特表 2024-533294 超音波刺激構造および治療用化学種の送達のための方法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】超音波刺激構造および治療用化学種の送達のための方法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/59 20170101AFI20240905BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240905BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20240905BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20240905BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

A61K47/59

A61K47/60

A61K47/61

A61K31/7105

A61K47/62

A61K9/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515033

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 US2022042708

(87)【国際公開番号】W WO2023038937

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/241,183

(32)【優先日】2021-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/338,799

(32)【優先日】2022-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500273296

【氏名又は名称】ザ・ペン・ステート・リサーチ・ファンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110001243

【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジュリアン エイチ．アリザバラガ

(72)【発明者】

【氏名】モハマド アブ－ラバン

(72)【発明者】

【氏名】ジュリアンナ シー．シモン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ジェイ．ヘイズ

(72)【発明者】

【氏名】フェルドウシ サベラ ラウナクー

(72)【発明者】

【氏名】ティアス イエイングスト

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA95

4C076CC09

4C076CC26

4C076EE22

4C076EE23

4C076EE24

4C076EE30

4C076EE31

4C076EE36

4C076EE37

4C076EE38

4C076EE41

4C076EE42

4C076EE43

4C076EE59

4C076FF68

4C076FF70

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA13

4C086ZA96

4C086ZB21

(57)【要約】

本開示の例示的な実施形態は、組成物および組成物を使用する方法を提供する。本明細書に記載される組成物は、ヒドロゲル、治療用化学種、およびヒドロゲルを治療用化学種に接合する結合基を含む。ヒドロゲルを治療用化学種に接合する結合基は、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を含む。本開示のいくつかの態様は、対象者に治療用化学種を送達する方法に関する。本方法は、組成物を対象者に配置する工程と、レトロ・ディールス・アルダー反応を開始してディールス・アルダー環状付加反応生成物を分解し、それにより結合基を切断し、治療用化学種をヒドロゲルから分離する工程とを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ディールス・アルダー環状付加反応生成物を含む結合基を含むヒドロゲルと、
ヒドロゲルに結合した治療用化学種と、
を含み、トリガー事象に暴露される際に、結合基は可逆的な逆行性開裂反応を起こしてヒドロゲルから治療用化学種を放出するように構成されていることを特徴とする組成物。

【請求項2】

治療用化学種がヒドロゲル内に封入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

トリガー事象が音響エネルギーのパルス波を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含み、
パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含み、
パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含み、および
処理時間は約３０秒から約３００秒の範囲である
ことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

ヒドロゲルが生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

生体適合性ポリマーが、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

結合基はジエンとジエノフィルとの反応生成物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

ジエンは、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

ジエノフィルは、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。

【請求項12】

第１前駆体を含む第１材料と、
第２前駆体を含む第１治療用化学種と、
を含み、第１前駆体および第２前駆体は、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を形成し、ディールス・アルダー環状付加反応生成物は、第１トリガー事象に暴露される際にレトロ・ディールス・アルダー反応を起こし、第１治療用化学種を放出するように構成されていることを特徴とする組成物。

【請求項13】

第３前駆体を含む第２材料と、
第４前駆体を含む第２治療用化学種と、
をさらに含み、第３前駆体および第４前駆体は、ディールス・アルダー・環状付加反応生成物を形成し、第３前駆体および第４前駆体は、第１前駆体および第２前駆体とは異なることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

第３前駆体および第４前駆体が、第２トリガー事象へ暴露される際にレトロ・ディールス・アルダー反応を起こし、第２治療用化学種を放出するように構成されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

第１トリガー事象が第２トリガー事象とは相違し、第１治療用化学種および第２治療用化学種が異なるトリガー事象で放出されることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

第１トリガー事象または第２トリガー事象の少なくとも一方が、音響エネルギーのパルス波を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

第１トリガー事象および第２トリガー事象が音響エネルギーのパルス波を含む場合、第２トリガー事象は、第１トリガー事象とは異なる波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含む音響エネルギーのパルス波を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含み、
パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含み、
パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含み、および
処理時間は約３０秒から約３００秒の範囲である
ことを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。

【請求項20】

第１材料が生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。

【請求項21】

第２材料が生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

生体適合性ポリマーが、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

第１治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項24】

第１前駆体が、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールから選択されるジエンを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項25】

第２前駆体が、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンを含むジエノフィルを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項26】

第３前駆体が、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールから選択されるジエンを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。

【請求項27】

第４前駆体が、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンを含むジエノフィルを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。

【請求項28】

ヒドロゲルと治療用化学種とを含む組成物を対象者に配置する工程であって、ヒドロゲルは、ヒドロゲルと治療用化学種とを結合する結合基を含む工程と、
組成物を音響エネルギーのパルス波に暴露して可逆的な逆行性開裂反応を開始して結合基を切断し、ヒドロゲルから治療用化学種を分離させる工程と、
を含むことを特徴とする、対象者に治療用化学種を送達する方法。

【請求項29】

治療用化学種をヒドロゲル内に封入する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ヒドロゲルの第１前駆体と治療用化学種の第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を介して治療用化学種とヒドロゲルとを連結する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含み、
パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含み、
パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含み、および
処理時間は約３０秒から約３００秒の範囲である
ことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ヒドロゲルが生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項34】

生体適合性ポリマーが、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項36】

結合基はジエン前駆体とジエノフィル前駆体とのディールス・アルダー反応生成物を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項37】

ジエン前駆体は、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ジエノフィル前駆体は、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

対象者の組織に対して、第１前駆体と第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を含む材料を配置する工程と、
材料を第１トリガー事象に暴露して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始させる工程と、
を含むことを特徴とする、対象者において制御された組織再生を促進する方法。

【請求項40】

治療用化学種を材料内に封入する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

第１前駆体および第２前駆体とは異なる第３前駆体および第４前駆体を含むディールス・アルダー反応生成物を介して、治療用化学種を材料に連結させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

治療用化学種を第２トリガー事象に暴露して、第３前駆体および第４前駆体のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始し、治療用化学種を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

第１トリガー事象または第２トリガー事象の少なくとも一方が、音響エネルギーのパルス波を含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

第２トリガー事象を、第１トリガー事象とは異なる波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含むように調整して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応とは異なる速度で治療用化学種を分離させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

第２トリガー事象を、第１トリガー事象とほぼ同一の波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含むように調整して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応と同様の速度で治療用化学種を分離させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含み、
パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含み、
パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含み、および
処理時間は約３０秒から約３００秒の範囲である
ことを特徴とする、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

材料が生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。

【請求項49】

生体適合性ポリマーが、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

第１治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。

【請求項51】

第１前駆体が、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールから選択されるジエンを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。

【請求項52】

第２前駆体が、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンを含むジエノフィルを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示の様々な実施形態は、一般的に治療用化学種の制御放出のための構造に関し、より詳細には、集束超音波（ｆＵＳ）刺激下でレトロ・ディールス・アルダー開裂反応を起こすヒドロゲルに関する。

【背景技術】

【0002】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０２１年９月７日に出願された米国特許仮出願第６３／２４１，１８３号および２０２２年５月５日に出願された米国特許仮出願第６３／３３８，７９９号の利益を主張し、両出願は、参照によりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

【0003】

（連邦政府後援研究の声明）
本発明は、米国陸軍／ＭＲＭＣから授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ－２１－１－００５２の下、政府の支援を受けて行われたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。

【0004】

制御された薬物放出を可能にする移植可能な構造体および薬物送達システムは、外科的再建後および再生医療中に、従来はアクセスが困難であった骨および組織を修復する際に、改善された結果をもたらす可能性がある。治療薬を標的部位に直接送達する場合、慣用のポリマーをベースとしたシステムは、多くの場合に受動的な拡散およびポリマー分解に依存し、治療薬放出の時間的制御を欠く。同様に、骨再生のための高分子移植構造体は、制御できない高分子分解および構造の欠如に悩まされている。化学的トリガーなどの内部刺激は、時間的放出を制御するのに役立つが、多くの場合に、ポリマーの分解を開始して治療薬を放出させるために、被験者の特異的な免疫反応または薬物送達システムに組み込まれる追加の化学物質を必要とする。光、熱、磁界のような外部からの物理的刺激もまた、ポリマー分解および治療薬の放出を開始させることができる。しかしながら、これらの方法は領域全体を物理的刺激にさらすため、標的外のイオン化または熱傷（burning）をもたらす恐れがある。さらに、このような刺激は、組織深部のポリマーベースのドラッグデリバリーシステムに到達しないため、薬物放出の強度および頻度の制御に欠ける。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、強力かつ安全な外部刺激下で容易に分解して治療薬を標的に放出できる組成物は、有益な薬物送達システムを提供し、深部組織標的に対する標的外イオン化および熱傷を制限し得る。本明細書の開示では、ディールス・アルダー結合基を有する架橋３Ｄネットワークからなるポリマーベースの薬物送達システムは、集束超音波で刺激される際に分解を受けて治療薬を放出し、治療薬の放出速度を制御すると同時に標的外への影響を制限する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の主題は、集束超音波刺激下でレトロ・ディールス・アルダー開裂反応を起こし、任意選択に治療用化学種を標的組織に放出する、ヒドロゲルを有する組成物を送達する方法またはその使用を含む。本開示の例示的な実施形態は、ヒドロゲルと、ヒドロゲルに結合した治療用化学種とを含む組成物を提供する。ヒドロゲルは、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を有する結合基を含むことができる。トリガー事象に暴露された際に可逆的な逆行性開裂反応を起こしてヒドロゲルから治療用化学種を放出させるように、結合基を構成することができる。

【0007】

いくつかの実施形態において、ヒドロゲル内に治療用化学種を封入することができる。

【0008】

いくつかの実施形態では、トリガー事象は、音響エネルギーのパルス波を含むことができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことができる。

【0010】

いくつかの実施形態では、波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含むことができる。パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内に、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含むことができる。パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含むことができる。治療時間は、約３０秒から約３００秒の範囲であり得る。

【0011】

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは生体適合性ポリマーを含むことができる。生体適合性ポリマーは、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物（mimic）、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことができる。いくつかの実施形態において、結合基は、ジエンとジエノフィルとの反応生成物を含むことができる。ジエンは、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールの少なくとも１種を含むことができる。ジエノフィルは、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンの少なくとも１種を含むことができる。

【0013】

本開示の例示的な実施形態は、第１材料および第１治療用化学種を含む組成物を提供する。第１材料は、第１前駆体を含むことができる。第１治療用化学種は、第２前駆体を含むことができる。第１前駆体および第２前駆体は、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を形成することができる。ディールス・アルダー環状付加反応生成物は、第１治療用化学種を放出するための第１トリガー事象に暴露されたときに、レトロ・ディールス・アルダー反応を受けるように構成することができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、組成物は、第２材料および第２治療用化学種をさらに含むことができる。第２材料は、第３前駆体を含むことができる。第２治療用化学種は、第４前駆体を含むことができる。第３前駆体および第４前駆体は、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を形成し得る。いくつかの実施形態において、第３前駆体および第４前駆体は、第１前駆体および第２前駆体とは異なっていてもよい。

【0015】

いくつかの実施形態において、第３前駆体および第４前駆体は、第２トリガー事象に暴露された際にレトロ・ディールス・アルダー反応を起こして、第２治療用化学種を放出するように構成することができる。

【0016】

いくつかの実施形態では、第１トリガー事象は、第２トリガー事象とは異なり、第１治療用化学種および第２治療用化学種を、別個のトリガー事象で放出するようにすることができる。

【0017】

いくつかの実施形態において、第１トリガー事象または第２トリガー事象の少なくとも一方は、音響エネルギーのパルス波を含むことができる。

【0018】

いくつかの実施形態では、音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことができる。

【0019】

いくつかの実施形態において、第１トリガー事象および第２トリガー事象が音響エネルギーのパルス波を含む場合、第２トリガー事象は、第１トリガー事象とは異なる波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含む音響エネルギーのパルス波を含むことができる。

【0020】

いくつかの実施形態では、波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含むことができる。パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含むことができる。パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含むことができる。治療時間は、約３０秒から約３００秒の範囲であり得る。

【0021】

いくつかの実施形態において、第１材料は、生体適合性ポリマーを含むことができる。第２材料は、生体適合性ポリマーを含むことができる。生体適合性ポリマーは、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことができる。

【0022】

いくつかの実施形態において、第１治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことができる。

【0023】

いくつかの実施形態において、第１前駆体は、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールから選択されるジエンを含むことができる。第２前駆体は、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンからなるジエノフィルを含むことができる。第３前駆体は、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールから選択されるジエンを含むことができる。第４前駆体は、置換または無置換のアルケンまたはアルキンからなるジエノフィルを含むことができる。

【0024】

本開示の例示的な実施形態は、対象者に治療用化学種を送達する方法を提供する。本方法は、ヒドロゲルと治療用化学種とを含む組成物を対象者に配置する工程と、組成物を音響エネルギーのパルス波に暴露する工程とを含むことができる。ヒドロゲルは、ヒドロゲルと治療用化学種とを結合する結合基を含むことができる。組成物を音響エネルギーのパルス波に暴露することで、可逆的な逆行性開裂反応を開始して結合基を切断し（severe）、ヒドロゲルから治療用化学種を分離することができる。

