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▶ ダンマールクス・テクニスケ・ウニヴェルシテートの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】ＣＯ２固定性好熱性細菌の増殖の増加
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240905BHJP
C12P 7/02 20060101ALI20240905BHJP
C12P 7/24 20060101ALI20240905BHJP
C12P 7/40 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N15/09 Z
C12P7/02
C12P7/24
C12P7/40
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514614
(86)(22)【出願日】2022-09-07
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2022074870
(87)【国際公開番号】W WO2023036823
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】21195239.5
(32)【優先日】2021-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522246588
【氏名又は名称】ダンマールクス・テクニスケ・ウニヴェルシテート
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＭＡＲＫＳ ＴＥＫＮＩＳＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ニールセン，アレックス トフトゴー
(72)【発明者】
【氏名】イェンセン，トアビョルン エルショイ
(72)【発明者】
【氏名】アクセルセン，アマリー メルトン
(72)【発明者】
【氏名】レードル，ステファニー
(72)【発明者】
【氏名】ブレンドム，セバスチャン スヴェン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC02
4B064AC03
4B064AC04
4B064AC31
4B064AD03
4B064AD04
4B064AD05
4B064AD06
4B064CA02
4B064CA19
4B064CB16
4B064CD01
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB02
4B065BD50
4B065CA54
4B065CA60
(57)【要約】
ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）種細菌の増殖を増加させる方法、かかる方法に由来する遺伝子改変された細菌、および適宜生化学物質の産生において、炭素含有基質を代謝するためのかかる細菌の使用が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）種に属する細菌の増殖速度を増加させる方法であって、該細菌においてステージ０胞子形成プロテインＡホモログ（Ｓｐｏ０Ａ）の発現および／または活性を低減または消失させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を該細菌に導入することを含む、方法。
【請求項2】
前記１つまたは複数の遺伝子改変が、前記細菌においてＳｐｏ０Ａタンパク質の発現を低減または消失させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｓｐｏ０Ａ遺伝子が欠失されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記細菌においてＳｉｎＲの変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を前記細菌に導入することをさらに含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含み、好ましくは、該アミノ酸が、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはＷであり、より好ましくは、該アミノ酸がＦであり、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ムーレラ属種に属する細菌の誘導期の持続時間を減少し、および／または増殖速度を増加させる方法であって、該細菌においてＨＴＨ型転写制御因子ＳｉｎＲ（ＳｉｎＲ）の変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を該細菌に導入することを含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にバリン（Ｖ）以外のアミノ酸を含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、方法。
【請求項6】
配列番号２における１９８位に相当する位置にある前記アミノ酸が、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
配列番号２における１９８位に相当する位置にある前記アミノ酸がＦである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ムーレラ属種が、（ａ）ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）；
（ｂ）ムーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）；
（ｃ）Ｍ．サーモアセチカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）株ＤＳＭ ５１２Ｔと比較して、少なくとも約９６．５％のＭＵＭｍｅｒアライメント（ＡＮＩｍ）スコアに基づく平均ヌクレオチド同一性を有する細菌株；
（ｄ）Ｍ．サーモアセチカ株ＤＳＭ ２９５５Ｔと比較して、少なくとも約９６．５％のＭＵＭｍｅｒアライメント（ＡＮＩｍ）スコアに基づく平均ヌクレオチド同一性を有する細菌株；ならびに
（ｅ）（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、または（ａ）から（ｄ）までの全ての組合せ
から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって得られたか、または得ることが可能な遺伝子改変された細菌。
【請求項10】
Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）種に属する細菌であって、該細菌が、該細菌においてＳｐｏ０Ａの発現および／または活性を低減または消失させるよう遺伝子改変されており、該低減された発現および／または活性が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌。
【請求項11】
Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ種に属する細菌であって、該細菌が、ＳｉｎＲの変異体をコードする導入遺伝子を含むよう遺伝子改変され、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、細菌。
【請求項12】
Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ種に属する細菌であって、前記細菌が、（ａ）配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含む、ＳｉｎＲの変異体を含み、ここで、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、該細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供し、
（ｂ）Ｓｐｏ０Ａの低減もしくは消失された発現および／または活性を有し、ここで、該低減された発現および／または活性が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌。
【請求項13】
前記ｓｐｏ０Ａ遺伝子が欠失されている、請求項１０または１２に記載の細菌。
【請求項14】
配列番号２における１９８位に相当する位置にある前記アミノ酸がＦである、請求項１１または１２に記載の細菌。
【請求項15】
適宜生化学物質の産生において、炭素含有基質を代謝するための請求項９から１４のいずれか一項に記載の細菌の使用。
【請求項16】
ｉ）炭素含有基質が、ＣＯおよび／またはＣＯ２であるか、ｉｉ）前記生化学物質が、Ｃ１～Ｃ４アルコール、Ｃ１～Ｃ４ケトン、Ｃ１～Ｃ４アルデヒド、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸、およびそれらの任意の混合物から選択されるか、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方である、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記細菌が、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３株またはＭ．サーモアセチカ３９０７３－ＨＨ株などのそれに由来する株である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法、請求項９から１４のいずれか一項に記載の細菌、あるいは請求項１５または１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＯ２の固定および生化学物質の産生のための好熱性細菌の利用、ならびに遺伝子改変によってかかる細菌の増殖を増加させ、ＣＯ２固定の効率の増加につながる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バルクケミカルは、数百万トンの規模で化石燃料の分解によって持続不可能に産生されている。同時に、人類は毎年４０ギガトンを超えるＣＯ２を大気に排出しており、気候変動および温度上昇の不穏な影響を招いている。産業上のＣＯ２排出を回収して、炭素を価値に変換するよう提案する技術が出現している。しかしながら、効率および実現可能性が、その実行を制限している。ＣＯ２回収のための伝統的な技術として、フィルター、植樹、または藻類の生育が挙げられる。フィルターは、ＣＯ２ガス中の不純物に対して感受性の高い高価な触媒を要する一方で、植樹および藻類の生育は、極めて低い土地面積効率を有する。
【0003】
これらの制限を満たすプロセスを開発するために、細菌、特に高温で機能する細菌の適用は、非常に重要であると予測される。高い培養温度は、不要な微生物による混入のリスクを低減させる。発酵は通常、大量の冷却水を要する。好熱性細菌を使用した発酵については、この要件は適用されない。全体として、好熱性発酵プロセスは、他のバイオベースの産生プロセスと比較した場合に大幅に低い資本支出および運用費用をもたらす特徴を有する。
【0004】
酢酸生成（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ）細菌は、ＣＯ２（またはＣＯ）を唯一の炭素供給源として増殖する細菌の一群である。酢酸生成細菌の増殖は、ＣＯ２の固定に直結している。生物の１つであるムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）は、産業的観点からＣＯ２を固定するのに興味深い特性を有する。ＣＯ２固定はこの生物では非常に効率的であるが、増殖速度は制限されている。より高い増殖速度を有する株は、ＣＯ２固定をより効率的にさせるのに非常に有益である。工業生産では、気体の供給における変動ならびにバイオリアクターにおける勾配がみられる。Ｍ．サーモアセチカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）は、栄養素または基質が制限されている場合に、死滅するか、または胞子形成することが知られている。このことは、不活性な継代をもたらし、全体的な効率を大幅に減少させる。より長い期間、またはよりストレスの多い条件下で生存可能であり、またより速く回復すること（栄養素または基質が利用可能となった場合に）が可能な細胞を開発することは、プロセスの効率に利益をもたらす。国際公開第２０１１／０１９７１７ Ａ１号（Ｍａｓｃｏｍａ Ｃｏｒｐ．）は、選択可能なマーカーをコードするベクター、および例えば、好熱性細菌宿主細胞におけるかかるマーカーによる、例えばｓｐｏ０Ａなどの標的遺伝子の置き換えにおけるそれらの使用に関する。国際公開第２０２０／１５７４８７ Ａ２号（ノッティンガム大学）は、胞子形成細胞における例えばＳｐｏ０Ａの遺伝子発現を制御するのに使用するための遺伝子コンストラクトに関する。
【0005】
