作がん細胞の死滅及び／または生存率を評価することとを含む、方法を提供する。

【0026】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬはＣＤ３抗原を発現する。

【0027】

本開示のさらに他の態様は、ポリクローナルＴ細胞の効力を評価するための方法であって、ポリクローナルＴ細胞及び操作がん細胞のクローン集団を共培養することであって、操作がん細胞が抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体フラグメントを発現する、共培養することと、操作がん細胞の死滅及び／または生存率を評価することとを含む、方法を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞はＣＤ３抗原を発現する。

【0029】

いくつかの実施形態において、操作がん細胞は抗ＣＤ３抗体フラグメントを発現する。例えば、抗ＣＤ３抗体フラグメントは抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖは低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントである。

【0030】

いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤでＣＤ３に結合し、ここで、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤは約５×１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍低いＫＤでＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔの変異を有するアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体フラグメントは、それぞれ膜繋留抗ＣＤ３抗体または膜繋留抗ＣＤ３抗体フラグメントである。

【0032】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、ｅＴＩＬは編集ｅＴＩＬである。いくつかの実施形態において、編集ｅＴＩＬはゲノム修飾を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、操作がん細胞は、操作黒色腫細胞、操作大腸癌細胞、操作胆管癌細胞、及び操作乳癌細胞から選択される。いくつかの実施形態において、操作がん細胞は操作黒色腫細胞である。

【0034】

いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも２４時間、例えば、約２４～７２時間行われる。

【0035】

いくつかの実施形態において、測定は、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レザズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む。

【0036】

本開示のさらなる態様は、ＴＩＬの効力を評価するための方法であって、ＴＩＬと、不死化細胞と、Ｔ細胞を活性化し不死化細胞に結合する二重特異性分子とを共培養することと、ＴＩＬの効力を評価することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬはＣＤ３抗原を発現する。いくつかの実施形態において、二重特異性分子は、ＣＤ３に結合する分子を含む。

【0037】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは操作ＴＩＬ（ｅＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、ｅＴＩＬは編集ｅＴＩＬである。いくつかの実施形態において、編集ｅＴＩＬはゲノム修飾を含む。

【0038】

本開示の他の態様は、ポリクローナルＴ細胞の効力を評価するための方法であって、ポリクローナルＴ細胞と、不死化細胞と、Ｔ細胞を活性化し不死化細胞に結合する二重特異性分子とを共培養することと、ポリクローナルＴ細胞の効力を評価することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ポリクローナルＴ細胞はＣＤ３抗原を発現する。いくつかの実施形態において、二重特異性分子は、ＣＤ３に結合する分子を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は不死化細胞のクローン集団を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、不死化細胞は（例えば、ヒト）がん細胞である。いくつかの実施形態において、がん細胞は、黒色腫細胞、大腸癌細胞、胆管癌細胞、及び乳癌細胞から選択される。

【0040】

いくつかの実施形態において、二重特異性分子は、ＣＤ１９に結合する分子を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性分子は、ＣＤ３に結合する分子を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性分子は、ＣＤ１９及びＣＤ３に結合する分子を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、二重特異性分子はＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）である。

【0042】

いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも２４時間、例えば、約２４～７２時間行われる。

【0043】

いくつかの実施形態において、測定は、細胞生存率アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態において、測定は、細胞毒性アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態において、測定は、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レザズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイから選択されるアッセイを実施することを含む。

【0044】

添付の図面と併せて行う以下の例示的な実施形態についての詳細な説明により、本開示の上記及び他の特徴及び利点がより十分に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】０μＬ、２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、４００μＬ、または８００μＬのｍＯＫＴ３をコードするｐＫＳＱ３６６またはｐＫＳＱ３６７レンチウイルスを形質導入したＡ３７５細胞をヒト汎ＣＤ３^＋Ｔ細胞とともに一晩共培養したことを示している。翌日、ＣＤ６９活性化をフローサイトメトリーにより評価した。様々な量のｐＫＳＱ３６６ウイルスを形質導入したＡ３７５細胞は、２５μＬのウイルスの場合以外は、同様のレベルのＣＤ６９活性化をもたらすことが分かった。ｐＫＳＱ３６７を形質導入したＡ３７５細胞は、わずかにより高いレベルのＣＤ６９の活性化をもたらし、様々な量のウイルスを使用したところ同様のレベルの活性化が認められた。

【図2】Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７及び非形質導入細胞をヤギ－抗マウス抗体で染色してｍＯＫＴ３表面発現を確認したことを示している。９９．２％のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７がｍＯＫＴ３を発現していることが分かった。

【図3A】様々なエフェクター細胞：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で３日間Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７と共培養したプレＲＥＰ ＴＩＬを示している。プレＲＥＰ ＴＩＬによるＡ３７５の殺滅は、１０：１でＤ２７７７の場合以外では観察されない。全てのＥ：Ｔで、ＴＩＬのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７に対する認識及びそれに続く殺滅の増加が観察されている。

【図3B】様々なエフェクター細胞：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で３日間Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７と共培養したプレＲＥＰ ＴＩＬを示している。プレＲＥＰ ＴＩＬによるＡ３７５の殺滅は、１０：１でＤ２７７７の場合以外では観察されない。全てのＥ：Ｔで、ＴＩＬのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７に対する認識及びそれに続く殺滅の増加が観察されている。

【図3C】様々なエフェクター細胞：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で３日間Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７と共培養したプレＲＥＰ ＴＩＬを示している。プレＲＥＰ ＴＩＬによるＡ３７５の殺滅は、１０：１でＤ２７７７の場合以外では観察されない。全てのＥ：Ｔで、ＴＩＬのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７に対する認識及びそれに続く殺滅の増加が観察されている。

【図4】様々な膜アンカー、シグナルペプチド、及びｓｃＦｖリンカーを有するコンストラクトがいずれもＴ細胞をロバストに活性化することを示している。示されたコンストラクトを有するＫ５６２細胞を汎Ｔ細胞と共培養した。２４時間後、Ｔ細胞のＣＤ８及びＣＤ６９の表面発現を染色し、フローサイトメトリーにより測定した。ＣＤ６９発現は、ｍＯＫＴ３を発現するＫ５６２細胞と共培養した後、Ｋ５６２細胞の細胞膜に繋留するアンカーとは無関係に高くなった。

【図5】高親和性Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７が、それが由来するＡ３７５親細胞株と比較して高いｍＯＫＴ３マーカー発現を示すことを示している。

【図6】低親和性株Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９７が高いｍＯＫＴ３マーカー発現を示すことを示している。形質導入に使用するウイルスの量を増加させても、これらの細胞表面でのｍＯＫＴ３の発現は増加しない。

【図7】低親和性株Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８が中レベルのｍＯＫＴ３マーカー発現を示すことを示している。形質導入に使用するウイルスの量を増加させても、これらの細胞表面でのｍＯＫＴ３の発現は増加しない。

【図8】汎Ｔ細胞が、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７標的細胞と共培養した後に、細胞表面でＣＤ６９発現の増加を示すことを示している。これは、標的細胞（Ａ３７５ ｐＳＫＱ３６７）の認識及び汎Ｔ細胞の活性化を示すものである。これに対し、汎Ｔ細胞は、Ａ３７５親細胞と共培養した後にはほとんどＣＤ６９発現を示さない。このことは、汎Ｔ細胞の認識が欠如しており、そのため活性化が増加しないことを実証している。対照として単独で培養した汎Ｔ細胞は、基礎的ＣＤ６９発現の欠如を示している。

【図9】汎Ｔ細胞が、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９６標的細胞と共培養した後に、細胞表面でＣＤ６９発現をあまり示さないことを示している。この発現レベルは、Ａ３７５親細胞と共培養した汎Ｔ細胞と同等である（図８）。このことは、汎Ｔ細胞による標的細胞認識が欠如しており、そのため活性化が増加しないことを実証している。

【図10】汎Ｔ細胞が、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９７標的細胞と共培養した後に、細胞表面でＣＤ６９の発現を示すことを示している。この発現レベルは、標的細胞（Ａ３７５ ｐＳＫＱ３９７）の認識及び汎Ｔ細胞の活性化を示している。より大量のウイルスを形質導入した標的細胞は、汎Ｔ細胞の活性化をわずかに増加させる能力を有するように思われる。

【図11】汎Ｔ細胞が、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８標的細胞と共培養した後に、細胞表面でＣＤ６９の発現を示すことを示している。この発現レベルは、標的細胞（Ａ３７５ ｐＳＫＱ３９８）の認識及び汎Ｔ細胞の活性化を示している。より大量のウイルスを形質導入した標的細胞は、汎Ｔ細胞の活性化をわずかに増加させる能力を有するように思われる。

【図12】Ａ３７５親細胞を単層として、ＴＩＬドナー３２３９由来の遺伝子標的編集ＴＩＬ（ＥＰなし、ＯＬＦＲ、ＳＯＣＳ１、ＣＢＬＢ）と共培養したことを示している。ｍＯＫＴ３の表面発現が欠如しているため、標的Ａ３７５細胞の成長の低減または差は観察されなかった。

【図13】Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７細胞を単層として、ＴＩＬドナー３２３９由来の遺伝子標的編集ＴＩＬ（ＥＰなし、ＯＬＦＲ、ＳＯＣＳ１、ＣＢＬＢ）と共培養したことを示している。以前に観察された高レベルのｍＯＫＴ３表面発現により、標的Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７細胞の成長における大幅な低減が示された。

【図14】Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８細胞を単層として、ＴＩＬドナー３２３９由来の遺伝子標的編集ＴＩＬ（ＥＰなし、ＯＬＦＲ、ＳＯＣＳ１、ＣＢＬＢ）と共培養したことを示している。ｐＫＳＱ３９８は、ｐＫＳＱ３６７に比べてＣＤ３に対する親和性が低減しているため、ＴＩＬによる標的Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８細胞殺滅の動態が低減することが示された。全ての群がこの細胞株に対し同様の活性を有しており、このことからＯＫＴ３との親和性が低いとＴＩＬの殺滅が困難になることが示唆される。

【図15】１０，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７またはＡ３７５－ｐＫＳＱ３９８を超低接着プレートにプレーティングし、スフェロイドの形態を観察するために１０日にわたりイメージングしたことを示している。

【図16】１０，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７またはＡ３７５－ｐＫＳＱ３９８を超低接着プレートにプレーティングしたことを示している。エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）及びＳＯＣＳ１編集ＴＩＬを４日後に様々なＥ：Ｔ比で加えた。イメージングをスフェロイド形成及び共培養の期間にわたって継続した。このような画像を、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７については３６時間後、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３９８については７２時間後に収集した。

【図17】１０，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７またはＡ３７５－ｐＫＳＱ３９８を超低接着プレートにプレーティングしたことを示している。エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）及びＳＯＣＳ１編集ＴＩＬを４日後に様々なＥ：Ｔ比で加えた。イメージングをスフェロイド形成及び共培養の期間にわたって継続した。このような画像を共培養から７２時間後に収集した。

【図18】１０，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７を超低接着プレートにプレーティングしたことを示している。エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）及びＳＯＣＳ１編集ＴＩＬを４日後に様々なＥ：Ｔ比で加えた。イメージングをスフェロイド形成及び共培養の期間にわたって継続した。このような画像を共培養から５日後に収集した。