【0025】

いくつかの実施形態において、本方法は、ヒドロゲル内に治療用化学種を封入する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、ヒドロゲル上の第１前駆体と治療用化学種上の第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を介して、治療用化学種をヒドロゲルとカップリングする工程をさらに含むことができる。

【0026】

いくつかの実施形態では、音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことができる。

【0027】

いくつかの実施形態では、波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含むことができる。パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含むことができる。パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含むことができる。治療時間は、約３０秒から約３００秒の範囲であり得る。

【0028】

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは生体適合性ポリマーを含むことができる。生体適合性ポリマーは、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことができる。

【0029】

いくつかの実施形態において、治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことができる。

【0030】

いくつかの実施形態において、結合基は、ジエン前駆体とジエノフィル前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を含むことができる。ジエン前駆体は、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールの少なくとも１種を含むことができる。ジエノフィル前駆体は、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンの少なくとも１種を含むことができる。

【0031】

本開示の例示的な実施形態は、対象者内の制御された組織再生を促進する方法を提供する。本方法は、対象者の組織に対して、第１前駆体と第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を含む材料を配置する工程と、材料を第１トリガー事象に暴露して材料のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始させる工程とを含むことができる。

【0032】

いくつかの実施形態において、本方法は、材料内に治療用化学種を封入する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、第１前駆体および第２前駆体とは異なる、第３前駆体と第４前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を介して、治療用化学種を材料とカップリングさせる工程をさらに含むことができる。

【0033】

いくつかの実施形態において、本方法は、治療用化学種を第２トリガー事象に暴露し、それにより第３前駆体および第４前駆体のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始させて治療用化学種を分離（uncouple）させる工程をさらに含むことができる。

【0034】

いくつかの実施形態において、第１トリガー事象または第２トリガー事象の少なくとも一方は、音響エネルギーのパルス波を含むことができる。

【0035】

いくつかの実施形態では、音響エネルギーのパルス波は、波形、パルス持続時間、およびパルス繰返し周波数を含むことができる。

【0036】

いくつかの実施形態では、波形は、約４０メガパスカル（ＭＰａ）から約１００ＭＰａの範囲のピーク陽圧振幅と、約１０ＭＰａから約３０ＭＰａの範囲のピーク陰圧振幅とを含むことができる。パルス持続時間は、約１マイクロ秒（μｓ）から約２０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の時間枠内で、約１サイクルから約２０，０００サイクルの範囲のサイクル数を含むことができる。パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚの範囲の周波数を含むことができる。治療時間は、約３０秒から約３００秒の範囲であり得る。

【0037】

いくつかの実施形態において、本方法は、第２トリガー事象を、第１トリガー事象とは異なる波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含むように調整して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応とは異なる速度で治療用化学種を分離させるようにする工程をさらに含むことができる。

【0038】

いくつかの実施形態において、本方法は、第２トリガー事象を、第１トリガー事象とほぼ同一の波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含むように調整して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応と同様の速度で治療用化学種を分離させるようにする工程をさらに含むことができる。

【0039】

いくつかの実施形態において、材料は生体適合性ポリマーを含むことができる。生体適合性ポリマーは、置換または非置換の、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびこれらの組み合わせを含むことができる。

【0040】

いくつかの実施形態において、治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ模倣物、およびそれらの組み合わせの少なくとも１種を含むことができる。

【0041】

いくつかの実施形態において、結合基は、ジエン前駆体とジエノフィル前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を含むことができる。ジエン前駆体は、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールの少なくとも１種を含むことができる。ジエノフィル前駆体は、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンの少なくとも１種を含むことができる。

【0042】

本開示のこれらの態様および他の態様を、以下の詳細な説明および添付の図面に記載する。実施形態の他の態様および特徴は、特定の例示的な実施形態に関する以下の説明を図面と合わせて検討することにより、当業者に明らかになるであろう。本開示の特徴を特定の実施形態および図に関連して論じるとしても、本開示のすべての実施形態は、本明細書で論じられる特徴の１つまたは複数を含むことができる。さらに、１つまたは複数の実施形態を特定の有利な特徴を有するものとして論じるとしても、そのような特徴の１つまたは複数を、本明細書で論じられる種々の実施形態とともに使用することもできる。同様に、例示的な実施形態をデバイス、システム、または方法の実施形態として以下で議論するとしても、そのような例示的な実施形態は、本開示の種々のデバイス、システム、および方法で実装され得ることを理解されたい。

【0043】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、現在開示されている主題の複数の実施形態を示すものであり、本明細書とともに、現在開示されている主題の原理を説明する役割を果たすものである。さらに、現在開示されている主題の範囲を限定することを何ら意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】本発明の例示的な実施形態にしたがう、対象者内に配置される例示的な組成物を示す概略図である。

【図2A】本発明の例示的な実施形態にしたがう、外部刺激下で分解を受ける治療用化学種および結合基を有する例示的な組成物の概略図である。

【図2B】本発明の例示的な実施形態にしたがい、外部刺激下で分解を受ける、２種の別個の材料に２種の別個の治療用化学種が結合されている例示的な組成物の概略図である。

【図3A】本発明の例示的な実施形態にしたがって、外部刺激下でレトロ・ディールス・アルダー反応を起こして結合基を形成する、例示的な組成物および前駆体を示す図である。

【図3B】本発明の例示的な実施形態にしたがって、外部刺激下でレトロ・ディールス・アルダー反応を起こして結合基を形成する、例示的な組成物および前駆体を示す図である。

【図3C】本発明の例示的な実施形態にしたがって、外部刺激下でレトロ・ディールス・アルダー反応を起こして結合基を形成する、例示的な組成物および前駆体を示す図である。

【図4A】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なキトサンヒドロゲルおよび結合基を有するキトサンヒドロゲルのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4B】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的な結合基を有するキトサンヒドロゲルのＤＳＣ曲線を示す図である。

【図4C】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4D】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4E】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4F】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4G】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。

【図4H】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＤＳＣ曲線を示す図である。

【図4I】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＤＳＣ曲線を示す図である。

【図4J】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＤＳＣ曲線を示す図である。

【図4K】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なポリカプロラクトン材料および結合基を有するポリカプロラクトン材料のＤＳＣ曲線を示す図である。

【図4L】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的な結合基を有するキトサンヒドロゲルのレオロジー曲線を示す図である。

【図5A】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図5B】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図5C】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図5D】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図5E】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図5F】本発明の例示的な実施形態にしたがう、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示す図である。

【図6A】本発明の例示的実施形態にしたがう、集束超音波刺激下での例示的ヒドロゲルの分解のリアルタイム画像を示す図である。

【図6B】本発明の例示的実施形態にしたがって種々の条件の集束超音波に暴露する際の、周囲温度変化を示す図である。

【図6C】本発明の例示的な実施形態にしたがう例示的な結合基を有するヒドロゲルの集束超音波への暴露前後の光学的形状測定（profilometry）結果を示す図である。

【図7A】本発明の例示的な実施形態にしたがい、例示的なヒドロゲルの、ＨｅＬａ細胞を用いた細胞適合性染色の結果を示す図である。

【図7B】本発明の例示的な実施形態にしたがい、例示的なヒドロゲルの、ＨｅＬａ細胞を用いた細胞適合性染色の結果を示す図である。

【図8A】本発明の例示的な実施形態にしたがい、例示的なヒドロゲルの、ＨｅＬａ細胞による代謝活性を示すグラフである。

【図8B】本発明の例示的な実施形態にしたがい、例示的なヒドロゲルの、ＨｅＬａ細胞をもちいた総細胞数を示すグラフである。

【図8C】本発明の例示的な実施形態にしたがい、２０℃から６０℃の範囲の温度において１時間から４時間にわたって浸漬させた場合の、例示的なヒドロゲルおよび材料からの治療用化学種の集束超音波依存性放出を示すグラフである。

【図9】本発明の例示的な実施形態にしたがい、種々の結合基を有する例示的材料および例示的構造の環状付加物により生成される、ギブス自由エネルギー反応障壁およびエンタルピー反応障壁を示す図である。

【図10】本発明の例示的な実施形態にしたがい、治療用化学種を対象者に送達する例示的な方法を示す図である。

【図11】本発明の例示的な実施形態にしたがい、治療用化学種を対象者に送達する例示的な方法を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本開示の原理および特徴の理解を容易にするために、種々の例示的実施形態を以下に説明する。本明細書に開示される実施形態の種々の要素を構成するものとして以下に説明される構成要素、工程、および材料は、例示的であって制限的なものではないことを意図する。本明細書に記載される構成要素、工程、および材料と同一または類似の機能を果たす多くの好適な構成要素、工程、および材料は、本開示の範囲内に包含されることを意図する。本明細書に記載されていないそのような他の構成要素、工程、および材料は、本明細書に開示される実施形態の開発後に開発される同様の構成要素または工程を含むが、それらに限定されるものではない。

【0046】

開示される技術の例示的な実施形態を本明細書で詳細に説明するが、他の実施形態が企図されることを理解されたい。したがって、開示される技術が、その範囲において、以下の説明に記載される構成要素の構造および配置の詳細、あるいは図面に図示される構成要素の構造および配置の詳細に限定することを意図しない。開示された技術は、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施または実施することが可能である。

【0047】

また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の参照語を含むことに留意しなければならない。「含む（comprising）」または「含有する（containing）」または「含む（including）」とは、少なくとも指定された化合物、元素、粒子、または方法工程が、組成物または成形品または方法中に存在することを意味する。しかしながら、たとえ指定された化合物、材料、粒子、方法工程と同じ機能を有するとしても、他の化合物、材料、粒子、方法工程の存在を排除するものではない。

【0048】

例示的な実施形態を説明する際、明瞭化のための専門用語を援用する。各用語は、当業者によって理解される最も広い意味を意図し、同様の目的を達成するために同様の方法で動作するすべての技術的等価物を含むことが意図される。また、方法の１つまたは複数の工程の記載は、明示的に特定された工程の間に追加の方法工程または介在する方法工程の存在を排除するものではないことを理解されたい。方法の工程は、開示された技術の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された順序とは異なる順序で実行することができる。同様に、装置またはシステムにおける１つまたは複数の構成要素についての言及は、追加的な構成要素または明示的に特定された構成要素の間に介在する構成要素の存在を排除するものではないことも理解されたい。

【0049】

本明細書で論じるように、「対象者」または「患者」の血管系は、ヒトまたは任意の動物の血管系であってもよい。動物は、哺乳類、獣医動物、家畜動物またはペット型動物などを含むがこれらに限定されない、適用可能なあらゆる種類の動物であってよいことが理解されるべきである。一例として、動物は、ヒトに類似した特定の特性を有するように特に選択された実験動物（たとえば、ラット、イヌ、ブタ、サルなど）であってもよい。対象者は、ヒトの患者であってもよい。

【0050】

本明細書で使用する場合、任意の数値または範囲に対する「約（about）」または「約（approximately）」という用語は、適切な許容範囲を示す。より具体的には、「約」または「約」は、言及された値の±２０％の値の範囲を指すことができ、たとえば、「約９０％」は、７１％～９９％の値の範囲を指すことができる。

【0051】

図１に示すように、本発明の例示的な実施形態は、図２Ａおよび図２Ｂにより明確に示されるように、対象者の骨に対する移植可能な構造であるか、または薬物送達系であり得る組成物１００の概略を提供する。

【0052】

図２Ａは、ヒドロゲル１１０と治療用化学種１２０とを含む例示的な組成物１００を提供する。ヒドロゲル１１０は結合基１３０を含むことができる。いくつかの実施形態において、結合基１３０は、図２Ａに示されるようにヒドロゲル１１０同士を結合することができる。代替的または追加的に、結合基１３０は、図２Ｂに示され、そして以下により詳細に記載されるように、ヒドロゲル１１０を治療用化学種１２０に直接的または間接的に結合することができる。結合基１３０は、ジエン１３２およびジエノフィル１３４を含むディールス・アルダー環状付加反応生成物を含むことができる。左方の概略図に示すように、対象者に送達または移植されたとき、かつ、逆行性開裂反応（すなわちレトロ・ディールス・アルダー反応）を開始するのに十分なトリガー事象１４０による刺激を受ける前に、ヒドロゲル１１０は、結合基１３０を介して治療用化学種１２０に連結され、治療用化学種１２０を封入することができる。いくつかの場合、ヒドロゲル１１０がトリガー事象１４０に暴露される際に、図２Ａの右方の概略図に示されるように、組成物１００は、治療用化学種１２０を放出するか、または治療用化学種１２０を標的に送達することができる。

