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特表2024-533163スプライソソーム構成要素のリクルートを介したＲＮＡ編集
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】スプライソソーム構成要素のリクルートを介したＲＮＡ編集
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240905BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240905BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
A61K31/7088
A61P21/00
A61P43/00 105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513942
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-04-01
(86)【国際出願番号】 US2022042486
(87)【国際公開番号】W WO2023034582
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,428
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/345,660
(32)【優先日】2022-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523389442
【氏名又は名称】タシト・セラピューティクス・インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ネルス， デイビッド エー．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA94
4C086ZB21
(57)【要約】
トランススプライシングを促進するための方法及び組成物が開示される。いくつかの実施形態において、組成物は、標的ＲＮＡ分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む。組成物は、ＲＮＡドナー分子を更に含んでもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物。
【請求項2】
標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物であって、前記ＲＮＡドナー分子は、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、前記組成物。
【請求項3】
前記ＲＮＡドナー分子が、操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択されるヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離され、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的で５’末端から１６核酸塩基未満で始まるＲＮＡモチーフを含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的なＲＮＡモチーフを含有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子の前記バリアントが、ｖＵ１．４、ｖＵ１．１１、ｖＵ１．８、ｖＵ１．７、ｖＵ１．５、及びｖＵ１．１２からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記核内低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）前記ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、前記組成物。
【請求項13】
前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ＲＮＡドナー分子中のスプライスドナー部位から２００塩基未満離れて位置する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
前記ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導された配列を含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項19】
前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項22】
前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記ＲＮＡドナー分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
前記翻訳増強エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項27】
前記ＲＮＡドナー分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項28】
前記核酸分子が、異種プロモーターを更に含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物を含む、ベクター。
【請求項30】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される、請求項２９に記載のベクター。
【請求項31】
請求項２９または３０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項32】
疾患を治療するための方法であって、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物または請求項２９もしくは３０に記載のベクターを含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項33】
対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物または請求項２９もしくは３０に記載のベクターを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項34】
疾患を治療するための方法であって、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物または請求項２９もしくは３０に記載のベクターを、治療上有効な量の治療を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項35】
対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物または請求項２９もしくは３０に記載のベクターを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３日に出願された米国仮出願第６３／２４０，４２８号、及び２０２２年５月２５日に出願された米国仮出願第６３／３４５，６６０号の利益を主張するものであり、これらの出願は、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年９月３日に出願された米国仮出願第６３／２４０，４２８号、及び２０２２年５月２５日に出願された米国仮出願第６３／３４５，６６０号の利益を主張するものであり、これらの出願は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
疾患の原因となるＲＮＡ配列を置き換えるというニーズは、長年望まれているが、未だ満たされていない。本開示は、ヒト細胞のＲＮＡ分子中の特定のＲＮＡ配列を置換するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本開示は、標的ＲＮＡ内の選択されたＲＮＡ配列を置換するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト遺伝子療法との関係において、スプライソソームの構成要素をＲＮＡドナーにリクルートし、標的ＲＮＡの編集を促進して、疾患を治療する、操作された核内低分子ＲＮＡとともに使用されるＲＮＡドナー分子を提供する。
【0003】
ヒト遺伝子疾患の効果的な治療は、ヒト細胞の欠陥的遺伝子配列を効率的に置換することが必要である。ＲＮＡ編集は、ヒト遺伝子治療として提案されているが、効率が低く、ＲＮＡ編集のサイズ及び組成が限られているため、臨床試験では成功していない。更に、ＲＮＡ及びＤＮＡの編集に免疫原性タンパク質を使用することは、安全性の問題が伴う。本開示は、長年望まれているが満たされていないこのニーズに対処し得るＲＮＡ編集の改善について記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
特定の態様において、本明細書で開示されるのは、標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択されるヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離される。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離され、ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的で５’末端から１６核酸塩基未満で始まるＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的なＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及びＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントは、ｖＵ１．４、ｖＵ１．１１、ｖＵ１．８、ｖＵ１．７、ｖＵ１．５、ｖＵ１．１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核内低分子ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、翻訳増強エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、異種プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書で開示される請求項の組成物を含むベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるベクターを含む細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを、治療上有効な量の治療を必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。
【0005】
特定の態様において、本明細書で開示されるのは、標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物であって、ＲＮＡドナー分子は、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、組成物である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択されるヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離される。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離され、ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的で５’末端から１６核酸塩基未満で始まるＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的なＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された低分子ＲＮＡ分子は、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及びＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントは、ｖＵ１．４、ｖＵ１．１１、ｖＵ１．８、ｖＵ１．７、ｖＵ１．５、ｖＵ１．１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核内低分子ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、翻訳増強エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、異種プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書で開示される請求項の組成物を含むベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるベクターを含む細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを、治療上有効な量の治療を必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。
【0006】
特定の態様において、本明細書で開示されるのは、ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、組成物である。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡドメインは、ＲＮＡドナー分子中のスプライスドナー部位から２００塩基未満離れて位置する。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡドメインは、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される。いくつかの実施形態において、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡドメインは、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡドメインは、ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡドメインは、ヒトＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及びＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、少なくとも４ヌクレオチド長であり、ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、翻訳増強エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、異種プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書で開示される請求項の組成物を含むベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるベクターを含む細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを、治療上有効な量の治療を必要とする患者に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載されるベクターを当該対象に投与することを含む、方法である。
【0007】
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】Ａ～Ｃは、本明細書に記載される方法の一実施形態を示す。Ａは、直接的に疾患に寄与する（「ＲＮＡ病原性」）または疾患原因タンパク質への翻訳を介して間接的に疾患に寄与する（「病原性タンパク質の翻訳」）、変異した（「欠陥的」）ＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるヒト遺伝子疾患の概念を示す。Ｂは、ドナーＲＮＡ及び操作された核内低分子ＲＮＡ（「ｅｓｎＲＮＡ」）から構成されるシステムを示す。ＲＮＡドナー分子とｅｓｎＲＮＡを組み合わせることで、変異を持つ標的ＲＮＡにＲＮＡドナーがハイブリダイゼーションし、続いて、ｅｓｎＲＮＡとＲＮＡドナーが会合することにより、スプライソソーム構成要素がリクルートされ、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間でトランススプライシングが生じることにより、変異したＲＮＡが修正される。これにより、標的ＲＮＡ中の選択された配列がＲＮＡドナー分子で置き換えられた、修正された標的ＲＮＡが得られる。Ｃは、構成要素がどのように相互作用するかを示す。ＲＮＡドナーと標的ＲＮＡとの間の塩基対形成により、これらの分子が近接する。ｅｓｎＲＮＡとＲＮＡドナーとの間の塩基対形成により、スプライソソーム構成要素が近接し、標的ＲＮＡとＲＮＡドナーとの間のトランススプライシング反応が促進される。
【0009】
【図2】Ａ～Ｂは、２つの非限定的な実施形態を示す。Ａは、標的ＲＮＡ分子内の内部配列に置換をもたらすバージョンを示す。この実施形態では、標的ＲＮＡの５’末端及び３’末端を保持しながら、内部配列をＲＮＡドナー分子で置き換える。Ｂは、標的ＲＮＡの３’末端を保持しながら、標的ＲＮＡの５’末端部分の置換をもたらすことを示す。
【0010】
【0011】
【図4】Ａ～Ｄは、標的ＲＮＡ中の内部配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡの重要性を明らかにするために設計された実験を示す。Ａは、ＧＦＰのＮ末端及びＣ末端部分（「Ｃ－ＧＦＰ」）を持つが、蛍光に必要な内部ＧＦＰ配列を欠くスプリットＧＦＰレポーターの設計を示す。レポーターでは、この内部ＧＦＰ配列は、イントロンによって挟まれた終止コドンを持つ短いエクソンで置き換えられている。内部配列は、１つのイントロンドメイン及び１つのアンチセンスドメインによって挟まれたＲＮＡドナー分子内の置換配列である。Ｂは、レポーター単独の活性を示すものであり、シススプライシングにより終止コドンで中断されたＧＦＰ配列が生成されるので、ＧＦＰシグナルは生成されない。Ｃは、ｅｓｎＲＮＡを含まないＲＮＡドナー分子の存在下でのレポーターの活性を示すものであり、同様にシススプライシングが主に生じることから、ＧＦＰシグナルは生成されない。Ｄは、ｅｓｎＲＮＡを含むＲＮＡドナー分子の存在下でのレポーターの活性を示すものであり、トランススプライシングが主に生じることから、ＧＦＰシグナルが生成される。
【0012】
【図5】Ａ～Ｂは、標的ＲＮＡ中の５’末端配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡの重要性を明らかにするために設計された実験を示す。Ａは、ＧＦＰのＣ末端部分（「Ｃ－ＧＦＰ」）を持つが、蛍光に必要なＮ末端ＧＦＰ配列を欠くスプリットＧＦＰレポーターの設計を示す。レポーターでは、このＮ末端ＧＦＰ配列は、イントロンによって挟まれた短いエクソンで置き換えられている。Ｎ末端配列（「Ｎ－ＧＦＰ」）は、１つのイントロン配列及び１つのアンチセンスドメインによって挟まれたＲＮＡドナー分子内の置換配列である。Ｂは、レポーター単独の活性を示すものであり、シススプライシングによりＧＦＰのＮ末端部分が欠けたＧＦＰ配列が生成されるので、ＧＦＰシグナルは生成されない。Ｃは、ｅｓｎＲＮＡを含まないＲＮＡドナー分子の存在下でのレポーターの活性を示すものであり、同様にシススプライシングが主に生じることから、ＧＦＰシグナルは効率的に生成されない。Ｄは、ｅｓｎＲＮＡを含むＲＮＡドナー分子の存在下でのレポーターの活性を示すものであり、トランススプライシングが主に生じることから、ＧＦＰシグナルが効率的に生成される。
【0013】
【図6】Ａは、標的ＲＮＡ内の特定の配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡの特定の特徴の重要性を調べた実験データである。ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡから誘導されるが、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な領域を生成する変異を５’末端に持つ、様々なｅｓｎＲＮＡ（Ａ～Ｈと表記）を構築した。これらのアンチセンスドメインの標的をＢに概説する。ヒト細胞を、図５に記載されるレポーターシステムとともに、ＲＮＡドナー及び様々なｅｓｎＲＮＡで処理した。それにより得られたＧＦＰシグナルは、２つのｅｓｎＲＮＡ（「ｅｓｎＲＮＡ Ｂ」及び「ｅｓｎＲＮＡ Ｃ」）が最も高いＧＦＰシグナルを示し、したがって、標的ＲＮＡへＲＮＡドナー分子が最も効率的に挿入されたことを示している。これらのデータは、ｅｓｎＲＮＡによる標的ＲＮＡへのＲＮＡドナー配列への効率的な挿入を達成するには、標的部位の選択が重要な因子であることを示している。「陰性対照」は、ＲＮＡドナーがレポーターを標的とするアンチセンスドメインを含有しない実験条件を指す。「ｗｔ ｅｓｎＲＮＡ」は、ＲＮＡドナーが確かにレポーターを標的とするが、ｅｓｎＲＮＡが未改変の野生型ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡと同一である実験条件を指す。
【0014】
【図7】標的ＲＮＡ内の特定の配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡの存在の重要性を調べた実験データである。ｅｓｎＲＮＡ分子が存在しない場合、シーケンシングしたクローンは、全長ＧＦＰとアライメントしなかった（右パネルに示した２３個のシーケンシングしたクローンのうち０個）。ｅｓｎＲＮＡの存在下では、４つのクローンが全長ＧＦＰとアライメントした（右パネルに示した２４個のシーケンシングしたクローンのうち４個）。これらの完全にアライメントしたクローンを「クローン１～４」と表示した。ＲＮＡドナー由来の配列と標的ＲＮＡ由来の配列の接合部で隣接するこれらのクローンの配列は、全てのクローン間で完全なアライメントを示し、予想される全長ＧＦＰ配列を示している。
【0015】
【図8】Ａ～Ｂは、標的ＲＮＡ内の特定の配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡの様々な特徴の重要性を調べた実験データである。細胞を、ｅｓｎＲＮＡ ＢまたはｅｓｎＲＮＡ Ｂの様々な変異型、及び図５に概説したレポーターシステム（ＲＮＡドナー及びレポーター）でトランスフェクトした。それにより得られたＧＦＰシグナルは、ｅｓｎＲＮＡ内のステムループ構造の存在がｅｓｎＲＮＡの活性に重要であることを示している。実際、スプライソソーム因子をリクルートするステムループ構造（ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ４）の除去または変異は、標的ＲＮＡへのＲＮＡドナーの挿入を低下させる。Ａは、結果を示す。Ｂは、様々な変異を示す。
【0016】
【図9】Ａ～Ｂは、標的ＲＮＡ内の特定の配列の置換との関係におけるｅｓｎＲＮＡ内のアンチセンスドメインの重要性を調べた実験データである。細胞を、ｅｓｎＲＮＡ ＢまたはｅｓｎＲＮＡ Ｂの様々な変異型、及び図５に概説したレポーターシステム（ＲＮＡドナー及びレポーター）でトランスフェクトした。それにより得られたＧＦＰシグナル（Ａ）は、ＲＮＡドナーに対して相補的なｅｓｎＲＮＡ中の配列の長さを減らすと、ＧＦＰシグナルが低くなり、それにより、標的ＲＮＡへのＲＮＡドナーの効率的な挿入が少なくなることを示している。ｅｓｎＲＮＡ「＋」は、ＲＮＡドナーに対して１０塩基の相補配列を含有するｅｓｎＲＮＡの存在を示す。「９ｂ」、「４ｂ」、及び「２ｂ」は、ｅｓｎＲＮＡとＲＮＡドナーとの間にそれぞれ９塩基、４塩基、及び２塩基の相補配列があることを示す（Ｂ）。ＲＮＡドナーの「＋」は、標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含有するＲＮＡドナーの存在を示し、「－」は、標的ＲＮＡに対して相補的でない対照ＲＮＡドナーの存在を示す。Ａは、結果を示す。Ｂは、様々な変異を示す。
【0017】
【図10】標的ＲＮＡ内の特定の配列の置換との関係における様々なｅｓｎＲＮＡの活性を記述する実験データである。Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及びＵ１ ｓｎＲＮＡのバリアントから誘導される様々なｅｓｎＲＮＡ（番号１～６１及びｅｓｎＲＮＡ Ｂと比較）を構築した。ｅｓｎＲＮＡは全て、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な領域を生成する変異を５’末端に持っている。ヒト細胞を、図５に記載されるレポーターシステムとともに、ＲＮＡドナー及び様々なｅｓｎＲＮＡで処理した。それにより得られるＧＦＰシグナルは、ＲＮＡ編集に関連する効率を示す。これらのデータは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡのバリアントから誘導された配列の使用がトランススプライシングによるＲＮＡ編集効率を高めるのに重要な手段であることを示している。
【発明を実施するための形態】
【0018】
一態様において、本明細書で開示されるのは、生細胞内の特定のＲＮＡ分子中の任意の配列の置換を可能にするＲＮＡ技術である。理論に拘束されるものではないが、ＲＮＡトランススプライシングに基づくこの技術は、このトランススプライシングプロセスの触媒活性を提供するために、ヒト細胞内に自然に存在するスプライソソームを利用する。典型的に、ＲＮＡスプライシングは、ＲＮＡ分子内で生じ、未成熟メッセンジャーＲＮＡ分子（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）から、エクソンが連結され、イントロンが除去されて、成熟メッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）が形成される。このプロセスは、シススプライシングと称される。ＲＮＡトランススプライシングは、スプライソソームが明確に異なる別個のＲＮＡ分子から誘導されるエクソンを連結するプロセスである。このプロセスは、ヒト細胞では稀にしか生じないが、ＲＮＡトランススプライシングを促進する最新システムは、低レベルで活性である。本明細書に記載されるのは、ＲＮＡトランススプライシングの効率を高める組成物である。これらの改善されたＲＮＡトランススプライシング組成物は、標的ＲＮＡ分子内の変異配列を置き換えて、ヒト疾患に対処するために使用することができる。任意のＲＮＡ配列の置換は、無数の特定用途がある一般的な能力であり、そのいくつかは、関連する実証実験として探求されている。ＲＮＡトランススプライシングは、操作された配列を標的ＲＮＡに挿入し、ＲＮＡ安定性の改変またはＲＮＡ翻訳の改変など、標的ＲＮＡに新たな活性を付与することができる。この特徴を使用して、標的ＲＮＡによるタンパク質の生成を増加させることができる。その最も広範な意味で、このＲＮＡトランススプライシング技術は、標的ＲＮＡのコーディング領域とノンコーディング領域の両方に任意の変化を与えることができる。
【0019】
ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子の使用を伴う本開示のＲＮＡトランススプライシング技術は、複数のＲＮＡ標的に対するＲＮＡトランススプライシングを高効率で示す初めての技術である。高効率のＲＮＡトランススプライシングは、これまでのＲＮＡトランススプライシングシステムにはない３つの主な利点がある。第１に、この効率の改善により、変異遺伝子の活性を再構成するのに十分なレベルで欠陥的ＲＮＡ配列を置き換え、劣性遺伝子障害を治療することができる。事実、多くの劣性遺伝子障害の治療には少なくとも１５％の効率が必要であり、１００％の効率は標的ＲＮＡ内の配列の完全な置換である。第２に、この効率の改善により、毒性獲得型変異を伴う遺伝子障害を治療するのに十分なレベルで欠陥的ＲＮＡ配列を置き換えることができる。これらの疾患を治療するには、毒性変異を持つＲＮＡを排除することが必要とされるため、このクラスの多くの疾患には、変異配列の高効率での置換が必要である。その結果、更に高い効率が求められる（５０％＋）。最後に、本明細書に記載されるＲＮＡトランススプライシング技術は、複数の標的ＲＮＡを修正する幅広い能力があることから、この技術のなかでも広く適用可能で効率的なものであることを示している。これは、極めて一般的な能力であり、本開示は、複数の標的ＲＮＡの配列を効率的に置き換えることができるＲＮＡトランススプライシングシステムの実証を提供する。
【0020】
本技術を形成するためにｅｓｎＲＮＡ分子を組み込むことで、標的ＲＮＡのコーディング配列とノンコーディング配列の両方を改変することを更に可能にする能力が得られる。標的ＲＮＡの５’または３’非翻訳領域を高効率で置き換えることによって、翻訳またはターンオーバーなどのＲＮＡの挙動を変えることができる。これらの作用の最終結果として、標的ＲＮＡからのタンパク質の増加またはＲＮＡレベルの変化に伴う他の下流への効果が生じる。
【0021】
トランススプライシングを促進するためのＲＮＡ分子
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、トランススプライシングを促進するためのＲＮＡ分子を含む。一態様において、本明細書に記載されるのは、ＲＮＡドナー分子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナーは、標的ＲＮＡ分子及びｅｓｎＲＮＡ分子と結合して、トランススプライシングを促進する。別の実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ｅｓｎＲＮＡドメインを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、トランススプライシングを促進するためのＲＮＡ分子を含む。一態様において、本明細書に記載されるのは、ＲＮＡドナー分子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナーは、標的ＲＮＡ分子及びｅｓｎＲＮＡ分子と結合して、トランススプライシングを促進する。別の実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ｅｓｎＲＮＡドメインを含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ｅｓｎＲＮＡドメインを含まない。一例は、図３Ａに示される。一態様において、本明細書に記載されるのは、ｅｓｎＲＮＡ分子及び３つのドメインを含むＲＮＡドナー分子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、置換ドメインを含む。置換ドメインは、トランススプライシング反応を介して標的ＲＮＡ分子に挿入され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、標的ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシング反応を促進するイントロンドメインを含む。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子は、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導されるが、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な配列を含有するように改変されている。理論に拘束されるものではないが、トランススプライシングＲＮＡドナー分子と、ＲＮＡドナー分子と接触するｅｓｎＲＮＡの組み合わせにより、ヒト細胞の疾患原因ＲＮＡ配列を十分に効率的に置き換えて疾患に対処する様式で、標的ＲＮＡ内の選択された配列の置換がもたらされる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列特異的な様式で疾患原因ＲＮＡ分子を標的とし、これらのＲＮＡ分子内の疾患原因ＲＮＡ配列を高効率で置き換えるための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡの実装は、疾患原因配列の置換または操作された配列の標的ＲＮＡへの挿入を含む様々な状況において有用性を示す。いくつかの実施形態において、操作された配列は、標的ＲＮＡの翻訳または安定性を改変し、タンパク質産生または標的ＲＮＡレベルを増加または減少させることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞、ならびにトランススプライシングＲＮＡ組成物を使用する方法を提供する。
