特表 2024-533367 皮膚障害を処置するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】皮膚障害を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/164 20060101AFI20240905BHJP

   A61K 31/19 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/225 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/66 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 31/343 20060101ALI20240905BHJP

   A61K 8/42 20060101ALN20240905BHJP

   A61K 8/49 20060101ALN20240905BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

A61K31/164

A61K31/19

A61K31/225

A61P17/02

A61P31/04

A61P43/00 121

A61K9/06

A61K31/66

A61K31/56

A61K45/00

A61K31/343

A61K8/42

A61K8/49

A61Q19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515367

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-05-01

(86)【国際出願番号】 US2022042753

(87)【国際公開番号】W WO2023038968

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/242,059

(32)【優先日】2021-09-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520477485

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・インディアナ・ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100163784

【弁理士】

【氏名又は名称】武田 健志

(72)【発明者】

【氏名】セーン，チャンダン・ケイ

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，サシュワティ

(72)【発明者】

【氏名】シンハ，ミトゥン

(72)【発明者】

【氏名】ゴーシュ，ナンディニ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C083

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA06

4C076BB31

4C076CC19

4C076FF70

4C083AC641

4C083AC642

4C083AC841

4C083AC842

4C083CC05

4C083EE13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA28

4C084MA63

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC202

4C084ZC751

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA05

4C086DA08

4C086DA34

4C086GA02

4C086HA30

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA28

4C086MA63

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZB35

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA01

4C206DB48

4C206GA03

4C206GA25

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA48

4C206MA83

4C206NA14

4C206ZA89

4C206ZB35

4C206ZC75

(57)【要約】

治療有効量の、細菌セラミダーゼ阻害剤および／またはセラミドを含む組成物を、影響を受けた組織に投与することによって、皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における皮膚状態を処置するための組成物および方法が開示される。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物リパーゼ活性の阻害剤、
セラミド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドからなる群から選択される表皮脂質、および
薬学的に許容される担体
を含む、組成物。

【請求項2】

阻害剤が、セラミダーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

抗微生物剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

抗微生物剤が、抗生物質である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

表皮脂質が、セラミド、任意選択で長鎖ジヒドロセラミドである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項6】

セラミドが、

【化1】

［式中、Ｒは、－（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）、－（ＣＨＯＨ）（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）または－（ＣＨ_２）_{１８～３０}Ｏ（ＣＯ）（ＣＨ_２）_７（ＣＨ＝ＣＨ）ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨ）（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３である］
の一般構造を有する、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

セラミダーゼ阻害剤が、セラミダスチンである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

局所適用のためのクリームとして製剤化される、請求項６または７に記載の組成物。

【請求項9】

皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における皮膚状態を処置する方法であって、哺乳動物に、治療有効量の請求項１に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項10】

皮膚状態が、創傷であり、投与ステップが、創傷に前記組成物を局所適用することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

皮膚状態が、損なわれたバリア機能であり、投与ステップが、創傷に前記組成物を局所適用することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

創傷が、微生物病原体に感染している、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

微生物病原体が、シュードモナス・エルギノーサである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

細菌病原体による感染の危険性があるかまたは細菌病原体に感染している創傷を処置する方法であって、創傷に関連する組織を、
治療有効量のセラミダーゼ阻害剤、および
１つまたは複数のセラミド
を含む組成物と接触させるステップを含む、方法。

【請求項15】

セラミダーゼ阻害剤が、セラミダスチンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

セラミドが、

【化2】

［式中、Ｒは、－（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）、－（ＣＨＯＨ）（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）または－（ＣＨ_２）_{１８～３０}Ｏ（ＣＯ）（ＣＨ_２）_７（ＣＨ＝ＣＨ）ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨ）（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３である］
の一般構造を有する、請求項１４または１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０２１年９月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２４２，０５９号に対する優先権を主張し、その開示内容は本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

政府支援の記載
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＤＫ１１４７１８、ＤＫ１２５８３５、ＧＭ１０８０１４およびＮＳ０４２６１７の下の政府支援で行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

皮膚は、内部環境と外部環境との間の自然のバリアとして作用し、したがって、機械的および化学的傷害、微生物、および紫外線損傷に対する保護などの必須の生物学的機能において重要な役割を果たす。ヒトの皮膚は、外側の表皮および下にある真皮という２つの主要な層で主に構成される。

【0004】

表皮は、真皮を覆い、外部環境と直接接触する。真皮は、脱水および外部攻撃に対して体を保護する主要な役割を有する。表皮を構成する細胞は、脂質ドメインによって境界が定められる。分化の過程で、その役割が表皮の生存層の細胞膜の流体構造の生成にあるリン脂質は、脂肪酸、コレステロールおよびセラミドから主になる混合物（スフィンゴ脂質）によって徐々に置き換えられる。これらの脂質は、表皮の、特に表皮の最も外側の層である角質層の、「バリア」特性を担う。

【0005】

表皮脂質は、生存表皮において主に合成される。表皮脂質は、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドで主に構成される。セラミドは、細胞シグナル伝達において最も重要な役割を果たし、かつヒト表皮において細胞増殖、分化およびアポトーシスに関連する、スフィンゴ脂質のクラスである。表皮脂質は、角質細胞間脂質の多層構造を維持するのに必要である。表皮脂質はまた、表皮の「バリア」機能に寄与し、水分喪失／加湿の課題の克服に寄与する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、宿主皮膚脂質と、皮膚創傷微小環境においてそれらを代謝することが可能な細菌因子との間の相互作用に関連する課題に対処する。このような相互作用は、創傷閉鎖障害に関連する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

概要
一態様では、本開示は、損なわれたバリア機能に関連する皮膚状態を処置するための組成物に関する。より詳細には、本開示は、セラミドを含む表皮脂質の枯渇により、バリア機能が最適には及ばない、皮膚状態を対象とする。一実施形態では、セラミドの枯渇は、特に真皮創傷の場合の、皮膚組織の病原体感染の結果である。一実施形態では、損なわれたバリア機能を示す組織は、治療有効量の細菌セラミダーゼ阻害剤および任意選択で１つまたは複数のセラミドを含む、医薬組成物で処置される。

【0008】

別の態様では、本開示は、皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物の皮膚に、治療有効量の、細菌セラミダーゼ阻害剤および／またはセラミドを含む組成物を投与することによって、皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における皮膚状態を処置する方法に関する。一実施形態では、本方法は、１つまたは複数のセラミドの投与とともに、１つまたは複数の細菌セラミダーゼ阻害剤を同時に投与するステップを含む。細菌セラミダーゼ阻害剤およびセラミドは、同時にまたは逐次的に投与され得る。逐次的に投与される場合、細菌セラミダーゼ阻害剤およびセラミドは、最初に投与された化合物が依然として有効である時間枠内に投与される。

【0009】

本開示のさらなる実施形態、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から、および本開示の実施を通じて明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】図１Ａ～１Ｆは、誘導性細菌セラミダーゼが、宿主皮膚セラミドを枯渇させることを示す。図１Ａ：慢性創傷バイオフィルム感染のブタモデルの時系列の概略図。図１Ｂ：バイオフィルムに感染したブタ創傷における細菌セラミダーゼ（ｂｃｄａｓｅ）の誘導。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって収集した、自発感染（ＳＩ）および野生型Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡｗｔ）感染ブタ創傷表皮（感染後ｄ７）におけるｂｃｄａｓｅ発現のリアルタイムｑＰＣＲ分析。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝５）として提示される。図１Ｃ：ＰＡΔｃｅｒバイオフィルムは、分泌ｂｃｄａｓｅ活性が欠損していた。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝６）として提示される。遺伝子ｂｃｄａｓｅ発現データについて図８Ａを参照。［ＮＢＤ－ＣＥＲ － Ｃ１２－ＮＢＤ－セラミド、ＮＢＤ－ＤＡ － ＮＢＤ－ドデカン酸］。図１Ｄ：ＳＩ、またはＰ．エルギノーサのセラミダーゼ変異体（ＰＡΔｃｅｒ）に感染した創傷と比較した、ＰＡｗｔバイオフィルムに感染したブタ創傷におけるセラミドの枯渇。データは、平均５４４±ＳＥＭ、（ｎ＝６）として提示される。図１Ｅ：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ標的化リピディドミック（ｌｉｐｉｄｉｄｏｍｉｃ）アプローチによって測定した場合の、ＰＡｗｔ、またはＰＡΔｃｅｒに曝露されたブタ皮膚脂質におけるセラミドの枯渇。細菌に曝露されていない同じ皮膚脂質をシャム対照として使用した。階層的クラスター分析により、皮膚脂質（ｎ＝６）におけるセラミドの１９種の下方制御が明らかになった。特異的に影響を受けた個々のセラミドは、図９Ａ～９Ｓに示される。図１Ｆ：経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）によって測定した、皮膚創傷のバリア機能の機能回復は、ＰＡｗｔバイオフィルム感染後に損なわれた。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として提示される。‡ｐ＜０．０５（ＰＡΔｃｅｒと比較）、および＊ｐ＜０．０５（ＳＩと比較）。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【図1E】同上。

【図1F】同上。

【図2A】図２Ａ～２Ｃは、宿主脂質が、ＰＡｗｔバイオフィルム凝集体形成を促進することを示す。皮膚脂質は、接種の２４時間後にインビトロポリカーボネート膜バイオフィルム系においてバイオフィルム凝集体形成を誘導した。宿主脂質に応答したＰＡｗｔバイオフィルムにおけるＥＰＳの存在量の増加が観察された。図２Ａ：ＷＧＡ染色を使用したバイオフィルム凝集体の定量化。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０として提示される。図２Ｂおよび２Ｃ：宿主脂質は、病原体ＰＡｗｔにおいてバイオフィルム遺伝子発現を誘導する。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝５）として提示される。

【図2B】同上。

【図2C】同上。

【図3A】図３Ａ～３Ｊは、宿主長鎖セラミドのバイオジェネシスが、ＰＡｗｔバイオフィルム感染の条件下で損なわれることを示す。図３Ａ：長鎖セラミドバイオジェネシス経路の概要が示される。図３Ｂ：ｑＰＣＲによって測定した、ＳＩまたはＰＡΔｃｅｒと比較した、ＰＡｗｔに感染した創傷部位の皮膚組織におけるＣｅｒＳ３の下方制御。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５～７）として提示される。図３Ｃ：ＰＡｗｔは、皮膚脂質におけるジヒドロセラミド（Ｃ１８ＤＨＣｅｒ）のレベルを低下させた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ標的化リピドミックアプローチによる測定。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として提示される。図３Ｄ：標準治療の一部として陰圧創傷療法（ＮＰＷＴ）を受けた慢性創傷患者からの創傷流体収集。図３Ｅ～３Ｆ：環状ｄｉＧＭＰが豊富なヒト創傷流体中のジヒドロセラミドのより低いレベル。環状ｄｉ－ＧＭＰは、ＰＡバイオフィルム感染のマーカーである（ｎ＝５）。図３Ｇ：バイオフィルム誘導性ｍｉＲ－１０６ｂは、宿主ＣｅｒＳ３を標的とする。図３Ｈ：ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＰＡｗｔバイオフィルムに感染したヒトケラチノサイト（ＨＫ）における上昇したｍｉＲ－１０６ｂ。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５～６）として提示される。ｍｉＲ－１０６ｂは、ＲＮＡＨｙｂｒｉｄ（商標）アルゴリズムに従って、ＣｅｒＳ３位置３３１～３５５の３’－ＵＴＲを標的とすることが予測される。図３Ｉ：ｍｉＲ－１０６ｂは、ヒトケラチノサイト（ＨＫ）においてｐｍｉＲ－標的－Ｃｅｒｓ－３’－ＵＴＲをサイレンシングした。ＦＬ、ホタルルシフェラーゼ；ＲＬ、レニラルシフェラーゼ。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である。図３Ｊ：ｍｉＲ－１０６ｂは、ヒトケラチノサイト（ＨＫ）においてＣｅｒＳ３タンパク質発現をサイレンシングした。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として提示される。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図3E】同上。

【図3F】同上。

【図3G】同上。

【図3H】同上。

【図3I】同上。

【図3J】同上。

【図4】図４は、創傷部位の皮膚ＰＰＡＲδ発現が、ＰＡｗｔバイオフィルム感染に応答して下方制御されることを示す概略図である。

【図5】図５は、その増強されたセラミダーゼ系を作動させ、それを維持するために細菌が使用する宿主脂質因子の盗用に依存するＰＡバイオフィルム形成に関連するメカニズムを示す。

【図6A】図６Ａ～６Ｃは、ｂｃｄａｓｅの変異についてのＰＡΔｃｅｒの検証を示す。ｂｃｄａｓｅは、ＰＡΔｃｅｒにおいて検出されなかった。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝４）として提示される。感染後ｄ７およびｄ１４についてのＳＩ、ＰＡｗｔまたはＰＡΔｃｅｒ創傷の創傷からのＣＦＵカウント。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝４～６）として提示される。１６Ｓ ｒＲＮＡ可変領域の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合の、感染後の創傷部位からの他の細菌種の中のシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）の存在量。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝４）として提示される。ＰＡｗｔまたはＰＡΔｃｅｒに感染した創傷におけるバイオフィルム構造の証拠。図６Ｄ：ＳＩまたはＰＡΔｃｅｒと比較した、ＰＡｗｔに感染した創傷における増加したＰＡバイオフィルムマトリックス。ブタｄ１４創傷組織は、ＰＡバイオフィルムマトリックス成分特異的ｐｅｌ（緑色）抗体およびＤＡＰＩ（青色）で免疫染色された。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝５）として提示される。図６Ｅ：皮膚脂質への曝露は、ＰＡｗｔにおいてｂｃｄａｓｅ発現を誘導したが、このような誘導は、枯渇した皮膚脂質に曝露されたＰＡｗｔにおいて減衰する。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝４～６）として提示される。図６Ｆ：仮説的に、宿主皮膚脂質は、シュードモナス転写活性化因子ＳｐｈＲの上方制御を介してＰＡｗｔにおいてｂｃｄａｓｅ発現を誘導する。図６Ｇ：皮膚脂質への曝露は、ＰＡｗｔにおいてＳｐｈＲ発現を誘導した。データは、平均±ＳＥＭ、＝５～６）として提示される。

【図6B】同上。

【図6C】同上。

【図6D】同上。

【図6E】同上。

【図6F】同上。

【図6G】同上。

【図7A】図７Ａ～７Ｕは、セラミド枯渇およびセラミダスチン救済に関する。図７Ａ～７Ｓ：皮膚脂質における、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した場合の、セラミド枯渇。適用可能な場合、細菌への曝露後、脂質を、標的化アプローチを介して抽出および分析した。こうして得られたデータを、３群間で有意差を有する脂質を具体的に特定するために、Ｒ３．５．３を使用するＡＮＯＶＡによる分析に供した。ＡＮＯＶＡによって試験した場合に有意性を有するものを、０．０５のＦＤＲカットオフを有するテューキー－ＨＳＤを使用する事後分析に供した。これらの閾値を通過した群差を有する脂質を、箱ひげ図として示した。皮膚セラミドは、脂肪アシルタイプ、スフィンゴイド骨格タイプ、およびスフィンゴイド骨格長－脂肪アシル長の形式に従う標準的命名法を使用して表示されている。ＮＳ＝Ｃｅｒ２（非ヒドロキシ脂肪酸を有する、スフィンゴイド骨格）；ＮＰ＝Ｃｅｒ３（非ヒドロキシ脂肪酸、フィトスフィンゴイド骨格）；ＮＨ＝Ｃｅｒ８（非ヒドロキシ脂肪酸、６－ヒドロキシスフィンゴイド骨格）；ＮＤＳ＝Ｃｅｒ１０（非ヒドロキシ脂肪酸、ジヒドロキシスフィンゴイド骨格）；ＡＳ＝Ｃｅｒ５（α－ヒドロキシ脂肪酸、スフィンゴイド骨格）；ＡＰ＝Ｃｅｒ６（α－ヒドロキシ脂肪酸、フィトスフィンゴイド骨格）。Ｙ軸の値は、ｃｐｓ（１秒あたりのカウント）における強度である。図７Ｔ：ヒトケラチノサイト（ＨＫ）膜セラミドは、抗セラミド（赤色）抗体およびＤＡＰＩ（青色）による免疫染色に基づいて、ＰＡｗｔによる感染に感受性であることが見出されたが、ＰＡΔｃｅｒ感染したケラチノサイトの単層ではそうではなかった。図７Ｕ：ＰＡ ｂｃｄａｓｅ阻害剤であるセラミダスチンは、ＰＡｗｔバイオフィルム感染に応答したケラチノサイトセラミドの枯渇を救済した。ヒトケラチノサイト（ＨＫ）を、セラミダスチン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＰＡバイオフィルムと共培養した細胞の馴化培地（２５％ｖ／ｖ）で２４時間処理した。