【0053】

図２Ｂに目を向けると、例示的な組成物２００は、第１前駆体２３２を有する第１材料２１０ａと、第２前駆体２３４を有する第１治療用化学種１２０ａとを含む。第１前駆体２３２および第２前駆体２３４は一緒になって、ジエンおよびジエノフィルを含むディールス・アルダー環状付加反応生成物である第１結合基２３０ａを形成することができる。また、組成物２００は、第３前駆体２３６を有する第２材料２１０ｂと、第４前駆体２３８を有する第２治療用化学種１２０ｂとを含むことができる。第１前駆体２３２および第２前駆体２３４と同様に、第３前駆体２３６および第４前駆体２３８は一緒になって、ジエンおよびジエノフィルを含むディールス・アルダー環状付加反応生成物である第２結合基２３０ｂを形成することができる。概略図に示すように、第１材料２１０ａおよび第２材料２１０ｂは一緒になって、ヒドロゲルまたは他の生体適合性材料のようなポリマー構造を形成することができる。それぞれの材料２１０ａ、２１０ｂは、周知の架橋技術を用いて官能基架橋を介して連結することができる。それぞれの材料２１０ａ、２１０ｂを、それぞれの治療用化学種２２０ａ、２２０ｂと直接的または間接的に連結させることができる。それによって、対象者に送達または移植され、かつ、第１トリガー事象２４０ａおよび／または第２トリガー事象２４０ｂによる刺激の前に、組成物２００を骨などの標的組織に構造的に固定させることができる。第１トリガー事象２４０ａに暴露される際に、第１結合基２３０ａは逆行性開裂反応すなわちレトロ・ディールス・アルダー反応を起こすことができるが、第２結合基２３０ｂは連結されたままであり、標的組織に対して第１治療用化学種２２０ａのみを放出および／または送達することができる。同様に、第２トリガー事象２４０ｂに暴露される際に、第２結合基２３０ｂは逆行性開裂反応すなわちレトロ・ディールス・アルダー反応を起こし、第２治療用化学種２２０ｂを放出および／または送達することができる。いくつかの場合、第１結合基２３０ａは第２結合基２３０ｂとは実質的に異なり、第２治療用化学種２２０ｂの放出とは有意に異なるエネルギー特性（たとえば、より高いエネルギーまたはより低いエネルギー）のトリガー事象において、組成物２００から第１治療用化学種２２０ａを放出させることができる。特定の実施形態において、第１トリガー事象２４０ａおよび第２トリガー事象２４０ｂのエネルギー特性（すなわち、波形、パルス持続時間、および／またはパルス繰返し周波数の範囲）を接近させるように、第１結合基２３０ａおよび第２結合基２３０ｂを類似させることができる。

【0054】

一般に、ヒドロゲルは、親水性かつ生体適合性ポリマーの３Ｄネットワークであり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、個々のポリマー鎖の物理的架橋からスポンジ状材料を形成することができる。スポンジ状材料は、任意の形状に成形可能であり、圧縮可能であり、ペイロードを装填可能である。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル１１０が非圧縮の３Ｄネットワークにある際に、組成物１００のヒドロゲル１１０は、膨潤して大量の水または他の流体を保持する生体適合性および生分解性材料で形成することができる。代替的または追加的に、組成物２００の材料２１０を、剛性があり、ステントまたはプレートとして機能することができる生体適合性構造材料で作ることができる。

【0055】

いくつかの例において、組成物１００、２００は、１種または複数種のモノマーから形成されるポリマー材料であることができる。特定の実施形態において、ヒドロゲル１１０は、反応してゲル化する共有結合架橋を形成する官能基を有する前駆体１３２、１３４から形成することができる。一般的に、前駆体は、重合可能かつ架橋剤官能基を含み、架橋剤官能基は互いに反応して反復単位からなるポリマーを形成する。いくつかの場合、ヒドロゲル１１０は、ディールス・アルダー環状付加反応前駆体を含む前駆体１３２、１３４から構成される。特定の例では、材料２１０は、第１前駆体を有する第１のポリマーまたは材料２１０ａから構成することができ、第１前駆体１３２は、第２前駆体１３４を有する第１治療用化学種１２０ａと連結して、ディールス・アルダー環状付加反応生成物を形成する。

【0056】

種々の例において、前駆体１３２、１３４、２３２、２３４、２３６、２３８は、連鎖成長（付加）重合または工程成長（縮合）重合を含む種々の機構によって反応することができる。加えて、ヒドロゲルの連鎖成長重合および段階成長重合のための方法は、乳化重合、溶液重合、懸濁重合、光重合、開環重合、可逆的付加－フラグメント化連鎖移動重合、ディールス・アルダー環状付加重合、プラズマ重合、および沈殿重合を含むことができるが、それらに限定されるものではない。

【0057】

いくつかの実施形態において、ヒドロゲル１１０および／または材料２１０ａ、２１０ｂは、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリ（メチルビニルエーテル－alt－マレイン酸）、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリ－Ｌ－乳酸コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、およびポリ酸無水物を含むが、それらに限定されるものではない。追加的または代替的に、ヒドロゲル１１０および／または材料２１０ａ、２１０ｂは、たとえば、キトサン、キチン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、ゼラチン、アミロース、ヒアルロン酸、およびアルギン酸のような、天然に存在する多糖類を含むことができる。ヒドロゲル１１０および／または材料２１０ａ、２１０ｂの例示的な組成物を図３Ａ～図３Ｃに提供する。

【0058】

所望の粘度に基づいて、ヒドロゲル１１０および／または材料２１０ａ、２１０ｂのサイズおよび質量を変化させることができる。たとえば、約５０，０００～約１９０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するキトサンベースのヒドロゲルは、低分子量ヒドロゲルを構成することができる。特定の実施形態において、ヒドロゲル１１０および／または材料２１０ａ、２１０ｂは、約２キロダルトン（ｋＤａ）から約４００ｋＤａ以上の範囲であり得る。

【0059】

いくつかの実施形態において、組成物１００、２００の治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂは、イン・ビボでヒト患者を治療することを含む、患者の疾患または状態を治療する特定の目的または目的に有用な任意の適切な治療薬または診断薬であることができる。たとえば、いくつかの例において、治療用化学種は、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

【0060】

低分子化合物は、約１００ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有する、炭化水素系化合物、無機化合物、有機金属化合物を含む。また、低分子治療薬は、単結合を有する飽和化合物、または二重結合もしくは三重結合を有する不飽和化合物を含むことができる。また、いくつかの実施態様では、低分子は鎖状または環状であることができる。核酸は、生細胞に一般的に見出される複合有機物質を含むことができ、ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびそれらに関連する核酸（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ、（「ｍＲＮＡ」）、小干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）など）を含むが、それらに限定されるものではない。核酸は天然物であっても合成物であってもよい。同様に、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、天然物であってもよいし、合成もしくは実験室製であってもよい。いくつかの実施形態において、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂは、たとえば、ＴＮＦＲ２ ＥＣＤ、ヒト化ＩｇＧ、キメラＩｇＧ、改変インスリン、ヒトＥＰＯ、ＰＥＧヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト化Ｆａｂ、ヒトインターフェロンβ－１ａ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、Ａ型ボツリヌス毒素、フルオレセインイソチオシアネートで標識されたアルブミン（ＦＩＴＣ－アルブミン）、適切なマイクロＲＮＡ（たとえば、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－１４８ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１０３／１０７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－２１８、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、ｍｉＲ－１０ａなど）、および任意の適切なモノクローナル抗体（たとえば、および任意の適切なモノクローナル抗体（たとえば、抗ＣＤ３、マウスＩｇＧ２ａ、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、キメラＩｇＧ１ Ｆａｂ、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ２Ｒ、抗ＲＳＶ、抗ＴＮＦ、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ１１ａ、抗ＶＥＧＦ、抗ａ４インテグリン、抗ＩＬ１２／２３、抗ＩＬ６Ｒ、抗ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３、抗ＲＡＮＫ－Ｌ、抗ＢＬｙＳ、抗ＣＴＬＡ－４など）または融合タンパク質（たとえば、アフリベルセルト、リロナセプト、アレファセプト、ロミプロスチム、アバタセプト／ベラタセプト、デニロイキン－ジフチトクスなど）を含むことができる。

【0061】

特定の実施例において、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂを、組織再生の治療に使用することができる。たとえば、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂは、骨形成調節因子、軟骨形成調節因子、内皮形成調節因子、筋原性調節因子、抗癌剤、抗真菌剤、抗菌剤、または幹細胞であることができる。骨形成調節因子は、シンバスタチン、ラネル酸ストロンチウム、ｍｉＲＮＡ－２６ａ、ｍｉＲＮＡ－１４８ｂ、ｍｉＲＮＡ－２７ａ、およびｍｉＲＮＡ－４８９を含むが、それらに限定されるものではない。軟骨形成調節因子は、ｍｉＲＮＡ－９、ｍｉＲＮＡ－７９、ｍｉＲＮＡ－１４０、およびｍｉＲＮＡ－３０Ａを含むが、それらに限定されるものではない。いくつかの例示的な内皮細胞形成調節因子は、ｍｉＲＮＡ－２１０、ｍｉＲＮＡ－１９５、ｍｉＲＮＡ－１５５、ｍｉＲＮＡ－１０６ｂ、ｍｉＲＮＡ－９３、およびｍｉＲＮＡ－２５を含むが、それらに限定されるものではない。筋原性調節因子のいくつかの実施形態は、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－１、ｓｉＧＤＦ－８、ｍｉＲＮＡ－１３３、ｍｉＲＮＡ－２４、およびｍｉＲＮＡ－１６を含むが、それらに限定されるものではない。適切な抗癌剤または癌化学療法において一般的に使用される組成物は、パクリタキシル、アファチニブ、ジマレイン酸塩、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ｍｉＲＮＡ－１４８ｂ、ｍｉＲＮＡ－１３５、ｍｉＲＮＡ－１２４、ｍｉＲＮＡ－１０１、ｍｉＲＮＡ－２９ｃ、ｍｉＲＮＡ－１５ａ、およびｍｉＲＮＡ－３４を含むことができる。適切な抗真菌剤は、クロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾール、テルビナフィン、フルコナゾール、ケトコナゾール、およびアムホテリシンを含むが、それらに限定されるものではない。一般的な抗菌剤は、ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、フルオロキノロンを含む。

【0062】

また、いくつかの実施形態において、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂは、セラグノスティックス、すなわち症状または疾患を診断および治療するために使用することができる化学種を含むことができる。このようなセラグノスティックスは、蛍光剤、燐光剤、放射能、ＭＲＩ活性、あるいは、他の方法による画像化、追跡、または可視化可能な特性のような、診断特性を含むことができる。

【0063】

いくつかの実施形態において、結合基１３０は、本開示の目的と矛盾しない任意の適切な結合基であることができる。前述のように、ヒドロゲル１１０および／または材料２１０は、一緒になってディールス・アルダー環状付加反応を受けることができる２種以上の前駆体から構成することができる。したがって、前駆体１３２、１３４、２３２、２３４、２３６、２３８のいずれかは、任意の適切なディールス・アルダー環状付加反応の前駆体を含むことができる。当業者に理解されるように、ディールス・アルダー反応は、共役ジエンとジエノフィルとの共役付加反応である。本開示の特定の実施形態は、置換または非置換アルケンなどの適切なジエンを含む。いくつかの実施形態において、適切なジエンは、フラン、チオフェン、またはピロールを含むことができるが、それらに限定されるものではない。限定されることを意図するものではないが、いくつかの例示的なジエンは、１，２－プロパジエン、イソプレン、１，３－ブタジエン、２，４－オクタンジオン、１，５－シクロオクタジエン、ノルボルナジエン、２－ピロン、ジシクロペンタジエン、１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、３，５－ジメチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、１，５－ジメチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、２，４，５－トリメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、５－フェニル－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、２，５－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、３－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、５－（３，４－ジメチルフェニル）－２－メチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸、２－メチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸、フラン－２－カルボン酸、フラン－３－カルボン酸、２－（フラン－２－イル）酢酸、３－（５－メチルフラン－２－イル）プロピオン酸、５－エチルフラン－２－カルボン酸、５－イソブチル－２－メチルフラン－３－カルボン酸、４，５－ジメチルフラン－２－カルボン酸、チオフェン－２－カルボン酸、４，５－ジメチルチオフェン－２－カルボン酸、３－メチルチオフェン－２－カルボン酸、５－メチルチオフェン－２－カルボン酸、５－フェニルチオフェン－２－カルボン酸、２－（チオフェン－２－イル）酢酸、チオフェン－３－カルボン酸、２－（チオフェン－３－イル）酢酸、５－エチルチオフェン－２－カルボン酸、および５－メチル－４－フェニルチオフェン－３－カルボン酸を含むが、それらに限定されるものではない。

