知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ クローズド・ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”の特許一覧
特表2024-533328誘導性プロモーター、それに基づくベクターおよび宿主細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】誘導性プロモーター、それに基づくベクターおよび宿主細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 100Z
C12N15/12 ZNA
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515119
(86)(22)【出願日】2022-09-06
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 RU2022050279
(87)【国際公開番号】W WO2023038547
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】2021126254
(32)【優先日】2021-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516261966
【氏名又は名称】ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】コノノフ，アレクセイ・ウラディミロビッチ
(72)【発明者】
【氏名】ジリアコワ，マリーア・ウラドミロウナ
(72)【発明者】
【氏名】ゴルデーフ，アレクサンドル・アンドリービッチ
(72)【発明者】
【氏名】プシュコワ，マリーア・ユリエウナ
(72)【発明者】
【氏名】ソロウィエフ，ワレリ－・ウラディミロビッチ
(72)【発明者】
【氏名】モロゾフ，ドミトリー・バレンチノビッチ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野、特に汎用の誘導性プロモーター、それに基づくベクターおよび宿主細胞、ならびに前記宿主細胞を生成するための方法に関する。提案された発明は、標的タンパク質、例えば受容体リガンド、例えばサイトカインの活性を分析することを可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位、ならびに最小プロモーターを含む誘導性プロモーター。
【請求項2】
前記転写因子ＳＴＡＴ３の前記結合部位が、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項3】
前記転写因子ＳＴＡＴ５の前記結合部位が、配列番号４、配列番号５または配列番号６を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項4】
ＡＰ－１ファミリー転写因子の前記結合部位が、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項5】
転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の前記結合部位が、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されている、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項6】
前記転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の前記結合部位が、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されており、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の誘導性プロモーター。
【請求項7】
転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の前記結合部位が、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項8】
前記最小プロモーターがＴＡＴＡボックスを含む、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項9】
前記最小プロモーターが配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の誘導性プロモーター。
【請求項10】
５’末端から３’末端方向に、請求項１から９のいずれか一項に記載の誘導性プロモーター、およびレポーター遺伝子を含む、誘導性発現ベクター。
【請求項11】
前記レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子である、請求項１０に記載の誘導性発現ベクター。
【請求項12】
前記ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子が、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の誘導性発現ベクター。
【請求項13】
配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の誘導性発現ベクター。
【請求項14】
標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞を生成するための方法であって、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の誘導性発現ベクターにより細胞を形質転換するステップを含む、方法。
【請求項15】
標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の誘導性プロモーター、およびレポーター遺伝子を含む、宿主細胞。
【請求項16】
前記レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項17】
前記ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子が、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項18】
配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項19】
前記標的タンパク質が受容体リガンドである、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項20】
前記受容体リガンドがサイトカインである、請求項１９に記載の宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野、特に汎用の誘導性プロモーター、それに基づくベクターおよび宿主細胞、ならびに前記宿主細胞を生成するための方法に関する。提案された発明は、標的タンパク質、例えば受容体リガンド、例えばサイトカインの活性を分析することを可能にする。
【背景技術】
【0002】
各種治療上活性なポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体、融合タンパク質、各種サイトカイン、受容体リガンドなど）には、複数の障害および疾患の治療のための有効な医薬生成物としての価値が実証されてきた。
【0003】
新規の治療上活性なポリペプチドを開発するには、所与の治療上活性なポリペプチドの生物活性を決定するために、機能試験を実施することが必要である。
治療上活性なポリペプチドについての生物活性試験は、候補医薬生成物を評価するのに使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代細胞培養物および特殊細胞株の両方を使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏで実験動物を使用して、分子の生物活性を分析することに基づく、一連の技法である。機能試験のデータは、候補の治療上活性なポリペプチドの活性についての情報をもたらす。
治療上活性なポリペプチドについての生物活性試験は、候補医薬生成物を評価するのに使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代細胞培養物および特殊細胞株の両方を使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏで実験動物を使用して、分子の生物活性を分析することに基づく、一連の技法である。機能試験のデータは、候補の治療上活性なポリペプチドの活性についての情報をもたらす。
【0004】
機能試験は以下の群に分けられる：
１）特定の活性（細胞増殖の刺激および阻害、細胞毒性／アポトーシス、抗ウイルス活性、分化、遊走など）についての試験、
２）レポーター遺伝子発現についての試験。
１）特定の活性（細胞増殖の刺激および阻害、細胞毒性／アポトーシス、抗ウイルス活性、分化、遊走など）についての試験、
２）レポーター遺伝子発現についての試験。
【0005】
増殖／細胞毒性調節試験は、最も治療上活性なポリペプチドについての最も汎用的な試験である。これらの試験は、治療上活性なポリペプチドのレベルおよび活性を、それらの、細胞増殖を増大または減少させる能力により測定する。方法は、試験試料に応答した細胞の成長または死を追跡することに基づく（Ｂａｎｋｓ ＲＥ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｉｔｆａｌｌｓ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ．２０００年４月；３７（２）：１３１～８２． ｄｏｉ： １０．１０８０／１０４０８３６００９１１７４１８７． ＰＭＩＤ： １０８１１１４２）。
【0006】
そのような試験は抗増殖活性アッセイに応用され、例えば研究者らは、ＩＦＮ－β－１ａの、ＷＩＳＨ細胞の成長を低減させる能力を評価した（Ｒｅｎａｔｏ Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ－β－１ａ ｍａｊｏｒ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５巻、１号、２０１５年１月、２１～２９頁、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｕ０８２）。
