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特表2024-533335オリゴヌクレオチド二本鎖におけるセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチド二本鎖におけるセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6816 20180101AFI20240905BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515136
(86)(22)【出願日】2022-09-08
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 US2022076091
(87)【国際公開番号】W WO2023039459
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/242,208
(32)【優先日】2021-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505243216
【氏名又は名称】メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ハーキンズ，セス ビー．
(72)【発明者】
【氏名】ブレイク，ティモシー ジェー．
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR38
4B063QR56
4B063QS34
4B063QS36
(57)【要約】
試料中のオリゴヌクレオチドを検出するための方法、具体的には、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出するための方法が本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化する方法であって、前記方法が、（ａ）前記試料を、プローブのセットを含む組成物と接触させることであって、前記プローブのセットが、
（ｉ）支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブ、並びに
（ｉｉ）前記支持体表面に固定化された第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブを含み、
前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、
前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス結合部分が、前記アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、接触させることと、
（ｂ）前記プローブを前記試料とともにインキュベートして、
（ｉ）前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖とハイブリダイズした前記センスプローブを含むセンス複合体、及び
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖とハイブリダイズした前記アンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体を含む、ハイブリダイゼーション複合体を含む、ハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
（ｃ）前記支持体表面を、前記センスプローブ及び前記アンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが前記支持体表面に固定化された前記第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ハイブリダイゼーション混合物と接触させ、前記ハイブリダイゼーション混合物中の前記ハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、
（ｄ）前記支持体表面における前記標識の存在に基づいて、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を検出又は定量化することと、を含む、方法。
【請求項2】
（ｃ）が、（Ｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体の前記第１のオリゴヌクレオチドタグ及び前記第２のオリゴヌクレオチドタグが、前記支持体表面で前記第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、前記支持体表面を前記ハイブリダイゼーション混合物と接触させて、前記ハイブリダイゼーション複合体を前記支持体表面に固定化することと、
（ｉｉ）前記固定化したハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｃ）が、（ｉ）前記ハイブリダイゼーション混合物を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させて、反応混合物を形成することと、
（ｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体の前記第１のオリゴヌクレオチドタグ及び前記第２のオリゴヌクレオチドタグが、前記支持体表面に固定化された前記第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、前記支持体表面を（ｉ）の前記反応混合物と接触させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々、個々に、約８～約５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々、個々に、約１６～約３０ヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖が、ＤＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖が、ＲＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖が、ＤＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖が、ＲＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖、アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方が、個々に、１つ以上の修飾核酸を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖、前記アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方が、個々に、５’－コンジュゲート又は３’－コンジュゲートを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、α－トコフェロール、アプタマー、抗体、コレステロール、スクアレン、脂肪酸、又はヌクレオリピドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記センスプローブの前記センス結合長が、前記センス鎖の前記センス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記センス結合長が、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合長が、前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記アンチセンス結合長が、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、第１のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、前記第１の捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドタグ長が、前記第１の捕捉オリゴヌクレオチド長と同じである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、第１のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、前記第１の捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドタグ長が、前記第１の捕捉オリゴヌクレオチド長よりも短い、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記第２のオリゴヌクレオチドタグが、第２のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチドが、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、前記第２のオリゴヌクレオチドタグ長が、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチド長と同じである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記第２のオリゴヌクレオチドタグが、第２のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチドが、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、前記第２のオリゴヌクレオチドタグ長が、前記第２の捕捉オリゴヌクレオチド長よりも短い、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記センスプローブが、ＤＮＡを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＤＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記センスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記センスプローブの前記センス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＤＮＡを含み、前記センスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記アンチセンスプローブが、ＤＮＡを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記アンチセンスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＤＮＡを含み、前記アンチセンスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項36】
前記センスプローブが、ＲＮＡを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記センスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記センスプローブの前記センス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＲＮＡを含み、前記センスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項41】
前記アンチセンスプローブが、ＲＮＡを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＲＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記アンチセンスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＲＮＡを含み、前記アンチセンスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項46】
前記センスプローブ、前記アンチセンスプローブ、又はその両方が、１つ以上の修飾核酸を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
１つ以上の修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
１つ以上の修飾ヌクレオチドが、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記一本鎖特異的ヌクレアーゼが、一本鎖特異的ＤＮａｓｅを含む、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記一本鎖特異的ＤＮａｓｅが、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、又はマングビーンヌクレアーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記一本鎖特異的ヌクレアーゼが、一本鎖特異的ＲＮａｓｅを含む、請求項３６～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記一本鎖特異的ＲＮａｓｅが、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅＯＮＥ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
（ａ）～（ｃ）が、同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項54】
（ａ）～（ｃ）が、順次に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項55】
（ｂ）におけるハイブリダイゼーション条件が、（ｉ）前記プローブを前記試料第１の温度でインキュベートして、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を変性させることと、
（ｉｉ）前記プローブを前記オリゴヌクレオチド二本鎖の変性したセンス鎖及び変性したアンチセンス鎖とともに第２の温度でインキュベートして、前記センスプローブ及び前記アンチセンスプローブを前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖にハイブリダイズさせることと、を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記センス複合体及び前記アンチセンス複合体を、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
（ｂ）における前記ハイブリダイゼーション条件が、（ｉ）前記プローブを前記試料約６０℃～約９５℃の第１の温度で約１分～約１５分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）前記プローブを前記試料とともに、約１０℃～約６５℃の第２の温度で約３０秒～約５分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記プローブを前記試料とともに、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
（ｂ）における前記ハイブリダイゼーション条件が、（ｉ）前記プローブを前記試料約９５℃の第１の温度で約２分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）前記プローブを前記試料とともに、約６５℃の第２の温度で約１分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記プローブを前記試料とともに、約４℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
約１℃／秒～約２℃／秒のステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間の第１の温度遷移速度を含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項60】
約１．８℃／秒のステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間の第１の温度遷移速度を含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項61】
ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に約０．０５℃／秒～約１℃／秒の第２の温度遷移速度を含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項62】
約０．１℃／秒のステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）との間の第２の温度遷移速度を含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項63】
前記プローブが、希釈剤５４又はＮ－ＰＬＥＸハイブリダイゼーション緩衝液１若しくは２を含む緩衝液中で前記試料とともにインキュベートされる、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記試料が複数のオリゴヌクレオチド二本鎖を含み、（ａ）における前記組成物が複数のプローブのセットを含み、各プローブのセットが、固有のオリゴヌクレオチド二本鎖の固有のセンス又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする、請求項１～６３のいずれか一項記載の方法。
【請求項65】
（ｃ）が、前記支持体表面を前記センス複合体及び前記アンチセンス複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１５分～約１２時間インキュベートすることを含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
（ｃ）が、前記支持体表面を前記センス複合体及び前記アンチセンス複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１時間～約２時間インキュベートすることを含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記支持体表面が、前記センス複合体及び前記アンチセンス複合体とともに、振盪しながらインキュベートされる、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項68】
（ｃ）が、前記支持体表面を前記センス複合体及び前記アンチセンス複合体とともに、約７０５ｒｐｍで振盪しながら、約３７℃の温度で約１時間インキュベートすることを含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
（ａ）における前記組成物が、約２０ｐＭ～約１０ｎＭのセンスプローブを含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
（ａ）における前記組成物が、約２０ｐＭ～約１０ｎＭのアンチセンスプローブを含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記試料が、生体試料を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記試料が、未処理の生体試料を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記試料が、前処理した生体試料を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項74】
前記試料が、精製した試料を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項75】
前記試料が、沈殿、遠心分離、又はカラムクロマトグラフィによって精製される、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記試料が、抽出した試料を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項77】
前記試料が、天然に存在するＲＮａｓｅを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項78】
前記方法が、（ａ）の前に、前記試料を、ＲＮａｓｅ阻害剤と混合することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記試料が、細胞フリーＤＮＡを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項80】
前記生体試料が、生物から得られた流体を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項81】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、尿、糞便、母乳、唾液、又は羊水を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記試料が、環境試料を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
前記試料が、製造プロセス試料を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記方法が、約２００ｐｇ／ｍＬ未満の検出限界を有する、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記支持体表面が、１つ以上の電極を含む、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
１つ以上の電極が、炭素電極を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
１つ以上の電極が、カーボンインク電極を含む、請求項８５又は８６に記載の方法。
【請求項88】
１つ以上の電極が、マルチウェルプレートに含まれる、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記マルチウェルプレートの各ウェルが、電極を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記標識が、結合対のメンバーを含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記標識が、ビオチンを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記標識が、電気化学発光標識を含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光読み取り緩衝液と接触させること、及び前記電極に電位を印加することによって、アッセイシグナルを生成するステップを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記共反応物が、三級アミン、トリプロピルアミン、Ｎ－ブチルジエタノールアミン、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
プローブのセットを含む組成物であって、前記プローブのセットが、（ａ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｂ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含み、
前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、
前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス結合部分が、前記アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、組成物。
【請求項96】
組成物であって、（ａ）センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド二本鎖と、
（ｂ）プローブのセットであって、
（ｉ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｉｉ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含み、
前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、
前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス結合部分が、前記アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、組成物。
【請求項97】
１つ以上のハイブリダイゼーション複合体を含む組成物であって、前記ハイブリダイゼーション複合体が、（ａ）オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体であって、前記センスプローブが、第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含み、前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有する、センス複合体と、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体であって、前記アンチセンスプローブが、第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含み、前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス結合部分が、前記アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、アンチセンス複合体と、
それらの組み合わせと、を含む、組成物。
【請求項98】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々、個々に、約８～約５０ヌクレオチドを含む、請求項９５～９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項99】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々、個々に、約１６～約３０ヌクレオチドを含む、請求項９５～９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項100】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖が、ＤＮＡを含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項101】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖が、ＲＮＡを含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項102】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖が、ＤＮＡを含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項103】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖が、ＲＮＡを含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項104】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項105】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項106】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖が、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項107】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖、アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方が、個々に、１つ以上の修飾核酸を含む、請求項９５～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項108】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖、前記アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方が、個々に、５’－コンジュゲート又は３’－コンジュゲートを含む、請求項９５～１０７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項109】
前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、α－トコフェロール、アプタマー、抗体、コレステロール、スクアレン、脂肪酸、又はヌクレオリピドを含む、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項110】
前記センスプローブの前記センス結合長が、前記センス鎖の前記センス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い、請求項９５～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項111】
前記センス結合長が、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである、請求項９５～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項112】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する、請求項９５～１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項113】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合長が、前記アンチセンス鎖の前記アンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い、請求項９５～１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項114】
前記アンチセンス結合長が、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである、請求項９５～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項115】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記アンチセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する、請求項９５～１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項116】
前記センスプローブが、ＤＮＡを含む、請求項９５～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項117】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＤＮＡを含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項118】
前記センスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項119】
前記センスプローブの前記センス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項120】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＤＮＡを含み、前記センスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項121】
前記アンチセンスプローブが、ＤＮＡを含む、請求項９５～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項122】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＤＮＡを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項123】
前記アンチセンスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項124】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項125】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＤＮＡを含み、前記アンチセンスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項126】
前記センスプローブが、ＲＮＡを含む、請求項９５～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項127】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＲＮＡを含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項128】
前記センスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項129】
前記センスプローブの前記センス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項130】
前記センスプローブの前記センス結合部分が、ＲＮＡを含み、前記センスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項131】
前記アンチセンスプローブが、ＲＮＡを含む、請求項９５～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項132】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＲＮＡを含む、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項133】
前記アンチセンスプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項134】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分及び前記オリゴヌクレオチドタグが、ＲＮＡを含む、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項135】
前記アンチセンスプローブの前記アンチセンス結合部分が、ＲＮＡを含み、前記アンチセンスプローブの前記オリゴヌクレオチドタグが、ＤＮＡを含む、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項136】
前記センスプローブ、前記アンチセンスプローブ、又はその両方が、１つ以上の修飾核酸を含む、請求項９５～１３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項137】
１つ以上の修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項138】
１つ以上の修飾ヌクレオチドが、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項139】
前記標識が、結合対のメンバーを含む、請求項９５～１３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項140】
前記標識が、ビオチンを含む、請求項１３９に記載の組成物。
【請求項141】
前記標識が、電気化学発光標識を含む、請求項９５～１３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項142】
請求項１～９４のいずれか一項に記載の方法を実行するための、キット。
【請求項143】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、微生物の核酸配列を含む、請求項１～９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項144】
前記微生物が、ヒトマイクロバイオームの成分である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項145】
前記微生物が、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスである、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
【請求項146】
前記微生物が、細菌である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項147】
前記オリゴヌクレオチド二本鎖の前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、細菌からの１６Ｓ ｒＲＮＡ又はｒＤＮＡを含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項148】
