知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ エリクサージェン セラピューティクス，インコーポレイティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】がんのための温度制御可能なＲＮＡ免疫療法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240905BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240905BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 Z
A61P35/00
A61P37/04
A61K31/7088
A61K48/00
A61K47/26
C12N15/86 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513756
(86)(22)【出願日】2022-08-31
(85)【翻訳文提出日】2024-04-24
(86)【国際出願番号】 US2022075789
(87)【国際公開番号】W WO2023034881
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,280
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/341,318
(32)【優先日】2022-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/390,216
(32)【優先日】2022-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521469128
【氏名又は名称】エリクサージェン セラピューティクス，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(74)【代理人】
【識別番号】100208225
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 修二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100217179
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 智史
(72)【発明者】
【氏名】ミノル エス．エイチ．コ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076CC07
4C076CC27
4C076EE20
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA06
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA03
4C085BB01
4C085BB23
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086NA05
4C086NA06
4C086ZB09
4C086ZB26
(57)【要約】
本開示は、がん抗原をコードする、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、及び温度感受性自己複製ＲＮＡに関する。このＲＮＡ構築物は、ヒト被験体などの哺乳動物被験体におけるがん免疫療法に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物であって、賦形剤、及び融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠くアルファウイルスレプリコンと、を含む温度感受性自己複製ＲＮＡを含み、前記ＯＲＦが、５’から３’に、（ｉ）哺乳動物シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）がん抗原をコードするヌクレオチド配列と、
を含み、
前記温度感受性自己複製ＲＮＡが、許容温度で前記融合タンパク質を発現することができるが、非許容温度では発現することができない、
組成物。
【請求項2】
前記がん抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５（サバイビン）抗原、ＰＲＡＭＥ抗原、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＴＡＡがＷＴ１抗原を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＷＴ１抗原のアミノ酸配列が、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５抗原、及びＰＲＡＭＥ抗原を含む、ＴＡＡ融合タンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＴＡＡ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７、又は配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＴＡＡがＢＩＲＣ５抗原を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＢＩＲＣ５抗原のアミノ酸配列が、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＴＡＡがＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のアミノ酸配列が、配列番号４、又は配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＴＡＡがＭＡＧＥＡ３抗原を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＭＡＧＥＡ３抗原のアミノ酸配列が、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＴＡＡがＰＲＡＭＥ抗原を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＰＲＡＭＥ抗原のアミノ酸配列が、配列番号６、又は配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記がん抗原がネオ抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
前記哺乳動物シグナルペプチドが、哺乳動物抗原提示細胞において発現される表面タンパク質のシグナルペプチドである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記哺乳動物シグナルペプチドが、ＣＤ５シグナルペプチドであり、前記ＣＤ５シグナルペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記アルファウイルスレプリコンが、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）のβシート５とβシート６との間に４～６個の追加のアミノ酸を含む、前記ｎｓＰ２の発現を生じる１２～１８ヌクレオチドの挿入を有する非構造タンパク質コード領域を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記追加のアミノ酸が、配列番号１４（ＴＧＡＡＡ）の配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１２を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記ｎｓＰ２のアミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択される１つの配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１１を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記許容温度が３０℃～３６℃、又は３１℃～３５℃、又は３２℃～３４℃、又は３３℃±０．５℃であり、前記非許容温度が３７℃±０．５℃であり、任意選択で、前記許容温度が３１℃～３５℃であり、前記非許容温度が少なくとも３７℃±０．５℃である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記組成物が脂質ナノ粒子を含まない、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記組成物がキトサンをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物被験体に投与して、前記哺乳動物被験体において前記がん抗原に対する免疫応答を刺激するステップを含む、方法。
【請求項30】
前記組成物が皮内投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記免疫応答が、前記がん抗原を発現する哺乳動物細胞と反応性の細胞性免疫応答を含む、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞性免疫応答が、がん抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答及びがん抗原特異的ヘルパーＴリンパ球応答の一方又は両方を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記免疫応答が、前記がん抗原と反応性の体液性免疫応答をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記哺乳動物被験体がヒト被験体である、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
（ｉ）実施形態１～２８のいずれか一項に記載の組成物と、（ｉｉ）哺乳動物被験体への前記組成物の皮内送達のためのデバイスと、
を含む、キット。
【請求項36】
前記デバイスがシリンジ及び針を含む、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／３９０，２１６号、２０２２年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／３４１，３１８号、及び２０２１年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２４０，２８０号の利益を主張するものであり、それら各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／３９０，２１６号、２０２２年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／３４１，３１８号、及び２０２１年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２４０，２８０号の利益を主張するものであり、それら各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子配列表の提出
電子配列表（６９９４４２００１５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ、サイズ：２５３７４バイト、作成日：２０２２年８月３０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子配列表（６９９４４２００１５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ、サイズ：２５３７４バイト、作成日：２０２２年８月３０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、がん抗原をコードする、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、及び温度感受性自己複製ＲＮＡに関する。このＲＮＡ構築物は、ヒト被験体などの哺乳動物被験体におけるがん免疫療法に適している。
【背景技術】
【0004】
免疫療法は、がんの治療に有効であり得、より広く使用されるようになっている。１つの療法戦略は、腫瘍細胞において発現される抗原を含む免疫原性組成物を、がん患者に注射することである。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞において発現されるが、胚細胞においても発現され、又は正常細胞において低レベルで発現される。腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、ネオ抗原とも呼ばれ、腫瘍細胞においてのみ発現され、多くの場合、腫瘍細胞において変異している遺伝子から発現される。がん免疫療法は、がん細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導に依存する。
【0005】
強力なＴＡＡ又はＴＳＡ特異的細胞性免疫応答を誘導して、ＴＡＡ又はＴＳＡを発現する腫瘍細胞を破壊するがん免疫療法が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、がん細胞に対する細胞性免疫応答を誘導するための、がん抗原（ＴＡＡ及び／又はＴＳＡ）の使用に関する。いくつかの実施形態では、温度制御可能な自己複製ＲＮＡワクチンプラットフォームが利用される。例示的な実施形態では、ＷＴ１タンパク質は、温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）から宿主細胞において発現されて、ＷＴ１発現腫瘍細胞に対する強力な細胞性免疫応答を誘導する。ｃ－ｓｒＲＮＡは、本明細書では温度感受性自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡｔｓ）とも呼ばれる。重要なことに、ｃ－ｓｒＲＮＡ－ＷＴ１免疫療法剤（ＥＸＧ－５１０１）は、前臨床モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害し、更に、確立された腫瘍のサイズを減少させることが見出された。したがって、本明細書に記載されるｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、ＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮとしても知られる）、ＰＲＡＭＥ又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（ネオ抗原としても知られる）の発現に適したベクターである。いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡは、２つ以上のＴＡＡ、ＴＳＡ、又はＴＡＡ及びＴＳＡの組み合わせの融合タンパク質を発現するために使用される。
【0007】
