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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】肺障害におけるＷＮＴシグナル伝達の調整
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240905BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240905BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240905BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240905BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61P11/00
A61P29/00
A61P43/00 107
A61P43/00 121
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/13
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515380
(86)(22)【出願日】2022-09-14
(85)【翻訳文提出日】2024-05-01
(86)【国際出願番号】 US2022076437
(87)【国際公開番号】W WO2023044348
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】63/244,071
(32)【優先日】2021-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/346,738
(32)【優先日】2022-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519271621
【氏名又は名称】スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フレッチャー， ラッセル
(72)【発明者】
【氏名】ライ， クオ－パオ
(72)【発明者】
【氏名】リー， ヤン
(72)【発明者】
【氏名】イェー， ウェン－チェン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路のモジュレーターを用いて肺障害を処置する方法を提供する。関連する投与方法の方法および医薬組成物も提供される。本発明は、部分的には、ＡＴ２／ＡＴ１移行状態細胞、異常な基底類似細胞、および／または疾患関連ＳＣＧＢ３Ａ２＋呼吸細気管支分泌細胞などの疾患特異的肺上皮細胞の病原性表現型に影響を及ぼし、続いてＡＴ２細胞およびＡＴ１上皮細胞（ＡＴ１細胞）の再生をもたらし、健康な肺組織を再生するためのＷｎｔアゴニストおよびアンタゴニストの使用に基づく。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肺障害を罹患している対象を処置する方法であって、操作されたＷｎｔアンタゴニストおよび／または操作されたＷｎｔアゴニストを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項2】
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが併せて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが逐次的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｗｎｔアゴニストが前記Ｗｎｔアンタゴニストの前に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｗｎｔアンタゴニストが前記Ｗｎｔアゴニストの前に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記肺障害が間質性肺疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記肺障害が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＣＯＰＤが、慢性気管支炎、気腫、および慢性喘息からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが組織標的化分子を組み込む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記操作されたＷｎｔアゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記操作されたＷｎｔアゴニストが組織標的化分子を組み込み、必要に応じて、前記組織が肺組織である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体または抗体断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記障害が肺線維症であり、前記対象が前記Ｗｎｔアンタゴニストで処置される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記障害が肺線維症であり、前記対象が、前記Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジン模倣物、または前記Ｗｎｔアゴニストと組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサーもしくはＲ－スポンジン模倣物との組み合わせで処置される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｗｎｔアゴニストおよび／または前記Ｗｎｔアンタゴニストが、マルチＦＺＤ特異的またはモノＦＺＤ特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＦＺＤ５、８またはＦＺＤ１、２、７に特異的であり、前記障害が、肺線維症および／またはＣＯＰＤなどの間質性肺疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記Ｗｎｔアゴニストまたは前記Ｗｎｔアンタゴニストが、ＦＺＤ４モノ特異的またはＦＺＤ５モノ特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記障害がＣＯＰＤであり、前記対象が前記Ｗｎｔアゴニストで処置される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年９月１４日に出願された米国仮出願第６３／２４４，０７１号および２０２２年５月２７日に出願された米国仮出願第６３／３４６，７３８号の優先権を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月１４日に出願された米国仮出願第６３／２４４，０７１号および２０２２年５月２７日に出願された米国仮出願第６３／３４６，７３８号の優先権を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表ＸＭＬは、ＸＭＬファイル形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表ＸＭＬを含有するＸＭＬファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿０１１＿０４ＷＯ＿ＳＴ２６．ｘｍｌである。ＸＭＬファイルは、１６，６０７バイトであり、２０２２年９月１３日に作成され、ＵＳＰＴＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表ＸＭＬは、ＸＭＬファイル形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表ＸＭＬを含有するＸＭＬファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿０１１＿０４ＷＯ＿ＳＴ２６．ｘｍｌである。ＸＭＬファイルは、１６，６０７バイトであり、２０２２年９月１３日に作成され、ＵＳＰＴＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して電子的に提出されている。
【0003】
発明の分野
本発明は、肺障害、特に、例えば肺線維症およびＣＯＰＤの処置としてのＷｎｔシグナルのモジュレーターを提供する。
本発明は、肺障害、特に、例えば肺線維症およびＣＯＰＤの処置としてのＷｎｔシグナルのモジュレーターを提供する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
肺胞の生成は、哺乳動物におけるガス交換を担う複雑な構造を作り出すために、複数の細胞系統間の入り組んだ相互作用を必要とする。上皮細胞、間葉細胞および内皮細胞の系統が組み合わさって、マウスにおいて胚性１６．５日目（Ｅ１６．５）頃から始まる分岐した気道の遠位先端の嚢状構造を拡大する。その後すぐに、この基本的な構造が再構築され、上皮細胞および間葉細胞のコミュニケーションを促進し、発達中の血管網の統合を助ける。肺胞のリモデリングは、肺胞の１型（ＡＴ１）上皮細胞および２型（ＡＴ２）上皮細胞の特定および成熟と同時に起こり、マウスでは生後３０日目（ＰＮ３０）に、ヒトでは青年期に肺が成熟するまで、生後も継続する。分岐形態形成を含む肺発達の初期段階の広範な知識にもかかわらず、肺胞の正常な生成を支配する細胞系統特異的相互作用および分子経路についてはほとんど知られていない。この過程の破壊は有害であり得、気管支肺異形成（ＢＰＤ）などの新生児疾患、ならびに特発性肺線維症（ＩＰＦ）および慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）の成人障害をもたらし得る。
肺胞の生成は、哺乳動物におけるガス交換を担う複雑な構造を作り出すために、複数の細胞系統間の入り組んだ相互作用を必要とする。上皮細胞、間葉細胞および内皮細胞の系統が組み合わさって、マウスにおいて胚性１６．５日目（Ｅ１６．５）頃から始まる分岐した気道の遠位先端の嚢状構造を拡大する。その後すぐに、この基本的な構造が再構築され、上皮細胞および間葉細胞のコミュニケーションを促進し、発達中の血管網の統合を助ける。肺胞のリモデリングは、肺胞の１型（ＡＴ１）上皮細胞および２型（ＡＴ２）上皮細胞の特定および成熟と同時に起こり、マウスでは生後３０日目（ＰＮ３０）に、ヒトでは青年期に肺が成熟するまで、生後も継続する。分岐形態形成を含む肺発達の初期段階の広範な知識にもかかわらず、肺胞の正常な生成を支配する細胞系統特異的相互作用および分子経路についてはほとんど知られていない。この過程の破壊は有害であり得、気管支肺異形成（ＢＰＤ）などの新生児疾患、ならびに特発性肺線維症（ＩＰＦ）および慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）の成人障害をもたらし得る。
【0005】
Ｗｎｔシグナル伝達は、複数の器官における幹細胞の自己再生および特定にとって大切な重要な経路である。Ｗｎｔ経路の構成成分は、初期肺発達中に特定のパターンで発現され、以前の研究は、肺内胚葉の特定および初期発達におけるＷｎｔシグナル伝達の本質的な役割を実証している。しかしながら、Ｗｎｔシグナル伝達が肺上皮の分化および成熟の後期段階において果たす役割は、依然として解明されていない。新規Ｗｎｔシグナル伝達レポーターマウス株（Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２－ＴｄＴｏｍ）は、肺胞形成中のＷｎｔシグナル伝達のこれまで知られていない波を明らかにした（Ｆｒａｎｋら、２０１６；Ｎａｂｈａｎら、２０１８）。この細胞株は、肺胞形成の開始時に出現するＡＴ２ｓＡｘｉｎ２と呼ばれるＡＴ２上皮細胞の亜系統を定義した。ＡＴ２ｓＡｘｉｎ２上皮細胞は、エクスビボアッセイにおいて肺オルガノイド形成を促進し、肺胞形成中にインビボでより大きなクローン成長能を有するようである。重要なことに、ＡＴ２上皮細胞集団全体におけるＷｎｔシグナル伝達の活性化は、同様の自己再生応答を誘発し、オルガノイド形成の増強、増殖の増加、および肺胞形成中のクローン拡大の増加を促進する。逆に、ＡＴ２上皮細胞系統全体におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害は、オルガノイド形成およびＡＴ２上皮細胞の自己再生を阻害し、それらの分化をＡＴ１上皮細胞系統に向けて迂回させる。増殖によるＡＴ２上皮細胞集団の拡大、およびその後のＡＴ１上皮細胞への分化を通して、肺胞形成中のＷｎｔアゴニストおよびアンタゴニストのシグナル伝達の両方について重要な役割のバランスをとる必要がある。
【0006】
ＣＯＰＤ患者では、肺胞上皮（したがって、ガス交換界面）が有意に低減し、いくらかの細気管支線維症および炎症も存在する（Ｂａｒｎｅｓら、２０１５）。ＣＯＰＤ肺は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達構成成分および活性の低減を示す（Ｈ Ａ ＢａａｒｓｍａおよびＫｏｎｉｇｓｈｏｆｆ ２０１７；Ｓｈｉら、２０１７；Ｒ．Ｗａｎｇら、２０１１）。エラスターゼおよび喫煙などのＣＯＰＤのマウスモデルでは、Ｗｎｔシグナル伝達の小分子アクチベーターの使用は、ＡＴ２細胞および肺胞を回復させ、気腔拡張の量を低減させるようであった（Ｋｎｅｉｄｉｎｇｅｒら、２０１１；Ｃｏｎｌｏｎら、２０２０．したがって、標的化Ｗｎｔ活性化は、ＣＯＰＤにおいてＡＴ２細胞を再生し、肺胞を回復させるという治療上の利点を提供し得る。
【0007】
ＩＰＦは、線維性病巣の蓄積およびＡＴ２上皮細胞過形成を特徴とする（Ｋｉｎｇ、Ｐａｒｄｏ、およびＳｅｌｍａｎ ２０１１）。ＴＧＦβシグナル伝達に加えて、間葉／線維芽細胞における過剰に活性なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が、細胞外マトリックスの過剰産生および線維性病巣形成に寄与すると考えられている（Ｃｈｉｌｏｓｉら、２００３；Ｓｈｉら、２０１７；Ｈ Ａ ＢａａｒｓｍａおよびＫｏｎｉｇｓｈｏｆｆ ２０１７）。単一細胞解像度で行われた最近の研究はこの見解と一致しており、特定の間葉亜集団における過剰に活性なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が線維形成遺伝子発現プログラムをもたらし得ることを実証している（Ｚｅｐｐら、２０１７）。肺胞上皮において、ＩＰＦにおけるＡＴ２過形成に関連する上皮細胞は、ＡＴ１細胞およびＡＴ２細胞の両方の混合系統特徴を示すという証拠がある（Ｘｕら、２０１６）。重要なことに、Ｗｎｔ／β－カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ－２を発現するＡＴ２上皮細胞のサブセットは、幹細胞／前駆細胞（気道上皮前駆細胞（ＡＥＰ）と呼ばれる）であり、ＡＴ２／ＡＥＰ上皮細胞増殖は、能動的なＷｎｔシグナル伝達を必要とする（Ｂａｒｋａｕｓｋａｓら、２０１３；Ｄｅｓａｉ、Ｂｒｏｗｎｆｉｅｌｄ、およびＫｒａｓｎｏｗ ２０１４；Ｚａｃｈａｒｉａｓら、２０１８；Ｎａｂｈａｎら、２０１８）。さらに、成体肺の固有およびオルガノイド培養研究では、ＡＴ１上皮細胞は、ＡＴ１細胞に分化するＡＴ２上皮細胞に由来し、これにはＷｎｔシグナル伝達の減弱が必要である（Ｒｏｃｋら、２０１１；Ｎａｂｈａｎら、２０１８；Ｚａｃｈａｒｉａｓら、２０１８）。ＡＴ２細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の活性化は、それらの拡大を促進することによって治療上の利益を提供することができ、次いで、ＡＴ１細胞へのそれらの分化の際に、肺疾患における肺胞の回復をもたらすことができる。
【0008】
いくつかの研究は、異常な基底類似細胞およびＡＴ２上皮細胞からＡＴ１上皮細胞への分化への移行において一時停止し、ＩＰＦ肺における細胞外マトリックスの産生に寄与すると思われる細胞の存在を示しており、これらは重複する集団であり得る（Ａｄａｍｓら、（２０２０）；Ｓｔｒｕｎｚら、（２０２０）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、（２０２０）；Ｈａｂｅｒｍａｎら、（２０２０））。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達の調整は、ＬＰＳまたはブレオマイシン傷害の際の肺のマクロファージの炎症状態に影響を及ぼすという証拠もある（Ｚｈｏｕら、２０２０）。肺線維症およびＩＰＦのための理想的な治療アプローチは、ＡＴ２／ＡＥＰ上皮細胞再生を促進し、ＡＴ２上皮細胞からＡＴ１上皮細胞への運命変換を促進しながら、筋線維芽細胞媒介性および疾患特異的上皮細胞媒介性のマトリックス産生を制限し、抗炎症性マクロファージ表現型を促進することである。
【0009】
最近のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ研究は、ＡＴ２移行状態（ＡＴ０）およびＳＣＧ３ＢＡ２＋終末呼吸細気管支分泌細胞を同定し、それらの分析は、ヒトおよび霊長類のＡＴ２細胞が、ＡＴ０移行状態を通過することによって、ＡＴ１細胞ならびに終末呼吸細気管支分泌細胞に分化することができることを見出し、ＡＴ２細胞の複能性を実証した［Ｍｕｒｔｈｙら、２０２２］。ヒトＩＰＦ試料では、ＡＴ０およびＳＣＧ３ＢＡ２＋終末呼吸細気管支細胞が線維性領域に富化されていた［Ｍｕｒｔｈｙ ２０２２］。培養において、ＡＴ２細胞がＡＴ０細胞および終末細気管支分泌細胞を形成するためには、Ｗｎｔ活性化またはＥＧＦの枯渇が必要であった［Ｍｕｒｔｈｙ ２０２２］。遠位ヒト肺の別の最近のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析ではまた、ＳＣＧＢ３Ｂ２を発現する終末呼吸細気管支分泌細胞の亜集団が同定され、これを呼吸気道分泌（ＲＡＳ）細胞と名付けた。彼らのオルガノイド培養研究は、ＲＡＳ細胞がインビトロでＡＴ２細胞に分化することができ、これがＷｎｔシグナル伝達を活性化することによって確実に増強されたという証拠を提供した［Ｂａｓｉｌら、２０２２］。まとめると、これらの知見は、移行状態、疾患に関連する異常な上皮細胞、または終末呼吸細気管支分泌細胞においてＷｎｔシグナル伝達を活性化することが、それらをＡＴ２細胞に分化させ、最終的に肺胞の回復をもたらし、線維症を制限するように導くことができるかもしれないことを示唆している。
【0010】
したがって、特定の肺細胞集団におけるＷｎｔシグナル伝達の標的化されたアンタゴニズムおよび／またはアゴニズムの機構を確立することは、線維性肺疾患において大きな治療上の利益を提供し得る。例えば、疾患特異的遠位肺上皮細胞（移行状態細胞、異常な基底類似細胞、または疾患関連終末細気管支呼吸細胞）におけるＷｎｔシグナル伝達の標的化されたアンタゴニズムおよび／またはアゴニズムのための機構を確立して、ＡＴ２上皮細胞を形成させるか、またはＡＴ１上皮細胞に分化させることにより、線維性肺疾患およびＣＯＰＤにおける線維症を低減させるという治療上の利益を提供することができる。特定の線維芽細胞集団の標的化されたアンタゴニズムおよび／またはアゴニズムのための方法を確立することにより、それらの線維形成促進活性を低減させることができた。
【0011】
さらに、抗炎症表現型および効果を促進するために、マクロファージを含む常在および／または浸潤免疫細胞に対する標的化Ｗｎｔシグナル伝達アゴニズムの機構を確立することは、線維性肺疾患およびＣＯＰＤにおいて線維症を低減させ、肺胞再生を促進するための治療上の利益を提供し得る。
【0012】
さらに、ＦＺＤ４調節を介したＷｎｔシグナル伝達の調整は、ＣＯＰＤモデルにおける肺胞修復に影響を及ぼすことが示唆されている（Ｓｋｒｏｎｓｋａ－Ｗａｓｅｋら、（２０１７）。したがって、ＦＺＤ４の富化を示す、内皮細胞上の標的化されたアゴニズムまたはアンタゴニズムのための方法を確立することは（例えば、Ａｄａｍｓら（２０２０）、前出を参照）、線維性肺疾患における線維症を低減させるための治療的利益を提供し得る。
【0013】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニズムとアンタゴニズムとの間のバランスを標的化された様式で調節するための組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の概要
本発明は、一部には、肺ＡＴ２上皮細胞（ＡＴ２細胞）の増殖を調節し、続いてこれらの細胞をＡＴ１上皮細胞（ＡＴ１細胞）に分化させて健康な肺組織を再生するためのＷｎｔアゴニストおよびアンタゴニストの使用に基づく。
