特表 2024-533322 抗原及び薬物－脂質コンジュゲートの免疫調節の組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】抗原及び薬物－脂質コンジュゲートの免疫調節の組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20240905BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/59 20060101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

A61K47/54

A61K9/127

A61K9/51

A61P37/06

A61P37/08

A61P29/00 101

A61P17/00

A61P3/10

A61P29/00

A61P13/12

A61P17/06

A61P21/04

A61P1/16

A61P7/06

A61P25/00

A61K45/06

A61P43/00 121

A61K39/00 G

A61K31/573

A61K31/59

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515097

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-05-01

(86)【国際出願番号】 CA2022051340

(87)【国際公開番号】W WO2023035068

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/241,625

(32)【優先日】2021-09-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521438102

【氏名又は名称】インテグレイテッド ナノセラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＮＡＮＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ２０５， ４４７５ Ｗａｙｂｕｒｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ Ｖ５Ｇ ４Ｘ４ Ｃａｎａｄａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン、サム

(72)【発明者】

【氏名】グエン、アン

(72)【発明者】

【氏名】ザイフマン、ジョシュア

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB21

4C076BB24

4C076BB25

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4C084AA20

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4C086ZB08

4C086ZB09

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZB15

4C086ZC35

4C086ZC75

(57)【要約】

（ｉ）切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含む脂質コンジュゲート；ならびに（ｉｉ）抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数種（１つもしくは複数）の核酸を含む免疫調節の組合せ。抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖である。脂質コンジュゲートならびに抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数種（１つもしくは複数）の核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含む脂質コンジュゲート；ならびに
抗原及び／又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸であって、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖である、抗原及び／又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸
を含む、免疫調節の組合せであって、
脂質コンジュゲートならびに抗原及び／又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸は、別個の送達ビヒクル内に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクル内に共に製剤化される、免疫調節の組合せ。

【請求項2】

送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子及び／又はリポソームであり、
場合により、送達ビヒクルが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達する脂質ナノ粒子である、
請求項１に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項3】

抗原又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸が、脂質ナノ粒子又はリポソーム内に捕捉され、脂質ナノ粒子における脂質の正味電荷と反対の正味電荷を有するか、あるいは
抗原が親油性であり、脂質ナノ粒子又はリポソームの脂質区画に取り込まれるか、あるいは
抗原が親水性であり、水性コアを含むリポソームに捕捉される、
請求項２に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項4】

脂質コンジュゲートが、抗原又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸と同じ送達ビヒクル内に共に製剤化される、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せであって、脂質コンジュゲートが第１の脂質コンジュゲートであり、免疫調節の組合せが第２の脂質コンジュゲートをさらに含み、第２の脂質コンジュゲートが、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含み、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤が第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なり、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートが、別個の送達ビヒクル内に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共に製剤化され、
場合により、免疫調節の組合せが複数の脂質コンジュゲートを含み、複数の脂質コンジュゲートが３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の免疫調節剤を含み、複数の脂質コンジュゲートの各免疫調節剤が異なり、複数の脂質コンジュゲートの各脂質コンジュゲートが、免疫調節の組合せの他のコンポーネント（成分）とは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネント（成分）のうちの１つもしくは複数と共製剤化される、免疫調節の組合せ。

【請求項6】

第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤が、第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なる免疫経路を標的化する、請求項５に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項7】

第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートが、同じ送達ビヒクル内に共に製剤化される、請求項５又は６に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項8】

各免疫調節剤が、寛容原性剤又は抗炎症剤である、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項9】

各免疫調節剤が、免疫賦活剤又は免疫抑制剤である、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項10】

各免疫調節剤が、独立して、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、インフラマソーム阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、コルチコステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、カルシニューリン阻害剤、又はビタミンＤ受容体アゴニストである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項11】

各免疫調節剤が、独立して、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、フルニソリド、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、フルドロコルチゾン、フルメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、イソフルプレドン、コルチコステロン、酢酸デスオキシコルトン、エナント酸デスオキシコルトン、１１－デオキシコルチコステロン、１１－デオキシコルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、サリチラート、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、アルファカルシドール、カルシポトリオール、ファレカルシトリオール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、２２－オキサカルシトリオール、タカルシトール、エルデカルシトール、エロカルシトール、イネカルシトール、ベコカルシジオール、セオカルシトール（ｓｅｏｃａｌｃｉｔａｌ）、エルゴカルシフェロール、レキサカルシトール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、又はエチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラートである、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せであって、抗原が第１の抗原であり、免疫調節の組合せが、第２の抗原又は第２の抗原をコードする１つもしくは複数の核酸をさらに含み、第１の抗原が第２の抗原とは異なり、
第２の抗原又は第２の抗原をコードする１つもしくは複数の核酸が、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１つもしくは複数と共に製剤化され、
場合により、免疫調節の組合せが複数の抗原を含むか、又は複数の抗原をコードする１つもしくは複数の核酸を含むか、又は複数の抗原を提供するために抗原及び抗原をコードする核酸（単数又は複数）の組合せを含み、複数の抗原が３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の抗原を含み、各抗原又は抗原をコードする核酸が、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１つもしくは複数と共に製剤化される、免疫調節の組合せ。

【請求項13】

第１の抗原をコードする１種又は複数の核酸及び第２の抗原をコードする１種又は複数の核酸が、単一の核酸内に含まれ、第１の抗原及び第２の抗原が、同じ送達ビヒクル内に共に製剤化される、請求項１２に記載の免疫調節の組合せ。

【請求項14】

抗原誘発性障害もしくは望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象の処置に使用するための、又は対象を処置するための医薬の製造に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せであって、
場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、自己免疫疾患（自己抗原に対するＴ細胞及び／又は抗体応答）、アレルギー性疾患（環境又は食物抗原に対するＴ細胞及びＩｇＥ応答）、移植（ドナー組織／器官／細胞における主要及びマイナー組織適合抗原に対するＴ細胞応答）、抗薬物抗体応答（治療薬の有効性を低下させる抗体応答）、遺伝子／タンパク質補充療法（遺伝的タンパク質欠損症で治療的に補充されたタンパク質に対するＴ細胞／抗体応答）から選択され、
場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、多発性硬化症、関節リウマチ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、白斑、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎、抗ＧＢＭ腎炎／グッドパスチャー病、セリアック病、乾癬、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、視神経脊髄炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、全身性エリテマトーデスＳＬＥを含むループス、自己免疫性肝疾患、筋炎、エバンス症候群、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群、温式自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性血管性浮腫、橋本甲状腺炎、ランバート・イートン症候群、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー（カシュー、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドのうちのいずれか由来の抗原）、卵アレルギー、牛乳アレルギー、大豆アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、ゴマアレルギー、小麦アレルギー、アレルギー性気道疾患、及び環境アレルゲン（花粉、ダスト、ペットのふけ、カビ及びゴキブリ由来の抗原）によって引き起こされるアレルギーから選択される、免疫調節の組合せ。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫調節の組合せを対象に投与することを含む、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象を処置する方法であって、抗原、又は抗原をコードする１つもしくは複数の核酸、及び脂質コンジュゲートを一緒に又は逐次投与し、
場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、自己免疫疾患（自己抗原に対するＴ細胞及び／又は抗体応答）、アレルギー性疾患（環境又は食物抗原に対するＴ細胞及びＩｇＥ応答）、移植（ドナー組織／器官／細胞における主要及びマイナー組織適合抗原に対するＴ細胞応答）、抗薬物抗体応答（治療薬の有効性を低下させる抗体応答）、又は遺伝子／タンパク質補充療法（遺伝的タンパク質欠損症で治療的に補充されたタンパク質に対するＴ細胞／抗体応答）から選択され、
場合により、抗原誘発性障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、白斑、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎、抗ＧＢＭ腎炎／グッドパスチャー病、セリアック病、乾癬、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、視神経脊髄炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、全身性エリテマトーデスＳＬＥを含むループス、自己免疫性肝疾患、筋炎、エバンス症候群、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群、温式自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性血管性浮腫、橋本甲状腺炎、ランバート・イートン症候群、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー（カシュー、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドのうちのいずれか由来の抗原）、卵アレルギー、牛乳アレルギー、大豆アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、ゴマアレルギー、小麦アレルギー、アレルギー性気道疾患、又は環境アレルゲン（花粉、ダスト、ペットのふけ、カビ及びゴキブリ由来の抗原）によって引き起こされるアレルギーから選択される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、例えば、抗原誘発性障害を処置、予防及び／又は改善するための、免疫調節のための抗原及び免疫調節剤－脂質コンジュゲートの組合せ及び/又は組合せ物に関する。

【背景技術】

【0002】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は適応免疫系を指令する。ＡＰＣは、外因性（及び自己）抗原を取り込み、処理し、細胞表面上のＭＨＣ（又はＨＬＡ分子）にそれらを負荷し、それは、その後様々なクラスのＴリンパ球によって認識されて、適切な免疫応答を誘発することができる。抗原特異的Ｔ細胞を、抗原：ＭＨＣ複合体を認識するそれらのＴ細胞受容体を介して関与させる一方、ＡＰＣは、抗原が炎症促進性又は恒常性／調節シグナルの存在下で取り込まれたかどうかに応じて、これらのＴ細胞に追加のシグナルを送達する。抗原が炎症促進性シグナル（例えば、感染性病原体に由来する）の存在下で取り込まれた事象では、ＡＰＣは成熟／活性化され、多くの場合、共刺激分子の高い表面レベルを特徴とする。これらの成熟ＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞に共刺激シグナルを送達して、抗原に対する下流の体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発する。対照的に、抗原が炎症性キューの非存在下で取り込まれる場合、ＡＰＣは未成熟なままであるか、又は抗原特異的Ｔ細胞応答を弱めて抗原に対する調節性Ｔ細胞応答を誘導する共抑制分子を発現する。したがって、ＡＰＣは、抗原特異的免疫応答を指令することにおいて中心的な役割を有する。

【0003】

多くの病理学的症状は、好ましくない又は不適切な抗原特異的免疫応答に関連する。これらの免疫応答は多様であり、アレルギー性疾患から自己免疫疾患、移植による拒絶反応にまで及ぶ。既存の処置は、免疫系の全身的で非識別的な全体的抑制を引き起こし、感染及び／又はがんのリスク増加ならびに免疫抑制用薬剤の追加の有害作用を伴う。さらに、これらの処置はいずれも治癒的ではないので、有害反応をさらに悪化させ、重要なことに、疾患を完全に制御することができない処置の慢性使用を必要とする。

【0004】

特定の抗原に対する寛容を誘導するためにＡＰＣを寛容化することは、抗原誘発性障害を処置するための別のアプローチである。そのようなアプローチは、免疫抑制剤に関連する免疫系の非特異的抑制の欠点を回避し得る。しかしながら、治療的処置のためにＡＰＣを寛容化することの主な制限のうちの１つは、ＡＰＣを対象の身体から取り出し、エクスビボで寛容化する必要性、及び再移植時に関連する疾患組織／部位へのこれらのＡＰＣの制限された輸送である。

【0005】

このように、当技術分野では、例えば、抗原誘発性障害を処置、予防及び／又は改善するために、特定の抗原に対する対象の免疫応答を改変する、既知のアプローチの欠点に対処した免疫調節的処置の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、既知の先行技術のうちの１つ又は複数の制限に対処するか、又はその有用な代替策を提供しようとするものである。

【0007】

本明細書に開示の様々な実施形態は、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含む脂質コンジュゲート；ならびに抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数種（一つもしくは複数）の核酸を含む免疫調節の組合せ及び/又は組合せ物に関し、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、脂質コンジュゲートならびに抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクル内に共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは脂質ナノ粒子及び／又はリポソームである。これらの実施形態のいくつかでは、送達ビヒクルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達する脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸は、脂質ナノ粒子又はリポソーム内に捕捉され、脂質ナノ粒子における脂質の正味電荷と反対の正味電荷を有するか、あるいは抗原は親油性であり、脂質ナノ粒子又はリポソームの脂質区画に取り込まれる。他の実施形態では、抗原は親水性であり、水性コアを含むリポソームに捕捉される。

【0008】

いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化される。免疫調節の組合せは、２種又はそれを超える（例えば、２、３、又は３種を超える）の脂質コンジュゲートを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは第１の脂質コンジュゲートであり、免疫調節の組合せは第２の脂質コンジュゲートをさらに含み、第２の脂質コンジュゲートは、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含み、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤は第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なり、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートは、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される。いくつかのそのような実施形態では、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤は、第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なる免疫経路を標的化する。いくつかの実施形態では、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートは、同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【0009】

様々な実施形態では、本明細書に開示の免疫調節の組合せは、抗原誘発性障害もしくは望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象の処置に使用されてもよく、又は対象を処置するための医薬の製造に使用されてもよい。したがって、本開示は、本明細書で定義される免疫調節の組合せを対象に投与することを含む、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原特異的免疫応答を有する対象を処置する方法を提供し、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸、及び脂質コンジュゲートは、一緒に又は逐次投与される。

【0010】

本開示の別の態様によれば、脂質部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含む少なくとも１種のプロドラッグ；ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸を含むワクチン製剤が提供され、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は製剤中の同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【0011】

本開示の別の態様によれば、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含む少なくとも１種のプロドラッグを投与すること；ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸を投与することを含む、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象を処置する方法が提供され、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、送達ビヒクルに別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され、少なくとも１種のプロドラッグならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、一緒に又は逐次投与される。

【0012】

本開示の別の態様によれば、少なくとも１種の抗原及び／又は少なくとも１種の抗原をコードする核酸と組み合わせて、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象を処置するための、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含むプロドラッグの使用が提供され、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、（ｉ）少なくとも１種の製剤中の同じ送達ビヒクルに共製剤化されるか、又は（ｉｉ）対象への逐次投与もしくは共投与のために別個の送達ビヒクルに製剤化される。

【0013】

本開示の別の態様によれば、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象を処置するための、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含むプロドラッグ、ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は少なくとも１種の抗原をコードする核酸の組合せが提供され、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグ、ならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、（ｉ）送達ビヒクルに共製剤化されるか、又は（ｉｉ）対象への逐次投与もしくは共投与のために別個の送達ビヒクルに製剤化される。

【0014】

本開示のさらなる態様によれば、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含む少なくとも２種のプロドラッグを含む製剤が提供され、少なくとも２種のプロドラッグは、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は製剤中の同じ送達ビヒクルに共製剤化され、少なくとも２種のプロドラッグは、異なる免疫経路を標的化する。場合により、製剤は、少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸を含み、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖である。抗原又は抗原をコードする核酸は、１つの送達ビヒクルに２つのプロドラッグと共製剤化されるか、又はその別個の送達ビヒクルに製剤化されることを含めて、送達ビヒクルに製剤化され得る。

【0015】

本開示の前述の態様のうちのいずれか１つによれば、送達ビヒクルは脂質ナノ粒子であり得る。

【0016】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、少なくとも１種のプロドラッグは、抗原又は抗原をコードする核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化され得る。

【0017】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、２種のプロドラッグが製剤中に存在し得、別個に製剤化され得るか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され得る。

【0018】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、免疫調節剤は、寛容原性剤又は抗炎症剤であり得る。

【0019】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、免疫調節剤は、免疫賦活剤又は免疫抑制剤であり得る。

【0020】

さらに、本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、少なくとも１種のプロドラッグの免疫調節剤は、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、フルニソリド、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、フルドロコルチゾン、フルメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、イソフルプレドン、コルチコステロン、酢酸デスオキシコルトン、エナント酸デスオキシコルトン、１１－デオキシコルチコステロン、１１－デオキシコルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、サリチラート、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、アルファカルシドール、カルシポトリオール、ファレカルシトリオール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、２２－オキサカルシトリオール、タカルシトール、エルデカルシトール、エロカルシトール、イネカルシトール、ベコカルシジオール、セオカルシトール、エルゴカルシフェロール、レキサカルシトール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、エチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラート、又はそれらの組合せから選択され得る。

【0021】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、２種又はそれを超える抗原及び／又は抗原をコードする核酸が製剤中に存在し得、別個に製剤化され得るか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され得る。

【0022】

本開示の前述の態様又は実施形態のうちのいずれか１つによれば、抗原は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であり得る。

【0023】

本開示の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図から当業者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】図１Ａは、ＤｉＯ（３，３’－ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩）で標識された脂質ナノ粒子（５４／４５／１ｍｏｌ：ｍｏｌのＬＮＰ、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）の投与の４８時間後に、フローサイトメトリーによって、ＡＰＣマーカー、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃについて評価したマウスの膵臓リンパ節からのゲートプロット（生細胞に対してゲート）を示す。マウスは、６００ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注射されるＬＮＰを、２４時間空けて２回の注射を受けた。

【0025】

【図1B】図１Ｂは、ＤｉＯで標識されたＬＮＰを注射したマウスの膵臓リンパ節におけるＤｉＯ陽性ＡＰＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞に対してゲート）の計数を示す。

【0026】

【図1C】図１Ｃは、ＤｉＯで標識された脂質ナノ粒子（５４／４５／１ｍｏｌ：ｍｏｌのＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）の投与の４８時間後に、フローサイトメトリーによって、ＡＰＣマーカー、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃについて評価したマウスの膵島からのゲートプロット（生細胞に対してゲート）を示す。

【0027】

【図1D】図１Ｄは、ＤｉＯで標識されたＬＮＰを注射したマウスの膵島におけるＤｉＯ陽性ＡＰＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞に対してゲート）の計数を示す。

【0028】

【図2A】図２Ａは、ＰＢＳ対照、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ＬＮＰ（５４／４５／１ｍｏｌ：ｍｏｌのＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）又はイオン化可能なＬＮＰ（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ：ｍｏｌのＡ００２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）を注射したマウス由来の膵島マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）におけるＤｉＯ陽性細胞の計数を示す。マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのＤｉＯを負荷したＬＮＰ製剤を注射し、２４時間後、膵島、膵臓リンパ節及び脾細胞を単離した。

【0029】

【図2B】図２Ｂは、ＤＳＰＣ／コレステロールＬＮＰ（水平のハッチング）及びイオン化可能なＬＮＰ－（対角のハッチング）を注射したマウス由来の、膵島、膵臓リンパ節及び脾臓におけるＤｉＯ陽性ＡＰＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞）のパーセンテージを示す棒グラフである。