他の実施形態の中でも、本開示は、賦形剤及び温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物はキトサンを含む。いくつかの実施形態では、キトサンは、低分子量（約３～５ｋＤａ）キトサンオリゴ糖、例えばキトサンオリゴ糖ラクテートである。いくつかの実施形態では、組成物は、リポソームも脂質ナノ粒子も含まない。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（本明細書において「ｃ－ｓｒＲＮＡ」又は「ｓｒＲＮＡｔｓ」と称される）の皮内注射後の細胞性（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）免疫応答の誘導のための機構の模式図を示す。
【0009】
【図2】温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）から発現されるがん抗原の模式図を示す。例示的な実施形態では、ヒトウィルムス腫瘍（ＷＴ１）タンパク質のコード領域は、ｃ－ｓｒＲＮＡ内に挿入された目的遺伝子（ＧＯＩ）である。ＥＸＧ－５１０１抗原は、配列番号１として示されるヒトＣＤ５抗原（ＣＤ５－ＳＰ）由来のシグナルペプチド配列と、配列番号１として示されるヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列（アイソフォームＤ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０２４４２６．６、ＮＣＢＩ番号ＮＰ＿０７７７４４．４）と、を含む融合タンパク質である。ＷＴ１アイソフォームＤのコード配列は、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）翻訳開始コドンを有する。
【0010】
【図3】ヒト被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための例示的な方法の模式図を示す。ｃ－ｓｒＲＮＡは、許容温度（例えば、３０～３５℃）では機能性であるが、非許容温度（例えば、３７℃以上）では機能性でない。人体の表面又はその直下の温度（表面体温）は約３１～３４℃であり、約３７℃である人体の深部体温よりも低い。ｃ－ｓｒＲＮＡは、許容表面体温である被験体の細胞への皮内及び皮下投与によって直接送達される。
【0011】
【図4】同系マウス腫瘍モデルにおけるＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡワクチンの試験を例示する。
【0012】
【図5】プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡワクチンを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍の増殖のグラフを示す。５匹のマウス（ｎ＝５）の平均及び標準偏差（エラーバー）を各群について示す。腫瘍接種後７日目までに、３群すべてのマウスで腫瘍が発生した。しかし、腫瘍接種後２５日目（注射後１８日目）までに、腫瘍増殖は、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡワクチンを注射したマウスにおいて用量依存的に遅延した。対照的に、プラセボを注射したマウスでは、腫瘍は増殖し続けた。
【0013】
【図6A】図６Ａ及び図６Ｂは、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図６Ａは、実験手順を例示する。
【図6B】図６Ａ及び図６Ｂは、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図６Ｂは、２５μｇのＥＸＧ－５１０１又はプラセボ（緩衝液のみ）の皮内注射によって各々免疫化されている５匹（ｎ＝５）のマウスから得られた脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。左パネルは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＭ－ＷＴ１）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。右パネルは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＭ－ＷＴ１）によって刺激された１×１０６個の脾細胞当たりのインターロイキン－４（ＩＬ－４）ＳＦＣの頻度を示す。平均及び標準偏差（エラーバー）を各群について示す。
【0014】
【図7】温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）から発現される複数の腫瘍関連抗原を含む融合タンパク質の模式図を示す。例示的な実施形態では、ＥＸＧ－５１０５抗原は、配列番号１として示されるヒトＣＤ５抗原（ＣＤ５－ＳＰ）由来のシグナルペプチド配列と、配列番号２として示されるヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列［アイソフォームＤ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０２４４２６．６、ＮＣＢＩ番号ＮＰ＿０７７７４４．４：ＷＴ１アイソフォームＤのコード配列は、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）翻訳開始コドンを有する］と、配列番号３として示されるヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮとしても知られる）タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１１６８）と、配列番号４として示されるヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１３２７）と、配列番号５として示されるヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００５３６２）と、配列番号６として示されるヒトＰＲＡＭＥタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１２９１７１５）と、を含む融合タンパク質である。ＴＡＡ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７として示され、ＣＤ５－ＳＰ＋ＴＡＡ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８として示される。
【0015】
【図8A】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ａは、実験手順を例示する。０日目に、合計１０匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを実験に使用した。５匹のマウスに各々２５μｇのＥＸＧ－５１０５を皮内注射で投与し、５匹のマウスにプラセボ（緩衝液のみ）を皮内注射で投与した。１４日目に、脾細胞を各マウスから収集し、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡワクチン上にコードされる例示的な抗原としてのＷＴ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答についてＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって試験した。
【図8B】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ｂは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＭ－ＷＴ１）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。
【図8C】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ｃは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－３８０）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。
【図8D】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ｄは、ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ ＰｅｐＭｉｘ ＭＡＧＥＡ３、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４３３５７、カタログ番号ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。
【図8E】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ｅは、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）タンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ ＰｅｐＭｉｘ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ－１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｏ１５３９２、カタログ番号ＰＭ－Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。
【図8F】図８Ａ～図８Ｆは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ（ヒトＷＴ１遺伝子、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１、ヒトＭＡＧＥＡ３、及びヒトＰＲＡＭＥ、の融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡ）の皮内注射による、腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図８Ｆは、ヒトＰＲＡＭＥタンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体：ＪＰＴ ＰｅｐＭｉｘ ＰＲＡＭＥ（ＯＩＰ４）、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４３３５７、カタログ番号ＰＭ－ＯＩＰ４）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
がん免疫療法は、主に細胞性免疫の誘導に依存する免疫原性組成物（すなわち、ＣＤ８＋キラーＴ細胞及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を伴うＴ細胞誘導ワクチン）によって最良に達成されると考えられる。本開示は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ、ネオ抗原とも呼ばれる）などの１つ以上のがん抗原をコードする、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、及び温度制御可能な自己複製ＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）を提供する。したがって、本開示は、がん免疫療法のための細胞性免疫に基づくプラットフォームを提供する。ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、広範囲の腫瘍において発現されるが、胚組織及び成体の非常に限定された細胞種においてのみ発現される。したがって、いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡはＷＴ１をコードする。いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡはＢＩＲＣ５（別名ＳＵＲＶＩＶＩＮ）をコードする。いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡはＮＹ－ＥＳＯ－１をコードする。いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡはＭＡＧＥＡ３をコードする。いくつかの実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡはＰＲＡＭＥをコードする。さらなる実施形態では、ｃ－ｓｒＲＮＡは、ＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥからなる群の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つすべてのがん抗原をコードする。
【0018】
細胞性免疫に基づくｍＲＮＡ免疫療法プラットフォーム
ワクチンプラットフォームは、Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎの先行特許出願［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号、現在国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号として公開］に部分的に記載されている。このワクチンプラットフォームは、細胞性免疫を誘導するように最適化され、これは、ワクチン生物学の既存の知識を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）などのアルファウイルスに基づく温度制御可能な自己複製ｍＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）と組み合わせることによって可能になる。用語ｃ－ｓｒＲＮＡ及びｓｒＲＮＡｔｓは、本開示全体を通して互換的に使用され、ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２（国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号に記載）が例示的な実施形態である。ｃ－ｓｒＲＮＡは、温度感受性を提供するアルファウイルスレプリカーゼに小さなアミノ酸変化を組み込むことによる、自己増幅ｍＲＮＡ（ｓａＲＮＡ又はＳＡＭ）としても知られるｓｒＲＮＡに基づく。Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎのｃ－ｓｒＲＮＡは、約３０～３５℃の許容温度範囲で機能性であるが、約３７℃以上の非許容温度では機能性でない。このプラットフォームは、ゲノム組込みがなく、迅速な開発と展開、及び単純なＧＭＰ（優良製造プロセス）プロセスが可能であるというｍＲＮＡプラットフォームのすべての利益と同時に、ｍＲＮＡプラットフォームと比較したｓｒＲＮＡプラットフォーム（すなわち、本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームに先行したもの）のさらなる利点、特に、より長い発現［Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５］及びより低い投薬量でのより高い免疫原性［Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４］を有する。しかし、この単純な温度制御可能な特徴は、以下に簡潔に記載されるように、Ｔ細胞誘導ワクチンの多くの望ましい特徴をともに引き出すことを可能にする。