【図7B】同上。

【図7C】同上。

【図7D】同上。

【図7E】同上。

【図7F】同上。

【図7G】同上。

【図7H】同上。

【図7I】同上。

【図7J】同上。

【図7K】同上。

【図7L】同上。

【図7M】同上。

【図7N】同上。

【図7O】同上。

【図7P】同上。

【図7Q】同上。

【図7R】同上。

【図7S】同上。

【図7T】同上。

【図7U】同上。

【図8A】図８Ａ～８Ｎは、セラミド枯渇を示す。図８Ａ～８Ｌ バイオフィルム感染ケラチノサイト馴化培地（ＣＭ）に曝露された皮膚脂質における、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した場合の、セラミド枯渇。示されるように、ＰＡ ｂｃｄａｓｅの重要性を試験するために、ＣＭは、セラミダスチン（ＣＳＴ）を含有した。脂質を、材料および方法に記載されるように、非標的化アプローチを使用して抽出および分析した。結果として生じたデータを、Ｒ３．３を使用して分析した。すべての群の分析について、ウィルコクソン符号付順位和検定法を使用し、多重比較について、ｐ＜０．０５での有意性を用いて、クラスカル・ウォリスとその後のベンジャミーニ・ホッホベルク補正を実施した。皮膚セラミドは、脂肪アシルタイプ、スフィンゴイド骨格タイプ、およびスフィンゴイド骨格長－脂肪アシル長の形式に従う標準的命名法を使用して表示されている。ＮＳ＝Ｃｅｒ２（非ヒドロキシ脂肪酸を有する、スフィンゴイド骨格）；ＮＰ＝Ｃｅｒ３（非ヒドロキシ脂肪酸、フィトスフィンゴイド骨格）；ＮＨ＝Ｃｅｒ８（非ヒドロキシ脂肪酸、６－ヒドロキシスフィンゴイド骨格）；ＮＤＳ＝Ｃｅｒ１０（非ヒドロキシ脂肪酸、ジヒドロキシスフィンゴイド骨格）；ＡＳ＝Ｃｅｒ５（α－ヒドロキシ脂肪酸、スフィンゴイド骨格）；ＡＰ＝Ｃｅｒ６（α－ヒドロキシ脂肪酸、フィトスフィンゴイド骨格）。Ｙ軸の値は、ｍｏｌ％におけるものである。（Ｍ）デジタル創傷画像および面積測定が示される。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝６）として提示される。ｐ＜０．０５（ＰＡΔｃｅｒと比較）および＊ｐ＜０．０５（ＳＩと比較）。

【図8B】同上。

【図8C】同上。

【図8D】同上。

【図8E】同上。

【図8F】同上。

【図8G】同上。

【図8H】同上。

【図8I】同上。

【図8J】同上。

【図8K】同上。

【図8L】同上。

【図8M】同上。

【図8N】同上。

【図9A】図９Ａ～９Ｉは、バイオフィルム形成における皮膚セラミド分解生成物の、可能性のある役割を示す。図９Ａ～９Ｂ：メタノール－クロロホルム法によって達成した、皮膚脂質の枯渇。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５として提示される。皮膚脂質は、ＳＥＭによって決定した場合、インビトロポリカーボネート膜バイオフィルム系におけるバイオフィルム凝集体形成を誘導した。広視野が示される。図９Ｃ：ＰＡｗｔ＋ビヒクル（ＰＢＳ）；図９Ｄ、ＰＡｗｔ＋皮膚脂質；図９Ｅ、ＰＡｗｔ＋枯渇した脂質；図９Ｆ、ＰＡΔｃｅｒ＋ビヒクル（ＰＢＳ） 図９Ｇ、ＰＡΔｃｅｒ＋皮膚脂質。スケールバー＝１μｍ、１０，０００×倍率。黄色の点は、濃密なＥＰＳ形成に印をつける。黄色の矢頭は、ＥＰＳ線維を識別する。ＬＢ培地中のＰＡｗｔまたはＰＡΔｃｅｒの増殖曲線。図９Ｈ：データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８として提示される。皮膚脂質を補充されたまたは皮膚脂質なしのＭ９最小培地中のＰＡｗｔまたはＰＡΔｃｅｒの増殖曲線。図９Ｉ：データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２～１６として提示される。＊ｐ＜０．０５（ＰＡｗｔと比較）。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図9D】同上。

【図9E】同上。

【図9F】同上。

【図9G】同上。

【図9H】同上。

【図9I】同上。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｉは、さらなる実験結果を示す。図１０Ａ：ｑＰＣＲによって測定した、ＰＡΔｃｅｒ感染創傷上皮と比較した、ＬＣＭキャプチャーＰＡｗｔ感染創傷上皮におけるＣｅｒＳ３の下方制御；データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として提示される。図１０Ｂ～１０Ｇ）ヒト慢性創傷流体中のジヒドロセラミドレベルは、ＰＡｗｔバイオフィルムの環状ｄｉＧＭＰマーカーと負に相関する（ｎ＝５）。図１０Ｈ：慢性創傷患者の人口統計学的特徴。図１０Ｉ：ＣｅｒＳ３ ３’ＵＴＲベクターマップ。

【図10B】同上。

【図10C】同上。

【図10D】同上。

【図10E】同上。

【図10F】同上。

【図10G】同上。

【図10H】同上。

【図10I】同上。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｏは、さらなる実験結果を示す。図１１Ａ：ＰＰＡＲδプロモータールシフェラーゼレポーターのベクターマップ。図１１Ｂ～１１Ｃ：ＰＰＡＲδは、ＣｅｒＳ３発現を推進する。ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ５０１５１６、１μｍｏｌ／ｍｌ）またはアンタゴニスト（ＧＳＫ０６６０、１μｍｏｌ／ｍｌ）で処理されたヒトケラチノサイト（ＨＫ）におけるＣｅｒＳ３発現。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として提示される。図１１Ｄ～１１Ｆ：Ｓ－１－Ｐ処理ＨＫにおけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの上方制御。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示される。図１１Ｇ～１１Ｊ：Ｓ－１Ｐ処理ＨＫにおけるヒストン脱アセチル化酵素の誘導。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示される。図１１Ｋ～１１Ｎ）Ｓ－１Ｐ処理ＨＫにおける他のヒストン脱アセチル化酵素。有意な変化は観察されなかった（ＮＳ）。データは、平均±ＳＥＭ、（ｎ＝８）として提示される。図１１Ｏ：Ｓ－１－Ｐ（５μｍｏｌ／ｍｌ）で処理されたＨＫにおけるｍｉＲ－１０６ｂ発現。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示される。

【図11B】同上。

【図11C】同上。

【図11D】同上。

【図11E】同上。

【図11F】同上。

【図11G】同上。

【図11H】同上。

【図11I】同上。

【図11J】同上。

【図11K】同上。

【図11L】同上。

【図11M】同上。

【図11N】同上。

【図11O】同上。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｃは、ＰＰＡＲδがＡＢＣＡ１２発現を推進することを示す。図１２Ａ～１２Ｂ）ＰＰＡＲδは、ヒトケラチノサイト（ＨＫ）においてＡＢＣＡ１２発現を推進する。ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ５０１５１６、１μｍｏｌ／ｍｌ）またはアンタゴニスト（ＧＳＫ０６６０、１μｍｏｌ／ｍｌ）で（２４時間）処理されたＨＫ。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として提示される。図１２Ｃ：ＰＡΔｃｅｒ ｑＰＣＲと比較した、ＰＡ ＬＣＭキャプチャーＰＡ感染創傷上皮におけるＡＢＣＡ１２の下方制御；データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として提示される。

【図12B】同上。

【図12C】同上。

【発明を実施するための形態】

【0011】

定義
本開示がさらに記載される前に、この開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、それ自体、当然変わり得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することは意図されないことも理解されるべきである。

【0012】

別段定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。このセクションに記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、または他の刊行物に記載される定義に反するか、またはそうでなければ該定義と矛盾する場合、このセクションに記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義に対して優先される。本発明を記載し、特許請求する際、以下の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。

【0013】

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含む。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、それらのオープンで、非限定的な意味で使用される。

【0014】

用語「約」は、本明細書で使用される場合、記載される値または値の範囲より１０パーセント大きいまたは小さいことを意味するが、任意の値または値の範囲を、このより広い定義のみに限定することは意図されない。用語「約」が先行する各値または値の範囲はまた、記載される絶対的な値または値の範囲の実施形態を包含することが意図される。

【0015】

本明細書で使用される場合、用語「精製された」および同様の用語は、天然または自然環境において分子または化合物に通常関連する混入物が実質的にない形態における分子または化合物の単離に関する。本明細書で使用される場合、用語「精製された」は、絶対的な純粋性を必要としない；むしろ、それは、相対的定義として意図される。用語「精製されたポリペプチド」は、核酸分子、脂質および炭水化物を含むがこれらに限定されない他の化合物から分離されているポリペプチドを記載するために本明細書で使用される。

【0016】

用語「単離された」は、言及される材料が、その元の環境（例えば、それが自然に存在する場合は、自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生存動物中に存在する自然に存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、自然系における共存材料の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドは、単離されている。

【0017】

本明細書で使用される場合、さらなる指定のない用語「患者」は、医師の監視ありまたはなしで治療的ケアを受ける、任意の温血脊椎動物の飼いならされた動物（例えば、以下に限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌおよび他のペットを含む）およびヒトを包含することが意図される。

【0018】

用語「阻害する」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータの減少を指す。これは、以下に限定されないが、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去を含み得る。これはまた、例えば、天然または対照レベルと比較した場合の、活性、応答、状態、または疾患の１０％の低下を含み得る。したがって、低下は、天然または対照レベルと比較した場合の、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはそれらの間の任意の量の低下であり得る。

【0019】

本明細書で使用される場合、用語「セラミド」は、スフィンゴシンおよび脂肪酸からなり、かつ

【0020】

【化1】

【0021】

［式中、Ｒは、脂肪酸の飽和または不飽和アルキル鎖であり、任意選択で、脂肪酸鎖は、脂肪酸鎖の遊離末端への基－Ｏ（ＣＯ）（ＣＨ_２）_７（ＣＨ＝ＣＨ）ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨ）（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３の結合によって伸長される］
の一般構造を有する、蝋状脂質分子のファミリーを定義する。

【0022】

セラミダーゼは、セラミドの、スフィンゴシンおよび脂肪酸への分解を触媒する。
本明細書で使用される場合、「セラミダーゼ阻害剤」は、中性／アルカリ性細菌セラミダーゼなどのセラミダーゼに対して阻害活性を示す任意の化合物である。細菌セラミダーゼ阻害剤は、細菌セラミダーゼ阻害剤を生成する微生物を使用して得ても、または化学合成を通じて得てもよい。セラミダスチンは、米国特許第８，２６３，３６９号に記載される例示的な細菌セラミダーゼ阻害剤であり、その開示内容は、本明細書に明示的に組み込まれる。セラミダスチンの構造は以下である：

【0023】

【化2】

【0024】

用語「制御放出」は、本明細書で使用される場合、製剤からの薬物放出の様式およびプロファイルが制御される製剤を指す。これは、即時型だけでなく、非即時型の放出製剤を含み、非即時型の放出製剤は、持続放出および遅延放出製剤を含むが、これらに限定されない。用語「持続放出」（「延長放出」とも呼ばれる）は、長期間にわたる薬物の漸進的な放出を提供し、長期間にわたる実質的に一定のレベルの薬物をもたらし得る薬物製剤を指すためにその従来の意味で本明細書において使用される。用語「遅延放出」は、製剤の投与と、製剤からの薬物の放出との間に時間遅延が存在する薬物製剤を指すためにその従来の意味で本明細書において使用される。「遅延放出」は、長期間にわたる薬物の漸進的な放出を含んでも、または含まなくてもよく、したがって、「持続放出」であっても、またはなくてもよい。用語「長期」放出は、本明細書で使用される場合、薬物製剤が、少なくとも２時間、３時間、４時間、時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間、７２時間、７３時間、７４時間、７５時間、７６時間、７７時間、７８時間、７９時間、８０時間、８１時間、８２時間、８３時間、８４時間、８５時間、８６時間、８７時間、８８時間、８９時間、９０時間、９１時間、９２時間、９３時間、９４時間、９５時間、９６時間、９７時間、９８時間、９９時間、１００時間、１０１時間、１０２時間、１０３時間、１０４時間、１０５時間、１０６時間、１０７時間、１０８時間、１０９時間、１１０時間、１１１時間、１１２時間、１１３時間、１１４時間、１１５時間、１１６時間、１１７時間、１１８時間、１１９時間、または１２０時間、治療レベルの活性成分を送達するように構築および配置されることを意味する。

【0025】

「賦形剤」は、組成物に添加され、意図される投薬量で治療効果を発揮することが意図されない、任意の不活性成分を指すが、それは、製品の送達を改善するように作用し得る。賦形剤のさらなる特徴は、参照により本明細書に組み込まれる、米国医薬品局医薬品評価研究センター（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５年５月））によって発行されたＧｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに見出され得る。

【0026】

「薬学的に許容される担体」は、記載される発明の組成物の製剤化および投与に使用できる任意の実質的に非毒性の担体を指し、その中で、記載される発明の製品は、安定し生体利用可能を維持する。薬学的に許容される担体は、それを、処置される対象への投与に好適なものとするのに十分に高純度かつ十分に低毒性のものでなければならない。さらに、それは、活性薬剤の安定性および生体利用性を維持するべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であってよく、所与の組成物の活性薬剤および他の成分と組み合わされた場合に、計画された投与様式で、所望のバルク、粘稠性などを提供するように選択される。

【0027】

「低下した」または「低下させること」は、度合い、強度、程度、サイズ、量、密度または数の縮小、減少、減衰または減退を指す。
「局所的」は、適用の点における、またはその直下における医薬組成物の投与を指す。用語「局所的に」「局所投与」および「局所的に適用すること」は、上皮表面を含む、組織または細胞の１つまたは複数の表面上に医薬組成物を送達することを指すために互換的に使用される。組成物は、液体の場合、注ぐ、滴下する、またはスプレーすることによって；軟膏、ローション、クリーム、ゲルなどの場合、擦り込むことによって；粉末の場合、振りかけることによって；液体またはエアロゾル組成物の場合、スプレーすることによって；または任意の他の適切な手段によって適用され得る。局所投与は、一般に、全身的効果ではなく局所的効果を提供する。

【0028】

「処置する」または「処置すること」は、疾患、状態または障害の進行を阻止する、実質的に阻害する、遅らせるまたは逆転させること、状態の臨床的または審美的症状を実質的に改善すること、疾患、状態、または障害の臨床的または審美的症状の出現を実質的に予防すること、および有害なまたは不快な症状から保護することを含む。「処置する」または「処置すること」は、以下のうちの１つまたは複数を達成することをさらに指す：（ａ）障害の重症度を低下させること、（ｂ）処置される障害に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）処置される障害に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）障害を以前に有していた患者において障害の再発を制限すること、および（ｅ）障害の症状を以前に示した患者において症状の再発を制限すること。

【0029】

本明細書で使用される場合、薬物の「有効な」量または「治療有効量」は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な薬物の量を指す。「有効な」量は、個体の年齢および全般的状態、投与様式などに応じて、対象ごとに、またはさらには対象内で時間とともに変わる。したがって、正確な「有効量」を特定することが常に可能であるとは限らない。しかし、任意の個体の場合の適切な「有効な」量は、日常的な実験を使用して、当業者によって決定され得る。

【0030】

「創傷治癒剤」は、皮膚または他の体組織が傷害後にそれ自体を修復する、複雑なプロセスを促進する薬剤を指す。正常な皮膚では、表皮（表面層）および真皮（より深い層）は、外部環境に対する保護バリアを形成する。そのため、用語「創傷治癒剤」は、創傷治癒プロセスを促進する任意の物質を指す。

【0031】

実施形態
本開示は、微生物病原体が、複雑なバイオフィルムを生成するために、宿主皮膚脂質を利用しなければならないという発見を対象とする。したがって、抗バイオフィルム戦略は、必ずしも常に微生物自体を標的とする必要はない。特に微生物病原体による宿主の感染の危険性が増強される状況下で、微生物病原体によって利用される宿主脂質を標的とすることは、このような感染を予防または処置するための有効な戦略であり得る。一実施形態では、抗バイオフィルム戦略は、宿主皮膚脂質の微生物利用を妨げる薬剤および抗微生物剤の両方の投与を含む。一実施形態では、微生物病原体の病原性セラミド分解メカニズムに干渉するまたはそれを阻害する薬剤を投与するステップを含む、微生物病原体感染を処置または予防する方法が提供される。

【0032】

一実施形態では、関連する水分喪失／加湿の課題を有するバリア機能の喪失を示す損傷組織を処置する方法が提供され、損傷組織を、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドからなる群から選択される表皮脂質の外部供給源と接触させる。一実施形態では、損傷組織を、セラミドを含む組成物と接触させる。一実施形態では、組織は、病原性微生物病原体による現在または以前の感染の結果として損傷している。

