特表 2024-533113 ヒトビトロネクチン断片及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】ヒトビトロネクチン断片及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/78 20060101AFI20240905BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20240905BHJP

   C07K 17/08 20060101ALI20240905BHJP

   C07K 17/02 20060101ALI20240905BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20240905BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 15/70 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

C07K14/78

C12N15/12 ZNA

C12N15/10 200Z

C07K17/08

C07K17/02

C12M3/00 A

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N15/70 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N5/0775

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513724

(86)(22)【出願日】2022-08-31

(85)【翻訳文提出日】2024-03-07

(86)【国際出願番号】 US2022042228

(87)【国際公開番号】W WO2023034430

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/239,456

(32)【優先日】2021-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520122600

【氏名又は名称】バイオ－テクネ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フリン，ケビン シー．

(72)【発明者】

【氏名】アンデルセン，マーネル

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジュン

(72)【発明者】

【氏名】アイザックソン，エイミー

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ，ブライアン ジェイ．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC02

4B029CC13

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4B065AA26X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC12

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BA06

4B065BA30

4B065BC41

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA61

4H045BA62

4H045CA40

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、野生型ビトロネクチンまたは以前に特徴付けられたビトロネクチン断片と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける改善された製造可能性、幹細胞培養用途における改善された機能、及び改善された安定性を有するヒトビトロネクチンフラグメントに関する。本発明は、細胞培養用及び再生医療における基質としてのその使用に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビトロネクチンポリペプチド断片であって：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくとも５０個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失を含み；
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくともＣ末端アミノ酸３６２～４７８の欠失を含み；
ビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み；
ビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメインを含まない；
ビトロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン及びＨｐ４ドメインを含まない；及び
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの同じ断片に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項2】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及び／またはＨｐ３ドメインを含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項3】

請求項１または２に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、約２００～約３５０アミノ酸の長さを有する、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失；及び
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、Ｃ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの残基６２～２９２に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの、
６３位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６７位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６８位に相当する位置でのアミノ酸置換；
８０位に相当する位置でのアミノ酸置換；及び／または
１４８位に相当する位置でのアミノ酸置換、を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項7】

前記アミノ酸置換が、Ｔ６３Ｇ置換、Ｖ６７Ｓ置換、Ｖ６７Ｎ置換、Ｆ６８Ｐ置換、Ｄ８０Ｙ置換、及び／またはＱ１４８Ｅ置換を含む、請求項６に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項8】

配列番号２からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項9】

配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項10】

Ｄ８０位における前記アミノ酸置換がＤ８０Ｙ置換を含み、及び／またはＱ１４８位における前記アミノ酸置換がＱ１４８Ｅ置換を含む、請求項９に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項11】

配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、６３位に相当する位置でのアミノ酸置換、６７位に相当する位置でのアミノ酸置換、及び／または６８位に相当する位置でのアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項12】

Ｔ６３位における前記アミノ酸置換がＴ６３Ｇ置換を含み、Ｖ６７位における前記アミノ酸置換がＶ６７Ｓ置換またはＶ６７Ｎ置換を含み、及び／またはＦ６８位における前記アミノ酸置換がＦ６８Ｐ置換を含む、請求項１１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項13】

Ｃ末端Ｈｉｓ－タグをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項14】

１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のＣ末端Ｈｉｓ残基を含む、請求項１３に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項15】

配列番号３からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、非動物由来である、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項17】

マイクロキャリアにコンジュゲートしている、請求項１～１６のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項18】

前記マイクロキャリアが、ヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含む、請求項１７に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート。

【請求項19】

請求項１～１６のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、または請求項１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲートを含む組成物。

【請求項20】

請求項１９に記載の組成物であって、非動物由来である、前記組成物。

【請求項21】

細胞培養基質として使用するための、請求項１～１６のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、請求項１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または請求項１９もしくは２０に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１～１６のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列。

【請求項23】

請求項２２に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【請求項24】

請求項２３に記載の発現ベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含む、前記発現ベクター。

【請求項25】

請求項２２に記載のヌクレオチド配列または請求項２３もしくは２４のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項26】

請求項２５に記載の宿主細胞であって、Ｅ．ｃｏｌｉを含む、前記宿主細胞。

【請求項27】

ビトロネクチンポリペプチド断片を産生する方法であって、請求項２２に記載のヌクレオチド配列、請求項２３もしくは２４に記載の発現ベクター、または請求項２５もしくは２６に記載の宿主細胞から、前記ビトロネクチンポリペプチド断片を発現させることを含む、前記方法。

【請求項28】

前記産生されたビトロネクチン断片ポリペプチドが非動物由来である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

細胞培養方法であって、請求項１～１８のいずれか１項に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、請求項１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または請求項１９もしくは２０に記載の組成物を含む基質上で細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項30】

前記細胞が幹細胞を含む、請求項２９に記載の細胞培養方法。

【請求項31】

前記細胞を非動物由来条件下で培養する、請求項２９または３０に記載の細胞培養方法。

【請求項32】

細胞培養がエクスビボである、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。

【請求項33】

前記細胞が、幹細胞を含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の細胞培養方法。

【請求項34】

前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、請求項３３に記載の細胞培養方法。

【請求項35】

前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、請求項３３に記載の細胞培養方法。

【請求項36】

細胞培養方法であって、配列番号２または配列番号３からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む基質上で幹細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項37】

細胞培養方法であって、ビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号２からなり、配列番号２が、
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６３位に相当する位置でのＴ６３Ｇアミノ酸置換；
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６７位に相当する位置でのＶ６７ＳまたはＶ６７Ｎアミノ酸置換；及び
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６８位に相当する位置でのＦ６８Ｐアミノ酸置換、によって変更されている、前記ビトロネクチンポリペプチド断片、を含む基質上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年９月１日に出願された米国仮出願第６３／２３９，４５６号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、２０２２年８月２３日に作成された、５キロバイトのサイズを有する「０５４１－００００１７ＷＯ０１」という表題のＸＭＬファイルとして特許センター経由で米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表の電子出願により、電子的に提出された配列表は、３７ ＣＦＲ §１．８２１（ｃ）により要求される紙のコピーと§１．８２１（ｅ）により要求されるＣＲＦの両方として機能する。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

再生医療は、損傷もしくは疾患細胞、組織、及び臓器を修復、再生、または置換することを目的とした成長中の医療分野である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と多能性幹細胞（ＰＳＣ）（胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む）はともに、現在、再生医療における種々の適応症に対し臨床試験中である。再生医療の重要な側面は、組織置換戦略の治療薬として使用するための幹細胞及びそれらの誘導体のエクスビボでの培養及び拡大である（Ｂｌａｕ ａｎｄ Ｄａｌｅｙ， ２０１９， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３８０（１８）：１７４８－１７６０）。これらの細胞を生成する際の重要なステップは、安全で堅牢なエクスビボ培養である。これは、堅牢な機能性を維持しながら、（供給の観点から）安全で信頼できる細胞培養培地及び基質の最適化を伴う。安全性に関しては、米国薬局方（ＵＳＰ）刊行物ＵＳＰ＜１０４３＞（ＵＳＰ４３－ＮＦ３８－７３８１、ＵＳＰ－ＮＦ＜１０４３＞“Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ， Ｇｅｎｅ， ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，” Ｐｈａｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ；４３：７３８１）に基準が概説されており、これは、再生医療を含む細胞及び遺伝子治療で補助材料として使用される原材料のリスク分類のための段階的システムを詳述している（ＵＳＰ４３－ＮＦ３８）。動物成分含有試薬の使用は高リスク（第４段階）であると考えられるが、ＧＭＰ条件下で生成された非動物由来材料は低リスク（第２段階）であると考えられる。したがって、幹細胞培養用の低リスクで非動物由来基質を実現することは、再生医療におけるより広範な用途を推進するための重要な目標である。

【0004】

ＭＳＣ及びＰＳＣの従来の細胞培養技術では、フィブロネクチンなどの血漿精製マトリックス（Ｖｅｅｖｅｒｓ－Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；１２４（Ｐｔ ８）：１２８８－３００；及びＳｏｍａｉａｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１０（１２）：ｅ０１４５０６８）、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）もしくはＣＵＬＴＲＥＸ ＢＭＥ（商標）などの複雑性腫瘍由来マトリックス（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；１９（１０）：９７１－４）のいずれかを使用する。より最近では、組換え製造プロトコールを用いて作製されたより均質な組成を有するマトリックス（ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンを含む）が幹細胞の培養に使用されている（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ；３：１２３６；Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ： Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ；４：１９３１；Ｂｒａａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；２６（９）：２２５７－６５；及びＫａｌａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；１０（８３）：２０１３０１３９）。これらの基質は、ばらつきを低減し、細胞培養環境の精細度を改善することができる。しかし、これらのタンパク質またはタンパク質断片は、製造が困難で高価である場合があり、及び／または動物細胞で作製される。

【0005】

再生医療の分野では、製造が容易で、堅牢で、真に非動物由来のマトリックス分子が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、ビトロネクチンポリペプチド断片を含み、ビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくとも５０個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失を含み；配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくともＣ末端アミノ酸３６２～４７８の欠失を含み；ビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み；ビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメインを含まない；ビトロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン及びＨｐ４ドメインを含まない；及び配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドの同じ断片に対する約９５％の配列同一性を含む。

【0007】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及び／またはＨｐ３ドメインを含む。

【0008】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、約２００～約３５０アミノ酸の長さを有する。

【0009】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、以下：配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失；配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、Ｃ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失、を含む。

【0010】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドの残基６２～２９２に対する約９５％の配列同一性を含む。

【0011】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの８０位及び／または１４８位に相当する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、Ｄ８０Ｙ置換及び／またはＱ１４８Ｅ置換を含む。

【0012】

いくつかの態様では、ビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６３位、６７位、及び／または６８位に相当する位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ６３Ｇ置換及び／またはＶ６７Ｓ置換及び／またはＶ６７Ｎ置換及び／またはＦ６８Ｐ置換を含む。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、Ｔ６３Ｇ置換、Ｖ６７Ｓ置換またはＶ６７Ｎ置換、及びＦ６８Ｐ置換を含む。

【0013】

本開示は、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む。

【0014】

本開示は、配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む。いくつかの態様では、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換はＤ８０Ｙ置換を含み、及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換はＱ１４８Ｅ置換を含む。

【0015】

本開示は、配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｔ６３位におけるアミノ酸置換及び／またはＶ６７及び／またはＦ６８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む。いくつかの態様では、Ｔ６３位におけるアミノ酸置換はＴ６３Ｇ置換を含み、及び／またはＶ６７位におけるアミノ酸置換はＶ６７ＳまたはＶ６７Ｎ置換を含む。いくつかの態様では、Ｆ６８位におけるアミノ酸置換は、Ｆ６８Ｐ置換を含む。

【0016】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片は、Ｃ末端Ｈｉｓタグをさらに含む。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のＣ末端Ｈｉｓ残基を含む。

【0017】

本開示は、配列番号３からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む。

【0018】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片は、非動物由来である。

【0019】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片は、マイクロキャリアにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、マイクロキャリアはヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含む。

【0020】

本開示は、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片、または本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲートの組成物を含む。いくつかの態様では、組成物は、非動物由来である。

【0021】

いくつかの態様では、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または本明細書に開示される組成物は、細胞培養基質として使用するためのものである。

【0022】

本開示は、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0023】

本開示は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含む。

【0024】

本開示は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列または本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉを含む。

【0025】

本開示は、ビトロネクチンポリペプチド断片を産生する方法であって、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、本明細書に開示される発現ベクター、または本明細書に開示される宿主細胞からビトロネクチンポリペプチド断片を発現させることを含む、方法を含む。いくつかの態様では、産生されるビトロネクチン断片ポリペプチドは、非動物由来である。

【0026】

本開示は、細胞培養方法であって、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または本明細書に開示される組成物を含む基質上で細胞を培養することを含む、方法を含む。いくつかの態様では、細胞は、幹細胞を含む。いくつかの態様では、細胞を、非無動物由来条件下で培養する。いくつかの態様では、細胞培養はエクスビボである。

【0027】

本明細書で使用される場合、「単離された」とは、元の環境（例えば、天然に存在する場合は天然環境）から取り出された材料を指し、したがって、その天然状態から「ヒトの手によって」変更されたものである。

【0028】

「及び／または」という用語は、列挙された要素の１つもしくはすべて、または列挙された要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

【0029】

「好ましい」及び「好ましくは」という言葉は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらすことができる本発明の実施形態を指す。しかし、同じかまたは他の状況下では、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、また、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図するものではない。

【0030】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語及びその変形形態は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有さない。

【0031】

「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句の後に来るものすべてを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、かつ他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、この語句の後に列挙された任意の要素を含み、他の要素については、列挙された要素の開示において指定された活性または作用を妨げず、寄与もしない要素に限定することを意味する。したがって、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、列挙された要素は必要または必須であるが、他の要素については任意選択であり、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼすかどうかに応じて、他の要素が存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示す。

【0032】

別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は互換的に使用され、１つまたは複数を意味する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「または」という用語は、その内容に別段の明確な指示がない限り、「及び／または」を含むその通常の意味で一般的に使用される。

【0034】

「及び／または」という用語は、列挙された要素の１つもしくはすべて、または列挙された要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

【0035】

本明細書における端点による数値範囲の記載には、その範囲内に包含されるすべての数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。

【0036】

ここで、「最大」ある数字（例えば、最大５０）には、その数（例えば、５０）も含まれる。

【0037】

「範囲に（ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）」または「範囲内（ｗｉｔｈｉｎ ａ ｒａｎｇｅ）」という用語（及び同様の記述）には、記述された範囲の端点が含まれる。

【0038】

別段の指定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、別段の指定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、均等論を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

【0039】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、すべての数値には、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる範囲が本質的に含まれている。

【0040】

個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法では、ステップは実行可能な任意の順序で実行することができる。また、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に実行することができる。

【0041】

本明細書全体で、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「ある特定の実施形態（ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」、または「いくつかの実施形態（ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」などへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特性、構造、組成または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の種々の箇所に出現するそのような語句は、必ずしも本開示の同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特性、構造、組成、または特徴は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わせることができる。

【0042】

本出願全体のいくつかの箇所において、ガイダンスは、例のリストを通じて提供され、例は、種々の組み合わせで使用することができる。それぞれの場合において、列挙されたリストは代表群としてのみ機能し、排他的リストとして解釈されるべきではない。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

【0043】

全体にわたるすべての見出しは読者の便宜のためのものであり、特に指定がない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】機能ドメインを有するビトロネクチンの線形構造を示す。完全なビトロネクチンポリペプチド鎖（上）及びこの研究で生成されたバリアントを示す。インテグリン結合ＲＧＤドメインは、残基６４～６６で標識されている。機能ドメインは以下の通りである：ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）、ヘモペキシン（ｈｅｍｏｅｐｏｘｉｎ）（Ｈｐ）、及びヘパリン結合（Ｈｂ）。２９３位と４３０位のシステイン間にジスルフィド結合がある。