ワクチンプラットフォームは、Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎの先行特許出願［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号、現在国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号として公開］に部分的に記載されている。このワクチンプラットフォームは、細胞性免疫を誘導するように最適化され、これは、ワクチン生物学の既存の知識を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）などのアルファウイルスに基づく温度制御可能な自己複製ｍＲＮＡ（ｃ－ｓｒＲＮＡ）と組み合わせることによって可能になる。用語ｃ－ｓｒＲＮＡ及びｓｒＲＮＡｔｓは、本開示全体を通して互換的に使用され、ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２（国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号に記載）が例示的な実施形態である。ｃ－ｓｒＲＮＡは、温度感受性を提供するアルファウイルスレプリカーゼに小さなアミノ酸変化を組み込むことによる、自己増幅ｍＲＮＡ（ｓａＲＮＡ又はＳＡＭ）としても知られるｓｒＲＮＡに基づく。Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎのｃ－ｓｒＲＮＡは、約３０～３５℃の許容温度範囲で機能性であるが、約３７℃以上の非許容温度では機能性でない。このプラットフォームは、ゲノム組込みがなく、迅速な開発と展開、及び単純なＧＭＰ（優良製造プロセス）プロセスが可能であるというｍＲＮＡプラットフォームのすべての利益と同時に、ｍＲＮＡプラットフォームと比較したｓｒＲＮＡプラットフォーム（すなわち、本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームに先行したもの）のさらなる利点、特に、より長い発現［Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５］及びより低い投薬量でのより高い免疫原性［Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４］を有する。しかし、この単純な温度制御可能な特徴は、以下に簡潔に記載されるように、Ｔ細胞誘導ワクチンの多くの望ましい特徴をともに引き出すことを可能にする。
【0019】
簡潔に述べると、ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２は、異種タンパク質の一過性発現のために開発された温度感受性自己複製ＶＥＥＶに基づくＲＮＡレプリコンである。温度感受性は、ＶＥＥＶの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）内での５つのアミノ酸残基の挿入によって付与される。ｎｓＰ２タンパク質はヘリカーゼ／プロテイナーゼであり、これはｎｓＰ１、ｎｓＰ３及びｎｓＰ４と共にＶＥＥＶレプリカーゼを構成する。ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２は、ＶＥＥＶ構造タンパク質（カプシド、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３）を含有しない。Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号の実施例３、図１２、及び配列番号２９～４９は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0020】
全般的な技術及び定義
本開示の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは当技術分野の技術の範囲内である。
本開示の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは当技術分野の技術の範囲内である。
【0021】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。例えば、「１つの（ａｎ）」賦形剤は、１つ以上の賦形剤を含む。
【0022】
本明細書で使用される句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンドであり、このような実施形態が追加の要素を含み得ることを示す。対照的に、句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は閉じられており、このような実施形態が追加の要素（微量不純物を除く）を含まないことを示す。句「から本質的になる」は、部分的に閉じられており、このような実施形態が、このような実施形態の基本的特徴を実質的に変化させない要素をさらに含み得ることを示す。
【0023】
値に関して本明細書で使用される用語「約」は、その値の９０％～１１０％を包含する（例えば、キトサンオリゴ糖に関して使用される場合、約５，０００ダルトンの分子量は、４，５００ダルトン～５，５００ダルトンを指す）。
【0024】
用語「抗原」は、抗体又はＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識され結合される物質を指す。抗原には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合炭水化物、糖、ガングリオシド、脂質及びリン脂質、それらの部分及びそれらの組み合わせが含まれ得る。本開示の文脈において、用語「抗原」は、典型的には、１つ以上の翻訳後修飾を含み得る、少なくとも８アミノ酸残基長のポリペプチド又はタンパク質抗原を指す。
【0025】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、別段の指定がない限り、特定の長さに限定されない。ポリペプチドには、天然アミノ酸残基又は天然及び非天然アミノ酸残基の組み合わせが含まれ得る。この用語にはまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性（例えば、抗原性）を維持する限り、自然又は天然の配列に対して修飾を含み得る。
【0026】
本明細書で使用される用語「単離された」及び「精製された」は、天然に付随している少なくとも１つの成分から取り出された（例えば、その元の環境から取り出された）材料を指す。用語「単離された」は、組換えタンパク質に関して使用される場合、タンパク質を産生した宿主細胞の培養培地から取り出されたタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、単離されたタンパク質（例えば、ＷＴ１タンパク質）は、ＨＰＬＣによって決定されるとき、少なくとも７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度である。
【0027】
物質の「有効量」又は「十分な量」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量であり、このようなものとして、「有効量」は、それが適用される文脈に応じて異なる。抗原をコードするｍＲＮＡを含む本開示の組成物を投与する文脈において、有効量は、免疫応答（好ましくは抗原に対する細胞性免疫応答）を刺激するのに十分なｍＲＮＡを含有する。
【0028】
本開示において、用語「個体」及び「被験体」は、哺乳動物を指す。「哺乳動物」には、限定されるわけではないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、家畜、競技用動物、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）及びペット（例えば、イヌ及びネコ）が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【0029】
抗原をコードするｍＲＮＡを含む組成物に関して本明細書で使用される用語「用量」は、任意の時点で被験体によって摂取される（被験体に投与されるか、又は被験体に受け入れられる）量の測定された部分を指す。本開示の組成物を、それを必要とする被験体に投与することは、被験体において抗原に対する免疫応答を刺激するために、有効量の、抗原をコードするｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む。
【0030】
応答又はパラメータの「刺激」には、目的のパラメータを除いて他の点では同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合に、その応答又はパラメータを誘発及び／又は増強することが含まれる（例えば、抗原を含まないか又はコードしない対照組成物の投与と比較した場合の、抗原を含むか又はコードする組成物の投与後の抗原特異的サイトカイン分泌の増加）。例えば、免疫応答（例えば、Ｔｈ１応答）の「刺激」は、応答の増加を意味する。測定されるパラメータに応じて、増加は、２倍～２００倍以上、５倍～５００倍以上、１０倍～１０００倍以上、又は２、５、１０、５０、もしくは１００倍～２００、５００、１，０００、５，０００、もしくは１０，０００倍であり得る。
【0031】
逆に、応答又はパラメータの「阻害」には、目的のパラメータを除いて他の点では同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合に、その応答又はパラメータを低減及び／又は抑制することが含まれる。例えば、免疫応答（例えば、Ｔｈ２応答）の「阻害」は、応答の減少を意味する。測定されるパラメータに応じて、減少は、２倍～２００倍、５倍～５００倍以上、１０倍～１０００倍以上、又は２、５、１０、５０、もしくは１００倍～２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、もしくは１０，０００倍であり得る。
【0032】
相対的な用語「より高い」及び「より低い」は、目的のパラメータを除いて他の点では同じ条件と比較した場合、あるいは別の条件と比較した場合の、応答又はパラメータにおけるそれぞれ測定可能な増加又は減少を指す。例えば、「より高い抗体力価」は、対照条件（例えば、ｍＲＮＡを含まないか、又は抗原をコードしない対照ｍＲＮＡを含む比較組成物の投与）の結果としての抗原反応性抗体力価よりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍高い、抗原をコードするｍＲＮＡを含む本開示の組成物の投与の結果としての抗原反応性抗体力価を指す。同様に、「より低い抗体力価」は、抗原をコードするｍＲＮＡを含む本開示の組成物の投与の結果としての抗原反応性抗体力価よりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍低い、対照条件（例えば、ｍＲＮＡを含まないか、又は抗原をコードしない対照ｍＲＮＡを含む比較組成物の投与）の結果としての抗原反応性抗体力価を指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「免疫化」は、抗原に対する哺乳動物被験体の反応を増加させ、したがって、感染に抵抗するか、もしくはそれを克服する、及び／又は疾患に抵抗するその能力を改善するプロセスを指す。
【0034】
本明細書で使用される用語「ワクチン接種」は、哺乳動物被験体の体内へのワクチンの導入を指す。
【0035】
本明細書で使用される場合、「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「パーセント同一性」及び「配列同一性」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して用いた場合、配列を整列させ、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列（例えば対象抗原）中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。
【0036】
アミノ酸置換には、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の別のアミノ酸での置換が含まれ得る。アミノ酸置換を目的の抗原に導入してもよく、産物を、所望の活性、例えば、増大した安定性及び／又は免疫原性についてスクリーニングしてもよい。
【0037】
アミノ酸は概して、以下の共通の側鎖特性にしたがって分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0038】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを同じクラスの別のメンバーと交換することを含む。非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含む。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、活性成分（例えば、抗原をコードするｍＲＮＡ）を含む組成物中に存在する化合物を指す。医薬的に許容され得る賦形剤は、不活性な医薬化合物であり、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、等張化剤、及び保存剤を含み得る（Ｐｒａｍａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ，４５：６５－７７，２０１３）。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤、及び等張化剤のうちの１つ以上として機能する賦形剤を含む（例えば、食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクル及び等張化剤の両方として役立ち得る）。
【0040】
細胞性免疫のための皮内送達の最適化
