特表 2024-533375 同種異系ヒトＴ細胞の代替生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】同種異系ヒトＴ細胞の代替生成

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240905BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240905BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240905BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 15/19 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240905BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61K35/28

A61P37/02

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/06

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/12

C12N15/19

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N5/0783

C12N15/86 Z

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515385

(86)(22)【出願日】2022-09-08

(85)【翻訳文提出日】2024-05-07

(86)【国際出願番号】 US2022042869

(87)【国際公開番号】W WO2023039041

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/242,909

(32)【優先日】2021-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518431004

【氏名又は名称】カイト ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】ベドヤ、 フェリペ

(72)【発明者】

【氏名】バレ、 デイヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ペダレディガリ、 ヴィジャ ゴパル レディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB44

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖を下方制御することができる核酸を含み並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ドミナントネガティブ受容体及び／又はスイッチ受容体をコードする外因性核酸をさらに含む、養子Ｔ細胞療法に適した遺伝子編集修飾免疫細胞を提供する。また、修飾免疫細胞を生成するための組成物及び方法、並びに養子療法及び疾患又は症状の治療に修飾免疫細胞を使用する方法も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む修飾免疫細胞：
（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群より選択される内因性免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失であって、該挿入及び／又は欠失は、１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる、挿入及び／又は欠失、及び
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸、及び、任意選択で、
（ｃ）ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９又はそれらの組み合わせをさらに含む。

【請求項2】

前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる、請求項１に記載の修飾免疫細胞：
（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γから選択されるＴ細胞受容体サブユニット、
（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ及び／又はＮＬＲＣ５から選択されるＨＬＡクラスＩ分子、並びに、
（ｃ）ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及び／又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子。

【請求項3】

（ａ）前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：
（ｉ）ＣＤ３δの遺伝子発現、及び、
（ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現、又は
（ｂ）前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：
（ｉ）ＣＤ３εの遺伝子発現、及び、
（ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現、又は、
（ｃ）前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：
（ｉ）ＣＤ３γの遺伝子発現、及び、
（ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現、
請求項２に記載の修飾免疫細胞。

【請求項4】

前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる、請求項１～３の何れか１項に記載の修飾免疫細胞：
（Ｉ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖、又は
（ＩＩ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖、又は
（ＩＩＩ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【請求項5】

（ａ）前記修飾修飾免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ及び樹状細胞からなる群より選択される、及び／又は、
（ｂ）前記修飾免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である、及び／又は
（ｃ）前記修飾免疫細胞は、同種異形Ｔ細胞又は自己ヒトＴ細胞である、
請求項１～４の何れか１項に記載の修飾免疫細胞。

【請求項6】

前記挿入及び／又は欠失は、以下からなる群から選択される遺伝子編集の結果である、請求項１～５の何れか１項に記載の修飾免疫細胞：
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系及びガイドＲＮＡ、
（ｂ）ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系又はメガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、及び、
（ｃ）アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される遺伝子サイレンシング系。

【請求項7】

（ａ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＭＡＤ７又はそれらの任意の組み合わせ、を含む、又は、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｐＡｄ５／Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターを含む、又は、
（ｃ）前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む、
請求項６に記載の修飾免疫細胞。

【請求項8】

（ａ）前記ガイドＲＮＡは、（１）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン又は（２）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１内の配列と相補的である、又は、
（ｂ）前記配列は、ＣＤ３δ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５３によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｃ）前記配列は、ＣＤ３ε遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５２によってコードされる核酸配列を含む。又は、
（ｄ）前記配列は、ＣＤ３γ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５４によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｅ）前記配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５５によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｆ）前記配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６１によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｇ）前記配列は、ＴＡＰ１遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５６によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｈ）前記配列は、ＴＡＰ２遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５７によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｉ）前記配列は、ＴＡＰＢＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５９又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｊ）前記配列は、ＮＬＲＣ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６０によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｋ）前記配列は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６２によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｌ）前記配列は、ＲＦＸ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号６４又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｍ）前記配列は、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６５によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｎ）前記配列は、ＲＦＸＡＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６６によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｏ）前記配列は、Ｉｉ鎖遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６７、配列番号６８又は組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、
請求項７に記載の修飾免疫細胞。

【請求項9】

（ａ）前記免疫細胞は、該修飾免疫細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する、
（ｂ）前記免疫細胞は、該修飾免疫細胞が対象に投与された場合、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる挿入及び／又は欠失を含む免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する、及び任意選択で、前記免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答であり、さらに任意選択で、ＧｖＨＤ応答の低下は、ＨＬＡ－Ｉ不一致細胞又はＨＬＡ－ＩＩ不一致細胞に対して誘発される、
請求項１～８の何れか１項に記載の修飾免疫細胞。

【請求項10】

（ａ）前記ＧｖＨＤ応答は、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約９５％以上、低下する、又は、
（ｂ）前記ＧｖＨＤ応答は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上又は約２００倍以上、低下する、及び／又は、
（ｃ）前記修飾免疫細胞による前記ＧｖＨＤ応答の低下は、１つ又は複数の遺伝子座における欠失及び／又は挿入のない同等の免疫細胞、又は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡにおける欠失及び／又は挿入を含む免疫細胞と比較される、
請求項９に記載の修飾免疫細胞。

【請求項11】

前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、該ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の修飾免疫細胞。

【請求項12】

（ａ）前記抗原結合ドメインは、全長抗体若しくはその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、単一特異性Ｆａｂ_２、二重特異性Ｆａｂ_２、三重特異性Ｆａｂ_２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含み、及び／又は、
（ｂ）前記膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファー鎖、ベータ鎖若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１５４、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の膜貫通ドメインから選択され、及び／又は、
（ｃ）前記共刺激ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の細胞内ドメイン又はそれらのバリアントからなる群から選択されるタンパク質の１つ又は複数の共刺激ドメインを含み、及び／又は、
（ｄ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ又はそれらのバリアントからなる群から選択される細胞内ドメインを含む、及び／又は、
（ｅ）前記腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインは、以下のとおりある：
（ｉ）血液悪性腫瘍に関連する、
（ｉｉ）固形腫瘍に関連する、及び／又は、
（ｉｉｉ）ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）、及び／又は、
（ｆ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）を含む、及び／又は、
（ｇ）前記ＣＡＲ、は以下を含む：
（ｉ）ＰＳＭＡ抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、
（ｉｉ）メソセリン抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又は、
（ｉｉｉ）ＴｎＭＵＣ１抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、
請求項１１に記載の修飾免疫細胞。

【請求項13】

（ａ）前記スイッチ受容体は、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び正のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含む、及び／又は、
（ｂ）前記ドミナントネガティブ受容体は、以下を含む：
（ｉ）負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断型バリアント、
（ｉｉ）細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを実質的に欠く、負のシグナルに関連する野生型タンパク質のバリアント、又は、
（ｉｉｉ）負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、
請求項１～１２の何れか１項に記載の修飾免疫細胞。