【図2A】１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌの異なるＶＴＮ断片上で培養されたヒトｉＰＳＣ細胞の比較を示す。ここでは、ＮＳＯ細胞で作製された全長組換えＶＴＮが対照として含まれる。ＶＴＮ６２－１２０及びＶＴＮ６２－１５５上で増殖させたｉＰＳＣ細胞によって小さな丸いコロニーが生じるが、ＶＴＮ６２－２９２は大きなコロニーの増殖を支持する。ｉＰＳＣの代表的な明視野画像を示す。

【図2B】１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌの異なるＶＴＮ断片上で培養されたヒトｉＰＳＣ細胞の比較を示す。ここでは、ＮＳＯ細胞で作製された全長組換えＶＴＮが対照として含まれる。培養から４日後のｉＰＳＣの拡大倍率の定量を棒グラフで示す。バリアントのうち、ｈＶＴＮ６２－２９２断片のみが低濃度でｉＰＳＣ細胞の拡大を支持することができ、及び比較してＶＴＮ－Ｎバリアントは拡大が低下していることを示すことに留意されたい。

【図3A】１０μｇ／ｍｌ、及び５μｇ／ｍｌ、及び１μｇ／ｍｌの異なるＶＴＮ断片上で培養されたヒトＭＳＣ細胞の比較を示す。ＭＳＣの形態はすべてのＶＴＮバリアントで類似しているが、ＶＴＮ６２－１２０及びＶＴＮ６２－１５５では数が減少している。ＭＳＣの代表的な明視野画像を示す。

【図3B】１０μｇ／ｍｌ、及び５μｇ／ｍｌ、及び１μｇ／ｍｌの異なるＶＴＮ断片上で培養されたヒトＭＳＣ細胞の比較を示す。２継代培養後のＭＳＣの拡大倍率の定量を示す。細菌発現バリアントの中で、ｈＶＴＮ６２－２９２断片は低濃度（１μｇ／ｍｌ）で優れたＭＳＣ細胞拡大を示すことに留意されたい。

【図4A】ｈＶＴＮ６２－２９２上で培養した場合の多能性状態におけるｉＰＳＣの長期維持を示す。ｉＰＳＣを、非動物由来ｉＰＳＣ培地を使用したＶＴＮ６２－２９２バリアント上で維持し、５継代にわたって正常な形態及び健全な拡大が維持される。棒グラフは、１００，０００の細胞出発集団から４日間増殖させた後のウェルあたりの総生細胞の平均数を示す。

【図4B】ｈＶＴＮ６２－２９２上で培養した場合の多能性状態におけるｉＰＳＣの長期維持を示す。フローサイトメトリーで示されているように、長期培養の後、ｉＰＳＣは多能性のマーカーを維持している。濃灰色のヒストグラムは、抗体シグナルを示し、薄灰色のヒストグラムはアイソタイプ対照染色を示す。ｉＰＳＣは、幹細胞性マーカーであるＯｃｔ３、Ｓｏｘ２、及びＳＳＥＡ－４を高レベルに維持している。逆に、ｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣの分化マーカーであるＳＳＥＡ－１のレベルが低い。陽性細胞のパーセントを、フローグラフの右上に示す。フローグラフ上のゲートは、アイソタイプ対照によって設定した。

【図4C】ｈＶＴＮ６２－２９２上で培養した場合の多能性状態におけるｉＰＳＣの長期維持を示す。ＶＴＮ６２－２９２上で培養されたｉＰＳＣは、外胚葉細胞に分化する能力を維持している。画像は、外胚葉に分化した細胞を視覚化するための転写因子Ｏｔｘ２、及び総細胞数を視覚化するためのＤＡＰＩを示す。グラフは、未分化ｉＰＳＣと比較して、外胚葉分化後のＯｔｘ２を発現する細胞のパーセントの増加を示す。

【図4D】ｈＶＴＮ６２－２９２上で培養した場合の多能性状態におけるｉＰＳＣの長期維持を示す。ＶＴＮ６２－２９２上で培養されたｉＰＳＣは、胚体内胚葉に分化する能力を維持している。画像は、内胚葉分化細胞を可視化するための転写因子Ｓｏｘ１７の染色、及び総細胞数を可視化するためのＤＡＰＩの染色を示す。グラフは、未分化ｉＰＳＣと比較して、内胚葉分化後のＳｏｘ１７を発現する細胞のパーセントの増加を示す。

【図5A】ｈＶＴＮ６２－２９２上でのｉＰＳＣの長期維持後、完全に非動物由来のワークフローにおいて、ｉＰＳＣが神経前駆細胞（ＮＰＣ）及び前脳ニューロンに分化する能力を保持していることを示す。実験ワークフローを示す図である。ｉＰＳＣは、非動物由来ｉＰＳＣ培地を使用したＶＴＮ６２－２９２バリアント上で維持される。神経誘導は、阻害剤ＳＢ４３２１９及びＮ２－ＧＭＰサプリメントを用いて行われる。神経前駆細胞は、神経誘導の７～１０日後に出現する。２８日にわたり、２継代を経て、非動物由来Ｎ２１サプリメントを用いて神経培地に変換された後、前脳ニューロンが出現する。

【図5B】ｈＶＴＮ６２－２９２上でのｉＰＳＣの長期維持後、完全に非動物由来のワークフローにおいて、ｉＰＳＣが神経前駆細胞（ＮＰＣ）及び前脳ニューロンに分化する能力を保持していることを示す。ＩＢＪ６ ｉＰＳＣニューロンは、幹細胞性を維持する条件下で培養され（０日目、ｄ０）、１０日後（ｄ１０）に中間神経前駆細胞に分化し、または３２日後（ｄ３２）に終末前脳ニューロンに分化した。画像は、ナイーブｉＰＳＣが高レベルのＯｃｔ３／４を発現し、これはＮＰＣ分化の１０日後に大きく減少することを示す（左パネル）。ＮＰＣ分化の後、Ｐａｘ６発現の増加があり、これはナイーブｉＰＳＣでは観察されない（中央パネル）。神経分化の３２日後、長いベータ－３－チューブリン陽性神経突起を有するニューロンが多数存在し、これはナイーブｉＰＳＣには存在しない（右パネル）。より小さい画像は、核を介して細胞を可視化するためのＤＡＰＩ染色を示す。

【図5C】ｈＶＴＮ６２－２９２上でのｉＰＳＣの長期維持後、完全に非動物由来のワークフローにおいて、ｉＰＳＣが神経前駆細胞（ＮＰＣ）及び前脳ニューロンに分化する能力を保持していることを示す。棒グラフは、ｉＰＳＣの大部分（＞８０％）がＯｃｔ３／４に対して陽性であるが、この幹細胞性マーカーは分化ニューロンにおいて失われることを示す。逆に、ｉＰＳＣはベータＩＩＩチューブリンを発現しないが、分化細胞の６０％超がこの神経マーカーを高レベルで発現する。

【図6A】インテグリン結合を改善すると考えられた変異は、ｉＰＳＣ細胞培養の機能の改善をもたらさないが、種間のコンセンサス配列に基づいて設計された変異は、同様の（Ｑ１４８Ｅ及びＤ８０Ｙ）ｉＰＳＣ細胞拡大を示すことを示す。１μｇ／ｍｌ ＶＴＮバリアント上で培養したｉＰＳＣの明視野画像であり、ｉＰＳＣコロニーは、ＶＴＮ，Ｄ８０Ｙ及びＶＴＮ，Ｑ１４８Ｅ上では良好に増殖するが、ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ、ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ、Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ、及びＶＴＮ，ＴＧ６３，Ｖ６７Ｓ上では小さいことを示している。三重変異体ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは接着またはｉＰＳＣ細胞の拡大を支持せず、二重変異体ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８ＰはＶＴＮ６２－２９２バリアントと比較して増殖が減弱した。

【図6B】インテグリン結合を改善すると考えられた変異は、ｉＰＳＣ細胞培養の機能の改善をもたらさないが、種間のコンセンサス配列に基づいて設計された変異は、同様の（Ｑ１４８Ｅ及びＤ８０Ｙ）ｉＰＳＣ細胞拡大を示すことを示す。棒グラフは、２つの異なる濃度でコーティングされたＶＴＮバリアント上の２つの別々のｉＰＳＣ細胞（ＢＹＳ１１０及びＩＢＪ６）の総細胞数を示す。ＢＹＳ１１０細胞株とＩＢＪ６細胞株の両方について、Ｄ８０Ｙは、特に１μｇ／ｍｌ（薄灰色のボックス）で、他の変異体と比較して同様の生細胞計数を示すことに留意されたい。三重変異体ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは接着またはｉＰＳＣ細胞の拡大を支持せず、二重変異体ＶＴＮ，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８ＰはＶＴＮ６２－２９２バリアントと比較して増殖が減弱した。

【図7A】アッセイにおけるアルファＶベータ５（αＶβ５）インテグリンヘテロ二量体に対するＶＴＮバリアントの結合親和性を示す。ＥＬＩＳＡ滴定曲線の代表的なグラフを示す。Ｙ軸は、ＨＲＰ二次シグナルからの光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定値を示す。Ｘ軸は、タンパク質の滴定を示す。

【図7B】アッセイにおけるアルファＶベータ５（αＶβ５）インテグリンヘテロ二量体に対するＶＴＮバリアントの結合親和性を示す。表は、１つの実験における異なるＶＴＮバリアントについてのＥＤ５０（５０％有効量）値をまとめたものである。

【図7C】アッセイにおけるアルファＶベータ５（αＶβ５）インテグリンヘテロ二量体に対するＶＴＮバリアントの結合親和性を示す。棒グラフは、ＶＴＮ－ＦＬに対して正規化された５回のＥＬＩＳＡ実験のＥＤ５０平均を示す。これらのアッセイでは、ｈＶＴＮ６２－２９２は、αＶβ５に対する結合親和性は全長ＶＴＮ（ＶＴＮ－ＦＬ）と同様であるが、若干の増加を示す。これらは両方とも、ＶＴＮ－ＦＬの７％以内にあるＶＴＮ－Ｎバリアント（ＶＴＮ－ＣＴＳ）と同様のαＶβ５に対する親和性を示す。驚くべきことに、インテグリン結合を改善すると想定されたＶＴＮ変異体、すなわちＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、αＶβ５結合親和性を大幅に減少させ、ＥＤ５０値が７倍を超えて増加した。しかし、Ｄ８０Ｙ変異は、αＶβ５親和性の強化を示し、平均ＥＤ５０値が４４％を超えて低下した。エラーバー＝標準誤差。

【図8】細胞接着アッセイで決定した、種々のビトロネクチンバリアントへの細胞の結合を示す。このアッセイでは、ｉＰＳＣを低濃度のＶＴＮバリアント（０．５６ｎｇ／ｍｌ）に１時間接着させ、洗浄して接着について評価した。ＶＴＮ６２－２９２Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ変異体では細胞接着がほぼ完全に喪失している。ＶＴＮ－Ｎバリアントと比較すると、ＶＴＮ６２－２９２バリアント単独で増加があり、Ｑ１４８Ｅ変異体またはＤ８０Ｙ変異体との接着はそれ以上増加しない。

【図9】ＶＴＮ６２－２９２の熱安定性を示す。データは、全長ビトロネクチン（ＶＴＮ－ＦＬ）と比較した細胞拡大に基づいている。細胞をプレーティングする前に摂氏３７度で４日間インキュベートすると、ＶＴＮ－ＮがｉＰＳＣ拡大を支持する能力が顕著に低下する。しかし、ＶＴＮ６２－２９２は、ＶＴＮ－ＦＬと比較して細胞増殖の明らかな低下を示さない。Ｄ８０Ｙ及びＱ１４８Ｅ変異は、予測されるような安定性に関して何の利点ももたらさないように思われる。エラーバー＝標準偏差。

【図10A】フローサイトメトリーによって分析された三胚葉分化によって示されるように、ＶＴＮ６２－２９２がｉＰＳＣの多能性を支持することを示す。マーカーの平均蛍光強度の有意な増加によって示されるように、内胚葉におけるＨＮＦ４αの発現増加を示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。

【図10B】フローサイトメトリーによって分析された三胚葉分化によって示されるように、ＶＴＮ６２－２９２がｉＰＳＣの多能性を支持することを示す。マーカーの平均蛍光強度の有意な増加によって示されるように、外胚葉におけるＰａｘ６の発現増加を示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。

【図10C】フローサイトメトリーによって分析された三胚葉分化によって示されるように、ＶＴＮ６２－２９２がｉＰＳＣの多能性を支持することを示す。マーカーの平均蛍光強度の有意な増加によって示されるように、中胚葉におけるブラキュリーの発現増加を示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。

【図10D】フローサイトメトリーによって分析された三胚葉分化によって示されるように、ＶＴＮ６２－２９２がｉＰＳＣの多能性を支持することを示す。幹細胞性マーカーであるＮａｎｏｇは、中胚葉分化を誘導するプロトコールに従って有意に減少する。

【図11】Ａは、ＶＴＮ６２－２９２が、核型分析によって示されるゲノム安定性を備えたｉＰＳＣの長期培養を支持することを示す。ＶＴＮ６２－２９２上で２か月にわたり、１３継代を経てｉＰＳＣを長期培養した後、細胞は正常な核型を維持し、再生医療用の幹細胞の増殖にとって重要な特性であるゲノムの安定性を示している。Ｂは、ＶＴＮ６２－２９２が、核型分析によって示されるゲノム安定性を備えたｉＰＳＣの長期培養を支持することを示す。ＶＴＮ６２－２９２上で２か月にわたり、１３継代を経てｉＰＳＣを長期培養した後、細胞は正常な核型を維持し、再生医療用の幹細胞の増殖にとって重要な特性であるゲノムの安定性を示している。

【図12A】基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用した末梢血単球（ＰＢＭＣ）の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを示す。これは、以前の研究では、他のＶＴＮバリアントではこれを示すことができなかったという点で重要である（Ｙｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ， ２０１８，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；５０（４）：１３１８－１３３１）。Ｓｅｎｄａｉ Ｃｙｔｏｔｕｎｅ ２．０リプログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）による形質導入後の異なる時点でのｉＰＳＣコロニーの形成を示す。個々のコロニーをクローニングした後、ｈＶＴＮ６２－２９２上で誘導された新生ｉＰＳＣは、境界が滑らかなコロニーに細胞が密に詰まったｉＰＳＣの形態学的特性を示す。

【図12B】基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用した末梢血単球（ＰＢＭＣ）の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを示す。これは、以前の研究では、他のＶＴＮバリアントではこれを示すことができなかったという点で重要である（Ｙｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ， ２０１８，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；５０（４）：１３１８－１３３１）。個々のコロニーをクローニングした後、ｈＶＴＮ６２－２９２上で誘導された新生ｉＰＳＣは、境界が滑らかなコロニーに細胞が密に詰まったｉＰＳＣの形態学的特性を示す。これらのｉＰＳＣは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＥ－カドヘリン発現を含むｉＰＳＣの特徴的マーカーを示す。

【図12C】基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用した末梢血単球（ＰＢＭＣ）の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを示す。これは、以前の研究では、他のＶＴＮバリアントではこれを示すことができなかったという点で重要である（Ｙｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ， ２０１８，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；５０（４）：１３１８－１３３１）。フローサイトメトリーによるＯｃｔ３及びＳｏｘ２の分析でも、幹細胞性マーカーの発現が示されたが、ＳＳＥＡ１発現の非存在は、ｉＰＳＣの未分化状態を示していた。