【0033】

一実施形態によれば、微生物リパーゼの阻害剤と、１つまたは複数の表皮脂質とを含む、組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、セラミダーゼ阻害剤を含む。一実施形態では、組成物は、セラミダーゼ阻害剤と、１つまたは複数のセラミドとを含む。したがって、一実施形態では、本開示は、微生物の病原性セラミド分解メカニズムを阻害する方法だけでなく、修復された皮膚のバリア機能を救済するために宿主セラミドを補充して、機能的創傷閉鎖を可能にする方法を提供する。セラミダーゼ阻害剤は、一実施形態では、セラミダーゼの酵素活性に干渉する化合物である。このような化合物は、セラミダスチン、またはヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡを含み得る。一実施形態では、セラミダーゼ阻害剤は、例えば、セラミダーゼをコードする核酸に結合する干渉ＲＮＡを含む、セラミダーゼの発現に干渉する薬剤である。

【0034】

したがって、一実施形態では、局所投与のために製剤化された医薬組成物が提供され、組成物は、細菌セラミダーゼ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の総重量に基づいて、ゼロより大きく約１０重量％までの量の細菌セラミダーゼ阻害剤を含む。例えば、セラミドの総量は、組成物の総重量に基づいて、ゼロより大きく約９重量％まで、ゼロより大きく約８重量％まで、ゼロより大きく約７重量％まで、ゼロより大きく約６重量％まで、ゼロより大きく約５重量％まで、ゼロより大きく約４重量％まで、ゼロより大きく約３重量％まで、ゼロより大きく約２重量％まで、ゼロより大きく約１重量％までであり得る。一実施形態では、組成物は、セラミド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドから選択される１つまたは複数の表皮脂質をさらに含む。

【0035】

一実施形態によれば、本開示の組成物を構成するセラミダーゼ阻害剤は、１つまたは複数のセラミドまたはその誘導体をさらに含む。一実施形態では、組成物のセラミドは、一般式：

【0036】

【化3】

【0037】

［式中、Ｒは、４～３２の範囲から選択される炭素原子の飽和または不飽和脂肪族鎖であり、任意選択で、Ｒは、－（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）、－（ＣＨＯＨ）（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）または－（ＣＨ_２）_{１８～３０}Ｏ（ＣＯ）（ＣＨ_２）_７（ＣＨ＝ＣＨ）ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨ）（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３である］
を有する。一実施形態では、セラミドは、セラミド１、セラミド２、セラミド３、セラミド３Ｂ、セラミド４、セラミド５、セラミド１Ａ、セラミド６ＩＩ、セラミドＡＰ、セラミドＥＯＰ、セラミドＥＯＳ、セラミドＮＰ、セラミドＮＧ、セラミドＮＳ、セラミドＡＳ、ジラウリン酸セラミドＮＳ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。場合によっては、セラミドは、セラミド－ＥＯＳ、セラミド－ＮＳ、セラミド－ＮＰ、セラミド－ＥＯＨ、セラミド－ＡＳ、セラミド－ＮＨ、セラミド－ＡＰ、セラミド－ＡＨ、セラミド－ＯＳ、セラミド－ＯＨ、（疑似）セラミド、例えば、ヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡ、セチルオキシプロピルグリセリルメトキシプロピルミリスタミド、Ｎ－（１－ヘキサデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（１－ヘキサデシル）エステル、およびヒドロキシエチルパルミチルオキシヒドロキシプロピルパルミタミド、およびそれらの混合物を含み、またはこれらから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択で１つ、２つ、またはそれより多くの他のセラミドと組み合わせて、セラミドＥＯＰを含み得る。例えば、場合によっては、組成物は、セラミドの組み合わせ、例えば、セラミドＥＯＰ、セラミドＮＰ、セラミドＡＰの組み合わせを含む。

【0038】

セラミドおよびセラミド誘導体は、以下に限定されないが、ＳＮ－１位でリン酸化を受けないであろう、ＳＮ－１位の誘導体、例えば、１－クロロおよび１－ベンゾイルセラミド、ならびにセラミダーゼによる分解を受けないであろう、ＳＮ－２位（アミド結合）における誘導体、例えば、メチルカルバメート基または２－Ｏ－エチル置換基を含む。さらに、これらのセラミド類似体の細胞透過性形態が利用可能である。これらの細胞透過性セラミドおよび／または誘導体の例は、２～１０個の炭素を含有し、ＳＮ－２位において短鎖脂肪酸を有する（Ｃ６セラミド）。Ｃ６－セラミドの例は、Ｎ－ヘキサノイル－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－スフィンゴシンである。セラミドは、自然源から単離されてもよく、または化学合成されてもよい。一実施形態では、セラミドは、市販のクリーム、ローション、スプレー、ゲル、フォームまたは軟膏中にすでに製剤化されている。市販の組成物の例としては、Ｐｒｏｍｉｕｓ Ｐｈａｒｍａによって生成されるＥｐｉＣｅｒａｍ（登録商標）、ＣＥＲＡＶＥ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）またはＣＥＲＡＭＥＤＸ（登録商標）（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）が挙げられる。一実施形態では、組成物は、組成物の総重量に基づいて、ゼロより大きく約１０重量％までの量の１つまたは複数のセラミドを含む。例えば、セラミドの総量は、組成物の総重量に基づいて、ゼロより大きく約９重量％まで、ゼロより大きく約８重量％まで、ゼロより大きく約７重量％まで、ゼロより大きく約６重量％まで、ゼロより大きく約５重量％まで、ゼロより大きく約４重量％まで、ゼロより大きく約３重量％まで、ゼロより大きく約２重量％まで、ゼロより大きく約１重量％までであり得る。

【0039】

一実施形態では、本開示の組成物は、ステロールを含む。例示的なステロールとしては、コレステロール、硫酸コレステリル、酢酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、イソステアリン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、およびフィトステロールが挙げられる。組成物中のステロールの総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２０重量％まで変わり得る。例えば、コレステロールの総量は、組成物の総重量に基づいて、０．１重量％以上、０．２重量％以上、０．３重量％以上、０．４重量％以上、０．５重量％以上、０．６重量％以上、０．７重量％以上、０．８重量％以上、０．９重量％以上、１．０重量％以上および／または２０重量％以下、１５重量％以下、１３重量％以下、１１重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２．５重量％以下（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。

【0040】

組成物は、水、例えば、精製水を含み得る。組成物中の水の総量は、クレンジング組成物の総重量に基づいて、約３０～約９５重量％まで変わり得るが、典型的には約３０～約９５重量％である。場合によっては、水の総量は、組成物の総重量に基づいて、約３０～約９０重量％、約３０～約８５重量％、約３０～約８０重量％、約３５～約９０重量％、約３５～約８５重量％、約３５～約８０重量％、約４０～約９０重量％、約４０～約８５重量％、約４０～約８０重量％、約４５～約９０重量％、約４５～約８５重量％、約４５～約８０重量％、約５０～約９０重量％、約５０～約８５重量％、約５０～約８０重量％、約５５～約９０重量％、約５５～約８５重量％、約５５～約８０重量％、約６０～約９０重量％、約６０～約８５重量％、約６０～約８０重量％、約６５～約９０重量％、約６５～約８５重量％、または約６５～約８０重量％である。

【0041】

一実施形態では、組成物は、脂肪酸化合物、例えば、不飽和または飽和の脂肪酸または脂肪酸誘導体をさらに含む。不飽和または飽和脂肪酸としては、以下に限定されないが、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、ガドレイン酸、ペンタデカン酸、マルガリン酸、マルガロレイン酸、ベヘン酸、ジホモリノール酸、アラキドン酸およびリグノセリン酸が挙げられる。脂肪酸誘導体は、脂肪アルコールの脂肪酸エステル、脂肪アルコール誘導体の脂肪酸エステル（このような脂肪アルコール誘導体が、エステル化可能なヒドロキシル基を有する場合）、脂肪アルコールおよび脂肪アルコール誘導体以外のアルコールの脂肪酸エステル、ヒドロキシ置換脂肪酸、およびそれらの混合物を含むと定義される。脂肪酸誘導体の非限定的な例としては、共役リノール酸、リシノール酸、モノステアリン酸グリセロール、１２－ヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸エチル、ステアリン酸セチル、パルミチン酸セチル、ポリオキシエチレンセチルエーテルステアレート、ポリオキシエチレンステアリルエーテルステアレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルステアレート、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、ジステアリン酸ポリオキシエチレン、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジステアリン酸プロピレングリコール、ジステアリン酸トリメチロールプロパン、ステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ポリグリセリル、セバシン酸ジメチル、ＰＥＧ－１５ココエート、ＰＰＧ－１５ステアレート、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、ＰＥＧ－８ラウレート、ＰＰＧ－２イソステアレート、ＰＰＧ－９ラウレート、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0042】

組成物中の脂肪化合物の総量は、組成物の総重量に基づいて、例えば、約０．１～約２５重量％まで変わり得る。例えば、脂肪化合物の総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２５重量％、約０．１～約２０重量％、約０．１～約１５重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約８重量％、約０．１～約６重量％、約０．５～約２５重量％、約０．５～約２０重量％、約０．５～約１５重量％、約０．５～約１０重量％、約０．５～約８重量％、約０．５～６重量％、約１～約２５重量％、約１～約２０重量％、約１～約１５重量％、約１～約１０重量％、約１～約８重量％、または約１～約６重量％、約１．５～約２５重量％、約１．５～約２０重量％、約１．５～約１５重量％、約１．５～約１０重量％、約１．５～約８重量％、または約１．５～約６重量％、約２～約２５重量％、約２～約２０重量％、約２～約１５重量％、約２～約１０重量％、約２～約８重量％、または約２～約６重量％、約２．５～約２５重量％、約２．５～約２０重量％、約２．５～約１５重量％、約２．５～約１０重量％、約２．５～約８重量％、または約２．５～約６重量％、約３～約２５重量％、約３～約２０重量％、約３～約１５重量％、約３～約１０重量％、約３～約８重量％、または約３～約６重量％、約３．５～約２５重量％、約３．５～約２０重量％、約３．５～約１５重量％、約３．５～約１０重量％、約３．５～約８重量％、または約３．５～約６重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。追加としてまたは代替として、脂肪化合物の総量は、組成物の総重量に基づいて、０．１～２５重量％、０．１～２０重量％、０．１～１５重量％、０．１～１０重量％、０．１～８重量％、０．１～６重量％、０．１～２５重量％、０．５～２０重量％、０．５～１５重量％、０．５～１０重量％、０．５～８重量％、０．５～６重量％、１～２５重量％、１～２０重量％、１～１５重量％、１～１０重量％、１～８重量％、または１～６重量％、１．５～２５重量％、１．５～２０重量％、１．５～１５重量％、１．５～１０重量％、１．５～８重量％、または１．５～６重量％、２～２５重量％、２～２０重量％、２～１５重量％、２～１０重量％、２～８重量％、または２～６重量％、２．５～２５重量％、２．５～２０重量％、２．５～１５重量％、２．５～１０重量％、２．５～８重量％、または２．５～６重量％、３～２５重量％、３～２０重量％、３～１５重量％、３～１０重量％、３～８重量％、または３～６重量％、３．５～２５重量％、３．５～２０重量％、３．５～１５重量％、３．５～１０重量％、３．５～８重量％、または３．５～６重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。

【0043】

組成物の脂肪化合物の非限定的な例は、油、鉱油、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪アルコール誘導体、脂肪酸誘導体（例えば、アルコキシル化脂肪酸、または脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、または脂肪酸のプロピレングリコールエステル、または脂肪酸のブチレングリコールエステル、またはネオペンチルグリコールおよび脂肪酸のエステル、または脂肪酸のポリグリセロール／グリセロールエステル、またはエチレングリコールおよび脂肪酸のグリコールジエステルもしくはジエステル、または脂肪酸および脂肪アルコールのエステル、短鎖アルコールおよび脂肪酸のエステル）、グリセリルエステル（グリセロールエステル）、脂肪アルコールのアルキルエーテル、脂肪アルコールのアルキルエーテルの脂肪酸エステル、アルコキシル化脂肪アルコールの脂肪酸エステル、アルコキシル化脂肪アルコールのアルキルエーテルの脂肪酸エステル、脂肪アルコールのエステル、ヒドロキシ置換脂肪酸、ワックス、トリグリセリド化合物、ラノリン、およびそれらの混合物を含み、またはこれらから選択されてもよい。場合によっては、１つまたは複数の脂肪化合物は、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸のエステル、および／または脂肪アルコールのエステル（例えば、パルミチン酸セチル、ステアリン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ステアリン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、およびステアリン酸ステアリル（「セチルエステル」と呼ばれる混合物））を含んでもよく、またはこれらから選択されてもよい。追加としてまたは代替として、１つまたは複数の脂肪化合物は、炭化水素、脂肪アルコール、脂肪アルコール誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪エステル、脂肪エーテル、油、ワックスなどを含んでもよく、またはこれらから選択されてもよい。一例では、１つまたは複数の脂肪化合物は、直鎖状、分岐状、および／または環状の炭化水素、例えば、環状Ｃ６～Ｃ１６アルカン、ヘキサン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、およびイソパラフィン、例えば、イソヘキサデカン、イソドデカンおよびイソデカンである。さらに、直鎖状または分岐状炭化水素は、揮発性または不揮発性流動パラフィン、ワセリン、液体ワセリン、ペトロラタムポリデセン、水添ポリイソブテン、およびスクアランなど、１６個を超える炭素原子を有する鉱物、植物、動物または合成起源の炭素原子および水素原子のみからなり得る。

【0044】

一実施形態では、組成物は、１つまたは複数のポリオールを含む。１つまたは複数のポリオールは、２～１５個の炭素原子および少なくとも２個のヒドロキシル基を有するポリオールから選択されてもよい。組成物中に使用され得る例示的なポリオールは、アルカンジオール、例えば、グリセリン、１，２，６－ヘキサントリオール、トリメチロールプロパン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ジプロピレングリコール、２－ブテン－１，４－ジオール、２－エチル－１，３－ヘキサンジオール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、カプリリルグリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－ペンタンジオール、および４－メチル－１，２－ペンタンジオール；グリコールエーテル、例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノ－ｎ－プロピルエーテル、エチレングリコールモノ－イソ－プロピルエーテル、ジエチレングリコールモノ－イソ－プロピルエーテル、エチレングリコールモノ－ｎ－ブチルエーテル、エチレングリコールモノ－ｔ－ブチルエーテル、ジエチレングリコールモノ－ｔ－ブチルエーテル、１－メチル－１－メトキシブタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノ－ｔ－ブチルエーテル、プロピレングリコールモノ－ｎ－プロピルエーテル、プロピレングリコールモノ－イソ－プロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールモノ－ｎ－プロピルエーテル、およびジプロピレングリコールモノ－イソ－プロピルエーテル；ソルビトール；ソルビタン；トリアセチン；およびそれらの混合物を含み、かつ／またはこれらから選択されてもよい。

【0045】

１つまたは複数のポリオールは、グリコールまたはグリコールエーテル、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはそれらのエーテルのモノメチル、モノエチルおよびモノブチルエーテル、例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、ジプロピレングリコールのモノメチルエーテル、ならびにジエチレングリコールのアルキルエーテル、例えば、ジエチレングリコールのモノエチルエーテルまたはモノブチルエーテルであり得る。一例では、１つまたは複数のポリオールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、ペンチレングリコール、１，３－プロパンジオール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、カプリリルグリコール、グリセリン、およびそれらの混合物を含み、またはこれらから選択される。別の例では、組成物は、カプリリルグリコール、グリセリン、およびそれらの混合物を含み、またはこれらから選択される。

【0046】

いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量に基づいて、約１０重量％未満、好ましくは約９重量％未満、好ましくは約８重量％未満、好ましくは約７重量％未満、好ましくは約６重量％未満、好ましくは約５重量％未満、好ましくは約４重量％未満、好ましくは約３重量％未満、好ましくは約２重量％未満、または好ましくは約１重量％未満の量のプロピレングリコールおよび／またはエトキシジグリコールを有する。あるいは、組成物は、組成物の総重量に基づいて、１０重量％未満、好ましくは９重量％未満、好ましくは８重量％未満、好ましくは７重量％未満、好ましくは６重量％未満、好ましくは約５重量％未満、好ましくは４重量％未満、好ましくは３重量％未満、好ましくは２重量％未満、または好ましくは１重量％未満の量のプロピレングリコールおよび／またはエトキシジグリコールを有し得る。一例では、組成物に、プロピレングリコールおよび／またはエトキシジグリコールがないまたは実質的にないように、１つまたは複数のポリオールは、プロピレングリコールおよび／またはエトキシジグリコールを含まない。