【0030】

【図3】図３は、ヒト血漿（ｈＰｌａｓｍａ）中での２時間のインキュベーション後の、デキサメタゾン（Ｄ０４５）及びカルシトリオール（Ｄ０５３、Ｄ０６８、Ｄ０８３）脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を用いて共製剤化されたＬＮＰ（４９／４０／１０／１ｍｏｌ：ｍｏｌのＤＳＰＣ／コレステロール／プロドラッグ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）中に残存する脂質コンジュゲート（プロドラッグ）のパーセンテージを示す棒グラフである。

【0031】

【図4】図４は、ａＬＮＰ脂質コンジュゲート（プロドラッグ）処理後の、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）の表面上に共刺激分子を有する骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）のパーセンテージを示す棒グラフである。ＬＮＰを、示したように、Ｄ０３４もしくはＤ０４５デキサメタゾン脂質コンジュゲート（プロドラッグ）ならびに／又はＤ０５３及びＤ０８３カルシトリオール脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を用いて製剤化した。ＢＭＤＣを４８時間処理し、ＬＮＰは様々なカルシトリオール及びデキサメタゾン脂質コンジュゲート（単独又は組合せ）を含んだ。その後、脂質コンジュゲート（プロドラッグ）製剤がＬＰＳ媒介性活性化を防止できる（すなわち、ＢＭＤＣを寛容する）かどうかを判定するために、ＢＭＤＣをリポ多糖（ＬＰＳ）刺激を用いて２４時間チャレンジした。ＢＭＤＣの共刺激マーカーを、ＣＤ８０－ＣＤ８６－（縦線）、ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ｄｉｍ（横線）及びＣＤ８０＋ＣＤ８６＋（斜め線）として特徴付けた。処理を、ＬＰＳのみ（対照）及びＬＰＳなし（非処理）で処理したＢＭＤＣと比較して示す。

【0032】

【図5】図５は、混合白血球（ＭＬＲ）反応アッセイで示したように、１０～９９％のモル％でのデキサメタゾン（ＩＮＴ－Ｄ０３４及びＩＮＴ－Ｄ０４５）及びカルシトリオール（ＩＮＴ－Ｄ０５３及びＩＮＴ－Ｄ０８３）のプロドラッグの様々なＬＮＰ製剤について、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖パーセンテージを示す棒グラフである。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、最初に様々なモル％のデキサメタゾン又はカルシトリオールコンジュゲートを含むＬＮＰで４８時間処理し、次いでＬＰＳとの２４時間のインキュベーションによって活性化した。次いで、それらを採取し、Ｂａｌｂ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞と５：１又は１０：１のＴ対ＢＭＤＣ比で混合した。処理を、ＬＰＳあり及び空のＬＮＰ（対照）、ＬＰＳあり及びＬＮＰなし（＋ＬＰＳ－ＬＮＰ）、ならびにＬＰＳなしＬＮＰなし（非処理）で処理したＢＭＤＣと比較して示す。

【0033】

【図6】図６は、デキサメタゾン（Ｄ０３４、Ｄ０４５）及びカルシトリオール（Ｄ０８３）脂質コンジュゲート（プロドラッグ）ならびにこれらのプロドラッグの組合せを用いて製剤化された様々な脂質コンジュゲート（プロドラッグ）ＬＮＰについて、Ｔ細胞の増殖パーセンテージを示す棒グラフである。Ｃ５７Ｂｌ／６ ＢＭＤＣを、単一の脂質コンジュゲート（プロドラッグ）又は脂質コンジュゲートの組合せ（プロドラッグ）を含むＬＮＰ（ＤＳＰＣ又はＤＭＰＣ、コレステロール、プロドラッグ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ（４９／４０／１０／１のモル比）で４８時間処理し、その後洗浄し、Ｂａｌｂ／ｃ ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。脂質濃度はすべての処理に対して３０μＭであった。データを、３連でのＣＤ４＋細胞における（ＣＦＳＥ希釈による）増殖％の平均値＋ＳＤとして表す。

【0034】

【図7】図７は、ＬＮＰに共製剤化された異なる比のデキサメタゾン（Ｄ０４５）及びカルシトリオール（Ｄ０８３）脂質コンジュゲート（プロドラッグ）の関数としてのＴ細胞の増殖を示す棒グラフである。ＬＮＰにおけるデキサメタゾン（Ｄ０４５）及びカルシトリオール（Ｄ０８３）脂質コンジュゲート（プロドラッグ）の異なる比は、Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼす。Ｃ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣを、様々なモル比のＤ０４５及びＤ０８３を含むＬＮＰで４８時間処理し、その後洗浄し、Ｂａｌｂ／ｃ ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。脂質濃度はすべての処理に対して３０ｕＭであった。データを、３連でのＣＤ４＋細胞における（ＣＦＳＥ希釈による）増殖％の平均値＋ＳＤとして表す。

【0035】

【図8】図８は、凡例に示された濃度のカルシトリオール（Ｄ０５３）を含む脂質コンジュゲートを用いて製剤化されたＬＮＰ、非処理又は対照ＬＮＰ（Ｃｔｒ ＬＮＰ）で前処理したＢＭＤＣと混合した後の、ＯＴ－ＩＩマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞増殖を示す棒グラフである。ＬＮＰ前処理後、ＢＭＤＣを、様々な濃度の遊離オボアルブミン３２３－３３９ペプチド（ＯＶＡ）を用いてパルスし、ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。データを、３連でのＣＤ４＋細胞における（ＣＦＳＥ希釈による）増殖％の平均値＋ＳＤとして表す。

【0036】

【図9】図９は、ＯＶＡあり／なし、対照ＬＮＰ、ＯＶＡを封入したＬＮＰ、又はカルシトリオール及びＯＶＡを用いて共製剤化されたＬＮＰ（Ｄ０５３－ＬＮＰ－ＯＶＡ）で処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣと混合した後の、ＯＴ－ＩＩマウスから回収したＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞増殖を示す棒グラフである。データを、３連でのＣＤ４＋細胞における（ＣＦＳＥ希釈による）増殖％の平均値＋ＳＤとして表す。

【0037】

【図10A】図１０Ａは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10B】図１０Ｂは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10C】図１０Ｃは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10D】図１０Ｄは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10E】図１０Ｅは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10F】図１０Ｆは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10G】図１０Ｇは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10H】図１０Ｈは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10I】図１０Ｉは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10J】図１０Ｊは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10K】図１０Ｋは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10L】図１０Ｌは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【図10M】図１０Ｍは、例示的な免疫調節剤－脂質コンジュゲートの構造を示す。

【0038】

【図11】図１１は、Ｏｖａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウス由来）と、Ｏｖａ ｍＲＮＡ及び脂質コンジュゲートを別個に負荷したＬＮＰで前処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣとの共培養における抗原特異的Ｔ細胞の増殖の棒グラフである。エラーバーは平均値±ＳＤを表す。

【0039】

【図12】図１２は、Ｏｖａ抗原をコードするｍＲＮＡ及び本発明の脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を共負荷した様々なＬＮＰで前処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣとの共培養後の、ＣＦＳＥで標識されたＯｖａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩマウス由来）の増殖を示す一連の棒グラフである。データを、ＣＤ４＋細胞のパーセントとしてのマーカー陽性細胞の平均値±ＳＤとして示す（Ｙ軸）。

【0040】

【図13A】図１３Ａは、Ｏｖａ抗原をコードするｍＲＮＡ及び本発明の脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を共負荷したＬＮＰで前処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣと共培養した、ＣＦＳＥで標識されたＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清で測定されたサイトカインを示す棒グラフのセットである。データを、ＣＤ４＋細胞のパーセントとしてのマーカー陽性細胞の平均値±ＳＤとして示す（Ｙ軸）。

【図13B】図１３Ｂは、Ｏｖａ抗原をコードするｍＲＮＡ及び本発明の脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を共負荷したＬＮＰで前処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣと共培養した、ＣＦＳＥで標識されたＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清で測定されたサイトカインを示す棒グラフのセットである。データを、ＣＤ４＋細胞のパーセントとしてのマーカー陽性細胞の平均値±ＳＤとして示す（Ｙ軸）。

【0041】

【図14】図１４は、Ｏｖａ ｍＲＮＡを有するＬＮＰと対比して、脂質コンジュゲートＤ０３４をさらに負荷したＬＮＰの注射に対して応答したマウスにおける抗体産生を示す棒グラフである。エラーバーは±ＳＤを表し、統計解析はテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより行い、＊Ｐ＜０．５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、２回の独立した実験からの群あたりｎ≧７匹のマウス。

【発明を実施するための形態】

【0042】

免疫調節の組合せ（あるいは、ワクチン製剤と称される）、その使用及びその方法が本明細書で提供される。免疫調節の組合せは、（ｉ）親油性部分に連結された免疫調節剤を含み、送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソームなど）に製剤化される脂質コンジュゲート、及び（ｉｉ）送達ビヒクルに製剤化される、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含む。脂質コンジュゲートならびに抗原及び／又はそれをコードする核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化され得るか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され得る。

【0043】

いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、インビトロアッセイ又はインビボアッセイのいずれかによって実証されるように、ＡＰＣによって取り込まれる。例示するためであり、限定するものではないが、本開示は、本明細書に開示の免疫調節の組合せが骨髄系細胞（例えば、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ））において寛容化表現型を誘導することができることを示す。さらに、これらの寛容化ＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を抑制し、抗原特異的制御性Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカイン分泌を減少させ、抗原特異的抗体産生を減少させることができる。

【0044】

定義

【0045】

「ワクチン製剤」は、対象における抗原誘発性障害を処置、予防及び／又は改善するための、本明細書に記載されているような１種又は複数の同じ又は異なる送達ビヒクルを含むあらゆる医薬製剤を指す。用語は、あらゆる好適な薬学的に許容され得る塩及び／又は賦形剤で調製される製剤を含む。

【0046】

「免疫調節剤」は、対象において免疫応答を変化させることができる薬剤を指す。１つの非限定的な実施形態では、免疫調節物質は、対象において免疫応答を増強する免疫賦活剤である。別の非限定的な実施形態では、免疫調節物質は、対象において免疫応答を妨害又は低減する免疫抑制剤である。免疫調節物質は、骨髄系細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球及び顆粒球）又はリンパ系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及びそれらのあらゆるさらなる分化した細胞を調節することができる。

【0047】

「寛容原性剤」は、免疫応答を抑制するか、又は抗原に対する寛容を誘導する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、寛容原性剤は、抗原に対する免疫応答の抑制を向上、及び／又は抗原に対する寛容の誘導を向上する。例えば、寛容原性剤は、ＡＰＣによる抗原の寛容原性の提示を促進することができる。

【0048】

「抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答」は、抗原特異的免疫刺激、例えば、抗原提示細胞による抗原に対する免疫系の刺激に関連する対象の症状を指す。そのような障害としては、免疫系のあらゆる望まない刺激が挙げられ、限定されないが、アレルギー、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、抗薬物抗体応答などが挙げられる。

【0049】

「抗原」は、当技術分野における通常の意味を有し、特定の抗体又はＴ細胞受容体に結合して免疫系を改変することができる分子又は分子複合体を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、外来の又は非外来のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖である。いくつかの実施形態では、抗原は抗原誘発性障害を誘導する。

【0050】

「送達ビヒクル」は、免疫調節剤－脂質コンジュゲート（例えば、プロドラッグ）を製剤化することができるあらゆる好適な粒子を指す。非限定的な例としては、脂質ナノ粒子、リポソームなどが挙げられる。

【0051】

脂質コンジュゲート（例えば、プロドラッグ）の一部として免疫調節剤に連結された部分又はイオン化可能なもしくは永久的に荷電した脂質の親油性部分に関する「親油性部分」としては、限定されないが、免疫調節剤、プロドラッグ又は脂質に十分な疎水性を付与して、好適な送達ビヒクルへのその製剤化を容易にする、脂質又は他の親油性基が挙げられる。

【0052】

「足場部分」は、その１つ又は複数の炭化水素鎖、１つ又は複数のそれぞれの生分解性基を介して連結されている、脂質コンジュゲート、プロドラッグ、又はイオン化可能なもしくは永久的に荷電した脂質の親油性部分の炭化水素鎖を指す。

【0053】

本明細書で使用される「プロドラッグ」、「脂質プロドラッグ」、「免疫調節剤－脂質コンジュゲート」、「脂質コンジュゲート」、「薬物－脂質コンジュゲート」又は「プロドラッグコンジュゲート」は、共有結合及び非共有結合を含むあらゆる好適な連結又はリンカーを介して親油性部分に連結された免疫調節剤を指す。いくつかの実施形態では、連結又はリンカーは、共有結合的に付着している。免疫調節剤は、親油性部分からの放出時に活性化されてもよい。

【0054】

脂質コンジュゲート

【0055】

脂質コンジュゲートは、親油性部分に連結された免疫調節剤を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、免疫応答を抑制するか、又は抗原に対する寛容を誘導する寛容原性剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は免疫賦活剤である。

【0057】

免疫調節剤は、上流及び下流の免疫経路の様々な分子を標的化することによって、対象においてそれらの免疫調節効果を発揮する。上流は薬剤によって直接的に改変される標的であり、下流は免疫調節剤が炎症を阻害する重要な経路である。これらの薬剤の多くは、同じ下流の経路で収束／重複する。上流の標的としては、限定されないが、グルココルチコイド受容体、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＣＯＸ１／ＣＯＸ２（ＡＳＡによるような直接的なアセチル化又はサリチラートによるような発現の阻害による）、ビタミンＤ受容体、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２、及びカルシニューリンが挙げられる。下流の標的としては、限定されないが、ＮＦ－カッパＢ複合体の発現／活性の阻害、ＡＰ－１の発現／活性の阻害、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の阻害、及びＮＦＡＴファミリーの阻害が挙げられる。

【0058】

脂質コンジュゲートに含めるための免疫調節剤の例としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、インフラマソーム阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、コルチコステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、カルシニューリン阻害剤、及び／又はビタミンＤ受容体アゴニストが挙げられる。いくつかの実施形態では、各免疫調節剤は、ＮＳＡＩＤ、インフラマソーム阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、コルチコステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、ＤＭＡＲＤ、カルシニューリン阻害剤、又はビタミンＤ受容体アゴニストから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各免疫調節剤は、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、サリチラート、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、アルファカルシドール、カルシポトリオール、ファレカルシトリオール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、２２－オキサカルシトリオール、タカルシトール、エルデカルシトール、エロカルシトール、イネカルシトール、ベコカルシジオール、セオカルシトール、エルゴカルシフェロール、レキサカルシトール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、又はエチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラートから独立して選択される。

【0059】

一実施形態では、免疫調節剤は、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、ミコフェノール酸、シロリムス及び／又はタクロリムスから選択される。

【0060】

別の実施形態では、免疫調節剤は、ＪＡＫ阻害剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、ＮＳＡＩＤ、インフラマソーム阻害剤及び／又はビタミンＤ受容体アゴニストである。

【0061】

例えば、ＪＡＫ阻害剤は、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ及び／又はアブロシチニブから選択され得る。

【0062】

ＤＭＡＲＤは、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン及び／又はスルファサラジンから選択され得る。

【0063】

脂質コンジュゲートに取り込まれ得るＮＳＡＩＤの例としては、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン及び／又はリコフェロンが挙げられる。

【0064】

脂質コンジュゲートへの取込みのためのインフラマソーム阻害剤としては、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４及び／又はエチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラートが挙げられる。

【0065】

ビタミンＤ受容体アゴニストの例としては、カルシトリオール、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、アルファカルシドール、カルシポトリオール、ファレカルシトリオール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、２２－オキサカルシトリオール、タカルシトール、エルデカルシトール、エロカルシトール、イネカルシトール、ベコカルシジオール、セオカルシトール、エルゴカルシフェロール及び／又はレキサカルシトールが挙げられる。

【0066】

脂質コンジュゲートの親油性部分は、好適な送達ビヒクルでその製剤化を容易にするのに十分な疎水性を免疫調節剤に付与する。好適な脂質部分の例としては、共同所有及び同時係属中のＷＯ２０２０／１９１４７７（ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／００００３９；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。

【0067】

免疫調節剤を含む２種又はそれを超える脂質コンジュゲートは、同じ又は別個の送達ビヒクルに製剤化され得る。そのような実施形態では、２種又はそれを超える免疫調節剤は、２種（又はそれを超える）の薬剤が相加的又は相乗的であるモル比で同じ送達ビヒクル内に安定に保持されるように製剤化され得る。例えば、２、３、４、又は４種を超える脂質コンジュゲート（例えば、２、３、４、又は４種を超えるプロドラッグ）は、一緒に又は別個の送達ビヒクルに製剤化され得る。いくつかの実施形態では、免疫調節の組合せは複数の脂質コンジュゲートを含み、複数の脂質コンジュゲートは３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０種を超える免疫調節剤を含み、複数の脂質コンジュゲートの各免疫調節剤は異なり、複数の脂質コンジュゲートの各脂質コンジュゲートは、免疫調節の組合せの他のコンポーネント（成分）とは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネント（成分）のうちの１種又は複数と共製剤化される。２種又はそれを超える免疫調節剤間の相加的又は相乗的な効果は、当業者に公知のＣｈｏｕ Ｔａｌａｌａｙ法を含むいずれかの好適な技法によって求められ得る。いくつかの実施形態では、２種の脂質コンジュゲート（例えば、２種のプロドラッグ）は、同じ送達ビヒクルに共製剤化される。本明細書の脂質コンジュゲートは、高い封入効率、例えば、最大９０％以上の封入効率で送達ビヒクルへの製剤化に特に適している。

【0068】

いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは第１の脂質コンジュゲートであり、免疫調節の組合せは第２の脂質コンジュゲートをさらに含み、第２の脂質コンジュゲートは、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含み、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤は第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なり、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートは、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される。いくつかの実施形態では、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤は、第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なる免疫経路を標的化する。いくつかの実施形態では、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートは、同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【0069】