【図12D】基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用した末梢血単球（ＰＢＭＣ）の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを示す。これは、以前の研究では、他のＶＴＮバリアントではこれを示すことができなかったという点で重要である（Ｙｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ， ２０１８，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；５０（４）：１３１８－１３３１）。単一クローンに由来するｉＰＳＣは、ブラキュリーの発現増加によって示されるように、中胚葉細胞を形成する分化能力を有する。

【図13A】ＶＴＮ６２－２９２及び種々の変異体がインテグリン受容体に対して親和性の変化を示していることを示す。アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）及びアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））を含む主要なＲＧＤ結合インテグリンヘテロ二量体に対する、ＲＧＤモチーフに隣接するＶＴＮ６２－２９２バリアント及び変異の結合親和性を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を介してアッセイした。ＥＬＩＳＡ滴定曲線の代表的なグラフを示す。Ｙ軸は、ＨＲＰ二次シグナルからの光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定値を示す。Ｘ軸は、タンパク質の滴定を示す。

【図13B】ＶＴＮ６２－２９２及び種々の変異体がインテグリン受容体に対して親和性の変化を示していることを示す。アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）及びアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））を含む主要なＲＧＤ結合インテグリンヘテロ二量体に対する、ＲＧＤモチーフに隣接するＶＴＮ６２－２９２バリアント及び変異の結合親和性を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を介してアッセイした。表は、代表的な実験からの異なるＶＴＮバリアントについてのＥＤ５０（５０％有効量）値をまとめたものである。

【図14】ＶＴＮ６２－２９２及びその種々の変異体が、相対的ＥＬＩＳＡ結合親和性によって示されるように、インテグリン受容体に対する親和性の変化を示していることを示す。これらの棒グラフは、フィブロネクチン（ＦＮ）（α５β１、αＶβ１、及びαＶβ３）またはＶＴＮ－ＦＬ（αＶβ５）に対して正規化された≧２回のＥＬＩＳＡ実験のＥＤ５０平均を示す。これらのアッセイでは、ｈＶＴＮ６２－２９２は、αＶβ５に対する結合親和性は全長ＶＴＮ（ＶＴＮ－ＦＬ）と同様であるが、若干の増加を示す。しかし、ｈＶＴＮ６２－２９２は、αＶβ３、αＶβ１、及びα５β１に対する改善された結合親和性を示す。ＶＴＮ－Ｎバリアント（ＶＴＮ－ＣＴＳ）も同様の傾向を示すが、典型的には、４つのインテグリンヘテロ二量体すべてに対する親和性が低くなる。これらの実験により、インテグリン結合を改善すると想定されたＶＴＮ変異体、すなわちＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、αＶβ５結合親和性を大幅に減少させ、ＥＤ５０値が増加することが確認された。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体も、αＶβ５結合親和性の低下を示した。三重変異体は、２つの主要なフィブロネクチン受容体、すなわちαＶβ３及びα５β１、ならびにαＶβ１に対する親和性の増加を示した。これは、インテグリン結合能力においてフィブロネクチンと類似した変異体が存在するという点で重要である。αＶβ３、αＶβ１、及びα５β１のグラフは、フィブロネクチン結合に対するものであり、αＶβ５のグラフは、全長ビトロネクチンに対するものである。エラーバー＝標準偏差。

【図15A】培養中のＭＳＣ増殖に対するＶＴＮ変異体の効果を示す。提示されたデータは、３つの濃度のＶＴＮの３回の実験からのものである。細胞増殖は、７２時間後のＭＣＳ細胞培養物のコンフルエンスを分析することによって監視した。ＦＮ及び異なるＶＴＮ６２－２９２バリアント上のＭＳＣの明視野画像を示す。

【図15B-1】培養中のＭＳＣ増殖に対するＶＴＮ変異体の効果を示す。提示されたデータは、３つの濃度のＶＴＮの３回の実験からのものである。細胞増殖は、７２時間後のＭＣＳ細胞培養物のコンフルエンスを分析することによって監視した。３つの濃度はすべて、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体がＭＳＣ増殖の強化を支持することを示している。これは、（図６Ａ及び図６Ｂに示すように）減弱された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ）または完全に抑制された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ）三重変異体でのｉＰＳＣの増殖とは顕著な対照を成している。

【図15B-2】培養中のＭＳＣ増殖に対するＶＴＮ変異体の効果を示す。提示されたデータは、３つの濃度のＶＴＮの３回の実験からのものである。細胞増殖は、７２時間後のＭＣＳ細胞培養物のコンフルエンスを分析することによって監視した。３つの濃度はすべて、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体がＭＳＣ増殖の強化を支持することを示している。これは、（図６Ａ及び図６Ｂに示すように）減弱された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ）または完全に抑制された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ）三重変異体でのｉＰＳＣの増殖とは顕著な対照を成している。

【図16A】ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２、及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上での未分化状態のＩＢＪ６ ｉＰＳＣ細胞株の細胞拡大を示す。この実験は、幹細胞性の異なる状態にある同じ細胞株が基質選択性を切り替えることができることを示す。未分化状態では、明視野画像で見られ、コンフルエンスパーセントによって定量されるように、ｉＢＪ６ ｉＰＳＣはＶＴＮ６２－２９２上でのみ大幅に拡大する。ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上では本質的に増殖がないことに留意されたい。

【図16B】ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２、及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上でのＭＳＣへの分化後の、ＩＢＪ６ ｉＰＳＣ細胞株の細胞拡大を示す。この実験は、幹細胞性の異なる状態にある同じ細胞株が基質選択性を切り替えることができることを示す。誘導ＭＳＣ（ｉＭＳＣ）への分化後、同じ細胞株は、ＦＮ上で増殖の増加を示すが、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上で最良の増殖を示す。これは、ＭＳＣ分化後のαＶβ３の発現の増加及び／またはα５β１インテグリンを介する結合の増加に起因すると思われる。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本開示は、非動物由来条件における幹細胞のエクスビボ培養を含む、細胞培養の基質としての産生及び使用のための改善された特性を有するビトロネクチンポリペプチド断片を提供する。

【0046】

ビトロネクチン（ＶＴＮまたはＶＮ）は、血清及び細胞接着、遊走、細胞拡散、及び細胞外固定に関与する細胞外マトリックスに豊富に見出されるヘモペキシンファミリーの糖タンパク質である。全長ビトロネクチンポリペプチドは、４７８アミノ酸残基である。シグナル配列を除去すると、成熟ビトロネクチンタンパク質は、４５９アミノ酸残基からなる５４ｋＤａの糖タンパク質である。

【0047】

全長ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００６３８．４）を以下に示す：

【0048】

【0049】

以下のドメインを示す、全長ビトロネクチンの二次構造を図１に図示する：
－ アミノ酸残基１～１９からのシグナルペプチド。
－ アミノ酸残基２０～６３のＮ末端ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン。ＳＭＢドメインは緻密なジスルフィドノットであり、約３５残基内に４つのジスルフィド結合がある。
－ アミノ酸残基６４～６６のアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフ。
－ ヘモペキシン相同性を有する３つの中央ドメイン。これらのヘモペキシン様ドメインは、アミノ酸残基１５８～２０２からのＨｐ１、アミノ酸残基２０３～２５０からのＨｐ２、及びアミノ酸残基２５１～３０５からのＨｐ３である。
－ アミノ酸残基３６５～３９５を含むヘパリン結合ドメイン（Ｈｂ）。
－ アミノ酸残基４１９～４７２にヘモペキシン相同性（Ｈｐ４）を有するＣ末端ドメイン。

【0050】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、シグナルペプチド、Ｎ末端ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン、ヘパリン結合ドメイン（Ｈｂ）、及び／またはＣ末端Ｈｐ４ドメインのうちの１つ以上が欠失しているビトロネクチンポリペプチド断片を含む。いくつかの態様では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、シグナルペプチド、Ｎ末端ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン、ヘパリン結合ドメイン（Ｈｂ）、及びＣ末端Ｈｐ４ドメインが欠失しているビトロネクチンポリペプチド断片を含む。

【0051】

いくつかの態様では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、アミノ酸残基６４～６６にビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含む。

【0052】

いくつかの態様では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及びＨｐ３ドメインのいずれか１つ、いずれか２つ、または３つすべてを含み得る。

【0053】

いくつかの態様では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、アミノ酸残基６４～６６にビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及びＨｐ３ドメインのいずれか１つ、いずれか２つ、または３つすべてを含み、アミノ酸からのシグナルペプチド、Ｎ末端ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン、ヘパリン結合ドメイン（Ｈｂ）、及びＣ末端Ｈｐ４ドメインが欠失している、ビトロネクチンポリペプチド断片を含む。

【0054】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、全長ビトロネクチン（４７８アミノ酸）または成熟ビトロネクチン（４５９アミノ酸）よりも短い長さを有する。例えば、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、約２００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、または約３００アミノ酸～約３５０アミノ酸の長さを有し得る。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、もしくは約３５０アミノ酸、またはそれらの任意の範囲の長さを有し得る。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、約２３０、約２３１、約２３２、約２３２、約２３４、約２３５、約２３６、約２３７、約２３９、約２４０アミノ酸、またはそれらの任意の範囲の長さを有し得る。

【0055】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失及びＣ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失を含み得る。いくつかの態様では、そのようなビトロネクチンポリペプチド断片は、ヒトビトロネクチンのアミノ酸６２～２９２の断片（配列番号１）であり、本明細書ではｈＶＴＮ（６２－２９２）、ＶＴＮ６２－２９２、またはｈビトロネクチン：６２－２９２とも呼ばれ、以下のアミノ酸配列：
ＭＶＴＲＧＤＶＦＴＭ ＰＥＤＥＹＴＶＹＤＤ ＧＥＥＫＮＮＡＴＶＨ ＥＱＶＧＧＰＳＬＴＳ ＤＬＱＡＱＳＫＧＮＰ
ＥＱＴＰＶＬＫＰＥＥ ＥＡＰＡＰＥＶＧＡＳ ＫＰＥＧＩＤＳＲＰＥ ＴＬＨＰＧＲＰＱＰＰ ＡＥＥＥＬＣＳＧＫＰ
ＦＤＡＦＴＤＬＫＮＧ ＳＬＦＡＦＲＧＱＹＣ ＹＥＬＤＥＫＡＶＲＰ ＧＹＰＫＬＩＲＤＶＷ ＧＩＥＧＰＩＤＡＡＦ
ＴＲＩＮＣＱＧＫＴＹ ＬＦＫＧＳＱＹＷＲＦ ＥＤＧＶＬＤＰＤＹＰ ＲＮＩＳＤＧＦＤＧＩ ＰＤＮＶＤＡＡＬＡＬ
ＰＡＨＳＹＳＧＲＥＲ ＶＹＦＦＫＧＫＱＹＷ ＥＹＱＦＱＨＱＰＳＱ ＥＥ （配列番号２）
を有する。

【0056】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号２のビトロネクチンポリペプチド断片と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるビトロネクチンポリペプチド断片を含む。本明細書で使用される場合、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で考察する場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも４０パーセント（％）、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるかどうかは、当技術分野で公知の方法及びコンピュータプログラム／ソフトウェア、例として、限定するものではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ． ５３７１１）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の最良の相同性のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本開示による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、参照配列内のアミノ酸の総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるように設定する。

【0057】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、配列番号２に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸置換を有するビトロネクチンポリペプチド断片を含む。そのようなアミノ酸置換は、表１に示されているもののいずれかを含むが、これらに限定されない。

【0058】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸６２～７０に対応する領域内の、ＲＧＤインテグリン結合部位に隣接する位置にあってもよい。例えば、そのような置換は以下の位置にあってもよい：
Ｔ６３Ｇアミノ酸置換を含むがこれに限定されない、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６３位（配列番号２の３位）；
Ｖ６７Ｓアミノ酸置換を含むがこれに限定されない、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６７位（配列番号２の７位）；
Ｆ６８Ｐアミノ酸置換を含むがこれに限定されない、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６８位（配列番号２の８位）；
Ｔ６３ＧまたはＶ６７Ｓアミノ酸置換を含むがこれらに限定されない、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６３位及び６７位で；及び／または
Ｔ６３Ｇ、Ｖ６７Ｎ、及びＦ６８Ｐアミノ酸置換を含むがこれらに限定されない、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６３、６７、及び６８位。

【0059】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの８０位（配列番号２の２０位）における置換を含むことができ、Ｄ８０Ｙアミノ酸置換を含むが、これに限定されない。

【0060】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの１４３位（配列番号２の８３位）における置換を含むことができ、Ｈ１４３Ｄアミノ酸置換を含むが、これに限定されない。

【0061】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの１４８位（配列番号２の８８位）における置換を含むことができ、Ｑ１４８Ｅアミノ酸置換を含むが、これに限定されない。

【0062】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの１４９位（配列番号２の８９位）における置換を含むことができ、Ｐ１４９Ｓアミノ酸置換を含むが、これに限定されない。

【0063】

そのようなアミノ酸置換は、配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンのＣ２９３のシステインを置換する置換を含むことができる。

【0064】

いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、８０位のアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）がチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）に置換されている（配列番号２の２０位のＤがＹに置換されている）、ヒトビトロネクチン（配列番号１）のアミノ酸６２～２９２に対応する断片を含み、本明細書ではＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙと呼ばれる（本明細書ではＶＴＮ６２－２９２（Ｄ８０Ｙ）、ＶＴＮ６２－２９２ Ｄ８０Ｙ、及びＶＴＮ６２－２９２Ｄ８０Ｙとも呼ばれる）。

【0065】

いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、１４８位のグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）に置換されている（配列番号２の２０位のＱがＥに置換されている）、ヒトビトロネクチン（配列番号１）のアミノ酸６２～２９２に対応する断片を含み、本明細書ではＶＴＮ６２－２９２（Ｑ１４８Ｅ）とも呼ばれる。

【0066】

いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、変異ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐを含み得る。これらの変異を有するＶＴＮ断片は、これらのインテグリンに対するフィブロネクチン結合と同様の様式で、ＲＧＤ結合インテグリン、すなわちアルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）及びアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））に対する結合における改変を与え得る。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉなどの非動物由来系でフィブロネクチン（ＦＮ）を発現することが困難であることを考慮すると、本明細書に開示されるビトロネクチンポリペプチド断片及びそのバリアントは、非動物由来系で大規模に産生することができるＦＮ様分子を提供する。これは、ＦＮ受容体αＶβ３及びα５β１を介したシグナル伝達を介して改善される細胞療法及び再生医療における追加の用途に有益である。このような利点の例には、心筋細胞分化及び骨芽細胞分化が含まれる。

【0067】

また、ビトロネクチンポリペプチド断片のＮ末端及び／またはＣ末端にビトロネクチン起源ではない追加の異種アミノ酸残基を有するビトロネクチンポリペプチド断片も本開示に含まれる。そのような異種アミノ酸残基は、例えば、酵素活性、または他の追加の成分、例として、リンカー、検出可能なマーカー、もしくは融合タンパク質をコードし得る。