【0064】

いくつかの実施形態において、ジエンは、置換または非置換の、アルケンまたはアルキンのいずれかを含むことができる適切なジエノフィルとのディールス・アルダー環状付加反応を受ける。いくつかの実施形態において、適切なジエノフィルは、アクロレイン、メチルビニルケトン、アクリル酸、メチルアクリレート、アクリルアミド、アクリロニトリル、メチルアクリレート、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル、無水マレイン酸、マレロニトリル、ブテノライド、α－メチレン－γ－ブトラクトン、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－エチルマレイミド、ジメチルアセチレンジカルボキシレート、６－マレイミドヘキサン酸、２－ブテナール、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、３－マレイミド安息香酸、３－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）ヘキサン酸、４－マレイミド酪酸、４－マレイミド安息香酸、４－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）ヘキサン酸、４－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－ピロール－１－イル）－安息香酸、５－マレイミドペンタン酸、６－マレイミドヘキサン酸、６－（３－メチル－２，５－ジオキソピロール－１－イル）ヘキサン酸、６－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）－２－メチルヘキサン酸、６－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）－４－メチルヘキサン酸、７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘプタン酸、９－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）ノナン酸、１０－（２，５－ジオキソピロール－１－イル）デカン酸、１１－マレイミドウンデカン酸、１３－（２，５－ジオキソ－２、５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）トリデカン酸、Ｎ－（カルボキシヘプチル）マレイミド、Ｎ－（４－カルボキシ－３－ヒドロキシフェニル）マレイミド、α－マレイミジル－ω－カルボキシルポリ（エチレングリコール）を含むが、それらに限定されるものではない。

【0065】

追加的または代替的に、ディールス・アルダー環状付加反応生成物は、ジエノフィルと、置換または非置換の、フラン、チオフェン、またはピロールとの反応生成物であることができる。当業者が理解するように、ヒドロゲル１１０の機械的強度および反応時間は、前駆体１３２、１３４の制御、ならびにそれぞれの前駆体１３２、１３４の官能基の制御によって調節することができる。組成物１００を薬物送達系として有効にするための種々の特徴を有するヒドロゲル１１０を作製するために、前駆体１３２、１３４の混合および整合をすることができる。いくつかの実施形態において、前駆体１３２、１３４は、触媒の必要なしに、迅速に反応することができる。いくつかの実施形態において、前駆体１３２、１３４は、クリックケミストリー反応にしたがってもよい。

【0066】

当業者が理解するように、第１前駆体１３２および第２前駆体１３４は、ジエンまたはジエノフィルのいずれかであることができる。ここで、第１前駆体１３２および第２前駆体１３４は、ヒドロゲル１１０同士を連結するように機能するためにヒドロゲル内に存在するか、または２つの一方がヒドロゲル内に存在し、他方が治療用化学種を官能基化して、ディールス・アルダー環状付加反応を介して治療用化学種をヒドロゲルに連結し、最終的にレトロ・ディールス・アルダー反応により前記治療用化学種を放出することを条件とする。いくつかの実施形態において、多くの適切なジエノフィルは細胞適合性であるため、治療用化学種はジエノフィルに結合させることができる。しかしながら、治療用化学種をジエンに結合させてもよい。非限定的な例として、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（ＤＣＣ）などのカルボジイミド架橋剤を使用し、アミド結合形成を介して、ジエノフィル上のカルボン酸（－ＣＯＯＨ）を治療用化学種上のアミン（－ＮＨ_２）に結合させることができる。

【0067】

同様に、２種以上の材料２１０ａ、２１０ｂおよび／または２種以上の治療用化学種２２０ａ、２２０ｂを用い、２種以上のジエンおよびジエノフィルの組み合わせを使用して、別個のトリガー事象下でレトロ・ディールス・アルダー反応を受ける２種以上の独特なディールス・アルダー環状付加反応を起こすことができる。このように、第１前駆体２３２、第２前駆体２３４、第３前駆体２３６、および第４前駆体２３８は、独立的に前述の適切なジエンおよび／またはジエノフィルであり、結果として、２種の異なるシクロヘキセンまたは複素環式ディールス・アルダー反応生成物を形成させることができる。

【0068】

結合基１３０で架橋したヒドロゲル１１０のＦＴＩＲスペクトルを図４Ａに示す。いくつかの実施例によれば、結合基１３０をもたらす前駆体１３２、１３４との架橋の程度が結合基１３０をもたらす場合、結合基１３０によるヒドロゲル１１０の架橋の程度は、ヒドロゲル１１０のＦＴＩＲピークの強度の減少をもたらす。１つの例として、１１５３ｃｍ^－１、１０７２ｃｍ^－１、１０３３ｃｍ^－１、および８９７ｃｍ^－１付近のブロードピークは、ヒドロゲル１１０に帰すことができる。図４Ａに示すように、結合基１３０によるヒドロゲル１１０の架橋は、１６９２ｃｍ^－１付近のピークをもたらす。

【0069】

さらに、結合基１３０で架橋されたヒドロゲル１１０の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線を図４Ｂに提供する。いくつかの実施例によれば、結合基１３０で架橋されたヒドロゲル１１０は、熱流を伴う架橋の転移を経験し得る。図４Ｂに例示的に提供されるように、いくつかの実施形態において、ヒドロゲル１１０および結合基１３０の架橋は、約１０１．９℃の温度で変化を経験し得る。代替的または追加的に、異種のディールス・アルダー環状付加反応生成物または架橋の程度の変化を有するヒドロゲル１１０および結合基１３０において、材料が約１１９．７℃の温度で変化を経験する可能性がある。当業者が理解するように、ディールス・アルダー環状付加反応生成物または架橋の程度を調整することにより、治療用化学種１２０を放出させる材料の転移に関連する温度および熱流を調整することができる。

【0070】

図４Ｃ～図４Ｇに、結合基１３０を有する架橋材料２１０のＦＴＩＲスペクトルを提供する。いくつかの実施例によれば、材料２１０を調整して、前駆体２３２、２３４、２３６、および２３８との架橋の程度を変化させることができる。図４Ｃから図４ＧのＦＴＩＲスペクトルは、ジオールとしての例示的な材料２１０（それぞれにおける最上部のスペクトル）、シアネートとしての例示的な材料２１０、および第１結合基１３０ａおよび／または第２結合基１３０ｂとの材料２１０の架橋サンプルを示す。ジオールと２つの架橋材料の間では、芳香環の伸縮は、１６５０ｃｍ^－１～１５８０ｃｍ^－１に存在する。種々の結合基１３０ａ、１３０ｂにおいて、３３５０ｃｍ^－１の小さな隆起はアミドＮ－Ｈ伸縮によるものである。アルデヒド対脂肪族ケトンのＣ＝Ｏ伸縮は１７００ｃｍ^－１に見出される。いくつかの例において、Ｃ＝Ｃ結合およびＣ＝Ｏ結合の増加が１５１５ｃｍ^－１に存在し、一方で１３９５ｃｍ^－１～１３７５ｃｍ^－１は環状付加によるＣ－Ｈ変角である。１２５０ｃｍ^－１～１０２０ｃｍ^－１の小さな相違はＣ－Ｎ結合による。１１５０ｃｍ^－１の強いディールス・アルダーピークはＣ－Ｏ伸縮に起因する。

【0071】

いくつかの実施形態において、ディールス・アルダー環状付加生成物は、レトロ・ディールス・アルダー反応（すなわち逆ディールス・アルダー反応）をさらに受けることができ、ここで結合基１３０はフラグメンテーションを起こし、治療用化学種１２０の放出を開始することができる。図２Ａに示されるように、結合基１３０がレトロ・ディールス・アルダー反応を受ける際に、ヒドロゲル１１０は、制御された様式で治療用化学種１２０を放出することができる。いくつかの実施例において、レトロ・ディールス・アルダー・フラグメンテーションは、結合基１３０を再構築および再形成することが可能な結合形成と同じパターンの結合切断をもたらすことができる。図３Ａに示すように、生体適合性の６－マレイミドヘキサン酸（ジエノフィル）は、刺激後に前駆体官能基を維持しながら、フラン（Ｘ＝Ｏの場合）、チオフェン（Ｘ＝Ｓの場合）、またはピロール（Ｘ＝ＮＨの場合）と一般的な環状付加反応を起こすことができ、式中、ｎは約１０～約２２００の任意の整数であり得る。特定の例において、レトロ・ディールス・アルダー・フラグメンテーションは、刺激の結果として、ヒドロゲル１１０内に第１前駆体１３２および第２前駆体１３４とは異なる官能基をもたらすことができる。追加的または代替的に、フラグメンテーションは、ヘテロ・ディールス・アルダー・フラグメンテーションを起こして、結合の切断が、酸素、窒素、または硫黄を含む複素環を形成することを伴ってもよい。いくつかの例では、レトロ・ディールス・アルダーは不可逆であることができ、たとえばＣＯまたはＣＯ_２のような副生成物を生成および放出することができる。

【0072】

図２Ａに戻ると、いくつかの実施形態によれば、ヒドロゲル１１０、より具体的には結合基１３０は、集束超音波外部刺激の下でレトロ・ディールス・アルダー反応を起こし、治療用化学種１２０を放出することができる。一般的に、集束超音波は、非電離性の超音波を使用して、制御された調節可能な深さにおいて組織を加熱、切除、および／または空洞化する、非侵襲的技術である。一般的に、集束超音波はヒドロゲル１１０と相互作用し、ヒドロゲル１１０内に空洞または気泡を形成することができる。超音波イメージングとは異なり、集束超音波はパルス波を使用してターゲットに必要な熱的または機械的な線量をもたらす。さらに、図１に示されるように、集束超音波は、ターゲットにのみ集束すると同時に、超音波が組織の多くの層（たとえば、皮膚、軟部組織、筋肉など）を貫いて伝播することを可能にする。

【0073】

いくつかの実施形態において、集束超音波からの音響エネルギーのパルス波は、パルス繰返し周波数、パルス持続時間、ピーク圧力振幅、および衝撃係数（duty cycle）のような調節可能なパラメータを含むことができる。さらに、ヒドロゲル１１０から治療用化学種１２０を放出するため、および／または第１材料２１０ａおよび第２材料２１０ｂから治療用化学種２２０ａ、２２０ｂをそれぞれ順次的に放出するための所望の結果のために、それぞれのパラメータを調整することができる。

【0074】

いくつかの実施形態において、集束超音波刺激は、結合基１３０、２３０の逆行性開裂反応を開始させるために、パルス繰返し周波数の範囲を有し得る。たとえば、パルス繰返し周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）から約１００Ｈｚまで変化してもよい。パルス繰返し周波数は、たとえば、約０．１Ｈｚから約０．５Ｈｚまで、約０．５Ｈｚから約１Ｈｚまで、約１Ｈｚから約５Ｈｚまで、約５Ｈｚから約１０Ｈｚまで、約１０Ｈｚから約１５Ｈｚまで、約１５Ｈｚから約２０Ｈｚまで、約２０Ｈｚから約３０Ｈｚまで、約３０Ｈｚから約４０Ｈｚまで、約４０Ｈｚから約５０Ｈｚまで、約５０Ｈｚから約６０Ｈｚまで、約６０Ｈｚから約７０Ｈｚ、約７０Ｈｚから約８０Ｈｚまで、約８０Ｈｚから約９０Ｈｚまで、約９０Ｈｚから約１００Ｈｚおよびその間の任意の範囲（たとえば約２３Ｈｚから約８９．６Ｈｚまで）であってもよい。

【0075】

標的組織の深さ、大きさ、および傷害レベルに応じて、集束超音波周波数を増減させて、結合基１３０、２３０の逆行性開裂反応の程度を制御することができる。たとえば、皮膚の下１０ｍｍに位置する組成物１００、２００に本明細書に記載の方法を適用する場合、皮膚の下５０ｍｍ以上に位置する組成物１００、２００と比較して、ｆＵＳトランスデューサのパラメータが必要となる場合がある。加えて、集束超音波刺激は、約１マイクロ秒から約１０００ミリ秒の範囲のパルス持続時間を有してもよい。持続時間は、たとえば、約１マイクロ秒から約１００マイクロ秒まで、約１００マイクロ秒から約２００マイクロ秒まで、約２００マイクロ秒から約３００マイクロ秒から約４００マイクロ秒まで、約４００マイクロ秒から約５００マイクロ秒まで、約５００マイクロ秒から約６００マイクロ秒まで、約６００マイクロ秒から約７００マイクロ秒まで、約７００マイクロ秒から約８００マイクロ秒まで、約８００マイクロ秒から約９００マイクロ秒まで、約９００マイクロ秒から約１ミリ秒まで、約１ミリ秒から約１００ミリ秒まで、約１００ミリ秒から約２００ミリ秒まで、約２００ミリ秒から約３００ミリ秒まで、約３００ミリ秒から約４００ミリ秒まで、約４００ミリ秒から約５００ミリ秒まで、約５００ミリ秒から約６００ミリ秒まで、約６００ミリ秒から約７００ミリ秒、約７００ミリ秒から約８００ミリ秒まで、約８００ミリ秒から約９００ミリ秒まで、約９００ミリ秒から約１秒までであってもよい。