【0023】
特定の態様において、本明細書に記載されるのは、ヒトスプライソソームｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された操作された核内低分子ＲＮＡ（「ｅｓｎＲＮＡ」）分子と、（ａ）トランススプライシングを促進する少なくとも１つのドメイン（「イントロンドメイン」）、（ｂ）ヒト細胞内に存在するｐｒｅ－ｍＲＮＡ（「標的ＲＮＡ」）に対して相補的な配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの結合ドメイン（「アンチセンスドメイン」）、及び（ｃ）トランススプライシングを介して標的ＲＮＡに挿入されるコーディングドメイン（「置換ドメイン」）を含むＲＮＡドナー分子とを含む、組成物である。ｅｓｎＲＮＡ分子がＲＮＡドナー分子と結合し、スプライソソーム構成要素をリクルートすることで、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングが促進され、それにより、ＲＮＡドナー分子配列が標的ＲＮＡに挿入される。他の実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む、組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡをそれぞれコードする２つの核酸配列を含む、組成物を提供する。
【0024】
特定の態様において、本明細書に記載されるのは、２つのドメイン（ＲＮＡドナードメイン及びｅｓｎＲＮＡドメイン）を含有する単一のＲＮＡ分子であり、ここで、単一のＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ分子と選択的に結合し、標的ＲＮＡ分子とのトランススプライシング反応を高効率で促進する。特定の態様において、本開示は、単一のＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞を提供する。特定の態様において、本開示は、疾患または障害を治療するために、本開示の単一のＲＮＡ分子、ベクター、組成物及び細胞を使用する方法を提供する。
【0025】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ｅｓｎＲＮＡドメインを含む。一例は、図３Ｂに示される。一態様において、本明細書で開示されるのは、少なくとも４つのドメインを含むＲＮＡドナー分子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、置換ドメインを含む。置換ドメインは、トランススプライシング反応を介して標的ＲＮＡ分子に挿入され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、標的ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシング反応を促進するイントロンドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導されたｅｓｎＲＮＡドメインを含む。
【0026】
本開示は、いくつかの実施形態において、（ａ）トランススプライシングを促進する少なくとも１つのドメイン（「イントロンドメイン」）、（ｂ）ヒト細胞内に存在するｐｒｅ－ｍＲＮＡ（「標的ＲＮＡ」）に対して相補的な配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの結合ドメイン（「アンチセンスドメイン」）、（ｃ）トランススプライシングを介して標的ＲＮＡに挿入されるコーディングドメイン（「置換ドメイン」）、及び（ｄ）ｅｓｎＲＮＡ配列を含む操作された核内低分子ＲＮＡ（「ｅｓｎＲＮＡ」）ドメインを含むＲＮＡドナー分子を含む、組成物を提供する。ｅｓｎＲＮＡドメインは、スプライソソーム構成要素をリクルートすることで、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングが促進され、それにより、ＲＮＡドナー分子配列が標的ＲＮＡに挿入される。他の実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子をコードする核酸配列を含む、組成物を提供する。
【0027】
ｅｓｎＲＮＡ分子及びドメイン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、ｅｓｒＲＮＡドメインを含むｅｓｎＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、ｅｓＲＮＡドメインを含むＲＮＡドナー分子を含む。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離され、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、ｅｓｒＲＮＡドメインを含むｅｓｎＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、ｅｓＲＮＡドメインを含むＲＮＡドナー分子を含む。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離され、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される。
【0028】
本明細書で開示されるｅｓｎＲＮＡ分子及びｅｓｎＲＮＡドメインを含む組成物は、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された任意の配列を含む。核内低分子ＲＮＡ遺伝子には、限定するものではないが、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２が含まれる。ｅｓｎＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な配列を含有し得る。この相補配列は、ｅｓｎＲＮＡ分子の５’末端またはその近傍に位置し得る。相補配列には、限定するものではないが、５’ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’が含まれる。いくつかの実施形態において、上記の相補配列は、チミジン塩基の一部または全てがウラシルに置き換えられていてもいなくてもよく、トランススプライシングエンハンサー配列は、限定するものではないが、５’－ＣＧＡＧＣＵＣＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＵＣＵ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＵＡＵＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＵＡＡＵＡＵＣＧ－３’、５’－ＵＡＡＧＡＧＡＧＣＵ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＵＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＵＣＧＵＵＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＵＣＧＵ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＵＣＧＵＵＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＵＣＧＵＵＧ－３’を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された１つ以上のステムループ形成ＲＮＡ配列を含有する。一実施形態において、そのようなｅｓｎＲＮＡドメインは、その対応する野生型配列または元の配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する。一実施形態において、そのようなｅｓｎＲＮＡドメインは、その対応する野生型配列または元の配列に対して、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９１％、最大約９２％、最大約９３％、最大約９４％、最大約９５％、最大約９６％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【0030】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子またはｅｓｎＲＮＡドメインは、いかなる生物にも由来せず、スプライソソームタンパク質と結合する合成配列から構成される。
【0031】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、置換ドメインから少なくとも約１ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、ＲＮＡドナー分子中の置換配列の最初または最後のヌクレオチドから５’方向に、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約３ヌクレオチド、少なくとも約４ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約６ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約９ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１３ヌクレオチド、少なくとも約１４ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３１ヌクレオチド、少なくとも約３１ヌクレオチド、少なくとも約３２ヌクレオチド、少なくとも約３３ヌクレオチド、少なくとも約３４ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチド、少なくとも約３７ヌクレオチド、少なくとも約３８ヌクレオチド、少なくとも約３９ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４１ヌクレオチド、少なくとも約４２ヌクレオチド、少なくとも約４３ヌクレオチド、少なくとも約４４ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約４６ヌクレオチド、少なくとも約４７ヌクレオチド、少なくとも約４８ヌクレオチド、少なくとも約４９ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、または５００ヌクレオチド以上離れて位置する。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡドメインは、ＲＮＡドナー分子中の置換配列の最初または最後のヌクレオチドから５’方向に、最大約２ヌクレオチド、最大約３ヌクレオチド、最大約４ヌクレオチド、最大約５ヌクレオチド、最大約６ヌクレオチド、最大約７ヌクレオチド、最大約８ヌクレオチド、最大約９ヌクレオチド、最大約１０ヌクレオチド、最大約１１ヌクレオチド、最大約１２ヌクレオチド、最大約１３ヌクレオチド、最大約１４ヌクレオチド、最大約１５ヌクレオチド、最大約１６ヌクレオチド、最大約１７ヌクレオチド、最大約１８ヌクレオチド、最大約１９ヌクレオチド、最大約２０ヌクレオチド、最大約２１ヌクレオチド、最大約２２ヌクレオチド、最大約２３ヌクレオチド、最大約２４ヌクレオチド、最大約２５ヌクレオチド、最大約２６ヌクレオチド、最大約２７ヌクレオチド、最大約２８ヌクレオチド、最大約２９ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約３１ヌクレオチド、最大約３１ヌクレオチド、最大約３２ヌクレオチド、最大約３３ヌクレオチド、最大約３４ヌクレオチド、最大約３５ヌクレオチド、最大約３６ヌクレオチド、最大約３７ヌクレオチド、最大約３８ヌクレオチド、最大約３９ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約４１ヌクレオチド、最大約４２ヌクレオチド、最大約４３ヌクレオチド、最大約４４ヌクレオチド、最大約４５ヌクレオチド、最大約４６ヌクレオチド、最大約４７ヌクレオチド、最大約４８ヌクレオチド、最大約４９ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約５５ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約６５ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約７５ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約８５ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約９５ヌクレオチド、最大約１００ヌクレオチド、最大約１１０ヌクレオチド、最大約１２０ヌクレオチド、最大約１３０ヌクレオチド、最大約１４０ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１６０ヌクレオチド、最大約１７０ヌクレオチド、最大約１８０ヌクレオチド、最大約１９０ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約３００ヌクレオチド、最大約４００ヌクレオチド、最大約５００ヌクレオチド、または最大約５００ヌクレオチド以上離れて位置する。
【0032】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、トランススプライシングを促進するｅｓｎＲＮＡ配列が存在し得る。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡは、ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離される。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、配列ｅｓｎＲＮＡは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡバリアントから誘導または単離される。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、Ｕ１ ｓｎＲＮＡバリアントは、以下からなるリストから選択される（名称の後の括弧内はＵＣＳＣヒトゲノムアセンブリ２００６に従ったゲノム位置である）：ｔＵ１．１［ｃｈｒ１：１６７１３３６７－１６７１２９６７］、ｔＵ１．２［ｃｈｒ１：１６８６６０３０－１６８６５６３０］、ｖＵ１．１［ｃｈｒ１：１４２４３８７００－１４２４３８３００］、ｖＵ１．２［ｃｈｒ１：１４２４６４８１３－１４２４６４４１３］、ｖＵ１．４［ｃｈｒ１：１４３０２２７３９－１４３０２２３３９］、ｖＵ１．５［ｃｈｒ１：１４３２０２９６８－１４３２０２５６８］、ｖＵ１．７［ｃｈｒ１：１４４６８０７９０－１４４６８０３９０］、ｖＵ１．８［ｃｈｒ１：１４５０２２９２７－１４５０２２５２７］、ｖＵ１．９［ｃｈｒ１：１４５９７７７９１－１４５９７７３９１］、ｖＵ１．１０［ｃｈｒ１：１４６３０１２８９－１４６３００８８９］、ｖＵ１．１１［ｃｈｒ１：１４６３２７４２７－１４６３２７０２７］、ｖＵ１．１５［ｃｈｒ１：１４６８７１６９６－１４６８７１２９６］、ｖＵ１．１６［ｃｈｒ１：１４７０３３７２６－１４７０３３３２６］、ｖＵ１．１７［ｃｈｒ１：１４７４６０８９３－１４７４６０４９３］、ｖＵ１．１８［ｃｈｒ１：１４７４９０８４５－１４７４９０４４５］、ｖＵ１．１９［ｃｈｒ１：１４７７８０８８０－１４７７８０４８０］、ｔＵ１．３［ｃｈｒ１：１６９３９７６２－１６９４０１６２］、ｔＵ１．４［ｃｈｒ１：１７０９５２２６－１７０９５６２６］、ｖＵ１．３［ｃｈｒ１：１４２４７８８７６－１４２４７９２７６］、ｖＵ１．６［ｃｈｒ１：１４４０９４１１４－１４４０９４５１４］、ｖＵ１．１２［ｃｈｒ１：１４６３４１４８６－１４６３４１８８６］、ｖＵ１．１３［ｃｈｒ１：１４６４６０７７０－１４６４６１１７０］、ｖＵ１．１４［ｃｈｒ１：１４６６０８０８９－１４６６０８４８９］、ｖＵ１．２０［ｃｈｒ１：１４７８７２５３５－１４７８７２９３５］。
【0033】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0034】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0035】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0036】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0037】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＡＧＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＣＧＣを含むか、またはそれらからなる。
【0038】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0039】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0040】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＴＡＧＡＴＡＡＴＡＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0041】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＴＡＧＴＴＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴを含むか、またはそれらからなる。
【0042】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１０）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧを含むか、またはそれらからなる。
【0043】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＡＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧを含むか、またはそれらからなる。
【0044】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0045】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１３）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＣＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0046】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0047】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１５）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0048】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0049】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0050】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0051】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ１９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＡＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0052】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２０）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0053】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0054】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0055】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２３）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＴＡＧＴＴＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0056】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0057】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２５）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＡＣＧＣＧＡＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0058】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0059】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＧＡＴＡＣＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0060】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇＧＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0061】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ２９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0062】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３０）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0063】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0064】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0065】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３３）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＧＡＡｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0066】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0067】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３５）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0068】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0069】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0070】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0071】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ３９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0072】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＴＣＴＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＴｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0073】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0074】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0075】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0076】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0077】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＴＡＧＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＴａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0078】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ４９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0079】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0080】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５２）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0081】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５３）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0082】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５４）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0083】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５５）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0084】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５６）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0085】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５７）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＡＣａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇを含むか、またはそれらからなる。
【0086】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５８）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0087】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ５９）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0088】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ６０）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0089】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡの配列は、（ｅｓｎＲＮＡ６１）：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧを含むか、またはそれらからなる。
【0090】
アンチセンスドメイン
本開示のいくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスドメインは、標的配列に結合する。本開示のいくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスドメインは、標的ＲＮＡに結合する。
本開示のいくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスドメインは、標的配列に結合する。本開示のいくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスドメインは、標的ＲＮＡに結合する。
【0091】
本開示のいくつかの実施形態において、アンチセンスドメインは、トランススプライシングの成功により、標的ＲＮＡ中のマイクロオープンリーディングフレームが除去されるように選択される。このようにして、トランススプライシングシステムは、マイクロオープンリーディングフレームを除去し、標的ＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。