【0007】
別の注目すべき例は、細胞性免疫を評価するのに広く使用されるリンパ球増殖アッセイである（Ｎｉｋｂａｋｈｔ、Ｍ．ら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ； ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９、４５０３（２０１９）． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４１１７１－８）。現在までに、細胞増殖アッセイは、以下の通りの複数のサイトカイン：ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、３、４、５、６、７、８、１０、１３、１５、１９、２１、３３について市販されている。
【0008】
レポーター遺伝子は一般的に、転写および／または翻訳レベルでの、受容体媒介性発現の変化を追跡するための細胞アッセイに使用される。これらの最適化された遺伝子は、プロモーター内の感受性配列の制御下で発現され、転写因子がそこに結合する。
【0009】
Ｐｈｙｌｌｉｓ Ａ．Ｒｅｅｓ、Ｒ．Ｊｏｅｌ Ｌｏｗｙは、時間および労力のかかる増殖アッセイに対する代案として、１型インターフェロンを測定するためのレポーター細胞株の使用について報告した（Ｐｈｙｌｌｉｓ Ａ．ら、Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅａｄｉｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、４６１巻、２０１８、６３～７２頁、ＩＳＳＮ ００２２－１７５９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１８．０６．００７）。
【0010】
Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ Ｍｏｃｋらは、ＮＦ－ｋＢ依存性プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーター株を開発した。アナログが、従来の試験、例えばＣＴＬＬ－２増殖アッセイ、ＩＮＦ－γ誘導性ＩＬ－１２を検出するためのＥＬＩＳＡ、ＴＮＦの細胞毒性の測定により生成された（Ｍｏｃｋ Ｊ．ら、Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０２０；１０（１）：３２３４．２０２０年２月２４日出版． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－６０１８２－４）。
【0011】
Ｚｅｕｎｅｒ ＭＴらは、神経炎症について調査するための、ＮＦ－ｋＢ感受性プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーター細胞株の使用について報告した。このアッセイは、神経細胞における炎症促進性分子およびペプチド、ならびに抗炎症性医薬品の有効性を評価することを可能にする（Ｍａｒｉｅ－Ｔｈｅｒｅｓ Ｚｅｕｎｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ、２０１７、ｄｏｉ： １０．１１５５／２０１７／６２０９８６５）。
【0012】
Ｗａｎｇらは、ＳＩＥ（血清応答配列）の制御下でルシフェラーゼを発現する細胞株に基づく増殖アッセイのアナログを開発した（Ｗａｎｇ Ｌ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ （２０１８）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２０１９．１０７４６６）。
【0013】
従来の特定の活性アッセイと比較した場合のレポーター細胞の利点は以下を含む：
１）容易に再現可能な結果、自動化およびスケール変更、
２）標的医薬生成物に対する特異性、
３）高レベルの感受性、低レベルのバックグラウンド活性化、
４）使用の容易さ、レポーターシグナルの容易な検出。
１）容易に再現可能な結果、自動化およびスケール変更、
２）標的医薬生成物に対する特異性、
３）高レベルの感受性、低レベルのバックグラウンド活性化、
４）使用の容易さ、レポーターシグナルの容易な検出。
【0014】
従来の特定の活性アッセイと比較した場合のレポーター細胞の欠点は、工程が最大数カ月続く可能性があることから、標的医薬生成物に対する個々のレポーター細胞を開発する長い工程を含むことである。
【0015】
ゆえに、わずか１つの個々の治療上活性なポリペプチドではなく、複数の各種治療上活性なポリペプチドの生物活性を決定するのに使用可能なレポーター細胞の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の著者らは、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位、ならびに最小プロモーターを含む汎用の誘導性プロモーター、ならびにそれに基づくベクターおよび宿主細胞を開発し、これらは、わずか１つの個々の治療上活性なポリペプチドではなく、複数の各種治療上活性なポリペプチドの生物活性を決定することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【0017】
一側面において、本発明は、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位、ならびに最小プロモーターを含む誘導性プロモーターに関する。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３の結合部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３の結合部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0018】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ５の結合部位を含み、これは、配列番号４、配列番号５または配列番号６を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0019】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターはＡＰ－１ファミリー転写因子の結合部位を含み、これは、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0020】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されている。
【0021】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されており、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0022】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターを含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターを含む。
【0023】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む最小プロモーターを含む。
一側面において、本発明は、５’末端から３’末端方向に、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む誘導性発現ベクターに関する。
一側面において、本発明は、５’末端から３’末端方向に、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む誘導性発現ベクターに関する。
【0024】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターはホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターはホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
【0025】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞を生成するための方法に関し、前記方法は、上記の誘導性発現ベクターのうちのいずれかにより細胞を形質転換することを含む。
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞を生成するための方法に関し、前記方法は、上記の誘導性発現ベクターのうちのいずれかにより細胞を形質転換することを含む。
【0026】
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む。
【0027】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞はホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞はホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
【0028】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質は受容体リガンドである。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質は受容体リガンドである。
【0029】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質はサイトカインである。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１は、遺伝子レポーター構築物の図である。この構築物は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１依存性プロモーターの制御下の、レポーターホタルルシフェラーゼタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列を含む。非コード領域はＴＡＴＡボックスからなる最小プロモーターを含み、その５’末端には、図に示されるように、３つの反復配列としての、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１の交互の結合部位（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）からなるシス調節配列が位置する。隣接配列は、標的ベクター内の発現カセット周囲の領域に対し相補的であり、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５ＩおよびＢｇｌＩＩの認識部位を含む。