【図19】５，０００個または１０，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３９８を超低接着プレートにプレーティングしたことを示している。エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）及びＳＯＣＳ１編集ＴＩＬを４日後に様々なＥ：Ｔ比で加えた。イメージングをスフェロイド形成及び共培養の期間にわたって継続した。このような画像を共培養から５日後に収集した。

【図20】７２時間にわたる異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比におけるＳＯＣＳ１編集ＴＩＬ及び対照未編集ＴＩＬのＡ３７５－ＯＫＴ３ｌｔスフェロイドに対する細胞毒性を示している。単層培養では、ＳＯＣＳ１編集細胞は、Ａ３７５－ｐＫＳＱＡ３６７細胞及びＡ３７５－ｐＫＳＱ３６８細胞の殺滅において、未編集細胞と差がなかった（図１３及び図１４）。３Ｄスフェロイド設定では、ＳＯＣＳ１編集細胞は対照に比べて細胞毒性の増強が示された。このことから、スフェロイド設定ではアッセイが異なる感度を有することが示唆される。

【図21】２４時間及び異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比において、ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬ及び対照未編集ＴＩＬがＡ３７５－ＯＫＴ３ｌｔスフェロイドに対し産生するＩＦＮγを示している。

【図22】２４時間及び異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比において、ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬ及び対照未編集ＴＩＬがＡ３７５－ＯＫＴ３ｌｔスフェロイドに対し産生するＩＬ－６を示している。

【図23】２４時間のＴＩＬ－スフェロイド共培養後の上清中で検出された発光レベルを示している。

【図24】２４時間のＴＩＬ－スフェロイド共培養後の上清中の算出ＬＤＨレベルを示している。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本開示は、いくつかの態様において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍効力の測定に有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、例えば、ＴＩＬ及び不死化細胞を共培養することと、ＴＩＬ、不死化細胞、及び二重特異性分子を共培養することを含むアプローチを用いてＴＩＬの効力を評価することとを含む。

【0047】

現在Ｔ細胞機能のモニタリングに使用されている多くのＴＩＬ効力アッセイが、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－２）放出アッセイの使用に焦点を当てている。例えば、Ｔ細胞の活性化は、非細胞ベースのＴ細胞活性化試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズを含める）を用いた短い共培養期間の後のＩＦＮ－γ分泌を測定することにより、定量することができる。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）は標的細胞上のＭＨＣ Ｉ及びＦａｓの発現を増強するため、サイトカイン分泌は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞溶解活性と相関している。例えば、ＴＣＲ刺激時にインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）放出が５０ｐｇ／ｍｌ超、１００ｐｇ／ｍｌ超、１５０ｐｇ／ｍｌ超、または２００ｐｇ／ｍｌ超である場合、ＴＩＬは強力であるとみなされ得る。

【0048】

しかし、ＴＩＬが少なくとも標的細胞との相互作用と、グランザイムＢ及びパーフォリンを含む細胞溶解性顆粒の脱顆粒のような死誘導のためのメディエーターの産生／放出とが可能であることが要求される、標的腫瘍細胞による活性化及び直接の殺滅は、非細胞ベースＴＩＬ活性化法によって駆動される現在利用可能なサイトカイン放出アッセイでは測定されない、臨床効果において同様に重要な指標である。本明細書で提供されるＴＩＬ効力アッセイは、関連する腫瘍細胞ベースの相互作用を通じてＴＩＬを活性化することにより、既存のＴＩＬ効力アッセイ（例えば、サイトカイン放出アッセイ）を改善する。これにより、標的細胞（例えば、がん細胞などの不死化細胞）の細胞死及び／または生存率、または代理脱顆粒マーカー（例えば、ＣＤ１０７ａ）の測定、またはエフェクターサイトカイン／ケモカイン（例えば、炎症性サイトカイン／ケモカイン）（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ＿２、及びＴＮＦα）の産生を、より生理的に適切なＴＩＬ／腫瘍細胞共培養設定において、直接測定する機会がもたらされる。

【0049】

「ＴＩＬ効力アッセイ」とは、ＴＩＬの抗腫瘍活性（例えば、サイトカイン産生、ＴＩＬ脱顆粒、腫瘍成長阻害）を特性評価（例えば、定量化）するために使用されるアッセイを指す。ＴＩＬ効力アッセイは、ＴＩＬの急速な拡大の前及び／または後、かつ養子細胞療法（ＡＣＴ）などの臨床使用適用の前に、ＴＩＬの抗腫瘍活性の評価に使用することができる。

【0050】

腫瘍浸潤リンパ球
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（操作ＴＩＬ及び／または編集ＴＩＬを含む）は、その抗腫瘍活性の効力（例えば、腫瘍細胞成長の阻害）に基づいて特性評価することができる。

【0051】

「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という表現は、対象の血流を離れて腫瘍内に移動したリンパ球集団を指す。ＴＩＬとしては、限定されるものではないが、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）、ナチュラルキラーＴ細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬが含まれる。「初代ＴＩＬ」とは、本明細書で概説するように患者組織試料から得られたもの（「採取直後」と称されることもある）のことであり、「二次ＴＩＬ」とは、拡大または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団のことであり、限定されるものではないが、バルクＴＩＬ及び拡大ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）がこれに含まれる。いくつかの実施形態において、初代ＴＩＬは、患者の末梢血から得られた腫瘍反応性Ｔ細胞を含む。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾されたまたは他の方法で操作されたＴＩＬを含むことができる。また、「ＴＩＬ」は、対象の血流を離れ、腫瘍内に移動し、次いで再び離れて血流に入ったリンパ球集団も指す。

【0052】

本明細書で一般的に概説するように、ＴＩＬは、一般的には患者試料から採取され、患者に移植する前にその数を拡大するように操作される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、以下で説明するように遺伝子的に操作することができる。概して、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料から得られ（「初代ＴＩＬ」）、次いで、本明細書に記載のように、さらなる操作のためにより大きな集団に拡大され、任意選択で凍結保存及び再刺激され、任意選択でＴＩＬの健康状態の指標として表現型及び代謝パラメーターについて評価される。

【0053】

「対象」及び「患者」という用語はヒトを指す。いくつかの実施形態において、このヒトは、患者自身のＴＩＬの拡大集団を伴う免疫療法を必要とする患者であり得る。他の実施形態において、このヒトは、別の患者自身のＴＩＬの拡大集団を伴う免疫療法を必要としている患者であり得る。

【0054】

概して、ＴＩＬは、細胞表面マーカーを用いて生化学的に定義するか、または腫瘍に浸潤し治療をもたらす能力によって機能的に定義することができる。概して、ＴＩＬは、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＴＣＲｇｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上を発現するものとして分類することができる。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者に再導入する際の固形腫瘍に浸潤する能力によって機能的に定義することができる。

【0055】

従来のＴＩＬ製造プロセスによりｅｘ ｖｉｖｏで培養されたＴＩＬを利用する養子細胞療法は、少なくとも２つのステップ、すなわち、プレＲＥＰステップと、それに続く少なくとも１つの急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）ステップとを伴う。養子細胞療法は、黒色腫患者において好結果が得られる宿主免疫抑制後の療法となっている。現在の点滴許容パラメーターは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、またはＣＤ４陽性）の表示測定値、ならびにＲＥＰ生成物の拡大及び生存率の数値的倍率に依存する。

【0056】

「細胞集団」または「ＴＩＬ集団」という表現は、共通の形質を共有する複数の細胞またはＴＩＬを指す。概して、ＴＩＬ集団の数は１×１０^６～１×１０^１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、初代ＴＩＬをＩＬ－２存在下で初期成長させると、およそ１×１０^７細胞のバルクＴＩＬ集団が得られ得る。概して、ＲＥＰ拡大は、注入用の１．５×１０^９～１．５×１０^１０細胞の集団を提供するために行われる。いくつかの実施形態において、細胞集団はモノクローナルである。他の実施形態において、細胞集団はポリクローナルである。いくつかの実施形態において、細胞集団がポリクローナルである場合、細胞は依然として１つ以上の共通の形質を共有する。モノクローナルＴ細胞集団は、単一のＴＣＲ遺伝子再構成パターンが優勢となる。これに対し、ポリクローナルＴ細胞集団は多様なＴＣＲ遺伝子再構成パターンを有し、これにより、ある特定の状況ではより有効となり得る。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、追加の機能（限定されるものではないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、腫瘍関連抗原（例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１）を標的とするＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソセリン）もしくは系統制限細胞表面分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、もしくはＨＥＲ２）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む）を含むように遺伝子操作される。

【0058】

「操作ＴＩＬ」または「ｅＴＩＬ」という用語は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低減が得られる非天然の手段によってもたらされた１つ以上のゲノム修飾を含むＴＩＬ、ならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低減可能な天然に存在しない遺伝子調節系を含むＴＩＬを包含する。「非修飾ＴＩＬ」または「対照ＴＩＬ」とは、ゲノムが天然に存在しない手段によって修飾されておらず、かつ天然に存在しない遺伝子調節系を含まない、または対照遺伝子調節系（例えば、空のベクター対照、非標的ｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡなど）を含む、ＴＩＬまたはＴＩＬ集団を指す。１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低減している天然に存在するＴＩＬは、非修飾ＴＩＬまたは対照ＴＩＬという用語に含まれる。

【0059】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって製造される操作ＴＩＬは、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列内に、内在性遺伝子の発現及び／または機能の低減をもたらす１つ以上の修飾（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失、または変異）を含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列内の修飾は、ｍＲＮＡ転写を低減または阻害して、コードされたｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低減する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列の修飾は、ｍＲＮＡの翻訳を低減または阻害して、コードされたタンパク質の発現レベルを低減する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列内の修飾は、内在性タンパク質の非修飾（すなわち、野生型）バージョンと比較して、機能が低下または変化した修飾内在性タンパク質をコードする（例えば、後述するドミナントネガティブ変異体）。

【0060】

いくつかの実施形態において、標的細胞（例えば、修飾ＴＩＬは、腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ））が発現するタンパク質標的を認識する、操作抗原特異的受容体をさらに含む。「操作抗原受容体」という用語は、天然に存在しない抗原特異的受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を指す。いくつかの実施形態において、操作抗原受容体は、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介しシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと融合した細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞外ドメインは、標的細胞が発現する抗原にＭＨＣ非依存的に結合して、ＲＥ細胞の活性化及び増殖をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメントに融合したタグを認識する。このような実施形態において、ＣＡＲの抗原特異性は標識抗体の抗原特異性に依存するため、ある抗体を別の抗体に置き換えることにより、単一のＣＡＲコンストラクトが複数の異なる抗原の標的化に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合フラグメントを含むことができる。本開示で有用な抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び単鎖抗体が挙げられる。

【0061】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン）、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、またはリンパ球活性化ドメインに由来し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲ構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは当技術分野で知られている（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６；ＵＳ２０１３０２８７７４８；ＷＯ２０１５／１４２６７５；ＷＯ２０１４／０５５６５７；及びＷＯ２０１５／０９０２２９（参照により本明細書に援用される）を参照）。