【0092】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、アンチセンスドメインを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスドメインを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に対して、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８７％、最大約９０％、最大約９１％、最大約９２％、最大約９３％、最大約９４％、最大約９５％、最大約９６％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスドメインは、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスドメインは、標的ＲＮＡ配列に対して相補的である間に、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２１０ヌクレオチド、少なくとも約２２０ヌクレオチド、少なくとも約２３０ヌクレオチド、少なくとも約２４０ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２６０ヌクレオチド、少なくとも約２７０ヌクレオチド、もしくは少なくとも約２７０を超えるヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスドメインは、標的ＲＮＡ配列に対して相補的である間に、最大約２０ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約１００ヌクレオチド、最大約１１０ヌクレオチド、最大約１２０ヌクレオチド、最大約１３０ヌクレオチド、最大約１４０ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１６０ヌクレオチド、最大約１７０ヌクレオチド、最大約１８０ヌクレオチド、最大約１９０ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２１０ヌクレオチド、最大約２２０ヌクレオチド、最大約２３０ヌクレオチド、最大約２４０ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約２６０ヌクレオチド、最大約２７０ヌクレオチド、または最大約２７０を超えるヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【0093】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的配列は、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２７５ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３２５ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３７５ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４２５ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約４７５ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、または５００を超えるヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、標的配列は、最大約５ヌクレオチド、最大約１０ヌクレオチド、最大約１５ヌクレオチド、最大約２０ヌクレオチド、最大約２５ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約３５ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約４５ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約５５ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約６５ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約７５ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約８５ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約９５ヌクレオチド、最大約１００ヌクレオチド、最大約１２５ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１７５ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２２５ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約２７５ヌクレオチド、最大約３００ヌクレオチド、最大約３２５ヌクレオチド、最大約３５０ヌクレオチド、最大約３７５ヌクレオチド、最大約４００ヌクレオチド、最大約４２５ヌクレオチド、最大約４５０ヌクレオチド、最大約４７５ヌクレオチド、もしくは最大約５００ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、標的配列は、約５～約５００ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、標的配列は、約５０～約２５０ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、標的配列は、約５～約５０ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【0094】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、病原性ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、本開示のトランススプライシングＲＮＡのアンチセンスドメインに対して相補的な標的配列を含む。
【0095】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的配列は、標的ＲＮＡの単一の連続ストレッチ内に含まれる。いくつかの実施形態において、標的配列は、標的ＲＮＡの単一の連続ストレッチ間に広がっていない１つ以上のヌクレオチドから構成されるか、またはそれを含み得る。
【0096】
いくつかの実施形態において、アンチセンスドメインは、疾患原因変異を持つ場合がある標的ＲＮＡをコードする遺伝子（角括弧内は対応するアクセッション番号、括弧内は対応する疾患）に対して相補的であり、以下からなる群から選択される：ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ［ＥＮＳＧ０００００２４０５０５］（分類不能型免疫不全症）；ＡＤＡ、ＣＥＣＲ１［ＥＮＳＧ０００００１９６８３９、ＥＮＳＧ００００００９３０７２］（アデノシンデアミナーゼ欠損症）；ＩＬ２ＲＧ［ＥＮＳＧ０００００１４７１６８］（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）；ＨＢＢ［ＥＮＳＧ０００００２４４７３４］（ベータ－サラセミア）；ＨＢＡ１、ＨＢＡ２［ＥＮＳＧ０００００２０６１７２、ＥＮＳＧ０００００１８８５３６］（アルファ－サラセミア）；Ｕ２ＡＦ１［ＥＮＳＧ０００００１６０２０１］（骨髄異形成症候群）；ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＭＡＴＲ３、ＳＯＤ１、Ｃ９ＯＲＦ７２［ＥＮＳＧ０００００１４２１６８、ＥＮＳＧ０００００１２０９４８、ＥＮＳＧ００００００８９２８０、ＥＮＳＧ００００００１５４７９、ＥＮＳＧ０００００１４２１６８、ＥＮＳＧ０００００１４７８９４］（筋萎縮性側索硬化症）；ＭＡＰＴ、ＰＧＲＮ［ＥＮＳＧ０００００１８６８６８、ＥＮＳＧ００００００３０５８２］（パーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症）；ＣＤＨ２３、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ［ＥＮＳＧ０００００１０７７３６、ＥＮＳＧ０００００１３７４７４、ＥＮＳＧ００００００４２７８１］（アッシャー症候群）；ＧＡＬＣ［ＥＮＳＧ００００００５４９８３］（クラッベ病）；ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２［ＥＮＳＧ０００００１６６３１１、ＥＮＳＧ０００００１４１４５８、ＥＮＳＧ０００００１１９６５５］（ニーマン・ピック病）；ＰＲＮＰ［ＥＮＳＧ０００００１７１８６７］（プリオン病）；ＳＣＮ１Ａ［ＥＮＳＧ０００００１４４２８５］（ドラヴェ症候群）；ＰＩＮＫ１、ＡＴＰＧＡＰ２［ＥＮＳＧ０００００１５８８２８］（若年性パーキンソン病）；ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＰＲ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ１、ＦＧＦ１４［ＥＮＳＧ０００００１２４７８８、ＥＮＳＧ０００００２０４８４２、ＥＮＳＧ００００００６６４２７、ＥＮＳＧ０００００１９６１５５、ＥＮＳＧ０００００１７３８９８、ＥＮＳＧ０００００１４１８３７、ＥＮＳＧ０００００１６３６３５、ＥＮＳＧ０００００１２８８８１、ＥＮＳＧ０００００１５６４７５、ＥＮＳＧ０００００１３１３９８、ＥＮＳＧ０００００１２６５８３、ＥＮＳＧ０００００１５０９９５、ＥＮＳＧ０００００１１２５９２、ＥＮＳＧ０００００１０２０５７、ＥＮＳＧ０００００１０２４６６］（脊髄小脳失調症）；ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＧ１、ＳＬＣ６Ａ１、ＰＲＲＴ２、ＰＴＥＮ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＳＴＡＲＤ７、ＣＬＲＮ１［ＥＮＳＧ０００００１４４２８５、ＥＮＳＧ０００００１３６５３１、ＥＮＳＧ０００００１４１８３７、ＥＮＳＧ０００００２７３０７９、ＥＮＳＧ０００００１８３４５４、ＥＮＳＧ０００００１６９０５７、ＥＮＳＧ０００００１７６１６５、ＥＮＳＧ０００００１５７１０３、ＥＮＳＧ０００００１６７３７１、ＥＮＳＧ０００００１７１８６２、ＥＮＳＧ００００００７５０４３、ＥＮＳＧ０００００１８４１５６、ＥＮＳＧ００００００８４０９０、ＥＮＳＧ０００００１６３６４６］（遺伝性てんかん障害）；ＡＴＭ［ＥＮＳＧ０００００１４９３１１］（毛細血管拡張性運動失調症）；ＧＬＢ１［ＥＮＳＧ０００００１７０２６６］（ＧＭ１ガングリオシドーシス）；ＧＢＡ［ＥＮＳＧ０００００１７７６２８］（ゴーシェ病）；ＧＭ２Ａ［ＥＮＳＧ０００００１９６７４３］（ＧＭ２ガングリオシドーシス）；ＵＢＥ３Ａ［ＥＮＳＧ０００００１１４０６２］（アンジェルマン症候群）；ＳＬＣ２Ａ１［ＥＮＳＧ０００００１１７３９４］（グルコーストランスポーター１欠損症）；ＬＡＭＰ２［ＥＮＳＧ０００００００５８９３］（ダノン病）；ＧＬＡ［ＥＮＳＧ０００００１０２３９３］（ファブリー病）；ＰＫＤ１、ＰＫＤ２［ＥＮＳＧ０００００００８７１０、ＥＮＳＧ０００００１１８７６２］（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患）；ＧＡＡ［ＥＮＳＧ０００００１７１２９８］（ポンペ病）；ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ［ＥＮＳＧ０００００１６９１７４、ＥＮＳＧ０００００１３０１６４、ＥＮＳＧ００００００８４６７４、ＥＮＳＧ０００００１３０２０３］（家族性高コレステロール血症）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１［ＥＮＳＧ００００００３４９７１、ＥＮＳＧ０００００１２３２４０、ＥＮＳＧ０００００１８３７３５、ＥＮＳＧ０００００１３４９８７、ＥＮＳＧ０００００１３８０６１］（開放隅角緑内障）；ＩＤＵＡ［ＥＮＳＧ０００００１２７４１５］（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＩＤＳ［ＥＮＳＧ００００００１０４０４］（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＣＬＮ３［ＥＮＳＧ０００００１８８６０３］（バッテン病）；ＤＭＤ［ＥＮＳＧ０００００１９８９４７］（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；ＬＭＮＡ［ＥＮＳＧ０００００１６０７８９］（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）；ＤＹＳＦ［ＥＮＳＧ０００００１３５６３６］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）；ＳＧＣＡ［ＥＮＳＧ０００００１０８８２３］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）；ＳＧＣＢ［ＥＮＳＧ０００００１６３０６９］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）；ＳＧＣＧ［ＥＮＳＧ０００００１０２６８３］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）；ＳＧＣＤ［ＥＮＳＧ０００００１７０６２４］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）；ＤＵＸ４［ＥＮＳＧ０００００２６０５９６］（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）；Ｆ９［ＥＮＳＧ０００００１０１９８１］（血友病Ｂ）；Ｆ８［ＥＮＳＧ０００００１８５０１０］（血友病Ａ）；ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６［ＥＮＳＧ０００００１５６３１３、ＥＮＳＧ０００００１０２２１８、ＥＮＳＧ０００００１６３９１４、ＥＮＳＧ０００００１０５６１８、ＥＮＳＧ０００００１５０２７５、ＥＮＳＧ０００００１１７３６０、ＥＮＳＧ０００００１０１１６１］（網膜色素変性症）；ＣＦＴＲ［ＥＮＳＧ０００００００１６２６］（嚢胞性線維症）；ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＴＲＣ、ＤＦＮＡ１、ＷＦＳ１［ＥＮＳＧ０００００１６５４７４、ＥＮＳＧ０００００１２１７４２、ＥＮＳＧ０００００２４２８６６、ＥＮＳＧ０００００１３１５０４、ＥＮＳＧ０００００１０９５０１］（常染色体優性聴覚障害）；ＰＯＵ３Ｆ３［ＥＮＳＧ０００００１９８９１４］（非症候群性難聴）。
【0097】
置換ドメイン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、置換ドメインを含むＲＮＡドナー分子を含む。いくつかの実施形態において、置換ドメインは、標的ＲＮＡから誘導または単離される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、置換ドメインを含むＲＮＡドナー分子を含む。いくつかの実施形態において、置換ドメインは、標的ＲＮＡから誘導または単離される。
【0098】
いくつかの実施形態において、置換ドメインは、ヒト遺伝子から誘導または単離された配列から構成される。いくつかの実施形態において、置換ドメインを含む配列は、ヒト遺伝子と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。いくつかの実施形態において、置換ドメインを含む配列は、ヒト遺伝子と、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８７％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９９％またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。いくつかの実施形態において、置換ドメインは、ヒト遺伝子から誘導または単離された配列と１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、置換ドメインは、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２１０ヌクレオチド、少なくとも約２２０ヌクレオチド、少なくとも約２３０ヌクレオチド、少なくとも約２４０ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２６０ヌクレオチド、少なくとも約２７０ヌクレオチド、２７０を超えるヌクレオチド、もしくはその間の任意数のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、置換ドメインは、最大約２ヌクレオチド、最大約５ヌクレオチド、最大約１０ヌクレオチド、最大約２０ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約１００ヌクレオチド、最大約１１０ヌクレオチド、最大約１２０ヌクレオチド、最大約１３０ヌクレオチド、最大約１４０ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１６０ヌクレオチド、最大約１７０ヌクレオチド、最大約１８０ヌクレオチド、最大約１９０ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２１０ヌクレオチド、最大約２２０ヌクレオチド、最大約２３０ヌクレオチド、最大約２４０ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約２６０ヌクレオチド、最大約２７０ヌクレオチド、もしくはその間の任意数のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【0099】
本明細書で開示される置換ドメインを含む組成物は、ＲＮＡ配列の置換または挿入が有効な治療法となり得るあらゆる戦略を含む。置換ドメインの例としては、限定するものではないが、以下の遺伝子（角括弧内は遺伝子アクセッションＩＤ及び括弧内は関連する疾患）から誘導または単離された配列が挙げられる：ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ［ＥＮＳＧ０００００２４０５０５］（分類不能型免疫不全症）；ＡＤＡ、ＣＥＣＲ１［ＥＮＳＧ０００００１９６８３９、ＥＮＳＧ００００００９３０７２］（アデノシンデアミナーゼ欠損症）；ＩＬ２ＲＧ［ＥＮＳＧ０００００１４７１６８］（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）；ＨＢＢ［ＥＮＳＧ０００００２４４７３４］（ベータ－サラセミア）；ＨＢＡ１、ＨＢＡ２［ＥＮＳＧ０００００２０６１７２、ＥＮＳＧ０００００１８８５３６］（アルファ－サラセミア）；Ｕ２ＡＦ１［ＥＮＳＧ０００００１６０２０１］（骨髄異形成症候群）；ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＭＡＴＲ３、ＳＯＤ１、Ｃ９ＯＲＦ７２［ＥＮＳＧ０００００１４２１６８、ＥＮＳＧ０００００１２０９４８、ＥＮＳＧ００００００８９２８０、ＥＮＳＧ００００００１５４７９、ＥＮＳＧ０００００１４２１６８、ＥＮＳＧ０００００１４７８９４］（筋萎縮性側索硬化症）；ＭＡＰＴ、ＰＧＲＮ［ＥＮＳＧ０００００１８６８６８、ＥＮＳＧ００００００３０５８２］（パーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症）；ＣＤＨ２３、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ［ＥＮＳＧ０００００１０７７３６、ＥＮＳＧ０００００１３７４７４、ＥＮＳＧ００００００４２７８１］（アッシャー症候群）；ＧＡＬＣ［ＥＮＳＧ００００００５４９８３］（クラッベ病）；ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２［ＥＮＳＧ０００００１６６３１１、ＥＮＳＧ０００００１４１４５８、ＥＮＳＧ０００００１１９６５５］（ニーマン・ピック病）；ＰＲＮＰ［ＥＮＳＧ０００００１７１８６７］（プリオン病）；ＳＣＮ１Ａ［ＥＮＳＧ０００００１４４２８５］（ドラヴェ症候群）；ＰＩＮＫ１、ＡＴＰＧＡＰ２［ＥＮＳＧ０００００１５８８２８］（若年性パーキンソン病）；ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＰＲ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ１、ＦＧＦ１４［ＥＮＳＧ０００００１２４７８８、ＥＮＳＧ０００００２０４８４２、ＥＮＳＧ００００００６６４２７、ＥＮＳＧ０００００１９６１５５、ＥＮＳＧ０００００１７３８９８、ＥＮＳＧ０００００１４１８３７、ＥＮＳＧ０００００１６３６３５、ＥＮＳＧ０００００１２８８８１、ＥＮＳＧ０００００１５６４７５、ＥＮＳＧ０００００１３１３９８、ＥＮＳＧ０００００１２６５８３、ＥＮＳＧ０００００１５０９９５、ＥＮＳＧ０００００１１２５９２、ＥＮＳＧ０００００１０２０５７、ＥＮＳＧ０００００１０２４６６］（脊髄小脳失調症）；ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＧ１、ＳＬＣ６Ａ１、ＰＲＲＴ２、ＰＴＥＮ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＳＴＡＲＤ７、ＣＬＲＮ１［ＥＮＳＧ０００００１４４２８５、ＥＮＳＧ０００００１３６５３１、ＥＮＳＧ０００００１４１８３７、ＥＮＳＧ０００００２７３０７９、ＥＮＳＧ０００００１８３４５４、ＥＮＳＧ０００００１６９０５７、ＥＮＳＧ０００００１７６１６５、ＥＮＳＧ０００００１５７１０３、ＥＮＳＧ０００００１６７３７１、ＥＮＳＧ０００００１７１８６２、ＥＮＳＧ００００００７５０４３、ＥＮＳＧ０００００１８４１５６、ＥＮＳＧ００００００８４０９０、ＥＮＳＧ０００００１６３６４６］（遺伝性てんかん障害）；ＡＴＭ［ＥＮＳＧ０００００１４９３１１］（毛細血管拡張性運動失調症）；ＧＬＢ１［ＥＮＳＧ０００００１７０２６６］（ＧＭ１ガングリオシドーシス）；ＧＢＡ［ＥＮＳＧ０００００１７７６２８］（ゴーシェ病）；ＧＭ２Ａ［ＥＮＳＧ０００００１９６７４３］（ＧＭ２ガングリオシドーシス）；ＵＢＥ３Ａ［ＥＮＳＧ０００００１１４０６２］（アンジェルマン症候群）；ＳＬＣ２Ａ１［ＥＮＳＧ０００００１１７３９４］（グルコーストランスポーター１欠損症）；ＬＡＭＰ２［ＥＮＳＧ０００００００５８９３］（ダノン病）；ＧＬＡ［ＥＮＳＧ０００００１０２３９３］（ファブリー病）；ＰＫＤ１、ＰＫＤ２［ＥＮＳＧ０００００００８７１０、ＥＮＳＧ０００００１１８７６２］（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患）；ＧＡＡ［ＥＮＳＧ０００００１７１２９８］（ポンペ病）；ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ［ＥＮＳＧ０００００１６９１７４、ＥＮＳＧ０００００１３０１６４、ＥＮＳＧ００００００８４６７４、ＥＮＳＧ０００００１３０２０３］（家族性高コレステロール血症）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１［ＥＮＳＧ００００００３４９７１、ＥＮＳＧ０００００１２３２４０、ＥＮＳＧ０００００１８３７３５、ＥＮＳＧ０００００１３４９８７、ＥＮＳＧ０００００１３８０６１］（開放隅角緑内障）；ＩＤＵＡ［ＥＮＳＧ０００００１２７４１５］（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＩＤＳ［ＥＮＳＧ００００００１０４０４］（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＣＬＮ３［ＥＮＳＧ０００００１８８６０３］（バッテン病）；ＤＭＤ［ＥＮＳＧ０００００１９８９４７］（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；ＬＭＮＡ［ＥＮＳＧ０００００１６０７８９］（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）；ＤＹＳＦ［ＥＮＳＧ０００００１３５６３６］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）；ＳＧＣＡ［ＥＮＳＧ０００００１０８８２３］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）；ＳＧＣＢ［ＥＮＳＧ０００００１６３０６９］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）；ＳＧＣＧ［ＥＮＳＧ０００００１０２６８３］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）；ＳＧＣＤ［ＥＮＳＧ０００００１７０６２４］（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）；ＤＵＸ４［ＥＮＳＧ０００００２６０５９６］（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）；Ｆ９［ＥＮＳＧ０００００１０１９８１］（血友病Ｂ）；Ｆ８［ＥＮＳＧ０００００１８５０１０］（血友病Ａ）；ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６［ＥＮＳＧ０００００１５６３１３、ＥＮＳＧ０００００１０２２１８、ＥＮＳＧ０００００１６３９１４、ＥＮＳＧ０００００１０５６１８、ＥＮＳＧ０００００１５０２７５、ＥＮＳＧ０００００１１７３６０、ＥＮＳＧ０００００１０１１６１］（網膜色素変性症）；ＣＦＴＲ［ＥＮＳＧ０００００００１６２６］（嚢胞性線維症）；ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＴＲＣ、ＤＦＮＡ１、ＷＦＳ１［ＥＮＳＧ０００００１６５４７４、ＥＮＳＧ０００００１２１７４２、ＥＮＳＧ０００００２４２８６６、ＥＮＳＧ０００００１３１５０４、ＥＮＳＧ０００００１０９５０１］（常染色体優性聴覚障害）；ＰＯＵ３Ｆ３［ＥＮＳＧ０００００１９８９１４］（非症候群性難聴）。
【0100】
いくつかの実施形態において、置換ドメインは、コドン最適化される。
【0101】
ヒト遺伝子から誘導された配列に加えて、置換ドメインは、標的ＲＮＡの安定性、翻訳、プロセシング、または局在を変えるために、他の生物から誘導された配列を含み得る。非ヒト源から誘導された置換ドメインの例としては、限定するものではないが、タンパク質産生を増加させる配列、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及びＣＡＧＹＣＸ（Ｙ＝ＵまたはＡ；Ｘ＝Ｕ、Ｃ、またはＡ）型の鉄応答性エレメントから誘導または単離された配列が挙げられる。
【0102】
イントロンドメイン
特定の態様において、本明細書に記載されるＲＮＡドナー分子は、イントロンドメインを含む。いくつかの実施形態において、イントロンドメインは、疾患原因変異を含むＲＮＡ結合タンパク質によって優先的に標的とされる結合部位を保持する。いくつかの実施形態において、これらの変異ＲＮＡ結合タンパク質とイントロンドメインの解離定数は、変異のないＲＮＡ結合タンパク質とイントロンドメインの解離定数よりも低い。
特定の態様において、本明細書に記載されるＲＮＡドナー分子は、イントロンドメインを含む。いくつかの実施形態において、イントロンドメインは、疾患原因変異を含むＲＮＡ結合タンパク質によって優先的に標的とされる結合部位を保持する。いくつかの実施形態において、これらの変異ＲＮＡ結合タンパク質とイントロンドメインの解離定数は、変異のないＲＮＡ結合タンパク質とイントロンドメインの解離定数よりも低い。
【0103】
ＲＮＡモチーフ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｅｓｎＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して相補的なＲＮＡモチーフを含有する。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、ｅｓｎＲＮＡ分子の５’末端から始まる。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子中の少なくとも約３塩基、少なくとも約４塩基、少なくとも約５塩基、少なくとも約６塩基、少なくとも約７塩基、少なくとも約８塩基、少なくとも約９塩基、少なくとも約１０塩基、少なくとも約１１塩基、少なくとも約１２塩基、少なくとも約１３塩基、少なくとも約１４塩基、少なくとも約１５塩基、少なくとも約１６塩基、少なくとも約１７塩基、少なくとも約１８塩基、少なくとも約１９塩基、少なくとも約２０塩基、少なくとも約２１塩基、少なくとも約２２塩基、少なくとも約２３塩基、少なくとも約２４塩基、少なくとも約２５塩基、少なくとも約２６塩基、少なくとも約２７塩基、少なくとも約２８塩基、少なくとも約２９塩基、少なくとも約３０塩基、少なくとも約３１塩基、少なくとも約３２塩基、少なくとも約３３塩基、少なくとも約３４塩基、少なくとも約３５塩基、少なくとも約３６塩基、少なくとも約４０塩基、少なくとも約５０塩基、少なくとも約６０塩基、少なくとも約７０塩基、少なくとも約８０塩基、少なくとも約１００塩基、またはそれ以上が、ＲＮＡドナー分子に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子中の最大約３塩基、最大約４塩基、最大約５塩基、最大約６塩基、最大約７塩基、最大約８塩基、最大約９塩基、最大約１０塩基、最大約１１塩基、最大約１２塩基、最大約１３塩基、最大約１４塩基、最大約１５塩基、最大約１６塩基、最大約１７塩基、最大約１８塩基、最大約１９塩基、最大約２０塩基、最大約２１塩基、最大約２２塩基、最大約２３塩基、最大約２４塩基、最大約２５塩基、最大約２６塩基、最大約２７塩基、最大約２８塩基、最大約２９塩基、最大約３０塩基、最大約３１塩基、最大約３２塩基、最大約３３塩基、最大約３４塩基、最大約３５塩基、最大約３６塩基、最大約４０塩基、最大約５０塩基、最大約６０塩基、最大約７０塩基、最大約８０塩基、または最大約１００塩基が、ＲＮＡドナー分子に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｅｓｎＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して相補的なＲＮＡモチーフを含有する。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、ｅｓｎＲＮＡ分子の５’末端から始まる。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子中の少なくとも約３塩基、少なくとも約４塩基、少なくとも約５塩基、少なくとも約６塩基、少なくとも約７塩基、少なくとも約８塩基、少なくとも約９塩基、少なくとも約１０塩基、少なくとも約１１塩基、少なくとも約１２塩基、少なくとも約１３塩基、少なくとも約１４塩基、少なくとも約１５塩基、少なくとも約１６塩基、少なくとも約１７塩基、少なくとも約１８塩基、少なくとも約１９塩基、少なくとも約２０塩基、少なくとも約２１塩基、少なくとも約２２塩基、少なくとも約２３塩基、少なくとも約２４塩基、少なくとも約２５塩基、少なくとも約２６塩基、少なくとも約２７塩基、少なくとも約２８塩基、少なくとも約２９塩基、少なくとも約３０塩基、少なくとも約３１塩基、少なくとも約３２塩基、少なくとも約３３塩基、少なくとも約３４塩基、少なくとも約３５塩基、少なくとも約３６塩基、少なくとも約４０塩基、少なくとも約５０塩基、少なくとも約６０塩基、少なくとも約７０塩基、少なくとも約８０塩基、少なくとも約１００塩基、またはそれ以上が、ＲＮＡドナー分子に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子中の最大約３塩基、最大約４塩基、最大約５塩基、最大約６塩基、最大約７塩基、最大約８塩基、最大約９塩基、最大約１０塩基、最大約１１塩基、最大約１２塩基、最大約１３塩基、最大約１４塩基、最大約１５塩基、最大約１６塩基、最大約１７塩基、最大約１８塩基、最大約１９塩基、最大約２０塩基、最大約２１塩基、最大約２２塩基、最大約２３塩基、最大約２４塩基、最大約２５塩基、最大約２６塩基、最大約２７塩基、最大約２８塩基、最大約２９塩基、最大約３０塩基、最大約３１塩基、最大約３２塩基、最大約３３塩基、最大約３４塩基、最大約３５塩基、最大約３６塩基、最大約４０塩基、最大約５０塩基、最大約６０塩基、最大約７０塩基、最大約８０塩基、または最大約１００塩基が、ＲＮＡドナー分子に対して相補的である。