なおさらなる実施形態では、免疫調節の組合せは、第３の脂質コンジュゲートをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の脂質コンジュゲートの免疫調節剤は、第１及び／又は第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なる免疫経路を標的化する。なおさらなる実施形態では、免疫調節の組合せは、４種を超える脂質コンジュゲートをさらに含む。

【0070】

免疫調節剤は、有機合成によって生成されるものを含む、脂肪酸、グリセリド、リン脂質又は他の疎水性部分などの脂質部分と共有結合的に又は非共有結合的に連結され得る。親油性部分の免疫調節剤への連結は、典型的には、免疫調節剤の疎水性を増加させる。

【0071】

脂質コンジュゲートのＬｏｇＰは、免疫調節剤に所望の程度の疎水性を付与するのに十分であり得る。一実施形態では、脂質コンジュゲートの予測ＬｏｇＰは、５～３０の間、６～２８の間又は７～２５の間である。

【0072】

いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、親油性部分に共有結合的に連結されている。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結されている。

【0073】

免疫調節剤は、親油性部分に連結されている場合に生物活性であってもよく、又は対象への投与後に親油性部分から切断されると生物活性であってもよい。これに関して、脂質コンジュゲートは、脂質コンジュゲートを対象に投与すると切断可能な１つ又は複数の生分解性基を含み得る。

【0074】

生分解性基は、エステル、アミド、アミジン、ヒドラゾン、ジスルフィド、エーテル、カルボナート、カルバマート、チオノカルバマート、グアニジン、グアニン、オキシム、イソ尿素、アシルスルホンアミド、ホスホルアミド、ホスホンアミド、ホスホロアミダート、ホスファート、ホスホナート、ホスホジエステル、ホスファートホスホノオキシメチルエーテル、Ｎ－マンニッヒ付加物、Ｎ－アシルオキシアルキルアミン、スルホンアミド、イミン、アゾ；アルカン、アルケンもしくはアルキンを含む炭素ベースの官能基；メチレン（ＣＨ_２）又は尿素から選択される１種又は複数の官能基を含む連結から独立して選択され得る。

【0075】

一実施形態では、親油性部分は、例えば、５～３０個の炭素原子、１４～２０個の炭素原子又は１６～１８個の炭素原子を有する前駆体脂肪酸又は他の親油性分子に由来し得る。

【0076】

別の実施形態では、親油性部分は、最大３、４、５又は６つの生分解性基を有する直鎖又は分枝の親油性鎖である。一実施形態では、生分解性基のうちの少なくとも１つは、エステル、アミド、アミジン、ヒドラゾン、ジスルフィド、エーテル、カルボナート、カルバマート、チオノカルバマート及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つから選択される。一実施形態では、生分解性基は、インビボでエステラーゼによって切断可能なエステルである。

【0077】

ある特定の実施形態では、脂質コンジュゲートは、免疫調節剤にコンジュゲートされた直鎖又は分枝の親油性部分を含む送達ビヒクルに製剤化され、親油性部分は、以下の式Ｉの構造を有する：

【化1】

（式中、Ｌは、Ｌ１＋Ｌ２＋Ｌ３＋Ｌ４＋Ｌ５＋Ｌ６で表され、Ｌは、２～１００個、２～７５個、２～８０個、３～６０個、４～５０個、５～４５個又は５～４０個の炭素原子及び０～６個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を含み；
Ｌ１は、０～４０個、１～４０個、１～３５個、又は３～３０個の炭素原子を有する炭素鎖であり、場合により、Ｌ１は、１個又は複数のシスもしくはトランスＣ＝Ｃ二重結合又は０～２個のシスもしくはトランスＣ＝Ｃ二重結合を有し；
Ｌ２及びＬ４は炭素原子であり；
Ｌ３は、０～２０個の炭素原子であり、０～２個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を含み；
Ｌ５は、０～２０個の炭素原子であり、０～２個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を含み；
Ｌ６は－ＣＨ_３、＝ＣＨ_２又はＨであり；
各Ｒは、独立して、０～３０個の炭素原子及び０～３個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合、場合により、０～２個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する直鎖又は分枝の炭化水素鎖であり、ここで、Ｒのうちの１つ又は複数が分枝している場合、各分枝点は、場合により、Ｘ２官能基を含むか、又は炭素原子であり；
ｎは０～８であり、ｐは０～８であり、ｎ＋ｐは０であるか、又は≧１又は１～８、２～６又は２～４であり；
存在する場合、各Ｘ２は、独立して、エステル、アミド、アミジン、ヒドラゾン、エーテル、カルボナート、カルバマート、チオノカルバマート、グアニジン、グアニン、オキシム、イソ尿素、アシルスルホンアミド、ホスホルアミド、ホスホンアミド、ホスホロアミダート、ホスファート、ホスホナート、ホスホジエステル、ホスファートホスホノオキシメチルエーテル、Ｎ－マンニッヒ付加物、Ｎ－アシルオキシアルキルアミン、スルホンアミド、イミン、アゾ；アルカン、アルケンもしくはアルキンを含む炭素ベースの官能基；メチレン（ＣＨ_２）又は尿素であるか；
あるいはＸ２は、少なくとも１個の水素結合を含む連結である）。

【0078】

一実施形態では、脂質コンジュゲートは足場部分を含む。一実施形態における足場部分は、上記の式ＩのＬで表され、少なくとも１つのＲは炭化水素側鎖として存在し、ｎ＋ｐは、１又は１～８又は１～７又は１～６又は１～５又は１～４又は１～３である。

【0079】

いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは、場合により、式Ｉの構造を有する１つの親油性部分を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは、２つの親油性部分を含み、各親油性部分は、同じであっても異なっていてもよい式Ｉの構造を独立して有し、各親油性部分は、別個の連結もしくはリンカーを介して免疫調節剤に連結されているか、又は同じ連結もしくはリンカーに連結されている。ある特定の実施形態では、各連結はエステルである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートは、２つを超える親油性部分を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、式Ｉの各親油性部分は、以下によって独立して定義される：Ｌ１は、３～３０個の炭素原子、及び０～３個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する炭素鎖であり、
ｎは０であり、
Ｌ３は存在せず、
ｐは１であり、
Ｘ２は、カルボナート又はエステルであり（場合により

【化2】

）、
Ｒは、１～２０個の炭素原子及び０～３個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する直鎖又は分枝の炭素鎖であり、
Ｌ５は、１～１０個の炭素原子を有する炭素鎖であり、０～１個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を含み、
Ｌ６は－ＣＨ_３である；
又はＬは、５～２０個の炭素原子及び０個のＣ＝Ｃ二重結合を有する炭素鎖である。

【0081】

いくつかの実施形態では、式Ｉの各親油性部分は、以下によって独立して定義される：Ｌ１は、５～２０個の炭素原子（場合により、８～１５個の炭素原子）、及び１又は２個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合（場合により、１個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合）を有する炭素鎖であり、場合により、Ｌ１は－Ｃ_６－９－Ｃ＝Ｃ－Ｃ－であり、
ｎは０であり、
Ｌ３は存在せず、
ｐは１であり、
Ｘ２は、カルボナート又はエステルであり（場合により

【化3】

）、
Ｒは、１～２０個の炭素原子及び０～２個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する直鎖又は分枝の炭素鎖（場合により、Ｒは、－Ｃ_１－６又はＣ_５－８－Ｃ＝Ｃ－Ｃ－Ｃ＝Ｃ－Ｃ_４－６である）であり、
Ｌ５は、１～１０個の炭素原子を有する炭素鎖であり、０～１個のシス又はトランスＣ＝Ｃ二重結合（場合により、０個のＣ＝Ｃ二重結合）を含み、
Ｌ６は－ＣＨ_３である；
又はＬは、５～１５個の炭素原子及び０個のＣ＝Ｃ二重結合を有する炭素鎖である。

【0082】

Ｌ１は、共有結合的連結によって又は水素結合を介して、Ｘ１連結を介して免疫調節剤に連結され得る。

【0083】

いくつかの実施形態では、Ｘ１連結は生分解性であり、これは、対象への投与後に切断され得ることを意味する。限定するものではないが、エステル結合は、患者への投与後にエステラーゼによって加水分解され、それによって免疫調節剤を親油性部分から放出することができる。しかしながら、他のＸ１連結は、疾患部位での環境に曝露されたときのそれらの放出特性に基づいて、調整された薬物放出のために利用され得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、Ｘ１は、エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼによって切断可能であるか、又は還元環境及び／又は高もしくは低ｐＨに曝露されると切断可能であり得る。

【0085】

ある特定の実施形態におけるＸ１の化学的連結は、最も有利にはリンカーである。多種多様な化学リンカーが当業者に公知であり、本明細書に記載のある特定の実施形態で用いられ得る。リンカーは、０～１２個の炭素原子及び少なくとも１つの切断可能な官能基を有し得る。一実施形態では、リンカーは、少なくとも２つの官能基、リンカーの一端を免疫調節剤にコンジュゲートするための第１の官能基及びリンカーの他端を式ＩのＬ上の炭素原子にコンジュゲートするための第２の官能基を有する。２つの官能基は、エステル、アミド、アミジン、ヒドラゾン、エーテル、カルボナート、カルバマート、チオノカルバマート、グアニジン、グアニン、オキシム、イソ尿素、アシルスルホンアミド、ホスホルアミド、ホスホンアミド、ホスホロアミダート、ホスファート、ホスホナート、ホスホジエステル、ホスファートホスホノオキシメチルエーテル、Ｎ－マンニッヒ付加物、Ｎ－アシルオキシアルキルアミン、スルホンアミド、イミン、アゾ；アルカン、アルケン又はアルキンなどの炭素ベースの官能基；メチレン（ＣＨ_２）又は尿素からそれぞれ独立して選択され得る。

【0086】

リンカーは、生分解性基の導入によって免疫調節剤の増強された放出を提供し得る。１個又は複数のエステル結合を有するリンカーは、患者への投与後にエステラーゼによって加水分解され、それによって免疫調節剤を脂質コンジュゲートから放出することができ得る。免疫調節剤及びＬの間の直接反応から生じる連結と同様に、免疫調節剤及び親油性部分の間にヒドラゾン結合を導入するリンカーは、免疫調節剤に脂質コンジュゲートからのｐＨ感受性放出を付与することができる。

【0087】

しかしながら、前述のことは単なる例示的なものであることが理解されよう。リンカーの追加の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１４９，７９４号に提供されている。米国特許第５，１４９，７９４号に記載されているリンカーの非限定的な例としては、アミノヘキサン酸、ポリグリシン、ポリアミド、ポリエチレン、及び１～１２個の炭素原子長である炭素骨格を有する短い官能化ポリマーが挙げられる。

【0088】

本明細書に記載の脂質コンジュゲートでの使用に適したリンカーのなおさらなる例は、以下の参考文献に提供されている：

【0089】

前述の参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態では、Ｘ１の化学的連結は、官能基及び別個のリンカーの両方を含む。リンカー及び官能基の様々な組合せが、脂質コンジュゲートに取り込まれ得る。

【0090】

一実施形態では、リンカーの一端をＬ１にコンジュゲートする少なくとも第２の官能基は、エステル又はアミド連結である。別の実施形態では、リンカーの官能基は、エステラーゼなどの酵素によって加水分解され得る。さらなる実施形態では、リンカーの両方の官能基はエステル連結である。

【0091】

いくつかの例示的な脂質コンジュゲートを、図１０Ａ～図１０Ｍに示す。本明細書に開示の免疫調節の組合せで使用するための、これら及び他の脂質コンジュゲートの製造は当技術分野で公知であり、以前に記載されている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０２０／１９１４７７を参照されたい。いくつかの脂質コンジュゲートの合成手順を例に記載する。

【0092】

簡潔には、免疫調節剤を、足場Ｌの反応性基又はリンカー基へのコンジュゲーションによって脂質部分に付着させて、化学的連結Ｘ１を形成することができる。一実施形態では、免疫調節剤は、親油性部分（例えば、式Ｉ）又はリンカーとコンジュゲーションすると、ヒドロキシル基又は水素原子を失い、脂質コンジュゲートを形成する。免疫調節剤は、当業者に公知のもの中でもとりわけ、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＰＯ_３Ｈ_２などの１種又は複数の反応性官能基を含む化学構造に由来し得、原子の配向に限定されない。

【0093】

例えば、脂質コンジュゲートは、免疫調節剤の（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ基及び前駆体足場Ｐのヒドロキシル基の間のコンジュゲーションによって（直接的に又は１種又は複数の中間体を介して）形成され得る。一般的な反応を、目的の分子（例えば、免疫調節剤）について以下に示す：

【化4】

【0094】

上記の例示的な実施形態では、Ｘ１の化学的連結はエステルであり、以下の構造を有する：

【化5】

。

【0095】

別の例示的な例では、免疫調節剤は、リンカーのカルボキシル基（（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ）と反応するヒドロキシル基（－ＯＨ）を有し得る。リンカーの第２のカルボキシル基（（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ）は、縮合反応を介して前駆体足場Ｐの炭素原子上のヒドロキシル基と反応し得る。以下の反応は、リンカーとしてのコハク酸の使用を示す。そのようなリンカーの使用は、以下の反応による２つのエステル基を有する脂質コンジュゲートをもたらす：

【化6】

【0096】

上記の非限定的な例では、Ｘ１の化学的連結は以下の構造を有する：

【化7】

。

【0097】

上記の反応は２段階で進行してもよいことを理解されたい。すなわち、免疫調節剤を最初にリンカーにコンジュゲートし、結果として得られた薬物－リンカーコンジュゲートをその後前駆体足場Ｐと反応させて、脂質コンジュゲート（プロドラッグ）反応生成物を生成することができる。

【0098】

前述のものは、コハク酸を使用して脂質コンジュゲートを生成することができること以外には、様々な異なるリンカーとしての単に例示目的のために提供されている。

【0099】

別の例では、免疫調節剤又はリンカーは、Ｌのアミン基とのコンジュゲーションのためのカルボキシル基（（Ｃ＝Ｏ）Ｏ）を有し、免疫調節剤及びＬの間にアミド又はアミド含有連結Ｘ１を形成し得る。以下に考察するように、Ｘ１の化学的連結を生成するための、薬物又はリンカーの官能基及び足場Ｌの間の他の反応は、当業者によって想定され得る。

【0100】

ある特定の免疫調節剤は、前駆体足場Ｐへの連結のための１つを超える反応性官能基を含み得る。そのような実施形態では、当業者によって理解され得るように、薬物－脂質コンジュゲートの合成中に保護基を用いて、薬物の所与の基を足場Ｌに選択的にコンジュゲートし、別の基を非コンジュゲートのままにすることができる。

【0101】

抗原又は抗原をコードする核酸（単数又は複数）

【0102】

いくつかの実施形態では、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖である。ある特定の実施形態では、抗原は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。抗原は、本明細書の送達ビヒクルに、そのフラグメント又は誘導体を含むがこれに限定されない、望ましくない免疫応答を誘発することが公知のものと同じ形態で製剤化され得る。抗原は、自己（ａｕｔｏ）もしくは「自己（ｓｅｌｆ）」と称される対象の体内に由来してもよく、又は外来もしくは「非自己」と称される外部環境に由来してもよい。

【0103】

抗原としては、アレルゲン、スーパー抗原、寛容原、Ｔ依存性抗原、Ｔ非依存性抗原又は免疫優性抗原が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、抗原はその供給源によって特徴付けられ、外因性抗原、内因性抗原、自己抗原又はネオ抗原を含む。

【0104】

抗原は、単一のエピトープを有し得るか、又は１個を超えるエピトープ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、又は１００個を超えるエピトープ）を含み得る。

【0105】

いくつかの実施形態では、抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示され、本明細書に記載の送達ビヒクルを使用して免疫系のＴ細胞を活性化することができる。

【0106】

いくつかの実施形態では、抗原は、アレルギー反応、自己免疫疾患、器官又は組織の拒絶反応、移植片対宿主病、抗薬物抗体又は遺伝子／タンパク質補充療法に関連する抗原である。これらの障害のうちの１種又は複数は、炎症性障害とも称され得る。抗原が炎症反応に関連する場合、抗原としては、記載されるようなアレルゲンである非自己抗原、又は望まない免疫応答を誘発する自己もしくは非自己抗原が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0107】

抗原がアレルギー反応に関連する場合、抗原としては、動物性物質又は陸生もしくは水性動物からの食物を含む動物源、植物花粉又はグルテンなどの植物源、薬物、食物、昆虫の針、カビ胞子などの真菌源、金属、ラテックスなどに由来する非自己抗原（アレルゲンとも称される）が挙げられ得るが、これらに限定さない。

【0108】

アレルギーの非限定的な例としては、アレルギー性喘息、枯草熱、蕁麻疹、湿疹、植物アレルギー、虫刺されアレルギー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、カビアレルギー、化粧品アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎又はコリザ、トピックアレルギー反応、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、過敏性反応及び他のアレルギー症状が挙げられる。食物アレルギーの非限定的な例としては、乳アレルギー、卵アレルギー、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、大豆アレルギー及びグルテンアレルギーが挙げられる。

【0109】

炎症性疾患の例としては、アルツハイマー病、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、嚢胞性線維症、皮膚炎、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、エリテマトーデス、筋ジストロフィー、腎炎、例えば、糸球体腎炎パーキンソン病、帯状疱疹及び潰瘍性大腸炎、心血管疾患、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、慢性胆嚢炎、結核、敗血症、サルコイドーシス、珪肺症及び他の塵肺症、ブドウ膜炎、精巣炎、卵巣炎、膵炎、胃炎、リウマチ熱が挙げられる。

【0110】

自己免疫疾患としては、関節リウマチ、多発性硬化症、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、原発性胆汁性胆管炎、免疫媒介性又はＩ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、例えば橋本甲状腺炎及び原発性粘液水腫、円形脱毛症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、セリアック病、シェーグレン症候群、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、視神経脊髄炎重症筋無力症、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、抗糸球体基底膜疾患、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、白斑、自己免疫性血管炎及び皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

抗原はまた、器官又は組織の拒絶反応に関連する症状を処置、予防及び／又は改善するために使用され得る。そのような抗原としては、同種異系細胞に由来するもの、例えば、同種異系細胞の抽出物由来の抗原及び内皮細胞抗原などの他の細胞由来の抗原が挙げられる。

