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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】角膜瘢痕化を予防または低減する局所薬物療法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240905BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240905BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240905BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20240905BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240905BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20240905BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240905BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/4178 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/41 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/4245 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20240905BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240905BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240905BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K47/18
A61K47/02
A61K47/04
A61K47/10
A61K47/20
A61K47/38
A61K47/36
A61K31/4178
A61K31/4184
A61K31/41
A61K31/4245
A61K31/573
A61K9/08
A61K9/06
A61P27/02
A61P43/00 121
A61P43/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513761
(86)(22)【出願日】2022-08-30
(85)【翻訳文提出日】2024-04-10
(86)【国際出願番号】 US2022075640
(87)【国際公開番号】W WO2023034779
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/239,195
(32)【優先日】2021-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/345,202
(32)【優先日】2022-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/392,917
(32)【優先日】2022-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595033056
【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＣｌｉｎｉｃＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】９５００ Ｅｕｃｌｉｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ウィルソン，スティーヴン イー．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA07
4C076AA09
4C076AA12
4C076BB24
4C076CC10
4C076DD19R
4C076DD22R
4C076DD23R
4C076DD34
4C076DD37R
4C076DD41
4C076DD43
4C076DD49R
4C076DD55R
4C076DD60
4C076DD70
4C076EE06W
4C076EE09P
4C076EE32P
4C076EE32W
4C076EE37W
4C084AA17
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA17
4C084MA58
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZC082
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC38
4C086BC39
4C086BC62
4C086BC71
4C086DA11
4C086GA02
4C086GA04
4C086GA07
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA58
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、またはロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４）を含む組成物を使用して、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療するための組成物、系、及び方法に関する。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療する方法であって、組成物を対象の角膜へ投与すること、または前記対象が前記組成物を前記角膜へ投与するように前記組成物を前記対象へ提供することを含み、
前記対象の前記角膜が、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕を含み、
前記組成物が、
ａ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、
ｂ）水、ならびに
ｃ）以下：
ｉ）前記組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、前記１つまたは複数の塩；
ｉｉ）前記組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及び
ｉｉｉ）前記組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤
のうちの少なくとも１つ；
ｄ）任意選択の防腐物質、ならびに
ｅ）任意選択の無痛化剤、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記薬剤が、０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記投与することまたは前記投与が、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも１か月の間少なくとも毎日遂行され、前記対象が、前記投与すること前記投与の直前に２０／Ｘであり、次いで前記少なくとも１週間、前記少なくとも２週間、または前記少なくとも１か月の終了時で２０／Ｙである最高矯正視力（ＢＳＣＶＡ）を有し、Ｙが、Ｘよりも少なくとも５ポイント低い、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｙが、前記Ｘよりも少なくとも１５ポイント低い、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記組成物が、前記薬剤、前記水、及び前記１つまたは複数の塩以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記組成物が、前記無痛化剤を含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ａ）前記組成物が、前記防腐物質をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つもしくは複数の塩、及び前記防腐物質以外の任意の追加の試薬を含まないか、もしくは検出可能には含まない、またはｂ）前記組成物が、前記防腐物質及び前記無痛化剤をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つもしくは複数の塩、前記防腐物質、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、もしくは検出可能には含まない、
請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記防腐物質が、塩化ベンザルコニウム、亜鉛素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ピュライト（ｐｕｒｉｔｅ）、臭化ベンゾドデシニウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クロロブタノール、チオマーサル、エデト酸２ナトリウム、及びオキシクロロ複合体（ＳＯＣ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記無痛化剤が、前記組成物中に存在し、前記無痛化剤が、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒアルロン酸からなる群から任意選択で選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記組成物が、点眼容器中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記組成物が、前記１つまたは複数の塩を含み、液体形態であり、さらに前記１つまたは複数のゲル化剤及び前記１つまたは複数の軟膏形成剤を含まないか、または検出可能には含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記組成物が、前記１つもしくは複数のゲル化剤及び／または前記１つもしくは複数の軟膏形成剤を含み、ゲルまたは軟膏の形態であり、任意選択で、前記ゲル化剤が、ヒプロメロース、カルボマーホモポリマー、及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択され、任意選択で、前記軟膏形成剤が、鉱物油及び／またはペトロラタムである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記投与することまたは前記投与が、少なくとも１週間の間で１日に少なくとも４または６または８回である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記投与することまたは前記投与が、少なくとも８時間の間約３０分毎に遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記投与することまたは前記投与が、前記角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、前記角膜損傷の前記出現から１か月後に、前記角膜が、０、０．５、１、または２のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、前記角膜損傷が、もし治療しないで放置されるならば、前記１か月後に、３または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるであろう、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記投与することまたは前記投与が、前記角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、前記角膜損傷の前記出現から１か月後に、前記角膜が、０、０．５、または１のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、前記角膜損傷が、もし治療しないで放置されるならば、前記１か月後に、２、３、または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるであろう、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記薬剤が、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、及びロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記１つまたは複数の塩が、以下：ｉ）約０．６４％の塩化ナトリウム、
ｉｉ）約０．０７５％の塩化カリウム、
ｉｉｉ）約０．０４８％の塩化カルシウム二水和物、
ｉｖ）約０．０３％の塩化マグネシウム六水和物、
ｖ）約０．３９％の酢酸ナトリウム三水和物、及び／または
ｖｉ）約０．１７％のクエン酸ナトリウム二水和物
のうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
コルチコステロイドを前記対象の前記角膜へ投与すること、または前記対象が前記コルチコステロイドを前記角膜へ投与するように前記コルチコステロイドを前記対象へ提供することをさらに含み、前記コルチコステロイドが、前記組成物中に存在するかまたは別の組成物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記組成物が、経時的に前記組成物を前記対象の涙液の中へ緩慢に放出する、結膜リザーバー、または他の連続的な送達デバイス中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記組成物が、経時的に前記組成物を放出する多孔質コラーゲン治療用コンタクトレンズ中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記組成物が、前記防腐物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記投与することまたは前記投与が、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも１か月の間少なくとも毎日遂行され、前記対象が、前記投与することまたは前記投与の直前にＸジオプトリーの近視スコアを有し、前記少なくとも１週間、前記少なくとも２週間、または前記少なくとも１か月の終了時でＹジオプトリーであり、Ｙが、Ｘよりも少なくとも１ジオプトリー低い、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記角膜損傷が、前記投与することまたは前記投与の１、３、６、１２、２４、または４８時間前に起こっている、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記組成物を対象の角膜へ投与することが、前記対象が前記組成物を自分の角膜へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記損傷が、外傷、化学熱傷、微生物感染、または手術によって引き起こされた、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記損傷が、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）または治療的レーザー角膜切除術（ＰＴＫ）によって引き起こされた、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
前記角膜損傷が、前記投与することまたは前記投与の５日以内に起こっている、請求項１に記載の方法。
【請求項30】
前記角膜損傷が、前記投与することまたは前記投与の２４時間以内に起こっている、請求項１に記載の方法。
【請求項31】
前記薬剤が、ロサルタンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項32】
系を対象へ送達することを含む方法であって、前記対象が、角膜損傷または既存の角膜瘢痕を含む眼を有し、
前記系が、
ａ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、ならびに
ｂ）
ｉ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、
ｉｉ）水、及び
ｉｉｉ）以下：
Ａ）前記組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、前記１つまたは複数の塩；
Ｂ）前記組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及び
Ｃ）前記組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤
のうちの少なくとも１つ；
ｉｖ）任意選択の防腐物質、及び
ｖ）任意選択の無痛化剤、
を含む、組成物
を含む、前記方法。
【請求項33】
前記薬剤が、０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記組成物が、前記薬剤、前記水、及び前記１つまたは複数の塩以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記組成物が、前記点眼用スポイト容器中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
０．２～０．９ｍｇ／ｍｌの前記濃度が、約０．７～０．８ｍｇ／ｍｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
０．２～０．９ｍｇ／ｍｌの前記濃度が、約０．４～０．６ｍｇ／ｍｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
前記組成物が、前記無痛化剤を含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項３２に記載の方法。
【請求項39】
前記組成物が、前記防腐物質及び前記無痛化剤をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、前記防腐物質、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記組成物が、前記防腐物質をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、及び前記防腐物質以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項３２に記載の方法。
【請求項41】
前記防腐物質が、塩化ベンザルコニウム、亜鉛素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ピュライト、または臭化ベンゾドデシニウムからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記無痛化剤が、前記組成物中に存在し、前記無痛化剤が、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒアルロン酸からなる群から任意選択で選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項43】
前記点眼容器が、使い捨ての容器である、請求項３２に記載の方法。
【請求項44】
前記組成物が、前記少なくとも１つの軟膏形成剤を含み、軟膏の形態である、請求項３２に記載の方法。
【請求項45】
前記組成物が、前記コンタクトレンズ中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項46】
前記組成物が、前記防腐物質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項47】
前記組成物が、前記無痛化剤をさらに含み、前記無痛化剤が、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、グリセリン、カルボマー、ヒアルロン酸、リン脂質、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリド、塩化ベンザルコニウム、及びエチレンジアミン四酢酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項48】
前記対象が、ヒト対象である、請求項３２に記載の方法。
【請求項49】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記角膜損傷が、前記送達の１、３、６、１２、２４、４８時間、または５日前に起こっている、請求項３２に記載の方法。
【請求項50】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記損傷が、外傷、化学熱傷、微生物感染、または手術によって引き起こされた、請求項３２に記載の方法。
【請求項51】
前記対象の前記角膜が、前記角膜損傷を含み、前記損傷が、レーザー屈折矯正角膜切除術または治療的レーザー角膜切除術によって引き起こされた、請求項３２に記載の方法。
【請求項52】
前記組成物が、前記１つまたは複数の塩を含み、液体形態であり、さらに前記１つまたは複数のゲル化剤及び前記１つまたは複数の軟膏形成剤を含まないか、または検出可能には含まない、請求項３２に記載の方法。
【請求項53】
前記角膜損傷が、前記送達の２４時間以内に起こっている、請求項３２に記載の方法。
【請求項54】
前記薬剤が、ロサルタンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項55】
ａ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、ｂ）水、ならびに
ｃ）以下：
ｉ）前記組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、前記１つまたは複数の塩；
ｉｉ）前記組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及び
ｉｉｉ）前記組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤
のうちの少なくとも１つ；
ｄ）任意選択の防腐物質、ならびに
ｅ）任意選択の無痛化剤、
を含む、組成物。
【請求項56】
前記薬剤が、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項57】
前記組成物が、前記１つもしくは複数のゲル化剤及び／または前記１つもしくは複数の軟膏形成剤を含み、ゲルまたは軟膏の形態であり、任意選択で、前記ゲル化剤が、ヒプロメロース、カルボマーホモポリマー、及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択され、任意選択で、前記軟膏形成剤が、鉱物油及び／またはペトロラタムである、請求項５５に記載の組成物。
【請求項58】
前記組成物が、液体形態であり、前記薬剤、前記水、及び前記１つまたは複数の塩以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項５６に記載の組成物。
【請求項59】
前記組成物が、液体形態であり、前記無痛化剤を含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項５５に記載の組成物。
【請求項60】
前記組成物が、前記防腐物質及び前記無痛化剤をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、前記防腐物質、及び前記無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項５５に記載の組成物。
【請求項61】
前記組成物が、前記防腐物質をさらに含み、前記組成物が、前記薬剤、前記水、前記１つまたは複数の塩、及び前記防腐物質以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない、請求項５５に記載の組成物。
【請求項62】
前記防腐物質が、塩化ベンザルコニウム、亜鉛素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ピュライト、または臭化ベンゾドデシニウムからなる群から選択される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項63】
前記薬剤が、０．７～０．９ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項64】
前記組成物が、前記１つまたは複数のゲル化剤を含み、ゲルの形態である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項65】
前記組成物が前記防腐物質を含み、前記防腐物質が抗生物質を含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項66】
前記組成物が、前記無痛化剤を含み、前記無痛化剤が、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、グリセリン、カルボマー、ヒアルロン酸、リン脂質、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリド、塩化ベンザルコニウム、及びエチレンジアミン四酢酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項67】
ａ）ｉ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、
ｉｉ）水、及び
ｉｉｉ）以下：