【請求項14】

（ａ）前記負のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８及びＴＩＭ－３からなる群から選択される、及び／又は、
（ｂ）前記正のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択される、及び／又は、
（ｃ）前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択される、及び／又は、
（ｄ）前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ１、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＧ８又はＴＧＦβＲドミナントネガティブ受容体である、及び／又は、
（ｅ）前記膜貫通ドメインは、以下のとおりである：
（ｉ）ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインから選択される、
（ｉｉ）前記負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通部又は前記負のシグナルに関連タンパク質の膜貫通ドメインから選択される、
請求項１３に記載の修飾免疫細胞。

【請求項15】

ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（ｌｉ鎖）からなる群から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む、単離修飾Ｔ細胞であって、
前記機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、以下の少なくとも１つを発揮する：
（ｉ）非修飾のＴ細胞と比較してＴ細胞受容体の発現が減少する、
（ｉｉ）障害ポリペプチドの発現が減少する、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体複合体の表面発現が完全に欠如する、及び、
（ｉｖ）Ｔ細胞受容体の架橋結合が減少する又は不十分である。

【請求項16】

（ａ）前記修飾Ｔ細胞は、該修飾Ｔ細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾Ｔ細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する、及び／又は、
（ｂ）前記修飾Ｔ細胞は、２つ以上の機能障害ポリペプチドを含み、第２の障害ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体鎖（ＴＲＡＣ）である、及び／又は、
（ｃ）前記修飾Ｔ細胞は、以下を含む：
（ｉ）ＴＲＡＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される３つ以上の機能障害ポリペプチド、
（ｉｉ）ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つの機能障害ポリペプチド、
（ｉｉｉ）ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される３つの機能障害ポリペプチド、
（ｉｖ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される機能障害ポリペプチド並びにＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、又は、
（ｖ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される機能障害ポリペプチド並びにＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される機能障害ポリペプチド、及び／又は、
（ｄ）前記修飾Ｔ細胞は、以下を含む：
（ｉ）機能障害ＣＤ３δ及びＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、
（ｉｉ）機能障害ＣＤ３ε及びＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、又は、
（ｉｉｉ）機能障害ＣＤ３γ及びＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、及び／又は、
（ｅ）前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つ以上の機能障害ポリペプチドを含み、及び／又は、
（ｆ）前記修飾Ｔ細胞は、
（ｉ）ＴＲＡＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖又はそれらの任意の組み合わせの発現が低下している、又は、
（ｉｉ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖又はそれらの任意の組み合わせを発現しない、及び／又は、
（ｇ）前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣ２ＴＡから選択される機能障害ポリペプチドをさらに含む、及び／又は、
（ｈ）前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ若しくはＣ２ＴＡの発現が低下しているか、又はＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ若しくはＣ２ＴＡを発現しない、及び／又は、
（ｉ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γの修飾は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の機能障害につながる、及び／又は、
（ｊ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン、任意選択で、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１を標的とすることによって修飾される、
請求項１５に記載の単離修飾Ｔ細胞。

【請求項17】

修飾免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）免疫細胞に、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を導入する工程、
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸を免疫細胞に導入する工程、及び、
（ｃ）前記修飾免疫細胞を増殖させてＴ細胞の集団を生成する工程、及び任意選択で、
（ｄ）ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸を前記免疫細胞に導入する工程をさらに含む。

【請求項18】

（ａ）１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：
（ｉ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γから選択されるＴ細胞受容体サブユニット、
（ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ又はＮＬＲＣ５から選択されるＨＬＡクラスＩ分子、及び、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子、及び／又は、
（ｂ）１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３δの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができ、及び／又は、
（ｃ）１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３εの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができ、及び／又は、
（ｄ）１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３γ並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる、
請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる、請求項１７又は１８に記載の方法：
（Ｉ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖、又は、
（ＩＩ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖、又は、
（ＩＩＩ）以下の何れか１つ：
（ａ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、
（ｂ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、
（ｃ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、
（ｄ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｅ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｆ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、
（ｇ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、
（ｈ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、
（ｉ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、
（ｊ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｋ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｌ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、
（ｍ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、
（ｎ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、
（ｏ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、
（ｐ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｑ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｒ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、
（ｓ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、
（ｔ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、
（ｕ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、
（ｖ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｗ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、
（ｘ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、
（ｙ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、
（ｚ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、
（ａａ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、
（ｂｂ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、
（ｃｃ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は
（ｄｄ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【請求項20】

（ａ）前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、リンパ前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ及び樹状細胞、及び／又は、
（ｂ）前記免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞、及び／又は、
（ｃ）前記免疫細胞は、同種異系Ｔ細胞又は自己Ｔ細胞である、
請求項１７～１９の何れか１項に記載の方法。

【請求項21】

（ａ）前記核酸は、ウイルス形質導入によって免疫細胞に導入され、該ウイルス形質導入は、該免疫細胞を、１つ又は複数の核酸を含むウイルスベクターと接触させることを含む、及び／又は、
（ｂ）前記核酸は、ウイルス形質導入によって免疫細胞に導入され、該ウイルス形質導入は、該免疫細胞を、１つ又は複数の核酸を含むウイルスベクターと接触させることを含み、さらに、該ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、及び／又は、
（ｃ）発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸のそれぞれは、以下の群から選択される遺伝子編集系を含む：
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系及びガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系又はメガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、及び、
（ｉｉｉ）アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される遺伝子サイレンシング系、
請求項１７～２０の何れか１項に記載の方法。

【請求項22】

（ａ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＭＡＤ７又はそれらの任意の組み合わせ、を含む、及び／又は、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｐＡｄ５／Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターを含む、及び／又は、
（ｃ）前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む、及び／又は、
（ｄ）前記ガイドＲＮＡは、（１）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε若しくはＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン又は（２）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε若しくはＣＤ３γのエクソン１内の配列と相補的である、又は、
（ｅ）前記配列は、ＣＤ３δ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは配列番号５３によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｆ）前記配列は、ＣＤ３ε遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５２によってコードされる核酸配列を含む。又は、
（ｇ）前記配列は、ＣＤ３γ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５４によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｈ）前記配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５５によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｉ）前記配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６１によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｊ）前記配列は、ＴＡＰ１遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５６によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｋ）前記配列は、ＴＡＰ２遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５７によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｌ）前記配列は、ＴＡＰＢＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５９又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｍ）前記配列は、ＮＬＲＣ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６０によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｎ）前記配列は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６２によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｏ）前記配列は、ＲＦＸ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号６４又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｐ）前記配列は、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６５によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｑ）前記配列は、ＲＦＸＡＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６６によってコードされる核酸配列を含む、又は、
（ｒ）前記配列は、Ｉｉ鎖遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６７、配列番号６８又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む、
請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