【0062】

様々な腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが当技術分野で知られており、例えば、ＣＤ１７１特異性ＣＡＲ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００７）１５（４）：８２５－８３３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異性ＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３－１０５３）、ＥＧＦ－Ｒ特異性ＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１４）１０７（１）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋ特異性ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１－９５９）、ＦＲ－α特異性ＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６－６０１５）、ＨＥＲ２特異性ＣＡＲ（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８－１６９６；Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３－２１４３；Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９－１７８７；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０－８５３；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１０）１８（４）：８４３－８５１；Ｇｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡ特異性ＣＡＲ（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９－３１５９）、ＩＬ１３Ｒα２特異性ＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１８）：４０６２－４０７２）、ＧＤ２特異性ＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０－６０５６；Ｃａｒｕａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１５）２１（５）：５２４－５２９）、ＥｒｂＢ２特異性ＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９－１０７０）、ＶＥＧＦ－Ｒ特異性ＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６－４４７）、ＦＡＰ特異性ＣＡＲ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ（２０１４）２（２）：１５４－１６６）、ＭＳＬＮ特異性ＣＡＲ（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９－３０）、ＮＫＧ２Ｄ特異性ＣＡＲ（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１５）２３（１０）：１６００－１６１０）、ＣＤ１９－特異性ＣＡＲ（アキシカブタゲンシロルユーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））が知られている。また、８２／３３７ Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）（腫瘍特異的ＣＡＲの臨床試験を概説）も参照。

【0063】

本明細書で一般的に概説するように、ＴＩＬは、一般的には患者試料から採取され、患者に移植する前にその数を拡大するように操作される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、以下で説明するように遺伝子的に操作することができる。概して、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料から得られ（「初代ＴＩＬ」）、次いで、さらなる操作のためにより大きな集団に拡大され、任意選択で凍結保存及び再刺激され、任意選択でＴＩＬの健康状態の指標として表現型及び代謝パラメーターについて評価される。

【0064】

患者腫瘍試料は、当技術分野で知られている方法を用いて、概して外科的切除、針生検、または腫瘍及びＴＩＬ細胞の混合物を含む試料を得るための他の手段を介し、得ることができる。概して、腫瘍試料は、任意の固形腫瘍（原発性腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移を含む）に由来することができる。腫瘍細胞は任意のがんタイプとすることができ、これには膀胱癌、脳腫瘍、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、子宮頚癌、大腸癌、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、口唇及び口腔癌、頭頚部癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、多形膠芽腫、神経芽腫、肝臓癌、中皮腫、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌を含む）、皮膚癌（限定されるものではないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、非黒色腫皮膚癌、及び黒色腫を含む）、卵巣癌、ぶどう膜癌、子宮体癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、ならびに甲状腺癌が含まれる。いくつかの実施形態において、有用なＴＩＬは悪性黒色腫腫瘍から得られる。これは、この腫瘍がとりわけ高レベルのＴＩＬを有することが報告されているためである。原発性肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む）、膀胱癌、子宮頚癌、黒色腫腫瘍、またはその転移を使用して、ＴＩＬを得ることができる。

【0065】

ひとたび得た腫瘍試料は、概して鋭利な剥離を用いてフラグメント化して約１～約８ｍｍ^３または約０．５～約４ｍｍ^３の小片にする（約２～３ｍｍ^３が特に有用である）。ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物を用いてこれらのフラグメントから培養される。このような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＲＰＭＩ）１６４０バッファー、２ｍＭグルタミン酸、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、３０単位／ｍｌのＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ）中でインキュベートし、次に機械的分離（例えば、組織分離器を使用）を行うことにより、生成することができる。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離し、次に５％ ＣＯ_２中で、３７℃で３０分間インキュベートし、次に上記の条件下で、小さな組織片しか存在しなくなるまで機械的分離及びインキュベートのサイクルを繰り返すことにより、生成することができる。このプロセスの最後に、細胞浮遊液中に多数の赤血球または死細胞が含まれる場合は、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を実施してこれらの細胞を除去することができる。当技術分野で知られている代替方法（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（この開示内容は参照により全体として本明細書に援用される））を使用してもよい。前述の方法はいずれも、ＴＩＬを拡大する方法またはがんを治療する方法のための本明細書に記載の任意の実施形態に使用することができる。

【0066】

概して、採取した細胞浮遊液は「初代細胞集団」または「採取直後の」細胞集団と呼ばれる。いくつかの実施形態において、フラグメント化は物理的フラグメント化（例えば、切離及び消化）を含む。いくつかの実施形態において、フラグメント化は物理的フラグメント化である。いくつかの実施形態において、フラグメント化は切離である。いくつかの実施形態において、フラグメント化は消化による。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、患者から得られる酵素的腫瘍消化物及び腫瘍フラグメントから最初に培養することができる。

【0067】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から得られる。いくつかの実施形態において、腫瘍消化物は、機械的に分離した腫瘍を酵素培地（例えば、限定されるものではないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ）中でインキュベートし、次に機械的に分離する（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）ことによって作製される。いくつかの実施形態において、機械的に分離した腫瘍はおよそ１ｍｍ^３のフラグメントに分割される。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離することができる。次いで溶液を５％ ＣＯ_２中３７℃で３０分間インキュベートし、次いで再び機械的破壊をおよそ１分間行うことができる。再び５％ ＣＯ_２中、３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍に３回目の機械的破壊をおよそ１分間行うことができる。いくつかの実施形態において、３回目の機械的分離後に、大きな組織片が存在する場合、さらに１回または２回の機械的分離を試料に適用することができ、５％ ＣＯ_２中、３７℃で３０分間のインキュベートを伴っても伴わなくてもよい。いくつかの実施形態において、最終インキュベートの終わりに、細胞浮遊液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、ＦＩＣＯＬＬを用いた密度勾配分離を実施してこれらの細胞を除去することができる。

【0068】

いくつかの実施形態において、細胞は、試料採取後、任意選択で凍結または凍結保存し、拡大段階に入る前に凍結保存することができる。

【0069】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最初の腫瘍のフラグメント化または解離から最大で合計９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは合計９～２５日間、９～２１日間、または９～１４日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計９日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１０日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１１日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１２日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１３日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１４日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１５日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１６日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１７日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１８日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計１９日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２０日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２１日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２２日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２３日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２４日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２５日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２６日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２７日間拡大される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、最大で合計２８日間拡大される。

【0070】

いくつかの実施形態において、拡大されたＴＩＬは、多数の表現型マーカー（本明細書に記載ものを含む）の発現について分析される。いくつかの実施形態において、マーカーはＴＣＲα／β、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲから選択される。いくつかの実施形態において、１つ以上の調節マーカー、すなわち、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４の群からの１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。

【0071】

いくつかの実施形態において、メモリーマーカーはＣＣＲ７またはＣＤ６２Ｌである。諸実施形態において、再刺激されたＴＩＬは、サイトカイン放出アッセイを用いてサイトカイン放出について評価される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３または自己腫瘍消化物との共培養のいずれかによる刺激に応答して、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の分泌について評価される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３または自己腫瘍消化物との共培養のいずれかによる刺激に応答して、ＩＬ－６分泌について評価される。測定され得る追加のエフェクターサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）が挙げられる。ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＸＣＬ１などのケモカインも評価されることがある。

【0072】

ＴＩＬは様々な調節マーカー（例えば、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１２２）について評価される。

【0073】

不死化細胞
不死化細胞とは、無限に増殖するように操作されており、そのため長期間にわたって培養することができる細胞のことである。典型的には、不死化細胞株は、継続的な分裂を可能にする染色体異常または変異を有する様々な供給源（例えば、腫瘍）から得られる。したがって、不死化細胞は「操作されている」とみなされる。不死化細胞集団は、異種の集団であってもよく、（クローン集団を形成するために）単一の不死化クローンに由来してもよい。いくつかの実施形態において、不死化細胞は異種の不死化細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞は不死化細胞のクローン集団を含む。

【0074】

不死化細胞は、様々な種及び／または起源に由来することができる。例えば、不死化細胞は、不死化動物細胞もしくは不死化ヒト細胞、またはこれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、不死化細胞は不死化ヒト細胞である。

【0075】

いくつかの実施形態において、不死化細胞はがん細胞である。例えば、がん細胞としては、限定されるものではないが、黒色腫細胞、大腸癌細胞、胆管癌細胞、及び乳がん細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、がん細胞は、黒色腫細胞、大腸癌細胞、胆管癌細胞、及び乳癌細胞から選択される。

【0076】

本明細書に記載のＴＩＬ効力アッセイに使用するために操作され得る不死化細胞としては、限定されるものではないが、Ａ３７５黒色腫細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６１９（商標））、Ｋ５６２多分化能造血悪性細胞、初代細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３）、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標））が挙げられる。いくつかの実施形態において、不死化細胞はＡ３７５細胞、Ｋ５６２細胞、初代細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びＣＨＯ細胞から選択される。本明細書に記載のアッセイ及び方法に有用な不死化細胞は、前述の例に限定されないことを理解されたい。他の不死化細胞株も当技術分野で知られており、本開示に従って使用することができる。

【0077】

Ｔ細胞応答を抑制する免疫抑制マーカー（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）を発現する細胞株を使用して、ＴＩＬが抑制シグナルに抵抗性であるかどうかを試験することも、本明細書では企図されている。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ効力アッセイに使用するために操作され得る不死化細胞は、Ｔ細胞応答を抑制する免疫抑制マーカー（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を発現する細胞株を含む。

【0078】

Ｔ細胞応答を増強する共刺激マーカーを発現する細胞株（例えば、ＣＤ８０／８６、ＯＸ４０Ｌ、及び／または４１ＢＢＬ）も、ＴＩＬ効力アッセイに使用するために操作することができる。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ効力アッセイのために操作され得る不死化細胞は、Ｔ細胞応答を増強するための共刺激マーカー（例えば、ＣＤ８０／８６）を発現することができる細胞株を含む。

【0079】

「腫瘍細胞」または「がん細胞」という表現は、制御なしに分裂し、固形腫瘍を形成したり、血液を異常な細胞であふれさせたりする細胞を指す。健康な細胞は、これ以上の娘細胞の必要がなくなると分裂を停止するが、腫瘍細胞またはがん細胞は引き続きコピーを生成する。またこれらの細胞は、転移として知られるプロセスで、身体のある部位から別の部位に広がることができる。腫瘍細胞は、複数のがんタイプから単離することができ、これには膀胱癌、脳腫瘍、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、子宮頚癌、大腸癌、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、口唇及び口腔癌、頭頚部癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、多形膠芽腫、神経芽腫、肝臓癌、中皮腫、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌を含む）、皮膚癌（限定されるものではないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、非黒色腫皮膚癌、及び黒色腫を含む）、卵巣癌、ぶどう膜癌、子宮体癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、ならびに甲状腺癌が含まれる。いくつかの実施形態において、がん細胞はリンパ腫からも単離される。腫瘍細胞は、原発性腫瘍及び転移から単離することができる。

【0080】

不死化細胞は、ＴＩＬとの共培養の関係で終始記述されているが、不死化細胞は、Ｔ細胞を活性化する（例えば、Ｔ細胞抗原に結合する）分子を発現する、または発現するように操作されている任意の腫瘍細胞（例えば、がん細胞）と置き換えてもよいことを理解されたい。

【0081】

リンパ球を活性化する分子
本開示の操作不死化細胞は、Ｔ細胞を活性化する分子を含むまたは発現することができる。

【0082】

「リンパ球を活性化する分子」及び「Ｔ細胞を活性化する分子」とは、細胞を活性化状態にする非内在性の刺激を指す。内在性のプロセスにおいて、例えばＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子にペプチド抗原を提示されると、活性化状態になる。ひとたび活性化されると、Ｔ細胞は急速に分裂し、免疫応答を調節または補助するサイトカインを分泌する。内在性Ｔ細胞の活性化プロセスは、少なくとも（ａ）ＣＤ３を伴うＴＣＲ複合体の活性化と、（ｂ）ＡＰＣ表面のタンパク質によるＣＤ２８または４－１ＢＢの共刺激とを伴う。当技術分野では、ＣＤ３、ＣＤ２８、または４－１ＢＢアゴニスト（例えば、抗体）によるＴ細胞の刺激により、Ｔ細胞の内在性活性化をシミュレートできることが知られている。このように、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／または４－１ＢＢはともにＴ細胞を活性化することができる。