【図2】図２は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１依存性プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする、レポータープラスミドベクターＥ６．９０＿ＳＴＡＴ３＿ＳＴＡＴ５＿ＡＰ－１＿ＦＬｕｃのマップである。ＡｍｐＲは、アンピシリンに対する抵抗性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における選択を可能にし、ポリＡはポリアデニル化シグナル、転写終結因子であり、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１は、ＦＬｕｃ遺伝子発現を調節する調節配列であり、ＭｉｎＰは、ＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターであり、ＦＬｕｃは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼ遺伝子であり、ＨｙｇＲは、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子である。これは、真核細胞培養物における選択を可能にし、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーは、ＳＶ４０ウイルスの真核生物プロモーター／エンハンサーである。
【図3】図３は、ヒトＩＬ１０ＲＡ遺伝子をコードする、発現プラスミドベクターＥ４．２４４＿ＩＬ１０ＲＡ＿ＰＲのマップである。ＨＳ４はＨＳ４インスレーターであり、ｐＣＭＶｅ／ＥＦ１アルファは、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファの構成的ハイブリッドプロモーターであり、ＫｏｚａｋはＫｏｚａｋ配列であり、ＩＬ１０ＲＡはヒトＩＬ１０ＲＡ遺伝子であり、ポリＡはポリアデニル化シグナル、転写終結因子であり、ＳＶ４０エンハンサーは、ＳＶ４０ウイルスのエンハンサーであり、ｂ－グロビンＭＡＲは、ヒトｂ－グロビン遺伝子のＭＡＲ配列（Ｍ５）であり、Ｒｅｐ開始点１は複製開始点部位であり、ＡｍｐＲは、アンピシリンに対する抵抗性をもたらすベータ－ラクタマーゼ遺伝子である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養物における選択を可能にし、Ｆ１開始点はバクテリオファージｆ１複製開始点であり、ＳＶ４０プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの真核生物プロモーターである。ＰｕｒｏＲは、ピューロマイシンに対する真核生物の抵抗性である。この遺伝子は、ピューロマイシンに対する抵抗性を付与する。これは、真核細胞培養物における選択を可能にする。
【図4】図４は、ヒトＩＬ１０ＲＢ遺伝子をコードする、発現プラスミドベクターＥ４．２４５＿ＩＬ１０ＲＢ＿ＢＲのマップである。ＨＳ４はＨＳ４インスレーターであり、ｐＣＭＶｅ／ＥＦ１アルファは、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファの構成的ハイブリッドプロモーターであり、ＫｏｚａｋはＫｏｚａｋ配列であり、ＩＬ１０ＲＡはヒトＩＬ１０ＲＡ遺伝子であり、ポリＡはポリアデニル化シグナル、転写終結因子であり、ＳＶ４０エンハンサーは、ＳＶ４０ウイルスのエンハンサーであり、ｂ－グロビンＭＡＲは、ヒトｂ－グロビン遺伝子のＭＡＲ配列（Ｍ５）であり、Ｒｅｐ開始点１は複製開始点部位であり、ＡｍｐＲは、アンピシリンに対する抵抗性をもたらすベータ－ラクタマーゼ遺伝子である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養物における選択を可能にし、Ｆ１開始点はバクテリオファージｆ１複製開始点であり、ＳＶ４０プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの真核生物プロモーターであり、ＢｌａｓｔｉＲは、ブラストサイジンに対する真核生物の抵抗性である。この遺伝子は、ブラストサイジンに対する抵抗性を付与する。これは、真核細胞培養物における選択を可能にする。
【図6】図６は、ＰＭＡ濃度３３ｎＭに応答した、レポータークローン株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの活性化の倍加の度合を示すヒストグラムである。Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｃ４、Ｃ６、Ｄ１、Ｄ４、Ｃ４＃２、Ｂ０＞、Ｂ１＞、Ｂ２＞、Ｂ３＞は、各種クローンレポーター株の名称であり、初期－未トランスフェクト親細胞、プール－トランスフェクション後の細胞集団。プールおよび未トランスフェクト細胞は対照として使用した。
【図7】図７は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ１０に応答した、ＩＬ１０Ｒを発現するレポータークローン株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの活性化の倍加の度合を示すヒストグラムである。Ａ１．２、Ａ１．４、Ａ１．５、Ａ１．７、Ｃ１．１、Ｃ１．２、Ｃ１．６、Ｃ１．１５、Ｃ１．１１、Ｃ１．１４、Ｃ１．１６、Ａ４＿１、Ａ４＿３、Ａ４＿９、Ａ４＿１０、Ｃ４＿３、Ｃ４＿１２、Ｃ４＿１３、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１２、Ａ１５、Ａ２３、Ａ３１、Ｃ４４、Ｃ４．４、Ｃ１２、Ｃ１６、Ｃ２０、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３１、Ｃ３３、Ｃ４０、Ｃ４１は、ＩＬ１０レポーターの各種クローン株の名称である。
【図9】図９は、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの３つの異なるクローン（Ｃｌ．Ｄ１、ｃｌ．Ｂ３、ｃｌ．Ｃ４＃２）に基づいて生成されたＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬプールの、ＧＡＳ６依存性活性化のグラフである。ＧＡＳ６は、ＡＸＬ依存性細胞シグナル伝達の活性化剤である。Ｃｌ．Ｄ１、ｃｌ．Ｂ３、ｃｌ．Ｃ４＃２）は、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃのクローンである。
【図10】図１０は、各種ＧＡＳ６生成物の濃度に応じた、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬの活性化を示すグラフである。ＧＡＳ６生成物＃１、＃２、＃３は、３つの異なるＧａｓ６生成物である。
【図13】図１３は、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの各種クローン（図１３ではクローンＣ２、図１４ではクローンＨ４、図１５ではクローンＥ８）のＧＡＳ６依存性活性化を示すグラフである。クローンＣ２、Ｈ４およびＥ８は、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼをコードする構築物を使用して、天然のＡＸＬ発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）であるＤＵ１４５細胞株に基づいて生成された、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１細胞株のクローンである。これらのクローンは、ＧＡＳ６プロセシングに対し最大の応答レベルを示した。
【図14】図１４は、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの各種クローン（図１３ではクローンＣ２、図１４ではクローンＨ４、図１５ではクローンＥ８）のＧＡＳ６依存性活性化を示すグラフである。クローンＣ２、Ｈ４およびＥ８は、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼをコードする構築物を使用して、天然のＡＸＬ発現体であるＤＵ１４５細胞株に基づいて生成された、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１細胞株のクローンである。これらのクローンは、ＧＡＳ６プロセシングに対し最大の応答レベルを示した。
【図15】図１５は、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの各種クローン（図１３ではクローンＣ２、図１４ではクローンＨ４、図１５ではクローンＥ８）のＧＡＳ６依存性活性化を示すグラフである。クローンＣ２、Ｈ４およびＥ８は、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼをコードする構築物を使用して、天然のＡＸＬ発現体であるＤＵ１４５細胞株に基づいて生成された、ＤＵ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１細胞株のクローンである。これらのクローンは、ＧＡＳ６プロセシングに対し最大の応答レベルを示した。
【図16】図１６は、ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃのプールおよび個々のクローンのＧＡＳ６依存性活性化のグラフである。Ｃｌ．１、ｃｌ．８、ｃｌ．１０、ｃｌ．１４は、ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃプールから生成された、ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ細胞株のクローンである。プールは、ＡＸＬ過剰発現体（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）である細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬから生成された、細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃであり、そこには、ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子が、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１依存性プロモーターの制御下で導入された。