（ａ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する、
（ｂ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を含む免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する、及び／又は、
（ｃ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、対象において低下した免疫応答を発揮し、該免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答である、及び／又は、
（ｄ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、対象において低下した免疫応答を発揮し、該免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答であり、さらに、該ＧｖＨＤ応答の低下は、ＨＬＡ－Ｉ不一致細胞又はＨＬＡ－ＩＩ不一致細胞に対して誘発される、
（ｅ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、対象において低下した免疫応答を発揮し、該免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答であり、さらに、該ＧｖＨＤ応答は、以下のとおりである：
（ｉ）約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約９５％以上、低下する、又は、
（ｉｉ）前記ＧｖＨＤ応答は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上又は約２００倍以上低下する、及び／又は、
（ｆ）前記免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、対象において低下した免疫応答を発揮し、該免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答であり、さらに、前記修飾免疫細胞による低下したＧｖＨＤ応答が、１つ又は複数の遺伝子座における欠失及び／又は挿入を含まない同等の免疫細胞、又は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡにおける欠失及び／又は挿入を含む免疫細胞と比較される。
請求項１７～２２の何れか１項に記載の方法。

【請求項24】

（ａ）前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、該ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、及び／又は、
（ｂ）前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、該ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、さらに腫瘍抗原を標的とする該抗原結合ドメインは、以下のとおりある：
（ｉ）血液悪性腫瘍に関連する、
（ｉｉ）固形腫瘍に関連する、及び／又は、
（ｉｉｉ）ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）、及び／又は、
（ｃ）前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、該ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、さらに該ＣＡＲは、以下を含む：
（ｉ）ＰＳＭＡ抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、
（ｉｉ）メソセリン抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又は、
（ｉｉｉ）ＴｎＭＵＣ１抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、及び／又は、
（ｄ）前記スイッチ受容体は、以下を含み：
（ｉ）ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＩＳＧ３、ＶＳＩＧ８、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ－３からなる群より選択される、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び、
（ｉｉｉ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群より選択される正のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメイン、及び／又は、
（ｅ）前記ドミナントネガティブ受容体は、以下を含む：
（ｉ）負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断型バリアント、
（ｉｉ）細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを実質的に欠く、負のシグナルに関連する野生型タンパク質のバリアント、又は、
（ｉｉｉ）負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、及び／又は、
（ｆ）前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択される、及び／又は、
（ｇ）前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ１、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＧ８又はＴＧＦβＲドミナントネガティブ受容体である、及び／又は、
（ｈ）前記膜貫通ドメインは、以下のとおりである：
（ｉ）ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインから選択される、
（ｉｉ）前記負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通部又は前記負のシグナルに関連タンパク質の膜貫通ドメインから選択される、
請求項１７～２３の何れか１項に記載の方法。

【請求項25】

（ａ）前記修飾免疫細胞の増殖は、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータ、ＩＬ－１０及びｃ－ｋｉｔリガンドからなる群より選択される因子でＴ細胞を培養する工程を含む、及び／又は
（ｂ）前記免疫細胞の多能性を誘導するために、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２をコードするポリペプチド及び／又は核酸を免疫細胞に導入する工程をさらに含む、及び／又は、
（ｃ）前記免疫細胞は、血液サンプル、全血サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル又はアフェレーシスサンプルから得られる、及び／又は、
（ｄ）前記免疫細胞は、アフェレーシスサンプルから得られ、さらに該アフェレーシスサンプルは、凍結保存サンプルである、及び／又は、
（ｅ）前記免疫細胞は、アフェレーシスサンプルから得られ、さらに該アフェレーシスサンプルは、新鮮サンプルである、及び／又は、
（ｆ）前記免疫細胞は、ヒト対象から得られる、
請求項１７～２４の何れか１項に記載の方法。

【請求項26】

請求項１７～２５の何れか１項に記載の方法から得られる修飾免疫細胞の集団。

【請求項27】

請求項１～１６の何れか１項に記載の修飾免疫細胞若しくは修飾Ｔ細胞又は請求項２６に記載の修飾免疫細胞の集団及び薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含む組成物。

【請求項28】

請求項２７に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における免疫増強に関連する疾患又は症状を治療する方法。

【請求項29】

（ａ）前記症状は、癌であり、及び／又は
（ｂ）前記症状は、癌であり、さらに該癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、及び／又は、
（ｃ）前記症状は、癌であり、該癌は、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である、
請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

請求項１～１６の何れか１項に記載の修飾免疫細胞若しくは修飾Ｔ細胞、請求項２６に記載の修飾免疫細胞の集団又は請求項２７に記載の組成物を対象に投与することを含む、癌を治療する方法。

【請求項31】

前記癌は、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

請求項１～１６の何れか１項に記載の修飾免疫細胞若しくは修飾Ｔ細胞、請求項２６に記載の修飾免疫細胞の集団又は請求項２７に記載の組成物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞又は組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法。

【請求項33】

請求項１～１６の何れか１項に記載の修飾免疫細胞、請求項２６に記載の修飾免疫細胞の集団又は請求項２７に記載の組成物を含み、任意選択で使用説明書を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照：
本出願は、２０２１年９月１０日に出願された米国仮出願第６３／２４２，９０９号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照により特に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で生成された自己抗原特異的Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）を患者に戻すものであり、癌、感染症、自己免疫疾患（ａｕｔｏ－ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）の治療に有望な戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ）であることが示されている。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現（ｅｘｐｒｅｓｓ）するように組み換えられた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）一次細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）であり、エクスビボで増殖して一次免疫細胞を癌細胞等の病理学的細胞に誘導する。ＣＡＲは、単一の融合分子（ｓｉｎｇｌｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）内の１つ又は複数のシグナル伝達ドメインに関連付けられた標的部分からなる合成抗体様分子であり、Ｔ細胞に抗原特異性を伝達するように設計されている。ＣＡＲは、リンパ腫や固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍の腫瘍細胞表面に発現する抗原に対してＴ細胞をリダイレクト（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）させることに成功している。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、特定の種類の癌の治療において長期的な有効性も示す。

【0003】

しかしながら、養子免疫療法は現在、自己細胞移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）に基づいている。自己免疫療法では、患者から単離され、エクスビボで遺伝子組換え又は選択され、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養され、患者に再び注入された患者自身のリンパ球に基づいて、患者は個別化された治療を受ける。自己養子免疫療法は承認され、一般的に成功しているにもかかわらず、そのような治療法の拡張性と実現可能性には大きな課題がある。自己養子免疫療法は依然としてかなり複雑であり、専門知識と臨床管理、そして高価な専用施設を必要とする。また、ＣＡＲ製造中に病気が急速に進行したり、治療前に患者の免疫機能が低下したりするため、養子免疫療法を受けることができない患者も多く存在する。そのため、癌免疫療法の広範な臨床応用は、自己ＣＡＲ Ｔ細胞の個別化調製によって課せられる相当な経済的制約によって制限されている。したがって、同種治療用細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）が事前に製造され、詳細に特徴付けられ、幅広い患者に即時に投与できる標準化された養子免疫療法が必要である。