【0112】

さらなる実施形態では、抗原を使用して、移植可能な移植片に関連する望まない症状を処置、予防及び／又は改善することができる。そのような抗原は、移植可能な移植片のレシピエントにおける望ましくない免疫応答に関連する。いくつかの実施形態では、移植抗原としては、器官又は組織の拒絶反応又は移植片対宿主病に関連するものが挙げられる。そのような抗原はまた、生物学的材料の細胞から、又は移植可能な移植片に関する情報から得られ得るか、又はそれに由来し得る。移植抗原には、一般に、細胞に含まれる又は発現されるものが含まれる。移植可能な移植片に関する情報としては、配列情報、抗原のタイプもしくはクラス及び／又はそれらのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、又はＢ細胞提示の制約が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗原を産生するために使用される情報としては、移植可能な移植片のタイプ（例えば、自家移植片、同種異系移植片、異種移植片）、移植片の分子及び細胞組成、移植片が由来するか移植片が移植される身体位置（例えば、器官全体又は部分、皮膚、骨、神経、腱、ニューロン、血管、脂肪、角膜など）が挙げられる。

【0113】

ある特定の実施形態によれば、抗原は、抗原性タンパク質、ペプチド、ポリペプチド又はそれらのフラグメントの発現が直接的又は間接的に可能な核酸によってコードされる。抗原は、ＤＮＡ又はＲＮＡ及びそれらのハイブリッドを含むがこれらに限定されない核酸配列によってコードされ得る。ＤＮＡには、抗原を発現することができるあらゆるベクターが含まれる。ＲＮＡは、今度は、抗原タンパク質、ペプチド、ポリペプチド又はそれらのフラグメントをコードするｍＲＮＡ又は自己増幅するＲＮＡをコードしてもよい。

【0114】

抗原をコードするＤＮＡは、典型的には環状（例えば、プラスミド、ミニサークル又はナノプラスミド）であるが、本明細書のある特定の実施形態では線状ＤＮＡも企図される。いくつかの実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは自律的に複製する。自律的に複製するＤＮＡは、宿主細胞において機能的な複製起点又は自律複製配列（ＡＲＳ）を有する。別の実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、公知の技法を使用して対象の宿主細胞のゲノムに挿入されることによって複製し得る。

【0115】

抗原をコードするＤＮＡは、プロモーター配列及び終結領域などの調節領域をコードし得る。抗原をコードするＤＮＡは、適切な微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））にクローニングされ、次いで、インビトロ又はインビボでの発現のために本明細書に開示の送達ビヒクルに製剤化され得る。ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子配列を含み得るが、投与のための製剤にレポーター遺伝子配列を含めることは任意である。そのような配列は、動物モデルでの研究のためにＤＮＡに取り込まれ得る。

【0116】

抗原をコードするＤＮＡは、一本鎖、二本鎖であってもよく、又はいくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡに相補的）、リボザイム及び三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。長期間の活性を有するために、いくつかの実施形態における一本鎖核酸は、安定な非ホスホジエステル連結で置換されたいくつかの又はすべてのヌクレオチド連結を有し得る。

【0117】

抗原をコードするＤＮＡは、１つ又は複数の糖部分及び／又はピリミジンもしくはプリン塩基のうちの１つ又は複数において改変がなされた核酸を含み得る。さらなる実施形態では、ＤＮＡベクターは、ペプチド、タンパク質、ステロイド又は糖部分で改変され得る。そのような改変は、目的の標的部位への送達を容易にし得る。

【0118】

免疫調節の組合せに使用される核酸は、天然供給源から単離することができ、ＡＴＣＣ又はＧｅｎＢａｎｋライブラリーなどの供給源から得ることができ、又は合成方法によって調製することができる。合成核酸は、様々な溶液又は固相法によって調製され得る。一般に、固相合成が好ましい。ホスファイト－トリエステル、ホスホトリエステル、及びＨ－ホスホナート化学による核酸の固相合成の手順の詳細な説明は、広く利用可能である。

【0119】

一実施形態では、ＤＮＡベクターは二本鎖ＤＮＡであり、７００を超える塩基対、８００を超える塩基対、又は９００を超える塩基対、又は１０００を超える塩基対を含む。

【0120】

前で考察されたように、核酸は、抗原をコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又は自己増幅するＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、天然供給源から精製され、組換え発現系を使用して産生され、場合により精製され得るか、又は化学的に合成され得る。ある特定の実施形態では、抗原をコードするＲＮＡは、改変ＲＮＡ及び非改変ＲＮＡの両方を包含する。

【0121】

ＲＮＡが化学的に合成されるそれらの実施形態では、ＲＮＡは、化学的に改変された塩基もしくは糖、及び／又は骨格の改変を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、シュードウリジン、５－メトキシウリジン、及び５－メチルシチジン）；化学的に改変された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）；インターカレートされた塩基；改変された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／又は改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオアート及び５’－Ｎ－ホスホロアミダイト連結）であるか、又はそれを含む。

【0122】

抗原をコードするＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成され得る。例えば、ある特定の実施形態におけるＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝液系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、ならびに／又はＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、直鎖又は環状ＤＮＡ鋳型を用いて行われる。

【0123】

いくつかの実施形態では、インビトロで合成された抗原をコードするＲＮＡを、製剤化及び封入する前に精製して、ＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素及び他の試薬を含む好ましくない不純物を除去することができる。

【0124】

一実施形態では、ＲＮＡは、１つ又は複数のコード及び非コード領域を含む。

【0125】

ＲＮＡは様々な長さであり得る。いくつかの実施形態では、本開示を使用して、長さが約０．１～２０ｋｂ、１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、又は約８～１５ｋｂの範囲のインビトロで合成されたＲＮＡを製剤化することができる。いくつかの抗原は、８～１２アミノ酸長ほどの小さいものであり得る。

【0126】

典型的には、ＲＮＡ合成は、５’末端に「キャップ」を、３’末端に「テール」を付加することを含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見出されるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。

【0127】

いくつかの実施形態では、抗原をコードするＲＮＡは５’及び／又は３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ＲＮＡの安定性又は翻訳に影響を及ぼす１種又は複数のエレメント、例えば鉄応答性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長の間であり得る。

【0128】

いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内のある位置におけるＲＮＡの安定性に影響を及ぼすタンパク質に対する結合部位、又はＲＮＡに対する１つもしくは複数の結合部位のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、約５０～５００又はそれを超えるヌクレオチド長の間であり得る。

【0129】

ある特定の実施形態では、インビトロでの転写反応から提供されるＲＮＡが望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、及び／又は動物から産生されるＲＮＡなどの他のＲＮＡ供給源が企図される。

【0130】

ＲＮＡ配列はレポーター遺伝子配列を含み得るが、投与のための医薬製剤にレポーター遺伝子配列を含めることは任意である。そのような配列は、動物モデルのインビボ研究のためにＲＮＡに取り込まれて、生体内分布を評価することができる。

【0131】

いくつかの実施形態では、免疫調節の組合せは、単一抗原又は単一抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含む。他の実施形態では、免疫調節の組合せは、単一抗原又は１種を超える抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含む。免疫調節の組合せは、抗原（単数又は複数単数又は複数）及び抗原（単数又は複数単数又は複数）をコードする核酸（単数又は複数単数又は複数）の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、１種を超える抗原は２種の抗原を含む。ある特定の実施形態では、１種を超える抗原は２種を超える抗原を含む。

【0132】

ある特定の実施形態では、免疫調節の組合せは、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含む。これらの実施形態のいくつかでは、抗原は第１の抗原であり、免疫調節の組合せは、第２の抗原又は第２の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸をさらに含み、第１の抗原は第２の抗原とは異なり、第２の抗原又は第２の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸は、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１種もしくは複数と共製剤化される。ある特定の実施形態では、第１の抗原をコードする１種又は複数の核酸及び第２の抗原をコードする１種又は複数の核酸は、単一の核酸内に含まれ、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【0133】

ある特定の実施形態では、免疫調節の組合せは、複数の抗原を含むか、又は複数の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含むか、又は複数の抗原を提供するために抗原及び抗原をコードする核酸（単数又は複数単数又は複数）の組合せを含む。各抗原又は抗原をコードする核酸は、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１種もしくは複数と共製剤化される。各抗原は、１個又は１個を超えるエピトープを含み得る。代替の実施形態では、複数の抗原は、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０種を超える抗原を含む。

【0134】

送達ビヒクル

【0135】

様々な送達ビヒクルを使用して、免疫調節の組合せ（あるいは「ワクチン製剤」と称される）を調製することができる。これらとしては、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むナノ粒子、リポソーム、脂質を含むポリマーナノ粒子、ポリマーベースのナノ粒子、エマルジョン、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0136】

本開示の脂質コンジュゲートは、脂質又は他の疎水性コンポーネントを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、又はポリマーベースの系）への取込みに特に適している。ある特定の実施形態における脂質コンジュゲートの脂質様特性は、これら又は他の送達ビヒクルへのその負荷を容易にし得る。例えば、いくつかの実施形態では、所与のナノ粒子への負荷効率は、７５％～１００％、８０％～１００％、又は最も有利には９０％～１００％である。いくつかの実施形態では、送達ビヒクル（単数又は複数単数又は複数）はリポソーム及び／又は脂質ナノ粒子である。

【0137】

一実施形態では、脂質コンジュゲート及び抗原又はそれをコードする核酸は、小胞を形成する脂質、及び場合によりステロールを含む脂質製剤コンポーネントと混合することによって、脂質ナノ粒子又はリポソームに負荷される。結果として、カーゴを取り込む脂質ナノ粒子及び／又はリポソームを、押出、エタノール注入及びインライン混合を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の多種多様なよく記載された製剤方法論を使用して調製することができる。そのような方法は、Ｍａｃｌａｃｈｌａｎ，Ｉ．及びＰ．Ｃｕｌｌｉｓ、「Ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ－ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”、Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２００５．５３ＰＡ：１５７～１８８；Ｊｅｆｆｓ，Ｌ．Ｂ．ら、「Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ，Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ、２００５．２２（３）：３６２～７２；及びＬｅｕｎｇ，Ａ．Ｋ．ら、“Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍｉｘｉｎｇ Ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｎｓｅ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｃｏｒｅ”、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃ，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２０１２、１１６（３４）：１８４４０～１８４５０に記載されており、それらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0138】

リポソームは、リン脂質二重層によって囲まれた内部の水溶液を含むが、脂質ナノ粒子は、代替的に親油性コアを含み得る。そのような親油性コアは、脂質コンジュゲート（例えば、プロドラッグ）及び／又は抗原もしくはそれをコードする核酸のためのリザーバとして機能することができる。固体及び液体の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の脂質コンジュゲート（単数又は複数）及び／又は抗原（単数又は複数）もしくはそれをコードする核酸（単数又は複数）の送達のために使用され得る。

【0139】

一実施形態では、リン脂質二重層を含むリポソーム又は脂質ナノ粒子が提供され、脂質コンジュゲートは、二重層内で疎水性油相を形成する。そのような送達ビヒクルは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１９１４７７（ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／００００３９）に記載されている。別の実施形態では、送達ビヒクルはリポソームである。

【0140】

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の送達ビヒクルは脂質ナノ粒子であり、場合により、少なくとも１種の脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子の脂質区画に取り込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の送達ビヒクルはリポソームであり、場合により、少なくとも１種の脂質コンジュゲートは、リポソームの脂質二重層の油相内に取り込まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の抗原又は少なくとも抗原をコードする１種もしくは複数の核酸は、脂質ナノ粒子又はリポソーム内に捕捉され、脂質ナノ粒子中の脂質の正味電荷とは反対の正味電荷を有する。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の抗原は親油性であり、脂質ナノ粒子又はリポソームの脂質区画に取り込まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の抗原は親水性であり、水性コアを含むリポソームに捕捉される。

【0141】

送達ビヒクルはまた、界面活性剤によって安定化された脂質コアを含むナノ粒子（例えば、リポソーム又はＬＮＰ）であり得る。小胞を形成する脂質は、安定剤として利用され得る。別の実施形態では、送達ビヒクルは、安定化脂質によって囲まれたポリマーナノ粒子コアを含むポリマー－脂質ハイブリッド系である。

【0142】

あるいは、ナノ粒子は、脂質を含まないポリマーから調製されてもよい。そのようなナノ粒子は、ポリマーシェルによって囲まれた薬物の濃縮コアを含んでもよく、又はポリマーマトリックス全体に分散した固体又は液体を有してもよい。

【0143】

本明細書に記載の脂質コンジュゲート及び／又は抗原もしくはそれをコードする核酸はまた、油滴又は油コアを含む薬物送達ビヒクルであるエマルジョンに取り込まれ得る。エマルジョンは脂質安定化され得る。例えば、エマルジョンは、脂質の単層又は二重層などの乳化コンポーネントによって安定化された油で満たされたコアを含み得る。

【0144】

ミセルは、疎水性コア中に存在する薬剤の送達に利用される、両親媒性脂質又はポリマーコンポーネントで構成される自己集合性粒子である。薬物を、本明細書に記載されているような足場分子Ｌへ及び疎水性基Ｒとコンジュゲートすることにより、ミセルへの薬物負荷を向上することができる。

【0145】

本明細書の脂質コンジュゲートを封入するために使用され得る、当業者に公知の薬物送達ビヒクルのさらなるクラスはカーボンナノチューブである。

【0146】

前述の送達ビヒクルの調製及び脂質がコンジュゲートされた免疫調節剤のその中への取込みのための様々な方法が利用可能であり、当業者によって容易に実施され得る。

【0147】

本開示で包含されるある特定の脂質コンジュゲートは、担体不含系の一部を形成し得る。そのような実施形態では、脂質コンジュゲートは、粒子に自己集合することができる。限定するものではないが、免疫調節剤が親水性である場合、両親媒性プロドラッグは、安定剤を用いて又は用いずにナノ粒子に集合することができる。

【0148】

ＬＮＰは、高圧押出、エタノール注入、マイクロ流体混合及びインライン混合を含む多種多様なよく記載された製剤方法論を使用して作製され得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲート（プロドラッグ）及び／又は抗原もしくはそれをコードする核酸を含む薬物送達ビヒクルの多分散性指数（ＰｄＩ）は、０．４０、０．３５、０．３０、０．２５、０．２０又は０．１５未満である。

【0150】

本明細書に記載の脂質コンジュゲートは、薬物送達ビヒクルの高い封入効率に特に適している。一実施形態では、脂質コンジュゲート（プロドラッグ）の封入効率は、１０～９９％、１５～９９％、２０～９９％又は２５～９９％である。

【0151】

脂質コンジュゲート（単数又は複数）を含む送達ビヒクルは、抗原（単数又は複数）もしくはそれをコードする核酸（単数又は複数）と共製剤化されてもよく、又は脂質コンジュゲート（単数又は複数）及び抗原（単数又は複数）もしくは核酸（単数又は複数）は、別個の送達ビヒクルに製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲート（単数又は複数）は、抗原（単数又は複数）又は抗原（単数又は複数）をコードする１種もしくは複数の核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化される。

【0152】

抗原又はそれをコードする核酸は、イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質を含む脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルに製剤化され得る。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である抗原が脂質ナノ粒子に封入される場合、イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質は、生理学的ｐＨ及び温度での抗原の電荷に応じて、カチオン性又はアニオン性であり得る。荷電した脂質は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有のＷＯ２０２１／０２６６４７；出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／０５１０９８に記載されているように、足場及び生分解性基によってそれに連結された１つ又は複数の炭化水素側鎖を含む親油性部分を含み得る。

【0153】

荷電した抗原（例えば、タンパク質、ペプチド及び／又は核酸）は、イオン性相互作用を使用してリポソーム又はＬＮＰ内に捕捉され得る。抗原がアニオン性である場合、カチオン性脂質を使用することができ、逆もまた同様である。核酸が送達ビヒクルに製剤化される場合、イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質は、典型的には、生理学的ｐＨで正に荷電している。同様に、抗原が荷電している場合、イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質は、典型的には、脂質ナノ粒子でのその製剤化を容易にするために、抗原の電荷とは反対の電荷を有する。例えば、抗原が、荷電したペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である場合、イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質は、典型的には、生理学的ｐＨで反対の正味電荷を有し得る。

【0154】

親油性又は疎水性抗原を、混合プロセス（例えば、押出、エタノール注入、インライン混合、マイクロ流体）の前に、脂質混合物へ添加することによって、リポソーム又は脂質ナノ粒子に直接的に負荷することができる。カーゴの疎水性は、ナノ粒子が形成されるときに、ナノ粒子の脂質区画内への自発的捕捉を可能にする。この方法は、天然の親油性又は疎水性のカーゴに適用され得る。

【0155】

水溶性又は親水性の抗原を、水性コアを含むリポソームに受動的に負荷することができる。抗原は、小胞を形成するために使用される緩衝水溶液に直接添加される。リポソームは、確立された方法（例えば、押出、エタノール注入、インライン混合、マイクロ流体など）を使用して作製される。この方法は、一般に、低い捕捉をもたらすが、カーゴの量を、使用される濃度によって制御することができる。少量の抗原が、寛容の誘導のために使用される。

【0156】

リポソームワクチン系のための製剤の例は、以下に提供されている：Ｓｃｈｅｗｅｎｄｅｎｅｒ ２０１４ Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：１５９～１８２；Ｓｃｈｍｉｄｔら、２０１６ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ８：７；及びＫｅｒｓｔｅｎ １９９５ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２４１：１１７～１３８。

【0157】

ある特定の実施形態では、ＬＮＰ又はリポソーム送達ビヒクルの永久的に荷電した又はイオン化可能な脂質は、ヘッド基、及び例えば、上記の式Ｉの構造を有する直鎖又は分枝の親油性部分を含む。

【0158】

一実施形態では、永久的に荷電した又はイオン化可能な脂質は、足場部分を含む。一実施形態における足場部分は、上記の式ＩのＬ（Ｌ１＋Ｌ２＋Ｌ３＋Ｌ４＋Ｌ５）で表され、少なくとも１つのＲは炭化水素側鎖として存在し、ｎ＋ｐは、１又は１～８又は１～７又は１～６又は１～５又は１～４又は１～３である。