前記細菌が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｏｔａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｎｅｍａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｅｒｉｏ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｅｍｏｄｅｘ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｏｔａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、又はＹｅｒｓｉｎｉａ細菌である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項149】
前記試料が、生体試料を含む、請求項１４３～１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項150】
前記生体試料が、ヒトの体の一部分から単離された試料を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項151】
前記体の前記一部分が、鼻腔、口腔、皮膚、耳、粘膜、胃腸管、尿生殖路、気道、眼、又はそれらの組み合わせである、請求項１５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、試料中のオリゴヌクレオチドを検出又は定量化するための方法、具体的には、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸ベースの治療剤は、薬物療法、特に小分子、タンパク質ベース、又は抗体ベースの治療剤などの従来の治療剤が接近することができない生物学的標的に対する有望な候補のクラスを構成する。核酸ベースの治療剤には、例えば、疾患に関連する異常なタンパク質の産生を低減又は防止するために、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現を阻害する一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド分子が含まれる。いくつかの核酸ベースの治療剤が、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されており、より多くが、様々な疾患の治療のための臨床試験において調査されている。
【0003】
核酸は、高度に荷電され、急速に分解され、身体から除去される大きな分子であり、これは乏しい薬理学的特性をもたらし得る。Ｓｔｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）「Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６（４）：１５６３－１５６４。結果として、薬物動態、組織標的化、及び組織蓄積は全て、核酸ベースの治療剤を開発するときに重要な考慮事項である。高感度かつ定量的アッセイが、核酸薬物動態を特性評価するために必要とされている。Ｔｈａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）「ＰＯＥ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｒｉｃｅｓ．」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．１０（１）：１０４２５（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－６６８２９－６）。
【0004】
様々なポリメラーゼ連鎖反応（polymerase-chain reaction、ＰＣＲ）に基づいた、サイズ排除クロマトグラフィ（size-exclusion chromatography、ＳＥＣ）、及び液体クロマトグラフィ－質量分析（liquid chromatography-mass spectrometry、ＬＣ－ＭＳ）方法が、核酸治療剤を特性評価するために存在するが、これらの方法は、アッセイ感度及び時間のかかる抽出ステップによって制限される。同上。オリゴヌクレオチド治療剤の固有な生物物理学的特性は、非定型的な吸収、分布、代謝、及び排出（absorption，distribution，metabolism and elimination、ＡＤＭＥ）プロセス、並びに薬物動態－薬力学（pharmacokinetics-pharmacodynamics、ＰＫＰＤ）解離をもたらし得る。これらの関係を理解することの困難性は、増加した動物使用を含む薬物開発プロセス全体を通して非効率性をもたらし得、ヒト治験における増加したリスクをもたらし得る。同上。オリゴヌクレオチド治療剤の両方の鎖の定量化は、オリゴヌクレオチド治療剤の安定性及び代謝経路を理解するため、かつ治療剤の薬理学を解明するモデルを開発するために重要であり得る。同上。
【0005】
したがって、例えば患者から得られた試料からの、オリゴヌクレオチド治療剤の検出又は定量化のための高感度アッセイが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化する方法が本明細書に記載される。一態様では、方法は、
（ａ）試料を、プローブのセットを含む組成物と接触させることであって、プローブのセットが、
（ｉ）支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブ、並びに
（ｉｉ）支持体表面に固定化された第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブを含み、
センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、
アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、接触させることと、
（ｂ）プローブを試料とともにインキュベートして、
（ｉ）オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体を含む、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させ、ハイブリダイゼーション混合物を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、
（ｄ）支持体表面に固定化された標識の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することと、を含む。
（ａ）試料を、プローブのセットを含む組成物と接触させることであって、プローブのセットが、
（ｉ）支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブ、並びに
（ｉｉ）支持体表面に固定化された第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブを含み、
センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、
アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、接触させることと、
（ｂ）プローブを試料とともにインキュベートして、
（ｉ）オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体を含む、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させ、ハイブリダイゼーション混合物を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、
（ｄ）支持体表面に固定化された標識の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することと、を含む。
【0007】
一態様では、（ｃ）は、
（ｉ）ハイブリダイゼーション複合体の第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面で第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させて、ハイブリダイゼーション複合体を支持体表面に固定化することと、
（ｉｉ）固定化したハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、を含む。
（ｉ）ハイブリダイゼーション複合体の第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面で第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させて、ハイブリダイゼーション複合体を支持体表面に固定化することと、
（ｉｉ）固定化したハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させることと、を含む。
【0008】
一態様では、（ｃ）は、
（ｉ）ハイブリダイゼーション混合物を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させて、反応混合物を形成することと、
（ｉｉ）センスプローブ及びアンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面を（ｉ）の反応混合物と接触させることと、を含む。
（ｉ）ハイブリダイゼーション混合物を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させて、反応混合物を形成することと、
（ｉｉ）センスプローブ及びアンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定化された第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面を（ｉ）の反応混合物と接触させることと、を含む。
【0009】
一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、アンチセンス複合体の一部分であるアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、アンチセンス複合体の一部分ではない。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ハイブリダイゼーション複合体の一部分である。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖を含まない。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、プローブ－プローブ複合体である。一態様では、プローブ－プローブ複合体は、一本鎖オーバーハングを含む。
【0010】
一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、センス複合体の一部分であるセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、センス複合体の一部分ではない。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ハイブリダイゼーション複合体の一部分である。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖を含まない。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、プローブ－プローブ複合体である。一態様では、プローブ－プローブ複合体は、一本鎖オーバーハングを含む。
【0011】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は各々、個々に、約８～約５０ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は各々、個々に、約１６～約３０ヌクレオチドを含む。
【0012】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＲＮＡを含む。
【0013】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を含む。
【0014】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、５’－コンジュゲート又は３’－コンジュゲートを含む。一態様では、コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine、ＧａｌＮＡｃ）、細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide、ＣＰＰ）、α－トコフェロール、アプタマー、抗体、コレステロール、スクアレン、脂肪酸、又はヌクレオリピド（nucleolipid）を含む。
【0015】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、微生物の核酸配列を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ヒトマイクロバイオームの成分である微生物の核酸配列を含む。一態様では、微生物は、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスである。一態様では、微生物は、細菌である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ又はｒＤＮＡを含む。
【0016】
一態様では、センスプローブのセンス結合長は、センス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、センス結合長は、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。
【0017】
一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合長は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、アンチセンス結合長は、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。
【0018】
一態様では、第１のオリゴヌクレオチドタグは、第１のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、第１のオリゴヌクレオチドタグ長は、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長と同じである。一態様では、第１のオリゴヌクレオチドタグは、第１のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、第１のオリゴヌクレオチドタグ長は、第１の捕捉オリゴヌクレオチド長よりも短い。
【0019】
一態様では、第２のオリゴヌクレオチドタグは、第２のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、第２のオリゴヌクレオチドタグ長は、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長と同じである。一態様では、第２のオリゴヌクレオチドタグは、第２のオリゴヌクレオチドタグ長を有し、第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長を有し、第２のオリゴヌクレオチドタグ長は、第２の捕捉オリゴヌクレオチド長より短い。
【0020】
一態様では、センスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0021】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0022】
一態様では、センスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0023】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0024】
一態様では、センスプローブ、アンチセンスプローブ、又はその両方は、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）を含む。一態様では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、ホスホジエステル（phosphodiester、ＰＯ）、ホスホロチオエート（phosphorothioate、ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（2’O-methyl、２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（2’O-methoxyethyl、ＭＯＥ）、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（phosphoroamidate morpholino、ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（2’-deoxy-2’-fluoro、２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される。
【0025】
一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＤＮａｓｅは、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、又はマングビーン（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼである。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＲＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅＯＮＥ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、又はエキソリボヌクレアーゼＩＩである。
【0026】
一態様では、（ａ）～（ｃ）は、同時に行われる。一態様では、（ａ）～（ｃ）は、順次に行われる。
【0027】
一態様では、（ｂ）におけるハイブリダイゼーション条件は、
（ｉ）プローブを試料第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることと、
（ｉｉ）プローブをオリゴヌクレオチド二本鎖の変性したセンス鎖及び変性したアンチセンス鎖とともに第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることと、を含む。
（ｉ）プローブを試料第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることと、
（ｉｉ）プローブをオリゴヌクレオチド二本鎖の変性したセンス鎖及び変性したアンチセンス鎖とともに第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることと、を含む。
【0028】
一態様では、ハイブリダイゼーションは、センス複合体及びアンチセンス複合体を、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることを更に含む。
【0029】
一態様では、（ｂ）におけるハイブリダイゼーション条件は、
（ｉ）プローブを試料約６０℃～約９５℃の第１の温度で約１分～約１５分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）プローブを試料とともに、約１０℃～約６５℃の第２の温度で約３０秒～約５分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）プローブを試料とともに、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む。
（ｉ）プローブを試料約６０℃～約９５℃の第１の温度で約１分～約１５分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）プローブを試料とともに、約１０℃～約６５℃の第２の温度で約３０秒～約５分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）プローブを試料とともに、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む。
【0030】
一態様では、（ｂ）におけるハイブリダイゼーション条件は、
（ｉ）プローブを試料約９５℃の第１の温度で約２分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）プローブを試料とともに、約６５℃の第２の温度で約１分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）プローブを試料とともに、約４℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む。
（ｉ）プローブを試料約９５℃の第１の温度で約２分間インキュベートすることと、
（ｉｉ）プローブを試料とともに、約６５℃の第２の温度で約１分間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）プローブを試料とともに、約４℃の保持温度でインキュベートすることと、を含む。
【0031】
一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、約１℃／秒～約２℃／秒のステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間の第１の温度遷移速度を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、約１．８℃／秒のステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間の第１の温度遷移速度を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に約０．０５℃／秒～約１℃／秒の第２の温度遷移速度を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、約０．１℃／秒のステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間の第１の温度遷移速度を含む。
【0032】
一態様では、プローブは、希釈剤５４又はＮ－ＰＬＥＸハイブリダイゼーション緩衝液１若しくは２を含む緩衝液中で試料とともにインキュベートされる。
【0033】
一態様では、試料は複数のオリゴヌクレオチド二本鎖を含み、（ａ）における組成物は複数のプローブのセットを含み、各プローブのセットは、固有のオリゴヌクレオチド二本鎖の固有のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする。
【0034】
一態様では、（ｃ）は、支持体表面をセンス複合体及びアンチセンス複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１５分～約１２時間インキュベートすることを含む。一態様では、（ｃ）は、支持体表面をセンス複合体及びアンチセンス複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１時間～約２時間インキュベートすることを含む。一態様では、支持体表面は、センス複合体及びアンチセンス複合体とともに振盪しながらインキュベートされる。一態様では、（ｃ）は、支持体表面をセンス複合体及びアンチセンス複合体とともに、約７０５ｒｐｍで振盪しながら、約３７℃の温度で約１時間インキュベートすることを含む。
【0035】
一態様では、（ａ）における組成物は、約２０ｐＭ～約１０ｎＭのセンスプローブを含む。一態様では、（ａ）における組成物は、約２０ｐＭ～約１０ｎＭのアンチセンスプローブを含む。
【0036】
一態様では、試料は、生体試料を含む。一態様では、試料は、未処理の生体試料を含む。一態様では、試料は、前処理した生体試料を含む。一態様では、試料は、精製した試料を含む。一態様では、試料は、沈殿、遠心分離、又はカラムクロマトグラフィによって精製される。一態様では、試料は、抽出した試料を含む。一態様では、試料は、天然に存在するＲＮａｓｅを含む。一態様では、方法は、（ａ）の前に試料をＲＮａｓｅ阻害剤と混合することを含む。一態様では、試料は、細胞フリーＤＮＡを含む。
【0037】
一態様では、生体試料は、生物から得られた流体を含む。一態様では、生体試料は、全血、血漿、血清、尿、糞便、母乳、唾液、又は羊水を含む。一態様では、試料は、環境試料を含む。一態様では、試料は、製造プロセス試料を含む。
【0038】
一態様では、方法は、約２００ｐｇ／ｍＬ未満の検出限界を有する。
【0039】
一態様では、支持体表面は、１つ以上の電極を含む。一態様では、１つ以上の電極は、炭素電極を含む。一態様では、１つ以上の電極は、カーボンインク電極を含む。一態様では、１つ以上の電極は、マルチウェルプレートに含まれる。一態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは、電極を含む。
【0040】
一態様では、標識は、結合対のメンバーを含む。一態様では、標識は、ビオチンを含む。
【0041】
一態様では、標識は、電気化学発光（electrochemiluminescent、ＥＣＬ）標識を含む。一態様では、方法は、電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光読み取り緩衝液と接触させること、及び電極に電位を印加することによって、アッセイシグナルを生成するステップを含む。一態様では、共反応物は、三級アミン、トリプロピルアミン、Ｎ－ブチルジエタノールアミン、及びそれらの組み合わせから選択される。
【0042】
一態様では、プローブのセットを含む組成物が提供される。一態様では、プローブのセットは、
（ａ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｂ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含み、
センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。
（ａ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｂ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含み、
センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。
【0043】
一態様では、
（ａ）センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド二本鎖と、
（ｂ）
（ｉ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｉｉ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含む、プローブのセットと、を含む組成物が提供され、
センスプローブのセンス結合部分は、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。
（ａ）センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド二本鎖と、
（ｂ）
（ｉ）第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含む、センスプローブと、
（ｉｉ）第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含む、アンチセンスプローブと、を含む、プローブのセットと、を含む組成物が提供され、
センスプローブのセンス結合部分は、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有し、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。
【0044】
一態様では、１つ以上のハイブリダイゼーション複合体を含む組成物が提供される。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、
（ａ）オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体であって、センスプローブが、第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含み、センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有する、センス複合体と、
（ｂ）オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体であって、アンチセンスプローブが、第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含み、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、アンチセンス複合体と、
それらの組み合わせと、を含む。
（ａ）オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体であって、センスプローブが、第１の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第１の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び第１の標識を含み、センスプローブのセンス結合部分が、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有する、センス複合体と、
（ｂ）オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体であって、アンチセンスプローブが、第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である第２の一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び第２の標識を含み、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分が、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する、アンチセンス複合体と、
それらの組み合わせと、を含む。
【0045】
一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は各々、個々に、約８～約５０ヌクレオチドを含む。一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は各々、個々に、約１６～約３０ヌクレオチドを含む。
【0046】
一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を含む。
【0047】
一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、組成物中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、５’－コンジュゲート又は３’－コンジュゲートを含む。一態様では、コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、α－トコフェロール、アプタマー、抗体、コレステロール、スクアレン、脂肪酸、又はヌクレオリピドを含む。
【0048】
一態様では、組成物中のセンスプローブのセンス結合長は、センス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、組成物中のセンスプローブのセンス結合長は、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである。一態様では、組成物中のセンスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。
【0049】
一態様では、組成物中のアンチセンスプローブのアンチセンス結合長は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、組成物中のアンチセンスプローブのアンチセンス結合長は、約１０～約１６ヌクレオチドの長さである。一態様では、組成物中のアンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。
【0050】
一態様では、組成物中のセンスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0051】
一態様では、組成物中のアンチセンスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0052】
一態様では、組成物中のセンスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0053】
一態様では、組成物中のアンチセンスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0054】
一態様では、組成物中のセンスプローブ、アンチセンスプローブ、又は両方のプローブは、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。一態様では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される。
【0055】
一態様では、組成物中の標識は、結合対のメンバーを含む。一態様では、標識は、ビオチンを含む。一態様では、組成物中の標識は、電気化学発光標識を含む。
【0056】
一態様では、本明細書に記載の方法を実行するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1A】本明細書に記載のアンチセンス結合プローブがアンチセンスオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしているアンチセンス結合複合体の概略図である。
【図1B】本明細書に記載のセンス結合プローブがセンスオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしているセンス結合複合体の概略図である。
【図2A】オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス結合鎖と「短い」アンチセンス結合プローブとの間で形成されたアンチセンス結合複合体の概略図である。
【図2B】オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス結合鎖と「短い」センス結合プローブとの間に形成されたセンス結合複合体の概略図である。
【図2C】「短い」センス結合プローブと「短い」アンチセンス結合プローブとの間で形成された「非生産的」結合複合体を示す概略図である。
【図3A】オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス結合鎖と「全長」アンチセンス結合プローブとの間で形成されたアンチセンス結合複合体の概略図である。
【図3B】オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス結合鎖と「全長」センス結合プローブとの間に形成されたセンス結合複合体の概略図である。
【図3C】「全長」センス結合プローブと「全長」アンチセンス結合プローブとの間で形成された「非生産的」結合複合体を示す概略図である。
【図4A】支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブのオリゴヌクレオチドタグの概略図であり、プローブは、一本鎖オーバーハングを有するアンチセンス複合体又はセンス複合体の一部である。
【図4B】支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブのオリゴヌクレオチドタグの概略図であり、プローブは、一本鎖オーバーハングを有しないアンチセンス複合体又はセンス複合体の一部である。
【図4C】支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブのオリゴヌクレオチドタグの概略図であり、プローブは、アンチセンス複合体又はセンス複合体の一部ではない。
【図4D】支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブのオリゴヌクレオチドタグの概略図であり、プローブは、一本鎖オーバーハングを含むプローブ－プローブ複合体の一部である。
【図4E】支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブのオリゴヌクレオチドタグの概略図であり、プローブは、一本鎖オーバーハングを含まないプローブ－プローブ複合体の一部である。