【0004】

同種免疫療法（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、同種Ｔ細胞反応（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）等の多くの合併症を引き起こす可能性のある危険な処置であり、同種Ｔ細胞反応は、臨床的には移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＧＶＨＤ）及び／又は宿主対移植片病（Ｈｏｓｔ－ｖｅｒｓｕｓ－Ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＨｖＧＤ、移植片拒絶）として現れる。ＧｖＨＤは、ドナーＣＡＲ細胞上のアロ反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ＴＣＲを介して注入された同種異形ＣＡＲ－Ｔ細胞による受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）組織の攻撃によって引き起こされる。特に、注入されたＴ細胞上の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）Ｔ細胞受容体アルファー（ＴＣＲα；ＴＲＡＣ）及びベータ（ＴＣＲβ；ＴＲＢＣ）鎖は、受容体内の主要及びマイナー組織適合性抗原を認識し、ＧｖＨＤを引き起こす可能性がある。逆に、注入された同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は受容者のＴリンパ球によって拒絶され、ＨｖＧＤを引き起こす可能性がある。このように、同種固有の免疫応答を制御する標準的な解決策が特定されれば、同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の使用により、養子免疫療法の適用性と汎用性が向上するであろう。ＧｖＨＤを特異的に阻害することで、同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の安全かつ効果的な使用が可能になる。

【発明の概要】

【発明が解決すべき課題】

【0005】

従って、宿主免疫応答を誘発しないＣＡＲ－Ｔ細胞の改良された方法に対する必要性が存在する。具体的には、改善された適合性を有する同種異形Ｔ細胞を生成するための新規な代替組成物及び方法が必要とされている。

【0006】

本発明は、これらのニーズに対処する方法及び組成物を提供する。
概要：

【課題を解決するための手段】

【0007】

一つの態様において、本開示は、以下を含む修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）免疫細胞：（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群より選択される内因性免疫タンパク質をそれぞれコードする（ｅｎｃｏｄｅｉｎｇ）１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失、を提供する。前記挿入及び／又は欠失は、１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を下方制御する（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）ことができる。さらに、前記修飾免疫細胞は、（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）核酸、を含む。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞は、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γから選択されるＴ細胞受容体サブユニッット、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ及び／又はＮＬＲＣ５から選択されるＨＬＡクラスＩ分子、並びに、（ｃ）ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及び／又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子。

【0009】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３δの遺伝子発現、及び、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現。

【0010】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３εの遺伝子発現、及び、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現。

【0011】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３γの遺伝子発現、及び、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現。

【0012】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（ｐ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（ｑ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0013】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0014】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（ｐ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（ｑ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0015】

いくつかの実施形態において、前記修飾修飾免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ、樹状細胞又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞は、同種異形Ｔ細胞又は自己ヒトＴ細胞である。

【0016】

いくつかの実施形態において、前記挿入及び／又は欠失は、以下からなる群から選択される遺伝子編集の結果である、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系及びガイドＲＮＡ、（ｂ）ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系又はメガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、及び、（ｃ）アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される遺伝子サイレンシング系。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｐＡｄ５／Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＭＡＤ７ヌクレアーゼ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ａ ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ ｎｕｃｌｅａｓｅ））又はそれらの任意の組み合わせ、を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、ガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン内の配列と相補的である。

【0018】

いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＣＤ３δ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは配列番号５３によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＣＤ３ε遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５２によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、
ＣＤ３γ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５４によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５５によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６１によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＴＡＰ１遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５６によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＴＡＰ２遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５７によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＴＡＰＢＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５９又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＮＬＲＣ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６０によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６２によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＲＦＸ５遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号６４又はそれらの組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６５によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、ＲＦＸＡＰ遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６６によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記相補的配列は、Ｉｉ鎖遺伝子座内にあり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６７、配列番号６８又はそれらの任意の組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。

【0019】

本開示の一態様において、前記修飾免疫細胞は、該修飾免疫細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。

【0020】

いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞は、該修飾免疫細胞が対象に投与された場合、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる挿入及び／又は欠失を含む免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。いくつかの実施形態において、前記免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答である。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞による前記ＧｖＨＤ応答の低下は、１つ又は複数の遺伝子座における欠失及び／又は挿入のない同等の免疫細胞、又はＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡにおける欠失及び／又は挿入を含む免疫細胞と比較される。いくつかの実施形態において、ＧｖＨＤ応答の低下は、ＨＬＡ－Ｉ不一致細胞に対して又はＨＬＡ－ＩＩ不一致細胞に対して誘発される。

【0021】

いくつかの実施形態において、前記ＧｖＨＤ応答は、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約９５％以上、低下する。いくつかの実施形態において、前記ＧｖＨＤ応答は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上又は約２００倍以上低下する。

【0022】

本開示の一つの態様において、前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメインは、全長抗体若しくはその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、単一特異性Ｆａｂ_２、二重特異性Ｆａｂ_２、三重特異性Ｆａｂ_２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含む。

【0023】

前記修飾免疫細胞のいくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファー鎖、ベータ鎖若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１５４、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の膜貫通ドメインから選択される。

【0024】

前記修飾免疫細胞のいくつかの実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の細胞内ドメイン又はそれらのバリアントからなる群から選択されるタンパク質の１つ又は複数の共刺激ドメインを含む。

【0025】

前記修飾免疫細胞のいくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ又はそれらのバリアントからなる群から選択される細胞内ドメインを含む。

【0026】

前記修飾免疫細胞のいくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインは、血液悪性腫瘍に関連する及び／又は固形腫瘍に関連する。いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、及びインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）からなる群から選択される腫瘍抗原を標的とする。

【0027】

いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは、（ａ）ＰＳＭＡ抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン又は（ｂ）メソセリン抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン又は（ｃ）ＴｎＭＵＣ１抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

【0028】

本開示の一態様において、前記修飾免疫細胞は、さらにスイッチ受容体を含む。いくつかの実施形態において、前記スイッチ受容体は、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び正のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含む。

【0029】

いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞は、さらに前記ドミナントネガティブ受容体を含む。いくつかの実施形態において、前記ドミナントネガティブ受容体は、（ａ）負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断型バリアント又は（ｂ）細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを実質的に欠く、負のシグナルに関連する野生型タンパク質のバリアント、又は、（ｃ）負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、を含む。いくつかの実施形態において、前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ１、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＧ８又はＴＧＦβＲドミナントネガティブ受容体である。