ステージ０胞子形成プロテインＡホモログ（Ｓｐｏ０Ａ）は、細菌の胞子形成の調節に関与するタンパク質である。Ｓｐｏ０ＡはＤＮＡに結合し、多くの遺伝子の発現を制御する（Molle et al., Mol. Microbiol.; 50:1683-1701 2003）。Ｓｐｏ０Ａは、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を含む種々の属における胞子形成カスケードを活性化する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｓｐｏ０Ａ遺伝子の欠失は、胞子形成を防止すると報告されている（Spigelman et al., J. Bacteriol.; 172:5011-5019 1990）。
【0006】
ＨＴＨ型転写制御因子ＳｉｎＲ（ＳｉｎＲ）は、栄養枯渇に応答して栄養増殖の終わりに誘導される発達プロセスの負および正の制御因子の両方として機能することが報告されている。例えば、ＳｉｎＲは、Ｓｐｏ０Ａの抑制因子として作用する。ＳｉｎＲ四量体は、栄養増殖中にマトリックス遺伝子の転写抑制因子として作用する一方で、定常期中に、ＳｉｎＲ単量体は、ＳｉｎＩまたはＳｌｒＲのいずれかと複合体を形成する。ＳｉｎＩは抗抑制因子であり、ＳｉｎＲを隔離することができるのに対して、ＳｌｒＲ－ＳｉｎＲ複合体は、マトリックスオペロンの抑制を解放し、代わりに浮遊性（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ）増殖に必要とされる遺伝子を抑制する（Kearns et al., Mol. Microbiol.; 55:739-749 2005、Chai et al., Mol. Microbiol.; 74:876-887 2009、Chai et al., Genes Dev.; 24:754-765 2010）。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）種細菌の増殖が、ＳｉｎＲおよびＳｐｏ０Ａをコードする遺伝子の遺伝子改変によって増加され得ることを見出した。したがって、本発明は概して、ムーレラ属種細菌の増殖を増強し、それによりＣＯ２固定および生化学的産生のそれらの効率を増加させる方法に関する。
【0008】
したがって、第１の態様では、本発明は、ムーレラ属種に属する細菌の増殖速度を増加させる方法であって、該細菌においてステージ０胞子形成プロテインＡホモログ（Ｓｐｏ０Ａ）の発現および／または活性を低減または消失させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を該細菌に導入することを含む、方法に関する。
【0009】
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子改変は、細菌においてＳｐｏ０Ａタンパク質の発現を低減または消失させる遺伝子改変を含む。
【0010】
一部の実施形態では、ｓｐｏ０Ａ遺伝子は欠失されている。
【0011】
一部の実施形態では、当該方法は、細菌においてＳｉｎＲの変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を細菌に導入することをさらに含み、ここで、ＳｉｎＲ変異体は、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含み、好ましくはここで、上記アミノ酸は、Ｆ、Ｉ、Ｙ、またはＷであり、より好ましくはここで、上記アミノ酸はＦであり、ここで、ＳｉｎＲ変異体は、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する。
【0012】
第２の態様では、本発明は、ムーレラ属種に属する細菌の誘導期の持続時間を減少し、および／または増殖速度を増加させる方法であって、該細菌においてＨＴＨ型転写制御因子（ＳｉｎＲ）の変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を該細菌に導入することを含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にバリン（Ｖ）以外のアミノ酸を含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、方法に関する。
【0013】
一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）である。
【0014】
一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＦである。第１および第２の態様の一部の実施形態では、ムーレラ属種は、（ａ）ムーレラ・サーモアセチカ；（ｂ）ムーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）；（ｃ）Ｍ．サーモアセチカ株ＤＳＭ ５１２Ｔと比較して、少なくとも約９６．５％のＭＵＭｍｅｒアライメント（ＡＮＩｍ）スコアに基づく平均ヌクレオチド同一性を有する細菌株；（ｄ）Ｍ．サーモアセチカ株ＤＳＭ ２９５５と比較して、少なくとも約９６．５％のＭＵＭｍｅｒアライメント（ＡＮＩｍ）スコアに基づく平均ヌクレオチド同一性を有する細菌株；ならびに（ｅ）（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、または（ａ）から（ｄ）までの全ての組合せから選択される。
【0015】
第３の態様では、本発明は、第１または第２の態様の実施形態による方法によって得られたか、または得ることが可能な遺伝子改変された細菌に関する。
【0016】
第４の態様では、本発明は、Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）種に属する細菌であって、該細菌が、該細菌においてＳｐｏ０Ａの発現および／または活性を低減または消失させるよう遺伝子改変され、低減された該発現および／または活性が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌に関する。
【0017】
第５の態様では、本発明は、Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ種に属する細菌であって、該細菌が、ＳｉｎＲの変異体をコードする導入遺伝子を含むよう遺伝子改変され、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含み、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、細菌に関する。細菌は、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３株またはＭ．サーモアセチカ３９０７３－ＨＨ株などのそれに由来する株であってもよい。
【0018】
第６の態様では、本発明は、Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ種に属する細菌であって、前記細菌が、
（ａ）配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含む、ＳｉｎＲの変異体を含み、ここで、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供し、
（ｂ）Ｓｐｏ０Ａの低減もしくは消失された発現および／または活性を有し、ここで、該低減された発現および／または活性が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌に関する。
（ａ）配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含む、ＳｉｎＲの変異体を含み、ここで、該ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、前記細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供し、
（ｂ）Ｓｐｏ０Ａの低減もしくは消失された発現および／または活性を有し、ここで、該低減された発現および／または活性が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌に関する。
【0019】
第４および第６の態様の一部の実施形態では、ｓｐｏ０Ａ遺伝子は欠失されている。
【0020】
第５および第６の態様の一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＦである。
【0021】
第７の態様では、本発明は、適宜生化学物質の産生において、炭素含有基質を代謝するための態様３～６のいずれか１つに記載の細菌の使用に関する。
【0022】
一部の実施形態では、
ｉ）炭素含有基質は、ＣＯおよび／またはＣＯ２であるか、
ｉｉ）生化学物質は、Ｃ１～Ｃ４アルコール、Ｃ１～Ｃ４ケトン、Ｃ１～Ｃ４アルデヒド、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸、およびそれらの任意の混合物から選択されるか、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方である。
ｉ）炭素含有基質は、ＣＯおよび／またはＣＯ２であるか、
ｉｉ）生化学物質は、Ｃ１～Ｃ４アルコール、Ｃ１～Ｃ４ケトン、Ｃ１～Ｃ４アルデヒド、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸、およびそれらの任意の混合物から選択されるか、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方である。
【0023】
第１から第７の態様の一部の実施形態では、細菌は、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３株またはＭ．サーモアセチカ３９０７３－ＨＨ株などのそれに由来する株である。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図3】図３：時間（ｈ）での時間の関数としてのＷＴ株およびΔｓｐｏ０Ａ株の増殖曲線を示す。Ａ；三重反復培養の個々の測定を示す。Ｂ；平均増殖曲線、明色のパターンは標準偏差を示す。Ｃ；Ｂと同じであるが、対数スケールでの光学密度を示す。
【図4】図４：桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ複合体の構造解析を示す。Ａ；桿菌由来のＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ複合体（ＰＤＢ ＩＤ：１ｂ０ｎ）。ＳｉｎＲ由来のＨＴＨドメインは、いかなるパターンも用いずに示され、オリゴマー形成ドメインは円を用いたパターンで、ＳｉｎＩは五量体を用いたパターンで示されている。Ｂ；パターンスキームはＡと同様であり、Ｔ６０およびＬ６１の側鎖は、小さな黒三角形のパターンを有する棒状の表示で示されている。Ｃ；Ｌ６１の拡大、およびＬからＦへの突然変異の可視化。フェニルアラニンの提唱されている構造は、灰色の棒状の表示で示されている。目に見える円盤およびパターンは、原子ファンデルワールス半径の対での重複を示している。短い線または小さな円盤は、原子がほぼ接触しているかまたはわずかに重複している場合に示されている。十字を有する大きな円盤は、かなりのファンデルワールス重複を示している。他の全てが、それらの両端間に存在する。Ｄ；Ｔ６０の拡大、およびＴからＦへの突然変異の可視化。左：ＳｉｎＲにおけるＴ６０と、ＳｉｎＩにおけるＥ１４との間の水素結合。中央：最も一般的な回転異性体におけるフェニルアラニンを伴う、ＴからＦへの突然変異。右：最も好適な回転異性体におけるフェニルアラニンを伴う、ＴからＦへの突然変異。円盤およびパターンはＣで示されている通りである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
定義
本明細書で用いる場合、「ムーレラ属種」という用語は、細菌ムーレラ属に属し、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に属するものとして分類される種の群の任意の成員を指す。ムーレラ属種は通常、好熱性であり、嫌気性であり、内生胞子形成性であり、例えば、温泉から単離され得る。ムーレラ属種の非限定的なリストは、アメリカ国立生物工学情報センター（ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）アドレスncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=44260；２０２１年７月１日にアクセス、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および本明細書中の他の箇所に見出され得る。