【0068】

いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片のＣ末端は、例えばポリヒスチジンタグまたはストレプトアビジンタグなどの検出可能なマーカーにコンジュゲートすることができる。ポリヒスチジンタグまたは標識ビオチンに対する蛍光コンジュゲート抗体を使用して、ビトロネクチンを間接的に検出することができる。これらのタグは、タンパク質の量及び対応するインテグリン受容体との相互作用に関連する定量を提供することができる。加えて、これらのタグは、抗体コンジュゲートを介したヒドロゲルポリマー（アルギネート、ポリエチレングリコールなど）へのコンジュゲートに利用することができる。あるいは、ビトロネクチン官能化ヒドロゲルの形成のために、ビトロネクチンペプチドを、遊離アミン基、カルボン酸基またはスルホンなどの反応性基を介してヒドロゲルに直接コンジュゲートさせることもできる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端は、コンジュゲーション反応のために、側鎖反応性アミノ基を増加させるためにリジン、または反応性チオールを増加させるためにシステインを付加することによって改変することができる。

【0069】

いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有するヒトビトロネクチン（配列番号１）のアミノ酸６２～２９２に対応する断片を含む。ポリヒスチジンタグは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のＨｉｓ残基であり得、例えば、６つのヒスチジン残基のＣ末端ポリヒスチジンタグを有する、ヒトビトロネクチン（配列番号１）のアミノ酸６２～２９２に対応する断片を含み、この断片は、本明細書ではヒトビトロネクチン断片６２－２９２ Ｃ－ＨｉｓまたはＶＴＮ６２－２９２ｈｉｓ、ｈビトロネクチン：６２－２９２／Ｈｉｓ６とも呼ばれ、以下の配列：
ＭＶＴＲＧＤＶＦＴＭ ＰＥＤＥＹＴＶＹＤＤ ＧＥＥＫＮＮＡＴＶＨ ＥＱＶＧＧＰＳＬＴＳ ＤＬＱＡＱＳＫＧＮＰ
ＥＱＴＰＶＬＫＰＥＥ ＥＡＰＡＰＥＶＧＡＳ ＫＰＥＧＩＤＳＲＰＥ ＴＬＨＰＧＲＰＱＰＰ ＡＥＥＥＬＣＳＧＫＰ
ＦＤＡＦＴＤＬＫＮＧ ＳＬＦＡＦＲＧＱＹＣ ＹＥＬＤＥＫＡＶＲＰ ＧＹＰＫＬＩＲＤＶＷ ＧＩＥＧＰＩＤＡＡＦ
ＴＲＩＮＣＱＧＫＴＹ ＬＦＫＧＳＱＹＷＲＦ ＥＤＧＶＬＤＰＤＹＰ ＲＮＩＳＤＧＦＤＧＩ ＰＤＮＶＤＡＡＬＡＬ
ＰＡＨＳＹＳＧＲＥＲ ＶＹＦＦＫＧＫＱＹＷ ＥＹＱＦＱＨＱＰＳＱ ＥＥＨＨＨＨＨＨ （配列番号３）
を有する。

【0070】

ヒスチジンタグは、多くの目的に役立つ。これはニッケルカラムによるアフィニティー精製を提供し、それによって細胞溶解物中の他の細胞材料からビトロネクチンポリペプチド断片を単離する。これは、抗Ｈｉｓ抗体の抗原として機能することができ、イムノアッセイにおけるビトロネクチンポリペプチド断片の定量に使用される。また、Ｈｉｓタグは、ビトロネクチンポリペプチド断片を細胞培養基質に結合するために使用することができる。

【0071】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、本明細書に記載される特性の１つ以上を有し得る。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片の特徴付けは、本明細書に含まれる実施例セクションに記載される方法のいずれかを含むがこれらに限定されない、利用可能な様々な方法のいずれかによるものであり得る。

【0072】

例えば、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞で発現させた場合、全長ビトロネクチンまたは他の断片と比較して収量の改善を示し得る。

【0073】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞で発現させた場合、全長ビトロネクチンまたは他の断片と比較して溶解度の改善を示し得る。

【0074】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、全長ビトロネクチンまたは他の断片と比較して熱安定性の増大を示し得る。

【0075】

変異ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐを含むがこれらに限定されない、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、ＲＧＤ結合インテグリン、例えば、アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）またはアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））に対する結合親和性の低下を示し得る。結合の低下は、全長ビトロネクチン（配列番号１）または全長フィブロネクチンと比較して決定することができる。

【0076】

変異ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐを含むがこれらに限定されない、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、ＲＧＤ結合インテグリン、例えば、アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）またはアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））に対する結合親和性の増加を示し得る。結合の増加は、全長ビトロネクチン（配列番号１）または全長フィブロネクチンと比較して決定することができる。

【0077】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、細胞培養表面への、ヒト多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞）及び間葉系幹細胞を含むがこれらに限定されない、種々の細胞型の接着／付着のための好適な細胞結合基質として機能することができる。

【0078】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、二次元細胞培養（例えば、組織培養プラスチックのコーティング）用の、マイクロキャリア（例えば、ヒドロゲルベースまたはポリスチレンミクロスフェア）へのコンジュゲート用の、または三次元マトリックス中での培養（例えば、合成ヒドロゲルの成分として）用の細胞培養マトリックスとして機能することができる。

【0079】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、ヒト多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むがこれらに限定されない、培養中の種々の細胞型の未分化拡散及び拡大を支持することができ、この場合、細胞は未分化の表現型を維持する。

【0080】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、全長ビトロネクチンまたは全長フィブロネクチンと比較して、多能性幹細胞の生存能力、拡散、多能性、クローニング細胞の維持、分化、及び／または人工多能性細胞の誘導を支持する強化された能力を有することができる。

【0081】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、分化プロトコールにおいて幹細胞の分化を支持することができる。例えば、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の中内胚葉細胞系譜細胞及び肝細胞系譜細胞への分化を支持すること、またはヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化を支持することである。

【0082】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、非動物由来条件で産生することができる。

【0083】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、非動物由来条件での幹細胞のエクスビボ培養を含む細胞培養の基質として機能することができる。

【0084】

核酸
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を記載する。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１を有するヒトビトロネクチンのビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0085】

別の態様では、本開示は、本開示の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを記載する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。適切なＤＮＡ配列は、様々な手順によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、当技術分野で公知の手順によってベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。そのような手順は、当業者の範囲内であるとみなされる。多数の好適なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。以下のベクターは例として提供される。細菌ベクターとしては、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５、が挙げられる。真核生物ベクターとしては、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。

【0086】

いくつかの態様では、好適なベクターは、原核宿主細胞、非真核宿主細胞、または非動物宿主細胞（動物界に属さない宿主細胞）におけるビトロネクチンポリペプチド断片の発現のための発現ベクターである。非限定的な例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌宿主細胞、または植物宿主細胞における発現のための発現ベクターが挙げられる。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用してもよい。

【0087】

さらなる態様では、本開示はまた、上記のヌクレオチド配列またはベクターのうちの少なくとも１つを含有する宿主細胞を含む。宿主細胞は、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、原核細胞、例として、細菌細胞、真菌細胞、または植物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態では、宿主細胞、はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介ランスフェクション、エレクトロポレーション、またはヌクレオフェクションなどの任意の好適な技術によるものであり得る。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現することができる。このような組換え発現のための真核細胞の例としては、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＮＳＯ、Ｖｅｒｏ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＳＦ２１細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ細胞が挙げられる。原核生物発現系は、ＤＨ５アルファ、ＤＥ３、及びＲＯＳＥＴＴＡ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）細胞菌株などのＥ．ｃｏｌｉバリアントを含む。

【0088】

本開示のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを使用して、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片を産生するために、無細胞翻訳系を用いることができる。あるいは、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、当技術分野で公知の手順によって化学的に合成することができる。

【0089】

本明細書に含まれる実施例に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞における本開示のビトロネクチンポリペプチド断片の発現によって、全長ビトロネクチン、またはＶＴＮ６２－３９８及びＶＴＮ６２－４７８などの以前に知られている断片の収量及び溶解度と比較して、収量が改善し、溶解度が改善したことが実証された。ヒトビトロネクチンの全長天然バージョンは、おそらくタンパク質の翻訳後プロセシングのため、Ｅ．ｃｏｌｉで大量に発現させることが不可能ではないにしても困難である。ジスルフィド結合を形成するアミノ酸Ｃ２９３及びＣ４３０を含む大きな断片と比較しても、同じことが当てはまる。Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた場合、断片ＶＴＮ６２－３９８は低い発現及び酸化を示し、市販のＶＴＮ断片であるＶＴＮ６２－４７８（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は封入体に蓄積し、追加の可溶化ステップが必要となり、大規模製造が複雑になる。対照的に、例えば、配列番号２及び配列番号３のビトロネクチンポリペプチド断片ならびにそれらのバリアントを含む、本開示のビトロネクチンポリペプチド断片によって、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞で発現させた場合、可溶性タンパク質産物が生じる。

【0090】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、本明細書に記載されるように発現させまたは合成して、非動物由来であり、動物汚染のないビトロネクチンポリペプチド断片の調製物を得ることができる。非動物由来産物は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの、非動物宿主細胞から発現及び単離させることができる。非動物由来産物は、一次、二次、または三次プロセスにおいて任意の動物成分含有原材料を使用せずに作製することができる。免疫細胞及び幹細胞を含むがこれらに限定されない、治療用途のための細胞のエクスビボ培養には、安全で堅牢な培養条件が必要である。このような培養に使用される細胞培養培地及び基質の安全基準は、米国薬局方（ＵＳＰ）刊行物ＵＳＰ＜１０４３＞に概説されており、ここでは、再生医療を含む細胞及び遺伝子治療において補助材料として使用される原材料のリスク分類のための段階的システムが詳述されている（ＵＳＰ４３－ＮＦ３８）。動物成分含有試薬の使用は高リスク（第４段階）であると考えられるが、ＧＭＰ条件下で生成された非動物由来材料は低リスク（第２段階）であると考えられる。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、治療用途のための細胞のエクスビボ培養のための、そのような低リスクで非動物由来の産物を提供する。

【0091】

また、本開示には、本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片のうちの１つ以上を含む組成物も含まれる。そのような組成物は、細胞接着用の基質としてそのような組成物を含む細胞培養に使用することができる。そのような組成物は、非無動物由来であってもよい。そのような組成物は、定義された培養培地、すなわち培地のすべての成分が完全に開示され、特徴付けられている培養培地として機能し得る。

【0092】

本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、二次元または三次元細胞培養基質を含む様々な基質に会合またはコンジュゲートすることができる。本開示のビトロネクチンポリペプチド断片は、例えばヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含むマイクロキャリアにコンジュゲートすることができる。ヒドロゲルは、溶解性ヒドロゲルであってもよい。ヒドロゲルは、これらのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９２７，３３４号、米国特許第９，７９０，４６７号、及び米国特許第１０，７３９，３３８号にさらに詳細に記載されているように、複数のアルギン酸分子が分岐ポリマー分子にコンジュゲートまたはブレンドされてヒドロゲルを形成している、複数のアルギン酸分子と複数の分岐ポリマー分子との組成物を含んでもよい。

【0093】

本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、そのコンジュゲート、及びその組成物は、基礎的細胞生物学研究から細胞治療及び再生医療ワークフローまでの用途で使用するための、様々な細胞型の培養に使用することができる。そのようなビトロネクチンポリペプチド断片は、種々の細胞型の細胞付着及び／または増殖基質として機能することができる。

【0094】

そのような培養には、インビトロ培養に加えて、細胞のエクスビボを含めてもよい。本明細書で使用される場合、エクスビボとは、「生体の外」を意味する。エクスビボ培養では、細胞または組織を生存生物から直接採取し、定義された培養条件下で培養することができる。次に、そのような細胞は、エクスビボ培養後に生物に戻すことができる。

【0095】

本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、そのコンジュゲート、及びその組成物は、幹細胞及び幹細胞由来の細胞、例えば、成体幹細胞、胎児幹細胞、前駆細胞、末梢造血幹細胞、内皮前駆細胞、羊膜幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、腸幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、またはがん幹細胞など、の培養に使用することができる。幹細胞には、多能性幹細胞及び多分化能幹細胞を含めることができる（Ｓａｌｚｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ；２０１６：５２４６５８４；Ｂｒａａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；２６（９）：２２５７－６５）。幹細胞由来細胞としては、中胚葉及びそれに由来する細胞、例として心筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、胚体内胚葉及びそれらに由来する細胞、外胚葉及びそれに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、３つの胚葉すべての細胞に分化することができる細胞を指す。多能性細胞の例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」は、ＥＳ細胞などのより高い潜在能を有する細胞と同様の特徴を示す、体細胞に由来する多能性細胞を指す。多分化能幹細胞の例としては、間葉系幹細胞が挙げられる。

【0097】

本明細書に記載のビトロネクチンポリペプチド断片、その組成物、及びそのコンジュゲートは、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法などの適応Ｔ細胞療法システムで使用するための細胞の操作及び／または拡大のための細胞の培養に使用することができる（例えば、Ｆｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ；９４（Ｓ１）：Ｓ３－Ｓ９；Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ；４２（６）：２１８３－２１９５；及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， １３（１）：８６で概説されている）。

【0098】

本発明は、特許請求の範囲で定義される。しかし、以下に、非限定的な例示的な態様の非網羅的リストを提供する。これらの態様の特性のうちの任意の１つ以上は、本明細書に記載される別の実施例、実施形態、または態様の任意の１つ以上の特性と組み合わせることができる。本発明の例示的な実施形態は、以下を含むが、これらに限定されない。

【0099】

実施形態１．ビトロネクチンポリペプチド断片であって：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくとも５０個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失を含み；
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくともＣ末端アミノ酸３６２～４７８の欠失を含み；
ビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み；
ビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメインを含まない；
ビトロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン及びＨｐ４ドメインを含まない；及び
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドの同じ断片に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0100】

実施形態２．実施形態１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及び／またはＨｐ３ドメインを含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0101】

実施形態３．実施形態１または２に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、約２００～約３５０アミノ酸の長さを有する、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0102】

実施形態４．実施形態１～３のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失；及び
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、Ｃ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0103】

実施形態５．実施形態１～４のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドの残基６２～２９２に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0104】

実施形態６．配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの８０位及び／または１４８位に相当する位置にアミノ酸置換を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0105】

実施形態７．アミノ酸置換がＤ８０Ｙ置換及び／またはＱ１４８Ｅ置換を含む、実施形態６に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0106】

実施形態８．配列番号２からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0107】

実施形態９．配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。

【0108】

実施形態１０．Ｄ８０位におけるアミノ酸置換がＤ８０Ｙ置換を含み、及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換がＱ１４８Ｅ置換を含む、実施形態９に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0109】

実施形態１１．配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの６３位、６７位、及び／または６８位に相当する位置にアミノ酸置換を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0110】