【発明を実施するための形態】
【0031】
定義および一般的方法
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される技術および科学用語は全て、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される技術および科学用語は全て、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【0032】
さらに、状況により別途必要とされない限り、単数の用語は複数の用語を含むものとし、複数の用語は単数の用語を含むものとする。一般的には、細胞培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医化学および製薬化学の現在の分類および方法、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および核酸のハイブリダイゼーションおよび化学反応は、当業者に周知であり、当技術分野で広く使用される。酵素反応および精製方法は、製造業者のガイドラインに従って、当技術分野で一般的であるように、または本明細書に記載されるように実施される。
【0033】
本明細書で交換可能に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、修飾されているかまたはされておらず、核酸の断片または領域を決定し、非天然ヌクレオチドを含有するかまたは含有せず、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【0034】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドは、非限定的な例として、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲおよび同様のものを使用する、組換えライブラリーまたは細胞ゲノム由来の核酸配列のクローニング、および合成手段を含む、当技術分野で利用可能な任意の手段により得られる全ての核酸配列を非限定的な例として含む。
【0035】
本発明が、天然の染色体環境、すなわち天然の状態のヌクレオチド配列に関しないことも、ここに含まれるべきである。本発明の配列は単離および／または精製されている、すなわち、本発明の配列は、例えば少なくとも部分的に改変された環境をコピーすることにより、直接または間接的に試料採取された。ゆえに、例えば宿主細胞を用いて組換え遺伝学により得られるか、または化学合成により得られる、単離された核酸もここで言及されるべきである。
【0036】
別途示されない限り、用語ヌクレオチド配列はその相補体を包含する。ゆえに、特定の配列を有する核酸は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含する核酸として理解されるべきである。
【0037】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターにより推進される転写および／または翻訳として定義される。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターにより推進される転写および／または翻訳として定義される。
【0038】
発明の詳細な記載
誘導性プロモーター
一側面において、本発明は、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位、ならびに最小プロモーターを含む誘導性プロモーターに関する。
誘導性プロモーター
一側面において、本発明は、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位、ならびに最小プロモーターを含む誘導性プロモーターに関する。
【0039】
本発明による誘導性プロモーターは、受容体リガンド、例えばサイトカインの活性を決定するための、レポーター細胞系における使用について汎用性がある。
誘導性プロモーターは、特定のシグナルに応答して遺伝子発現をもたらすプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、特定のシグナルに応答して遺伝子発現をもたらすプロモーターを指す。
【0040】
本発明の著者らは驚くべきことに、誘導性プロモーター中に、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位が存在することで、リガンドとその受容体との間の相互作用から生成される特定のシグナルに応答した、レポーター遺伝子の発現のレベルを決定することが可能となることを見出し、受容体リガンドは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＮＰ、レプチン、ＮＮＴ－１／ＢＳＦ－３、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１９、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ３７、ＩＬ１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＳＦ３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５、成長ホルモン、プロラクチン、ＴＨＰＯ、ＭＧＤＦ、ＥＰＯ、ＴＳＬＰ、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＬ－１、ＩＬ－１７、ＴＮＦ、ＴＮＦ－α、ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ／ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＩ、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＴＮＦ－Ｃ、ＣＤ７０、４－１ＢＢリガンドまたはＧＡＳ６を含む複数のサイトカインおよび他の受容体リガンドから選択されてよく、ゆえに、前記誘導性プロモーターが、受容体に対するリガンド、例えばサイトカインの活性を決定するための、レポーター細胞系における使用について汎用性となる。
【0041】
転写因子ＳＴＡＴ３の結合部位は、ＴＴＣｎｎｎＧＡＡであるコア部分を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３の結合部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３の結合部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0042】
転写因子ＳＴＡＴ５の結合部位は、ＴＴＣｎｎｎＧＡＡであるコア部分を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ５の結合部位を含み、これは、配列番号４、配列番号５または配列番号６を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ５の結合部位を含み、これは、配列番号４、配列番号５または配列番号６を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0043】
転写因子ＡＰ－１の結合部位は、Ｔ［Ｇ／Ｔ］Ａ［Ｃ／Ｇ］ＴＣＡであるコア部分を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターはＡＰ－１ファミリー転写因子の結合部位を含み、これは、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターはＡＰ－１ファミリー転写因子の結合部位を含み、これは、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列である。
【0044】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されている。
【0045】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されており、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０の、またはそれを超える反復配列として表される。ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１反復配列の最大量は、発現ベクターの容量により制限される。ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１反復配列の量は、本発明による誘導性プロモーターの性能に影響を及ぼさない。
【0046】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは、５’末端から３’末端まで順に、以下の順序：ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１で配列されており、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0047】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡＰ－１の結合部位を含み、これらは配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターを含む。
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターを含む。
【0048】
最小プロモーターは、ＴＡＴＡボックス（Ｈｏｇｎｅｓｓ ｂｏｘ）および転写開始部位を含む、最少の調節配列含有量を有するプロモーターを指し、プロモーターは、特別な調節配列がその前に追加されない限り機能しない。
【0049】