本明細書で用いる場合、「ムーレラ属種」という用語は、細菌ムーレラ属に属し、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に属するものとして分類される種の群の任意の成員を指す。ムーレラ属種は通常、好熱性であり、嫌気性であり、内生胞子形成性であり、例えば、温泉から単離され得る。ムーレラ属種の非限定的なリストは、アメリカ国立生物工学情報センター（ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）アドレスncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=44260；２０２１年７月１日にアクセス、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および本明細書中の他の箇所に見出され得る。
【0026】
これまではクロストリジウム・サーモアセチカ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）として知られていた種である酢酸生成（気体発酵）種ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍ．サーモアセチカ）、およびムーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍ．サーモオートトロフィカ）ならびに研究室環境において単離された株または天然供給源から単離された株を含む、それらに由来する全ての株が特に好ましい。Ｍ．サーモアセチカおよびＭ．サーモオートトロフィカは多くの場合、２つの異なる種とみなされるが、ゲノム比較により、Ｍ．サーモオートトロフィカ株は、Ｍ．サーモアセチカの株として再分類され得ることが示されている（Redl et al., Front. Microbiol.; 10:3070 2020）。したがって、本明細書において使用される場合、Ｍ．サーモアセチカは、一般にＭ．サーモアセチカとして分類される細菌の株およびＭ．サーモオートトロフィカの株などの遺伝子解析によってＭ．サーモアセチカ株として分類され得る細菌の株の両方を指し得る。細菌株がＭ．サーモアセチカ種に属するかどうかを決定する方法は、以下に記載される。Ｍ．サーモアセチカ株の非限定的な例として、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３－ＨＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３１０５４、好ましくはバージョンＣＰ０３１０５４．１）、およびＭ．サーモアセチカＹ７２が挙げられる。本明細書において使用される場合、「野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ」は、Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカの任意の天然に発生する株を指す。例えば、通常、野生型Ｍ．サーモアセチカのゲノムは、ｓｐｏ０Ａ遺伝子、ＳｉｎＲタンパク質をコードする遺伝子（好ましくは、配列番号２における１９８に相当するアミノ酸位置にバリンを有する）、またはその両方を含む。
【0027】
本明細書において使用される場合、「ＳｉｎＲ」または「ＨＴＨ型転写制御因子ＳｉｎＲ」という用語は、ムーレラ属種細菌によってコードされる変異体に限定されずに、ＳｉｎＲの全ての変異体を含む。ムーレラ・サーモアセチカによってコードされるＳｉｎＲの変異体の例は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ０Ａ５Ｂ７ＹＰＲ１（配列番号２）のタンパク質である。表１を参照のこと。本明細書において使用される場合、「ＳｉｎＲ」という用語は、配列番号２に対して少なくとも８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９１％、例えば９２％、例えば９３％、例えば９４％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、および例えば９９％配列同一性を有するタンパク質を指す。好ましくは、本明細書において記載される方法による任意の遺伝子改変に先立って、改変されるべきムーレラ属種の細胞は自然ＳｉｎＲタンパク質を含み、そのタンパク質は好ましくは、配列番号２における１９８位に相当するアミノ酸位置においてバリンを含む。好ましくは、Ｍ．サーモアセチカのＳｉｎＲは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＮＡ）遺伝子座タグＭｏｔｈＨＨ＿０１７５３（配列番号１）を有する遺伝子によってコードされる。表１を参照のこと。
【0028】
本明細書において使用される場合、「Ｓｐｏ０Ａ」または「ステージ０胞子形成プロテインＡホモログ」という用語は、関連するムーレラ属種の内因性タンパク質を指す。Ｓｐｏ０Ａの例は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ０Ａ５Ｂ７ＹＰＧ０（配列番号４）を有するＭ．サーモアセチカＳｐｏ０Ａである。表１を参照されたい。Ｓｐｏ０Ａの別の例は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ０Ａ１Ｄ７ＸＢＥ２を有するＭ．サーモアセチカＳｐｏ０Ａである。本明細書において使用される場合、「Ｓｐｏ０Ａ」という用語は、配列番号４に対して少なくとも８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９１％、例えば９２％、例えば９３％、例えば９４％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、および９９％配列同一性を有するタンパク質を指す。好ましくは、Ｍ．サーモアセチカのＳｐｏ０Ａは、ＥＮＡ遺伝子座タグＭｏｔｈＨＨ＿０１６１７（配列番号３）を有する遺伝子によってコードされる。表１を参照のこと。
【0029】
「遺伝子」という用語は、タンパク質などの細胞機能をコードする核酸配列を指し、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびコード配列に続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「導入遺伝子」は、遺伝子操作技法によって、例えば形質転換によって細胞に導入された、自然または異種の遺伝子である。遺伝子名称は、本明細書において小文字の最初の文字を用いたイタリック体のテキストで記載される（例えば、ｓｐｏ０Ａ）のに対して、タンパク質名称は、大文字の最初の文字を用いた通常のテキストで記載される（例えば、Ｓｐｏ０Ａ）。
【0030】
【表1】
【0031】
本明細書において使用される場合、「遺伝子改変」は、宿主細胞ゲノムへの遺伝的に受け継がれた変化の導入を指す。変化の例として、遺伝子および制御配列における突然変異、コードおよび非コードＤＮＡ配列における突然変異が挙げられる。「突然変異」は、ゲノム中の核酸または核酸断片の欠失、置換および挿入を含む。
【0032】
親または参照タンパク質の「変異体」は、親または参照タンパク質と比較した場合に、アミノ酸置換、挿入および欠失などの１つまたは複数の突然変異を含む。通常、変異体は、例えば、少なくとも機能的にまたは触媒的に活性な部分にわたって、適宜全長にわたって少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９３％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％の、親または参照タンパク質のアミノ酸配列に対して高い配列同一性を有する。
【0033】
別記されない限り、「配列同一性」は、本明細書においてアミノ酸配列に関して使用される場合、下記式：（Ｎｒｅｆ－Ｎｄｉｆ）・１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｒｅｆは、２つの配列のうちの一方における残基の数であり、Ｎｄｉｆは、それらがそれらの全長にわたって、かつ同じ方向にアラインされている場合の２つの配列において同一でない残基の数である）に従って、等しい長さの２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定される。したがって、アミノ酸配列ＧＳＴＤＹＴＱＮＷＡ（配列番号１９）は、配列ＧＳＴＧＹＴＱＡＷＡ（配列番号２０；ｎｄｉｆ＝２およびｎｒｅｆ＝１０）と８０％の配列同一性を有する。
【0034】
配列同一性は、従来の方法、例えば、Smith and Waterman(Adv. Appl. Math.; 2:482 1981)によって、Pearson and Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 85:2444 1988)の「類似性に関する検索」法によって、Thompson et al.(Nucleic Acids Res.; 22:467380 1994)のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Rice et al., Trends Genet.; 16:276-277 2000）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.; 48:443-453 1970）のコンピュータ化された実装によって、例えばＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（www.ebi.ac.uk）で提供されるように決定することができる。そのソフトウェアがアメリカ国立生物工学情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて得られ得るＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., Mol. Biol.; 215:403-410 1990）もまた使用され得る。上述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、「ウィンドウ」の長さ、ギャップペナルティなどに関するデフォルトパラメーターが使用され得る。
【0035】
参照アミノ酸配列における特定参照残基「に相当する」１つのアミノ酸配列における残基は、例えば、前項に記載される配列アライメントソフトウェアの使用によって決定される場合、参照残基とアラインする残基である。
【0036】
「発現」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子がｍＲＮＡに転写されるプロセスを指し、ｍＲＮＡの、アミノ酸配列、即ちタンパク質またはポリペプチドへの続く翻訳を含んでもよい。
【0037】
本明細書において使用される場合、宿主細胞における遺伝子の「発現の低減」は、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが、対照と比較した場合に、宿主細胞において大幅に、通常少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％低減されることを意味する。通常、発現の低減が宿主細胞における遺伝子改変によって得られる場合、対照は、改変されていない宿主細胞である。
【0038】
宿主細胞における遺伝子の「発現の消失」とは、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質が宿主細胞において本質的に存在しないか、存在しないか、または検出不可能であることを意味する。
【0039】
「ノックダウン」という用語は、本明細書において使用される場合、プロモーターにおける突然変異の導入などの、宿主細胞における遺伝子の発現の低減をもたらす様々な技法のいずれかを指す。
【0040】
「ノックアウト」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子における突然変異の導入、または遺伝子の欠失などの、宿主細胞における遺伝子の発現の消失をもたらす様々な技法のいずれかを指す。「欠失」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子のコード配列の部分的または完全な除去を指し、それは、その遺伝子の発現の消失、または非機能的な遺伝子産物の発現のいずれかをもたらす。
【0041】
「活性」または「機能」という用語は、本明細書において使用される場合、またタンパク質の活性または機能に言及する場合、それ以上何も指定されていない場合には、そのタンパク質の任意の活性または機能、例えば、触媒活性、結合活性、抑制因子活性などを意味し得る。
【0042】
本明細書において使用される場合、宿主細胞におけるタンパク質の「活性の低減」は、そのタンパク質の１つまたは複数の比活性が、対照と比較した場合に、宿主細胞において大幅に、通常少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％低減されることを意味する。通常、活性の低減が宿主細胞における遺伝子改変によって得られる場合、対照は、改変されていない宿主細胞である。宿主細胞におけるタンパク質の「活性の消失」とは、そのタンパク質の１つまたは複数の比活性が宿主細胞において本質的に存在しないか、存在しないか、または検出不可能であることを意味する。