実施形態１２． ６３位におけるアミノ酸置換がＴ６３Ｇ置換を含み、６７位におけるアミノ酸置換がＶ６７Ｓ置換またはＶ６７Ｎ置換を含み、及び／または６８位におけるアミノ酸置換がＦ６８Ｐ置換を含む、実施形態１１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0111】

実施形態１３．Ｃ末端Ｈｉｓ－タグをさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0112】

実施形態１４． １、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のＣ末端Ｈｉｓ残基を含む、実施形態１３に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0113】

実施形態１５．配列番号３からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0114】

実施形態１６．実施形態１～１５のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、非動物由来である、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【0115】

実施形態１７．マイクロキャリアにコンジュゲートしている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【0116】

実施形態１８．マイクロキャリアが、ヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含む、実施形態１７に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート。

【0117】

実施形態１９．実施形態１～１６のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、または実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲートを含む組成物。

【0118】

実施形態２０．実施形態１９に記載の組成物であって、非動物由来である、前記組成物。

【0119】

実施形態２１．細胞培養基質として使用するための、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または実施形態１９もしくは２０に記載の組成物。

【0120】

実施形態２２．実施形態１～１６のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列。

【0121】

実施形態２３．実施形態２２に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【0122】

実施形態２４．実施形態２３に記載の発現ベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含む、前記発現ベクター。

【0123】

実施形態２５．実施形態２２に記載のヌクレオチド配列または実施形態２３もしくは２４のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【0124】

実施形態２６．実施形態２５に記載の宿主細胞であって、Ｅ．ｃｏｌｉを含む、宿主細胞。

【0125】

実施形態２７．ビトロネクチンポリペプチド断片を産生する方法であって、実施形態２２に記載のヌクレオチド配列、実施形態２３もしくは２４に記載の発現ベクター、または実施形態２５もしくは２６に記載の宿主細胞から、ビトロネクチンポリペプチド断片を発現させることを含む、前記方法。

【0126】

実施形態２８．産生されたビトロネクチン断片ポリペプチドが非動物由来である、実施形態２７に記載の方法。

【0127】

実施形態２９．細胞培養方法であって、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または実施形態１９もしくは２０に記載の組成物を含む基質上で細胞を培養することを含む、前記方法。

【0128】

実施形態３０．細胞が幹細胞を含む、実施形態２９に記載の細胞培養方法。

【0129】

実施形態３１．幹細胞がヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、実施形態３０に記載の細胞培養方法。

【0130】

実施形態３２．幹細胞がヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、実施形態３０に記載の細胞培養方法。

【0131】

実施形態３３．細胞を非動物由来条件下で培養する、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の細胞培養方法。

【0132】

実施形態３４．細胞培養がエクスビボである、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の細胞培養方法。

【0133】

本発明を、以下の実施例で説明する。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

【実施例】

【0134】

実施例１
ビトロネクチン６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙ
非動物由来条件下での全長組換えビトロネクチン（ＶＴＮ）の産生には問題があり、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現系で発現させると不溶性タンパク質が生じ、収量が低くなる（表１）。この実施例では、溶解度及び発現が改善された種々のビトロネクチンバリアントが産生された。ビトロネクチンポリペプチドの二次構造及びこの実施例で産生及び試験されたバリアントを図１に示す

【表1】

【0135】

以前の研究では、Ｎ末端ＳＭＢドメイン単独の除去（ＶＴＮ－Ｎ、またはＶＴＮ６２－４７８）またはＣ末端Ｖ１０ドメインの欠失と組み合わせたその除去（ＶＴＮ－ＮＣ、またはＶＴＮ６２－３９８）によって、培養中に多能性幹細胞を支持する、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製された組換えＶＴＮバリアントが生じることが示唆されている。これらのバリアントは、培養中の接着及び生存生物活性を保持またはさらに改善するが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製されると不溶性タンパク質が生じるため、追加の可溶化ステップが必要となり、大規模製造が複雑になる。これら２つのＶＴＮバリアント（ＶＴＮ６２－４７８及びＶＴＮ６２－３９８）の溶解度の低さ、及びその結果生じる低収量を表１に示す。

【0136】

この実施例で産生及び試験されたビトロネクチンバリアントは、アミノ酸６４～６６においてインテグリン結合ＲＧＤ部位を保持しているが、緻密なＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメイン（アミノ酸２０～６３）は欠失している。ヘパリン結合（Ｈｂ）領域（アミノ酸３６２～３９５）は、この実施例で産生及び試験されたバリアントの一部に存在していた。図１を参照のこと。

【0137】

システイン残基２９３と４３０の間のジスルフィド結合を除去するようにＶＴＮ６２－２９２バリアントを構築した（図１及び表１を参照）。

【0138】

この実施例において産生及び試験された２つのＶＴＮ切断バリアント（ＶＴＮ６２－１５５及びＶＴＮ６２－１２０）では、アミノ酸１６９及び２４２におけるグリコシル化部位が除去された（図１及び表１を参照）。

【0139】

組換えタンパク質の異種発現のための標準的Ｅ．ｃｏｌｉ培養物において、これらの種々のコンストラクトのタンパク質収量を試験した。アミノ酸３９８までのより長い断片の発現によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて低い溶解度及び低い収量がもたらされたが、ＶＴＮ６２－１２０、ＶＴＮ６２－１５５、及びＶＴＮ６２－２９２バリアントは可溶性であり、高い発現がもたらされた（図１及び表１を参照のこと）。収量が低い及び／または溶解度が低いため、表１のバリアント１～３は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける非動物由来産生と適合せず、さらなる分析から除外された。

【0140】

次に、この実施例では、細胞培養に好適な基質である、高収量の可溶性バリアントを同定した。この目的のために、潜在的な細胞療法用途にとって重要な２つの細胞型、すなわちヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を試験した。幹細胞ワークフローの１つの重要な目標は、動物成分含有原材料を排除することである。したがって、ＶＴＮバリアントは、すべての増殖因子を含む、成分が非動物由来である固有の培地配合で試験した。

【0141】

ｉＰＳＣ株１２－１０ａを単一細胞として２０，０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングし、毎日培地を交換しながら５日間コロニーを増殖させた。より微妙な性能差を識別するために、より典型的な濃度の１０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌと低濃度の１μｇ／ｍｌを含む、所与のＶＴＮバリアントの３つの異なる濃度を試験した。実際、ＶＴＮ６２－２９２バリアントで培養されたｉＰＳＣは、動物由来の全長ＶＴＮ及び市販のＶＴＮ６２－４９８バリアント（ＶＴＮ－Ｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている）と比較して、低濃度でも典型的な形態及び高い拡大を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。しかし、ＶＴＮ６２－１２０及びＶＴＮ６２－１５５バリアントは、特により低濃度ではｉＰＳＣコロニー増殖を支持しなかった。

【0142】

ヒトＭＳＣ培養物は、それほど劇的な結果ではないものの、同様の結果となるはずである（図３Ａ及び３Ｂ）。ＶＴＮ６２－１２０及びＶＴＮ６２－１５５ではＭＳＣは接着し、正常な形態を有していたが、生細胞の収量はＶＴＮ６２－２９２バリアントよりもかなり低かった。これらの結果は、ＶＴＮ６２－２９２バリアントが幹細胞培養を支持する能力において全長野生型ＶＴＮと同様の生物学的特性を与えることを示している。

【0143】

多能性幹細胞の重要な特性は、長期間にわたり、複数の継代後に効力を維持しながら拡散する能力である。したがって、ＶＴＮ６２－２９２バリアントがｉＰＳＣの拡大及び幹細胞性を長期にわたって支持する能力を試験した。５継代後（培養３週間）、ｉＰＳＣは高い拡大率で典型的な形態を維持した（図４Ａ）。フローサイトメトリーを使用すると、多能性マーカーであるＯｃｔ３、Ｓｏｘ２、及びＳＳＥＡ－４は高度に発現したままである一方、分化マーカーＳＳＥＡ－１は、細胞培養において長期間、ＶＴＮ６２－２９２上で増殖させた細胞において低レベルで発現していることが示された（図４Ｂ）。

【0144】

次に、ＶＴＮ６２－２９２上で維持されたｉＰＳＣが、異なる胚葉及び多様な系譜に分化することができることが実証された。外胚葉は、ノギンを介したＴＧＦβシグナルの阻害によってパターン化される。これらの条件下では、ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ３／４の発現を失うが、外胚葉転写因子Ｏｔｘ－１は有意に増加する（図４Ｃ）。胚体内胚葉は、アクチビンＡとＷｎｔシグナル伝達の組み合わせによってインビボで発達する。これらのシグナルをエクスビボでエミュレートすると、ＶＴＮ６２－２９２上で維持されたｉＰＳＣにおけるＳｏｘ１７の発現増加及びＯｃｔ３／４の減少が生じ、したがって、これらの細胞が内胚葉細胞系譜に分化する可能性が示される（図４Ｄ）。他の実験では、ＶＴＮ６２－２９２上で維持されたｉＰＳＣは、中胚葉誘導体である心筋細胞に分化することができた。したがって、ＶＴＮ６２－２９２上で長期間細胞培養を維持したｉＰＳＣは、多能性を維持している。

【0145】

図４Ａ～４Ｄに示される結果は、フローサイトメトリーを用いた別々の実験で確認され、これらのマーカーの平均蛍光強度の有意な増加によって示されるように、それぞれ中胚葉、内胚葉、及び外胚葉についてブラキュリー、ＨＮＦ４α、及びＰａｘ６の発現増加が示された。（図１０Ａ～Ｃ）。加えて、幹細胞性マーカーであるＮａｎｏｇは、中胚葉分化を誘導するプロトコールに従って有意に減少する（図１０Ｄ）。

【0146】

異なる細胞株では、ＢＸＳ０１１４株（ＡＴＣＣから入手可能）も３回の実験でＶＴＮ６２－２９２上で複数の継代後に多能性を示した。胚体内胚葉分化は、Ｗｎｔ３ａ及びアクチビンシグナルによって達成され、フローサイトメトリーによってマーカーＨＮＦ４αを用いて評価した（図１０Ａ）。ＨＮＦ４αの有意な増加があり、内胚葉への分化が成功したことを示した。胚体外胚葉への分化は、ノギン及び小分子ＳＢ４１３４５２による二重ＳＭＡＤ阻害により実行した。分化の成功は、分化プロトコール後に劇的に増加した神経外胚葉マーカーＰａｘ６で染色することによって観察された（図１０Ｂ）。中胚葉系譜への分化は、ＧＳＫ ３阻害剤である小分子ＣＨＩＲ ９９０２１によって達成された。ブラキュリーのフローサイトメトリーは、中胚葉分化の有意な増加（図１０Ｃ）、及び同時に幹細胞性マーカーであるＮａｎｏｇの減少（図１０Ｄ）を示した。これらのデータをまとめると、ＶＴＮ６２－２９２バリアントは、ナイーブ条件下での多能性幹細胞の培養を支持し、主要な３つの胚葉すべてへの分化能力を維持することを示す。

【0147】

急速に分裂する幹細胞の培養及び拡大に関する潜在的な懸念があるため、ゲノムの安定性に注意を払う必要がある。したがって、２か月にわたる細胞培養及び１３継代の後、核型分析を実行した（ＷｉＣｅｌｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉ）。１２１０ａ細胞の分析は、染色体の正常な核型／バンドパターンを示し、これはゲノム安定性の証拠を提供する（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＶＴＮ６２－２９２上で２か月にわたり、１３継代を経てｉＰＳＣを長期培養した後、細胞は正常な核型を維持し、再生医療用の幹細胞の増殖にとって重要な特性であるゲノムの安定性を示している。

【0148】

ＶＴＮは、体細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを支持しないが、基底膜抽出物（ＢＭＥ、別名マトリゲル）及びラミニンなどのその他の未定義のマトリックスはリプログラミングを支持することができることが報告されている。これらのマトリックスは、非動物由来ではないため、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ）によるリプログラミング後の非動物由来ワークフローを支持する基質としてＶＴＮ６２－２９２を使用し、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、Ｓｅｎｄａｉリプログラミングキット（ＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０）を用い、製造業者の指針の改変に従って基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用して、人工多能性幹細胞にリプログラミングした。形質導入の７日目の後、培養物を、完全な非動物由来条件に完全に移行させた。

【0149】

図１２Ａ～１２Ｄは、基質としてｈＶＴＮ６２－２９２を使用した末梢血単球（ＰＢＭＣ）の人工多能性幹細胞へのリプログラミングを示す。これは、以前の研究では、他のＶＴＮバリアントではこれを示すことができなかったという点で重要である。図１２Ａは、Ｓｅｎｄａｉ Ｃｙｔｏｔｕｎｅ２．０リプログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）による形質導入後の異なる時点でのｉＰＳＣコロニーの形成を示す。個々のコロニーをクローニングした後、ｈＶＴＮ６２－２９２上で誘導された新生ｉＰＳＣは、境界が滑らかなコロニーに細胞が密に詰まったｉＰＳＣの形態学的特性を示す。これらのｉＰＳＣは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＥ－カドヘリン発現を含むｉＰＳＣの特徴的マーカーを示す（図１２Ｂ）。フローサイトメトリーによるＯｃｔ３及びＳｏｘ２の分析でも、幹細胞性マーカーの発現が示されたが、ＳＳＥＡ１発現の非存在は、ｉＰＳＣの未分化状態を示していた（図１２Ｃ）。加えて、単一クローンに由来するｉＰＳＣは、ブラキュリーの発現増加によって示されるように、中胚葉細胞を形成する分化能力を有する（図１２Ｄ）。

【0150】

図１２Ａは、Ｓｅｎｄａｉウイルスによる形質導入後の異なる時点でのｉＰＳＣコロニーの形成を示す。コロニー形成効率は、ＢＭＥマトリックス上でのコロニー形成効率と同様であった。個々のコロニーをクローニングした後、ｈＶＴＮ６２－２９２上で誘導された新生ｉＰＳＣは、境界が滑らかなコロニーに細胞が密に詰まったｉＰＳＣの形態学的特性を示す。これらのｉＰＳＣは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＥ－カドヘリン発現を含むｉＰＳＣの特徴的マーカーを示す（図１２Ｂ）。フローサイトメトリーによるＯｃｔ３及びＳｏｘ２の分析でも、幹細胞性マーカーの発現が示されたが、ＳＳＥＡ１発現の非存在は、ｉＰＳＣの未分化状態を示していた（図１２Ｃ）。加えて、単一クローンに由来するｉＰＳＣは、ブラキュリーの発現増加によって示されるように、中胚葉細胞を形成する分化能力を有する（図１２Ｄ）。リプログラミング実験は、２つの異なるドナーを用いた２つの独立した実験で首尾よく繰り返された。