【0083】

活性化Ｔ細胞は数を増加させ、または増殖し、免疫応答を高めるためにサイトカイン（活性化ＴＩＬ）の産生を開始する。

【0084】

不死化細胞は、Ｔ細胞抗原に結合する（例えば、直接結合する）ことによりＴ細胞を活性化する分子を含む及び／または発現することができる。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ（例えば、操作ＴＩＬ及び／または編集ＴＩＬ）はＴ細胞抗原を発現する。Ｔ細胞抗原の非限定的な例としてはＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４、ＣＤ８が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞抗原はＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞抗原はＣＤ２である。

【0085】

「ＣＤ３」という用語は、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方の活性化を助けるＣＤ３（分化抗原群３）Ｔ細胞共受容体を指す。ＣＤ３は、６つの異なるポリペプチド鎖（２つのＣＤ３ゼータ鎖、２つのＣＤ３イプシロン鎖、１つのＣＤ３ｅガンマ鎖、及び１つのＣＤ３デルタ鎖）から構成されるタンパク質複合体である。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖（またはガンマ鎖及びデルタ鎖）と会合して、Ｔリンパ球内で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖（またはガンマ鎖及びデルタ鎖）ならびにＣＤ３分子は、ともにＴＣＲ複合体を構成する。ヒトＣＤ３Ｅ遺伝子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ ９１６により特定される。ヒトＣＤ３Ｅ遺伝子の例示的な塩基配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７３８３．１である。

【0086】

「ＣＤ２８」という用語は分化抗原群２８を指し、これはＴ細胞上に発現し、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要とされる共刺激シグナルを提供するタンパク質の１つである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を通じてのＴ細胞刺激により、様々なサイトカイン（例えば、インターロイキン）産生のための強力なシグナルがもたらされ得る。ＣＤ２８は、ＣＤ８０及びＣＤ８６タンパク質の受容体である。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化されると、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内でＣＤ８０発現が上方調節される。ヒトＣＤ２８遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ ９４０により特定される。ヒトＣＤ２８遺伝子の例示的な塩基配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２９６１８．１である。例示的なヒトＣＤ２８ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１９）である。

【0087】

「ＣＤ２」という用語は分化抗原群２（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２）を指し、これは、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に見られる細胞接着分子である。ＣＤ２は、他の接着分子と相互作用してＴ細胞及びＮＫ細胞の共刺激分子として機能する。ヒトＣＤ２遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ ９１４により特定される。ヒトＣＤ２遺伝子の例示的な塩基配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０５０９０８．１である。例示的なヒトＣＤ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ＭＳＦＰＣＫＦＶＡＳＦＬＬＩＦＮＶＳＳＫＧＡＶＳＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲＶＳＫＰＫＩＳＷＴＣＩＮＴＴＬＴＣＥＶＭＮＧＴＤＰＥＬＮＬＹＱＤＧＫＨＬＫＬＳＱＲＶＩＴＨＫＷＴＴＳＬＳＡＫＦＫＣＴＡＧＮＫＶＳＫＥＳＳＶＥＰＶＳＣＰＥＫＧＬＤＩＹＬＩＩＧＩＣＧＧＧＳＬＬＭＶＦＶＡＬＬＶＦＹＩＴＫＲＫＫＱＲＳＲＲＮＤＥＥＬＥＴＲＡＨＲＶＡＴＥＥＲＧＲＫＰＨＱＩＰＡＳＴＰＱＮＰＡＴＳＱＨＰＰＰＰＰＧＨＲＳＱＡＰＳＨＲＰＰＰＰＧＨＲＶＱＨＱＰＱＫＲＰＰＡＰＳＧＴＱＶＨＱＱＫＧＰＰＬＰＲＰＲＶＱＰＫＰＰＨＧＡＡＥＮＳＬＳＰＳＳＮ（配列番号２０）である。

【0088】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は、Ｔ細胞抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）ことによりＴ細胞を活性化する分子を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞はＣＤ３抗原に結合することによりＴ細胞を活性化する分子を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞はＣＤ２８抗原に結合することによりＴ細胞を活性化する分子を含む。いくつかの実施形態において、不死化細胞はＣＤ２抗原に結合することによりＴ細胞を活性化する分子を含む。

【0089】

「特異的に結合する」という表現は、分子（例えば、抗体）が、特定の抗原（例えば、Ｔ細胞抗原）と、当該複合体が会合する上で親和性がより低い他の抗原に比べて高い特異性で相互作用することを指す。特異的結合相互作用は、イオン結合、水素結合、または他のタイプの化学的もしくは物理的結合によって媒介され得る。いくつかの実施形態において、分子は、タンパク質及び／または高分子の複雑な混合物中で標的抗原を認識すると、特定の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子はおよそ１０^－５Ｍ未満、例えば、約１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、またはさらにそれより低い親和性（ＫＤ）でＴ細胞抗原に結合する。

【0090】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子はＴ細胞アゴニストである。「アゴニスト」という用語は、細胞表面にまたは可溶性形態で標的に結合する化学物質、分子、巨大分子、分子の複合体、または巨大分子の複合体を指す。ある特定の実施形態において、アゴニストが細胞表面の標的に結合すると、アゴニストは標的を活性化して生物学的応答をもたらす。アゴニストとしては、ホルモン、神経伝達物質、抗体、及び抗体のフラグメントが挙げられる。

【0091】

Ｔ細胞を活性化する分子の非限定的な例としては、限定されるものではないが、抗体（例えば、全抗体及び／または抗体フラグメント）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）バインダー、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）バインダー、ならびに他の分子バインダー（例えば、リガンド及び受容体）が挙げられる。

【0092】

「抗体」という用語は、概して４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子のエピトープ結合機能を保持するその機能的フラグメント、変異体、バリアント、もしくは誘導体を指す。このようなフラグメント、変異体、バリアント、または誘導体抗体形式は当技術分野で知られている。完全長抗体の１つの実施形態において、各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖可変領域（ドメイン）は、本開示ではＶＤＨとも呼ばれる。ＣＨは、３つのドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＣＬは単一のＣＬドメインから構成される。軽鎖可変領域（ドメイン）は、本開示ではＶＤＬとも呼ばれる。ＶＨ及びＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分割することができ、この領域の間に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が分散して存在する。概して、各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４に並んでいる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。

【0093】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は抗体フラグメントである分子を発現する。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦｖフラグメントから選択される。

【0094】

アゴニストまたは抗体に関連して使用される「フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持するアゴニストまたは抗体のフラグメントを指す。抗体のフラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、合成リンカーによって連結することができる。この合成リンカーにより、これらのドメインは、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（別名単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））として作製することが可能になる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるように意図されている。他の形態の単鎖抗体（例えば、ダイアボディ）も包含される。さらに、単鎖抗体には、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「線状抗体」も含まれ、これらは相補的な軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する。

【0095】

「ＫＤ」という用語は、特定のアゴニスト－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本明細書に記載のアゴニストは、例えば、アゴニストをリガンド、標的を分析物として用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて定量した場合に、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤ（約１×１０^－９Ｍまたは１×１０^－１０Ｍ）よりも高い解離平衡定数（ＫＤ）で標的に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアゴニスト（例えば、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアント）は、５×１０^－１０Ｍより高いＫＤに対応する親和性で標的タンパク質（例えば、ＣＤ３）に結合する。

【0096】

「ｋｏｆｆ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定のアゴニスト－抗原相互作用の解離速度定数を指す。当該値はｋｄ値とも称される。

【0097】

「ｋｏｎ」（Ｍ－１×ｓｅｃ－１）という用語は、特定のアゴニスト－抗原相互作用の会合速度定数を指す。

【0098】

「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定のアゴニスト－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。

【0099】

「ＫＡ」（Ｍ^－１）という用語は、特定のアゴニスト－抗原相互作用の会合平衡定数を指し、ｋｏｎをｋｏｆｆで割ることによって得られる。

【0100】

「抗ＣＤ２８抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント（例えば、モノクローナル抗体）を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体内のＣＤ２８受容体に向けられるヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体を含む。

【0101】

「抗ＣＤ２抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント（例えば、モノクローナル抗体）を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体内のＣＤ２受容体に向けられるヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体を含む。

【0102】

「抗ＣＤ３抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント（例えば、モノクローナル抗体）を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体内のＣＤ３受容体に向けられるヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体を含む（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１８６６１３Ａ１号（参照により本明細書に援用される）を参照）。抗ＣＤ３抗体にはＯＫＴ３（別名ムロモナブ）が含まれる。また、抗ＣＤ３抗体にはＵＣＨＴ１クローン（別名Ｔ３及びＣＤ３ｃ）も含まれる。他の抗ＣＤ３抗体としては、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが挙げられる。
ムロモナブ－ＣＤ３軽鎖
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＡＤＴＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号１７）
ムロモナブ－ＣＤ３重鎖
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＧＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１８）

【0103】

「ＯＫＴ３」という用語は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）により生産された抗ＣＤ３抗体、またはそのバイオシミラーもしくはバリアント（例えば、ヒト化、キメラ、または親和性成熟バリアント）を指す。ＯＫＴ３を産生可能なハイブリドーマはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで入手可能であり、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ３を産生可能なハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で入手可能であり、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。

【0104】

いくつかの実施形態において、抗体フラグメントはＯＫＴ３抗体（例えば、ＯＫＴ３抗体フラグメント）である。いくつかの実施形態において、ＯＫＴ３抗体フラグメントは膜結合型ＯＫＴ３（ｍＯＫＴ３）ｓｃＦｖフラグメントである。

【0105】

膜貫通ドメインを利用して、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖを不死化細胞の細胞表面に固定することができる。例えば、ヒトＣＤ８膜貫通ドメインを利用して、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖを不死化細胞の細胞表面に固定することができる。本明細書では、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖを不死化細胞の細胞表面に固定するために、例えばマウス（ｐＫＳＱ３６６）のような他の種由来のＣＤ８膜貫通ドメイン、またはＣＤ１４もしくはＣＤ２８のような他の膜貫通タンパク質を使用することも企図される。いくつかの実施形態において、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖは、不死化細胞の細胞表面に繋留されて発現する。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ８膜貫通ドメインを利用して、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖを不死化細胞の細胞表面に固定する。

【0106】

多くのＴ細胞は、ｍＯＫＴ３の非常に強力な刺激に応答する。親和性がより低いＴ細胞受容体結合を使用することにより、細胞間のばらつきに起因するＴ細胞受容体シグナル伝達閾値のわずかな違いを分離することができ、また患者に注入する前のＴ細胞療法製品に対し、より高い感受性で品質を判定することができる。ｍＯＫＴ３フラグメントの低親和性バリアントを、部位変異誘発を介し、天然Ｔ細胞受容体の認識抗原に対する親和性をより緊密にモデル化するように作製することができる。天然Ｔ細胞受容体の公表された親和性はμＭ ＫＤの範囲内にある。