【0030】

いくつかの実施形態において、前記負のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記正のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択される。

【0031】

いくつかの実施形態において、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１Ａ１３２Ｌ－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択される。

【0032】

前記修飾免疫細胞のいくつかの実施形態において、前記スイッチ受容体の膜貫通ドメインは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。いくつかの実施形態において、前記スイッチ受容体の膜貫通ドメインは、負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通部又は前記負のシグナルに関連タンパク質の膜貫通ドメインから選択される。

【0033】

いくつかの態様において、本開示は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（ｌｉ鎖）からなる群から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む、単離修飾Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、以下の少なくとも１つを発揮する：（ｉ）非修飾のＴ細胞と比較してＴ細胞受容体の発現が減少する、（ｉｉ）障害ポリペプチドの発現が減少する、（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体複合体の表面発現が完全に欠如する、及び／又は、（ｉｖ）Ｔ細胞受容体の架橋結合が減少する又は不十分である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、該修飾Ｔ細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾Ｔ細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。

【0034】

いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、２つ以上の機能障害ポリペプチドを含み、第２の障害ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＲＡＣ）である及び／又はＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）である。

【0035】

いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、以下を含む：（ａ）ＴＲＡＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される３つ以上の機能障害ポリペプチド、又は、（ｂ）ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つの機能障害ポリペプチド、又は（ｃ）ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される３つの機能障害ポリペプチド、又は、（ｄ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される機能障害ポリペプチド並びにＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、又は、（ｅ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される機能障害ポリペプチド並びにＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される機能障害ポリペプチド。

【0036】

いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、以下を含む：（ａ）機能障害ＣＤ３δ及びＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、（ｂ）機能障害ＣＤ３ε及びＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、又は、（ｃ）機能障害ＣＤ３γ及びＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド。

【0037】

いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つ以上の機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖又はそれらの任意の組み合わせの発現が低下している。いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖又はそれらの任意の組み合わせを発現しない。

【0038】

いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣ２ＴＡから選択される機能障害ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ若しくはＣ２ＴＡの発現が低下しているか、又はＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ若しくはＣ２ＴＡを発現しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γの修飾は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の機能障害につながる。ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの少なくとも一つは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン、任意選択で、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１を標的とすることによって修飾される。

【0039】

本開示の一つの態様は、（ａ）免疫細胞に、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を導入する工程、（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸を免疫細胞に導入する工程、及び、（ｃ）前記修飾免疫細胞を増殖させてＴ細胞の集団を生成する工程、を含む修飾免疫細胞を生成する方法、を提供する。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞を生成する方法は、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸を前記免疫細胞に導入する工程をさらに含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞に導入される１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる：（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γから選択されるＴ細胞受容体サブユニット、及び／又は、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ又はＮＬＲＣ５から選択されるＨＬＡクラスＩ分子、及び／又は、（ｃ）ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子。

【0041】

いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３δの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３εの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる。いくつかの実施形態において、前記修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、ＣＤ３γ並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる。

【0042】

いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（ｐ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（ｑ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0043】

いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0044】

いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞に導入された１つ又は複数の核酸は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる：（ａ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（ｂ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（ｃ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（ｄ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｅ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｆ）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（ｇ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（ｈ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（ｉ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（ｊ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（ｋ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｌ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（ｍ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（ｎ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（ｏ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（ｐ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（ｑ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｒ）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（ｓ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（ｔ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（ｕ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（ｖ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（ｗ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（ｘ）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（ｙ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（ｚ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（ａａ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（ｂｂ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（ｃｃ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（ｄｄ）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0045】

いくつかの実施形態では、修飾される前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、リンパ前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ及び樹状細胞から選択される。いくつかの実施形態では、修飾される前記免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では修飾される前記免疫細胞は、同種異系Ｔ細胞又は自己Ｔ細胞である。

【0046】

いくつかの実施形態では、前記核酸は、ウイルス形質導入（ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって前記免疫細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記ウイルス形質導入は、前記免疫細胞を、前記１つ又は複数の核酸を含むウイルスベクターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。

【0047】

いくつかの実施形態では、１つ又は複数の内因性免疫遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸のそれぞれは、以下の群から選択される遺伝子編集系を含む：（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系及びガイドＲＮＡ、（ｂ）ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系又はメガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、及び、（ｃ）アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される遺伝子サイレンシング系。

【0048】

いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＭＡＤ７ヌクレア－ゼ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）又はそれらの任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はｐＡｄ５／Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターを含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン内の配列と相補的である。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１内の配列と相補的である。

【0051】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５３によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３ε遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５２によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３γ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５４によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５５によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６１によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰ１遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５６によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰ２遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５７によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰＢＰ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５９又はそれらの任意の組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＮＬＲＣ５遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６０によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６２によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸ５遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号６４又はそれらの任意の組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６５によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸＡＰ遺伝子座内の配列と相補的であり、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６６によってコードされる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞に導入される前記ガイドＲＮＡは、Ｉｉ鎖遺伝子座内の配列と相補的であり、ガイドＲＮＡは、配列番号６７、配列番号６８又は任意の組み合わせによってコードされる核酸配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成される前記修飾免疫細胞は、該修飾免疫細胞が対象に投与された場合、同じ対象に投与された非修飾免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。

【0053】

いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成される前記修飾免疫細胞は、該免疫細胞が対象に投与された場合、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を含む免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成した前記修飾免疫細胞による低下したＧｖＨＤ応答は、１つ又は複数の遺伝子座における欠失及び／又は挿入を含まない同等の免疫細胞、又はＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡにおける欠失及び／又は挿入を含む免疫細胞と比較される。

【0054】

いくつかの実施形態では、前記免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答である。いくつかの実施形態では、前記ＧｖＨＤ応答の低下は、ＨＬＡ－Ｉ不一致細胞又はＨＬＡ－ＩＩ不一致細胞に対して誘発される。いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成された前記修飾免疫細胞により誘発される前記ＧｖＨＤ応答は、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約９５％以上、低下する。いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成された前記修飾免疫細胞により誘発される前記ＧｖＨＤ応答は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上又は約２００倍以上、低下する。

【0055】

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞を導入された前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、腫瘍抗原を標的とする該抗原結合ドメインは、血液悪性腫瘍に関連する及び／又は固形腫瘍に関連する。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、及びインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）からなる群から選択される腫瘍抗原を標的とする。

【0057】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞を導入された前記ＣＡＲは、（ａ）ＰＳＭＡ抗原結合ドメイン（例えば、配列番号７３又は７４）、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン又は（ｂ）メソセリン抗原結合ドメイン（例えば、配列番号７５）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ｃ）又は（ｃ）ＴｎＭＵＣ１抗原結合ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含み、メソテリンＣＡＲは、配列番号７１又は配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲは、配列番号６９に示される核酸配列によってコードされる。