【0076】

いくつかの実施形態では、集束超音波刺激は、特定の持続時間および特定の周波数に対して、１サイクルから約１，０００，０００サイクルまでの範囲で変動するパルス持続時間を有することができる。パルス持続時間は、約１サイクルから約１０サイクルまで、約１０サイクルから約１００サイクルまで、約１００サイクルから約５００サイクルまで、約５００サイクルから約１，０００サイクルまで、約１，０００サイクルから約２，０００サイクルまで、約２，０００サイクルから約４，０００サイクルまで、約４，０００サイクルから約８，０００サイクルまで、約８，０００サイクルから約１６，０００サイクルまで、約１６，０００サイクルから約２０，０００サイクルまで、約２０，０００サイクルから約３０，０００サイクルまで、約３０，０００サイクルから約４０，０００サイクルまで、約４０，０００サイクルから約５０，０００サイクルまで、約５０，０００サイクルから約６０，０００サイクルまで、約６０，０００サイクルから約７０，０００サイクルまで、約７０，０００サイクルから約８０，０００サイクルまで、約８０，０００サイクルから約９０，０００サイクルまで、約９０，０００サイクルから約１００，０００サイクルまで、約１００，０００サイクルから約２００，０００サイクルまで、約２００，０００サイクルから約３００，０００サイクルまで、約３００，０００サイクルから約４００，０００サイクルまで、約４００，０００サイクルから約５００，０００サイクルまで、約５００，０００サイクルから約６００，０００サイクルまで、約６００，０００サイクルから約７００，０００サイクルまで、約７００，０００サイクルから約８００，０００サイクルまで、約８００，０００サイクルから約９００，０００サイクルまで、約９００，０００サイクルから約１，０００，０００サイクル、およびその間の任意の範囲（たとえば１，５６８サイクルから約１６０，５０４サイクルまでであってもよい。たとえば、いくつかの実施形態において、５分間にわたって１Ｈｚで繰り返される２０ｍｓのパルスは、結合基１３０の逆行性開裂反応を十分に誘導して、治療用化学種１２０を効果的に放出させることができる。

【0077】

さらに、集束超音波刺激は、約１００ｍＰａから約１Ｐａの範囲の、ピーク音響圧力に対応する振幅を有することができる。約１００ｍＶのピーク圧力は、約８ＭＰａのピーク陽圧および約６ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。同様に、約３００ｍＶのピーク圧力は、約３７ＭＰａのピーク陽圧および約１６ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。約５００ｍＶのピーク圧力は、約６９ＭＰａのピーク陽圧および約２１ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。約７００ｍＶのピーク圧力は、約１０６ＭＰａのピーク陽圧および約２８ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。いくつかの実施形態において、集束超音波は、ピーク陽圧において約４０ＭＰａ～約１００ＭＰａの最大値を有し、およびピーク陰圧において約１０ＭＰａ～約３０ＭＰａの大きさを有する、圧力振幅または強度を有することができる。

【0078】

いくつかの実施形態では、集束超音波刺激は、約３０秒から約３００秒までの範囲の治療時間を有することができる。治療時間は、たとえば、約３０秒から約４０秒まで、約４０秒から約５０秒まで、約５０秒から約６０秒まで、約６０秒から約７０秒まで、約７０秒から約８０秒まで、約８０秒から約９０秒まで、約９０秒から約１００秒まで、約１００秒から約１１０秒まで、約１１０秒から約１２０秒まで、約１２０秒から約１３０秒まで、約１３０秒から約１４０秒まで、約１４０秒から約１５０秒まで、約１５０秒から約１６０秒まで、約１６０秒から約１７０秒まで、約１７０秒から約１８０秒まで、約１８０秒から約１９０秒まで、約１９０秒から約２００秒まで、約２００秒から約２１０秒まで、約２１０秒から約２２０秒まで、約２２０秒から約２３０秒まで、約２３０秒から約２４０秒まで、約２４０秒から約２５０秒まで、約２５０秒から約２６０秒まで、約２６０秒から約２７０秒まで、約２７０秒から約２８０秒まで、約２８０秒から約２９０秒まで、約２９０秒から約３００秒、およびその間の任意の範囲（たとえば約３４秒から約２０６秒まで）であってもよい。

【0079】

ヒドロゲル１１０に使用される結合基１３０およびそれぞれの前駆体１３２、１３４、または材料２１０ａ、２１０ｂに使用される第１結合基１３０ａおよび第２結合基１３０ｂに応じて、刺激の周波数を増加または減少させて、フラグメンテーションの程度を制御することができる。さらに、集束超音波刺激は、約１マイクロ秒から約１秒までの範囲のパルス持続時間を有してもよい。パルス持続時間は、たとえば、約１マイクロ秒から約１００マイクロ秒まで、約１００マイクロ秒から約２００マイクロ秒まで、約２００マイクロ秒から約３００マイクロ秒まで、約３００マイクロ秒から約４００マイクロ秒まで、約４００マイクロ秒から約５００マイクロ秒まで、約５００マイクロ秒から約６００マイクロ秒まで、約６００マイクロ秒から約７００マイクロ秒まで、約７００マイクロ秒から約８００マイクロ秒まで、約８００マイクロ秒から約９００マイクロ秒まで、約９００マイクロ秒から約１ミリ秒まで、約１ミリ秒から約１００ミリ秒まで、約１００ミリ秒から約２００ミリ秒まで、約２００ミリ秒から約３００ミリ秒まで、約３００ミリ秒から約４００ミリ秒まで、約４００ミリ秒から約５００ミリ秒まで、約５００ミリ秒から約６００ミリ秒まで、約６００ミリ秒から約７００ミリ秒まで、約７００ミリ秒から約８００ミリ秒まで、約８００ミリ秒から約９００ミリ秒まで、約９００ミリ秒から約１秒までであってもよい。

【0080】

いくつかの実施形態では、集束超音波刺激は、特定の持続時間および特定の周波数に対して、約０．１Ｈｚから約１０００Ｈｚまでの範囲で変動するパルス繰返し周波数を有することができる。パルス繰返し周波数は、たとえば、約０．１Ｈｚから約１Ｈｚ、約１Ｈｚから約１００Ｈｚ、約１００Ｈｚから約２００Ｈｚ、約２００Ｈｚから約３００Ｈｚ、約３００Ｈｚから約４００Ｈｚ、約４００Ｈｚから約５００Ｈｚ、約５００Ｈｚから約６００Ｈｚ、約６００Ｈｚから約７００Ｈｚ、約７００Ｈｚから約８００Ｈｚ、約８００Ｈｚから約９００Ｈｚ、約９００Ｈｚから約１０００Ｈｚであってもよい。たとえば、いくつかの実施形態において、５分間にわたって１Ｈｚで繰り返される２０ｍｓのパルスは、ヒドロゲル１１０を十分にフラグメント化して、治療用化学種１２０を効果的に放出させることができる。

【0081】

加えて、集束超音波は、約１００ｍＶから約１Ｖまでの範囲のピーク電圧に対応する振幅を有することができる。約１００ｍＶのピーク圧力は、約８ＭＰａのピーク陽圧および約６ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。同様に、約３００ｍＶのピーク圧力は、約３７ＭＰａのピーク陽圧および約１６ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。約５００ｍＶのピーク圧力は、約６９ＭＰａのピーク陽圧および約２１ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。約７００ｍＶのピーク圧力は、約１０６ＭＰａのピーク陽圧および約２８ＭＰａのピーク陰圧に相関することができる。いくつかの実施形態において、集束超音波は、陽圧における約１０ＭＰａ～約３０ＭＰａの最大値および陰圧における約１５ＭＰａ～約２５ＭＰａの大きさを有する、圧力振幅または強度を有することができる。

【0082】

当業者が理解するように、結合基１３０、２３０ａ、２３０ｂ内の結合を切断するためのエネルギー障壁が架橋された前駆体に依存するため、種々の結合基１３０、２３０ａ、２３０ｂのフラグメンテーションは変化することができる。図９は、種々の結合基を有する例示的な材料について生成された例示的なギブス自由エネルギー反応障壁およびエンタルピー反応障壁を提供する。いくつかの実施形態において、フランに基づく結合基を有するレトロ・ディールス・アルダー環状付加物は、チオフェンに基づく結合基よりも高い放出速度またはより大きい分裂速度（fractionality rate）を有することができる。したがって、いくつかの実施形態において、チオフェンと比較して、フランを有する前駆体を有する結合基１３０、２３０ａ、２３０ｂの方が、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂの放出速度が大きくなってもよい。図５Ａおよび図５Ｆに示すように、蛍光強度によって測定されるように、治療用化学種の集束超音波放出は、フランを含む前駆体を有する種々の結合基についてより高いことが示された。

【0083】

いくつかの実施形態では、集束超音波は、対象内の刺激組成物１００、２００に集束する際に、組織を通過することができる。一般的に、軟部組織における超音波の減衰（振幅の減少）は、超音波の初期周波数および超音波の移動距離に依存する。たとえば、軟部組織では、超音波の周波数が高いほど減衰が大きくなる。いくつかの実施形態では、集束超音波は、より低い周波数のトランスデューサでより深くイメージングすることができる。一部の実施形態では、超音波が組織内をさらに進む際に、超音波の減衰が大きくなる。

【0084】

図６Ａに示すように、組成物からの治療用化学種の超音波媒介放出は、集束超音波と組み合わせた超音波イメージングを用いてリアルタイムで可視化することができる。さらに、治療用化学種の放出は、組成物１００、２００内の成分、または治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂ自体が、発光性（たとえば、蛍光性または燐光性）、放射性、ＭＲＩ活性、または別の方法で画像化または追跡が可能である場合、さらなる可視化が可能となる。重要なことは、集束超音波を使用することにより、周囲組織への標的外影響を制限することができることである。図６Ｂに示すように、種々のパラメータの集束超音波を５分間照射する際に、周囲組織の温度上昇が２℃以上抑制された。＋７８ＭＰａおよび－２１ＭＰａのピーク振幅を有する７００ｍＶの高強度集束超音波を照射した場合、周囲組織の初期温度は２０．２℃であり、５分後（３００秒後）の終端温度は２２．１℃（１．９℃上昇）であった。同様に、＋６８ＭＰａと－１１ＭＰａのピーク振幅を有する３００ｍＶの高強度集束超音波を照射した場合、周囲組織の初期温度は２０．８℃であり、５分（３００秒）後の終端温度は２２．３℃（１．５℃上昇）であった。

【0085】

図６Ｃは、＋７８ＭＰａおよび－２１ＭＰａのピーク振幅を有する７００ｍＶ集束超音波への暴露前後の組成物１００、２００の光学的形状測定を提供する。図示されるように、暴露前の組成物１００、２００は、滑らかで連続的な表面を有する。１０分間にわたるｆＵＳへの暴露後に、組成物１００、２００は、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂを標的に放出することができる間隙を表面に呈し始める。

【0086】

図７Ａは、細胞を組成物１００、２００に暴露した１日後、３日後、および７日後の細胞生存率および増殖分析の画像を提供する。同様に、図７Ｂは、組成物１００、２００を介して送達された少なくとも１種の治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂのトランスフェクションの画像を示す。

【0087】

組成物１００、２００の細胞適合性を図８Ａおよび図８Ｂに示す。図示されるように、７日後、ヒドロゲルまたは材料１１０、２１０単独（結合基なし）、および結合基（ＦＤＡまたはＴＤＡ）を有するヒドロゲルまたは材料は、ほぼ１００％の代謝活性相対値および１００％の細胞数相対値または生存率を示す。組成物１００、２００はいかなる細胞毒性も誘導しないように見える。

【0088】

図８Ｃは、２０℃～６０℃の範囲で変動する温度で１～４時間にわたって浸漬したヒドロゲルおよび材料の例からの集束超音波に依存した治療用化学種の放出を示すグラフである。図９は、種々の結合基と、環状付加物の例示的構造とを有する例示的な材料に関して生成されたギブス自由エネルギー反応障壁およびエンタルピー反応障壁を示す。図示されるように、４，５－ジメチル－Ｎ－（２－スルファニルエチル）－２－チオフェンカルボキサミド（ＴＤＡ－１）、ピロール－２－カルボン酸（ＰＤＡ）、２－フランメタンチオール（ＦＤＡ）、２－チオフェンメタンチオール（ＴＤＡ－２）ジエンのような例示的なディールス・アルダー結合基は、順反応（ディールス・アルダー反応生成物）およびＤＡ環状付加物結合基に基づく逆反応（レトロ・ディールス・アルダー反応）に関して、幅広い反応障壁を有することができる。

【0089】

いくつかの実施形態において、組成物１００、２００は、結合基１３０、２３０ａ、２３０ｂを切断するエネルギー障壁に特異的な刺激下で、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂを放出することができる。加えて、組成物１００、２００は、電気刺激、熱、光、磁界、または化学的刺激を含むがそれらに限定されるものではない種々の他の形態の刺激と組み合わせられる集束超音波刺激下で、レトロ・ディールス・アルダー・フラグメンテーションを受けて、治療用化学種１２０、２２０ａ、２２０ｂを放出することができる。たとえば、熱と集束超音波の組み合わせは、対象者に対する、特定の活性化温度を有する結合基を有する治療用化学種の送達を補助することができる。同様に、印加磁界と集束超音波の組み合わせは、対象者に対する、特定の磁気特性を有する結合基、またはナノ粒子、微粒子などの磁性材料に共有結合した結合基を有する治療用化学種の送達を補助することができる。