【0159】

式ＩのＬ１は、直接的に又はリンカーを介してヘッド基に連結されていてもよい。リンカーは、直鎖、分枝又は環構造であり得る。イオン化可能な又は永久的に荷電した脂質の好適なリンカー基の例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／０２６６４７（ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／０５１０９８）に提供されているように、当技術分野で周知である。

【0160】

リンカー領域を介してＬ１に直接的又は間接的に連結され得るヘッド基の例としては、以下が挙げられる：
（ｉ）以下からなる群から選択されるイオン化可能なカチオン性部分：

【化8】

（ｉｉ）以下からなる群から選択される永久的に荷電した部分：

【化9】

（ｉｉｉ）以下からなる群から選択されるイオン化可能なアニオン性部分：

【化10】

；又は
（ｉｖ）以下からなる群から選択される双性イオン部分：

【化11】

。

【0161】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）への選択的送達

【0162】

本明細書に記載の組成物は、ＡＰＣへの送達のために使用され得る。例として、限定するものではないが、送達ビヒクルのインビボでのＡＰＣ取込みは、膵島（例えば、ＡＰＣがベータ細胞と相互作用して、１型糖尿病の場合ではベータ細胞抗原を取り上げる場合）又は膵臓リンパ節（例えば、ＡＰＣがＴ細胞と相互作用して抗原を提示し、その抗原に対して開始され得るＴ細胞応答のタイプを指令する場合）において実証され得る。一実施形態では、送達ビヒクルの取込みはＡＰＣに対して選択的であり、非ＡＰＣ免疫細胞の取込みは限定的である。取込みがＡＰＣに対して選択的であるかどうかの判定は、本明細書の例１の方法を使用して実施され得る。例えば、膵島の内分泌細胞及びリンパ節の非ＡＰＣ免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への送達ビヒクルの送達は限定的であり得る。

【0163】

例えば、非ＡＰＣに送達される、本明細書に記載の製剤中の脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルの全集団は、例１の技法を使用して測定した場合に、２０％未満、１５％未満又は１０％未満であり得る。

【0164】

いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、膵島及び／又はリンパ節の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に選好的に送達する脂質ナノ粒子である。

【0165】

投与方法

【0166】

いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートを含む送達ビヒクルは、対象の抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を処置、予防及び／又は改善するために投与される医薬製剤の一部である。医薬製剤は、いずれかの好適な投与量で投与され得、薬学的に許容され得る賦形剤を含み得る。

【0167】

脂質コンジュゲート（単数又は複数）が第１の送達ビヒクルに製剤化され、抗原又は抗原をコードする核酸が第２の送達ビヒクルに製剤化される実施形態では、第１及び第２の送達ビヒクルは別個に又は一緒に投与され得る。別個に投与される場合、第１及び第２の送達ビヒクルは、対象に逐次投与され得る。すなわち、第１の送達ビヒクルは、第２のものの前に投与され得、逆もまた同様である。第１及び第２の送達ビヒクルの投与間の時間枠は、患者要件に基づいて選択され得る。第１及び第２の送達ビヒクルは、典型的には、好適な賦形剤及び薬学的に許容され得る塩を含む医薬製剤の各部分である。

【0168】

一実施形態では、１種又は複数の医薬製剤は、非経口的に、すなわち、動脈内、静脈内、皮下又は筋肉内に投与される。なおさらなる実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内又は子宮内投与用である。別の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、硝子体内、網膜下、髄腔内、又は他の局所経路を介して投与される。

【0169】

本明細書に記載の組成物は、患者を含む対象に投与され得る。これには、ヒト又は非ヒト対象が含まれる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0170】

処置のために選択される対象は、抗原特異的免疫刺激又は望ましくない抗原駆動性免疫応答に関連する病理学的症状を有し得る。これらの免疫障害及び望ましくない抗原駆動性免疫応答は多様であり、アレルギー反応から自己免疫疾患、移植による拒絶反応にまで及ぶ。いくつかの実施形態では、抗原誘発性障害は、自己免疫疾患（自己抗原に対するＴ細胞及び／又は抗体応答）、アレルギー性疾患（環境又は食物抗原に対するＴ細胞及びＩｇＥ応答）、移植（ドナー組織／器官／細胞における主要及びマイナー組織適合抗原に対するＴ細胞応答）、抗薬物抗体応答（治療薬の有効性を低下させる抗体応答）、又は遺伝子／タンパク質補充療法（遺伝的タンパク質欠損症で治療的に補充されたタンパク質に対するＴ細胞／抗体応答）から選択される。いくつかの実施形態では、抗原誘発性障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、白斑、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎、抗ＧＢＭ腎炎／グッドパスチャー病、セリアック病、乾癬、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、視神経脊髄炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、全身性エリテマトーデスＳＬＥを含むループス、自己免疫性肝疾患、筋炎、エバンス症候群、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群、温式自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性血管性浮腫、橋本甲状腺炎、ランバート・イートン症候群、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー（カシュー、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドのうちのいずれか由来の抗原）、卵アレルギー、牛乳アレルギー、大豆アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、ゴマアレルギー、小麦アレルギー、アレルギー性気道疾患、又は環境アレルゲン（花粉、ダスト、ペットのふけ、カビ及びゴキブリ由来の抗原）によって引き起こされるアレルギーから選択される。

【0171】

例示的な実施形態

【0172】

本明細書に開示の様々な非限定的な実施形態を、以下に定義する：
実施形態１．切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含む脂質コンジュゲート；ならびに抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含む免疫調節の組合せであって、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、脂質コンジュゲートならびに抗原及び／又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、免疫調節の組合せ。
実施形態２．送達ビヒクルが脂質ナノ粒子及び／又はリポソームであり、場合により、送達ビヒクルが、膵島及び／又はリンパ節の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に効果的に送達する脂質ナノ粒子である、実施形態１に記載の免疫調節の組合せ。
実施形態３．抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸が、脂質ナノ粒子又はリポソーム内に捕捉され、脂質ナノ粒子における脂質の正味電荷と反対の正味電荷を有するか、あるは抗原が親油性であり、脂質ナノ粒子又はリポソームの脂質区画に取り込まれるか、あるいは抗原が親水性であり、水性コアを含むリポソームに捕捉される、実施形態２に記載の免疫調節の組合せ。
実施形態４．脂質コンジュゲートが、抗原又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せ。
実施形態５．実施形態１～４のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せであって、脂質コンジュゲートが第１の脂質コンジュゲートであり、免疫調節の組合せが第２の脂質コンジュゲートをさらに含み、第２の脂質コンジュゲートが、切断可能な連結によって又は切断可能なリンカーを介して親油性部分に共有結合的に連結された免疫調節剤を含み、第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤が第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なり、第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートが、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され、場合により、免疫調節の組合せが複数の脂質コンジュゲートを含み、複数の脂質コンジュゲートが３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の免疫調節剤を含み、複数の脂質コンジュゲートの各免疫調節剤が異なり、複数の脂質コンジュゲートの各脂質コンジュゲートが、免疫調節の組合せの他のコンポ－ネントとは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１種もしくは複数と共製剤化される、免疫調節の組合せ。
実施形態６．第２の脂質コンジュゲートの免疫調節剤が、第１の脂質コンジュゲートの免疫調節剤とは異なる免疫経路を標的化する、実施形態５に記載の免疫調節の組合せ。
実施形態７．第１の脂質コンジュゲート及び第２の脂質コンジュゲートが、同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態５又は６に記載の免疫調節の組合せ。
実施形態８．各免疫調節剤が寛容原性剤又は抗炎症剤である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せ。
実施形態９．各免疫調節剤が免疫賦活剤又は免疫抑制剤である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せ。
実施形態１０．各免疫調節剤が、独立して、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、インフラマソーム阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、コルチコステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、カルシニューリン阻害剤、又はビタミンＤ受容体アゴニストである、実施形態１～９のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せ。
実施形態１１．各免疫調節剤が、独立して、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、フルニソリド、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、フルドロコルチゾン、フルメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、イソフルプレドン、コルチコステロン、酢酸デスオキシコルトン、エナント酸デスオキシコルトン、１１－デオキシコルチコステロン、１１－デオキシコルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、サリチラート、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、アルファカルシドール、カルシポトリオール、ファレカルシトリオール、マキサカルシトール、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、２２－オキサカルシトリオール、タカルシトール、エルデカルシトール、エロカルシトール、イネカルシトール、ベコカルシジオール、セオカルシトール、エルゴカルシフェロール、レキサカルシトール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、又はエチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラートである、実施形態１～９のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せ。
実施形態１２．実施形態１～１１のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せであって、抗原が第１の抗原であり、免疫調節の組合せが、第２の抗原又は第２の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸をさらに含み、第１の抗原が第２の抗原とは異なり、第２の抗原又は第２の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸が、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１種もしくは複数と共製剤化され、場合により、免疫調節の組合せが複数の抗原を含むか、又は複数の抗原をコードする１種もしくは複数の核酸を含むか、又は複数の抗原を提供するために抗原及び抗原をコードする核酸（単数又は複数）の組合せを含み、複数の抗原が３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の抗原を含み、各抗原又は抗原をコードする核酸が、免疫調節の組合せの他のコンポーネントとは別個の送達ビヒクルに独立して製剤化されるか、又は免疫調節の組合せの他のコンポーネントのうちの１種もしくは複数と共製剤化される、免疫調節の組合せ。
実施形態１３．第１の抗原をコードする１種又は複数の核酸及び第２の抗原をコードする１種又は複数の核酸が、単一の核酸内に含まれ、第１の抗原及び第２の抗原が、同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態１２に記載の免疫調節の組合せ。
実施形態１４．抗原誘発性障害もしくは望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象の処置に使用するための、又は対象を処置するための医薬の製造に使用するための、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せであって、場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、自己免疫疾患（自己抗原に対するＴ細胞及び／又は抗体応答）、アレルギー性疾患（環境又は食物抗原に対するＴ細胞及びＩｇＥ応答）、移植（ドナー組織／器官／細胞における主要及びマイナー組織適合抗原に対するＴ細胞応答）、抗薬物抗体応答（治療薬の有効性を低下させる抗体応答）、遺伝子／タンパク質補充療法（遺伝的タンパク質欠損症で治療的に補充されたタンパク質に対するＴ細胞／抗体応答）から選択され、場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、多発性硬化症、関節リウマチ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、白斑、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎、抗ＧＢＭ腎炎／グッドパスチャー病、セリアック病、乾癬、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、視神経脊髄炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、全身性エリテマトーデスＳＬＥを含むループス、自己免疫性肝疾患、筋炎、エバンス症候群、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群、温式自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性血管性浮腫、橋本甲状腺炎、ランバート・イートン症候群、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー（カシュー、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドのうちのいずれか由来の抗原）、卵アレルギー、牛乳アレルギー、大豆アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、ゴマアレルギー、小麦アレルギー、アレルギー性気道疾患、及び環境アレルゲン（花粉、ダスト、ペットのふけ、カビ及びゴキブリ由来の抗原）によって引き起こされるアレルギーから選択される、免疫調節の組合せ。
実施形態１５．実施形態１～１３のいずれか１つに記載の免疫調節の組合せを対象に投与することを含む、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答を有する対象を処置する方法であって、抗原、又は抗原をコードする１種もしくは複数の核酸、及び脂質コンジュゲートを一緒に又は逐次投与し、場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、自己免疫疾患（自己抗原に対するＴ細胞及び／又は抗体応答）、アレルギー性疾患（環境又は食物抗原に対するＴ細胞及びＩｇＥ応答）、移植（ドナー組織／器官／細胞における主要及びマイナー組織適合抗原に対するＴ細胞応答）、抗薬物抗体応答（治療薬の有効性を低下させる抗体応答）、遺伝子／タンパク質補充療法（遺伝的タンパク質欠損症で治療的に補充されたタンパク質に対するＴ細胞／抗体応答）から選択され、場合により、抗原誘発性障害又は望ましくない抗原駆動性免疫応答が、多発性硬化症、関節リウマチ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、白斑、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎、抗ＧＢＭ腎炎／グッドパスチャー病、セリアック病、乾癬、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、視神経脊髄炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、全身性エリテマトーデスＳＬＥを含むループス、自己免疫性肝疾患、筋炎、エバンス症候群、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群、温式自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性血管性浮腫、橋本甲状腺炎、ランバート・イートン症候群、ピーナッツ／レギュームアレルギー、ツリーナッツアレルギー（カシュー、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドのうちのいずれか由来の抗原）、卵アレルギー、牛乳アレルギー、大豆アレルギー、魚アレルギー、甲殻類アレルギー、ゴマアレルギー、小麦アレルギー、アレルギー性気道疾患、及び環境アレルゲン（花粉、ダスト、ペットのふけ、カビ及びゴキブリ由来の抗原）によって引き起こされるアレルギーから選択される、方法。
実施形態１６．脂質部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含む少なくとも１種のプロドラッグ；ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸を含むワクチン製剤であって、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、別個の送達ビヒクルに製剤化されるか、又は製剤中の同じ送達ビヒクルに共製剤化される、ワクチン製剤。
実施形態１７．送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、実施形態１６に記載のワクチン製剤。
実施形態１８．少なくとも１種のプロドラッグが、抗原又は抗原をコードする核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態１６又は１７に記載のワクチン製剤。
実施形態１９．２種のプロドラッグが製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態１６、１７、又は１８に記載のワクチン製剤。
実施形態２０．免疫調節剤が寛容原性剤である、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載のワクチン製剤。
実施形態２１．免疫調節剤が免疫賦活剤又は免疫抑制剤である、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載のワクチン製剤。
実施形態２２．少なくとも１種のプロドラッグの免疫調節剤が、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、エチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラート、又はそれらの組合せから選択される、実施形態１６～２１のいずれか１つに記載のワクチン製剤。
実施形態２３．実施形態１６～２２のいずれか１つに記載のワクチン製剤であって、２種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸が製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、ワクチン製剤。
実施形態２４．親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含む少なくとも１種のプロドラッグを投与すること；ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸を投与することを含む、抗原誘発性障害を有する対象を処置する方法であって、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、送達ビヒクルに別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化され、少なくとも１種のプロドラッグならびに少なくとも１種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、一緒に又は逐次投与される、方法。
実施形態２５．送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６．少なくとも１種のプロドラッグが、抗原及び／又は抗原をコードする核酸と共に送達ビヒクル内に共製剤化される、実施形態２４又は２５に記載の方法。
実施形態２７．２種のプロドラッグが製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態２４、２５、又は２６に記載の方法。
実施形態２８．免疫調節剤が寛容原性剤である、実施形態２４～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．免疫調節剤が免疫賦活剤又は免疫抑制剤である、実施形態２４～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０．少なくとも１種のプロドラッグの免疫調節剤が、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、エチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラート、又はそれらの組合せから選択される、実施形態２４～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．２種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸が製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態２４～３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２．少なくとも１種の抗原及び／又は少なくとも１種の抗原をコードする核酸と組み合わせて、抗原誘発性障害を有する対象を処置するための、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含むプロドラッグの使用であって、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、（ｉ）少なくとも１種のワクチン製剤中の同じ送達ビヒクルに共製剤化されるか、又は（ｉｉ）対象への逐次投与もしくは共投与のために別個の送達ビヒクルに製剤化される、使用。
実施形態３３．送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、実施形態３２に記載の使用。
実施形態３４．少なくとも１種のプロドラッグが、抗原又はそのような抗原をコードする核酸と同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態３２又は３３に記載の使用。
実施形態３５．２種のプロドラッグが製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態３２、３３、又は３４に記載の使用。
実施形態３６．免疫調節剤が寛容原性剤である、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の使用。
実施形態３７．免疫調節剤が免疫賦活剤又は免疫抑制剤である、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の使用。
実施形態３８．少なくとも１種のプロドラッグの免疫調節剤が、デキサメタゾン、カルシトリオール、アセチルサリチル酸、ミコフェノール酸、シロリムス、タクロリムス、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、レチノイン酸、シクロホスファミド（ナイトロジェンマスタード）、フィルゴチニブ、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、ウパダシチニブ、オクラシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、デルゴシチニブ、デュークラバシチニブ、アブロシチニブ、オーラノフィン、アプレミラスト、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、サリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、ナプロキセン、イブプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ザルトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ブロムフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、セレコキシブ、フィロコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、クロニキシン、リコフェロン、ＭＣＣ９５０、グリブリド、ＣＹ－０９、トラニラスト、オリドニン、ＢＯＴ－４－オン（２－シクロヘキシルイミノ－６－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［１，３］オキサチオール－４－オン）、ＩＮＦ３９（エチル２－（２－クロロベンジル）アクリラート）、ＭＮＳ（３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン）、フェナム酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、ケルセチン、ＪＣ－１７１、イブルチニブ、ＯＬＴ１１７７、ＦＣ１１Ａ－２、ＩＮＦ５８、ＪＣ１２４、エチル２－（（２－クロロフェニル）（ヒドロキシ）メチル）アクリラート、又はそれらの組合せから選択される、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の使用。
実施形態３９．２種の抗原及び／又は抗原をコードする核酸が製剤中に存在し、別個に製剤化されるか、又は同じ送達ビヒクルに共製剤化される、実施形態３２～３８のいずれか１つに記載の使用。
実施形態４０．抗原誘発性障害を有する対象を処置するための、親油性部分にコンジュゲートされた免疫調節剤を含むプロドラッグ、ならびに少なくとも１種の抗原及び／又は少なくとも１種の抗原をコードする核酸の組合せであって、少なくとも１種の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、又は多糖であり、少なくとも１種のプロドラッグならびに抗原及び／又は抗原をコードする核酸は、（ｉ）同じ送達ビヒクルに共製剤化されるか、又は（ｉｉ）対象への逐次投与もしくは共投与のために別個の送達ビヒクルに製剤化される、組合せ。