【0107】

いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントが使用される。いくつかの実施形態において、分子は、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤでＣＤ３に結合し、ここで、ｍＯＫＴ ｓｃＦｖのＫＤは、約１×１０^－９～約１×１０^－１１、例えば、約５×１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＹ５７の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５及びＹ５７の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｍ及びＹ５７Ａの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対しＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔの変異を有するアミノ酸配列を含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、約１×１０^－６～約５×１０^－８の解離定数（ＫＤ）でＣＤ３に結合する。例えば、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントはＣＤ３に約１×１０^－６、１×１０^－７、または１×１０^－８のＫＤで結合する。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントはＣＤ３に約５×１０^－７のＫＤで結合する。

【0109】

いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントはＣＤ３に、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖのＫＤより少なくとも１０倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも３０倍低い、少なくとも４０倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも６０倍低い、少なくとも７０倍低い、少なくとも８０倍低い、少なくとも９０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１１０倍低い、少なくとも１２０倍低い、少なくとも１３０倍低い、少なくとも１４０倍低い、少なくとも１５０倍低い、少なくとも１６０倍低い、少なくとも１７０倍低い、少なくとも１８０倍低い、少なくとも１９０倍低い、少なくとも２００倍低い、少なくとも２１０倍低い、少なくとも２２０倍低い、少なくとも２３０倍低い、少なくとも２４０倍低い、少なくとも２５０倍低い、少なくとも２７５倍低い、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１１００倍、少なくとも１２００倍低いＫＤで結合する。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも２５０倍低いＫＤでＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、低親和性ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖバリアントは、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤよりも少なくとも１０００倍低いＫＤでＣＤ３に結合する。

【0110】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子は膜繋留分子である。他の分子、例えば、Ｔ細胞受容体ＣＤ３に結合しこれをクラスター化してＴ細胞を活性化する細菌性スーパー抗原（例えば、ＳＥＢ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は、不死化細胞の細胞表面に繋留したｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖと同様に働くことが企図されている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）である。Ｔ細胞受容体／ＣＤ３成分に結合する他のモノクローナル抗体ｓｃＦｖフラグメント、例えば、抗ＣＤ３抗体クローンＢＣ３も、不死化細胞の細胞表面に繋留したｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖと同様に働くことが企図されている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子は抗ＣＤ３抗体クローンＢＣ３である。

【0111】

いくつかの実施形態において、不死化細胞はＦｃ受容体を発現する。このような実施形態において、Ｆｃ受容体及びＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）の両方に結合するモノクローナル抗ＣＤ３抗体などの抗体を使用して、ＴＩＬの効力を評価することができる。

【0112】

他の実施形態において、Ｔ細胞を活性化する分子は不死化細胞では発現しない。むしろ、この分子は不死化細胞にもＴ細胞にも結合できる二重特異性分子であり得る。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（例えば、ブリナツモマブ）は、不死化細胞によって発現するＣＤ１９と、Ｔ細胞によって発現するＣＤ３とに結合する分子の１つの非限定的な例である。

【0113】

共培養条件
本明細書で提供される方法は、いくつかの態様において、リンパ球（例えば、ＴＩＬ）及び不死化細胞を共培養することを含む。

【0114】

不死化細胞は、二次元単層細胞としても、多層三次元スフェロイドとしても培養することができる。スフェロイドとは、平坦な表面への接着が妨げられる環境下で形成する、自己組織化する多細胞凝集体のことである。

【0115】

二次元培養とは、細胞が単層として、例えば、接着表面を有する培養フラスコ、皿、またはマルチウェルプレートで成長する接着培養のことである。比較として、三次元スフェロイド培養は、非接着性あるいは低接着性の培養系であり、細胞は多層スフェロイドとして、例えば、非接着性プレート上、濃縮培地もしくはゲル様物質中、または足場上での浮遊培養下で成長する。

【0116】

いくつかの実施形態において、三次元系の不死化細胞が超低接着（ＵＬＡ）表面で培養される。超低接着表面とは、特異的及び非特異的な固定化を阻害する物質を含む表面のことであり、強制的に細胞を浮遊状態にして三次元スフェロイドの形成を可能にする。いくつかの実施形態において、超低接着表面は、親水性の中性荷電コーティングを含む。いくつかの実施形態において、親水性の中性荷電ヒドロゲルコーティングは表面に共有結合している。いくつかの実施形態において、表面はポリスチレンを含む。したがって、いくつかの実施形態において、超低接着表面は、親水性の中性荷電コーティングが共有結合しているポリスチレン表面である。当技術分野で知られているように、超低接着表面は、概して安定性、無細胞毒性、生物学的に不活性、及び非分解性である。

【0117】

いくつかの実施形態において、三次元系の不死化細胞が超低接着マルチウェルプレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で培養される。いくつかの実施形態において、マルチウェルプレート（例えば、マルチウェルポリスチレンプレート）の超低接着表面は、親水性の中性荷電共有結合ヒドロゲル層である。様々なマルチウェル形式が利用可能であり、例えば、６、２４、または９６ウェル形式が利用可能である。

【0118】

以下に示す培養条件は、二次元共培養にも三次元共培養にも使用することができる。

【0119】

いくつかの実施形態において、不死化細胞の共培養物は２５，０００～２００，０００個の不死化細胞を含む。例えば、不死化細胞の共培養物は５０，０００～１００，０００個の不死化細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、不死化細胞の共培養物は２５０００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、または１００００個の不死化細胞を含む。

【0120】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は、例えば、培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））（血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））及び抗生物質（例えば、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を含む）が入ったマルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）にプレーティングされる。

【0121】

いくつかの実施形態において、不死化細胞は、ＴＩＬを加える前に、（例えば、ＵＬＡ表面を有するマルチウェルプレート内で、または接着マルチウェルプレート内で）培地中で約４８時間～約９６時間（例えば、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、または約９６時間）培養して三次元スフェロイドを形成する。

【0122】

例えば、ＴＩＬ（例えば、プレＲＥＰ ＴＩＬ）を作製するために、共培養の前に、いくつかの実施形態において、腫瘍消化試料（例えば、黒色腫腫瘍消化試料）が解凍され、ＩＬ－２の存在下でＲＥＰ前培地にプレーティング（例えば、１．５ｅ６細胞／ｍＬ）される。ＩＬ－２の再プレーティング及びフィーディングは、いくつかの実施形態では、例えば、２日後に成長が１．５倍未満に鈍化するまで、１～３日ごとに繰り返される。

【0123】

共培養開始の前日に、いくつかの実施形態では、プレＲＥＰ ＴＩＬが解凍され、ＲＥＰ培地（例えば、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ－Ｖ、５％ヒトＡＢ血清、及びＩＬ－２）中で一晩静置される。

【0124】

いくつかの実施形態において、汎Ｔ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され、不死化細胞と共培養される。

【0125】

いくつかの実施形態において、共培養は、２：１のエフェクター（Ｔ細胞）：標的（不死化細胞）比（Ｅ：Ｔと略記される）で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は１：１のＥ：Ｔ比で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は１：２のＥ：Ｔ比で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は３：１、２：１、または１：１のＥ：Ｔ比で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は５：１のＥ：Ｔ比で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は１０：１のＥ：Ｔ比で実施される。いくつかの実施形態において、共培養は２０：１のＥ：Ｔ比で実施される。

【0126】

共培養の期間は様々であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ及び不死化細胞は少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間共培養される。例えば、ＴＩＬ及び不死化細胞は２～７２時間、２～４８時間、２～３６時間、２～２４時間、２～１２時間、４～７２時間、４～４８時間、４～３６時間、４～２４時間、４～１２時間、１２～７２時間、８～７２時間、８～４８時間、８～３６時間、８～２４時間、８～１２時間、１２～７２時間、１２～４８時間、１２～３６時間、１２～２４時間、２４～７２時間、２４～４８時間、または２４～３６時間共培養され得る。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ及び不死化細胞は約２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間共培養される。いくつかの実施形態において、ＴＩＬ及び不死化細胞は少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３６時間、または少なくとも７２時間共培養される。

【0127】

いくつかの実施形態において、ＴＩＬ及び不死化細胞の共培養物は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、またはこれらの組合せを、例えば、約５，０００Ｕ／ｍｌ～約８，０００Ｕ／ｍｌ（例えば、５，０００Ｕ／ｍｌ、５，５００Ｕ／ｍｌ、６，０００Ｕ／ｍｌ、６，５００Ｕ／ｍｌ、７，０００Ｕ／ｍｌ、７，５００Ｕ／ｍｌ、または８，０００Ｕ／ｍｌ）の最終濃度で含む。

【0128】

ＩＬ－２はインターロイキンであり、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の１つのタイプである。これは、免疫に関与する白血球（白血球、多くの場合リンパ球）の活動を調節する１５．５～１６ｋＤａのタンパク質である。ＩＬ－２は、微生物感染に対する身体の自然応答の一部である。ＩＬ－２は、リンパ球により発現するＩＬ－２受容体に結合することにより、その作用を媒介する。ＩＬ－２の主な供給源は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0129】

ＩＬ－２は、主にＴ細胞に対するその直接的な作用を介して、免疫系の重要な機能である寛容及び免疫において不可欠な役割を有する。Ｔ細胞が成熟する胸腺内では、ある特定の未熟Ｔ細胞が調節性Ｔ細胞（体内の正常な健康細胞を攻撃するように別段に刺激された他のＴ細胞を抑制する）に分化するように促進することにより、自己免疫疾患が防止される。ＩＬ－２は活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）を促進する。また、ＩＬ－２は、Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞に分化し、また最初のＴ細胞が抗原による刺激も受けた場合にはメモリーＴ細胞に分化するように促進して、身体が感染症を撃退するのを助ける。ＩＬ－２は、他の極性化サイトカインとともに、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１及びＴｈ２リンパ球に分化するように刺激し、その一方でＴｈ１７及び濾胞性Ｔｈリンパ球に分化するのを妨害する。その発現及び分泌は緊密に調節されており、免疫応答の増幅及び減衰における一過性の正及び負の両方のフィードバックループの一部として機能する。ＩＬ－２は、Ｔ細胞免疫学的記憶（抗原選択されたＴ細胞クローンの数及び機能の拡大に依存）の発生における役割を通じて、細胞媒介性免疫を持続させる役割を担う。

【0130】

ＩＬ－１５は、ヒトにおいて染色体４ｑ３１の３４ｋｂ領域によりコードされる１４～１５ｋＤａの糖タンパク質である。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と構造的に類似するサイトカインである。ＩＬ－２のように、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）及び共通のガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、それを通じてシグナルを伝達する。ＩＬ－１５は、多くの細胞種及び組織（単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、及び神経細胞を含む）によって構成的に発現する。ＩＬ－１５は、多面発現性サイトカインとして、自然免疫及び適応免疫において重要な役割を果たしている。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖を調節する。抗原の不在下でメモリーＴ細胞を維持する生存シグナルは、ＩＬ－１５によってもたらされる。このサイトカインはＮＫ細胞の発生にも関与する。