【0104】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子は、ｅｓｎＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドから５’方向に、少なくとも約１ヌクレオチド、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約３ヌクレオチド、少なくとも約４ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約６ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約９ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１３ヌクレオチド、少なくとも約１４ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３１ヌクレオチド、少なくとも約３１ヌクレオチド、少なくとも約３２ヌクレオチド、少なくとも約３３ヌクレオチド、少なくとも約３４ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチド、少なくとも約３７ヌクレオチド、少なくとも約３８ヌクレオチド、少なくとも約３９ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４１ヌクレオチド、少なくとも約４２ヌクレオチド、少なくとも約４３ヌクレオチド、少なくとも約４４ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約４６ヌクレオチド、少なくとも約４７ヌクレオチド、少なくとも約４８ヌクレオチド、少なくとも約４９ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド以上、またはその間の任意のヌクレオチド数離れている、ＲＮＡドナー分子に対して相補的なＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、ｅｓｎＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドから５’方向に、最大約１ヌクレオチド、最大約２ヌクレオチド、最大約３ヌクレオチド、最大約４ヌクレオチド、最大約５ヌクレオチド、最大約６ヌクレオチド、最大約７ヌクレオチド、最大約８ヌクレオチド、最大約９ヌクレオチド、最大約１０ヌクレオチド、最大約１１ヌクレオチド、最大約１２ヌクレオチド、最大約１３ヌクレオチド、最大約１４ヌクレオチド、最大約１５ヌクレオチド、最大約１６ヌクレオチド、最大約１７ヌクレオチド、最大約１８ヌクレオチド、最大約１９ヌクレオチド、最大約２０ヌクレオチド、最大約２１ヌクレオチド、最大約２２ヌクレオチド、最大約２３ヌクレオチド、最大約２４ヌクレオチド、最大約２５ヌクレオチド、最大約２６ヌクレオチド、最大約２７ヌクレオチド、最大約２８ヌクレオチド、最大約２９ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約３１ヌクレオチド、最大約３１ヌクレオチド、最大約３２ヌクレオチド、最大約３３ヌクレオチド、最大約３４ヌクレオチド、最大約３５ヌクレオチド、最大約３６ヌクレオチド、最大約３７ヌクレオチド、最大約３８ヌクレオチド、最大約３９ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約４１ヌクレオチド、最大約４２ヌクレオチド、最大約４３ヌクレオチド、最大約４４ヌクレオチド、最大約４５ヌクレオチド、最大約４６ヌクレオチド、最大約４７ヌクレオチド、最大約４８ヌクレオチド、最大約４９ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約５５ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約６５ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約７５ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約８５ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約９５ヌクレオチド、最大約１００ヌクレオチド、最大約１１０ヌクレオチド、最大約１２０ヌクレオチド、最大約１３０ヌクレオチド、最大約１４０ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１６０ヌクレオチド、最大約１７０ヌクレオチド、最大約１８０ヌクレオチド、最大約１９０ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約３００ヌクレオチド、最大約４００ヌクレオチド、最大約５００ヌクレオチド、最大約５００ヌクレオチド以上離れている。
【0105】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して相補的なＲＮＡモチーフを含有し、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’を含む。
【0106】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子は、ＲＮＡドナー分子に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性である、ＲＮＡドナー分子に相補的であるＲＮＡモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡドナー分子に対して、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８７％、最大約９０％、最大約９１％、最大約９２％、最大約９３％、最大約９４％、最大約９５％、最大約９６％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡドナー分子に対して１００％相補的である。
【0107】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ分子及びＲＮＡドナー分子は、ｅｓｎＲＮＡ－ドナー複合体と呼ばれる複合体を形成する。
【0108】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ－ドナー複合体は、塩基対形成を介して標的ＲＮＡと会合する。
【0109】
ＵＴＲ
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、５’非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を高める。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を低下させる。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の局在を変化させる。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子のプロセシングを変化させる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、５’非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を高める。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を低下させる。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の局在を変化させる。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子のプロセシングを変化させる。
【0110】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子は、３’非翻訳領域を更に含む。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を高める。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の安定性を低下させる。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子の局在を変化させる。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、ＲＮＡドナー分子のプロセシングを変化させる。
【0111】
核酸修飾
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子またはｅｓｎＲＮＡは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、及び／または核酸類似体、化学修飾核酸、もしくは２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラのうちの少なくとも１つを含む。本明細書で使用される場合、「核酸類似体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する標準的なプリン塩基またはピリミジン塩基と構造的な類似性を有する化合物を指す。核酸類似体は、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基と比較して、修飾糖及び／または修飾核酸塩基を含有し得る。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチドまたは２’－リボヌクレオチドであり、ここで、核酸塩基には、修飾塩基（例えば、キサンチン、ウリジン、オキサニン（オキサノシン）、７－メチルグアノシン、ジヒドロウリジン、５－メチルシチジン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチルイソデオキシシトシン、イソデオキシグアノシン、デオキシウラジン、イソデオキシシチジン、他の０－１プリン類似体、Ｎ－６－ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７－デアザヒポキサンチン、他の７－デアザプリン、及び２－メチルプリンなど）が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、イノシン、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホロアミダート－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシン、及び２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択され得る。他の実施形態において、核酸類似体は、核酸模倣体（例えば、人工核酸及びゼノ核酸（ＸＮＡ）など）である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子またはｅｓｎＲＮＡは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、及び／または核酸類似体、化学修飾核酸、もしくは２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラのうちの少なくとも１つを含む。本明細書で使用される場合、「核酸類似体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する標準的なプリン塩基またはピリミジン塩基と構造的な類似性を有する化合物を指す。核酸類似体は、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基と比較して、修飾糖及び／または修飾核酸塩基を含有し得る。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチドまたは２’－リボヌクレオチドであり、ここで、核酸塩基には、修飾塩基（例えば、キサンチン、ウリジン、オキサニン（オキサノシン）、７－メチルグアノシン、ジヒドロウリジン、５－メチルシチジン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチルイソデオキシシトシン、イソデオキシグアノシン、デオキシウラジン、イソデオキシシチジン、他の０－１プリン類似体、Ｎ－６－ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７－デアザヒポキサンチン、他の７－デアザプリン、及び２－メチルプリンなど）が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、イノシン、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホロアミダート－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシン、及び２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択され得る。他の実施形態において、核酸類似体は、核酸模倣体（例えば、人工核酸及びゼノ核酸（ＸＮＡ）など）である。
【0112】
核酸
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される遺伝子導入及び発現技術に使用するための、本明細書で開示されるＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子をコードする核酸配列である。必ずしも明示的に述べられているわけではないが、本明細書で提供される配列は、発現産物だけでなく、同じ生物学的特性を有するタンパク質を産生する実質的に同一の配列を提供するために使用することができることを理解されたい。これらの「生物学的に同等な」または「生物学的に活性な」または「同等な」ポリペプチドは、本明細書に記載される同等なポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルト条件下で実行される配列同一性法を使用して比較した場合に、参照核酸配列に対して、少なくとも６０％、または代替的に少なくとも６５％、または代替的に少なくとも７０％、または代替的に少なくとも７５％、または代替的に少なくとも８０％、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％同一の核酸配列を有し得る。特定の実施形態の例として、いくつかの具体的な配列が提供される。更に、同等なポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される遺伝子導入及び発現技術に使用するための、本明細書で開示されるＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子をコードする核酸配列である。必ずしも明示的に述べられているわけではないが、本明細書で提供される配列は、発現産物だけでなく、同じ生物学的特性を有するタンパク質を産生する実質的に同一の配列を提供するために使用することができることを理解されたい。これらの「生物学的に同等な」または「生物学的に活性な」または「同等な」ポリペプチドは、本明細書に記載される同等なポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルト条件下で実行される配列同一性法を使用して比較した場合に、参照核酸配列に対して、少なくとも６０％、または代替的に少なくとも６５％、または代替的に少なくとも７０％、または代替的に少なくとも７５％、または代替的に少なくとも８０％、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％同一の核酸配列を有し得る。特定の実施形態の例として、いくつかの具体的な配列が提供される。更に、同等なポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
【0113】
本明細書で開示される核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、特定のコドンの使用頻度が様々な細胞で異なるという事実を指す。このコドンバイアスは、その細胞型における特定のｔＲＮＡの相対存在量の偏りに対応する。対応するｔＲＮＡの相対存在量と一致するように配列中のコドンを変えることによって、発現を増加させることが可能である。また、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であるコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることも可能である。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞だけでなく、様々な他の生物にも使用され得る。遺伝コードに基づいて、様々な置換ドメインをコードする核酸配列を生成することができる。いくつかの実施形態において、そのような配列は、開示される方法が実施される、置換ドメインを含有するＲＮＡドナー分子を発現させるために使用される宿主細胞など（哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など）の宿主細胞または標的細胞における発現に対して最適化される。特定の種のコドン選好及びコドン使用頻度表を使用することで、特定種のコドン使用選好性を利用した、置換ドメインをコードする単離された核酸分子（その対応する野生型タンパク質に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードするものなど）を操作することができる。例えば、本明細書で開示される置換ドメインは、特定の目的生物によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一例において、置換ドメインの核酸配列は、その対応する野生型核酸配列または元の核酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するものなど、ヒト細胞における発現に対して最適化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの置換ドメイン（ベクターの一部であり得る）をコードする単離されたＲＮＡドナー分子は、真核細胞における発現に対してコドン最適化された少なくとも１つの置換ドメインコーディング配列、またはヒト細胞における発現に対してコドン最適化された少なくとも１つの置換ドメインコーディング配列を含む。一実施形態において、そのようなコドン最適化置換ドメインコーディング配列は、その対応する野生型配列または元の配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する。別の実施形態において、真核細胞のコドン最適化核酸配列は、その対応する野生型または元のタンパク質に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも９約２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する置換ドメインをコードする。別の実施形態において、配列は異なるが、同じ置換ドメインタンパク質配列をコードする核酸など、機能的に同等の核酸を含有する様々なクローンを常法により生成することができる。コーディング配列中のサイレント変異は、複数のコドンが同じアミノ酸残基をコードすることができる遺伝コードの縮重（すなわち、重複性）に起因する。そのため、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされ得、セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされ得、アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得、アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得、システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得、アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされ得、グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得、チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得、イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされ得る。標準的な遺伝コードを示す表は、様々な情報源で見出すことができる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．５ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ参照）。
【0114】
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対、ホーグステイン結合、または任意の他の配列特異的様式によって生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する二本鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、自己ハイブリダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断など、より広範なプロセス中の１つの工程を構成し得る。
【0115】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度、約６ｘ ＳＳＣ～約１０ｘ ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約０％～約２５％のホルムアミド濃度、及び約４ｘ ＳＳＣ～約８ｘ ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度、約９ｘ ＳＳＣ～約２ｘ ＳＳＣの緩衝液濃度、約３０％～約５０％のホルムアミド濃度、及び約５ｘ ＳＳＣ～約２ｘ ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１ｘ ＳＳＣ～約０．１ｘ ＳＳＣの緩衝液濃度が挙げられる。
【0116】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチング位置または相同位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本明細書に記載される配列の１つと、４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を有する。
【0117】
プロモーター
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子をコードする配列は、真核細胞内でＲＮＡドナー分子を発現することが可能なプロモーターをコードする配列を更に含む。
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子をコードする配列は、真核細胞内でＲＮＡドナー分子を発現することが可能なプロモーターをコードする配列を更に含む。
【0118】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、操作された核内低分子ＲＮＡ分子をコードする配列は、真核細胞内で操作された核内低分子ＲＮＡ分子を発現することが可能なプロモーターをコードする配列を更に含む。
【0119】
ベクター
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、単離されたものか、または組み換えである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、自己相補型である。
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、単離されたものか、または組み換えである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、自己相補型である。
【0120】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２のＡＡＶから単離または誘導された末端逆位反復配列またはカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、単離されたものか、または組み換え（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、自己相補型（ｓｃＡＡＶ）である。
【0121】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームもしくはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、エキソソームもしくはデンドリマーを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターまたは組み換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組み換え発現系」という用語は、組み換えによって形成された特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。
【0122】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本明細書で提供される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、限定するものではないが、発現制御エレメントを含む。本明細書で使用される「発現制御エレメント」は、遺伝子などのコーディング配列の発現を調節する任意の配列を指す。発現制御エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、５’または３’非翻訳領域、及びイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0123】
発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始及び速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び調節分子が結合し得る遺伝子エレメントを含有し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。プロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＡＧ、Ｃｂｈ、ＥＦ－１ａ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＵＣＯＥ、ｈＡＡＴ、ＴＢＧ、デスミン、ＭＣＫ、Ｃ５－１２、ＮＳＥ、シナプシン、ＰＤＧＦ、ＭｅｃＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥＮＫ、ＥＡＡＴ２、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ｈ１及びＵ６プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することが可能なプロモーターから単離または誘導された配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リジンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される。
【0124】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、真核細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、ヒト細胞である。
【0125】
「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して、転写の可能性または頻度を増加させることができるＤＮＡの領域である。エンハンサー及び転写後調節エレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶエンハンサー及びＷＰＲＥが挙げられる。
【0126】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本明細書で提供される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、限定するものではないが、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の構造、すなわち、二重または三重または多重のコーディング領域またはエクソンを有する構造を得るためのＩＲＥＳまたは２Ａペプチド部位などのベクターエレメントを含み、それ自体が単一の構築物から２つ以上のタンパク質をｍＲＮＡから発現する能力を有する。マルチシストロン性ベクターは、同じｍＲＮＡから２つ以上の別個のタンパク質を同時に発現する。マルチシストロン性構造を構築するために広く使用される２つの戦略は、ＩＲＥＳまたは２Ａ自己切断部位の使用によるものである。「ＩＲＥＳ」は、ポリシストロン性ベクター構築物内に使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物を起源とする配列内リボソーム進入部位またはその一部を指す。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、キャップ依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「２Ａ自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進し、それにより単一のプロモーターから２つのポリペプチドを生成する部位を組み込むためにベクター構築物内に使用される連結配列を指す。そのような自己切断ペプチドには、限定するものではないが、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａペプチドまたは自己切断ペプチドをコードする配列が含まれる。
【0127】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスＩもしくはＩＩベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または２つ以上のウイルスベクターの好ましい態様を組み込んだ任意のハイブリッドもしくはキメラベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の発現制御エレメントを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の選択マーカーを更に含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、低毒性である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、宿主ゲノムに組み込まれず、それにより、挿入変異誘発を引き起こす確率が低くなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、．３ｋｂ～４．７５ｋｂの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物、システム、方法、及びキットのいずれかに使用され得るＡＡＶベクターの例としては、ＡＡＶ１ベクター、改変ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、改変ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、改変ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、改変ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、改変ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、改変ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、改変ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ７４ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ７４ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、及び改変ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターならびにその任意の組み合わせまたは同等物を挙げることができる。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクターだけでなく、関連プラスミド（例えば、パッケージングプラスミド、ｒｅｖ発現プラスミド、エンベローププラスミド）と組み合わせた導入遺伝子プラスミドベクター、及びウイルスまたはウイルス様侵入機構により外因性核酸を細胞に導入することが可能なレンチウイルス系粒子を指し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物、システム、方法、及びキットのいずれかで使用され得るレンチウイルスベクターの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、改変スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、改変アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、改変ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、改変ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、改変ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、または改変ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を挙げることができる。