本発明は、一部には、肺ＡＴ２上皮細胞（ＡＴ２細胞）の増殖を調節し、続いてこれらの細胞をＡＴ１上皮細胞（ＡＴ１細胞）に分化させて健康な肺組織を再生するためのＷｎｔアゴニストおよびアンタゴニストの使用に基づく。
【0015】
本発明は、部分的には、ＡＴ２／ＡＴ１移行状態細胞、異常な基底類似細胞、および／または疾患関連ＳＣＧＢ３Ａ２＋呼吸細気管支分泌細胞などの疾患特異的肺上皮細胞の病原性表現型に影響を及ぼし、続いてＡＴ２細胞およびＡＴ１上皮細胞（ＡＴ１細胞）の再生をもたらし、健康な肺組織を再生するためのＷｎｔアゴニストおよびアンタゴニストの使用に基づく。
【0016】
本発明は、一部には、肺における免疫細胞の応答を調節して炎症を制限し、肺ＡＴ２細胞の増殖およびその後のＡＴ１細胞への分化を助長して健康な肺組織を再生する環境を提供するためのＷｎｔアンタゴニストおよびアゴニストの使用に基づく。
【0017】
一態様では、本発明は、肺障害を罹患している対象を処置する方法であって、操作されたＷｎｔアンタゴニストおよび／または操作されたＷｎｔアゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、肺障害は間質性肺疾患であり、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、急性呼吸窮迫症候群から選択することができる。他の実施形態では、肺障害は、慢性気管支炎、気腫、および慢性喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【0018】
一定の実施形態では、対象に、Ｗｎｔアンタゴニストのみを投与する（すなわち、Ｗｎｔアゴニストを投与しない）。特定の実施形態では、対象に、例えば、肺線維症によって引き起こされる障害を処置するために、Ｗｎｔアンタゴニストのみを投与する。特定の実施形態では、活性化筋線維芽細胞などの線維化促進細胞を標的とすることが線維化を制限し得る肺線維症によって引き起こされる障害を処置するために、対象にＷｎｔアンタゴニストのみを投与する。
【0019】
一定の実施形態では、対象に、Ｗｎｔアゴニストのみを投与する（すなわち、Ｗｎｔアンタゴニストを投与しない）。一定の実施形態では、対象に、例えば、ＣＯＰＤによって引き起こされる障害を処置するために、Ｗｎｔアゴニストのみを投与する。他の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストのみを使用して、肺線維症によって引き起こされる障害を処置することができる。
【0020】
一定の実施形態では、本方法は、ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストの両方を投与することを含む。特定の実施形態では、ＷｎｔアンタゴニストおよびＷｎｔアゴニストは逐次的に投与され、他の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストは併せて投与される。一定の実施形態では、逐次的に投与される場合、Ｗｎｔアンタゴニストは、Ｗｎｔアゴニストの前に投与される。一定の実施形態では、逐次的に投与される場合、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔアンタゴニストの前に投与される。一定の実施形態では、対象は、例えば、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、および急性呼吸窮迫症候群から選択され得る間質性肺疾患を処置するために、ＷｎｔアンタゴニストおよびＷｎｔアゴニストを投与される。他の実施形態では、対象は、例えば、慢性気管支炎、気腫、および慢性喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置するために、ＷｎｔアンタゴニストおよびＷｎｔアゴニストを投与される。
【0021】
本明細書に開示される方法の特定の実施形態では、操作されたアンタゴニストは、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される。特定の実施形態では、操作されたアゴニストは、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、および小分子からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＷｎｔアンタゴニストおよびＷｎｔアゴニストは、１つの分子上にある。
【0022】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストおよび／またはＷｎｔアゴニストは、組織標的化分子を組み込む。一定の実施形態では、組織標的化分子は、組織または細胞特異的細胞表面分子に結合する抗体またはその断片であり得る。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図5A】図５Ａおよび図５Ｂは、Ｓｕｒｒｏｚｅｎ Ｗｎｔ活性化タンパク質（ＳＷＡＰ）である表１のＳＷＡＰ１が、インビトロアッセイにおいてＡＴ２増殖および肺胞オルガノイド成長を促進する能力を示す。図５Ａの２つの上の画像は、異なる倍率でのＡＴ２オルガノイドの顕微鏡写真である。図５Ａの２つの下の画像は、ＡＴ２オルガノイドにおけるヒトＡＴ２細胞マーカーＨＴＩＩ－２８０の発現および免疫蛍光によって評価したＫＩ６７発現を示す。図５Ｂは、対照細胞およびＲＳＰＯ１、ＳＷＡＰ１＋ＲＳＰＯ１、またはＣＨＩＲ９９０２１で処理した細胞の細胞生存率を示すグラフである。ＡＴ２オルガノイドは、ヒトＡＴ２細胞マーカーＨＴＩＩ－２８０を発現し、培地中で増殖する（ＫＩ６７＋細胞）。ＲＳＰＯ１と組み合わせた、ＦＺＤ１、２、５、７、８特異的Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストタンパク質（ＳＷＡＰ）であるＳＷＡＰ１は、培養物成長を反映する細胞生存率の尺度であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイによって評価されるように、ＡＴ２オルガノイド培養物を拡大させる。ＳＷＡＰ１／ＲＳＰＯ１は、Ｗｎｔシグナル伝達のアクチベーターである小分子ＣＨＩＲ９９０２１よりも有効である。
【図5B】同上。
【0028】
【0029】
【図7】図７は、急性ブレオマイシンマウスモデルにおいて線維性である肺の面積を低減させ、線維症の重症度を低下させるＦＺＤ１、２、５、７、８特異的ＳＷＡＰ５／ＲＳＰＯの組み合わせを介したＷｎｔシグナル伝達活性化の能力を示す。この図は、ブレオマイシン誘発の動物急性肺傷害モデルにおける投与スキームを示す。ブレオマイシンを時間０で投与し、生理食塩水、抗ＧＦＰ抗体、またはＦＺＤマルチＦｚｄ特異的ＳＷＡＰ５＋ＲＳＰＯの組み合わせを第１週と第３週との間に４回投与し、３週間後に終了および採血を行った。左のグラフは、示された処置後の線維症に罹患した肺のパーセントを示し、右のグラフは、示された処置後の線維症スコアを示す。急性ブレオマイシンモデルにおける線維化の程度の低減は、ＳＷＡＰ５／ＲＳＰＯの組み合わせ（コンボ）を使用して見られた。
【0030】
【図8A】図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれＦＺＤ１、２、７およびＦＺＤ５、８に特異的なＳＷＡＰ２およびＳＷＡＰ３が単独で（ＲＳＰＯの非存在下で）用量依存的にヒトＡＴ２細胞オルガノイド拡大を誘導する能力を示す。ＳＷＡＰ処理単独では、小分子経路アクチベーターＣｈｉｒ９９０２１よりも多くのＡＴ２オルガノイド拡大を誘導した（図８Ａ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（図８Ｂ）を用いてオルガノイドの拡大を評価した。
【図8B】同上。
【0031】
【0032】
【図10A】図１０Ａ～図１０Ｄは、急性ブレオマイシン肺傷害マウスモデルにおいて線維性である肺の面積を低減させ、線維症の重症度を低下させるＦＺＤ１、２、５、７、８特異的ＳＷＡＰ５単独およびＲＳＰＯ２単独を介したＷｎｔシグナル伝達活性化の能力を示す。図１０Ａは、ブレオマイシン誘発急性肺傷害動物モデルにおける投与スキームを示す。ブレオマイシンを時間０で投与し、生理食塩水、抗ＧＦＰ抗体、マルチＦｚｄ特異的ＳＷＡＰ５、またはＲＳＰＯ２単独を２つの異なる用量のうちの１つで、１週目と３週目との間に４回投与し、３週間後に終了および採血を行った。図１０Ｂは、示された処置後の修正Ａｓｈｃｒｏｆｔ線維症スコアを示す。図１０Ｃは、示された処置後の線維症に罹患した肺のパーセントを示す。図１０Ｄは、肺における全平滑筋α－アクチン（ＡＣＴＡ２）発現のパーセンテージを示す（ＡＣＴＡ２発現は、線維症に寄与する細胞外マトリックスを分泌する筋線維芽細胞と相関する。例えば、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（１９８９）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．６０：６４３－６５０を参照）。急性ブレオマイシンモデルにおける線維化の程度の低減は、ＳＷＡＰ５単独およびＲＳＰＯ２単独を使用して見られた。抗ＧＦＰ処置条件に対して統計的比較を行う。
【図10B-D】同上。
【0033】
【図11A】図１１Ａ～図１１Ｈは、急性ブレオマイシンマウスモデルにおいて線維性である肺の面積を低減させ、線維症の重症度（修正Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア）を低下させるＦＺＤ５、８特異的ＳＷＡＰ（ＳＷＡＰ３）単独を介したＷｎｔシグナル伝達活性化の能力を示す。図１１Ａは、ブレオマイシン誘発急性肺傷害動物モデルにおける投与の概略図を示す。ブレオマイシンを時間０で投与し、抗ＧＦＰ抗体、マルチＦｚｄ特異的ＳＷＡＰ５、またはＦｚｄ５、８特異的ＳＷＡＰ単独を３つの異なる用量のうちの１つで、１週目と３週目との間に４回投与し、３週間後に終了および採血を行った。図１１Ｂは、示された処置後の修正Ａｓｈｃｒｏｆｔ線維症スコアを示す。図１１Ｃは、示された処置後の線維症に罹患した肺のパーセントを示す。急性ブレオマイシンモデルにおける線維化の程度の低減は、ＳＷＡＰ３単独を使用して見られた。図１１Ｄは、ブレオマイシン傷害マウスモデルにおいて、ＡＣＴＡ２のパーセントで測定した場合のＳＷＡＰ３による線維化の低減を示す。図１１Ｅは、Ｈ＆Ｅに基づく病理スコアによるヘマトキシリンおよびエオシン染色組織切片の組織病理評価に基づく線維症の低減を伴う炎症の低減を強調している。図１１Ｆ～図１１Ｈは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームによって評価される急性ブレオマイシンマウス線維症モデルの肺組織におけるサイトカイン（それぞれＩＬ６、ＩＬ１Ｂ、ＧＲＯ／ＣＸＣＬ１）の低減を示す。定量化には、体重減少のため早期に終了した動物を含め、処置した全ての動物が含まれた。抗ＧＦＰ処置条件に対して統計的比較を行う。
【図11B-C】同上。
【図11D】同上。
【図11E】同上。
【図11F-H】同上。
【0034】
【図12A】図１２Ａ～図１２Ｂは、急性ブレオマイシンマウスモデルにおいて線維性である肺の面積を低減させ、線維症の重症度（修正Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア）を低下させるＦＺＤ１、２、７特異的ＳＷＡＰ（ＳＷＡＰ６）単独を介したＷｎｔシグナル伝達活性化の能力を示す。図１２Ａは、ブレオマイシン誘発急性肺傷害動物モデルにおける投与スキームを示す。ブレオマイシンを時間０で投与し、抗ＧＦＰ抗体、マルチＦｚｄ特異的ＳＷＡＰ５、またはＦｚｄ１、２、７特異的ＳＷＡＰ６単独を３つの異なる用量のうちの１つで、１週目と３週目との間に４回投与し、３週間後に終了および採血を行った。図１２Ｂは、示された処置後の修正Ａｓｈｃｒｏｆｔ線維症スコアを示す。ＳＷＡＰ６は、急性ブレオマイシンモデルにおいて線維化の程度の低減の傾向を生じさせた。定量化には、体重減少のため早期に終了した動物を含め、処置した全ての動物が含まれた。
【図12B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0035】
詳細な説明
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、それらの対応する複数の言及を含む。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、それらの対応する複数の言及を含む。
【0036】
本明細書に引用される全ての参考文献は、あたかも各個々の刊行物、特許出願または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。
Ｉ．定義
Ｉ．定義
【0037】
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調整などを記載または指すことができる。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば接着を調整もしくは維持する活性、または細胞、例えば細胞膜もしくは細胞骨格の構造を維持する活性を指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］などを意味し得る。
【0038】
本明細書で使用される「投与する」または「導入する」または「提供する」という用語は、対象の１つの細胞、複数の細胞、組織および／または器官への、または対象への組成物の送達を指す。そのような投与または導入は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで行われ得る。
【0039】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原エピトープに特異的に結合するのに必要な可変領域配列を含む単離されたまたは組換え結合剤を意味する。したがって、抗体は、所望の生物学的活性を示す、例えば特異的標的抗原に結合する任意の形態の抗体またはその断片である。したがって、それは最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２を含むがこれらに限定されない抗体断片を包含する。抗体は、抗体またはその断片を含む融合ポリペプチドおよび関連分子をさらに含む。
【0040】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、例えばインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（例えば、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残りの「Ｆｃ」断片とを生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。抗体断片には、インタクトな抗体と同じ抗原に結合する機能的断片が含まれる。
【0041】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合されることができ、３０さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物において使用されることができる、分子または分子の一部を指す。一定の実施形態では、結合剤（例えば、Ｗｎｔ代用分子もしくはその結合領域、またはＷｎｔアンタゴニスト）は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【0042】
本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原、特に１またはそれを超えるＦｚｄ受容体、またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６に結合する、免疫グロブリン重鎖および／もしくは軽鎖の、またはナノボディ（登録商標）（Ｎａｂ）の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。これに関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、１またはそれを超えるＦｚｄ受容体またはＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する抗体由来のＶＨおよびＶＬの１、２、３、４、５または６つすべてのＣＤＲを含み得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、「生物学的活性」および「生物学的に活性」という用語は、細胞内の特定の生物学的エレメントに起因する活性を指す。例えば、Ｗｎｔアゴニストまたはその断片もしくはバリアントの「生物学的活性」は、Ｗｎｔシグナルを模倣または増強する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントの生物学的活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントが、例えば、結合、酵素活性などのそのネイティブの機能を実行する能力を指す。第３の例として、遺伝子調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列など）の生物学的活性は、調節エレメントまたはその機能的断片もしくはバリアントが、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現をそれぞれ調節する、すなわち、その翻訳をそれぞれ促進する、増強する、または活性化する能力を指す。
【0044】
本明細書で使用される「二機能性抗体」という用語は、１つの抗原部位に対する特異性を有する第１のアームと、異なる抗原部位に対する特異性を有する第２のアームとを含む抗体を指し、すなわち、二機能性抗体はデュアル特異性を有する。
【0045】
「二重特異性抗体」は、本明細書において、クアドロマ技術によって（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７－５４０（１９８３）を参照）、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーションによって（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４（６０１２）：６２８－６３１（１９８５）を参照）、またはＦｃ領域に変異を導入するノブ・イントゥ・ホールもしくは同様の手法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）によって生成され、複数の異なる免疫グロブリン種をもたらし、そのうちの１つのみが機能的二重特異性抗体である、完全長抗体を指すために使用される。二重特異性抗体は、その２つの結合アームの一方（ＨＣ／ＬＣの一方の対）で１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第２のアーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）で異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義により、二重特異性抗体は、（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）２つの異なる抗原結合アームを有し、結合する各抗原に対して一価である。
【0046】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、列挙されたエレメントが、例えば、組成物、方法、キットなどに必要とされることを意味するが、例えば、特許請求の範囲内の組成物、方法、キットなどを形成するために他のエレメントが含まれてもよい。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて他のエレメント、例えばポリアデニル化配列、エンハンサーエレメント、他の遺伝子、リンカードメインなどを含み得る発現カセットである。