【0090】

本明細書に開示された実施形態のいずれかにおいて、治療用化学種を対象者に送達する方法１０００は、ヒドロゲルおよび治療用化学種を対象者に配置する工程１０１０を含むことができ、ヒドロゲルは、ヒドロゲルと治療用化学種とを結合する結合基を含む。方法１０００は、組成物を音響エネルギーのパルス波に暴露し、可逆的な逆行性開裂反応を開始させて結合基を酷使し、治療用化学種をヒドロゲルから分離する工程１０２０をさらに含むことができる。方法１０００は、工程１０２０の後に終了することができる。あるいは、方法１０００は、治療用化学種をヒドロゲル内に封入する工程、ヒドロゲルの第１前駆体と治療用化学種の第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を介して治療用化学種をヒドロゲルとカップリングさせる工程のような種々の工程をさらに含むことができる。

【0091】

特定の実施形態によれば、対象者において制御された組織再生を促進するための方法１１００が記載される。方法１１００は、対象者の組織に対して、第１前駆体と第２前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を含む材料を配置する工程１１１０を含むことができる。また、方法１１００は、材料を第１トリガー事象に暴露して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始させる工程１１２０を含むことができる。方法１１００は、工程１１２０の後に終了してもよい。あるいは、方法１１００は、任意選択的に、第１前駆体および第２前駆体とは異なる第３前駆体および第４前駆体とを含むディールス・アルダー反応生成物を介して、治療用化学種を材料とカップリングさせる工程１１３０をさらに含むことができる。方法１１００は、治療用化学種を第２トリガー事象に暴露して、第３前駆体と第４前駆体のレトロ・ディールス・アルダー反応を開始させて治療用化学種を分離する工程１１４０をさらに含むことができる。さらに、方法１１００は、第１トリガー事象とは異なる波形、パルス持続時間、またはパルス繰返し周波数の少なくとも１種を含むように第２トリガー事象を調整して、材料のレトロ・ディールス・アルダー反応とは異なる速度で治療用化学種を分離する工程１１５０をさらに含むことができる。

【0092】

以下の実施例は、本開示の態様をさらに説明する。しかしながら、これらは、本明細書に記載される本開示の教示または開示を決して限定するものではない。

【実施例1】

【0093】

（例１） 素材
６－マレイミドヘキサン酸（９０％）、２－フロ酸（９８％）、２－チオフェンカルボン酸（９９％）、メタノール（無水、９９．８％）、キトサン（７５－８５％脱アセチル化、５０～１９０ｋＤａ）、グルタルアルデヒド（２５％水溶液）、塩酸（ＨＣｌ、ＡＣＳ試薬、３７％）、ＦＩＴＣ－アルブミン（フルオレセインイソチオシアネート結合体）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、９８％）、プロテイナーゼＫ（トリチラチウム・アルブム由来、３０ユニット／ｍｇタンパク質以上）、メタノール－ｄ_４（Ｄ：９９．８原子％以上）、および塩化重水素溶液（３５質量％Ｄ_２Ｏ溶液、Ｄ：９９原子％以上）は、Millipore Sigma (St Louis, MO)から購入した。Tegadermは3M Health Care (St Paul, MN)から入手した。ＨｅＬａ細胞はベンシルバニア州立大学(University Park, PA)のSartorius Cell Culture Facilityから入手した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はCorning (Corning, NY)から入手した。ダルベッコ・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、Cytiva (Pittsburgh, PA)から入手した。使い捨て生検パンチ（Ｍｉｌｔｅｘ、直径４．０ｍｍ）はIntegra Life Sciences (Princeton, NJ)から入手した。組織培養プレートインサート（ポリカーボネート膜、半透明、孔径０．４μｍ）はVWR (Radnor, PA)から購入した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ 生存率／細胞毒性キット、アラマーブルーＨＳ細胞生存率試薬、Quant-iT PicoGreen dsDNA分析キット、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、抗生物質－抗真菌剤は、Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)から購入した。全ての試薬は受領したままで使用した。

【0094】

（例２） ディールス・アルダー型結合基の合成例
本明細書に開示された研究において、種々の環状付加物を使用した。フランＤＡ（ＦＤＡ）は、２－フロ酸と６－マレイミドヘキサン酸との間のディールス・アルダー反応生成物であった。チオフェンＤＡ（ＴＤＡ）は、２－チオフェンカルボン酸と６－マレイミドヘキサン酸との間の生成物であった。フラン、チオフェンまたはピロールのジエン（式Ｉ）と６－マレイミドヘキサン酸との一般的な環状付加反応を以下に示す。ＦＤＡの調製のために、１．７５ｇの６－マレイミドヘキサン酸と０．９３ｇの２－フロ酸をガラスバイアル中で１５ｍＬのメタノールに溶解させた。その後、容器を密閉し、アルミホイルで遮光し、攪拌下、室温で７日間反応を進行させた。１．７５ｇの６－マレイミドヘキサン酸と１．０６ｇの２－チオフェンカルボン酸を１５ｍＬのメタノールと組み合わせて、ＴＤＡを合成した。反応に使用したガラスバイアルを密封および遮光し、３日間にわたって油浴中で６０℃に加熱した。両環状付加物をカラムクロマトグラフィーで精製し、^１Ｈ ＮＭＲ分光法および^１３Ｃ ＮＭＲ分光法で特性評価を行った。

【0095】

【化1】

【0096】

式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨである。６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサン酸と式Ｉを反応させると、式ＩＩのディールス・アルダー結合基が生成する。

【0097】

【化2】

【0098】

（例３） キトサンヒドロゲルの調製
キトサン（０．２５ｇ）を５ｍＬの脱イオン水に溶解させ、１７μＬの１Ｍ ＨＣｌ、ＥＤＣ／ＮＨＳを添加した。１００μＬの１００μＭ溶液を加え、室温で１５分間にわたってキトサンと反応させた。直径３５ｍｍのペトリ皿にキャストする前に、たとえばＦＤＡまたはＴＤＡのようなディールス・アルダー結合基５００μＬを混合物に加えた。ヒドロゲルを終夜放置して架橋させ、特性評価前に凍結乾燥した。熱に不安定なディールス結合基を含まない対照標準のヒドロゲルは、１００μＬのグルタルアルデヒド溶液（０．１％水溶液１００μＬ）でキトサンを架橋することにより得られた。タンパク質放出試験のために、架橋前にＦＩＴＣ－アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液１００μＬ）をキトサンに添加した。いくつかの例では、キトサンを式ＩＩと混合して式ＩＩＩを形成した。

【0099】

【化3】

【0100】

【化4】

【0101】

式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨであり、ｎは１０から２２００の整数である。

【0102】

（例４） ヒドロゲルの特性評価
Bruker Avance-III-HD-500 (Bruker, Billerica, MA)を用い、２９８Ｋにおいて、架橋ヒドロゲルの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを収集した。Bruker Vertex 70を用い、４０００ｃｍ^－１から５５０ｃｍ^－１の範囲でＦＴＩＲスペクトルを記録した。ＤＳＣ Ｑ２０００熱量計(TA Instruments, New Castle, DE)を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を行った。熱特性を、１０℃／分の加熱速度で２５℃から２００℃の間で記録し、反応エンタルピーを決定した。パージガスとして窒素を使用した。

【0103】

（例５） ＰＣＬ－フランの合成
磁気撹拌バーを取り付けた１００ｍＬ丸底フラスコ中で、ＤＭＦ（２５ｍＬ）を溶媒として用い、ＰＣＬジオール（３．０ｇ、１．５ミリモル）をＭＤＩ（メチレンジフェニルジイソシアネート、０．７５ｇ、３ミリモル）と反応させた。反応は窒素雰囲気下、６０℃において、３時間にわたって行った。その後、溶液を室温まで冷却した。第２段階として、イソシアネート末端キャッププレポリマー溶液に対して、フルフリルアミン（０．１３３ｍＬ。１．５ミリモル）を滴下した。フルフリルアミンの添加から３０分後、温度を７０℃に上昇させ、１０時間にわたって保持した。室温まで冷却した後、１滴のフルフリルアミンを溶液に加えて、イソシアネートがすべて消費されたことを確認した。３０分後、溶液全体を過剰のジエチルエーテルに注加し、ＰＣＬフランを精製した。ろ過し、室温で真空乾燥した後、半乾燥物を蒸発皿に入れ、終夜にわたって３７℃で放置した。中間生成物ＰＣＬフランとして、白色粉末ポリマーが得られた。熱に不安定なディールス結合基を含まない対照標準ポリマーは、ＰＣＬシアネート（３ｇ）をイソソルビド（０．１４７ｇ、１ミリモル）で架橋して得た。分解またはタンパク質放出の研究のために、架橋前に、ＰＣＬに対して、ＦＩＴＣ－アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液５００μＬ）を添加した。いくつかの例では、ディールス・アルダー結合基で連結されたＰＣＬの形成を、式ＩＶを生成する以下の模式図に示す。

【0104】

【化5】

【0105】

（例６） 結合基を用いたＰＣＬ－フラン架橋
ビスマレイミド（ＢＭＩ）（０．３９ｇ、１ミリモル）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＭＦ（１２．５ｍＬ）に溶解したＰＣＬフラン（３ｇ）の溶液に添加した。磁気撹拌バーを２５ｍＬフラスコに入れ、水浴の温度を５０℃に設定した。ＢＭＩ添加後約５時間で溶液全体がゲルになる。ＢＭＩ添加から４時間後、ＦＩＴＣ－アルブミン（０．５ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。フラスコ内でのゲル化を避けるため、１５ｍＬの溶液を直径１００ｍｍのＰＴＦＥ製蒸発皿に注ぎ、ＰＴＦＥ製皿を５０℃の真空オーブンに終夜にわたって配置した。ＤＡ反応による架橋がさらに進行し、架橋密度の高いポリマーフィルムが得られる。一方、溶媒ＤＭＦを蒸発させ、平坦な架橋ＰＣＬ－ＦＤＡポリマーを最終生成物として得た。窒素下、６０℃で、式ＩＶをビスマレイミドと組み合わせて架橋を開始すると、以下に示す式ＶのＰＣＬ－結合基構造が形成される。

【0106】

【化6】

【0107】

ＰＣＬジオール、ＰＣＬシアネート、ＰＣＬフラン（式ＩＶ）およびＰＣＬ－ＦＤＡ（式Ｖ）のＦＴＩＲ吸収スペクトルを図４Ｃに示す。ＰＣＬフランは高濃度のＣ＝Ｏを有し、１６６５ｃｍ^－１にブロードなピークを示す。ジオールと２つの架橋サンプルの間には、１６５０ｃｍ^－１～１５８０ｃｍ^－１および１５５０ｃｍ^－１～１４００ｃｍ^－１の範囲に芳香環がある。３３５０ｃｍ^－１の小さな隆起はアミドのＮ－Ｈ伸縮である。１２５０ｃｍ^－１と１０２０ｃｍ^－１の間のよりブロードなピークの多くは、Ｃ－Ｎ結合によるものである。１３４２ｃｍ^－１～１２６６ｃｍ^－１間の伸縮は芳香族アミンに関連し、１３１０ｃｍ^－１～１２５０ｃｍ^－１は芳香族エステルに関連する（わずかに、よりブロード）。ＰＣＬジオール、ＰＣＬシアネート、チオフェンメチルおよびＰＣＬ－ＴＤＡＭのＦＴＩＲ吸光度スペクトルを図４Ｄに示す。ＰＣＬジオール、ＰＣＬシアネート、チオフェンエチルおよびＰＣＬ－ＴＤＡＥのＦＴＩＲ吸光度スペクトルを図４Ｅに示す。ＰＣＬジオール、ＰＣＬ ＣＹＡ、ＰＣＬ－ＩＳＯのＦＴＩＲ吸光度スペクトルを図４Ｆに示す。ＰＣＬ－ＦＤＡ、ＰＣＬ ＴＤＡＭ、ＴＣＬ ＴＤＡＥ、およびＰＣＬ ＩＳＯのＦＴＩＲ吸光度スペクトルを図４Ｇに示す。

【0108】

（例７） 生体適合性
１０％ウシ胎児血清と１％抗生物質－抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ＨｅＬａ細胞を培養した。５％ ＣＯ_２、温度３７℃の加湿インキュベーター内に、細胞培養フラスコを保存した。

