知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨークの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】異種移植のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/12 20150101AFI20240905BHJP
A61K 35/42 20150101ALI20240905BHJP
A61K 35/22 20150101ALI20240905BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240905BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240905BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
A61K35/12
A61K35/42
A61K35/22
A61P11/00
A61P13/12
A61P37/06
A61P29/00
A61K35/28
A61P43/00 121
C12N5/10 ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513512
(86)(22)【出願日】2022-09-01
(85)【翻訳文提出日】2024-02-28
(86)【国際出願番号】 US2022075809
(87)【国際公開番号】W WO2023034894
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,637
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】306018457
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】サイクス，ミーガン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ヨン－グワン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB33
4C087BB41
4C087BB44
4C087BB55
4C087CA03
4C087MA02
4C087MA05
4C087MA67
4C087NA14
4C087NA20
4C087ZA31
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZC75
4C087ZC80
(57)【要約】
本明細書で提供されるのは、異種移植の方法、例えば、ブタからヒトへの移植である。また、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞（「ＥＶ」、例えば、エクソソーム）及びそれを含む組成物、例えば、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶである。更に、本明細書で提供されるのは、ＥＶを作製する方法及び異種移植のためのその使用である。いくつかの態様では、異種移植の方法は、異種移植片においてヒトＣＤ４７を発現するステップを含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
異種移植の方法であって、前記方法が、ａ．ドナーブタから臓器を得ることと、
ｂ．前記臓器をヒトＣＤ４７でクロスドレッシングさせること（ｃｒｏｓｓ－ｄｒｅｓｓｉｎｇ）と、
ｃ．ヒトレシピエントに前記臓器を移植することと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記クロスドレッシングステップが、前記臓器を、細胞外小胞（ＥＶ）を含むヒトＣＤ４７に曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＥＶが、ヒト細胞から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記細胞が、組換えヒトＣＤ４７を発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞が、トランスジェニック細胞である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
前記クロスドレッシングが、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶとともに、前記臓器を２時間インキュベートすることによって達成される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記クロスドレッシングが、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶとともに、前記臓器を６時間インキュベートすることによって達成される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記クロスドレッシングが、前記臓器をエクスビボ灌流することによって達成される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記クロスドレッシングが、前記ドナーブタ、前記ヒトレシピエント、またはそれらの組み合わせをインビボ灌流することによって達成される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が、ヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約５％～約２５％、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約２５％～約５０％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約５０％～約７５％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約７５％～約８０％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を飲み込むＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約８０％～約８５％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約８５％～約９０％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約９０％～約９５％、前記クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、前記クロスドレッシングされた臓器の検出可能な貪食がないという結果をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記方法が、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、ヒトマクロファージからの保護による前記臓器の生存率の増加をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記クロスドレッシングされた臓器が、アポトーシスを誘導することなく、貪食を回避する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記クロスドレッシングされた臓器が、貪食を回避し、任意の検出可能なレベルのアポトーシスを呈しない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約５％～約２５％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約２５％～約５０％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約５０％～約７５％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約７５％～約８０％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約８０％～約８５％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約８５％～約９０％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞が、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、少なくとも約９０％低いレベルのアポトーシスを呈する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
アポトーシスが、ヨウ化プロピジウム染色によって測定される、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約５％～約２５％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約２５％～約５０％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約５０％～約７５％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約７５％～約８０％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約８０％～約８５％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約８５％～約９０％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記クロスドレッシングされた臓器が、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の少なくとも９０％の低減を呈する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約５％～約２５％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約２５％～約５０％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約５０％～約７５％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約７５％～約８０％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約８０％～約８５％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約８５％～約９０％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記ヒトレシピエントが、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の少なくとも９０％の低減を呈する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記臓器が、腎臓である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記臓器が、肺である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記ヒトレシピエントが、腎不全に罹患している、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも１０～２０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも２０～３０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも３０～４０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも４０～５０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも５０～６０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも６０～７０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも７０～８０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも８０～９０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記ヒトレシピエントが、同等な臨床環境における標準ケアよりも少なくとも９０％少ない免疫抑制療法を必要とする、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記方法が、タンパク尿の低減をもたらす、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
タンパク尿が、２４時間当たり３ｇ未満に低減される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
タンパク尿が、２４時間当たり５００ｍｇに低減される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
タンパク尿が、２４時間当たり３００ｍｇに低減される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
タンパク尿が、２４時間当たり１５０ｍｇに低減される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
タンパク尿が、前記移植の２週間以内に消失する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
タンパク尿が、前記移植の１か月以内に消失する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
タンパク尿が、前記移植の２か月以内に消失する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
タンパク尿が、前記移植の４か月以内に消失する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
前記レシピエントに骨髄組織を移植することを更に含む、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記骨髄が、前記腎臓と同じブタから採取される、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記骨髄が、前記腎臓とは異なるブタから採取される、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記骨髄が、ＥＶへの曝露によってヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項72】
前記臓器が、ヒトＳＩＲＰαを発現しない、請求項１～７１のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．相互参照
本出願は、２０２１年９月３日出願の米国仮出願第６３／２４０，６３７号の利益を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月３日出願の米国仮出願第６３／２４０，６３７号の利益を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
２．配列表
本出願は、Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介してＸＭＬファイルフォーマットで提出されたコンピュータ可読式配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して提出された配列表のＸＭＬファイルは、「１４６４８－００４－２２８＿ｓｅｑｌｉｓｔ．ｘｍｌ」と題され、２０２２年８月３０日に作成され、３２，７８２バイトのサイズである。
本出願は、Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介してＸＭＬファイルフォーマットで提出されたコンピュータ可読式配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して提出された配列表のＸＭＬファイルは、「１４６４８－００４－２２８＿ｓｅｑｌｉｓｔ．ｘｍｌ」と題され、２０２２年８月３０日に作成され、３２，７８２バイトのサイズである。
【0003】
３．政府ライセンスの権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与された付与番号Ｐ０１ ＡＩ０４５８９７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与された付与番号Ｐ０１ ＡＩ０４５８９７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
【0004】
４．序言
本明細書で提供されるのは、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、例えば、ブタからヒトへの移植の方法である。また、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞（「ＥＶ」、例えば、エクソソーム）及びそれを含む組成物、例えば、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶである。更に、本明細書で提供されるのは、ＥＶを作製する方法及び異種移植のためのその使用である。いくつかの態様では、異種移植の方法は、異種移植片においてヒトＣＤ４７を発現するステップを含む。ある特定の態様では、異種移植の方法は、標的組織上でのシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）の発現に依存しない。
５．
本明細書で提供されるのは、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、例えば、ブタからヒトへの移植の方法である。また、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞（「ＥＶ」、例えば、エクソソーム）及びそれを含む組成物、例えば、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶである。更に、本明細書で提供されるのは、ＥＶを作製する方法及び異種移植のためのその使用である。いくつかの態様では、異種移植の方法は、異種移植片においてヒトＣＤ４７を発現するステップを含む。ある特定の態様では、異種移植の方法は、標的組織上でのシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）の発現に依存しない。
５．
【背景技術】
【0005】