【0047】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、例えば、組成物、方法、キットなどの基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない特定の材料またはステップに記載された、例えば、組成物、方法、キットなどの範囲の限定を意味する。例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響を及ぼさない限り、追加の配列、例えばリンカー配列を含んでおよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」バリアントまたは変異体ポリペプチド断片は、列挙された配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス、それが由来する完全長ナイーブポリペプチドに基づく配列の境界に約１０アミノ酸残基、例えば列挙された境界アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１残基少ないか、または列挙された境界アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０残基多いアミノ酸残基を有する。
【0048】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲に明記されていない任意のエレメント、ステップ、または成分を除外することを意味する。例えば、列挙された配列「からなる」ポリペプチドまたはポリペプチドドメインは、列挙された配列のみを含有する。
【0049】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、複写、転写、スプライシング、翻訳または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼし得、本質的に増強または阻害性であり得る。当該分野で公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターから（３’方向で）下流に位置するコード領域の転写を開始する特定の条件下で可能なＤＮＡ領域である。
【0050】
「エピトープ」は、抗体が認識して結合する抗原上の特異的領域であり、「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープは、通常、タンパク質の表面上で５～８アミノ酸長である。タンパク質は、三次元的に折り畳まれた構造であり、エピトープは、溶液中に存在するようなその形態、またはそのネイティブの形態でのみ認識され得る。エピトープが三次元構造によって一緒にされたアミノ酸で構成される場合、エピトープは立体構造または不連続である。エピトープが単一のポリペプチド鎖上に存在する場合、それは連続的または線状エピトープである。抗体が認識するエピトープに応じて、抗体は、タンパク質の断片または変性セグメントのみに結合するものであってもよく、またはネイティブタンパク質に結合可能であってもよい。
【0051】
エピトープを認識する抗体またはその抗体断片の部分は、「エピトープ結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」と呼ばれる。抗体または抗体断片のエピトープまたは抗原結合ドメインはＦａｂ断片中にあり、エフェクター機能はＦｃ断片中にある。重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）内の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる６つのセグメントは、抗体の残りのフレームワーク（ＦＲ領域）球状構造からループアウトし、相互作用して分子の一端に露出表面を形成する。これが抗原結合ドメインである。一般に、４～６個のＣＤＲが抗原の結合に直接関与するが、より少ないＣＤＲが主な結合モチーフを提供し得る。
【0052】
「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードする領域を含み、意図された標的細胞において遺伝子産物の発現を行うために使用される、本明細書で論じられるまたは当技術分野で公知のベクター、例えばプラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどである。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を促進するためにコード領域に作動的に連結された制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的化配列などを含む。制御エレメントと、発現のためにそれらが作動可能に連結されている１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることがあり、その多くは当技術分野において公知で利用可能であるか、または当技術分野で利用可能な構成成分から容易に構築することができる。
【0053】
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する４つの隣接アミノ酸配列を指す。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得るが、ＦＲは主に、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へと折り畳むことに関与する。ＦＲ内で、特定のアミノ残基および特定の構造的特徴は非常に高度に保存されている。これに関して、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へと折り畳まれると、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列にかかわらず、ＣＤＲループの特定の「カノニカル」構造への折り畳まれた形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造領域があることが一般に認識されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
【0054】
「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定するものではないが、サルおよびヒトを含むヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物のスポーツ動物（例えば、ウマ）；哺乳動物農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物ペット（イヌ、ネコなど）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳動物を指す。
【0055】
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与する（天然に存在するおよび天然に存在しない）アミノ酸から構成される均一な抗体集団を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長のモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（登録商標）、それらのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに本明細書に開示されるＷｎｔ代用分子を含む、必要な特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定されることを意図しない。この用語は、全免疫グロブリンならびに「抗体」の定義の下で上述の断片などを含む。
【0056】
本明細書で使用される「ネイティブ」または「野生型」という用語は、野生型細胞、組織、器官または生物に存在するヌクレオチド配列、例えば遺伝子または遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはタンパク質を指す。本明細書で使用される「バリアント」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えばネイティブポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体を指し、すなわち参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と１００％未満の配列同一性を有する。言い換えると、バリアントは、参照ポリヌクレオチド配列、例えばネイティブのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、完全長のネイティブポリヌクレオチド配列と５０％またはそれを超える、６０％またはそれを超える、または、７０％またはそれを超える配列同一性、例えば完全長のネイティブポリヌクレオチド配列と７５％または８０％またはそれを超える、例えば８５％、９０％、または、９５％またはそれを超える、例えば９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。別の例として、バリアントは、完全長のネイティブポリペプチド配列と７０％またはそれを超える配列同一性、例えば完全長のネイティブポリペプチド配列と７５％または８０％またはそれを超える、例えば８５％、９０％、または、９５％またはそれを超える、例えば９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであり得る。バリアントはまた、参照配列、例えば、ネイティブ配列の断片と７０％またはそれを超える配列同一性、例えば、ネイティブ配列と７５％または８０％またはそれを超える、例えば、８５％、９０％、または、９５％またはそれを超える、例えば、９８％または９９％の同一性を共有する参照配列、例えば、ネイティブ配列のバリアントフラグメントを含み得る。
【0057】
「作動的に連結される」または「作動可能に連結される」は、遺伝子エレメントの並置を指し、そのエレメントは、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動的に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
【0058】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションを含む。
【0059】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの、両方を包含する。
【0060】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインメントされたとき、２つの配列を比較した場合、塩基またはアミノ酸のそのパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でワールドワイドウェブ上で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを使用して配列をアライメントすることができる。反対のことが示されない限り、配列同一性はＢＬＡＳＴを使用して決定される。別のアライメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全子会社である米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。アライメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンディエゴのＨａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．の一部門）に記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを可能にするアライメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを可能にするアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアライメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列をアライメントすることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照のこと。
【0061】
Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムが興味深い。ギャップ生成ペナルティは、一般に１～５、通常は２～４の範囲であり、多くの実施形態では３である。ギャップ拡張ペナルティは、一般に約０．０１～０．２０の範囲であり、多くの場合０．１０である。プログラムは、比較のために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されたデフォルトパラメータを使用して決定される。このプログラムは、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。
【0062】
関心のある別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。パーセント配列同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティ：１．００；ギャップペナルティ：１．００；ギャップサイズペナルティ：０．３３；およびジョイニングペナルティ：３０．０。
【0063】
本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を指示するのに十分な最小配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は遍在性であってもよく（広範囲の細胞、組織および種で強く活性であることを意味する）、または細胞型特異的、組織特異的または種特異的であってもよい。プロモーターは、「構成的」であってもよく（絶えず活性であることを意味する）、または「誘導性」であってもよい（プロモーターが、生物因子または非生物因子の存在または非存在によって活性化または不活性化され得ることを意味する）。本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と近接していても近接していなくてもよいエンハンサー配列も含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、ネイティブ遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。
【0064】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え体」は、ポリヌクレオチドが、クローニングステップ、制限ステップまたはライゲーションステップ、および天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。
【0065】
「処置」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味するために本明細書で使用される。効果は、疾患の部分的または完全な治癒および／または疾患に起因する有害作用に関して治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物における疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を停止させること；または（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退縮を引き起こすことを含む。進行中の疾患の処置は、その処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減させる場合、特に興味深い。そのような処置は、望ましくは、罹患組織における機能の完全な喪失の前に行われる。対象の治療は、望ましくは、疾患の症候期の間、場合によっては疾患の症候期の後に投与される。「予防する」という用語は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防または阻害すること、例えば、疾患またはその症状が対象に生じる可能性を低減させることを意味する。
【0066】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の範囲内である、細胞生物学、分子生物学技術）、微生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９１）において十分に説明されており、これらの各々は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【0067】
本発明のいくつかの態様を、例示のための例示的な用途を参照して以下に記載する。本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、および方法が記載されていることを理解されたい。しかしながら、当業者であれば、１またはそれを超える特定の詳細を用いずに、または他の方法を用いて本発明を実施することができることを容易に認識する。本発明は、いくつかの動作が異なる順序で、および／または他の動作もしくは事象と併せて起こり得るため、動作または事象の例示された順序によって限定されない。さらに、本発明による方法論を実施するために、すべての例示された動作または事象が必要とされるわけではない。
【0068】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることを意図している。
【0069】
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、より好ましくはさらに１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、一桁以内、好ましくは、値の５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味すると仮定されるべきである。
【0070】
本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた刊行物の任意の開示に取って代わることが理解される。
【0071】
特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙、または「負」限定の使用に関連して、「単に」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行詞としての役割を果たすことを意図している。
【0072】
別段の指示がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学の従来の技術および組換えＤＮＡ技術を用いる。
ＩＩ．一般
ＩＩ．一般
【0073】
本発明は、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）および特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない肺障害を改善するためにＷｎｔシグナルを調整する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、筋線維芽細胞、免疫細胞、肺特異的ＡＴ２細胞、終末呼吸細気管支細胞および／または異常な上皮細胞のためのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達アンタゴニスト、ならびに、様々な肺障害を軽減するためにこれらの細胞の自己再生および／または分化を促進するためのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを提供する。
【0074】
Ｗｎｔ（「Ｗｉｎｇｌｅｓｓ関連の組み込み部位：Ｗｉｎｇｌｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ」または「ＷｉｎｇｌｅｓｓおよびＩｎｔ－１」または「Ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ」）リガンドおよびそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛、肺、および多くの他の組織を含む多くの必須の器官および組織の発達、恒常性および再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１２４８０１２によって総説されている；）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調整は、変性疾患および組織損傷の処置の可能性を有する。
【0075】