Ａ）前記組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、前記１つまたは複数の塩；
Ｂ）前記組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及び
Ｃ）前記組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤
のうちの少なくとも１つ；
ｉｖ）任意選択の防腐物質、及び
ｖ）任意選択の無痛化剤、
を含む組成物；ならびに
ｂ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、
を含む系。
【請求項68】
前記系が前記点眼用スポイトを含み、前記組成物が前記点眼用スポイト内部に存在する、請求項６７に記載の系。
【請求項69】
前記系が前記コンタクトレンズを含み、前記組成物が、前記コンタクトレンズの内部にまたは前記コンタクトレンズの内側表面上に存在する、請求項６７に記載の系。
【請求項70】
前記薬剤が、０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項６７に記載の系。
【請求項71】
前記薬剤が、０．７ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項６７に記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦政府による資金提供に関する記載
本発明は、国防省（ＣＤＭＲＰ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１９－１－０８４６の政府助成により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国防省（ＣＤＭＲＰ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１９－１－０８４６の政府助成により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【0002】
配列表
２０２２年８月３０日に生成され、１，９２９バイトのファイルサイズを有する、タイトル「３９７６５－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」のコンピューター可読配列表のテキストは、本明細書と共に提出され、参照することによってその全体が本明細書に援用される。
２０２２年８月３０日に生成され、１，９２９バイトのファイルサイズを有する、タイトル「３９７６５－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」のコンピューター可読配列表のテキストは、本明細書と共に提出され、参照することによってその全体が本明細書に援用される。
【0003】
本発明は、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、またはロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４）を含む組成物を使用して、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療するための組成物、系、及び方法に関する。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。
【背景技術】
【0004】
外傷、微生物感染、瘢痕化疾患、及び何らかの角膜手術後に、筋線維芽細胞の発達によって媒介される角膜の瘢痕性線維化は、米国において及び世界中で、視力喪失の最も重要な原因のうちの１つである（Ｗｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＷＨＯの統計によれば、両側失明の５．１％は角膜失明であり、実質の瘢痕化は最大のサブカテゴリーである（Ｗｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。細菌性角膜炎または外傷に起因する角膜混濁も、米国における角膜移植のよくみられる理由である（Ｇｈｏｓｈｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）。外傷、感染、疾患、または手術に起因する持続的な角膜瘢痕化が、ヒトにおいて、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、及び他の種でのもの（Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｈｉｎｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｊｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０；ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）と同じ筋線維芽細胞関連メカニズムによって起こる（Ｃｏｃｋｅｒｈａｍ ａｎｄ Ｈｉｄａｙａｔ，１９９９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、またはロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４）、または他のＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む組成物を使用して、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療するための組成物、系、及び方法に関する。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～３．０ｍｇ／ｍｌ（例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０．．．、２．５．．．、または３．０ｍｇ／ｍｌ）の濃度で組成物中に存在する。
【0006】
いくつかの実施形態において、ａ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、ｂ）水、ならびにｃ）ｉ）組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、１つまたは複数の塩；ｉｉ）組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及びｉｉｉ）組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤、のうちの少なくとも１つ；ｄ）任意選択の防腐物質、ならびにｅ）任意選択の無痛化剤、を含む組成物が、本明細書において提供される。
【0007】
ある特定の実施形態において、系を対象へ送達することを含む方法であって、対象が、角膜損傷または既存の角膜瘢痕を含む眼を有し、系が、ａ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、ならびにｂ）ｉ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、ｉｉ）水、及びｉｉｉ）Ａ）組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、１つまたは複数の塩、Ｂ）組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及びＣ）組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤、のうちの少なくとも１つ；ｉｖ）任意選択の防腐物質、及びｖ）任意選択の無痛化剤、を含む組成物を含む、前記方法が、本明細書において提供される。
【0008】
さらなる実施形態において、ａ）ｉ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、ｉｉ）水、及びｉｉｉ）Ａ）組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、１つまたは複数の塩；Ｂ）組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及びＣ）組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤、のうちの少なくとも１つ；ｉｖ）任意選択の防腐物質、及びｖ）任意選択の無痛化剤、を含む組成物；ならびにｂ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、を含む系が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、系は、点眼用スポイトを含み、組成物は、点眼用スポイトの内部に存在する。さらなる実施形態において、系は、コンタクトレンズを含み、組成物は、コンタクトレンズの内部にまたはその内側表面上に存在する。
【0009】
いくつかの実施形態において、組成物を対象の角膜へ投与すること、または対象が組成物を角膜へ投与するように組成物を対象へ提供することを含む、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療する方法であって、対象の角膜が、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕を含み、組成物が、ａ）ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含む、薬剤、ｂ）水、ならびにｃ）ｉ）組成物が水性形態である場合に、ほぼ生理的な濃度の１つまたは複数の塩及びほぼ生理的なｐＨを有するようなレベルで存在する、１つまたは複数の塩；ｉｉ）組成物がゲルの形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数のゲル化剤；及びｉｉｉ）組成物が軟膏の形態であるようなレベルで存在する、１つまたは複数の軟膏形成剤、のうちの少なくとも１つ；ｄ）任意選択の防腐物質、ならびにｅ）任意選択の無痛化剤を含む、前記方法が、本明細書において提供される。
【0010】
特定の実施形態において、薬剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。他の実施形態において、投与することまたは投与は、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも１か月の間少なくとも毎日遂行され、対象は、投与することまたは投与の直前に２０／Ｘであり、次いで少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも１か月の終了時で２０／Ｙである最高矯正視力（ＢＳＣＶＡ）を有し、Ｙは、Ｘよりも少なくとも５ポイント（または１０、１５、もしくは２０、もしくは２５、もしくは３０ポイント）低い。
【0011】
ある特定の実施形態において、組成物は、薬剤、水、及び１つまたは複数の塩以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない。他の実施形態において、組成物は、無痛化剤を含み、組成物は、薬剤、水、１つまたは複数の塩、及び無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、防腐物質をさらに含み、組成物は、薬剤、水、１つまたは複数の塩、及び防腐物質以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない。ある特定の実施形態において、組成物は、防腐物質及び無痛化剤をさらに含み、組成物は、薬剤、水、１つまたは複数の塩、防腐物質、及び無痛化剤以外の任意の追加の試薬を含まないか、または検出可能には含まない。
【0012】
特定の実施形態において、防腐物質は、塩化ベンザルコニウム、亜鉛素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ピュライト（ｐｕｒｉｔｅ）、臭化ベンゾドデシニウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クロロブタノール、チオマーサル、エデト酸２ナトリウム、及びオキシクロロ複合体（ＳＯＣ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、無痛化剤は、組成物中に存在し、無痛化剤は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒアルロン酸からなる群から任意選択で選択される。
【0013】
いくつかの実施形態において、組成物は、点眼容器中に存在し、任意選択で、点眼容器は、使い捨ての容器である。さらなる実施形態において、組成物は、１つまたは複数の塩を含み、液体形態であり、さらに１つまたは複数のゲル化剤及び１つまたは複数の軟膏形成剤を含まないか、または検出可能には含まない。追加の実施形態において、組成物は、１つもしくは複数のゲル化剤及び／または１つもしくは複数の軟膏形成剤を含み、ゲルまたは軟膏の形態であり、任意選択で、ゲル化剤は、ヒプロメロース（例えば約０．３％）、カルボマーホモポリマー（例えば約０．５％）、及びカルボキシメチルセルロース（例えば約１％）からなる群から選択され、任意選択で、軟膏形成剤は、鉱物油（例えば約４０～５０％）及び／またはペトロラタム（例えば４０～６０％）である。
【0014】
いくつかの実施形態において、投与することまたは投与は、少なくとも１週間の間で１日に少なくとも４または６または８回である。さらなる実施形態において、投与することまたは投与は、約３０分毎に少なくとも８時間遂行される。追加の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０、０．５、１、または２のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、３または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。他の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０、０．５、または１のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、２、３、または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。
【0015】
特定の実施形態において、薬剤は、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、及びロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から選択される。他の実施形態において、１つまたは複数の塩は、以下：ｉ）約０．６４％もしくは０．６０％～０．０７０％の塩化ナトリウム、ｉｉ）約０．０７５％もしくは０．０７０～０．０８０％の塩化カリウム、ｉｉｉ）約０．０４８％もしくは０．０４０～０．０５５％の塩化カルシウム二水和物、ｉｖ）約０．０３％もしくは０．０１～０．０５％の塩化マグネシウム六水和物、ｖ）約０．３９％もしくは０．３０～０．５０の酢酸ナトリウム三水和物、及び／またはｖｉ）約０．１７％もしくは約０．１０～０．３０％のクエン酸ナトリウム二水和物のうちの１つもしくは複数またはすべてを含む。
【0016】
ある特定の実施形態において、方法は、コルチコステロイドを対象の角膜へ投与すること、または対象がコルチコステロイドを角膜へ投与するようにコルチコステロイドを対象へ提供することをさらに含み、コルチコステロイドは、組成物中に存在するかまたは別の組成物中に存在する。他の実施形態において、組成物は、経時的に組成物を対象の涙液の中へ緩慢に放出する、結膜リザーバー、または他の連続的な送達デバイス中に存在する。ある特定の実施形態において、組成物は、経時的に組成物を放出する多孔質コラーゲン治療用コンタクトレンズ中に存在する。
【0017】
いくつかの実施形態において、組成物は、防腐物質（例えば抗生物質）を含む。さらなる実施形態において、投与することまたは投与は、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも１か月の間少なくとも毎日遂行され、対象は、投与することまたは投与の直前にＸジオプトリーの近視スコアを有し、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも１か月の終了時でＹジオプトリーであり、Ｙは、Ｘよりも少なくとも１ジオプトリー低い。特定の実施形態において、対象は、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、またはブタである。
【0018】
特定の実施形態において、対象の角膜は角膜損傷を含み、角膜損傷は、投与することまたは投与の１、３、６、１２、２４、または４８時間前に起こっている。他の実施形態において、組成物を対象の角膜へ投与することは、対象が組成物を自分の角膜へ投与することを含む。他の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、損傷は、外傷、化学熱傷、微生物感染、または手術によって引き起こされた。特定の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、損傷は、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）または治療的レーザー角膜切除術（ＰＴＫ）によって引き起こされた。
【0019】
ある特定の実施形態において、角膜損傷は、投与することまたは投与の５日以内に起こっている。さらなる実施形態において、角膜損傷は、投与することまたは投与の２４時間以内に起こっている。追加の実施形態において、薬剤は、ロサルタンを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、点眼用スポイト容器中に存在する。他の実施形態において、組成物は、コンタクトレンズ中に存在する。
【0020】
いくつかの実施形態において、第１の組成物を対象の角膜へ（例えば局所的に）投与すること、または前記対象が前記組成物を前記角膜へ投与するように前記組成物を前記対象へ提供することを含む、角膜損傷（例えば最近起こっている）及び／または既存の角膜瘢痕（例えば３、４、５、６か月以上の間存在したもの）の対象を治療する方法であって、前記対象の前記角膜が、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕を含み、前記組成物が、薬剤を含み、前記薬剤が、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含み；任意選択で、前記薬剤が、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から選択され、前記方法が、任意選択で、コルチコステロイドを対象の角膜へ投与すること、または対象がコルチコステロイドを角膜へ投与するようにコルチコステロイドを対象へ提供することをさらに含み、コルチコステロイドが、第１の組成物または第２の組成物中に存在する、前記方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、水中油型エマルションまたはミセルの形態である。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、１～３０ｍｇ／ｍｌ（１．０．．．、５．０．．．、１０．０．．．、１５．０．．．、２０．０．．．、２５．０．．、または３０．０ｍｇ／ｍｌ等）で第１の組成物及び／または第２の組成物中に存在する（例えば水中油型エマルションまたはミセルで存在するならば）。
【0021】
特定の実施形態において、系を対象へ送達することを含む方法であって、前記対象が、角膜損傷または既存の角膜瘢痕を含む眼を有し、前記系が、ａ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、及びｂ）薬剤が、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含み、前記薬剤が、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から任意選択で選択される、前記薬剤を含む第１の組成物、及びｃ）コルチコステロイドが、前記第１の組成物または第２の組成物中に存在する、任意選択の前記コルチコステロイド、を含む、前記方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、薬剤は、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。ある特定の実施形態において、コルチコステロイドは方法において用いられ、第１の組成物中に存在する。他の実施形態において、コルチコステロイドは方法において用いられ、第２の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、水中油型エマルションまたはミセルの形態である。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、１～３０ｍｇ／ｍｌ（１．０．．．、５．０．．．、１０．０．．．、１５．０．．．、２０．０．．．、２５．０．．、または３０．０ｍｇ／ｍｌ等）で第１の組成物及び／または第２の組成物中に存在する（例えば水中油型エマルションまたはミセルで存在するならば）。
【0022】
いくつかの実施形態において、（例えば第１の組成物及び／または第２の組成物を）送達または投与することは、薬局職員、医師、看護師、または他の医療従事者によって遂行される。ある特定の実施形態において、角膜損傷は、第１の組成物及び／または第２の組成物を送達または投与の５日以内（例えば５、４、３、２、または１日）に起こっている。他の実施形態において、角膜損傷は、第１の組成物及び／または第２の組成物を送達または投与の２４時間以内（例えば２４．．．、１２．．．、６．．．、３．．．、２．．．、または１時間）に起こっている。
【0023】
いくつかの実施形態において、薬剤及び食塩水、ならびに任意選択のコルチコステロイドを含むかまたはそれらから本質的になる組成物であって、前記薬剤が、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含み、前記薬剤が、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から任意選択で選択される、前記組成物が、本明細書において提供される。
【0024】
特定の実施形態において、ａ）薬剤が、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含み、前記薬剤が、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４からなる群から任意選択で選択される、前記薬剤を含む第１の組成物、及びｂ）点眼用スポイト容器またはコンタクトレンズ、及びｃ）コルチコステロイドが、前記第１の組成物または第２の組成物中に存在する、前記任意選択のコルチコステロイド、を含む系が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、系は、点眼用スポイトを含み、第１の組成物及び／または第２の組成物は、点眼用スポイトの内部に存在する。さらなる実施形態において、系は、コンタクトレンズを含み、第１の組成物及び／または第２の組成物は、コンタクトレンズの内部にまたはその内側表面上に存在する。
【0025】
特定の実施形態において、本明細書における組成物は、滅菌される。いくつかの実施形態において、薬剤は、約０．２～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で第１の組成物中に存在する。さらなる実施形態において、第１の組成物中の０．２～０．９ｍｇ／ｍｌの薬剤の濃度は、約０．８ｍｇ／ｍｌ、または約０．７ｍｇ／ｍｌ、または約０．６ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約０．４ｍｇ／ｍｌ、または約０．３ｍｇ／ｍｌ、または約０．２ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、液体またはゲルの形態であり、食塩水をさらに含む。追加の実施形態において、第１の組成物は、薬剤及び食塩水からなるかもしくは本質的になる；及び／または、組成物は、７．０～７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、水中油型エマルションまたはミセルの形態である。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、１～３０ｍｇ／ｍｌ（１．０．．．、５．０．．．、１０．０．．．、１５．０．．．、２０．０．．．、２５．０．．、または３０．０ｍｇ／ｍｌ等）で第１の組成物及び／または第２の組成物中に存在する（例えば水中油型エマルションまたはミセルで存在するならば）。
【0026】
ある特定の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、防腐物質をさらに含む。いくつかの実施形態において、防腐物質は、塩化ベンザルコニウム、亜鉛素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ピュライト、または臭化ベンゾドデシニウムからなる群から選択される。追加の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、防腐物質を含まない。
【0027】
いくつかの実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、点眼容器中に存在する。他の実施形態において、点眼容器は、使い捨ての容器である。
【0028】