【0109】

２４ウェルプレートに対して、ＨｅＬａ細胞を０．０５×１０^６細胞／ウェルの密度で播種した。ヒドロゲルを使い捨て生検パンチで切り出し、均一な形状と体積のサンプルを得た。ヒドロゲル試料を、組織培養プレート用インサートを用いて別個のウェルに加えた。細胞をヒドロゲルに暴露した後、第１日、第３日、第７日に細胞生存率および増殖の分析を行った（図７Ａ参照）。製造者の推奨にしたがうアラマーブルー分析を用いて、細胞の代謝活性を測定した。３７℃で３時間にわたって、１０％アラマーブルー溶液とともに細胞を培養した。その後、Molecular Devices Spectramax M5 Microplate/Cuvette Readerを用いて、５６０ｎｍ／５９０ｎｍ（励起／発光）において、各ウェルの蛍光強度を測定した。製造元のプロトコルにしたがうＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性を用いて、細胞生存率を評価した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２μＭのカルセインＡＭおよび４μＭのＥｔｈＤ－１使用液とともに３７℃で３０分間にわたって培養した。その後、細胞をOlympus IX73蛍光顕微鏡(Olympus, Center Valley, PA)で撮影した。ImageJ (NIH, Bethesda, MD)を用いて画像処理を行った。全ＤＮＡ含量を用いて細胞数を測定した。０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫをウェルに添加し、プレートを５６℃で一晩培養して細胞を溶解し、ＤＮＡ内容物を放出させた。PicoGreen dsDNA分析キットを製造者の推奨にしたがって使用し、サンプルあたりのｄｓＤＮＡ量を定量した。ウェル内容物と等体積のPicoGreen dsDNA試薬をウェル内容物と合わせ、Molecular Devices Spectramax M5 Microplate/Cuvette Readerを用いて、４８０ｎｍ／５２０ｎｍ（励起／発光）において、各ウェルの蛍光強度を測定した。

【0110】

ディールス・アルダー結合基で架橋したキトサンヒドロゲルの細胞適合性を評価するために、ＨｅＬａ細胞をヒドロゲルおよびその分解生成物に直接暴露した。代謝活性、生存率、総細胞数を１日後、３日後、７日後に測定した（図８Ａおよび図８Ｂ参照）。ヒドロゲルは、これらの直接暴露イン・ビトロ研究において、いかなる細胞毒性も誘発しなかったように見える。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ蛍光画像においては、別個の群の間に視認できる差異は見られなかった。同様に、Ｃｈ、Ｃｈ－ＦＤＡ、Ｃｈ－ＴＤＡの各群の間に、経時的な代謝活性および細胞数に関する有意差は認められなかった。これらの結果は、キトサンを強固な細胞増殖をサポートする優れた生体適合性を持つ生体材料として記載している文献と一致している。同様に、ディールス・アルダー結合基で架橋した他のヒドロゲルも細胞培養に適していると報告されている。

【0111】

（例８） 浸漬加熱
ＦＩＴＣ－アルブミンを含むヒドロゲルを、直径４ｍｍの使い捨て生検パンチを用いて切り出し、均一な形状と体積のサンプルを得た。それぞれのヒドロゲルサンプルを１ｍＬのＰＢＳとともに密封した微量遠心チューブに配置した。その後、微量遠心チューブを４０℃、６０℃、または８０℃のいずれかの温度において１時間、２時間、または６時間にわたって加熱した。４０℃および６０℃の温度には水浴を使用したが、水分の蒸発を緩和するために８０℃の温度には油浴を使用した。浸漬加熱後、サンプルを遠心分離し（１０分、１２００×ｇ）、上清の１５０μＬの３つのアリコートを、９６ウェルプレートにピペット移送した。Molecular Devices Spectramax M5 Microplate/Cuvette Readerを用いて、４９５ｎｍ／５２０ｎｍ（励起／発光）において各ウェルの蛍光強度を測定して、レトロ・ディールス・アルダー反応によって放出されたＦＩＴＣ－アルブミンの量を評価した（図５Ａ参照）。

【0112】

モデルタンパク質としてＦＩＴＣ－アルブミンを含むＦＤＡまたはＴＤＡ結合基で架橋したキトサンヒドロゲルを用いて、熱放出浸漬試験を行った。レトロ・ディールス・アルダー反応によって放出されたＦＩＴＣ－アルブミンの量は、蛍光強度測定によって決定された。同一の熱処理において、ＴＤＡ結合基に比較して、ＦＤＡ結合基においてより高いタンパク質放出速度が測定された。ジエンのスルフヒドリル基をカルボキシル基に置換した同等のディールス・アルダー結合基は、熱処理下で金属ナノ粒子からペイロードを放出する際、同程度のタンパク質放出速度を示した。実験結果は、密度汎関数理論により予測されたエネルギー障壁と相関し、フランに基づくディールス・アルダー環状付加物は、チオフェンに基づく環状付加物よりも高い放出速度を示した。

【0113】

（例９） 超音波を介したタンパク質放出
種々のディールス・アルダー・ヒドロゲルの合成と特性はこれまでに報告されているが、集束超音波刺激との相互作用、ヒドロゲルの再編成、およびその結果としての制御された薬物放出はこれまで検討されていなかった。本明細書に記載された結果は、集束超音波刺激により、ディールス・アルダー架橋ヒドロゲル中に封入されたタンパク質ペイロードの制御された放出をもたらすレトロ・ディールス・アルダー反応を駆動する能力を示すと同時に、進行中のプロセスをリアルタイムで可視化できることを示す（図６Ａ参照）。集束超音波刺激の増加は、刺激応答性制御を示すタンパク質放出速度の増加と相関した。Ｃｈ－ＦＤＡのタンパク質放出速度は、Ｃｈ－ＴＤＡで観察された速度よりも高く、熱浸漬研究の結果と一致した。これらのデータは、レトロ・ディールス・アルダー反応のエネルギー障壁がタンパク質放出速度と相関することを示しており、ジエンおよびジエノフィルの組成を操作することにより、集束超音波刺激に暴露された際のヒドロゲルの安定性を調整する手段を提供する。

【0114】

（例１０） 統計分析
GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いてデータを解析した。結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。サンプルサイズ（ｎ）は図の凡例に示した。統計解析は、Tukeyの事後試験を伴う２ウェイ分散分析（2-way ANOVA）により行った。統計的有意性をｐ＜０．０５とした。

【0115】

（例１１） ディールス・アルダー型ヒドロゲルの合成と特性評価
図３Ｃに示すように、架橋のためのアクリロイル基とジエンとの共役のためのアミノ基を含む鎖状ヘテロ二官能性ＰＥＧ誘導体（ＴＤＡ１、ＰＤＡ、ＦＤＡ、ＴＤＡ２）を用いて、ＰＥＧヒドロゲルを調製した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドとアミンの反応により、アミド結合を用いて、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－１４８ｂをジエノフィル（６－マレイミドヘキサン酸）に結合させた。ディールス・アルダー反応により、ｍｉＲ－２１０－マレイミドおよびｍｉＲ－１４８ｂ－マレイミドを、ＰＥＧ上のジエンに結合させた。迅速なゲル化のために、分子量１０ｋＤａのＰＥＧを１５％（ｗ／ｖ）で使用した。図４Ａ～図４Ｋに示すように、ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＭＳによって、反応生成物の特性決定をすることができ、ＤＳＣ－ＴＧＡ、ＦＴＩＲおよびレオロジーによって、ヒドロゲルの特性決定をすることができる。必要に応じて、マクロモノマーの濃度、分岐因子、または分子量を変更することによって、ＰＥＧ－ＤＡゲルの機械的特性を調整することができる。

【0116】

密度汎関数理論（ＤＦＴ）モデルを用いて、これら４種の別個のＤＡ環状付加結合基の順反応障壁および逆反応障壁ならびに反応エネルギーに関して、本質的な量子力学的計算を行った。図９に示すように、モデル化されたギブス自由エネルギー反応障壁およびエンタルピー反応障壁に基づいて、４，５－ジメチル－Ｎ－（２－スルファニルエチル）－２－チオフェンカルボキサミド（ＴＤＡ－１）、ピロール－２－カルボン酸（ＰＤＡ）、２－フランメタンチオール（ＦＤＡ）、２－チオフェンメタンチオール（ＴＤＡ－２）であるジエンに基づくＤＡ環状付加結合基は、有意に異なるペイロード放出速度論プロファイルを提供すると予想される。Abu-Laban M, Kumal RR, Casey J, Becca J, LaMaster D, Pacheco CN, Sykes DG, Jensen L, Haber LH, Hayes DJ, 「Comparison of thermally actuated retro-diels-alder release groups for nanoparticle based nucleic acid delivery」, J Colloid Interface Sci. 2018; 526: 312-21. Epub 2018/05/12. doi: 10.1016/j.jcis.2018.04.085. PubMed PMID: 29751265; PMCID: PMC5994202、およびArrizabalaga JH, Casey JS, Becca JC, Jensen L, Hayes DJ. 「Comparison of thermoresponsive Diels-Alder linkers for the release of payloads from magnetic nanoparticles via hysteretic heating.」 JCIS Open. 2021; 4: 100034. doi: https://doi.org/10.1016/j.jciso.2021.100034を参照されたい。

【0117】

図３Ｃに示すように、本明細書に記載の可逆的ＤＡ部位を、ｍｉＲＮＡをヒドロゲルに連結するために使用した。ディールス・アルダー結合基を用いてキトサンまたはＰＥＧのようなヒドロゲルを架橋して、治療剤放出組成物を形成することができる。図４Ａは、ヒドロゲル－ＦＤＡ（２－フランメタンチオール）およびヒドロゲル－ＴＤＡ－１（２－チオフェンメタンチオール）を提供するが、さらなる結合基が企図される。図４Ｂおよび図４Ｌは、ヒドロゲル－ＦＤＡおよびヒドロゲル－ＴＤＡ－１のＤＳＣ－ＴＧＡおよびレオロジーをそれぞれ提供し、図９に提供される計算された反応障壁と相関する熱的および機械的挙動における予測可能な差異を示す。

【0118】

（例１２） 集束超音波によるペイロード放出
図６Ａは、ディールス・アルダー架橋ヒドロゲル中に封入されたＢＳＡタンパク質ペイロードの放出を制御するｆＵＳ刺激の能力を示すと同時に、進行中のプロセスのリアルタイムの可視化を可能にすることを示す画像である。図５Ａに示すように、ｆＵＳ刺激の増加は、刺激に応答する制御を示すタンパク質放出速度の増加と相関する。密度汎関数理論（ＤＦＴ）によりモデル化された反応障壁に基づき、ＴＤＡ－１、ＰＤＡ、ＦＤＡ、およびＴＤＡ－２ディールス・アルダー環状付加体結合基は、有意に異なるペイロード放出動態を提供することができる。図７Ｂは、ＦＤＡ－キトサンおよびＴＤＡ－キトサンとともに培養したＨｅＬａ細胞が、３日後、イン・ビトロにおいて、ヒドロゲルの使用による細胞毒性を何ら経験しなかったことを示す。

【0119】

（例１３） ＡＤＳＣｓスフェロイドにおけるｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の組み合わせ送達
幹細胞の同時的な骨形成分化および内皮細胞分化を調べるために、トランスフェクションしたＡＤＳＣを３Ｄスフェロイド培養に組み込んだ。ｍｉＲ－２１０模倣物のトランスフェクションでは、未処理の対照標準と比較して、ＶＥ－カドヘリンの発現のアップレギュレーションおよび最小限のＲｕｎＸ２発現が得られた（図７Ｂ）。スフェロイドをｍｉＲ－１４８ｂ単独でトランスフェクションした場合、最小限のＶＥ－カドヘリン発現を伴い、ＲＵＮＸ２はアップレギュレートされた。ｍｉＲ－１４８ｂおよびｍｉＲ－２１０を組み合わせると、対照標準と比較して、ＲＵＮＸ２発現およびＶＥ－カドヘリン発現が増加した。トランスフェクションされたＡＳＣスフェロイドを用いたこの共分化条件は、前駆細胞が骨再生の際に生体内で遭遇する協調的分化環境を忠実に表現する。

【0120】

ディールス・アルダー架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲルによる時空間制御されたｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の送達は、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で骨形成を調節する。レトロ・ディールス・アルダー反応速度は、ｆＵＳで刺激されたときのｍｉＲＮＡ模倣物の放出速度と相関する。加えて、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の放出は、ｆＵＳのエネルギーをＤＡレトロ反応障壁に同調させることにより、順次的に制御することができる。

【0121】

図６Ａに示すように、ｆＵＳ刺激は、ディールス・アルダー架橋ヒドロゲル中に封入されたＢＳＡタンパク質ペイロードの放出を制御すると同時に、進行中のプロセスのリアルタイムの可視化を可能にする。ｆＵＳ刺激の増加は、刺激応答制御を示すタンパク質放出速度の増加と相関する（図５Ａ）。ｆＵＳ応答と、付随するヒドロゲルからのｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の放出を研究した。特に、ｆＵＳ刺激のための重要なパラメータ、ならびにイン・ビトロにおけるｍｉＲ－２１０模倣物濃度およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物濃度およびＤＡ部分組成の影響である。

【0122】

【表1】

ＰＥＧヒドロゲルのｆＵＳ反応、ならびにｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の関連する放出に対するＤＡ結合基組成の影響を、第１表に概説したように評価した。ＦＤＡ、ＰＤＡ、ＴＤＡ－１、ＴＤＡ－２結合基を用いてＰＥＧヒドロゲルを調製した。蛍光に基づく保持分析を用いて、ｆＵＳ条件の関数としてｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の放出動態を決定した。細胞増殖および生存率はＤＮＡ定量および代謝分析で評価した。