Ｗｎｔシグナル伝達を治療法として調整するための課題の１つは、複数のＷｎｔリガンドおよびＷｎｔ受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ １－１０（Ｆｚｄ１－１０）の存在であり、多くの組織が複数の重複するＦｚｄを発現する。カノニカルＷｎｔシグナルはまた、共受容体として低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）を含み、これらはＦｚｄに加えて様々な組織で広く発現される。
【0076】
Ｒ－スポンジン１－４は、Ｗｎｔシグナルを増幅するリガンドのファミリーである。Ｒ－スポンジンの各々は、一端にジンクおよびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）またはリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）を含み、他端にロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４－６（ＬＧＲ４－６）を含有する受容体複合体を介して働く（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ ２０１４，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７－１６１によって総説されている）。Ｒ－スポンジンは、追加の作用機構を介して作用することもある。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、分解のためにＷｎｔ受容体（Ｆｚｄ１－１０およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６）を特異的に標的化する２つの膜結合Ｅ３リガーゼである。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４－６へのＲ－スポンジンの結合は、三元複合体のクリアランスまたは隔離を引き起こし、これにより、Ｗｎｔ受容体からＥ３リガーゼが除去され、Ｗｎｔ受容体が安定化され、Ｗｎｔシグナルが増強される。各Ｒ－スポンジンは２つのフューリンドメイン（１および２）を含有し、フューリンドメイン１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、フューリンドメイン２はＬＧＲ４－６に結合する。フューリンドメイン１および２を含有するＲ－スポンジンの断片は、Ｗｎｔシグナル伝達を増幅するのに十分である。Ｒ－スポンジンの効果はＷｎｔシグナルに依存するが、ＬＧＲ４－６およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の両方が様々な組織で広く発現されるため、Ｒ－スポンジンの効果は組織特異的ではない。
【0077】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達アンタゴニストまたはアゴニストは、１またはそれを超えるＦｚｄ受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害または増強する結合剤またはエピトープ結合ドメインを含むことができる。一定の実施形態では、薬剤または抗体は、それが結合するヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（複数可）内のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に特異的に結合する。さらに、ＬＲＰに対するエピトープ結合ドメインを含有するアンタゴニスト結合剤も使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β－カテニンアンタゴニストは、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３および１またはそれを超えるＦＺＤ受容体または１またはそれを超えるＬＲＰ共受容体に結合してＦＺＤ受容体またはＬＲＰ受容体の分解を促進する結合剤またはエピトープ結合ドメインを有し、この分子はまた、標的化のための細胞型特異的エピトープに結合する結合ドメインを含有することができる。Ｅ３リガーゼアゴニスト抗体またはその断片は、単一分子であることができ、または他のＷｎｔアンタゴニスト、例えばＦｚｄ受容体アンタゴニスト、ＬＲＰ受容体アンタゴニストなどと組み合わせることもできる。
【0078】
当技術分野で周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域上に位置する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、エピトープ結合ドメインを含有するその断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（登録商標）（Ｎａｂ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、その合成バリアント、天然に生じるバリアント、エピトープ結合ドメインを含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに必要な特異性の抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成も包含する。遺伝子融合によって構築された「ダイアボディ」多価または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，１９９３）もまた、本明細書で企図される抗体の特定の形態である。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９－５８８３，１９８８）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９－１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６を参照のこと。
【0079】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生成し、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は各々、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。本開示の一定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭ、および稀な場合ではＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断によって生成することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当技術分野で公知の組換え技術を使用してより一般的に誘導される。Ｆｖ断片は、ネイティブ抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６－２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６。
【0080】
一定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ抗体が企図される。例えば、カッパ体（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９－５７（１９９７））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：５３０５－９（１９９４））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ ９０：６４４４－８（１９９３））；またはＪａｎｕｓｉｎ（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５－５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１－５２（１９９２））は、所望の特異性を有する抗体の選択に関する本出願の教示に従って標準的な分子生物学技術を用いて調製され得る。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体由来のＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を含み得るが、１つの結合ドメインを介して１またはそれを超えるＦｚｄ受容体に、および第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合する二重特異性抗体が生成され得る。これらの抗体は、組換え分子生物学的技術によって産生されてもよく、または物理的に互いにコンジュゲートされてもよい。
【0081】
ｓｃＦｖポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨ－およびＶＬ－をコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９－５８８３）。天然に凝集した（しかし化学的に分離された）軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を抗体Ｖ領域から、抗原結合部位の構造に実質的に類似した三次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子へと変換するための化学構造を識別するためのいくつかの方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらへの米国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号；およびＬａｄｎｅｒらへの米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【0082】
一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体がダイアボディの形態である。ダイアボディ（ｄＡｂ）は、ポリペプチドのマルチマーであり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは（例えば、ペプチドリンカーによって）連結されているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない：抗原結合部位は、マルチマー内のあるポリペプチドの第１のドメインと、マルチマー内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【0083】
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））。
【0084】
二重特異性抗体を使用する場合、これらは従来の二重特異性抗体であり得、これは様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６－４４９（１９９３））で製造することができ、例えば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製することができ、または上記の二重特異性抗体断片のいずれかであり得る。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域なしで構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低減する。
【0085】
二重特異性ダイアボディは、二重特異性全抗体とは対照的に、容易に構築して大腸菌内で発現させることができるため、特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などの多くの他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を使用してライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば抗原Ｘに対する特異性で一定に保つ場合、他方のアームを変化させ、適切な特異性の抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性全抗体は、ノブ・イントゥ・ホール操作（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６－６２１（１９９６））によって作製され得る。
【0086】
一定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供されてもよい。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標は）、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照；例えばＵＳ２００９０２２６４２１も参照）。この独自の抗体技術は、現在の小型抗体フォーマットよりも長い治療域が予想される安定したより小型の抗体フォーマットを作り出す。ＩｇＧ４抗体は不活性であると考えられ、したがって免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、対応するインタクトＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ，Ｕｔｒｅｃｈｔ）と比較して異なる安定性を有する半分子断片を得るために、抗体のヒンジ領域を排除することによって改変され得る。ＩｇＧ４分子を半分にすると、同族抗原（例えば、疾患標的）に結合することができるＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上の１つの領域のみが残り、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は標的細胞上の１つの部位のみに一価で結合する。
【0087】
一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体およびその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）セットの間にそれぞれ挟まれた重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、ＣＤＲを支持し、ＣＤＲの互いに対する空間的関係を定義する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖のＶ領域の３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行して、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と示される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書では「分子認識単位」と呼ばれる。「いくつかの抗原－抗体複合体の結晶学的分析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広範な接触を形成し、最も広範な抗原接触は重鎖ＣＤＲ３とであることを実証した。したがって、分子認識単位は主に抗原結合部位の特異性を担う。
【0088】
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する４つの隣接アミノ酸配列を指す。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得るが、ＦＲは主に、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へと折り畳むことに関与する。ＦＲ内で、特定のアミノ残基および特定の構造的特徴は非常に高度に保存されている。これに関して、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へと折り畳まれると、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列にかかわらず、ＣＤＲループの特定の「カノニカル」構造への折り畳まれた形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造領域があることが一般に認識されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
【0089】
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与する（天然に存在するおよび天然に存在しない）アミノ酸から構成される均一な抗体集団を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長のモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（登録商標）、それらのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに本明細書に開示されるＷｎｔ代用分子を含む、必要な特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定されることを意図しない。この用語は、全免疫グロブリンならびに「抗体」の定義の下で上述の断片などを含む。
【0090】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生成し、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は各々、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。本開示の一定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭ、および稀な場合ではＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断によって生成することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当技術分野で公知の組換え技術を使用してより一般的に誘導される。Ｆｖ断片は、ネイティブ抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６－２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６。
【0091】
一定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が企図される。例えば、カッパ体（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９－５７（１９９７））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：５３０５－９（１９９４））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ ９０：６４４４－８（１９９３））；またはＪａｎｕｓｉｎ（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５－５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１－５２（１９９２））は、所望の特異性を有する抗体の選択に関する本出願の教示に従って標準的な分子生物学技術を用いて調製され得る。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体由来のＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を含み得るが、１つの結合ドメインを介して１またはそれを超えるＦｚｄ受容体に、および第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合する二重特異性抗体が生成され得る。これらの抗体は、組換え分子生物学的技術によって産生されてもよく、または物理的に互いにコンジュゲートされてもよい。
【0092】