ある特定の実施形態において、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、少なくとも１週間（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８週間）の間で１日に少なくとも４回（例えば１日に４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６回）である。他の実施形態において、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、少なくとも１週間の間で１日に少なくとも８回である。ある特定の実施形態において、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、少なくとも８時間（例えば少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０時間．．．、または７２時間、または３日間まで）の間で約３０分毎に遂行される。
【0029】
いくつかの実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０、０．５、１、または２のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、３または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。他の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０、０．５、または１のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、２、３、または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。追加の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０または０．５、１のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、１、２、３、または４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。いくつかの実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、投与することまたは投与（例えばＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドについての）は、角膜損傷の出現から１～５日以内に開始して、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行され、角膜損傷の出現から１か月後に、角膜は、０、０．５、２、または３のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを有し、角膜損傷は、もし治療しないで放置されるならば、１か月後に、４のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアを生ずるだろう。
【0030】
特定の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、軟膏、液体、またはゲルの形態である。他の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、経時的にＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン）及び／またはコルチコステロイドを対象の涙液の中へ緩慢に放出する、結膜リザーバー、または他の連続的な送達デバイス中に存在する。他の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、経時的にＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン）またはコルチコステロイドを放出する多孔質コラーゲン治療用コンタクトレンズ中に存在する。追加の実施形態において、第１の組成物及び／または第２の組成物は、抗生物質をさらに含む。特定の実施形態において、抗生物質は、シプロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベシフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネオマイシン、アンホテリシンＢ、ナタマイシン、ジグルコン酸クロルヘキシジン、ポリヘキサメチリン（ｐｏｌｙｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｉｎｅ）ビグアナイド、またはブロレンからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、Ａｃｅ－２受容体アンタゴニストを含有する組成物は、少なくとも１つの抗ウイルス剤（例えば単純ヘルペスウイルスのためのもの、アシクロビル、バルシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びトリフルリジン等）を含む、及び／または、抗アカントアメーバ薬（イセチオン酸プロパミジン、ヘキサミジン、及びペンタミジン等）を含む。
【0031】
ある特定の実施形態において、対象は、ヒト対象である。追加の実施形態において、対象の角膜は角膜損傷を含み、角膜損傷は、第１の組成物及び／または第２の組成物を投与することまたは投与の１、３、６、１２、２４、または４８時間前に起こっている。いくつかの実施形態において、対象の角膜は、角膜瘢痕を含み、投与することまたは投与（第１の組成物及び／または第２の組成物の）は、角膜のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアが、角膜の最初のＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアから少なくとも０．５または少なくとも１だけ低減されるように、少なくとも１週間の間少なくとも毎日遂行される。いくつかの実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、損傷は、外傷、化学熱傷、微生物感染、または手術によって引き起こされた。他の実施形態において、対象の角膜は、角膜損傷を含み、損傷は、レーザー屈折矯正角膜切除術または治療的レーザー角膜切除術によって引き起こされた。さらなる実施形態において、角膜損傷は、第１の組成物及び／または第２の組成物を投与することまたは投与の５日以内に起こっている。他の実施形態において、角膜損傷は、第１の組成物及び／または第２の組成物を投与することまたは投与の２４時間以内に起こっている。いくつかの実施形態において、薬剤は、ロサルタンを含む。特定の実施形態において、薬剤は、ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４を含む。
【0032】
ある特定の実施形態において、本明細書における組成物は、以下の試薬：メチルセルロース（例えば０．５％、１％、１．５％、もしくは２％、または０．５％～２％の任意の濃度）；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば０．５％、１％、１．５％、もしくは２％、または０．５％～２％の任意の濃度）；デキストラン（例えば０．１％または０．２％）；グリセリン（例えば０．１％～２％）；カルボマー（例えば０．１％～０．５％）；ヒアルロン酸（例えば角膜浸透性を増加させ、患者の快適さを改善する；約３６０～約１２００ｋＤａで変動する分子量を備えた；０．０３％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、または０．０３％～１％の任意の濃度で存在する）；ならびに角膜浸透性を増加させ、患者の快適さを改善し得る、リン脂質、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸、またはトリグリセリド等のより高い粘度の脂質（例えば０．５％～５％）のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、本明細書における組成物は、以下の試薬：角膜上皮透過性を増加させて、より大きなＴＧＦβ遮断のために、実質の中へのロサルタンまたは他の本明細書における薬剤浸透を増加させる成分のうちの１つまたは複数をさらに含む。かかる試薬は使用され得、例えば、典型的には、瘢痕化応答の初期相におけるＴＧＦβのより大きな遮断のために、感染または損傷後の約１～５日の間使用されるだろう。これを達成するために添加される成分としては、例えば塩化ベンザルコニウム（例えば０．０２％）、及びエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（例えば０．０１％）が挙げられる。
【0034】
他の実施形態において、本明細書における組成物は、コルチコステロイド等の抗炎症剤（例えば損傷１日～２週間後に使用される）をさらに含む。ある特定の実施形態において、抗炎症剤は、酢酸プレドニゾロン（例えば０．１％、０．２％、０．５％、１％、または０．１％～１％の任意の濃度）；フルロメタロン（ｆｌｕｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）（例えば０．１％、０．２５％、０．５％、または０．１％～０．５％の任意の濃度）；リン酸デキサメタゾンナトリウム（例えば０．１％～０．２％）；ロテプレドノール（例えば０．１％～１％）；及びジフルプレドナート（例えば０．０１％～０．１％）から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】局所ロサルタン溶液及び／または経口ロサルタン溶液あるいは対応するビヒクル溶液により処理された、代表的な無傷の偽手術角膜及び８ｍｍの中央部のデスメ膜剥離手術後１か月の角膜の標準化された細隙灯写真。経口ロサルタン（Ａ）または局所ロサルタン（Ｂ）により処理された偽手術の無傷の対照（Ｃｏｎ）角膜である。Ｃ．デスメ膜剥離手術ならびに１か月の間の経口ビヒクル及び局所ビヒクルによる処理を行った角膜である。矢頭は、血管新生を示す。Ｄ．デスメ膜剥離手術及び１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンによる処理を行った角膜である。矢頭は、血管新生を示す。Ｅ．デスメ膜剥離手術及び１か月の間の１日６回の０．４ｍｇ／ｋｇの局所ロサルタンによる処理を行った角膜である。Ｃ及びＤに比較した周辺角膜の透明度、加えて中央部の混濁の減少及び透明化領域（矢印）、そして、ＣまたはＤに比較した角膜血管新生の減少に注目されたい。Ｆ．デスメ膜剥離手術ならびに１日６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタン及び１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンの両方による処理を行った角膜も、Ｃ及びＤに比較して、周辺角膜のより高い透明度及び中央部の混濁の減少を有していた。周辺の混濁の透明化の領域は、この角膜においても存在した（矢印）。Ｇ．各々の角膜について２．５ｍｍの直径の円でＩｍａｇｅＪにより測定された混濁の強度を示すグラフである。各々の群についての平均及び標準誤差を示す。＊及び＊＊は、ＤＭＲ＋局所ロサルタンとＤＭＲ＋局所ロサルタン及び経口ロサルタンそれぞれについての混濁の強度は、他の群とは有意に異なっていたが、互いとは有意に異なっていなかったことを示す。ＤＭＲは、デスメ膜剥離手術である。Ｕｎは、無傷の偽手術である。ＯＲは、経口である。ＴまたはＴＯＰは、局所である。ＬまたはＬｏｓは、ロサルタンである。
【図2A】ロサルタンまたはビヒクルによる処理の１か月後の筋線維芽細胞についてのα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）マーカー及び角膜中の角膜実質細胞についてのケラトカンマーカーの二重ＩＨＣ。各々の群中の２つの角膜からの代表的な中央部の切片を示す。線維化ＳＭＡ陽性（赤色）層の厚さが、ＤＭＲ局所ロサルタン群（パネルＣ、Ｄ）ならびにＤＭＲ局所ロサルタン及び経口ロサルタン群（Ｇ、Ｈ）中の角膜に比較して、ＤＭＲ経口ビヒクル及び局所ビヒクル群（ＤＭＲビヒクル、パネルＡ、Ｂ）ならびにＤＭＲ経口ロサルタン群（パネルＥ、Ｆ）中の角膜でのものより厚かったことに注目されたい。いくつかの角膜の輪部で指摘されるＳＭＡ陽性細胞は、輪部血管と関連する周皮細胞である。パネルＤ中で示されるＤＭＲ局所ロサルタン角膜は、その群中の角膜の後部のＳＭＡ陽性線維化が最も少なかった。角膜後部の線維化が、経口（パネルＩ、Ｊ）または局所（パネルＫ、Ｌ）のロサルタンにより処理された無傷の偽手術角膜において無かったことに注目されたい。青色は、細胞核のＤＡＰＩ染色である。
【図2B】各々の群の各々の角膜における個別のＳＭＡ陽性線維化領域のグラフの結果を提供する。個別の測定及び各々の群についての平均±標準誤差を示す。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続く群間の事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定の統計的比較は、表４を参照されたい。
【図3A】ＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての二重ＩＨＣ。カラムＡ。１か月の間局所ロサルタンにより処理された無傷の偽手術角膜において、ＩＶ型コラーゲンは、デスメ膜（矢印）において検出されたが、たとえあるにしても、実質または実質細胞（主として角膜実質細胞であった）においてほとんど検出されなかった。ＴＧＦβ－１は、角膜内皮細胞（矢頭）において産生されたが、少数の散在した実質細胞においてのみであった。角膜内皮細胞または房水からの実質の中へのＴＧＦβ－１浸透は、インタクトなデスメ膜、及びＩＶ型コラーゲン及びパールカンを包含するその構成要素によって阻害される。この結果は、処理されなかった無傷の偽手術群（図示せず）または経口ビヒクル単独により処理された無傷の偽手術群（図示せず）で同一であった。カラムＢ。デスメ膜剥離手術１か月後ならびに局所ビヒクル及び経口ビヒクルによる処理１か月で、ＩＶ型コラーゲンは、主として筋線維芽細胞及び角膜線維芽細胞が占める実質後部（角括弧によって描かれる）において高レベルで存在したが、主として角膜実質細胞が占める実質のより前部においては存在しなかった。ＴＧＦβ－１は、実質細胞及び実質組織の両方において線維化した実質後部の全体で高レベルで検出された。カラムＣ。デスメ膜剥離手術１か月後及び局所ロサルタン単独による処理１か月で、デスメ膜及び内皮を欠く角膜後部の表面に隣接するところ（矢印）を除いて、ＩＶ型コラーゲンは、実質後部において著しく減少した。ＴＧＦβ－１は、実質後部表面で及び実質後部の全体で多量に存在した。カラムＤ。デスメ膜剥離手術１か月後及び経口ロサルタン単独による処理１か月で、ＩＶ型コラーゲンは、主として筋線維芽細胞及び角膜線維芽細胞が占める実質後部において高レベルで存在したが、主として角膜実質細胞が占める実質のより前部においては存在しなかった。ＴＧＦβ－１は、実質後部表面で及びいくつかの実質細胞において多量に検出された。カラムＥ。デスメ膜剥離手術１か月後ならびに局所ロサルタン及び経口ロサルタンの両方による処理１か月で、ＩＶ型コラーゲンは、実質後部において著しく減少した。ＴＧＦβ－１は、実質後部表面で及びいくつかの実質細胞において高レベルで検出された。青色は、すべての合成画像中でＤＡＰＩである。黄色の破線の四角形は、ＩｍａｇｅＪによるＩＶ型コラーゲンについて定量された領域の例を示し、３つの重複しない四角形の平均が、その角膜についての値として見なされる。
【図3B】各々の群の各々の角膜の角膜後部の表面に接する幅０．７５×高さ０．５の四角形中の、ＩｍａｇｅＪにより分析された実質後部における個別のＩＶ型コラーゲン染色強度のグラフの結果。個別の測定及び各々の群についての平均±標準誤差を示す。局所そして経口のビヒクルカラムの上部の二重対角線は、この群における最高値が、実際にはＹ軸の単位を超えていたことを示す（この角膜についての値は平均６．５８６×１０３強度であった）。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続く群間の事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定の統計的比較は、表５を参照されたい。
【図4A】ロサルタンの化学構造を示す。
【図4B】ロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４の化学構造を示す。
【図4C】テルミサルタンの化学構造を示す。
【図4D】バルサルタンの化学構造を示す。
【図4E】オルメサルタンの化学構造を示す。
【図4F】カンデサルタンの化学構造を示す。
【図5A】直径５ｍｍの濾紙上の１ＮのＮａＯＨへの１分間の曝露の１か月後、及び局所ビヒクル（ＶＥＨ）、０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、１％の酢酸プレドニゾロン、または０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン＋１％の酢酸プレドニゾロンによる１か月の間の１日あたり６回の連続的な処理でのウサギ角膜の標準化された細隙灯写真。各々の角膜における混濁は、中央部のより濃いゾーン（＊）及び周辺のより薄いゾーン（＊＊）で構成されることに注目されたい。矢印は、中央部の角膜の血管新生を示す。点線の円は、中央部のより濃いゾーン及び周辺のより薄いゾーンの組み合わせを含む、個別の角膜についての合計の混濁のＩｍａｇｅＪ分析の例を示す。倍率１５倍。
【図5B】個別の角膜においてＩｍａｇｅＪにより測定された合計の混濁領域のグラフ。平均±平均の標準誤差を、各々の群について示す。＊は、混濁がビヒクルＢＳＳ対照群とは有意に異なっていたことを示す。表８は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図5C】個別の角膜においてＩｍａｇｅＪにより測定されたピクセル強度での合計の混濁のグラフ。平均±平均の標準誤差を、各々の群について示す。＊は、混濁がビヒクルＢＳＳ対照群とは有意に異なっていたことを示す。表９は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図6A】無傷の対照角膜、ならびにアルカリ熱傷の損傷及び局所処理の１か月後のものにおける、角膜実質細胞特異的マーカーケラトカン（緑色）及び筋線維芽細胞特異的マーカーα－ＳＭＡ（赤色）についての二重免疫組織化学。すべてのアルカリ熱傷した角膜において、脆弱な周辺上皮及び持続的な上皮の欠陥が指摘された。ロサルタン単独またはロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用により処理された角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、角膜後部に局在する傾向があり、角膜前部は、ケラトカン陽性角膜実質細胞が再増殖していた。酢酸プレドニゾロン単独により処理された角膜の２つの例が示され、この群において認められる変動を実証する。＃１において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、この角膜の全体の厚さを占め、持続的な上皮の欠陥があった。＃２において、持続的な上皮の欠陥の存在にもかかわらず、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質後部のみにおいて存在していた。すべてのアルカリ熱傷した角膜は、角膜後部の８～１０ｍｍの直径の領域にわたって角膜内皮を欠いていた。矢印は、後部のα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の有る領域を示す。ＬＯＳは、局所ロサルタンである。酢酸Ｐｒｅｄは、１％の酢酸プレドニゾロンである。ＢＳＳ Ｖｅｈは、平衡塩類溶液ビヒクルである。ｅは、上皮である。Ｓは、実質である。
【図6B】各々の群における各々の角膜の中央部の切片においてＩｍａｇｅＪを使用して決定された合計のα－ＳＭＡ陽性実質領域のグラフ。＊は、平均がＢＳＳビヒクル対照群とは有意に異なっていたことを示す。＃は、平均が酢酸プレドニゾロン単独群とは有意に異なっていたことを示す。表１０は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の統計的比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図6C】各々の群における各々の角膜の中央部の切片においてＩｍａｇｅＪを使用して決定された、ピクセルでの角膜切片あたりの合計のα－ＳＭＡ陽性強度のグラフ。＊は、平均がＢＳＳビヒクル対照群とは有意に異なっていたことを示す。＃は、平均が酢酸プレドニゾロン単独群とは有意に異なっていたことを示す。ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群において平均及び平均の標準誤差がより低く、酢酸プレドニゾロンのみの群において平均及び平均の標準誤差がより高いことに注目されたい。表１１は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の統計的比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図7A】実質前部及び実質後部の両方におけるＴＧＦβ－１及びＩＶ型コラーゲンについての二重免疫組織化学。各々の群についての代表的なＩＨＣを示す。矢印は、各々の角膜におけるデスメ膜またはデスメ膜の残余物を示す。実質前部（実質前部表面で四角形の長辺）及び実質後部（実質後部表面で四角形の長辺、デスメ膜またはその残余物の直前）の両方についての代表的なＩｍａｇｅＪ定量化四角形（１００×５０単位）。ＴＧＦβ－１における差異は、群間で指摘されなかった。
【図7B】群における実質前部のＩＶ型コラーゲンのＩＨＣ強度単位のＩｍａｇｅＪ定量化。＊及び＊＊は、平均がビヒクル群とは有意に異なっていたことを示す。表１２は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の統計的比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図7C】群における実質後部におけるＩＶ型コラーゲンのＩＨＣ強度単位のＩｍａｇｅＪ定量化。＊は、平均がビヒクル群とは有意に異なっていたことを示す。表１２は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅに続く群間の統計的比較のための事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定ｐ値を示す。
【図8】角膜血管新生（ＣＮＶ）における最初の静脈内フルオレセイン充填の角膜血管造影画像。黄色の線は、角膜血管新生の無い各々の角膜のおよその領域の輪郭を描く。いくつかの眼において、瞬膜または眼瞼は、周辺角膜の部分をカバーしており、ＣＮＶの無い周辺領域は、細隙灯の直接的な検査から指摘されるように概算された。拡大２０倍。
【図9】ＩｍａｇｅＪにより分析して、合計のα－ＳＭＡ陽性実質領域及びピクセルでの合計のα－ＳＭＡ強を決定した、各々の角膜からの代表的な中央部の切片におけるα－ＳＭＡについての免疫組織化学。矢印は、ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用で処理した角膜の実質の最も後部のみにおいて存在した局在領域のα－ＳＭＡ染色を示す。
【図10A】－９Ｄ ＰＲＫ、及びビヒクルまたはロサルタンによる１か月の間の局所処理後の細隙灯混濁。各々の角膜の標準化された細隙灯写真。光反射がすべて類似の位置に所在することに注目されたい。黄色の点線の円は、混濁の平均の合計のピクセルを決定するためにＩｍａｇｅＪにより分析された各々の角膜画像のエキシマレーザーアブレーションゾーン内の３．５ｍｍの直径の中央部の領域を示す。
【図10B】ＩｍａｇｅＪにより分析された角膜内の平均の中央部混濁ピクセルのグラフ。ロサルタン処理角膜に比較して、ビヒクル処理角膜において、より高い平均及びより大きいばらつき（より大きい標準誤差）であることに注目されたい。
【図11A】各々の角膜の中央の０．５ｍｍにおける、筋線維芽細胞マーカーα－ＳＭＡ及び角膜実質細胞マーカーケラトカンについての二重免疫組織化学（図１０Ａ～Ｂと同じ標識）。各々の角膜について、α－ＳＭＡ及びケラトカンについてのＩＨＣ、そしてすべての細胞核のＤＡＰＩ染色との合成物を、ＩｍａｇｅＪによるα－ＳＭＡ染色の合計のピクセルについて分析されたα－ＳＭＡ単独を示す対応するパネルと一緒に示す。黄色の破線のボックスは、各々の角膜の中央の０．５ｍｍにおける、すべてのα－ＳＭＡ染色を取り込んだＩｍａｇｅＪによる分析の領域を示す。＊は、切片作成の間に大部分の角膜において起こった実質からの上皮の人為的なずれの例を示す。これは、手術の１か月後で－９Ｄ ＰＲＫを有するほぼすべてのウサギ角膜において存在するＥＢＭの不完全な再生におそらく関連していた。６、７青色は、すべてパネル中で細胞核のＤＡＰＩ染色である。両方の群の多くのパネルにおいて、ＤＡＰＩ陽性核を有するが、ＳＭＡ陰性及びケラトカン陰性である実質中の細胞は、おそらく主として角膜線維芽細胞であるが、ある程度の免疫細胞はＰＲＫ後の１か月でも存続し得る。
【図11B】Ａ中で示した四角形のＩｍａｇｅＪ分析により決定された合計のα－ＳＭＡピクセルのグラフ。ロサルタン処理群に比較して、ビヒクル処理群におけるより高い平均及びまたビヒクル処理群におけるより大きいばらつき（より大きい標準誤差）に注目されたい。
【図12A】中央部の角膜におけるＩＶ型コラーゲン（緑色）及びＴＧＦβ－１（マゼンタ）についての代表的な二重鎖免疫組織化学。無傷の角膜において、ＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬ ＩＶ）は、上皮基底膜（矢印）及びデスメ膜（矢頭）に主として局在し、実質においてほとんど検出されなかった。－９Ｄ ＰＲＫの１か月後のビヒクル処理群において、ＣＯＬ ＩＶは、上皮基底膜（矢印によって示される）の後部の幅広いバンドにおいてそして無傷のデスメ膜において存在していた。－９Ｄ ＰＲＫの１か月後のロサルタン処理群において、ＣＯＬ ＩＶは、上皮基底膜（矢印）に局在し、比較的少量のみが下にある実質において検出された。デスメ膜（このロサルタン処理角膜については示されない）も、多量のＣＯＬ ＩＶを有していた。各々の－９Ｄ ＰＲＫ角膜についてのＣＯＬ ＩＶのみのパネルにおいて、点線の四角形は、両方の処理群における各々の角膜のすべての実質のＩＶ型コラーゲンを囲む、ＩｍａｇｅＪにおける９００ピクセル×２３５ピクセル分析の四角形である。ｅは、上皮である。青色は、すべてのパネル中でＤＡＰＩである。