【図5A】希釈剤５４中でハイブリダイズした１×及び４×濃度のアンチセンス（antisense、ＡＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図5B】ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズした１×及び４×濃度のアンチセンス（ＡＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図6A】希釈剤５４中でハイブリダイズした１×及び４×濃度のセンス（sense、ＳＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図6B】ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズした１×及び４×濃度のセンス（ＳＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図7A】希釈剤５４中でハイブリダイズした１６マー（ＦＬ）及び１２マーアンチセンス（ＡＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図7B】ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズした１６マー（ＦＬ）及び１２マーアンチセンス（ＡＳ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図8A】単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖にハイブリダイズした１６マー（ＦＬ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図8B】単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖にハイブリダイズした１２マープローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図9A】単独における又はヘテロ二本鎖におけるセンス（ＳＳ）鎖にハイブリダイズした１６マー（ＦＬ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図9B】単独における又はヘテロ二本鎖におけるセンス（ＳＳ）鎖にハイブリダイズした１２マープローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図10A】単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖にハイブリダイズした１２マープローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図10B】単独における又はヘテロ二本鎖におけるセンス（ＳＳ）鎖にハイブリダイズした１２マープローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図11A】長いか又は短いハイブリダイゼーション条件下でアンチセンス（ＡＳ）鎖にハイブリダイズした１６マー（ＦＬ）プローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図11B】長いか又は短いハイブリダイゼーション条件下でアンチセンス（ＡＳ）鎖にハイブリダイズした１２マープローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図12A】希釈剤５４中及び血漿中の個々のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図12B】希釈剤５４中及び血漿中のヘテロ二本鎖でのセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図13A】希釈剤５４又は脳溶解物中の個々のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図13B】希釈剤５４又は脳溶解物中のヘテロ二本鎖のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図14A】ＬＮＡがあるか又はなしでの個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図14B】ＬＮＡがあるか又はなしでのヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図15A】種々の濃度におけるアンチセンス（ＡＳ）ＬＮＡプローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図15B】種々の濃度におけるセンス（ＳＳ）ＬＮＡプローブでのＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図16A】非修飾又はＬＮＡ修飾１２マープローブを用いた個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖の多重検出におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図16B】非修飾又はＬＮＡ修飾１２マープローブを用いたヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖の多重検出におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図17A】非修飾又はＬＮＡ修飾１２マープローブを用いた個々のセンス（ＳＳ）鎖の多重検出におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図17B】非修飾又はＬＮＡ修飾１２マープローブを用いたヘテロ二本鎖のセンス（ＳＳ）鎖の多重検出におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図18A】ＦＬプローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブを使用して検出された個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図18B】ＦＬプローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブを使用して検出された個々のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図19A】ＦＬプローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブを使用して検出されたヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図19B】ＦＬプローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブを使用して検出されたヘテロ二本鎖のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図20A】アンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）プローブ長の組み合わせを使用して検出した場合のヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【図20B】アンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）プローブ長の組み合わせを使用して検出した場合のヘテロ二本鎖のセンス（ＳＳ）鎖におけるＥＣＬシグナル曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0058】
Ａ．定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとし、例えば、「ａ」又は「ａｎ」は複数形、例えば、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」を含み、「又は」という用語は、特に明記されない限り、「及び／又は」を意味することができる。「含むこと（including）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」という用語は、限定するものではない。任意のタイプの本明細書に提供される範囲は、記載される特定の範囲内の全ての値、及び特定の範囲における端点あたりの値を含む。本明細書で使用される場合、「の間（between）」という語を使用して表される範囲は、範囲の端点を含む。したがって、例えば、５０℃～７０℃の範囲は、５０℃～７０℃を含み、すなわち、それは、５０℃及び７０℃の端点を含む。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとし、例えば、「ａ」又は「ａｎ」は複数形、例えば、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」を含み、「又は」という用語は、特に明記されない限り、「及び／又は」を意味することができる。「含むこと（including）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」という用語は、限定するものではない。任意のタイプの本明細書に提供される範囲は、記載される特定の範囲内の全ての値、及び特定の範囲における端点あたりの値を含む。本明細書で使用される場合、「の間（between）」という語を使用して表される範囲は、範囲の端点を含む。したがって、例えば、５０℃～７０℃の範囲は、５０℃～７０℃を含み、すなわち、それは、５０℃及び７０℃の端点を含む。
【0059】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、例えば、本発明を説明する際に用いられる、組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、及びそれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、又は製剤を作製するために使用される典型的な測定手順及び取り扱い手順を通して、これらの手順における不注意な誤りを通して、方法を実行するために使用される出発材料若しくは成分の製造、供給源、又は純度の違い、及び他の同様の考慮事項を通して、発生し得る数として表される量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤の経時変化に起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を有する製剤を混合又は処理することに起因して異なる量を包含する。「約」という用語によって修飾される場合、本明細書に添付される特許請求の範囲は、かかる等価物を含む。
【0060】
概して、本明細書に記載される細胞培養及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド化学又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、並びにそれらの技法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの一般的に知られている３文字記号又は１文字記号のいずれかによって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
【0061】
「ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、糖、及び１つ以上のヌクレオチド間架橋を含むモノマー単位を指す。本明細書に使用される場合、用語ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドを含む。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、（guanine、Ｇ）、アデニン、（adenine、Ａ）、シトシン、（cytosine、Ｃ）、チミン、（thymine、Ｔ）、及びウラシル、（uracil、Ｕ）、並びに天然に存在する塩基類似体が含まれる。デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）では、糖は、デオキシリボースである。リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）では、糖は、リボースである。「修飾ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、糖、又はヌクレオチド間結合に修飾を含むヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチドは、相補的な天然に存在するヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドと塩基対形成することが依然として可能である。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間結合によって互いに共有結合した２つ以上のヌクレオチドのポリマーを指す。
【0062】
本明細書に使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間結合によって共有結合した２つ以上のヌクレオチド、概して、約５～約１００ヌクレオチドを含む短いポリマーを指す。一態様では、オリゴヌクレオチドは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、若しくは３０ヌクレオチドから、最大約３０、３５、４０、４５、５０、若しくは１００ヌクレオチドの長さ、又は約８～約５０ヌクレオチドの長さ、約１０～約４０ヌクレオチドの長さ、約１２～約３０ヌクレオチドの長さ、約１８～約３０ヌクレオチドの長さであるポリマーである。本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドという用語は、一本鎖オリゴヌクレオチド若しくは二本鎖オリゴヌクレオチド、又は二本鎖オリゴヌクレオチドの個々のオリゴヌクレオチド鎖を指すことができる。一態様では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤を指す。
【0063】
「オリゴヌクレオチド治療剤」は、標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、それにハイブリダイズすることができる少なくとも１つの鎖を含むオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド治療剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド治療剤は、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の発現又は量を調節することができる。「調節する」という用語は、標的核酸の発現又は量を増加又は減少させることを含むことができる。「発現」という用語は、遺伝子における情報がタンパク質を産生するために使用されるプロセスを指し、転写、スプライシング、転写後修飾、及び翻訳を含むが、これらに限定されない。一態様では、オリゴヌクレオチド治療剤は、標的核酸の発現又は量を増加する。一態様では、オリゴヌクレオチド剤は、標的核酸の発現又は量を減少する。一態様では、オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、精製又は単離される。一態様では、オリゴヌクレオチドは、固相化学合成によって作製される。例えば、本明細書に記載されるようなセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、プローブ、タグ、又は捕捉オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドを作製するための方法は、既知である。
【0064】
本明細書で使用される場合、「塩基対形成」は、二本鎖オリゴヌクレオチドの形成をもたらすプリンとピリミジンとの間の特異的水素結合を指す。ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対形成する。ＲＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対形成する。任意の特定のメカニズムに限定されないが、塩基対形成の最も一般的なメカニズムは、相補的核酸塩基間の水素結合を含み、ワトソン－クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合であり得る。
【0065】
「キメラ」という用語は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有する化合物を指す。実施形態では、各領域は、複数のサブユニットを有する。本明細書に使用される場合、「キメラプローブ」という用語は、２つ以上の生物学的供給源に由来する連結した一本鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。
【0066】
「相補的」とは、例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合塩基対形成モデルに従って、水素結合の形成によって相互作用する核酸分子又はオリゴヌクレオチドを指す。ハイブリダイゼーションは、２つの相補的ＤＮＡ分子間（ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション）、２つのＲＮＡ分子間（ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）、又は相補的ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子間（ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）で生じることができる。ヌクレオチドに関連して使用される場合、「相補的」という用語は、例えば、互いに塩基対形成することができるプリン及びピリミジンを含む、ヌクレオチドの対を指す。ヌクレオチドの相補的な対は、天然に存在するヌクレオチドの対、修飾ヌクレオチドの対、又は天然に存在するヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドを含む対を含むことができる。オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、「相補的」という用語は、１つのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド又はその一部分が、別のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド又はその一部分と、相補的ヌクレオチドがアラインメントされたとき、水素結合することができることを意味する。ハイブリダイゼーションは、より長いヌクレオチド配列の一部分に相補的である短いヌクレオチド配列間で生じることができる。ハイブリダイゼーションは、１００％の「配列相補性」を有しない配列（すなわち、ワトソン－クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合塩基対形成モデルなどの塩基対形成モデルに基づいて１００％未満のヌクレオチドがアラインメントする配列）間で生じることができるが、より低い配列相補性を有する配列は、より高い配列相補性を有する配列よりも安定性が低く、ハイブリダイズする可能性が低い。一態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する（すなわち、１つのオリゴヌクレオチド配列又は領域の各ヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチド鎖又は領域の各ヌクレオチドと水素結合することができる）。別の態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列相補性を有する。一態様では、「実質的な相補性」は、部分的に相補的であり、生理学的に関連する条件下でハイブリダイズすることができる配列を指す。一態様では、「実質的な相補性」は、部分的に相補的であり、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列を指す。一態様では、相補性は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤の２つのオリゴヌクレオチド間の相補性を指す。一態様では、相補性は、一本鎖オリゴヌクレオチド治療剤と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとの間の相補性を指す。一態様では、相補性は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグと一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドとの間の相補性を指す。一態様では、相補性は、一本鎖オリゴヌクレオチドとキメラプローブとの間の相補性を指す。
【0067】
２つの相補的配列がハイブリダイズするか否かは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存し得、これは、温度、溶媒、イオン強度、及び他のパラメータなどの条件に依存して変化し得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、他の潜在的に交差反応するか又は干渉する配列の存在下で、２つの相補的核酸配列の所望のハイブリダイゼーション産物の選択的形成又は維持を提供するように選択することができる。ストリンジェントな条件は配列依存的である－典型的には、より長い相補的配列は、より短い相補的配列よりも高い温度で特異的にハイブリダイズする。概して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、画定されたイオン強度、化学的変性剤の濃度、ｐＨ、及びハイブリダイゼーションパートナーの濃度での特定のヌクレオチド配列における熱融点（thermal melting point、Ｔｍ）（すなわち、配列の５０％が実質的に相補的な配列にハイブリダイズする温度）よりも約５℃～約１０℃低い。概して、より高いパーセンテージのＧ及びＣ塩基を有するヌクレオチド配列は、より低いパーセンテージのＧ及びＣ塩基を有するヌクレオチド配列よりも、よりストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。概して、ストリンジェンシーは、温度を上げること、ｐＨを上げること、イオン強度を下げること、又は化学的核酸変性剤（例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び炭酸エチレン）の濃度を上げることによって高めることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ、約５００ｍＭ、又は約２００ｍＭ未満の塩濃度、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約６０℃、又は約８０℃超のハイブリダイゼーション温度、及び約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％超の化学的変性剤濃度を含む。多くの因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るため、パラメータの組み合わせは、任意のパラメータ単独の絶対値よりも重要であり得る。
【0068】
一態様では、相補性は、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との間の相補性を指す。一態様では、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。一態様では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、又はプロモーター指向性ＲＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、細胞遺伝子、又は発現が特定の障害若しくは疾患に関連する遺伝子から転写されたｍＲＮＡである。一態様では、標的核酸は、感染病原体からの核酸分子である。一態様では、標的核酸は、ウイルス又は細菌の核酸である。
【0069】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイズすること」、又は「ハイブリダイゼーション」は、２つの相補的オリゴヌクレオチド間の塩基対形成を指す。一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤の一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、標的核酸にハイブリダイズすることができる。一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、互いにハイブリダイズする。一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズする。一態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。「特異的にハイブリダイズする」とは、より高い親和性を有し、試料中の他のオリゴヌクレオチドとの顕著な交差ハイブリダイゼーションを有せずに生じる、２つの相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを指す。一態様では、相補的オリゴヌクレオチドは、細胞の細胞質に見出される条件などの生理学的に関連する条件下で特異的にハイブリダイズする。別の態様では、相補的オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする。
【0070】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド二本鎖」は、互いに少なくとも部分的に相補的であり、相補的核酸塩基間の塩基対形成を介して互いにハイブリダイズする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の少なくとも１つの鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の少なくとも１つの鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の両方の鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の両方の鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである１つの鎖及びＲＮＡである１つの鎖を含むヘテロ二本鎖である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の２つのオリゴヌクレオチド鎖の糖－リン酸骨格は、反対方向に配向され（すなわち、一方の鎖は５’から３’に延び、他方は３’から５’に延びる）、これは「逆平行」と呼ばれる。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の２つのオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド二本鎖がその全長にわたって二本鎖であるように、すなわちオリゴヌクレオチド二本鎖が平滑末端を有するように、互いに同じ長さである。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の２本のオリゴヌクレオチド鎖は、互いに同じ長さであるが、オリゴヌクレオチド二本鎖がその全長にわたって二本鎖ではないようにアラインメントする、すなわち、オリゴヌクレオチド二本鎖は、二本鎖の両端に一本鎖３’オーバーハング又は一本鎖５’オーバーハングを有する。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の２つのオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド二本鎖がその全長にわたって二本鎖ではないように、すなわち、オリゴヌクレオチド二本鎖が、オリゴヌクレオチド二本鎖の一端又は両端に一本鎖３’オーバーハング又は一本鎖５’オーバーハングを有するように、互いに異なる長さである。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１～約５、約１～約４、約１～約３、又は約１～約２ヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、１つの平滑末端と、一本鎖オーバーハングを含む１つの末端とを有する。オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、「長さ」という用語は、一本鎖オリゴヌクレオチドのポリマー骨格におけるヌクレオチド残基の数を指す。
【0071】
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、一方の鎖の少なくとも１つの末端が、他方の鎖の対応する末端よりも長い、二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。一態様では、一本鎖オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方又は両方の鎖の３’末端に位置する。一態様では、一本鎖オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方又は両方の鎖の５’末端に位置する。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１～約５ヌクレオチド、約１～約４ヌクレオチド、約１～約３ヌクレオチド、又は約１～約２ヌクレオチドを含む。一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の末端は平滑であり、他方の末端は３’又は５’オーバーハングを含む。一態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の末端は、一本鎖オーバーハングを含む。
【0072】
「アンチセンス」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びが、例えば、ワトソン－クリック塩基対合を介して標的核酸にハイブリダイズすることができるように、標的核酸の転写に必要な配向に対して反転している核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド二本鎖の「センス鎖」は、アンチセンス鎖に相補的であり、したがって、標的核酸の少なくとも一部分に対して「センス」である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖は、互いに少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％相補的である。
【0073】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドが、それらの５’炭素原子と３’炭素原子との間のホスホジエステル結合などのヌクレオシド間結合によって連結され、その結果、末端５’炭素及び３’炭素が、分子の５’－（ホスホリル）末端及び３’－（ヒドロキシル）末端と呼ぶことができるオリゴヌクレオチドのいずれかの末端で露出されるため、「方向」又は「方向性」を有する。
【0074】
「同一の」という用語は、オリゴヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって同じ位置に同一の核酸塩基を含むことを意味する。「配列同一性％」という用語は、比較ウィンドウにわたって２つのアラインメントした配列を比較し、同一の核酸塩基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって決定することができる。比較ウィンドウは、全長配列を含むことができるか、又はより大きな配列の下位部分であり得る。様々な方法及びアルゴリズムは、２つ又は配列間の同一性パーセントを決定するために知られており、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＥＮＴＲＥＺを含むが、これらに限定されない。
【0075】
一態様では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応にも関与することができる非天然に存在する化学構造を有する構造的類似体を含む。一例では、ヌクレオチド又は核酸は、例えば、アミン若しくはチオール修飾ヌクレオチド塩基、リン酸、又は糖の使用を介して、それを標識に連結するか、又は標識に連結することができる反応性官能基を提供する化学修飾を含み得る。「反応性官能基」という用語は、更なる化学反応を受けて、例えば、別の官能基と共有結合を形成することができる原子又は原子の結合基を指す。反応性官能基の例としては、アミノ、チオール、ヒドロキシ、及びカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、反応性官能基は、チオール基を含む。これらの化学修飾を介してヌクレオチド又は核酸に連結することができる標識としては、ビオチン、ハプテン、フルオロフォア、及び電気化学発光（ＥＣＬ）標識などの検出可能な部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【0076】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾、例えば、糖修飾若しくは核酸塩基修飾を含むオリゴヌクレオチド、又はヌクレオシド間結合修飾を指す。一態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ホスホロチオエート拘束エチル（ｃＥｔ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない１つ以上の修飾を含む。「ロックド核酸ヌクレオシド」又は「ＬＮＡ」は、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を有する二環式糖部分を含むヌクレオシドを指す。「ホスホロチオエート」は、非架橋酸素の１つが硫黄によって置き換えられているヌクレオチド間結合を指す。
【0077】
「コンジュゲート」という用語は、オリゴヌクレオチドに直接的又は間接的に結合している原子又は原子群を指す。一態様では、コンジュゲートは、安定的なリンカー又は切断可能なリンカーを介してオリゴヌクレオチドに接続される。一態様では、コンジュゲートは、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷、又はクリアランス特性を含むがこれらに限定されない、それが結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の特性を変更する。コンジュゲートの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ビタミンＥ（α－トコフェロールとしても知られる）、アプタマー、抗体、コレステロール又はコレステロール誘導体、スクアレン、脂肪酸、ヌクレオリピド、及び球状核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
「ヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドポリマーの骨格を切断することができる酵素、例えばヒドロラーゼを指す。一態様では、ヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドの骨格におけるホスホジエステル結合を切断するホスホジエステラーゼである。「リボヌクレアーゼ」又は「ＲＮａｓｅ」は、リボ核酸（ＲＮＡ）を優先的に切断する酵素を指す。「デオキシリボヌクレアーゼ」又は「ＤＮａｓｅ」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を優先的に切断する酵素を指す。一態様では、ヌクレアーゼは、一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖領域を優先的に切断する「一本鎖特異的ヌクレアーゼ」である。一本鎖特異的ＲＮａｓｅは、一本鎖ＲＮＡを優先的に切断する酵素である。一本鎖特異的ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡを優先的に切断する酵素である。
【0079】
「標的核酸」は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするように設計される、既知の配列を有する目的の核酸を指す。一態様では、標的核酸は、オリゴヌクレオチド治療剤がハイブリダイズするように設計される、既知の配列を有する核酸である。一態様では、標的核酸は、原核生物又は真核生物のＤＮＡ又はＲＮＡに見出される配列である。一態様では、標的核酸は、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、細胞における標的核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、細胞によって発現される遺伝子の活性を変化させる。一態様では、オリゴヌクレオチドの標的核酸とのハイブリダイゼーションは、遺伝子の活性を増加する。一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸とのハイブリダイゼーションは、遺伝子の活性を減少する。
【0080】
一態様では、標的核酸は、１６ＳリボソームＤＮＡ（１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ）又は１６リボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ）を含む。１６ｓ ｒＲＮＡは、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を介して遺伝子メッセージを機能的細胞成分に変換する必須プロセスに関与する、原核生物のリボソームの小サブユニットのリボソームＲＮＡ成分である。遺伝子１６ｓ ｒＤＮＡは、１６ｓ ｒＲＮＡ配列をコードする。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、細菌に保存されており、種特異的シグネチャー配列を提供することができる超可変領域を含み、細菌の特定並びに系統発生、特定、分類、及び定量化の試験において広く使用されている。
【0081】
「対象」又は「患者」という用語は、オリゴヌクレオチド組成物が実験、診断、予防、又は治療の目的のために投与される生物を指し、動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物、昆虫、虫、及び植物が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、対象は、疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい可能性がある。
【0082】
本明細書で使用される場合、「ヒトマイクロバイオーム」という用語は、ヒトの体上及び体内で自然に生存する、細菌、真菌、ウイルス、及びそれらの遺伝子などの全ての微生物のコレクションを指す。一態様では、ヒトマイクロバイオームの微生物は、皮膚、乳腺、鼻腔、精液、子宮、卵胞、肺、唾液、口腔粘膜、結膜、胆管、及び胃腸管を含むヒトの器官、組織、及び体液上又はそれら内に生存する。一態様では、ヒトマイクロバイオームは、ヒトを害することのない片利共生及び共存する微生物からなる。一態様では、ヒトマイクロバイオームは、ヒトの体に役立つ微生物からなる。一態様では、ヒトマイクロバイオームは、ヒトの体に有害である微生物からなる。一態様では、ヒトマイクロバイオームは、ヒトの体に役立ち、有害である微生物群からなる。一態様では、ヒトマイクロバイオームは、相利共生である微生物からなり、ヒトの体及び微生物叢の両方が利益を得る。