【0058】

本開示の一つの態様では、前記修飾免疫細胞を導入された前記スイッチ受容体は、（ａ）ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＩＳＧ３、ＶＳＩＧ８、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ－３からなる群より選択される、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン（ｂ）膜貫通ドメイン、及び、（ｃ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群より選択される正のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメイン、を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択される。

【0060】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞を導入された前記ドミナントネガティブ受容体は、（ａ）負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断型バリアント、又は（ｂ）細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを実質的に欠く、負のシグナルに関連する野生型タンパク質のバリアント、又は、（ｃ）負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ１、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＧ８又はＴＧＦβＲドミナントネガティブ受容体である。

【0061】

いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体の前記膜貫通ドメインは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体の前記膜貫通ドメインは、負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通部又は前記負のシグナルに関連タンパク質の膜貫通ドメインから選択される。

【0062】

本開示の１つの態様では、前記修飾免疫細胞の増殖を提供する。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞の増殖は、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータ、ＩＬ－１０及びｃ－ｋｉｔリガンドからなる群より選択される因子でＴ細胞を培養する工程を含む。本開示の１つの態様では、前記免疫細胞の多能性を誘導するために、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２をコードするポリペプチド及び／又は核酸を免疫細胞に導入する工程をさらに含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、血液サンプル、全血サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル、又はアフェレーシスサンプルから得られる。いくつかの実施形態では、前記アフェレーシスサンプルは、凍結保存サンプルである。いくつかの実施形態では、前記アフェレーシスサンプルは、新鮮サンプルである。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ヒト対象から得られる。

【0064】

本開示の１つの態様では、先行する実施態様の何れか一つの方法から得られる修飾免疫細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、先行する実施態様の何れか一つの修飾免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、先行する実施態様の何れか一つに開示される方法により生成される修飾免疫細胞の集団及び薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含む。

【0065】

本開示の１つの態様は、先行する実施態様の何れか一つに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における免疫増強に関連する疾患又は症状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記症状は、癌である。いくつかの実施形態では、前記癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記癌は、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、先行する実施態様の何れか一つの修飾免疫細胞、先行する実施態様の何れか一つの修飾Ｔ細胞の集団又は先行する実施態様の何れか一つの組成物を対象に投与することを含む癌を治療する方法を含む。

【0066】

本開示の１つの態様は、先行する実施態様の何れか一つの修飾免疫細胞、先行する実施態様の何れか一つの修飾免疫細胞の集団又は先行する実施態様の何れか一つの組成物を含む、有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞又は組織に対するＴ細胞を刺激する方法を提供する。

【0067】

本開示の１つの態様は、先行する実施態様の何れか一つの修飾免疫細胞、先行する実施態様の何れか一つの修飾Ｔ細胞の集団又は先行する実施態様の何れか一つの組成物を含み、任意選択で使用説明書を含むキットを提供する。

【0068】

前述の要約と、以下の図面及び詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものである。これらは、本開示の更なる詳細を提供することを意図しているが、限定するものとして解釈されるものではない。他の目的、利点、及び新規な特徴は、本開示の以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0069】

図１は、３つの二量体モジュールＣＤ３δ／ＣＤ３ε、ＣＤ３γ／ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζに結合した可変ＴＣＲアルファー鎖（ＴＣＲ－α、ＴＲＡＣ）及びＴＣＲベータ鎖（ＴＣＲ－β、ＴＲＢＣ）を含むヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－ＣＤ３複合体の概略図を示す。ＣＤ３δ／ＣＤ３ε及びＣＤ３γ／ＣＤ３εモジュールが本開示の主題である。

【0070】

図２Ａ～２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたＣＤ３δ（図２Ａ）、ＣＤ３ε（図２Ｂ）及びＣＤ３γ（図２Ｃ）遺伝子の標的破壊後のフローサイトメトリーにより測定される、ヒトＴ細胞上のＴＣＲ－α及びＴＣＲ－β鎖の破壊効率を示す棒グラフである。

【0071】

図３は、図１の戦略を使用して生成された同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示すグラフであり、１０日間の集団倍加数を示す。試験された前記同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）（ＴＲＡＣ ＫＯ）、ＣＤ３δ、ノックアウト（Ｄ１ ＫＯ）、ＣＤ３γノックアウト（Ｇ４ ＫＯ）及びＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）を含む組み換えＴ細胞である。

【0072】

図４Ａ及び４Ｂは、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト、ＣＤ３δノックアウト（Ｄ１ ＫＯ）、ＣＤ３γノックアウト（Ｇ４ ＫＯ）及びＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）のＣＲＩＳＰＲ媒介下方制御を比較したフローサイトメトリー結果を示す。図４Ａは、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）が、ＴＣＲ－α／β鎖の表面発現によって測定されるように、Ｔ細胞受容体ノックアウトの標的としてより優れていることを示している。図４Ｂは、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）を含む同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が、例えばＣＤ３γ又はＣＤ３δノックアウトを含むＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い形質導入効率を有し、機能的に優れていることを示す；ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の実施形態が図示されている。

【0073】

図５は、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト、ＣＤ３δノックアウト（Ｄ１）、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４）及びＣＤ３γノックアウト（Ｇ４）を含む同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力を示すグラフであり、ＰＳＭＡ Ｅ４同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が最良の殺傷能力を有することを示す。標的細胞は、ＰＣ３細胞である。

【0074】

図６Ａ～６Ｄは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ不一致検出アッセイ（Ｔ７Ｅ１）を使用して図示したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性を示す。図６Ａは、３つの異なるｇＲＮＡを使用して３つの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子の部位から増幅されたＴ７Ｅ１処理ＰＣＲ産物の代表的なゲル電気泳動像を示す。図６Ｂ～６Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集効率を示すＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒエレクトロフェログラムによって生成されたエレクトロフェログラムを示す。

【0075】

図７Ａ～Ｄは、Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）ＣＲＩＳＰＲ編集効率の結果を示す、コントロール及びＴ７Ｅ１処理ＰＣＲのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒエレクトロフェログラム及びゲル電気泳動を示す。特に、図７Ａは、サンプルＣ２ＴＡ－１－ＰＣＲについての総合結果を示し、図７Ｂは、サンプルＣ２ＴＡ－１－Ｔ７Ｅ１についての総合結果を示し、図７Ｃは、サンプルＣ２ＴＡ－２－ＰＣＲについての総合結果を示し、図７Ｄは、サンプルＣ２ＴＡ－２－Ｔ７Ｅ１についての総合結果を示す。

【0076】

図８は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイの結果を示すグラフであり；コントロールＴ細胞（第２ドナー）、同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞単独又は共培養における生存性を示し；ＨＬＡ不一致が存在するにもかかわらず、第２（無関係）ドナー由来のＴ細胞が、共培養において同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に応答して増殖しないことを示す。同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ及びＣＲＩＳＰＲで編集されたＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／Ｃ２ＴＡ ｇＲＮＡを含む。