【図12B】四角形（Ａ中で示されるような）のＩｍａｇｅＪ分析により決定された合計のＣＯＬ ＩＶピクセルのグラフ。ビヒクル処理群に比較して、ロサルタン処理群における合計のＣＯＬ ＩＶ染色ピクセルの著しいダウンレギュレーションに注目されたい（ｐ＝０．００４）。
【0036】
定義
本明細書において使用される時、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、治療、研究、分析、試験、または診断される、ヒト及び非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、家禽など）を包含するがこれらに限定されない任意の動物を指す。
本明細書において使用される時、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、治療、研究、分析、試験、または診断される、ヒト及び非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、家禽など）を包含するがこれらに限定されない任意の動物を指す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明は、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、アジルサルタン、またはロサルタン代謝物質ＥＸＰ３１７４）を含む組成物を使用して、角膜損傷及び／または既存の角膜瘢痕の対象を治療するための組成物、系、及び方法に関する。ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストは、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。
【0038】
本開示の実施形態の開発の間に遂行された研究において、局所ロサルタンは、角膜のより前部から中間部の損傷（外傷、化学熱傷、微生物感染、及びレーザー屈折矯正角膜切除術または治療的レーザー角膜切除術等の手術等）または角膜のより後部の損傷（白内障もしくは他の手術、デスメ膜剥離手術、または内皮炎の間の内皮外傷等）によって誘発される限定的な筋線維芽細胞の発達及び線維化に有効であり得ることが示された。外傷、化学熱傷、微生物感染、手術、または疾患は、角膜の任意の層に関与し得る。本開示の実施形態の開発の間に遂行された他の研究において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及びコルチコステロイド併用が、眼外傷の治療において有効であることが示された。
【0039】
ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト及び／またはコルチコステロイドは、水（例えば約９０％の水）及び油性賦形剤（例えば涙液膜の脂質層を復元し、乾燥から水層を保護することによって、眼表面の利益になる）を含む、１つまたは複数の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、組成物は、水中油型エマルション（例えばＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）、Ｌａｃｒｉｎｍｕｎｅ（登録商標）、及びＩｋｅｒｖｉｓ（登録商標）などだが、ＣｓＡの代わりにＡＣＥ－２受容体阻害物質及び／またはコルチコステロイドを含有する）またはミセルベースの溶液（例えばＰａｐｉｌｏｃｋ Ｍｉｎｉ（登録商標）、Ｍｏｄｕｓｉｋ－Ａ Ｏｆｔｅｎｏ（登録商標）、及びＴａｅｊｏｏｎ［ＴＪ］Ｃｙｐｏｒｉｎ（登録商標）などだが、ＣｓＡの代わりにＡＣＥ－２受容体阻害物質及び／またはコルチコステロイドを含有する）の形態である。特定の実施形態において、組成物は、以下の：ｉ）可溶化剤／促進物質（例えばヒマシ油、中鎖トリグリセリド、ポリオキシリイ（ｐｏｌｙｏｘｌｙ）－４０ステアリン酸塩エタノール、ポリソルベート８０エタノール、またはトウモロコシ油）、ｉｉ）界面活性物質（例えばポリソルベート８０、チロキサポール、ポロキサマー１８８、または塩化セタルコニウム）、ｉｉｉ）防腐物質（例えばホウ酸またはソルビン酸）、ｉｖ）安定化物質（例えばカルボマーコポリマーＡ型、またはナトリウムＥＤＴＡ）、ｖ）粘度調節物質（例えばヒプロメロースまたはヒアルロン酸ナトリウム）、ｖｉ）ｐＨ調節物質（例えばＮａＯＨ、ＮａＨ２ＰＯ４、または重亜硫酸ナトリウム）、ｖｉｉ）浸透圧剤（例えばグリセロールまたはＮａＣｌ）、及び／またはｖｉｉｉ）希釈物質（例えば水、ペトロラタム、ラノリン、またはアルコール）うちの１つまたは複数を含有する。
【0040】
ある特定の実施形態において、角膜損傷（無治療での放置に比較して）または治療された既存の角膜瘢痕の改善は、Ｆａｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，１９９０，１０８（５）：６６５－６７５（参照することによって本明細書に援用される）中で記載されるようにＦａｎｔｅｓ細隙灯角膜ヘイズスコアによって測定され、以下の表６中で示される。
【表1】
【0041】
本開示は任意の特定のメカニズムへ限定されるものではないが、以下の実施例中で記載される経口ロサルタンは、局所送達により達成される濃度に比較して、角膜実質において十分な濃度に達しなかったので、ＤＭＲ後の角膜の瘢痕性線維化の減少において有効ではなかったと考えられる。経口ロサルタンが１９９５年にＦＤＡによって承認されて以来、高血圧または他の疾患のために何百万人もの患者によって使用されており、角膜の瘢痕性線維化に対する有益な効果は報告されていないので、このことは意外ではない。
【0042】
アブレージョンまたは他の外傷によって等の角膜上皮へのダメージは、急速に分裂する上皮細胞の増殖によって迅速に修復される（通常２４～４８時間以内に）。しかしながら、角膜上皮細胞のこの急速な分裂増殖には、瘢痕組織の発達がしばしば付随する。角膜における瘢痕組織の存在は、「角膜ヘイズ」（光が角膜を介して通過できないことに起因して視力が劇的に低減される角膜の混濁化）をもたらす。角膜混濁の治療は、瘢痕組織形成の程度に応じて変動する。瘢痕化が軽度でのままで、角膜の表面のみに影響する症例において、手術またはレーザー除去が、治療として使用される。瘢痕組織が角膜の中へより深く広がる状況において、組織全体の除去及び新しい角膜の移植が、多くの場合使用される。したがって、損傷後のこの組織における瘢痕化の予防は、視力の温存における重要なステップである。
【0043】
多くの角膜損傷は、典型的には、角膜の瘢痕化を生ずることが公知である。これらは、３つの大きなカテゴリー：外傷、感染、及び疾患病態へと分類され、そのすべては、本明細書の薬剤によって治療されることが企図される。自然な外傷（アブレージョンまたは化学熱傷等）、そして視力の医学的矯正と関連する外傷（フォトアブレーション、またはコンタクトレンズに誘導された損傷等）は、正常な角膜上皮の破壊を引き起こし、これらの細胞の迅速な増殖及び多くの場合瘢痕組織の形成をもたらす。手術（移植等）からもたらされる角膜へのダメージも、通常はこの組織の瘢痕化を導く。
【0044】
細菌、ウイルス、真菌、アカントアメーバ、及び他の生物体による眼の感染も、瘢痕化を導き得る。例えば、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、肺炎双球菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の株による眼の感染は、角膜の表面上に潰瘍形成を引き起こすことが公知である。かかる潰瘍は、周囲の上皮層を破壊するだけでなく、さらに角膜実質に浸透し、ダメージを与え、急性炎症細胞、及び損傷された上皮細胞自体によって放出されたコラゲナーゼによってさらに支援される。角膜及び周囲の組織へのかかる深く広範囲なダメージは、大規模な瘢痕化をもたらす。他の非潰瘍性病原体も角膜の瘢痕化を導くことが公知である。かかる生物体の１つは、帯状疱疹ウイルス（帯状疱疹）であり、この生物体による感染は、しばしば瘢痕化をもたらす。
【0045】
病原体または外傷によって直ちに引き起こされない多くの疾患病態も、瘢痕化に起因する角膜混濁に関与する。かかる病態の２つは、瘢痕性類天疱瘡及びスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）である。瘢痕性類天疱瘡は、口腔粘膜及び眼の結膜に影響する自己免疫性水疱性疾患であり、その場合角膜上皮の炎症は、瘢痕化を導く。ＳＪＳは、多形性紅斑の重度の形態（免疫複合体媒介性超過敏反応）である。この疾患の眼の所見は、上皮の潰瘍形成そしてそれに続く重度の瘢痕化である。
【0046】
大多数の患者は、エキシマレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）に続いて、様々な程度の角膜ヘイズを発症する。角膜ヘイズは、典型的には２～４か月でピークに達し、近視の矯正度にともなって増加することが指摘されている。かかるヘイズは、１ライン以上のＰＲＫ後の最高矯正視力の喪失を導き得る。角膜実質リモデリングは、ＰＲＫ後の角膜ヘイズの程度に影響し、角膜ヘイズは、可能な最高矯正視力における低減、屈折矯正についての退行、及び試みられた矯正についての予測可能性の低さの原因であると考えられる。ＰＲＫ後の角膜ヘイズの形成は、レーザー角膜アブレーション及び実質の創傷治癒の結果である。ＰＲＫ技術（例えばレーザー－組織相互作用、レーザービームの光学プロファイリング、マルチゾーンマルチパスアプローチ、及びエッジスムージング技法）の理解で見られた著しい進歩にもかかわらず、ＰＲＫと関連する生物学的な側面（創傷治癒等）の特徴付けには、依然としてＰＲＫ技術と関連する重要な限定が存在する。
【0047】
ある特定の実施形態において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニスト（例えばロサルタン）を含有する本明細書の組成物は、内皮置換外科療法（例えばＤＳＡＥＫ及びＤＭＥＫ等）後に３１、３２、特に、移植組織が、意図された土台から部分的にずれ、実質後部の領域がデスメ膜及び内皮によりカバーされないようになる場合に１９、２２、発達し得る角膜後部の線維化を調節するために使用される。重度の炎症（アルカリ熱傷等）と関連する角膜疾患において、ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含有する本明細書における組成物は、コルチコステロイドが、線維細胞筋線維芽細胞前駆細胞のアポトーシスも誘発し２０、重度の炎症が、角膜混濁の原因でもある角膜実質の線維及びあるマトリックスにダメージを与える２２ので、非常に有効な治療であり得る。本明細書の組成物（ＡＣＥ－２受容体アンタゴニストを含有する）が、予防的に実質の線維化の発達を阻害するのに及び一旦それが発達したならば、治療的に線維化を処置するのに有効であり得る他のいくつかの例示的な角膜疾患としては、ウイルス性角膜炎、細菌性角膜炎、真菌性角膜炎、及びアカントアメーバ性角膜炎、角膜外傷、化学熱傷、ならびに他の角膜手術誘導線維化が挙げられる。筋線維芽細胞が病態生理学（トラコーマのような結膜瘢痕化障害３３及び緑内障濾過手術後の結膜濾過胞の線維化３４等）における役割を有する眼の前眼部の他の領域における線維化を阻害するためにも、本明細書の組成物が使用され得る。
【実施例】
【0048】
実施例１
局所ロサルタンは、損傷後の角膜の瘢痕性線維化を阻害する
本実施例は、デスメ膜剥離手術（中央部のデスメ膜及び角膜内皮の除去）後のウサギ角膜において発達した角膜実質の線維化に対する局所及び／または経口のＴＧＦ－β遮断物質ロサルタンの効果を検討及び記載する。２８匹のニュージーランドホワイトウサギが含まれ、１つの眼において８ｍｍの中央のデスメ膜剥離手術またはデスメ膜剥離手術無しの偽の対照手術のいずれかを行った。デスメ膜剥離手術無しの４つの眼の群を、医薬物無し、局所ロサルタン、または経口ロサルタンにより１か月の間処理した。デスメ膜剥離手術を行った４つの眼の群を、局所及び経口のビヒクル、局所ロサルタン、経口ロサルタン、または局所ロサルタン及び経口ロサルタンの両方により１か月の間処理した。標準化された細隙灯写真を、ＩｍａｇｅＪにより測定した中央部の混濁強度と共に得た。角膜の後部の線維化したゾーンを、ＱｕＰａｔｈ分析を使用して、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）及びケラトカンの免疫組織化学について測定した。角膜後部におけるＩＶ型コラーゲン発現を、ＩｍａｇｅＪならびにＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての二重免疫組織化学により定量した。デスメ膜剥離手術後に、経口でないが局所のロサルタンは、デスメ膜剥離手術及びビヒクル単独による処理を行った角膜に比較して、中央部の実質の混濁の強度を減少させ、周辺の角膜瘢痕化を低減させた。局所ロサルタンは、デスメ膜剥離手術後に発達した角膜血管新生も低減させた。局所ロサルタンは、デスメ膜剥離手術１か月後のビヒクル処理に比較して、実質後部の細胞のＩＶ型コラーゲン産生を減少させた。
局所ロサルタンは、損傷後の角膜の瘢痕性線維化を阻害する
本実施例は、デスメ膜剥離手術（中央部のデスメ膜及び角膜内皮の除去）後のウサギ角膜において発達した角膜実質の線維化に対する局所及び／または経口のＴＧＦ－β遮断物質ロサルタンの効果を検討及び記載する。２８匹のニュージーランドホワイトウサギが含まれ、１つの眼において８ｍｍの中央のデスメ膜剥離手術またはデスメ膜剥離手術無しの偽の対照手術のいずれかを行った。デスメ膜剥離手術無しの４つの眼の群を、医薬物無し、局所ロサルタン、または経口ロサルタンにより１か月の間処理した。デスメ膜剥離手術を行った４つの眼の群を、局所及び経口のビヒクル、局所ロサルタン、経口ロサルタン、または局所ロサルタン及び経口ロサルタンの両方により１か月の間処理した。標準化された細隙灯写真を、ＩｍａｇｅＪにより測定した中央部の混濁強度と共に得た。角膜の後部の線維化したゾーンを、ＱｕＰａｔｈ分析を使用して、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）及びケラトカンの免疫組織化学について測定した。角膜後部におけるＩＶ型コラーゲン発現を、ＩｍａｇｅＪならびにＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての二重免疫組織化学により定量した。デスメ膜剥離手術後に、経口でないが局所のロサルタンは、デスメ膜剥離手術及びビヒクル単独による処理を行った角膜に比較して、中央部の実質の混濁の強度を減少させ、周辺の角膜瘢痕化を低減させた。局所ロサルタンは、デスメ膜剥離手術後に発達した角膜血管新生も低減させた。局所ロサルタンは、デスメ膜剥離手術１か月後のビヒクル処理に比較して、実質後部の細胞のＩＶ型コラーゲン産生を減少させた。
【0049】
筋線維芽細胞の発達及び瘢痕性の実質の線維化は、角膜の前部及び後部への損傷後に、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β及びおそらく他の増殖因子（血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等）によって媒介される（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｗｉｌｓｏｎ，２０１９）。角膜後部の線維化についての最近特徴付けられたモデルは、ウサギにおけるデスメ膜－内皮複合体の一部分のデスメ膜剥離手術による除去である（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。房水は、おそらく、デスメ基底膜の増殖因子調節機能の非存在下において、角膜線維芽細胞及び線維細胞からの筋線維芽細胞の発達を、後続して駆動するＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２の重要な供給源である（Ｍｅｄｅｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
【0050】
ロサルタンは、高血圧、糖尿病性腎臓病、心不全、及び左心室拡張を治療するために使用される経口薬である（Ｓｉｍｐｓｏｎ ａｎｄ ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，２０００）。ロサルタンは、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストである（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、が、またＴＧＦβの阻害物質であることが示された（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌａｖｏｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｙｌｉｅ－Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本研究の目的は、以前に示されたウサギのデスメ膜剥離手術モデルを使用する角膜損傷が、角膜後部の筋線維芽細胞の発達及び線維化を誘発した後に、ロサルタンが瘢痕性線維化を阻害したかどうかを決定することであった。本研究は、ウサギにおけるデスメ膜剥離手術損傷後に、経口でないが局所のロサルタンが、実質の混濁、実質の線維化、及び実質のＩＶ型コラーゲン産生を有意に減少させることを示す。
【0051】
方法
動物
動物に関するすべての手順は、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）及びＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｙ（Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。すべての動物は、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。本研究には、各々が２．５～３．０ｋｇの体重である１０～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ２８匹（各々の群中で４匹）が含まれていた。
動物
動物に関するすべての手順は、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）及びＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｙ（Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。すべての動物は、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。本研究には、各々が２．５～３．０ｋｇの体重である１０～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ２８匹（各々の群中で４匹）が含まれていた。
【0052】
中央部のデスメ膜（ＤＭ）－内皮複合体の切除（デスメ膜剥離手術）
３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射によって、ウサギに全身麻酔した。加えて、局所塩酸プロパラカイン１％（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、手術の前に各々の眼に適用した。各々の群中のランダムに選択された１つの角膜に、デスメ膜剥離手術無しの偽手術または８ｍｍの直径の中央部のデスメ膜－内皮切除を行った。手術１か月後の時間点を研究のために選択したが、それは、以前の時間経過のデスメ膜剥離手術研究において、角膜後部における筋線維芽細胞及び線維化がこの時間点で最大だったからである（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。先行研究において記載されるように、デスメ膜剥離手術を遂行した（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、ワイヤーリッドスペキュラを各々のウサギの１つの眼の中へ配置し、参照のために８ｍｍの直径ゲンチアナバイオレットの円を上皮表面上にマークした。輪部刺入の切開を、１．６ｍｍのブレード（Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）により生成し、０．３ｍｌのＨｅａｌｏｎ ＯＶＤ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、前眼房の中へ注射した。逆シンスキーフック（Ｋａｔｅｎａ、Ｄｅｎｖｉｌｌｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を、前眼房の中へ配置し、以前に角膜前部表面上でマークされた８ｍｍの領域の下にあるデスメ膜及び内皮の８ｍｍの直径ディスクを切除し、後続する内皮角膜移植は、無しであった。デスメ膜または内皮の除去は、無傷の偽手術眼においては遂行しなかった。残存するＨｅａｌｏｎ ＯＶＤを、Ｓｉｍｃｏｅ潅注及び吸引カニューレ（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、Ｓｔｏｒｚ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）により除去し、前眼房を平衡塩類溶液（ＢＳＳ）により充填した。前眼房からの漏出を予防するために、シングル１０－０ナイロン縫合糸を切開部位に置いた。１滴のシプロフロキサシン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、手術直後に、及びおよそ２日の上皮刺入創の治癒までに１日４回角膜に適用した。
３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射によって、ウサギに全身麻酔した。加えて、局所塩酸プロパラカイン１％（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、手術の前に各々の眼に適用した。各々の群中のランダムに選択された１つの角膜に、デスメ膜剥離手術無しの偽手術または８ｍｍの直径の中央部のデスメ膜－内皮切除を行った。手術１か月後の時間点を研究のために選択したが、それは、以前の時間経過のデスメ膜剥離手術研究において、角膜後部における筋線維芽細胞及び線維化がこの時間点で最大だったからである（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。先行研究において記載されるように、デスメ膜剥離手術を遂行した（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、ワイヤーリッドスペキュラを各々のウサギの１つの眼の中へ配置し、参照のために８ｍｍの直径ゲンチアナバイオレットの円を上皮表面上にマークした。輪部刺入の切開を、１．６ｍｍのブレード（Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）により生成し、０．３ｍｌのＨｅａｌｏｎ ＯＶＤ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、前眼房の中へ注射した。逆シンスキーフック（Ｋａｔｅｎａ、Ｄｅｎｖｉｌｌｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を、前眼房の中へ配置し、以前に角膜前部表面上でマークされた８ｍｍの領域の下にあるデスメ膜及び内皮の８ｍｍの直径ディスクを切除し、後続する内皮角膜移植は、無しであった。デスメ膜または内皮の除去は、無傷の偽手術眼においては遂行しなかった。残存するＨｅａｌｏｎ ＯＶＤを、Ｓｉｍｃｏｅ潅注及び吸引カニューレ（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、Ｓｔｏｒｚ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）により除去し、前眼房を平衡塩類溶液（ＢＳＳ）により充填した。前眼房からの漏出を予防するために、シングル１０－０ナイロン縫合糸を切開部位に置いた。１滴のシプロフロキサシン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、手術直後に、及びおよそ２日の上皮刺入創の治癒までに１日４回角膜に適用した。
【0053】
手術直後に開始し、群に応じて（表１）、デスメ膜剥離手術及び無傷の対照の眼を、３０μｌ のｐＨ７．０の生理食塩水中の０．４ｍｇ／ｍｌのロサルタン（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、または３０μｌのｐＨ７．０のビヒクル生理食塩水により１日あたり６回（午前８～午後６時の２時間毎）処理した。
【表2】
【0054】
経口ロサルタンを投与された動物に、シリンジを備えた経口アプリケーターを使用して、経口溶液中の５ｍｇ／ｋｇ、または経口ビヒクル溶液単独を、午前８時、午後１時、及び午後６時に１日あたり３回投与した。経口溶液を、５ｍｌの蒸留水＋５０ｍｌのｏｒａ－ｐｌｕｓ（懸濁ビヒクル－Ｐｅｒｒｉｇｏ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）＋４５ｍｌのＯｒａ－ｓｗｅｅｔ（香味の付いたシロップビヒクル－Ｐｅｒｒｉｇｏ）により調製した。
【0055】
標準化された細隙灯写真及び瘢痕強度のＩｍａｇｅＪ分析