【0083】
「プローブ」は、オリゴヌクレオチド二本鎖の一本鎖にハイブリダイズすることができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む試薬を指す。一態様では、プローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス又はアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。「センスプローブ」は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズすることができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスプローブ」は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。一態様では、プローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス又はアンチセンス鎖に相補的又は実質的に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、プローブは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的であるオリゴヌクレオチドタグ（標的化配列と呼ぶことができる）を含む。プローブは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との組み合わせを含むことができ、１つ以上の修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。プローブは、化学合成又は酵素合成を含むがこれらに限定されない、当該分野で既知の任意の好適な方法によって調製することができる。
【0084】
「リンカー」は、１つの化学部分を別の化学部分に結合する１個以上の原子を指す。一態様では、リンカーは、反応性官能基又は標識をオリゴヌクレオチドに結合する。リンカーは、１個以上の原子、例えば、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０個の原子～約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０個の原子を含むヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物であることができ、炭素、酸素、硫黄、窒素、及びリン、並びにそれらの組み合わせなどの原子を含むことができる。リンカーの例としては、アミド基、エステル基、カーボネート基、及びエーテル基などの低分子量基、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖及びアルキル鎖などの高分子量結合基が挙げられる。リンカーは、１個以上の原子、単位、又は分子を含み得る。
【0085】
「標識」は、検出可能な物理的特性を有するか、又は化学基若しくは部分に検出可能な物理的特性を示させることができる化学基若しくは部分を指し、例えば、基質の検出可能な生成物への変換を触媒する酵素が挙げられる。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、又は他の方法によって検出することができる。標識の例としては、放射性同位体、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、電気化学発光部分、磁性粒子、及び生物発光部分が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、標識は、結合対のメンバーである化合物であり、結合対の第１のメンバー（「一次結合試薬」と呼ぶことができる）は、基質、例えば、オリゴヌクレオチドに結合され、結合対の他方のメンバー（「二次結合試薬」と呼ぶことができる）は、検出可能な物理的特性を有するか、又は検出可能な物理的特性を有する部分に結合される。結合対の非限定的な例としては、ビオチン及びストレプトアビジン又はアビジン、相補的オリゴヌクレオチド、ハプテン及びハプテン結合パートナー、並びに抗体／抗原結合対が挙げられる。
【0086】
本明細書で使用される場合、本明細書で説明される方法ステップに関連して使用されるときの「同時に」は、ステップが実質的に同時に行われ、すなわち、１つの方法ステップの少なくとも一部分の実行が別の方法ステップの一部分の実行と時間的に重複する方法を指す。「同時に」は、正確な同時活性を必要とせず、すなわち、全ての方法ステップが同時に開始又は終了することは必要とされない。一態様では、「同時に」は、反応が同じ反応体積中又は同じインキュベーション期間中に起こるように、方法ステップに必要な全ての試薬が同じ反応混合物中で組み合わされることを意味することができる。
【0087】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載される方法ステップに関連して使用されるときの「順次に」は、ステップが異なる時点で行われる方法を指し、例えば、方法の実施において別個の事象が生じる。一態様では、順次のステップは、別々のインキュベーション期間中に行われる。一態様では、順次のステップは、異なる反応混合物中で行われる。一態様では、順次の方法ステップは、異なる時間に行われる。一態様では、順次の方法ステップは、異なる時間でだが、同じ反応セル（rection cell）中又は同じ表面で行われる。
【0088】
「捕捉オリゴヌクレオチド」は、支持体表面に固定化することができ、相補的オリゴヌクレオチドタグにハイブリダイズする（したがって、表面で捕捉する）ように設計されるオリゴヌクレオチド試薬を指す。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドプローブに存在する一本鎖オリゴヌクレオチドタグと選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖配列である。捕捉オリゴヌクレオチドは、固体形態（例えば、凍結乾燥された）で、溶液中で、又は支持体表面に、例えば、粒子（例えば、微粒子、ビーズ）若しくはアレイに固定化されて提供され得る。
【0089】
「検出」は、標識の存在又は非存在に基づいて、オリゴヌクレオチドなどの物質の存在を検出又は定量化することを指すことができる。一態様では、「検出すること」は、オリゴヌクレオチドなどの物質の存在又は非存在が決定されるプロセスを指す。一態様では、「定量化すること」は、オリゴヌクレオチドなどの物質の量が決定されるときのプロセスを指す。
【0090】
「対応する」は、捕捉オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドタグとの間の関係を指すために使用することができ、オリゴヌクレオチドタグは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定の捕捉オリゴヌクレオチド配列に特異的に結合するように設計される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ストリンジェントな条件下で、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、他の捕捉オリゴヌクレオチドと結合又は交差反応しない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ストリンジェントな条件下で、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、アレイにおける他の捕捉オリゴヌクレオチドと結合又は交差反応しない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その「対応する」捕捉オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、「対応する」オリゴヌクレオチドタグ配列及び捕捉オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する。別の態様では、対応する配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を有する。
【0091】
「対応する」は、センスプローブのセンス結合部分又はアンチセンスプローブのアンチセンス結合部分と、それぞれ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖との間の関係を指すために使用することができる。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のその対応するセンス鎖に特異的に結合し、試料中の他のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖、又は試料中のオリゴヌクレオチドタグと結合又は交差反応しない。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のその対応するアンチセンス鎖に特異的に結合し、試料中の他のオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、又は試料中のオリゴヌクレオチドと結合又は交差反応しない。一態様では、「対応する」センス結合部分又はアンチセンス結合部分と、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドとは、それぞれ、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する。別の態様では、「対応する」センス結合部分又はアンチセンス結合部分と、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとのヌクレオチドは、それぞれ、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を有する。
【0092】
「交差反応する」又は「交差反応性」とは、オリゴヌクレオチド配列が、試料中の２つ以上の他のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を指す。一態様では、「交差反応する」という用語は、試料中の第２のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列の能力を指し、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列と相補的ではないか、又は実質的に相補的ではない。一態様では、「交差反応する」又は「交差反応性」という用語は、試料中の２つ以上のオリゴヌクレオチドタグ又は２つ以上のタグ付き標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドの能力を指す。一態様では、交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件下で、試料中の１つ以上のオリゴヌクレオチドタグにハイブリダイズする。「非交差反応性」又は「非交差反応すること」は、試料中の特定のオリゴヌクレオチド配列にのみハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列、例えば、試料中のその対応する相補的配列にのみハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列の能力を指す。一態様では、「非交差反応性」という用語は、捕捉オリゴヌクレオチドが、２つ以上のオリゴヌクレオチドタグ又は２つ以上のタグ付き標的ヌクレオチド配列を含む試料中の１つのオリゴヌクレオチドタグにのみハイブリダイズする能力を指す。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料中の１つのオリゴヌクレオチドタグのみにハイブリダイズする。一態様では、非交差反応性とは、第１のオリゴヌクレオチドが、試料中のその相補的配列以外の配列に結合する比率が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で０．０５％未満であることを意味する。一態様では、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件は、２７℃～４７℃の温度、２１％～４１％のホルムアミド濃度、３００ｍＭ～５００ｍＭの塩濃度、及び７．５～８．５のｐＨを含む。一態様では、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件は、約３７℃の温度、約３１％のホルムアミド濃度、約４００ｍＭの塩濃度、及び８．０のｐＨを含む。
【0093】
「アレイ」は、本明細書において結合ドメイン又はアレイエレメントと呼ばれる、２つ以上の空間的に別個の（すなわち、重複しない）アドレス可能な位置を有する１つ以上の支持体表面を指す。一態様では、各アドレス可能な位置は、例えば捕捉オリゴヌクレオチドを含むアッセイ試薬を含む。
【0094】
「支持体表面」とは、種々の物質、例えば、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを固定化することができる表面材料を指す。「支持体表面」は、平面又は非平面であることができる。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を含む。一態様では、支持体表面は、複数のウェルを有するプレート、すなわち「マルチウェルプレート」である。マルチウェルプレートは、任意のパターン又は構成で配置された任意のサイズ又は形状の任意の数のウェルを含むことができる。別の態様では、支持体表面は、湾曲した面を有する。一態様では、支持体表面は、１つ以上の粒子、ビーズ、又はマイクロスフェアによって提供される。粒子、ビーズ、又はマイクロスフェアという用語は、別段の指示がない限り、互換的に使用することができる。一態様では、支持体表面は、色分けされた粒子、ビーズ、又はマイクロスフェアを含む。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、アッセイフローセル又はアッセイ流体を含む。
【0095】
一態様では、支持体表面は、例えば、「遺伝子チップ」デバイスで典型的であるように、複数のアドレス可能な位置（「スポット」と呼ばれ得る）を含む。別の態様では、アレイは、ビーズの懸濁液中の各ビーズがアドレス可能な位置を表す「ビーズアレイ」アプローチ（これは、例えば、フローサイトメトリー又は顕微鏡検出技法を使用してアドレスされ得る）におけるように、各々が１つのアドレス可能な位置を有する複数の支持体表面を含む。別の態様では、アレイは複数の支持体表面を含み、各々が、表面当たり１つ以上、又は２つ以上のアドレス可能な位置を有する。支持体表面上のアドレス可能な位置は、均一な行及び列に配置することができるか、又は他のパターンを形成することができる。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば、約１０未満から約５０、約１００、約２００、約５００、又は約１０００超まで変化することができる。「多重化」とは、単一アッセイにおける２つ以上のアッセイ標的の同時分析を指す。
【0096】
アッセイで測定された分析物、又はアッセイで使用される試薬の文脈において、「複数」という用語は、分析物又は試薬の２つ以上のコピー（例えば、試薬Ａ及び試薬Ａの別のコピー）だけではなく、２つ以上の構造的又は機能的に異なる分析物又は試薬（例えば、試薬Ａ及び試薬Ｂ）を意味する。例えば、「複数の検出試薬」という用語は、２つ以上の構造的又は機能的に異なる検出試薬がアッセイ中に存在することを意味し、例えば、異なる検出試薬は各々、異なる標的分析物に特異的に結合し、１つの試薬の複数のコピーが存在する状況を記述しない。しかしながら、この文脈における「複数」という用語の使用は、複数の分析物又は試薬のうちのいずれかの複数のコピーが存在する可能性を排除しない。例えば、複数の固定化した標的化試薬相補体は、標的化試薬相補体Ａの１つ以上のコピー及び標的化試薬相補体Ｂの１つ以上のコピーを含む固定化した標的化試薬相補体を指し得る。複数の分析物又は試薬を指す場合、「第１の」、「第２の」、「第３の」など、又は「追加の」という用語は、固有の分析物又は試薬の間を区別するために使用することができる。例えば、「第１の」検出試薬は、「第１の」標的分析物に結合し、「第２の」検出試薬は、「第２の」標的分析物又は標的分析物の異なる部分に結合する。
【0097】
「固有の」は、組成物又は混合物中に存在する他の成分に依存する相対的な用語である。例えば、ヌクレオチド配列、例えば、プローブの分析物結合部分のヌクレオチド配列に関連して使用される場合、「固有の」という用語は、１つの分析物結合部分のヌクレオチド配列が、組成物又は混合物中の他のプローブの分析物結合部分のヌクレオチド配列とは異なることを意味する。同様に、標的化試薬又はオリゴヌクレオチドタグに関連して使用される場合、「固有の」という用語は、標的化試薬又はオリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列が、組成物又は混合物中の他の標的化試薬又はタグのヌクレオチド配列と異なることを意味する。「固有の」という用語は、「固有の」分析物又は試薬の複数のコピーがアッセイ又は試料に存在し得る可能性を排除しない。
【0098】
「炭素系」とは、主成分として元素炭素（Ｃ）を含有する材料を指す。炭素含有材料又は炭素系材料の例としては、カーボン、カーボンブラック、黒鉛状炭素、ガラス状炭素、カーボンナノチューブ、炭素フィブリル、グラファイト、炭素繊維、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。炭素系材料は、例えば、グラファイト、カーボンブラック、又はカーボンナノチューブを含む元素炭素を含むことができる。一態様では、炭素系材料は、導電性炭素－ポリマー複合材料、導電性ポリマー、又はマトリックス中に分散された導電性粒子、例えば、カーボンインク、カーボンペースト、又は金属インクを含む。導電性炭素粒子としては、例えば、マトリックス、例えば、エチレン酢酸ビニル（ethylene vinyl acetate、ＥＶＡ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、又はアクリロニトリルブタジエンスチレン（acrylonitrile butadiene styrene、ＡＢＳ）などのポリマーマトリックス中に分散された、例えば、炭素フィブリル、カーボンブラック、又は黒鉛状炭素が挙げられる。かかるポリマーマトリックスはまた、酢酸ビニル、エチレン、ビニルアルコール、塩化ビニル、アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマーから選択されるモノマーを含み得る２つ以上のタイプの成分モノマーとのコポリマーを含むことができる。
【0099】
Ｂ．概要
本明細書において、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖の第１及び第２の鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、方法は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するために使用される。
本明細書において、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖の第１及び第２の鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、方法は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するために使用される。
【0100】
本明細書に記載の方法は、例えば、血漿、血清、全血、尿、糞便、母乳、唾液、及び羊水を含むがこれらに限定されない生体液、並びに脳、肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓などの器官若しくは器官ホモジネート、又は筋肉、皮膚、若しくは骨髄などの他の組織を含むがこれらに限定されない組織若しくは組織ホモジネートを含む、様々な複雑な生体試料におけるオリゴヌクレオチド治療剤を特性評価するための頑強かつ高感度な方法を提供する。一態様では、試料は、環境試料である。一態様では、試料は、製造プロセス試料である。
【0101】
一態様では、方法は、例えば、薬物動態（pharmacokinetics、ＰＫ）、薬力学（pharmacodynamics、ＰＤ）、クリアランス、半減期、ピーク濃度、曝露－応答関係、生体内分布、組織標的化、組織蓄積、組織生物学的利用能、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態、生体内分布、及び細胞取り込みを特性評価するために使用することができる。一態様では、方法は、オリゴヌクレオチド二本鎖の両方の鎖を検出又は定量化するために、例えば、二本鎖の安定性、並びにオリゴヌクレオチド二本鎖の個々の鎖の薬物動態、生体内分布、及び細胞取り込みを評価するために使用することができる。
【0102】
一態様では、方法又はキットは、微生物の１つ以上のヌクレオチド配列又はバリアントを特定、検出、又は定量化するために使用される。一態様では、方法又はキットは、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスの１つ以上のヌクレオチド配列又はバリアントを特定、検出、又は定量化するために使用される。一態様では、方法又はキットは、ヒトマイクロバイオームの成分である細菌、真菌、原生動物、又はウイルスの１つ以上のヌクレオチド配列を特定、検出、又は定量化するために使用される。方法又はキットの一態様では、細菌からの１６Ｓ ｒＲＮＡ又はｒＤＮＡの１つ以上のヌクレオチド配列又はバリアントを特定、検出、又は定量化するために使用される。
【0103】
一態様では、細菌は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｏｔａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｎｅｍａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｅｒｉｏ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｅｍｏｄｅｘ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｏｔａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、又はＹｅｒｓｉｎｉａ細菌である。
【0104】
一態様では、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、方法は、試料を、センスプローブ及びアンチセンスプローブを含むプローブのセットを含む組成物と接触させることを含む。一態様では、センスプローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、アンチセンスプローブは、支持体表面に固定化された第２の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有する。一態様では、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。
【0105】
一態様では、方法は、プローブを試料とともにインキュベートしてハイブリダイゼーション混合物を形成するステップを更に含む。一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、センスプローブがオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とハイブリダイズしてセンス複合体を形成し、アンチセンスプローブがオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とハイブリダイズしてアンチセンス複合体を形成する「生産的」又は「望ましい」ハイブリダイゼーション複合体を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、１つ以上の「非生産的」又は望ましくないハイブリダイゼーション複合体を含む。非生産的なハイブリダイゼーション複合体の一例は、センスプローブがオリゴヌクレオチドのセンス鎖にハイブリダイズしない場合、又はアンチセンスプローブがオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖にハイブリダイズしない場合である。非生産的ハイブリダイゼーション複合体の別の例は、センスプローブ及びアンチセンスプローブが、互いにハイブリダイズしてプローブ－プローブ複合体を形成する場合である。
【0106】
図１Ａは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖１１及びアンチセンスプローブ１２を含むアンチセンス複合体１０の概略図であり、アンチセンスプローブ１２は、オリゴヌクレオチドタグ１３、アンチセンス結合部分１４、及び標識１５を含む。図１Ｂは、オリゴヌクレオチド二本鎖からのセンス鎖２１及びセンスプローブ２２を含むセンス複合体２０の概略図であり、センスプローブ２２は、オリゴヌクレオチドタグ２３、センス結合部分２４、及び標識２５を含む。
【0107】
オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出しようとする場合に生じる１つの困難性は、プローブ－プローブハイブリダイゼーションに起因する潜在的な非生産的結合である。オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖並びにセンスプローブ及びアンチセンスプローブを含むハイブリダイゼーション混合物中で可能であるハイブリダイゼーション複合体が、図２Ａ～図２Ｃ（短い結合部分を有するプローブを使用）及び図３Ａ～図３Ｃ（全長結合部分を有するプローブを使用）に示される。
【0108】
図２Ａは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖１１及びアンチセンスプローブ１２を含むアンチセンス複合体１０の概略図であり、アンチセンスプローブ１２は、オリゴヌクレオチドタグ１３、「短い」アンチセンス結合部分１４、及び標識１５を含む。図２Ｂは、オリゴヌクレオチド二本鎖からのセンス鎖２１及びセンスプローブ２２を含むセンス複合体２０の概略図であり、センスプローブ２２は、オリゴヌクレオチドタグ２３、「短い」センス結合部分２４、及び標識２５を含む。本明細書で使用される場合、「短い」結合部分という用語は、アンチセンスプローブ及びセンスプローブの結合部分が、それぞれ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖よりも短い（すなわち、少なくとも１ヌクレオチド少なく含む）長さを有し、その結果、アンチセンス複合体１０に一本鎖オーバーハング１６が存在し、センス複合体２２に一本鎖オーバーハング２６が存在することを意味する。
【0109】
一態様では、アンチセンス複合体１０のアンチセンス１１鎖の末端部分は、一本鎖である。一態様では、アンチセンス複合体１０のアンチセンス１１鎖の３’末端部分は、一本鎖である。一態様では、アンチセンス複合体１０のアンチセンス１１鎖の５’末端部分は、一本鎖である。一態様では、センス複合体２０のセンス鎖２１の末端部分は、一本鎖である。一態様では、センス複合体２０のセンス鎖２１の３’末端部分は、一本鎖である。一態様では、センス複合体２０のセンス鎖２１の５’末端部分は、一本鎖である。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１～約１０ヌクレオチドの長さ、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約３ヌクレオチドの長さ、又は約１～約２ヌクレオチドの長さである。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０ヌクレオチドの長さである。
【0110】
図２Ｃは、アンチセンスプローブ１２の「短い」アンチセンス結合部分１４がセンスプローブ２２の「短い」センス結合部分２４にハイブリダイズする、プローブ－プローブ結合複合体４０の概略図である。この状況において、アンチセンスプローブ１０が「短い」アンチセンス結合部分１４を有し、センスプローブ２０が「短い」センス結合部分２４を有する場合、プローブ－プローブ複合体４０において露出した一本鎖オーバーハング１７及び２７が存在する。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるアンチセンスプローブ１２のアンチセンス結合部分１４の５’末端は、一本鎖である。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるセンスプローブ２２のセンス結合部分２４の５’末端は、一本鎖である。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるアンチセンスプローブ１２のアンチセンス結合部分１４の５’末端及びセンスプローブ２２のセンス結合部分２４の５’末端は、各々一本鎖である。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるアンチセンスプローブ１２のアンチセンス結合部分１４の３’末端は、一本鎖である。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるセンスプローブ２２のセンス結合部分２４の３’末端は、一本鎖である。一態様では、プローブ－プローブ複合体４０におけるアンチセンスプローブ１２のアンチセンス結合部分１４の３’末端及びセンスプローブ２２のセンス結合部分２４の３’末端は、各々一本鎖である。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１～約１０ヌクレオチドの長さ、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約３ヌクレオチドの長さ、又は約１～約２ヌクレオチドの長さである。一態様では、一本鎖オーバーハングは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０ヌクレオチドの長さである。
【0111】
図３Ａは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖１１及びアンチセンスプローブ１２’を含むアンチセンス複合体１０’の概略図であり、アンチセンスプローブ１２’は、オリゴヌクレオチドタグ１３、「全長」アンチセンス結合部分１４’、及び標識１５を含む。図３Ｂは、オリゴヌクレオチド二本鎖からのセンス鎖２１及びセンスプローブ２２’を含むセンス複合体２０’の概略図であり、センスプローブ２２’は、オリゴヌクレオチドタグ２３、「全長」センス結合部分２４’、及び標識２５を含む。本明細書で使用される場合、「全長」結合部分という用語は、アンチセンスプローブ及びセンスプローブの結合部分が、それぞれ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖と同じ長さであり（すなわち、同じ数のヌクレオチド塩基を含む）、その結果、アンチセンス複合体１０’又はセンス複合体２０’に一本鎖オーバーハングが存在しないことを意味する。図３Ｃは、アンチセンスプローブ１２’の「全長」アンチセンス結合部分１４’が、センスプローブ２２’の「全長」センス部分２４’にハイブリダイズされ、そこに一本鎖オーバーハングが存在しない、プローブ－プローブ結合複合体４０’の概略図である。
【0112】
一態様では、支持体表面は、センスプローブ又はアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、ハイブリダイゼーション混合物と接触する。一態様では、アンチセンス複合体の一部分であるアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、センス複合体の一部分であるセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。図４Ａにおいて、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、アンチセンス複合体のアンチセンス鎖部分が一本鎖オーバーハングを含み、それであるように「短く」、センスプローブのセンス結合部分は、センス複合体のセンス鎖部分が一本鎖オーバーハングを含むように「短い」。図４Ｂにおいて、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は「全長」であり、そのためアンチセンス複合体のアンチセンス鎖部分は一本鎖オーバーハングを含まず、センスプローブのセンス結合部分は「全長」であり、その結果、センス複合体のセンス鎖部分は一本鎖オーバーハングを含まない。アンチセンス複合体又はセンス複合体が、それぞれアンチセンスプローブ又はセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面にハイブリダイズする状況は、本明細書において「生産的」と称される。
【0113】
一態様では、アンチセンスプローブ又はセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、それぞれアンチセンス複合体又はセンス複合体の一部分ではない。アンチセンス複合体又はセンス複合体ではないハイブリダイゼーション複合体が、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面にハイブリダイズする状況は、本明細書において「非生産的」と称される。一態様では、図４Ｃに示されるように、アンチセンスプローブ１２又はセンスプローブ２２のオリゴヌクレオチドタグは、アンチセンスプローブ１２又はセンスプローブ２２のみを支持体表面３０に結合する。この状況において、アンチセンスプローブ１２又はセンスプローブ２２のそれぞれアンチセンス結合部分１４及びセンス結合部分２４は、一本鎖のままである。
【0114】
一態様では、アンチセンスプローブ又はセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、プローブ－プローブ複合体の一部分であり、アンチセンスプローブ１２又はセンスプローブ２２のオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面３０にプローブ－プローブ複合体４０’を固定化する。一態様では、図４Ｄに示されるように、プローブのアンチセンス結合部分及びセンス結合部分は「短く」、その結果、プローブ－プローブ複合体４０の結合部分に一本鎖オーバーハングが存在する。一態様では、図４Ｅに示すように、プローブのアンチセンス結合部分及びセンス結合部分は「全長」であり、その結果、プローブ－プローブ複合体４０’の結合部分に一本鎖オーバーハングが存在しない。
【0115】
一態様では、試料は複数のオリゴヌクレオチド二本鎖を含み、組成物は複数のプローブのセットを含み、各プローブのセットは、固有のオリゴヌクレオチド二本鎖の固有のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする。
【0116】
一態様では、方法は、ステップダウンハイブリダイゼーション条件を含み、プローブは、アニーリング温度の漸進的低下の間に、それらのそれぞれのセンス鎖又はアンチセンス鎖にハイブリダイズする。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、試料を第１の温度でインキュベートしてオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させる変性ステップを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、アニーリングステップを含み、プローブをオリゴヌクレオチド二本鎖の変性したセンス鎖及び変性したアンチセンス鎖とともに第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブがセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズすることを可能にする。一態様では、方法は、センス複合体及びアンチセンス複合体を、約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることを含む。
【0117】
一態様では、変性ステップは、試料を約６０℃～約９５℃の第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、変性ステップは、試料を少なくとも約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、又は約８０℃、かつ最大約８５℃、約９０℃、約９５℃、又は約１００℃の第１の温度でインキュベートすることを含む。一態様では、変性ステップは、試料を約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、又は約１００℃の第１の温度で試料をインキュベートすることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、試料を約８０℃～約９５℃の第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、試料を約９０℃～約９５℃の第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、試料を約９５℃の第１の温度でインキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、試料は、約１分間～約１５分間インキュベートされる。一態様では、試料は、少なくとも約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、又は約５分間、かつ最大約１０分間又は約１５分間インキュベートされる。一態様では、試料は、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、又は約１５分間インキュベートされる。一態様では、試料は、約１分間～約５分間インキュベートされる。一態様では、試料は、約１分間～約２分間インキュベートされる。一態様では、試料は、約２分間インキュベートされる。一態様では、変性ステップは、プローブを試料約６０℃～約９５℃の第１の温度で約１分間～約１５分間インキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料約８０℃～約９５℃の第１の温度で約１分間～約５分間インキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料約９５℃の第１の温度で約２分間インキュベートして、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を変性させることを含む。