一定の実施形態では、本開示の抗体は、ナノボディ（登録商標）の形態をとり得る。ナノボディ（登録商標）技術は、ラクダ科動物（例えば、ラクダおよびラマ）が重鎖のみからなり、したがって軽鎖を欠く、完全に機能的な抗体を有するという発見および同定後に最初に開発された。これらの重鎖のみの抗体は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３）を含有する。クローン化され単離された単一可変ドメインは、完全な抗原結合能を有し、非常に安定である。これらの単一可変ドメインは、それらの固有の構造的および機能的特性と共に、「ナノボディ（登録商標）」の基礎を形成する。ナノボディ（登録商標）は単一遺伝子によってコードされており、ほとんどすべての原核生物宿主および真核生物宿主、例えば大腸菌（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号参照）、カビ（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））および酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベルミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号参照）で効率的に産生される。製造プロセスはスケーラブルであり、数キログラムの量のナノボディ（登録商標）が製造されている。ナノボディ（登録商標）は、長い貯蔵寿命を有するすぐに使用可能な液剤として製剤化され得る。ナノクローン（登録商標）法（例えば、国際公開第０６／０７９３７２号参照）は、Ｂ細胞の自動化されたハイスループット選択に基づいて、所望の標的に対してナノボディ（登録商標）を生成するための独自の方法である。ナノボディ（登録商標）は、ラクダ特異的重鎖のみの抗体の単一ドメイン抗原結合断片である。ＶＨＨ抗体とも呼ばれるナノボディ（登録商標）は、典型的には約１５ｋＤａの小さなサイズを有する。
【0093】
意図される別の抗体断片は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）が、１つの分子的実体において２つのモノクローナル抗体の機能および特異性を組み合わせる操作されたタンパク質であることである。ＤＶＤ－Ｉｇは、ＩｇＧ様分子として設計されているが、各軽鎖および重鎖は、ＩｇＧ中の１つの可変ドメインの代わりに、短いペプチド結合を介してタンデムに２つの可変ドメインを含有する。２つの可変ドメインの融合方向およびリンカー配列の選択は、分子の機能活性および効率的な発現にとって重要である。ＤＶＤ－Ｉｇは、従来の哺乳動物発現系によって、製造および精製のための単一種として製造することができる。ＤＶＤ－Ｉｇは、親抗体の特異性を有し、インビボで安定であり、ＩｇＧ様の物理化学的および薬物動態学的特性を示す。ＤＶＤ－Ｉｇおよびそれらを作製するための方法は、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０－１２９７（２００７）に記載されている。
【0094】
一定の実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片はヒト化されている。これは、一般に組換え技術を用いて調製され、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造とを有するキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインを含んでもよく、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域にグラフトされたＣＤＲのみを含んでもよい。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、または１またはそれを超えるアミノ酸置換によって改変されていてもよい。これは、ヒト個体において免疫原としての定常領域を排除するが、外来可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：４２２０－４２２４；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９－１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３－３２７）。本明細書中に開示される抗Ｆｚｄ抗体またはＬＲＰ抗体のヒト化のための例示的な方法には、米国特許第７，４６２，６９７号に記載される方法が含まれる。
【0095】
別のアプローチは、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、できるだけヒト形態に近づけて再形成するように可変領域を改変することにも焦点を合わせている。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、所与の種において比較的保存されＣＤＲの足場を提供すると推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に挟まれた、問題のエピトープに応答して変化し結合能力を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することが知られている。特定のエピトープに関して非ヒト抗体を調製する場合、可変領域は、改変されるヒト抗体中に存在するＦＲに非ヒト抗体由来のＣＤＲをグラフトすることによって「再成形」または「ヒト化」することができる。様々な抗体に対するこの手法の適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．，ら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１－８５６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ら，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ら，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３－３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ら，（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：１２４－１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ら，（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：４１８１－４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ら，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６－２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ら，（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２８６９－２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５－４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ら，（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９－１１５４によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体に対して変化した１またはそれを超えるＣＤＲ（１、２、３、４、５、６個）を有し、これは、元の抗体由来の１またはそれを超えるＣＤＲ「に由来する」１またはそれを超えるＣＤＲとも呼ばれる。
【0096】
一定の実施形態では、本開示の抗体はキメラ抗体であり得る。これに関して、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結または他の方法で融合された抗体の抗原結合断片から構成される。一定の実施形態において、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源のものである。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む、親抗体とは異なるＩｇクラスに由来し得る。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、１またはそれを超える異なるＩｇクラス由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成され得る。ヒト化抗体に関して上述したように、キメラ抗体の抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲの１またはそれを超えるもののみを含んでもよく（例えば、本明細書中に記載される抗体の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ）、または可変ドメイン全体を含んでもよい（ＶＬ、ＶＨまたは両方）。
【0097】
免疫グロブリンＣＤＲおよび可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、およびその更新（現在はインターネット上で利用可能）（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）を参照することによって決定され得る。
【0098】
一定の実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニスト結合剤は、約１μＭまたはそれ未満、約１００ｎＭまたはそれ未満、約４０ｎＭまたはそれ未満、約２０ｎＭまたはそれ未満、または、約１０ｎＭまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、一定の実施形態では、１よりも多くのＦＺＤに結合する本明細書に記載のＦＺＤ結合剤または抗体は、約ｌ００ｎＭまたはそれ未満、約２０ｎＭまたはそれ未満、または、約１０ｎＭまたはそれ未満のＫＤでこれらのＦＺＤに結合する。一定の実施形態では、結合剤は、約１μＭまたはそれ未満、約１００ｎＭまたはそれ未満、約４０ｎＭまたはそれ未満、約２０ｎＭまたはそれ未満、約１０ｎＭまたはそれ未満、または、約１ｎＭ ２０またはそれ未満のＥＣ５０で１またはそれを超えるその標的抗原に結合する。ＫＤは親和性に反比例するので、ＫＤ値が低いほど（濃度が低いほど）、抗体の親和性は高くなる。高親和性相互作用は、低いＫＤ、迅速な認識（高いＫｏｎ）、および形成された複合体の強い安定性（低いＫｏｆｆ）を特徴とする。したがって、ＫＤを使用して、抗体親和性または感度を評価することができる。例えば、ＫＤ値が１０－４～１０－６である場合、抗体感度はマイクロモル濃度であり；ＫＤ値が１０－７～１０－９である場合、抗体感度はナノモル濃度であり；ＫＤ値が１０－１０～１０－１２である場合、その抗体感度はピコモル濃度であり；ＫＤ値が１０－１３～１０－１５の場合、その抗体感度はフェムトモル濃度である。特定の実施形態では、ＫＤは、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０．１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、または１０－１５未満であるか、または約１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０．１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、または１０－１５である。
【0099】
本発明の抗体または他の薬剤は、当技術分野で公知の任意の方法によって特異的結合についてアッセイすることができる。使用され得る免疫アッセイとしては、限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応（gel diffusion precipitin reaction）、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイおよびプロテインＡ免疫アッセイなどの技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは日常的であり、当技術分野で周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【0100】
例えば、標的抗原への抗体の特異的結合は、ＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原を調製することと、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすることと、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた抗体または他の結合剤をウェルに添加することと、一定期間インキュベートすることと、抗原の存在を検出することとを含む。いくつかの実施形態では、抗体または薬剤は検出可能な化合物にコンジュゲートされず、代わりに、第１の抗体または薬剤を認識する第２のコンジュゲートされた抗体がウェルに添加される。いくつかの実施形態では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体または薬剤をウェルにコーティングすることができ、抗原をコーティングされたウェルに添加した後に、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第２の抗体を添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために修正することができるパラメータならびに当技術分野で公知のＥＬＩＳＡの他の変形について知識があるであろう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ １１．２．１を参照されたい）。
【0101】
標的抗原に対する抗体または他の薬剤の結合親和性および抗体－抗原相互作用のオフ速度は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識抗原（例えば、Ｆｚｄ、ＬＲＰ）またはその断片もしくはバリアントを、漸増量の非標識抗原の存在下で目的の抗体とインキュベートし、続いて標識抗原に結合した抗体を検出することを含む放射性免疫アッセイである。抗体の親和性および結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定することができる。いくつかの実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ動力学的分析が、抗体または薬剤の結合オン速度および結合オフ速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ動力学的分析は、表面に固定化された抗原を有するチップからの抗体の結合および解離を分析することを含む。
ＩＩＩ．Ｗｎｔアゴニスト、Ｗｎｔアンタゴニストおよび医薬組成物
ＩＩＩ．Ｗｎｔアゴニスト、Ｗｎｔアンタゴニストおよび医薬組成物
【0102】
いくつかの実施形態では、ＷｎｔアンタゴニストまたはＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達経路中の様々な分子に結合する様々なエピトープ結合断片を組み込んだ操作された組換えポリペプチドである。例えば、Ｗｎｔアンタゴニストは、１またはそれを超えるＦｚｄ受容体またはＬＲＰ受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する抗体またはその断片であり得る。別の例として、Ｗｎｔアゴニストは、１またはそれを超えるＦｚｄ受容体に結合する抗体またはその断片およびＬＲＰ受容体（例えば、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６）に結合する抗体またはその断片を含んでもよい。ＦｚｄおよびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（登録商標）など）は、１つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に連結され得る。同様に、ＲＳＰＯなどのポリペプチドは、組織特異的細胞表面抗原に対する抗体またはその断片を含有するように操作されてもよく、例えば、ＨＴＩＩ－２８０．ＲＳＰＯはまた、Ｅ３リガーゼのエンハンサー、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３と併せてまたは逐次的に投与されてもよい。Ｅ３リガーゼエンハンサーは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、Ｅ３リガーゼ活性を増強するアゴニスト抗体または断片であり得る。
【0103】
逆に、Ｗｎｔアゴニストはまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路中の様々な分子に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を増強するエピトープ結合断片を組み込んだ組換えポリペプチドであることができる。例えば、Ｗｎｔアゴニストは、Ｆｚｄ受容体および／またはＬＲＰ受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する抗体またはその断片であることができる。ＦｚｄおよびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ（登録商標）など）は、１つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に連結され得る。
【0104】
一定の実施形態では、ＷｎｔアゴニストまたはＷｎｔアンタゴニストは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６のいずれかまたは両方に結合する。一定の実施形態では、ＷｎｔアゴニストまたはＷｎｔアンタゴニストは、１つのＦｒｉｚｚｌｅｄのみに特異的に結合し、すなわちモノ特異的であるが、他の実施形態では、ＷｎｔアゴニストまたはＷｎｔアンタゴニストは、２またはそれを超えるＦｒｉｚｚｌｅｄに結合し、すなわち多特異的（ｍｕｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。特定の実施形態では、ＷｎｔアゴニストまたはＷｎｔアンタゴニストは、ＦＺＤ１、２、７特異的、ＦＺＤ５、８特異的、またはＦＺＤ４モノ特異的である。特定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、ＳＷＡＰ１、ＳＷＡＰ２、ＳＷＡＰ３、ＳＷＡＰ４、ＳＷＡＰ５もしくはＳＷＡＰ６、またはその機能的バリアントもしくは断片である。機能的バリアントまたはその断片は、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、またはそれを超える結合親和性で同じ標的に結合し得る。
【0105】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト抗体またはその断片は、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示されている抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体に存在するＣＤＲを含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト抗体またはその断片は、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示されている抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体に存在する重鎖および／または軽鎖を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト抗体またはその断片は、米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示されている抗ＦＺＤ抗体中に存在するＣＤＲを含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト抗体またはその断片は、米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示されている抗ＦＺＤ抗体中に存在する重鎖および／または軽鎖を含む。