処理の１か月後に、研究の眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）により３０分間拡大させた。全身麻酔後に、各々のウサギにおける研究の眼で、同一の照明位置及び強度を使用して、Ｈａａｇ Ｓｔｒｅｉｔ（Ｍａｓｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）ＢＸ９００細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で標準化された細隙灯写真を撮った。各々の研究の眼について、２．５ｍｍの直径の中央部の円の強度（光反射を含まず、図１中で示される例）を、ＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェアを使用して決定した。混濁の強度の統計的比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
処理の１か月後に、研究の眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）により３０分間拡大させた。全身麻酔後に、各々のウサギにおける研究の眼で、同一の照明位置及び強度を使用して、Ｈａａｇ Ｓｔｒｅｉｔ（Ｍａｓｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）ＢＸ９００細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で標準化された細隙灯写真を撮った。各々の研究の眼について、２．５ｍｍの直径の中央部の円の強度（光反射を含まず、図１中で示される例）を、ＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェアを使用して決定した。混濁の強度の統計的比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
【0056】
角膜固定、免疫組織化学、及び線維化領域分析
手術及び処理の１か月後に、１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）の静脈注射を、全身麻酔下の動物の安楽死のために与えた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２の鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、角膜に触れずに、偽手術の無傷眼及びＤＭＲ眼の角膜－強膜縁を除去した。各々の角膜を、２４×２４×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央にセットし、型を液体ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で充填した。型及び角膜－強膜縁をドライアイス上で急速凍結し、切片を切るまで－８０℃で保存した。
手術及び処理の１か月後に、１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）の静脈注射を、全身麻酔下の動物の安楽死のために与えた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２の鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、角膜に触れずに、偽手術の無傷眼及びＤＭＲ眼の角膜－強膜縁を除去した。各々の角膜を、２４×２４×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央にセットし、型を液体ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で充填した。型及び角膜－強膜縁をドライアイス上で急速凍結し、切片を切るまで－８０℃で保存した。
【0057】
各々のＯＣＴブロックを角膜の正確な中央で二等分し、８μｍの厚みの横断切片を、クリオスタット（ＨＭ ５０５Ｍ；Ｍｉｃｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により以前のＤＭＲ損傷または無傷の偽手術の角膜内の中央部の角膜から切り、１スライドあたり３つの切片を、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍのＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡用スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）上に置いた。スライドを免疫組織化学まで－２０℃で維持した。
【0058】
二重免疫組織化学（ＩＨＣ）を、以前に記載された方法（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）を使用して、分析に関与しない研究者によるスライドのマスキング後に遂行し、ウサギ抗原を認識することがウエスタンブロット及びＩＨＣによって確認された一次抗体（表２）またはアイソタイプ対照抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ならびに二次蛍光タグ抗体（表３）を使用した。
【表3】
【表4】
【0059】
本研究において使用されるＡＢ７６９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ ＣＡ）ＩＶ型コラーゲン抗体は、精製されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンに対して生成され、アガロースへ架橋されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンにより親和性精製され、製造者によってヒト及びウシのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、及びＶＩ型のコラーゲンで交差吸収して、交差反応性が除去された。この抗体は、ＩＨＣにおいてウサギのＩＶ型コラーゲンを結合することが以前に示された（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．、印刷中）。ケラトカン抗体を、ペプチドＨ２Ｎ－ＬＲＬＤＧＮＥＩＫＰＰＩＰＩＤＬＶＡＣ－ＯＨ（配列番号１）に対して作製した。ＴＧＦβ－１（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）への抗体は、ＩＨＣにおいてウサギＴＧＦβ－１に結合し、ＴＧＦβ－２またはＴＧＦβ－３への反応性を示さない（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
【0060】
ＳＭＡ陽性線維化実質後部の領域を、ＬＡＳ Ｘソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、自動ステージ及びＬｅｉｃａ ７０００Ｔのカメラを装備したＬｅｉｃａ ＤＭ６Ｂ正立顕微鏡上で１０倍対物レンズによる標準化された写真撮影によって、分析者へマスクされた元の群で定量した。ＳＭＡ陽性実質後部の線維化の領域を、以前に記載された方法を使用して、較正されたＱｕＰａｔｈ ｖ０．２．３ソフトウェアにより角膜切片上の領域を手動でアウトラインを描くことによって測定した（Ｂａｎｋｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＳＭＡ陽性領域についての統計的分析を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
【0061】
免疫組織化学画像におけるＩＶ型コラーゲン強度を、すべての切片に適用した標準化された顕微鏡照明設定を使用して生成された７．６２ｃｍの幅×５．６９ｃｍの高さ及び３００ＤＰＩ画像上でＩｍａｇｅＪを使用して、角膜後部の表面に接する実質後部の幅０．７５×高さ０．５の四角形において定量した。分析された試料においてデスメ膜存在するならば、四角形の後部側が、デスメ膜の直前の角膜後部の表面へ接するように、定量化四角形を位置させた。デスメ膜剥離手術または偽手術の無傷の角膜の対応する領域内の３つの非重複四角形のＩＶ型平均コラーゲン強度を、その角膜についての値として使用した。すべての群間の統計的比較についてのｐ値を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続く事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定により遂行した。
【0062】
結果
細隙灯写真及び中央部の角膜における混濁
処理１か月後の異なる群からの代表的な標準化された細隙灯写真を、図１中で示す。１日あたり３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタン（Ａ）、または１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタン（Ｂ）のいずれも、偽手術の無傷の角膜の透明度に対する効果がなかった。デスメ膜剥離手術ならびに１日あたり３回の経口ビヒクル溶液及び１日あたり６回の局所ビヒクル溶液による処理（Ｃ）の１か月後に、すべての角膜は、顕著な血管新生を備えて輪部へ広がる重度の瘢痕性線維化を有していた。デスメ膜剥離手術１か月後及び１か月の間の１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンによる処理（Ｄ）時に、デスメ膜剥離手術及びビヒクル処理を行った対照角膜に比較して、瘢痕性線維化及び血管新生の差はなかった。デスメ膜剥離手術１か月後及び１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｋｇの局所ロサルタンによる処理（Ｅ）時に、瘢痕性線維化の全体的な減少があり、中央部の混濁の強度の減少し、周辺角膜における透明度により虹彩細部が明瞭に観察されることが可能なり、実質の中間の混濁が透明化する領域があった。デスメ膜剥離手術１か月後ならびに１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｋｇの局所ロサルタン及び１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンによる処理（Ｆ）時に、角膜混濁及び血管新生の変化は、局所ロサルタン単独による処理により示されるものとは異なっていなかった。
細隙灯写真及び中央部の角膜における混濁
処理１か月後の異なる群からの代表的な標準化された細隙灯写真を、図１中で示す。１日あたり３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタン（Ａ）、または１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタン（Ｂ）のいずれも、偽手術の無傷の角膜の透明度に対する効果がなかった。デスメ膜剥離手術ならびに１日あたり３回の経口ビヒクル溶液及び１日あたり６回の局所ビヒクル溶液による処理（Ｃ）の１か月後に、すべての角膜は、顕著な血管新生を備えて輪部へ広がる重度の瘢痕性線維化を有していた。デスメ膜剥離手術１か月後及び１か月の間の１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンによる処理（Ｄ）時に、デスメ膜剥離手術及びビヒクル処理を行った対照角膜に比較して、瘢痕性線維化及び血管新生の差はなかった。デスメ膜剥離手術１か月後及び１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｋｇの局所ロサルタンによる処理（Ｅ）時に、瘢痕性線維化の全体的な減少があり、中央部の混濁の強度の減少し、周辺角膜における透明度により虹彩細部が明瞭に観察されることが可能なり、実質の中間の混濁が透明化する領域があった。デスメ膜剥離手術１か月後ならびに１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｋｇの局所ロサルタン及び１日３回の５ｍｇ／ｋｇの経口ロサルタンによる処理（Ｆ）時に、角膜混濁及び血管新生の変化は、局所ロサルタン単独による処理により示されるものとは異なっていなかった。
【0063】
中央部の角膜の２．５ｍｍの円における混濁の強度が、ＩｍａｇｅＪにより定量された場合に（図１Ｇ）、１か月の間の局所ビヒクル及び経口ビヒクルの溶液と共にデスメ膜剥離手術を行った群、または１か月の間の経口ロサルタン単独と共にデスメ膜剥離手術を行った群に比較して、１か月の間の局所ロサルタンと共にデスメ膜剥離手術、または１か月の間の局所ロサルタン及び経口ロサルタンと共にデスメ膜剥離手術を行った群において、有意な減少（Ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定）があった。１か月の間の局所ロサルタンと共にデスメ膜剥離手術を行った群と１か月の間の局所ロサルタン及び経口ロサルタンと共にデスメ膜剥離手術を行った群との間に、中央部の角膜における混濁の強度の有意差はなかった。
【0064】
α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）筋線維芽細胞マーカー及びケラトカン角膜実質細胞マーカーについての免疫組織化学
ＳＭＡ及びケラトカンについての免疫組織化学についての代表的な結果を図２中で示す。デスメ膜剥離手術ならびに１か月の間の局所ビヒクル及び経口ビヒクルによる処理を行った角膜（Ａ、Ｂ）は、ＳＭＡ筋線維芽細胞マーカーのＩＨＣによって輪郭が描かれる顕著な角膜後部の線維化を有していた。デスメ膜剥離手術及び１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンによる処理を行った角膜（Ｃ、Ｄ）すべては、角膜後部においてＳＭＡ陽性線維化ゾーンの著しい減少を有していた。図２Ｄ中で示される角膜は、任意の群中のデスメ膜剥離手術を行った任意の角膜における後部線維化の領域が最も小さかった。デスメ膜剥離手術及び１か月の間の１日あたり３回の経口５ｍｇ／ｋｇのロサルタンによる処理を行った角膜（Ｅ、Ｆ）は、１か月の間の局所及び経口のビヒクル溶液により処理したデスメ膜剥離手術の角膜に類似した後部線維化を有していた。デスメ膜剥離手術ならび両方の１か月の間の１日あたり６回の局所ロサルタン及び１日あたり３回の経口ロサルタンによりにより処理した角膜（Ｇ、Ｈ）も、角膜後部におけるＳＭＡ陽性線維化の減少を有していたが、デスメ膜剥離手術及び局所ロサルタン単独による処理を行った角膜とは有意に異なっていなかった。１日３回の経口ロサルタン（Ｉ、Ｊ）または１日６回の局所ロサルタンのいずれかにより処理した無傷の角膜（Ｋ、Ｌ）は、ＳＭＡ陽性後部角膜線維化を生じなかった。
ＳＭＡ及びケラトカンについての免疫組織化学についての代表的な結果を図２中で示す。デスメ膜剥離手術ならびに１か月の間の局所ビヒクル及び経口ビヒクルによる処理を行った角膜（Ａ、Ｂ）は、ＳＭＡ筋線維芽細胞マーカーのＩＨＣによって輪郭が描かれる顕著な角膜後部の線維化を有していた。デスメ膜剥離手術及び１か月の間の１日あたり６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンによる処理を行った角膜（Ｃ、Ｄ）すべては、角膜後部においてＳＭＡ陽性線維化ゾーンの著しい減少を有していた。図２Ｄ中で示される角膜は、任意の群中のデスメ膜剥離手術を行った任意の角膜における後部線維化の領域が最も小さかった。デスメ膜剥離手術及び１か月の間の１日あたり３回の経口５ｍｇ／ｋｇのロサルタンによる処理を行った角膜（Ｅ、Ｆ）は、１か月の間の局所及び経口のビヒクル溶液により処理したデスメ膜剥離手術の角膜に類似した後部線維化を有していた。デスメ膜剥離手術ならび両方の１か月の間の１日あたり６回の局所ロサルタン及び１日あたり３回の経口ロサルタンによりにより処理した角膜（Ｇ、Ｈ）も、角膜後部におけるＳＭＡ陽性線維化の減少を有していたが、デスメ膜剥離手術及び局所ロサルタン単独による処理を行った角膜とは有意に異なっていなかった。１日３回の経口ロサルタン（Ｉ、Ｊ）または１日６回の局所ロサルタンのいずれかにより処理した無傷の角膜（Ｋ、Ｌ）は、ＳＭＡ陽性後部角膜線維化を生じなかった。
【0065】
図２Ｍ中のグラフは、各々の群における各々の角膜の後部線維化ゾーンの領域の定量化の結果を示す。無傷の角膜のうちの任意のものにおいて、それらに、非処理、１日あたり６回の局所ロサルタン、または１日あたり３回の経口ロサルタンを行っても、ＳＭＡ陽性線維化はなかった。デスメ膜剥離手術を行った群において、１日につき６回の０．４ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンにより処理されたものは、デスメ膜剥離手術を行った他の群（それらが、１か月の間の単独経口ロサルタン、１か月の間の経口及び局所のロサルタン、または１か月の間の経口及び局所のビヒクル溶液により処理されたかどうかにかかわらず）に比較して、有意により低い（表４）平均ＳＭＡ陽性後部線維化領域を有していた。ＳＭＡ陽性後部線維化領域の平均領域は、１か月の間の経口ロサルタン単独により処理された群において最も高く、ＳＭＡ陽性後部線維化の領域のばらつきもその群においてより大きかった。しかしながら、経口ロサルタン単独により処理されたデスメ膜剥離手術角膜の平均ＳＭＡ陽性後部線維化領域は、１か月の間の局所及び経口のビヒクルにより処理されたかまたは１か月の間の局所及び経口のロサルタンにより処理されたデスメ膜剥離手術を行った群とは統計的に有意に異なっていなかった。表４は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続く事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定により遂行されたすべての群間の統計的比較についてのｐ値を提供する。
【表5】
【0066】
ＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１の免疫組織化学、ならびに実質後部のＩＶ型コラーゲン染色強度の定量化
ＴＧＦβ－１との二重のＩＶ型コラーゲンについての免疫組織化学の代表的な結果を、図３中で示す。局所ロサルタン（Ａ）もしくは経口ロサルタン（図示せず）により処理されたか、または処理されなかった（図示せず）偽手術の無傷の角膜において、ＩＶ型コラーゲンは、主としてデスメ基底膜及び上皮基底膜（図示せず）に局在し、稀な実質細胞のみがＩＶ型コラーゲンを含有していた。ＴＧＦβ－１は、内皮、及び稀に実質細胞、そして角膜上皮（図示せず）に局在していた。
ＴＧＦβ－１との二重のＩＶ型コラーゲンについての免疫組織化学の代表的な結果を、図３中で示す。局所ロサルタン（Ａ）もしくは経口ロサルタン（図示せず）により処理されたか、または処理されなかった（図示せず）偽手術の無傷の角膜において、ＩＶ型コラーゲンは、主としてデスメ基底膜及び上皮基底膜（図示せず）に局在し、稀な実質細胞のみがＩＶ型コラーゲンを含有していた。ＴＧＦβ－１は、内皮、及び稀に実質細胞、そして角膜上皮（図示せず）に局在していた。
【0067】
手術の１か月後のすべてのデスメ膜剥離手術角膜は、中央部のデスメ膜及び角膜内皮を欠いていた。デスメ膜剥離手術ならびに１か月の間の局所ビヒクル及び経口ビヒクルの両方による処理を行った角膜において（図３Ｂ）、実質後部は、ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞により充填された厚い後部線維化ゾーン及び主として角膜線維芽細胞であるＳＭＡ陰性ケラトカン陰性の細胞の上に重なる層を含有していた（これは図２中で観察することができる）。これらの細胞は、図３Ｂ中の角括弧により示される後部線維化ゾーンを占め、この全体のゾーンは、高レベルのＩＶ型コラーゲンを有していた。これらの角膜の線維化ゾーンにおける細胞の多くは、それらに付随するＴＧＦβ－１を有していた。デスメ膜剥離手術及び１か月の間の局所ロサルタン単独による処理を行った角膜において（図３Ｃ）、ＩＶ型コラーゲンは、主として後部表面に隣接して検出された。これらの角膜の実質後部における多くの細胞は、ＴＧＦβ－１が付随した。図３Ｃ中で示される角膜において示されるように、これらの角膜のすべてではないがいくつかは、角膜後部表面でＴＧＦβ－１を蓄積する緻密層も有していた。デスメ膜剥離手術を行い、経口ロサルタン単独により処理された角膜（図３Ｄ）は、デスメ膜剥離手術ならびに１か月の間の局所ビヒクル及び経口ビヒクルによる処理を行った角膜（図３Ｂ）とは有意に異なっていなかった。デスメ膜剥離手術を行い、１か月の間の局所ロサルタン及び経口ロサルタンの両方により処理された角膜（図３Ｅ）は、デスメ膜剥離手術を行い、局所ロサルタン単独により処理された角膜からのＩＶ型コラーゲンに関して、群としては異なっていなかった。したがって、経口ロサルタン単独は、実質後部におけるＩＶ型コラーゲン産生に対する有意な効果はなく、経口ロサルタン処理は、局所ロサルタン単独処理への相加的な効果はなかった。
【0068】
図３Ｆは、図３Ａ～３Ｅ中で示されるように、角膜後部表面に接する実質後部の幅０．７５×高さ０．５のＩｍａｇｅＪ四角形において定量され、無傷の角膜のデスメ膜を含まない、ＩＶ型コラーゲン強度を示すグラフである。局所ロサルタン、または局所ロサルタン及び経口ロサルタンの処理は、局所ビヒクル及び経口ビヒクルにより処理された角膜に比較して、デスメ膜剥離手術１か月後の実質後部のＩＶ型コラーゲン産生を有意に減少させた。
【0069】
表５は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続く事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定により遂行された、実質後部におけるＩＶ型コラーゲンレベルのすべての群間の統計的比較についてのｐ値を提供する。
【表6】
【0070】
デスメ膜剥離手術ならびに局所ビヒクル及び経口ビヒクルによる処理を行った群へ比較して、デスメ膜剥離手術及び経口ロサルタン単独による処理を行った群において、平均ＩＶ型コラーゲン強度がより低いのは、おそらく後者の群における１つの角膜が、ＩＶ型コラーゲンの実質レベルが高かったことに起因するが、図３Ｆのグラフ中で示されるように、これらの群間の差は、統計的に有意ではなかった。ビヒクルに処理された角膜に比較して、実質後部または実質後部表面のＴＧＦβ－１のレベルに対する局所及び／または経口のロサルタン処理の効果は示されず、デスメ膜剥離手術群のすべての実質後部において検出されたＴＧＦβ－１タンパク質レベルのかなりの変動があった。
【0071】
本開示は、任意の特定のメカニズムに限定されておらず、メカニズムの理解が本発明を実践には必要ではないが、図３中で示される結果の主要な重要性は、ロサルタンが角膜の中へ浸透し、ＴＧＦβ（筋線維芽細胞の発達を駆動することによって線維化を刺激する主要な増殖因子）をブロックすることを示すと考えられる。ＴＧＦβは、筋線維芽細胞が下にある場合に、角膜中で無秩序な多くのコラーゲンの産生も刺激する。ＩＶ型コラーゲンは、正常な無傷の角膜において、実質ではなく、上皮基底膜及びデスメ基底膜のみにおいて見出されるので、よく追跡することができるコラーゲンの１つのである。図３中でそれを観察することができる。１型コラーゲンのような他のものも筋線維芽細胞によって産生される。筋線維芽細胞それ自体及びそれらが産生する無秩序なコラーゲンは、瘢痕性線維化における混濁である。したがって、局所ロサルタンは、実質における筋線維芽細胞の発達を阻害し、いくらかの筋線維芽細胞が発達するならば、瘢痕コラーゲンの産生を減少させると考えられる。
【0072】
デスメ膜剥離手術（ＤＭＲ）モデルは、角膜上皮の解剖学的構造または機能に明白に影響せずに、ウサギにおいて重度の実質後部の筋線維芽細胞発達及び線維化を引き起こす（図１；図２；Ｍｅｄｅｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．、印刷中）。局所ロサルタンがＤＭＲを行った角膜の実質後部における筋線維芽細胞及び線維化発達に影響したという観察は、本研究において、局所ロサルタンが角膜後部実質の中に浸透した可能性を証明する。
【0073】
ＩＶ型コラーゲンは、ヘテロ三量体へと集合する６つの別個のα鎖（α１～α６）から構成される（Ｐｏｚｚｉ ｅｔ ａ．，２０１７）。事実上、すべての基底膜は、ＩＶ型コラーゲンを含有し、最も普遍的な三量体は、２つのα１及び１つのα２鎖から構成される。無傷の角膜において、ＩＶ型コラーゲンは、上皮基底膜（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．、印刷中）及びデスメ膜（図３及びＳａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．、印刷中）において顕著であるが、ＩＶ型コラーゲンは、無傷の角膜の実質細胞ではほとんど検出されない（図３）。最近の研究により、中央部のデスメ膜剥離手術後の角膜後部における角膜線維芽細胞及び筋線維芽細胞によってＩＶ型コラーゲンタンパク質が産生され、ＴＧＦβ－１は、角膜線維芽細胞及び筋線維芽細胞においてＩＶ型コラーゲンｍＲＮＡの産生をアップレギュレートすることが示された（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．、印刷中）。ＩＶ型コラーゲンの重要な特性は、それがＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２（Ｐａｒａｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，２００６）そしてＰＤＧＦ（Ｐａｒａｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に直接結合し、それによって、同族の受容体へのそれらの結合は減少するということである。本発明は任意の特定のメカニズムに限定されるものではないが、デスメ膜剥離手術後の角膜後部における角膜線維芽細胞及び筋線維芽細胞によって産生されたＩＶ型コラーゲンは、産生の領域における実質細胞に対するＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２の効果をダウンレギュレートし、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２のより前部の実質の浸透を減少させるように機能すると考えられる。したがって、角膜における角膜線維芽細胞及び筋線維芽細胞によって産生されたＩＶ型コラーゲンは、実質細胞に対するＴＧＦβ効果を調節するように負のフィードバック調節機構を供し得る。