現在、同種ドナーの深刻な不足が、実施される臓器移植の数を制限している。この需給格差は、他の種の臓器（異種移植片）の使用によって補うことができる。非ヒト霊長類の使用に関連する倫理的問題及び非現実性を考慮すると、ブタはヒトにとって最も好適なドナー種と考えられている。臓器のサイズ及びヒトとの生理学的類似性に加えて、ブタは急速に繁殖させ、同系交配させることができるので、遺伝子改変に特に適しており、ヒトへの移植片ドナーとして機能する能力を改善することができる（Ｓａｃｈｓ １９９４，Ｐａｔｈ．Ｂｉｏｌ．４２：２１７－２１９、Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，４ Ｓｕｐｐｌ．６：４３－５０）。
【0006】
非特異的免疫抑制療法と移植との組み合わせは、高い早期移植免疫寛容に関連するが、臨床臓器移植の成功に対する重大な制限は、大きくは、移植片の慢性拒絶反応に起因する晩期移植片機能喪失である。腎臓移植によって、レシピエント当たり平均４．４年の生存年数がもたらされている。Ｒａｎａ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ．２０１５；１５０（３）：２５２－２５９を参照されたい。しかしながら、生体腎移植後１０年以内には、移植片の３０％超が機能しなくなる。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ：２０１７ Ａｎｎｕａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ：Ｋｉｄｎｅｙ［２０２１年３月２２日に取得］を参照されたい。インターネット：＜ＵＲＬ：ｓｒｔｒ．ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．ｈｒｓａ．ｇｏｖ／ａｎｎｕａｌ＿ｒｅｐｏｒｔｓ／２０１７／Ｋｉｄｎｅｙ．ａｓｐｘ＞から取得。
【0007】
異種移植片拒絶反応を防止するために必要な生涯にわたる免疫抑制のレベルは許容できないほど毒性があり得るので、免疫寛容は、臨床異種移植を成功させるために更に重要である。加えて、患者において免疫学的寛容が達成されたかどうかを確実に示すマーカーは同定されておらず、その結果、免疫抑制離脱が基礎とする実験パラメータが存在しない。
【0008】
したがって、異種移植における目的は、異種レシピエントに移植された後にドナー動物由来の混合キメラ細胞の耐久性を最適化すること、ならびにドナー動物の健康及び生存率を維持することを含む。
【0009】
混合キメリズムにより、レシピエントにおけるＴ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のレベルでドナーへの寛容を誘導することができる。Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ Ａ，Ｙａｍａｄａ Ｋ．ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ Ｍ．，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５８：２４１－２５８。Ｓａｃｈｓ Ｄ．Ｈ．，Ｋａｗａｉ Ｔ．ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ Ｍ．，２０１４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．４：ａ０１５５２９。造血は、骨髄微小環境におけるサイトカイン及び接着分子と造血細胞上の受容体との相互作用に関与する、厳密に調節された工程である。これらの受容体－リガンド相互作用のうちの多くは、種特異的（例えば、ＩＬ－３及びＩＬ－３Ｒ）または種選択的（例えば、ＳＣＦ－ｃＫＩＴ、ＧＭ－ＣＳＦ－ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＶＬＡ－５－フィブロネクチン）であるので、（例えば、ブタからの）混合キメラ細胞は、内因性造血細胞（例えば、ヒト細胞）と比較して競合的に不利であり、移植された細胞の緩やかな機能喪失に至るであろう。耐久性のある混合キメリズムは、生涯にわたるＴ、Ｂ、及びＮＫ細胞寛容を最も確実にすることができるので、このキメリズムの機能喪失は、望ましくない。
【0010】
ヒトサイトカイン受容体及び接着分子をブタドナー動物に導入することは、この競合的欠点を克服するのに役立ち、生涯にわたるキメリズム及び寛容を確実にするであろう。Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ Ａ，Ｙａｍａｄａ Ｋ．ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ Ｍ．，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２５８：２４１－２５８。造血は厳密に調節されるので、これらの遺伝子をブタゲノムのそれらの自然の遺伝子座に挿入して、それらが天然の調節配列の制御下で、生理学的様式で機能できるようにすることが望ましい場合がある。これは、天然ブタ遺伝子を破壊し、それをヒト対応物と置き換えることによって達成され得る。しかしながら、このアプローチには、それぞれ、種特異的または種選択的ブタサイトカイン（または接着リガンド）に対してブタ細胞を無応答または低反応にするという問題が有り得る。したがって、ヒト導入遺伝子の長期発現は、ドナー動物の健康に有害であり得る。Ｄｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ Ｍａｙ；１１３（１０）：１４４０－６、及びＣｒｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ；１０：２４２－５０。
【0011】
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られているＣＤ４７は、遍在的に発現される５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）α（ＣＤ１７２ａ及びＳＨＰＳ－１としても知られている）のリガンドとして機能する（Ｂｒｏｗｎ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：６０３－７、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１１：１３０－５）。ＣＤ４７及びＳＩＲＰαは、細胞遊走、Ｂ細胞の接着、及びＴ細胞活性化を含む、多様な細胞工程において重要な役割を果たす、細胞間コミュニケーション系を構成する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１００２８、Ｍｏｔｅｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＥＭＢＯ １２２：２６３４、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１６８：３２１３、Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５４７）。加えて、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα系は、マクロファージによる貪食の負の調節に関与する。いくつかの細胞タイプ（すなわち、赤血球、血小板または白血球）の表面上のＣＤ４７は、マクロファージによる貪食を阻害した。貪食の阻害におけるＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の役割は、初代野生型マウスマクロファージが、ＣＤ４７欠損マウスから得られたが野生型マウスからのものではない、オプソニン化されていない赤血球（ＲＢＣ）を急速に貧食するという観察によって示されている（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２０５１）。また、ＣＤ４７は、その受容体であるＳＩＲＰαを通して、Ｆｃγ及び補体受容体媒介性貪食の両方を阻害することも報告されている（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．２００１；Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：８５５）。
【0012】
ＣＤ４７は、遍在的に発現し、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）上の重要な阻害性受容体であるシグナル伝達調節タンパク質（ＳＩＲＰ）αのリガンドとして作用する。新たな証拠は、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル伝達経路が、マクロファージ及びＤＣ活性化の調節において重要な役割を果たすことを示しており、免疫学的障害のための有望な介入標的を提供する。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα細胞コミュニケーション系は、種特異的である（例えば、ブタＣＤ４７は、ブタ骨髄細胞の貪食を阻害しない）。ブタＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の交差反応の欠如はまた、ヒトマクロファージによる他のタイプのブタ細胞（例えば、肝細胞）の拒絶に寄与し、ＤＣ活性化を刺激し（以下を参照されたい）、したがって、抗ブタＴ細胞応答を誘発する。
【0013】
ＣＤ４７欠損細胞は、同系野生型（ＷＴ）マウスへの注入後にマクロファージによって激しく拒絶され、ＣＤ４７が、マクロファージに「私を食べないで」シグナルを提供することを実証している（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８：２０５１－４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４：１３７４４）。ブタを移植ソースとして使用する異種移植には、臨床移植における主要な制限要因であるヒト臓器ドナーの深刻な不足を解消する可能性がある（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．７：５１９－３１）。マクロファージによる異種細胞の強い拒絶（Ａｂｅ ２００２，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６８：６２１）は、大きくは、ドナーＣＤ４７とレシピエントＳＩＲＰαとの間の機能的相互作用の欠如によって引き起こされ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ；１０９：８３６－４２、Ｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：５０６２－６。Ｎａｖａｒｒｏ－Ａｌｖａｒｅｚ ２０１４，Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２３：３４５－５４）、これが、ヒトＣＤ４７トランスジェニックブタの開発につながっている（Ｔｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０１：３１６－２１、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０２０；２７：ｅ１２５４９）。マクロファージに加えて、ＤＣの亜集団もまた、ＳＩＲＰαを発現する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４：１３７４４－９、Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４５：６６９－８４）。ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル伝達はまた、ＤＣ活性化及びＴ細胞をプライミングするその能力を阻害し、ドナー特異的輸血（ＤＳＴ）または肝細胞移植によるＴ細胞寛容の誘導に重要な役割を果たす（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４：１３７４４－９、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２３：３５５－６３。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．６：２６８３９）。ＳＩＲＰαとの相互作用を介して貪食を阻害する「私を食べないで」分子として機能することに加えて、そのリガンド（例えば、抗ＣＤ４７抗体、ＴＳＰ－１、可溶性ＳＩＲＰα）へのライゲーション時に、ＣＤ４７シグナル伝達はまた、細胞老化または死を誘導し、細胞増殖を抑制する。
【発明の概要】
【0014】
６．発明の概要
一態様では、本明細書で提供されるのは、異種移植の方法であって、方法が、（ａ）ドナーブタから臓器を得ることと、（ｂ）臓器をヒトＣＤ４７でクロスドレッシング（ｃｒｏｓｓ－ｄｒｅｓｓｉｎｇ）させることと、（ｃ）臓器をヒトレシピエントに移植することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングステップは、臓器を、細胞外小胞（ＥＶ）を含むヒトＣＤ４７に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、ヒト細胞から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、組換えヒトＣＤ４７を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスジェニック細胞である。
一態様では、本明細書で提供されるのは、異種移植の方法であって、方法が、（ａ）ドナーブタから臓器を得ることと、（ｂ）臓器をヒトＣＤ４７でクロスドレッシング（ｃｒｏｓｓ－ｄｒｅｓｓｉｎｇ）させることと、（ｃ）臓器をヒトレシピエントに移植することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングステップは、臓器を、細胞外小胞（ＥＶ）を含むヒトＣＤ４７に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、ヒト細胞から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、組換えヒトＣＤ４７を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスジェニック細胞である。
【0015】
いくつかの実施形態では、クロスドレッシングは、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶとともに、臓器を２時間インキュベートすることによって達成される。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングは、ヒトＣＤ４７を発現するＥＶとともに、臓器を６時間インキュベートすることによって達成される。
【0016】
いくつかの実施形態では、クロスドレッシングは、臓器をエクスビボ灌流することによって達成される。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングは、ドナーブタ、ヒトレシピエント、またはそれらの組み合わせをインビボ灌流することによって達成される。
【0017】
いくつかの実施形態では、方法は、ヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた臓器細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約５％～約２５％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約２５％～約５０％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約５０％～約７５％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約７５％～約８０％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約８０％～約８５％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約８５％～約９０％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされていない臓器細胞と比較して、約９０％～約９５％の、クロスドレッシングされた臓器細胞のヒトマクロファージによる貪食の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、クロスドレッシングされた臓器の検出可能な貪食がないという結果をもたらす。
【0018】
いくつかの実施形態では、方法は、クロスドレッシングされた細胞を貪食するＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって測定して、ヒトマクロファージからの保護により臓器の生存率が増加したという結果をもたらす。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、アポトーシスを誘導することなく、貪食を回避する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、貪食を回避し、検出可能なレベルのアポトーシスを呈しない。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約５％～約２５％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約２５％～約５０％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約５０％～約７５％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約７５％～約８０％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約８０％～約８５％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、約８５％～約９０％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器から得られた細胞は、クロスドレッシングされていない臓器から得られた細胞と比較して、少なくとも９０％低いレベルのアポトーシスを呈する。いくつかの実施形態では、アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム染色によって測定される。
【0019】
いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約５％～約２５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約２５％～約５０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約５０％～約７５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約７５％～約８０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約８０％～約８５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の約８５％～約９０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、クロスドレッシングされた臓器は、クロスドレッシングされていない臓器と比較して、炎症の少なくとも９０％の低減を呈する。