【0043】
標的タンパク質の活性の低減または消失をもたらす遺伝子改変は、非機能的もしくは機能性の低いタンパク質の発現をもたらす、そのタンパク質のコード配列における突然変異または欠失を含み得る。さらに、標的遺伝子の発現および／または活性の低減または消失をもたらす遺伝子改変は、本明細書において使用される場合、間接的であってもよく、それらが遺伝子自体における遺伝子改変ではないことを意味する。かかる遺伝子改変は、例えば、標的遺伝子の発現を低減させる核酸配列、例えば、標的遺伝子の発現を阻害する抑制因子の導入を含み得る。
【0044】
本発明の実施形態を実施するのに有用な標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.(2012). Molecular cloning: A laboratory manual, 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New Yorkによって、およびSilhavy, T. J., Bennan, M.L., and Enquist, L.W.(1984). Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New Yorkによって記載されている。細菌ゲノムにおける標的遺伝子のノックアウトなどの標的ゲノム編集に関する技法として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ベースの系が挙げられる。
【0045】
細菌の「増殖速度」は、本明細書において使用される場合、単位時間あたりの細胞分裂数を反映する尺度である。増殖速度は、６００ｎｍでの細菌培養物の光学密度（ＯＤ）測定に基づいて算出することができ、ここで増殖速度は、単位時間あたり、例えば１時間あたりのＯＤにおける変化として表すことができる。
【0046】
本明細書において使用される場合、「誘導期」という用語は、細菌の誘導期に言及する場合、細菌増殖の４つの期：誘導期、対数期、定常期、および死滅期のうちの最初の期を意味する。誘導期は、細菌が複製を開始する（対数期に入る）前に、通常、新しい外部条件に適応する期である。新しい外部条件の非限定的な例として、新たな培地への接種、および既存の培養物への栄養素、例えば炭素供給源の添加が挙げられる。誘導期の間、細胞分裂は通常、低いか、または存在しない。
【0047】
本明細書において使用される場合、「代謝」は、適宜１つまたは複数の酵素によって触媒される、１つまたは複数の代謝プロセスにおける基質の消費を意味する。
【0048】
「基質」という用語は、本明細書において使用される場合、酵素が産物を形成するよう作用して、そのプロセスにおいて基質を変換する分子を指す。生合成経路に関連して使用される場合、「基質」という用語は、参照される経路の最初の酵素が作用する分子（複数可）を指す。「炭素含有基質」は、ＣＯまたはＣＯ２などの少なくとも１つの炭素原子を含有する基質である。
【0049】
本明細書において使用される場合、「生化学物質」は、生物学的プロセスによって産生することができる分子を意味する。本発明の状況において、ムーレラ属種細菌は、目的の生化学物質を産生するのに適した特定酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子の挿入などの、それらの天然の内因性酵素の作用によって、または遺伝子改変後に、生化学物質を産生するのに使用することができる。
【0050】
本発明の特定実施形態
実施例１に記載されるように、Ｍ．サーモアセチカの増殖速度は、Ｓｐｏ０Ａをコードする遺伝子の欠失によって増加された（実施例１；図３および表３）。
実施例１に記載されるように、Ｍ．サーモアセチカの増殖速度は、Ｓｐｏ０Ａをコードする遺伝子の欠失によって増加された（実施例１；図３および表３）。
【0051】
細胞の増殖速度を制御するための遺伝子発現の調節は、複雑であり、かつ繊細に調整されており、通常多くの遺伝子／タンパク質が関与している。しかしながら、ここでは、単一遺伝子、Ｓｐｏ０Ａをコードする遺伝子の欠失により、Ｍ．サーモアセチカの増殖速度が増加された。さらに、当該遺伝子は、それをありふれたプロモーターの制御下で抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子で置き換えることによって欠失させた。かかる変更は通常、改変された生物の増殖を遅らせるが、この場合、逆の効果が見られた。さらに、これまでの報告（背景技術を参照）において示されていることに反して、Ｍ．サーモアセチカにおいて、ｓｐｏ０Ａの欠失は、胞子形成の減少をもたらさなかった。この見解により、Ｍ．サーモアセチカにおけるｓｐｏ０Ａの欠失時に観察された成長速度の増加は、カスケードがまだ機能的であったため、胞子形成カスケードに関連した代謝負荷の低減に起因するものではなかったことが示唆される。
【0052】
実施例２において記載されるように、ＳｉｎＲにおけるＶ１９８Ｆ突然変異は、より長いインキュベーション期間後、新鮮な培地への接種時にＭ．サーモアセチカの誘導期の持続時間を減少させた（それが静止状態からより迅速な回復を導いた）（実施例２）。さらに、Ｍ．サーモアセチカＳｉｎＲにおけるＶ１９８ＦなどのＶ１９８突然変異は、タンパク質の安定性、抗抑制因子ＳｉｎＩに対するその親和性および／またはオリゴマー形成するその能力に影響を及ぼし得ることが見出された（実施例２、図４ならびに表４および表５を参照）。
【0053】
したがって、本発明者らは、Ｍ．サーモアセチカ細菌の成長を増強する（増殖速度を増加させること、および／または誘導期の持続時間を減少させることによる）方法を特定した。Ｍ．サーモアセチカにおいて、増殖と、ＣＯ２の固定との間に直接的な関連がみられる。本発明は、増殖が増強された株を提供し、それにより、ＣＯ２の固定が増強された株を提供する。さらに、これらの株は、目的の生化学物質の産生のための１つまたは複数の酵素を含有するよう改変されてもよく、それにより、かかる生化学物質の産生の増加をもたらす。
【0054】
ＣＯ２固定および生化学物質産生の増加に加えて、これらの目的で本発明による方法を使用する利点は、下記を含む：
【0055】
－ Ｍ．サーモアセチカの高い培養温度は、背景技術の項目でも記載したように、混入リスクの低減、より高い変換速度、冷却水の不要、および他のバイオベースの産生プロセスと比較した場合に大幅に低い資本支出および運用費用を含むいくつかの利点を有する。
【0056】
－ ストレスの多い状況に陥った後により早く回復することが可能な細胞は、これがバイオリアクターにおけるより大きな度合いの変動および勾配（栄養素、ｐＨ、および基質）を可能にするため、バイオリアクターにおける使用に非常に好適である。
【0057】
－ 一部の実施形態では、遺伝子またはオペロンは過剰発現される必要がなく、それは代謝負荷の増加を表している。これらの操作された株は、発酵全体にわたって高い代謝活性を維持する。
【0058】
方法
一部の態様では、本発明は、遺伝子改変を細菌に導入して、Ｓｐｏ０Ａの発現および／または活性に影響を及ぼすか、あるいはＳｉｎＲの突然変異体を発現させることによって、ムーレラ属種細菌の増殖を増強する方法に関する。
一部の態様では、本発明は、遺伝子改変を細菌に導入して、Ｓｐｏ０Ａの発現および／または活性に影響を及ぼすか、あるいはＳｉｎＲの突然変異体を発現させることによって、ムーレラ属種細菌の増殖を増強する方法に関する。
【0059】
ムーレラ属種細菌の増殖は、細菌の増殖速度（単位時間あたりの細胞分裂数）を増加させることによって、または誘導期の持続時間（細菌が新しい外部条件に適応した後、細菌が複製を開始するまでにかかる時間）を減少させることによって、またはその両方の組合せによって増強され得る。増殖を増強する方法はともに、ＣＯ２の固定、および適宜目的の生化学物質の産生を増加させる。
【0060】
細菌増殖測定
細菌増殖は、実施例において使用されるように、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の測定を含む標準的な技法によって容易に測定される。連続測定を使用して、グラフを作成することができ、そこから誘導期の持続時間および増殖速度を決定することができる。誘導期の持続時間を決定するために、細菌培養物のＯＤ（細胞数の尺度として）は、細胞が指数関数的増殖期（対数期）に入るまで、例えば新たな培地に接種されることによって、細胞が新たな外部条件に曝露された時点から追跡されるべきである。増殖速度の算出については、グラフを対数スケールで示している（図１を参照）。増殖速度（μ）は、グラフの直線部分（指数関数期または対数期）から導かれた２つのデータ点：時点１におけるＯＤ値（ｔ１、ＯＤ１）および時点２におけるＯＤ値（ｔ２、ＯＤ２）（ここで、ｔ２＞ｔ１）から算出することができる。続いて、増殖速度は、式Ｉに従って算出され得る：
細菌増殖は、実施例において使用されるように、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の測定を含む標準的な技法によって容易に測定される。連続測定を使用して、グラフを作成することができ、そこから誘導期の持続時間および増殖速度を決定することができる。誘導期の持続時間を決定するために、細菌培養物のＯＤ（細胞数の尺度として）は、細胞が指数関数的増殖期（対数期）に入るまで、例えば新たな培地に接種されることによって、細胞が新たな外部条件に曝露された時点から追跡されるべきである。増殖速度の算出については、グラフを対数スケールで示している（図１を参照）。増殖速度（μ）は、グラフの直線部分（指数関数期または対数期）から導かれた２つのデータ点：時点１におけるＯＤ値（ｔ１、ＯＤ１）および時点２におけるＯＤ値（ｔ２、ＯＤ２）（ここで、ｔ２＞ｔ１）から算出することができる。続いて、増殖速度は、式Ｉに従って算出され得る：
【0061】
【数1】
【0062】
遺伝子改変
Ｓｐｏ０Ａ：
１つの態様では、本発明は、ムーレラ属種に属する細菌の増殖速度を増加させる方法であって、細菌においてステージ０胞子形成プロテインＡホモログ（Ｓｐｏ０Ａ）の発現および／または活性を低減または消失させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を細菌に導入することを含む、方法に関する。
Ｓｐｏ０Ａ：
１つの態様では、本発明は、ムーレラ属種に属する細菌の増殖速度を増加させる方法であって、細菌においてステージ０胞子形成プロテインＡホモログ（Ｓｐｏ０Ａ）の発現および／または活性を低減または消失させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を細菌に導入することを含む、方法に関する。
【0063】
かかる細菌におけるＳｐｏ０Ａの発現および活性は、標準的な技法を使用して当業者によって決定され得る。Ｓｐｏ０Ａ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの決定について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）およびウェスタンブロットなどの技法が使用され得る。細菌におけるＳｐｏ０Ａの活性を定量化するために、まずどの活性が定量化されるべきかを決定する必要がある。胞子形成の制御因子として、Ｓｐｏ０ＡはＤＮＡに結合し、多くの遺伝子の発現を制御する（Molle et al., Mol. Microbiol.; 50:1683-1701 2003）。したがって、Ｓｐｏ０Ａの活性は、例えば遺伝子マイクロアレイによって、または既知のＳｐｏ０Ａ結合モチーフを含有するレポーター遺伝子系を使用して、ａｂｒＢ、ｓｐｏＩＩＡ、ｓｐｏＩＩＧ、およびｓｐｏＩＩＥなどの遺伝子を含む遺伝子の選択の発現を評価することによって検査することができる。
【0064】
一部の実施形態では、かかる細菌におけるＳｐｏ０Ａの発現は、例えば、遺伝子改変の導入に先立つ細菌におけるｓｐｏ０Ａの発現レベル、参照細菌細胞における発現レベル、または例えば、教科書もしくは文献からの対照値などの対照と比較して低減される。さらなる実施形態において、Ｓｐｏ０Ａの発現は、細菌において少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％低減される。Ｓｐｏ０Ａの発現は例えば、ｓｐｏ０Ａ遺伝子のノックダウンによって、例えば、そのプロモーターにおいて、またはリボソーム結合部位などの翻訳開始領域において突然変異を導入することによって、触媒的に不活性なＣａｓ酵素を使用したＣＲＩＳＰＲ技法であるＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を使用することによって、細菌細胞を遺伝子の転写または翻訳を妨害するアンチセンス配列と接触させることによって、あるいはｓｐｏ０Ａの転写を活性化する転写因子をコードする遺伝子を欠失すること、またはｓｐｏ０Ａの転写を阻害する抑制因子をコードする核酸配列を導入することによって低減され得る。
【0065】