【0128】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、少なくともＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の本開示のＲＮＡドナー分子（複数可）及びｅｓｎＲＮＡ分子（複数可）を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、２つ以上の本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むか、またはコードする。本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡドナー分子を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、少なくともＲＮＡドナー分子を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上のＲＮＡドナー分子（複数可）を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、２つ以上のＲＮＡドナー分子を含むか、またはコードする。
【0129】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、単離されたものか、または組み換えである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、自己相補型である。
【0130】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２のＡＡＶから単離または誘導された末端逆位反復配列またはカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、単離されたものか、または組み換え（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、自己相補型（ｓｃＡＡＶ）である。
【0131】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームもしくはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスもしくはデンドリマーを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターまたは組み換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組み換え発現系」という用語は、組み換えによって形成された特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。
【0132】
いくつかの実施形態において、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子は、非カチオン性脂質、ＰＥＧコンジュゲート脂質、ステロール、またはこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。
【0133】
いくつかの実施形態において、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子は、非カチオン性脂質を更に含み、ここで、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン及び、例えば、ＷＯ２０１７／０９９８２３またはＵＳ２０１８／００２８６６４に記載される非カチオン性脂質からなる群から選択される。
【0134】
いくつかの実施形態において、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子は、コンジュゲート脂質を更に含み、ここで、コンジュゲート脂質、ここで、コンジュゲート脂質は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノーロアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩からなる群から選択される。
【0135】
いくつかの実施形態において、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子は、コレステロールまたはコレステロール誘導体を更に含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子は、イオン化可能脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを更に含む。イオン化可能脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールの量は、独立して変えることができる。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、粒子中に存在する総脂質のうち約２０モル％～約９０モル％の量のイオン化可能脂質、粒子中に存在する総脂質のうち約５モル％～約３０モル％の量の非カチオン性脂質、粒子中に存在する総脂質のうち約０．５モル％～約２０モル％の量の、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及び粒子中に存在する総脂質のうち約２０モル％～約５０モル％の量のステロールを含む。
【0137】
総脂質とＤＮＡベクターの比率は、必要に応じて変えることができる。例えば、総脂質とＤＮＡベクター（質量または重量）の比率は、約１０：１～約３０：１であり得る。
【0138】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本明細書で提供される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、限定するものではないが、発現制御エレメントを含む。本明細書で使用される「発現制御エレメント」は、遺伝子などのコーディング配列の発現を調節する任意の配列を指す。発現制御エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、及びイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始及び速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び調節分子が結合し得る遺伝子エレメントを含有し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。プロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＡＧ、Ｃｂｈ、ＥＦ－１ａ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＵＣＯＥ、ｈＡＡＴ、ＴＢＧ、デスミン、ＭＣＫ、Ｃ５－１２、ＮＳＥ、シナプシン、ＰＤＧＦ、ＭｅｃＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥＮＫ、ＥＡＡＴ２、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、及びＵ６プロモーターが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して、転写の可能性または頻度を増加させることができるＤＮＡの領域である。エンハンサー及び転写後調節エレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶエンハンサー及びＷＰＲＥが挙げられる。
【0139】
細胞及び組織
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ウシ、マウス、ネコ、ウマ、ブタ、イヌ、サル、またはヒトの細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、生殖系列細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の生殖系列細胞は、ヒト細胞ではない。
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ウシ、マウス、ネコ、ウマ、ブタ、イヌ、サル、またはヒトの細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、生殖系列細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の生殖系列細胞は、ヒト細胞ではない。
【0140】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、胚幹細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の胚幹細胞は、ヒト細胞ではない。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、多能性幹細胞または万能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、成体幹細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
【0141】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、Ｔリンパ球（本明細書においてＴ細胞とも称される）。本開示のＴ細胞の例としては、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びガンマデルタＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、Ｂリンパ球である。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、抗原提示細胞である。
【0142】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の筋肉細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の筋肉細胞は、横紋筋細胞である。
【0143】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の体細胞は、上皮細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の上皮細胞は、扁平細胞上皮、立方細胞上皮、円柱細胞上皮、重層細胞上皮、偽重層細胞上皮または移行細胞上皮を形成する。いくつかの実施形態において、本開示の上皮細胞は、限定するものではないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、メロクリン腺、漿液腺、粘液腺及び脂腺を含む、腺を形成する。いくつかの実施形態において、本開示の上皮細胞は、限定するものではないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含む、器官の外表面と接触する。いくつかの実施形態において、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触する。
【0144】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の脳細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の神経細胞は、中枢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態において、本開示の神経細胞は、脳または脊髄のニューロンである。いくつかの実施形態において、本開示の神経細胞は、脳神経または視神経のニューロンである。いくつかの実施形態において、本開示の神経細胞は、末梢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態において、本開示の神経細胞は、神経膠細胞またはグリア細胞である。いくつかの実施形態において、本開示のグリア細胞は、限定するものではないが、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、及びミクログリアを含む、中枢神経系のグリア細胞である。いくつかの実施形態において、本開示のグリア細胞は、限定するものではないが、シュワン細胞及びサテライト細胞を含む、末梢神経系のグリア細胞である。
【0145】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の肝臓細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の肝臓細胞は、肝星細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の肝臓細胞は、クッパー細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の肝臓細胞は、類洞内皮細胞である。
【0146】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、光受容体である。いくつかの実施形態において、本開示の光受容体は、桿体である。いくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、錐体である。いくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、双極細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、神経節細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、水平細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の網膜細胞は、アマクリン細胞である。
【0147】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の心臓細胞は、心筋細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の心臓細胞は、心臓ペースメーカー細胞である。
【0148】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の体細胞は、プライマリー細胞である。
【0149】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の体細胞は、培養細胞である。
【0150】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の体細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕのものである。
【0151】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の体細胞は、自己由来または同種異系である。
【0152】
使用方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、２つのＲＮＡ分子（ＲＮＡドナー及び操作された核内低分子ＲＮＡまたはｅｓｎＲＮＡ）を含む組成物であり、ここで、ＲＮＡドナーは、標的ＲＮＡ分子と選択的に結合し、一方、ｅｓｎＲＮＡは、ＲＮＡドナー分子と結合し、標的ＲＮＡ分子とのトランススプライシング反応を促進する。特定の態様において、本明細書に記載されるのは、非天然ＲＮＡドナー分子を標的とし、内因性スプライソソームによるＲＮＡドナー分子の認識を増加させる非天然ｅｓｎＲＮＡ分子である。本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子、ベクター、組成物ならびに細胞を使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、２つのＲＮＡ分子（ＲＮＡドナー及び操作された核内低分子ＲＮＡまたはｅｓｎＲＮＡ）を含む組成物であり、ここで、ＲＮＡドナーは、標的ＲＮＡ分子と選択的に結合し、一方、ｅｓｎＲＮＡは、ＲＮＡドナー分子と結合し、標的ＲＮＡ分子とのトランススプライシング反応を促進する。特定の態様において、本明細書に記載されるのは、非天然ＲＮＡドナー分子を標的とし、内因性スプライソソームによるＲＮＡドナー分子の認識を増加させる非天然ｅｓｎＲＮＡ分子である。本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子、ベクター、組成物ならびに細胞を使用する方法を提供する。
【0153】
理論に拘束されるものではないが、トランススプライシングＲＮＡドナー分子と、ＲＮＡドナー分子と接触するｅｓｎＲＮＡの組み合わせにより、ヒト細胞の疾患原因ＲＮＡ配列を十分に効率的に置き換えて疾患に対処する様式で標的ＲＮＡ内の選択された配列の置換がもたらされる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列特異的な様式で疾患原因ＲＮＡ分子を標的とし、これらのＲＮＡ分子内の疾患原因ＲＮＡ配列を高効率で置き換えるための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡの実装は、疾患原因配列の置換または操作された配列の標的ＲＮＡへの挿入を含む様々な状況において、有用性を示す。いくつかの実施形態において、操作された配列は、標的ＲＮＡの翻訳または安定性を改変し、タンパク質産生または標的ＲＮＡレベルを増加または減少させることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞、ならびにトランススプライシングＲＮＡ組成物を使用する方法を提供する。
【0154】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、４つのドメインを含むＲＮＡドナー分子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子中の４つのドメインの組み合わせにより、ヒト細胞の疾患原因ＲＮＡ配列を十分に効率的に置き換えて疾患に対処する様式で、標的ＲＮＡ内の選択された配列の置換がもたらされる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列特異的な様式で疾患原因ＲＮＡ分子を標的とし、このＲＮＡ分子内の疾患原因ＲＮＡ配列を高効率で置き換えるための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナー分子の実装は、疾患原因配列の置換または操作された配列の標的ＲＮＡへの挿入を含む様々な状況において、有用性を示す。いくつかの実施形態において、操作された配列は、標的ＲＮＡの翻訳または安定性を改変し、タンパク質産生または標的ＲＮＡレベルを増加または減少させることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＮＡドナー分子を含むかまたはコードする、ベクター、組成物及び細胞、ならびにトランススプライシングＲＮＡ組成物を使用する方法を提供する。
【0155】
いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡ及びＲＮＡドナーは、図１Ａ～１Ｃに示されるように、遺伝子疾患を修復するために使用される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナーは、変異を持つ標的ＲＮＡにハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナーと標的ＲＮＡとの間の塩基対形成により、これらの分子が近接する。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡとＲＮＡドナーとの間のｂ形成により、スプライソソーム構成要素が近接し、標的ＲＮＡとＲＮＡドナーとの間のトランススプライシング反応が促進される。いくつかの実施形態において、ｅｓｎＲＮＡは、ＲＮＡドナーと接触する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡドナーとｅｓｎＲＮＡの接触により、スプライソソーム構成要素がリクルートされる。いくつかの実施形態において、トランススプライシングは、ＲＮＡドナー分子と標的ＲＮＡとの間で生じ、これにより、標的ＲＮＡ中の選択された配列がＲＮＡドナー分子で置き換えられた、修復された標的ＲＮＡが得られる。
【0156】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、標的ＲＮＡの内部配列を編集することができる。一例は、図２Ａに示される。一実施形態において、ＲＮＡドナー及びｅｓｎＲＮＡは、内部配列を編集する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、標的配列の末端部分を編集することができる。一例は、図２Ｂに示される。
【0157】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を改変する方法であって、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む、方法である。
【0158】
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む、方法を提供する。
【0159】
本開示は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、または１００％の効率で改変する方法であって、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を最大約１５％、最大約２０％、最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５、または１００％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。
【0160】
いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約１５％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約２０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約３０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約４０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約５０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約６０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約７０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約８０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の配列を少なくとも約９０％の効率で改変することを含み、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。
【0161】
本開示は、ＲＮＡ分子の非翻訳領域の配列を改変する方法であって、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む、方法を提供する。
【0162】
本開示は、ＷＰＲＥまたは類似の活性を有する配列の挿入によってＲＮＡの発現を増加させる方法であって、ＲＮＡドナー分子（またはその一部）のうちの１つ以上とＲＮＡ分子との結合及びトランススプライシングに好適な条件下で、組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む、方法を提供する。
【0163】
本開示は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の組成物を改変する方法であって、組成物と標的ＲＮＡを含む細胞を、組成物及び標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングに好適な条件下で接触させることを含む、方法を提供する。
【0164】
本開示は、標的ＲＮＡの組成を少なくとも約２０％の効率で改変する方法であって、組成物と標的ＲＮＡを含む細胞を、組成物及び標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングに好適な条件下で接触させることを含み、１００％の効率は、標的ＲＮＡ内の選択された配列の完全な置換を構成する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８９％、少なくとも約％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％である。いくつかの実施形態において、効率は、最大約２０％、最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８９％、最大約％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、または１００％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約２０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約６０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約７０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約８０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態において、効率は、約１００％である。
【0165】
本明細書に記載されるように、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の組成を少なくとも約２０％の効率で改変する方法であって、組成物と標的ＲＮＡを含む細胞を、組成物及び標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングに好適な条件下で接触させることを含み、１００％の効率は、標的ＲＮＡ内の選択された配列の完全な置換を構成する、方法である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８９％、少なくとも約％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％である。いくつかの実施形態において、効率は、最大約２０％、最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％、最大約５５％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８９％、最大約％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、または１００％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約２０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約６０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約７０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約８０％である。いくつかの実施形態において、効率は、少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態において、効率は、約１００％である。
【0166】
本開示は、標的ＲＮＡの組成を高効率で改変する方法であって、組成物と標的ＲＮＡを含む細胞を、組成物及び標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングに好適な条件下で接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子を含むかまたはコードする、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のＲＮＡドナー及びｅｓｎＲＮＡを含むかまたはコードする、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶである。
【0167】
本開示は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の組成を高効率で改変する方法であって、組成物と標的ＲＮＡを含む細胞を、組成物及び標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングに好適な条件下で接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子を含むかまたはコードする、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードする、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶである。
【0168】
本開示は、治療上有効な量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法を提供する。
【0169】
本開示は、治療上有効な量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法であって、ここで、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子を含むかまたはコードするベクターを含み、組成物は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現レベルを改変する、方法を提供する。
【0170】
本開示は、治療上有効な量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法であって、ここで、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードするベクターを含み、組成物は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現レベルを改変する、方法を提供する。
【0171】