【0020】
いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約５％～約２５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約２５％～約５０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約５０％～約７５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約７５％～約８０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約８０％～約８５％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の約８５％～約９０％の低減を呈する。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、クロスドレッシングされていない臓器を用いた移植と比較して、移植後に、全身炎症の少なくとも９０％の低減を呈する。
【0021】
いくつかの実施形態では、臓器は、腎臓である。いくつかの実施形態では、臓器は、肺である。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、腎不全に罹患している。
【0022】
いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも１０～２０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも２０～３０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも３０～４０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも４０～５０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも５０～６０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも６０～７０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも７０～８０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも８０～９０％少ない免疫抑制療法を必要とする。いくつかの実施形態では、ヒトレシピエントは、同等な臨床環境における標準ケアよりも少なくとも９０％少ない免疫抑制療法を必要とする。
【0023】
いくつかの実施形態では、方法は、タンパク尿の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、２４時間当たり３ｇ未満に低減する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、２４時間当たり５００ｍｇに低減する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、２４時間当たり３００ｍｇに低減する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、２４時間当たり１５０ｍｇに低減する。
【0024】
いくつかの実施形態では、タンパク尿は、移植の２週間以内に消失する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、移植の１か月以内に消失する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、移植の２か月以内に消失する。いくつかの実施形態では、タンパク尿は、移植の４か月以内に消失する。
【0025】
いくつかの実施形態では、方法は、骨髄組織をレシピエントに移植することを更に含む。いくつかの実施形態では、骨髄は、腎臓と同じブタから採取される。いくつかの実施形態では、骨髄は、腎臓とは異なるブタから採取される。いくつかの実施形態では、骨髄は、ＥＶへの曝露によってヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされる。
【0026】
いくつかの実施形態では、臓器は、ヒトＳＩＲＰαを発現しない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
７．図面の簡単な説明
【図1A-C】ブタＬＣＬの（Ａ）、トランスジェニックｈＣＤ４７による（Ｂ）、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞との共培養（Ｃ）後の、クロスドレッシング。
【図2】ブタＬＣＬの、及びトランスジェニックｈＣＤ４７による、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞との共培養後の、クロスドレッシング。
【図3A-B】ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の（Ａ）、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞との共培養後のトランスジェニックｈＣＤ４７による（Ｂ）、クロスドレッシング。
【図4A-C】ｈＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞の（Ａ）、天然ｈＣＤ４７による（Ｂ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養（Ｃ）後の、クロスドレッシング。
【図5A-B】ブタＬＣＬの（Ａ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養後の（Ｂ）、天然ｈＣＤ４７によるクロスドレッシング。
【図6】ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞、ブタＬＣＬ／ＣＤ４７ｐ／ｈ細胞、ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と混合したＣＤ４７ＫＯ細胞（染色時に混合）、ＷＴ ＪｕｒｋａｔまたはブタｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞と共培養したＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞（２４時間）、ブタＬＣＬ細胞、及びＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養したＬＣＬ細胞（２４時間）上のＣＤ４７発現。図中の数字は、ゲーティングされたＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞及びブタＬＣＬ細胞に対するＣＤ４７染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図7A-D】２時間後の、ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞の（Ａ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）からの細胞外小胞（Ｃ）またはエクソソーム（Ｄ）によるＣＤ４７クロスドレッシングの測定。
【図8A-D】６時間後の、ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞の（Ａ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）からの細胞外小胞（Ｃ）またはエクソソーム（Ｄ）によるＣＤ４７クロスドレッシングの測定である。
【図9A-D】２時間後の、ブタＬＣＬ細胞の（Ａ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞からの細胞外小胞（Ｃ）またはエクソソーム（Ｄ）によるＣＤ４７クロスドレッシングの測定。
【図10A-D】６時間後の、ブタＬＣＬ細胞の（Ａ）、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞からの細胞外小胞（Ｃ）またはエクソソーム（Ｄ）によるＣＤ４７クロスドレッシングの測定。
【発明を実施するための形態】
【0028】
８．発明の詳細な説明
本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７を担持する細胞外小胞（「ＥＶ」、例えば、エクソソーム）及びそれを含む組成物である。そのようなＣＤ４７を担持するＥＶを使用して、組織をクロスドレッシングし、そのような組織がマクロファージ及び他の食細胞による貪食による排除を回避することを可能にすることができる。そのような方法及び組成物は、異種移植に使用され得る。ＥＶを作製する方法は、セクション６．１に記載されている。生じたＥＶを含む組成物については、セクション６．２に記載されている。ＥＶを使用して組織をクロスドレッシングさせる方法については、セクション６．３に記載されている。異種移植におけるそのような組織の使用については、セクション６．４に記載されている。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７を担持する細胞外小胞（「ＥＶ」、例えば、エクソソーム）及びそれを含む組成物である。そのようなＣＤ４７を担持するＥＶを使用して、組織をクロスドレッシングし、そのような組織がマクロファージ及び他の食細胞による貪食による排除を回避することを可能にすることができる。そのような方法及び組成物は、異種移植に使用され得る。ＥＶを作製する方法は、セクション６．１に記載されている。生じたＥＶを含む組成物については、セクション６．２に記載されている。ＥＶを使用して組織をクロスドレッシングさせる方法については、セクション６．３に記載されている。異種移植におけるそのような組織の使用については、セクション６．４に記載されている。
【0029】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。整数が必要とされるかまたは予想される場合、及びパーセンテージの場合では、この用語の範囲は、次の整数までの切り上げ、及び次の整数までの切り下げを含むことが理解される。明確にするために、「約Ｘ」及び「少なくとも約Ｘ」等の語句の本明細書における使用は、「Ｘ」を包含し、具体的にＸを列挙すると理解される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「細胞外小胞（ＥＶ）」という用語は、一般に、細胞によって細胞外空間に分泌される脂質膜封入小胞を指し、限定されないが、エクソソーム及び／またはマイクロベシクルを含む。
【0031】
本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、一般に、マイクロベシクル等の他のＥＶと比較して、典型的にはサイズが小さい（例えば、直径が３０～１５０ｎｍ）ＥＶのサブセットを指す。
【0032】
本明細書で使用される場合、「クロスドレッシング」という用語は、一般に、例えば、細胞を、当該タンパク質を発現する細胞またはＥＶとともにインキュベートすることによって誘導される、細胞におけるトランスジェニックタンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現を指す。
【0033】
８．１ ＥＶを作製する方法
８．１．１．ＥＶ
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞によって細胞外環境に放出される脂質二重層封入膜である。ＥＶの例としては、エクソソーム、マイクロベシクル（ＭＶ）、及びアポトーシス体が挙げられる。例えば、Ｃａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）２０：２４０を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＥＶは、エクソソームを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、エクソソームからなる。ある特定の実施形態では、ＥＶは、ＭＶを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、ＭＶからなる。
８．１．１．ＥＶ
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞によって細胞外環境に放出される脂質二重層封入膜である。ＥＶの例としては、エクソソーム、マイクロベシクル（ＭＶ）、及びアポトーシス体が挙げられる。例えば、Ｃａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）２０：２４０を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＥＶは、エクソソームを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、エクソソームからなる。ある特定の実施形態では、ＥＶは、ＭＶを含む。いくつかの実施形態では、ＥＶは、ＭＶからなる。
【0034】
特定の実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約２，０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約１，５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約１，０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２０ｎｍ～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約５０ｎｍ～約１，５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約５０ｎｍ～約１，０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約５０ｎｍ～約５００ｎｍである。
【0035】
エクソソームは、本開示での使用に好適な１つの例示的なタイプのＥＶである。エクソソームを特徴付けるための様々なマーカーは、当該技術分野で既知であり、限定されないが、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、及びＣＤ３７）、及びフロチリンを含む。ＭＶは、本開示での使用に好適な別の例示的なタイプのＥＶであり、これらの小胞を定義するために使用される一般的なタンパク質マーカーとしては、限定されないが、セレクチン、インテグリン、及びＣＤ４０リガンドが挙げられる。
【0036】
８．１．２．ＥＶのソース
本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７を含むＥＶである。いくつかの実施形態では、ＥＶが含むＣＤ４７は、ＥＶを放出する細胞に対して天然である。他の例では、ＣＤ４７は、ＥＶを放出する細胞（例えば、トランスジェニックＣＤ４７）に対して天然ではない。好ましい実施形態では、ＣＤ４７は、トランスジェニックヒトＣＤ４７である。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７を含むＥＶである。いくつかの実施形態では、ＥＶが含むＣＤ４７は、ＥＶを放出する細胞に対して天然である。他の例では、ＣＤ４７は、ＥＶを放出する細胞（例えば、トランスジェニックＣＤ４７）に対して天然ではない。好ましい実施形態では、ＣＤ４７は、トランスジェニックヒトＣＤ４７である。
【0037】
多くの細胞タイプは、ＥＶを放出し、ＥＶは、宿主細胞によって放出される、核酸、タンパク質、及び脂質等の様々なタイプのカーゴを担持し得る。本明細書で提供されるＥＶは、培養物中の細胞株によって、または培養物中の一次細胞によって放出され得る。例示的な実施形態では、ＥＶは、ヒト細胞、例えば、培養物中のヒト一次細胞から放出される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、トランスジェニックＣＤ４７を発現するヒト細胞から放出される。他の特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ヒトがん細胞、例えば、ＣＤ４７を過剰発現するヒトがん細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞）から放出される。本明細書で提供されるＥＶは、ヒトＣＤ４７を自然に発現する細胞から、またはヒトＣＤ４７を組換え発現するように改変されている細胞、例えば、以下のセクション６．１．３に記載の改変された細胞から放出され得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ヒトＣＤ４７を過剰発現するように改変された細胞、例えば、以下のセクション６．１．３に記載の改変された細胞から放出される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ヒトＣＤ４７を誘導的に発現するように改変された細胞、例えば、以下のセクション６．１．３に記載の改変された細胞から放出される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、生体液、例えば、血液から単離される。
【0038】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶを放出する細胞は、ＥＶ放出を向上する薬剤で処置され得る。細胞からのＥＶの放出を向上する薬剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０２１，１１（９）：４３５１－４３６２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｓ ２０２０，９（３）：６６０、及びＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８（１０）：２２０３－２２１９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０２０を参照されたい。特定の実施形態では、ＥＶ放出を向上する薬剤は、超音波、アジポネクチン、ノルエピネフリン、フォルスコリン、フェノテロール、メチルドーパミン、またはメフェネシンである。
【0039】
８．１．３．ＥＶを放出するトランスジェニック細胞株を作製する方法
また、本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７を発現するトランスジェニック細胞（例えば、一次細胞または細胞株細胞）であり、これは、ＣＤ４７を担持するＥＶを放出する。ヒトＣＤ４７のアミノ酸配列は、以下のＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受入番号：ＮＰ＿００１７６８、ＮＰ＿００１３６９２３５．１、ＮＰ＿９４２０８８、及びＸＰ＿００５２４７９６６．１に見出すことができる。ヒトＣＤ４７をコードする核酸配列は、以下のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受入番号：ＮＭ＿００１７７７、ＮＭ＿１９８７９３、ＸＭ＿００５２４７９０９．２及びＮＭ＿００１３８２３０６．１に見出すことができる。本明細書で提供されるトランスジェニック細胞株を作製するために、ＣＤ４７の任意の既知のスプライスバリアントが使用され得る。ヒトＣＤ４７のアミノ酸及びヌクレオチド配列の非限定的な例が、表１に提供されている。