本発明の一部の態様において、誘導性プロモーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む最小プロモーターを含む。
誘導性発現ベクター
一側面において、本発明は、５’末端から３’末端方向に、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む誘導性発現ベクターに関する。
誘導性発現ベクター
一側面において、本発明は、５’末端から３’末端方向に、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む誘導性発現ベクターに関する。
【0050】
本発明による誘導性発現ベクターは、リガンド、例えばサイトカインの、その受容体に対する活性を決定するためのレポーター細胞系を生成するのに汎用性がある。
誘導性発現ベクターは組換えベクターである。
誘導性発現ベクターは組換えベクターである。
【0051】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、ルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
【0052】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターはホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
【0053】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、または赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ）、または酵素ベータ－ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子、またはレポーター遺伝子として使用可能な、蛍光もしくは発光タンパク質をコードする任意の他の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
【0054】
本発明の一部の態様において、誘導性発現ベクターは、レポーターポリペプチドの遺伝子の発現をもたらす調節配列を含む異種核酸配列を含む。
「標的細胞において異種核酸配列によりコードされる生成物の発現をもたらす調節配列」は、本発明において使用される場合、クローニング先のコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、誘導性プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；および必要に応じて、タンパク質分泌を向上させる配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物次第で異なり、原核生物では、そのような制御配列は概して、リボソーム結合部位のプロモーター、および転写終結配列を含み、真核生物では、一般的にそのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「調節配列」は、その存在が発現およびプロセシングにとって重要である少なくとも全ての成分を包含する。
「標的細胞において異種核酸配列によりコードされる生成物の発現をもたらす調節配列」は、本発明において使用される場合、クローニング先のコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、誘導性プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；および必要に応じて、タンパク質分泌を向上させる配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物次第で異なり、原核生物では、そのような制御配列は概して、リボソーム結合部位のプロモーター、および転写終結配列を含み、真核生物では、一般的にそのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「調節配列」は、その存在が発現およびプロセシングにとって重要である少なくとも全ての成分を包含する。
【0055】
用語「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）」または「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、本明細書で使用される場合、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことができる。エンハンサー配列は、一般的にはプロモーター配列から５’方向に位置するか、またはコードＤＮＡ配列（例えば単数または複数の組換え産物に転写または翻訳されるＤＮＡ配列）の下流もしくは配列内に位置しうる。ゆえに、エンハンサー配列は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列の、１００塩基対、２００塩基対、または３００またはそれを超える塩基対分上流または下流に位置しうる。エンハンサー配列は、ＤＮＡ配列から発現される組換え産物の量を、単一のプロモーター配列に伴う発現レベルを超えて増大させることができる。複数のエンハンサー配列は当業者にとって容易に利用可能である。
【0056】
本発明の一部の態様において、汎用の誘導性発現ベクターは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＮＰ、レプチン、ＮＮＴ－１／ＢＳＦ－３、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１９、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ３７、ＩＬ１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＳＦ３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５、成長ホルモン、プロラクチン、ＴＨＰＯ、ＭＧＤＦ、ＥＰＯ、ＴＳＬＰ、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＬ－１、ＩＬ－１７、ＴＮＦ、ＴＮＦ－α、ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ／ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＩ、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＴＮＦ－Ｃ、ＣＤ７０、４－１ＢＢリガンドまたはＧＡＳ６である、複数の各種受容体リガンドの活性を分析するための、汎用のレポーター細胞株として使用される宿主細胞を発生させるのに使用されてよい。
【0057】
宿主細胞およびそれを生成するための方法
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞を生成するための方法に関し、前記方法は、上記の誘導性発現ベクターのうちのいずれかにより細胞を形質転換することを含む。
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞を生成するための方法に関し、前記方法は、上記の誘導性発現ベクターのうちのいずれかにより細胞を形質転換することを含む。
【0058】
一側面において、本発明は、標的タンパク質の活性を分析するための宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、上記の誘導性プロモーターのうちのいずれかおよびレポーター遺伝子を含む。
【0059】
本発明による上記の誘導性プロモーターの特徴により、本発明による宿主細胞は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＮＰ、レプチン、ＮＮＴ－１／ＢＳＦ－３、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１９、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ３７、ＩＬ１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＳＦ３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５、成長ホルモン、プロラクチン、ＴＨＰＯ、ＭＧＤＦ、ＥＰＯ、ＴＳＬＰ、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＬ－１、ＩＬ－１７、ＴＮＦ、ＴＮＦ－α、ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ／ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＩ、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＴＮＦ－Ｃ、ＣＤ７０、４－１ＢＢリガンドまたはＧＡＳ６である、複数の各種受容体リガンドの活性を分析するのに使用されてよい。
【0060】
本発明による宿主細胞は組換え宿主細胞である。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、ルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、ルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
【0061】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、ホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞はホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞はホタルルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含み、これは配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