本開示は、治療上有効な量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法であって、ここで、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子を含むかまたはコードするベクターを含み、組成物は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する、方法を提供する。
【0172】
本開示は、治療上有効な量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法であって、ここで、組成物は、本開示のＲＮＡドナー分子及びｅｓｎＲＮＡ分子を含むかまたはコードするベクターを含み、組成物は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する、方法を提供する。
【0173】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、遺伝子性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、遺伝子性疾患または障害は、単一遺伝子疾患または障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、常染色体優性疾患もしくは障害、常染色体劣性疾患もしくは障害、Ｘ染色体連鎖（Ｘ連鎖）疾患もしくは障害、Ｘ連鎖優性疾患もしくは障害、Ｘ連鎖劣性疾患もしくは障害、Ｙ連鎖疾患もしくは障害またはミトコンドリア病もしくは障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、分類不能型免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ベータ－サラセミア、アルファ－サラセミア、骨髄異形成症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、アッシャー症候、クラッベ病、ニーマン・ピック病、プリオン病、ドラヴェ症候群、若年性パーキンソン病、脊髄小脳失調症、遺伝性てんかん障害、毛細血管拡張性運動失調症、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、アンジェルマン症候群、グルコーストランスポーター１型欠損症、ダノン病、ファブリー病、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、ポンペ病、家族性高コレステロール血症、開放隅角緑内障、ハーラー症候群またはムコ多糖症１型、ハンター症候群またはムコ多糖症２型、バッテン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型、肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型、肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、血友病Ｂ、血友病Ａ、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、常染色体優性聴覚障害、及び非症候群性難聴であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子性疾患または障害である。いくつかの実施形態において、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子性疾患または障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、限定するものではないが、ハンチントン病、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、マルファン症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、遺伝性多発性外骨腫症、フォン・ウィルブランド病、及び急性間欠性ポルフィリン症を含む、常染色体優性疾患または障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、限定するものではないが、色素欠乏症、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、脊髄性筋萎縮症、及びロバーツ症候群を含む、常染色体疾患または障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、限定するものではないが、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、レット症候群、及び血友病Ａを含む、Ｘ連鎖疾患または障害である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子疾患または障害は、限定するものではないが、レーベル遺伝性視神経症を含む、ミトコンドリア障害である。
【0174】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、免疫疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫疾患または障害は、限定するものではないが、Ｂ細胞欠損症、Ｔ細胞欠損症、好中球減少症、無脾症、補体欠損症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び医学的介入による免疫不全（医学的治療法の意図された作用または有害作用としての免疫抑制）を含む、免疫不全疾患または障害である。いくつかの実施形態において、免疫疾患または障害は、限定するものではないが、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイド症、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索＆ニューロンニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）もしくは好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）もしくはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ様関節炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、分類不能結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、またはウェゲナー肉芽腫症を含む、自己免疫疾患または障害である。
【0175】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、炎症性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【0176】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、代謝性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【0177】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、変性または進行性の疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、変性または進行性の疾患または障害には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、及び老化が含まれるが、これらに限定されない。
【0178】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、感染性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【0179】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、小児科または発達性の疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【0180】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、心血管疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【0181】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、増殖性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増殖性疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、がんには、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）、ＣＮＳ原発リンパ腫（リンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、消化管カルチノイド腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系（脳癌）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、癌腫、心臓性（心臓）腫瘍、胎児性腫瘍、胚細胞性腫瘍、ＣＮＳ原発リンパ腫、子宮頸癌、肝内胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胚芽腫、子宮内膜癌（子宮癌）、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫（頭頸部癌）、ユーイング肉腫（骨癌）、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、小児眼球内黒色腫、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の悪性線維性組織球腫、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、小児消化管間質腫瘍、胚細胞性腫瘍、小児頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、卵巣胚細胞性腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛疾患、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌（頭頸部癌）、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌（頭頸部癌）、白血病、口唇・口腔癌（頭頸部癌）、肝臓癌、肺癌（非小細胞及び小細胞）、小児肺癌、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚癌）、中皮腫、原発不明転移性頸部扁平上皮癌（頭頸部癌）、ＮＵＴ遺伝子変化を伴う正中線癌、口癌（頭頸部癌）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔・副鼻腔癌（頭頸部癌）、鼻咽頭癌（頭頸部癌）、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇・口腔癌及び口腔咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（頭頸部癌）、褐色細胞腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳癌、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発性癌、腎細胞（腎臓）癌、網膜芽細胞腫、小児横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）、唾液腺癌（頭頸部癌）、肉腫、小児横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）、小児血管腫瘍（軟部組織肉腫）、ユーイング肉腫（骨癌）、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、骨肉腫（骨癌）、子宮肉腫、セザリー症候群、リンパ腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、頸部扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌（頭頸部癌）、鼻咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、腎細胞癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍（軟部組織肉腫）、外陰癌、ウイルムス腫瘍ならびに他の小児腎腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【0182】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、本開示の疾患または障害には、増殖性疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増殖性疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、ＤＮＡの欠失または転座により２つの遺伝子に由来する配列を含むキメラＲＮＡを生成する遺伝子融合の存在を伴う。遺伝子融合のペアには、ＭＡＮ２Ａ１及びＦＥＲ、ＤＮＡＪＢ１及びＰＲＫＡＣＡ、ＢＣＲ－ＡＢＬ１、ＴＭＰＲＳＳ２及びＥＲＧ、ＥＷＳＲ１及びＦＬＩ１、ＰＭＬ及びＲＡＲＡ、ＥＭＬ４及びＡＬＫ、ＫＩＡＡ１５４９及びＢＲＡＦ、ＣＣＤＣ６及びＲＥＴ、ＳＳ１８及びＳＳＸ１、ＲＵＮＸ１及びＲＵＮＸ１Ｔ１、ＰＡＸ３及びＦＯＸＯ１、ＮＣＯＡ４及びＲＥＴ、ＥＴＶ６及びＲＵＮＸ１、ＦＵＳ及びＤＤＩＴ３、ＳＳ１８及びＳＳＸ２、ＮＰＭ１及びＡＬＫ、ＫＭＴ２Ａ及びＡＦＦ１、ＴＣＦ３及びＰＢＸ１、ＳＴＩＬ及びＴＡＬ１、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＤＧＦＢ、ＣＲＴＣ１及びＭＡＭＬ２、ＮＡＢ２及びＳＴＡＴ６、ＥＷＳＲ１及びＡＴＦ１、ＥＴＶ６及びＮＴＲＫ３、ＥＷＳＲ１及びＥＲＧ、ＥＷＳＲ１及びＷＴ１、ＤＮＡＪＢ１及びＰＲＫＡＣＡ、ＰＡＸ７及びＦＯＸＯ１、ＦＵＳ及びＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＢＦＡ２Ｔ３及びＧＬＩＳ２、ＰＡＸ８及びＰＰＡＲＧ、ＫＭＴ２Ａ及びＭＬＬＴ１、ＥＷＳＲ１及びＮＲ４Ａ３、ＫＭＴ２Ａ及びＭＬＬＴ３、ＡＳＰＳＣＲ１及びＴＦＥ３、ＨＭＧＡ２及びＬＰＰ、ＪＡＺＦ１及びＳＵＺ１２、ＫＩＦ５Ｂ及びＲＥＴ、ＦＵＳ及びＥＲＧ、ＳＬＣ４５Ａ３及びＥＲＧ、ＮＵＰ２１４及びＡＢＬ１、ＳＥＴ及びＮＵＰ２１４、ＣＤ７４及びＲＯＳ１、ＥＴＶ６及びＡＢＬ１、ＴＰＭ３及びＮＴＲＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ及びＲＥＴ、ＥＷＳＲ１及びＣＲＥＢ１、ＫＭＴ２Ａ及びＡＦＤＮ、ＥＷＳＲ１及びＤＤＩＴ３、ＣＬＴＣ及びＡＬＫ、ＥＴＶ６及びＰＤＧＦＲＢ、ＴＰＭ３及びＡＬＫ、ＫＭＴ２Ａ及びＭＬＬＴ１０、ＴＭＰＲＳＳ２及びＥＴＶ１、ＢＲＤ４及びＮＵＴＭ１、ＮＵＰ９８及びＫＤＭ５Ａ、ＲＡＮＢＰ２及びＡＬＫ、ＣＴＮＮＢ１及びＰＬＡＧ１、ＫＭＴ２Ａ及びＥＬＬ、ＴＡＦ１５及びＮＲ４Ａ３、ＦＧＦＲ３及びＴＡＣＣ３、ＰＣＭ１及びＪＡＫ２、ＹＷＨＡＥ及びＮＵＴＭ２Ｂ、ＳＴＲＮ及びＡＬＫ、ＣＲＴＣ３及びＭＡＭＬ２、ＣＤＨ１１及びＵＳＰ６、ＣＤＫＮ２Ｄ及びＷＤＦＹ２、ＣＩＣ及びＤＵＸ４、ＳＬＣ３４Ａ２及びＲＯＳ１、ＡＴＩＣ及びＡＬＫ、ＣＤ７４及びＮＲＧ１、ＭＹＢ及びＮＦＩＢ、ＰＲＣＣ及びＴＦＥ３、ＫＩＦ５Ｂ及びＡＬＫ、ＴＭＰＲＳＳ２及びＥＴＶ４、ＫＭＴ２Ａ及びＳＥＰＴ９、ＥＷＳＲ１及びＰＯＵ５Ｆ１、ＦＧＦＲ１及びＰＬＡＧ１、ＭＮ１及びＥＴＶ６、ＴＢＬ１ＸＲ１及びＴＰ６３、ＫＭＴ２Ａ及びＥＰＳ１５、ＳＬＣ４５Ａ３及びＥＬＫ４、ＤＨＨ及びＲＨＥＢＬ１、ＨＥＹ１及びＮＣＯＡ２、ＥＺＲ及びＲＯＳ１、ＧＯＰＣ及びＲＯＳ１、ＨＭＧＡ２及びＷＩＦ１、ＫＭＴ２Ａ及びＣＲＥＢＢＰ、ＳＳ１８及びＳＳＸ４Ｂ、ＦＡＭ１３１Ｂ及びＢＲＡＦ、ＥＷＳＲ１及びＦＥＶ、ＥＷＳＲ１及びＰＢＸ１、ＴＰＭ４及びＡＬＫ、ＳＮＤ１及びＢＲＡＦ、ＡＣＴＢ及びＧＬＩ１、ＫＭＴ２Ａ及びＫＮＬ１、ＫＭＴ２Ａ及びＳＥＰＴ６、ＳＤＣ４及びＲＯＳ１、ＴＦＧ及びＡＬＫ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１及びＥＴＶ１、ＰＴＰＲＫ及びＲＳＰＯ３、ＪＡＺＦ１及びＰＨＦ１、ＨＭＧＡ２及びＲＡＤ５１Ｂ、ＫＭＴ２Ａ及びＭＬＬＴ１１、ＴＰＲ及びＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９及びＢＲＡＦ、ＦＵＳ及びＣＲＥＢ３Ｌ１、ＥＴＶ６及びＪＡＫ２、ＨＭＧＡ２及びＮＦＩＢ、ＫＭＴ２Ａ及びＡＦＦ３、ＣＨＣＨＤ７及びＰＬＡＧ１、ＶＴＩ１Ａ及びＴＣＦ７Ｌ２、ＬＩＦＲ及びＰＬＡＧ１、ＥＷＳＲ１及びＥＴＶ１、ＳＲＧＡＰ３及びＲＡＦ１、ＫＭＴ２Ａ及びＡＦＦ４、ＭＥＡＦ６及びＰＨＦ１、ＰＡＸ３及びＮＣＯＡ１、ＨＡＳ２及びＰＬＡＧ１、ＥＷＳＲ１及びＮＦＡＴＣ２、ＨＩＰ１及びＡＬＫ、ＧＯＬＧＡ５及びＲＥＴ、ＢＣＲ及びＪＡＫ２、ＥＷＳＲ１及びＥＴＶ４、ＤＣＴＮ１及びＡＬＫ、ＭＢＴＤ１及びＣＸｏｒｆ６７、ＮＤＲＧ１及びＥＲＧ、ＣＡＲＳ及びＡＬＫ、ＳＦＰＱ及びＴＦＥ３、ＫＭＴ２Ａ及びＡＲＨＧＡＰ２６、ＫＭＴ２Ａ及びＥＰ３００、ＫＭＴ２Ａ及びＴＥＴ１、ＰＡＸ５及びＪＡＫ２、ＰＰＦＩＢＰ１及びＡＬＫ、ＹＷＨＡＥ及びＮＵＴＭ２Ａ、ＬＲＩＧ３及びＲＯＳ１、ＴＦＧ及びＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３及びＲＯＳ１、ＳＬＣ４５Ａ３及びＥＴＶ１、ＥＲＣ１及びＲＥＴ、ＳＥＣ１６Ａ及びＮＯＴＣＨ１、ＫＴＮ１及びＲＥＴ、ＳＥＣ３１Ａ及びＪＡＫ２、ＴＣＥＡ１及びＰＬＡＧ１、ＱＫＩ及びＮＴＲＫ２、ＲＮＦ１３０及びＢＲＡＦ、ＥＩＦ３Ｅ及びＲＳＰＯ２、ＥＷＳＲ１及びＺＮＦ４４４、ＬＭＮＡ及びＮＴＲＫ１、ＰＰＦＩＢＰ１及びＲＯＳ１、ＰＷＷＰ２Ａ及びＲＯＳ１、ＥＷＳＲ１及びＹＹ１、ＦＵＳ及びＡＴＦ１、ＰＡＸ３及びＮＣＯＡ２、ＺＣ３Ｈ７Ｂ及びＢＣＯＲ、ＢＲＤ３及びＮＵＴＭ１、ＣＡＮＴ１及びＥＴＶ４、ＣＩＣ及びＦＯＸＯ４、ＣＯＬ１Ａ１及びＵＳＰ６、ＥＷＳＲ１及びＺＮＦ３８４、ＫＭＴ２Ａ及びＡＢＩ１、ＫＭＴ２Ａ及びＡＣＴＮ４、ＫＭＴ２Ａ及びＣＥＰ１７０Ｂ、ＫＭＴ２Ａ及びＦＯＸＯ３、ＫＭＴ２Ａ及びＧＡＳ７、ＫＭＴ２Ａ及びＭＬＬＴ６、ＫＭＴ２Ａ及びＳＥＰＴ２、ＫＭＴ２Ａ及びＳＥＰＴ５、ＭＳＮ及びＡＬＫ、ＶＣＬ及びＡＬＫ、ＥＺＲ及びＥＲＢＢ４、ＲＥＬＣＨ及びＲＥＴ、ＳＬＣ３Ａ２及びＮＲＧ１、ＴＲＩＭ２４及びＢＲＡＦ、ＫＬＣ１及びＡＬＫ、ＡＲＩＤ１Ａ及びＭＡＳＴ２、ＧＰＢＰ１Ｌ１及びＭＡＳＴ２、ＮＦＩＸ及びＭＡＳＴ１、ＮＯＴＣＨ１及びＧＡＢＢＲ２、ＴＡＤＡ２Ａ及びＭＡＳＴ１、ＺＮＦ７００及びＭＡＳＴ１、ＴＲＩＭ２４及びＲＥＴ、ＴＲＩＭ３３及びＲＥＴ、ＳＳＢＰ２及びＪＡＫ２、ＫＭＴ２Ａ及びＥＥＦＳＥＣ、ＣＬＣＮ６及びＢＲＡＦ、ＧＮＡＩ１及びＢＲＡＦ、ＭＫＲＮ１及びＢＲＡＦ、ＮＡＣＣ２及びＮＴＲＫ２、ＦＧＦＲ１及びＴＡＣＣ１、ＴＲＩＭ２７及びＲＥＴ、ＨＭＧＡ２及びＦＨＩＴ、ＨＯＯＫ３及びＲＥＴ、ＰＣＭ１及びＲＥＴ、ＣＥＰ８９及びＢＲＡＦ、ＣＬＩＰ１及びＲＯＳ１、ＥＲＣ１及びＲＯＳ１、ＨＬＡ及びＡ及びＲＯＳ１、ＬＳＭ１４Ａ及びＢＲＡＦ、ＭＹＯ５Ａ及びＲＯＳ１、ＳＨＴＮ１及びＲＯＳ１、ＴＰ５３及びＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３及びＲＯＳ１、ＺＣＣＨＣ８及びＲＯＳ１、ＦＧＦＲ３及びＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＫＬＫ２及びＥＴＶ１、ＡＣＳＬ３及びＥＴＶ１、ＮＵＰ１０７及びＬＧＲ５、ＨＭＧＡ２及びＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＨＭＧＡ２及びＣＯＸ６Ｃ、ＧＡＴＭ及びＢＲＡＦ、ＨＡＣＬ１及びＲＡＦ１、ＨＥＲＰＵＤ１及びＢＲＡＦ、ＺＳＣＡＮ３０及びＢＲＡＦ、ＳＬＣ４５Ａ３及びＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２及びＬＨＦＰＬ６、ＣＯＬ１Ａ２及びＰＬＡＧ１、ＥＳＲＰ１及びＲＡＦ１、ＩＲＦ２ＢＰ２及びＣＤＸ１、ＴＦＧ及びＮＲ４Ａ３、ＣＬＴＣ及びＴＦＥ３、ＥＷＳＲ１及びＭＹＢ、ＮＯＮＯ及びＴＦＥ３、ＦＣＨＳＤ１及びＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２及びＥＢＦ１、ＡＣＢＤ６及びＲＲＰ１５、ＡＧＰＡＴ５及びＭＣＰＨ１、ＡＧＴＲＡＰ及びＢＲＡＦ、ＡＲＦＩＰ１及びＦＨＤＣ１、ＡＴＧ４Ｃ及びＦＢＸＯ３８、ＢＢＳ９及びＰＫＤ１Ｌ１、ＣＥＮＰＫ及びＫＭＴ２Ａ、ＣＮＢＰ及びＵＳＰ６、ＤＤＸ５及びＥＴＶ４、ＥＩＦ３Ｋ及びＣＹＰ３９Ａ１、ＥＰＣ１及びＰＨＦ１、ＥＲＯ１Ａ及びＦＥＲＭＴ２、ＥＴＶ６及びＩＴＰＲ２、ＥＷＳＲ１及びＮＦＡＴＣ１、ＥＷＳＲ１及びＰＡＴＺ１、ＥＷＳＲ１及びＳＭＡＲＣＡ５、ＥＷＳＲ１及びＳＰ３、ＦＢＸＬ１８及びＲＮＦ２１６、ＦＧＦＲ１及びＺＮＦ７０３、ＦＮ１及びＡＬＫ、ＦＵＳ及びＦＥＶ、ＧＭＤＳ及びＰＤＥ８Ｂ、ＨＭＧＡ２及びＡＬＤＨ２、ＩＬ６Ｒ及びＡＴＰ８Ｂ２、ＩＮＴＳ４及びＧＡＢ２、ＪＰＴ１及びＵＳＨ１Ｇ、ＫＬＫ２及びＥＴＶ４、ＫＭＴ２Ａ及びＡＢＩ２、ＫＭＴ２Ａ及びＡＲＨＧＥＦ１２、ＫＭＴ２Ａ及びＢＴＢＤ１８、ＫＭＴ２Ａ及びＣＡＳＰ８ＡＰ２、ＫＭＴ２Ａ及びＣＢＬ、ＫＭＴ２Ａ及びＣＩＰ２Ａ、ＫＭＴ２Ａ及びＣＴ４５Ａ２、ＫＭＴ２Ａ及びＤＡＢ２ＩＰ、ＫＭＴ２Ａ及びＦＯＸＯ４、ＫＭＴ２Ａ及びＦＲＹＬ、ＫＭＴ２Ａ及びＧＭＰＳ、ＫＭＴ２Ａ及びＧＰＨＮ、ＫＭＴ２Ａ及びＬＡＳＰ１、ＫＭＴ２Ａ及びＬＰＰ、ＫＭＴ２Ａ及びＭＡＰＲＥ１、ＫＭＴ２Ａ及びＭＹＯ１Ｆ、ＫＭＴ２Ａ及びＮＣＫＩＰＳＤ、ＫＭＴ２Ａ及びＮＲＩＰ３、ＫＭＴ２Ａ及びＰＤＳ５Ａ、ＫＭＴ２Ａ及びＰＩＣＡＬＭ、ＫＭＴ２Ａ及びＰＲＲＣ１、ＫＭＴ２Ａ及びＳＡＲＮＰ、ＫＭＴ２Ａ及びＳＨ３ＧＬ１、ＫＭＴ２Ａ及びＳＯＲＢＳ２、ＫＭＴ２Ａ及びＴＯＰ３Ａ、ＫＭＴ２Ａ及びＺＦＹＶＥ１９、ＭＢＯＡＴ２及びＰＲＫＣＥ、ＭＩＡ２及びＧＥＭＩＮ２、ＮＦ１及びＡＳＩＣ２、ＮＦＩＡ及びＥＨＦ、ＮＴＮ１及びＡＣＬＹ、ＯＭＤ及びＵＳＰ６、ＰＬＡ２Ｒ１及びＲＢＭＳ１、ＰＬＸＮＤ１及びＴＭＣＣ１、ＲＡＦ１及びＤＡＺＬ、ＲＢＭ１４及びＰＡＣＳ１、ＲＧＳ２２及びＳＹＣＰ１、ＳＥＣ３１Ａ及びＡＬＫ、ＳＥＰＴ８及びＡＦＦ４、ＳＬＣ２２Ａ１及びＣＵＴＡ、ＳＬＣ２６Ａ６及びＰＲＫＡＲ２Ａ、ＳＬＣ４５Ａ３及びＥＴＶ５、ＳＱＳＴＭ１及びＡＬＫ、ＳＳ１８Ｌ１及びＳＳＸ１、ＳＳＨ２及びＳＵＺ１２、ＳＵＳＤ１及びＰＴＢＰ３、ＴＣＦ１２及びＮＲ４Ａ３、ＴＥＣＴＡ及びＴＢＣＥＬ、ＴＨＲＡＰ３及びＵＳＰ６、ＴＭＰＲＳＳ２及びＥＴＶ５、ＴＰＲ及びＡＬＫ、ＵＢＥ２Ｌ３及びＫＲＡＳ、ＷＤＣＰ及びＡＬＫ、ＳＳ１８及びＵＳＰ６が含まれるが、これらに限定されない。
【0183】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、疾患または障害と診断されている。いくつかの実施形態において、本開示の対象は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を呈する。いくつかの実施形態において、対象は、疾患または障害の発症リスクを予測するバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、遺伝子変異である。
【0184】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、雌である。本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、雄である。いくつかの実施形態において、本開示の対象は、２本のＸＸ染色体またはＸＹ染色体を有する。いくつかの実施形態において、本開示の対象は、２本のＸＸ染色体またはＸＹ染色体と、ＸまたはＹのいずれかの第３の染色体を有する。
【0185】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、中年成人、または高齢成人である。本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、生後少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、または少なくとも約３１日である。本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、生後少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、または少なくとも約１２ヶ月である。本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、少なくとも約１歳、少なくとも約２歳、少なくとも約３歳、少なくとも約４歳、少なくとも約５歳、少なくとも約６歳、少なくとも約７歳、少なくとも約８歳、少なくとも約９歳、少なくとも約１０歳、少なくとも約１５歳、少なくとも約２０歳、少なくとも約２５歳、少なくとも約３０歳、少なくとも約３５歳、少なくとも約４０歳、少なくとも約４５歳、少なくとも約５０歳、少なくとも約５５歳、少なくとも約６０歳、少なくとも約６５歳、少なくとも約７０歳、少なくとも約７５歳、少なくとも約８０歳、少なくとも約８５歳、少なくとも約９０歳、少なくとも約９５歳、少なくとも約１００歳またはその間の任意の年齢もしくは部分的な年齢である。
【0186】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。
【0187】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の対象は、ヒトである。
【0188】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、治療上有効な量は、本開示の組成物の単回用量を含む。いくつかの実施形態において、治療上有効な量、治療上有効な量は、本開示の組成物の少なくとも１用量を含む。いくつかの実施形態において、治療上有効な量、治療上有効な量は、本開示の組成物の１用量以上（複数可）を含む。
【0189】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害の徴候または症状を排除する。いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を軽減する。
【0190】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害を排除する。
【0191】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害の発症を予防する。いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害の発症を遅らせる。いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を軽減する。いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、対象の予後を改善する。
【0192】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の組成物は、対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、静脈内経路によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、注射または注入によって対象に投与される。
【0193】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の組成物は、対象に局所投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、骨内、眼内、脳脊髄内または脊髄内経路によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、中枢神経系の脳脊髄液に直接投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、眼球の組織または液体に直接投与されるが、眼球構造外では生物学的利用能を持たない。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、注射または注入によって対象に投与される。
【0194】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＲＮＡドナー分子を含む組成物は、医薬組成物として製剤化される。簡潔に述べると、本明細書で開示される使用のための医薬組成物は、融合タンパク質（複数可）、または任意選択により免疫直交性でもあるＡＡＶ中に任意選択により含まれる融合タンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含み得る。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、眼内、及び／または非経口投与用に製剤化され得る。ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【0195】
番号付き実施形態
特定の態様において、本明細書で開示されるのは、以下の実施形態である。
１．ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）前記ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、前記組成物。
２．操作された核内低分子ＲＮＡ分子及びＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、前記組成物。
３．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡドナー分子内の配列に対して相補的なモチーフを含有し、前記モチーフは、次の配列：５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’のうちの１つである、実施形態２に記載の組成物。
４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、５’末端から開始して、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトＵ１遺伝子から誘導または単離された配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
５．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、５’末端から開始して、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
６．前記操作された核内低分子ＲＮＡが、５’末端から開始して、合成またはヒトＵ１遺伝子から誘導もしくは単離された配列、それに続く前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された別の配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
７．前記操作された核内低分子ＲＮＡが、５’末端から開始して、ヒトＵ１遺伝子から誘導または単離された配列、それに続くＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