【0074】
この実施例において、デスメ膜剥離手術後の１か月の間の局所ロサルタン治療は、角膜後部表面でのものを除くビヒクルに比較して、実質後部におけるＩＶ型コラーゲンレベルを著しくダウンレギュレートした（図３）。このことは、局所ロサルタンが角膜後部実質の中へ浸透し、デスメ膜剥離手術の１か月後のこの時点でのデスメ基底膜及び角膜内皮を欠く角膜後部表面を除いて、ＴＧＦβ－１に応答して実質細胞によるＩＶ型コラーゲン産生を阻害することを示し、局在する実質のＴＧＦβ－１濃度は、房水内のＴＧＦβ－１リザーバーへの接近に起因して最も高い可能性があった。この観察により、ＴＧＦβが、房水に由来する、及び／または損傷後の実質細胞によって局所的に産生されるかどうかにかかわらず、損傷された角膜におけるＴＧＦβ調節効果が、局所ロサルタンによりダウンレギュレーションされることの直接的な証拠が提供された（図３）。図３Ｆ中の結果により、経口ロサルタン単独が、局所ビヒクル及び経口ビヒクル処理角膜に比較して、デスメ膜剥離手術の１か月後の後部実質のＩＶ型コラーゲンレベルに対しておそらくいくらかの効果を有する傾向が示されたが、２つの群は統計的な有意差はなく、もし小さな差が実際に存在するならば、臨床的な意味はありそうもないだろう。この実施例の帰結は、ＩＶ型コラーゲン発現を検出するＩＨＣ及び他のアッセイが、ロサルタン及び他のモジュレーターの抗ＴＧＦβ効果のモニタリングを可能にするであろうということである。
【0075】
結論として、本研究は、局所ロサルタンが、外傷、感染、疾患、及び手術によって引き起こされた角膜の瘢痕性線維化の予防的な防止及び治療において有効であり得ることを示唆する。筋線維芽細胞は生存についてはＴＧＦβに依存するので（Ｗｉｌｓｏｎ，２０２０）、ロサルタンのＴＧＦβ阻害効果は、確立している角膜瘢痕でさえも有用でもあり得る。
【0076】
実施例１についての参照文献
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Ｗｉｌｓｏｎ， ２０２１ｂ， Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２０７：１０８５９４．
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【0077】
実施例２
局所ロサルタン及びコルチコステロイドは、アルカリ熱傷損傷後の角膜実質の筋線維芽細胞生成及び瘢痕性線維化を相加的に阻害する
本実施例は、ウサギにおけるアルカリ熱傷損傷後の角膜の瘢痕性線維化の阻害におけるロサルタン及び酢酸プレドニゾロンの有効性を評価及び記載する。簡潔には、研究には、１６匹のニュージーランドホワイトウサギが含まれていた。アルカリ熱傷損傷を、５ｍｍの直径のＷｈａｔｍａｎ ＃１濾紙上の１ＮのＮａＯＨを使用して産生した。各々の群における４つの角膜を、５０μｌの１）ＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、２）１％の酢酸プレドニゾロン、３）０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン及び１％の酢酸プレドニゾロン併用、または４）ＢＳＳにより、１か月の間１日あたり６回処理した。混濁の領域及び合計の混濁を、標準化された細隙灯写真においてＩｍａｇｅＪにより分析した。両方の群における角膜を、手術の１か月後にＯＣＴ中で凍結固定し、α－ＳＭＡ及びケラトカンまたはＴＧＦβ－１及びＩＶ型コラーゲンについて免疫組織化学（ＩＨＣ）を遂行した。局所ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用による処理は、細隙灯混濁の領域及び強度を有意に減少させた。この併用は、１切片あたりの実質の筋線維芽細胞のα－ＳＭＡの染色の領域及び強度も著しく減少させ、筋線維芽細胞を実質後部のみに制限し、処理１か月後にケラトカン陽性角膜実質細胞の有る実質の前部及び中間を再増殖させた。角膜線維芽細胞は、基底膜（特に角膜前部及び後部実質において）に付随しないＩＶ型コラーゲンを産生し、この産生は局所ロサルタンによって減少した。結論として、局所ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用は、全層の損傷（角膜内皮のダメージを包含する）を産生する角膜アルカリ熱傷後の筋線維芽細胞関連線維化の減少に有効であった。
局所ロサルタン及びコルチコステロイドは、アルカリ熱傷損傷後の角膜実質の筋線維芽細胞生成及び瘢痕性線維化を相加的に阻害する
本実施例は、ウサギにおけるアルカリ熱傷損傷後の角膜の瘢痕性線維化の阻害におけるロサルタン及び酢酸プレドニゾロンの有効性を評価及び記載する。簡潔には、研究には、１６匹のニュージーランドホワイトウサギが含まれていた。アルカリ熱傷損傷を、５ｍｍの直径のＷｈａｔｍａｎ ＃１濾紙上の１ＮのＮａＯＨを使用して産生した。各々の群における４つの角膜を、５０μｌの１）ＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、２）１％の酢酸プレドニゾロン、３）０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン及び１％の酢酸プレドニゾロン併用、または４）ＢＳＳにより、１か月の間１日あたり６回処理した。混濁の領域及び合計の混濁を、標準化された細隙灯写真においてＩｍａｇｅＪにより分析した。両方の群における角膜を、手術の１か月後にＯＣＴ中で凍結固定し、α－ＳＭＡ及びケラトカンまたはＴＧＦβ－１及びＩＶ型コラーゲンについて免疫組織化学（ＩＨＣ）を遂行した。局所ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用による処理は、細隙灯混濁の領域及び強度を有意に減少させた。この併用は、１切片あたりの実質の筋線維芽細胞のα－ＳＭＡの染色の領域及び強度も著しく減少させ、筋線維芽細胞を実質後部のみに制限し、処理１か月後にケラトカン陽性角膜実質細胞の有る実質の前部及び中間を再増殖させた。角膜線維芽細胞は、基底膜（特に角膜前部及び後部実質において）に付随しないＩＶ型コラーゲンを産生し、この産生は局所ロサルタンによって減少した。結論として、局所ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用は、全層の損傷（角膜内皮のダメージを包含する）を産生する角膜アルカリ熱傷後の筋線維芽細胞関連線維化の減少に有効であった。
【0078】
材料及び方法
動物
動物の処理及びケアは、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）及びＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｙ（Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。すべてのウサギは、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。本実施例には、各々が２．５～３．０ｋｇの体重である１０～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ１６匹が含まれていた。
動物
動物の処理及びケアは、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）及びＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｙ（Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。すべてのウサギは、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。本実施例には、各々が２．５～３．０ｋｇの体重である１０～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ１６匹が含まれていた。
【0079】
角膜アルカリ熱傷方法
アルカリ曝露の２４時間の前に開始し、処理後５～７日間継続して、１リットルの飲料水あたり６０ｍｌの小児用の液体アセトアミノフェン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を、ウサギに投与した。すべてのアルカリ曝露及び試験の前に、３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射によって、ウサギに麻酔をかけた。加えて、局所塩酸プロパラカイン１％（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、各々の眼に適用した。必要に応じて、疼痛の徴候により、皮下注射によって０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンも１日２回ウサギに投与した。
アルカリ曝露の２４時間の前に開始し、処理後５～７日間継続して、１リットルの飲料水あたり６０ｍｌの小児用の液体アセトアミノフェン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を、ウサギに投与した。すべてのアルカリ曝露及び試験の前に、３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射によって、ウサギに麻酔をかけた。加えて、局所塩酸プロパラカイン１％（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、各々の眼に適用した。必要に応じて、疼痛の徴候により、皮下注射によって０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンも１日２回ウサギに投与した。
【0080】
アルカリ損傷を、平衡塩類溶液（ＢＳＳ、０．６４％の塩化ナトリウム、０．０７５％の塩化カリウム、０．０４８％の塩化カルシウム二水和物、０．０３％の塩化マグネシウム六水和物、０．３９％の酢酸ナトリウム三水和物、０．１７％のクエン酸ナトリウム二水和物、ｐＨ７．５、Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）中の１Ｎの水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び１００μｌの１ＮのＮａＯＨ溶液により湿潤させた５ｍｍの直径の円形のＷｈａｔｍａｎナンバー１濾紙（カタログ番号１００１－６５０８、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、以前に出版された方法１０により、ウサギの１つの眼において生じさせた。アルカリ熱傷損傷に続いて、角膜にＢＳＳをたっぷり潅注した。各々の損傷された角膜に、１滴のシプロフロキサシン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）も、手術の１０分後、及び１週間の間で１日４回で研究医薬物から少なくとも１５分あけて投与した。
【0081】
局所ロサルタン及び／または酢酸プレドニゾロンによる処理
アルカリ熱傷損傷直後に開始して、各々の群中の４つの角膜を、１）５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、２）５０μｌの１％の酢酸プレドニゾロン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）、３）少なくとも５分間隔で、５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン及び５０μｌの１％の酢酸プレドニゾロン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）、または４）５０μｌのＢＳＳにより、１か月の間で１日あたり６回（およそ午前８時、午前１０時、正午１２時、午後２時、午後４時、及び午後６時）処理した。
アルカリ熱傷損傷直後に開始して、各々の群中の４つの角膜を、１）５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、２）５０μｌの１％の酢酸プレドニゾロン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）、３）少なくとも５分間隔で、５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン及び５０μｌの１％の酢酸プレドニゾロン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）、または４）５０μｌのＢＳＳにより、１か月の間で１日あたり６回（およそ午前８時、午前１０時、正午１２時、午後２時、午後４時、及び午後６時）処理した。
【0082】
損傷２週間後の上皮欠損についてのフルオレセイン染色
アルカリ熱傷損傷２週間後に、ＢＳＳ中の局所０．５％のフルオレセインを各々の眼に適用し、上皮欠損（複数可）の存在または非存在を記録した。
アルカリ熱傷損傷２週間後に、ＢＳＳ中の局所０．５％のフルオレセインを各々の眼に適用し、上皮欠損（複数可）の存在または非存在を記録した。
【0083】
標準化された細隙灯写真、角膜血管造影法、及び角膜混濁のＩｍａｇｅＪ分析
水酸化ナトリウム曝露及び処理の１か月後に、ケタミン－キシラジンの全身麻酔下のウサギで、眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）により３０分間拡大させた。各々のウサギにおける研究の眼で、標準化された照明レベル及び照明角度により、Ｔｏｐｃｏｎ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＳＬ－Ｄ７細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で細隙灯写真を撮った。各々の研究眼について、混濁の合計の領域を、ｍｍ２へ較正されたＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェアを使用して、手書きの選択ツールにより混濁をアウトラインを描くことによって決定した。各々の角膜における混濁領域についてのピクセルでの「生の内部の密度」も、ＩｍａｇｅＪを使用して決定した。
水酸化ナトリウム曝露及び処理の１か月後に、ケタミン－キシラジンの全身麻酔下のウサギで、眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）により３０分間拡大させた。各々のウサギにおける研究の眼で、標準化された照明レベル及び照明角度により、Ｔｏｐｃｏｎ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＳＬ－Ｄ７細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で細隙灯写真を撮った。各々の研究眼について、混濁の合計の領域を、ｍｍ２へ較正されたＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェアを使用して、手書きの選択ツールにより混濁をアウトラインを描くことによって決定した。各々の角膜における混濁領域についてのピクセルでの「生の内部の密度」も、ＩｍａｇｅＪを使用して決定した。
【0084】
すべての角膜に、以前に記載されたように１１、中心耳静脈中への１．５ｍｌの１０％のフルオレセインナトリウム（ＭｃＫｅｓｓｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＴＸ）の注射直後の角膜における色素通過のピークで、細隙灯システム、及び角膜を広範に照射して「バリヤーフイルター」（フルオレセイン放射のピークである５２０～５３０ｎｍのみを透過）を使用するデジタルカメラシステムにより、蛍光血管造影法を行った。
【0085】
角膜の固定及び切片作成
曝露及び局所処理の１か月後に、ウサギを、ケタミン－キシラジンの全身麻酔後に、静脈注射による１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）及び両側性気胸により安楽死させた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により、眼の角膜－強膜縁を除去した。角膜を、２４×２４×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央に置き、それをＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により充填し、ドライアイス上で急速冷凍した。ブロックを、切片を作成まで－８０℃で保存した。
曝露及び局所処理の１か月後に、ウサギを、ケタミン－キシラジンの全身麻酔後に、静脈注射による１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）及び両側性気胸により安楽死させた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により、眼の角膜－強膜縁を除去した。角膜を、２４×２４×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央に置き、それをＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により充填し、ドライアイス上で急速冷凍した。ブロックを、切片を作成まで－８０℃で保存した。
【0086】
ＯＣＴブロックを角膜の中央で二等分し、８μｍの厚みの横断切片を、クリオスタット（ＨＭ ５０５Ｍ；Ｍｉｃｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により中央部の角膜から切った。各々の角膜からの切片を、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍのＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡用スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）上に置いた。切片の有るスライドを免疫組織化学の前に－２０℃で維持した。
【0087】
免疫組織化学及び線維化領域混濁強度解析
多重免疫組織化学（ＩＨＣ）を、以前に記載された方法８、ならびにウサギ抗原を認識することがウエスタンブロット及びＩＨＣによって確認された一次抗体（表７）またはアイソタイプ対照抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ならびに二次蛍光タグ抗体を使用して遂行した（表７）。
多重免疫組織化学（ＩＨＣ）を、以前に記載された方法８、ならびにウサギ抗原を認識することがウエスタンブロット及びＩＨＣによって確認された一次抗体（表７）またはアイソタイプ対照抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ならびに二次蛍光タグ抗体を使用して遂行した（表７）。
【表7】
【0088】
ＩＶ型コラーゲン抗体（カタログ番号ＡＢ７６９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）は、精製されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンに対して作製され、それは、アガロースへ架橋されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンにより親和性精製され、製造者によってヒト及びウシのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、及びＶＩ型のコラーゲンで交差吸収して、交差反応性が除去された。このＩＶ型コラーゲン抗体は、ＩＨＣにおいてウサギＩＶ型コラーゲンに結合し８、９、α－１／α－２鎖を認識するが、α－３～α－６鎖を認識しないことが以前に示された。ケラトカン抗体を、ペプチドＨ２Ｎ－ＬＲＬＤＧＮＥＩＫＰＰＩＰＩＤＬＶＡＣ－ＯＨ（配列番号１）に対して作製する。このマーカーを使用して、インサイチューで角膜実質細胞を同定した。ＴＧＦβ－１抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）は、ＩＨＣにおいてウサギＴＧＦβ－１に結合し、ＴＧＦβ－２またはＴＧＦβ－３への反応性を示さない。５
【0089】
ｍｍ２でのα－ＳＭＡ陽性実質領域及びピクセルでの合計のα－ＳＭＡ混濁を、ＬＡＳ Ｘソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、自動化ステージ及びＬｅｉｃａ ７０００Ｔのカメラを装備したＬｅｉｃａ ＤＭ６Ｂ正立顕微鏡上で１０倍対物レンズにより得られた、標準化された画像を使用して定量した。３つの中央部の角膜の平均を各々の角膜から分析して、α－ＳＭＡ陽性実質領域及び合計のα－ＳＭＡ混濁を提供した。各々の角膜についてのｍｍ２でのα－ＳＭＡ陽性実質領域を、α－ＳＭＡ陽性染色領域（複数可）の輪郭を描くために手書きの選択ツールを使用するＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェアにより、中央部の角膜の画像の完全な直径及び厚さ（すべての画像について、３００ＤＰＩ、幅８８５×高さ５００、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで同一の＋５０％の明るさの増加をともなうファイルにすべて変換）から決定した。いくつかの角膜において、２つ以上の別の領域が存在し、これらの領域の和をその角膜についての値として使用した。各々の角膜についてのこれらの同じ切片において、ピクセルでの合計のα－ＳＭＡ陽性強度も、同様に別のα－ＳＭＡ陽性領域が存在するならば、和を使用することによってＩｍａｇｅＪにより決定した。
【0090】
各々の群におけるすべての角膜に、ＩＶ型コラーゲンについてのＩＨＣを行った。各々の角膜からの画像を、均一な３００ＤＰＩ、８７５×５６８ピクセルのファイルに変換した。各々の角膜は、角膜前部（存在するならばＥＢＭより後方の、実質前部表面で四角形の前部側）及び角膜後部（存在するならばデスメ膜より前方の、後部実質の表面で四角形の後部側）の両方における、３つの無作為に位置させた１００×５０のＩｍａｇｅＪ分析四角形中のシグナル強度の３つの測定値を有していた。各々のボックス内の染色強度を、分析ヒストグラム機能により決定し、３つのボックスの平均は、その角膜についての実質前部または実質後部における強度値であった。
【0091】
統計
統計的分析を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
統計的分析を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
【0092】
結果
アルカリ熱傷後の持続的な上皮欠損
アルカリ熱傷の２及び４週間後に、すべての群におけるすべての角膜は、少なくとも１ｍｍの直径の上皮欠損を有し、処理群間に差が無いことが見出された。
アルカリ熱傷後の持続的な上皮欠損
アルカリ熱傷の２及び４週間後に、すべての群におけるすべての角膜は、少なくとも１ｍｍの直径の上皮欠損を有し、処理群間に差が無いことが見出された。
【0093】
アルカリ熱傷後の細隙灯実質混濁及び中央部の角膜の血管新生（ＣＮＶ）
５ｍｍの濾紙円上での１００μｌの１ＮのＮａＯＨの１分間の方法、続いて、局所０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、１％の酢酸プレドニゾロン、０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、及び１％の酢酸プレドニゾロン、またはＢＳＳビヒクルによる１か月の間の１日あたり６回の処理を使用した場合の、角膜の各々の中央部の実質の混濁は、図５Ａ中で示される通りであった。合計の実質混濁領域を測定するために使用されたＩｍａｇｅＪの描出の例は、各々の処理について１つの角膜において示される。各々の画像化角膜についてのこれらの定量化領域が、非常に高密度の中央部（例えばＬＯＳ－２の＊）及びより低い密度の周辺部（例えばＬＯＳ－２の＊＊）を含有することに注目されたい。各々の群における各々の角膜についてのｍｍ２での混濁の合計の領域を、図５Ｂ中で示す。群間の統計的比較を表８中で示す。
５ｍｍの濾紙円上での１００μｌの１ＮのＮａＯＨの１分間の方法、続いて、局所０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、１％の酢酸プレドニゾロン、０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、及び１％の酢酸プレドニゾロン、またはＢＳＳビヒクルによる１か月の間の１日あたり６回の処理を使用した場合の、角膜の各々の中央部の実質の混濁は、図５Ａ中で示される通りであった。合計の実質混濁領域を測定するために使用されたＩｍａｇｅＪの描出の例は、各々の処理について１つの角膜において示される。各々の画像化角膜についてのこれらの定量化領域が、非常に高密度の中央部（例えばＬＯＳ－２の＊）及びより低い密度の周辺部（例えばＬＯＳ－２の＊＊）を含有することに注目されたい。各々の群における各々の角膜についてのｍｍ２での混濁の合計の領域を、図５Ｂ中で示す。群間の統計的比較を表８中で示す。
【表8】
【0094】
ロサルタン単独群、プレドニゾロン単独群、ならびにロサルタン及びプレドニゾロン併用群は、ＢＳＳビヒクル群とは有意に異なっていたが、互いに有意に異ならなかった。ＩｍａｇｅＪも使用して、各々の角膜における高密度中央部領域及びより低い密度の周辺領域の組み合わせ（各々の群からの１つの角膜中の破線によって示されるように）についてのピクセルでの合計の混濁強度を決定し、そのデータを図５Ｃ中で示す。群間の統計的比較を表９中で示す。
【表9】
【0095】