【0062】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、または赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ）、または酵素ベータ－ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子、またはレポーター遺伝子として使用可能な、蛍光もしくは発光タンパク質をコードする任意の他の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、または赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ）、または酵素ベータ－ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子、またはレポーター遺伝子として使用可能な、蛍光もしくは発光タンパク質をコードする任意の他の遺伝子であるレポーター遺伝子を含む。
【0063】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質は受容体リガンドである。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質はサイトカインである。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は、標的タンパク質の活性を分析するのに使用され、標的タンパク質はサイトカインである。
【0064】
本発明の一部の態様において、宿主細胞は真核細胞である。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
形質転換のための宿主として使用される哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、利用可能な複数の不死化細胞株を含む。これらは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および複数の他の細胞株を含む。細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、生成されるタンパク質の必要な特徴をもたらすかを決定することにより選択される。使用可能な他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞である。植物宿主細胞は、例えばタバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどを含む。細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種を含む。酵母宿主細胞は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
本発明の一部の態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
形質転換のための宿主として使用される哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、利用可能な複数の不死化細胞株を含む。これらは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および複数の他の細胞株を含む。細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、生成されるタンパク質の必要な特徴をもたらすかを決定することにより選択される。使用可能な他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞である。植物宿主細胞は、例えばタバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどを含む。細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種を含む。酵母宿主細胞は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
【0065】
本発明の上記の宿主細胞は、ヒト胚を使用して生成される宿主細胞を指さない。
本発明の上記の宿主細胞は、ヒト生殖系細胞の遺伝的完全性を改変することにより生成される宿主細胞を指さない。
本発明の上記の宿主細胞は、ヒト生殖系細胞の遺伝的完全性を改変することにより生成される宿主細胞を指さない。
【実施例】
【0066】
以下の実施例は、本発明のよりよい理解のために提供される。これらの実施例は説明のためのものでしかなく、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【0067】
本明細書で引用される出版物、特許、および特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にする目的で、説明および例として詳細に記載されてきたが、本発明の教示に照らせば、添付の態様の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変がそこになされてよいことが、当業者には容易に明らかである。
【0068】
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者のプロトコルに従って使用した。
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者のプロトコルに従って使用した。
【0069】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。単数の制限部位に隣接する、３００～１４００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより構築し、それに続いて制限部位を介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。単数の制限部位に隣接する、３００～１４００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより構築し、それに続いて制限部位を介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【0070】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒシークエンシングにより決定した。
ＤＮＡ配列分析および配列データ管理
Ｕｎｉｐｒｏ’ｓ ＵＧＥＮＥスイートバージョン１．２９およびＳｎａｐＧｅｎｅ Ｖｉｅｗｅｒを、配列生成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示に使用した。
ＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒシークエンシングにより決定した。
ＤＮＡ配列分析および配列データ管理
Ｕｎｉｐｒｏ’ｓ ＵＧＥＮＥスイートバージョン１．２９およびＳｎａｐＧｅｎｅ Ｖｉｅｗｅｒを、配列生成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示に使用した。
【0071】
発現ベクター
レポーター遺伝子を含むベクターは、出願書類に記載されるように、レポーター構築物：Ｅ． ｃｏｌｉにおいて前記プラスミドの複製をもたらす複製開始部位に加えて、選択的抗生物質（アンピシリン）に対するＥ． ｃｏｌｉの抵抗性を付与する遺伝子を含んでいた。
レポーター遺伝子を含むベクターは、出願書類に記載されるように、レポーター構築物：Ｅ． ｃｏｌｉにおいて前記プラスミドの複製をもたらす複製開始部位に加えて、選択的抗生物質（アンピシリン）に対するＥ． ｃｏｌｉの抵抗性を付与する遺伝子を含んでいた。
【0072】
以下に記載されるベクターの遺伝子構築物を、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成、および例えば対応するベクターにおける独自の制限部位を使用しての、対応する核酸セグメントの接続による、既知の組換え方法および技法を使用する構築により構築した。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。一過性トランスフェクションについては、形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ培養物からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製した。
【0073】
実施例１．ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ－１感受性プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポータープラスミドベクターの生成。
汎用のレポーター構築物を発生させるため、我々は、多くの各種シグナル伝達分子の活性を媒介する転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１を選択した。
汎用のレポーター構築物を発生させるため、我々は、多くの各種シグナル伝達分子の活性を媒介する転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１を選択した。
【0074】
我々は、ＴＡＴＡボックスからなる最小プロモーターを含む調節配列を創出し、プロモーターの５’末端には転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＰ－１のための結合部位（ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１７１３－１０；ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ００１７４８２００）を３つの反復配列として配置した（図１）。この転写因子結合部位の組み合わせにより、広い適用範囲を有する誘導性プロモーターを生成することが可能となる。
【0075】
アレイを構築するため、我々は、２０ｂｐの重複を有する、６つの６０ｂｐ長の部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドからの合成により構築を実施し、プラスミドベクターに対し相補的な領域に隣接する２４９ｂｐ長の断片を得た。生じた配列を、ライゲーション非依存クローニングによりベクターＥ６．９０内にクローニングした（図２）。クローニングされた核酸配列をＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【0076】