【0118】
一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに約１０℃～約６５℃の第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに少なくとも約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃、かつ最大約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、又は約６５℃の第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、又は約６５℃の第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに約４０℃及び約６５℃からの第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに６０℃～約６５℃の第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに約６５℃の第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせるステップを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに第２の温度で約３０秒間～約５分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに第２の温度で少なくとも約３０秒間、約６０秒間、約９０秒間、かつ最大約２分間、約３分間、約４分間、又は約５分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに第２の温度で約１分間～約２分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに第２の温度でインキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせるステップを含む。一態様では、アニーリングステップは、プローブを試料とともに約１０℃～約６５℃の第２の温度で約３０秒間～約５分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに約４０℃～約６５℃の第２の温度で約１分間～約２分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに約６５℃の第２の温度で約１分間インキュベートして、センスプローブ及びアンチセンスプローブをセンス鎖及びアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに約２℃～約８℃の保持温度でインキュベートすることを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション条件は、プローブを試料とともに約４℃の保持温度でインキュベートすることを含む。
【0119】
一態様では、アニーリングステップと保持との間の温度遷移速度は、約０．０５℃／秒～約０．５℃／秒である。一態様では、アニーリングステップと保持との間の温度遷移速度は、約０．１℃／秒である。
【0120】
一態様では、プローブは、希釈剤５４又はＮ－ＰＬＥＸハイブリダイゼーション緩衝液１若しくは２を含む緩衝液中で試料とともにインキュベートさせる。
【0121】
一態様では、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物は、一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触する。一態様では、支持体表面は、最初に、センスプローブ及びアンチセンスプローブの第１のオリゴヌクレオチドタグ及び第２のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面で第１の捕捉オリゴヌクレオチド及び第２の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を支持体表面に固定化する条件下で、ハイブリダイゼーション混合物と接触し、次いで、支持体表面は、一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物は、一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触して、反応混合物を形成し、次いで、センスプローブ及びアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面で固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面を反応混合物と接触する。
【0122】
一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＤＮａｓｅは、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、又はマングビーンヌクレアーゼである。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＲＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅＯＮＥ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、又はエキソリボヌクレアーゼＩＩである。
【0123】
一態様では、図４Ｃに示されるように、一本鎖ヌクレアーゼは、ハイブリダイゼーション複合体における未結合の一本鎖プローブを切断し、プローブから標識を分離する。有利なことに、これはプローブから標識を除去し、非結合プローブの支持体表面への固定化によって引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
【0124】
一態様では、図４Ｄに示されるように、一本鎖ヌクレアーゼは、「短い」プローブを使用して形成された一本鎖オーバーハングプローブ－プローブ複合体を切断し、プローブ－プローブ複合体から標識を除去し、それによってバックグラウンドレベルを減少させる。
【0125】
一態様では、図４Ｅに示すように、プローブ－プローブ複合体は、一本鎖オーバーハングが存在しないようにＦＬプローブから形成される。この状況では、標識は支持体表面に固定化されたままであり、高いバックグラウンドレベルを引き起こす。
【0126】
一態様では、試料をプローブのセットを含む組成物と接触させる方法ステップ、プローブを試料とともにインキュベートして、センス複合体及びアンチセンス複合体を含むハイブリダイゼーション複合体を形成する方法ステップ、支持体表面を、ハイブリダイゼーション複合体を含むハイブリダイゼーション混合物と接触させる方法ステップ、並びに支持体表面を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる方法ステップのうちの１つ以上が同時に行われる。一態様では、試料をプローブのセットを含む組成物と接触させる方法ステップ、プローブを試料とともにインキュベートして、センス複合体及びアンチセンス複合体を含むハイブリダイゼーション複合体を形成する方法ステップ、支持体表面を、ハイブリダイゼーション複合体を含むハイブリダイゼーション混合物と接触させる方法ステップ、並びにハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる方法ステップは全て同時に行われる。
【0127】
一態様では、試料をプローブのセットを含む組成物と接触させる方法ステップ、プローブを試料とともにインキュベートして、センス複合体及びアンチセンス複合体を含むハイブリダイゼーション複合体を含むハイブリダイゼーション混合物を形成する方法ステップ、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させる方法ステップ、並びにハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる方法ステップのうちの１つ以上が順次に行われる。一態様では、試料をプローブのセットを含む組成物と接触させる方法ステップ、プローブを試料とともにインキュベートして、センス複合体及びアンチセンス複合体を含むハイブリダイゼーション複合体を含むハイブリダイゼーション混合物を形成する方法ステップ、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させる方法ステップ、並びにハイブリダイゼーション複合体を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる方法ステップは各々、順次に行われる。
【0128】
一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約１５分間～約１２時間インキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに、少なくとも約１５分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、又は約６時間、かつ最大約６時間又は約１２時間インキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約３０分～約３時間インキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約１時間～約２時間インキュベートする。
【0129】
一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約２０℃～約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに、少なくとも約２０℃、約２５℃、又は約３０℃、かつ最大約２５℃、又は約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約２０℃～約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約３０℃～約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約３５℃～約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃の温度でインキュベートする。一態様では、支持体表面は、センス複合体及びアンチセンス複合体とともに約３７℃の温度でインキュベートする。
【0130】
一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約７００ｒｐｍ～約９００ｒｐｍで振盪しながら振盪しながらインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに約７００ｒｐｍ、７０５ｒｐｍ、７１０ｒｐｍ、７２５ｒｐｍ、７５０ｒｐｍ、かつ最大約８００ｒｐｍ、約８５０ｒｐｍ、又は約９００ｒｐｍで振盪しながら振盪しながらインキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体と約７０５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
【0131】
一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１５分間～約１２時間インキュベートする。一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体とともに、約２０℃～約４０℃の温度で約１時間～約２時間インキュベートする。一態様では、支持体表面は、センス複合体及びアンチセンス複合体とともに振盪しながらインキュベートする。一態様では、支持体表面は、センス複合体及びアンチセンス複合体とともに、約３７℃の温度で約１時間、約７０５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
【0132】
一態様では、試料は複数のオリゴヌクレオチド二本鎖を含み、プローブ組成物は複数のプローブのセットを含み、各プローブのセットは、固有のオリゴヌクレオチド二本鎖の固有のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ～約１０ｎＭのセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ、約５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ、又は約２５０ｐＭから、最大約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、又は約１０ｎＭのセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約１００ｐＭ～約５００ｐＭのセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ～約２００ｐＭのセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ～約１００ｐＭのセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ、約５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ、又は約２５０ｐＭから、最大約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、又は約１０ｎＭのアンチセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約１００ｐＭ～約５００ｐＭのアンチセンスプローブを含む。一態様では、プローブ組成物は、約２０ｐＭ～約２００ｐＭのアンチセンスプローブを含む。
【0133】
一態様では、方法は、支持体表面に固定化された存在標識に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することを含む。一態様では、方法は、約２００ｐｇ／ｍＬ未満の検出下限（lower limit of detection、ＬＬＯＤ）を有する。
【0134】
Ｃ．オリゴヌクレオチド二本鎖
一態様では、本明細書に記載の方法は、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖を検出するために使用される。一態様では、本明細書に記載の方法は、オリゴヌクレオチド二本鎖の第１の鎖及び第２の鎖を検出するために使用される。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤である。一態様では、オリゴヌクレオチド治療剤は、センス及びアンチセンス鎖を含む。
一態様では、本明細書に記載の方法は、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖を検出するために使用される。一態様では、本明細書に記載の方法は、オリゴヌクレオチド二本鎖の第１の鎖及び第２の鎖を検出するために使用される。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤である。一態様では、オリゴヌクレオチド治療剤は、センス及びアンチセンス鎖を含む。
【0135】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の両方の鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の両方の鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の１つの鎖はＤＮＡを含み、オリゴヌクレオチド二本鎖の１つの鎖はＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖である。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＲＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＤＮＡを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＲＮＡを含む。
【0136】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の一方又は両方の鎖は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の鎖のうちの１つは、ＤＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の鎖のうちの１つは、ＲＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＤＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＤＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖は、ＲＮＡ及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基、糖、又はヌクレオチド間結合における修飾を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、個々に、５’－又は３’－バイオコンジュゲートを含む。一態様では、バイオコンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、α－トコフェロール、アプタマー、抗体、コレステロール、スクアレン、脂肪酸、又はヌクレオリピドを含む。
【0137】
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖は、独立して、約５～約１００ヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖は、独立して、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、又は約３０ヌクレオチドから、最大約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、又は約１００ヌクレオチドの長さを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖は、約８～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約１０～約３０ヌクレオチド、約１２～約３０ヌクレオチド、約１６～約３０、又は約１８～約３０ヌクレオチドを含む。
【0138】
Ｄ．オリゴヌクレオチドプローブ
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズすることができるセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができるアンチセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ、アンチセンス結合部分、及び標識を含むアンチセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ、センス結合部分、及び標識を含むセンスプローブが提供される。
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズすることができるセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができるアンチセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ、アンチセンス結合部分、及び標識を含むアンチセンスプローブが提供される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ、センス結合部分、及び標識を含むセンスプローブが提供される。
【0139】
１．オリゴヌクレオチドタグ
一態様では、センスプローブ及びアンチセンスプローブは、捕捉オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
一態様では、センスプローブ及びアンチセンスプローブは、捕捉オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【0140】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドではない捕捉オリゴヌクレオチドと交差反応しないか、又はそれにハイブリダイズしない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その対応する捕捉オリゴヌクレオチドではない捕捉オリゴヌクレオチドと交差反応しないか、又はそれにハイブリダイズしない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖にハイブリダイズしない。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分にハイブリダイズせず、又はその逆も同様である。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、生理学的に適切な条件下又はストリンジェントな条件下で、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分にハイブリダイズしない。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、生理学的に適切な条件下又はストリンジェントな条件下で、センスプローブのセンス結合部分にハイブリダイズしない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、生理学的に適切な条件下又はストリンジェントな条件下で、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖にハイブリダイズしない。
【0141】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグ及びその対応する捕捉オリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の「配列相補性」を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ及び捕捉オリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列相補性を有する配列を有する。
【0142】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、組換えによって産生される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、化学的に合成される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、天然に存在する配列ではない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖ＤＮＡ配列を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖ＲＮＡ配列を含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0143】
一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【0144】
一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【0145】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0146】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、アンチセンスプローブの５’末端に結合される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、アンチセンスプローブの３’末端に結合される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、センスプローブの５’末端に結合される。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、センスプローブの３’末端に結合される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖と相補的ではなく、ハイブリダイズしない。
【0147】
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５、かつ最大約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、若しくは約４０、又は約１５及び約４０、若しくは約２０及び約３０ヌクレオチドからの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列よりも、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０、かつ最大約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、若しくは約２０、又は約１～約２０、約１０～約１５、若しくは約１２～約１３ヌクレオチド短いヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、少なくとも約２４、約３０、又は約３６ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、対応する捕捉オリゴヌクレオチドの長さと同じである長さを有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、対応する捕捉オリゴヌクレオチドの長さよりも短い長さを有する。
【0148】
２．結合部分
一態様では、アンチセンスプローブは、アンチセンス結合部分を含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の核酸配列に相補的である核酸配列を有する。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる。一態様では、アンチセンス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の「配列相補性」を有する。一態様では、アンチセンス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列相補性を有する配列を有する。
一態様では、アンチセンスプローブは、アンチセンス結合部分を含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の核酸配列に相補的である核酸配列を有する。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる。一態様では、アンチセンス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の「配列相補性」を有する。一態様では、アンチセンス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列相補性を有する配列を有する。
【0149】
一態様では、センスプローブは、センス結合部分を含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の核酸配列に相補的な核酸配列を有する。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズすることができる。一態様では、センス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の「配列相補性」を有する。一態様では、センス結合部分とオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とは、ワトソン－クリックモデルに基づいて少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列相補性を有する配列を有する。
【0150】
一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合長は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、アンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖よりも約１～約１０ヌクレオチド短い長さを有する。一態様では、アンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖よりも約１～約５ヌクレオチド短い長さを有する。一態様では、アンチセンス結合部分は、約１０～約２５ヌクレオチドの長さ、又は約１０～約２０ヌクレオチド、若しくは約１０～約１６ヌクレオチドの長さである。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、長さを有し、これは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の長さの約５０％～約９９％である。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、長さを有し、これは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の長さの約７５％～約９５％である。
【0151】
一態様では、センスプローブのセンス結合長は、センス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。一態様では、センス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖よりも約１～約１０ヌクレオチド短い長さを有する。一態様では、センス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖よりも約１～約５ヌクレオチド短い長さを有する。一態様では、センス結合部分は、約１０～約２５ヌクレオチドの長さ、又は約１０～約２０ヌクレオチド、若しくは約１０～約１６ヌクレオチドの長さを有する。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、長さを有し、これは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の長さの約５０％～約９９％である。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、長さを有し、これは、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の長さの約７５％～約９５％である。
【0152】
一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖の５’末端とアラインメントする３’末端を有する。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端とアラインメントする５’末端を有する。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端とアラインメントする３’末端を有する。
【0153】
一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。
【0154】
一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0155】
一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0156】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＤＮＡを含むアンチセンス結合部分及びＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、アンチセンス結合部分アンチセンスプローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いアンチセンス結合長を有する。一態様では、アンチセンスプローブは、ＲＮＡを含むアンチセンス結合部分及びＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、アンチセンス結合部分アンチセンスプローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いアンチセンス結合長を有する。一態様では、センスプローブは、ＤＮＡを含むセンス結合部分及びＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いセンス結合長を有する。一態様では、センスプローブは、ＲＮＡを含むセンス結合部分及びＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いセンス結合長を有する。
【0157】
一態様では、アンチセンスプローブの結合部分は、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、アンチセンスプローブの結合部分は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、アンチセンスプローブの結合部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【0158】
一態様では、センスプローブの結合部分は、１つ以上の修飾核酸を含む。一態様では、センスプローブの結合部分は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一態様では、センスプローブの結合部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【0159】
３．標識
一態様では、プローブは、標識を含む。一態様では、標識は、プローブに直接的に結合される。別の態様では、標識は、リンカーを介してプローブに結合される。一態様では、標識は、プローブの５’末端に結合される。一態様では、標識は、プローブの３’末端に結合される。一態様では、標識は、一次標識である。一態様では、一次標識は、検出可能な物理的特性を有する。一次標識の例としては、放射性同位体、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、電気化学発光（ＥＣＬ）部分、磁性粒子、及び生物発光部分が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、一次標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識である。一態様では、ＥＣＬ標識は、遷移金属、例えばルテニウムを含む有機金属錯体である。一態様では、一次標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。
一態様では、プローブは、標識を含む。一態様では、標識は、プローブに直接的に結合される。別の態様では、標識は、リンカーを介してプローブに結合される。一態様では、標識は、プローブの５’末端に結合される。一態様では、標識は、プローブの３’末端に結合される。一態様では、標識は、一次標識である。一態様では、一次標識は、検出可能な物理的特性を有する。一次標識の例としては、放射性同位体、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、電気化学発光（ＥＣＬ）部分、磁性粒子、及び生物発光部分が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、一次標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識である。一態様では、ＥＣＬ標識は、遷移金属、例えばルテニウムを含む有機金属錯体である。一態様では、一次標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。
【0160】
一態様では、標識は、結合対のメンバーである化合物であり、結合対の第１のメンバー（「一次結合試薬」と呼ぶことができる）は、基質、例えば、オリゴヌクレオチドに結合され、結合対の他方のメンバー（「二次結合試薬」と呼ぶことができる）は、検出可能な物理的特性を有するか、又は検出可能な物理的特性を有する部分に結合される。結合対の非限定的な例としては、ビオチン及びストレプトアビジン、又はアビジン、相補的オリゴヌクレオチド、ハプテン及びハプテン結合パートナー、並びに抗体－抗原結合対が挙げられる。一態様では、標識は、ビオチンを含む一次結合剤である。一態様では、二次結合試薬は、ストレプトアビジンを含む。一態様では、二次結合試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。
【0161】
Ｅ．試料
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、試料中にある。一態様では、試料は、目的の供給源から得られるか、又はそれに由来する生体試料である。一態様では、試料は、生物であるか、又は生物から得られる。一態様では、試料は、植物であるか、又は植物から得られる。一態様では、試料は、動物であるか、又は動物から得られる。一態様では、試料は、哺乳動物から得られる。一態様では、試料は、ヒトから得られる。一態様では、目的の供給源は、バイオリアクターを含む。一態様では、試料は、製造プロセス試料である。一態様では、試料は、環境試料である。一態様では、環境試料は、例えば、帯水層試料、地下水試料、又は廃水試料を含む、水試料を含む。一態様では、環境試料は、土壌試料を含む。一態様では、環境試料は、土壌微生物試料を含む。一態様では、試料は、細胞フリーＤＮＡを含む。