【0131】

リンパ球抗腫瘍効力の評価
リンパ球（例えば、ＴＩＬ）及び不死化細胞の共培養後、リンパ球の抗腫瘍効力は、例えば、脱顆粒（例えば、ＣＤ１０７ａ発現）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ－γ）、及び／または細胞死、及び／または一定期間にわたる不死化細胞の生存率を測定することによって評価することができる。例えば、効力を評価するための期間は１２～７２時間とすることができる。いくつかの実施形態において、リンパ球（例えば、ＴＩＬ）の抗腫瘍効力は１２～４８時間、１２～３６時間、１２～２４時間、２４～７２時間、２４～４８時間、または２４～３６時間評価される。いくつかの実施形態において、リンパ球（例えば、ＴＩＬ）の抗腫瘍効力は１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間評価される。いくつかの実施形態において、リンパ球（例えば、ＴＩＬ）の抗腫瘍効力は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３６時間、または少なくとも７２時間評価される。

【0132】

脱顆粒を測定するための方法としては、限定されるものではないが、ＣＤ１０７ａまたはＣＤ１０７ｂなどのリソソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）の細胞表面染色、フローサイトメトリー表示測定値の使用が挙げられる。ＬＡＭＰは細胞溶解顆粒の脂質二重層に見出され、ＴＩＬによる殺滅の媒介のために放出されると、ＴＩＬの表面と融合して、脱顆粒及び直接的な細胞毒性のマーカーとして機能する。

【0133】

サイトカイン産物を測定するための方法としては、限定されるものではないが、ＴＩＬを含むｍＯＫＴ３－Ａ３７５細胞株の共培養後の細胞培養上清のＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、もしくはＭＳＤアッセイ、またはｍＯＴＫ３－Ａ３７５共培養後のＴＩＬにおけるサイトカイン転写物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析が挙げられる。

【0134】

効力を評価するために細胞死及び／または生存率を測定するための方法としては、限定されるものではないが、リアルタイム細胞生存率アッセイ、ＡＴＰ細胞生存率アッセイ、生細胞プロテアーゼ生存率アッセイ、テトラゾリウム還元細胞生存率アッセイ、レサズリン還元細胞生存率アッセイ、死細胞プロテアーゼ放出細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出細胞毒性アッセイ、及びＤＮＡ色素細胞毒性アッセイが挙げられる。当技術分野で知られている、細胞の健康状態、細胞死、及び／または細胞生存率を測定するための他のアッセイも本明細書で企図されている。このようなアッセイの非限定的な例を以下に示す。

【0135】

細胞生存率アッセイでは、代謝的に活性な（生きている）細胞の指標として様々なマーカーを使用する。一般的に使用されるマーカーの例としては、ＡＴＰレベルの測定、基質還元能力の測定、及び生細胞に特有の酵素／プロテアーゼ活性の検出が挙げられる。

【0136】

ＲｅａｌＴｉｍｅ－Ｇｌｏ（商標）ＭＴ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ９７１１）はリアルタイムで細胞生存率を測定する。このアッセイでは、操作ルシフェラーゼ及びプロ基質（ルシフェラーゼの基質ではない）を直接培養基に加える。プロ基質は、細胞膜を透過し細胞内に進入することができる。ただし、代謝が活発な生細胞のみが、プロ基質をルシフェラーゼの基質に還元することができる。次いで基質は細胞から出て、検出試薬中のルシフェラーゼにより、発光シグナルの生成に使用される。同じウェルを３日間繰り返し測定することができる。この方法の主な利点は、少ないプレート及び細胞を用いて、用量応答を定量するための動態モニタリングが簡便にできる点である。また、この方法は細胞溶解が不要であるため、同じ細胞をさらなる細胞ベースアッセイまたは下流用途に使用することができる。

【0137】

生細胞のみがＡＴＰを合成できることから、ＡＴＰは細胞生存率の測定に使用することができる。ＡＴＰは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７５７０）を洗浄剤、安定化ルシフェラーゼ、及びルシフェリン基質を含む試薬とともに使用して測定することができる。洗浄剤は生存細胞を溶解し、ＡＴＰを培地中に放出する。ＡＴＰの存在下で、ルシフェラーゼはルシフェリンを使用して発光を生成し、ルミノメーターを用いて１０分以内にこれを検出することができる。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ９２４１）は単一の溶液として提供され、容易に実施できるように試薬調製時間が低減され、室温保存の利便性がもたらされる。これらのＡＴＰアッセイは、基質を着色した生成物に変換するのに長いインキュベート時間を必要としない。また、優れた感度及び幅広い直線性を有するため、少数の細胞が使用される高処理用途への適合性が高い。また、他の方法に比べてアーチファクトも生じにくい。

【0138】

生細胞プロテアーゼ活性は細胞死の後に急速に消失するため、生細胞の有用なマーカーである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（商標）細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ６０８０）を用いて、生細胞プロテアーゼ活性を、細胞透過性蛍光プロテアーゼ基質（ＧＦ－ＡＦＣ）を用いて測定することができる。基質は生細胞に入り、そこで生細胞プロテアーゼにより切断されて、生細胞の数に比例した蛍光シグナルを生成する。この方法におけるインキュベート時間は０．５～１時間で、これはテトラゾリウムアッセイ（１～４時間）より短い。この方法は細胞を溶解しないため、同じ試料ウェルで多くの他のアッセイ（生物発光レポーター細胞ベースアッセイを含む）と多重化することができる。

【0139】

生細胞の検出に使用されるテトラゾリウム化合物は、２つの基本的なカテゴリーに分類される。

【0140】

生細胞を容易に透過する正荷電化合物（ＭＴＴ）：
代謝が活発な生細胞は、ＭＴＴを紫色のホルマザン生成物に変換することができる。したがって、色形成は生細胞の有用なマーカーであり得る。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ４０００）はこの化学作用を使用する。ただし、この方法におけるインキュベート時間は長い（通常は４時間）。また、ホルマザン生成物は不溶性であるため、吸光度の表示値を記録する前に可溶化試薬を加えなければならない。

【0141】

細胞を透過しない負荷電化合物（ＭＴＳ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１）：
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ３５８２）を使用する場合、負荷電化合物は、中間電子カップリング試薬と結合しなければならない。それにより細胞に進入し、還元され、次いで細胞を出てテトラゾリウムを可溶性ホルマザン生成物に変換することができる。この方法におけるインキュベート時間は１～４時間である。得られたホルマザンは可溶性であるため可溶化試薬を加える必要がなく、便利なものとなる。

【0142】

レサズリンは、弱い内部蛍光を有する濃青色の細胞透過性指示色素である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ８０８０）は、レサズリンを使用して細胞生存率を測定する。代謝が活発な生存細胞のみが、レサズリンをピンク色で蛍光性のレゾルフィンに還元することができる。１～４時間のインキュベート後、マイクロプレート分光光度計または蛍光光度計を用いてシグナルを定量化する。この方法は比較的安価であり、テトラゾリウムアッセイよりも感受性が高い。ただし、検査中の化合物からの蛍光がレゾルフィンの表示値に干渉することがある。

【0143】

全てのテトラゾリウムまたはレザズリン還元アッセイの難点は、それらが経時的な着色または蛍光生成物の蓄積に依存することである。シグナルは経時的に徐々に増加するため、この長いインキュベート中の細胞生存率の減少は検出することができない。

【0144】

細胞が死滅し膜の完全性を喪失すると、死細胞プロテアーゼが放出される。次いで発光性基質（ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ９２９０）または蛍光発生基質（ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｆｌｕｏｒ（商標）細胞毒性アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ９２６０）を使用して死細胞プロテアーゼ活性を測定することができる。この基質は細胞を透過しないため、この基質からのシグナルは、インタクトな生細胞からは本質的に生成されない。さらに、このアッセイは非溶解性であるため、他の適合性のアッセイ化学作用と多重化することができる。

【0145】

膜の完全性を失った死細胞は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を放出する。これは乳酸からピルビン酸への変換を触媒し、同時にＮＡＤＨを産生する。放出されたＬＤＨ活性は、過剰な基質（乳酸及びＮＡＤ＋）を提供してＮＡＤＨを産生させることにより、測定することができる。このＮＡＤＨは、種々のアッセイ化学作用を用いて測定することができる。

【0146】

１．ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ：ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ（カタログ番号Ｊ２３８０）において、レダクターゼは、ＮＡＤＨ及びレダクターゼ基質（プロルシフェリン）を使用してルシフェリンを生成する。ルシフェリンは独自のルシフェラーゼを用いて測定し、光シグナルはルミノメーターにより測定されるＬＤＨの量に比例する。

【0147】

２． ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）均質膜完全性アッセイ：ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）均質膜完全性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７８９０）：レザズリンから蛍光性レゾルフィン生成物への変換（蛍光光度計を用いて測定）。

【0148】

３．ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ：ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ１７８０）は、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）から赤色ホルマザン生成物への変換を検出し、色吸光度により測定される。

【0149】

一部のＤＮＡ結合色素は生細胞から排除されるものの、透過性の死細胞のＤＮＡに進入し染色することができる。トリパンブルーのような従来の染料は、血球計を用いて手作業で染色細胞をカウントする必要がある場合が多く、手間がかかり容易にスケーラブルではない。従来の色素の別の難点は、細胞に毒性の場合があり、エンドポイント測定にしか使用できないことである。

【0150】

ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）緑色色素などの比較的新しい色素は、ＤＮＡに結合すると蛍光シグナルを生成し、これは蛍光光度計を用いて容易に測定される。この色素は培養基で希釈し、播種する際または試験化合物で処理する際に直接細胞に送達することができ、リアルタイムの動態測定が可能である。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）緑色細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ８７４１）は無毒で光安定性が高く、容易にスケーラブルである。

【0151】

本明細書で開示する全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用されている主題に関し、参照により本明細書に援用され、場合によってはそれが文書全体を包含することもある。

【0152】

明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。

【0153】

また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されるとは限らない。

【0154】

特許請求の範囲及び上記の明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」「～から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などは制限がないこと、すなわち後に続くものを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。

【0155】

数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。

【0156】

値の範囲が示される場合、範囲の上端から下端の間及び両端を含む各値は、本明細書において具体的に企図され記載されるものである。

【実施例】

【0157】

実施例１：汎用Ｔ細胞アゴニストタンパク質ｍＯＫＴ３及びその低親和性バリアントの作製
以下のアミノ酸配列を融合することにより、汎用Ｔ細胞アゴニスト（本明細書では膜ＯＫＴ３（ｍＯＫＴ３）またはｐＫＳＱ３６７と称される）を作製した。
マウスＩｇＧ重鎖由来シグナルペプチド：ＭＥＲＨＷＩＦＬＬＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳ（配列番号１）；
マウスモノクローナル抗ＣＤ３ｅ抗体クローンＯＫＴ３に由来するｓｃＦｖ：ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮ（配列番号２）；及び
ヒトＣＤ８に由来する膜貫通ドメイン：ＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶ（配列番号１２）

【0158】

ｍＯＫＴ３タンパク質をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを、ＥＦ１Ａプロモーターを含むレンチウイルスベクタープラスミド内でクローニングし、次にＴ２Ａ自己切断ペプチド（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１５））及びブラストサイジン耐性遺伝子（ＭＡＫＰＬＳＱＥＥＳＴＬＩＥＲＡＴＡＴＩＮＳＩＰＩＳＥＤＹＳＶＡＳＡＡＬＳＳＤＧＲＩＦＴＧＶＮＶＹＨＦＴＧＧＰＣＡＥＬＶＶＬＧＴＡＡＡＡＡＡＧＮＬＴＣＩＶＡＩＧＮＥＮＲＧＩＬＳＰＣＧＲＣＲＱＶＬＬＤＬＨＰＧＩＫＡＩＶＫＤＳＤＧＱＰＴＡＶＧＩＲＥＬＬＰＳＧＹＶＷＥＧ＊（配列番号１６））をクローニングした。ＥＦ１Ａプロモーターによって発現したＯＫＴ３－ＣＤ８タンパク質を含む最終コンストラクトは、本明細書ではｐＫＳＱ３６７とも称される。