実施例２．安定な発現体細胞株を創出するための、ＩＬ－１０受容体サブユニットをコードするプラスミドベクターの生成。
特定の細胞試験におけるレポーター株を評価するため、我々は、レポーター細胞の表面上にＩＬ－１０受容体を発現させた。
特定の細胞試験におけるレポーター株を評価するため、我々は、レポーター細胞の表面上にＩＬ－１０受容体を発現させた。
【0077】
ヒトＩＬ－１０Ｒａ遺伝子（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１３６５１）およびヒトＩＬ－１０Ｒｂ遺伝子（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０８３３４）の天然の配列を発生させるため、我々は、ドナーの末梢血単核細胞から総ＲＮＡを単離し、これに基づいてｃＤＮＡを合成した。生じたｃＤＮＡライブラリーを、制限部位に隣接する標的配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。発現ベクター内の標的遺伝子を、制限－ライゲーション方法によりクローニングした（図３、図４）。クローニングされた核酸配列をＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【0078】
実施例３．ＨＥＫ２９３ Ｎｆ－ｋＢの活性化。
我々は、ＰＭＡ活性化剤を使用してクローンレポーター株をスクリーニングした。この薬剤はプロテインキナーゼＣに直接影響を及ぼし、ゆえにレポーター遺伝子発現を活性化するシグナル伝達カスケードを引き起こす（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１３７３－００５－１２１０－５；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｍ２６１）。ＰＭＡの最良の用量を決定するため、我々は、ＨＥＫ２９３ Ｎｆ－ｋＢレポーター株の活性化を伴う実験を行った。細胞を、１ウェルあたり３＊１０５細胞で、接着培養物用の白色９６ウェル培養プレートに播種し、ＰＭＡ活性化剤を、グラフに示される濃度で、最大１５０μｌでウェルに添加した。溶液は全て、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ成長培地で調製した。プレートを、５％ＣＯ２の存在下の湿潤雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを排水させ、溶解成分を有するルシフェリン基質１００μｌを添加し、プレートを暗所に１０分間放置し、その後、ＳｐａｒｋＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ２．１ソフトウェアパッケージ（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用するプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。
我々は、ＰＭＡ活性化剤を使用してクローンレポーター株をスクリーニングした。この薬剤はプロテインキナーゼＣに直接影響を及ぼし、ゆえにレポーター遺伝子発現を活性化するシグナル伝達カスケードを引き起こす（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１３７３－００５－１２１０－５；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｍ２６１）。ＰＭＡの最良の用量を決定するため、我々は、ＨＥＫ２９３ Ｎｆ－ｋＢレポーター株の活性化を伴う実験を行った。細胞を、１ウェルあたり３＊１０５細胞で、接着培養物用の白色９６ウェル培養プレートに播種し、ＰＭＡ活性化剤を、グラフに示される濃度で、最大１５０μｌでウェルに添加した。溶液は全て、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ成長培地で調製した。プレートを、５％ＣＯ２の存在下の湿潤雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを排水させ、溶解成分を有するルシフェリン基質１００μｌを添加し、プレートを暗所に１０分間放置し、その後、ＳｐａｒｋＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ２．１ソフトウェアパッケージ（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用するプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。
【0079】
このようにＰＭＡ活性化剤の最良の濃度３３ｎＭを選択した（図５）。
実施例４．安定なレポーター細胞株の生成。
レポーター細胞株についての重要な指標は、試験分子に応答した活性化の倍加の度合、およびバックグラウンド活性化のレベルである。
実施例４．安定なレポーター細胞株の生成。
レポーター細胞株についての重要な指標は、試験分子に応答した活性化の倍加の度合、およびバックグラウンド活性化のレベルである。
【0080】
実施例１のレポーター構築物を含むプラスミドベクターによりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３、ＵＳＡ）を使用して、安定なレポーター細胞株を生成した。生じた安定なプールを、限界希釈クローニングによりクローニングした。クローン株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃをスクリーニングするため、我々はルシフェラーゼ発現活性化試験を行った。細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１＊１０５細胞で播種し、ウェルに最大最終体積１５０μｌで、３３ｎＭ ＰＭＡ活性化剤を添加した。溶液は全て、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ成長培地で調製した。プレートを、５％ＣＯ２の存在下の湿潤雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを排水させ、溶解成分を有するルシフェリン基質１００μｌを添加し、プレートを暗所に１０分間放置し、その後、ＳｐａｒｋＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ２．１ソフトウェアパッケージ（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用するプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。
【0081】
このようにレポーター細胞株を生成し、これは、高い活性化の倍加の度合および低レベルのバックグラウンド活性化を示す（図６）。
実施例５．ＩＬ１０に特異的なレポーター株の生成。
実施例５．ＩＬ１０に特異的なレポーター株の生成。
【0082】
特定の細胞試験におけるレポーター株を評価するため、我々は、レポーター細胞の表面上にＩＬ－１０受容体を発現させた。この目的のため、実施例４で生成されたＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃレポーター細胞株を、実施例２で生成されたＩＬ－１０受容体サブユニットをコードするプラスミドベクターによりトランスフェクトした。ＩＬ１０受容体を発現するクローンレポーター株をスクリーニングするため、我々は実施例３に記載されるルシフェラーゼ発現活性化試験を実施した。濃度１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ１０を活性化剤として使用した。
【0083】
活性化の倍加の度合に基づくクローンのスクリーニングおよび選択が、汎用の株に基づくＩＬ１０特異的レポーター株をもたらした（図７）。
実施例６．ＩＬ１０活性決定試験
候補医薬生成物の活性を評価するのにレポーター株が使用される。我々は、グラフに示される各種濃度のＩＬ１０活性化剤に応答したルシフェラーゼ発現活性化試験を実施した。試験設計は実施例３に記載される。
実施例６．ＩＬ１０活性決定試験
候補医薬生成物の活性を評価するのにレポーター株が使用される。我々は、グラフに示される各種濃度のＩＬ１０活性化剤に応答したルシフェラーゼ発現活性化試験を実施した。試験設計は実施例３に記載される。
【0084】
我々は最終的に、特定の活性化剤に対するレポーター細胞株の用量依存性応答を観察した（図８）。
実施例７．汎用のレポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃに基づく、Ｇａｓ６ ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１生成物による細胞内シグナル伝達のＡＸＬ媒介性活性化を評価するための、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬの創出。
実施例７．汎用のレポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃに基づく、Ｇａｓ６ ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１生成物による細胞内シグナル伝達のＡＸＬ媒介性活性化を評価するための、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬの創出。
【0085】
レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬを発生させるため、我々は、汎用のレポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ：ｃｌ．Ｄ１、ｃｌ．Ｂ３およびｃｌ．Ｃ４＃２の３つのクローンを使用し、それらに基づいて、我々は、埋め込まれ、構成的に発現されたＡＸＬ受容体遺伝子を有する３プールの細胞をそれぞれ生成した。これらのプールのＡＸＬ媒介性活性化を試験した。試験を、発光アッセイ用に設計された９６ウェル培養プレートにおいて実施した。懸濁液は、各ウェルに３０，０００のＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ細胞、および図９に示される濃度のＡＸＬリガンドＧＡＳ６を含有していた。ウェル中の細胞懸濁液の最終体積は１００μｌであり、懸濁液の成分は全て、ウシ胎児血清不含のＤＭＥＭ培地で調製した。成分を全て添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートし、次いで、発光アッセイキットを使用して、我々はウェルにおける発光強度を測定した。プレートリーダーを使用して測定を実施した。ＧＡＳ６の存在下での所与のプールについての発光レベルの、ＧＡＳ６の非存在下での発光レベルに対する比として活性化レベルを算出した。