【0151】

この実施例の主な目標は、多能性幹細胞から分化した細胞を生成するための完全に非動物由来のワークフローで使用するためのＶＴＮバリアントを開発することであった。そのようなバリアントは、再生医療に関連するワークフローの安全性及び有効性を改善するための広い用途を有する。したがって、ＶＴＮ６２－２９２を、 を使用してエクスビボでｉＰＳＣから前脳ニューロンを生成するプロトコールにおける細胞マトリックスとして試験した（図５Ａ）。培養培地、サプリメント、増殖因子、及び小分子などの他のすべての成分は、動物成分含有材料を完全に欠いていた。ＶＴＮ６２－２９２上でｉＰＳＣを４継代拡大させた後、以前の研究（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；２７（３）：２７５－８０；ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ： Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；２７（５）：４８５）に基づいて、ＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５２－ＧＭＰ（Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む非動物由来Ｎ２培地に細胞を高密度でプレーティングした。７～１２日後、これにより、神経幹細胞転写因子Ｐａｘ６及びＳｏｘ１の高発現を有する神経前駆細胞（ＮＰＣ）が得られる（図５Ｂ）。次に、これらのＮＰＣを、非動物由来Ｎ２１神経サプリメントを含むニューロン培地に細胞を移行させた後、前脳ニューロンにさらに分化させることができる。分化の開始から３２日後、６０％を超える細胞が、長い神経突起伸長を有し、神経マーカーであるベータＩＩＩチューブリンについて陽性であった（図５Ｃ）。加えて、ｉＰＳＣにおいて顕著であった幹細胞性マーカーＯｃｔ３の発現は、分化プロトコール後には不存在であった（図５Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＶＴＮ６２－２９２がナイーブ多能性状態のｉＰＳＣを支持できること、またｉＰＳＣの下流系譜への分化も支持することができることを示しており、ＶＴＮ６２－２９２が幹細胞培養の有望な薬剤であることを示している。

【0152】

接着タンパク質としてのＶＴＮの機能を改善するために、ＶＴＮ６２－２９２バリアントに標的変異を導入した。

【0153】

まず、ＲＧＤインテグリン結合部位に隣接するアミノ酸を改変した。ＶＴＮ６２－２９２バリアントの６つの変異体を産生し、これらのアミノ酸の変化が細胞培養中のより大きなＶＴＮポリペプチドに関連して生物学的機能の改善を促進できるかどうかを決定するために試験した。これらは、表１に列挙されているバリアント９～１５である。ビトロネクチンは、ＲＧＤモチーフを介してインテグリンヘテロ二量体に結合する。αＶβ５及びαＶβ３は、高い親和性で結合する主要なＶＴＮ受容体であるが、α５β１インテグリンは、ＶＴＮに対して弱く相互作用することもできる。ＲＧＤモチーフは、フィブロネクチン、ラミニン及びオステオポンチンなどの他のインテグリン結合タンパク質の間で保存されるが、これらのタンパク質は、インテグリンヘテロ二量体に対して異なる親和性を示す。ＲＧＤモチーフ自体は、これらのタンパク質のいずれにおいてもインテグリンとの最適な相互作用にとって重要である；ここでの点変異は、インテグリン結合を減少または排除する（Ｃｈｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２６８（１３）：９７２５－９）。ＲＧＤモチーフに隣接するアミノ酸配列が、このトリペプチドを介してインテグリンに結合する種々のタンパク質の差次的結合を少なくとも部分的に説明することができるという証拠が増加している。例えば、小さなペプチドを使用した生化学的研究では、様々なインテグリンヘテロ二量体に対する結合親和性が研究されている（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。この情報を利用して、我々は、ＲＧＤ部位の周囲の領域のアミノ酸を改変することにより、幹細胞培養用の接着タンパク質としてのＶＴＮ６２－２９２の機能を調節することを試みた。例えば、配列ＧＲＧＤＳＰは、αＶβ５、αＶβ３、及びα５β１に対する結合親和性を増加させることが示された。これは、単離でのＲＧＤペプチドに対する大幅な改善である（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。

【0154】

２番目に、種間配列アラインメントを使用して、ヒト配列では異なるＶＴＮポリペプチドのコンセンサス配列を同定した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ；６４３：１２９－１４８）。コンセンサス配列アラインメントは、タンパク質の分子進化を研究するために使用されており、さらに最近では、機能を変化させる可能性のある変異を同定するために使用されている。特に、コンセンサス配列は、分子構造の安定性の差異を示している場合があり、これは組換えタンパク質の発現に有益であろう。公的に利用可能なオンライン配列アライメントツールを使用して、他のビトロネクチン配列の大部分と比較して、ヒト配列における種々の単一アミノ酸のバリエーションを同定した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ；６４３：１２９－１４８）。２つの最も優勢なアミノ酸変化、すなわち、２０位のアスパラギン酸からチロシンへの変化（Ｄ８０Ｙ）及び１４８位のグルタミンからグルタミン酸への変化（Ｑ１４８Ｅ）をさらに試験した。これらの点変異を作製し、６２－２９２バリアントにおける組換えビトロネクチンタンパク質の機能及び安定性に何らかの利点を与えるかどうかを調べるために試験した。これらは、表１に列挙したバリアント７～８である。

【0155】

ＶＴＮ６２－２９２に対するこれらの変異のスクリーニングでは、多能性幹細胞培養を支持する能力に焦点を当てた。２つの異なるｉＰＳＣ細胞株（ＢＹＳ１１０及びｉＢＪ６）ならびに２つの濃度を試験した。驚くべきことに、インテグリン結合を改善すると予測されたアミノ酸置換は、実際にｉＰＳＣ細胞増殖を減少させた（図６Ａ及び６Ｂ）。例えば、三重変異ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、ペプチド研究で、αＶβ５、αＶβ３、及びα５β１を含む種々のインテグリンヘテロ二量体の結合についての大幅な改善が示されていたため、細胞接着を改善すると予想されていた（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。しかし、これらの研究では、この変異は、特に低濃度において、ｉＰＳＣの基質としてのビトロネクチンの機能に有害であった（図６Ａ及び６Ｂ）。興味深いことに、コンセンサス配列アラインメントを使用して試験された２つの変異は、ｉＰＳＣのマトリックスとして有望であることが示された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｑ１４８Ｅ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙ）。特に、Ｄ８０Ｙ変異は、両方の濃度で両方のｉＰＳＣ株の細胞拡大の改善を支持したが、１μｇ／ｍｌの濃度でより顕著であった。ｉＢＪ６細胞株の場合、これは全生細胞の５０％を超える増加であった（図６Ｂ）。

【0156】

ＶＴＮ６２－２９２バリアント及びＤ８０Ｙ変異で観察された細胞拡大の改善を考慮して、ＶＴＮバリアントがαＶβ５ヘテロ二量体に結合する能力をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。

【0157】

ＶＴＮ６２－２９２バリアンント及びその中の変異を、ＮＳＯ細胞（マウス細胞株）で作製した全長ビトロネクチン及び市販のバージョンのＶＴＮ６２－４９８（いわゆるＶＴＮ－Ｎ、またはＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ製のＶＴＮ－ＣＴＳ）と比較した。これらのアッセイは、ＶＴＮ６２－２９２が全長ＶＴＮ及びＶＴＮ－ＣＴＳと同様のαＶβ５に対する結合親和性を有すること（図７Ａ）、及びＶＴＮ６２－２９２三重変異体が、ＶＴＮ－ＦＬまたはＶＴＮ６２－２９２と比較して、ほぼ顕著な増加である、５２３ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０で（これは、結合が不十分であることを示す）、αＶβ５への結合を大幅に減少させたことを実証した。これは、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐが、細胞培養においてｉＰＳＣを支持できなかった以前の実験とよく相関していた（図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ）。

【0158】

対照的に、ＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙ変異体は、αＶβ５結合親和性においてほぼ２倍の増加を示し、これは、ｉＰＳＣ細胞の拡大におけるこのバリアントの改善された機能と相関していた。これは、αＶβ５結合に関するＥＤ５０値のほぼ５０％の減少によって示される（図７Ｂ）。Ｑ１４８Ｅ変異体は、αＶβ５結合の有意な増加を示さなかった。このデータは、培養における幹細胞の拡大を支持することについてのＤ８０Ｙ変異体の機能の改善が、インテグリンに対する親和性及びインテグリン媒介接着または細胞シグナル伝達の増加に関連している場合があることを示している。

【0159】

ＲＧＤドメインに隣接する変異体は、αＶβ５結合の改善を示さなかったが、これらの変化が他のインテグリンヘテロ二量体への結合に影響を与え得る可能性がある。追加のＥＬＩＳＡ実験を実行して、ＶＴＮ６２－２９２バリアント及びそれから作製した変異体の、主要ＲＧＤ受容体：アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）及びアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））に対する結合親和性を調べた。αＶβ３及びα５β１は、主要なフィブロネクチン（ＦＮ）受容体である。αＶβ３及びαＶβ５は、ＶＴＮ受容体である。ＦＮ及び全長ＶＴＮを、比較のために使用した。図１３Ａ及び１３Ｂ及び図１４は、アルファＶベータ５（αＶβ５）、アルファＶベータ１（αＶβ１）、アルファＶベータ３（αＶβ３）及びアルファ５ベータ５（α５β１）（ａｌｐｈａ５Ｂｅｔａ５（α５β１））を含む主要なＲＧＤ結合インテグリンヘテロ二量体に対する、ＲＧＤモチーフに隣接するＶＴＮ６２－２９２バリアント及び変異の結合親和性を示す。これらのアッセイでは、ｈＶＴＮ６２－２９２は、αＶβ５に対する結合親和性は全長ＶＴＮ（ＶＴＮ－ＦＬ）と同様であるが、若干の増加を示す。しかし、ｈＶＴＮ６２－２９２は、αＶβ３、αＶβ１、及びα５β１に対する改善された結合親和性を示す。このことによって、一部の細胞増殖アッセイにおいてｈＶＴＮ６２－２９２がＦＬ－ＶＴＮよりも優れている理由を説明することができる。ＶＴＮ－Ｎバリアント（ＶＴＮ－ＣＴＳ）も同様の傾向を示すが、典型的には、４つのインテグリンヘテロ二量体すべてに対する親和性が低くなる。

【0160】

これらの実験により、インテグリン結合を改善すると想定されたＶＴＮ変異体、すなわちＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、αＶβ５結合親和性を大幅に減少させ、ＥＤ５０値が増加することが確認された。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体も、程度は低いものの、αＶβ５結合親和性の低下を示した。興味深いことに、三重変異体は、２つの主要なフィブロネクチン受容体、すなわちαＶβ３及びα５β１、ならびにαＶβ１に対する親和性の増加を示した。これは、インテグリン結合能力においてフィブロネクチンと類似した変異体が存在するという点で重要である。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ変異体は、非動物由来条件で効率的に作製することができるが、全長フィブロネクチンはそれができないため、これらの変異体は、最適な増殖のためにＦＮ及び／またはこれらのインテグリンを利用する細胞型を用いて非動物由来細胞培養条件を達成する利点を与えることができる。

【0161】

ｉＰＳＣの支持におけるＶＴＮバリアントの役割をさらに調査するために、改変接着アッセイを実行して、これにより、細胞をＶＴＮコーティング組織培養プレートに１時間接着させた後、洗浄して基質への細胞の接着を試験した（Ｋｕｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；１８２（１）：１６－９；ａｎｄ Ｔａｏｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１４５（２）：４１３－２０）。このアッセイは、細胞が下部のマトリックスにどの程度しっかりと結合しているかを測定するものと考えられている。このアプローチを使用すると、全長ＶＴＮと比較してＶＴＮ６２－２９２へのｉＰＳＣ細胞結合の増加（図７Ｂ）は検出されなかった。ＶＴＮ６２－２９２バリアントは、ＶＴＮ－Ｎ（ＣＴＳ）バリアントよりも高い接着力を示した。ＶＴＮ－Ｎは利用可能な唯一の他の機能的非動物由来ＶＴＮであるため、これは重要である。しかし、Ｄ８０Ｙ変異は、インテグリン結合の改善を考えると、驚くべきことに接着の改善をもたらさなかった（図８を参照のこと）。このアッセイは、初期の細胞付着中に形成された新生接着体（ｎａｓｃｅｎｔ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）をプローブするが、より成熟した接着斑はプローブしないため、これらの結果はＶＴＮの細胞接着特性を完全に反映していない場合がある。

【0162】

ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙバリアントは細胞培養におけるｉＰＳＣの拡大を支持したが、三重変異体ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、この拡大を支持しなかった。このことは、これらの変異体がｉＰＳＣで発現する主要なＶＴＮ受容体であるαＶβ５に結合する能力が低下していることの反映である可能性が高い。データは示されていないが、この実施例では、ｉＰＳＣは典型的なＶＴＮ受容体β３の発現を欠いているが、間葉幹細胞（ＭＳＣ）はβ３を含むＲＧＤ受容体の主要なサブユニットをすべて発現していることが確認された。ＭＳＣは一般にＦＮ上で増殖し、ＭＳＣ分化はα５β１インテグリンによって促進される。したがって、αＶβ３及びα５β１に対する親和性の増加を示すＥＬＩＳＡデータを考慮すると、ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体及び／またはＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ変異体は、ＭＳＣの増殖を促進する可能性がある。

【0163】

これを試験するために、ヒト骨由来ＭＳＣを、ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２、ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上で培養した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。種々の濃度で、ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐは、ＦＮ及びＶＴＮ６２－２９２と比較して細胞増殖の改善を示した（図１５Ｂ）。これらのマトリックスはすべて、ＢＭＥと比較してＭＳＣ増殖が改善された。

【0164】

図１５Ａ及び１５Ｂは、培養中のＭＳＣ増殖に対するＶＴＮ変異体の効果を示す。提示されたデータは、３つの濃度のＶＴＮの３回の実験からのものである。細胞増殖は、７２時間後のＭＣＳ細胞培養物のコンフルエンスを分析することによって監視した。図１５Ａは、ＦＮ及び異なるＶＴＮ６２－２９２バリアント上のＭＳＣの明視野画像を示す。３つの濃度はすべて、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体がＭＳＣ増殖の強化を支持することを示している（図１５Ｂ）。これは、減弱された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ）または完全に抑制された（ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ）三重変異体でのｉＰＳＣの増殖とは顕著な対照を成している（図６Ａ及び図６Ｂ）。図１６Ａ及び１６Ｂは、ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２、及びＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上での未分化状態、及びＭＳＣへの分化後の、ＩＢＪ６ ｉＰＳＣ細胞株の細胞拡大を示す。この実験は、幹細胞性の異なる状態にある同じ細胞株が基質選択性を切り替えることができることを示す。未分化状態では、明視野画像で見られ、コンフルエンスパーセントによって定量されるように、ｉＢＪ６ ｉＰＳＣはＶＴＮ６２－２９２上でのみ大幅に拡大する（図１６Ａ）。ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上では本質的に増殖がないことに留意されたい。誘導ＭＳＣ（ｉＭＳＣ）への分化後、同じ細胞株は、ＦＮ上で増殖の増加を示すが、ＶＴＮ６２－２９２，Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ上で最良の増殖を示す（図１６Ｂ）。これは、ＭＳＣ分化後のαＶβ３の発現の増加及び／またはα５β１インテグリンを介する結合の増加に起因すると思われる。