【発明を実施するための形態】

【0077】

詳細な説明：
Ｉ． 概要：
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体は、少なくとも８つのポリペプチドサブユニット（ＴＣＲαβ、ＣＤ３εγ、ＣＤ３εδ、ＣＤ３ζζ）からなる大きなマルチサブユニット複合体である。ＴＣＲαβヘテロ二量体は、主要組織適合性複合体クラスＩ及びクラスＩＩ分子（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に結合した抗原の認識を担うリガンド結合サブユニットである。ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζは二量体として組織化され、ＴＣＲαβヘテロ二量体によって生成されたシグナルを形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）３つの二量体モジュールＣＤ３δ／ＣＤ３ε、ＣＤ３γ／ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζを形成する。現在まで、ＧｖＨＤ及び／又はＨｖＨＤ回避戦略は、ＴＲＡＣ遺伝子座の標的破壊によるＴＣＲα鎖の下方制御を含む同種異系Ｔ細胞の生成であった。本開示以前には、ＣＤ３α／βの破壊が、同種異系Ｔ細胞の生成を成功させるために重要であると考えられていたため、ＧｖＨＤ及びＨｖＨＤの促進におけるＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζの調節的役割は研究されていなかった。本開示は、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζ遺伝子座の標的破壊（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）により、ＴＲＡＣ遺伝子座の標的破壊を含むＣＡＲ Ｔ細胞と同等及び／又はそれよりも効率的な同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が生成されたという驚くべき発見を詳述する。本開示では、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ遺伝子の少なくとも１つの破壊が好ましい。

【0078】

本発明は、１つ又は複数の内因性Ｔ細胞受容体複合体遺伝子の発現をノックダウンし、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド、腫瘍抗原、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン又はサイトカイン受容体の何れかを発現することにより、修飾Ｔ細胞を生成するための方法及び組成物を含む。

【0079】

したがって、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はスイッチ受容体、及び／又は免疫増強因子と組み合わせた、Ｔ細胞受容体複合体の遺伝子編集されたＣＤ３δ遺伝子、ＣＤ３ε遺伝子、ＣＤ３ζ遺伝子、及び／又はＣＤ３γ遺伝子の少なくとも１つを含む修飾免疫細胞が、当該技術分野で知られている標準的な同種異形Ｔ細胞と比較した場合、インビトロで様々な癌細胞株に対して強力な細胞質活性を示し、またインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で有意な腫瘍根絶を示す、強化された適応性を有する改良された同種異形Ｔ細胞であるという観察に基づいている。

【0080】

養子免疫療法は癌患者にとって大きな期待をもたらす。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲ細胞の製造に関しては現在いくつかの課題が存在する。これらの課題は、養子免疫療法の成功の可能性に影響を与える。

【0081】

同種異形養子免疫療法は承認され、一般的に成功しているにもかかわらず、そのような療法の拡張性と実現可能性には大きな課題がある。特に、養子免疫療法の広範な臨床応用は、同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の個別化調製によって課せられる相当な経済的制約によって制限されている。しかし、標準化された養子免疫療法は、同種異形細胞をあらかじめ製造し、詳細な特性を明らかにし、幅広い患者にすぐに投与できるようにするものであるが、同種異形Ｔ細胞反応等多くの合併症の可能性がある危険な方法であることに変わりはない。同種異形Ｔ細胞反応は、臨床的には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び／又は宿主対移植片病（ＨｖＧＤ、移植片拒絶反応）として現れる。ＧｖＨＤは、ドナーＣＡＲ細胞上のアロ反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ＴＣＲを介した同種異形ＣＡＲ－Ｔ細胞注入によるレシピエント組織の攻撃によって引き起こされる。特に、注入されたＴ細胞上の内因性Ｔ細胞受容体アルファー（ＴＣＲα；ＴＲＡＣ）及びベータ（ＴＣＲβ；ＴＲＢＣ）鎖は、受容体内の主要及びマイナー組織適合性抗原を認識し、ＧｖＨＤを引き起こす。逆に、注入された同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントのＴリンパ球によって拒絶され、ＨｖＧＤを引き起こす可能性がある。特に、輸注Ｔ細胞上の内因性Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα；ＴＲＡＣ）とβ鎖（ＴＣＲβ；ＴＲＢＣ）は、レシピエントの主要組織適合抗原とマイナー組織適合抗原を認識し、ＧｖＨＤを引き起こす。逆に、注入された同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントのＴリンパ球によって拒絶され、ＨｖＧＤに至ることがある。

【0082】

本開示以前は、同種異形Ｔ細胞応答に対処するための一つのアプローチは、ゲノム編集技術を使用して同種異形Ｔ細胞を組み換え、同種異形ドナーＴ細胞におけるＴＣＲα、ＴＣＲβ及び／又は１つ又は複数の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）及び／又はＭＨＣクラスＩＩ複合体の発現を消失させることであった。ＴＣＲαβヘテロ二量体は、ＴＣＲ複合体全体の組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）と活性に必要であるため、ＴＣＲα又はβ鎖の何れかの発現をノックアウトすると、ドナーＣＡＲ Ｔ細胞が宿主のアロ抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ）を認識できなくなり、その結果ＧＶＨＤが起こらなくなる。さらに、ドナーＴ細胞内のＭＨＣ Ｉを編集すると、逆に、レシピエントのＴ細胞によるこれらの同種異形Ｔ細胞が認識できなくなり、その結果、移植片の拒絶が起こらなくなる。現在までに、ＴＲＡＣ遺伝子座の標的破壊によるα鎖の削除は、主にβ鎖が２つのＴＲＢＣ遺伝子（ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２）によってコードされているため、ＧＶＨＤ回避戦略として利用されてきた。そのため、ＴＲＢＣ遺伝子をノックアウトすることは、さらに複雑になる可能性がある。

【0083】

Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡをＴ細胞に最小限の毒性で効率的に導入する最適なプロトコルは、依然として確立されていない。さらに、現在の技術では、ＣＡＲ Ｔ細胞の１００％においてＴＣＲノックアウトは得られない。ＣＡＲ Ｔ療法に有用な同種異形細胞の生成を成功させるためには、１００％のＴＣＲノックアウトが有益であるため、このことは重要である。