【0159】

ｍＯＫＴ３タンパク質の低親和性バリアントを、ｐＫＳＱ３６７レンチウイルスコンストラクトの部位特異的変異誘発により構築した。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００７９３に記載されているように、ｓｃＦｖのＲ５５位及びＹ５７位をそれぞれＲ５５Ｍ及びＹ５７Ａに（別名ｍＯＫＴ３ｍａ／ｐＫＳＱ３９７）、またはそれぞれＲ５５Ｌ及びＹ５７Ｔに（別名ｍＯＫＴ３ｌｔ／ｐＫＳＱ３９８）に変異させた。これらのｓｃＦｖバリアントの公表されている親和性は、親ＯＫＴ３クローン（公表されている親和性のＫＤ：５×１０^－１０Ｍ（Ｌａｗ ｅｔ ａｌ、Ｒｅｉｎｈｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．））よりも２５０倍低い（ＯＫＴ３ｍａ）または１０００倍低い（ＯＫＴ３ｌｔ）。ｍＯＫＴ３の低親和性バリアントは、天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とその認識抗原との親和性（公表されている親和性はμＭ ＫＤの範囲）に対しより密接にモデル化されている。多くのＴ細胞は非常に強力なｍＯＫＴ３の刺激に応答し、一方で低親和性ＴＣＲ結合により、細胞ごとにＴＣＲシグナル伝達閾値のわずかな違いを分離することができ、患者に注入する前に、Ｔ細胞治療製品間の品質をより高い感受性で判定することが可能となり得る。

【0160】

２９３Ｔ細胞にｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ及びｐｓＰａｘ２レンチウイルスパッケージングプラスミドを同時形質移入することにより、レンチウイルスコンストラクトをパッケージングした。ウイルス上清をＡ３７５細胞に移し、形質導入から４８時間後に培地をブラスチジンを含む培地に切り替えて、首尾よく形質導入したｍＯＫＴ３コンストラクトを有する細胞を選択した。首尾よく形質導入した選択Ａ３７５細胞をＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７と称する（Ａ３７５－ｍＯＫＴ３とも称する）。

【0161】

実施例２：ｍＯＫＴ３－Ａ３７５細胞の作製及び当該細胞がＴ細胞を活性化することの実証。

【0162】

ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び抗生物質が入った９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０，０００個または１００，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞をプレーティングした。汎Ｔ細胞を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、先にプレーティングしたＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７と共培養した。共培養を２：１のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔと略記する）で実施した。先にプレーティングしたＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７から培地を除去し、ＩＬ－２を含む造血無血清培地中の１００，０００個または２００，０００個のＴ細胞を、それぞれ５０，０００個または１００，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７を含むウェルに加えた。上清をプレートから除去し、細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ６９抗体で染色した。フローサイトメトリーを実施し、ＣＤ６９発現を測定した。ＣＤ６９活性化が全ての形質導入試料で観察された（図１）。

【0163】

ｍＯＫＴ３の表面発現を検証するため、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞を細胞染色バッファー中でヤギ血清とインキュベートし、その後に細胞を細胞染色バッファーで洗浄し、次いで１：１００ヤギ－抗マウス抗体とインキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを実施して発現を評価した。ＯＫＴ３発現が、形質導入細胞の９９．２％で観察された（図２）。

【0164】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるｍＯＫＴ３－Ａ３７５細胞の殺滅
プレＲＥＰ ＴＩＬを作製するため、黒色腫腫瘍消化試料を解凍し、１．５ｅ６細胞／ｍＬでプレＲＥＰ培地（熱不活性化ヒトＡＢ血清、Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｇｌｕｔａｍａｘ、β－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ＩＬ－２、及びＤＮａｓｅ（Ｄ２７７及びＤ３２９１培養にのみ添加）を含む）にプレーティングした。その後、ＩＬ－２を細胞に加えた。細胞をカウントし、１ｅ６細胞／ｍＬで、ＩＬ－２（Ｄ２７７及びＤ３２９１）を含むプレＲＥＰ培地、または１：１のプレＲＥＰ ＴＩＬ培地：造血無血清培養基及びＩＬ－２（Ｄ５７４６）に再プレーティングした。ＩＬ－２の再プレーティング及びフィーディングを、２日後に成長が１．５倍以下に減速するまで繰り返した。Ｄ２７７、Ｄ３２９１、及びＤ５７４６を培養期間後に凍結した。

【0165】

共培養を開始する前日に、３例のドナーに由来するプレＲＥＰ ＴＩＬを解凍し、ＩＬ－２を含むＲＥＰ培地中で一晩静置した。共培養を開始する前日に、６，０００個のＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７を、ＩＬ－２及びカスパーゼ３／７色素を含むＲＥＰ培地が入った９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、９６ウェルプレートから培地を除去し、ＴＩＬを、前日にプレーティングしたＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７に１０：１、３：１、１：１、または０．３：１のＥ：Ｔで加えた。ＩｎｃｕＣｙｔｅにより、プレートを２時間ごとに３日間イメージングした。試験した全てのＥ：Ｔにわたり、ＴＩＬによるＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞の認識及び殺滅が観察された（図３Ａ～３Ｃ）。

【0166】

代替的ＯＫＴ３膜アンカーの実施例：
この実験の目的は、様々なシグナルペプチド及び膜アンカーを使用して、ｍＯＴＫ３を細胞表面に発現できること、そしてＡ３７５細胞に加えて他の細胞タイプによってもｍＯＫＴ３を発現できることを示すことであった。２００万個のＫ５６２細胞に、様々なシグナルペプチド（例えば、マウスＩｇＧ、ヒトＣＳＦ２Ｒ、及びヒトＣＤ５）と融合したＯＫＴ３ ｓｃＦｖと、膜アンカータンパク質（マウスＣＤ８ａ、ヒトＣＤ８ａ、ヒトＣＤ２８、及びヒトＣＤ１４を含む）とを含むｐＫＳＱ３２８、ｐＫＳＱ３７７、ｐＫＳＱ３７８、ｐＫＳＱ３６８、及びｐＫＳＱ３６９コンストラクトをコードするレンチウイルスを形質導入した。形質導入から４８時間後、形質導入したＫ５６２細胞を、プラスチジン耐性マーカー（存在する場合）について選択した。形質導入から８日後に、ＩＬ－２含有培地中で、ドナーＰＢＭＣから単離した１００，０００個の汎Ｔ細胞の存在下、Ｋ５６２安定細胞株を１００，００細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングから２４時間後、細胞を抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ６９抗体で染色した。フローサイトメトリーを実施し、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９（Ｔ細胞活性化のマーカー）の表面発現を、非刺激対照との比較で定量化した。ｍＯＫＴ３コンストラクトの構築に使用した複数のシグナルペプチドと膜アンカーとの組合せがＴ細胞の活性化を駆動することが観察された（図４）。

【0167】

実施例３：特性評価：ｍＯＫＴ３の発現、汎Ｔ細胞との共培養、及びＣＤ６９誘導
Ａ３７５親細胞（ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ（赤色蛍光核レポーター）を含む）にｐＫＳＱ３６７、ｐＫＳＱ３９６、ｐＫＳＱ３９７、またはｐＫＳＱ３９８を形質導入した。「低親和性」コンストラクトであるｐＫＳＱ３９６、ｐＫＳＱ３９７、及びｐＫＳＱ３９８に、形質導入を確実にするために３つの異なるウイルスを形質導入した。

【0168】

形質導入及びコンストラクトの有効性を評価するため、いくつかのアッセイを実施した。
１．細胞表面でのｍＯＫＴ３発現。
２．Ａ３７５形質導入標的細胞との共培養後にＣＤ６９を発現した汎Ｔ細胞の活性化。
３．患者由来黒色腫ＴＩＬとの共培養後におけるＡ３７５形質導入細胞の成長の低減（ＴＩＬによる認識の指標）。

【0169】

Ａ３７５細胞（Ａ３７５親株及び形質導入株の両方）を１．５ｅ６／ｍＬで細胞培養基に再浮遊させ、０．７５ｅ５／５０μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。翌日、プレーティングした細胞を細胞染色バッファー中のヤギ血清でブロックし、暗所でインキュベートした。続いて、細胞を細胞染色バッファー中の（１：１００）ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル、Ａｌｅｘａ６４７で染色し、インキュベートした。洗浄後、細胞を細胞染色バッファーに再懸濁し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した（図５～７）。

【0170】

Ａ３７５細胞（Ａ３７５親株及び形質導入株の両方）を１．５ｅ６／ｍＬで細胞培養基に再浮遊させ、０．７５ｅ５／５０μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＭＣ（ドナー番号１４８１９２）を解凍し、製造業者のプロトコルに従って汎Ｔ細胞を単離した。単離した汎Ｔ細胞をカウントし、１．５ｅ６／ｍＬで再浮遊させた。０．７５ｅ５の単離した汎Ｔ細胞を、プレーティングしたＡ３７５標的細胞に加え（ウェル当たり５０μＬ）、一晩インキュベートした。プレーティングした細胞を細胞染色バッファーにより洗浄し、抗ＣＤ６９ Ａｂ ＢＶ７８５を細胞染色バッファー中で染色し、インキュベートした。洗浄後、細胞を細胞染色バッファーに再懸濁し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した（図８～１１）。

【0171】

実施例４：二次元Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７共培養モデル
Ａ３７５細胞（Ａ３７５親株及び形質導入株の両方）を１．２ｅ５／ｍＬで細胞培養基に再浮遊させ、６ｅ３／５０μＬ／ウェルで９６ウェル平底プレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。翌日、ＲＥＰ培地（ＡＩＭＶ、ＲＰＭＩ、ヒトＡＢ血清）中の各ＴＩＬ条件の６ｅ３／５０μＬ／ウェルを、プレーティングしたＡ３７５標的細胞の上に加えた。ＩＬ－２を含む１つのＲＥＰ培地を各共培養ウェルに加えた。共培養プレートを室温でインキュベートし、その後ＩｎｃｕＣｙｔｅに移動した。共培養プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ内でさらなる期間の間インキュベートし、その後画像収集を開始した。画像を２時間ごとに合計７２時間取得した（１０ｘ対物レンズで読取りフェーズ及び赤色）。ＩｎｃｕＣｙｔｅの画像を、各ウェルで検出した赤色蛍光の総面積で定量化し、次いで０時間に戻して正規化して、経時的な標的細胞の拡大／低減の変化を特定した（図１２～１４）。

【0172】

図１３及び１４では、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７及びＡ３７５ ｐＫＳＱ３９８細胞を各々単層として培養している。未編集ＴＩＬ及び遺伝子編集ＴＩＬを培養物に加え、イメージングを通じてＴＩＬ細胞毒性を腫瘍細胞面積の変化により測定した。Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７を腫瘍標的として用いた場合、ＳＯＣＳ１遺伝子編集ＴＩＬもＣＢＬＢ遺伝子編集ＴＩＬも、未編集ＴＩＬより良好な腫瘍の制御は示さなかった（図１３）。Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８を腫瘍標的として用いた場合、いずれのＴＩＬも、腫瘍成長を制御することができなかった（図１４）。このように、腫瘍標的を単層として培養する設定では、未編集ＴＩＬと編集ＴＩＬとで有効性を区別することはできない。