また、本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７を発現するトランスジェニック細胞（例えば、一次細胞または細胞株細胞）であり、これは、ＣＤ４７を担持するＥＶを放出する。ヒトＣＤ４７のアミノ酸配列は、以下のＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受入番号：ＮＰ＿００１７６８、ＮＰ＿００１３６９２３５．１、ＮＰ＿９４２０８８、及びＸＰ＿００５２４７９６６．１に見出すことができる。ヒトＣＤ４７をコードする核酸配列は、以下のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受入番号：ＮＭ＿００１７７７、ＮＭ＿１９８７９３、ＸＭ＿００５２４７９０９．２及びＮＭ＿００１３８２３０６．１に見出すことができる。本明細書で提供されるトランスジェニック細胞株を作製するために、ＣＤ４７の任意の既知のスプライスバリアントが使用され得る。ヒトＣＤ４７のアミノ酸及びヌクレオチド配列の非限定的な例が、表１に提供されている。
【0040】
本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）である。ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、または改変ヒト免疫不全ウイルス）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、アルファウイルス、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎａ ｖｉｒｕｓ）等）、プラスミド、または他のベクター（例えば、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、またはナノ粒子等の、非ウイルスベクター）を挙げることができる。
【0041】
８．１．３．１ トランスジェニック細胞株を作製する方法
トランスジェニック細胞（一次細胞または細胞株細胞を含む）は、当該技術分野で既知であるか、または本明細書で提供される任意の方法を使用して産生され得る。
トランスジェニック細胞（一次細胞または細胞株細胞を含む）は、当該技術分野で既知であるか、または本明細書で提供される任意の方法を使用して産生され得る。
【0042】
本明細書で提供されるトランスジェニック細胞株は、細胞ＤＮＡと、細胞に導入された外来性ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物、ベクター等）との間の相同組換え（ＨＲ）を使用して、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）を発現するように操作され得る。あるいは、本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７導入遺伝子は、その必要な調節配列の全てと一緒に、例えばヒト人工染色体として細胞株に導入される。
【0043】
細胞株のゲノムへのヒトＣＤ４７導入遺伝子の配列特異的挿入（またはノックイン）は、ヒトＣＤ４７の導入遺伝子を含有する構築物を、標的となる染色体遺伝子座の相同組換え（ＨＲ）で組み合わせた、配列特異的エンドヌクレアーゼによっても達成され得る。Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７，１５０２２－１５０２６．Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：６４－６７．Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：３０５５－３０６０．
【0044】
配列特異的エンドヌクレアーゼの別の例としては、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられる。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則的間隔を持つ短い回文構造の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））系は、標的ＤＮＡのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合及び配列特異的切断を利用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、２０ヌクレオチドを含有する）は、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位（ＮＮＧ）の上流の標的ゲノムＤＮＡ配列及び定常ＲＮＡ足場領域に相補的である。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質は、ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ部位の上流の定義された位置で二本鎖切断を導入する。Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３；Ｍａｓｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ８８７０、Ｃａｒｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：４５１－４５９、Ｔｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：６９５－６９６。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１２，４８２：３３１－３３８、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６－８２１、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３。
【0045】
本明細書に記載の方法及び組成物の配列特異的エンドヌクレアーゼは、生物から操作、キメラ化、または単離することができる。エンドヌクレアーゼは、例えば、変異誘発によって、特定のＤＮＡ配列を認識するように操作することができる。Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３８７０－３８７９。コンビナトリアルアセンブリは、異なる酵素からのタンパク質サブユニットを会合または融合させることができる方法である。Ａｍｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５５：４４３－４５８。ある特定の実施形態では、これらの２つのアプローチである変異誘発及びコンビナトリアルアセンブリを組み合わせて、所望のＤＮＡ認識配列を有する操作されたエンドヌクレアーゼを産生することができる。
【0046】
配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ等の配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、細胞に導入され得る。核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクター等のより大きな構築物の一部として、または例えば、エレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルス輸送体、マイクロインジェクション、及びバイオリスティック法によって直接送達され得る。同様に、１つ以上の導入遺伝子を含有する構築物は、核酸を細胞に導入するのに適切な任意の方法によって送達され得る。
【0047】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスジェニック細胞株は、ヒトＣＤ４７を誘導的に発現した。多数の誘導性プロモーター及び遺伝子発現系が当該技術分野で既知である。例えば、プロモーターは、化学物質、例えば、テトラサイクリン、タモキシフェン、またはクミン酸塩によって誘導され得る。遺伝子発現は、タンパク質－タンパク質相互作用（例えば、ラパマイシンによって制御されるＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲとの間の相互作用）によって制御することもできる。例えば、Ｋａｌｌｕｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｃｅｌｌｓ ８：７９６を参照されたい。
【0048】
一実施形態では、標的遺伝子の条件付きノックアウトを達成するために、配列特異的組換え系が使用され得る。リコンビナーゼは、介在するポリヌクレオチドに隣接する特定のポリヌクレオチド配列（リコンビナーゼ認識部位）を認識し、相互鎖交換を触媒し、介在するポリヌクレオチドの反転または切除をもたらす酵素である。Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１６０－１６４。
【0049】
一実施形態では、細胞内の標的遺伝子の条件付きノックアウトについては、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ系が使用され得る。これは、相同組換え（ＨＲ）及び誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を介した、ｌｏｘＰ部位の標的化された組み込み（ノックイン）に関与する。
【0050】
別の実施形態では、導入遺伝子（例えば、リコンビナーゼ、またはヒトＣＤ４７導入遺伝子をコードする）の条件付き発現は、外因性刺激によって誘導または不活性化され得る調節配列を使用することによって達成することができる。例えば、条件付きノックアウト対立遺伝子の配列特異的組換え系は、例えば、リコンビナーゼの活性を化学物質（薬物）によって誘導可能であるようにすることによって調節することができる。化学物質は、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の転写を活性化するか、またはＣｒｅリコンビナーゼタンパク質の核への輸送を活性化することができる。あるいは、リコンビナーゼは、投与された薬物の存在によってではなく、投与された薬物の不在によって活性化され得る。誘導系を調節する（したがって、例えば、条件付きノックアウトを誘導する）化学物質の非限定的な例としては、テトラサイクリン、タモキシフェン、ＲＵ－４８６、ドキシサイクリン等が挙げられる。Ｎａｇｙ Ａ（Ｆｅｂ ２０００），Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ：ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｉｌｏｒｉｎｇ，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（２）：９９－１０９。例えば、米国特許出願第１５／５５８，７８９号に記載される条件付きノックアウト及びノックイン構築物を参照されたい。
【0051】
８．１．３．２ ＥＶの染色体外発現
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７が染色体外ＤＮＡから発現されるＥＶを産生する方法である。染色体外ＤＮＡは、宿主染色体ＤＮＡに組み込まれないＤＮＡである。染色体外ＤＮＡの非限定的な例としては、プラスミド及び環式染色体外ＤＮＡが挙げられる。真核生物細胞では、染色体外ＤＮＡは、核内部または核外部に見出され得る。例えば、宿主細胞は、ヒトＣＤ４７をコードするベクター（例えば、上のセクション６．１．３に記載のベクター）でトランスフェクトされ得、ヒトＣＤ４７タンパク質は、宿主ＤＮＡに組み込まれることなく、ベクターから発現される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ４７が染色体外ＤＮＡから発現されるＥＶを産生する方法である。染色体外ＤＮＡは、宿主染色体ＤＮＡに組み込まれないＤＮＡである。染色体外ＤＮＡの非限定的な例としては、プラスミド及び環式染色体外ＤＮＡが挙げられる。真核生物細胞では、染色体外ＤＮＡは、核内部または核外部に見出され得る。例えば、宿主細胞は、ヒトＣＤ４７をコードするベクター（例えば、上のセクション６．１．３に記載のベクター）でトランスフェクトされ得、ヒトＣＤ４７タンパク質は、宿主ＤＮＡに組み込まれることなく、ベクターから発現される。
【0052】
８．１．３．３ 細胞からのＥＶの単離
ＥＶは、当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載の任意の方法を使用して、細胞（例えば、ＣＤ４７を発現するトランスジェニック細胞）から単離され得る。例えば、Ｃａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）２０：２４０を参照されたい。
ＥＶは、当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載の任意の方法を使用して、細胞（例えば、ＣＤ４７を発現するトランスジェニック細胞）から単離され得る。例えば、Ｃａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）２０：２４０を参照されたい。
【0053】
例えば、ＥＶは、細胞培養上清の画分遠心分離によって単離され得る。例示的なプロトコルでは、細胞上清は、２，０００ｇ（３，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心分離されて、細胞デブリ及び死細胞が除去される。次いで、ＥＶは、１６，５００ｇ（９，８００ｒｐｍ）で４５分間の遠心分離によって精製される。エクソソームは、同様のプロトコルによって得ることができ、細胞上清が、２，０００ｇ（３，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心分離されて、細胞デブリ及び死細胞が除去され、次いで、エクソソームが、１００，０００ｇ（２６，４５０ｒｐｍ）でおよそ２時間～１６時間の遠心分離によって単離される。
【0054】
エクソソームを含むＥＶはまた、勾配密度遠心分離を使用して精製され得る。この方法では、ＥＶは、スクロース、イオヘキソール、またはイオジキサノールのいずれかの溶液中の浮力密度に基づいて分離される。エクソソーム等のＥＶを単離するために使用される方法の他の例としては、有機溶媒（例えば、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、またはプロタミン）を用いる沈降、免疫沈降、抗体でコーティングされた磁気ビーズ（例えば、抗ＣＤ６３でコーティングされた磁気ビーズ）を使用する分離、マイクロ流体デバイス、及び限外濾過が挙げられる。例えば、例示的なプロトコルについては、Ｃａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）２０：２４０、及びＭｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３；３９４（１０）：１２５３－１２６２を参照されたい。更なる例示的な方法は、ヘパリン抱合アガロースビーズを使用する単離（例えば、Ｂａｌａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１０２６６を参照されたい）、及びＴｉｍ４親和性精製を使用する精製（例えば、Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，３３９３５を参照されたい）である。
【0055】
更に、ＥＶの単離のための市販のキットが利用可能であり、本明細書で提供されるＥＶを分離するために使用することができる。非限定的な例としては、ｅｘｏＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）キット（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｐａｎ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
【0056】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、単離または精製される。本明細書で提供されるＥＶは、当該技術分野で既知であるか、または本明細書で提供される任意の方法を使用して精製され得る。本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」ＥＶは、ＥＶが由来する細胞または組織ソースからの細胞材料、微粒子、または他の汚染物質（例えば、細胞小器官、脂質、コレステロール）を実質的に含まない。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の純度のものである。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、９９％超の純度のものである。純度は、例えば、動的光散乱もしくは単一粒子追跡分析を使用して粒径を測定することによって、またはフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、もしくは電子顕微鏡等の技術によって決定することができる。例えば、Ｂａｌａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１０２６６，Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，３３９３５及びＣａｒｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：２４０を参照されたい。
【0057】
８．１．３．４ ｍＲＮＡレベルを検出するためのアッセイ
ｍＲＮＡレベルを検出または定量するいくつかの方法が、当該技術分野で既知である。例示的な方法には、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲベースの方法（例えば、定量的ＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）分析等が含まれるが、これらに限定されない。ヒトＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を使用して、ｍＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的なプローブを調製することができる。次いで、プローブを使用して、ＰＣＲに基づく方法、ノーザンブロッティング、ディップスティックアッセイ、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ等の任意の好適なアッセイを使用して、試料中のｍＲＮＡを検出することができる。
ｍＲＮＡレベルを検出または定量するいくつかの方法が、当該技術分野で既知である。例示的な方法には、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲベースの方法（例えば、定量的ＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）分析等が含まれるが、これらに限定されない。ヒトＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を使用して、ｍＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的なプローブを調製することができる。次いで、プローブを使用して、ＰＣＲに基づく方法、ノーザンブロッティング、ディップスティックアッセイ、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ等の任意の好適なアッセイを使用して、試料中のｍＲＮＡを検出することができる。