皮内ワクチン接種は、長期持続細胞性免疫及び免疫原の増大をもたらす［Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００９］。ヒト皮膚（表皮及び真皮）には、ランゲルハンス細胞及び真皮樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）が豊富である。皮内ワクチン接種は、ＡＰＣを標的とするので、皮下又は筋内ワクチン接種よりも５～１０倍有効であることが知られており［Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００９］、このような標的化はまた、長期持続性免疫のためにＴ細胞免疫経路を活性化する。皮内注射によって、ｃ－ｓｒＲＮＡは主に皮膚ＡＰＣによって取り込まれ、そこで複製し、抗原を産生し、抗原をペプチドに消化し、これらのペプチドをＴ細胞に提示する（図１）。この経路を介して提示されるペプチドは、ＭＨＣ－Ｉ拘束性ＣＤ８＋キラーＴ細胞を刺激する。別の経路では、ＡＰＣはまた、近くの皮膚細胞によって産生される抗原を取り込む。この経路を介して提示されるペプチドは、ＭＨＣ－ＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を刺激する。
皮内ワクチン接種は、長期持続細胞性免疫及び免疫原の増大をもたらす［Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００９］。ヒト皮膚（表皮及び真皮）には、ランゲルハンス細胞及び真皮樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）が豊富である。皮内ワクチン接種は、ＡＰＣを標的とするので、皮下又は筋内ワクチン接種よりも５～１０倍有効であることが知られており［Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００９］、このような標的化はまた、長期持続性免疫のためにＴ細胞免疫経路を活性化する。皮内注射によって、ｃ－ｓｒＲＮＡは主に皮膚ＡＰＣによって取り込まれ、そこで複製し、抗原を産生し、抗原をペプチドに消化し、これらのペプチドをＴ細胞に提示する（図１）。この経路を介して提示されるペプチドは、ＭＨＣ－Ｉ拘束性ＣＤ８＋キラーＴ細胞を刺激する。別の経路では、ＡＰＣはまた、近くの皮膚細胞によって産生される抗原を取り込む。この経路を介して提示されるペプチドは、ＭＨＣ－ＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を刺激する。
【0041】
皮内注射の問題及び本発明者らの解決策
ここで、本発明者らが特定した潜在的な問題及び本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームが提供する解決策がある。
ここで、本発明者らが特定した潜在的な問題及び本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームが提供する解決策がある。
【0042】
（１）皮内ワクチンプラットフォームにおけるようなｓｒＲＮＡの適用について認識されていない重大なハードルは、ｍＲＮＡ及びｓｒＲＮＡの両方が皮膚温度で抗原を十分に発現しないことである［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］。分かりにくいことに、ヒトの皮膚の温度（約３０～３５℃）は、ヒトの深部体温（約３７℃）よりも低い。これは、３７℃で開発されたベクター及びプラットフォームが皮内注射に最適ではないことを意味する。本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームの１つの新基軸は、それが皮膚温度で抗原を強く発現することである［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］。さらに、この温度制御はまた、ｃ－ｓｒＲＮＡの意図されない全身分布によって引き起こされる安全性リスクを最小化する。なぜなら、ｃ－ｓｒＲＮＡは、その温度がその許容閾値を超えて上昇すると（ｃ－ｓｒＲＮＡが身体深部に近づくと）不活性化されるからである。言い換えれば、ｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームは、ｍＲＮＡ及びｓｒＲＮＡと比較して皮内注射に最良の抗原を発現し、それはさらに、ベクターが被験体の身体の他の領域に広がり、産生されるようになる能力が制限されるか、又は不活性化されるという安全性の特徴を有する。
【0043】
（２）皮内ワクチン接種の別の課題は、適した添加剤の欠如である。アジュバント（例えば、アルミニウム塩及び水中油）は、皮内経路によって送達される場合、局所的に反応原性が高すぎるため、アジュバントは、臨床的に承認された皮内ワクチンに組み込まれておらず、その結果、免疫原性がより低くなる［Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００９］。筋内投与されるｍＲＮＡ及びｓｒＲＮＡワクチンに使用される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も水中油型であり、これは皮膚反応原性を引き起こし、ＰＥＧなどのＬＮＰ成分に対するアレルギー反応のリスクを増加させ得る。本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームは、裸のｃ－ｓｒＲＮＡ（ＬＮＰなし、アジュバントなし）として注射されるため、この問題に対する解決策となる。第１に、細胞、特にＡＰＣ内でのＲＮＡの自己複製は、強力な自然免疫を誘導し、これがアジュバントの主要な機能の代替となる。第２に、文献及び本発明者ら自身のデータは、特に皮内注射について、裸のｍＲＮＡ／ｓｒＲＮＡが、ｍＲＮＡ／ｓｒＲＮＡのエレクトロポレーション［Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２］及びＬＮＰと組み合わせたｍＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ［Ｇｏｌｏｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８］と比較して、同等に効率的に抗原を産生することを実証する。
【0044】
（３）第３の課題は、皮内ワクチンの先例の数が限られていることである。日常的に皮内投与されてきたのはＢＣＧワクチンのみである。皮内注射を採用するためのハードルを下げる１つの方法は、容易で一貫した皮内注射を可能にするために現在利用可能である、ＭｉｃｒｏｎＪｅｔ６００（ＮａｎｏＰａｓｓ）及びＩｍｍｕｃｉｓｅ（Ｔｅｒｕｍｏ）などの特化デバイスを使用することによるものである。これらのデバイスはまた、大規模生産及び展開のための良好な候補でもある。しかし、これらの特殊なデバイスは比較的高価であるため、標準的な針及びシリンジを使用するＭａｎｔｏｕｘ技術による皮内注射も選択肢である。
【0045】
適した抗原の設計
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞において発現されるが、胚細胞においても発現され、又は正常細胞において低レベルで発現される。米国がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、がん療法の標的に適した７５個のがん抗原を選択した（Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。例えば、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）は、米国がん研究所によって特定された７５個のがん抗原の中で最も有望なものとしてランク付けされた（Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＷＴ１は、広範な腫瘍において発現されるが、胚組織において発現され、及び成体における非常に限定された細胞型においてのみ発現される。例えば、ＷＴ１は、大部分の白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ）、膵臓がん、肺がん、及び神経膠芽腫において発現される。ＷＴ１ペプチドは、多くの前臨床及び臨床試験においてがんワクチンに対する抗原として使用されている。ＷＴ１の使用を実施例１に示す。このリストはまた、ＮＹ－ＥＳＯ－１（実施例２）及びＭＡＧＥＡ３（実施例３）を含む。本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームに基づくがんワクチンに対する抗原として、任意のＴＡＡを使用してもよい。融合タンパク質又は別々に発現されるタンパク質として、これらのＴＡＡの任意の組み合わせを使用することも可能である（実施例４）。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞において発現されるが、胚細胞においても発現され、又は正常細胞において低レベルで発現される。米国がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、がん療法の標的に適した７５個のがん抗原を選択した（Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。例えば、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）は、米国がん研究所によって特定された７５個のがん抗原の中で最も有望なものとしてランク付けされた（Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＷＴ１は、広範な腫瘍において発現されるが、胚組織において発現され、及び成体における非常に限定された細胞型においてのみ発現される。例えば、ＷＴ１は、大部分の白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ）、膵臓がん、肺がん、及び神経膠芽腫において発現される。ＷＴ１ペプチドは、多くの前臨床及び臨床試験においてがんワクチンに対する抗原として使用されている。ＷＴ１の使用を実施例１に示す。このリストはまた、ＮＹ－ＥＳＯ－１（実施例２）及びＭＡＧＥＡ３（実施例３）を含む。本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームに基づくがんワクチンに対する抗原として、任意のＴＡＡを使用してもよい。融合タンパク質又は別々に発現されるタンパク質として、これらのＴＡＡの任意の組み合わせを使用することも可能である（実施例４）。
【0046】
近年、患者由来の腫瘍細胞のゲノム配列決定を行うことが一般的になってきている。このような試みは、多くの場合、それらのゲノムにおける変異による、腫瘍に特異的なタンパク質産物又はペプチドを特定する。ネオ抗原とも呼ばれるこれらの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、がんワクチンの理想的な標的である。本発明者らのｃ－ｓｒＲＮＡプラットフォームに基づくがんワクチンに対する抗原として、単一のＴＳＡ又は複数のＴＳＡの融合体を使用してもよい（実施例５）。
【0047】
Ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現のキトサン増強
ＲＮアーゼ阻害剤（ヒト胎盤から精製されたタンパク質）は、ｃ－ｓｒＲＮＡ上にコードされる抗原に対する免疫原性をわずかに増強し、これはおそらく、マウスに皮内注射された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでｃ－ｓｒＲＮＡからの抗原の発現を増強することによる（例えば、国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号の図２５Ｃを参照のこと）。ＲＮアーゼ阻害剤は、ｃ－ｓｒＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮアーゼ媒介性分解から保護し得る。しかし、注射可能な製品において賦形剤としてタンパク質に基づくＲＮアーゼ阻害剤を使用することは困難であるため、療法目的のためにｉｎ ｖｉｖｏで目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現を増強することができる代替的な薬剤を見出すことが望ましい。
ＲＮアーゼ阻害剤（ヒト胎盤から精製されたタンパク質）は、ｃ－ｓｒＲＮＡ上にコードされる抗原に対する免疫原性をわずかに増強し、これはおそらく、マウスに皮内注射された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでｃ－ｓｒＲＮＡからの抗原の発現を増強することによる（例えば、国際公開第２０２１／１３８４４７（Ａ１）号の図２５Ｃを参照のこと）。ＲＮアーゼ阻害剤は、ｃ－ｓｒＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮアーゼ媒介性分解から保護し得る。しかし、注射可能な製品において賦形剤としてタンパク質に基づくＲＮアーゼ阻害剤を使用することは困難であるため、療法目的のためにｉｎ ｖｉｖｏで目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現を増強することができる代替的な薬剤を見出すことが望ましい。
【0048】
低分子量キトサン（分子量約６ｋＤａ）は、３０～２２０ｎＭの範囲の阻害定数でＲＮアーゼの活性を阻害することが示された（Ｙａｋｏｖｌｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｃｏｍｍｕｎ，３５７（３）：Ｊ．５８４－８，２００７）。２つの異なるキトサンオリゴマー、すなわちキトサンオリゴマー（ＣＡＳ番号９０１２－７６－４、分子量≦５ｋＤａ、≧７５％脱アセチル化：Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ＧｍｂＨ：製品番号４４００９）、及びキトサンオリゴ糖ラクテート（ＣＡＳ番号１４８４１１－５７－８、分子量約５ｋＤａ、＞９０％脱アセチル化：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：製品番号５２３６８２）が最近試験された。驚くべきことに、０．００１μｇ／ｍＬ（約０．２ｎＭ：Ｙａｋｏｖｌｅｖ ｅｔ ａｌ．、上記、２００７によって発見された阻害定数の約１／１００）という非常に低いレベルのキトサンオリゴマーであっても、ｃ－ｓｒＲＮＡ上にコードされるルシフェラーゼの発現を約１０倍増強可能であることが見出された（データ未提示）。ＧＯＩ発現の同様の増強は、最大で０．５μｇ／ｍＬにわたってのキトサンオリゴマーによって、及び０．１μｇ／ｍＬのキトサンオリゴ糖ラクテートによって達成された。
【0049】
キトサンは、複合体又はナノ粒子を形成することができるため、ヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ）送達ベクターとして使用されている（Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，６５（９）：１２３４－７０，２０１３、及びＣａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ，１７：３８１，２０１９に概説されている）。しかし、キトサンオリゴマーによるＧＯＩ発現の増強が、ナノ粒子又はｃ－ｓｒＲＮＡとキトサンオリゴマーとの複合体形成によって媒介されそうにないことは注目に値する。第１に、このような低濃度のキトサンオリゴマーは、ＲＮＡとの複合体形成を可能にしない。第２に、皮内注射の直前にキトサンオリゴマーをｃ－ｓｒＲＮＡに添加することにより、複合体を形成するために十分な時間がない。