【0106】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示されている抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体に存在するＣＤＲを含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示される抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体中に存在する可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域（または完全重鎖および／または完全軽鎖）を含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、または米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示されている抗ＦＺＤ抗体中に存在するＣＤＲを含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示されている抗ＦＺＤ抗体中に存在する可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域（または完全重鎖および／または完全軽鎖）を含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示される抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体に存在するＣＤＲを含む抗体またはその断片、および米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示される抗ＦＺＤ抗体に存在するＣＤＲを含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２１００７９０８９号に開示される抗ＬＲＰ５抗体または抗ＬＲＰ６抗体に存在する可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域（または完全重鎖および／または完全軽鎖）を含む抗体またはその断片、および米国特許出願公開第２０２１００８７２８０号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２１／００３０５４号、米国仮出願第６２／８７５，０７３号、または米国特許出願公開第２０２２０２７５０９５号に開示される抗ＦＺＤ抗体に存在する可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域（または完全重鎖および／または完全軽鎖）を含む抗体またはその断片を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２０００４８３２４号、米国特許出願公開第２０２００３０８２８７号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２０／０１０３０８号、米国仮特許出願第６２／７９７，７７２号、または米国特許出願公開第２０２１０２９２４２２号に開示されているＷｎｔアゴニスト（Ｗｎｔ代用分子）またはその１またはそれを超える結合ドメインを含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、米国特許出願公開第２０２０００４８３２４号、米国特許出願公開第２０２００３０８２８７号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２０／０１０３０８号、米国仮特許出願第６２／７９７，７７２号、または米国特許出願公開第２０２１０２９２４２２号に開示されるＷｎｔアゴニスト（Ｗｎｔ代用分子）中に存在する可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域（または完全重鎖および／または完全軽鎖）を含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、表１に開示されるＳＷＡＰ１、ＳＷＡＰ２、ＳＷＡＰ３、ＳＷＡＰ４、ＳＷＡＰ５、もしくはＳＷＡＰ６、またはそのバリアントもしくは断片である。
【0107】
活性な第２のフューリンドメインを欠き（変異または排除され）、もはやＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合することができない変異ＲＳＰＯポリペプチドは、組織特異的細胞表面抗原、例えばＨＴＩＩ－２８０に対する抗体またはその断片を含有するように操作され得る。ＲＳＰＯはまた、Ｅ３リガーゼのさらなる阻害剤、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３と併せてまたは逐次的に投与され得る。Ｅ３リガーゼエンハンサーは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、Ｅ３リガーゼ活性を増強するアンタゴニスト抗体または断片であり得る。Ｅ３リガーゼアンタゴニストはまた、Ｅ３リガーゼ活性を阻害し、したがってＷｎｔ受容体を安定化するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴマーであり得る。
【0108】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、組織特異的Ｗｎｔアゴニスト、例えばＲ－スポンジン模倣物であり、例えばＦｚｄポリペプチドのＥ３リガーゼ分解を阻害し得る。特定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、例えば、米国特許出願公開第２０２０００２４３３８号に開示されているようなＲ－スポンジン代用分子もしくはその結合ドメイン、または組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達増強分子またはその結合ドメイン（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０２０／０１４２７１号、米国仮出願第６２／８２２，７３１号、または米国特許出願公開第ＵＳ２０２１－０３８０６７８号に開示されている）。
【0109】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔアゴニストは、目的の標的組織、例えば肺組織に特異的に結合する組織標的化分子または結合領域を含む。特定の組織内の特定の細胞型および細胞は、細胞表面受容体などの１またはそれを超える細胞または組織特異的表面分子を含み得る。本明細書で使用される場合、分子は、１またはそれを超える他の細胞または組織型、または任意の他の細胞または組織型と比較して、特定の細胞または組織型（例えば、肺細胞または肺組織）上により多くの量の分子が存在する場合、細胞または組織特異的であると言われる。一定の実施形態では、より多い量は、１またはそれを超える他の細胞型もしくは組織型、または任意の他の細胞型もしくは組織型における量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍である。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、例えば１またはそれを超える他の非標的器官、組織または細胞型と比較して、Ｗｎｔシグナル伝達を増強すること、例えば疾患または障害を処置または予防することが望ましい標的器官、組織または細胞型、例えば器官、組織または細胞型での発現が増加または増強されている。一定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、１またはそれを超える他の器官、組織または細胞型と比較して、それぞれ、標的器官、組織または細胞型の表面上に優先的に発現される。例えば、特定の実施形態では、細胞表面受容体は、標的器官、組織または細胞において、それぞれ、１またはそれを超える、５またはそれを超える、すべての他の器官、組織もしくは細胞において発現されるものよりも、またはすべての他の器官、組織もしくは細胞の平均よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍高いレベルで発現される場合、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子であると見なされる。一定の実施形態では、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子は、細胞表面受容体、例えば、細胞表面膜内に位置する領域および標的化モジュールが結合することができる細胞外領域を含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、標的組織または標的組織を含む組織のサブセット上でのみ発現される細胞表面分子を特異的に標的化することによって、または全ての、ほとんどの、またはかなりの数の他の組織と比較して標的組織上でより高いレベルの発現、例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０の他の組織上よりも標的組織上でより高い発現を有する細胞表面分子を特異的に標的化することによって実施され得る。
【0110】
特定の実施形態では、標的化モジュールは、目的の標的細胞または組織型、すなわちＷｎｔシグナル伝達活性を増強または増加させることが望ましい細胞または組織型上に発現される組織特異的表面分子に結合する。各組織特異的表面分子に結合する標的化モジュールは、抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、組織または細胞特異的受容体の天然リガンド、またはそれらの誘導体、および合成小分子などであり得るが、これらに限定されない。
【0111】
一定の実施形態では、組織標的化分子は、目的の組織の表面上の細胞表面受容体またはマーカーに結合する抗体である。一定の実施形態では、組織は肺である。
【0112】
本明細書に記載のＷｎｔアンタゴニストまたはアゴニスト分子と、１またはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物も開示される。
【0113】
さらなる実施形態では、本明細書に記載のＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、１またはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物も開示される。一定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テール配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コード配列に作動的に連結されたプロモーターを含む発現カセットである。
【0114】
さらなる実施形態では、本明細書に記載のＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、例えばウイルスベクターと、１またはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物も開示される。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト分子をコードする核酸配列およびＷｎｔアゴニストをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド、例えば発現カセット内にある。
【0115】
本開示はさらに、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子をコードする核酸に作動的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、１またはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤とを含む細胞を含む医薬組成物を企図する。特定の実施形態では、医薬組成物は、ＷｎｔアンタゴニストおよびＷｎｔアゴニストをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト分子をコードする核酸配列およびＷｎｔアゴニスト分子をコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド、例えば発現カセット内に、および／または同じ細胞内に存在する。特定の実施形態では、細胞は、処置される対象から得られた異種細胞または自己細胞である。
【0116】
特定の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。本開示は、第１の活性薬剤としてのＷｎｔアンタゴニスト分子の送達のための第１の分子と、第２の薬剤としてのＷｎｔアゴニストとを含む医薬組成物を企図する。第１および第２の分子は、同じ種類の分子であってもよいし、異なる種類の分子であってもよい。例えば、一定の実施形態では、第１および第２の分子は、それぞれ独立して、以下の種類の分子：ポリペプチド、有機小分子、第１または第２の活性薬剤をコードする核酸（必要に応じてＤＮＡまたはｍＲＮＡ、必要に応じて修飾ＲＮＡ）、第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（必要に応じて発現ベクターまたはウイルスベクター）、および第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（必要に応じて発現カセット）から選択されてもよい。
【0117】
対象分子は、単独でまたは組み合わせて、一般に安全で非毒性であり望ましい製剤を調製するのに有用な薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤および試薬と組み合わせることができ、哺乳動物、例えばヒトまたは霊長類の使用に許容され得る賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合は気体であり得る。そのような担体、希釈剤および賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。補足的な活性化合物も製剤に組み込むことができる。製剤に使用される溶液または懸濁液は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝液；凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの洗剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は無菌である。
【0118】
医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末をさらに含んでもよい。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。場合によっては、組成物は滅菌されており、シリンジに引き込むかまたはシリンジから対象に送達することができるように流動性でなければならない。一定の実施形態では、それは製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒などであり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の管理、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。内部組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【0119】
滅菌溶液は、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト抗体またはその抗原結合断片（またはコードしているポリヌクレオチドもしくはそれを含む細胞）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量で組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末が、以前に滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【0120】
一実施形態では、医薬組成物は、抗体またはその抗原結合断片を身体からの迅速な排出から保護する担体、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。これらの材料は商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容され得る担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【0121】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、医薬組成物を投与単位形態で製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用される投与単位形態は、処置される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性抗体またはその抗原結合断片を含有する。投与単位形態の仕様は、抗体またはその抗原結合断片の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにそのような活性抗体またはその抗原結合断片を調剤する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【0122】
医薬組成物は、投与のための指示と共に、容器、パック、またはディスペンサー、例えばシリンジ、例えばプレフィルドシリンジに含めることができる。
【0123】
本開示の医薬組成物は、任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与した際に生物学的に活性な抗体もしくはその抗原結合断片を（直接的または間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。
【0124】
本開示は、本明細書に記載のＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子の薬学的に許容され得る塩を含む。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本開示の化合物の生理学的および薬学的に許容され得る塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない塩を指す。様々な薬学的に許容され得る塩が当技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（およびそのより最近の版）、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｊａｍｅｓ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載されている。また、適切な塩に関する総説については、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ」Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００２）を参照されたい。薬学的に許容され得る塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成される。
【0125】
カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ－Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、およびプロカイン（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９）を含む。上記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態を十分な量の所望の塩基と接触させて従来の方法で塩を生成することによって調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、遊離酸を従来の様式で単離することによって再生され得る。遊離酸形態は、極性溶媒への溶解度などの特定の物理的特性においてそれらのそれぞれの塩形態とは幾分異なるが、それ以外は、塩は、本開示の目的のためにそれらのそれぞれの遊離酸と等価である。