【0165】

ｉＰＳＣ（ｉＭＳＣ）由来のＭＳＣは、均質性及び拡張性を含む臨床用途のための多くの利点を提供する。したがって、ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８ＰのｉＭＳＣへの適合性について試験した。最初に、ｉＢＪ６ ｉＰＳＣを、ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ上で増殖させた。明視野画像及び細胞コンフルエンス測定により、ＶＴＮ６２－２９２は、ｉＰＳＣの堅牢な拡大を支持したが、ＦＮ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐは、ｉＰＳＣ増殖を支持できなかったことが確認された（図１６Ａ）。しかし、ｉＰＳＣからｉＭＳＣへの分化後、ＦＮ、ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐは、細胞拡大を支持した（図１６Ｂ）。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ変異体は、細胞コンフルエンス測定によって示されるように、最も高い細胞拡大を示した。これは、ＭＳＣ分化後のβ３発現の増加及び／またはα５β１を介したシグナル伝達の増加を反映している可能性が高い。

【0166】

ＶＴＮ６２－２９２及びＤ８０Ｙ変異体のこの改善された機能は、タンパク質の熱安定性に関連している場合があり、これは他のタンパク質におけるコンセンサスアラインメントに関する以前の研究に基づいて予測されている（Ｐｏｒｅｂｓｋｉ ａｎｄ Ｂｕｃｋｌｅ， ２０１６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２９（７）：２４５－５１）。したがって、細胞培養基質としてのＶＴＮを改善するという目標に関連した簡単な試験を実行した。この試験では、ＶＴＮバリアントを３７℃で４日間インキュベートした後、ｉＰＳＣをプレーティングした。４日間の細胞拡大の後、Ｄ８０Ｙ変異がＶＴＮ６２－２９２変異体を超える追加の安定性を与えないことが予想外に観察された（図９）。中程度であるが、ＶＴＮ６２－２９２バリアントは、ＶＴＮ－Ｎバリアントと比較して安定性の利点を与えた。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ由来断片はいずれも、ＶＴＮ－ＦＬタンパク質を上回る安定性の利点を有していなかった。それにもかかわらず、これらの結果は、ＶＴＮ６２－２９２が他のＥ．ｃｏｌｉ由来断片よりも安定性が増大している場合があり、これが細胞培養にとってさらなる利点であり得ることを示唆している。

【0167】

まとめると、この実施例の結果は、ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙバリアントが、全長ＶＴＮ及び以前に公開されたＶＴＮバリアントよりも有意な利点を与えることを示している。第１に、原核生物発現系におけるＶＴＮ６２－２９２の製造可能性の強化は、幹細胞の培養及び分化のための非動物由来ワークフローのための生物学的に活性な接着分子の大量産生を提供する、主要な利点である。より小さなバリアントも高い発現を示したが、ｉＰＳＣまたはＭＳＣ培養を支持する機能が不十分であるため、これらのバリアントは、幹細胞用途には不十分である。第２の利点は、全長ＶＴＮまたはＶＴＮ－Ｎバリアントと比較して、ｉＰＳＣ及びＭＳＣの拡大を支持するためのこれらのバリアントの機能が改善されていることである。ｉＰＳＣに関しては、このことは、ＶＴＮ６２－２９２及びＶＴＮ６２－２９２，Ｄ８０Ｙが複数のｉＰＳＣ細胞株において細胞拡大の大幅な改善を示す低濃度で、特に顕著である。さらに、これらのバリアントの有用性は、これらのバリアントがｉＰＳＣの、胚体内胚葉、神経前駆細胞、及び完全に分化したニューロンへの分化も支持するため、より堅牢な幹細胞ワークフローにも当てはまる。第３の利点は、再生医療に関連する完全な非動物由来エクスビボワークフローへの適用である。

【0168】

加えて、ここでの結果は、ＲＧＤインテグリン結合特異性をＶＴＮバリアントに関連して調節して、細胞型特異的細胞培養を調整し、これらの細胞の挙動を改変することもできることを示唆している。再生医療との関係では、これらのＶＴＮ変異体は、ＭＳＣの拡大を強化させるための非動物由来基質を提供する。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｓ，Ｆ６８Ｐ及びＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐを含むこれらの変異体は、中胚葉系譜分化、心臓分化、または骨形成などの、α５β１及び／またはαＶβ３によって強化される細胞プロセスにも有益であることも証明され得る。

【0169】

実施例２
インテグリン特異性を差次的に調整した組換えビトロネクチンバリアントは間葉系幹細胞及び多能性幹細胞の増殖を最適化する

【0170】

ビトロネクチン（ＶＴＮ）は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のエクスビボ拡大のための重要な定義された基質であるが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にはあまり頻繁には使用されない。後者の細胞型は、フィブロネクチン（ＦＮ）を使用してより頻繁に拡大させるが、組換え技術を使用して産生するのは困難かつ費用がかかる。

【0171】

実施例１でより詳細に記載された標的変異によって、異なるインテグリンヘテロ二量体の結合の改変を通じて、ＶＴＮがＭＳＣを支持する能力が改善される。これらの新規組換えヒトビトロネクチン（ｈＶＴＮ）バリアントは、カノニカルなＦＮ受容体であるアルファ５－ベータ１を含む主要なＲＧＤインテグリンヘテロ二量体に対して異なる結合活性を示す。この異なるインテグリン結合活性を通じて、これらのｈＶＴＮバリアントは、ＭＳＣ及びｉＰＳＣの接着、生存、拡散、及び分化を差次的に支持する。これらの改変されたＶＴＮバリアントのうちの１つ（ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐ；本明細書ではＶＮ－３とも呼ばれる）は、細胞培養において未分化ｉＰＳＣを支持できなかったが、ＭＳＣ接着、生存、及び拡大の改善を示した。さらに、ＭＳＣ骨形成分化は、このＶＴＮバリアントでも強化された。ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐバリアントは、アルファＶ－ベータ３に対して同様の結合親和性を示したが、アルファＶ－ベータ５に対して親和性の大幅な減少、及びアルファ５－ベータ１に対して親和性の増加を示した。インテグリン発現プロファイリングを使用して、ＭＳＣはすべての主要なＲＧＤ結合インテグリンヘテロ二量体サブユニットを発現する一方、ｉＰＳＣはベータ３インテグリンの発現を欠いており、ｉＰＳＣがＲＧＤ含有ＥＣＭタンパク質と結合するために使用することができるヘテロ二量体のレパートリーが制限されていることが示された。インテグリンアルファＶベータ５ヘテロ二量体の結合をブロックすると、ｉＰＳＣが全長ＶＴＮまたはＶＴＮバリアントのいずれかに結合する能力が損なわれるが、ＭＳＣのＶＴＮへの結合には影響を及ぼさない。アルファＶベータ３、アルファＶベータ５、及びアルファ５ベータ１をブロックすることのみによって、ＭＳＣのＶＴＮへの結合が大幅に減少する。このことは、未分化ｉＰＳＣは主にアルファＶ－ベータ５を使用してＶＴＮに結合するのに対し、ＭＳＣはより多用途であり、種々のインテグリンヘテロ二量体を使用してＶＴＮに結合できることを強く示唆している。興味深いことに、ｉＰＳＣがＭＳＣに分化すると、ベータ３インテグリンの発現を開始し、その後ＶＴＮ６２－２９２ Ｔ６３Ｇ，Ｖ６７Ｎ，Ｆ６８Ｐバリアントに効果的に結合できるようになり、インテグリンの発現パターンの変化がどのようにして様々なビトロネクチンバリアントに対する感受性を与えるのかが確認される。

【0172】

インテグリン受容体の結合は、多様で必須の細胞の挙動を駆動する種々の短期及び長期の細胞応答に影響を与える。アクチン細胞骨格への直接結合及びＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓを介したシグナル伝達を通じて、インテグリンはアクチンの動態及び接着斑の代謝回転を調節し、結果として細胞－基質結合、細胞の極性、遊走に影響を与える。加えて、インテグリンは、細胞の生存、拡散、及び分化に影響を与える、相互接続された多様な形質導入経路を通じてシグナル伝達する。インテグリンは、αサブユニット及びβサブユニットで構成される膜貫通ヘテロ二量体であり、これらは異なる組み合わせで配列されて２４個の固有のインテグリン受容体を形成する。これらの異なるヘテロ二量体は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン（ＦＮ）、及びビトロネクチン（ＶＴＮ）などの異なる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の結合に従ってサブグループに分類することができる。

【0173】

フィブロネクチン及びビトロネクチンは、５つのαＶインテグリン、２つのβ１インテグリン、及びαＩＩｂβ３インテグリンによって認識される共通のアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを共有している（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ；１１９（Ｐｔ １９）：３９０１－３）。ラミニン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、及び血小板内皮細胞接着分子を含む、追加のＥＣＭ及び接着分子はまた、これらのインテグリンによって認識されるＲＧＤ部位を有する。ＲＧＤ結合モチーフの機構は、一般に種々のα／β二量体間で保存されているが、おそらく結合部位の特異的立体構造の差異により、異なるリガンド親和性が存在する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ；１４（７）：１３４４７－６２）。

【0174】

異なる立体構造のＲＧＤモチーフの提示により、合成ペプチドの結合が変化する可能性があることはよく知られており、環状ＲＧＤペプチドは、直鎖ペプチド及び環状ペプチドの異なるバリエーションよりも高い親和性を示し、様々なインテグリンに対して異なる結合親和性を示す（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。実際、二量体の界面におけるＲＧＤペプチドの隣接するアミノ酸配列及び結合様式を変更することによって、合成ペプチドに対しインテグリン特異性を達成することができる（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。これらの研究は、所与のＲＧＤ含有ＥＣＭ分子が様々なインテグリン二量体に対して有する相対親和性が、ＲＧＤモチーフの提示に依存しており、これは、隣接するアミノ酸配列の影響を受ける可能性があることを示唆している。

【0175】

種々のＲＧＤ含有分子に対するインテグリンの結合親和性の差異により、細胞培養におけるＥＣＭマトリックス上の多様な細胞挙動が調節される可能性が高い。血清中の通常は高レベルのフィブロネクチン、ビトロネクチン、及びその他の接着タンパク質が細胞接着に必要であり、他の多数の増殖因子、タンパク質、及びその他の分子が細胞挙動に影響を与えるため、無血清細胞培養条件下では、ＥＣＭ基質の選択が特に重要になる。多能性幹細胞（ＰＳＣ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、再生医療における用途のためにＥＣＭマトリックス上でのエクスビボ拡大を必要とする２つの重要な細胞型である。これらの細胞型及びそれらの誘導体を採用するには、動物由来、及びさらにはヒト由来の材料を排除して、定義された細胞培養条件を最適化する必要がある。異種成分不含条件下において、ＭＳＣ培養のプロトコールでは、一般に拡大期と分化期の両方にフィブロネクチンを使用する（Ｃｉｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ；２０１７：６５９７８１５；及びＢａｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；１１（１）：１３０８９）。あまり使用されないが、ＭＳＣは、ビトロネクチン、基底膜抽出物、及びラミニン上でも増殖及び分化する（Ｌａｍ ａｎｄ Ｌｏｎｇａｋｅｒ， ２０１２， Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ；６ Ｓｕｐｐｌ ３（０ ３）：ｓ８０－６）。多様な基質を使用するＭＳＣの能力は、多様なインテグリンサブユニットの発現によるも可能性が高い（Ｆｒｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ；２１（１３）：２４４２－５６）。ＭＳＣは種々のインテグリンに結合し、それを通じてシグナル伝達することができ、拡大速度及び分化能力は基質／結合モチーフに応じて変動する。多くの研究では、αＶ及びβ１インテグリンの両方を介して媒介されるとみられている、ＭＳＣの拡大、骨形成及び軟骨形成分化を促進するために異種条件下でＦＮが使用されており（Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ， ２０１２， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ；１２５（Ｐｔ １６）：３７０３－１２；Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ；１５（３）：６１８－６２８；及びＢａｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；１１（１）：１３０８９）、骨形成分化において役割を果たすα５β１の結合が強化されるという証拠を伴う（Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；３０（６）：１０８９－９７；Ｈａｍｉｄｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１０６（４４）：１８５８７－９１；Ｆｒｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ；２１（１３）：２４４２－５６）。ＭＳＣの基質としては一般的には使用されているわけではないが、ビトロネクチンは、カノニカルなαＶβ３及び代替のαＶβ５ ＶＴＮ受容体を発現するＭＳＣの接着、拡大、及び分化も支持する（Ｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ；９５（４）：１１１４－２４）。異種成分不含培養下での多能性幹細胞の培養への移行は、マウス線維芽細胞フィーダーシステムの代わりに、重要な増殖因子を含有する基質及び培地として基底膜抽出物（ＢＭＥ）を採用することから始めた（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；２４（２）：１８５－７）。ＢＭＥは、高レベルのラミニン、ＩＶ型コラーゲン、パーレカン、及びエンタクチン、ならびに低レベルの、フィブロネクチンなどの他の多くの接着関連タンパク質を含む、タンパク質の未定義の混合物である。ナイーブ状態では、ＰＳＣは、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチンなどの精製または組換えＥＣＭタンパク質上で、拡大及び長期培養することができる。しかし、ＰＳＣを多能性状態に維持するためにフィブロネクチンを使用する報告には一貫性がなく、増殖速度が低下し、自発的分化が増加すると報告している報告もある（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ；２０１６：５３８０５６０）。

【0176】

異なるＲＧＤインテグリン受容体二量体の特異的結合は、細胞内シグナル伝達及び細胞挙動に対して異なる結果を有する。例えば、主要なＦＮ受容体であるαＶβ３及びα５β１は、微小環境及び運動性の適切な機械受容のために相乗作用するが（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１５（６）：６２５－３６）、それらは異なる結合パートナー及び経路を介して細胞内にシグナル伝達する。これは、短期的には細胞挙動に微妙な差異をもたらし、長期的には細胞生理学のより顕著な変化をもたらす可能性がある。短期的には、α５β１のＦＮ結合により、接着斑が小さく、より大きなより動的な細胞がもたらされるが、αＶβ３を介したＦＮシグナル伝達により、接着斑及びストレスファイバーが大きく、より小さな運動性の低い細胞がもたらされる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１５（６）：６２５－３６）。長期的には、α５β１媒介シグナル伝達が、ＭＳＣの骨形成分化（Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；３０（６）：１０８９－９７；Ｆｒｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ；２１（１３）：２４４２－５６）及びｉＰＳＣの心臓特異化（Ｎｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；９（１）：１８０７７）にとって重要であるという証拠がある。α５β１インテグリンはフィブロネクチンの主要な受容体であり、主に中央結合領域の１０番目のＦＮＩＩＩリピートドメインのＲＧＤ部位を介して結合し、ＦＮＩＩＩリピートドメイン９のＰＨＳＲＮモチーフのある程度の相加効果を伴う（Ｐａｎｋｏｖ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ， ２００２， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ；１１５（Ｐｔ ２０）：３８６１－３）。フィブロネクチンは、胚発育に不可欠である；その欠失によって、血管奇形及び心臓奇形を含む重度の中胚葉欠損が生じる（Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；１１９（４）：１０７９－９１；ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｌｏｏｄ；９０（８）：３０７３－８１）。α５インテグリンの遺伝的除去には、血管及び心臓の異常と重複する中胚葉欠損があり、α５β１を介したＦＮシグナル伝達がこれらの発育過程に少なくとも部分的に関与していることを示唆している（Ｂｏｕｖａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ；８９（３）：２１１－２３；及びＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ；３９５（２）：２３２－４４）。