ロサルタン単独群及びロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用群は、ＢＳＳビヒクル群とは有意に異なっていたが、互いに有意に異ならなかった。１％の酢酸プレドニゾロン群とＢＳＳビヒクル群との間の差は、統計的有意差に達しなかった。しかしながら、ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用群は、実質の混濁領域及び合計の混濁強度の両方について最も低い平均の標準誤差を有していた。
【0096】
中央部の角膜の血管新生（図８）が、すべての４つのＢＳＳビヒクル処理角膜において、局所０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン単独により処理された２つの角膜において、１％の酢酸プレドニゾロン単独により処理された角膜のうちの１つで発達し、０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン及び１％の酢酸プレドニゾロンの両方により処理された角膜においてはどれも発達しなかった。
【0097】
ケラトカン陽性角膜実質細胞及びα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞についてのＩＨＣ
図６Ａは、各々の群中の角膜からの代表的な中央部の切片を示す。本研究におけるアルカリ損傷を行ったすべての角膜は、損傷の１か月後で、中央部の６～１０ｍｍ以内で角膜内皮を有していなかった。α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、無傷の角膜において見出されなかった。ＢＳＳビヒクルにより処理されたすべての角膜は、図６Ａ中で示されるように、完全な厚さまたはほぼ完全な厚さのα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞を有したが、ケラトカン陽性角膜実質細胞のいくつかのパッチは存在した。ロサルタン単独により処理された角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、図６Ａ中の例で示されるように、すべての角膜において主として実質の後部半分に制限された。α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の局在化は、酢酸プレドニゾロン群においてより変動する傾向があった。その群中の２つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質を通して見出され（図６Ａ中の例＃１において示されるように）、２つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質の後部半分においてのみ存在した（図６Ａ中の例＃２において示されるように）。ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群中のすべての４つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質の非常に後部に制限され、ケラトカン陽性角膜実質細胞の有る実質のより前部が再増殖した（図６Ａ中で示されるように）。
図６Ａは、各々の群中の角膜からの代表的な中央部の切片を示す。本研究におけるアルカリ損傷を行ったすべての角膜は、損傷の１か月後で、中央部の６～１０ｍｍ以内で角膜内皮を有していなかった。α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、無傷の角膜において見出されなかった。ＢＳＳビヒクルにより処理されたすべての角膜は、図６Ａ中で示されるように、完全な厚さまたはほぼ完全な厚さのα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞を有したが、ケラトカン陽性角膜実質細胞のいくつかのパッチは存在した。ロサルタン単独により処理された角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、図６Ａ中の例で示されるように、すべての角膜において主として実質の後部半分に制限された。α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の局在化は、酢酸プレドニゾロン群においてより変動する傾向があった。その群中の２つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質を通して見出され（図６Ａ中の例＃１において示されるように）、２つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質の後部半分においてのみ存在した（図６Ａ中の例＃２において示されるように）。ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群中のすべての４つの角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質の非常に後部に制限され、ケラトカン陽性角膜実質細胞の有る実質のより前部が再増殖した（図６Ａ中で示されるように）。
【0098】
図９は、実質のα－ＳＭＡ陽性染色の合計の領域（及び合計のα－ＳＭＡ陽性混濁のＩｍａｇｅＪ分析のために使用された、各々の角膜からの代表的な切片におけるα－ＳＭＡ陽性染色を示す。酢酸プレドニゾロン群中の実質α－ＳＭＡ陽性染色のばらつきは、この図中で指摘され得る。各々の角膜中の合計のα－ＳＭＡ領域についてのＩｍａｇｅＪ解析結果を、図６Ｂ中で示す。表１０は、群間の統計的比較を示す。
【表10】
【0099】
ロサルタン－酢酸プレドニゾロン併用群は、ビヒクル対照群よりも有意に少ないα－ＳＭＡ領域を有していた。ロサルタン－酢酸プレドニゾロン併用群は、酢酸プレドニゾロン群よりも有意に少ないα－ＳＭＡ領域を有していた。他の差は統計的有意差に達しなかったが、ロサルタン群が、ビヒクル対照群とは有意に異なる傾向があったことが指摘され得る。各々の角膜についてのピクセルでの合計のα－ＳＭＡ混濁強度のＩｍａｇｅＪ解析結果を、図６Ｃ中で示す。表１１は、群間の統計的比較を示す。
【表11】
【0100】
この場合もやはり、ロサルタン－酢酸プレドニゾロン併用群は、ビヒクル対照群よりも極めて有意に少ないピクセルでのα－ＳＭＡ混濁強度を有していた。さらに、ロサルタン－酢酸プレドニゾロン併用群は、合計のα－ＳＭＡ混濁強度が、酢酸プレドニゾロン単独群よりも有意により少なかった。他の差は統計的有意差に達しなかった。重要なことには、ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群における合計のα－ＳＭＡ領域（図６Ｂ）及び合計のα－ＳＭＡ混濁強度（図６Ｃ）の両方についての低いばらつきに注目されたい。
【0101】
図７Ａは、各々の群中の代表的な角膜についての実質前部及び実質後部におけるＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての代表的な二重ＩＨＣを示し、例示的なＩｍａｇｅＪ定量化四角形も示す。図７Ｂは、各々の群中の角膜の実質前部におけるＩＶ型コラーゲン染色強度についての定量化を示す。ロサルタン処理及びロサルタン＋１％の酢酸プレドニゾロンの両方は、ビヒクル処理に比較して、実質前部におけるＩＶ型コラーゲンの平均強度単位を有意に減少させた。酢酸プレドニゾロン単独は、ビヒクル処理に比較して、実質前部におけるＩＶ型コラーゲン染色強度が減少する傾向を生じたが、差は統計的有意差に達しなかった。表１２は、群間の実質前部におけるＩＶ型コラーゲン強度についての統計的比較を示す。
【表12】
【0102】
図７Ｃは、各々の群中の角膜の実質後部におけるＩＶ型コラーゲン染色強度についての定量化を示す。局所ロサルタン処理のみが、ビヒクル処理とは有意に異なっていたが、ロサルタン＋１％の酢酸プレドニゾロン併用群は、有意性に向かう傾向にあった。表１３は、群間の前部と後部におけるＩＶ型コラーゲン強度についての統計的比較を示す。
【表13】
【0103】
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によって引き起こされる角膜へ化学的損傷は、軽度の自然治癒性の眼表面の障害から、角膜上皮、角膜縁、実質、及び角膜内皮に影響する破壊的な熱傷まで変動する。１０、１２～１７重度のアルカリ熱傷損傷は、角膜血管新生（ＣＮＶ）及び持続的な上皮欠損にしばしば付随する。１２～１７重度のＮａＯＨ角膜熱傷は、また小柱網、虹彩、毛様体、レンズ、網膜、及び視神経も損傷し得る。１２
【0104】
本実施例において使用される１ＮのＮａＯＨの角膜熱傷損傷方法は、多くの以前のウサギ研究において使用された。１０、１３、１４アルカリ熱傷損傷の効果及び局所用薬剤の可能性のある効果の分析のために１か月の時間点を選択したが、それは、１か月が、先行研究２～６において角膜への損傷に対する創傷治癒応答がピークに達する時だったからである。本実施例は、１００マイクロリットルの１ＮのＮａＯＨによる重度の化学的損傷が、５ｍｍの濾紙送達系を１分間使用して加えられ、実質を介して浸透し、角膜内皮の下にある大きな領域及び多くの場合デスメ膜（直径およそ８～１０ｍｍ）を均一に損傷したことを示した。この方法を使用して、輪部損傷の証拠は示されなかった。同様に、この損傷後のウサギ眼において、虹彩またはレンズのダメージの証拠は、示されなかった。ある特定の実験において、この方法を使用する１ＮのＮａＯＨへの１５秒の曝露でさえ、角膜内皮がダメージを受けた（Ｓａｍｐａｉｏ ＬＰ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＳＥ、未出版データ、２０２１）ため、ＮａＯＨの希釈物はおそらく角膜の上皮及び実質前部に制限される損傷のモデルを作製することが必要であろう。
【0105】
１ＮのＮａＯＨによって生じた影響を受けた上皮、角膜実質細胞、及び角膜内皮の細胞死のモードは、壊死であることが以前に報告された。１５、１６細胞壊死は、おそらく、下にある膠原細繊維の変性と一緒に１７、重度の角膜炎症応答を誘発し、これは、損傷後の最初の数日から２週間の間に本研究におけるすべての角膜で細隙灯により指摘された。
【0106】
すべての群中の損傷及び処理の１か月後に残存する混濁は、より低い密度のリングによって囲まれた高密度中央部のゾーンによって特徴付けられた（図５Ａ）。高密度中央部の領域は、発達した筋線維芽細胞、及びこれらの線維化細胞が産生した多量の無秩序な細胞外マトリックスと一緒に、元のＮａＯＨ損傷によって生じた変性し無秩序なコラーゲン線維を表わすと考えられていた。５、６、１８より低い密度リングは、角膜線維芽細胞によって生成される無秩序な細胞外マトリックスがより少ない量であることと一緒に、激しくダメージを受けなかった実質のコラーゲン及び角膜線維芽細胞と関連し得る。
【0107】
ロサルタンはアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）ＩＩ受容体アンタゴニストであり、ＴＧＦβシグナリングも阻害する。９、１９～２４本実施例において、ＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン、１％の酢酸プレドニゾロン、またはロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用による１日あたり６回の局所処理は、標準化された細隙灯画像上でＩｍａｇｅＪにより測定された合計の角膜混濁領域を減少させた（図５Ｂ）。混濁の合計の領域における差は、ロサルタン、酢酸プレドニゾロン、またはロサルタン／酢酸プレドニゾロン併用群の間で有意に異ならなかった（表８）。ＩｍａｇｅＪにより測定された角膜の混濁領域におけるピクセルでの合計の混濁は、ビヒクルＢＳＳ群に比較して、０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン群または０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン＋１％の酢酸プレドニゾロン併用群において有意により低かった。１％の酢酸プレドニゾロン単独群は、ビヒクルＢＳＳ群に比較して、合計の混濁が減少する傾向があったが、差は統計的有意差に達しなかった（表９）。
【0108】
本実施例において最も興味深い知見のうちの１つは、異なる処理群中の筋線維芽細胞の発達及び実質の線維化に関連する（図６Ａ）。アルカリ熱傷に続いてビヒクルＢＳＳによる処理を行ったすべての角膜は、角膜の完全な厚さを通してα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞及び線維化を有していたが、この線維化は、実質前部及び実質後部の表面に隣接して最も大きいように思われ（図９）、これは、おそらく、涙液、上皮、残存する周辺の角膜内皮、及び角膜表面の房水から実質に浸透するより高い濃度のＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２に起因する。５、６０．８ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンにより処理されたＮａＯＨ損傷角膜において、α－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の最大密度は、実質後部の半分において示される傾向があったが、より低い量の実質前部のα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、処理の１か月後に２つのロサルタン処理角膜において示された（図９）。持続的な角膜上皮欠損それ自体は、実質前部の筋線維芽細胞及び線維化の発達と関連し２５、２つのロサルタン処理角膜において示される前部の筋線維芽細胞が何らかの役割を有し得る。１％の酢酸プレドニゾロン単独により処理されたアルカリ損傷角膜は、実質筋線維芽細胞の発達においてよりばらつきがあった（図９）。しかしながら、損傷ならびにロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用による処理後に、すべての４つの角膜におけるα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、実質の非常に後部に制限された（図９）。図６Ａ中の代表的な角膜において示され得るように、１か月の時点までに、処理群のうちのどの角膜においても、角膜内皮及びデスメ膜が再生していなかったことに留意することが重要である。
【0109】
ＩｍａｇｅＪを使用して、中央部の角膜の各々におけるα－ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の領域が決定された場合に（図６Ｂ）、ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群は、ビヒクルＢＳＳ処理群とは有意に異なっていた（ｐ＝０．０００５、表１０）。このロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用群は、α－ＳＭＡ染色領域について低い平均の標準誤差も有していた（図６Ｂ）。ロサルタン及び酢酸プレドニゾロン併用群は、酢酸プレドニゾロン単独群よりもα－ＳＭＡ染色の有意に少ない領域を有していた。同様に、ＩｍａｇｅＪを使用して、角膜の各々における角膜切片あたりの合計のα－ＳＭＡ強度が決定された場合に（図６Ｃ）、ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン処理併用群は、ビヒクルＢＳＳ処理群よりも有意に低く（ｐ＝０．００２、表１１）、ロサルタン＋酢酸プレドニゾロン処理併用群は、酢酸プレドニゾロン単独群よりも有意に低かった（ｐ＝０．０１）。本発明は、任意の特定のメカニズムに限定されておらず、メカニズムの理解が本発明を実践には必要ではないが、本発明者らは、重度のアルカリ熱傷後のロサルタン＋酢酸プレドニゾロン併用処理の有効性が、重度の組織壊死による炎症のコルチコステロイド調節、ならびに実質の筋線維芽細胞発達及びしたがってこれらの細胞による無秩序なコラーゲン産生に対する線維化促進性ＴＧＦβ効果のロサルタン調節に起因したという仮説を立てる。骨髄由来線維細胞も、角膜線維芽細胞に加えて、損傷後に輪部から実質に侵入し、ＴＧＦβ駆動性の筋線維芽細胞への前駆細胞である。２６、２７コルチコステロイドは、多数の筋線維芽細胞の生成のために必要な線維細胞の分裂増殖を阻害し２８、線維細胞アポトーシスも誘発する。２９したがって、局所コルチコステロイドは、これらのメカニズムを介して、角膜線維芽細胞及び線維細胞の両方からの筋線維芽細胞の発達のロサルタン阻害に寄与し得る。
【0110】
本実施例は、重度の水酸化ナトリウム損傷が、通常は、角膜線維化応答を増加させる角膜内皮及びデスメ膜へダメージと関連することを実証した。このことは、角膜内皮のダメージが、損傷の長期転帰の主要な決定要素である、生物兵器薬剤（サルファマスタード等）によって引き起こされた化学熱傷の効果に関する知見に類似する。３０、３１局所ロサルタン及びコルチコステロイド併用は、これらの化学的生物武器薬剤に応答して起こる筋線維芽細胞生成及び角膜の瘢痕性線維化も減少させることができた。
【0111】
実施例２についての参照文献
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１７． Ｍａｓｋａｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １９８７；３５：３９６－４００．
１８． Ｊｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １９９９；１１２：６１３－２２．
１９． Ｗｙｌｉｅ－Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４；４４６： ８７０－８７５．
２０． Ｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１２；１２６ （１１ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１８９－１９７．
２１． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２０１２；２１：２４０７－２４２４．
２２． Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００１；１０３：７８９－７９１．
２３． Ｌａｖｏｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００５；２３：１８９５－１９０３．
２４． Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００７；１３：２０４－２１０．
２５． Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｒｅｆ Ｓｕｒｇ． ２０１８；３４：５９－６４．
２６． Ｌａｓｓａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２０１８；１７０：１７７－１８７．
２７． ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ２０２０；６１：２８－３５．
２８． Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ２０１４；２０１４：７３８６２５．
２９． Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５；１３５：１１８６－９５．ｅ１－６．
３０． ＭｃＮｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ２０１３；５４：６７３５－４４．
３１． ＭｃＮｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｒｎｅａ． ２０２０；３９：６４０－６４８．
３２． Ｐａｒａｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １９９１；１４３：３０３－３０８．
３３． Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ． ２００６；４１：１８７－１９５．
３４． Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏ． ２０２２；１０９：１６２－１７２
【0112】
実施例３
ウサギにおけるレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）後の筋線維芽細胞生成及び遅発性ヘイズ（ｌａｔｅ ｈａｚｅ）（瘢痕化線維化）のロサルタン阻害
本実施例は、ウサギにおけるＰＲＫ後の筋線維芽細胞の生成及び遅発性ヘイズ瘢痕性線維化の発達に対する、ビヒクルに比較した、局所ロサルタンの効果を評価及び記載する。
ウサギにおけるレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）後の筋線維芽細胞生成及び遅発性ヘイズ（ｌａｔｅ ｈａｚｅ）（瘢痕化線維化）のロサルタン阻害
本実施例は、ウサギにおけるＰＲＫ後の筋線維芽細胞の生成及び遅発性ヘイズ瘢痕性線維化の発達に対する、ビヒクルに比較した、局所ロサルタンの効果を評価及び記載する。
【0113】
要約
簡潔には、ウサギ（１２）に、１つの眼において－９Ｄ ＰＲＫ、続いて１か月の間の１日あたり６回の５０μｌの０．８ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンまたは５０μｌのビヒクルを行った。標準化された細隙灯写真を、安楽死の前に得た。二重ＩＨＣを、筋線維芽細胞マーカーα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）及び角膜実質細胞マーカーケラトカンまたはＩＶ型コラーゲン及び形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β－１について凍結固定した角膜上で遂行した。ＩｍａｇｅＪを定量化のために利用した。局所ロサルタンは、ＰＲＫの１か月後にビヒクルに比較して、角膜混濁を有意に減少させ（Ｐ＝０．０４）、実質前部の筋線維芽細胞生成を有意に減少させた（Ｐ＝０．０１）。局所ロサルタンは、ＰＲＫの１か月後にビヒクルに比較して、実質前部の非基底膜ＩＶ型コラーゲンも減少させた（Ｐ＝０．００４）。局所ＡＣＥＩＩ受容体阻害物質ロサルタン（ＴＧＦβシグナリングの公知の阻害物質）は、ビヒクルに比較して、ウサギにおける－９Ｄ ＰＲＫ後の遅発性ヘイズ瘢痕化線維化及び筋線維芽細胞生成を減少させた。それは、ＴＧＦβ調節性で角膜線維芽細胞産生の非基底膜実質のＩＶ型コラーゲンも減少させる。
簡潔には、ウサギ（１２）に、１つの眼において－９Ｄ ＰＲＫ、続いて１か月の間の１日あたり６回の５０μｌの０．８ｍｇ／ｍｌの局所ロサルタンまたは５０μｌのビヒクルを行った。標準化された細隙灯写真を、安楽死の前に得た。二重ＩＨＣを、筋線維芽細胞マーカーα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）及び角膜実質細胞マーカーケラトカンまたはＩＶ型コラーゲン及び形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β－１について凍結固定した角膜上で遂行した。ＩｍａｇｅＪを定量化のために利用した。局所ロサルタンは、ＰＲＫの１か月後にビヒクルに比較して、角膜混濁を有意に減少させ（Ｐ＝０．０４）、実質前部の筋線維芽細胞生成を有意に減少させた（Ｐ＝０．０１）。局所ロサルタンは、ＰＲＫの１か月後にビヒクルに比較して、実質前部の非基底膜ＩＶ型コラーゲンも減少させた（Ｐ＝０．００４）。局所ＡＣＥＩＩ受容体阻害物質ロサルタン（ＴＧＦβシグナリングの公知の阻害物質）は、ビヒクルに比較して、ウサギにおける－９Ｄ ＰＲＫ後の遅発性ヘイズ瘢痕化線維化及び筋線維芽細胞生成を減少させた。それは、ＴＧＦβ調節性で角膜線維芽細胞産生の非基底膜実質のＩＶ型コラーゲンも減少させる。
【0114】
背景
臨床的に重要な遅発性角膜ヘイズ（角膜実質の瘢痕性線維化とも称される）は、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）後の合併症として報告され続けている。（１）ＰＲＫ後の遅発性ヘイズの発生率は、術中マイトマイシンＣの単回用量が広範囲で採用された後に著しく減少した（２、３）が、マイトマイシンＣ適用にもかかわらず、いくつかの眼において示され続け、それは「ブレークスルーヘイズ」と称される。（４）．遅発性ヘイズは、ＰＲＫによる中等度から高度の近視または遠視矯正後に最も一般的に認められるが、特に術中マイトマイシンＣ処理が省かれる場合に、または手術に続いて持続的な上皮欠損がある場合に、遅発性ヘイズは、低度近視についてのＰＲＫ矯正後に時々認められる。（２、３）。
臨床的に重要な遅発性角膜ヘイズ（角膜実質の瘢痕性線維化とも称される）は、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）後の合併症として報告され続けている。（１）ＰＲＫ後の遅発性ヘイズの発生率は、術中マイトマイシンＣの単回用量が広範囲で採用された後に著しく減少した（２、３）が、マイトマイシンＣ適用にもかかわらず、いくつかの眼において示され続け、それは「ブレークスルーヘイズ」と称される。（４）．遅発性ヘイズは、ＰＲＫによる中等度から高度の近視または遠視矯正後に最も一般的に認められるが、特に術中マイトマイシンＣ処理が省かれる場合に、または手術に続いて持続的な上皮欠損がある場合に、遅発性ヘイズは、低度近視についてのＰＲＫ矯正後に時々認められる。（２、３）。
【0115】