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖は、試料中にある。一態様では、試料は、目的の供給源から得られるか、又はそれに由来する生体試料である。一態様では、試料は、生物であるか、又は生物から得られる。一態様では、試料は、植物であるか、又は植物から得られる。一態様では、試料は、動物であるか、又は動物から得られる。一態様では、試料は、哺乳動物から得られる。一態様では、試料は、ヒトから得られる。一態様では、目的の供給源は、バイオリアクターを含む。一態様では、試料は、製造プロセス試料である。一態様では、試料は、環境試料である。一態様では、環境試料は、例えば、帯水層試料、地下水試料、又は廃水試料を含む、水試料を含む。一態様では、環境試料は、土壌試料を含む。一態様では、環境試料は、土壌微生物試料を含む。一態様では、試料は、細胞フリーＤＮＡを含む。
【0162】
一態様では、試料は、生体試料を含む。一態様では、試料は、未処理の生体試料を含む。一態様では、試料は、前処理した生体試料を含む。一態様では、試料は、例えば、１つ以上の成分を除去するために、又は１つ以上の薬剤を添加するために前処理される。一態様では、試料は、精製した試料を含む。生体試料からオリゴヌクレオチドを精製する方法は既知であり、例えば、沈殿、遠心分離、及びカラムクロマトグラフィが挙げられる。一態様では、カラムクロマトグラフィには、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィ（reverse phase high performance liquid chromatography、ＲＰ－ＨＰＬＣ）、アニオン交換高圧液体クロマトグラフィ（anion exchange high pressure liquid chromatography、ＡＥＸ ＨＰＬＣ）、又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamide gel electrophoresis、ＰＡＧＥ）が挙げられる。一態様では、試料は、抽出した試料である。一態様では、試料は、例えば、半透膜を使用して濾過される。一態様では、試料は、試料から抽出されたか、又はｍＲＮＡの増幅若しくは逆転写のような技法に試料を供することによって得られたオリゴヌクレオチドを含む。
【0163】
一態様では、試料は、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、試料は、１つ以上の増幅した標的オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）を含むがこれらに限定されない方法によって得られた、１つ以上の増幅した標的オリゴヌクレオチド配列を含む。
【0164】
一態様では、生体試料は、例えば、体液、分泌物、排泄物、細胞、組織若しくは器官、又はそれらのホモジネートを含む、生体組織又は生体液を含む。一態様では、生体液としては、血漿、血清、全血、リンパ液、尿、糞便、母乳、痰、唾液、腹水、脳脊髄液、腹水、胸膜液、及び羊水が挙げられる。一態様では、生物学的組織は、脳、肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓などの器官若しくは器官ホモジネート、又は例えば、筋肉、皮膚、若しくは骨髄などの他の組織を含むがこれらに限定されない、組織又は組織ホモジネートを含む。一態様では、生体試料には、組織又は細針生検試料、細胞含有体液、浮遊核酸、婦人科流体、皮膚スワブ、膣スワブ、口腔スワブ、鼻腔スワブ、洗液、又は洗浄、例えば管洗浄物若しくは気管支肺胞洗浄物、吸引物、擦過物、外科標本が含まれる。
【0165】
一態様では、生体試料は、ヒトの体の一部分から単離された試料を含む。一態様では、生体試料は、鼻腔、口腔、皮膚、耳、粘膜、胃腸管、尿生殖路、気道、眼、又はそれらの組み合わせから単離された試料を含む。一態様では、生体試料は、スワブ採取、穿刺サンプリング、及び血清サンプリングを含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の方法を使用してヒトの体の一部分から得られた試料を含む。
【0166】
一態様では、試料は、天然に存在するＲＮａｓｅを含む。天然に存在するＲＮａｓｅを含む試料では、試料をセンスプローブ及びアンチセンスプローブと接触させる前に、試料をＲＮａｓｅ阻害剤と接触させることが望ましくあり得る。
【0167】
Ｆ．捕捉オリゴヌクレオチド
一態様では、方法又はキットは、支持体表面で別個の結合ドメインに固定化されている、又は固定化することができる、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、天然に存在する配列ではない。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、組換えによって産生される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、化学的に合成される。
一態様では、方法又はキットは、支持体表面で別個の結合ドメインに固定化されている、又は固定化することができる、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、天然に存在する配列ではない。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、組換えによって産生される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、化学的に合成される。
【0168】
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、センス又はアンチセンスプローブに結合される。
【0169】
一態様では、方法又はキットは、目的のオリゴヌクレオチド二本鎖の固有の捕捉オリゴヌクレオチドセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に固定化される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、アレイに固定化される。一態様では、アレイは、２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アレイは、約２～約１５０個以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
【0170】
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はハイブリダイゼーション反応にも関与することができる非天然化学構造を含む構造的類似体を含む核酸配列を含む、一本鎖核酸配列を含む。
【0171】
一態様では、特定のアレイに使用される捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、互いに少なくとも約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、又は約５℃以内に類似の結合エネルギー又は融解温度（Ｔｍ）を有し、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチドの５０％がその相補体とハイブリダイズし、５０％が溶液中で遊離している温度を指す。Ｔｍは、既知の方法を使用して、例えば、温度の関数として、その相補体を有するオリゴヌクレオチドの吸光度変化を測定することによって、決定することができる。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、５０ｍＭのＮａＣｌで、約５０℃～約７０℃、約５５℃～約６５℃、又は少なくとも約５０℃、約５５℃、若しくは約６０℃から、最大約６０℃、約６５℃、若しくは約７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、約４０％～約６０％、又は約４０％～約５０％のＧＣ含量を有する。
【0172】
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、約２０～約１００、約３０～約５０、又は約３５～約４０ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、又は約３６、かつ最大約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約７５、又は約１００ヌクレオチドの長さである。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも２０、約２４、約３０、又は約３６ヌクレオチドを含む。一態様では、アレイにおける１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、その相補的オリゴヌクレオチドタグの核酸配列と長さが同一ではない。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、その相補的一本鎖オリゴヌクレオチドタグの配列よりも、例えば、最大約５、約１０、約１５、約２０、又は約２５塩基長い配列を有する。
【0173】
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に共有結合によって又は非共有結合によって固定化される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面で１つ以上の結合ドメインに共有結合によって又は非共有結合によって固定化される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、静電相互作用、例えば、オリゴヌクレオチドでの負に荷電したリン酸基と支持体表面での正電荷との間を介して支持体表面に吸着される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドに（直接的又はリンカー部分を介して）結合した第１の結合パートナーと、表面に固定化された第２の結合パートナーとの結合を介して、支持体表面に固定化される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に共有結合によって固定化される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に直接的に固定化される。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して支持体表面に固定化される。
【0174】
捕捉オリゴヌクレオチドは、「ＫＩＴＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＴＡＲＧＥＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＮＡＬＹＴＥＳ ＩＮ Ａ ＳＡＭＰＬＥ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」と題された国際出願公開第ＷＯ２０２０／２２７０１６号（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に開示されており、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【0175】
Ｇ．支持体表面
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが、支持体表面に固定化される。捕捉オリゴヌクレオチドは、従来の結合アッセイに使用される支持体表面を含む、様々な支持体表面に固定化することができる。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を有する。別の態様では、支持体表面は、湾曲した面を有する。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、色分けされたマイクロスフェアを含む。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＢＡＤＧＥ，ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１１）：１８８８－１８９８を参照されたい。一態様では、支持体表面は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている１つ以上のビーズを含む。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが、支持体表面に固定化される。捕捉オリゴヌクレオチドは、従来の結合アッセイに使用される支持体表面を含む、様々な支持体表面に固定化することができる。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を有する。別の態様では、支持体表面は、湾曲した面を有する。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、色分けされたマイクロスフェアを含む。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＢＡＤＧＥ，ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１１）：１８８８－１８９８を参照されたい。一態様では、支持体表面は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている１つ以上のビーズを含む。
【0176】
支持体表面は、ポリスチレン及びポリプロピレンなどのポリマー、セラミック、ガラス、例えば、炭素系インクなどの炭素－ポリマー複合材料を含む複合材料を含む様々な好適な材料から作製することができる。一態様では、支持体表面は、炭素系支持体表面である。
【0177】
一態様では、支持体表面は、１つ以上の粒子又は「ビーズ」によって提供される。一態様では、ビーズは、最大約１ｃｍ（又は約１０，０００μｍ）、約５０００μｍ、約１，０００μｍ、約５００μｍ、又は約１００μｍの直径を有することができる。一態様では、ビーズは、約１０ｎｍ及び約１００μｍから、約１００ｎｍ及び約１０μｍから、又は約０．５μｍ及び約５μｍからの直径を有する。一態様では、ビーズは、常磁性であり、磁場の使用を介してビーズを捕捉する能力を提供する。一態様では、支持体表面は、ストレプトアビジンコーティング磁性粒子又はアビジンコーティング磁性ビーズによって提供され、ビオチン標識捕捉オリゴヌクレオチドがビーズに固定化される。
【0178】
一態様では、支持体表面は、複数のウェルを有するプレート、すなわち「マルチウェルプレート」である。マルチウェルプレートは、任意のパターン又は構成で配置された任意のサイズ又は形状の任意の数のウェルを含むことができる。一態様では、マルチウェルプレートは、約１～約１０，０００ウェルを含む。一態様では、マルチウェルアッセイプレートは、プレート及びウェルの数、サイズ、形状、及び構成について業界標準フォーマットを使用する。標準的なフォーマットの例としては、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、及び９６００ウェルプレートが挙げられ、ウェルは二次元アレイで構成される。他のマルチウェルフォーマットには、単一ウェル、２ウェル、６ウェル、及び２４ウェル、並びに６１４４ウェルプレートが含まれる。一態様では、支持体表面は、９６ウェルプレートを含む。
【0179】
一態様では、支持体表面は、捕捉オリゴヌクレオチドが結合ドメインと呼ばれる既知の位置にプリントされた二次元パターン化アレイを含む。一態様では、支持体表面は、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される、別個の、重複しない、アドレス可能な結合ドメインのパターン化したアレイを含み、各結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドの配列は既知であり、適切な標的分析物と相関することができる。一態様では、特定の結合ドメインにおける全ての捕捉オリゴヌクレオチドは同じ配列を有し、１つの結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドは、他の結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。一態様では、複数の結合ドメインは、支持体表面に規則的な行及び列で整列され、各結合ドメインの正確な位置及び配列は、コンピューターデータベースに記録される。一態様では、アレイは、対称格子パターンで配置される。他の態様では、アレイは、放射状に分布したライン、ラセン状ライン、又は規則的なクラスタを含むがこれらに限定されない別のパターンで配置される。別の態様では、各結合ドメインは、１つ以上の微粒子又はビーズの表面に配置され、微粒子又はビーズは、異なる結合ドメイン間の識別を可能にするようにコード化される。
【0180】
一態様では、支持体表面は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドに対応する各ウェル内に１つ以上の別個のアドレス可能な結合ドメインを含むマルチウェルプレートである。一態様では、支持体表面は、野生型ヌクレオチド配列を検出するための少なくとも１つの結合ドメイン、及び変異体ヌクレオチド配列を検出するための別の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５個の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、少なくとも約７、約１０、約１６、又は約２５個の結合ドメインを含む。
【0181】
一態様では、支持体表面は、少なくとも２４、９６、又は３８４ウェルを含むマルチウェルプレートであり、各ウェルは、異なる捕捉オリゴヌクレオチドが別個の結合ドメインに固定化されている、最大１０個の結合ドメインのアレイを含む。より特定の態様では、支持体表面は、各ウェルが最大１０個の結合ドメインを有するアレイを含む、９６ウェルプレートである。一態様では、９６ウェルプレートの各ウェルは、そこに固定された最大１０個の別個の捕捉オリゴヌクレオチドを有する、最大１０個の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、同じ捕捉オリゴヌクレオチドを有する同じパターン化アレイを含む。別の態様では、異なるウェルは、捕捉オリゴヌクレオチドの異なるパターン化アレイを含み得る。
【0182】
Ｈ．ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Nuclease protection assay、ＮＰＡ）
一態様では、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料は、プローブのセットと接触し、プローブのセットは、センスプローブ及びアンチセンスプローブを含む。一態様では、センスプローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、アンチセンスプローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、方法は、プローブを試料とともにインキュベートして、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物を形成することを含む。一態様では、方法は、ハイブリダイゼーション複合体のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させることを含む。一態様では、方法は、支持体表面に固定化された標識の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することを含む。一態様では、方法は、支持体表面に固定化された標識したセンスハイブリダイゼーション複合体及びアンチセンスハイブリダイゼーション複合体の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することを含む。
一態様では、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、試料中のオリゴヌクレオチド二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖を検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、試料は、プローブのセットと接触し、プローブのセットは、センスプローブ及びアンチセンスプローブを含む。一態様では、センスプローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、アンチセンスプローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるアンチセンス結合部分、及び標識を含む。一態様では、方法は、プローブを試料とともにインキュベートして、ハイブリダイゼーション複合体を含有するハイブリダイゼーション混合物を形成することを含む。一態様では、方法は、ハイブリダイゼーション複合体のオリゴヌクレオチドタグが、支持体表面に固定された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、支持体表面をハイブリダイゼーション混合物と接触させることを含む。一態様では、方法は、支持体表面に固定化された標識の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することを含む。一態様では、方法は、支持体表面に固定化された標識したセンスハイブリダイゼーション複合体及びアンチセンスハイブリダイゼーション複合体の存在に基づいて、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖を検出又は定量化することを含む。
【0183】
一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、センス鎖のセンス鎖長よりも短いセンス結合長を有する。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、センス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いセンス結合長を有する。一態様では、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも短いアンチセンス結合長を有する。一態様では、アンチセンス鎖のアンチセンス結合部分は、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いアンチセンス結合長を有する。
【0184】
一態様では、センスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0185】
一態様では、センスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0186】
一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、センスプローブのセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、センスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0187】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0188】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分及びオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。
【0189】
一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＤＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡを含む。一態様では、アンチセンスプローブのアンチセンス結合部分は、ＲＮＡを含み、アンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡを含む。
【0190】
一態様では、アンチセンスプローブは、ＤＮＡを含むアンチセンス結合部分及びＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、アンチセンス結合部分アンチセンスプローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いアンチセンス結合長を有する。一態様では、アンチセンスプローブは、ＲＮＡを含むアンチセンス結合部分及びＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、アンチセンス結合部分アンチセンスプローブは、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖のアンチセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いアンチセンス結合長を有する。一態様では、センスプローブは、ＤＮＡを含むセンス結合部分及びＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いセンス結合長を有する。一態様では、センスプローブは、ＲＮＡを含むセンス結合部分及びＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドタグを含むキメラプローブであり、センスプローブのセンス結合部分は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖のセンス鎖長よりも少なくとも１ヌクレオチド短いセンス結合長を有する。
【0191】
一態様では、方法は、プローブのセットを試料とともにインキュベートして、ハイブリダイゼーション混合物を形成することを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、センス複合体及びアンチセンス複合体を含むハイブリダイゼーション複合体を含有する。一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖とハイブリダイズしたセンスプローブを含むセンス複合体、及びオリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖とハイブリダイズしたアンチセンスプローブを含むアンチセンス複合体を含む。
【0192】
一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、以下の非生産的ハイブリダイゼーション複合体：オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖にハイブリダイズしないセンスプローブ、オリゴヌクレオチド二本鎖のアンチセンス鎖にハイブリダイズしないアンチセンスプローブ、又はセンスプローブ及びアンチセンスプローブが互いにハイブリダイズするプローブ－プローブ複合体、のうちの１つ以上を更に含有する。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体は、一本鎖オーバーハングを含む。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体は、一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体は、一本鎖ＲＮＡ配列を含む。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体は、一本鎖ＤＮＡ配列を含む。
【0193】
一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列は、一本鎖特異的ヌクレアーゼによって消化される。一態様では、一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列は、一本鎖特異的ＤＮａｓｅで消化されるＤＮＡ配列である。一態様では、一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列は、一本鎖特異的ＲＮａｓｅで消化されるＲＮＡ配列である。
【0194】
一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列の消化は、ハイブリダイゼーション複合体が溶液中にある間に（すなわち、ハイブリダイゼーション複合体がセンス又はアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面に固定化される前に）行われる。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列の消化は、ハイブリダイゼーション複合体がセンスプローブ又はアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面に固定化された後に行われる。一態様では、方法は、一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列が一本鎖特異的ＲＮａｓｅで消化された後に洗浄ステップを含む。一態様では、方法は、一本鎖オーバーハング又は一本鎖オリゴヌクレオチド配列が一本鎖特異的ＲＮａｓｅで消化され、支持体表面に固定化された後に、洗浄ステップを含む。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、支持体表面に固定化された標識の存在に基づいて検出又は定量化される。一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、支持体表面に固定化された標識したセンス複合体又はアンチセンス複合体の存在に基づいて検出又は定量化される。
【0195】
Ｉ．電極
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス又はアンチセンス鎖は、電気化学発光（ＥＣＬ）を使用して検出又は定量化される。電気化学発光を使用する分析物の多重測定は、米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、オリゴヌクレオチド二本鎖のセンス又はアンチセンス鎖は、電気化学発光（ＥＣＬ）を使用して検出又は定量化される。電気化学発光を使用する分析物の多重測定は、米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0196】
一態様では、支持体表面は、１つ以上の電極を含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上の作用電極及び１つ以上の対電極を含む。一態様では、支持体表面は、電気化学アッセイ又は電気化学発光アッセイにおける使用のための１つ以上の電極に形成された１つ以上の結合ドメインを含む。
【0197】
一態様では、結合ドメインは、捕捉オリゴヌクレオチドでコーティングされたビーズを電極表面上に収集することによって形成される。一態様では、ビーズは常磁性であり、ビーズは磁場の使用を介して電極に収集される。
【0198】
一態様では、電極は、アッセイ容器、アッセイフローセル、アッセイ流体工学、又はアッセイを実行するのに有用な他の構成要素を提供するアッセイモジュール内に提供される。電気化学発光アッセイを実行するためのアッセイモジュールの例としては、例えば、マルチアレイケース、アッセイプレートケース、カートリッジケースなどが挙げられる。一態様では、電極は、アッセイ容器、アッセイフローセル、アッセイ流体工学、又はアッセイを実行するのに有用な他の構成要素を提供するアッセイモジュール内に提供される。電気化学発光アッセイを実行するためのアッセイモジュールの例は、米国特許第６，６７３，５３３号、同第７，８４２，２４６号、同第９，７３１，２９７号、及び同第８，２９８８３４号に見出すことができる。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの電極を含むマルチウェルプレートである。一態様では、マルチウェルアッセイプレートの各ウェルは、少なくとも１つの電極を含む。一態様では、マルチウェルアッセイプレートの少なくとも１つのウェルは、作用電極を含む。別の態様では、マルチウェルアッセイプレートの少なくとも１つのウェルは、作用電極及び対電極を含む。別の態様では、マルチウェルアッセイプレートの各ウェルは、作用電極及び対電極を含む。一態様では、作用電極は、対電極に隣接しているが、電気的に接触していない。
【0199】
一態様では、電極は、例えば、金、銀、白金、ニッケル、鋼、イリジウム、銅、アルミニウム、導電性合金、又はそれらの組み合わせなどの金属を含む導電性材料から構成される。別の態様では、電極は、シリコン及びゲルマニウムなどの半導体材料、又は酸化インジウムスズ（indium tin oxide、ＩＴＯ）及び酸化アンチモンスズ（antimony tin oxide、ＡＴＯ）などの半導体薄膜を含む。別の態様では、電極は、酸化アルミニウム被覆アルミニウムなどの酸化物被覆金属を含む。一態様では、電極は、炭素系材料を含む。一態様では、電極は、導電性複合材料、インク、ペースト、ポリマーブレンド、及び、例えば、導電性又は半導電性材料と非導電性材料との混合物を含む金属／非金属複合材料を含有する材料の混合物を含む。一態様では、電極は、炭素、ガラス状炭素、カーボンブラック、黒鉛状炭素、カーボンナノチューブ、炭素フィブリル、グラファイト、炭素繊維、及びそれらの混合物などの炭素系材料を含む。一態様では、電極は、導電性炭素－ポリマー複合材料、導電性ポリマー、又はマトリックス中に分散された導電性粒子、例えば、カーボンインク、カーボンペースト、又は金属インクを含む。一態様では、作用電極は、例えば、マトリックス、例えば、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、又はこれらのポリマーのうちの１つ以上のコポリマーなどのポリマーマトリックス中に分散された、例えば、炭素フィブリル、カーボンブラック、又は黒鉛状炭素などの導電性炭素粒子を含む、炭素－ポリマー複合材料から作製される。
【0200】
一態様では、作用電極は、１つ以上の導電性材料の連続導電性シート又は薄膜から作製され、これは、押出、圧縮、又は鋳型成形され得る。別の態様では、作用電極は、例えば、プリンティング、ペインティング、コーティング、スピンコーティング、蒸発、化学蒸着、電解析出、無電解析出、フォトリソグラフィ、又は他の電子微細加工技術によって、基板上に沈着又はパターン化された導電性材料から作製される。一態様では、作用電極は、例えば、インクジェットプリンティング、レーザプリンティング、又はスクリーンプリンティングによってポリマー支持体上にプリントされた導電性カーボンインクを含む。カーボンインクは既知であり、Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｃｏ．（例えば、Ａｃｈｅｓｏｎ ４４０Ｂ、４２３ｓｓ、ＰＦ４０７Ａ、ＰＦ４０７Ｃ、ＰＭ－００３Ａ、３０Ｄ０７１、４３５Ａ、Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ ５０５ＳＳ、及びＡｑｕａｄａｇ（商標））、Ｅ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．（例えば、Ｄｕｐｏｎｔ ７１０５、７１０１、７１０２、７１０３、７１４４、７０８２、７８６１Ｄ、及びＣＢ０５０）、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｉｎｃ．（例えば、Ｃ－１００）、及びＥｒｃｏｎ Ｉｎｃ．（例えば、Ｇ－４５１）によって製造された材料を含む。
【0201】
一態様では、作用電極は、連続薄膜である。別の態様では、作用電極は、１つ以上の不連続領域又は不連続領域のパターンを含む。代替的に、作用電極は、複数の接続した領域を含み得る。作用電極に露出した電極表面の１つ以上の領域は、例えば、パターン化した絶縁体インク層を作用電極上にスクリーンプリンティングすることによって、又はダイカット絶縁薄膜を接着することによって、作用電極を覆うパターン化した絶縁層によって画定することができる。露出領域は、作用電極にプリントされた試薬のアレイのアレイエレメントを画定し得、上述のようなアレイ形状及びパターンを得ることができる。一態様では、絶縁層は、露出した作用電極表面の一連の環状領域（又は「スポット」）を画定する。
【0202】
対電極は、作用電極について一般的に上述される特性のうちの１つ以上を有し得る。一態様では、作用電極及び対電極は、同じ材料から構成される。別の態様では、作用電極及び対電極は、同じ材料から構成されず、例えば、作用電極は炭素電極であり得、対電極は金属電極であり得る。
【0203】
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、パッシブ吸着によって１つ以上の電極に固定化される。別の態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、電極に共有結合によって固定化される。一態様では、電極は、例えば、電極の表面に捕捉オリゴヌクレオチドなどの試薬を固定化するために、誘導体化又は変更される。一態様では、電極は、試薬の固定化を改善するために、例えば、試薬の固定化のための官能基を導入するために、又はその吸着特性を増強するために、化学的又は機械的処理によって変更される。導入することができる官能基の例としては、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ２）、活性化カルボキシル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－エステル）、ポリ－（エチレングリコール）、チオール、アルキル（（ＣＨ２）ｎ）基、又はそれらの組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、１つ以上の試薬、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、共有結合又は非共有結合の手段のいずれかによって、炭素含有電極、例えば、カーボンブラック、フィブリル、又は別の材料中に分散された炭素に固定化される。チオール基を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、タンパク質層又は化学架橋層などの追加のチオール反応性層を最初に沈着させることを必要とせずに、炭素含有電極、例えばスクリーンプリンティングしたカーボンインク電極に共有結合することができることが見出されている。一態様では、チオール修飾オリゴヌクレオチドなどのチオール基を有する捕捉オリゴヌクレオチドの電極への直接的付着のための方法が提供され、この方法は、電極に捕捉表面及びアレイを形成するための単純で、頑強で、効率的で、かつ再現性のあるプロセスを提供する。一態様では、チオール基を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、スクリーンプリンティングしたカーボンインク電極などの炭素含有電極に、チオールと電極との反応を介して、最初にチオール反応性層を電極に加えることなく、直接的に固定化される。