【0047】

組成物中のポリオールの総量は、組成物の総重量に基づいて、例えば、約０．１～約２５重量％まで変わり得る。例えば、ポリオールの総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２５重量％、約０．１～約２０重量％、約０．１～約１５重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約８重量％、約０．１～約６重量％、約０．５～約２５重量％、約０．５～約２０重量％、約０．５～約１５重量％、約０．５～約１０重量％、約０．５～約８重量％、約０．５～６重量％、約１～約２５重量％、約１～約２０重量％、約１～約１５重量％、約１～約１０重量％、約１～約８重量％、または約１～約６重量％、約１．５～約２５重量％、約１．５～約２０重量％、約１．５～約１５重量％、約１．５～約１０重量％、約１．５～約８重量％、または約１．５～約６重量％、約２～約２５重量％、約２～約２０重量％、約２～約１５重量％、約２～約１０重量％、約２～約８重量％、または約２～約６重量％、約２．５～約２５重量％、約２．５～約２０重量％、約２．５～約１５重量％、約２．５～約１０重量％、約２．５～約８重量％、または約２．５～約６重量％、約３～約２５重量％、約３～約２０重量％、約３～約１５重量％、約３～約１０重量％、約３～約８重量％、または約３～約６重量％、約３．５～約２５重量％、約３．５～約２０重量％、約３．５～約１５重量％、約３．５～約１０重量％、約３．５～約８重量％、または約３．５～約６重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。追加としてまたは代替として、ポリオールの総量は、組成物の総重量に基づいて、０．１～２５重量％、０．１～２０重量％、０．１～１５重量％、０．１～１０重量％、０．１～８重量％、０．１～６重量％、０．１～２５重量％、０．５～２０重量％、０．５～１５重量％、０．５～１０重量％、０．５～８重量％、０．５～６重量％、１～２５重量％、１～２０重量％、１～１５重量％、１～１０重量％、１～８重量％、または１～６重量％、１．５～２５重量％、１．５～２０重量％、１．５～１５重量％、１．５～１０重量％、１．５～８重量％、または１．５～６重量％、２～２５重量％、２～２０重量％、２～１５重量％、２～１０重量％、２～８重量％、または２～６重量％、２．５～２５重量％、２．５～２０重量％、２．５～１５重量％、２．５～１０重量％、２．５～８重量％、または２．５～６重量％、３～２５重量％、３～２０重量％、３～１５重量％、３～１０重量％、３～８重量％、または３～６重量％、３．５～２５重量％、３．５～２０重量％、３．５～１５重量％、３．５～１０重量％、３．５～８重量％、または３．５～６重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。

【0048】

組成物は、１つまたは複数の乳化剤を含み得る。例えば、乳化剤は、単独でまたは混合物として、および任意選択で共乳化剤とともに使用される、両性、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性乳化剤であり得る。乳化剤は、取得しようとするエマルションに応じて適切な様式で選択される。

【0049】

場合によっては、非イオン性界面活性剤は、ポリオールの、例えば８～２４個の炭素原子を含有する飽和または不飽和鎖を有する脂肪酸とのエステル、およびそれらのアルコキシル化誘導体；Ｃ８～Ｃ２４のポリエチレングリコールエステル；Ｃ８～Ｃ２４のソルビトールエステル；Ｃ８～Ｃ２４、好ましくはＣ１２～Ｃ２２の脂肪酸または酸の糖（スクロース、グルコース、アルキルグリコース）エステル、およびそれらのアルコキシル化誘導体；糖およびＣ８～Ｃ２４、好ましくはＣ１２～Ｃ２２の脂肪アルコールまたはアルコールのエーテル；およびそれらの混合物から選択されてもよい。一例では、非イオン性界面活性剤は、酸化エチレンの、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸のエステルとの付加物、およびそれらの混合物から選択されるエトキシル化脂肪エステルである。好適であり得るエトキシル化脂肪エステルの例としては、９～１００個のオキシエチレン基を含有するもの、例えば、ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ラウレート（ＣＴＦＡ名として：ＰＥＧ－９ラウレート～ＰＥＧ－５０ラウレート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０パルミテート（ＣＴＦＡ名として：ＰＥＧ－９パルミテート～ＰＥＧ－５０パルミテート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ステアレート（ＣＴＦＡ名として：ＰＥＧ－９ステアレート～ＰＥＧ－５０ステアレート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０パルミトステアレート；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ベヘネート（ＣＴＦＡ名として：ＰＥＧ－９ベヘネート～ＰＥＧ－５０ベヘネート）；ポリエチレングリコール１００ＥＯモノステアレート（ＣＴＦＡ名：ＰＥＧ－１００ステアレート）；およびそれらの混合物が挙げられる。

【0050】

場合によっては、組成物は、スペーサーによって頭部基を通じて互いに連結される親水性頭部基および親油性基によって構成される、同一または異なる２つの界面活性剤部分を有し得る、二量体界面活性剤などの乳化剤を含み得る。例えば、１つまたは複数の乳化剤は、名称ＣＥＲＡＬＵＴＩＯＭでＳａｓｏｌ社によって販売されるもの、例えば、ＣＥＲＡＬＵＴＩＯＮ Ｈ：ベヘニルアルコール、ステアリン酸グリセリル、クエン酸ステアリン酸グリセリルおよびジココイルエチレンジアミンＰＥＧ－１５硫酸ナトリウム、ＣＥＲＡＬＵＴＩＯＮ Ｆ：ラウロイルラクチレートナトリウムおよびジココイルエチレンジアミンＰＥＧ－１５硫酸ナトリウム、ＣＥＲＡＬＵＴＩＯＮ Ｃ：水、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、セテアレス－２５、ジココイルエチレンジアミンＰＥＧ－１５硫酸ナトリウム、ラウロイルラクチレートナトリウム、ベヘニルアルコール、ステアリン酸グリセリル、クエン酸ステアリン酸グリセリル、アラビアゴム、キサンタンガム、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベンを含んでもよく、またはこれらから選択されてもよい。一実施形態では、組成物の乳化剤は、ラウロイルラクチレートナトリウムからなるか、またはラウロイルラクチレートナトリウムから本質的になる。別の実施形態では、組成物の乳化剤は、非イオン性乳化剤または陰イオン性乳化剤などの１つまたは複数のさらなる乳化剤とともに、ラウロイルラクチレートナトリウムを含む。

【0051】

組成物中の乳化剤の総量は、組成物の総重量に基づいて、例えば、約０．００１～約２５重量％まで変わり得る。例えば、脂肪化合物の総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．００１～約２５重量％、約０．００１～約２０重量％、約０．００１～約１５重量％、約０．００１～約１０重量％、約０．００１～約８重量％、約０．００１～約６重量％、約０．００５～約２５重量％、約０．００５～約２０重量％、約０．００５～約１５重量％、約０．００５～約１０重量％、約０．００５～約８重量％、約０．００５～６重量％、約０．０１～約２５重量％、約０．０１～約２０重量％、約０．０１～約１５重量％、約０．０１～約１０重量％、約０．０１～約８重量％、または約０．０１～約６重量％、約０．０５～約２５重量％、約０．０５～約２０重量％、約０．０５～約１５重量％、約０．０５～約１０重量％、約０．０５～約８重量％、または約０．０５～約６重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。一例では、組成物中の乳化剤の総量は、典型的には、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０重量％～５、６、７、８、９、または１０重量％の量である。

【0052】

組成物は、典型的な市販の製品よりも少ない量の乳化剤を有するように製剤化され得る。例えば、組成物は、組成物の総重量に基づいて、約０．００１～約６重量％、約０．００１～約５重量％、約０．００１～約４重量％、約０．００１～約３重量％、約０．００１～約２重量％、約０．００１～約１重量％、約０．００５～６重量％、約０．００５～約５重量％、約０．００５～約４重量％、約０．００５～約３重量％、約０．００５～約２重量％、約０．００５～約１重量％、約０．０１～約６重量％、約０．０１～約５重量％、約０．０１～約４重量％、約０．０１～約３重量％、約０．０１～約２重量％、または約０．０１～約１重量％、約０．０５～約６重量％、約０．０５～約５重量％、約０．０５～約４重量％、約０．０５～約３重量％、約０．０５～約２重量％、または約０．０５～約１重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の範囲の総量の乳化剤を有し得る。追加としてまたは代替として、組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．００１～６重量％、０．００１～５重量％、０．００１～４重量％、０．００１～３重量％、０．００１～２重量％、０．００１～１重量％、０．００５～６重量％、０．００５～５重量％、０．００５～４重量％、０．００５～３重量％、０．００５～２重量％、０．００５～１重量％、０．０１～６重量％、０．０１～５重量％、０．０１～４重量％、０．０１～３重量％、０．０１～２重量％、または０．０１～１重量％、０．０５～６重量％、０．０５～５重量％、０．０５～４重量％、０．０５～３重量％、０．０５～２重量％、または０．０５～１重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の範囲の総量の乳化剤を有し得る。

【0053】

本明細書に記載される組成物は、１つまたは複数のシリコーン油を含み得る。シリコーン油の非限定的な例としては、ジメチコン、シクロメチコン、ポリシリコーン－１１、フェニルトリメチコン、トリメチルシリルアモジメチコン、およびステアロキシトリメチルシランが挙げられる。場合によっては、組成物は、ジメチコン、および任意選択でさらなる油、例えばさらなるシリコーン油を含む。典型的には、１つまたは複数のシリコーン油は、不揮発性シリコーン油である。いくつかの実施形態では、シリコーン油は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ペンダントでありかつ／またはシリコーン鎖の末端にあり、基がそれぞれ２～２４個の炭素原子を含有する、アルキルまたはアルコキシ基を含むポリジメチルシロキサン、またはフェニルシリコーン、例えば、フェニルトリメチコン、フェニルジメチコン、フェニル（トリメチルシロキシ）ジフェニルシロキサン、ジフェニルジメチコン、ジフェニル（メチルジフェニル）トリシロキサンまたは（２－フェニルエチル）トリメチルシロキシシリケートである。

【0054】

組成物中の１つまたは複数のシリコーン油の量は、組成物の総重量に基づいて、例えば、約０．１～約２５重量％まで変わり得る。例えば、シリコーン油の総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２５重量％、約０．１～約２０重量％、約０．１～約１５重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約８重量％、約０．１～約６重量％、約０．５～約２５重量％、約０．５～約２０重量％、約０．５～約１５重量％、約０．５～約１０重量％、約０．５～約８重量％、約０．５～６重量％、または約０．５～５重量％、約１～約２５重量％、約１～約２０重量％、約１～約１５重量％、約１～約１０重量％、約１～約８重量％、約１～約６重量％、または約１～５重量％、約１．５～約２５重量％、約１．５～約２０重量％、約１．５～約１５重量％、約１．５～約１０重量％、約１．５～約８重量％、約１．５～約６重量％、または約１．５～５重量％、約２～約２５重量％、約２～約２０重量％、約２～約１５重量％、約２～約１０重量％、約２～約８重量％、約２～約６重量％、または約２～５重量％、約２．５～約２５重量％、約２．５～約２０重量％、約２．５～約１５重量％、約２．５～約１０重量％、約２．５～約８重量％、約２．５～約６重量％、または約２．５～５重量％、約３～約２５重量％、約３～約２０重量％、約３～約１５重量％、約３～約１０重量％、約３～約８重量％、約３～約６重量％、または約３～５重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の範囲であり得る。

【0055】

追加としてまたは代替として、シリコーン油の総量は、組成物の総重量に基づいて、０．１～２５重量％、０．１～２０重量％、０．１～１５重量％、０．１～１０重量％、０．１～８重量％、０．１～６重量％、０．５～２５重量％、０．５～２０重量％、０．５～１５重量％、０．５～１０重量％、０．５～８重量％、０．５～６重量％、または０．５～５重量％、１～２５重量％、１～２０重量％、１～１５重量％、１～１０重量％、１～８重量％、１～６重量％、または１～５重量％、１．５～２５重量％、１．５～２０重量％、１．５～１５重量％、１．５～１０重量％、１．５～８重量％、１．５～６重量％、または１．５～５重量％、２～２５重量％、２～２０重量％、２～１５重量％、２～１０重量％、２～８重量％、２～６重量％、または２～５重量％、２．５～２５重量％、２．５～２０重量％、２．５～１５重量％、２．５～１０重量％、２．５～８重量％、２．５～６重量％、または２．５～５重量％、３～２５重量％、３～２０重量％、３～１５重量％、３～１０重量％、３～８重量％、３～６重量％、または３～５重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。

【0056】

１つまたは複数の保存剤が、本明細書に記載される組成物中に含まれてもよい。好適な保存剤としては、以下に限定されないが、グリセリン含有化合物（例えば、グリセリンまたはエチルヘキシルグリセリンまたはフェノキシエタノール）、ベンジルアルコール、パラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベンなど）、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および／またはグレープフルーツ種子抽出物、またはそれらの組み合わせが挙げられる。２つ以上の保存剤が組成物中に含まれてもよい。他の保存剤は、当業者に公知であり、サリチル酸、ＤＭＤＭヒダントイン、ホルムアルデヒド、クロルフェニスム（Ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｓｍ）、トリクロサン、イミダゾリジニル尿素、ジアゾリジニル尿素、ソルビン酸、メチルイソチアゾリノン、デヒドロ酢酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、クオタニウム－１５、ステアラルコニウムクロリド、亜鉛ピリチオン、メタ重亜硫酸ナトリウム、２－ブロモ－２－ニトロプロパン、ジグルコン酸クロルヘキシジン、ポリアミノプロピルビグアニド、塩化ベンザルコニウム、亜硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、クエン酸、ニーム油、精油（各種）、乳酸、およびビタミンＥ（トコフェロール）を含む。一例では、組成物は、ＥＤＴＡ二ナトリウム、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、酢酸トコフェロール、および／またはそれらの混合物を含み、またはこれらから選択される、複数の保存剤を有する。

【0057】

保存剤は、任意選択で、組成物の総重量に基づいて、約０．０１重量％～約５重量％、約０．１５％～約１重量％、または約１重量％～約３重量％の範囲の量で含まれる。
組成物は、組成物の全体的なｐＨを増加または減少させるために１つまたは複数のｐＨ調整剤を含み得る。例えば、１つまたは複数の酸が、組成物のｐＨを減少させるために含まれてもよい。組成物のｐＨを減少させるのに好適な酸の例としては、以下に限定されないが、クエン酸、酢酸などが挙げられる。組成物は、組成物のｐＨを減少させるために、１つまたは複数の塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを含み得る。組成物のｐＨを調整するのに好適な追加のまたは代替の酸および塩基は、当業者に容易に公知である。

【0058】

組成物は、望ましくは、約４～約７、好ましくは約４．５～約６．５または約５．５～約６．５のｐＨのｐＨを有し得る。追加としてまたは代替として、組成物のｐＨは、４～７、好ましくは４．５～６．５、または好ましくは５．５～６．５の範囲であり得る。一例では、組成物のｐＨは、６または約６である。

【0059】

組成物中のｐＨ調整剤の量は、最終組成物および／または生成物の所望のｐＨに基づき得る。例えば、ｐＨ調整剤の総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．０５～約２０重量％の範囲であり得る。場合によっては、ｐＨ調整剤の総量は、組成物の総重量に基づいて、約０．０５～約１５重量％、約０．５～約１０重量％、約１～約５重量％、約１．５～約４重量％、または約２．０～約３重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）である。追加としてまたは代替として、組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．０５～１５重量％、０．５～１０重量％、１～５重量％、１．５～４重量％、または２．０～３重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の範囲の量のｐＨ調整剤を含み得る。

【0060】

組成物は、１つまたは複数の増粘剤を含み得る。増粘剤の量は、組成物中の他の成分および組成物についての所望の粘度に依存し得る。例えば、組成物は、組成物の粘度が、２０の毎分回転数（ＲＰＭ）でスピンドル数５を用いたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄレオメーターを使用して、２５℃の温度で、約１，０００ｃＰ～約１００，０００ｃＰ、約５，０００ｃＰ～約５０，０００ｃＰ、約１０，０００～約５０，０００ｃＰ、または約１５，０００ｃＰ～約４５，０００ｃＰであるような量の増粘剤を含み得る。追加としてまたは代替として、組成物の粘度は、２０ＲＰＭでスピンドル数５を用いたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄレオメーターを使用して、２５℃の温度で、１，０００ｃＰ～１００，０００ｃＰ、５，０００ｃＰ～５０，０００ｃＰ、１０，０００～５０，０００ｃＰ、または１５，０００ｃＰ～４５，０００ｃＰであり得る。

【0061】

増粘剤は、組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２０重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約９重量％、約０．２～約９重量％、約０．３～約９重量％、約０．４～約８重量％、約０．５～約５重量％、約１～約２０重量％、約１～約５重量％、または約１～約３重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の量であり得る。追加としてまたは代替として、増粘剤は、組成物の総重量に基づいて、０．１～２０重量％、０．１～１０重量％、０．１～９重量％、０．２～９重量％、０．３～９重量％、０．４～８重量％、０．５～５重量％、１～２０重量％、１～５重量％、または１～３重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）の量であり得る。さらに、増粘剤の量は、組成物の総重量に基づいて、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、または１．５重量％～２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０重量％（それらの間の範囲および部分範囲を含む）であり得る。