【0058】
他の実施形態では、生体試料中のヒトＣＤ４７発現を試験するための核酸アッセイを用意することができる。アッセイは、典型的には、固体支持体及び支持体に接触する少なくとも１つの核酸を含有し、核酸は、ｍＲＮＡの少なくとも一部分に対応する。そのアッセイは、その試料におけるｍＲＮＡの発現の変化を検出するための手段を有することもできる。アッセイ方法は、所望のｍＲＮＡ情報のタイプに応じて変動し得る。例示的な方法としては、限定されないが、ノーザンブロット及びＰＣＲに基づく方法（例えばｑＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられる。ｑＲＴ－ＰＣＲ等の方法はまた、試料中のｍＲＮＡの量を正確に定量することができる。
【0059】
典型的なｍＲＮＡアッセイ方法は、（１）表面に結合した対象プローブを得るステップと、（２）特異的な結合を提供するのに十分な条件下でｍＲＮＡの集団を表面に結合したプローブにハイブリダイズするステップと、（３）ハイブリダイゼーション後に洗浄して、表面に結合したプローブに特異的に結合しない核酸を除去するステップと、（４）ハイブリダイズされたｍＲＮＡを検出するステップと、を含むことができる。これらのステップの各々で使用する試薬と、使用する条件は、特定の用途に応じて変動し得る。
【0060】
ＰＣＲベースの方法等の他の方法も、ヒトＣＤ４７の発現を検出するために使用することができる。ＰＣＲ方法の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，０２４号に見出され得る。ＲＴ－ＰＣＲ方法の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，１２２，７９９号に見出され得る。インサイチュ蛍光ＰＣＲの方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，１８６，５０７号に記載されている。
【0061】
いくつかの実施形態では、定量的逆転写－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ＲＮＡ標的の検出及び定量の両方に使用することができる（Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．２００５，１０９：３６５－３７９）。いくつかの実施形態では、ｑＲＴ－ＰＣＲベースのアッセイは、細胞ベースのアッセイ中のｍＲＮＡレベルを測定するのに有用であり得る。ｑＲＴ－ＰＣＲベースの方法の例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０１，６６３号に見出すことができる。
【0062】
通常の逆転写酵素－ＰＣＲ及びアガロースゲルによる分析とは対照的に、ｑＲＴ－ＰＣＲは定量的な結果を与える。ｑＲＴ－ＰＣＲの更なる利点は、使用の相対的な容易さ及び利便性である。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００等のｑＲＴ－ＰＣＲ用の装置は市販されており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）配列検出化学品等の試薬も市販されている。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを、製造業者の指示に従って使用することができる。これらのキットは、ヒト、マウス、及びラットのｍＲＮＡ転写産物の迅速で信頼性の高い検出及び定量のための事前に製剤化された遺伝子発現アッセイである。例示的なｑＲＴ－ＰＣＲプログラムは、例えば、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、４０サイクルの９５℃で１５秒間、次に６０℃で１分間である。
【0063】
８．１．３．５ ポリペプチドまたはタンパク質レベルを検出するためのアッセイ
いくつかのタンパク質検出及び定量方法を使用して、ヒトＣＤ４７のレベルを測定することができる。任意の好適なタンパク質定量方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体ベースの方法を使用する。使用することができる例示的な方法には、免疫ブロット法（ウェスタンブロット）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、サイトメトリービーズアレイ、質量分析法等が含まれるが、これらに限定されない。直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡを含む、いくつかのタイプのＥＬＩＳＡが一般的に使用されている。
いくつかのタンパク質検出及び定量方法を使用して、ヒトＣＤ４７のレベルを測定することができる。任意の好適なタンパク質定量方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体ベースの方法を使用する。使用することができる例示的な方法には、免疫ブロット法（ウェスタンブロット）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、サイトメトリービーズアレイ、質量分析法等が含まれるが、これらに限定されない。直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡを含む、いくつかのタイプのＥＬＩＳＡが一般的に使用されている。
【0064】
８．２ ＥＶ組成物
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＥＶ、例えば、ＣＤ４７を担持するエクソソーム等のＣＤ４７を担持するＥＶを含む、組成物である（「ＥＶ組成物」）。精製されたＥＶは、例えば、凍結保護剤の存在下でＥＶを冷凍することによって凍結保存され、凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。ＥＶは、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）または足場（例えば、ＥＶがインビボで結合する細胞外マトリックスの構成要素を含む足場）を使用することによって安定化され得る。例えば、Ｋｕｓｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９：１１９９を参照されたい。
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＥＶ、例えば、ＣＤ４７を担持するエクソソーム等のＣＤ４７を担持するＥＶを含む、組成物である（「ＥＶ組成物」）。精製されたＥＶは、例えば、凍結保護剤の存在下でＥＶを冷凍することによって凍結保存され、凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。ＥＶは、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）または足場（例えば、ＥＶがインビボで結合する細胞外マトリックスの構成要素を含む足場）を使用することによって安定化され得る。例えば、Ｋｕｓｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９：１１９９を参照されたい。
【0065】
本明細書で提供されるＥＶ組成物は、ＣＤ４７含有量が変動し得る。ある特定の実施形態では、ＥＶは、ＣＤ４７ ｍＲＮＡを含む。ヒトＣＤ４７ ｍＲＮＡのレベルは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法、例えば、セクション６．１．３．４に記載の方法によって決定することができる。ある特定の実施形態では、ＥＶは、ＣＤ４７ポリペプチドまたはタンパク質を含む。ヒトＣＤ４７タンパク質のレベルは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法、例えば、セクション６．１．３．５に記載の方法を使用して決定することができる。
【0066】
したがって、例えば、ＥＶ組成物の１単位中に存在するＥＶの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、ヒトＣＤ４７を発現する。同様に、ヒトＣＤ４７は、ＥＶ組成物中の総膜関連タンパク質の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を占め得る。
【0067】
本明細書で提供されるＥＶ組成物は、好適な担体、例えば、薬学的に許容される担体を更に含み得る。一般に、「薬学的に許容される」担体は、生物学的ではない材料であるか、または望ましくないものではない材料であり、すなわち、この材料は、毒性等の任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、対象に投与することができる。例示的な薬学的に許容される担体としては、限定されないが、水性溶媒（例えば、水；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＳＢ）、アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）等の平衡塩類溶液；及び細胞培養培地）、ならびに非水性溶媒（例えば、脂肪、油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、植物油、及びエチルオレイン酸塩等の注射用有機エステル）が挙げられる。担体としては、液体、半固体、例えば、ペースト、または固体担体が挙げられる。加えて、必要に応じて、組成物は、湿潤剤、または乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含有し得る。薬学的組成物中の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。したがって、本発明のＥＶは、薬学的に許容される担体中で投与するために、既知の技術に従って製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２２ｎｄ Ｅｄ．２０１２）を参照されたい。
【0068】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．０１重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、０．０５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、０．１重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、０．５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、３０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、３５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、４０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、６０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、７０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、７５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、８０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、８５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、９０重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、９５重量／体積％～９９重量／体積％のＥＶを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１００％の凍結乾燥されたＥＶ等のＥＶを含み得る。
【0069】
本明細書で提供される組成物中に含まれるＥＶの量は、当業者によって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、異種移植片をクロスドレッシングさせるのに十分な量である。特定の実施形態では、ＥＶの量は、異種移植片をクロスドレッシングさせ、臓器細胞の貪食を低減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、異種移植片をクロスドレッシングさせ、移植後のレシピエントにおける全身炎症を低減するのに十分な量である。
【0070】
ある特定の実施形態では、ＥＶの量は、定量された量である。ＭＶ及びエクソソームを含むＥＶの定量のための様々な方法が、当該技術分野で既知である。例えば、ＥＶを定量するための非限定的な例示的な方法としては、電子顕微鏡（ＥＭ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー、調節可能な抵抗性パルスセンシング（ＴＲＰＳ）、ナノサイトナノ粒子追跡分析、タンパク質に基づく方法、及び酵素結合免疫吸着アッセイが挙げられる。
【0071】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０６～約１．０×１０１５個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０７～約１．０×１０１４個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０８～約１．０×１０１３個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０９～約１．０×１０１２個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１０～約１．０×１０１１個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０６～約１．０×１０１０個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０６～約１．０×１０８個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０８～約１．０×１０１５個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０８～約１．０×１０１２個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１０～約１．０×１０１５個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１２～約１．０×１０１５個のＥＶを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０６個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０７個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０８個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０９個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１０個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１１個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１２個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１３個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１４個のＥＶを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０×１０１５個のＥＶを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０マイクログラム（μｇ）～約１００グラム（ｇ）のＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５．０μｇ～約５０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１０．０μｇ～約１０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５０．０μｇ～約５ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１００．０μｇ～約１ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１０．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５０．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１００．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５０．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５００．０μｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１０．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５０．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１００．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５０．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５００．０ｍｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１０．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５０．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約１００．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約２５０．０ｇのＥＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約５００．０ｇのＥＶタンパク質を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、組成物中に含まれるＥＶの量は、ＥＶが生成される細胞の量と相対する。