【実施例】

【0173】

以下の例は、例示のみを目的として与えられており、本発明の範囲を限定するものではない。

【0174】

脂質コンジュゲートの合成

【0175】

様々な脂質コンジュゲートを、以下に示す合成手順Ａ～Ｅを使用して調製した。

【0176】

ＴＨＦ（窒素下でＮａ／ベンゾフェノンから新たに蒸留したもの）及びＥｔ_３Ｎ、ＤＭＦ及びＣＨ_２Ｃｌ_２（窒素下でＣａＨ_２から新たに蒸留したもの）を除いて、すべての試薬及び溶媒を商業的供給業者から購入し、特に明記しない限り、さらに精製することなく使用した。ＵＳＰグレードのヒマシ油を地元の薬局（Ｌｉｆｅ（商標）ブランド）で購入し、受け取ったまま使用した。ＮＭＲについては、化学シフトをδスケールの百万分率（ｐｐｍ）で報告し、カップリング定数Ｊはヘルツ（Ｈｚ）である。多重度を、「ｓ」（一重線）、「ｄ」（二重線）、「ｄｄ」（二重線の二重線）、「ｄｔ」（三重線の二重線）、「ｄｄｄ」（二重線の二重線の二重線）、「ｔ」（三重線）、「ｔｄ」（二重線の三重線）、「ｑ」（四重線）、「ｑｕｉｎ」（五重線）、「ｓｅｘ」（六重線）、「ｍ」（多重線）として報告し、さらに「ａｐｐ」（見かけ上）及び「ｂｒ」（ブロード）として認定する。

【0177】

ヒマシ油（リシノレイン）のヒドロキシ及びカルボキシ誘導体に基づく脂質コンジュゲートの一般的な合成の工程を、以下のスキーム１に提供する。続いて、以下の例Ｅ、Ｓ、Ｔ及びＷの脂質コンジュゲートを生成するための工程を記載する、一般手順Ａ～Ｅと称されるスキーム１が続く。

【0178】

スキーム１：ヒマシ油（リシノレイン）のヒドロキシ及びカルボキシ誘導体に基づく脂質コンジュゲートの一般的な合成。

【化12】

【0179】

スキームＩにおける上に記載の合成反応によれば、リシノレイン（リシノール酸のグリセリド）としても公知のヒマシ油は、図３に示すプロドラッグの合成のための出発物質である。

【0180】

上記工程１）では、ナトリウムメトキシド（２．０ｍＬのＭｅＯＨ中３．０Ｍ溶液、６．００ｍｍｏｌ、０．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のヒマシ油（２８．０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、１．００当量）の撹拌している室温１：１ ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）溶液に添加した。１４時間後、反応混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、Ｅｔ_２Ｏ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（１×１５０ｍＬ）、ブライン（１×１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、無色透明の油状物のメチル（１２Ｒ）－ヒドロキシオレアート１（２８．０ｇ、定量的収率）を得、これをさらに精製することなく使用した。メチル（１２Ｒ）－ヒドロキシオレアートの構造及びその物理的特性を以下に示す：
メチル（１２Ｒ）－ヒドロキシオレアート（１）：

【化13】

Ｒ_ｆ＝０．５０（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数1】

【0181】

上記の反応スキームの２）に従って、メチル（１２Ｒ）－ヒドロキシオレアート（９．３７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）の室温ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を、アルゴン下、丸底フラスコ中のＬｉＡｌＨ_４（１．２５ｇ、３３．０ｍｍｏｌ、１．１０当量）の撹拌された氷冷ＴＨＦ（９０ｍＬ）懸濁液に、２０～３０分間にわたって添加漏斗から添加した。添加が完了した後、冷浴を除去した。１４時間後、反応混合物を氷浴で冷却し、Ｅｔ_２Ｏ（１５０ｍＬ）で希釈し、クエンチ溶液（１．２５ｍＬのＨ_２Ｏ、１．２５ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ水溶液、３．７５ｍＬのＨ_２Ｏ）でクエンチし、室温で１時間撹拌し、Ｅｔ_２Ｏで十分に洗浄しながらＣｅｌｉｔｅを通して濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して、粗ジオールを淡黄色油状物（定量的収率）として得、これをさらに精製することなく使用した。

【0182】

上記反応スキームの３）に従って、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド（３．９６ｇ、２６．２ｍｍｏｌ、１．００当量）の室温ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を、アルゴン下、丸底フラスコ中の上記ジオール（８．２１ｇ、２８．９ｍｍｏｌ、１．１０当量）及びｉ－Ｐｒ_２Ｎｅｔ（５．７３ｍＬ、３２．８ｍｍｏｌ、１．２５当量）の１０～１５℃ＤＭＦ（２５ｍＬ）溶液に、３０分間にわたって添加漏斗から添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、次いで、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、１：１Ｅｔ_２Ｏ／ヘキサン（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ_２Ｏ（３×１００ｍＬ）、ブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗い１番目のシリルエーテルを淡黄色油状物として得た。粗生成物をシリカゲルのプラグ（２２０ｍＬのＳｉＯ_２、９９：１→９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、シリルエーテル２（８．３８ｇ、収率８０％）から構成される無色透明の油状物を得た。シリルエーテル２の構造、ならびにその物理的特性を以下に示す：

【0183】

Ｉ－１－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－１２－ヒドロキシオレイルアルコール（２）：

【化14】

Ｒ_ｆ＝０．１６（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数2】

【0184】

上記反応スキームの４）に従って、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４９５ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のＲＣＯ_２Ｈ（２７９ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１．２０当量）の氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）溶液に添加し、その後氷浴を除去し、結果として得られた混合物を１５分間撹拌した。この例では、ＲＣＯ_２Ｈはヘキサン酸であったが、他のアシル基を利用して所望の炭化水素側鎖Ｓを生成することができる。反応混合物を氷浴で再び冷却し、シリルエーテル、Ｉ－１－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－１２－ヒドロキシオレイルアルコール２（７９７ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）溶液、続いてＤＭＡＰ（３６６ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をＥｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅを通して濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して、粗エステルを白色半固体として得た。粗生成物をシリカゲルのプラグ（２０ｍＬのＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、Ｒ_ｆ＝０．５３（ＳｉＯ_２、９０：１０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を有する中間体エステル（定量的収率）として無色透明の油状物を得た。

【0185】

上記の反応スキームの５）に従って、ニートＨＦ・ピリジン溶液（０．７４ｍＬのピリジン中７０％ＨＦ、６．００ｍｍｏｌ、３．００当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のピリジン（０．４８ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、３．００当量）及び上記シリルエーテル（２．００ｍｍｏｌ）の撹拌された氷冷ＴＨＦ（６ｍＬ）溶液に添加した。２時間後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でクエンチした。混合物をＥｔ_２Ｏ（２×１０ｍＬ）で抽出し、次いで、合わせた有機抽出物をＨ_２Ｏ（１×１０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗第一級アルコールを得た。粗生成物をシリカゲルのプラグ（２０ｍＬ、９０：１０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、第一級アルコール３（定量的収率）を以下の構造及び物理的特性を有する無色透明の油状物として得た：
（１２Ｒ）－ヘキサノイルオキシオレイルアルコール（３）：

【化15】

【0186】

上記の反応スキームの６）に従って、固体無水コハク酸（４００ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ、２．００当量）及びＤＭＡＰ（６１１ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ、２．５０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の（１２Ｒ）－ヘキサノイルオキシオレイルアルコール（３）（７６５ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、１．００当量）の撹拌している室温ＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）溶液に添加した。１４時間後、反応を１Ｍ ＨＣｌ水溶液でクエンチし、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×１５ｍＬ）で抽出した。次いで、合わせた有機抽出物を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（１×１５ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、中間体ヘミスクシナート（定量的収率）を淡黄色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。中間体は、Ｒ_ｆ＝０．３２（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を有した。

【0187】

反応スキームの７）に従って、固体ＤＣＣ（９９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の上記ヘミスクシナート（２３２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．２０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られた混合物を１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、固体デキサメタゾン（１５７ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、Ｅｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅを通して濾過した。濾液を濃縮して、淡黄色油状物である粗生成物を得た。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（５０ｍＬのＳｉＯ_２、８０：２０→５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、以下の構造及び特性を有する所望のプロドラッグ４（３２８ｍｇ、収率９５％）として無色透明の油状物を得た：
２－（（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１０，１３，１６－トリメチル－３－オキソ－６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－ドデカヒドロ－３Ｈ－シクロペンタ［ａ］４９ｃｔａｄｉｃ４９ｒｅｎｅ－１７－イル）－２－オキソエチル（（Ｒ，Ｚ）－１２－（ヘキサノイルオキシ）４９ｃｔａｄｉｃ－９－エン－１－イル）スクシナート（４）：

【化16】

Ｒ_ｆ＝０．３８（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数3】

【0188】

脂質コンジュゲートは、スクシナートリンカーによってデキサメタゾンにコンジュゲートされたヘキサノイル（Ｃ６：０）側鎖を有するリシノレイル足場Ｌに基づく（ＩＮＴ－Ｄ０３４）。
上記の例では、ヘキサノイル側鎖（Ｃ６：０）を生成するために、上記反応の４）で添加したＲＣＯ_２Ｈはヘキサン酸であったが、他の脂肪酸を利用して、リシノレイル足場に所望の炭化水素側鎖Ｒを生成することができる。

【0189】

一般手順Ａ－（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－１２－ヒドロキシオレイルアルコール３のアシル化（４ａ～ｈ）：

【0190】

ＤＣＣ（１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の所望のカルボン酸（１．２０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、アルコール３（１．００当量、ＣＨ_２Ｃｌ_２中０．２５Ｍ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液、続いてＤＭＡＰ（１．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をＥｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して、粗エステルを白色半固体として得た。粗生成物をシリカゲルのプラグ（９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、純粋なエステルを得た。

【0191】

一般手順Ｂ－（１２Ｒ）－アシルオキシオレイルアルコール４ａ～ｈの脱シリル化－スクシニル化（５ａ～ｈ）：

【0192】

ＨＦ・ピリジン溶液（ピリジン中３．００当量の７０％ＨＦ）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のピリジン（３．００当量）及び１２－アシルリシノレイルアルコールシリルエーテル（１．００当量）の撹拌している氷冷ＴＨＦ（出発シリルエーテルに対して０．３０Ｍ）溶液に添加した。ＴＬＣが出発物質の消費を示したとき（２～８時間）、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でクエンチした。混合物をＥｔ_２Ｏ（２×１０ｍＬ）で抽出し、次いで、合わせた有機抽出物をＨ_２Ｏ（１×１０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗第一級アルコールを得た。粗生成物をシリカゲルのプラグ（９０：１０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空下で乾燥させて、第一級アルコールを無色透明の油状物として得、さらに精製することなくその後のスクシニル化に使用した。

【0193】

固体無水コハク酸（２．００当量）及びＤＭＡＰ（２．５０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の１２－アシルリシノレイルアルコール（１．００当量）の撹拌している室温ＣＨ_２Ｃｌ_２（出発第一級アルコールに対して０．３０Ｍ）溶液に添加した。１４時間後、反応を１Ｍ ＨＣｌ水溶液でクエンチし、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×１５ｍＬ）で抽出した。次いで、合わせた有機抽出物を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（１×１５ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をヘキサンに再溶解し、活性炭で処理し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、濾液を濃縮して、中間体ヘミスクシナートを無色から淡黄色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。

【0194】

一般手順Ｃ－メチル（１２Ｒ）－リシノレアート２のアシル化（６ａ～ｃ）：

【0195】

ＤＣＣ（１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の所望のカルボン酸（１．２０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、メチル（１２Ｒ）－リシノレアート（１．００当量、ＣＨ_２Ｃｌ_２中０．３０Ｍ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液、続いてＤＭＡＰ（１．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をヘキサンで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して、粗ジエステルを白色半固体として得、これをシリカゲルのプラグ（９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、純粋なエステルを得た。

【0196】

一般手順Ｄ－ヘミスクシナートへのデキサメタゾンのコンジュゲーション５ａ～ｈ：

【0197】

ＤＣＣ（１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の１２－アシルリシノレイルヘミスクシナート（１．２０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（デキサメタゾン中０．２Ｍ）溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、固体デキサメタゾン（１．００当量）及びＤＭＡＰ（１．５０当量）を添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、Ｅｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を濃縮して、粗生成物を淡黄色油状物として得、その後フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、８０：２０→５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色透明の油状物を所望のデキサメタゾンコンジュゲートとして得た。

【0198】

一般手順Ｅ－リシノレイン酸へのデキサメタゾンのコンジュゲーション１２ａ～ｂ、１３：

【0199】

ＤＣＣ（１．１０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のアシルオキシステアリン酸（１．１０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（デキサメタゾン中０．１Ｍ）溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、固体デキサメタゾン（１．００当量）及びＤＭＡＰ（１．５０当量）を添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、Ｅｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を濃縮して、粗生成物を淡黄色油状物として得、その後フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、無色透明の油状物を所望のコンジュゲートとして得た。

【0200】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルアセタート（４ａ）：

【0201】

塩化アセチル（０．４３ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のシリルエーテル３（２．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ、１．００当量）、塩化アセチル（０．４３ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、１．２０当量）、トリエチルアミン（０．８３ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＭＡＰ（７３３ｍｇ、６．００ｍｍｏｌ、１．２０当量）の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液に滴下し、これを室温に加温した。１４時間後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１×１５ｍＬ）、水（２×１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を溶離液に再溶解し、シリカゲルのプラグ（３０ｍＬのＳｉＯ_２、９７：３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）に通して、エステル４ａ（１．８３ｇ、８３％）を淡黄色油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４５（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数4】

【化17】

【0202】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルヘキサノアート（４ｂ）：

【0203】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）中のシリルエーテル３（２．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ）、ヘキサン酸（６９７ｍｇ、６．００ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．２４ｇ、６．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９１６ｍｇ、７．５０ｍｍｏｌ）により、２．３７ｇのエステル４ｂ（２．３９ｇ、定量的収率）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４３（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数5】

【化18】

【0204】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルラウラート（４ｃ）：

【0205】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中のシリルエーテル３（９９７ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、ラウリン酸（６０１ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（６１９ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４５８ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）により、エステル４ｃ（１．３８ｇ、定量的収率）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．５６（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数6】

【化19】

【0206】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルステアラート（４ｄ）：

【0207】

一般手順Ａに従い、２：１のＴＨＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）中のシリルエーテル３（９９７ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、ステアリン酸（８５３ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（６１９ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４５８ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）により、エステル４ｄ（１．５６ｇ、９４％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４８（ＳｉＯ_２、９０：１０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数7】

【化20】

【0208】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルオレアート（４ｅ）：

【0209】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中のシリルエーテル３（９９７ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、オレイン酸（８４７ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（６１９ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４５８ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）により、エステル４ｅ（１．６４ｇ、定量的）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４１（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数8】

【化21】

【0210】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルリノレアート（４ｆ）：

【0211】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍＬ）中のシリルエーテル３（８４７ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）、リノール酸（７１５ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（５２６ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３８９ｍｇ、３．１９ｍｍｏｌ）により、エステル４ｆ（１．０６ｇ、７６％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４６（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数9】

【化22】

【0212】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルリノレナート（４ｇ）：

【0213】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中のシリルエーテル３（９９７ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、リノレン酸（８３５ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（６１９ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４５８ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）により、エステル４ｇ（１．５２ｇ、９２％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３４（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数10】

【化23】

【0214】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９－エン－７－イルアラキドナート（４ｈ）：

【0215】

一般手順Ａに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍＬ）中のシリルエーテル３（７９７ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、アラキドン酸（６７０ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２２７ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３６６ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）により、フラッシュカラムクロマトグラフィー（９９：１→９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）後、エステル４ｈ（７３０ｍｇ、５３％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．５７（ＳｉＯ_２、９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数11】

【化24】

【0216】

（Ｒ，Ｚ）－４－（（１２－アセトキシオクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ａ）：

【0217】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ａ（１．７９ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（１．５２ｍＬ、１２．２ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．９８ｍＬ、１２．２ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（１．３４ｇ）を得、これを無水コハク酸（８１４ｍｇ、８．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．２４ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ａ（１．７２ｇ、定量的収率）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．２３（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数12】

【化25】

【0218】

（Ｒ，Ｚ）－４－（（１２－ヘキサノイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ｂ）：

【0219】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｂ（２．３５ｇ、５．００ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（１．８６ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．２１ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（１３ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（２．０１ｇ）を得、これを無水コハク酸（１．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．５３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（１３ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｂ（２．２０ｇ、収率９２％）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．３２（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数13】

【化26】

【0220】

（Ｒ，Ｚ）－４－（（１２－ラウロイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ｃ）：

【0221】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｃ（１．３８ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．９３ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．６０ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（８ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（１．２１ｇ）を得、これを無水コハク酸（５００ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７６４ｍｇ、６．２５ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｃ（１．３３ｇ、９４％）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．４４（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数14】

【化27】

【0222】

（Ｒ，Ｚ）－４－オキソ－４－（（１２－（ステアロイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）ブタン酸（５ｄ）：

【0223】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｄ（１．６６ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．９３ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．６０ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（８ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（１．３０ｇ）を得、これを無水コハク酸（５００ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７６４ｍｇ、６．２５ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｄ（１．２９ｇ、収率７９％）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．３５（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数15】

【化28】

【0224】

（Ｒ，Ｚ）－４－オキソ－４－（（１２－（オレオイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）ブタン酸（５ｅ）：

【0225】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｅ（６６３ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．３７ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．２４ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（５ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（５４６ｍｇ）を得、これを無水コハク酸（２００ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３０５ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｅ（６３０ｍｇ、収率９７％）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．４２（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数16】

【化29】

【0226】

４－（（（Ｒ，Ｚ）－１２－（リノレオイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ｆ）：

【0227】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｆ（１．０６ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．６０ｍＬ、４．８０ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．３９ｍＬ、４．８０ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（８ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（８９０ｍｇ）を得、これを無水コハク酸（３２０ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４８９ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｆ（１．０４ｇ、定量的収率）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．３５（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数17】

【化30】

【0228】

４－（（（Ｒ，Ｚ）－１２－（リノレノイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ｇ）：

【0229】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｇ（１．５４ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．８７ｍＬ、７．０１ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．５７ｍＬ、７．０１ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（６ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（１．３１ｇ）を得、これを無水コハク酸（４６８ｍｇ、４．６８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７１４ｍｇ、５．８４ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｇ（１．４７ｇ、定量的収率）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．３５（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数18】