【0050】
キトサンオリゴマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮアーゼ阻害剤としての有効濃度と比較してはるかに低い濃度でｉｎ ｖｉｖｏでのＧＯＩの発現を増強するため（Ｙａｋｏｖｌｅｖ ｅｔ ａｌ．、前出、２００７）、キトサンオリゴマーによるこの増強されたＧＯＩ発現は、そのＲＮアーゼ阻害機構によって媒介されない可能性があると考えられる。例えば、キトサンオリゴマーは、細胞へのｃ－ｓｒＲＮＡの取り込みを促進可能であり、それによって、ｃ－ｓｒＲＮＡからのＧＯＩの発現を増強可能である。それにもかかわらず、この驚くべき発見は、ｃ－ｓｒＲＮＡ上にコードされるＧＯＩのｉｎ ｖｉｖｏ療法発現を増強するための有効な手段を提供するものとなる。
列挙された実施形態
１．哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物であって、賦形剤、及び融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠くアルファウイルスレプリコンと、を含む温度感受性自己複製ＲＮＡを含み、このＯＲＦが、５’から３’に、
（ｉ）哺乳動物シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）がん抗原をコードするヌクレオチド配列と、
を含み、
温度感受性自己複製ＲＮＡが、許容温度で融合タンパク質を発現することができるが、非許容温度では発現することができない、
組成物。
２．がん抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む、実施形態１に記載の組成物。
３．ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）抗原、ＰＲＡＭＥ抗原、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態２に記載の組成物。
４．ＴＡＡがＷＴ１抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
５．ＷＴ１抗原のアミノ酸配列が、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の組成物。
６．ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５抗原、及びＰＲＡＭＥ抗原を含む、ＴＡＡ融合タンパク質である、実施形態２に記載の組成物。
７．ＴＡＡ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７、又は配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の組成物。
８．ＴＡＡがＢＩＲＣ５抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
９．ＢＩＲＣ５抗原のアミノ酸配列が、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の組成物。
１０．ＴＡＡがＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１１．ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のアミノ酸配列が、配列番号４、又は配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の組成物。
１２．ＴＡＡがＭＡＧＥＡ３抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１３．ＭＡＧＥＡ３抗原のアミノ酸配列が、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の組成物。
１４．ＴＡＡがＰＲＡＭＥ抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１５．ＰＲＡＭＥ抗原のアミノ酸配列が、配列番号６、又は配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の組成物。
１６．がん抗原がネオ抗原を含む、実施形態１に記載の組成物。
１７．哺乳動物シグナルペプチドが、哺乳動物抗原提示細胞において発現される表面タンパク質のシグナルペプチドである、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の組成物。
１８．哺乳動物シグナルペプチドがＣＤ５シグナルペプチドであり、ＣＤ５シグナルペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の組成物。
１９．アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０．アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスである、実施形態１９に記載の組成物。
２１．アルファウイルスレプリコンが、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）のβシート５とβシート６との間に４～６個の追加のアミノ酸を含む、ｎｓＰ２の発現を生じる１２～１８ヌクレオチドの挿入を有する非構造タンパク質コード領域を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の組成物。
２２．追加のアミノ酸が配列番号１４（ＴＧＡＡＡ）の配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
２３．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１２を含む、実施形態２２に記載の組成物。
２４．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択される１つの配列を含む、実施形態２３に記載の組成物。
２５．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１１を含む、実施形態２４に記載の組成物。
２６．許容温度が３０℃～３６℃、又は３１℃～３５℃、又は３２℃～３４℃、又は３３℃±０．５℃であり、非許容温度が３７℃±０．５℃であり、任意選択で許容温度が３１℃～３５℃であり、非許容温度が少なくとも３７℃±０．５℃である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．組成物が脂質ナノ粒子を含まない、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８．組成物がキトサンをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の組成物。
２９．哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の組成物を哺乳動物被験体に投与して、この哺乳動物被験体においてこのがん抗原に対する免疫応答を刺激するステップを含む、方法。
３０．組成物が皮内投与される、実施形態２９に記載の方法。
３１．免疫応答が、がん抗原を発現する哺乳動物細胞と反応性の細胞性免疫応答を含む、実施形態２９又は実施形態３０に記載の方法。
３２．細胞性免疫応答が、がん抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答及びがん抗原特異的ヘルパーＴリンパ球応答の一方又は両方を含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．免疫応答が、がん抗原と反応性の体液性免疫応答をさらに含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．哺乳動物被験体がヒト被験体である、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．（ｉ）実施形態１～２８のいずれか１つに記載の組成物と、
（ｉｉ）哺乳動物被験体へのこの組成物の皮内送達のためのデバイスと、
を含む、キット。
３６．デバイスがシリンジ及び針を含む、実施形態３５に記載のキット。
列挙された実施形態
１．哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物であって、賦形剤、及び融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠くアルファウイルスレプリコンと、を含む温度感受性自己複製ＲＮＡを含み、このＯＲＦが、５’から３’に、
（ｉ）哺乳動物シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）がん抗原をコードするヌクレオチド配列と、
を含み、
温度感受性自己複製ＲＮＡが、許容温度で融合タンパク質を発現することができるが、非許容温度では発現することができない、
組成物。
２．がん抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む、実施形態１に記載の組成物。
３．ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）抗原、ＰＲＡＭＥ抗原、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態２に記載の組成物。
４．ＴＡＡがＷＴ１抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
５．ＷＴ１抗原のアミノ酸配列が、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の組成物。
６．ＴＡＡが、ＷＴ１抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥＡ３抗原、ＢＩＲＣ５抗原、及びＰＲＡＭＥ抗原を含む、ＴＡＡ融合タンパク質である、実施形態２に記載の組成物。
７．ＴＡＡ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７、又は配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の組成物。
８．ＴＡＡがＢＩＲＣ５抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
９．ＢＩＲＣ５抗原のアミノ酸配列が、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の組成物。
１０．ＴＡＡがＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１１．ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のアミノ酸配列が、配列番号４、又は配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の組成物。
１２．ＴＡＡがＭＡＧＥＡ３抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１３．ＭＡＧＥＡ３抗原のアミノ酸配列が、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の組成物。
１４．ＴＡＡがＰＲＡＭＥ抗原を含む、実施形態２に記載の組成物。
１５．ＰＲＡＭＥ抗原のアミノ酸配列が、配列番号６、又は配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の組成物。
１６．がん抗原がネオ抗原を含む、実施形態１に記載の組成物。
１７．哺乳動物シグナルペプチドが、哺乳動物抗原提示細胞において発現される表面タンパク質のシグナルペプチドである、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の組成物。
１８．哺乳動物シグナルペプチドがＣＤ５シグナルペプチドであり、ＣＤ５シグナルペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の組成物。
１９．アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０．アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスである、実施形態１９に記載の組成物。
２１．アルファウイルスレプリコンが、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）のβシート５とβシート６との間に４～６個の追加のアミノ酸を含む、ｎｓＰ２の発現を生じる１２～１８ヌクレオチドの挿入を有する非構造タンパク質コード領域を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の組成物。
２２．追加のアミノ酸が配列番号１４（ＴＧＡＡＡ）の配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
２３．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１２を含む、実施形態２２に記載の組成物。
２４．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択される１つの配列を含む、実施形態２３に記載の組成物。
２５．ｎｓＰ２のアミノ酸配列が配列番号１１を含む、実施形態２４に記載の組成物。
２６．許容温度が３０℃～３６℃、又は３１℃～３５℃、又は３２℃～３４℃、又は３３℃±０．５℃であり、非許容温度が３７℃±０．５℃であり、任意選択で許容温度が３１℃～３５℃であり、非許容温度が少なくとも３７℃±０．５℃である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．組成物が脂質ナノ粒子を含まない、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８．組成物がキトサンをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の組成物。
２９．哺乳動物被験体においてがん抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の組成物を哺乳動物被験体に投与して、この哺乳動物被験体においてこのがん抗原に対する免疫応答を刺激するステップを含む、方法。
３０．組成物が皮内投与される、実施形態２９に記載の方法。
３１．免疫応答が、がん抗原を発現する哺乳動物細胞と反応性の細胞性免疫応答を含む、実施形態２９又は実施形態３０に記載の方法。