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、４８時間超の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約４８時間の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約２４時間の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１６時間の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１２時間の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、１２時間未満の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、４８時間超の間培養された約１．０×１０８～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約２４時間培養された約１．０×１０８～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１６時間の間培養された約１．０×１０８～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１２時間の間培養された１．０×１０６～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、１２時間未満の間培養された１．０×１０８～約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、４８時間超の間培養された約１．０×１０６～約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約２４時間培養された１．０×１０６～約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１６時間の間培養された１．０×１０６～約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１２時間の間培養された１．０×１０６～約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、１２時間未満の間培養された１．０×１０６～約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０５個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０６個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０７個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０８個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０９個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１０個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１１個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１２個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１３個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１４個の細胞から収集される量である。いくつかの実施形態では、ＥＶの量は、約１．０×１０１５個の細胞から収集される量である。
【0078】
８．３ 組織をクロスドレッシングさせるためにＥＶを使用する方法
本明細書で使用される場合、「クロスドレッシング」という用語は、例えば、細胞を、当該タンパク質を発現する細胞またはＥＶとともにインキュベートすることによって誘導される、細胞におけるトランスジェニックタンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現について記載している。例えば、ブタ細胞は、例えば、共インキュベーションによって、ヒトＣＤ４７を発現する細胞に曝露することによって、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされ得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ドナーブタからの骨髄組織とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ドナーブタからの腎臓とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、同じドナーブタからの骨髄組織及び腎臓の両方とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、第１のドナーブタからの腎臓及び第２のドナーブタからの骨髄組織とともにインキュベートされる。
本明細書で使用される場合、「クロスドレッシング」という用語は、例えば、細胞を、当該タンパク質を発現する細胞またはＥＶとともにインキュベートすることによって誘導される、細胞におけるトランスジェニックタンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現について記載している。例えば、ブタ細胞は、例えば、共インキュベーションによって、ヒトＣＤ４７を発現する細胞に曝露することによって、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされ得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ドナーブタからの骨髄組織とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、ドナーブタからの腎臓とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、同じドナーブタからの骨髄組織及び腎臓の両方とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＶは、第１のドナーブタからの腎臓及び第２のドナーブタからの骨髄組織とともにインキュベートされる。
【0079】
８．４ 異種移植においてＥＶを使用する方法
本明細書で提供されるのは、異種移植片を標的組織に移植する前に、異種移植片をＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）でクロスドレッシングさせることを含む、異種移植の方法である。ある特定の実施形態では、標的組織は、腎臓組織である。他の実施形態では、標的組織は、肺組織である。いくつかの実施形態では、標的組織は、ヒトである。いくつかの実施形態では、標的組織は、当該技術分野で既知の方法（例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応）によって決定した場合、ＳＩＲＰα（例えば、ヒトＳＩＲＰα）を発現しない。ある特定の態様では、ＣＤ４７クロスドレッシングは、標的組織上のシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）発現に依存しない。
本明細書で提供されるのは、異種移植片を標的組織に移植する前に、異種移植片をＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）でクロスドレッシングさせることを含む、異種移植の方法である。ある特定の実施形態では、標的組織は、腎臓組織である。他の実施形態では、標的組織は、肺組織である。いくつかの実施形態では、標的組織は、ヒトである。いくつかの実施形態では、標的組織は、当該技術分野で既知の方法（例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応）によって決定した場合、ＳＩＲＰα（例えば、ヒトＳＩＲＰα）を発現しない。ある特定の態様では、ＣＤ４７クロスドレッシングは、標的組織上のシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）発現に依存しない。
【0080】
８．４．１．異種移植片をＥＶに曝露する方法
ある特定の実施形態では、クロスドレッシングは、異種移植片を、ＣＤ４７を含むＥＶに曝露することによって達成される。他の実施形態では、クロスドレッシングは、ヒトＣＤ４７を発現する細胞株（例えば、トランスジェニック細胞株）と異種移植片を共培養することによって達成される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、インビトロでＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、インビボでＥＶに曝露される。例えば、エクソソーム等のＥＶは、インビボでＥＶを送達するために、後眼窩静脈洞、尾静脈、もしくは心内、または同様のアプローチを介して注射することができる。いくつかの実施形態では、異種移植片は、エクスビボでＥＶに曝露される。特定の実施形態では、異種移植片血管は、インビボでＥＶで灌流される。例えば、異種移植片は、ドナーもしくはレシピエントのいずれか、またはその両方においてインビボで灌流され得る。いくつかの実施形態では、異種移植片血管は、エクスビボでＥＶで灌流される。
ある特定の実施形態では、クロスドレッシングは、異種移植片を、ＣＤ４７を含むＥＶに曝露することによって達成される。他の実施形態では、クロスドレッシングは、ヒトＣＤ４７を発現する細胞株（例えば、トランスジェニック細胞株）と異種移植片を共培養することによって達成される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、インビトロでＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、インビボでＥＶに曝露される。例えば、エクソソーム等のＥＶは、インビボでＥＶを送達するために、後眼窩静脈洞、尾静脈、もしくは心内、または同様のアプローチを介して注射することができる。いくつかの実施形態では、異種移植片は、エクスビボでＥＶに曝露される。特定の実施形態では、異種移植片血管は、インビボでＥＶで灌流される。例えば、異種移植片は、ドナーもしくはレシピエントのいずれか、またはその両方においてインビボで灌流され得る。いくつかの実施形態では、異種移植片血管は、エクスビボでＥＶで灌流される。
【0081】
いくつかの実施形態では、異種移植片は、２回以上ＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、１、２、または３日間の過程にわたって２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回ＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、同じＥＶ組成物に繰り返し曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、異なるＥＶ組成物に曝露される。
【0082】
本明細書で提供されるように、ＥＶへの異種移植片の曝露は、移植前、移植後、またはその両方で行われ得る。いくつかの実施形態では、異種移植片は、移植前にＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、移植後にＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、移植前及び移植後にＥＶに曝露される。
【0083】
いくつかの実施形態では、異種移植片は、移植後に２回以上曝露される。例えば、移植後、レシピエントは、ＥＶを１回以上注入（例えば、静脈内注入）され得る。いくつかの実施形態では、レシピエントは、毎日ＥＶを注入される。いくつかの実施形態では、レシピエントは、１日に２回以上ＥＶを注入される。いくつかの実施形態では、レシピエントは、注入される。
【0084】
特定の実施形態では、臓器は、移植前、移植後、またはそれらの組み合わせで、インビボで直接ＥＶを注入される。例えば、臓器は、移植前に直接（例えば、肝門脈を介して）灌流され得る。いくつかの実施形態では、臓器は、移植前にインビボで直接灌流される。いくつかの実施形態では、臓器は、移植後にインビボで直接灌流される。いくつかの実施形態では、臓器は、移植前及び移植後にインビボで直接灌流される。いくつかの実施形態では、臓器は、移植前に２回以上インビボで直接灌流される。いくつかの実施形態では、臓器は、移植後に２回以上インビボで直接灌流される。いくつかの実施形態では、臓器は、移植前及び移植後に２回以上インビボで直接灌流される。
【0085】
ＥＶへの異種移植片の曝露は、異種移植片をクロスドレッシングさせるのに十分な任意の時間の間であり得る。いくつかの実施形態では、異種移植片は、約１～２時間、２～３時間、３～４時間、４～５時間、５～６時間、６～７時間、７～８時間、８～９時間、９～１０時間、１０～１１時間、または１１～１２時間、ＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、約１２～１６時間ＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、約１６～２４時間ＥＶに曝露される。いくつかの実施形態では、異種移植片は、２４時間超ＥＶに曝露される。
【0086】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、特定の臓器または細胞タイプへのその送達を改善するように操作される。標的化特性を有するＥＶを操作する様々な技術が、当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５１，１－１２（２０１９）を参照されたい）。例として、いくつかの実施形態では、ＥＶは、その意図する作用細胞に対するＥＶの標的化を改善する、特異的標的化ペプチドを発現する。別の例示的な標的化技術は、意図された作用細胞に対するＥＶの標的化を改善する特定のインテグリンの組み合わせを発現するように、ＥＶを操作することを含む。いくつかの実施形態では、操作は、ＥＶ産生後に実施される。
【0087】
８．４．２．異種移植片におけるＥＶへの曝露の影響
いくつかの実施形態では、細胞に対するＣＤ４７のクロスドレッシングは、当該細胞が貪食を回避することをもたらす。特定の実施形態では、細胞に対するＣＤ４７のクロスドレッシングは、アポトーシスを誘導することなく、当該細胞が貪食を回避することをもたらす。
いくつかの実施形態では、細胞に対するＣＤ４７のクロスドレッシングは、当該細胞が貪食を回避することをもたらす。特定の実施形態では、細胞に対するＣＤ４７のクロスドレッシングは、アポトーシスを誘導することなく、当該細胞が貪食を回避することをもたらす。
【0088】
ある特定の実施形態では、セクション６．４に記載の方法等によって本開示に従って生成されたＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞は、ＥＶからのＣＤ４７でクロスドレッシングされていない、ＣＤ４７を発現する細胞と比較して、ＣＤ４７リガンド（例えば、トロンボスポンジン（ＴＳＰ－１））とのライゲーションが減少したＣＤ４７を発現する。いくつかの実施形態では、セクション６．４に記載の方法等によって本開示に従って生成されたＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞は、ＥＶからのＣＤ４７でクロスドレッシングされていない、ＣＤ４７を発現する細胞と比較して、ＣＤ４７リガンド（例えば、トロンボスポンジン（ＴＳＰ－１）またはＳＩＲＰα）とのライゲーションが全くないかまたは検出不可能なレベルであるＣＤ４７を発現する。
【0089】
例えば、ＣＤ４７がＴＳＰ－１に結合すると、ＣＤ４７を発現する細胞に炎症及び死を引き起こし得る。しかしながら、本開示は、ＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞がアポトーシスシグナル伝達を伝達しないという知見に部分的に基づいている。逆に、ＣＤ４７でクロスドレッシングされておらず、内因性または外因性にＣＤ４７を発現している細胞は、細胞死を受け、炎症が増加する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示に従って生成されたＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞は、ＥＶからのＣＤ４７でクロスドレッシングされていない、ＣＤ４７を発現する細胞と比較して、細胞死の減少を呈する。ある特定の実施形態では、本開示に従って生成されたＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞は、ＥＶからのＣＤ４７でクロスドレッシングされていない、ＣＤ４７を発現する細胞と比較して、ＳＩＲＰα、またはその断片、キメラ、及び／または融合物への曝露時に細胞死の減少を呈する。特定の実施形態では、本開示に従って生成されたＣＤ４７でクロスドレッシングされた細胞は、約５０ｎＭのヒトＳＩＲＰα－Ｆｃへの１時間の曝露時に、ＥＶからのＣＤ４７でクロスドレッシングされず、同じ量のＳＩＲＰα－Ｆｃへ曝露された、ＣＤ４７を発現する細胞と比較して、細胞死の減少を呈する。
【0090】
貪食は、当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載の、例えば、実施例４に記載の任意の方法によって決定することができる。例えば、細胞は、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレットで標識され得、ヒトマクロファージとともにインキュベートされ得る。次いで、貪食のレベルは、フローサイトメトリーを使用して、標識された標的細胞を貪食したマクロファージ（ＣＤ１４陽性細胞）のパーセンテージを決定することによって測定することができる。本明細書で提供されるのは、移植前に、異種移植片を、ヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露することを含む、異種移植片をクロスドレッシングさせる方法であって、方法が、クロスドレッシングされていない異種移植片と比較して、異種移植片の貪食を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％減少させる、方法である。
【0091】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される異種移植方法は、アポトーシスを誘導することなく貪食の減少をもたらす。アポトーシスは、当該技術分野で既知の任意の方法または本明細書に記載の方法を使用して測定することができる。例えば、アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＰＩ及びアネキシンＶで細胞を染色することによって測定することができる。アポトーシスは、検出不可能であり得るか、または、同種ＣＤ４７を発現する異種移植片と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％減少され得る。
【0092】
貪食の回避は、細胞のより長い生存を生じ得、ひいては、延長されたキメリズムを生じ得る。例えば、ブタ骨髄細胞におけるヒトＣＤ４７のクロスドレッシングは、ブタ骨髄細胞がヒトレシピエントへの移植後の貪食を回避することを可能にし得、これは、ブタ骨髄細胞の生存の延長をもたらす。次いで、ブタ骨髄細胞の生存期間が長くなると、ひいては、キメリズムの延長につながり得、これは、移植拒絶反応を回避するのに有益であり得る。