【0123】

（例１４） 集束超音波刺激
ｆＵＳ刺激のために、Sonic Concepts製高強度集束超音波トランスデューサ（６４ｍｍ、１．２ＭＨｚ、ｆ＃＝１、３．６ＭＨｚ第３高調波）を使用した。ピーク圧力振幅は、陽圧７８ＭＰａおよび陰圧２１ＭＰａまでの範囲で変動し、０．１～１００Ｈｚで反復する０．１～１００ｍｓのパルス長で印加し、総印加時間は１～５分であった。

【0124】

（例１５） ｍｉＲＮＡ模倣物の放出
ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物を、それぞれＣｙ３およびＦＡＭで標識した。図３Ｃに示すように、２００ｎＭのｍｉＲ－２１０またはｍｉＲ－１４８ｂを、それぞれのディールス・アルダーＰＥＧヒドロゲルに結合させた。Ｃｙ３標識ｍｉＲ－２１０－マレイミドまたはＦＡＭ標識ｍｉＲ－１４８ｂ－マレイミドをＰＥＧ－ジエンに結合させた。ディールス・アルダー結合したｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物について、蛍光に基づく保持アッセイを用いて、ｆＵＳ条件の関数としてのヒドロゲルからの放出動態を決定した。ｆＵＳ刺激後のゲルの質量損失を測定した。ｆＵＳ中のゲルの温度はデータロガー熱電対および近赤外線カメラで監視した。

【0125】

ｍｉＲＮＡ模倣物放出はｆＵＳエネルギー送達に比例し、最適なｆＵＳ条件は、最大５分間にわたって、１Ｈｚで送達される１０ｍｓパルスを用いる、振幅３００ｍＶ（陽圧６８ＭＰａ、陰圧５ＭＰａのピーク圧力）の範囲であると予測される。ｍｉＲ－２１０模倣物放出およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物放出は、ｆＵＳ刺激の４時間後まで、断続的かつ有意な放出が認められた。ｍｉＲＮＡ模倣物放出の動態は次のような傾向を示した：ＤＡヒドロゲルではＴＤＡ１＞ＰＤＡ＞ＦＤＡ＞ＴＤＡ２という傾向を示した。約２０ｋＰａの剪断弾性率が予想される。ヒドロゲルはイン・ビトロでＭＳＣに有意な細胞毒性を誘導しなかった。動物は、ヒドロゲルおよびｆＵＳ刺激による有意な宿主反応および副作用を経験しなかった。

【0126】

（例１６） 細胞適合性評価
トランスウェルＭＳＣ培養モデルを用いて、超音波破断ヒドロゲルの細胞適合性を評価した。標準的なプロトコルにしたがって、ＣＤ３４＋ ＥＰＣおよびＭＳＣを特性決定および培養した。トランスウェルインサート上に、４人のドナーの細胞を２０万細胞毎ｃｍ^３で播種し、ディールス・アルダーＰＥＧヒドロゲルを有するウェルに配置し、ｆＵＳ活性化し、最長４週間にわたって培養した。標準的な方法にしたがうＤＮＡ含有量、アラマーブルー分析、ＲＴ－ＰＣＲにより、増殖、生存率、幹細胞性のマーカー（ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２）を毎週評価した。

【0127】

第２表（下記）にしたがって、限定された範囲のイン・ビボ大腿骨欠損移植を実施して、基本的な薬物動態、イン・ビボ分解率、および生体適合性を決定した。ＩＡＣＵＣプロトコルＰＲＯＴＯ２８００５１６に基づきＰＳＵで確立されたこの外科手術を、標準的な方法を修正して実施した。簡単に説明すると、８～１０週齢のＳＤラット（２５０ｇ～３００ｇ）を、１００～１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン、１０～１６ｍｇ／ｋｇのキシラジンを用いて麻酔した。成体ラットの右大腿骨骨幹部に６ｍｍの臨界寸法の骨欠損を形成した。次に、あらかじめ穴を開けた高密度ポリエチレン固定プレート（４×４×２３ｍｍ）を設置して、骨安定性を維持した。コラーゲンスポンジと、２００ｎＭのＣｙ３標識ｍｉＲ－２１０模倣物および２００ｎＭのＦＡＭ標識ｍｉＲ－１４８ｂ模倣物を含むディールス・アルダー結合基を伴うＰＥＧヒドロゲル（６ｍｍ×２ｍｍの円筒形）を手術部位に挿入して欠損を充填し、近位および遠位の骨膜に縫合した。ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の濃度を合致させたコラーゲンスポンジを対照標準とした。手術部位を層状に閉鎖し、確立された術後動物看護プロトコルにしたがって動物を監視した。術後第３日、第７日、および第１４日に、半数の動物の欠損部位にｆＵＳを適用し、半数にはｆＵＳを適用しなかった（対照標準）。前述のように、ｆＵＳ刺激にはSonic Concepts製高強度集束超音波トランスデューサ（６４ｍｍ、１．２ＭＨｚ、ｆ＃＝１、３．６ＭＨｚ第３高調波）を使用した。それぞれの時点において、動物を安楽死させ、血清および組織を採取した。蛍光顕微鏡法を用いて、手術部位のＣｙ３標識ｍｉＲＮＡ模倣物分布およびＦＡＭ標識ｍｉＲＮＡ模倣物分布を試験した。ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の放出は、ｆＵＳ群および対照標準におけるゲル中の残存ｍｉＲＮＡ模倣物の蛍光を比較することにより決定した。分解は各時点で組織学的に分析した。ＰＥＧ ＥＬＩＳＡ分析（Abcam）を実施して、血清中のＰＥＧ分解産物を検出した。手術部位の炎症および体重を１日おきに観察して、生体適合性を判定した。第１４日に、組織学のために手術部位組織、肝臓、脾臓、腎臓、脳および心臓組織を摘出し、酵素マーカー、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）濃度を測定した。前述の実験に基づき、各群に４匹のラット（ｎ＝４）が必要であった。この研究には合計９６匹の動物が必要であった；３つの時点において、２群（ｆＵＳの有無）、４種のヒドロゲル組成物（ＴＤＡ－１、ＰＤＡ、ＦＤＡ、ＴＤＡ－２）、（４匹のラット×２群×４組成物×３時点）。

【0128】

【表2】

【0129】

（例１７） 分節欠損修復での骨再生における、ｆＵＳを介したヒドロゲルからのｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物放出の検討
ｍｉＲ－１４８ｂ模倣物単独の場合と比較して、ＭＳＣにおけるｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の共導入は、骨形成マーカーおよび内皮形成マーカーの発現を有意にアップレギュレートさせたが、誘導のタイミングが発現に影響した。したがって、ｆＵＳを介したシステムを用いたｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－１４８ｂの順次的に制御された導入により、内皮形成分化および骨形成分化が促進され、ｆＵＳ依存的に分節欠損の閉鎖の改善をもたらす。ギブス自由エネルギー反応障壁およびエンタルピー反応障壁に基づけば、４つのディールス・アルダー結合基は有意に異なる放出動態をもたらすであろう（図９）。

【0130】

大腿骨欠損モデルを実施して、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の制御放出と骨再生を実証した。前述の分化タイムラインを模倣するために、術後第３日、第７日、および第１４日に欠損部位にｆＵＳを適用した。血管新生および骨再生を第３週、第６週、第１２週に観察して、骨産生およびリモデリングに対する逐次投与の影響を捕捉した。

【0131】

（例１８）ＭＳＣｓの骨形成に関する、ｆＵＳを介したｍｉＲ－１４８ｂ放出のイン・ビトロ評価
第３表に概説する、第３日、第７日および第１４日に活性化されるトランスウェル培養モデルを用いるＰＥＧ－ＤＡゲルへの逐次的なｆＵＳ刺激によって、ＣＤ３４＋ ＥＰＣおよびＭＳＣの内皮形成誘導および骨形成誘導におけるｆＵＳ放出ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の活性を評価した。対照標準の未処理ｍｉＲＮＡ模倣物の活性に対してｆＵＳ放出ｍｉＲＮＡ模倣物の活性を比較することにより、これらの実験において、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物活性に対する熱化の影響を評価した。ヒドロゲルを調製し、トランスウェルＭＳＣ細胞培養を同様に実施した。ラマン分光法、ｑＰＣＲ、免疫組織化学および比色染色により、２８日間にわたって、前駆細胞の分化を毎週評価した。ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光および比色染色によって、内皮形成マーカー：ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびｖＷＦ；骨形成制御因子：ＮＯＧおよびＲＵＮＸ１；ならびに骨形成マーカー：ＡＬＰ、ＲｕｎＸ２、ＯＰ、ＯＣＮの発現を毎週評価した。イン・ビトロ骨形成の終点指標として役立つアリザリンレッド染色およびOsteoImageを用いて、石灰化を評価した。

【0132】

【表3】

【0133】

（例１９） イン・ビボでの骨再生
ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の時空間的に調節された送達が、臨界サイズの大腿骨欠損の閉鎖に及ぼす影響を評価した。２種のディールス・アルダー組成物を用いてイン・ビボ研究を行ったが、他のディールス・アルダー結合基も、試験された２種の組成物と比較して機能することが期待される。イン・ビボでの機能性および生体適合性が実証され、かつ逆反応のエネルギー障壁が最も低いディールス・アルダー結合基を、ヒドロゲルに対するｍｉＲ－２１０の結合に使用した。ｍｉＲ－１４８ｂには、許容される最も高い逆反応障壁を有するディールス・アルダー結合基を用いた。これによって、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の間のｆＵＳ放出速度の差が最も大きくなった。前述の方法にしたがって欠損を作製した。コラーゲンスポンジを欠損に圧入し、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物を含むディールス・アルダーＰＥＧヒドロゲルを、臨界サイズの大腿骨欠損に隣接して配置した。コラーゲン単独では、臨界サイズの大腿骨欠損の閉鎖は得られなかった。ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－１４８ｂ有するコラーゲンスポンジおよびｆＵＳを対照標準とした。術後第３日、第７日、第１４日に逐次的ｆＵＳ治療を行い、ｍｉＲ－２１０模倣物（第３日）およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物（第７日と第１４日）を欠損部位に局所的に放出させた。この研究には、ｆＵＳ群および無ｆＵＳ群、ならびに、コラーゲンｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物群（対照標準）が含まれた。術後第３週、第６週、および第１２週に動物を安楽死させた。ラマン分光法、組織学およびμＣＴを用いて骨形成を評価した。組織学的（アナリンブルー、ペンタクローム染色、ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｒｕｎｘ２およびＯＣＮに関する免疫染色）に組織を評価した。組織に対してオステオイメージ（Osteoimage）、およびμＣＴを行い、欠損部位近傍の組織における石灰化、骨形成、血管新生を評価した。動物全体にわたって、異所性骨化（ＨＯ）を評価した。同様に、μＣＴは、コントラストを高めるためにミコフィル（micofil）を用いて血管系のイメージングのために行われた。スキャン画像は、ランドマークベースアプローチおよび強度ベースアプローチを用いて、Avizoソフトウェアを用いて３Ｄ空間で記録した。Avizoソフトウェアを用いて、血管密度、血管の分離および相互結合性を決定した。欠損の組織サンプルを消化し、４１ターゲットのヒト骨代謝抗体アレイ（Human Bone Metabolism Antibody Array）Ｂ（Abcam）に対するライセート試験を実施した。８匹／群の群サイズにより、検出力８０％、α＝０．０１１５と仮定して、実験群／対照標準群間のμＣＴで測定された骨量の約～２０％のペアワイズ差（Δ＝２０％）を検出することができた。合計９６匹の動物を使用した（ラット８匹×２群×２組成物（実験および対照標準）×３時点）。

【0134】

イン・ビトロにおいて、ｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の逐次的送達は、前駆細胞の内皮形成マーカーおよび骨形成マーカーの発現を増加させた。イン・ビボにおけるｍｉＲ－２１０模倣物およびｍｉＲ－１４８ｂ模倣物の逐次的送達は、無ｆＵＳおよびコラーゲンゲルの対照標準コホートと比較して、欠損における脈管形成および欠損の閉鎖を改善した。無ｆＵＳ群およびコラーゲンヒドロゲル群と比較して、ｆＵＳ刺激ヒドロゲルを逐次的送達された動物では骨量が改善した。

【0135】

本明細書に開示された実施形態および特許請求の範囲は、その適用において、本明細書に記載され図面に図示された構成要素の構造および配置の詳細に限定されないことを理解されたい。むしろ、本明細書および図面は、想定される実施形態の例を提供するものである。本明細書に開示された実施形態および特許請求の範囲は、さらに、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施することが可能である。また、本明細書で採用される表現および用語は、説明のためのものであり、特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。

【0136】

したがって、当業者であれば、本出願および特許請求の範囲の基礎となる概念は、本出願に提示された実施形態および特許請求の範囲のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法、およびシステムの設計の基礎として容易に利用できることを理解するであろう。したがって、特許請求の範囲は、このような等価な構成を含むものとみなされることが重要である。

【0137】

さらに、要約書の目的は、米国特許商標庁および一般公衆、特に特許用語および法律用語に精通していない当業者が、ざっと見ただけで、本出願の技術開示の性質および本質を迅速に判断できるようにすることである。要約書は、本出願の特許請求の範囲を定義するものではなく、また、特許請求の範囲を限定するものでもない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】