一部の実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの発現は消失される。それは、Ｓｐｏ０Ａ ｍＲＮＡ、Ｓｐｏ０Ａタンパク質、またはその両方が、細菌において本質的に存在しないか、存在しないか、または検出不可能であることを意味する。Ｓｐｏ０Ａの発現は例えば、ｓｐｏ０Ａ遺伝子のノックアウトによって、例えば、遺伝子を突然変異させることによって、例えば未成熟終止コドンをコード配列に導入することによって、または遺伝子を欠失させること（これは、本明細書において使用される場合、遺伝子のコード配列の部分的または完全な除去のいずれかを意味し得る）によって消失され得る。一部の実施形態では、ｓｐｏ０Ａは、ラムダレッド媒介組換え、Ｐ１ファージ形質導入、一本鎖オリゴヌクレオチドリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）／ＭＡＧＥ技術（例えば、Datsenko and Wanner, 2000; Thomason et al., 2007; Wang et al., 2009を参照）およびＣＲＩＳＰＲベースの技術などの技術を用いてノックアウトされ得る。一部の実施形態では、ｓｐｏ０Ａは、実施例１において記載されるように、細菌をノックアウトベクターで形質転換することと、相同組換えを使用して、染色体において遺伝子を置き換えることとによってノックアウトされ得る。一部の実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの発現は、遺伝子のプロモーターを突然変異させることまたは欠失させることによって消失されてもよい。一部の実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの発現は、ＣＲＩＳＰＲの触媒的に不活性な変異体を使用して、または例えばＳｐｏ０Ａの発現もしくは翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡを発現させることによって消失され得る。Ｓｐｏ０Ａタンパク質およびそれらをコードする遺伝子、特にムーレラ属種の例が、本明細書において提供される。本明細書において具体的に開示される各ムーレラ属種を含む他のムーレラ属種におけるＳｐｏ０Ａタンパク質をコードする内因性遺伝子は、例えば遺伝子相同性に基づいて、当該技術分野において既知の方法を使用して同定され得る。
【0066】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えば、Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet.; 168:111-115 1979を参照）、コンピテント細胞（例えば、Young and Spizizen, J. Bacteriol.; 81:823-829 1961またはDubnau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol.; 56:209-221 1971を参照）、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower, Biotechniques; 6:742-751 1988を参照）、またはコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thome, J. Bacteriol.; 169:5771-5278 1987を参照）を使用して達成され得る。
【0067】
一部の実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの活性は低減される。さらなる実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの活性は、細菌において少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％低減される。一部の実施形態では、Ｓｐｏ０Ａの活性は消失される。それは、Ｓｐｏ０Ａの１つまたは複数の比活性が、細菌において本質的に存在しないか、存在しないか、または検出不可能であることを意味する。Ｓｐｏ０Ａの活性は例えば、非機能的または機能性の低いタンパク質の発現をもたらす、ｓｐｏ０Ａのコード配列における突然変異または欠失を導入することによって低減または消失され得る。
【0068】
ＳｉｎＲ：
１つの態様では、本発明はムーレラ属種に属する細菌の誘導期の持続時間を減少し、および／または増殖速度を増加させる方法であって、細菌においてＨＴＨ型転写制御因子ＳｉｎＲ（ＳｉｎＲ）の変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を細菌に導入することを含み、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にバリン（Ｖ）以外のアミノ酸を含み、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合、細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、方法に関する。
１つの態様では、本発明はムーレラ属種に属する細菌の誘導期の持続時間を減少し、および／または増殖速度を増加させる方法であって、細菌においてＨＴＨ型転写制御因子ＳｉｎＲ（ＳｉｎＲ）の変異体を発現させるよう１つまたは複数の遺伝子改変を細菌に導入することを含み、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にバリン（Ｖ）以外のアミノ酸を含み、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合、細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供する、方法に関する。
【0069】
一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＩである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＭである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＶである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＹである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＣである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＷである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＴである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＡである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＰである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＲである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＥである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＨである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＫである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＮである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＱである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＤである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＧである。一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＳである。
【0070】
好ましい実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＦである。
【0071】
一部の実施形態では、ＳｉｎＲ変異体は、配列番号２と少なくとも９１％配列同一性、例えば９２％、例えば９３％、例えば９４％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、および例えば９９％配列同一性を有する。
【0072】
一部の実施形態では、ＳｉｎＲ変異体をコードするベクターは、適宜本明細書中の他の箇所に記載される技術を使用して、形質転換によって細菌細胞に導入される。導入されると、ＳｉｎＲ変異体をコードする遺伝子は、染色体組込み体として、または自己複製性染色体外ベクター上に維持され得る。
【0073】
適宜、内因性ｓｉｎＲ遺伝子は、例えば、当該技術分野において既知の方法に従って、または本明細書中の他の箇所に記載される方法によってノックアウトされ得る。
【0074】
適宜、内因性ｓｉｎＲ遺伝子は、改変されていないままでもよい。好ましくは、内在性ｓｉｎＲ遺伝子は、配列番号２における１９８位に相当するアミノ酸位置にバリンを有する。
【0075】
好ましくは、細菌宿主細胞の形質転換のために、ＳｉｎＲ変異体の発現を制御するのに適切なプロモーターが選択される。プロモーターは、細菌宿主細胞にとって自然または異種であってもよく、即ち、それぞれ、プロモーターは、宿主細胞と同じ種に由来してもよく、またはプロモーターは、宿主細胞とは異なる種に由来してもよい。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであり得る。構成的プロモーターは連続的なタンパク質発現を可能にするのに対して、誘導性プロモーターは、条件付きタンパク質発現を可能にする。誘導性プロモーターを使用して、タンパク質発現は、特定分子の存在、光の存在もしくは非存在、または特定温度を条件とし得る。ムーレラ属種におけるタンパク質発現を制御するのに使用することができるプロモーターとして、Ｍ．サーモアセチカに由来し、通常グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの発現を制御する構成的プロモーターＰＧ３ＰＤが挙げられる。他の適切なプロモーターは、既知であるか、または周知の技法を使用して当業者によって同定され得る。
【0076】
一部の実施形態では、配列番号２における１９８位に相当する位置にバリン（Ｖ）以外のアミノ酸を含むＳｉｎＲ変異体は、部位特異的突然変異誘発により１つまたは複数の突然変異を細菌染色体上のＳｉｎＲをコードする遺伝子に導入することによって生成され得る。これは、例えば相同組換えベースの技法を使用することによって達成され得る。
【0077】
形質転換は、当該技術分野において周知の方法を使用して確認することができる。かかる方法として、例えば、全ゲノム配列決定、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡのノーザンブロットまたはＰＣＲ増幅、遺伝子産物の発現のためのイムノブロッティング、あるいは導入された核酸配列の存在または発現を検査するための他の適切な解析方法が挙げられる。発現レベルは、当該技術分野において周知の方法を使用して十分な発現を得るようさらに最適化することができる。
【0078】
Ｓｐｏ０Ａ＋ＳｉｎＲ：
本発明の一部の態様では、Ｓｐｏ０Ａに関する遺伝子改変、およびその改変が上述されているＳｉｎＲに関する遺伝子改変は、同じ細胞内で組み合わされる。したがって、本発明によるムーレラ属種細菌は、例えば、本明細書において記載されるようなＳｉｎＲ変異体を含んでもよく、また欠失に起因したｓｐｏ０Ａ遺伝子を欠如してもよい。本明細書において記載されるような様々な遺伝子改変に関するありとあらゆる態様および実施形態は、ありとあらゆる考え得る組合せで組み合わされてもよい。
本発明の一部の態様では、Ｓｐｏ０Ａに関する遺伝子改変、およびその改変が上述されているＳｉｎＲに関する遺伝子改変は、同じ細胞内で組み合わされる。したがって、本発明によるムーレラ属種細菌は、例えば、本明細書において記載されるようなＳｉｎＲ変異体を含んでもよく、また欠失に起因したｓｐｏ０Ａ遺伝子を欠如してもよい。本明細書において記載されるような様々な遺伝子改変に関するありとあらゆる態様および実施形態は、ありとあらゆる考え得る組合せで組み合わされてもよい。
【0079】
１つの態様では、本発明は、Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカ種に属する細菌であって、細菌が、
（ａ）配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含む、ＳｉｎＲの変異体を含み、ここで、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供し、
（ｂ）Ｓｐｏ０Ａの低減もしくは消失された発現および／または活性を有し、ここで、発現および／または活性の低減が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌に関する。