８．前記置換ドメインが、ＧＬＢ１（ＧＭ１ガングリオシドーシス）；ＧＢＡ（ゴーシェ病）；ＧＭ２Ａ（ＧＭ２ガングリオシドーシス）；ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ（家族性高コレステロール血症）；ＧＡＡ（ポンペ病）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）；ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＣＬＮ３（バッテン病）；Ｆ９（血友病Ｂ）；Ｆ８（血友病Ａ）、ＬＡＭＰ２（ダノン病）；ＧＬＡ（ファブリー病）；ＳＬＣ２Ａ１（グルコーストランスポーター１型欠損症）；ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）；ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＣＬＮ３（バッテン病）；ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）；ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；ＤＹＳＦ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）；ＳＧＣＢ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）；ＳＧＣＧ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）；ＳＧＣＡ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）；ＳＧＣＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）；ＤＵＸ４、Ｄ４Ｚ４（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）；ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６（網膜色素変性症）からなる群から選択されるヒト遺伝子から誘導または単離される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物。
９．前記置換ドメインが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から選択される発現増強配列から誘導または単離される、実施形態１～７に記載の組成物。
１０．前記アンチセンスドメインが、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（分類不能型免疫不全症）、ＡＤＡ、ＣＥＣＲ１（アデノシンデアミナーゼ欠損症）、ＩＬ２ＲＧ（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）、ＨＢＢ（ベータ－サラセミア）、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２（アルファ－サラセミア）、Ｕ２ＡＦ１（骨髄異形成症候群）、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＭＡＴＲ３、ＳＯＤ１、Ｃ９ＯＲＦ７２（筋萎縮性側索硬化症）、ＭＡＰＴ、ＰＧＲＮ（パーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症）、ＣＤＨ２３、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ（アッシャー症候）、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２（ニーマン・ピック病）、ＰＲＮＰ（プリオン病）、ＳＣＮ１Ａ（ドラヴェ症候群）、ＰＩＮＫ１、ＡＴＰＧＡＰ２（若年性パーキンソン病）、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＲＰ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ１、ＦＧＦ１４（脊髄小脳失調症）、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＧ１、ＳＬＣ６Ａ１、ＰＲＲＴ２、ＰＴＥＮ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＳＴＡＲＤ７、ＣＬＲＮ１（遺伝性てんかん障害）、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症）、ＧＬＢ１（ＧＭ１ガングリオシドーシス）、ＧＢＡ（ゴーシェ病）、ＧＭ２Ａ（ＧＭ２ガングリオシドーシス）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＳＬＣ２Ａ１（グルコーストランスポーター１型欠損症）、ＬＡＭＰ２（ダノン病）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患）、ＧＡＡ（ポンペ病）、ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ（家族性高コレステロール血症）、ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）、ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）、ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）、ＣＬＮ３（バッテン病）、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）、ＤＹＳＦ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＳＧＣＡ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＳＧＣＢ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＳＧＣＧ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＳＧＣＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）、ＤＵＸ４、Ｄ４Ｚ４（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）、Ｆ９（血友病Ｂ）、Ｆ８（血友病Ａ）、ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６（網膜色素変性症）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症）、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＴＲＣ、ＤＦＮＡ１、ＤＦＮＡ１４（常染色体優性聴覚障害）、ＰＯＵ３Ｆ３（非症候群性難聴）からなる群から選択されるヒト遺伝子から誘導または単離された配列に対して相補的である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物。
１１．前記ＲＮＡドナー分子が、前記ＲＮＡドナー分子及び／または前記ｅｓｎＲＮＡの局在、プロセシング、または輸送を変える非翻訳領域を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物。
１２．前記ＲＮＡドナー分子及び／またはｅｓｎＲＮＡを含む配列が、トランススプライシング効率を高めるＲＮＡ結合タンパク質によって結合される配列を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載の組成物。
１３．ＲＮＡドナー分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の組成物。
１４．前記ＲＮＡドナー分子が、異種プロモーターを更に含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の組成物。
１５．前記ｅｓｎＲＮＡが、異種プロモーターを更に含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の組成物。
１６．前記プロモーターが、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することが可能なプロモーターから単離または誘導される、実施形態１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物。
１８．標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物であって、前記ＲＮＡドナー分子は、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、前記組成物。
１９．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態１７～１８に記載の組成物。
２０．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する、実施形態１９に記載の組成物。
２１．前記ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される、実施形態１７～２０に記載の組成物。
２２．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む、実施形態１７～２１に記載の組成物。
２３．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはバリアントから誘導または単離され、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的で５’末端から１６核酸塩基未満で始まるＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２２に記載の組成物。
２４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的なＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２３に記載の組成物。
２５．前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、実施形態２４に記載の組成物。
２６．前記ＲＮＡドナー分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２５に記載の組成物。
２７．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態１７～２６に記載の組成物。
２８．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態１７～２７に記載の組成物。
２９．前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含んでいる、実施形態１７～２８に記載の組成物。
３０．前記翻訳増強エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む、実施形態２９に記載の組成物。
３１．前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、実施形態１７～３０に記載の組成物。
３２．前記ＲＮＡドナー分子及び核内低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１７～３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）前記ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、前記組成物。
３４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態３３に記載の組成物。
３５．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態３３または３４に記載の組成物。
３６．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する、実施形態３３～３５に記載の組成物。
３７．前記ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される、実施形態３３～３６に記載の組成物。
３８．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む、実施形態３７に記載の組成物。
３９．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導された配列を含む、実施形態３７に記載の組成物。
４０．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ＲＮＡドナー分子中のスプライスドナー部位から２００塩基未満離れて位置する、実施形態３９に記載の組成物。
４１．前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、実施形態４０に記載の組成物。
４２．前記ＲＮＡドナー分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、実施形態３３～４１に記載の組成物。
４３．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子または前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態３３～４２に記載の組成物。
４４．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態３３～４３に記載の組成物。
４５．前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含んでいる、実施形態４４に記載の組成物。
４６．前記翻訳増強エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む、実施形態４５に記載の組成物。
４７．前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、実施形態１７～４６に記載の組成物。
４８．前記ＲＮＡドナー分子及び核内低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１７～４７のいずれか１つに記載の組成物。
４９．前記核酸分子が、異種プロモーターを更に含む、実施形態１７～４８に記載の組成物。
５０．実施形態１７～４９に記載の組成物を含む、ベクター。
５１．前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される、実施形態５０に記載のベクター。
５２．実施形態５１に記載のベクターを含む、細胞。
５３．疾患を治療するための方法であって、実施形態１７または実施形態１８に記載のＲＮＡドナー分子及び操作された核内低分子ＲＮＡ分子を含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
５４．対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子及び操作された核内低分子ＲＮＡ分子を前記対象に投与することを含む、前記方法。
５５．疾患を治療するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子を含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
５６．対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子を前記対象に投与することを含む、前記方法。
特定の態様において、本明細書で開示されるのは、以下の実施形態である。
１．ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）前記ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、前記組成物。
２．操作された核内低分子ＲＮＡ分子及びＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、前記組成物。
３．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡドナー分子内の配列に対して相補的なモチーフを含有し、前記モチーフは、次の配列：５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’のうちの１つである、実施形態２に記載の組成物。
４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、５’末端から開始して、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトＵ１遺伝子から誘導または単離された配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
５．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、５’末端から開始して、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
６．前記操作された核内低分子ＲＮＡが、５’末端から開始して、合成またはヒトＵ１遺伝子から誘導もしくは単離された配列、それに続く前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列、それに続くヒトｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導または単離された別の配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
７．前記操作された核内低分子ＲＮＡが、５’末端から開始して、ヒトＵ１遺伝子から誘導または単離された配列、それに続くＲＮＡドナー分子中の配列に対して相補的な配列で構成される、実施形態２に記載の組成物。
８．前記置換ドメインが、ＧＬＢ１（ＧＭ１ガングリオシドーシス）；ＧＢＡ（ゴーシェ病）；ＧＭ２Ａ（ＧＭ２ガングリオシドーシス）；ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ（家族性高コレステロール血症）；ＧＡＡ（ポンペ病）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）；ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＣＬＮ３（バッテン病）；Ｆ９（血友病Ｂ）；Ｆ８（血友病Ａ）、ＬＡＭＰ２（ダノン病）；ＧＬＡ（ファブリー病）；ＳＬＣ２Ａ１（グルコーストランスポーター１型欠損症）；ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）；ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）；ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）；ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）；ＣＬＮ３（バッテン病）；ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）；ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；ＤＹＳＦ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）；ＳＧＣＢ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）；ＳＧＣＧ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）；ＳＧＣＡ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）；ＳＧＣＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）；ＤＵＸ４、Ｄ４Ｚ４（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）；ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６（網膜色素変性症）からなる群から選択されるヒト遺伝子から誘導または単離される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物。
９．前記置換ドメインが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から選択される発現増強配列から誘導または単離される、実施形態１～７に記載の組成物。
１０．前記アンチセンスドメインが、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（分類不能型免疫不全症）、ＡＤＡ、ＣＥＣＲ１（アデノシンデアミナーゼ欠損症）、ＩＬ２ＲＧ（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）、ＨＢＢ（ベータ－サラセミア）、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２（アルファ－サラセミア）、Ｕ２ＡＦ１（骨髄異形成症候群）、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＭＡＴＲ３、ＳＯＤ１、Ｃ９ＯＲＦ７２（筋萎縮性側索硬化症）、ＭＡＰＴ、ＰＧＲＮ（パーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症）、ＣＤＨ２３、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ（アッシャー症候）、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２（ニーマン・ピック病）、ＰＲＮＰ（プリオン病）、ＳＣＮ１Ａ（ドラヴェ症候群）、ＰＩＮＫ１、ＡＴＰＧＡＰ２（若年性パーキンソン病）、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＲＰ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ１、ＦＧＦ１４（脊髄小脳失調症）、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＧ１、ＳＬＣ６Ａ１、ＰＲＲＴ２、ＰＴＥＮ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＳＴＡＲＤ７、ＣＬＲＮ１（遺伝性てんかん障害）、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症）、ＧＬＢ１（ＧＭ１ガングリオシドーシス）、ＧＢＡ（ゴーシェ病）、ＧＭ２Ａ（ＧＭ２ガングリオシドーシス）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＳＬＣ２Ａ１（グルコーストランスポーター１型欠損症）、ＬＡＭＰ２（ダノン病）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患）、ＧＡＡ（ポンペ病）、ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ（家族性高コレステロール血症）、ＭＹＯＣ、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＷＤＲ３６、ＣＹＰＩＢ１（開放隅角緑内障）、ＩＤＵＡ（ハーラー症候群またはムコ多糖症１型）、ＩＤＳ（ハンター症候群またはムコ多糖症２型）、ＣＬＮ３（バッテン病）、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）、ＤＹＳＦ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＳＧＣＡ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＳＧＣＢ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＳＧＣＧ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＳＧＣＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｆ型）、ＤＵＸ４、Ｄ４Ｚ４（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）、Ｆ９（血友病Ｂ）、Ｆ８（血友病Ａ）、ＵＳＨＡ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＨＯ、ＰＲＰＦ３１、ＵＳＨ１Ｆ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ６（網膜色素変性症）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症）、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＴＲＣ、ＤＦＮＡ１、ＤＦＮＡ１４（常染色体優性聴覚障害）、ＰＯＵ３Ｆ３（非症候群性難聴）からなる群から選択されるヒト遺伝子から誘導または単離された配列に対して相補的である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物。
１１．前記ＲＮＡドナー分子が、前記ＲＮＡドナー分子及び／または前記ｅｓｎＲＮＡの局在、プロセシング、または輸送を変える非翻訳領域を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物。
１２．前記ＲＮＡドナー分子及び／またはｅｓｎＲＮＡを含む配列が、トランススプライシング効率を高めるＲＮＡ結合タンパク質によって結合される配列を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載の組成物。
１３．ＲＮＡドナー分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の組成物。
１４．前記ＲＮＡドナー分子が、異種プロモーターを更に含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の組成物。
１５．前記ｅｓｎＲＮＡが、異種プロモーターを更に含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の組成物。
１６．前記プロモーターが、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することが可能なプロモーターから単離または誘導される、実施形態１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物。
１８．標的ＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡを含む、組成物であって、前記ＲＮＡドナー分子は、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメインを含む、前記組成物。
１９．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態１７～１８に記載の組成物。
２０．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する、実施形態１９に記載の組成物。
２１．前記ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される、実施形態１７～２０に記載の組成物。
２２．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む、実施形態１７～２１に記載の組成物。
２３．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはバリアントから誘導または単離され、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的で５’末端から１６核酸塩基未満で始まるＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２２に記載の組成物。
２４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡドナー分子に対して部分的または完全に相補的なＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２３に記載の組成物。
２５．前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、実施形態２４に記載の組成物。
２６．前記ＲＮＡドナー分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、実施形態１７～２５に記載の組成物。
２７．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子またはバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態１７～２６に記載の組成物。
２８．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態１７～２７に記載の組成物。
２９．前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含んでいる、実施形態１７～２８に記載の組成物。
３０．前記翻訳増強エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む、実施形態２９に記載の組成物。
３１．前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、実施形態１７～３０に記載の組成物。
３２．前記ＲＮＡドナー分子及び核内低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１７～３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．ＲＮＡドナー分子を含む組成物であって、（ａ）作動可能に連結された治療配列をコードする１つ以上の置換ドメイン、（ｂ）前記置換ドメインのＲＮＡスプライシングを促進する１つ以上のイントロンドメイン、及び（ｃ）標的ＲＮＡ分子への結合を促進する１つ以上のアンチセンスドメイン、及び（ｄ）前記ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングを促進する操作された核内低分子ＲＮＡドメインを含む、前記組成物。
３４．前記操作された核内低分子ＲＮＡ分子が、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態３３に記載の組成物。
３５．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子から単離または誘導される、実施形態３３または３４に記載の組成物。
３６．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、合成であり、スプライソソームの構成要素と結合する、実施形態３３～３５に記載の組成物。
３７．前記ヒト核内低分子ＲＮＡ遺伝子が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２からなる群から選択される、実施形態３３～３６に記載の組成物。
３８．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１遺伝子のバリアントから単離または誘導された配列を含む、実施形態３７に記載の組成物。
３９．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ヒトＵ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導された配列を含む、実施形態３７に記載の組成物。