【0062】

１つまたは複数の増粘剤は、キサンタンガム、グアーガム、ビオサッカリドガム、セルロース、アカシアセネカガム、スクレロチウムガム、アガロース、ペクチン、ゲランガム、ヒアルロン酸であり得る。さらに、１つまたは複数の増粘剤は、ポリアクリロイルジメチルタウリンアンモニウム、アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ＶＰコポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレーツコポリマー、ポリアクリルアミド、カルボマー、およびアクリレーツ／アクリル酸アルキル（Ｃ１０～３０）クロスポリマーから選択されるポリマー増粘剤を含み得る。一例では、組成物は、ポリアクリロイルジメチルタウリンアンモニウムおよび／またはポリアクリル酸ナトリウムを含む。別の例では、組成物は、ポリアクリロイルジメチルタウリンアンモニウム、キサンタンガム、カルボマー、およびそれらの混合物の少なくとも１つを含み、またはこれらから選択される。

【0063】

記載される発明の組成物は、皮膚において局所的に濃縮された活性薬剤を保持するのに有効なマイクロカプセル化成分を含有し得る。いくつかの実施形態によれば、マイクロカプセル化成分は、リポソームを含む。いくつかの実施形態によれば、マイクロカプセル化成分は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態によれば、マイクロカプセル化成分は、リポソームとポリマーとの複合体、またはポリマーソームを含む。マイクロカプセル化成分の他の例としては、以下に限定されないが、ミセル、逆ミセル、エマルション、マイクロエマルションなどが挙げられる。

【0064】

リポソームは、一般に、水性コアを取り囲む疎水性二重層を形成するリン脂質およびコレステロールからなるサブミクロンの球形小胞として知られている。これらの構造は、多種多様な治療剤とともに使用されており、それ自体の疎水性特性（例えば、二重層捕捉）または親水性特性（例えば、水性区画における捕捉）に部分的に基づいて、リポソーム内に薬物を捕捉することを可能にする。リポソームは、一般に、制御放出のために、および脂質カプセル化化合物の薬物標的化のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．、１９９３）。

【0065】

典型的には、リポソーム中などに、薬物、活性治療剤または医薬組成物をカプセル化することは、薬物の生体内分布のパターンおよび薬物動態を変更し得る。ある特定の場合に、リポソームカプセル化は、薬物毒性を低下させることが見出されている。例えば、長期循環リポソーム製剤は、主に肝臓および脾臓において、単核貪食細胞系の臓器による取り込みを回避し得る。いくつかの実施形態によれば、このような長期循環リポソームは、リポソームと、リポソーム取り込みにおいて役割を果たす血漿成分との間の相互作用を妨げるように作用する、可撓性の水溶性ポリマー鎖の表面被覆を含み得る。いくつかの実施形態によれば、このようなリポソームは、この被覆なしで、飽和長鎖リン脂質およびコレステロールで構成され得る。

【0066】

例示的なリポソームは、リポソーム形成脂質を含む脂質層を含み得る。脂質は、リポソームの主な包装／捕捉／構造要素を提供する少なくとも１つのホスファチジルコリンを含み得る。ホスファチジルコリンは、主にＣ１６またはより長い脂肪酸鎖を含む。鎖長は、リポソーム構造、完全性、および安定性を提供する。任意選択で、脂肪酸鎖の１つは、少なくとも１つの二重結合を有し得る。本明細書で使用される場合、用語「ホスファチジルコリン」は、以下に限定されないが、大豆ＰＣ、卵ＰＣジエライドイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、レシチン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水添大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン３０（ＤＢＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含む。

【0067】

本開示のある特定の特徴は、明確にするために別個の実施形態の文脈で記載されるが、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよい。逆に、本開示の様々な特徴は、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されるが、別個にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供されてもよい。可変要素によって表される化学基に関する実施形態のすべての組み合わせは、このような組み合わせが、安定な化合物（すなわち、単離され、特徴付けされ、生物学的活性について試験され得る化合物）である化合物を包含する程度まで、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、このような可変要素を記載する実施形態に列挙される化学基のすべてのサブコンビネーションも、本開示によって具体的に包含され、化学基のありとあらゆるこのようなサブコンビネーションが個別にかつ明示的に本明細書に開示されているかのように本明細書に開示される。

【実施例】

【0068】

実施例１
セラミダスチンは、シュードモナス・エルギノーサ感染によるセラミド喪失を防止する
方法
動物
動物を、１２時間の明暗サイクル下で、食料および水を自由に与えて飼育した。

【0069】

細菌株。
シュードモナス・エルギノーサ野生型株（ＰＡｗｔ）、シュードモナス・エルギノーサセラミダーゼ変異体（ＰＡΔｃｅｒ）を、３７℃にてルリア寒天（ＬＡ）プレート上でまたは低塩化ナトリウムを有するルリアブロス（ＬＢＮＳ）で増殖させた。

【0070】

ブタ全層熱傷およびバイオフィルム創傷モデル
飼いならされたヨークシャー雌性ブタを傷つけ、感染させて、慢性創傷バイオフィルムモデルを確立した。８個の全層熱傷創傷（５．０８×５．０８ｃｍ（２×２インチ））をブタの背部上に作製した。熱傷後３日目に、創傷に、ＰＡｗｔ、またはＰＡΔｃｅｒ株（ＣＦＵ１０５／ｍｌ）のいずれかを、慢性創傷に豊富にあることが知られている別のグラム陰性細菌であるアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）１９６０６（ＣＦＵ１０６／ｍｌ）とともに接種した。対照創傷を、２５０μｌの滅菌ＰＢＳを用いて偽接種によって処理した。対照創傷は誘導性感染を受けず、皮膚ミクロフローラによりコロニー形成させた。これらの創傷を、自発感染（ＳＩ）と呼ぶ。創傷を、接種後５６日まで追跡した。シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡ）、アシネトバクター・バウマニ（ＡＣＩＮ）および皮膚ミクロフローラからなる慢性多微生物ブタ創傷バイオフィルム感染において、ＰＡは、優勢な種として現れる。経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）ブタおよび生検ブタの２セットのブタを使用した。ＴＥＷＬブタは、接種後０日目、７日目、１４日目および５６日目にＴＥＷＬデータ収集のためにのみ使用した。生検ブタは、細菌接種後７、１４、３５および５６日目に生検収集のためにのみ使用した。ブタを接種後５６日で安楽死させた。６ｍｍ滅菌使い捨てパンチ生検ツールを使用して、生検を収集した。それぞれの独立したブタ創傷を、ブタ創傷実験についての１つの「ｎ」とみなす。表１は、使用したブタの総数を含む。

【0071】

【表1】

【0072】

走査型電子顕微鏡画像化。
試料をグルタルアルデヒド固定緩衝液中に収集し、段階的エタノールで脱水し、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）で処理し、一晩放置して乾燥させた。走査前に、試料をマウントし、金で被覆した。試料の画像化を、電界放出銃電子源を備えたＦＥＩ（商標）ＮＯＶＡ ｎａｎｏＳＥＭ走査型電子顕微鏡（ＦＥＩ（商標）、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を使用することによって行う。

【0073】

経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）測定。
ＤｅｒｍａＬａｂ Ｃｏｍｂｏ（商標）（ｃｙｂｅｒＤＥＲＭ ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ）を使用して、創傷からの経表皮水分喪失を測定した。ＴＥＷＬを、ｇ（ｍ２）－１ ｈ－１で測定した。Ｄｅｒｍａｌａｂ Ｃｏｍｂｏは、コンピュータおよびプローブを有する主要測定ユニットからなる。ＴＥＷＬプローブは、垂直方向に互いに近くに位置した２つの湿度センサーを有し、ＴＥＷＬを、センサー間の湿度勾配から決定する。プローブを、ブタ皮膚表面上に置く。皮膚から放出された、蒸発した水を、プローブ中のセンサーによって検出し、測定して、ＴＥＷＬ値を与える。

【0074】

細菌セラミダーゼ活性アッセイ。
シュードモナスセラミダーゼ活性アッセイを、Ｏｈｎｉｓｈｉから適合させた。ＰＡｗｔおよびＰＡΔｃｅｒ株を、３７℃にて低塩化ナトリウムを有するルリアブロス（ＬＢＮＳ）中で一晩増殖させた。ＰＡｗｔおよびＰＡΔｃｅｒ馴化培地を、０．２μｍフィルターを使用する濾過によって一晩増殖培養物から得た。培地（５００μｌ）を、１５ｍｍｏｌのＣ１２－ＮＢＤ－セラミドとともに１６時間インキュベートした。反応を、８５°で１０分間加熱することによって停止した。溶液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｖａｎｔ ＤＮＡ１２０ ＳｐｅｅｄＶａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を使用して蒸発させ、５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）中で再構成し、その後、１０分間の超音波処理浴が続いた。溶液を１，５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートに使用および適用し、これをクロロホルム／メタノール／アンモニア（９０：１５：１ｖ／ｖ）で展開した。酵素の作用によって放出されたＮＢＤ－ドデカン酸、および残存ＮＢＤ－セラミドを、ＴＬＣによって分離し、ａＺｕｒｅ ＧｅｌＤｏｃ（ａＺｕｒｅ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃ６００）を使用して画像化した。濃度測定法によるバンドの定量化のために、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用した。

【0075】

ヒト対象、および慢性創傷からの流体収集。
この研究に参加している対象は、標準的臨床ケアの一部として陰圧創傷療法（ＮＰＷＴ）を受けている慢性創傷患者であった。患者の人口統計学的特徴および創傷関連情報を図１２Ｉに提示する。ＮＰＷＴドレッシング（スポンジ）を細胞単離および創傷流体収集のために各患者から収集した。創傷ドレッシングを食塩溶液で洗浄することによって、ＮＰＷＴドレッシングから創傷流体を得た。ヘルシンキ宣言プロトコールに従い、患者は、彼らの書面による同意書を提出した。ヒト創傷流体中の環状ジグアニレート（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）のレベルを、製造業者の説明書に従って、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して測定し、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用して測定したアルブミンレベルに対して正規化した。Ｃ－ｄｉ－ＧＭＰは、ＰＡバイオフィルム感染のマーカーであり、したがって、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰが豊富な創傷流体をリピドミック分析に使用した。

【0076】

ヒト創傷流体試料のリピドミック分析。
創傷流体試料を遠心分離して、あらゆる細片および細胞を除去し、次いで、血漿について記載されるように処理した。脂質を、内部標準の存在下、メタノール：ジクロロメタン中で試料から抽出した。抽出物を窒素下で濃縮し、０．２５ｍＬのジクロロメタン：メタノール（５０：５０）中の１０ｍＭ酢酸アンモニウム中で再構成した。抽出物をインサートに移し、ｎａｎｏ ＰＥＥＫチュービングおよびＳｃｉｅｘ ＳｅｌｅｘＩｏｎ－５５００ ＱＴＲＡＰを用いたＳｈｉｍａｚｄｕ ＬＣで実施される、インフュージョン－ＭＳ分析のためにバイアル中に入れた。試料を、ポジティブモードおよびネガティブモードの両方のエレクトロスプレーにより分析した（分析をＭｅｔａｂｏｌｏｎ（登録商標）によって行った）。５５００ ＱＴＲＡＰスキャンを、合計１，１００を超えるＭＲＭを用いたＭＲＭモードで実施した。個々の脂質種を、標的化合物およびそれらの割り当てられた内部標準のピーク面積比を取得し、次いで、試料に添加した内部標準の濃度を掛けることによって定量化した。脂質クラスの濃度を、クラス内のすべての分子種の合計から計算し、脂肪酸組成を、個々の脂肪酸によって構成される各クラスの割合を計算することによって決定した。

【0077】

ＬＣ ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを使用した皮膚セラミドのリピドミック分析。
スフィンゴリピドームの標的化分析を行った。簡潔に述べると、５００ｐｍｏｌの各スフィンゴ脂質内部標準混合物（Ａｖａｎｔｉ）をブタ創傷端組織に添加し、脂質を改変Ｂｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒプロトコールによるものとした。結果として生じた混合物を超音波処理して、凝集体を分散させ、遠心分離して、微粒子を除去し、澄んだ上清を新しいガラス管に移し、乾燥させ、メタノール（６００μｌ）中で再構成した。抽出された脂質を、超高速液体クロマトグラフィーシステムであるＳｈｉｍａｄｚｕ ＮｅｘｅｒａでＫｉｎｅｔｉｘ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ、２．６μ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して分離し、線形勾配（溶媒Ａ、５８：４１：１のＣＨ３ＯＨ／水／ＨＣＯＯＨ ５ｍｍギ酸アンモニウム；溶媒Ｂ、９９：１のＣＨ３ＯＨ／ＨＣＯＯＨ ５ｍｍギ酸アンモニウム、３．５分の２０～１００％Ｂおよび４．５分の１００％Ｂ、流速０．４ｍｌ／分、６０℃）を使用して溶出した。ＱＴＲＡＰ ６５００機器（ＳＣＩＥＸ）を使用したタンデム質量分光法とともにエレクトロスプレーイオン化を使用して、スフィンゴ脂質を検出および定量化した。個々のスフィンゴ脂質を、前駆体→生成物ＭＲＭ対を使用してモニターした。ＱＴＲＡＰ ６５００質量分析システムによるスフィンゴ脂質の検出のためのパラメータは、以下の通りである：カーテンガス：３０；ＣＡＤ：高；イオンスプレー電圧：５５００Ｖ；ソース温度：５００℃；ガス１：４０；ガス２：６０；デクラスタリングポテンシャル：８０Ｖ。衝突エネルギーはトランジションごとに異なった。ＭＲＭトランジションおよび衝突エネルギーは、調査したアナライトに応じて異なった。

【0078】

非標的化リピドミクスを、以前に公開されたように行った。簡潔に述べると、様々な細菌を、スナップキャップチューブ中で３ｍｌのトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）中で６時間培養した。細菌によって使用済みのすべての培地試料を、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、その後、リパーゼアッセイを実施した。上清をヒートブロック中で８０℃に２０分間加熱することによって、使用済み培地試料の熱不活性化対照を調製し、その後、アッセイに使用される１：１希釈を実施した。真空下にてｓｐｅｅｄｖａｃ中で３０分間乾燥させた０．６ｍｇ（５００μｌの１．２５ｍｇ／ｍｌストック）の総心臓抽出物を取得することによって、脂質を調製した。脂質を、改変ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ法によりこの混合物から抽出した。２５０μｌの反応体積からの脂質を、１ｍｌのメタノールおよび０．５ｍｌのクロロホルムを使用し、その後、１０μｌのＳＰＬＡＳＨリピドミクス内部標準ミックス（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を添加して抽出し、室温で１０分間インキュベートした。相分離した混合物から、底部の疎水性有機相（底部相）を、新しいガラス管に移した。脂質を含有する有機相を窒素流下で乾燥させ、脂質を、２５０ｕｌの注入溶媒（５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、５０：５０）中で再度可溶化した。最後に、脂質を、以前開示されたように、ＭＳ／ＭＳＡＬＬアプローチの使用により分析した。簡潔に述べると、ＭＳ／ＭＳＡＬＬを、２５分にわたり流速９ｕｌ／分でＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－２０ＡＣＸＲを使用する直接注入によるＳｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ－ＴＯＦ ５６００＋を使用して実施した。

【0079】

試料を、流量勾配を使用して注入した。質量範囲（ｍ／ｚ１００～１２００）における脂質を分析するために使用した実験パラメータは、ポジティブイオン化モード：ＣＵＲ ３０、ＧＳ１ １６、ＧＳ２ ４０、ＴＥＭ １５０、累積時間５０００ｍｓ、ＣＡＤ ４、ＣＥ ３８ ＣＥＳ ５、ＤＰ ８０およびネガティブイオン化モード：ＣＵＲ ３０、ＧＳ１ １６、ＧＳ２ ４０、ＴＥＭ １００、累積時間３０００ｍｓ、ＣＡＤ ４、ＣＥ －４５、ＣＥＳ ５、ＤＰ －８０であった。データ分析を以前記載されたように実施し、セラミド含有量をｍｏｌ％値で報告した。