【0177】

フィブロネクチン分子は、同じ遺伝子から選択的にスプライシングされた複数のアイソフォームにおいて存在する。一般に、ＦＮは、ジスルフィド結合を介して連結された２つの大きな約２５０ｋＤａの糖タンパク質サブユニットの二量体である（Ｐａｎｋｏｖ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ， ２００２， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ；１１５（Ｐｔ ２０）：３８６１－３）。そのため、組換えフィブロネクチンの産生は労が多いプロセスであり、哺乳動物系では収量が少なくなり、Ｅ．ｃｏｌｉベースの発現系では本質的に不可能である（Ｓｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；５２２：７３－９９）。ＦＮは、多くのインテグリン結合パートナーを有するが、ＦＮの重要な効果の多くは、α５β１を介して媒介される。ＶＴＮなどの他のＲＧＤタンパク質は、ＲＧＤ結合ポケットの基本的な類似性にもかかわらず、α５β１に結合してα５β１を介してシグナル伝達することができない（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）。

【0178】

実施例１でより詳細に考察されるように、アミノ酸６２～２９２からなるＶＴＮバリアントは、全長ＶＴＮまたは他の公開された断片と同等であるかまたはそれらを改善する機能活性を有する非動物由来系において効果的に産生することができる。種々のＲＧＤ含有ＥＣＭ分子からの隣接アミノ酸配列の分析及びＲＧＤ含有ペプチドに対する改変に基づき（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：３９８０５）、この実施例では、このＶＴＮ６２－２９２バリアントのインテグリン結合部位の改変により、異なるインテグリンアイソフォームに特異的に結合するプラットフォームが提供された。

【0179】

この実施例では、特異的インテグリンヘテロ二量体への結合を改変するビトロネクチンバリアントを作製した。ＶＴＮ６２－２９２バリアントバックグラウンドのＲＧＤドメイン周辺に設計された単一、二重、及び三重変異は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてαＶβ３、αＶβ５、αＶβ１、及びα５β１ヘテロ二量体に対して異なる親和性を示す。驚くべきことに、単一及び二重変異はαＶβ３、αＶβ１、及びα５β１インテグリンの結合を抑制するが、これらの単一及び複数の／二重（ｔｉｐｌｅ）変異体に基づいて構築された三重変異体は、これらの同じインテグリンへの結合を改善することが観察された。細胞アッセイでは、これらの同じ三重変異体に対する骨由来ＭＳＣとｉＰＳＣ由来ＭＳＣの両方で増殖の改善が観察されたが、ｉＰＳＣ増殖は減弱、または完全に消失した。後者の結果は、これらの三重変異体はｉＰＳＣにおいて主要なＶＴＮ受容体であるαＶβ５に結合する能力が低下していることに起因する可能性が高い。このことは、ＶＴＮ上で培養したｉＰＳＣを用いた抗体ブロッキング実験で確認され、αＶβ５を単独でブロックするとｉＰＳＣ細胞増殖が大幅に減少し、αＶβ５とともにβ１をブロックするとｉＰＳＣ増殖が完全に阻害されることを示した。αＶβ３をブロックしても、ＶＴＮ上のｉＰＳＣ増殖には影響を及ぼさない。ＶＮ上でのｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ｉＭＳＣ）の増殖は、αＶβ５、αＶβ３、及びβ１がすべて同時にブロックされた場合には劇的には減弱されず、このことは、これらの細胞のインテグリン発現プロファイルと一致する。さらに、ＶＴＮの三重変異体では骨形成分化が強化されることが観察され、インテグリン結合の変化が細胞生理機能にさらなる影響を与えることを示唆している。全体として、この実施例は、ＲＧＤインテグリン結合特異性をＶＴＮバリアントに関連して調節して、細胞型特異的細胞培養を調整し、これらの細胞の挙動を改変することもできることを示している。再生医療との関係では、これらのＶＴＮ変異体は、ＭＳＣの拡大を強化させるための非動物由来基質を提供する。これらの変異体によって、中胚葉系譜分化または骨形成など、α５β１及び／またはαＶβ３によって強化される細胞プロセスに有益であることも証明することができる。

【0180】

本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、及び刊行物、ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列登録、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録、ならびにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、参照により組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示（複数可）との間に矛盾が存在する場合には、本出願の開示が優先されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ示されている。そこから不必要な限定が理解されるべきではない。本発明は、示され記載されている正確な詳細に限定されるものではなく、当業者にとって明らかな変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれる。

【0181】

配列表フリーテキスト
配列番号１ 全長ヒトビトロネクチン
配列番号２ ビトロネクチンポリペプチド断片アミノ酸６２～２９２（ｈＶＴＮ（６２～２９２））
配列番号３ Ｈｉｓタグ付きビトロネクチンポリペプチド断片アミノ酸６２～２９２

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B-1】

【図15B-2】

【図16A】

【図16B】

【配列表】

2024533113000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-05-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビトロネクチンポリペプチド断片であって：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくとも５０個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失を含み；
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくともＣ末端アミノ酸３６２～４７８の欠失を含み；
ビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み；
ビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメインを含まず；
ビトロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン及びＨｐ４ドメインを含まず；かつ
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの同じ断片に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項2】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及び／またはＨｐ３ドメインを含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項3】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、約２００～約３５０アミノ酸の長さを有する、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項4】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失；及び
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、Ｃ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項5】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの残基６２～２９２に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項6】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの、
６３位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６７位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６８位に相当する位置でのアミノ酸置換；
８０位に相当する位置でのアミノ酸置換；及び／または
１４８位に相当する位置でのアミノ酸置換、を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項7】

前記アミノ酸置換が、Ｔ６３Ｇ置換、Ｖ６７Ｓ置換、Ｖ６７Ｎ置換、Ｆ６８Ｐ置換、Ｄ８０Ｙ置換、及び／またはＱ１４８Ｅ置換を含む、請求項６に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項8】

配列番号２からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項9】

配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項10】

Ｄ８０位における前記アミノ酸置換がＤ８０Ｙ置換を含み、及び／またはＱ１４８位における前記アミノ酸置換がＱ１４８Ｅ置換を含む、請求項９に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項11】

配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、６３位に相当する位置でのアミノ酸置換、６７位に相当する位置でのアミノ酸置換、及び／または６８位に相当する位置でのアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項12】

Ｔ６３位における前記アミノ酸置換がＴ６３Ｇ置換を含み、Ｖ６７位における前記アミノ酸置換がＶ６７Ｓ置換またはＶ６７Ｎ置換を含み、及び／またはＦ６８位における前記アミノ酸置換がＦ６８Ｐ置換を含む、請求項１１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項13】

Ｃ末端Ｈｉｓ－タグをさらに含む、請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項14】

１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のＣ末端Ｈｉｓ残基を含む、請求項１３に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項15】

配列番号３からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項16】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、非動物由来である、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項17】

マイクロキャリアにコンジュゲートしている、請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。

【請求項18】

前記マイクロキャリアが、ヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含む、請求項１７に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート。

【請求項19】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片を含む組成物。

【請求項20】

請求項１９に記載の組成物であって、非動物由来である、前記組成物。

【請求項21】

細胞培養基質として使用するための、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列。

【請求項23】

請求項２２に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【請求項24】

請求項２３に記載の発現ベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含む、前記発現ベクター。

【請求項25】

請求項２２に記載のヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。

【請求項26】

請求項２５に記載の宿主細胞であって、Ｅ．ｃｏｌｉを含む、前記宿主細胞。

【請求項27】

ビトロネクチンポリペプチド断片を産生する方法であって、請求項２２に記載のヌクレオチド配列から、前記ビトロネクチンポリペプチド断片を発現させることを含む、前記方法。

【請求項28】

前記産生されたビトロネクチン断片ポリペプチドが非動物由来である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

細胞培養方法であって、請求項１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片を含む基質上で細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項30】

前記細胞が幹細胞を含む、請求項２９に記載の細胞培養方法。

【請求項31】

前記細胞を非動物由来条件下で培養する、請求項２９に記載の細胞培養方法。

【請求項32】

細胞培養がエクスビボである、請求項２９に記載の細胞培養方法。

【請求項33】

前記細胞が、幹細胞を含む、請求項２９に記載の細胞培養方法。

【請求項34】

前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、請求項３３に記載の細胞培養方法。

【請求項35】

前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、請求項３３に記載の細胞培養方法。

【請求項36】

細胞培養方法であって、配列番号２または配列番号３からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む基質上で幹細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項37】

細胞培養方法であって、ビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号２からなり、配列番号２が、
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６３位に相当する位置でのＴ６３Ｇアミノ酸置換；
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６７位に相当する位置でのＶ６７ＳまたはＶ６７Ｎアミノ酸置換；及び
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６８位に相当する位置でのＦ６８Ｐアミノ酸置換、によって変更されている、前記ビトロネクチンポリペプチド断片、を含む基質上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することを含む、前記方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0181】

配列表フリーテキスト
配列番号１ 全長ヒトビトロネクチン
配列番号２ ビトロネクチンポリペプチド断片アミノ酸６２～２９２（ｈＶＴＮ（６２～２９２））
配列番号３ Ｈｉｓタグ付きビトロネクチンポリペプチド断片アミノ酸６２～２９２
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ビトロネクチンポリペプチド断片であって：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくとも５０個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失を含み；
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、少なくともＣ末端アミノ酸３６２～４７８の欠失を含み；
ビトロネクチンのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）インテグリン結合ドメインを含み；
ビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳｍＢ）ドメインを含まない；
ビトロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン及びＨｐ４ドメインを含まない；及び
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの同じ断片に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[２] 実施形態１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、ビトロネクチンのＨｐ１、Ｈｐ２、及び／またはＨｐ３ドメインを含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[３] 実施形態１または２に記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、約２００～約３５０アミノ酸の長さを有する、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[４] 実施形態１～３のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、６１個の連続するＮ末端アミノ酸の欠失；及び
配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドと比較して、Ｃ末端アミノ酸２９３～４７８の欠失を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[５] 実施形態１～４のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号１を有する前記全長ビトロネクチンポリペプチドの残基６２～２９２に対する約９５％の配列同一性を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[６] 実施形態１～５のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、以下：
配列番号１を有する全長ヒトビトロネクチンの、
６３位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６７位に相当する位置でのアミノ酸置換；
６８位に相当する位置でのアミノ酸置換；
８０位に相当する位置でのアミノ酸置換；及び／または
１４８位に相当する位置でのアミノ酸置換、を含む、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[７] 前記アミノ酸置換が、Ｔ６３Ｇ置換、Ｖ６７Ｓ置換、Ｖ６７Ｎ置換、Ｆ６８Ｐ置換、Ｄ８０Ｙ置換、及び／またはＱ１４８Ｅ置換を含む、実施形態６に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[８] 配列番号２からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。
[９] 配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、Ｄ８０位におけるアミノ酸置換及び／またはＱ１４８位におけるアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。
[１０] Ｄ８０位における前記アミノ酸置換がＤ８０Ｙ置換を含み、及び／またはＱ１４８位における前記アミノ酸置換がＱ１４８Ｅ置換を含む、実施形態９に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[１１] 配列番号１を有する全長ビトロネクチンと比較して、６３位に相当する位置でのアミノ酸置換、６７位に相当する位置でのアミノ酸置換、及び／または６８位に相当する位置でのアミノ酸置換を有する、配列番号２からなるビトロネクチンポリペプチド断片。
[１２] Ｔ６３位における前記アミノ酸置換がＴ６３Ｇ置換を含み、Ｖ６７位における前記アミノ酸置換がＶ６７Ｓ置換またはＶ６７Ｎ置換を含み、及び／またはＦ６８位における前記アミノ酸置換がＦ６８Ｐ置換を含む、実施形態１１に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[１３] Ｃ末端Ｈｉｓ－タグをさらに含む、実施形態１～１２のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[１４] １、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のＣ末端Ｈｉｓ残基を含む、実施形態１３に記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[１５] 配列番号３からなる、ビトロネクチンポリペプチド断片。
[１６] 実施形態１～１５のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片であって、非動物由来（動物不含）である、前記ビトロネクチンポリペプチド断片。
[１７] マイクロキャリアにコンジュゲートしている、実施形態１～１６のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片。
[１８] 前記マイクロキャリアが、ヒドロゲルまたはポリスチレンミクロスフェアを含む、実施形態１７に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート。
[１９] 実施形態１～１６のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、または実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲートを含む組成物。
[２０] 実施形態１９に記載の組成物であって、非動物由来（動物不含）である、前記組成物。
[２１] 細胞培養基質として使用するための、実施形態１～１６のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または実施形態１９もしくは２０に記載の組成物。
[２２] 実施形態１～１６のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列。
[２３] 実施形態２２に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
[２４] 実施形態２３に記載の発現ベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含む、前記発現ベクター。
[２５] 実施形態２２に記載のヌクレオチド配列または実施形態２３もしくは２４のいずれかに記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[２６] 実施形態２５に記載の宿主細胞であって、Ｅ．ｃｏｌｉを含む、前記宿主細胞。
[２７] ビトロネクチンポリペプチド断片を産生する方法であって、実施形態２２に記載のヌクレオチド配列、実施形態２３もしくは２４に記載の発現ベクター、または実施形態２５もしくは２６に記載の宿主細胞から、前記ビトロネクチンポリペプチド断片を発現させることを含む、前記方法。
[２８] 前記産生されたビトロネクチン断片ポリペプチドが非動物由来（動物不含）である、実施形態２７に記載の方法。
[２９] 細胞培養方法であって、実施形態１～１８のいずれかに記載のビトロネクチンポリペプチド断片、実施形態１７もしくは１８に記載のビトロネクチンポリペプチド断片コンジュゲート、または実施形態１９もしくは２０に記載の組成物を含む基質上で細胞を培養することを含む、前記方法。
[３０] 前記細胞が幹細胞を含む、実施形態２９に記載の細胞培養方法。
[３１] 前記細胞を非動物由来条件下で培養する、実施形態２９または３０に記載の細胞培養方法。
[３２] 細胞培養がエクスビボである、実施形態２９～３１のいずれかに記載の細胞培養方法。
[３３] 前記細胞が、幹細胞を含む、実施形態２９～３２のいずれかに記載の細胞培養方法。
[３４] 前記幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、実施形態３３に記載の細胞培養方法。
[３５] 前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、実施形態３３に記載の細胞培養方法。
[３６] 細胞培養方法であって、配列番号２または配列番号３からなるビトロネクチンポリペプチド断片を含む基質上で幹細胞を培養することを含む、前記方法。
[３７] 細胞培養方法であって、ビトロネクチンポリペプチド断片であって、配列番号２からなり、配列番号２が、
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６３位に相当する位置でのＴ６３Ｇアミノ酸置換；
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６７位に相当する位置でのＶ６７ＳまたはＶ６７Ｎアミノ酸置換；及び
配列番号１を有する全長ビトロネクチンに対して６８位に相当する位置でのＦ６８Ｐアミノ酸置換、によって変更されている、前記ビトロネクチンポリペプチド断片、を含む基質上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することを含む、前記方法。

【国際調査報告】