【0093】
本明細書で提供されるように、移植前に、ヒトＣＤ４７を含むＥＶで異種移植片をクロスドレッシングさせることは、異種移植片の炎症を低減する。いくつかの実施形態によれば、異種移植片の炎症は、検出不可能であり得るか、または、同種ＣＤ４７を発現する異種移植片と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％減少され得る。
【0094】
また、本明細書で提供される、移植前に、ヒトＣＤ４７を含むＥＶで異種移植片をクロスドレッシングさせることは、レシピエントにおける全身炎症を低減し得る。いくつかの実施形態によれば、異種移植片移植後のレシピエントにおける全身炎症は、検出不可能であり得るか、または、同種ＣＤ４７を発現する異種移植片を用いた移植後と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％減少され得る。
【0095】
移植拒絶反応は、異種移植片の多くのレシピエントにとって主要な問題であり、しばしば免疫抑制療法の長期投与を必要とし、貪食の回避がレシピエントにおける異種移植片の拒絶反応を低減し得る。したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、レシピエントにおける異種移植片の拒絶反応を低減するための方法であって、移植前に、異種移植片を、ヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露することを含む、方法である。
【0096】
いくつかの実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片のレシピエントと比較して、レシピエントへの免疫抑制療法の投与の低減（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０％超の投与の低減）をもたらす。特定の実施形態では、方法は、ヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片を受けている同等なレシピエント（例えば、レシピエントと同じタイプの組織または臓器を受けた、同じ性別の、かつ同等な年齢、身長、及び／または体重の人）に通常投与される免疫抑制療法の量と比較して、レシピエントへの免疫抑制療法の投与の低減（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０％超の投与の低減）をもたらす。特定の実施形態では、方法は、同等な臨床環境における標準ケアと比較して、レシピエントへの免疫抑制療法の投与の低減（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０％超の投与の低減）をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない以前の異種移植片を受けた後に当該レシピエントが必要とする免疫抑制療法の量と比較して、レシピエントへの免疫抑制療法の投与の低減（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０％超の投与の低減）をもたらす。他の実施形態では、方法は、同等な臨床環境における異種移植片が移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない、同等な臨床環境における免疫抑制療法の必要とされる量と比較して、レシピエントへの免疫抑制療法の投与の低減（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０％超の投与の低減）をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、免疫抑制療法、例えば、以下のセクション６．４．３に記載の免疫抑制療法の更なる投与を必要としないレシピエントをもたらす。
【0097】
いくつかの実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片と比較して、異種移植片の生存率の延長をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、同等なレシピエント（例えば、同じ性別の、かつ同等な年齢、身長、及び／または体重の患者）に移植された、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない同等な異種移植片（例えば、レシピエントと同じタイプの組織または臓器）と比較して、異種移植片の生存率の延長（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～７５％、７５～１００％、１００～２００％、２００～３００％、もしくは３００％超の生存率の延長、または１～２年、２～３年、３～４年、４～５年、５～６年、６～８年、８～１０年、１０～１５年、もしくは１５～２０年の延長）をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、当該レシピエントが以前に受けた、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない、異種移植片の生存率と比較して、異種移植片の生存率の延長（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～７５％、７５～１００％、１００～２００％、２００～３００％、もしくは３００％超の生存率の延長、または１～２年、２～３年、３～４年、４～５年、５～６年、６～８年、８～１０年、１０～１５年、もしくは１５～２０年の延長）をもたらす。
【0098】
いくつかの実施形態では、方法は、異種移植片が移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない、同等な臨床環境における異種移植片の生存率と比較して、生存率の延長（例えば、約１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～７５％、７５～１００％、１００～２００％、２００～３００％、もしくは３００％超の生存率の延長、または１～２年、２～３年、３～４年、４～５年、５～６年、６～８年、８～１０年、１０～１５年、もしくは１５～２０年の延長）をもたらす。
【0099】
いくつかの実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片のレシピエントと比較して、レシピエントのより良好な健康に関連する生活の質をもたらす。他の実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片を受けた同等なレシピエント（例えば、レシピエントと同じタイプの組織または臓器を受けた、同じ性別の、かつ同等な年齢、身長、及び／または体重の人）と比較して、レシピエントのより良好な健康に関連する生活の質をもたらす。他の実施形態では、方法は、以前の異種移植後に当該レシピエントが経験した健康に関連する生活の質と比較して、レシピエントのより良好な健康に関連する生活の質をもたらす。他の実施形態では、方法は、異種移植片が、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない、同等な臨床環境と比較して、レシピエントのより良好な健康に関連する生活の質をもたらす。健康に関連する生活の質とは、個人の生活の質に対する健康側面の全体的な影響を指し、身体的症状、機能的状態、心理的状態、及び社会的関係性を含む。健康に関連する生活の質は、例えば、３６－Ｉｔｅｍ Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ Ｓｕｒｖｅｙ（ＳＦ－３６）、ＥｕｒｏＱｏｌ－５ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ＥＱ－５Ｄ）、及びＫｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＫＤＱＯＬ）を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって評価することができる。例えば、Ｐａｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｃｅｎｔｅｒｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）１２：１７１－１８１を参照されたい。
【0100】
いくつかの実施形態では、方法は、移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片のレシピエントと比較して、移植レシピエントのより長い（例えば、１０～２０％、２０～３０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、もしくは９０～１００％長い、または２～３倍、３～５倍、５～７倍、７～１０倍、もしくは１０～１５倍長い）生存をもたらす。他の実施形態では、方法は、ヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない異種移植片を受けた同等なレシピエント（例えば、レシピエントと同じタイプの組織または臓器を受けた、同じ性別の、かつ同等な年齢、身長、及び／または体重の人）の生存と比較して、移植レシピエントのより長い（例えば、１０～２０％、２０～３０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、もしくは９０～１００％長い、または２～３倍、３～５倍、５～７倍、７～１０倍、もしくは１０～１５倍長い）生存をもたらす。他の実施形態では、方法は、異種移植片が移植前にヒトＣＤ４７を含むＥＶに曝露されていない、同等な臨床環境における移植レシピエントの生存と比較して、移植レシピエントのより長い（例えば、１０～２０％、２０～３０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、もしくは９０～１００％長い、または２～３倍、３～５倍、５～７倍、７～１０倍、もしくは１０～１５倍長い）生存をもたらす。
【0101】
一態様では、本明細書に記載の移植の方法は、タンパク尿のリスク、重症度、または持続時間の低減をもたらす。１日当たり１５０ｍｇを超えるタンパク質排泄は、一般的にタンパク尿の診断として使用される。ディップスティック分析は、しばしば尿中のタンパク質濃度を測定するために使用される。これは半定量的方法であり、その結果は負、トレース、１＋、２＋、３＋、または４＋として表される。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ ａｎｄ Ｔｅｍｔｅ，Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ６２（６）：１３３３－１３４０（２０００）を参照されたい。総タンパク質レベルまたはアルブミンレベルのみを測定して定量試験を提供してもよい。結果は、総タンパク質もしくはアルブミンレベルで、またはアルブミン対クレアチンの比またはタンパク質対クレアチンの比で発現され得る。
【0102】
特定の実施形態では、本明細書に記載の移植の方法は、タンパク尿の重症度の低減をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載の移植の方法は、タンパク尿の持続時間の低減をもたらす。例えば、本明細書の方法に従って処置された患者におけるタンパク尿の重症度は、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされていないドナー腎臓を受けた患者において観察されるタンパク尿の重症度と比較して、減少され得る。
【0103】
いくつかの実施形態では、尿中のタンパク質レベルによって測定されるタンパク尿の重症度は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％を超えて低減する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置された患者は、尿中の１日当たり１５０ｍｇを超えるタンパク質の排泄量として定義されるタンパク尿を経験しない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置された患者は、移植後１、２、３、３～７、７～１０、１０～１４日後、または１～２、２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８週間後、または１、２、３、４、５、６か月後に消失する一過性タンパク尿を経験することがある。
【0104】
いくつかの実施形態では、タンパク尿を発症する、本明細書に記載される方法で処置されたレシピエントの尿中の総タンパク質の濃度は、１日当たり約６０ｍｇ未満、１日当たり約８０ｍｇ未満、１日当たり約１００ｍｇ未満、１日当たり約１２０ｍｇ未満、１日当たり約１４０ｍｇ未満、１日当たり約１６０ｍｇ未満、１日当たり約２００ｍｇ未満、１日当たり約２２０ｍｇ未満、１日当たり約２４０ｍｇ未満、１日当たり約２６０ｍｇ未満、１日当たり約２８０ｍｇ未満、１日当たり約３００ｍｇ未満、１日当たり約３２０ｍｇ未満、１日当たり約３４０ｍｇ未満、１日当たり約３６０ｍｇ未満、１日当たり約３８０ｍｇ未満、または１日当たり約４００ｍｇ未満である。
【0105】
いくつかの実施形態では、タンパク尿を発症する、本明細書に記載される方法で処置されたレシピエントの尿中のアルブミンの濃度は、１日当たり約５ｍｇ未満、１日当たり約１０ｍｇ未満、１日当たり約２０ｍｇ未満、１日当たり約３０ｍｇ未満、１日当たり約４０ｍｇ未満、１日当たり約５０ｍｇ未満、１日当たり約６０ｍｇ未満、１日当たり約７０ｍｇ未満、１日当たり約８０ｍｇ未満、１日当たり約９０ｍｇ未満、または１日当たり約１００ｍｇ未満である。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者の２４時間尿試料中のクレアチニンに対するタンパク質の比は、約０．２未満、約０．４未満、約０．６未満、約０．８未満、または約１未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者の２４時間尿試料中のクレアチニンに対するアルブミンの比は、約０．０２未満、約０．０４未満、約０．０６未満、約０．０８未満、または約０．１未満である。
【0107】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で処置されたレシピエントがタンパク尿を発症するリスクは、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされていないドナー腎臓のレシピエントのリスクと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少する。
【0108】
８．４．３．追加の処置
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者は、追加の処置を受ける。患者は、１つ以上の異なる方法による追加の処置を受ける場合がある。追加の処置は、本明細書で提供される処置の方法の前に、それと同時に、またはその後に行われ得る。
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者は、追加の処置を受ける。患者は、１つ以上の異なる方法による追加の処置を受ける場合がある。追加の処置は、本明細書で提供される処置の方法の前に、それと同時に、またはその後に行われ得る。
【0109】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って異種移植片を受けている患者は、骨内骨髄移植（ＩＢＢＭ）を受ける。特定の実施形態では、骨髄は、異種移植片と同じソースからのものである。特定の実施形態では、骨髄は、ヒトＣＤ４７を発現する。
【0110】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って異種移植片を受けた患者は、免疫抑制療法を受ける。免疫抑制療法は、移植拒絶反応を低減させる、及び／または異種移植の転帰を寛解するために示される任意のＦＤＡに承認された処置であってもよい。免疫抑制療剤の非限定的な例としては、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムスまたはシクロスポリン）、抗増殖剤（例えば、ミコフェノール酸塩、６－メルカプトプリンまたはそのプロドラッグであるアザチオプリン等の抗代謝物質）、ラパマイシンの哺乳動物標的の阻害剤（ｍＴＯＲ）（例えば、シロリムス、ラパマイシン）、ステロイド（例えば、プレドニゾン）、細胞周期阻害剤（アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル）、リンパ球除去剤（例えば、抗胸腺細胞グロブリン、またはアレムツズマブ、シプリズムまたはバシリキシマブ等の抗体）及び共刺激遮断剤（例えば、ベラタセプト）が挙げられる。例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ（２０２０）．，Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．Ｍａｒ；８（６）：４０９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｖ；２９：１９０１３２及びＢｅｎｖｅｎｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ １０：３１４１－３１５５を参照されたい。
【0111】
免疫抑制療法は、導入療法（周術期、または手術直後）、維持用量として、または急性拒絶反応のために、投与することができる。導入療法には、一般的に、バシリキシマブ、抗胸腺細胞グロブリンまたはアレムツズマブが含まれる。免疫抑制療法はまた、レシピエントの生涯にわたって継続するためにしばしば必要とされる維持療法として投与され得る。維持免疫抑制療法は、一般的に、カルシニューリン阻害剤（タクロリムスまたはシクロスポリン）、抗増殖剤（ミコフェノール酸塩またはアザチオプリン）、及びコルチコステロイドを含む。急性拒絶反応に対する免疫抑制療法には、一般的に、チモグロブリンまたはミコフェノール酸塩が含まれる。例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．Ｍａｒ；８：４０９及びＢｅｎｖｅｎｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ １０：３１４１－３１５５を参照されたい。
【0112】
免疫抑制剤の非限定的な例としては、（１）プリン合成阻害剤（例えば、イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤、例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸塩、及びミコフェノール酸モフェチル）、ピリミジン合成阻害剤（例えば、レフルノミド及びテリフルノミド）、及び葉酸代謝拮抗剤（ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ）（例えば、メトトレキサート）等の代謝拮抗剤；（２）タクロリムス、シクロスポリンＡ、ピメクロリムス、及びボクロスポリン等のカルシニューリン阻害剤；（３）サリドマイド及びレナリドミド等のＴＮＦ－アルファ阻害剤；（４）アナキンラ等のＩＬ－１受容体拮抗剤；（５）ラパマイシン（シロリムス）、デフォロリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、及びバイオリムスＡ９等のラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤；（６）プレドニゾン等のコルチコステロイド；ならびに（７）いくつかの細胞標的または血清標的のうちのいずれか１つに対する抗体（抗リンパ球グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリンを含む）が挙げられる。