【0204】
一態様では、電極は、プラズマ、例えば、グロー放電プラズマなどの低温プラズで処理して、電極の物理的特性、化学組成、又は表面化学特性を変化させ、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドのような試薬の固定化を補助するか、又は汚染物質を低減するか、他の材料への接着を改善するか、表面の湿潤性を変化させるか、材料の沈着を促進するか、パターンを作製するか、又は均一性を改善する。有用なプラズマの例としては、酸素、窒素、アルゴン、アンモニア、水素、フルオロカーボン、水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。一態様では、酸素プラズマを使用して、炭素－ポリマー複合材料中に炭素粒子を有する電極を処理する。別の態様では、酸素を使用して、カルボン酸又は他の酸化炭素官能基を炭素又は有機材料（例えば、活性化エステル又は塩化アシル）に導入して、試薬のカップリングを促進する。別の態様では、アンモニア含有プラズマを使用して、カップリングアッセイ試薬における使用のためにアミノ基を導入することができる。一態様では、電極は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドの固定化を補助するために、前処理されない。
【0205】
一態様では、支持体表面は、各ウェル内に１つ以上の作用電極又は対電極を有するマルチウェルプレートなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、マルチウェルプレートは、各ウェル内に複数の作用電極又は対電極を含む。一態様では、マルチウェルプレートの作用電極又は対電極は、炭素、例えば、炭素インクのスクリーンプリンティング層を含む。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドでのチオール部分を介してスクリーンプリンティングしたカーボンインクに固定化される。一態様では、作用電極を使用して、ＥＣＬ標識からＥＣＬシグナルを誘導する。一態様では、ＥＣＬシグナルは、三級アルキルアミン、例えば、トリプロピルアミン又はブチルジエタノールアミンなどの共反応物の存在下でルテニウム－トリス－ビピリジンから放出される。
【0206】
一態様では、電極は、誘電性インク（すなわち、電気絶縁性インク）によって画定される上述の結合ドメインを含む。電極は、上記の結合ドメインを画定するパターンでその上にプリンティングされた誘電体を有する作用電極である。一態様では、結合ドメインは、露出した作用電極のほぼ環状の領域（又は「スポット」）である。電極は、射出成形された９６ウェルプレート上部をウェルの底部を画定するマイラシートに接着することによって形成された９６ウェルプレート内にある。マイラシートの上面は、その上にプリントされたスクリーンプリンティングカーボンインク電極を有し、その結果、各ウェルは、ウェルのほぼ中央にカーボンインク作用電極、及びウェルの２つの縁にほぼ向かう２つのカーボンインク対電極を含む。マイラシートの底部にプリントされ、導電性スルーホールを介してシートの上部に接続された電極は、作用電極及び対電極に電圧を印加するための接点を提供する。
【0207】
Ｊ．検出
一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化された標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたハイブリダイゼーション複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたセンス複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたアンチセンス複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、オリゴヌクレオチド配列は、アレイにおいて検出又は定量化される。
一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化された標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたハイブリダイゼーション複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたセンス複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化されたアンチセンス複合体での標識の検出に基づいて検出又は定量化される。一態様では、オリゴヌクレオチド配列は、アレイにおいて検出又は定量化される。
【0208】
一態様では、ハイブリダイゼーション複合体、例えば、アンチセンス複合体又はセンス複合体の存在は、標識からの発光を監視することによって検出され、蛍光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（fluorescence polarization、ＦＰ）、発光、化学発光、生物発光、リン光、光散乱、又は電極誘導発光を含むが、これらに限定されない。別の態様では、標識は、酵素、又は光散乱、吸光度、蛍光などの測定可能なシグナルをもたらす化学活性を有する他の化学反応性種を含む。酵素標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、標識は、ビオチン、フルオレセイン、又はジゴキシゲニンを含むがこれらに限定されない、検出可能なハプテンである。一態様では、標識は、ビオチンを含む。
【0209】
一態様では、ハイブリダイゼーション複合体、例えば、アンチセンス複合体又はセンス複合体は、支持体表面に位置する１つ以上の結合ドメインに固定化される。一態様では、１つ以上の結合ドメインは、１つ以上の電極に位置し、検出又は定量化することは、電圧波形を１つ以上の電極に印加して、捕捉された反応産物で標識を刺激し、電気化学的シグナル又は発光シグナルを生成することを含む。一態様では、検出又は定量化することは、ＥＣＬシグナルを測定すること、及びシグナルを試料中のセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在又は量と相関させることを含む。一態様では、放射光の強度は、試料中のセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの量に比例し、その結果、放射光は、試料中のセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの量の定量的決定を提供することができる。
【0210】
一態様では、支持体表面は、ハイブリダイゼーション複合体がそこに固定化された後に検出混合物と接触する。一態様では、支持体表面は、センス複合体又はアンチセンス複合体がそこに固定化された後に、検出混合物と接触する。一態様では、支持体表面は、任意の非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハングを一本鎖ヌクレアーゼで消化した後に、検出混合物と接触する。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハングの消化は、ハイブリダイゼーション複合体が溶液中にある間に（すなわち、それらハイブリダイゼーション複合体がセンスプローブ又はアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面に固定化される前に）行われる。一態様では、非生産的ハイブリダイゼーション複合体における一本鎖オーバーハングの消化は、ハイブリダイゼーション複合体がセンスプローブ又はアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグを介して支持体表面に固定化された後に行われる。一態様では、検出混合物は、ＥＣＬ標識を含む。ＥＣＬ標識の例には、ｉ）金属が、例えば、トリス－ビピリジル－ルテニウム（tris-bipyridyl-ruthenium、ＲｕＢｐｙ）部分などのＲｕ含有有機金属化合物及びＯｓ含有有機金属化合物を含む第ＶＩＩＩ族の貴金属からのものである有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及び関連化合物が含まれる。一態様では、検出混合物はまた、１つ以上の電気化学発光共反応物、及びｐＨ緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、消泡剤、塩、金属イオン、又は金属キレート剤などの１つ以上の追加の成分を含む。「電気化学発光共反応物」という用語は、電気化学発光標識に関与する種を指し、トリプロピルアミン（tripropylamine、ＴＰＡ）などの三級アミン、シュウ酸イオン、ＲｕＢｐｙではアスコルビン酸及びペルスルファート、ルミノールでは過酸化水素を含むが、これらに限定されない。電気化学発光を測定する方法は既知であり、測定を行うための機器が市販されている。例えば、電気化学発光を使用する分析物の多重測定は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）、及びＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒライン又は製品において使用される（例えば、米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0211】
一態様では、ビオチンは、ハイブリダイゼーション複合体に共有結合され、検出混合物は、アビジン部分を介して固定化したハイブリダイゼーション複合体に結合するストレプトアビジンコンジュゲート化標識を含む。一態様では、ストレプトアビジンコンジュゲート化標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識である。一態様では、電気化学発光標識は、Ｓｕｌｆｏ－ＴＡＧ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）などのｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【0212】
Ｋ．キット
一態様では、本明細書に記載の方法を実行するためのキットが提供される。「キット」とは、例えば、組成物を作成するため、デバイスを製造するため、又は方法を実行するために一緒に使用されるように提供又は集められる構成要素のセットを指す。キットは、１つ以上の構成要素を含むことができる。キットの構成要素は、１つのパッケージ又は複数のパッケージで提供され得、それらの各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。キットの列挙された構成要素はまた、単一の物理的パーツとして、又はキット使用のために組み合わされる複数のパーツとして提供され得る。例えば、キットの器具構成要素は、完全に組み立てられて提供され得、又は使用前に組み立てられる複数の器具パーツとして提供され得る。同様に、キットの液体試薬構成要素は、容器中の完全な液体製剤として、完全な液体製剤を提供するために組み合わされる１つ以上の乾燥試薬及び１つ以上の液体希釈剤として、又は完全な液体製剤を提供するために組み合わされる２つ以上の液体溶液として提供され得る。当技術分野において既知であるように、アッセイのためのキット構成要素は、異なる保存必要性、例えば、４℃対－７０℃の保存温度を有するために、しばしば別々に輸送及び保存される。
一態様では、本明細書に記載の方法を実行するためのキットが提供される。「キット」とは、例えば、組成物を作成するため、デバイスを製造するため、又は方法を実行するために一緒に使用されるように提供又は集められる構成要素のセットを指す。キットは、１つ以上の構成要素を含むことができる。キットの構成要素は、１つのパッケージ又は複数のパッケージで提供され得、それらの各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。キットの列挙された構成要素はまた、単一の物理的パーツとして、又はキット使用のために組み合わされる複数のパーツとして提供され得る。例えば、キットの器具構成要素は、完全に組み立てられて提供され得、又は使用前に組み立てられる複数の器具パーツとして提供され得る。同様に、キットの液体試薬構成要素は、容器中の完全な液体製剤として、完全な液体製剤を提供するために組み合わされる１つ以上の乾燥試薬及び１つ以上の液体希釈剤として、又は完全な液体製剤を提供するために組み合わされる２つ以上の液体溶液として提供され得る。当技術分野において既知であるように、アッセイのためのキット構成要素は、異なる保存必要性、例えば、４℃対－７０℃の保存温度を有するために、しばしば別々に輸送及び保存される。
【0213】
一態様では、キットは、支持体表面を含む。一態様では、キットは、支持体表面に固定化することができる捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、アレイにおける支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、アレイ内の既知の位置を有する１つ以上の別個の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、ビーズアレイに固定化された２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
【0214】
一態様では、キットは、炭素系支持体表面を含む。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの電極を含む。一態様では、電極は、炭素系電極である。一態様では、支持体表面は、１つ以上のカーボンインク電極を含む。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの作用電極及び少なくとも１つの対電極を含む。
【0215】
一態様では、キットは、マルチウェルアッセイプレートを含む支持体表面を含む。一態様では、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、１つ以上の電極を含む。一態様では、支持体表面は、マルチウェルプレートを含み、１つ以上のウェルは、１つ以上の作用電極及び１つ以上の対電極を含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上の参照電極を含む。
【0216】
一態様では、キットは、当技術分野で既知である標準フォーマットのマルチウェルプレートを含み、２４、９６、及び３８４ウェルプレートを含むことができるが、これらに限定されない。一態様では、キットは、１つ以上の９６ウェルプレートを含む。一態様では、キットは、１つのマルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１０個のマルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１０～１００個のマルチウェルプレートを含む。
【0217】
一態様では、キットは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上のアレイがプリントされる１つ以上の電極を有する支持体表面を含む。一態様では、キットは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上のアレイがプリントされている１つ以上のマルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１つ以上のマルチウェルプレートと、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む１つ以上のバイアルとを含み、捕捉オリゴヌクレオチドは、マルチウェルプレートにプリントすることができる。
【0218】
一態様では、キットは、支持体表面で１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、マルチウェルプレートのウェル内の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、電極で１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、マルチウェルプレートの１つ以上のウェル内の電極で１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
【0219】
別の態様では、キットは、１つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、キットは、容器中に提供される１つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含み、容器中のオリゴヌクレオチドタグは同じ配列を有し、各容器は、他の容器中のオリゴヌクレオチドタグの配列とは異なる（及び相補的でない）配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含有する。一態様では、キットは、別個の容器中に、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５、かつ最大約６４個の固有のオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、キットは、最大１０個の固有のオリゴヌクレオチドタグのセットを含む。
【0220】
一態様では、キットは、最大１０個の捕捉オリゴヌクレオチドがマルチウェルプレートのウェル内の１つ以上の結合ドメインに固定化される１つ以上のマルチウェルプレートを含み、各結合ドメインは、ウェル内の他の結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドの配列とは異なる配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、又は約２５個の固有の結合ドメインに固定化された、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、又は約２５個の別個の捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体表面を含む。一態様では、キットは、１つ以上のウェル中の少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、又は約２５個の固有の結合ドメインに固定化された少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、又は約２５個の別個の捕捉オリゴヌクレオチドを有するマルチウェルプレートを含む。一態様では、キットは、各ウェルがアレイに固定化された最大約１０個の捕捉オリゴヌクレオチドを含む、１つ以上のマルチウェルプレートを含む。一態様では、マルチウェルプレートは、マルチウェルプレートの各ウェル内に約１～約１０の検出アッセイから生じるように構成することができる。
【0221】
一態様では、キットは、一本鎖ヌクレアーゼを含む。一態様では、キットは、容器中に提供された一本鎖ヌクレアーゼタグを含む。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＤＮａｓｅは、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、又はマングビーンヌクレアーゼである。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＲＮａｓｅを含む。一態様では、一本鎖特異的ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅＯＮＥ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、又はエキソリボヌクレアーゼＩＩである。
【0222】
一態様では、試料中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列を検出又は定量化する発光アッセイ、例えば電気化学発光アッセイを行うためのキットが提供される。一態様では、キットは、電気化学発光アッセイを実行するのに有用な１つ以上のアッセイ構成要素を含む。
【0223】
一態様では、キットは、オリゴヌクレオチドタグと、それらの対応する相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションのための適切な条件（例えば、ストリンジェントな条件）を提供するために使用することができるハイブリダイゼーション緩衝液を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、希釈剤５４（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ハイブリダイゼーション緩衝液１又はハイブリダイゼーション緩衝液２（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。
【0224】
一態様では、キットは、標識を含む１つ以上の容器を含む。一態様では、標識は、放射性、蛍光、化学発光、電気化学発光、光吸収、光散乱、電気化学、磁気、及び酵素の標識から選択される。一態様では、標識は、電気化学発光標識を含む。一態様では、標識は、遷移金属を含む有機金属錯体を含む。一態様では、遷移金属は、ルテニウムを含む。一態様では、標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。
【0225】
一態様では、標識は、二次結合試薬の結合パートナーである一次結合試薬を含む。一態様では、二次結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体を含む。一態様では、二次結合試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、又は抗体を含む。一態様では、標識は、ビオチン、フルオレセイン、及びジゴキシゲニンから選択されるハプテンを含む。一態様では、標識は、第１のオリゴヌクレオチド配列を含む一次結合剤であり、二次結合試薬は、一次結合剤の第１のオリゴヌクレオチド配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0226】
一態様では、キットは、電気化学発光標識を含む１つ以上の容器を含む。より特定の態様では、キットは、トリス－ビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）などのＲｕ含有有機金属化合物又はＯｓ含有有機金属化合物を含有する１つ以上の容器を含む。一態様では、標識は、遷移金属を含む有機金属錯体を含む。一態様では、遷移金属は、ルテニウムを含む。一態様では、標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。別の態様では、キットは、ルミノール又は他の関連化合物を含有する１つ以上の容器を含む。
【0227】
一態様では、キットは、１つ以上の電気化学発光共反応物を有する１つ以上の容器を含む。一態様では、１つ以上の電気化学発光共反応物が、支持体表面に共有結合によって又は非共有結合によって固定化される。一態様では、１つ以上の電気化学発光共反応物は、支持体表面の１つ以上の作用電極に固定化される。
【0228】
一態様では、キットに含まれる標識は、一次結合試薬及び二次結合試薬を含む。一態様では、二次結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体を含む。
【0229】
一態様では、キットは、以下のアッセイ構成要素：１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチド、及び１つ以上の緩衝液、例えば、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、結合緩衝液、又は読み取り緩衝液、のうちの１つ以上を含む。
【0230】
一態様では、キットは、標識などの１つ以上のアッセイ構成要素を含む。一態様では、標識は、電気化学発光標識などの発光標識である。一態様では、キットは、少なくとも１つの電気化学発光共反応物質を含む。一態様では、電気化学発光共反応物は、三級アミン、トリプロピルアミン、又はＮ－ブチルジエタノールアミンを含む。
【0231】
一態様では、キットは、１つ以上の他のアッセイ構成要素を含む。一態様では、キットは、希釈剤、ブロッキング剤、安定化剤、界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝剤、及び保存剤を含むがこれらに限定されない１つ以上のアッセイを含む。一態様では、キットは、１つ以上のかかる構成要素の容器を含む。別の態様では、１つ以上の試薬が、キットとともに提供されたアッセイ支持体表面に含まれる。
【0232】
Ｌ．参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用された全ての参考文献、及びそれらに引用された参考文献は、それらが既に引用されていない限り、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用された全ての参考文献、及びそれらに引用された参考文献は、それらが既に引用されていない限り、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0233】
実施例
実施例１．全長プローブを使用するＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（RNase Protection Assay、ＲＰＡ）検出下限（Lower Limit of Detection、ＬＬＯＤ）
モデル１６マーヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）のセンス（ＳＳ）鎖及びアンチセンス（ＡＳ）鎖の検出限界（１つのＤＮＡ鎖及び１つのＲＮＡ鎖、両方とも修飾されている）を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）を使用して反対鎖の非存在下で決定した。
実施例１．全長プローブを使用するＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（RNase Protection Assay、ＲＰＡ）検出下限（Lower Limit of Detection、ＬＬＯＤ）
モデル１６マーヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）のセンス（ＳＳ）鎖及びアンチセンス（ＡＳ）鎖の検出限界（１つのＤＮＡ鎖及び１つのＲＮＡ鎖、両方とも修飾されている）を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）を使用して反対鎖の非存在下で決定した。
【0234】
核酸ベースの治療用分子に相補的な配列を有するＲＮＡ鎖及び捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するＤＮＡ鎖を含むキメラ全長アンチセンスプローブを作製し、一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、全長（１６マー）アンチセンス結合部分、及びビオチン標識を含んだ。キメラ全長センスプローブを核酸ベースの治療用分子に相補的な配列を有するＲＮＡ鎖を含んで作製し、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するＤＮＡ鎖を作製して、一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、全長（１６マー）センス結合部分、及びビオチン標識を含んだ。
【0235】
簡単に説明すると、個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖（１０ｍｇ／ｍＬ）を２００μｇ／ｍＬに希釈し、表１に示すように、ＡＳＯを希釈剤５４に４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度でスパイクし、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用することによって、個々のアンチセンス鎖又はセンス鎖について１０点較正曲線を生成した。
【0236】
【表1】
【0237】
２つの濃度の全長プローブを使用して、陽性シグナル及びバックグラウンドに対する影響を評価した：５０ｐＭ又は２００ｐＭ（４×）。キメラプローブを、表２に示すハイブリダイゼーションプロトコールを用いて、希釈剤５４（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中でアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0238】
【表2】
【0239】
一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド（キメラセンスプローブ及びアンチセンスプローブのオリゴヌクレオチドタグ配列に相補的な配列を有する）が固定化された９６ウェルＮ－ＰＬＥＸ（登録商標）プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（「ＭＳＤ」））を、Ｎ－ＰＬＥＸ（商標）ブロッキング緩衝液（ＭＳＤ）でブロッキングし、最小の１５０μＬ／ウェルのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＤＰＢＳ）で３×洗浄した。プローブをそれらの標的鎖にハイブリダイズさせた後、プローブ／分析物複合体を緩衝液で希釈し、プレートに添加し、振盪しながら３７℃で１時間ハイブリダイズさせた。２つの異なる緩衝液を使用して、プレートとのハイブリダイゼーションに対する影響を決定した：希釈剤５４、又はＮＰＬＥＸ（商標）ハイブリダイゼーション緩衝液１と２（ＭＳＤ）との２：３比のブレンド。
【0240】
プレートを再度洗浄し（最小の１５０μＬ／ウェルＤＰＢＳで３×）、希釈剤５４中のＲＮａｓｅカクテル（ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｉ、及びＲＮａｓｅ Ｔ１）をプレートに添加し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。
【0241】
プレートを再度洗浄し、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）ストレプトアビジン（ＭＳＤ）を希釈剤５４＋１％ブロッカＡ（ＭＳＤ）中でプレートに添加し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＭＳＤ ＧＯＬＤ（商標）読み取り緩衝液Ａ（ＭＳＤ）を添加し、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６０００又はＭＥＳＯ（登録商標）ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００ ｉｍａｇｅｒ（ＭＳＤ）を使用してプレートを読み取った。
【0242】
アンチセンス鎖及びプローブにおけるＥＣＬシグナルが表３に示され、センス鎖及びプローブについて表４に示される。アンチセンス（ＤＮＡ）鎖に対するプローブは、希釈剤５４及びハイブリダイゼーション緩衝液ブレンドにおいて、センス（ＲＮＡ）鎖に対するプローブよりも高いＥＣＬ読み取り値を有した。プローブの量を増加させると、およそ１０，０００ｐｇ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）のシグナル飽和で、陽性及び陰性のシグナルが増加した。
【0243】
図５Ａ及び図５Ｂは、アンチセンス（ＡＳ）鎖希釈剤５４プレートハイブリダイゼーション（図５Ａ）及び混合ハイブリダイゼーション緩衝液プレートハイブリダイゼーション（図５Ｂ）、並びにセンス（ＳＳ）希釈剤５４プレートハイブリダイゼーション（図６Ａ）及び混合ハイブリダイゼーション緩衝液プレートハイブリダイゼーション（図６Ｂ）におけるＥＣＬシグナル曲線を示す。
【0244】
表５及び表６は、それぞれ、アンチセンス（ＡＳ）プローブ及び鎖並びにセンス（ＳＳ）プローブ及び鎖における検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。
【0245】
結果は、アンチセンスプローブはセンスプローブよりも高いＥＣＬシグナル及び低いＬＬＯＤを有し、バックグラウンドはセンスプローブでより高い傾向があるが、両方のアッセイが良好な結果をもたらすことを実証する。希釈剤５４とハイブリダイゼーション緩衝液とのブレンドについての結果は類似していた。
【0246】
【表3】
【0247】
【表4】
【0248】
【表5】
【0249】
【表6】
【0250】
実施例２．短縮プローブのハイブリダイゼーション
実施例１からのモデル１６ヌクレオチドヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のセンス（ＳＳ）鎖及びアンチセンス（ＡＳ）鎖に、反対鎖の非存在下でハイブリダイズする短縮プローブ（１２マー、１１マー、及び１０マー）の能力を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）において評価した。プローブは、３’末端で短縮した。
実施例１からのモデル１６ヌクレオチドヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のセンス（ＳＳ）鎖及びアンチセンス（ＡＳ）鎖に、反対鎖の非存在下でハイブリダイズする短縮プローブ（１２マー、１１マー、及び１０マー）の能力を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）において評価した。プローブは、３’末端で短縮した。
【0251】
簡単に説明すると、１０点較正曲線（＋２つのブランクウェル）を、４倍連続希釈及び最高４０，０００ｐｇ／ｍＬのキャリブレータを用いてＡＳＯから個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖を使用して生成した。
【0252】
４つの異なるプローブ長を、上記の実施例１に記載の方法に従って検出のために評価した：２００ｐＭのプローブ濃度を使用する全長（Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ、ＦＬ）プローブ、１２マープローブ、１１マープローブ、及び１０マープローブ。プローブを希釈剤５４中でアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせ、希釈剤５４又はハイブリダイゼーション緩衝液１のいずれかでプレートにハイブリダイズさせた。較正曲線は、二連のウェルではなく、一連で希釈剤５４又はハイブリダイゼーション緩衝液１の間で分けた。
【0253】
一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、アンチセンス結合部分（全長１６マー（ＦＬ）、１２マー、１１マー、又は１０マー）、及びビオチン標識を含んだ４つのキメラアンチセンス（ＡＳ）プローブを生成した。
【0254】
一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、センス結合部分（全長１６マー（ＦＬ）、１２マー、１１マー、又は１０マー）、及びビオチン標識を含んだ４つのキメラセンス（ＳＳ）プローブを生成した。
【0255】
表７及び表８は、それぞれ希釈剤５４又はハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズしたアンチセンスプローブ及び鎖におけるＥＣＬシグナルを示す。表９及び表１０は、それぞれ、希釈剤５４又はハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズしたセンスプローブ及び鎖におけるＥＣＬシグナルを示す。表７～表１０からのデータが、図７Ａ～図７Ｂにグラフで示される。
【0256】
表１１は、希釈剤５４及びハイブリダイゼーション緩衝液中の１６マー（ＦＬ）プローブ及び１２マープローブにおけるアンチセンス（ＡＳ）プローブ及び鎖での検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。表１２及び表１３は、それぞれ希釈剤５４及びハイブリダイゼーション緩衝液中の１６マー（ＦＬ）プローブ、１２マープローブ、１１マープローブ、及び１０マープローブにおけるセンス（ＳＳ）プローブ及び鎖でのＬＬＯＤを示す。
【0257】
データは、ハイブリダイゼーション緩衝液を用いたハイブリダイゼーションが、希釈剤５４と比較して、アンチセンス（ＡＳ）鎖において１２マープローブでシグナルの損失を生じることを示す。アンチセンス鎖について、プローブを短縮することは、ＥＣＬシグナル及びＬＬＯＤｅｓｔに対して負の影響を有する。センス鎖について、プローブを短縮することは、ＥＣＬシグナル及びＬＬＯＤｅｓｔに対して最小の影響を有する。ハイブリダイゼーション緩衝液のタイプは、アッセイに影響を有しなかった。
【0258】
【表7】
【0259】
【表8】
【0260】
【表9】
【0261】
【表10】
【0262】
【表11】
【0263】
【表12】
【0264】
【表13】
【0265】
実施例３．アンチセンス鎖及びセンス鎖のヘテロ二本鎖検出
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出限界を、実施例２からの全長（１６マー）キメラプローブ又は１２マー短縮キメラプローブを使用して、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）について決定した。
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出限界を、実施例２からの全長（１６マー）キメラプローブ又は１２マー短縮キメラプローブを使用して、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）について決定した。
【0266】
１０点較正曲線を、個々のＡＳ鎖、ＳＳ鎖、又はヘテロ二本鎖を使用して、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。
【0267】
２つの異なるプローブ長を評価した：２００ｐＭの濃度で全長１６マー（ＦＬ）及び１２マー。
【0268】
基本的に実施例２に記載されるように、プローブを希釈剤５４中のアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせ、９６ウェルプレートに２連ウェルで希釈剤５４中で添加した。