４０．前記操作された核内低分子ＲＮＡドメインが、前記ＲＮＡドナー分子中のスプライスドナー部位から２００塩基未満離れて位置する、実施形態３９に記載の組成物。
４１．前記ＲＮＡモチーフが、５’－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴ－３’、５’－ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’、５’－ＴＡＴＣＧＣＡＡＣＧ－３’、５’－ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴ－３’、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣ－３’、５’－ＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴ－３’、５’－ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡ－３’、及び５’－ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧ－３’からなる群から選択される、実施形態４０に記載の組成物。
４２．前記ＲＮＡドナー分子が、少なくとも４ヌクレオチド長であり、前記ＲＮＡドナー分子中の配列に対して部分的または完全に相補的である、ＲＮＡモチーフを含有する、実施形態３３～４１に記載の組成物。
４３．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子または前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態３３～４２に記載の組成物。
４４．前記操作された低分子ＲＮＡ分子が、Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子及び前記Ｕ１核内低分子ＲＮＡ遺伝子のバリアントから誘導または単離される配列を含む、実施形態３３～４３に記載の組成物。
４５．前記ＲＮＡドナー分子が、翻訳を増強させる非翻訳領域を更に含んでいる、実施形態４４に記載の組成物。
４６．前記翻訳増強エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＭＡＬＡＴ１由来の三重らせん、Ｂ型肝炎ウイルスのＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、及び鉄応答性エレメントからなる群から誘導または単離される配列を含む、実施形態４５に記載の組成物。
４７．前記ＲＮＡドナー分子と前記標的ＲＮＡ分子との間の相互作用を強化し、トランススプライシング効率を高める、ＲＮＡ結合タンパク質を更に含む、実施形態１７～４６に記載の組成物。
４８．前記ＲＮＡドナー分子及び核内低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体、化学修飾核酸、または２つ以上の核酸もしくは核酸類似体から構成されるキメラである、実施形態１７～４７のいずれか１つに記載の組成物。
４９．前記核酸分子が、異種プロモーターを更に含む、実施形態１７～４８に記載の組成物。
５０．実施形態１７～４９に記載の組成物を含む、ベクター。
５１．前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群から選択される、実施形態５０に記載のベクター。
５２．実施形態５１に記載のベクターを含む、細胞。
５３．疾患を治療するための方法であって、実施形態１７または実施形態１８に記載のＲＮＡドナー分子及び操作された核内低分子ＲＮＡ分子を含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
５４．対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子及び操作された核内低分子ＲＮＡ分子を前記対象に投与することを含む、前記方法。
５５．疾患を治療するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子を含む治療上有効な量の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
５６．対象の遺伝的欠陥を修復するための方法であって、実施形態１７～４９に記載のＲＮＡドナー分子を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【0196】
定義
２つ以上の一連の数値の最初の数値の前（最後の数値の後）に「少なくとも」、「より大きい」、または「以上」という用語がある場合は常に、「少なくとも」、「より大きい」または「以上」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、１、２、または３以上は、１以上、２以上、または３以上と同等である。
２つ以上の一連の数値の最初の数値の前（最後の数値の後）に「少なくとも」、「より大きい」、または「以上」という用語がある場合は常に、「少なくとも」、「より大きい」または「以上」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、１、２、または３以上は、１以上、２以上、または３以上と同等である。
【0197】
２つ以上の一連の数値の最後の数値の後に「を超えない」、「未満」、または「以下」という用語がある場合は常に、「を超えない」、「未満」、または「以下」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、３、２、または１以下は、３以下、２以下、または１以下と同等である。
【0198】
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、２つ以上の原子または分子の間の弱いまたは強い相互作用を指し得る。相互作用は、１つ以上の分子によって直接的または間接的に媒介され得る。
【実施例】
【0199】
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれるものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【0200】
実施例１：操作された核内低分子ＲＮＡの特定
この研究は、ＲＮＡトランススプライシングとの関係において、改変した核内低分子ＲＮＡの活性を評価するものである。まず、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な様々な配列を含有する８つの操作された核内低分子ＲＮＡが、ＲＮＡドナー分子のＲＮＡトランススプライシングの効率を高めることができるかどうかを評価した（図６Ａ～６Ｂ）。これらのバリアントＲＮＡドナー分子は、スプリットＧＦＰレポーターを標的とし、ＲＮＡドナー分子とのトランススプライシングが成功した後にのみ蛍光を発する（図４Ａ～４Ｄ、５Ａ～５Ｄ）。このアッセイは、定性的なもので、完全に定量的なものではないが、細胞生物学のエンドユーザーがＲＮＡの存在、不在、または全般的な程度に関する科学的な質問に答えようとするときに多く使うものであるため、有用である。したがって、ＧＦＰトランススプライシングレポーターは、ＲＮＡトランススプライシング技術の研究で広く使用されている。ＧＦＰレポーターを使用して、トランススプライシング反応の効率に対する様々なトランススプライシングエンハンサー配列の相対的な影響を比較した。
この研究は、ＲＮＡトランススプライシングとの関係において、改変した核内低分子ＲＮＡの活性を評価するものである。まず、ＲＮＡドナー分子に対して相補的な様々な配列を含有する８つの操作された核内低分子ＲＮＡが、ＲＮＡドナー分子のＲＮＡトランススプライシングの効率を高めることができるかどうかを評価した（図６Ａ～６Ｂ）。これらのバリアントＲＮＡドナー分子は、スプリットＧＦＰレポーターを標的とし、ＲＮＡドナー分子とのトランススプライシングが成功した後にのみ蛍光を発する（図４Ａ～４Ｄ、５Ａ～５Ｄ）。このアッセイは、定性的なもので、完全に定量的なものではないが、細胞生物学のエンドユーザーがＲＮＡの存在、不在、または全般的な程度に関する科学的な質問に答えようとするときに多く使うものであるため、有用である。したがって、ＧＦＰトランススプライシングレポーターは、ＲＮＡトランススプライシング技術の研究で広く使用されている。ＧＦＰレポーターを使用して、トランススプライシング反応の効率に対する様々なトランススプライシングエンハンサー配列の相対的な影響を比較した。
【0201】
図６Ａ～６Ｂに記載されるデータを収集するための実験を、３つの一過性トランスフェクト構成要素：レポータープラスミド、ＲＮＡドナー（プラスミドにもコードされ、ＣＭＶプロモーターによって駆動される）、及びｅｓｎＲＮＡ（プラスミドにコードされ、ネイティブＵ１プロモーターによって駆動される）を用いて実施した。ｅｓｎＲＮＡは、ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡから誘導され、ＲＮＡドナー分子内の様々な配列に対して完全に相補的な１０～１４塩基長の領域を持つ改変された５’末端を持つ。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを３７℃、５％ＣＯ２中に維持し、２４ウェルプレートの各ウェルに３００，０００細胞でプレーティングした。リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って用いて、細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした全プラスミドの１／５はレポーター、１／５はＲＮＡドナープラスミド、２／５はｅｓｎＲＮＡプラスミド、１／５はｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするトランスフェクション制御プラスミドであった。ｍＣｈｅｒｒｙ制御の目的は、ＧＦＰレポーターによって生成されたシグナルを正規化する手段を提供することである。トランスフェクションから４８時間後、細胞を回収し、Ｓｏｎｙ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた蛍光活性化セルソーティングを使用して蛍光測定に供した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルが陽性であった細胞を特定し、次いで、この集団のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙシグナルの平均値を評価した。ＧＦＰシグナルをｍＣｈｅｒｒｙシグナルに対して正規化し、結果を図６Ａ～６Ｂに報告した。相補配列を変えたほとんどのｅｓｎＲＮＡは、未改変のＵ１ ｓｎＲＮＡ（野生型または「ｗｔ」ｅｓｎＲＮＡ）と比較して、ＧＦＰシグナルの顕著な増加をもたらさない。図６Ａ～６Ｂで使用したｅｓｎＲＮＡの完全な配列は、次のとおりである：ｅｓｎＲＮＡ Ａ：ＧＣＴＣＴＣＴＴＡＣｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａｔｇａｔｃａｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ；ｅｓｎＲＮＡ Ｂ：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ；ｅｓｎＲＮＡ Ｃ：ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ；ｅｓｎＲＮＡ Ｄ：ＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ；ｅｓｎＲＮＡ 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【0202】
次に、図６Ａ～６Ｂで特定されたｅｓｎＲＮＡが、異なるレポーターシステムとの関係において、高忠実のＲＮＡトランススプライシングを促進することができるかどうかを評価した（図７）。図６Ａでは、ヒトＣＯＬ１７Ａ１遺伝子由来の配列を含むレポーターを使用し、図７では、ヒトＳＣＮ１Ａ由来の配列をレポーターに使用した。したがって、これらの２つの標的の間でトランススプライシングが成功することは、この方法が多くの標的に対処できる幅広い適用可能性があることを示す。ＲＮＡドナー分子のトランススプライシングが成功した後にのみ蛍光を発するスプリットＧＦＰレポーターを用いる類似のアッセイを使用した。（図５Ａ～５Ｄ）。
【0203】
図７に記載されるデータを収集するための実験を、３つの一過性トランスフェクト構成要素：レポータープラスミド、ＲＮＡドナー（プラスミドにもコードされ、ＣＭＶプロモーターによって駆動される）、及びｅｓｎＲＮＡ Ｂ（プラスミドにコードされ、ネイティブＵ１プロモーターによって駆動される）を用いて実施した。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを３７℃、５％ＣＯ２中に維持し、２４ウェルプレートの各ウェルに３００，０００細胞でプレーティングした。リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って用いて、細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした全プラスミドの１／５はレポーター、１／５はＲＮＡドナープラスミド、２／５はｅｓｎＲＮＡプラスミド、１／５はｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするトランスフェクション制御プラスミドであった。トランスフェクションから４８時間後、細胞を回収し、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを細胞から抽出した。次に、細胞をＤＮＡｓｅ（ＴｕｒｂｏＤＮＡｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ）で処理し、逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ）に供した。次に、ｃＤＮＡを、シススプライスとトランススプライスの両方のレポーター産物を増幅するプライマーを使用するＰＣＲによって、次のプライマー：フォワード：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣ及びリバース：ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡを使用して、増幅した。これらのＰＣＲ産物をＴＯＰＯ－ＴＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ）にクローニングし、サンガー法によって配列決定した。配列決定の結果を全長ＧＦＰに対してアライメントし（図７）、完全またはほぼ完全なアラインメントを持つクローンを図７で比較した。全長は、ｅｓｎＲＮＡの存在下でのみ観察され、２５個のクローンのうち４個で全長ＧＦＰが得られた（ｅｓｎＲＮＡの非存在下で全長ＧＦＰが得られたのは、２４個のクローンのうち０個であった）。図７で使用したレポーターは、ＣＭＶプロモーター、ヒトＳＣＮ１Ａ１遺伝子のエクソン１５、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子のイントロン１５、及びａｃＧＦＰのＣ末端部分（１２７アミノ酸残基）を含有する（５’→３’方向）。このレポーターの配列は、次のとおりである：ＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＧＡＧＴＧＴＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＴＧｇｔａｔｇｔａｃｃｃａａｇｔｔａｇａｔａｔｇｃａｔｔｔｃａｇａａａｔａｃａｔｃａａｔａａｃａｔａａｃａａａｔｔｔｇｔｇｃｃｃａａｔｔｔａｔｔａａａａａａｔｇａｃｔｔｔｃａｔｇａｔａａａｔａａｔｔｔｔａａａｔｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｔｔａａｇａｔａｔｇｔｔｔａｔｃｔｔｃｔｔａｔｔｃｔａａａａａｔａｔａｃｃｇｃａａｃａｔｇｇｃａａａｇｔａｔａｇｔａｔｃａｃａａｔｃｔａｃｔａｔｇｇｔａａｔａｔａｇａａａｔａｃａｔｃｔｔａａａａｃａａａｔｇｔａｔｇｃａｃａｔｔａａｔａｔｔａｃｃｔａｔｇａｔａｔｔｔｔａｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｔａｔｔｔｔａｃａｇｃｔｃｔａｔｔｔｔｔｔｔａａｇａｃａａｇｇｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｔｃｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｔｇｃｔｃｔｇｔａｇａｔｃｔａｇｃｔｇｇｇｃｔｔｇａａｃｔｃａｇａｇａｔｃｃａｃｃｔｇｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｃａａｇｔａｃｔｔｇｇａｔｔａａａｇｔｇａｔｔｇｔｇｃｃａｃｃｔｇｇｃｔｔｃｔｃａａｃｔｃｔａｔｔｔｔａｔｔｃａｇｔｃａｃｔｔｃａｔｔｇｃａｔｔｔａｇｔｔａｔｔａａａｔｔｇｃａｔａｇｇａｃｔｇｔｔａａａａａｔｔｔａｃａｃａａａｔａｔｇｔｔａｔｇｔｇｃｇｔｇｔｇｔｔｔｇｔｇｔｇｔｇａｔｇｔｃｔａｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｔｇｃａｔｇｔｇａｇｇｇａｇａａａｇｇｇｇｇｃａａｔｔｔｔｔｇｃｔａｔａｇａａｔａｇｔｇｃｔａａｃａａｇａａｔｇｇｔｃｃａｔｇｃａｔａｔｇｔｔｇａａｇａｃｔｔｔｃａｔｔｃｔａａａｔｔｔｇｇｔｃａｔｇａｃｔａｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｃａｇｔｔａｔｃａｔｃｃａａｃａａｃａｃａａａａｔｃａｔｇａａｇａｇａｇａａａａｃｃｃａａａａｔａｃａｔｔｔａａａｔａａａｔａａｔｔｇｃａａａｔａｔｔａａｔｃａｔｔｔｔｔａａａｔｔｔｇｇａａｔｔｇｔｔａａａｇｔａｔｃｔｃａｇｔａａａｔａｔａｔｃｔｔｃｔｔｔｔａｃｔｃａｔａｔａａｔａｔｔａａａｔａｔａａｔｇａｔａａａｃｔａａｔｔｃａｔｔｃａａｇｔｔｃｔｔｃａｔｔｔｃａｔｇｔａｔｇｇｇａｇａｔｃｔｔｇａｇａｇｃａｇｔａｇａａａｇａａｔｇｃｃｔｃａｔｇｔａｃａｔａｇａｇａｔｇｇａｇｃａａｔａｔｃａｃａａａｔｔｃａｇａｇｔｇｃｔｃａａａａｃｔｔｔｔｃｔａｇｇｇｃｇｇａｇｔｇｔｔｇａａｃｃｃａｇｇｇｃｃｔｃａｔｇｔｔｔｔｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇｃｃｃａｃｔｔａａｃｔｔｃｔａｇｃａａｔｇｃｃｔｇｔｇｃｔｇｔａｔｃｔｔｇｃｔｃａｔａｔａｇｃａｔｔｃｇｇｔｔａｔｔｃａｔｔｃｔａｔａｇｃｔａａａｇｇａａｔａａｇｃｃａｔｃｃｔａｔｇｔｃｃｔｃｔｇｔｇｔｔｇｔｇｇｔｇａａｃａｃａｔａｃｔｔａｔｇｔｃｔｇｔｔｔｔｃａａｇＧＴｃＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＧＡ
【0204】
次に、ＲＮＡドナーと標的ＲＮＡとの間のトランススプライシング効率を高めるためには、ｅｓｎＲＮＡの特定の特徴が必要かどうかを評価した。図６で特定されたｅｓｎＲＮＡ（ｅｓｎＲＮＡ Ｂ）から開始し、特定のスプライソソーム構成要素と相互作用するｅｓｎＲＮＡの様々な欠失または変異部分を欠失または変異させた（図８Ｂ）。具体的には、スプライソソーム構成要素と相互作用する様々なテムループ構造をアデノシンの反復領域に変異させるか、または欠失させた。図８Ａに報告されるこれらのデータは、ｅｓｎＲＮＡによるスプライソソームのリクルートが、観察されたトランススプライシング活性の増強に必要であることを示している。
【0205】
図８Ａに記載されるデータを収集するための実験を、３つの一過性トランスフェクト構成要素：レポータープラスミド、ＲＮＡドナー（プラスミドにもコードされ、ＣＭＶプロモーターによって駆動される）、及びｅｓｎＲＮＡ Ｂ（プラスミドにコードされ、ネイティブＵ１プロモーターによって駆動される）を用いて実施した。野生型ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡの様々な特徴を欠くｅｓｎＲＮＡ Ｂのバリアントを比較した。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを３７℃、５％ＣＯ２中に維持し、２４ウェルプレートの各ウェルに３００，０００細胞でプレーティングした。リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って用いて、細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした全プラスミドの１／５はレポーター、１／５はＲＮＡドナープラスミド、２／５はｅｓｎＲＮＡプラスミド、１／５はｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするトランスフェクション制御プラスミドであった。トランスフェクションから４８時間後、細胞を回収し、Ｓｏｎｙ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた蛍光活性化セルソーティングを使用して蛍光測定に供した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルが陽性であった細胞を特定し、次いで、この集団のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙシグナルの平均値を評価した。ＧＦＰシグナルをｍＣｈｅｒｒｙシグナルに対して正規化し、結果を図８に報告した。ステムループ１、２、または４を欠失または変異させると、ＧＦＰシグナルが劇的に減少した。この結果は、ｅｓｎＲＮＡがＲＮＡドナーと標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングを増加させる機序として、スプライソソーム構成要素のリクルートが考えられることを示している。図８Ａ～８Ｂで使用したｅｓｎＲＮＡの完全な配列は、次のとおりである：ｅｓｎＲＮＡ Ｂ：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ；ｅｓｎＲＮＡ「ｍＳＬ４」：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔＡＡＡＡＡｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ、ｅｓｎＲＮＡ「－ＳＬ４」：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ、ｅｓｎＲＮＡ「－ＳＬ１、－ＳＬ２」：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ。図８Ａで使用したレポーターは、ＣＭＶプロモーター、ヒトＣＯＬ１７Ａ１遺伝子のエクソン８１、ヒトＣＯＬ１７Ａ１遺伝子のイントロン８１、及びａｃＧＦＰのＣ末端部分（１２７アミノ酸残基）を含む（５’→３’方向）。配列は、上に示すとおりである。
【0206】
次に、効率的なトランススプライシングを誘導するために必要なｅｓｎＲＮＡとＲＮＡドナー分子との間の逆相補性の程度を評価した。図６Ａ～８Ｂは、ＲＮＡドナーと標的ＲＮＡとの間の効率的なトランススプライシングを誘導するためには、ｅｓｎＲＮＡによるＲＮＡドナーの認識及びスプライソソーム因子のリクルートが必要であることを示しているが、次に、ｅｓｎＲＮＡ ＢとＲＮＡドナー分子との逆相補性を低下させると、トランススプライシング効率も低下するかどうかを調べた。ｅｓｎＲＮＡ Ｂは、レポーターに対して相補的な１０ヌクレオチド配列を含有している。レポーターに対して相補的な９ヌクレオチド、４ヌクレオチド及び２ヌクレオチド配列を有するｅｓｎＲＮＡ Ｂの連続変異を作製した（図９Ｂ）。実際、逆相補性の程度を低下させると、トランススプライシング活性も同時に低下する（図９Ａ）。この結果は、トランススプライシング活性を高めるためには、ｅｓｎＲＮＡ分子とＲＮＡドナー分子との会合が必要であることを示している。
【0207】
図９Ａ～９Ｂに記載されるデータを収集するための実験を、３つの一過性トランスフェクト構成要素：レポータープラスミド、ＲＮＡドナー（プラスミドにもコードされ、ＣＭＶプロモーターによって駆動される）、及びｅｓｎＲＮＡ Ｂまたは様々な変異体（プラスミドにコードされ、ネイティブＵ１プロモーターによって駆動される）を用いて実施した。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを３７℃、５％ＣＯ２中に維持し、２４ウェルプレートの各ウェルに３００，０００細胞でプレーティングした。リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って用いて、細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした全プラスミドの１／５はレポーター、１／５はＲＮＡドナープラスミド、２／５はｅｓｎＲＮＡプラスミド、１／５はｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするトランスフェクション制御プラスミドであった。トランスフェクションから４８時間後、細胞を回収し、Ｓｏｎｙ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた蛍光活性化セルソーティングを使用して蛍光測定に供した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルが陽性であった細胞を特定し、次いで、この集団のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙシグナルの平均値を評価した。ＧＦＰシグナルをｍＣｈｅｒｒｙシグナルに対して正規化し、結果を図９Ａに報告した。図９Ａで使用したｅｓｎＲＮＡの完全な配列は、次のとおりである：ｅｓｎＲＮＡ Ｂ：ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ、ｅｓｎＲＮＡ ９ｂ：ＧＡＧＣＴＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ ｅｓｎＲＮＡ ４ｂ：ａａｇａａａＣＴＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ ｅｓｎＲＮＡ ２ｂ：ａａｇａａａａａＣＴｇｃａｇｇｇｇａｇａｔａｃｃａＴＧＡＴＣＡｃｇａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｃａａａｔｇｔｇｇｇａａａｃｔｃｇａｃｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｔｔｃａａａａｇｔａｇａｃｔｇｔａｃｇｃｔａａｇｇｇｔｃａｔａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔａａａｔｇｔｔａａｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃｇｇａａｔａｇｇａａｇｔａａｃａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｇａｇａａａａａｇｃｇａｇｃａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔａａｃａｃａａａｔｔａｇｃｔａｔｃｇｔｇａａｇｔｃｃｇｃｔｃａｇ。図９で使用したレポーターは、ＣＭＶプロモーター、ヒトＣＯＬ１７Ａ１遺伝子のエクソン８１、ヒトＣＯＬ１７Ａ１遺伝子のイントロン８１、及びａｃＧＦＰのＣ末端部分（１２７アミノ酸残基）を含む（５’→３’方向に）。配列は、上に示すとおりである。
【0208】
実施例２：特定の標的ＲＮＡの翻訳を増加させるためのｅｓｎＲＮＡ及びＲＮＡドナー分子の使用
ＲＮＡ内の特定の変異配列を非変異配列で置き換えることに加えて、標的ｍＲＮＡ分子に対する別の有用な操作は、ｍＲＮＡによって産生されるタンパク質を増加させることである。特定のｍＲＮＡからのタンパク質産生が不十分であるというこの問題に対処するために、多くの試みがなされてきたが、いずれのアプローチも大きな欠点がある。実際、終止コドンのリードスルーを促進することによって翻訳を増加させる低分子薬物は、非標的ｍＲＮＡのリードスルーを促進することから、広範なオフターゲットに悩まされる。更に、未成熟終止コドンは、タンパク質レベルが不足する多くの原因の１つにすぎない。未成熟終止コドンを遮断するように操作されたｔＲＮＡは、これと同じ根本的な問題に悩まされている（ＷＯ２０１８／１６１０３２Ａｌ）。対照的に、ＲＮＡトランススプライシングシステムは、任意の標的ｍＲＮＡ内の配列を翻訳増幅配列に置き換えて、タンパク質産生を増加させることができる。イントロントランススプライシング増強配列（トランススプライシングエンハンサー配列）によって媒介される効率的なＲＮＡトランススプライシングは、特定のｍＲＮＡからのタンパク質産生の標的増幅を促進する手段という、長年望まれているが満たされていないこのニーズに対処することができる。
ＲＮＡ内の特定の変異配列を非変異配列で置き換えることに加えて、標的ｍＲＮＡ分子に対する別の有用な操作は、ｍＲＮＡによって産生されるタンパク質を増加させることである。特定のｍＲＮＡからのタンパク質産生が不十分であるというこの問題に対処するために、多くの試みがなされてきたが、いずれのアプローチも大きな欠点がある。実際、終止コドンのリードスルーを促進することによって翻訳を増加させる低分子薬物は、非標的ｍＲＮＡのリードスルーを促進することから、広範なオフターゲットに悩まされる。更に、未成熟終止コドンは、タンパク質レベルが不足する多くの原因の１つにすぎない。未成熟終止コドンを遮断するように操作されたｔＲＮＡは、これと同じ根本的な問題に悩まされている（ＷＯ２０１８／１６１０３２Ａｌ）。対照的に、ＲＮＡトランススプライシングシステムは、任意の標的ｍＲＮＡ内の配列を翻訳増幅配列に置き換えて、タンパク質産生を増加させることができる。イントロントランススプライシング増強配列（トランススプライシングエンハンサー配列）によって媒介される効率的なＲＮＡトランススプライシングは、特定のｍＲＮＡからのタンパク質産生の標的増幅を促進する手段という、長年望まれているが満たされていないこのニーズに対処することができる。
【0209】
筋強直性ジストロフィーは、スプライシング因子ＭＢＮＬ１と結合する反復的な「ＣＵＧ」領域を持つＲＮＡによって引き起こされる。ＭＢＮＬ１のタイトレーションがその典型的な標的から外れることで、ＲＮＡ選択的スプライシングの機能不全が広範囲に起こり、患者におけるほとんどの疾患発現の原因となる。効率的なＲＮＡトランススプライシングアプローチによりＭＢＮＬ１タンパク質産生を増加させれば、選択的スプライシング制御におけるその典型的な活性を再構成するのに十分なＭＢＮＬ１タンパク質が産生され、この疾患に対処することができる。
【0210】
トランススプライシングエンハンサー配列を含有するＲＮＡトランススプライシングシステムが特定のｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる能力を評価するために、様々なシススプライシングエンハンサー配列及びウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を持つＲＮＡトランススプライシングシステムを作製した。ホタルルシフェラーゼをコードする配列と、ＭＢＮＬ１の最後の２エクソン及び介在するイントロンとを含有するレポーターを作製した。
【0211】
実験は、実施例１に記載されている方法を使用して、一過性にトランスフェクトしたレポーター、ＲＮＡドナー、及びｅｓｎＲＮＡまたはレンチウイルスにパッケージされたシステムのいずれかで実施した。いくつかの翻訳増強３’配列は、ＲＮＡドナーとｅｓｎＲＮＡの組み合わせによって生成されるＧＦＰレポーターの量を増加させた。結果を図１０に示す。
【0212】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されてきたが、そのような実施形態がほんの一例としてのみ提供されることは当業者には自明であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変更及び置換を想起するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】