【0113】
非限定的な例示的な細胞標的及びそのそれぞれの阻害剤化合物としては、補体成分５（例えば、エクリズマブ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、アフェリモマブ及びゴリムマブ）、ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）、ＢＡＹＸ（例えば、ネレリモマブ）、インターフェロン（例えば、ファラリモマブ）、ＩＬ－６（例えば、エルシリモマブ）、ＩＬ－１２及びＩＬ－１３（例えば、レブリキズマブ及びウステキヌマブ）、ＣＤ３（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テペリズマブ、ビシリズマブ）、ＣＤ４（例えば、クレノリキシマブ、ケリキシマブ及びザノリムマブ）、ＣＤＩ ｌａ（例えば、エファリズマブ）、ＣＤ１８（例えば、エルリズマブ）、ＣＤ２０（例えば、アフツズマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ）、ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）、ＣＤ４０（例えば、テネリキシマブ、トラリズマブ）、ＣＤ６２Ｌ／Ｌ－セレクチン（例えば、アセリズマブ）、ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ）、ＣＤ１４７／ベイシジン（例えば、ガビリモマブ）、ＣＤ１５４（例えば、ルプリズマブ）、ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）、ＣＡＴ（例えば、ベルチリムマブ、レルデリムマブ、メテリムマブ）、インテグリン（例えば、ナタリズマブ）、ＩＬ－６受容体（例えば、トシリズマブ）、ＬＦＡ－１（例えば、オズリモマブ）、ならびにＩＬ－２受容体／ＣＤ２５（例えば、バシリキマブ、ダシリズマブ、イノリモマブ）が含まれるが、それらに限定されない。
【0114】
８．４．４．患者集団
好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者（例えば、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされた異種移植片のレシピエント）は、ヒト患者である。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は交換可能に使用され、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。非限定的な例としては、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ラット、マウス、イヌ及びネコ種のメンバーが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、対象は、ヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト小児である。特定の実施形態では、対象は、ヒトであり、ブタドナーから１つ以上のドナー移植片を受ける。他の特定の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、カニクイザルまたはアカゲザル）であり、ブタドナーから１つ以上の移植片を受ける。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者（例えば、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングされた異種移植片のレシピエント）は、ヒト患者である。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は交換可能に使用され、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。非限定的な例としては、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ラット、マウス、イヌ及びネコ種のメンバーが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、対象は、ヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト小児である。特定の実施形態では、対象は、ヒトであり、ブタドナーから１つ以上のドナー移植片を受ける。他の特定の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、カニクイザルまたはアカゲザル）であり、ブタドナーから１つ以上の移植片を受ける。
【0115】
一態様では、本明細書に記載の方法に従って処置された患者は、腎移植を必要とする。患者は、腎不全またはドナー腎臓の拒絶反応のために腎臓移植を必要とする場合がある。腎不全には、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、身体傷害、糖尿病、腎臓病（多嚢胞性腎疾患、糸球体疾患）、及びループス等の自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない多くの原因があり得る。腎不全は、急性または慢性であり得る。腎不全は、糸球体濾過率、血中尿素窒素、及び血清クレアチニン等の臨床検査、画像検査（超音波、コンピュータ断層撮影）または腎臓生検によって診断することもできる。
【0116】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、ステージ１の腎臓病を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、ステージ２の腎臓病を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、ステージ３の腎臓病を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、ステージ４の腎臓病を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、ステージ５の腎臓病を有する。
【0117】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、約９０以上の糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、約６０～９０のＧＦＲを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、約３０～６０のＧＦＲを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、約１５～３０のＧＦＲを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置された患者は、約１５以下のＧＦＲを有する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【実施例】
【0118】
９．実施例
このセクション（すなわち、セクション７）の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
このセクション（すなわち、セクション７）の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
【0119】
９．１ 実施例１：ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞との共培養後のトランスジェニックｈＣＤ４７によるブタＬＣＬ細胞及びヒトＪｕｒｋａｔ細胞のクロスドレッシング
この実施例は、異種ヒトＣＤ４７が、共培養後にヒトＣＤ４７を発現しない細胞株において正常に発現されることができることを実証する。
この実施例は、異種ヒトＣＤ４７が、共培養後にヒトＣＤ４７を発現しない細胞株において正常に発現されることができることを実証する。
【0120】
ヒトＣＤ４７をＥＶによって１つの細胞から別の細胞に移すことができるかどうかを決定するために、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）を発現しない親ブタＢリンパ腫細胞株（ＬＣＬ）からの細胞を、ｈＣＤ４７をトランスジェニックに発現するＬＣＬ細胞と共培養した。図１Ａ及び図２に示されるように、親ブタＬＣＬ細胞株は、ＦＡＣＳによって測定したところ、ｈＣＤ４７を発現しなかった（図１Ａ、図２、及び表２）。対照的に、トランスジェニックヒトＣＤ４７を発現するブタＬＣＬ細胞（ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞）は、高レベルのＣＤ４７を発現した（図１Ｂ、図２、及び表２）。注目すべきことに、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞との共培養後の親ＬＣＬ細胞株におけるｈｕＣＤ４７の検出は、ｈＣＤ４７発現の強力な増加を示した（図１Ｃ、図２、及び表２）。
【表2】
【0121】
ＣＤ４７がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってノックアウトされ、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞と共培養されたヒトＴ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して、同様の結果が観察された。簡潔には、ＣＤ４７ノックアウト（ＫＯ）Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｈＣＤ４７－Ｔｇ ＬＣＬ細胞と共培養し、ｈＣＤ４７発現を、ＦＡＣＳによって測定した。図３Ｂに示されるように、共培養は、ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｈＣＤ４７発現の強い増加に至った（図３Ｂ及び表２）。
【0122】
これらのデータは、ヒトＣＤ４７を発現する細胞と共培養することによって、ブタ細胞をヒトＣＤ４７でクロスドレッシングさせることができることを示した。
【0123】
９．２ 実施例２：野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養後の天然ｈＣＤ４７によるブタＬＣＬ及びｈＣＤ４７ノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞のクロスドレッシング
この実施例は、共培養後の１つの細胞株から別の細胞株へのｈＣＤ４７のクロスドレッシングが、追加の例示的な細胞株モデルにおいて再現可能であったことを実証する。
この実施例は、共培養後の１つの細胞株から別の細胞株へのｈＣＤ４７のクロスドレッシングが、追加の例示的な細胞株モデルにおいて再現可能であったことを実証する。
【0124】
簡潔には、ＣＤ４７ノックアウト（ＫＯ）細胞を、親（野生型、ＷＴ）Ｊｕｒｋａｔ細胞またはブタＬＣＬ細胞と２４時間共培養し、抗ｈＣＤ４７－ＢＶ７８６ ｍＡｂを使用して、ゲーティングされたＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するｈＣＤ４７クロスドレッシングについて、ＦＡＣＳによって分析した。単独で培養した細胞を染色対照として使用し、染色対照を別々に染色するか、または染色直前に混合した。示されているのは、代表的なヒストグラムである（図中の数字は、ゲーティングされたＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す）。
【0125】
図４Ａに示されるように、ＦＡＣＳによって決定したＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒトＣＤ４７のレベルは、野生型（ＷＴ）Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して、ほぼ完全に検出不可能であった（それぞれ、図４及び図４Ｂ、図６及び表３）。ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養後、ＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ｈＣＤ４７の強力な増加が観察された（図４Ｃ、図６、及び表３）。
【表3】
【0126】
ブタＬＣＬ細胞をＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養すると、同様の結果が観察された。図５Ａ～５Ｂに示されるように、ブタＬＣＬ細胞のＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養は、非共培養ブタＬＣＬ細胞と比較して、ｈＣＤ４７発現に強い増加をもたらした（それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂ、ならびに表３）。
【0127】
これらの結果はまた、ヒトＣＤ４７クロスドレッシングを、ヒト細胞に対して行うことができ、ｈＣＤ４７トランスジェニック細胞だけでなく、天然ＣＤ４７のみを発現する細胞によっても誘導することができることを示した。
【0128】
９．３ 実施例３：ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞からの細胞外小胞またはエクソソームによるＣＤ４７ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ４７クロスドレッシング
この実施例は、ＣＤ４７を発現する細胞から単離されたＥＶを使用して、ＣＤ４７を発現しない細胞をクロスドレッシングさせることができることを実証する。
この実施例は、ＣＤ４７を発現する細胞から単離されたＥＶを使用して、ＣＤ４７を発現しない細胞をクロスドレッシングさせることができることを実証する。
【0129】
簡潔には、ＭＶ及びエクソソームを、１０％のエクソソーム枯渇ＦＢＳ中で培養したＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞から収集した上清から単離した。細胞培養上清からの細胞外小胞（ＥＶ）及びエクソソーム（Ｅｘｏｓ）を、標準画分遠心分離プロトコルによって精製した。４８時間の細胞培養物から収集した上清を、２，０００ｇ（３，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心分離して、細胞デブリ及び死細胞を除去した。細胞外小胞を、１６，５００ｇ（９，８００ｒｐｍ）で４５分間遠心分離した後ペレット化し（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｏｐｔｉｍａ ＸＥ－９０）、ＰＢＳに再懸濁させた。上清からのペレット化したエクソソームを、１００，０００ｇ（２６，４５０ｒｐｍ）で２時間、４℃で更に遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｏｐｔｉｍａ ＸＥ－９０）、ＰＢＳに再懸濁させた。
【0130】
その後、単離したＭＶ及びエクソソームを、ＣＤ４７がノックアウトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ４７ ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞）と２時間または６時間共培養した。図７Ｃに示されるように、ＭＶとの２時間の共培養は、ＣＤ４７ ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ４７発現の増加に至った（図７Ｃ及び表４）。ＭＶまたはエクソソームとの共培養の６時間後、ＣＤ４７ ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＣＤ４７発現が増加した（それぞれ、図８Ｃ及び図８Ｄ、ならびに表４）。
【表4】
【0131】
これらのデータは、ｈＣＤ４７を発現する細胞からのＥＶ（例えば、ＭＶまたはエクソソーム）を使用して、ｈＣＤ４７を発現しない細胞をクロスドレッシングさせることができることを示している。
【0132】
９．４ 実施例４：ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞からの細胞外小胞またはエクソソームによるブタＬＣＬ細胞のＣＤ４７クロスドレッシング
この実施例は、共培養後に、ブタ細胞をヒト細胞からのｈＣＤ４７でクロスドレッシングさせることができることを実証する。
この実施例は、共培養後に、ブタ細胞をヒト細胞からのｈＣＤ４７でクロスドレッシングさせることができることを実証する。
【0133】
簡潔には、上記のように、ＭＶ及びエクソソームをＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞から単離した。その後、単離したＭＶ及びエクソソームを、ｈＣＤ４７を発現しないブタＬＣＬ細胞と２時間または６時間共培養した。図９Ｃに示されるように、ＭＶとの２時間の共培養は、ブタＬＣＬ細胞におけるＣＤ４７発現の増加に至った（図９Ｃ及び表５）。ＭＶまたはエクソソームとの共培養の６時間後、ブタＬＣＬ細胞において、ＣＤ４７発現が増加した（それぞれ、図１０Ｃ及び図１０Ｄ、ならびに表５）。
【表5】
【0134】
これらのデータは、野生型ヒトＪｕｒｋａｔ細胞から単離されたＥＶまたはエクソソームへの曝露によって、ブタＬＣＬ細胞（ブタＣＤ４７を発現する）を、ヒトＣＤ４７でクロスドレッシングさせることができることを示している。
【0135】
１０．均等物
本発明の具体的な実施形態を参照しながら、本発明について詳細に説明されているが、機能的に均等である変形形態が、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正形態は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明白になるであろう。そのような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本発明の具体的な実施形態を参照しながら、本発明について詳細に説明されているが、機能的に均等である変形形態が、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正形態は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明白になるであろう。そのような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【0136】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、本明細書に参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】