３２．細胞性免疫応答が、がん抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答及びがん抗原特異的ヘルパーＴリンパ球応答の一方又は両方を含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．免疫応答が、がん抗原と反応性の体液性免疫応答をさらに含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．哺乳動物被験体がヒト被験体である、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．（ｉ）実施形態１～２８のいずれか１つに記載の組成物と、
（ｉｉ）哺乳動物被験体へのこの組成物の皮内送達のためのデバイスと、
を含む、キット。
３６．デバイスがシリンジ及び針を含む、実施形態３５に記載のキット。
【実施例】
【0051】
略語：ＡＰＣ（抗原提示細胞）；ＢＩＲＣ５（５又はＳＵＲＶＩＶＩＮを含むバキュロウイルスＩＡＰリピート）；ＩＬ－４（インターロイキン－４）；ＩＦＮ－γ（インターフェロンガンマ）；ＭＡＧＥＡ３（黒色腫関連抗原３）；ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）；ＰＢＯ（プラセボ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１（ニューヨーク食道扁平上皮がん１又はＣＴＡＧ１Ｂ）；ＰＲＡＭＥ（黒色腫において優先的に発現される抗原）；ＳＦＣ（スポット形成細胞）；ｓｒＲＮＡｔｓ（温度感受性自己複製ＲＮＡ又はｃ－ｓｒＲＮＡ温度制御可能自己複製ＲＮＡ）；ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）；ＴＳＡ（腫瘍特異的抗原）；及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）。
【0052】
実施例１．ＷＴ１を発現する腫瘍に対する免疫療法
本実施例は、ヒトウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）タンパク質が、皮内注射された温度制御可能な自己複製ＲＮＡから発現された場合に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて強力な細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。驚くべきことに、ＥＸＧ－５１０１ ＲＮＡ構築物は、同系マウスがんモデルにおいてヒトＷＴ１を発現するマウス乳腺腫瘍細胞の排除を誘導する。
本実施例は、ヒトウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）タンパク質が、皮内注射された温度制御可能な自己複製ＲＮＡから発現された場合に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて強力な細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。驚くべきことに、ＥＸＧ－５１０１ ＲＮＡ構築物は、同系マウスがんモデルにおいてヒトＷＴ１を発現するマウス乳腺腫瘍細胞の排除を誘導する。
【0053】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
【0054】
ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡは、ヒトＷＴ１タンパク質に融合されたヒトＣＤ５シグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡベクター（ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６７５０６号］）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生された（図２）。ＥＸＧ－５１０１のＷＴ１タンパク質は、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）翻訳開始コドンから始まるアイソフォームＤによってコードされる。
【0055】
４Ｔ１乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２５３９）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来し、ヒト乳がん（ステージＩＶ）を再現することが知られている。
【0056】
図４は、実験手順を例示する。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるヒトウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）タンパク質アイソフォームＤ（ＮＭ＿０２４４２６．６）をコードするプラスミドＤＮＡと、選択可能マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子とで、４Ｔ１腫瘍細胞をトランスフェクションした。ヒトＷＴ１を発現する４Ｔ１細胞の安定な形質転換体を、Ｇ４１８選択によって単離した。細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射した（腫瘍接種後０日目）。７日目に、プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡのいずれかを皮内投与した（ワクチン接種後０日目）。腫瘍サイズを、５日目、８日目（ワクチン接種後０日目）、２５日目（ワクチン接種後１８日目）、及び３２日目（ワクチン接種後２５日目）に測定した。
【0057】
結果及び結論
図５は、プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡワクチンを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍の増殖を示す。５匹のマウス（ｎ＝５）の平均及び標準偏差（エラーバー）を各群について示す。腫瘍接種後７日目までに、３群すべてのマウスで腫瘍が発生した。しかし、２５日目（ワクチン接種後１８日目）までに、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡを注射したマウスにおいて腫瘍増殖が用量依存的に抑制された一方、プラセボを注射したマウスにおいて腫瘍は増殖し続けた。
図５は、プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡワクチンを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍の増殖を示す。５匹のマウス（ｎ＝５）の平均及び標準偏差（エラーバー）を各群について示す。腫瘍接種後７日目までに、３群すべてのマウスで腫瘍が発生した。しかし、２５日目（ワクチン接種後１８日目）までに、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡを注射したマウスにおいて腫瘍増殖が用量依存的に抑制された一方、プラセボを注射したマウスにおいて腫瘍は増殖し続けた。
【0058】
図６Ａ、６Ｂは、ＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡの皮内注射による腫瘍関連抗原反応性細胞性免疫応答の誘導を示す。図６Ａに示すように、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５μｇのＥＸＧ－５１０１又はプラセボ（ＰＢＯ）のいずれかを０日目に皮内注射した。１４日目にこれらのマウスから脾細胞を収集し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。図６Ｂは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ又はＩＬ－４スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度としてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。ＩＦＮ－γ分泌細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｈ１細胞に相当し、細胞媒介性（細胞性）免疫応答があるとみられ、一方、ＩＬ－４分泌細胞は、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞に相当する。したがって、この結果は、ＥＸＧ－５１０１がヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導したことを示す。
【0059】
結論として、皮内注射されたＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、乳がんの同系マウスモデルにおいて用量依存的にＷＴ１発現腫瘍の腫瘍増殖を抑制するか、又は腫瘍サイズを減少させる。さらに、皮内注射されたＥＸＧ－５１０１ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、マウスモデルにおいてヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導する。
【0060】
実施例２．ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する腫瘍に対する免疫療法
本実施例は、皮内注射されたヒトＮＹ－ＥＳＯ－１をコードするｃ－ｓｒＲＮＡが、同系マウスがんモデルにおいてヒトＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するマウス乳腺腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を誘導することができるかどうかの評価を記載する。
本実施例は、皮内注射されたヒトＮＹ－ＥＳＯ－１をコードするｃ－ｓｒＲＮＡが、同系マウスがんモデルにおいてヒトＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するマウス乳腺腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を誘導することができるかどうかの評価を記載する。
【0061】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
【0062】
ｃ－ｓｒＲＮＡ－ＮＹ－ＥＯＳ１ ｍＲＮＡは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質に融合されたヒトＣＤ５シグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡベクター（ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。ＮＹ－ＥＳＯ－１は、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）（ＮＭ＿００１３２７）としても知られている。
【0063】
４Ｔ１乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２５３９）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来し、ヒト乳がん（ステージＩＶ）を再現することが知られている。
【0064】
ＣＭＶプロモーターによって駆動される、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）（ＮＭ＿００１３２７）としても知られるヒトＮＹ－ＥＳＯ－１をコードするプラスミドＤＮＡと、選択可能マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子とで、４Ｔ１腫瘍細胞をトランスフェクションする。ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を発現する４Ｔ１細胞の安定な形質転換体を、Ｇ４１８選択によって単離する。細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射する（腫瘍接種後０日目）。７日目に、プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのｃ－ｓｒＲＮＡ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｍＲＮＡのいずれかを皮内投与する（ワクチン接種後０日目）。腫瘍サイズを、ワクチン接種後のいくつかの時点で測定する。
【0065】
結果および結論
皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、乳がんの同系マウスモデルにおいて用量依存的にＮＹ－ＥＳＯ－１発現腫瘍の腫瘍増殖を抑制するか又は腫瘍サイズを減少させると考えられる。
皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、乳がんの同系マウスモデルにおいて用量依存的にＮＹ－ＥＳＯ－１発現腫瘍の腫瘍増殖を抑制するか又は腫瘍サイズを減少させると考えられる。
【0066】
実施例３．ＭＡＧＥＡ３を発現する腫瘍に対する免疫療法
本実施例は、皮内注射されたヒトＭＡＧＥファミリーメンバーＡ３（ＭＡＧＥＡ３）をコードするｃ－ｓｒＲＮＡが、同系マウスがんモデルにおいてヒトＭＡＧＥＡ３を発現するマウス乳腺腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を誘導可能であるかどうかの評価を記載する。
本実施例は、皮内注射されたヒトＭＡＧＥファミリーメンバーＡ３（ＭＡＧＥＡ３）をコードするｃ－ｓｒＲＮＡが、同系マウスがんモデルにおいてヒトＭＡＧＥＡ３を発現するマウス乳腺腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を誘導可能であるかどうかの評価を記載する。
【0067】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
【0068】
ｃ－ｓｒＲＮＡ ｍＲＮＡ－ＭＡＧＥＡ３は、ヒトＭＡＧＥファミリーメンバーＡ３（ＭＡＧＥＡ３）タンパク質（ＮＭ＿００５３６２）に融合されたヒトＣＤ５シグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする温度制御可能な自己複製ＲＮＡベクター（ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。
【0069】
４Ｔ１乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２５３９）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来し、ヒト乳がん（ステージＩＶ）を再現することが知られている。
【0070】