【0126】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤および／または賦形剤、例えば食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホスフェートおよびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、バッファー、保存剤および他のタンパク質と混合した、治療有効量のＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子またはその薬学的に許容され得る塩を含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、モノステアリン酸ポリエチレングリコール化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル溶液およびハンクス溶液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンおよびグリコールである。好ましくは、この製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。
【0127】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウムなどの緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびＧｏｏｄら（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７に記載されているものなどの当業者に公知の他のバッファーを含む。バッファーのｐＨは、６．５～７．７５、好ましくは７～７．５、最も好ましくは７．２～７．４の範囲であり得る。
ＩＶ．使用方法
ＩＶ．使用方法
【0128】
本開示はまた、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子を使用して、例えばＷｎｔシグナル伝達経路を調整し、例えばＷｎｔシグナル伝達を増加または減少させる方法、および様々な治療状況でのＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子の投与を提供する。Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子を使用する処置方法が本明細書で提供される。一実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子は、不適切なまたは調節解除されたＷｎｔシグナル伝達を伴う疾患を有する対象に提供される。
【0129】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子は、組織または細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路を遮断または増強するために使用され得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路をアンタゴナイズすることは、細胞または組織におけるＷｎｔシグナル伝達を減少または阻害することを含み得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路をアゴナイズすることは、例えば、組織または細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の増加またはＷｎｔシグナル伝達の増強を含み得る。したがって、いくつかの態様では、本開示は、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路をアンタゴナイズ／アゴナイズする方法であって、組織または細胞を有効量の本明細書に開示されるＷｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子またはその薬学的に許容され得る塩と接触させることを含み、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子がＷｎｔシグナル伝達経路アンタゴニスト／アゴニストである方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行われる。特定の実施形態では、細胞は培養細胞または患者から得られた細胞であり、接触はインビトロまたはエクスビボで行われる。特に、ＡＴ２細胞を含むｉＰＳＣ由来および初代肺上皮細胞の両方を培養し、これらの細胞を疾患肺または肺疾患患者へと移植することに備えて、アゴニズムおよび／またはアンタゴニズムを介してこれらの細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を調整する。一定の実施形態では、細胞は、患者から得られ、エクスビボでＷｎｔアンタゴニストおよび／またはＷｎｔアゴニスト分子と接触させ、次いで、患者の肺（複数可）に移植される。一定の実施形態では、患者から得られた細胞は非疾患である。一定の実施形態では、ドナーから得られた細胞（例えば、肺細胞、例えば、初代肺上皮細胞）を、エクスビボでＷｎｔアンタゴニストおよび／またはＷｎｔアゴニスト分子と接触させ、次いで、患者に移植する。一定の実施形態では、ドナーから得られた肺をエクスビボでＷｎｔアンタゴニストおよび／またはＷｎｔアゴニスト分子と接触させ、次いで、患者に移植される。
【0130】
Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト分子は、肺障害の処置に使用され得る。特に、活性Ｗｎｔシグナル伝達は、間葉系細胞媒介性の線維化形成を促進することができ、それに必要であり、間葉系細胞の増殖、アポトーシスおよび細胞外マトリックス産生の変化に影響を及ぼす。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達のアゴナイズは、筋線維芽細胞に加えて、肺特異的前駆体ＡＴ２／ＡＥＰ（肺胞上皮前駆体）の増殖を促進する。ＡＴ２細胞の過剰増殖は、ＡＴ１細胞の低減に寄与し得る。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズすることは、肺間葉系組織における線維化の形成を阻害するだけでなく、ＡＴ２細胞のＡＴ１細胞への分化および肺組織の修復も可能にする。
【0131】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、ＡＴ２細胞の増殖を促進または増加させるために使用され得る。
【0132】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、ＡＴ２細胞のＡＴ１細胞への分化を促進または増加させるために使用され得る。
【0133】
一定の実施形態では、上皮細胞、例えばＡＴ２上皮細胞を最初にＷｎｔアゴニストと接触させてＡＴ２細胞の増殖を促進または増加させ、次いでＷｎｔアンタゴニストと接触させてＡＴ２細胞のＡＴ細胞への分化を促進または増加させ得る。
【0134】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニスト／アンタゴニスト分子（複数可）は、肺線維症疾患およびＣＯＰＤに存在するＡＴ２／ＡＴ１移行状態細胞および／または異常な基底類似細胞に影響を及ぼすために使用され得る。これは、それらの適切な自己再生および／またはＡＴ１細胞への分化を促進するためであり得る。
【0135】
一定の実施形態では、Ｗｎｔアゴニスト／アンタゴニスト分子（複数可）は、マクロファージを含む免疫細胞に影響を与えて、組織炎症を低減し組織修復を促進する抗炎症表現型を促進するように設計され得る。
【0136】
Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストは、併せてまたは逐次的に投与され得る。アンタゴニストおよびアゴニストは、別個の分子であってもよく、または単一の分子上に構築されてもよい。アンタゴニストとアゴニストの両方の同時処置により、プロテアーゼ切断可能リンカー（例えばｕＰＡ）を使用することによって、アンタゴニスト活性とアゴニスト活性を１つの分子内で連結することが可能であり得る。これらの対向する活性を１つの分子に連結する別のバージョンは、特異的ＦＺＤ受容体（複数可）結合剤およびＬＲＰ５／６結合剤に結合した、肺のすべての細胞型で発現される細胞表面抗原を使用することであろう。特異的ＦＺＤを発現しない細胞では、結合剤は細胞表面抗原およびＬＲＰに結合するためアンタゴニズムが生じるが、細胞表面結合剤ならびに特異的ＦＺＤ受容体（複数可）およびＬＲＰ５／６を発現する細胞では、活性なシグナル伝達複合体が生じる可能性があり、肺に特異的な１つの分子に統合されたアンタゴニズムおよびアゴニズムをもたらすであろう。
【0137】
さらなる実施形態では、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト分子はまた、組織標的化部分、例えば肺組織特異的受容体または細胞表面分子を認識する抗体またはその断片を組み込んでもよい。
【0138】
一定の実施形態では、アンタゴニストおよびアゴニストは、逐次的にまたは併せて投与される。第１の投与スケジュールでは、一般的または特異的なアンタゴニストが最初に投与され、次いで、細胞型特異的アゴニストの適用が続く。ＡＴ２細胞が増殖するように、パルス状用量でアゴニストを適用することが適切であり得るが、シグナル伝達が低減すると、一部の画分がＡＴ１細胞へと自然に分化する。次に、２番目以降のパルスを使用して、このプロセスを繰り返す。第２の投与スケジュールの場合、一般的または細胞型特異的アンタゴニストのいずれかが、細胞型特異的アゴニストと同時に投与される。このスキームでは、アンタゴニストは、リガンドまたは受容体レベルのいずれかですべてのＷｎｔシグナル伝達を制限することができるが、これは、受容体レベルで機能する細胞型特異的アゴニストを使用することによって、特定の細胞型で克服することができる。第３のスキームは、逐次的または同時の併用処置とそれに続くアンタゴニストの反復適用を用いることができる。第４のスキームでは、アゴニストが最初に投与され、続いてアンタゴニストを適用し、両方とも潜在的に細胞型特異的である。他の実施形態では、アンタゴニストは、ＩＰＦにおける組織損傷を処置するために単独で投与され、アゴニストは、結果としての損傷またはＣＯＰＤを処置するために単独で投与される。
【0139】
本発明はまた、ＩＰＦおよび／またはＣＯＰＤのための公知の処置との併用処置を提供する。例えば、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニストは、限定されないが、酸素治療、肺リハビリテーション、ニンテダニブ（Ｏｆｅｖ（登録商標））、ピルフェニドン（Ｅｓｂｒｉｅｔ（登録商標）、Ｐｉｒｆｅｎｅｘ（登録商標）、Ｐｉｒｅｓｐａ（登録商標））、コルチコステロイド（プレドニゾン）、ミコフェノール酸モテチル／ミコフェノール酸（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、タンキラーゼ阻害剤（例えば、ＸＡＶ９３９）およびポルキュピン（ＰＯＲＣＮ）阻害剤（例えば、ＷＮＴ９７４、ＬＫＧ９７４、ＩＷＰ－２、Ｃ５９など）を含む、肺線維症のためのいくつかの公知の治療と組み合わせることができる。ＣＯＰＤについては、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニストを、アルブテロール（Ｐｒｏ Ａｉｒ（登録商標）ＨＦＡ、Ventolin（登録商標）ＨＦＡ）、レバルブテロール（Ｘｏｐｅｎｅｘ（登録商標）ＨＦＡ）およびイプラトロピウム（Ａｔｒｏｖｅｎｔ（登録商標））などの短時間作用型気管支拡張薬；チオトロピウム（Ｓｐｉｒｉｖａ（登録商標））、サルメテロール（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ（登録商標））、ホルモテロール（Ｆｏｒａｄｉｌ（登録商標）、Ｐｅｒｆｏｒｏｍｉｓｔ（登録商標））、アルホルモテロール（Ｂｒｏｖａｎａ（登録商標））、インダカテロール（Ａｒｃａｐｔａ（登録商標））、およびアクリジニウム（Ｔｕｄｏｒｚａ（登録商標））などの長時間作用型気管支拡張剤；フルチカゾン（Ｆｌｏｖｅｎｔ（登録商標）ＨＦＡ、Ｆｌｏｎａｓｅ（登録商標））およびブデソニド（Ｐｌｕｍｉｃｏｒｔ Ｆｌｅｘｈａｌｅｒ（登録商標）、Uceris （登録商標））などの吸入ステロイド；フルチカゾン（Ａｄｖａｉｒ（登録商標））およびホルモテロールおよびブデソニド（Ｓｙｍｂｉｃｏｒｔ（登録商標））などの併用吸入剤；経口ステロイド；ロフルミラスト（Daliresp（登録商標））などのホスホジエステラーゼ－４阻害剤；テオフィリン；抗生物質；酸素治療；および肺リハビリテーションを含むがこれらに限定されない治療と組み合わせることができる。上記の治療薬は、本発明の分子と逐次的にまたは併せて投与することができる。
【0140】
本発明の方法は、限定するものではないが、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、急性呼吸窮迫症候群、および新生児肺発達を含む様々な肺障害を処置するために使用することができる。さらに、本発明の方法は、気腫、慢性喘息、および慢性気管支炎を含むがこれらに限定されない慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置するために使用することもできると考えられる。
【0141】
治療剤（例えば、Ｗｎｔアンタゴニスト／アゴニスト）は、疾患または傷害の発症前、発症中または発症後に投与され得る。進行中の疾患の処置は、その処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減させる場合、特に興味深い。そのような処置は、望ましくは、罹患組織における機能の完全な喪失の前に行われる。主題の治療は、望ましくは、疾患の症候期の間、場合によっては疾患の症候期の後に投与される。いくつかの実施形態では、主題の方法は、治療上の利益、例えば障害の発症の予防、障害の進行の停止、障害の進行の逆転などをもたらす。いくつかの実施形態では、主題の方法は、治療上の利益が達成されたことを検出するステップを含む。当業者は、そのような治療有効性の測定が、改変される特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性を測定するために使用する適切な検出方法を認識する。
【0142】
本明細書で言及された、および／または出願データシートに列挙された、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0143】
上記から、本開示の特定の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されているが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【0144】
本発明の広い範囲は、本発明を特定の実施形態に限定することを意図しない以下の実施例を参照して最もよく理解される。
【実施例】
【0145】
実施例
Ｉ．一般的な方法
分子生物学における標準的な方法を記載する。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｗｈｉｃｈ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｖｏｌ．１）、ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ（Ｖｏｌ．２）、ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｖｏｌ．３）、およびｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｖｏｌ．４）にも見られる。
Ｉ．一般的な方法
分子生物学における標準的な方法を記載する。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｗｈｉｃｈ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｖｏｌ．１）、ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ（Ｖｏｌ．２）、ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｖｏｌ．３）、およびｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｖｏｌ．４）にも見られる。
【0146】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法が記載される。Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ｐｐ．４５－８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製および断片化が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、前出。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【0147】
蛍光活性化細胞選別検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第２版；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む、核酸を改変するのに適した蛍光試薬が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．
【0148】
免疫系の組織学の標準的な方法を記載する。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｉａｔｔ，ら（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，Ｐａ．；Ｌｏｕｉｓ，ら（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【0149】
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１－７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１－７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７－１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３－４６９０．を参照されたい。
ＩＩ．単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析
ＩＩ．単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析
【0150】
さらなる細胞型特異的細胞表面発現遺伝子産物を同定し、細胞型特異的標的化に使用することができる肺胞上皮細胞および間葉系細胞集団を特異的にプロファイリングするために、組織を正常、ＩＰＦおよびＣＯＰＤ患者の肺から収集し、解離させて単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を行う。一般的な手順は、当技術分野で記載されており、例えば、Ｗａｎｇ，Ｙ．ら（２０１８）ＰＮＡＳ １１５：２４０７－２４１２；Ｚｅｐｐ，Ｊ．ら（２０１７）Ｃｅｌｌ １７０：１１３４－１１４８；Ａｄａｍｓら，（２０２０）前出；Ｈａｂｅｒｍａｎら，（２０２０）前出に記載されている。個々の細胞亜集団に特異的な遺伝子は、既知の細胞表面遺伝子産物と相互参照される。特定の肺細胞亜集団における発現を示す遺伝子を、ＮＣＢＩなどの公開データレポジトリを使用して他の組織における発現について評価する。
ＩＩＩ．Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングするためのインビトロアッセイ
ＩＩＩ．Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングするためのインビトロアッセイ
【0151】
Ｗｎｔアンタゴニストをスクリーニングするために、健常ドナーおよびＩＰＦ患者由来の初代ヒト肺線維芽細胞を得て、ＴＧＦ－β１で刺激して、細胞増殖、遊走（スクラッチアッセイ）、細胞外マトリックス産生（Ｃｏｌｌａ１）および筋線維芽細胞遺伝子発現（αＳＭＡ／ＡＣＴＡ２）を測定する。さらに、Ｗｎｔアンタゴニストを使用して、ＴＧＦβ１誘発線維化を低減させることができるかどうかを決定する（例えば、Ｃｏｎｔｅ，Ｅ．ら（２０１４）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．５８：１３－１９を参照）。
【0152】
初代ヒト肺ＡＴ２肺胞上皮細胞は、健常ドナーおよびＩＰＦ患者に由来する。ＡＴ２細胞に適用されるアンタゴニストは、ＡＴ１細胞への分化を促進および増強する。