【0269】
アンチセンス鎖検出及びセンス鎖検出におけるＥＣＬシグナルが、それぞれ表１４及び表１５に示される。表１４からのデータが図８Ａ～図８Ｂにグラフで示され、表１５からのデータが図９Ａ～図９Ｂにグラフで示される。
【0270】
表１６は、１６マー（ＦＬ）プローブ及び１２マープローブを使用する、単独での又はヘテロ二本鎖でのアンチセンス（ＡＳ）鎖における検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。表１７は、１６マー（ＦＬ）プローブ及び１２マープローブを使用する、単独での又はヘテロ二本鎖でのセンス（ＳＳ）鎖におけるＬＬＯＤを示す。
【0271】
結果は、１２マープローブが、アンチセンス鎖においてＥＣＬシグナルを減少させたが、センス鎖において減少させなかったことを示す。全長プローブは、個々の鎖からでも又はヘテロ二本鎖でも、両方の鎖について同様のＥＣＬシグナルを有した。１２マープローブは、ヘテロ二本鎖におけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方についてＥＣＬシグナルを減少させた。ヘテロ二本鎖は、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方について全長プローブを使用した場合、ＥＣＬシグナル又はＬＬＯＤｅｓｔに影響を与えなかった。１２マープローブは、ヘテロ二本鎖におけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方について、ＥＣＬシグナルを減少させ、ＬＬＯＤｅｓｔを増加させた。
【0272】
【表14】
【0273】
【表15】
【0274】
【表16】
【0275】
【表17】
【0276】
実施例４．全長（１６マー）プローブを使用した検出下限（ＬＬＯＤ）
実施例１からの個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖若しくはセンス（ＳＳ）鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、１６マー全長（ＦＬ）プローブを使用して、実施例１からのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）について決定した。
実施例１からの個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖若しくはセンス（ＳＳ）鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、１６マー全長（ＦＬ）プローブを使用して、実施例１からのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）について決定した。
【0277】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、個々のアンチセンス鎖、センス鎖、又はヘテロ二本鎖から、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。個々の鎖では、２ウェルを各キャリブレータ又は個々の鎖のために使用し、４ウェルをヘテロ二本鎖のための各キャリブレータのために、全ＬＬＯＤ決定のための２４個の個々のブランクウェルとともに使用した。２つのプローブ長を評価した：２００ｐＭの濃度で全長１６マー（ＦＬ）及び１２マー。プローブをアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖にハイブリダイズさせ、希釈剤５４中でプレートにハイブリダイズさせた。
【0278】
表１８に示されるように、ＥＣＬシグナルは、個々のアンチセンス鎖又はセンス鎖とヘテロ二本鎖との間で類似している。表１９に示される結果は、アンチセンス鎖におけるシングルプレックスアッセイのＬＬＯＤが、個々の鎖及びヘテロ二本鎖の両方について０．５ｐｇ／ｍＬ未満であり、センス鎖におけるシングルプレックスアッセイのＬＬＯＤが、個々の鎖及びヘテロ二本鎖についてそれぞれ２５ｐｇ／ｍＬ及び１４ｐｇ／ｍＬであったことを示す。Ｃａｌ－３における変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＣＶ）は全て１５％未満であり、アンチセンス鎖におけるＣＶはセンス鎖のものよりもはるかに低かった。
【0279】
【表18】
【0280】
【表19】
【0281】
実施例５．ヘテロ二本鎖の多重検出
この実験は、実施例１からのモデルヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖が、実施例１からのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）を多重フォーマットで使用して検出することができるかを決定するために設計された。
この実験は、実施例１からのモデルヘテロ二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖が、実施例１からのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）を多重フォーマットで使用して検出することができるかを決定するために設計された。
【0282】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖、センス（ＳＳ）鎖、又はヘテロ二本鎖から、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。プローブのみを有するウェルを含めて、プローブ－プローブ相互作用がアンチセンスプローブ及びセンスプローブで生じるか、並びにプローブ－プローブ相互作用が短縮した１２マープローブで排除され得るかを決定した。
【0283】
２つのプローブ長を評価した：濃度２００ｐＭで、全長１６マー（ＦＬ）及び１２マー（プローブ配列は実施例２に示される）。
【0284】
プローブをアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせ、９６ウェルプレートに２連ウェルで、希釈剤５４中でハイブリダイズさせた。
【0285】
１６マー（ＦＬ）プローブ及び１２マープローブを使用するアンチセンス鎖検出におけるＥＣＬシグナルが、それぞれ表２０及び表２１に示される。１６マー（ＦＬ）及び１２マープローブを使用するセンス鎖検出におけるＥＣＬシグナルが、それぞれ表２２及び表２３に示される。ＥＣＬデータが、図１０Ａ及び図１０Ｂにグラフで示される。表２４は、単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖について、１２マープローブを使用する多重検出での検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。
【0286】
結果は、全長プローブが多重アッセイで使用された場合、アンチセンスプローブ及びセンスプローブが交差反応し、非常に上昇したバックグラウンドシグナルを引き起こしたことを示す。高濃度で、アンチセンス鎖（個々又はヘテロ二本鎖）では相加効果が存在するが、一方、アンチセンススポットシグナルでセンス鎖との逆相関が存在し、逆もまた同様である（プローブに対する標的結合によるプローブ－プローブ相互作用の喪失に起因する可能性が高い）。
【0287】
シングルプレックス（実施例２）又はマルチプレックス（本実施例）における１２マープローブの使用は、同様のＥＣＬレベルをもたらし、プローブを多重化することの有害な影響は示さなかった。
【0288】
【表20】
【0289】
【表21】
【0290】
【表22】
【0291】
【表23】
【0292】
【表24】
【0293】
実施例６．ヘテロ二本鎖の検出に対するハイブリダイゼーション時間の効果
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出限界に対する短縮したハイブリダイゼーション時間の効果を決定した。
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出限界に対する短縮したハイブリダイゼーション時間の効果を決定した。
【0294】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。２つのプローブ長を評価した：２００ｐＭの濃度で全長１６マー（ＦＬ）及び１２マー。プローブは、「長いハイブリダイゼーション」プロトコール（表２５）及び「短いハイブリダイゼーション」プロトコール（表２６）を使用して、希釈剤５４中でアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。プローブは、９６ウェルプレートの二連ウェルにおいて希釈剤５４中でハイブリダイズさせた。
【0295】
全長（ＦＬ）プローブは、ヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の両方の検出において、１２マープローブよりも良好なシグナルを有した。結果が図１１Ａ及び図１１Ｂにグラフに示される。ハイブリダイゼーション時間の変化は、ＥＣＬシグナル生成に大きな影響を有しなかった。
【0296】
ヘテロ二本鎖のＡＳＯ鎖又はＳＯ鎖における検出感度は、プローブをその対応する鎖にハイブリダイズするための時間量を減少させることによって影響を受けない。アッセイ時間を短縮するために、短縮したハイブリダイゼーション条件下でプローブ／鎖ハイブリダイゼーションを行うことが推奨される。
【0297】
【表25】
【0298】
【表26】
【0299】
実施例７．血漿中のアンチセンス鎖及びセンス鎖の検出
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖における検出限界を、マウス血漿中にスパイクして決定した。
実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖における検出限界を、マウス血漿中にスパイクして決定した。
【0300】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、個々のアンチセンス鎖、センス鎖、又はヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。マウス血漿及び希釈剤の較正曲線の両方を、ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）ＲＮａｓｅ不活性化試薬を用いて、６０℃で１０分間前処理し、４℃で保持した。
【0301】
ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）試薬を希釈剤５４に１：１比（２０μＬのキャリブレータ又はブランク：２０μＬのＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）試薬）で添加した。全長１６マー（ＦＬ）プローブを、最終濃度２００ｐＭで使用した。５×プローブを、５０μＬの総体積のために希釈剤５４で調製した１０μＬ体積で添加した。プローブを、表２６に示される短縮したハイブリダイゼーションプロトコールを使用して、２連ウェルで希釈剤５４中又は血漿中のアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0302】
データ（示さず）は、アンチセンス鎖検出から生成されたＥＣＬシグナルが、マトリックスとして血漿を用いて、個々の鎖又はヘテロ二本鎖の一部分のいずれかで、大きく変化しないことを示している。図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、ＥＣＬシグナルは、個々のセンス鎖（ＲＮＡ）をマウス血漿に添加した場合に失われ、ヘテロ二本鎖のセンス鎖をマウス血漿に添加した場合に減少した。これは、ｓｓＲＮＡを分解する血漿中の内因性ＲＮａｓｅに起因する可能性が高い。表２７は、希釈剤５４中又は血漿中のアンチセンス鎖についての検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。表２８は、希釈剤５４中又は血漿中のセンス鎖についての検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。
【0303】
結果は、アンチセンス鎖（ＤＮＡ）を高感度で検出する能力が、血漿中で測定した場合に変化しなかったことを実証する。アンチセンス（ＤＮＡ）鎖については、ヘテロ二本鎖の個々の鎖及びアンチセンス鎖の両方が、希釈剤中及び血漿中で同様のＬＬＯＤｅｓｔを有する。しかし、センス鎖（ＲＮＡ）を検出する能力は、血漿中で測定した場合に変化した：個々のセンス鎖は検出不能であり、ヘテロ二本鎖のセンス鎖は検出可能であったが、感度が低下し、ダイナミックレンジが低下していた。
【0304】
【表27】
【0305】
【表28】
【0306】
実施例８．マウス血漿中のアンチセンス鎖及びセンス鎖のシングルプレックス検出
実施例１からのアンチセンス鎖及びセンス鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、マウス血漿中で全長（１６マー）プローブを使用し、基本的に実施例１に記載のＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）（以下に提供される変更を伴う）を使用して決定した。
実施例１からのアンチセンス鎖及びセンス鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、マウス血漿中で全長（１６マー）プローブを使用し、基本的に実施例１に記載のＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）（以下に提供される変更を伴う）を使用して決定した。
【0307】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、マウス血漿で４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。全検出下限（ＬＬＯＤ）決定のために、４ウェルを各キャリブレータについて、２４個のブランクウェルとともに使用した。キャリブレータ試料及びブランクを、実施例７に記載のようにＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）で前処理した。
【0308】
プローブをアンチセンス鎖又はセンス鎖に、実施例６に記載の短縮したハイブリダイゼーションプロトコールを用いてハイブリダイズさせたが、変性温度は血漿を９５℃まで加熱すると粘性がありすぎてピペッティングが容易ではないため、８０℃に低下させる１つの変更を加えた。改訂したプロトコールが、表２９に示される。
【0309】
【表29】
【0310】
結果（示さず）は、ＥＣＬシグナルが実施例７の血漿実験と一致することを示す。アンチセンス鎖（ＤＮＡ）おけるトップオブカーブ（top of curve、ＴＯＣ）シグナルは、センス鎖（ＲＮＡ）と比較してかなり高い。ヘテロ二本鎖のアンチセンス鎖（ＤＮＡ）におけるＬＬＯＤは、約１ｐｇ／ｍＬであり、センス（ＲＮＡ）鎖におけるＬＬＯＤは、シングルプレックスアッセイにおいて約３１ｐｇ／ｍＬだった。Ｃａｌ－３及びブランクでのＣＶは、全て１０％未満であり、低いシグナル変動性を示した。
【0311】
実施例９．バックグラウンドに対するブロッカＳ１の影響
ブロッカＳ１をＮ－ＰＬＥＸ（商標）ブロッキング緩衝液に添加する効果を、アンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）シングルプレックスアッセイに関連するバックグラウンドに対する影響について評価した。
ブロッカＳ１をＮ－ＰＬＥＸ（商標）ブロッキング緩衝液に添加する効果を、アンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）シングルプレックスアッセイに関連するバックグラウンドに対する影響について評価した。
【0312】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖から、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。全長（１６マー）プローブを、基本的に実施例８に記載のシンプレックスアンチセンス及びセンスアッセイのための方法に従って、２００ｐＭの濃度で使用した。ブロッカＳ１（ＭＳＤ）をＮ－ＰＬＥＸ（商標）ブロッカ（ＭＳＤ）に添加した。プローブを、希釈剤５４（ＭＳＤ）を用いてセンス鎖又はアンチセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0313】
結果は、Ｎ－ＰＬＥＸ（商標）ブロッカ中にブロッカＳ１を含めることが、シングルプレックスにおけるＡＳ鎖又はＳＳ鎖のいずれについても陽性又はバックグラウンドのシグナル生成に影響を有しなかったことを示す。
【0314】
実施例１０．バックグラウンドに対する二重ＲＮａｓｅ消化の影響
２つのＲＮａｓｅ消化ステップを行う効果を、実施例１に記載のアンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）シングルプレックスアッセイに関連するバックグラウンドに対する影響について評価した。
２つのＲＮａｓｅ消化ステップを行う効果を、実施例１に記載のアンチセンス（ＡＳ）及びセンス（ＳＳ）シングルプレックスアッセイに関連するバックグラウンドに対する影響について評価した。
【0315】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖から、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。全長（１６マー）プローブを、基本的に実施例８に記載のシンプレックスアンチセンス及びセンスアッセイのための方法に従って、２００ｐＭの濃度で使用した。ＲＮａｓｅ消化ステップを、１回又は２回行った。ＲＮａｓｅ消化ステップを１回行ったウェルを、第２のＲＮａｓｅ消化ステップ中に希釈剤５４とともにインキュベートした。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0316】
データ（示さず）は、追加のＲＮａｓｅ消化ステップを加えることが、陽性若しくはバックグラウンドのＥＣＬシグナル又はＬＬＯＤｅｓｔ測定にほとんど影響を有しなかったことを示す。
【0317】
実施例１１．脳溶解物におけるアンチセンス鎖及びセンス鎖の検出
実施例１からのアンチセンス鎖及びセンス鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、脳溶解物中で全長（１６マー）プローブを使用し、基本的に実施例８に記載のＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）（以下に提供される変更を伴う）を使用して決定した。
実施例１からのアンチセンス鎖及びセンス鎖又は完全モデルヘテロ二本鎖ＡＳＯにおける検出限界を、脳溶解物中で全長（１６マー）プローブを使用し、基本的に実施例８に記載のＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）（以下に提供される変更を伴う）を使用して決定した。
【0318】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、希釈した脳溶解物にスパイクしたアンチセンス鎖、センス鎖、及びヘテロ二本鎖を使用して、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。全長１６マー（ＦＬ）プローブを、２００ｐＭの濃度で使用した。
【0319】
実施例８に記載のプロトコールに従って、プローブをアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。脳（ＢｉｏＩＶＴ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）をホモジナイズし、希釈剤５４に溶解した。ホモジネートを遠心分離し、溶解物を収集し、希釈剤５４で１：４に希釈した。
【0320】
データ（示さず）は、ＡＳ鎖（個々の又はヘテロ二本鎖の一部分として）からのＥＣＬシグナル生成が、希釈剤５４又は１：４希釈した脳溶解物の間で非常に類似していることを示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、ＥＣＬシグナルは、希釈剤５４と比較して、脳溶解物中のセンス（ＳＳ）鎖（個々の又はヘテロ二本鎖の一部分として）からは、はるかに低かった。血漿中の結果を示す実施例８の結果とは対照的に、個々のセンス（ＳＳ）鎖は、脳溶解物中のヘテロ二本鎖のセンス（ＳＳ）鎖よりも高いＥＣＬシグナルを生成する。これは、脳細胞の溶解時のＲＮａｓｅ Ｈの放出に起因し得る。
【0321】
希釈剤５４中又は脳溶解物中の単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖のＬＬＯＤが、表３０及び表３１に示される。これらの結果は、アンチセンス（ＤＮＡ）鎖が、希釈した脳溶解物において容易に測定できることを示す。
【0322】
【表30】
【0323】
【表31】
【0324】
実施例１２．プローブへのＬＮＡの付加
１２マーＲＮａｓｅ保護プローブにロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことの影響を、実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス鎖又はセンス鎖の検出に対する影響について評価し、シングルプレックスアッセイで決定した。この方法は、基本的に実施例８に記載されるように行った。
１２マーＲＮａｓｅ保護プローブにロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことの影響を、実施例１からのモデルＡＳＯのアンチセンス鎖又はセンス鎖の検出に対する影響について評価し、シングルプレックスアッセイで決定した。この方法は、基本的に実施例８に記載されるように行った。
【0325】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、スパイクしたアンチセンス鎖、センス鎖、及びヘテロ二本鎖を使用して、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。ＬＮＡを有する全長１６マー（ＦＬ）又は１２マープローブを、２００ｐＭの濃度で使用した。プローブを、希釈剤５４を用いてモデルＡＳＯのアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0326】
図１４Ａ及び図１４Ｂは、単独における又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス（ＡＳ）を検出するための１６マー（ＦＬ）又は１２マーＲＮａｓｅプローブでのＬＮＡの影響を示す。表３２は、単独における又はヘテロ二本鎖におけるセンス（ＳＳ）鎖を検出するための１６ｍｅｒ（ＦＬ）又は１２ｍｅｒ ＲＮａｓｅプローブでのＬＮＡの影響を示す。表３３は、ＦＬ又は１２マーアンチセンスプローブでのＬＬＯＤを、ＬＮＡのあり及びなしで示す。表３４は、ＦＬ又は１２マーセンスプローブでのＬＬＯＤを、ＬＮＡのあり及びなしで示す。
【0327】
結果は、全長１６マー（ＦＬ）プローブが、ＡＳシングルプレックスアッセイ及びＳＳシングルプレックスアッセイの両方について、より高い陽性シグナル及びより低いバックグラウンドシグナルを生成したことを示す。ＬＮＡプローブを用いて観察されたより高いバックグラウンドは、ヌクレアーゼ分解に対するＬＮＡオリゴの耐性に起因する可能性が高い。プローブにおける分解の標的はＲＮＡ残基であるが、ＬＮＡはＲＮａｓｅからオリゴ全体を保護するのに役立った。
【0328】
【表32】
【0329】
【表33】
【0330】
【表34】
【0331】
実施例１３．ＬＮＡプローブの濃度試験
シングルプレックスＡＳ及びＳＳアッセイのバックグラウンドレベル及び感度に対する低下した濃度のＬＮＡプローブの影響を、実施例１からのモデルＡＳＯについて評価した。
シングルプレックスＡＳ及びＳＳアッセイのバックグラウンドレベル及び感度に対する低下した濃度のＬＮＡプローブの影響を、実施例１からのモデルＡＳＯについて評価した。
【0332】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。ＡＳアッセイ及びＳＳアッセイをシングルプレックスで行い、ＬＮＡを有する１２マープローブを４濃度：２００ｐＭ（０．２ｎＭ）、１００ｐＭ（０．１ｎＭ）、５０ｐＭ（０．０５ｎＭ）、及び２０ｐＭ（０．０２ｎＭ）で、ＡＳアッセイ及びＳＳアッセイの両方に使用した。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス鎖（ＳＳ）にハイブリダイズさせた。
【0333】
図１５Ａ及び図１５Ｂは、ヘテロ二本鎖のＡＳ鎖又はＳＳ鎖のいずれかに対するＬＮＡプローブの濃度を減少させると、陽性及びバックグラウンドのＥＣＬシグナルの両方が、それぞれ０．０２ｍＭ及び０．１ｎＭのプローブ濃度で減少し、改善された陽性及びバックグラウンドのシグナルを提供することを示す。
【0334】
表３５及び表３６は、それぞれヘテロ二本鎖におけるアンチセンス鎖又はセンス鎖を検出するための様々なＬＮＡプローブ濃度におけるＬＬＯＤを示す。
【0335】
【表35】
【0336】
【表36】
【0337】
実施例１４．アンチセンス鎖及びセンス鎖の多重検出におけるＬＮＡプローブ
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖のＡＳ鎖及びＳＳ鎖の多重検出を、ＬＮＡプローブを使用して評価した。
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖のＡＳ鎖及びＳＳ鎖の多重検出を、ＬＮＡプローブを使用して評価した。
【0338】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖、センス（ＳＳ）鎖、又はヘテロ二本鎖を使用して、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。このアッセイは、プローブ－プローブ相互作用がアンチセンスプローブとセンスプローブとの間で生じたかを決定するために、プローブのみを有するウェルを含んだ。
【0339】
２つの異なるプローブタイプを評価した：非修飾１２マープローブ又はＬＮＡ１２マープローブ。非修飾１２マープローブについて２００ｐＭのプローブ濃度。１２マーＡＳプローブは２０ｐＭの濃度で使用し、１２マーＳＳプローブはＡＳのために１００ｐＭの濃度で使用した。ＳＳ ＬＮＡプローブも１００ｐＭの濃度で使用した。ＬＮＡプローブの濃度は、より高いバックグラウンドを考慮して変化させた。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0340】
図１６Ａ及び図１６Ｂは、非修飾１２マープローブ又はＬＮＡ１２マープローブのいずれからもオフターゲットシグナルが存在しなかったことを示し、プローブ－プローブ相互作用がいずれの場合にも生じなかったが、ＬＮＡプローブは、ＡＳ鎖について非修飾１２マープローブよりも低い陽性ＥＣＬシグナル及び同様のバックグラウンドをもたらしたことを示す。
【0341】
図１７Ａ及び図１７Ｂは、非修飾１２マープローブ又はＬＮＡ１２マープローブのいずれからもオフターゲットシグナルが存在しなかったことを示し、プローブ－プローブ相互作用がＳＳプローブのいずれの場合にも生じなかったことを示す。
【0342】
表３７は、非修飾１２マープローブ及びＬＮＡ修飾１２マープローブを用いた、個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖又はヘテロ二本鎖におけるアンチセンス鎖の多重検出についてＬＬＯＤを示す。表３８は、非修飾１２マープローブ及びＬＮＡ修飾１２マープローブを用いた、個々のセンス（ＳＳ）鎖又はヘテロ二本鎖におけるセンス鎖の多重検出についてＬＬＯＤを示す。
【0343】
ＬＮＡプローブは、個々の鎖として、又はヘテロ二本鎖の一部分として、ＡＳ鎖及びＳＳ鎖の両方を検出することができた。シングルプレックスアッセイにおいて、全長プローブを超えて１２マーＬＮＡプローブを使用する利点はなかった。ＬＮＡプローブは、両方のアッセイについてより高いバックグラウンドを有し、バックグラウンドを許容可能なレベルにするために希釈しなければならない。特異的シグナルも犠牲にされる。非修飾１２マープローブは、ＡＳ鎖及びＳＳ鎖の多重検出において１２マーＬＮＡプローブより優れていた。
【0344】
【表37】
【0345】
【表38】
【0346】
実施例１５．１３マープローブ及び１４マープローブを使用するアンチセンス鎖及びセンス鎖のシングルプレックス検出
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖の個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出を、実施例８に記載される方法に従って、１３マープローブ及び１４マープローブを使用して評価した。
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖の個々のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出を、実施例８に記載される方法に従って、１３マープローブ及び１４マープローブを使用して評価した。
【0347】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。４つの異なるプローブタイプを評価した：２００ｐＭの濃度で、非修飾全長（ＦＬ）プローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブ。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0348】
図１８Ａ及び図１８Ｂは、１４マープローブにおけるＥＣＬシグナルがアンチセンス鎖及びセンス鎖検出におけるＦＬプローブと同様であったが、１３マープローブではわずかなシグナル損失が観察されたことを示す。より顕著な損失が、ＦＬプローブと比較して、１２マープローブで観察された。バックグラウンドは、１２マープローブ及び１３マープローブで増加した。
【0349】
表３９及び表４０は、全長（ＦＬ）プローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、又は１２マープローブを用いたアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖の検出におけるＬＬＯＤを示す。
【0350】
【表39】
【0351】
【表40】
【0352】
実施例１６．１３マープローブ及び１４マープローブを使用するアンチセンス鎖及びセンス鎖のヘテロ二本鎖検出
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出を、基本的に実施例８に記載の１３マープローブ及び１４マープローブを使用して評価した。
実施例１からのモデルヘテロ二本鎖のアンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖の検出を、基本的に実施例８に記載の１３マープローブ及び１４マープローブを使用して評価した。
【0353】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。４つの異なるプローブタイプを評価した：２００ｐＭの濃度で、非修飾全長（ＦＬ）プローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブ。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0354】
図１９Ａ及び図１９Ｂに示されるように、ＥＬ及び１４マープローブは、ヘテロ二本鎖のＡＳ鎖を測定する場合に同様のシグナルをもたらした。ヘテロ二本鎖のＡＳ鎖を測定する場合、１３マープローブはシグナルの顕著な損失を示し、１２マープローブは十分なシグナルを生成することができなかった。バックグラウンドは、１３マープローブで増加した。ＳＳプローブ及び鎖検出では、１４マープローブ及び１３マープローブはＦＬプローブに同様だったが、一方、１２マープローブではいくらかのシグナル損失があった。バックグラウンドは、１２マープローブで増加した。
【0355】
表４１及び表４２は、全長（ＦＬ）プローブ、１４マープローブ、１３マープローブ、又は１２マープローブを用いたアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖のヘテロ二本鎖検出におけるＬＬＯＤを示す。
【0356】
【表41】
【0357】
【表42】
【0358】
実施例１７．１３マープローブ及び１４マープローブを使用するアンチセンス鎖及びセンス鎖の多重検出
この実験は、１３マープローブ又は１４マープローブが、アンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖又は実施例１からのモデルヘテロ二本鎖の多重検出を可能にするかを決定するために設計された。
この実験は、１３マープローブ又は１４マープローブが、アンチセンス（ＡＳ）鎖及びセンス（ＳＳ）鎖又は実施例１からのモデルヘテロ二本鎖の多重検出を可能にするかを決定するために設計された。
【0359】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。プローブのみのウェルを、プローブ－プローブ相互作用を評価するために含めた。
【0360】
２つの異なるプローブタイプを評価した：２００ｐＭの濃度で、１４マープローブ及び１３マープローブ。プローブを希釈剤５４中でアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0361】
表４３及び表４４に示されるように、１４マープローブは、個々のＡＳ鎖及びヘテロ二本鎖のＡＳ鎖の両方の検出を可能にしたが、１４マープローブは、個々の鎖と比較してヘテロ二本鎖を測定する場合にシグナルにわずかな減少を示した。また、１３マープローブは、個々のＡＳ鎖及びヘテロ二本鎖のＡＳ鎖の検出を可能にしたが、シグナル低下が観察された。重要なことに、１４マープローブ及び１３マープローブの両方が、ヘテロ二本鎖のＡＳ鎖の多重検出で適合しており、プローブ－プローブ相互作用を引き起こさなかった。
【0362】
表４５及び表４６に示されるように、１４マープローブ及び１３マープローブの両方が、ヘテロ二本鎖のＳＳ鎖の検出を可能にしたが、１４マープローブは、１３マープローブよりもわずかに高いシグナルをもたらした。重要なことに、１４マープローブ及び１３マープローブの両方が、ヘテロ二本鎖のＳＳ鎖の多重検出で適合しており、プローブ－プローブ相互作用を引き起こさなかった。
【0363】
表４７及び表４８は、１４マープローブ及び１３マープローブを用いた、単独での又はヘテロ二本鎖の一部分としてのアンチセンス（ＡＳ）鎖又はセンス（ＳＳ）鎖の検出におけるＬＬＯＤを示す。
【0364】
したがって、１４マープローブはアンチセンス鎖に最適なプローブであり、一方、１３マープローブ又は１４マープローブのいずれもセンス鎖の検出に使用することができる。
【0365】
【表43】
【0366】
【表44】
【0367】
【表45】
【0368】
【表46】
【0369】
【表47】
【0370】
【表48】
【0371】
実施例１８．多重検出のためのプローブクロスチェック
この実験は、ヘテロ二本鎖の両方の鎖の多重検出におけるＡＳプローブ及びＳＳプローブの異なる組み合わせを評価するために設計された。
この実験は、ヘテロ二本鎖の両方の鎖の多重検出におけるＡＳプローブ及びＳＳプローブの異なる組み合わせを評価するために設計された。
【0372】
簡単に説明すると、１０点較正曲線を、ヘテロ二本鎖を使用し、４０，０００ｐｇ／ｍＬの最高キャリブレータ濃度を用いて、４倍連続希釈（＋２つのブランクウェル）を使用して生成した。３つの異なるプローブタイプを評価した：２００ｐＭの濃度で、１４マープローブ、１３マープローブ、及び１２マープローブ。プローブを、希釈剤５４を用いてアンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズさせた。
【0373】
各プローブを以下のように他の２つのプローブとクロスさせた。
【0374】
・１４マーＡＳ対１４マーＳＳ
・１４マーＡＳ対１３マーＳＳ
・１４マーＡＳ対１２マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１４マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１３マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１２マーＳＳ
・１２マーＡＳ対１４マーＳＳ
・１２マーＡＳ対１３マーＳＳ
１２マーＡＳ対１２マーＳＳは評価しなかった。
・１４マーＡＳ対１３マーＳＳ
・１４マーＡＳ対１２マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１４マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１３マーＳＳ
・１３マーＡＳ対１２マーＳＳ
・１２マーＡＳ対１４マーＳＳ
・１２マーＡＳ対１３マーＳＳ
１２マーＡＳ対１２マーＳＳは評価しなかった。
【0375】
図２０Ａに示されるように、ＥＣＬシグナルは、ＳＳプローブの長さにかかわらず、所与のＡＳプローブ長に対して一貫していた。１４マーＡＳプローブは、１３マーＡＳプローブ及び１２マーＡＳプローブよりも少ないシグナル損失を示した。図２０Ｂに示されるように、ＳＳプローブの長さの変化は、ＡＳプローブ長の変化と比較して、ＥＣＬシグナルに対する劇的な影響が少なかった。ＳＳシグナルは、ＡＳプローブが減少するにつれて減少し、特に１２マーＡＳプローブで減少した。重要なことに、１４マーＳＳプローブ又は１３マーＳＳプローブのいずれかが、多重検出のために良好に機能した。
【0376】
表４９は、プローブ組み合わせについてＬＬＯＤ及びヒル傾き測定値を提供する。
これらのデータは、短縮したプローブを使用することによって、同じウェル中のヘテロ二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を高感度で測定することが可能であることを示す。
これらのデータは、短縮したプローブを使用することによって、同じウェル中のヘテロ二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を高感度で測定することが可能であることを示す。
【0377】
【表49】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【国際調査報告】