【化31】

【0230】

４－（（（Ｒ，Ｚ）－１２－（アラキドノイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（５ｈ）：

【0231】

一般手順Ｂに従い、シリルエーテル４ｈ（７１１ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を、ＨＦ・ピリジン溶液（０．３９ｍＬ、３．１１ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．２５ｍＬ、３．１１ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（５ｍＬ）を用いて脱シリル化して中間体第一級アルコール（５９３ｍｇ）を得、これを無水コハク酸（２０１ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３０６ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）を用いたアシル化に供して、カルボン酸５ｈ（５８２ｍｇ、収率８７％）を得た。
Ｒ_ｆ＝０．３１（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数19】

【化32】

【0232】

メチル（１２Ｒ）－ヘキサノイルオキシオレアート（６ａ）：

【0233】

一般手順Ｃに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中のメチルリシノレアート（２．００ｇ、６．４０ｍｍｏｌ）、ヘキサン酸（８９８ｍｇ、７．６８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．５８ｇ、７．６８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１．１７ｇ、９．６０ｍｍｏｌ）により、シリカゲル（９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通した濾過後、リシノレアート６ａ（２．５２ｇ、収率９６％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．６２（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）；

【数20】

【化33】

【0234】

メチル（１２Ｒ）－リノレオイルオキシオレアート（６ｂ）：

【0235】

一般手順Ｃに従い、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中のメチルリシノレアート（５００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）、リノール酸（５３８ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３９６ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２９３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）により、シリカゲル（９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通した濾過後、リシノレアート６ｃ（８７５ｇ、収率９３％）を薄黄色油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．６７（ＳｉＯ_２、８０：２０ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）；

【数21】

【化34】

【0236】

（１２Ｒ）－ヘキサノイルオキシオレイン酸（７ａ）：

【0237】

アルゴンでフラッシュした丸底フラスコに、メチルエステル６ａ（１．９７ｇ、４．７９ｍｍｏｌ、１．００当量）及びｔ－ＢｕＯＨ（１２ｍＬ）、次いで２．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（１．８０ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ、０．７５当量）を投入した。１７時間後、反応溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌ水溶液を使用して２に調整し、Ｅｔ_２Ｏ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を、水（１×３０ｍＬ）、ブライン（１×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をシリカのプラグ（９８：２：０→５０：４５：５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）に通して濾過して、カルボン酸７ａ（１．３０ｇ、収率９２％）を淡黄色油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．２４（ＳｉＯ_２、７５：２０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）；

【数22】

【化35】

【0238】

（１２Ｒ）－リノレオイルオキシオレイン酸（７ｂ）：

【0239】

アルゴンでフラッシュした丸底フラスコに、メチルエステル６ｂ（５．９７ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．００当量）及びｔ－ＢｕＯＨ（２６ｍＬ）、次いで２．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（４．７０ｍＬ、９．３０ｍｍｏｌ、０．９０当量）を投入した。１７時間後、反応溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌ水溶液を使用して２に調整し、Ｅｔ_２Ｏ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を、水（１×３０ｍＬ）、ブライン（１×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、９５：５：０→８０：１５：５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）によって精製して、カルボン酸７ｂ（４．４８ｇ、収率８５％）を淡黄色油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３５（ＳｉＯ_２、７５：２０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）；

【数23】

【化36】

【0240】

メチル９，１０－ジヒドロキシステアラート（８）：

【0241】

ＫＯＨ（７．０１ｇ、１２５ｍｍｏｌ、５．００当量）を、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中のオレイン酸（７．０６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）及び水（１７５ｍＬ）の急速に撹拌した室温混合物に添加し、次いで、約１０℃に冷却した。水（７５ｍＬ）中のＫＭｎＯ_４（７．１１ｇ、４５．０ｍｍｏｌ、１．８０当量）の溶液を、１０分間にわたって滴下した。追加で１０～１５分間撹拌した後、反応を飽和ＮａＨＳＯ_３水溶液の添加によってクエンチし、次いで、冷却浴の補助を用いて濃ＨＣｌを添加することによってｐＨ≦２に調整した。白色の綿状混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、固体を吸引濾過によって回収し、空気で一晩乾燥させた。結果として得られた白色固体を熱重力濾過し、ＥｔＯＨから再結晶させて、（±）－ｓｙｎ－９，１０－ジヒドロキシステアリン酸を白色結晶として得た（５．８６ｇ、収率７４％）。

【0242】

濃Ｈ_２ＳＯ_４（０．０６ｍＬ、１．００ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、上記ジヒドロキシ酸（６．３３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）懸濁液に添加し、結果として得られた混合物を加熱還流した。１４時間後、混合物を室温に冷却し、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮し、結果として得られた残渣をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液の間で分配した。有機層を水（１×７５ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮して、メチルエステル８（６．４４ｇ、収率９７％）を白色固体として得た。
Ｒ_ｆ＝０．４５（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数24】

【化37】

【0243】

メチル９，１０，１２Ｒ－トリヒドロキシステアラート（９）：

【0244】

ＫＯＨ（５．６１ｇ、１００ｍｍｏｌ、２．００当量）を、１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中のリシノール酸（１４．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）及び水（５００ｍＬ）の急速に撹拌した室温混合物に添加し、次いで、約１０℃に冷却した。水（２５０ｍＬ）中のＫＭｎＯ_４（１３．４ｇ、８５．０ｍｍｏｌ、１．７０当量）の溶液を、１５分間にわたって滴下した。追加で１０～１５分間撹拌した後、反応を飽和Ｎａ_２ＳＯ_３水溶液の添加によってクエンチし、次いで、冷却浴の補助を用いて濃ＨＣｌを添加することによってｐＨ≦２に調整した。白色の綿状混合物を室温で４時間撹拌し、次いで、固体を吸引濾過によって回収し、空気で一晩乾燥させた。結果として得られた白色固体をＥｔＯＨを用いて熱重力濾過して、粗９，１０，１２－トリヒドロキシステアリン酸を得、これをさらに精製することなく使用した。

【0245】

濃Ｈ_２ＳＯ_４（０．１３ｍＬ、２．５０ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、上記ジヒドロキシ酸（６．３３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）懸濁液に添加し、結果として得られた混合物を加熱還流した。１４時間後、混合物を室温に冷却し、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮し、結果として得られた残渣を温ＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液の間で分配した。有機層を水（１×７５ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。結果として得られた淡黄色固体を温Ｅｔ_２Ｏで４回研和して、メチルエステル９（９．５２ｇ、収率５５％）を白色固体として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３３（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数25】

【化38】

【0246】

メチル９，１０－ジヘキサノイルオキシステアラート（１０ａ）：

【0247】

ＤＣＣ（２．２７ｇ、１１．０ｍｍｏｌ、２．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（１３ｍＬ）ヘキサン酸溶液（１．２８ｇ、１１．０ｍｍｏｌ、２．２０当量）に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、ジオール８（１．６５ｇ、５．００ｍｍｏｌ）、続いてＤＭＡＰ（１．５３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、２．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をＥｔ_２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（２×３０ｍＬ）、１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（２×３０ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（１×３０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮して、トリエステル１０ａ（２．６１ｇ、定量的収率）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．６６（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数26】

【化39】

【0248】

メチル９，１０－ジリノレオイルオキシステアラート（１０ｂ）：

【0249】

ＤＣＣ（４．３３ｇ、２１．０ｍｍｏｌ、２．１０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）溶液リノール酸（５．８９ｇ、２１．０ｍｍｏｌ、２．２０当量）に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、ジオール８（３．３０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、続いてＤＭＡＰ（３．０５ｇ、２５．０ｍｍｏｌ、２．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をヘキサンで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して、粗生成物を白色半固体として得、これをシリカゲルのプラグ（９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を通す濾過によって精製して、トリエステル１０ｂ（７．２４ｇ、収率８５％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．５７（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数27】

【化40】

【0250】

メチル９，１０，１２Ｒ－トリヘキサノイルオキシステアラート（１１）：

【0251】

ＤＣＣ（２．６４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ、３．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の撹拌している氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（１３ｍＬ）ヘキサン酸溶液（１．４９ｇ、１２．８ｍｍｏｌ、３．２０当量）に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、トリオール９（１．３９ｇ、４．００ｍｍｏｌ）、続いてＤＭＡＰ（１．７１ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、３．５０当量）を添加し、反応混合物を１４時間にわたって室温に加温した。反応混合物をヘキサンで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（２×３０ｍＬ）、１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（２×３０ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（１×３０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮して、トリエステル１１（１．９９ｇ、収率７８％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．７７（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数28】

【化41】

【0252】

９，１０－ジヘキサノイルオキシステアリン酸（１２ａ）：

【0253】

２．０Ｍ ＫＯＨ水溶液（０．９１ｍＬ、１．８２ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のトリエステル１０ａ（１．０５ｇ、２．００ｍｍｏｌ、１．１０当量）の室温ｔ－ＢｕＯＨ（７ｍＬ）溶液に添加した。２０時間撹拌した後、反応混合物を３Ｍ ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ≦２に酸性化し、Ｅｔ_２Ｏ（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（９０：５：５→８５：１０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製して、カルボン酸１２ａ（８０２ｍｇ、収率８６％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．２２（ＳｉＯ_２、８５：１０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）；

【数29】

【化42】

【0254】

９，１０－ジリノレオイルオキシステアリン酸（１２ｂ）：

【0255】

２．０Ｍ ＫＯＨ水溶液（３．００ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のトリエステル１０ｂ（５．６４ｇ、６．６０ｍｍｏｌ、１．１０当量）の室温ｔ－ＢｕＯＨ（７ｍＬ）溶液に添加した。２０時間撹拌した後、反応混合物を３Ｍ ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ≦２に酸性化し、ヘキサン（３×７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（９０：１０：０→８５：１０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製して、カルボン酸１２ｂ（２．３９ｇ、収率６８％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３３（ＳｉＯ_２、８５：１０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）；

【数30】

【化43】

【0256】

９，１０，１２Ｒ－トリヘキサノイルオキシステアリン酸（１３）：

【0257】

２．０Ｍ ＫＯＨ水溶液（１．４７ｍＬ、２．９４ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のテトラエステル１１（１．９８ｇ、３．１０ｍｍｏｌ、１．１０当量）の室温ｔ－ＢｕＯＨ（１０ｍＬ）溶液に添加した。２０時間撹拌した後、反応混合物を３Ｍ ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ≦２に酸性化し、ヘキサン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下、ロータリーエバポレーターで濃縮した。粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（９０：１０：０→８５：１０：５→７５：２０：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製して、カルボン酸１３（１．４０ｇ、収率７８％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３２（ＳｉＯ_２、８０：１５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）；

【数31】

【0258】

例Ｅ：ＩＮＴ－Ｄ０４５の合成

【化44】

２－（（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１０，１３，１６－トリメチル－３－オキソ－６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－ドデカヒドロ－３Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）－２－オキソエチル（（Ｒ，Ｚ）－１２－（リノレオイルオキシ）オクタデカ－９－エン－１－イル）スクシナート（ＩＮＴ－Ｄ０４５）：

【0259】

一般手順Ｄに従い、デキサメタゾン（１５７ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ヘミスクシナート５ｆ（３１０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（９９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）により、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、８０：２０→５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）後に、ＩＮＴ－Ｄ０４５（２７８ｍｇ、収率６８％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．５０（ＳｉＯ_２、５０：５０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数32】

【0260】

例Ｓ：ＩＮＴ－Ｄ０５３の合成

【化45】

（１Ｒ，３Ｓ，Ｚ）－３－ヒドロキシ－５－（２－（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－イリデン）エチリデン）－４－メチレンシクロヘキシル（Ｒ，Ｚ）－１２－アセトキシオクタデカ－９－エノアート及び（１Ｓ，５Ｒ，Ｚ）－５－ヒドロキシ－３－（２－（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－イリデン）エチリデン）－２－メチレンシクロヘキシル（Ｒ，Ｚ）－１２－アセトキシオクタデカ－９－エノアート（ＩＮＴ－Ｄ０５３）：ＪＺ－２５－０５７、０２９

【0261】

ＤＣＣ（５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の（１２Ｒ）－アセトキシオレイン酸（８２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）の撹拌している氷冷１：１ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、固体カルシトリオール（８３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）を添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、ＥｔＯＡｃで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を濃縮して、粗生成物を淡黄色油状物として得、その後フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、８０：２０→６５：３５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１－及び３－アセチル化コンジュゲートの約１：１の混合物（６１ｍｇ、収率４１％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．３３（ＳｉＯ_２、６０：４０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数33】

【0262】

例Ｔ：ＩＮＴ－Ｄ０６８の合成

【化46】

（Ｒ，Ｚ）－１８－（（（１Ｒ，３Ｓ，Ｚ）－３－ヒドロキシ－５－（２－（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－イリデン）エチリデン）－４－メチレンシクロヘキシル）オキシ）－１８－オキソオクタデカ－９－エン－７－イルリノレアート及び（Ｒ，Ｚ）－１８－（（（１Ｓ，５Ｒ，Ｚ）－５－ヒドロキシ－３－（２－（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－イリデン）エチリデン）－２－メチレンシクロヘキシル）オキシ）－１８－オキソオクタデカ－９－エン－７－イルリノレアート（ＩＮＴ－Ｄ０６８）：

【0263】

ＤＣＣ（５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の（１２Ｒ）－リノレオイルオキシオレイン酸（１３５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）の撹拌している氷冷１：１ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に添加し、次いで、氷浴を除去し、結果として得られたものを１５分間撹拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、固体カルシトリオール（８３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２０当量）を添加した。反応混合物を１４時間にわたって加温し、ＥｔＯＡｃで希釈し、１０分間撹拌し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過した。濾液を濃縮して、粗生成物を淡黄色油状物として得、その後フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、９５：５→９０：１０→７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１－及び３－アセチル化コンジュゲートの約１：１の混合物（７５ｍｇ、収率３９％）を無色透明の油状物として得た。
Ｒ_ｆ＝０．２６（ＳｉＯ_２、７０：３０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；

【数34】

【0264】

例Ｗ：二置換カルシトリオールの合成、ＩＮＴ－Ｄ０８７

【0265】

２つの脂質部分で二置換されたカルシトリオール脂質コンジュゲートを調製するための合成スキームの例を以下に提供する：

【化47】

【0266】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製

【0267】

脂質１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）又は１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）又は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに溶解した。ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ及びＰＥＧ－ＤＭＧを、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入し、コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。

【0268】

免疫調節剤を含む脂質コンジュゲート（以下の例では「プロドラッグ」と称される）（図１０Ａ～図１０Ｍを参照）を、上記のように、また以前に記載された（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１９１４７７を参照）ように合成した。

【0269】

脂質コンジュゲート（プロドラッグ）をエタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ又はＴＨＦに溶解した。ＬＮＰは、クロスジャンクションミキサーを使用して、ＤＳＰＣ又はＤＭＰＣ、コレステロール、プロドラッグ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ（４９／４０／１０／１のモル比）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と急速に混合することによって調製した。製剤をＰＢＳに対して透析して、残留エタノールを除去した。オボアルブミンペプチド３２３－３２９（ＯＶＡ）などのペプチド抗原がＬＮＰ内に共製剤化された場合、ペプチドはＰＢＳに溶解され、脂質相と急速に混合される。透析又はタンジェンシャルフロー濾過を使用して、すべての捕捉されていないペプチドを除去した。

【0270】

抗原をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを調製するために、ＩＮＴ－Ａ００２（共同所有のＷＯ２０２１／０２６６４７の３２ページ；出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／０５１０９８、これは参照により本明細書に組み込まれる）などのイオン化可能な脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－ＤＭＧをエタノールに溶解した。プロドラッグをエタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ又はＴＨＦに溶解した。ｍＲＮＡを、ｐＨ４．０で１０ｍＭのクエン酸又は２５ｍＭ酢酸緩衝液に溶解した。ＬＮＰは、エタノール中の脂質コンポーネント（ＩＮＴ－Ａ００２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ／プロドラッグのモル比４５／８．５／３５／１．５／１０）を緩衝水溶液中の核酸と、体積流量比１：３（エタノール対水溶液、合わせた流量２８ｍｌ／分）で室温にて急速に混合することによって調製した。次いで、生成物を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対してｐＨ７．４で２４時間透析して、残留エタノールを除去し、ｐＨを上昇させた。

【0271】

上記のように調製したＬＮＰの物理化学的特性を、その後特徴付けた。粒径は、リン酸緩衝生理食塩水への緩衝液交換後にＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して動的光散乱によって求めた。数加重サイズ及び分布データを使用した。脂質濃度は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）製のコレステロールＥ酵素アッセイキットを使用して総コレステロールを測定することによって求めた。ｍＲＮＡの捕捉は、改変したＱｕａｎｔｉ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して求めた。ＬＮＰ－ｍＲＮＡ系を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。蛍光強度（Ｅｘ／Ｅｍ：４８０／５２０ｎｍ）を比較して、ｍＲＮＡ捕捉％を求めた。

【0272】

例１：ＬＮＰは膵島、膵臓リンパ節及び脾臓のＡＰＣに効率的に蓄積する

【0273】

この例は、ＬＮＰが、薬物及び抗原を対象中に位置するＡＰＣに効果的に送達するための潜在的な送達プラットフォームを提供することを実証している。このことは、他の細胞型での薬物蓄積を回避し、ＡＰＣ集団への効果的な送達を提供することによって、副作用を制限し、用量要求量を低減するという追加の効果を有し得る。

【0274】

膵臓ＡＰＣにおけるＬＮＰの蓄積を求めるために、マウスは、６００ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注射される蛍光マーカーＤｉＯを含むＬＮＰを、２４時間空けて２回の注射を受けた。最初の注射の４８時間後、動物を安楽死させ、膵島及びリンパ節を採取した。膵島を手で選んで純度９９％にした。膵島及びリンパ節を単一細胞懸濁液に分散させ、生存性、ＣＤ４５（汎免疫細胞マーカー）ならびにＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ（ＡＰＣマーカー）について染色し、ＤｉＯ陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。