【0153】
Ｗｎｔアゴニストのスクリーニングのために、初代ヒトＡＴ２細胞（健常ドナー、ＩＰＦ患者またはＣＯＰＤ患者由来）、初代マウスＡＴ２細胞、マウスＡＴ２細胞株（ＭＬＥ１２）またはヒト肺胞上皮癌細胞株Ａ５４９を使用する。細胞を、ＬＲＰ抗体またはその断片と組み合わされたＦｚｄ受容体抗体またはその断片を含むＷｎｔアゴニストで処理する。あるいは、Ｗｎｔアゴニストは、Ｅ３リガーゼ活性を低減させるＲＳＰＯ変異体ポリペプチドと組み合わせた組織特異的抗原に結合する抗体またはその断片で構築することもできる。アゴニスト活性の分析には、細胞増殖、遊走（スクラッチアッセイ）、Ｗｎｔ／β－カテニン標的遺伝子発現（Ａｘｉｎ－２、サイクリンＤ１）およびＳＴＦ活性が含まれる。
ＩＶ．精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）培養
ＩＶ．精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）培養
【0154】
エクスビボ研究のために、健常ドナー、肺線維症およびＣＯＰＤ患者からの肺切片培養物を使用する。Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストは、線維芽細胞／筋線維芽細胞増殖、マトリックス産生、肺胞上皮細胞増殖（ＡＴ１およびＡＴ２細胞）およびＡＴ１／ＡＴ２細胞運命分化転換に対する効果、ならびに常在または浸潤免疫細胞に対する影響を決定するために、単独でまたは逐次的にまたは併せて添加される（例えば、Ａｌｓａｆａｄｉ，Ｈ．ら（２０１７）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２：８９６－９０２を参照）。
Ｖ．エクスビボでの肺胞オルガノイドの培養
Ｖ．エクスビボでの肺胞オルガノイドの培養
【0155】
エクスビボ研究のために、３Ｄオルガノイド培養物（例えば、Ｚａｃｈａｒｉａｓ，Ｗ．ら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５５：２５１－２５７およびＢａｒｋａｕｓｋａｓら（２０１７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：９８６－９９７を参照）を、健常、肺線維症またはＣＯＰＤ患者由来の初代ヒト肺線維芽細胞を患者由来の肺胞上皮細胞（ＡＴ２およびＡＥＰ細胞）と組み合わせることによって構築した。オルガノイドを、成長因子を含まないマトリゲルを含むＳＡＧＭ培地で培養した。Ｗｎｔアンタゴニストおよびアゴニストを逐次的または併せて添加して、線維芽細胞／筋線維芽細胞増殖、マトリックス産生、肺胞上皮細胞増殖およびＡＴ１／ＡＴ２細胞運命分化転換に対する効果を決定した。肺胞オルガノイドは、精製ＡＴ２細胞を含むヒト遠位肺細胞から直接培養することもできる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（２０２０）、前出）。
【0156】
ＡＴ２自己再生および肺胞オルガノイド成長を促進する様々なＷＮＴアゴニストＳＷＡＰの能力が実証された（図５Ａおよび図５Ｂ、図６、図８、および図９）。ＡＴ２細胞オルガノイド実験のすべてにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤Ｃ５９を使用して、Ｗｎｔリガンドの内因性分泌を防止した。ＲＳＰＯ１またはＲＳＰＯ２単独での処理はヒトＡＴ２培養物成長を増強しなかったが、マルチＦＺＤ特異的ＳＷＡＰ、ＳＷＡＰ１とＲＳＰＯ１との組み合わせでの処理は、ヒトＡＴ２細胞オルガノイド成長の増強をもたらし、これは小分子Ｗｎｔシグナル伝達アクチベーターＣｈｉｒ９９０２１での処理の際に観察された成長を超えた（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＡＴ２細胞オルガノイド成長をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイで評価した。さらに、ＲＳＰＯの非存在下では、ＳＷＡＰ２－４を含むサブファミリーおよびモノ特異的ＳＷＡＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、オルガノイドサイズの増加によって示されるように、ヒトＡＴ２細胞オルガノイド成長の増強をもたらし（図６）、ＳＷＡＰ２およびＳＷＡＰ３は、濃度依存的にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって評価されるように、ヒトＡＴ２オルガノイド培養物の伸長／生存率を誘導し、これは顕微鏡法によるオルガノイドの数およびオルガノイドサイズの増加にも反映された（図８）。１０ｎＭの濃度では、ＳＷＡＰ２およびＳＷＡＰ３は、小分子Ｗｎｔ経路アクチベーターＣｈｉｒ９９０２１よりも有効であった（図８）。さらに、ＲＳＰＯ２と組み合わせたＳＷＡＰ１、ＳＷＡＰ２、およびＳＷＡＰ３処理は、マウスＡＴ２オルガノイド培養物の拡大をもたらした（図９）。まとめると、これらの結果は、ＦＺＤ１、２、７、５、８（ＳＷＡＰ１）、ＦＺＤ１、２、７（ＳＷＡＰ２）およびＦＺＤ５、８（ＳＷＡＰ３）を介するアゴニズム、ならびにＦＺＤ４単独（ＳＷＡＰ４）を介するアゴニズムが、ヒトＡＴ２細胞の自己再生および拡大を促進することを強調している。特に、ヒトＡＴ２細胞オルガノイド成長を促進するＳＷＡＰ３（ＦＺＤ５、８およびＬＲＰ６に特異的）の能力は、ＦＺＤ５が肺胞上皮細胞において富化されていることが見出されたＡｄａｍｓら、（２０２０）（前出）からの公開されたｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるＷｎｔ受容体発現の分析と一致していた。ここに示されるデータは、モノ－ＦＺＤ５ ＳＷＡＰがＡＴ２細胞増殖および自己再生を促進することを示唆している。
【0157】
試験したＳＷＡＰＳには以下が含まれていた：ＳＷＡＰ１、ＦＺＤ－１、２、５、７、８特異的ＳＷＡＰ；ＳＷＡＰ２、ＦＺＤ１、２、７特異的ＳＷＡＰ；ＳＷＡＰ３、ＦＺＤ５、８特異的ＳＷＡＰ；ＳＷＡＰ４、ＦＺＤ４モノ特異的ＳＷＡＰ；およびＳＷＡＰ５、ＦＺＤ－１、２、５、７、８特異的ＳＷＡＰ；ＳＷＡＰ６、ＦＺＤ１、２、７特異的ＳＷＡＰ。これらのＳＷＡＰＳのそれぞれは、抗体軽鎖のＮ末端に融合したＬＲＰ６ ＶＨＨを有する抗ＦＺＤ抗体を含む。各ＳＷＡＰＳに存在する２本の重鎖と２本の軽鎖の配列を表１に示す。
ＶＩ．ブレオマイシン誘発急性および慢性肺線維症の動物モデル
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0158】
急性肺傷害（単一ブレオマイシン処理；図１）および慢性間欠性／低用量ブレオマイシンマウスモデル（図２）を使用して、抗線維化薬（例えば、ピルフェニドンおよびニンテダニブ）と組み合わせてまたは組み合わせずにＷｎｔアンタゴニストおよびアゴニスト（併せてまたは逐次的にまたは個別に投与される）の治療効果を決定し、抗線維化および改善された呼吸機能（例えば、Ｄｅｇｒｙｓｅ，Ａ．ら（２０１０）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９９：４４２－５２参照）に対する効果を評価した。線維症の改善は、ＷＮＴアゴニストであるＳＷＡＰ５による処置で観察された（例えば、図７、図１０を参照）。具体的には、０日目にブレオマイシンをマウスに気管内投与し、７日目から開始して２１日目の終了までの２週間、アゴニスト手法－ＳＷＡＰ５（ＦＺＤ１、２、５、７、８マルチＦＺＤ特異的ＳＷＡＰ）とＲＳＰＯ２の組み合わせ（コンボ）－で動物を毎週２回処置した。これにより、線維症の重症度の程度および線維症に罹患した肺の面積が低減した（図７）。これは、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニズムが肺線維症を低減し得ることを実証した。ＷｎｔアゴニストまたはＷｎｔシグナル伝達エンハンサーＲＳＰＯ２単独による処置でも線維症の改善が観察された（図１０）。例えば、ＳＷＡＰ５単独またはＲＳＰＯ２単独は、線維症スコアおよび罹患肺面積のパーセンテージを低減させた（図１０）。ＦＺＤ５、８特異的ＳＷＡＰ３は単独で、急性ブレオマイシンマウスモデルにおいて線維症スコア、罹患肺のパーセンテージ、免疫細胞浸潤、およびサイトカインレベルを用量依存的に低減させ（図１１）、ＦＺＤ１、２、７特異的ＳＷＡＰ６も線維症の低減を引き起こした（図１２）。
【0159】
これらの動物モデルでは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達アンタゴニストを、一般的または細胞型特異的のいずれかで適用して、線維形成性筋線維芽細胞の増殖および線維症に寄与する細胞外マトリックス構成成分の産生を低減させる。次いで、逐次的または併せてまたは独立して、ＡＴ２／ＡＥＰ細胞を特異的に標的化してそれらの自己再生を促進するアゴニストを適用するか、またはマクロファージなどの関連する免疫細胞を標的化して抗炎症状態を促進するアゴニストを適用する。そのＡＴ２特異的アゴニストが中止されると、ＡＴ２細胞のサブセットは、低減したレベルのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達活性および／またはアンタゴニストの活性によって引き起こされる新たなＡＴ１細胞に自然に分化する。さらなる研究では、線維形成性筋線維芽細胞を標的とするアンタゴニストとＡＴ２／ＡＥＰ細胞を標的とするアゴニストとの組み合わせを適用し、続いて線維形成性筋線維芽細胞とＡＴ２細胞の両方を標的とするアンタゴニストのみを連続して適用し、線維症を低減させ、ＡＴ２→ＡＴ１細胞変換を促進する。さらなる研究では、抗炎症状態を促進し、組織修復を促進するために、マクロファージ特異的Ｗｎｔアゴニストが使用され得る。
ＶＩＩ．気腫の動物モデル
ＶＩＩ．気腫の動物モデル
【0160】
タバコ喫煙誘発モデル（図３）を使用して、肺胞上皮細胞の再生および改善された呼吸機能（例えば、Ｂａａｒｓｍａ，Ｈ．ら（２０１７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１４：１４３－１６３参照）におけるＷｎｔアゴニスト（上記参照）の治療効果を評価するために、マウスの気腫を確立する。
【0161】
エラスターゼ誘発気腫マウスモデル（図４）もまた、マウスにおける気腫を確立し、肺胞上皮細胞の再生および改善された呼吸機能におけるＷｎｔアゴニストの治療効果を評価するために使用される（例えば、Ｂａａｒｓｍａら、前出を参照）。
【0162】
誘発気腫を有する動物を、ＡＴ２細胞増殖を促進するためにパルス状Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達アゴニズムで処置し、続いて、線維症を予防するためにアンタゴニズムとカップリングすることなくＡＴ２→ＡＴ１変換を行う。第２のアプローチでは、動物を一般的または細胞型特異的Ｗｎｔ／β－カテニンアンタゴニストで処置して線維化を制限し、次いで、順次または併せて、ＡＴ２細胞を特異的に活性化して増殖および自己再生させるＷｎｔアゴニストを適用する。これに続いて、ＡＴ２特異的Ｗｎｔアゴニストが除去され、したがって、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニズムおよび／またはアンタゴニスト活性の低減の際にＡＴ２がＡＴ１細胞に分化することが可能になる。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【0163】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及された、および／または出願データシートに列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を使用するように変更することができる。これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。
【0164】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B-D】
【図11A】
【図11B-C】
【図11D】
【図11E】
【図11F-H】
【図12A】
【図12B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0164】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
肺障害を罹患している対象を処置する方法であって、操作されたＷｎｔアンタゴニストおよび／または操作されたＷｎｔアゴニストを前記対象に投与することを含む方法。
（項目２）
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが併せて投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが逐次的に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｗｎｔアゴニストが前記Ｗｎｔアンタゴニストの前に投与される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記Ｗｎｔアンタゴニストが前記Ｗｎｔアゴニストの前に投与される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記肺障害が間質性肺疾患である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記肺障害が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＣＯＰＤが、慢性気管支炎、気腫、および慢性喘息からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが組織標的化分子を組み込む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記操作されたＷｎｔアゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、および小分子からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記操作されたＷｎｔアゴニストが組織標的化分子を組み込み、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体または抗体断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記障害が肺線維症であり、前記対象が前記Ｗｎｔアンタゴニストで処置される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記障害が肺線維症であり、前記対象が、前記Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジン模倣物、または前記Ｗｎｔアゴニストと組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサーもしくはＲ－スポンジン模倣物との組み合わせで処置される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｗｎｔアゴニストおよび／または前記Ｗｎｔアンタゴニストが、マルチＦＺＤ特異的またはモノＦＺＤ特異的である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＦＺＤ５、８またはＦＺＤ１、２、７に特異的であり、前記障害が、肺線維症および／またはＣＯＰＤなどの間質性肺疾患である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｗｎｔアゴニストまたは前記Ｗｎｔアンタゴニストが、ＦＺＤ４モノ特異的またはＦＺＤ５モノ特異的である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記障害がＣＯＰＤであり、前記対象が前記Ｗｎｔアゴニストで処置される、項目１に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
肺障害を罹患している対象を処置する方法であって、操作されたＷｎｔアンタゴニストおよび／または操作されたＷｎｔアゴニストを前記対象に投与することを含む方法。
（項目２）
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが併せて投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＷｎｔアンタゴニストとＷｎｔアゴニストが逐次的に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｗｎｔアゴニストが前記Ｗｎｔアンタゴニストの前に投与される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記Ｗｎｔアンタゴニストが前記Ｗｎｔアゴニストの前に投与される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記肺障害が間質性肺疾患である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、過敏性肺炎、急性間質性肺炎、間質性肺炎、全身性硬化症関連肺線維症、サルコイドーシス、石綿症誘発線維症、急性および慢性の肺感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の結果としての肺傷害、肺炎、吸引傷害、敗血症、急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記肺障害が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＣＯＰＤが、慢性気管支炎、気腫、および慢性喘息からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記操作されたＷｎｔアンタゴニストが組織標的化分子を組み込む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記操作されたＷｎｔアゴニストが、操作されたポリペプチド、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、および小分子からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記操作されたＷｎｔアゴニストが組織標的化分子を組み込み、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記組織標的化分子が、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体または抗体断片であり、必要に応じて、前記組織が肺組織である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記障害が肺線維症であり、前記対象が前記Ｗｎｔアンタゴニストで処置される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記障害が肺線維症であり、前記対象が、前記Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジン模倣物、または前記Ｗｎｔアゴニストと組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサーもしくはＲ－スポンジン模倣物との組み合わせで処置される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｗｎｔアゴニストおよび／または前記Ｗｎｔアンタゴニストが、マルチＦＺＤ特異的またはモノＦＺＤ特異的である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＦＺＤ５、８またはＦＺＤ１、２、７に特異的であり、前記障害が、肺線維症および／またはＣＯＰＤなどの間質性肺疾患である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｗｎｔアゴニストまたは前記Ｗｎｔアンタゴニストが、ＦＺＤ４モノ特異的またはＦＺＤ５モノ特異的である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記障害がＣＯＰＤであり、前記対象が前記Ｗｎｔアゴニストで処置される、項目１に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】