【0086】
実施例８．レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬにおける、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１のＡＸＬ媒介性活性化についての各種ＧＡＳ６生成物の試験。
【0087】
実施例７に記載される手順と同様に試験を実施し（濃度２μｇ／ｍｌのＧＡＳ６の存在下で）、活性化には、我々は、ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ（細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ：ｃｌ．Ｄ１に基づいて生成されたプール、実施例７を参照のこと）およびグラフに示される濃度の各種ＧＡＳ６調製物を使用した（図１０）。
【0088】
実施例９．ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬクローンのＡＸＬ媒介性活性化の分析。
細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ：ｃｌ．Ｄ１、ｃｌ．Ｂ３およびｃｌ．Ｃ４＃２に基づいて生成されたプール（実施例７を参照のこと）から、我々は、試験（濃度２μｇ／ｍｌのＧＡＳ６の存在下で、実施例７と同様に実施）において、ＧＡＳ６依存性活性化を示した個々のクローンを選択した。最大レベルの活性化を示したクローンを、ｃｌ．Ｄ１に基づいて生成された細胞プールから選択した。所与のプールの各種クローンおよび初期プール自体を含有する９６ウェルプレートのうちの１つにおける活性化レベルが表１に示され、これは非活性化細胞に対する活性化を示し、Ｈ１１ウェルはプールに対応する。灰色は、さらなる研究に使用されたクローンＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ（ｃｌ．１３）に対応するウェルを示す。
細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ：ｃｌ．Ｄ１、ｃｌ．Ｂ３およびｃｌ．Ｃ４＃２に基づいて生成されたプール（実施例７を参照のこと）から、我々は、試験（濃度２μｇ／ｍｌのＧＡＳ６の存在下で、実施例７と同様に実施）において、ＧＡＳ６依存性活性化を示した個々のクローンを選択した。最大レベルの活性化を示したクローンを、ｃｌ．Ｄ１に基づいて生成された細胞プールから選択した。所与のプールの各種クローンおよび初期プール自体を含有する９６ウェルプレートのうちの１つにおける活性化レベルが表１に示され、これは非活性化細胞に対する活性化を示し、Ｈ１１ウェルはプールに対応する。灰色は、さらなる研究に使用されたクローンＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ（ｃｌ．１３）に対応するウェルを示す。
【0089】
【表1】
【0090】
実施例１０．ＧＡＳ６の存在下でのインキュベーション時間に応じた、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬの活性化の研究。
実施例７に記載される手順と同様に試験を実施し、我々は、活性化のため、レポーター株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ（ｃｌ．１３）の細胞および濃度２μｇ／ｍｌのＧＡＳ６を使用し（図１１）、成分全てを添加した後、プレートをグラフに示される時間インキュベートし、次いでウェルにおける発光強度を決定した。前記濃度のＧＡＳ６の存在下での発光値の、同じインキュベーション時間での、ＧＡＳ６バリアントの非存在下での発光値に対する比として、活性化のレベルを算出した。最大レベルの活性化が、２４時間インキュベーション中に観察された。
実施例７に記載される手順と同様に試験を実施し、我々は、活性化のため、レポーター株ＨＥＫ２９３＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ＿ＡＸＬ（ｃｌ．１３）の細胞および濃度２μｇ／ｍｌのＧＡＳ６を使用し（図１１）、成分全てを添加した後、プレートをグラフに示される時間インキュベートし、次いでウェルにおける発光強度を決定した。前記濃度のＧＡＳ６の存在下での発光値の、同じインキュベーション時間での、ＧＡＳ６バリアントの非存在下での発光値に対する比として、活性化のレベルを算出した。最大レベルの活性化が、２４時間インキュベーション中に観察された。
【0091】
実施例１１．ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１細胞内シグナル伝達のＡＸＬ媒介性活性化を評価するための、天然に存在するＤｕ１４５細胞株に基づくレポーター細胞株の発生。
【0092】
ＡＸＬリガンドＧＡＳ６によるＤｕ１４５細胞増殖の活性化を試験するため（図１２）、我々は、天然のＡＸＬ発現体であるＤｕ１４５細胞株を使用した。接着培養物用の９６ウェル培養プレートにおいてアッセイを実施した。懸濁液は、各ウェルに、５，０００のＤｕ１４５細胞、およびグラフに示される濃度のＡＸＬリガンドＧＡＳ６を含有していた。ウェル中の細胞懸濁液の最終体積は１００μｌであり、懸濁液の成分は全て、０．３％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で調製した。成分全てを添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いでアラマーブルー試薬１０ｍｌを各ウェルに添加し、次いでタブレットをオービタルシェーカーで振とうし、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。プレートリーダーを使用して、励起波長５４４ｎｍおよび放出波長５９０ｎｍで蛍光を測定した。
【0093】
我々は、天然のＡＸＬ発現細胞株に基づく、ＡＸＬシグナル伝達のＧＡＳ６依存性活性化に対し感受性のレポーター細胞株を発生させるため、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼをコードするＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ遺伝子を含むＤｕ１４５細胞の安定なクローンを生成した。
【0094】
試験において活性化を示したクローンを選択した（図１３～１５）。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいて試験を実施した。実験前日、ＡＸＬリガンドＧＡＳ６をプラスチック上に固定化した：我々は、ＤＰＢＳ中濃度５μｇ／ｍｌのＧＡＳ６溶液を調製し、１００μＬを各プレートウェルに添加した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２とともに１６時間インキュベートした。次に我々は、５０，０００のＤｕ１４５＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃ細胞を含む懸濁液を添加した。細胞懸濁液の最終体積は１ウェルあたり１００μＬであった。細胞懸濁液を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートし、次いで、発光アッセイキットを使用して、我々はウェルにおける発光強度を測定した。プレートリーダーを使用して測定を実施した。
【0095】
実施例１２．ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１細胞内シグナル伝達のＡＸＬ媒介性活性化を評価するための、ＡＸＬを過剰発現する細胞株ＨＥＫ－２９３－ＡＸＬに基づくレポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃの創出。
【0096】
レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１＿ＦＬｕｃを創出するため、我々は、我々が生成した、ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む細胞のプールに基づく、ＡＸＬ過剰発現体である細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬを使用した。次に、我々はこのプールから個々のクローンを選択し、これらは試験において活性化を示した（図１６）。ＧＡＳ６ ２μｇ／ｍｌの濃度で、実施例７に記載される手順と同様に試験を実施した。ＧＡＳ６の存在下での所与のクローンについての発光値の、ＧＡＳ６の非存在下での発光値に対する比として、活性化のレベルを算出した。
【0097】
実施例１３．細胞数に応じた、レポーター細胞株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１の活性化の研究。
ＧＡＳ６ ２μｇ／ｍｌの濃度で、実施例７に記載される手順と同様に試験を実施し、レポーター株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１の細胞を、グラフに示されるように９６ウェルプレートの１ウェルあたりの細胞数で活性化に使用した（図１７）。ウェルが２５，０００～５０，０００細胞のレポーター株を含有していた場合に、最大レベルの活性化が観察された。
ＧＡＳ６ ２μｇ／ｍｌの濃度で、実施例７に記載される手順と同様に試験を実施し、レポーター株ＨＥＫ２９３＿ＡＸＬ＿ＳＴＡＴ３－ＳＴＡＴ５－ＡＰ１の細胞を、グラフに示されるように９６ウェルプレートの１ウェルあたりの細胞数で活性化に使用した（図１７）。ウェルが２５，０００～５０，０００細胞のレポーター株を含有していた場合に、最大レベルの活性化が観察された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】