【0275】

図１Ａ～図１Ｄは、単純な注射によって、ＬＮＰが膵島及び膵臓リンパ節の両方においてＡＰＣによって取り込まれることを示す。さらに、リンパ節及び膵島の両方において示されるように、膵島における内分泌細胞、及びリンパ節における非ＡＰＣ免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む、他の細胞型によるＬＮＰの取込みは制限されている（表１）。

【0276】

【表1】

【0277】

膵島ＡＰＣの標的化に関してＬＮＰの脂質組成物の効果を比較するために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇ ＤＳＰＣ／コレステロール又はＤｉＯを含むイオン化可能なＬＮＰを、膵島、膵臓リンパ節、及び脾細胞の単離の２４時間前に注射した。膵島を手で選んで純度９９％にした。組織を単一細胞懸濁液に分散させ、生存性、ＣＤ４５（汎免疫細胞マーカー）ならびにＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ（ＡＰＣマーカー）について染色し、ＤｉＯ陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。

【0278】

ＡＰＣにおける顕著な蓄積が、膵島、膵臓リンパ節及び脾臓において、リポソーム及びＬＮＰ（ＤＳＰＣ／コレステロール又はイオン化可能）の両方に対して観察される（図２）。
例２：ＬＮＰは、寛容化剤の脂質コンジュゲート（プロドラッグ）を効率的に共封入し、安定に保持することができる
例１に示すように、リポソーム及びＬＮＰ（ＤＳＰＣ／コレステロール及びイオン化可能）の両方は、インビボでＡＰＣに蓄積することができる。本開示の別の非限定的な態様は、その中に共製剤化された２種又はそれを超える異なる免疫調節剤を有するＬＮＰを提供する。プロドラッグは、その親油性の性質に起因して、共製剤化に独特に適している。結果は、１種を超えるプロドラッグを高い封入効率でＬＮＰに製剤化できることを示すだけでなく、プロドラッグがＬＮＰ中に安定に保持され得ることも示す。その上、本明細書の結果は、プロドラッグ戦略が２種又はそれを超える免疫調節剤の組合せの送達に特に適していることを示している。

【0279】

図３に示すように、デキサメタゾン（Ｄ０４５）及びカルシトリオール（Ｄ０５３、Ｄ０６８、Ｄ０８３）脂質プロドラッグの両方は、ヒト血漿中での２時間のインキュベーション後、ＬＮＰ内に安定に保持される。この例は、最大２０モル％のデキサメタゾン及びカルシトリオールプロドラッグを含むＬＮＰを調製する能力を実証しているが、本開示のＬＮＰは、最大９９モル％のプロドラッグを取り込むことができることが示されている。したがって、本開示のプロドラッグ戦略を使用して、追加の免疫調節剤（例えば、それらだけに限定されないが、アセチルサリチル酸、ミコフェノール酸、シロリムス及びタクロリムスなど）の共製剤化を、本明細書に開示のＬＮＰ製剤において達成することができる。

【0280】

ＬＮＰにおける異なる脂質プロドラッグの効率的捕捉を示す結果を、表２に示す。以下の表３、表４及び表５は、これらのプロドラッグの異なる比が捕捉効率に影響を及ぼすことなく達成できることを実証している。

【0281】

【表2】

デキサメタゾン及びカルシトリオール脂質プロドラッグの構造については、ＷＯ２０２０／１９１４７７（ＰＣＴ／ＣＡ２０２０／００００３９；参照により本明細書に組み込まれる）及び本明細書の図１０Ａ～図１０Ｇを参照されたい。

【0282】

【表3】

【0283】

【表4】

【0284】

【表5】

【0285】

例３：ＬＮＰに封入されたカルシトリオール及びデキサメタゾンプロドラッグを用いたＡＰＣの寛容化

【0286】

この例は、本開示のプロドラッグＬＮＰが、エクスビボでＡＰＣを寛容化することができることを実証している。

【0287】

骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、様々なカルシトリオール及びデキサメタゾンプロドラッグ（単独又は組合せ）を含むＬＮＰで４８時間処理した。その後、プロドラッグ製剤がＬＰＳ媒介性活性化を防止できる（すなわち、ＢＭＤＣを寛容化する）かどうかを判定するために、ＢＭＤＣをリポ多糖（ＬＰＳ）刺激を用いて２４時間チャレンジした。

【0288】

特に、マウス骨髄細胞を、標準的な手順に従って、ＡＰＣ（この場合では樹状細胞）に分化させた。簡潔には、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、３０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、及び３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を補充）中で培養することによって、Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から単離した骨髄から生成した。分化の５日後、ＢＭＤＣを、ＬＮＰに封入されたプロドラッグ又は空のＬＮＰ（ＬＮＰ対照）又はビヒクルを用いて４８時間処理し、その後リポ多糖（ＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍＬ）の添加によって２４時間活性化した。次いで、ＢＭＤＣを、下流での分析のために採取した。

【0289】

ＢＭＤＣ（上記）の細胞表面マーカーを特徴付けるために、浮遊及びゆるく付着した細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。５００，０００細胞を、１μｇ／試料のＦｃブロッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ１６、ＣＤ３２カタログ番号１４－０１６１８６）と共に室温で１０分間インキュベートした。ＣＤ８０－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０４７０７）、ＣＤ８６－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０５０１３）、ＭＨＣ ＩＩ－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０７６１３）、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ－ｅＦ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号６５－０８６５－１４）、及びＣＤ１１ｃ－ＢＶ５１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１１７３３７）を製造業者の推奨に従って試料に添加し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、フローサイトメトリーによる分析の前に、試料をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で２回洗浄した。

【0290】

図４に示すように、プロドラッグ処理は、エクスビボでＢＭＤＣを効果的に寛容化した。様々な寛容化プロドラッグ及びプロドラッグの組合せは、寛容原性又は未成熟表現型の誘導と一致して、ＤＣの細胞表面上のＢ７分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）のＬＰＳ誘導性発現を阻害した。活性化されたＤＣは、高いＭＨＣＩＩ及びＢ７分子の発現を有する一方、寛容原性／未成熟ＤＣは、低下したＢ７の発現を有し得る。さらに、図５に示すように、単一のプロドラッグ処理は、同種異系混合白血球反応において機能的な寛容原性ＤＣを誘導し、増殖の完全な防止がいくつかの製剤で観察された。とりわけ、これは非常に堅牢なタイプの免疫応答（器官の移植による拒絶反応に類似）であり、これらの寛容化プロドラッグの有効性を裏付けている。これらの免疫調節剤の組合せを使用した場合、Ｔ細胞の増殖のより大きな寛容又は抑制が観察された（図６及び図７）。

【0291】

例４：プロドラッグ－ＬＮＰは、抗原特異的マウスモデルにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を減少させることができる

【0292】

ＡＰＣ及びＴ細胞がＭＨＣ不一致ドナーに由来する同種異系マウスモデルにおいて、ＡＰＣを寛容化するという以前の実証が成功した。しかしながら、プロドラッグが抗原特異的刺激を減少させる能力を実証するために、抗原特異的マウスモデルを使用した。ＣＤ４ Ｔ細胞をＯＴ－ＩＩマウスから回収した。これらのマウスは、Ｉ－Ａｂ ＭＨＣクラスＩＩに提示された場合に、オボアルブミン３２３－３３９ペプチドフラグメント（ＯＶＡ）に結合し、反応するように操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体を有する。ＡＰＣにＯＶＡを負荷し、これらのＴ細胞と混合すると、Ｔ細胞の堅牢な増殖が観察される（抗原特異的免疫障害を有することに類似）。

【0293】

抗原特異的モデルのために、脾細胞をＯＴ－ＩＩマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５Ｃｂｎ／Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４陽性選択（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、カタログ番号１９８５２、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製し、１０μＭ ＣＦＳＥで標識し、９６ウェルＵ底プレートに１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。同日に、プロドラッグで処理したＣ５７ＢＬ／６ ＢＭＤＣ（上記）を採取し、ＯＶＡペプチドあり／なしでパルスし、３０Ｇｙで照射し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充）中、５０：１、１０：１及び５：１のＴ：ＤＣ比で、３日間ＣＤ４＋細胞と共培養した。その後、細胞を生存性について染色（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ７８０、カタログ番号６５－０８６５）及びＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４－５）、カタログ番号４８－００４２－８２）し、Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈によって定量した。

【0294】

図８に示すように、Ｄ０５３は、ＯＶＡが負荷されたＢＭＤＣによって誘導されるＴ細胞の増殖の量を有意に減少させる。さらに、この応答は、ＯＶＡペプチドを、寛容化プロドラッグを含むＬＮＰに共製剤化した場合に、保存される（図９）。

【0295】

例５：プロドラッグ－ＬＮＰ及びＬＮＰ－ｍＲＮＡの同時処理中に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の減少が観察される

【0296】

先の例では、免疫調節剤－脂質コンジュゲート（別個のＬＮＰにあるか、又はペプチド抗原と同じＬＮＰに共負荷されるかのいずれか）が、Ｏｖａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができることが示された。ペプチド又はタンパク質に加えて、そのコードされたタンパク質に翻訳され、かつその後抗原提示経路に沿ってプロセシングされるｍＲＮＡは、抗原の供給源として使用することができる。

【0297】

この例で使用されたｍＲＮＡは、免疫刺激を最小限に抑えるように改変されており、全長オボアルブミン（Ｏｖａ）タンパク質（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｌ－７２１０）をコードする。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を上記のように調製し、Ｈ－２ｂ ＭＨＣクラスＩＩ（Ｃ５７ＢＬ／６ハプロタイプ）に負荷されたＯｖａ３２３－３３９エピトープを特異的に認識する、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞）と共培養した。増殖を、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈に基づいて評価した。遊離Ｏｖａ３２３－３３９ペプチド（０．１μｇ／ｍＬ）を用いて４時間パルスしたＢＭＤＣを、抗原負荷した対照（遊離Ｏｖａペプチド）とし、非処理ＢＭＤＣを抗原なし対照とした。共培養の４８時間前に、ＢＭＤＣを、ＬＮＰ－ｍＲＮＡのみ又はＬＮＰ－ｍＲＮＡ及びデキサメタゾン（Ｄ０３４）もしくはカルシトリオール（Ｄ０５３）プロドラッグを含むＬＮＰで処理した。

【0298】

図１１に示すように、ＬＮＰ－ｍＲＮＡは、遊離ペプチド抗原と同様のレベルのＴ細胞増殖を誘導した。ＢＭＤＣを、脂質コンジュゲートＤ０３４又はＤ０５３を含むＬＮＰと共処理した場合、増殖のレベルが抑制された。このことは、抗原がペプチド（図８）であるかｍＲＮＡ（図１１）であるかにかかわらず、プロドラッグ－ＬＮＰ（すなわち、脂質コンジュゲート－ＬＮＰ）を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を減少させることができることをさらに実証している。

【0299】

例６：ＬＮＰは、ｍＲＮＡ及び寛容化剤のプロドラッグを効率的に共封入することができる

【0300】

この例では、ｍＲＮＡ及び免疫調節剤－脂質コンジュゲートを同じＬＮＰ内に共負荷する能力が実証されている。最大３つの異なるプロドラッグ及び最大１０モル％を、表６に示す。粒径（Ｚ－Ａｖｅ）、多分散性（ＰＤＩ）又はｍＲＮＡ捕捉にはほとんど影響がなかった。プロドラッグの捕捉も影響を受けなかった（表７）。

【0301】

【表6】

【0302】

【表7】

【0303】

例７：ｍＲＮＡ抗原及び免疫調節剤－脂質コンジュゲートを共負荷したＬＮＰは、ＣＤ４ Ｔ細胞において明確な寛容原性機構を誘発する

【0304】

抗原提示細胞によって提示された抗原を認識すると、Ｔ細胞におけるいくつかの応答は、Ｔ細胞機能の変化（例えば、アネルギー又は疲弊）、抗原特異的エフェクターＴ細胞の抑制された増殖又は欠失、ならびにＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及びＩＬ－１０産生Ｔｒ１を含む抗原特異的制御性Ｔ細胞の増殖を含む、抗原特異的免疫寛容に寄与し得る。抗原をコードするｍＲＮＡ及びプロドラッグを共負荷したＬＮＰを用いた抗原提示細胞の処理が、抗原特異的Ｔ細胞において寛容原性応答を誘導することができるかどうかを判定するために、Ｏｖａ ｍＲＮＡ及び様々な脂質コンジュゲートを共負荷したＬＮＰで前処理した抗原提示細胞（ＢＭＤＣ）との共培養物に対する応答において、Ｏｖａ反応性ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型を研究した。

【0305】

ＢＭＤＣをＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスから作成し、ＬＮＰ製剤で４８時間処理（又は非処理）し、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを用いて最後の２４時間成熟させた。この例のＬＮＰ製剤中の全長ＯｖａをコードするｍＲＮＡは、免疫刺激を最小限に抑えるように改変され（Ｌ－７２１０、ＴｒｉＬｉｎｋ）、遊離Ｏｖａ３２３－３３９ペプチド（０．１μｇ／ｍＬ）を用いて４時間パルスしたＢＭＤＣを、抗原負荷した対照とした。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４ Ｅａｓｙ Ｓｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＯＴ－ＩＩマウス（Ｉ－Ａｂ：Ｏｖａ３２３－３３９特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から単離し、ＣＦＳＥで標識した。共培養の日に、ＢＭＤＣを２回洗浄し、ウェルあたり１００，０００ＣＤ４細胞の密度で、１：５ＢＭＤＣ：ＣＤ４細胞の比でＣＤ４ Ｔ細胞と共培養した。Ｔ細胞を、様々なマーカー（固定可能な生存性色素、ＣＤ４、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４９ｂ、及びＬＡＧ３）との３日間の共培養後に染色し、フローサイトメトリーによって評価した。

【0306】

図１２に示すように、ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｏｖａ ｍＲＮＡのみのＬＮＰで前処理したＢＭＤＣに対して応答して大きく増殖した（遊離Ｏｖａ３２３－３３９ペプチドを用いて負荷したＢＭＤＣによる誘導に匹敵する）が、ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非処理（抗原なし）のＢＭＤＣに対して応答しての増殖は最小限であった。さらに、免疫調節剤－脂質コンジュゲートの非存在下では、Ｏｖａ抗原を提示するＢＭＤＣで刺激したＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋細胞の中で、ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ３＋（Ｔｒ１マーカー）細胞、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（Ｔｒｅｇマーカー）細胞の頻度に変化はなく、ＰＤ１＋及びＣＴＬＡ－４＋細胞の誘導はなかった。対照的に、Ｏｖａ ｍＲＮＡ及び脂質コンジュゲートを共負荷したＬＮＰで前処理したＢＭＤＣは、様々なＣＤ４＋Ｔ細胞応答の変化を誘発した；いくつかのＬＮＰ製剤は、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の減少を示す抗原特異的増殖を減少させた（最上部のパネル）；他のＬＮＰ製剤は、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ１を発現するＣＤ４＋細胞の頻度を増加させた（２番目及び３番目のパネル）；一方、他の製剤は、Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、４番目のパネル）又はＴｒ１（ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ３＋、最後のパネル）の頻度を顕著に誘導した。このように、改変ｍＲＮＡにコードされた抗原及び免疫調節性脂質コンジュゲートの両方を共負荷したＬＮＰは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞において明確な寛容原性応答（アネルギー、制御性細胞の増殖、制限されたエフェクター細胞の増殖）を誘発するように、ＢＭＤＣを誘導することができる。

【0307】

図１３Ａ及び図１３Ｂは、ｍＲＮＡにコードされた抗原単独のＬＮＰでの送達が、（ｍＲＮＡに対する自然免疫応答を最小限に抑えるように改変されているにもかかわらず）Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカイン分泌の誘導を引き起こしたが、様々な免疫調節性プロドラッグの共送達がこの応答を阻害し、多くの場合、ベースラインレベル未満に（ＩＦＮγ及びＴＮＦαの場合のように）抑制さえすることを示す。したがって、ＢＭＤＣへの改変ｍＲＮＡにコードされた抗原との免疫調節プロドラッグの共送達は、抗原特異的Ｔｈ１及びＴｈ２応答を低減させる。

【0308】

例８：ｍＲＮＡにコードされた抗原及び免疫調節性脂質コンジュゲートを共負荷したＬＮＰは、インビボで抗原特異的寛容を誘導することができる。

【0309】

この例は、改変ｍＲＮＡにコードされた抗原及び免疫調節性脂質コンジュゲートを共負荷したＬＮＰが、インビボで抗原特異的寛容を誘導することができることを実証している。

【0310】

雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、同じ粒子に共負荷されるＤ０３４を含む／含まない、改変Ｏｖａ ｍＲＮＡ（Ｌ－７２１０、ＴｒｉＬｉｎｋ）を負荷したＬＮＰを注射した。マウスに、ＬＮＰ（１０μｇ ｍＲＮＡ／マウスとして投与）又は緩衝液のみの合計３回の注射のために、隔週で１回、ｉｐ注射した。Ｏｖａ特異的ＩｇＧ１抗体を、マウス抗Ｏｖａ ＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号５００８３０－９６）によって、最後の注射の２週間後に回収した血清から測定した。

【0311】

図１４に示すように、マウスにＯｖａ ｍＲＮＡを有するＬＮＰを注射することにより、血清中に高レベルの抗Ｏｖａ抗体が誘導され、Ｏｖａ抗原に対する抗原特異的免疫応答を示している。対照的に、Ｏｖａ ｍＲＮＡ及び脂質コンジュゲートＤ０３４を共負荷したＬＮＰを受けたマウスは、抗Ｏｖａ ＩｇＧ１レベルを確実に抑制した。このように、改変ｍＲＮＡによってコードされるＯｖａ抗原に対する体液性免疫応答は、ＬＮＰに免疫調節性脂質コンジュゲートを共負荷することによって低減している。同様の結果（図示せず）が、追加の脂質コンジュゲート（Ｄ０３４＋Ｄ０５３、及びＤ０３４＋Ｄ０５３＋Ｄ０９７）と組み合わせて、Ｄ０３４を用いて共製剤化されたＬＮＰに対して観察された。

【0312】

本発明を前述の例を参照して説明及び例示したが、本発明から逸脱することなく様々な改変及び変更を行うことができることは明らかであろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図10K】

【図10L】

【図10M】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【国際調査報告】