【0080】

スフィンゴシン－１－ホスフェート（Ｓ－１－Ｐ）のリピドミック分析。試料調製：
試料をＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ中で秤量し、これに０．５ｎｍｏｌのｄ１７：１－Ｐを有する２０μｌのＩＳセラミド／スフィンゴ脂質混合物Ｉ（ＬＭ－６００２ Ａｄｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）を添加した。ホモジナイゼーションのために２００μｌの水を添加した。全体積を収集し、ガラスバイアルに移し、７５０μＬの２：１（ｖ／ｖ）比のメタノール／クロロホルムを添加した。混合物を超音波処理し、次いで、ヒーティングブロック中で４８℃にて一晩インキュベートした。室温で冷却した後、７５μＬのメタノール中の１Ｍ ＫＯＨを試料に添加し、次いで、超音波処理し、ヒーティングブロック中で３７℃にて２時間インキュベートした。冷却後、試料を１３，０００ｇで８分間遠心分離し、上清を新しい微小遠心分離管に移し、乾燥するまで真空濃縮した。抽出物を２００μＬの８０：２０移動相Ａ／Ｂ中で再構成した。次いで、５分間超音波処理し、１３，０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移した。ＨＰＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析：Ｓ－１－ＰレベルをＨＰＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって定量化した。分離を、Ｘｔｅｒｒａ Ｃ１８（２．１×１５０ｍｍ、μｍ）カラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓ １２００ ＨＰＬＣシステムで実施した。移動相Ａは、１０ｎＭのギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは、１：１（ｖ／ｖ）のイソプロパノール：アセトニトリル中の１０ｎＭのギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸である。初期条件は、８５：１５のＡ：Ｂであり、その後、８分で０：１００までの線形勾配が続き、２０分まで保持した。カラム再平衡化を、２１分で８５：１５のＡ：Ｂに戻すことによって実施し、３０分まで保持した。カラム流速は０．３ｍＬ／分であった。Ｓ－１－Ｐについての保持時間は１１．３分であった。

【0081】

分析：
アナライトを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ １９４ ６４６０トリプル四重極質量分析計を利用するＭＳ／ＭＳによって定量化した。定量化は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）に基づくものであった。ＥＳＩポジティブモードを、ｄ１８：１－Ｐ塩基について３０Ｖの衝突エネルギー（ＣＥ）を用いた３８０．４～２６４．４のトランジション、および内部標準ｄ１７：１－Ｐについて３０ＶのＣＥを用いた３６６．４～２５０．４のトランジションを用いて使用した。１３５Ｖのフラグメンターエネルギーおよび８０ｍｓのドウェルタイムを使用した。ソースパラメータは以下の通りであった：窒素ガス温度＝３２５℃および流速＝１０Ｌ／分、ネブライザー圧力＝５０ｐｓｉ、シースガス温度＝２５０℃、シースガス流速＝７Ｌ／分、およびキャピラリー電位＝３．５ｋＶ。すべてのデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｂ．０３ソフトウェアを用いて収集および分析した。定量化は、内因性分子の存在のためにｄ１８：１－Ｐおよびｄ１７：１－Ｐ塩基をＰＢＳに添加することによる、０．２５～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲を用いた、５点標準曲線に基づくものであった。標準曲線を線形関数に適合させ、相関係数＞０．９９を得た。Ｓ－１－Ｐアッセイ法をＭｅｒｒｉｌｌから適合させた。

【0082】

細菌１６Ｓ ｒＲＮＡについての次世代シークエンシング。
ブタ創傷端組織を、組織粉砕機（６７７０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ）を使用して粉砕した。各試料中の微生物ＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシークエンサーを使用してＭｉｃｒｏｇｅｎＤｘ Ｉｎｃによって配列決定された。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、細菌中の１６Ｓ遺伝子について、標的配列を検出および増幅した。標的化配列がＰＣＲを使用して増幅される場合に提供されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーに結合した固有の識別配列である「タグ」によって、ＭｉＳｅｑシークエンサーで実行される場合に、試料は互いに区別された。ＰＣＲ後、プールしたＤＮＡの精製を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡｍｐｕｒｅビーズおよびＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｅｌｕｔｅキットの両方を使用して小断片を除去することによって行った。ＤＮＡを定量化し、配列決定用に調製した。最後に、ＤＮＡライブラリーを、ＭｉＳｅｑシークエンサーで実行する。配列決定読み取りを、データ分析中に品質および長さについて分析した。データ分析パイプラインは、２つの主要な段階であるノイズ除去およびキメラ検出段階と、微生物多様性分析段階とからなった。ノイズ除去およびキメラ検出段階の間、ノイズ除去を、短い配列、シングルトン配列、およびノイズ読み取りを除去するための様々な技術を使用して実施した。２１９個の低品質読み取りを除去し、キメラ検出を、キメラ配列の除去の助けとなるように実施した。品質スコアまたは品質測定基準または適切な長さを下回るあらゆる読み取りを廃棄した。１６Ｓ ｒＲＮＡの可変領域の高品質配列決定読み取りを、ＭｉｃｒｏｇｅｎＤｘのキュレートデータベースと比較した。データベースは、１８５００種の固有の細菌からなる。

【0083】

細胞培養。
ヒトケラチノサイトを、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ増殖培地中で、標準的培養条件下（９５％空気および５％ＣＯ２からなる加湿雰囲気中で３７℃）で増殖させた。

【0084】

インビトロのヒトケラチノサイト－シュードモナスバイオフィルム共培養。
細菌バイオフィルムを、Ａｎｄｅｒｓｏｎから適合させた方法に従って、ヒトケラチノサイト細胞と共培養した。ヒトケラチノサイト細胞のコンフルエント培養物に、抗生物質のない培養培地中で、ＰＡｗｔまたはＰＡΔｃｅｒ（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）の細菌培養物を接種した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。１時間後、０．４％アルギニンを補充した新しいＤＭＥＭ（抗生物質なし）をプレートに添加した。７～８時間後、細胞を回収した。共培養培地を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、セラミダスチン実験に使用した。ヒトケラチノサイトを、セラミダスチン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＰＡｗｔバイオフィルムと共培養した細胞の馴化培地（２５％ｖ／ｖ）で２４時間処理した。

【0085】

インビトロのシュードモナスバイオフィルムモデル。
ポリカーボネート膜上のインビトロバイオフィルム培養を、Ｚｈａｏ（Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ ２０１０；１８（５）：４６７～７７）から適合させた。インビトロバイオフィルムを、ブタ皮膚脂質ありまたはなしのポリカーボネート膜（ＰＣＭ）上で２４時間増殖させた。接種の２４時間後、バイオフィルムを、ＳＥＭ、リアルタイムｑＰＣＲを使用したｍＲＮＡのために、またはコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ染色）のために処理した。

【0086】

ブタ皮膚からの脂質の単離。ブタの背から得たブタ皮膚の４ｃｍ×４ｃｍ×０．２５ｃｍ（高さ／幅および深さ）切片を、外科用ハサミおよびメスを使用して３ｍｍ^３以下のかたまりに切断した。こうして得られた組織を、プローブソニケーター（ＱＳｏｎｉｃａ Ｑ ５００）を使用して超音波処理した。組織および超音波処理したホモジネートを、処理中４０℃以下の温度で維持するように注意した。ホモジナイゼーションのこの処理後、脂質を、改変ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ法を使用して４００μＬのホモジネートから抽出した。簡潔に述べると、１ｍＬのメタノールをホモジネートに添加し、その後、バッチ超音波処理が続いた。その後、０．５ｍｌのクロロホルムを混合物に添加し、その後、再度超音波処理が続いた。角質層の高疎水性脂質種の抽出を可能にするために、こうして得られた混合物を４８０℃で４時間インキュベートした。混合物を６０００×ｇで１５分間遠心分離して、細片をペレット化して取り除き、こうして清澄化された抽出物を新しいガラスバイアルに移した。その後、さらなる１ｍＬのクロロホルムを混合物に添加し、その後、１０秒間ボルテックスした。次いで、２ｍＬの水をこの混合物に添加して、疎水性相および親水性相を分離した。相の分離をよりよく可能にするために、混合物を再度ボルテックスし、６０００×ｇで１５分間遠心分離した。ガラスパスツールピペットを使用して、底部有機層を注意深く取り出し、新しいガラスバイアルに移した。残存抽出物を、１ｍＬのクロロホルムを用いて再抽出し、遠心分離し、新しい底部有機相を、最初の抽出物の有機相と合わせた。こうして得られた疎水性脂質抽出物を、熱を使用せずに真空濃縮器により乾燥させた。次いで、乾燥した脂質抽出物を５００μＬの１：１メタノール：ジクロロメタン中で再構成し、その後の研究に使用した。

【0087】

ブタ皮膚からの脂質の枯渇。
ブタ皮膚組織を、低温粉砕機を使用して粉砕した。１ｇのブタ組織をＰＢＳにゆっくりと添加した（１０％ｗ／ｖ比）。混合物を、プローブソニケーターを４℃で使用してホモジナイズした。４００μＬのホモジネートを取得し、１ｍｌのメタノールを添加し、その後、超音波処理浴が続いた。０．５ｍｌのクロロホルムを混合物に添加し、その後、再度超音波処理が続いた。混合物のインキュベーションを４８℃で一晩行った。翌日、混合物を４３００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。こうして清澄化された抽出物を新しいガラスバイアルに移した。さらなる１ｍＬのクロロホルムを混合物に添加し、その後、１０秒間ボルテックスした。疎水性相および親水性相を分離するために、２ｍｌの水をこの混合物に添加した。相の分離をよりよく可能にするために、混合物を再度ボルテックスし、４３００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ガラスパスツールピペットを使用して、上部層を注意深く取り出し、新しいガラスバイアルに移した。残存抽出物を、１ｍＬのクロロホルムを用いて再抽出し、遠心分離し、新しい上部相を取り出し、最初の抽出物と合わせた。

【0088】

脂質定量化アッセイ。
脂質の枯渇を、製造業者のマニュアルに従って、Ｌｉｐｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（中性脂質）（ａｂｃａｍ）、Ｌｉｐｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（不飽和脂肪酸）（ａｂｃａｍ）を使用して定量化した。

【0089】

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）。
凍結組織ブロックを８μｍ切片に切断した。切片（２～３枚）を、それぞれＲＮＡＺａｐ処理した熱可塑性物質（ポリエチレンナフタレート）被覆ガラススライド（ＰＡＬＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｎｒｅｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にマウントし、使用まで－８０℃で保持した。必要な場合、切片を解凍し、以下の固定剤：９５％エタノール、１０％中性緩衝ホルマリン、またはアセトンのうちの１つの中で１分間固定し、カタパルトした。バイオフィルム感染および対照創傷組織の表皮層を、Ｃｅｌｌｓ－Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で提供される溶解緩衝液中でキャプチャーした。この後に、ＲＮＡ抽出および逆転写、およびリアルタイムＰＣＲを使用したｍＲＮＡ定量化が続いた。

【0090】

免疫組織化学および免疫細胞化学。
ＯＣＴ包埋創傷組織ブロックを、クライオスタットを使用して切片化した。凍結切片の免疫組織化学染色を、以下の一次抗体：抗セラミド（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｅｉｎｃｅ、ＭＩＤ １５Ｂ４；希釈１：１００）、α－ＰＰＡＲδ（Ａｂｃａｍ、希釈：１：２００）、α－ＡＢＣＡ１２（Ａｂｃａｍ、希釈：１：２００）を使用して実施した。蛍光検出を可能にするために、切片を、適切なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（緑色、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６４（赤色、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）コンジュゲート化二次抗体とともにインキュベートした。切片をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。免疫細胞化学のために、細胞をＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定し、１０パーセント正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングし、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。モザイク画像を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００ Ｍ、倒立蛍光顕微鏡法または共焦点顕微鏡法（ＬＳＭ８８０）を使用して収集した。画像分析を、Ｚｅｎ（Ｚｅｉｓｓ）ソフトウェアを使用して実施して、蛍光強度（蛍光ピクセル）を定量化した。

【0091】

ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。
ＯＣＴ切片を冷却アセトン中で３分間固定した。切片（１０μｍ厚さ）をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ＯＣＴ切片をアセトンで固定し、次いで、水で洗浄した。切片をヘマトキシリンで５分間染色し、水中で洗浄し、エオシンで２分間対比染色した。切片を段階的アルコールで脱水し、キシレンで洗浄し、その後、マウントした。

【0092】

ナイルレッド染色。
ナイルレッド染色法を、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎから適合させた。アセトン中のナイルレッド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。ＯＣＴ創傷組織切片をＰＢＳによって洗浄し、ナイルレッド溶液（１：１００希釈）で１０分間染色した。切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、マウントした。

【0093】

コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色。
細菌バイオフィルムを有するＰＣＭディスクを、寒天プレートからガラススライドに移した。コムギ胚芽凝集素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍｇ／ｍｌストック溶液をＰＢＳ中で希釈した。ＰＣＭディスクをコムギ胚芽凝集素（希釈１：２００）で１０分間染色した。次いで、ＰＣＭディスクをマウントし、ＡＩＲＹｓｃａｎ検出器を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０顕微鏡で画像化した。

【0094】

定量的ＲＴ ＰＣＲ。
ブタ創傷組織を、組織粉砕機（６７７０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ）を使用して粉砕し、全ＲＮＡをｍｉＲＶａｎａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して作製した。定量的またはリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑｍａｎまたはＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ）アプローチを、ｍＲＮＡ定量化に使用した。

【0095】

ウエスタンブロット分析。
ウエスタンブロットを、抗ＰＰＡＲδ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）、抗ＣｅｒＳ３（Ｏｒｉｇｅｎｅ、１：５００）に対する抗体を使用して実施した。β－アクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５０００）をハウスキーピングとして使用した。

【0096】

ＰＰＡＲδトランス活性アッセイ。
ヒトケラチノサイト細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５μｍｏｌの長鎖セラミド、Ｃ１８：０およびＣ２４：０（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｂａｍａ）で処理した。細胞をトランスフェクションから４８時間後に収集し、核タンパク質を、製造業者のプロトコールに従って、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して抽出した。ＰＰＡＲδトランス活性を、製造業者の説明書に従って、ＰＰＡＲ ｄｅｌｔａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ）を使用して測定した。

【0097】

ＤＮＭＴ３Ｂ活性アッセイ。
ヒトケラチノサイト細胞を、５μｍｏｌのスフィンゴシン－１－ホスフェート（Ａｖａｎｔｉ）で４８時間処理した。細胞を収集し、ＤＮＭＴ３Ｂ活性を、製造業者の説明書に従って、ＥｐｉＱｕｉｋ ＤＮＭＴ３Ｂ Ａｃｔｉｖｉｔｙ／Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ）を使用し、アッセイのための陽性対照として組換えＤＮＭＴ３Ｂタンパク質（ＡＣＴＩＶＥ ＭＯＴＩＦ）を使用して測定した。

【0098】

ＰＰＡＲδプロモーターアッセイ。
ＰＰＡＲδプロモーターアッセイを、以前記載されたように行った。ｍＮＰ－Ｌｕｃ（ＰＰＡＲデルタプロモーター）は贈与されたものであった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１６５３２；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１６５３２；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１６５３２）。ＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、ヒトケラチノサイト細胞を、ＰＰＡＲδプロモーターレポーター構築物で共トランスフェクトし、５μｍｏｌの長鎖セラミド、Ｃ：１８およびＣ：２４（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｂａｍａ）で処理した。培地をトランスフェクションから４８時間後に収集し、分泌されたＧＬｕｃおよびＳＥＡＰの活性を、製造業者のプロトコールに従って、Ｓｅｃｒｅｔｅ－Ｐａｉｒ Ｄｕａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を用いてＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。正規化されたプロモーター活性を、ＧＬｕｃ活性のＳＥＡＰ活性に対する比として提示している。

【0099】

ｍｉＲ－標的３’－ＵＴＲルシフェラーゼレポーターアッセイ。
ＨａＣａＴケラチノサイトを、ｍｉＲＩＤＩＡＮ模倣物－ｍｉＲ－１０６ｂでトランスフェクトし、その後、ｍｉＲ標的ＰＰＡＲδ－３’－ＵＴＲプラスミド（ＮＭ＿００６２３８、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ ＨｍｉＴ１０５０６１－ＭＴ０６）またはＣｅｒＳ３－３’－ＵＴＲプラスミド（ＮＭ＿１７８８４２、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ ＨｍｉＴ０９５４８６－ＭＴ０６）によるトランスフェクションが続いた。ルシフェラーゼアッセイおよび正規化を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。正規化を、レニラプラスミドとの共トランスフェクションによって達成した。データを、ホタル：レニラルシフェラーゼの比として提示する。

【0100】

ヒトケラチノサイトへのｍｉＲＮＡ送達。
ヒトケラチノサイト細胞のトランスフェクションを、記載されるように実施した。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間前に、ケラチノサイトを、抗生物質のないＤＭＥＭ培地中に播種した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を使用して、１００ｎＭのｍｉＲ－１０６ｂ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）で細胞をトランスフェクトした。非標的化ｍｉＲＮＡ陰性対照のトランスフェクションを、対照群について実施した。７２時間後、細胞を回収／再播種した。