（ａ）配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有し、配列番号２における１９８位に相当する位置にＶ以外のアミノ酸を含む、ＳｉｎＲの変異体を含み、ここで、ＳｉｎＲ変異体が、配列番号２と比較した場合に、細菌の誘導期の持続時間の減少および／または増殖速度の増加を提供し、
（ｂ）Ｓｐｏ０Ａの低減もしくは消失された発現および／または活性を有し、ここで、発現および／または活性の低減が、野生型Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカにおけるその発現および／または活性と相対的なものである、細菌に関する。
【0080】
好ましい実施形態では、ｓｐｏ０Ａ遺伝子は欠失され、配列番号２における１９８位に相当する位置にあるアミノ酸はＦである。
【0081】
遺伝子改変された細菌
一部の実施形態では、本発明は、Ｓｐｏ０Ａの発現および／または活性に影響を及ぼすよう、および／または細菌におけるＳｉｎＲの突然変異体を発現させるよう遺伝子改変されたムーレラ属種細菌に関する。
一部の実施形態では、本発明は、Ｓｐｏ０Ａの発現および／または活性に影響を及ぼすよう、および／または細菌におけるＳｉｎＲの突然変異体を発現させるよう遺伝子改変されたムーレラ属種細菌に関する。
【0082】
細菌における遺伝子改変は、当該技術分野において周知の技法によって、および本明細書中の他の箇所に記載されるように生成され得る。
【0083】
１つの態様では、遺伝子改変された細菌は、ムーレラ属に属する任意の細菌であり得る。種は、種ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・グリセリニ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）、ムーレラ・フミフェレア（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｈｕｍｉｆｅｒｒｅａ）、ムーレラ・ムルデリ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｍｕｌｄｅｒｉ）、ムーレラ・パークロラティレデュセンス（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、ムーレラ・スタムシイ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｔａｍｓｉｉ）、ムーレラ・サーモオートトロフィカ、ムーレラ属ｓｐ．２１５５５９／Ｅ３０－ＳＦ１＆２、ムーレラ属ｓｐ．６０＿４１、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ２４６．００、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ２４７．００、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ２４８．００、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ３８３．９８、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ３８４．９８、ムーレラ属ｓｐ．ＡＩＰ ５１５．００、ムーレラ属ｓｐ．ａｕｔｏ１１、ムーレラ属ｓｐ．ａｕｔｏ３９、ムーレラ属ｓｐ．ａｕｔｏ５４、ムーレラ属ｓｐ．ａｕｔｏ５９、ムーレラ属ｓｐ．ＣＦ４、ムーレラ属ｓｐ．ＣＦ５、ムーレラ属ｓｐ．Ｅ３０６Ｍ、ムーレラ属ｓｐ．Ｅ３０８Ｆ、ムーレラ属ｓｐ．Ｆ２１、ムーレラ属ｓｐ．Ｈａｍａ－１、ムーレラ属ｓｐ．ＨＵＣ２２－１、ムーレラ属ｓｐ．ＵＢＡ４０７６、ムーレラ属ｓｐ．集積クローンＲ１９、ムーレラ属ｓｐ．集積クローンＲ２、ムーレラ属ｓｐ．集積クローンＲ６５、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＢ１－Ｂ－６５、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＢ１１－Ｂ－１１、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＢ１３－Ｂ－１０３、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＢ１３－Ｂ－７２、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＤＧＧＥ－ｂａｎｄ１、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＴＥＲＩＢＣ１、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＴＥＲＩＢＣ２、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＴＥＲＩＢＣ３、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＴＥＲＩＢＣ４、ムーレラ属ｓｐ．集積培養クローンＴＥＲＩＢＣ５、および無培養ムーレラ属ｓｐ．のいずれか１つから選択され得るが、これらに限定されない［例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）アドレスncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=44260）を参照；２０２１年７月１日にアクセス］。
【0084】
他の態様では、遺伝子改変された細菌は、種ムーレラ・サーモアセチカおよび／またはムーレラ・サーモオートトロフィカに属すると分類される任意の細菌であり得る。Ｍ．サーモアセチカの株は、Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３およびＭ．サーモアセチカＹ７２ならびに例えばＭ．サーモアセチカ株３９０７３－ＨＨなどのそれらのいずれかに由来する株から選択され得るが、それらに限定されない。Ｍ．サーモアセチカおよび／またはＭ．サーモオートトロフィカの分類は、ＮＣＢＩの分類学ブラウザ（上記の参考文献を参照）などのリソースに基づいてもよく、および／またはそれは遺伝子解析に基づいてもよい。
【0085】
２つの細菌株が同じかまたは異なる種に属するかどうかを評価する方法は、当該技術分野において既知であり、平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）解析を含む。特定タイプのＡＮＩ解析は、ＭＵＭｍｅｒアライメント（ＡＮＩｍ）に基づくＡＮＩ解析である。簡潔に述べると、標的株のゲノムは、参照株のゲノムにアラインされ、適合領域が同定される。適合領域のヌクレオチド同一性のパーセントは、全ての適合領域の平均値として算出される。２つの細菌株の比較が、少なくとも９６．５％のＡＮＩｍスコアをもたらす場合、それらは同じ種に属するものとして分類され得る（Richter et al., PNAS; 106:19126-19131 2009、参照によりその全体が組み込まれる）。
【0086】
遺伝子改変された細菌の使用
１つの態様では、本発明は、適宜生化学物質の産生における炭素含有基質を代謝するための本発明の態様による遺伝子改変された細菌の使用に関する。
１つの態様では、本発明は、適宜生化学物質の産生における炭素含有基質を代謝するための本発明の態様による遺伝子改変された細菌の使用に関する。
【0087】
好ましい実施形態では、炭素含有基質は、ＣＯおよび／またはＣＯ２である。したがって、本明細書において記載されるような遺伝子改変された細菌は、環境に利益をもたらし得るＣＯ２などの温室効果ガスを固定する方法において好適に使用することができる。
【0088】
炭素含有基質
ムーレラ属種細菌は、Ｈ２／ＣＯ２またはＣＯを唯一の炭素供給源として天然で増殖することが可能である。したがって、ＣＯおよびＣＯ２を代謝するために本発明による遺伝子改変された細菌を使用するのにさらなる遺伝子改変は必要とされない。
ムーレラ属種細菌は、Ｈ２／ＣＯ２またはＣＯを唯一の炭素供給源として天然で増殖することが可能である。したがって、ＣＯおよびＣＯ２を代謝するために本発明による遺伝子改変された細菌を使用するのにさらなる遺伝子改変は必要とされない。
【0089】
ムーレラ属種細菌はまた、キシロース、フルクトース、メタノール、グルコース、アラビノース、マンノース、ラムノース、およびピルベートを含む他の炭素含有基質上でも天然で増殖する。
【0090】
生化学物質
本発明の実施形態では、本発明による遺伝子改変された細菌は、生化学物質の産生において使用される。
本発明の実施形態では、本発明による遺伝子改変された細菌は、生化学物質の産生において使用される。
【0091】
生化学物質は、例えば、Ｃ１～Ｃ４アルコール、Ｃ１～Ｃ４ケトン、Ｃ１～Ｃ４アルデヒド、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸、およびそれらの任意の混合物から選択され得る。一部の実施形態では、生化学物質は、アセテート、アセトン、ブタノン、およびエタノールから選択される。
【0092】
本発明による遺伝子改変された細菌による選択された生化学物質の産生のために、細菌は、それらに、選択された生化学物質の産生に有用な１つまたは複数の酵素を導入することによってさらに遺伝子改変されてもよい。通常、生化学物質の産生は、１つよりも多い酵素の作用を要し、生化学物質の産生は多くの場合、特定生合成経路を構成する多数の酵素の連続作用を要する。酵素は、それが所望の活性を提供する限り、文献において報告されている任意の種由来の任意の特性化および配列決定された酵素であり得る。一部の実施形態では、酵素は、細菌にとって自然である過剰発現遺伝子である。一部の実施形態では、酵素は、細菌にとって異種もしくは自然である酵素の機能的活性断片または変異体である。また、一部の実施形態では、組換え生合成経路は、通常所望の生化学物質の収率を低減させる競合反応を回避する目的で、１つまたは複数の遺伝子のノックダウンまたはノックアウトを含む。好熱性宿主細胞において機能的であるためには、酵素は、極めて熱安定性であるべきである。しかしながら、酵素は必ずしも好熱性生物に由来する必要はない。
【0093】
細菌への酵素の導入は、細菌を、それぞれがプロモーターの制御下で１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数のベクターで形質転換することによって行われる可能性があり、これは、上記のＳｉｎＲ変異体の発現について記載されたように、遺伝子の導入が宿主細胞において基質またはエネルギーを引き出しすぎないように適切なレベルでの遺伝子の発現を保証する。形質変換は、本明細書中の他の箇所に記載されるように実施され得る。選択された生化学物質の産生用の酵素を細胞に導入する形質転換事象は、適用可能であれば、Ｓｐｏ０Ａ用のノックアウトベクターおよび／またはＳｉｎＲ変異体をコードするベクターなどの、本発明に関連する任意の他のベクターの導入と組み合わせてもよい。遺伝子のいくつかは、同じベクター上で組み合わされてもよい。
【0094】
本発明によって産生され得る生化学物質の４つの（好ましい）例ならびにそれらの産生に適した酵素を以下に挙げる。生化学物質または生合成経路は、限定的なものとみなされるべきではなく、単に例とみなされるべきである。
【0095】
酢酸エステル：
酢酸生成性であるＭ．サーモアセチカを含むムーレラ属種細菌は、天然でアセテートを産生する。
酢酸生成性であるＭ．サーモアセチカを含むムーレラ属種細菌は、天然でアセテートを産生する。
【0096】
アセトン：
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるアセトンの産生は、細菌への下記酵素：チオラーゼ（Ｔｈｌ）、酢酸アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣｔｆＡＢ）、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）の導入によって可能となり得る。Ｍ．サーモアセチカにおけるアセトン産生に有用な合成オペロンの例については、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ番号ＭＷ４３６６９６を参照のこと（Zeldes et al., Biotechnol. Bioeng.; 115:2951-2961 2018、Kato et al., AMB Expr.; 11:59 2021）。特定オペロンは、カルダナエロバクター・サブテルラネウス（Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）由来のＴｈｌ、サーモシホ・メラネシエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）由来のＣｔｆＡＢ、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のＡｄｃをコードする遺伝子を含む。