ウサギにおける複数の調査により、ＰＲＫ後の上皮基底膜（ＥＢＭ）の再生欠損及び上皮下筋線維芽細胞の発達が、遅発性ヘイズ角膜実質線維化の発達の根底にあることが実証されている。（５～７）。筋線維芽細胞は、主として形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β－１及びＴＧＦβ－２によって駆動される細胞発達プログラムを介して、角膜実質細胞由来角膜線維芽細胞及び骨髄由来線維細胞の両方から角膜において発達する。（８、９）。ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２は、頂端上皮バリア機能と共に、実質の中へのＴＧＦβ通過を調節するＥＢＭの再生の遅延がある場合に、ＰＲＫ後の角膜上皮及び涙液から継続的に実質に侵入する。（６、１０～１２）。パールカン及びＩＶ型コラーゲンは、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２の実質の中への通過を調節するゲートキーパーとして役立つＥＢＭ構成要素である。（１０～１２）。筋線維芽細胞は、完全な発達及び生存のために、適切且つ継続的なＴＧＦβ－１及び／またはＴＧＦβ－２の供給源に決定的に依存し、これらの増殖因子によるシグナリングを枯渇させた場合に、これらの線維化細胞及びその前駆細胞はアポトーシスを起こす。（８、９）。
【0116】
材料及び方法
動物及び手術
動物手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって承認され、動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。各々が２．５～３ｋｇの体重である１２～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ１２匹が含まれていた。手術の２４時間の前に開始し、ＰＲＫ後５日間継続して、１Ｌの飲料水あたり６０ｍｌの小児用の液体アセトアミノフェン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を、ウサギに投与した。各々のウサギの１つの眼を、－９．０ Ｄ（近視スケールで）ＰＲＫを有するように無作為に選択し、手術の前に、２滴の１％の局所塩酸プロパラカイン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ（ＴＸ）、ＵＳＡ）を投与した。＃６４００ Ｂｅａｖｅｒブレード（ＭｅｄｅｘＳｕｐｐｌｙ、Ｐａｓｓａｉｃ、ＮＪ）を使用する手動の上皮デブリードマンによるＰＲＫを、ウサギに、筋肉内（ＩＭ）注射によって３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンによる全身麻酔ならびに１％のプロパラカイン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）による局所麻酔を行いながら、ＶＩＳＸ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ（ＣＡ））Ｓ４ ＩＲエキシマレーザーにより、以前に出版された方法６、７、１０を使用して遂行した。６ＰＲＫの対側性の効果は、以前の研究５、６、７、１０において示されていないので、反対の角膜を無傷の対照として含めた。
動物及び手術
動物手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって承認され、動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈの原則に従って処理された。各々が２．５～３ｋｇの体重である１２～１５週齢のメスのニュージーランドホワイトウサギ１２匹が含まれていた。手術の２４時間の前に開始し、ＰＲＫ後５日間継続して、１Ｌの飲料水あたり６０ｍｌの小児用の液体アセトアミノフェン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を、ウサギに投与した。各々のウサギの１つの眼を、－９．０ Ｄ（近視スケールで）ＰＲＫを有するように無作為に選択し、手術の前に、２滴の１％の局所塩酸プロパラカイン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ（ＴＸ）、ＵＳＡ）を投与した。＃６４００ Ｂｅａｖｅｒブレード（ＭｅｄｅｘＳｕｐｐｌｙ、Ｐａｓｓａｉｃ、ＮＪ）を使用する手動の上皮デブリードマンによるＰＲＫを、ウサギに、筋肉内（ＩＭ）注射によって３０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンによる全身麻酔ならびに１％のプロパラカイン（Ａｌｃｏｎ、Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）による局所麻酔を行いながら、ＶＩＳＸ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ（ＣＡ））Ｓ４ ＩＲエキシマレーザーにより、以前に出版された方法６、７、１０を使用して遂行した。６ＰＲＫの対側性の効果は、以前の研究５、６、７、１０において示されていないので、反対の角膜を無傷の対照として含めた。
【0117】
医薬物
手術直後に開始して、ＰＲＫを行った６つの眼を、５０μｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳ、０．６４％の塩化ナトリウム、０．０７５％の塩化カリウム、０．０４８％の塩化カルシウム二水和物、０．０３％の塩化マグネシウム六水和物、０．３９％の酢酸ナトリウム三水和物、０．１７％のクエン酸ナトリウム二水和物、ｐＨ７．５）により、１日６回（およそ午前８時、午前１０時、正午１２時、午後２時、午後４時、及び午後６時）処理し、ＰＲＫを行った６つの眼を、５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ、ＵＳＡ）により、１日６回処理した。ビヒクルまたはロサルタンによる処理を、ＰＲＫ手術後の１か月の間継続した。上皮が閉鎖するまで（すべての眼における上皮は、手術の５日後までに閉鎖した）、ＰＲＫを行った眼を、他の局所医薬物から少なくとも５分間で、さらに１滴の局所シプロフロキサシンにより１日３回処理した。いずれかの群においても、コルチコステロイドを投与しなかった。
手術直後に開始して、ＰＲＫを行った６つの眼を、５０μｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳ、０．６４％の塩化ナトリウム、０．０７５％の塩化カリウム、０．０４８％の塩化カルシウム二水和物、０．０３％の塩化マグネシウム六水和物、０．３９％の酢酸ナトリウム三水和物、０．１７％のクエン酸ナトリウム二水和物、ｐＨ７．５）により、１日６回（およそ午前８時、午前１０時、正午１２時、午後２時、午後４時、及び午後６時）処理し、ＰＲＫを行った６つの眼を、５０μｌのＢＳＳ中の０．８ｍｇ／ｍｌのロサルタン（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ、ＵＳＡ）により、１日６回処理した。ビヒクルまたはロサルタンによる処理を、ＰＲＫ手術後の１か月の間継続した。上皮が閉鎖するまで（すべての眼における上皮は、手術の５日後までに閉鎖した）、ＰＲＫを行った眼を、他の局所医薬物から少なくとも５分間で、さらに１滴の局所シプロフロキサシンにより１日３回処理した。いずれかの群においても、コルチコステロイドを投与しなかった。
【0118】
標準化された細隙灯写真及び角膜混濁のＩｍａｇｅＪ測定
ＰＲＫ及び処理の１か月後に、各々のウサギをケタミン－キシラジンで全身麻酔し、眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）により３０分間拡大させた。各々のウサギにおける研究の眼で、標準化された照明レベル及び照明角度により、Ｔｏｐｃｏｎ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＳＬ－Ｄ７細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で細隙灯写真を撮った。各々の研究角膜について、中央部の３．５ｍｍのＰＲＫアブレーションしたゾーンにおけるピクセルでの平均混濁を、ＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）の使用によって決定した。
ＰＲＫ及び処理の１か月後に、各々のウサギをケタミン－キシラジンで全身麻酔し、眼を、２滴の１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ Ｃｏ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）により３０分間拡大させた。各々のウサギにおける研究の眼で、標準化された照明レベル及び照明角度により、Ｔｏｐｃｏｎ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＳＬ－Ｄ７細隙灯撮影システムによる２０倍拡大で細隙灯写真を撮った。各々の研究角膜について、中央部の３．５ｍｍのＰＲＫアブレーションしたゾーンにおけるピクセルでの平均混濁を、ＩｍａｇｅＪ １．５３ａ分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）の使用によって決定した。
【0119】
角膜の冷凍固定及び切片作成
ウサギを、ケタミン－キシラジンの全身麻酔下で、静脈注射による１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ、ＵＳＡ）、続いて両側性気胸により安楽死させた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）により、角膜－強膜縁を除去した。角膜－強膜縁を、２４ｍｍ×２４ｍｍ×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央に置き、それをｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により充填し、ドライアイス上で急速冷凍した。ブロックを、切片を作成まで－８０℃で保存した。ブロックを角膜の中央で二等分し、１０μｍの厚みの横断切片を、クリオスタット（ＨＭ ５０５Ｍ；Ｍｉｃｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により中央部の角膜から切った。各々の角膜からの切片を、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍのＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡用スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置いた。切片の有るスライドを免疫組織化学（ＩＨＣ）の前に－２０℃で維持した。
ウサギを、ケタミン－キシラジンの全身麻酔下で、静脈注射による１００ｍｇ／ｋｇのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（Ｓｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ、ＵＳＡ）、続いて両側性気胸により安楽死させた。鋭利なＷｅｓｔｃｏｔｔハサミ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び０．１２鉗子（Ｓｔｏｒｚ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）により、角膜－強膜縁を除去した。角膜－強膜縁を、２４ｍｍ×２４ｍｍ×５ｍｍの型（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の中央に置き、それをｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により充填し、ドライアイス上で急速冷凍した。ブロックを、切片を作成まで－８０℃で保存した。ブロックを角膜の中央で二等分し、１０μｍの厚みの横断切片を、クリオスタット（ＨＭ ５０５Ｍ；Ｍｉｃｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により中央部の角膜から切った。各々の角膜からの切片を、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍのＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡用スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置いた。切片の有るスライドを免疫組織化学（ＩＨＣ）の前に－２０℃で維持した。
【0120】
実質のα－平滑筋アクチン及びＩＶ型コラーゲンの免疫組織化学（ＩＨＣ）及び定量化
１）α－平滑筋アクチン及びケラトカン、または２）ＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての二重ＩＨＣを、以前に記載された方法、ならびにウサギ抗原を認識することがウエスタンブロット及びＩＨＣによって確認された一次抗体またはアイソタイプの非特異的対照抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ならびに以前に記載された二次蛍光タグ抗体を使用して遂行した（表１４）。２０
１）α－平滑筋アクチン及びケラトカン、または２）ＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての二重ＩＨＣを、以前に記載された方法、ならびにウサギ抗原を認識することがウエスタンブロット及びＩＨＣによって確認された一次抗体またはアイソタイプの非特異的対照抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ならびに以前に記載された二次蛍光タグ抗体を使用して遂行した（表１４）。２０
【表14】
【0121】
ＩＶ型コラーゲン抗体（カタログＡＢ７６９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、精製されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンに対して生成された（アガロースへ架橋されたヒト及びウシのＩＶ型コラーゲンにより親和性精製され、次いで製造者によってヒト及びウシのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、及びＶＩ型のコラーゲンで交差吸収して、交差反応性が除去された）。このＩＶ型コラーゲン抗体は、ＩＨＣにおいてウサギＩＶ型コラーゲンに結合し６、２０、α－１／α－２鎖に結合するが、α－３～α－６鎖に結合しないことが以前に示された。
【0122】
角膜実質細胞特異的ケラトカン抗体を、ペプチドＨ２Ｎ－ＬＲＬＤＧＮＥＩＫＰＰＩＰＩＤＬＶＡＣ－ＯＨ（配列番号１）に対して作製した。使用されたＴＧＦβ－１抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、ＩＨＣにおいてウサギＴＧＦβ－１に結合し、ＴＧＦβ－２またはＴＧＦβ－３への反応性を示さない。６、２０画像を、ＬＡＳＸソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、自動ステージ及びＬｅｉｃａ ７０００Ｔのカメラを装備したＬｅｉｃａ ＤＭ６Ｂ正立顕微鏡上で１００倍の合計の拡大で得た。
【0123】
すべての画像を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ２２．１．１（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により３００ＤＰＩ、幅９００ピクセル×高さ６７２ピクセルの画像に変換した。実質のα－ＳＭＡまたは実質のコラーゲンＩＶ型の平均ピクセルを、関心のある色のみを示す画像パネルを使用する各々の角膜の３つの切片のＩｍａｇｅＪにより、幅９００ピクセル×高さ２３５ピクセルの四角形（α－ＳＭＡまたはＩＶ型コラーゲンのいずれかの定量化のために）において決定した。３つの角膜切片からの平均を、実質のα－ＳＭＡまたは実質のＩＶ型コラーゲンについての値として個別の角膜のために使用した。
【0124】
統計
群間の比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定に続く事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
群間の比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定に続く事後Ｄｕｎｎ’ｓ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して遂行した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
【0125】
結果
図１０Ａは、－９Ｄ（近視スケールで）ＰＲＫ及び１か月の局所薬物処理の後のビヒクル群及びロサルタン群における、各々の角膜からの標準化された細隙灯写真を提供する。この図は、ＩｍａｇｅＪを使用して、混濁について分析された各々の角膜におけるＰＲＫアブレーション内の均一な中央部の円形の３．５ｍｍの直径領域も示す。図１０Ｂは、ビヒクル処理群及びロサルタン処理群における各々の角膜について分析された３．５ｍｍの直径領域内の混濁の平均ピクセルを示す。ビヒクル群（平均±標準誤差、９３±６ピクセル）とロサルタン群（平均±標準誤差、７７±３）との間の差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０４）。
図１０Ａは、－９Ｄ（近視スケールで）ＰＲＫ及び１か月の局所薬物処理の後のビヒクル群及びロサルタン群における、各々の角膜からの標準化された細隙灯写真を提供する。この図は、ＩｍａｇｅＪを使用して、混濁について分析された各々の角膜におけるＰＲＫアブレーション内の均一な中央部の円形の３．５ｍｍの直径領域も示す。図１０Ｂは、ビヒクル処理群及びロサルタン処理群における各々の角膜について分析された３．５ｍｍの直径領域内の混濁の平均ピクセルを示す。ビヒクル群（平均±標準誤差、９３±６ピクセル）とロサルタン群（平均±標準誤差、７７±３）との間の差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０４）。
【0126】
図１１Ａは、－９Ｄ ＰＲＫ及び１か月の局所薬物処理の後のビヒクル群及びロサルタン群における、中央部の角膜のα－ＳＭＡ及びケラトカンについての代表的な二重免疫組織化学を示す。α－ＳＭＡのみの染色を示すパネル上のＩｍａｇｅＪによるα－ＳＭＡ染色強度の合計のピクセルについて分析された、幅９００ピクセル幅×高さ２３５ピクセルの領域も、各々の角膜について示す。図１１Ｂは、各々の角膜について分析された四角形内のα－ＳＭＡ染色の合計のピクセルのグラフを示す。ビヒクル処理群（平均±標準誤差、１６３０±８４０ピクセル）とロサルタン処理群（平均±標準誤差、１２０±６０ピクセル）との間の差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０１）。ロサルタン群に比較して、ビヒクル群において、はるかに大きい変動（より高い標準誤差）であることに注目されたい。
【0127】
図１２Ａは、代表的な無傷の対照の中央部の角膜、そして－９Ｄ ＰＲＫ及び１か月の局所薬物処理の後のビヒクル群及びロサルタン処理群の角膜における、ＩＶ型コラーゲン及びＴＧＦβ－１についての代表的な例示の二重免疫組織化学を示す。無傷の角膜において、ＴＧＦβ－１は上皮及び角膜内皮に多く局在し、実質においてはより少ない量が検出された。無傷の角膜において、ＩＶ型コラーゲンは、上皮基底膜及びデスメ膜に主として局在し、実質においてほとんど検出されなかった。ＰＲＫ及び１か月のビヒクルまたはロサルタン処理を行った角膜において、ＴＧＦβ－１は依然として上皮及び角膜内皮に局在したが、両方の処理群において上皮基底膜にも顕著に局在した。ビヒクル処理群の角膜において、ＴＧＦβ－１の顕著な線は、その群における各々の角膜のＩ型コラーゲンバンドのちょうど下の実質において存在した。
【0128】
図１２Ａは、－９Ｄ ＰＲＫの１か月後のビヒクル処理群においても、高いレベルのＩＶ型コラーゲンが上皮基底膜の下の上皮下実質においてバンドで存在したことを示す。－９Ｄ ＰＲＫの１か月後のロサルタン処理群において、ＩＶ型コラーゲンは、主として上皮基底膜に局在し、下にある実質前部においてはるかに少量のＩＶ型コラーゲンが検出された。
【0129】
図１２Ｂは、各々の角膜について分析された幅９００ピクセル×高さ２３５ピクセルの実質の四角形内のＩＶ型コラーゲンシグナルの合計のピクセルのグラフである。ビヒクル処理群（６２８７００±３７１００）とロサルタン処理群（１９１０００±９０００）との間の差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．００４）。
【0130】
ＰＲＫ後の角膜の遅発性ヘイズは、手術後の上皮下筋線維芽細胞の発達及び持続性からもたらされる実質の線維化の臨床徴候である。これらの線維芽細胞は、角膜実質細胞に比較して、角膜クリスタリンのダウンレギュレーションに起因して、線維芽細胞自体は不透過性である。２１筋線維芽細胞は、局所の角膜線維芽細胞（角膜実質細胞に由来する）及び骨髄由来線維細胞を含む前駆細胞から発達し、それは角膜損傷に応答して輪部血管から角膜に侵入する。２２、２３一旦成熟筋線維芽細胞が、上皮下実質において発達すれば、それらは大量の無秩序な細胞外マトリックス構成要素（Ｉ型コラーゲン及びコラーゲンＩＩＩ型等）を産生し、それは角膜透明度をさらに損なう。２２筋線維芽細胞前駆体の成熟筋線維芽細胞への発達、及び組織中の筋線維芽細胞の存続は、ＴＧＦβ－１及び／またはＴＧＦβ－２そして、血小板由来増殖因子を含む他の増殖因子の継続的且つ適切な供給に依存する。６、１０
【0131】
複数の研究により、上皮基底膜（ＥＢＭ）（それは上皮及び角膜実質細胞／角膜線維芽細胞の調和的な労力を介して産生される）の再生の遅延または欠損が、遅発性ヘイズ線維化の発達の根底にあることが実証された。６、１０パールカン及びＩＶ型コラーゲンは、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２の上皮及び涙液膜からの実質の中への侵入を調節する重要なＥＢＭ構成要素である。遅発性ヘイズ線維化の発達は、おそらく、実質の混濁、角膜表面へ伝達された不規則性、及びＰＲＫの屈折の効果の退行の組み合わせを介してＰＲＫ後の視力を減少させる。２２一旦遅発性ヘイズがウサギまたはヒト角膜において発達すれば、正常なＥＢＭが再生されるまで存続し、このプロセスは、典型的には、遅発性ヘイズ瘢痕性線維化の発達後に、ウサギでは数か月及びヒトでは数か月から数年かかる。この例において、１か月を分析のために選択したが、それは、１か月が、ウサギにおけるＰＲＫ後に角膜の遅発性ヘイズ線維化のピークであることを多くの研究が示したからである。５～７、１０正常な成熟ＥＢＭの再生は、上皮及び涙液のＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２についてのバリア機能を再確立し、これらの上皮下の実質の線維化促進増殖因子のレベルを低下させ、筋線維芽細胞のアポトーシスを導くか２４、またはおそらく筋線維芽細胞を角膜線維芽細胞表現型へ復帰させることであるが、後者の消失メカニズムはまだインサイチューで実証されていない。一旦実質における筋線維芽細胞が衰えれば、角膜線維芽細胞及び角膜実質細胞は影響を受けた実質組織に再び進入し、筋線維芽細胞によって産生された無秩序な細胞外マトリックスを再吸収／再編成して、角膜透明度を増加させる。２２
【0132】
図１０Ａ中の－９Ｄ ＰＲＫ及び局所ロサルタンによる処理の１か月後での角膜の各々は、筋線維芽細胞の減少にもかかわらず、中央部の混濁の残存を有していた。この混濁は、主として、角膜線維芽細胞によって産生された無秩序な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素（Ｉ型コラーゲン及びコラーゲンＩＩＩ型等）及び手術後のこの早い時点でのロサルタン処理にもかかわらず発達した少数の筋線維芽細胞に起因する。２１、２２筋線維芽細胞の発達の無いＰＲＫを有する多くの角膜は、角膜線維芽細胞によるクリスタリン産生の減少及びこれらの細胞による比較的低レベルの無秩序なＥＣＭの産生に起因して、臨床的に重要でないヘイズを発達させる。２１、２２この一過性の混濁は、典型的には数か月にわたって減少するが、これは、手術へ応答して発達した角膜線維芽細胞が、アポトーシス及び角膜実質細胞表現型への復帰の組み合わせによって消失するからである。２２したがって、この研究の両方の群における角膜は、おそらくより長いフォローアップではより透明になっていただろう。
【0133】
本実施例により、局所ロサルタンが、ＴＧＦβシグナリングを介して角膜線維芽細胞においてもアップレギュレートされる非基底膜実質のＩＶ型コラーゲン産生を減少させることが実証された（図１２Ａ～Ｂ）。１９、２０、２７実質のＩＶ型コラーゲンが、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－２に直接結合して、ＴＧＦβとその受容体との相互作用を調節するように機能すると思われるので２７、このＩＶ型コラーゲン産生の阻害が、全体的なＴＧＦのβ媒介性の線維化応答に対する有害効果を有し得るという懸念があるかもしれない。しかしながら、このことは本実施例において示されていない。
【0134】
実施例３についての参照文献
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【0135】
上記の明細書中で言及されたすべての出版物及び特許は、参照として本明細書に援用される。記載された本発明の組成物及び方法の様々な修飾及び変動は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに、当業者に明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関して記載されてきたが、請求の範囲に記載される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、関連する分野における当業者に明らかな本発明の実行のために記載されたモードの様々な修飾は、本発明の範囲内であることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【配列表】
【国際調査報告】