【0101】

ＰＰＡＲδプロモーターについてのバイサルファイトシークエンシング。
ＰＣＲ生成物をゲル抽出し（ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＮＡ１１１１－１ＫＴ）、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを、ＡＢＩ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。分析を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ５．４．５（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＩ）を使用して行った。結果を、精製ＤＮＡをｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３８０）にクローニングし、その後、配列決定することによって確認した。

【0102】

ＤＮＡのバイサルファイト変換。
スフィンゴシン－１－ホスフェート（５μＭ、４８時間）でトランスフェクトされたＨａＣａＴケラチノサイトからのＤＮＡのバイサルファイト変換を、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣｐＧ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、部品番号：４４４５５５５）を使用して実施した。細胞を溶解し、ＤＮＡを、ＰＣＲチューブ中で変性試薬を使用して、５０℃で１０分間変性させた。（１）６５℃で３０分間、（２）９５℃で１．５分間、（３）６５℃で３０分間、（４）９５℃で１．５分間、（５）６５℃で３０分間、および（６）４℃で最大４時間の条件下のＰＣＲ反応におけるバイサルファイトを含有する変換緩衝液による処理により、変性ＤＮＡ試料中で非メチル化シトシンをウラシルに変換した。この後、結合カラム中の変換されたＤＮＡの塩の除去および脱スルホン、一連の洗浄ステップ、および次いでＤＮＡの溶出が続いた。変換されたＤＮＡを、さらに使用するまで２０℃で保存した。

【0103】

定量化および統計分析。
データ分析を、平均±ＳＥＭとして提示される、スチューデントのｔ検定（両側）を使用して実施した。平均、ＳＥＭおよびスチューデントの対応のあるｔ検定分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０中のイン－ビルト関数を使用して行った。複数の群の間の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．２中のＡＮＯＶＡイン－ビルト関数を使用して検定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
結果
創傷感染およびバイオフィルム形成は、宿主皮膚セラミドを枯渇させる。確立された前臨床ブタ慢性創傷バイオフィルムモデル（図１Ａ）では、ＰＡセラミダーゼの発現は、ＰＡｗｔによる感染後７日目に３桁分誘導された（図１Ｂ）。対照創傷は、誘導性感染を受けず、自然皮膚ミクロフローラによりコロニー形成させた。これらの創傷を、自発感染（ＳＩ）と呼ぶ。細菌セラミダーゼは、宿主セラミドの破壊を引き起こすことが知られている。ＰＡセラミダーゼの重要性を決定するために、セラミダーゼ欠損ＰＡ株（ＰＡΔＣｅｒ）を研究した。変異体細菌株におけるセラミダーゼ（ｂｃｄａｓｅ）遺伝子の喪失を、ｑＲＴ ＰＣＲを使用して検証した（図６Ａ）。セラミダーゼ活性の喪失は、蛍光セラミド類似体を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって測定した場合、ＰＡΔＣｅｒにおいて明らかであった（図１Ｃ）。ＰＡ感染を、ＣＦＵアッセイによって確認した（図６Ｂ）。細菌種およびそれらの存在量を特定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ（可変領域）次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を実施した。ＰＡ感染を、ＮＧＳシークエンシングに基づいてさらに確認した（図６Ｃ）。初期感染は多微生物（ＰＡ＋ＡＢ）であったが、時間が経つにつれ、ＰＡは、バイオフィルムにおける優勢種になった（図６Ｃ）。細菌バイオフィルム凝集体の形成を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、およびＰＡバイオフィルムマトリックス成分特異的抗体ｐｅｌによる染色を使用して検証した（図９Ｃ～９Ｇ）。

【0104】

【表2】

【0105】

皮膚セラミドのバイオフィルム依存性喪失は、ＰＡｗｔでは明らかであったが、ＰＡΔＣｅｒではそうではなかった（図１Ｄ）。インビトロ研究により、宿主皮膚脂質への曝露は、ＰＡｗｔにおいてｂｃｄａｓｅを強力に誘導することが特定された；このような誘導は、枯渇した皮膚脂質に曝露されたＰＡｗｔでは減衰した（図６Ｅ）。誘導性ｂｃｄａｓｅは、シュードモナスＳｐｈＲ遺伝子の誘導に関連していた（図６Ｆおよび６Ｇ）。ＳｐｈＲは、ｂｃｄａｓｅの転写活性化因子として機能することが知られている。皮膚セラミドのバイオフィルム依存性喪失を、リピドミクスアプローチを用いて特徴付けた。１９種の長鎖皮膚セラミドは、ＰＡｗｔによるバイオフィルム感染に応答して枯渇することが観察されたが、ＰＡΔＣｅｒではそうではなかった（図１Ｆ、７Ａ～７Ｓ）。主成分分析（ＰＣＡ）により、ＰＡｗｔに応答した皮膚セラミドの存在量は、ＰＡΔＣｅｒおよびシャム曝露に応答した皮膚セラミドレベルのクラスターとは統計的に異なることが明らかになった。ＰＡｗｔバイオフィルム感染後のケラチノサイトセラミドの喪失に対処するメカニズム研究を、インビトロで行った（図７Ｔ）。ＰＡセラミダーゼの阻害剤であるセラミダスチンは、ＰＡｗｔバイオフィルム感染によって引き起こされる喪失に対してケラチノサイトセラミドを救済した（図７Ｕ）。セラミダスチンによるセラミドの救済に関する一致したデータが、バイオフィルム馴化培地で処理された、抽出された皮膚脂質に関するエクスビボ研究で観察された（図８Ａ～Ｌ）。

【0106】

感染の３つの群すべて（ＳＩ、ＰＡｗｔおよびＰＡΔＣｅｒ）における創傷を、５６日の期間にわたって研究した。この期間の間、これらの創傷のすべては、創傷面積測定（図８Ｍ～Ｎ）だけでなく、組織学によっても明らかなように、完全に閉鎖された。皮膚バリア機能、すなわち、皮膚バリア完全性を、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）を測定することによって研究した。ＰＡｗｔバイオフィルム感染の条件下では、皮膚セラミドの枯渇は、上昇したＴＥＷＬに関連していた（図１Ｆ）。皮膚バリア機能におけるこのような損傷は、ＰＡΔＣｅｒに応答して観察されなかった（図１Ｆ）。これらの所見は、ｂｃｄａｓｅの誘導と、修復された皮膚がバリア完全性を回復させることができないこととの間の因果関係を確立する。

【0107】

皮膚脂質は、ｂｃｄａｓｅを介してバイオフィルムを増大させる。
天然または脂質枯渇（図９Ａ～Ｂ）の皮膚組織抽出物の研究により、バイオフィルム形成の増大における脂質の明らかな役割が実証された。バイオフィルム形成に対する皮膚セラミドの分解の重要性を試験するために、抽出された脂質を、ｂｃｄａｓｅが十分であるまたは欠損している細菌に添加した。皮膚脂質抽出物の添加は、ＳＥＭおよびＥＰＳ染色によって測定した場合、ＰＡｗｔにおけるバイオフィルム形成を著しく増強した。このような増大は、ＰＡΔＣｅｒでは弱まった。これは、バイオフィルム形成における皮膚セラミド分解生成物の、可能性のある役割を示す（図９Ｃ～Ｄ）。バイオフィルム形成中に、細菌は、クオラムセンシング（ＱＳ）を使用して、抗生物質耐性などの挙動を調整する。ＰＡでは、ＱＳは、主要なＱＳ系であるｐｑｓＲおよびｒｈｌＲ２６を含む、一連の小分子受容体によって推進される。バイオフィルム凝集体に関する構造的観察と一致して、ｐｑｓＲおよびｒｈｌＲの発現は、宿主脂質で処理されたＰＡｗｔバイオフィルムにおいて、同じ処理条件下のＰＡΔＣｅｒと比較して、著しく高かった（図２Ｂおよび２Ｃ）。しかし、栄養ブロス中でプランクトン状態においてＰＡΔＣｅｒおよびＰＡｗｔの増殖速度に有意差は観察されなかった（図９Ｈ）。しかし、宿主脂質の存在下では、ＰＡΔＣｅｒの増殖の増加が観察された（図９Ｉ）。これは、ＰＡΔＣｅｒがより速い増殖を示したインビボの観察と一致している。ＰＡｗｔは、宿主の存在下で比較的遅く増殖したが、ＰＡｗｔは、青色のフェナジン（ピオシアニン）形成、ＷＧＡ染色およびｐｑｓＲ遺伝子の発現の増加によって実証されるように、バイオフィルム形成の増加を示した。ＰｑｓＲ／ｍｖｆＲは、ピオシアニン形成に必要とされることが知られている。ピオシアニンは、ＰＡ２８への細胞外ＤＮＡ結合を促進することによってバイオフィルム形成に寄与する。したがって、これらのデータは、微生物病原体が、単独で複雑な脅威を開始することができないこと、および微生物病原体が、複雑なバイオフィルムを生成するために宿主皮膚脂質を利用しなければならないことを実証した。

【0108】

創傷バイオフィルムは、宿主皮膚ＣｅｒＳ３を下方制御し、ジヒドロセラミドを枯渇させる。皮膚セラミド恒常性は、長鎖セラミドを生成するＣｅｒＳ３依存性生合成経路に依存する（図３Ａ）。創傷バイオフィルム感染は、ＰＡｗｔ感染創傷においてＣｅｒＳ３発現を下方制御することによってセラミド生合成を損なったが、ＰＡΔＣｅｒではそうではなかった（図３Ｂ、１０Ａ）。弱まった皮膚ＣｅｒＳ３発現は、ＰＡｗｔ感染に曝露されたブタ皮膚組織における長鎖ジヒドロセラミドレベルの枯渇に関連していた（図３Ｃ）。ＰＡバイオフィルムの存在を決定するために、環状ｄｉ－ＧＭＰを、慢性創傷患者からの創傷流体中のサロゲートマーカーとして使用した。前臨床ブタ研究からの本発明者らの所見と一致して、慢性創傷患者からの創傷流体の調査により、長鎖ジヒドロセラミドレベルの低下と、ＰＡバイオフィルムマーカー環状ｄｉ－ＧＭＰのレベルの上昇との間の密接な相関が明らかになった（図３Ｅ～３Ｆ、１０Ｂ～１０Ｈ）。したがって、ｄｉＧＭＰによって示されるＰＡバイオフィルムは、ジヒドロセラミドのより低いレベルに関連していた。

【0109】

ｍｉＲ－１０６ｂは、病原性役割を有する創傷端皮膚組織におけるバイオフィルム誘導性のものとして特定される。ｍｉＲ－１０６ｂは、ＰＡｗｔによって引き起こされるバイオフィルム感染に応答して誘導されたが、ＰＡΔＣｅｒによってはそうではなかった（図３Ｇ～３Ｈ）。ＣｅｒＳ３は、ｍｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングを受ける。ＲＮＡＨｙｂｒｉｄ（商標）分析により、ＣｅｒＳ３の３’－ＵＴＲは、ｍｉＲ－１０６ｂによって標的化される可能性があることが明らかになった（図３Ｉ～３Ｊ）。このような予測の生物学的検証を、ヒトケラチノサイトで行った。ｍｉＲ－１０６ｂ模倣物の送達は、ＣｅｒＳ３ ３’－ＵＴＲレポーター活性を有意に低下させた（図３Ｉ、１０Ｉ）。この所見と一致して、ｍｉＲ－１０６ｂ模倣物は、ＣｅｒＳ３タンパク質発現を減少させた（図３Ｊ）。

【0110】

バイオフィルム依存性セラミド枯渇後のＰＰＡＲδ活性の抑制。
転写因子のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）ファミリーでは、ＰＰＡＲδは、特にセラミド感受性である。バイオフィルムの影響を受けたセラミド枯渇組織では、ＰＰＡＲδ発現は下方制御された。このような影響は、ＰＡΔＣｅｒ感染の条件下では観察されず、このことは、皮膚セラミド枯渇の原因としての働きを示した（図４）。根底にあるメカニズムに対処するために、ヒトケラチノサイトバイオフィルム感染に関する研究を行った。ブタ研究からの所見と一致して、バイオフィルム感染は、ＰＰＡＲδ発現を弱めた。このような影響は、ＰＡセラミダーゼ阻害剤であるセラミダスチンの存在下で救済された。皮膚セラミドは、主に長鎖（≧Ｃ１８）である。したがって、Ｃ１８およびＣ２４セラミドを、ＰＰＡＲδ機能を調節するそれらの能力について試験した。ヒトケラチノサイトでは、これらの長鎖セラミドは、ＰＰＡＲδトランス活性化および転写を誘導した。ケラチノサイトにおいて、ＰＰＡＲδアゴニストＧＷ５０１５１６は、ＣｅｒＳ３の発現を増加させ（図１１Ｂ）、一方、そのアンタゴニストＧＳＫ０６６０は、ＣｅｒＳ３の発現を弱めた（図１１Ｃ）。これらの所見は、ケラチノサイトにおけるセラミドによるＰＰＡＲδの直接的調節を実証する証拠を構成する。

【0111】

スフィンゴシン－１－ホスフェートは、ＰＰＡＲδプロモーターをメチル化する。皮膚セラミドは、細菌セラミダーゼによってスフィンゴシンに分解される。スフィンゴシンは、スフィンゴシン－１ホスフェート（Ｓ－１－Ｐ）にリン酸化され、これは、生理活性脂質であり、遺伝子調節をエピジェネティックに下方制御し得る。したがって、本発明者らの実験系においてＰＰＡＲδを調節するＳ－１－Ｐのありそうな役割を試験した。創傷バイオフィルム感染のブタ前臨床モデルにおいて、Ｓ－１－Ｐのレベルの上昇が、ＰＡｗｔ感染後に検出されたが、ＰＡΔＣｅｒ感染後には検出されなかった。この所見は、検出されたＳ－１－Ｐが、ｂｃｄａｓｅの作用を受けた皮膚セラミドの分解生成物であることを示した。標準的培養条件下では、ヒトケラチノサイトが、生理活性スフィンゴ脂質Ｓ－１－Ｐで処理された場合、ＰＰＡＲδの遺伝子発現が弱まった。ＰＰＡＲδのこのような下方制御が、エピジェネティックに調節されたかどうかを決定するために、ＰＰＡＲδプロモーターのＣｐＧメチル化を研究した。

【0112】

Ｓ－１－Ｐは、プロモーターメチル化を引き起こした。このような増加したＰＰＡＲδプロモーターメチル化は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ＤＮＭＴ３Ｂ）の増大した触媒活性に関連していた。エピジェネティック調節因子に対するＳ－１－Ｐの影響の調査により、ＤＮＡメチル化およびヒストン脱アセチル化に有利に働く遺伝子発現に対するより広範囲の影響が明らかになった。Ｓ－１－ＰによるｍｉＲ－１０６ｂの誘導は、Ｓ－１－ＰがＰＰＡＲδを減衰させ得る、さらなるエピジェネティックメカニズムを構成する（図１１Ｏ）。

【0113】

ＰＰＡＲδは、バイオフィルム誘導性ｍｉＲ－１０６ｂの新規標的である。バイオフィルム誘導性でもあるＰＰＡＲδ標的化ｍｉＲの探索は、候補としてｍｉＲ－１０６ｂの特定をもたらした。ｍｉＲ－１０６ｂ模倣物の送達は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＰＰＡＲδレベルを損なった。ＰＰＡＲδを、３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーターアッセイによってｍｉＲ－１０６ｂに対する標的としてさらに検証した。したがって、体系的な研究により、ケラチノサイトにおけるバイオフィルム誘導性ｍｉＲ－１０６ｂの標的としてＰＰＡＲδが確立された。

【0114】

表皮脂質トランスポーターＡＢＣＡ１２は、創傷バイオフィルム感染後に損なわれた。皮膚セラミドは、すべての皮膚脂質の推定５０％を担っている。他の皮膚脂質は、皮膚バリア機能を可能にするのに重要な役割を果たす。これら２つは、皮膚の健康を相互作用的に維持することが知られている。ＡＢＣＡ１２は、その転写がＰＰＡＲδ依存性であるが（図１２Ａおよび１２Ｂ）、表皮ケラチノサイト脂質トランスポーターである。創傷部位ＡＢＣＡ１２発現は、ＰＡｗｔによるバイオフィルム感染に応答して減衰したが、ＳＩまたはＰＡΔＣｅｒではそうではなかった。ＡＢＣＡ１２のこのような下方制御は、皮膚脂質分布の明らかな変化に関連していた。創傷部位表皮では、極性脂質および中性脂質のレベルは、ＰＡｗｔによるバイオフィルム感染に応答して急激に低下したが、ＳＩまたはＰＡΔＣｅｒによってはそうではなかった。ヒトケラチノサイトに対するメカニズム追跡研究により、ＰＡｗｔによるバイオフィルム感染に応答したＡＢＣＡ１２の喪失は、セラミダスチンによって防止されたことが明らかになり、このことにより、喪失は、ｂｃｄａｓｅの作用を受けたケラチノサイトセラミドの分解生成物によって引き起こされることが実証された。このような所見は、ＰＡΔＣｅｒによる感染に応答したＡＢＣＡ１２の喪失の防止と一致していた。図５は、メカニズム概要を提示する。