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるアセトンの産生は、細菌への下記酵素：チオラーゼ（Ｔｈｌ）、酢酸アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣｔｆＡＢ）、およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）の導入によって可能となり得る。Ｍ．サーモアセチカにおけるアセトン産生に有用な合成オペロンの例については、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ番号ＭＷ４３６６９６を参照のこと（Zeldes et al., Biotechnol. Bioeng.; 115:2951-2961 2018、Kato et al., AMB Expr.; 11:59 2021）。特定オペロンは、カルダナエロバクター・サブテルラネウス（Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）由来のＴｈｌ、サーモシホ・メラネシエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）由来のＣｔｆＡＢ、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のＡｄｃをコードする遺伝子を含む。
【0097】
ブタノン：
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるブタノンの産生は、２，３－ブタンジオールの産生を触媒する酵素および得られた２，３－ブタンジオールをブタノンに変換する酵素を細菌に導入することによって可能となり得る。２，３－ブタンジオールは、ピルベートを、アセトインを介して２，３－ブタンジオールに変換されるアセト乳酸に変換することによって産生され、その反応は、酵素アセト乳酸シンターゼ（Ａｌｓ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（Ａｌｄｃ）、および２，３－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｂｄｈ）によって触媒される。続いて、２，３－ブタンジオールのブタノンへの変換は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）のような株において自然に見出されるジオールヒドラターゼ（ｐｄｕＣ、ｐｄｕＤ、およびｐｄｕＥ）の作用によって起こり得る（Ghiaci et al., Plos One; 9(7):e102774 2014）。ブタノンを産生する第２の方法は、プロピオニル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと融合させて、無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）β－ケトチオラーゼによって３－ケトバレリル－ＣｏＡを形成し、次にＡＢＥ産生クロストリジウムにおいて一般的に発現されるアセトアセチル－ＣｏＡ：アセテート／ブチレート：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣｆｔＡＢ）およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）の作用によって３－ケトバレリル－ＣｏＡをブタノンに変換することである（Srirangan et al., Biotechnology; 82:2574-2584 2016）。
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるブタノンの産生は、２，３－ブタンジオールの産生を触媒する酵素および得られた２，３－ブタンジオールをブタノンに変換する酵素を細菌に導入することによって可能となり得る。２，３－ブタンジオールは、ピルベートを、アセトインを介して２，３－ブタンジオールに変換されるアセト乳酸に変換することによって産生され、その反応は、酵素アセト乳酸シンターゼ（Ａｌｓ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（Ａｌｄｃ）、および２，３－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｂｄｈ）によって触媒される。続いて、２，３－ブタンジオールのブタノンへの変換は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）のような株において自然に見出されるジオールヒドラターゼ（ｐｄｕＣ、ｐｄｕＤ、およびｐｄｕＥ）の作用によって起こり得る（Ghiaci et al., Plos One; 9(7):e102774 2014）。ブタノンを産生する第２の方法は、プロピオニル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと融合させて、無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）β－ケトチオラーゼによって３－ケトバレリル－ＣｏＡを形成し、次にＡＢＥ産生クロストリジウムにおいて一般的に発現されるアセトアセチル－ＣｏＡ：アセテート／ブチレート：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣｆｔＡＢ）およびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）の作用によって３－ケトバレリル－ＣｏＡをブタノンに変換することである（Srirangan et al., Biotechnology; 82:2574-2584 2016）。
【0098】
エタノール：
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるエタノールの産生は、アセチル－ＣｏＡをエタノールに変換する二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）酵素を使用することによって、またはアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＡＯＲ）酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼを介してアセトアルデヒドへの、さらにはエタノールへのアセテート還元によって可能となり得る（Liew et al., Metab. Eng.; 40:104-114 2017）。
ムーレラ属種細菌における、より具体的にはＭ．サーモアセチカにおけるエタノールの産生は、アセチル－ＣｏＡをエタノールに変換する二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）酵素を使用することによって、またはアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＡＯＲ）酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼを介してアセトアルデヒドへの、さらにはエタノールへのアセテート還元によって可能となり得る（Liew et al., Metab. Eng.; 40:104-114 2017）。
【0099】
本発明は、下記実施例によって説明され、それらは限定的なものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0100】
［実施例１］
【0101】
Ｓｐｏ０Ａの欠失は、Ｍ．サーモアセチカの増殖速度を増加させる
環状ノックアウトプラスミドを構築し、相同組換えによってＭ．サーモアセチカにおいて遺伝子ｓｐｏ０Ａを欠失させた。
環状ノックアウトプラスミドを構築し、相同組換えによってＭ．サーモアセチカにおいて遺伝子ｓｐｏ０Ａを欠失させた。
【0102】
プラスミド骨格は、Ｍ．サーモアセチカにおいて機能的でない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＭＢ１レプリコンおよび中温性カナマイシン耐性マーカーを含むｐＫ１８であった。Ｍ．サーモアセチカのｓｐｏ０Ａの上流および下流それぞれ１ｋｂの２つの相同領域は、自然構成的Ｍ．サーモアセチカＰＧ３ＰＤプロモーターの制御下で好熱性ｋａｎＲ耐性マーカーに隣接していた（プラスミドマップを図２に示す）。プラスミドは、表２において列挙されているプライマーを用いたＰＣＲ（ハイフィデリティポリメラーゼを用いて）を使用して断片を増幅することによって構築された。断片は、ギブソン法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して集合させた。プラスミドが構築され、配列決定によって検証されたら、プラスミドは繁殖株に移入され、適切なＤＮＡメチル化も保証した。
【0103】
【表2】
【0104】
Ｍ．サーモアセチカＡＴＣＣ ３９０７３を、これまでに公開された方法に従って、ブチルゴム栓で閉じた１００ｍｌの血清ボトル（５０％充填）において培養した（ボトルおよび栓：Ｏｃｈｓ、ドイツ）（Daniel et al., J. Bacteriol.; 172:4464-4471 1990、Redl et al., Front. Microbiol.; 10 [3070] 2020）。しかしながら、培地は、緩衝液系を２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）に置き換えることと、フルクトースを炭素供給源（最終濃度６０ｍＭ）として利用することによって改変された。培地は下記組成を有した（ｇ／ｌで）：ＫＨ２ＰＯ４（０．５）；ＮＨ４Ｃｌ（０．４）；ＮａＣｌ（０．４）；ＭＥＳ（２０）；酵母抽出物（０．５）；１％微量元素溶液を培地に添加した。微量元素溶液を、２ｇ／ｌのニトリロ三酢酸を用いて調製し、ｐＨをＫＯＨで６．０に調節し、下記化合物を添加した（ｍｇ／ｌで）：ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（１０００）；Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ（８００）；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２００）；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２００）；ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０）；ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２０）；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（２０）；Ｎａ２ＳｅＯ４（２０）；Ｎａ２ＷＯ４（２０）。培養培地のｐＨを６．５に調節し、Ｎ２：ＣＯ２（８０：２０）で流し、１４０℃で４０分間オートクレーブにかけた。下記ストック溶液をオートクレーブ後に添加した：ＣａＣｌ２（最終５０ｍｇ／ｌ）、ＭｇＣｌ２（最終３３０ｍｇ／ｌ）、ビタミン溶液（１％）、システイン－ＨＣｌ（最終１ｍＭ）。ビタミン溶液には、ビオチン（２）；葉酸（２）；ピリドキシン－ＨＣｌ（１０）；チアミン－ＨＣｌ（５）；リボフラビン（５）；ニコチン酸（５）；カルシウムＤ－（＋）－パントテン酸塩（５）；ビタミンＢ１２（０．５）；ｐ－アミノ安息香酸（５）；チオクト酸（５）が含有されていた（ｍｇ／ｌで）。培地は接種前に予熱した。株を６０℃で培養し、撹拌した。固形培地には、１％Ｇｅｌｚａｎ（商標）、ＣａＣｌ２（１００ｍｇ／ｌ）、ＭｇＣｌ２（６６０ｍｇ／ｌ）が含有され、培地を１２０℃で２０分間滅菌した。
【0105】
エレクトロポレーションに先立って、細胞を指数関数期まで増殖させ、遠心分離によって回収し、緩衝液（５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／２７０ｍＭスクロース）で２回洗浄した。プラスミドＤＮＡおよそ１μｇを、エレクトロポレーションによって細胞に形質転換した。エレクトロポレーション条件は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標）および０．２ｃｍのギャップを有するキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．の製品）を使用することによって１．５ｋＶ、５００Ωであった。より詳細については、Kita et al.(J. Biosci. Bioeng.; 115:347-352 2013)を参照のこと。エレクトロポレーションからの回収は、上述するような培地中で行ったが、但し酵母抽出物の濃度を増加させた（１０ｇ／Ｌ）。回収は一晩中行い、その後、培養物（種々の希釈で）１００μｌを、４００μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する固形培地に蒔いた。インキュベーションは、コロニーがプレート上に出現するまで６０℃で４～７日間嫌気的に行った。コロニーは、４つのプライマーセット（ｓｐｏ０Ａ＿ｕｐ＿ｅｘｔ＿２５０ｂｐ－ｓｐｏ０Ａ＿ｄｎ＿ｅｘｔ＿２５０ｂｐ、ｓｐｏ０Ａ＿ｕｐ＿ｅｘｔ＿２５０ｂｐ－Ｋａｎ＿Ｓｅｑ ｒｅ、Ｋａｎ＿Ｓｅｑ ｆｏ－ｓｐｏ０Ａ＿ｄｎ＿ｅｘｔ＿２５０ｂｐ、およびＫａｎ＿Ｓｅｑ ｒｅ－Ｓｐｏ０Ａ＿ＵＰ＿ｆｏ（それぞれ、ｅｘｔ－ｅｘｔ、ｅｘｔ－ｉｎｔ、ｉｎｔ－ｅｘｔ、およびｉｎｔ－ｉｎｔ））を使用したＰＣＲによって組込みについて検査した。陽性コロニーは、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する液体培地中で培養した。