【0173】

実施例５：三次元Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイド共培養モデル
３Ｄ腫瘍スフェロイドは、標的細胞の単層よりも困難な標的及び複雑な微小環境を提供することができるため、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドを共培養アッセイの標的細胞として使用することを検討した。これにより、編集及び未編集ＴＩＬ間のわずかな効力の違いを確認できる可能性がある。

【0174】

単一クローンから作製した高親和性（ｐＫＳＱ３６７）及び低親和性（ｐＫＳＱ３９８）Ａ３７５株をスフェロイドベース共培養に使用した。

【0175】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７の高親和性及び低親和性クローンを、ＤＭＥＭ（熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質を補充）中で維持した。Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７高親和性単細胞クローン２０を高親和性スフェロイド共培養アッセイに使用し、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７低親和性単細胞クローン６を低親和性スフェロイド共培養アッセイに使用した。

【0176】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイド共培養については、共通のプロトコルに従った。
●－４日目：Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７を、ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ中で継代し、５，０００～１０，０００生細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレートを３７℃の５％ ＣＯ_２インキュベーター内のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムに移し、インキュベートしてスフェロイド形成を促進した。画像を数時間ごとに１回、フェーズ及び赤色チャネルにおいて４倍倍率で撮像した。
●－１日目：４例のドナー（ドナー１：Ｄ４２６７、ＮＳＣＬＣ、ドナー２：Ｄ４３９７、ＮＳＣＬＣ、ドナー３：Ｄ６１６４、黒色腫、ドナー４：Ｄ６４８１、黒色腫）由来の凍結保存ＴＩＬを解凍、洗浄、計数し、３ｅ＾６生細胞／ｍＬでＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ Ｖ、ヒトＡＢ血清を補充）に再浮遊させた。ＩＬ－２を加えた。細胞を適切なサイズのフラスコに入れ、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩静置した。
●０日目：ＴＩＬをセルストレーナーで濾過して適切なサイズのコニカルチューブに入れ、遠心分離し、カウントした。Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドが入ったプレートをＩｎｃｕｃｙｔｅから取り出した。ＴＩＬをＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドに１０：１～０．６２５：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で加えた。Ｅ：Ｔ比は、０日目の生ＴＩＬ（エフェクター）カウント及びＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７（標的）の初期播種密度に基づいて算出した。一部のウェルにはＴＩＬを加えず、成長対照として用いた。プレートを３７℃の５％ ＣＯ_２インキュベーター内のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムに移し、イメージングを４日目のように継続した。
●６日目：イメージングを中止し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅによって収集した画像の目視評価により、解析を行った。

【0177】

この場合において、解析は、画像を白黒に変換し、所与の時点でウェルに残存するスフェロイド（黒色）の面積を比較することにより行った。このデータは、スフェロイドの蛍光強度を評価することによっても解析した。蛍光レベルの低減をスフェロイド死滅の指標として使用した。このアッセイは、クロム放出またはカスパーゼ３発現によって読み取ることにより、標的細胞アポトーシスを評価するように設計することもできる。

【0178】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドの形態を、ＴＩＬを加えなかったウェルで評価した。高及び低親和性スフェロイドの形態の違いが観察された。具体的には、同じプレーティング密度（１０，０００細胞／ウェル）において、高親和性株（図面では「Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７」と表示）は、低親和性株（図面では「Ａ３７５－ＯＫＴ３ｌｔ」と表示）よりもはるかに「大きい」／「緩い」スフェロイドを形成した。形態の違いは、スフェロイド共培養の期間中（Ａ３７５－ＯＫＴ３播種から４～１０日後）に観察可能であった。同じ系統のクローン間にも形態の違いが存在する可能性があり、このような形態の違いが、Ｔ細胞間のわずかな違いを解明する別の機会をもたらす可能性がある（図１５）。

【0179】

ＴＩＬのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドに対する細胞毒性を、同じ時点でＥ：Ｔ比を増加させた場合の効果を比較することにより評価した。ＴＩＬ及びＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドを共培養したところ、高親和性スフェロイド（図面では「Ａ３７５－ＯＫＴ３」と表示）（ドナー１及び２）及び低親和性スフェロイド（図面では「Ａ３７５－ＯＫＴ３ｌｔ」と表示）（ドナー１、２、３、及び４）の両方に対し、ＥＰなし及びＳＯＣＳ１編集ＴＩＬの両方による用量依存的殺滅が観察された（図１６）。

【0180】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７の高親和性スフェロイド（図面では「Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７」と表示）及び低親和性スフェロイド（図面では「Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７Ａ３７５－ｐＫＳＱ３９８」と表示）に対するＴＩＬの細胞毒性動態の違いを、同じ時点で残存する高親和性及び低親和性スフェロイドのサイズを比較することにより評価した。高親和性スフェロイドは、ドナー１及び２による低親和性スフェロイドよりも迅速に死滅することが観察された（図１７）。

【0181】

図１７において、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３６７（Ａ３７５－ＯＫＴ３）腫瘍細胞をＴＩＬを加える前に４日間、３Ｄ腫瘍スフェロイドとして成長させた場合、ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬは、未編集対照（ＥＰなし）よりも高い腫瘍殺滅能力を示し、１．２５：１の比ではＳＯＣＳ１編集ＴＩＬによる完全な腫瘍のクリアランスが示された。一方、未編集対照のウェルでは残存する腫瘍が認められた。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬの有効性の増強は、Ａ３７５ ｐＫＳＱ３９８（Ａ３７５－ＯＫＴ３ｌｔ）細胞を３Ｄ腫瘍スフェロイドとして成長させた場合にも観察されたが、この違いはＥ：Ｔ比がより高い場合（５：１）に観察されている。

【0182】

ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬが、同じＥ：Ｔで高親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドの殺滅を増加させたかどうかについて評価した。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬによる高親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドに対する細胞毒性の増加が、ドナー２の場合に観察された。これらの画像は共培養から５日後に取得したものであり、これは、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７が異なる抗腫瘍力のＴＩＬを区別できることを示すものである（図１８）。

【0183】

ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬが低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドの殺滅を増加させたかどうかについて評価した。ドナー２、３、４については、ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬからのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７低親和性スフェロイドに対する効力の増加が観察された。これらの結果は、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７低親和性スフェロイドが、異なる効力のＴＩＬ集団を区別する感度を増加させることを示すものである（図１９）。

【0184】

ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬが低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドの殺滅を増加させたかどうかを、スフェロイド蛍光により評価した。Ａ３７５－ＯＫＴ３ｌｔ細胞を９６ウェル超低接着プレートにプレーティングし、４日間培養してスフェロイドを形成させた。４日目に、ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬまたは対照（例えば、未編集）ＴＩＬを解凍し、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でスフェロイド培養物に加えた。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬまたは対照（例えば、未編集）ＴＩＬによるスフェロイドの細胞毒性を、スフェロイド蛍光レベルの変化の関数としてＩｎＣｕｃｙｔｅでモニターした。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬは、Ｅ：Ｔ比の増加に伴って、低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドの殺滅が増加することを示した（図２０）。

【0185】

実施例６：ＩＦＮ－γ及び／またはＩＬ－６サイトカイン放出に基づくＴＩＬ効力を評価するためのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７モデルの使用
ＴＩＬ効力は、細胞毒性及び／またはサイトカイン放出に基づいて上清から測定することもできる。低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞三次元（３Ｄ）スフェロイドを共培養アッセイにおける標的細胞として用いて、細胞毒性及びエフェクターサイトカイン放出を評価した。単一クローンから作製した高（ｐＫＳＱ３６７）株も、後述のように使用することができた。

【0186】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７の高親和性クローン及び低親和性クローンを、単細胞浮遊液及び３Ｄスフェロイド共培養アッセイ用にＤＭＥＭ（熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質を補充）中で維持した。

【0187】

Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７の３Ｄスフェロイド共培養についても、同様のプロトコルに従った。
●－４日目（３Ｄスフェロイド共培養のみ）：Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７をＲＰＭＩ（ＦＢＳ及び抗生物質を補充）中で継代し、５，０００～１０，０００生細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムに移し、インキュベートしてスフェロイド形成を促進した。画像を数時間ごとに１回、フェーズ及び赤色チャネルにおいて４倍倍率で撮像する。
●－１日目：凍結保存したＴＩＬを解凍し、１回洗浄し、カウントし、３ｅ６生細胞／ｍＬでＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０及びＡＩＭ Ｖの１：１混合、ヒトＡＢ血清を補充）に再浮遊させた。ＩＬ－２を加える。細胞を適切なサイズのフラスコに入れ、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩静置した。単細胞浮遊液アッセイについては、Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７細胞を５，０００～１０，０００個／ウェルの生細胞密度でプレーティングした。ＴＩＬを加える前に、プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内に一晩移した。
●０日目：ＴＩＬをセルストレーナーで濾過して適切なサイズのコニカルチューブに入れ、遠心分離し、カウントした。Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイド及び／またはＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７単細胞浮遊液が入ったプレートをインキュベーターから取り出す。ＴＩＬを２０：１～０．６２５：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で加えた。Ｅ：Ｔ比は、０日目の生ＴＩＬ（エフェクター）カウント及びＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７（標的）の初期播種密度に基づいて算出した。一部のウェルにはＴＩＬを加えず、成長対照として用いた。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターに、またはアッセイに適切な３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムに移し、イメージングを継続した。
●３Ｄスフェロイドアッセイ：ＴＩＬ添加後１～２日目の間、イメージングを中止し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅによって収集された画像の目視評価によって解析を行った。ＴＩＬのＡ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドに対する細胞毒性を、この時点におけるＥ：Ｔ比の増加の効果を、並行して採取した上清と比較することにより評価した。ＩＦＮγ及び／またはＩＬ－６産生ならびに他のサイトカインの存在が、上清で直接検出された。ＴＩＬ細胞毒性を評価する代替的なアプローチとして、標的細胞の溶解時に上清中に速やかに放出される乳酸デヒドロゲナーゼのレベルも、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて上清中で測定した。

【0188】

効力が増加したＴＩＬは、単細胞浮遊またはスフェロイド共培養アッセイで、ＥＬＩＳＡ、ＭＳＤ、またはＬｕｍｉｎｅｘアッセイによる評価において、より多量のＩＦＮγ及びＩＬ－６サイトカイン産生をもたらすこと、及び／または、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼの測定値の増加に反映されるように、より高い細胞毒性を示すことが予測された。

【0189】

低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドとの共培養で成長させたＳＯＣＳ１編集ＴＩＬのＩＦＮγ及び／またはＩＬ－６の効力が増加したかどうかを評価した。低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７スフェロイドと共培養したＳＯＣＳ１編集ＴＩＬのＥ：Ｔ比を増加させたところ、ＩＦＮγ（図２１）及びＩＬ－６（図２２）の両方の分泌増加が示された。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬは、全てのＥ：Ｔ比において、両方のサイトカインをより高いレベルで産生した。

【0190】

ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬ及び低親和性Ａ３７５－ｐＫＳＱ３６７の共培養物からの上清は、対照ＴＩＬとの共培養物の場合よりも高いレベルの乳酸デヒドロゲナーゼも示しており、これは、細胞毒性の増強が、より大量のＡ３７５－ＫＳＱ３６７の細胞死及び乳酸デヒドロゲナーゼの放出をもたらすことと整合する（図２３及び図２４）。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【国際調査報告】