【0115】

広範囲の脂質を代謝する誘導性酵素を備えて、ＰＡは、宿主細胞結合を促進するため、および宿主免疫防御を回避するために、宿主脂質を利用することが知られている。自然免疫防御系のマクロファージでは、ＰＡは、ＰＡの内在化を助ける、スフィンゴ脂質が豊富なラフトを生成する宿主脂質セラミドの放出を引き起こす酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を増強する。肺では、ＰＡリポキシゲナーゼ（ｐＬｏｘＡ）は、宿主アラキドン酸－ホスファチジルエタノールアミンを酸化して、気管支上皮フェロトーシスを引き起こし、気道バイオフィルムを確立する。病原性微生物が宿主脂質を利用する能力を損なうように、宿主脂質が先制的に準備され得るという考えが、結果として現れた。ＰＡバイオフィルム感染創傷組織における３桁分の細菌セラミダーゼの誘導により、バイオフィルムの影響を受けた創傷における治癒応答におけるその重要性を試験する体系的調査が求められた。

【0116】

Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙは、皮膚創傷治癒の最も関連のある前臨床モデルとしてブタモデルの研究を推奨する。現在の研究は、インビボにおける免疫適格ブタにおける慢性創傷バイオフィルム感染の確立されたモデルの研究に基づく。このアプローチは、シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡ）およびアシネトバクター・バウマニからなる誘導性多微生物創傷バイオフィルムの確立をもたらす。ブタの正常皮膚フローラによってコロニー形成された非感染皮膚創傷は、ベースライン対照として機能し、自発感染（ＳＩ）と呼ばれた。このモデルでは、当業者は、創傷が慢性になるにつれ、ＰＡが、優勢株としての地位を確立することを理解する。

【0117】

皮膚は、バリア防御を提供する主要な機能を果たす。皮膚バリアの喪失は、感染およびアレルゲンへの脆弱性を増加させる。損なわれた皮膚バリア機能はまた、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触皮膚炎、およびいくつかの特定の遺伝的障害に関連している。皮膚のバリア機能を可能にする中心的なものは、皮膚セラミドである。皮膚のセラミド恒常性は、生合成経路と異化経路との間の動的バランスに依存する。ＰＡｗｔによるバイオフィルム感染が、修復された皮膚のバリア機能を損なうが、ＰＡΔＣｅｒではそうではないという観察は、セラミド枯渇が、治癒中のバリア機能の回復障害に関与することを示す直接的証拠を提供する。ＣｅｒＳ３は、長鎖皮膚セラミド合成の主要触媒として認識される。バイオフィルム誘導性ｍｉＲ－１０６ｂは、ＣｅｒＳ３の転写後遺伝子サイレンサーとして認識される。

【0118】

ＰＡは、宿主脂質を活用して、バイオフィルム形成を増強する。皮膚ブタ脂質の添加は、脱脂質に感受性のある様式でバイオフィルム形成を増大させた。バイオフィルムのこのような増大はＰＡΔＣｅｒでは存在しなかったため、脂質自体はトリガーではなかった。バイオフィルム形成は、ＰＡのクオラムセンシング（ＱＳ）経路に関連している。現在の研究は、セラミド分解生成物が、ＳｐｈＲを誘導可能であることを実証する。ＰＡの抗生物質耐性中に、ＳｐｈＲは、クオラムセンシングＶｑＳＭ－ＳｐｈＲ相互作用に関与している。この経路は、皮膚脂質がＱＳを誘導し得る、ありそうなメカニズムを表す。宿主皮膚脂質の転写調節において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ＰＰＡＲδは、中心的役割を果たす。このハブは、本明細書に開示される所見によって明らかになったパラダイムにおける中心的プレイヤーとして現れた。皮膚における基礎ＰＰＡＲδ活性は、セラミドによって推進される。上記のような、ＰＡバイオフィルム依存性増幅ループは、皮膚セラミドを枯渇させ、こうして、ＰＰＡＲδ活性を低下させた。そのループの一部として、セラミドがスフィンゴシンに異化されると、Ｓ－１－Ｐが生成された。Ｓ－１－Ｐは、ＰＰＡＲδ発現をエピジェネティックにサイレンシングした。Ｐ．エルギノーサによって引き起こされる炎症に続発する肺傷害に、セラミド由来スフィンゴシンおよびＳ１Ｐが、直接関与している。興味深いことに、セラミドはまた、抗微生物剤として作用し得る。スフィンゴシンは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を効果的に死滅させ、Ｐ．エルギノーサを中程度に死滅させた。スフィンゴシンは、整形外科のインプラント材料上のスタフィロコッカス・エピデルミディスバイオフィルムを防止および排除した。スフィンゴシンは、細菌膜カルジオリピンに結合し、増殖を制限する。細菌増殖遅延は、バイオフィルム形成に固有である。スフィンゴシンの誘導体であるＳ－１－Ｐの上昇は、より高いバイオフィルム形成に関連している。

【0119】

ＰＰＡＲδを下方制御するための第３のメカニズムは、ＰＡバイオフィルム誘導性ｍｉＲ－１０６ｂによって与えられた。これは、バイオフィルムの運命を高めるために、皮膚ＰＰＡＲδを無能にし、したがって、宿主代謝プロセスを乗っ取るための、ＰＡバイオフィルムによってうまく調整された取り組みと考えられ得る。特に興味深いのは、この全体的な事象のカスケードが、宿主脂質によって引き起こされるという観察である。それは、皮膚のバリア機能におけるＰＰＡＲδの機能的重要性に関係するため、ＰＰＡＲδのアゴニストの局所適用が、傷害後にこのような機能の回復を加速することが知られている。

【0120】

ＰＰＡＲδによって転写調節される、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターＡＢＣＡ１２は、生物膜を横断する様々な脂質の能動輸送に関与するタンパク質の高度に保存された群をコードする。表皮ケラチノサイトでは、ＰＰＡＲδは、ＡＢＣＡ１２を上方制御する。ＰＡバイオフィルム感染に応答した皮膚創傷部位ＰＰＡＲδの喪失は、損なわれたＡＢＣＡ１２発現に関連していた。修復された皮膚による傷の覆いが達成されている創傷部位では、このＡＢＣＡ１２欠損表皮はまた、脂質の存在量において損なわれていたことが認められた。このような病理学的徴候はまた、損なわれた皮膚バリアに低ＡＢＣＡ１２が関連している、先天性魚鱗癬において報告されている。これは、バイオフィルム感染歴を有する創傷が、閉鎖されたように見えるが、その部位がバリア機能において欠損しているため、機能的には閉鎖されていないという実証と一致している。損なわれたバリア機能を特徴とする、バイオフィルム感染歴を有する閉鎖された創傷部位は、引張強さが弱く、生体力学的に欠損していることが知られている。この観察は、バリア機能が欠損している皮膚が体への病原性アレルゲンの侵入を許容する窓として作用するという報告と総合すると、このような影響を受けた部位が、創傷常習性および全般的健康への他の脅威になりやすい可能性があるという理解を示す。

【0121】

皮膚創傷の状況では、病原性ＰＡバイオフィルム形成は、宿主脂質因子の盗用に依存し、細菌はこの宿主脂質因子を使用して、その増強されたセラミダーゼ系（他の状況では弱い）を作動させ、それを維持する。ＰＡバイオフィルム形成は、その微小環境に高度に応答性であり、そのため、皮膚創傷の状況では、それは、セラミド分解生成物を利用して、バイオフィルム凝集体を増大させた。このプロセスは、宿主脂質に応答した細菌セラミダーゼの大量の誘導によって開始された。スフィンゴシンおよびＳ－１－Ｐなどのこのような代謝の下流生成物は、それぞれ、セラミダーゼの誘導およびＰＰＡＲδの阻害に直接関与していた。ＰＡバイオフィルムはまた、ｍｉＲ－１０６ｂの誘導を介してＰＰＡＲδをサイレンシングした。低ＰＰＡＲδは、ＡＢＣＡ１２発現を制限し、これは、皮膚脂質恒常性の破壊をもたらす。皮膚のバリア機能はこうして損なわれた。感染および創傷の再発の危険性に関する皮膚の機能的欠損におけるこのような欠陥の重要性は、さらなる考察の理由となる。

【0122】

本開示の態様は、以下の列挙される項目のいずれかにおける実施形態として記載され得る。記載される実施形態のいずれも、実施形態が互いに矛盾しない程度に、任意の他の記載される実施形態と関連して使用可能であることが理解される。

【0123】

項目１．治療有効量の細菌セラミダーゼ阻害剤およびセラミドを含む、組成物。
項目２．組成物が、スキンケア組成物である、先行する項目１に記載の組成物。
項目３．組成物が、医薬組成物である、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0124】

項目４．組成物が、制御放出組成物であるように製剤化される、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目５．少なくとも１つの成分が、マイクロカプセル化される、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0125】

項目６．細菌セラミダーゼ阻害剤が、微生物から得られる、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目７．細菌セラミダーゼ阻害剤が、セラミダスチンである、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0126】

項目８．セラミドが、ヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡである、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目９．創傷治癒剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0127】

項目１０．皮膚に許容される１つまたは複数の賦形剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目１１．ステロールをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0128】

項目１２．コレステロールであるステロールをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目１３．精製水をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0129】

項目１４．共役リノール酸および／またはステアリン酸グリセリルである脂肪酸をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目１５．スクアレンである脂肪化合物をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0130】

項目１６．グリセリンであるポリオールをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目１７．ＰＥＧ－１００ステアレートおよび／またはフェノキシエタノールである乳化剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0131】

項目１８．ジメチコンであるシリコーン油をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目１９．ＥＤＴＡ二ナトリウム、ソルビン酸、およびクエン酸からなる群から選択される保存剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0132】

項目２０．クエン酸および水酸化カリウムからなる群から選択されるｐＨ調整剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目２１．キサンタンガムである増粘剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0133】

項目２２．組成物が、クリーム、ローション、セラム、バーム、ゲル（局所適用のため）、顆粒、粉末、ペースト、液体製剤、シロップ、溶液、エマルション、および懸濁液から選択される局所製剤である、先行する項目のいずれかに記載の組成物。

【0134】

項目２３．組成物の１つまたは複数の成分が、マイクロカプセル化される、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
項目２４．皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における皮膚状態を処置する方法であって、皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における皮膚状態に、治療有効量の、細菌セラミダーゼ阻害剤およびセラミドのうちの少なくとも１つを含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【0135】

項目２５．投与するステップが、組成物の局所投与を含む、先行する項目２４に記載の方法。
項目２６．皮膚状態が、加齢皮膚である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。

【0136】

項目２７．皮膚状態が、糖尿病皮膚である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。
項目２８．皮膚状態が、創傷である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。

【0137】

項目２９．皮膚状態が、哺乳動物の下肢上の創傷である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。
項目３０．皮膚状態が、慢性創傷である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。

【0138】

項目３１．皮膚状態が、開放創傷である、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。
項目３２．開放創傷が、多微生物バイオフィルム感染を含む、先行する項目２４～２５のいずれかに記載の方法。

【0139】

項目３３．開放創傷が、低下したセラミドを含む、先行する項目２４～３２のいずれかに記載の方法。
項目３４．開放創傷が、シュードモナス・エルギノーサを含むバイオフィルム感染を含む、先行する項目２４～３３のいずれかに記載の方法。

【0140】

項目３５．開放創傷が、熱傷である、先行する項目２４～３４のいずれかに記載の方法。
項目３６．皮膚状態が、閉鎖創傷である、先行する項目２４～３５のいずれかに記載の方法。

【0141】

項目３７．閉鎖創傷が、熱傷である、項目３６に記載の方法。
項目３８．皮膚状態が、２週間未満閉鎖されている閉鎖創傷である、先行する項目３５～３６のいずれかに記載の方法。

【0142】

項目３９．哺乳動物が、ヒト、霊長類、ラット、マウス、ウサギおよびモルモット、イヌ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、先行する項目２４～３８のいずれかに記載の方法。

【0143】

項目４０．哺乳動物が、ヒトである、先行する項目２４～３９のいずれかに記載の方法。
項目４１．投与される組成物が、処置される皮膚における皮膚バリア機能を増加させる、先行する項目２４～４０のいずれかに記載の方法。

【0144】

項目４２．投与される組成物が、処置される皮膚における経表皮水分喪失を低下させる、先行する項目２４～４１のいずれかに記載の方法。
項目４３．投与される組成物が、処置される皮膚における皮膚バリア機能を増加させ、皮膚バリア機能が、皮膚バリア完全性である、先行する項目２４～４２のいずれかに記載の方法。

【0145】

項目４４．細菌セラミダーゼ阻害剤が、組成物の総重量に関して、約０．００１重量％～約１０重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４３のいずれかに記載の方法。

【0146】

項目４５．細菌セラミダーゼ阻害剤が、組成物の総重量に関して、約０．０１重量％～約５重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４４のいずれかに記載の方法。
項目４６．細菌セラミダーゼ阻害剤が、組成物の総重量に関して、約０．１重量％～約０．５重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４５のいずれかに記載の方法。

【0147】

項目４７．セラミドが、組成物の総重量に関して、約０．００１重量％～約１０重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４６のいずれかに記載の方法。
項目４８．セラミドが、組成物の総重量に関して、約０．０１重量％～約５重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４７のいずれかに記載の方法。

【0148】

項目４９．セラミドが、組成物の総重量に関して、約０．１重量％～約０．５重量％の範囲の量で投与される、先行する項目２４～４８のいずれかに記載の方法。
項目５０．陰圧創傷療法が、処置に付随する、先行する項目２４～４９のいずれかに記載の方法。

【0149】

項目５１．微生物病原体リパーゼ活性の阻害剤、
セラミド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、遊離脂肪酸、およびトリグリセリドからなる群から選択される表皮脂質、および
薬学的に許容される担体
を含む、組成物。

【0150】

項目５２．項目１～２３の成分のいずれかを個別にまたは組み合わせてさらに含む、項目５１に記載の組成物。
項目５３．任意選択で、抗微生物剤が抗生物質である、抗微生物剤をさらに含む、項目５１または５２に記載の組成物。

【0151】

項目５４．表皮脂質が、

【0152】

【化4】

【0153】

［式中、Ｒは、－（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）、－（ＣＨＯＨ）（ＣＨ_２）_{１８～２９}（ＣＨ_３）または－（ＣＨ_２）_{１８～３０}Ｏ（ＣＯ）（ＣＨ_２）_７（ＣＨ＝ＣＨ）ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨ）（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３である］
の一般構造を有するセラミドである、項目５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【0154】

項目５５．セラミダーゼ阻害剤が、セラミダスチンまたはヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡである、項目５１～５４のいずれか一項に記載の組成物。
項目５６．組成物が、局所適用のための、クリーム、軟膏、バーム、ローションまたはペーストとして製剤化される、項目５１～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【0155】

項目５７．セラミダーゼ阻害剤が、その開示内容が本明細書に明示的に組み込まれる、公開された米国出願第２０１８０３６９２１１号および同第２０１１０２５１１９７号に開示されるものを含む、任意の公知のセラミダーゼ阻害剤から選択される、項目１～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【0156】

項目５８．損なわれたバリア機能に関連する皮膚状態の処置を必要とする哺乳動物における、損なわれたバリア機能に関連する皮膚状態を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療有効量の項目１～２３および５１～５７の組成物のいずれかを投与するステップを含む、方法。

【0157】

項目５９．皮膚状態が、創傷であり、投与ステップが、前記組成物を創傷に局所適用することを含み、任意選択で、創傷が、微生物病原体に感染しており、任意選択で、微生物病原体が、シュードモナス・エルギノーサである、項目５８に記載の方法。

【0158】

項目６０．細菌病原体による感染の危険性があるかまたは細菌病原体に感染している創傷を処置する方法であって、前記創傷に関連する組織を、治療有効量の項目１～２３および５１～５７の組成物のいずれかと接触させるステップを含む、方法。

【0159】

項目６１．前記創傷に関連する組織を、局所適用される組成物と接触させ、任意選択で、創傷が、微生物病原体に感染しており、任意選択で、微生物病原体が、シュードモナス・エルギノーサである、項目６０に記載の方法。

【0160】

他のバリエーションまたは実施形態は、上の記載から当業者には明らかである。したがって、上述の実施形態は、特許請求される発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。開示されるすべての参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図7J】

【図7K】

【図7L】

【図7M】

【図7N】

【図7O】

【図7P】

【図7Q】

【図7R】

【図7S】

【図7T】

【図7U】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図8J】

【図8K】

【図8L】

【図8M】

【図8N】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図11K】

【図11L】

【図11M】

【図11N】

【図11O】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【国際調査報告】