【0106】
形質転換をさらに検証するために、ｇＤＮＡを培養物から抽出し、全ゲノムを配列決定した。このようにして、ｓｐｏ０Ａ遺伝子がｋａｎＲカセットによって置き換えられていることが確認された。
【0107】
ＷＴおよびΔｓｐｏ０Ａ株の培養は、先述のような培地中で行った。定常増殖期に入った後、試料を採取し、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００）で目視検査した。培養物はともに、驚くほど胞子を形成していることが明らかであった。このことは、マラカイトグリーン胞子染色によってさらに確認された。水溶液中の０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）マラカイトグリーンを、細菌細胞が固定された顕微鏡スライドガラスに添加した。スライドを沸騰水上に置き、マラカイトグリーンを胞子に押し込んだ。冷却後（室温まで）、過剰な着色剤を水で洗い流した。染色された胞子は、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００）で同定された。両方の培養において、明らかに緑色に染色された胞子が観察された。
【0108】
欠失の影響をさらに検討するために、両方の株を培養し（３重反復で）、６００ｎｍでの培養物の光学密度をオンラインでモニタリングした。増殖曲線を図３に示す。驚くべきことに、Ｍ．サーモアセチカΔｓｐｏ０Ａの表現型は、図において、および表３に提示した増殖速度において明らかであるように、有意により高い増殖速度（より短い倍加時間）を特徴としている。
【0109】
【表3】
【0110】
ｔ検定（信頼区間０．０５で）によって有意性を評価することにより、Δｓｐｏ０Ａは野生型よりも有意に速く増殖することが示された。
［実施例２］
［実施例２］
【0111】
Ｍ．サーモアセチカのＳｉｎＲのアミノ酸配列における変化
胞子形成を起こしにくい株を開発するために、Ｍ．サーモアセチカ３９０７３－ＨＨを用いて進化研究を設定した。培養物を、２．５ｇ／ｌの酵母抽出物を有する培地（実施例１において記載したものと同じ）中で培養し、６０℃でインキュベートした。選抜圧をかけるために、培養物が定常期に達したら（通常、４日後）、２％接種物を使用して新鮮な培地に再接種した。このアプローチは、培養物がおよそ２５００世代（１４回の移入）にわたって進化するまで続けられた。
胞子形成を起こしにくい株を開発するために、Ｍ．サーモアセチカ３９０７３－ＨＨを用いて進化研究を設定した。培養物を、２．５ｇ／ｌの酵母抽出物を有する培地（実施例１において記載したものと同じ）中で培養し、６０℃でインキュベートした。選抜圧をかけるために、培養物が定常期に達したら（通常、４日後）、２％接種物を使用して新鮮な培地に再接種した。このアプローチは、培養物がおよそ２５００世代（１４回の移入）にわたって進化するまで続けられた。
【0112】
培地中でかつ進化中に使用された条件下で増殖させた培養物の特性化は、顕微鏡検査、胞子のマラカイトグリーン染色（実施例１における記載を参照）、およびバイオマス生成（光学密度測定による）によって行われた。進化された培養物は、崩壊された胞子形成を有さず、バイオマスの生成は、非進化株と類似していた。培養物をインキュベーター中で長期間保管することと、株を再培養することとによって、驚くべきことに、通常静止状態になった１～３日後のかなりの誘導期を有する野生型とは対照的に、２５日よりも長い間静止状態になった直後に代謝的に活性になることが可能であることが観察された。
【0113】
進化中に起きた遺伝子変化を評価するために、培養物を固形培地に様々な希釈で（単一コロニーの増殖を可能にするため）蒔いて、６０℃で７日間嫌気的にインキュベートした。６つの単一コロニーを採取し、液体培地中で培養した。２日間のインキュベーション後、細胞を遠心沈降させ、ゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、米国）を使用して個々の培養物から抽出し、抽出されたＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ ８．５中に溶解した。ＤＮＡの定量化は、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計を用いて行った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、米国）。当該ＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａショットガン配列決定ライブラリーを生成した。配列決定は、製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ、米国）によって推奨されるように、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を使用したＭｉＳｅｑシステムを用いることによって実施され（６００サイクル）、２×３００ｂｐペアエンドリードをもたらした。顕性突然変異は、参照ゲノム配列にアラインすることによって同定された。細胞の状態に関連した唯一の突然変異は、ＳｉｎＲをコードする遺伝子におけるＶ１９８Ｆ突然変異であった。
【0114】
進化株は、非崩壊胞子形成を有したが、野生型（ＳｉｎＲ＿１９８Ｖを保有している）は、胞子を産生する傾向が最も高く、細胞形態は特徴的な桿体ではなく、より円形であった。１９８Ｆによる進化株は、より特徴的な桿体形状の形態を有し、凝集しやすい傾向があった。新鮮な培地への接種物として使用された場合、ＳｉｎＲ＿１９８Ｆを有する培養物は、大幅に短い誘導期を有した。
【0115】
Ｍ．サーモアセチカのＳｉｎＲのタンパク質構造の解析により、Ｍ．サーモアセチカのＳｉｎＲが桿菌のＳｉｎＲに似ているが、２つのタンパク質は同一ではないことが示されている。Ｍ．サーモアセチカにおけるＳｉｎＲ由来の第３のＨＴＨドメインおよび枯草菌由来のＳｉｎＲの配列アライメントは、２つの異なるアライメントアルゴリズムを使用する。理論に制限されずに、これにより、Ｍ．サーモアセチカにおけるＶ１９８が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＴ６０またはＬ６１のいずれかと同等であり得ることが示唆される。枯草菌におけるＳｉｎＲは、他のタンパク質への結合またはオリゴマー形成における変化のさらなる解析を可能にした明白な結晶構造を有する。枯草菌由来のＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ複合体の構造の検査、ＳｉｎＲオリゴマー形成およびＳｉｎＩ結合の両方［ＳｉｎＩの結合はオリゴマー形成相互作用を模倣している（Bai et al., Genes Dev.; 7:139-148 1993、Lewis et al., J. Mol. Biol.; 283:907-912 1998）］により、Ｔ６０とＬ６１がＨＴＨドメインとオリゴマー形成ドメインとの中間相に存在していることが示されている（図４）。Ｌ６１の側鎖は、ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフの内側に面しており、このＰｈｅ（Ｆ）への突然変異は、立体衝突およびおそらくタンパク質の不安定化をもたらす（図４Ｃ）。Ｔ６０の側鎖は、オリゴマー形成ドメインに面しており、ＳｉｎＩ由来のＥ１４と２つの水素結合を作製している（図４Ｄ、左）。Ｔ６０のＦへの突然変異により水素結合能が除去され、ＳｉｎＲとＳｉｎＩとの間に立体衝突をもたらし、親和性を低減させる可能性が最も高い（図４Ｄ中央および左）。
【0116】
構造解析により、Ｌ６１はＳｉｎＲのタンパク質コアに面していることが見出され、したがって、Ｌ６１での突然変異は、ＳｉｎＲを不安定化させると予想される。Ｔ６０は、ＳｉｎＩ相互作用の中間相に面しており、したがって、この残基での突然変異は、ＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ相互作用の親和性に影響を及ぼすと予想される。これらの仮説を確認し、ＳｉｎＲタンパク質安定性および／またはＳｉｎＩ相互作用親和性のいずれかに対して類似した影響を有すると予測される他の突然変異を同定するために、２つの異なるバイオインフォマティクスツールが適用された：（ｉ）ＰｒｅｍＰＳサーバー（Chen et al., PLOS Comp. Biol.; 16:e1008543 2020）は、ＳｉｎＲタンパク質安定性に対する予測される影響を算出するのに使用され、（ｉｉ）ｍＣＳＭ－ＰＰＩ２サーバー（Rodrigues et al., Nucleic Acids Res.; 47:W338-W344 2019）は、ＳｉｎＩ相互作用親和性に対する予測される影響を算出するのに使用された。両方の場合において、Ｔ６０およびＬ６１の両方での全ての考え得る突然変異の影響が予測された。
【0117】
Ｌ６１での突然変異に関するバイオインフォマティクス予測（表４）により、この位置での突然変異がタンパク質安定性に対して大きな影響を有するのに対し、ＳｉｎＩ相互作用親和性に対する影響はそれほど顕著ではないことが示唆される。これは、Ｌ６１がタンパク質コアに面しており、ＳｉｎＩ相互作用部位の一部を形成していないことを示す構造解析と一致している。これらの観察に基づいて、Ｌ６１の突然変異時に観察される任意の表現型の影響に対する主な寄与因子は、タンパク質安定性であると予想される。Ｌ６１での個々の突然変異の解析は、全ての突然変異が不安定化していると予測され、Ｌ６１Ｆが最小限に不安定化しており（予測ΔΔＧ安定性（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）＝０．１５）、Ｌ６１Ｓが最も不安定化している（予測ΔΔＧ安定性（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）＝２．７７）ことを示している。先の配列アライメントによって示唆されたように、Ｍ．サーモアセチカにおけるＳｉｎＲ Ｖ１９８が、桿菌におけるＬ６１に相同的である場合、Ｖ１９８の任意のアミノ酸への突然変異は、Ｍ．サーモアセチカＳｉｎＲを不安定化し、したがって、Ｖ１９８Ｆに関して観察されたものと類似した表現型の影響を有すると予想される。
【0118】
Ｌ６１について予測されたものに反して、Ｔ６０での突然変異は、ＳｉｎＲとＳｉｎＩとの間の相互作用親和性に対して大きな影響があると予測されたのに対して、タンパク質安定性に対する影響は、あまり顕著ではないと予測された（表５）。これは、Ｔ６０がＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ相互作用の中間相に存在し、ＳｉｎＲ表面に面しているため、構造解析から予想される。これらの結果を考慮すると、Ｔ６０での突然変異の主な表現型の影響は、ＳｉｎＩに対する親和性における変化に起因すると予想される。個々の突然変異の評価は、２つの突然変異Ｔ６０ＤおよびＴ６０Ｅが、ＳｉｎＩに対する親和性を増加させると予測されることを示している。これは、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩がともにＳｉｎＩに対していくつかの新たな極性および水素結合接触を行う場合のモデル化された突然変異体構造の検査時に容易に説明される。突然変異の残りの部分（アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩以外の全てのアミノ酸）は、ＳｉｎＩに対する親和性を減少させると予測される。これは、Ｔ６０の側鎖がＳｉｎＩ由来のＥ１４と２つの水素結合を作製することが見出された場合の構造解析と良好に一致している。Ｔ６０の突然変異により水素結合能が除去され、ＳｉｎＲとＳｉｎＩと間の親和性を低減させる。先の配列アライメントによって示唆されたように、Ｍ．サーモアセチカにおけるＳｉｎＲ Ｖ１９８が、桿菌におけるＴ６０に相同的である場合、Ｖ１９８の、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩を除く任意のアミノ酸への突然変異は、ＳｉｎＲ－ＳｉｎＩ相互作用親和性を減少させ、したがって、Ｖ１９８Ｆに関して観察されたものと類似した表現型の影響を有すると予想される。
【0119】
【表4】
【0120】
【表5】
【0121】
参考文献のリスト
以下に列挙されるか、または本明細書中の他の箇所に記載される各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下に列挙されるか、または本明細書中の他の箇所に記載される各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】