ＣＭＶプロモーターによって駆動されるヒトＭＡＧＥＡ３（ＮＭ＿００５３６２）をコードするプラスミドＤＮＡと、選択可能マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子とで、４Ｔ１腫瘍細胞をトランスフェクションする。ヒトＭＡＧＥＡ３を発現する４Ｔ１細胞の安定な形質転換体を、Ｇ４１８選択によって単離する。細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射する（腫瘍接種後０日目）。７日目に、プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのｃ－ｓｒＲＮＡ－ＭＡＧＥＡ３ ｍＲＮＡのいずれかを皮内投与する（ワクチン接種後０日目）。腫瘍サイズを、ワクチン接種後のいくつかの時点で測定する。
【0071】
結果及び結論
皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡ－ＭＡＧＥＡ３ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、乳がんの同系マウスモデルにおいて用量依存的にＭＡＧＥＡ３発現腫瘍の腫瘍増殖を抑制するか、又は腫瘍サイズを減少させると考えられる。
皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡ－ＭＡＧＥＡ３ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、乳がんの同系マウスモデルにおいて用量依存的にＭＡＧＥＡ３発現腫瘍の腫瘍増殖を抑制するか、又は腫瘍サイズを減少させると考えられる。
【0072】
実施例４．２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍に対する免疫療法
本実施例は、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを含む、融合タンパク質をコードする皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、融合タンパク質のＴＡＡに対する強力な細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
本実施例は、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを含む、融合タンパク質をコードする皮内注射されたｃ－ｓｒＲＮＡが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、融合タンパク質のＴＡＡに対する強力な細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
【0073】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
【0074】
図７は、ヒトＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３及びＰＲＡＭＥの、ヒトＣＤ５遺伝子由来のシグナルペプチド配列を有する融合タンパク質をコードするｃ－ｓｒＲＮＡ ｍＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］）である、ＥＸＧ－５１０５ワクチンの模式図を示す。
【0075】
４Ｔ１乳腺腫瘍細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－２５３９）に由来し、ヒト乳がん（ステージＩＶ）を再現することが知られている。
【0076】
ＣＭＶプロモーターによって駆動される、それぞれ、ヒトＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３及びＰＲＡＭＥをコードする３つのプラスミドＤＮＡと、Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する選択可能マーカーとで、４Ｔ１腫瘍細胞株をトランスフェクションした。ヒトＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを発現する４Ｔ１細胞の安定な形質転換体を、Ｇ４１８選択後に単離した。細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射した。プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡワクチンのいずれかを皮内投与した。続いて、腫瘍サイズを測定した。
【0077】
結果及び結論
図８Ａは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡワクチンの免疫原性を調べるための実験手順を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に２５μｇのＥＸＧ－５１０５又はプラセボ（ＰＢＯ）のいずれかを皮内注射した。１４日目にこれらのマウスから脾細胞を収集し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。ＥＸＧ－５１０５は、ヒトＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを含む、融合タンパク質をコードする。このようなものとして、ＥＸＧ－５１０５の皮内注射は、これらのＴＡＡの５つすべてに対する細胞性免疫を同時に誘導すると予想される。実際、図８Ｂ～８Ｆに示される結果は、これが事実であったことを示す。図８Ｂは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ又はＩＬ－４スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度としてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。ＩＦＮ－γ分泌細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｈ１細胞に相当し、細胞媒介性（細胞性）免疫応答を示し、一方、ＩＬ－４分泌細胞は、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞に相当する。したがって、この結果は、ＥＸＧ－５１０５がヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導したことを示す。同様に、図８Ｃは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体）によって刺激された１×１０６個の脾細胞当たりのＩＦＮ－γ又はＩＬ－４スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度としてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。結果は、ＥＸＧ－５１０５が、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質ならびにヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導したことを示す。同様に、図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆは、それぞれ、ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）タンパク質、及びヒトＰＲＡＭＥタンパク質をカバーするペプチドのプールによって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。興味深いことに、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、及びＢＩＲＣ５（これらはすべて、腫瘍ならびにいくつかの他の組織において発現される）に対してよりも、いずれもむしろもっぱら腫瘍及び精巣において発現されるＭＡＧＥＡ３及びＰＲＡＭＥに対して、より強力な細胞性免疫応答が誘発された。
図８Ａは、ＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡワクチンの免疫原性を調べるための実験手順を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に２５μｇのＥＸＧ－５１０５又はプラセボ（ＰＢＯ）のいずれかを皮内注射した。１４日目にこれらのマウスから脾細胞を収集し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。ＥＸＧ－５１０５は、ヒトＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを含む、融合タンパク質をコードする。このようなものとして、ＥＸＧ－５１０５の皮内注射は、これらのＴＡＡの５つすべてに対する細胞性免疫を同時に誘導すると予想される。実際、図８Ｂ～８Ｆに示される結果は、これが事実であったことを示す。図８Ｂは、ヒトＷＴ１タンパク質をカバーする１１０のペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体）によって刺激された１×１０６脾細胞当たりのＩＦＮ－γ又はＩＬ－４スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度としてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。ＩＦＮ－γ分泌細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｈ１細胞に相当し、細胞媒介性（細胞性）免疫応答を示し、一方、ＩＬ－４分泌細胞は、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞に相当する。したがって、この結果は、ＥＸＧ－５１０５がヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導したことを示す。同様に、図８Ｃは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質をカバーするペプチドのプール（１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体）によって刺激された１×１０６個の脾細胞当たりのＩＦＮ－γ又はＩＬ－４スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度としてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。結果は、ＥＸＧ－５１０５が、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質ならびにヒトＷＴ１タンパク質に対する細胞性免疫を誘導したことを示す。同様に、図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆは、それぞれ、ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質、ヒトＢＩＲＣ５（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）タンパク質、及びヒトＰＲＡＭＥタンパク質をカバーするペプチドのプールによって刺激された１×１０６脾細胞当たりのサイトカイン（左、インターフェロンガンマ［ＩＦＮ－γ］、右、インターロイキン－４［ＩＬ－４］）スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度を示す。興味深いことに、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、及びＢＩＲＣ５（これらはすべて、腫瘍ならびにいくつかの他の組織において発現される）に対してよりも、いずれもむしろもっぱら腫瘍及び精巣において発現されるＭＡＧＥＡ３及びＰＲＡＭＥに対して、より強力な細胞性免疫応答が誘発された。
【0078】
結論として、皮内注射されたＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡ免疫療法剤は、同系マウスがんモデルにおいて融合タンパク質の個別の成分に対する細胞性免疫を誘導する。さらに、皮内注射されたＥＸＧ－５１０５ ｍＲＮＡワクチンは、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＩＲＣ５、ＭＡＧＥＡ３、及びＰＲＡＭＥを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制することが予想される。
【0079】
実施例５．腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を発現する腫瘍に対する免疫療法
本実施例は、ネオ抗原をコードする皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓが、同系マウスがんモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウス中、ネオ抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
本実施例は、ネオ抗原をコードする皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓが、同系マウスがんモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウス中、ネオ抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
【0080】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
ＢＡＬＢ／ｃ近交系雌マウス。
【0081】
ｓｒＲＮＡｔｓ ｍＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ１ｔｓ２［国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／６７５０６号］）は、ヒトＣＤ５遺伝子に由来するシグナルペプチド配列を有するネオ抗原をコードする。
【0082】
４Ｔ１乳腺腫瘍細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－２５３９）に由来し、ヒト乳がん（ステージＩＶ）を再現することが知られている。
【0083】
ＣＭＶプロモーターによって駆動されるヒトネオ抗原をコードする３つのプラスミドＤＮＡと、Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する選択可能マーカーとで、４Ｔ１腫瘍細胞株をトランスフェクションした。ヒトネオ抗原を発現する４Ｔ１細胞の安定な形質転換体を、Ｇ４１８選択後に単離した。細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射した。プラセボ（ＰＢＯ）、５μｇ又は２５μｇのｓｒＲＮＡｔｓネオ抗原ｍＲＮＡワクチンのいずれかを皮内投与した。続いて、腫瘍サイズを測定した。
【0084】
結果及び結論
皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓネオ抗原ｍＲＮＡワクチンは、ヒトネオ抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を抑制し、同系マウスがんモデルにおいて用量依存的に腫瘍を排除する。
皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓネオ抗原ｍＲＮＡワクチンは、ヒトネオ抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を抑制し、同系マウスがんモデルにおいて用量依存的に腫瘍を排除する。
【0085】
実施例６．Ｔ細胞誘導性に関しての自己複製ＲＮＡの比較
本実施例は、抗原をコードする皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓ構築物が、マウスにおいてその抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
本実施例は、抗原をコードする皮内注射されたｓｒＲＮＡｔｓ構築物が、マウスにおいてその抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するという知見を記載する。
【0086】
材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス。
【0087】
３つの異なる温度制御可能な自己複製ＲＮＡベクター（ｃ－ｓｒＲＮＡ）及び対照自己複製ＲＮＡベクター（ｃ－ｓｒＲＮＡ）を試験した。ｓｒＲＮＡの特徴を表６－１に要約する。親ＶＥＥＶ株のＩＦＮ－α／β感受性は以前に報告された（Ｓｐｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｏｌ，７２：１０２８６－１０２９１，１９９８）。ｃ－ｓｒＲＮＡ１は、ＶＥＥＶのＴＲＤ株に基づくが、Ａ１６Ｄ置換（ＴＣ８３変異）及びＰ７７８Ｓ置換を有するように修飾された。ｃ－ｓｒＲＮＡ３もまた、ＶＥＥＶのＴＲＤ株に基づくが、Ａ１６Ｄ及びＰ７７８Ｓ置換を含まなかった。ｓｒＲＮＡ４は、ヒトから単離されたＶＥＥＶのＶ１９８株に基づいた。３つすべてのｃ－ｓｒＲＮＡベクターには、以前に記載されたように（Ｋｏによる米国特許第１１，４２１，２４８号、実施例３、２１及び２２（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、温度制御性のためにＶＥＥＶのｎｓＰ２タンパク質内に同じ５アミノ酸挿入が含まれる。４つすべてのｓｒＲＮＡは、シグナルペプチド配列を欠く抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン）をコードする。
【表1】
【0088】
ＶＥＥＶゲノムのヌクレオチド配列は、ＴＲＤ株がＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ０１４４２．２として、ＴＣ－８３株がＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ０１４４３．１として、ＧｅｎＢａｎｋに開示されている。ｓｒＲＮＡのｎｓＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に開示される：ｓｒＲＮＡ０（配列番号１３）；ｃ－ｓｒＲＮＡ１（配列番号９）；ｃ－ｓｒＲＮＡ３（配列番号１０）；ｃ－ｓｒＲＮＡ４（配列番号１１）；ｃ－ｓｒＲＮＡコンセンサス（配列番号１２）。
【0089】
ｓｒＲＮＡの調製。すべてのｓｒＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生した。ＮＥＢ １０－ｂｅｔａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃ３０１９Ｈ／Ｃ３０１９Ｉ）をプラスミドＤＮＡで形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａブロスで培養した。精製したプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩによって線状化した。Ｃａｐ１及びポリＡを用いたｃ－ｓｒＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）は、Ｃｌｅａｎｃａｐ ＡＵ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と共にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを製造業者のプロトコルにしたがって用いた、プラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて行った。
【0090】
マウス皮膚へのｓｒＲＮＡの注射。マウスを無作為に群に分け、注射の１日前に後肢を剃毛し、皮膚を露出させた。乳酸リンゲル（ＬＲ）溶液中で再構成した５μｇ又は２５μｇのｓｒＲＮＡを、剃毛した皮膚に皮内注射した。
【0091】
結果及び結論
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、裸のＲＮＡ（脂質ナノ粒子もトランスフェクション試薬もなし）としてのｓｒＲＮＡ又はプラセボのうちの１つを皮内注射によって投与した（図９Ａ）。予想された通り、抗原特異的ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞の存在によって評価された細胞性免疫は、ワクチン接種後１４日目までに既に誘導されていた（図９Ｂ）。ｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導されたＴ細胞応答は、標準的な非温度制御性ｓｒＲＮＡ０によって誘導された応答よりも強かった。さらに、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４によって誘導されるＴ細胞応答はいずれも、ｓｒＲＮＡ０及びｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導される応答よりも強かった。驚くべきことに、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４によって誘導されるＴ細胞応答はいずれも、ｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導される応答よりも約３倍高かった。この差異は、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４の親ＶＥＥＶ配列が、ｃ－ｓｒＲＮＡ１の親ＶＥＥＶ配列よりもＩ型インターフェロンによる抑制に対してより耐性であることによると考えられる。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、裸のＲＮＡ（脂質ナノ粒子もトランスフェクション試薬もなし）としてのｓｒＲＮＡ又はプラセボのうちの１つを皮内注射によって投与した（図９Ａ）。予想された通り、抗原特異的ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞の存在によって評価された細胞性免疫は、ワクチン接種後１４日目までに既に誘導されていた（図９Ｂ）。ｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導されたＴ細胞応答は、標準的な非温度制御性ｓｒＲＮＡ０によって誘導された応答よりも強かった。さらに、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４によって誘導されるＴ細胞応答はいずれも、ｓｒＲＮＡ０及びｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導される応答よりも強かった。驚くべきことに、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４によって誘導されるＴ細胞応答はいずれも、ｃ－ｓｒＲＮＡ１によって誘導される応答よりも約３倍高かった。この差異は、ｃ－ｓｒＲＮＡ３及びｃ－ｓｒＲＮＡ４の親ＶＥＥＶ配列が、ｃ－ｓｒＲＮＡ１の親ＶＥＥＶ配列よりもＩ型インターフェロンによる抑制に対してより耐性であることによると考えられる。
【0092】
参考文献
本開示に関する参照文献には、Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６７５０６号；Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２２（１２）：２１１８－２１２９，２０１４；Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：５３２３－５３３７，２００９；Ｇｏｌｏｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１１：３８２－３９２，２０１８；Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｌｏｗ－ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ－ｉｎｃｏｍｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．」ＰＡＴＨ／ＷＨＯ Ａｕｇｕｓｔ ２７，２００９；Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３（９）：１４９５－５０１，１９９５；及びＪｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７（１）：ｅ２９７３２，２０１２が含まれる。
〔配列表〕
本開示に関する参照文献には、Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６７５０６号；Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２２（１２）：２１１８－２１２９，２０１４；Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：５３２３－５３３７，２００９；Ｇｏｌｏｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１１：３８２－３９２，２０１８；Ｈｉｃｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｌｏｗ－ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ－ｉｎｃｏｍｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．」ＰＡＴＨ／ＷＨＯ Ａｕｇｕｓｔ ２７，２００９；Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３（９）：１４９５－５０１，１９９５；及びＪｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７（１）：ｅ２９７３２，２０１２が含まれる。
〔配列表〕
【0093】
配列番号１
＞ヒトＣＤ５シグナルペプチド
＞ヒトＣＤ５シグナルペプチド
【化1】
【0094】
配列番号２
＞ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＮＭ＿０２４４２６．６）
＞ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＮＭ＿０２４４２６．６）
【化2】
【0095】
配列番号３
＞ヒトＢＩＲＣ５（別名サバイビン）タンパク質（ＮＭ＿００１１６８）
＞ヒトＢＩＲＣ５（別名サバイビン）タンパク質（ＮＭ＿００１１６８）
【化3】
【0096】
配列番号４
＞ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質（ＮＭ＿００１３２７）
＞ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質（ＮＭ＿００１３２７）
【化4】
【0097】
配列番号５
＞ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質（ＮＭ＿００５３６２）
＞ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質（ＮＭ＿００５３６２）
【化5】
【0098】
配列番号６
＞ヒトＰＲＡＭＥタンパク質（ＮＭ＿００１２９１７１５）
＞ヒトＰＲＡＭＥタンパク質（ＮＭ＿００１２９１７１５）
【化6】
【0099】
配列番号７
＞人工タンパク質：ＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥタンパク質の融合
＞人工タンパク質：ＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥタンパク質の融合
【化7】
【0100】
配列番号８
＞人工タンパク質：ヒトＣＤ５（シグナルペプチドのみ）、ＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥタンパク質の融合
＞人工タンパク質：ヒトＣＤ５（シグナルペプチドのみ）、ＷＴ１、ＢＩＲＣ５、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥタンパク質の融合
【化8】
【0101】
配列番号９
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ１ ｎｓＰ２
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ１ ｎｓＰ２
【化9】
【0102】
配列番号１０
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ３ ｎｓＰ２
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ３ ｎｓＰ２
【化10】
【0103】
配列番号１１
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ４ ｎｓＰ２
＞タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ４ ｎｓＰ２
【化11】
【0104】
配列番号１２
＞人工タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ ｎｓＰ２コンセンサス
＞人工タンパク質：ｃ－ｓｒＲＮＡ ｎｓＰ２コンセンサス
【化12】
【0105】
配列番号１３
＞ＶＥＥＶ：ｓｒＲＮＡ０
＞ＶＥＥＶ：ｓｒＲＮＡ０
【化13】
【0106】
配列番号１４
＞人工タンパク質：ｔｓ挿入
ＴＧＡＡＡ
＞人工タンパク質：ｔｓ挿入
ＴＧＡＡＡ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【配列表】
【国際調査報告】