【0084】

この問題に対処するために、本開示は、以下の表１に詳述されているように、ＣＤ３ε遺伝子、ＣＤ３γ遺伝子及び／又はＣＤ３δ遺伝子（図１を参照のこと）の破壊を、個々に、並びに少なくとも１つの他の遺伝子ノックアウトと組み合わせて詳述する。（ＣＤ３ζ遺伝子も破壊することができる）。本開示はまた、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ及び／又はＣＤ３δ（及び任意選択でＣＤ３ζ遺伝子）のうちの少なくとも１つが破壊された構造及びその使用を包含する。ＣＤ３ε、ＣＤ３γ及び／又はＣＤ３δ（及び任意選択でＣＤ３ζ遺伝子）のうちの少なくとも１つの破壊は、ＣＤ３α及びＣＤ３βのうちの１つ又は複数の破壊と組み合わせることもできる（例えば、ＣＤ３ε遺伝子及びＣＤ３γ遺伝子のノックアウト、ＣＤ３ε遺伝子及びＣＤ３α遺伝子のノックアウト、ＣＤ３γ遺伝子及びＣＤ３δ遺伝子のノックアウト等）。例えば、実施例２及び表１を参照されたい。これは、代替Ｔ細胞受容体サブユニット（ＣＤ３δ、ＣＤ３γ及びＣＤ３ε）及び抗原処理及び提示経路における追加の重要な遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を含む、本発明の新規な同種異形ＣＡＲ Ｔ戦略を示している。

【表1】

【0085】

驚くべきことに、２つ又は３つ（又はそれ以上）の破壊がＴ細胞受容体の発現を妨害し、最小限の毒性でＴＣＲの下方制御をもたらすことに成功したことが判明した。

【0086】

さらに、ＴＲＡＣ陰性Ｔ細胞は腫瘍内でより長く生存することが示されており（Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６７（６４８１）：ｅａｂａ７３６５（２０２０））、ＣＤ３ε遺伝子、ＣＤ３γ遺伝子、ＣＤ３ζ遺伝子、及び／又はＣＤ３δ遺伝子の破壊に焦点を当てても、養子免疫療法に有効なＴ細胞が生成されることは驚くべきことであった（ただし、上記のように、本開示は、ＣＤ３α及び／又はＣＤ３β遺伝子の破壊と組み合わせて、１つ又は複数のＣＤ３ε遺伝子、ＣＤ３γ遺伝子、ＣＤ３ζ遺伝子、及び／又はＣＤ３δ遺伝子を破壊することも包含する）。

【0087】

本開示は、同種異形Ｔ細胞応答に関連するＴＣＲシグナル伝達を交互に調整及び調節することにより、Ｔ細胞の機能特性を調節するための新規かつ代替的なアプローチを提供する。特に、本開示は、ＣＤ３ε遺伝子、ＣＤ３γ遺伝子、ＣＤ３ζ遺伝子及び／又はＣＤ３δ遺伝子の少なくとも１つを単独で、又は１つ若しくは複数の追加のＴＣＲ複合体成分と組み合わせて下方制御すると、ＣＡＲ Ｔ細胞の有益な抗腫瘍特性を維持しながら、同種Ｔ細胞応答が大幅に減少し、それによって安全で効果的なＣＡＲ Ｔ細胞が生成されることを示す。これらの新規かつ代替アプローチの利点については、以下で詳しく説明する。
ＩＩ．実験結果：

【0088】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたＣＤ３δ（図２Ａ）、ＣＤ３ε（図２Ｂ）及びＣＤ３γ（図２Ｃ）遺伝子の標的破壊後のフローサイトメトリーにより、ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ－α及びＴＣＲ－β鎖の破壊効率のパーセンテージを測定した（以下の実施例３も参照されたい）。図２Ａは、４つの異なるガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３及びｇＲＮＡ４を用いたＣＤ３δの破壊後の結果を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系におけるｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３ガイドＲＮＡを用いたＣＤ３δの標的破壊は、ＴＣＲα／βの１００％のＫＯ効率をもたらしたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系においてｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ４を用いた場合は、ＴＣＲα／βの約９０％以上のＫＯ効率をもたらした。したがって、ＣＤ３δを破壊するためには、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおいてｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３を使用することが好ましい。

【0089】

図２Ｂは、５つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５）を使用してＣＤ３εを標的として破壊した後の結果を示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５ガイドＲＮＡを使用してＣＤ３εを破壊すると、ＴＣＲ α／βの１００％のＫＯ効率が得られたが、ｇＲＮＡ１を使用すると、ＴＣＲα／βの約５０％のＫＯ効率しか得られず、最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系においてガイドｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３を使用すると、ＴＣＲ α／βの約９０％を超えるＫＯ効率が得られた。したがって、ＣＤ３εを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５ガイドＲＮＡの使用が好ましい。

【0090】

図２Ｃは、５つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４、ｇＲＮＡ５）を使用してＣＤ３γを標的として破壊した後の結果を示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系においてｇＲＮＡ４ガイドＲＮＡを使用してＣＤ３εを破壊すると、ＴＣＲ α／βの１００％のＫＯ効率が得られたが、ｇＲＮＡ５を使用すると、ＴＣＲα／βの約９５％を超えるＫＯ効率が得られ、最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系においてｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３ガイドＲＮＡを使用すると、ＴＣＲ α／βのあまり好ましくないＫＯ効率をもたらした。したがって、ＣＤ３γを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｇＲＮＡ４ガイドＲＮＡの使用が好ましい。

【0091】

下記の実施例４に詳細を示す別の実験では、１０日間にわたる同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の異なる構成体の増殖を評価した。このデータは重要であり、ナーゼなら、修飾免疫細胞が増殖しなければ、治療を成功させるのに十分な数の細胞が生成されないからである。試験された異なる構成体には、（１）ＴＲＡＣノックアウト（図３のアロ（ＡＬＬＯ）（ＴＲＡＣ ＫＯ））（例えば、本開示以前に使用されたノックアウト）、（２）ＣＤ３δノックアウト（図３のアロ（Ｄ１ ＫＯ））、（３）ＣＤ３γノックアウト（図３のアロ（Ｇ４ ＫＯ））及び（４）ＣＤ３εノックアウト（図３のアロ（Ｅ４ ＫＯ））を含む同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が含まれる。細胞集団の倍化率が Ｙ軸に表示され、日数がＸ軸に表示される。図３に詳述された結果は、全ての修飾細胞が９日間にわたって約４倍以上の増殖を示したことを示し、修飾細胞が免疫療法に有用な物質を有用な量生成することを実証している。

【0092】

実施例５では、ＴＣＲ－α／β鎖の表面発現を評価するために、いくつかの異なるノックアウト構築物を評価した。特に、図４Ａ及び４Ｂは、ＣＲＩＳＰＲを介したＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（例えば、本開示の前に使用された構築物）、ＣＤ３δノックアウト（Ｄ１ ＫＯ）、ＣＤ３γノックアウト（Ｇ４ ＫＯ）及びＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）の下方制御を比較したフローサイトメトリーの結果を示す。図４Ａは、ＴＣＲ－α／β鎖の表面発現によって測定した場合、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）がＴ細胞受容体ノックアウトのより良い標的であったことを示す。図４Ｂは、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）を含む同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が、例えばＣＤ３γ又はＣＤ３δノックアウトを含むＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い形質導入効率を有し、機能的に優れていることを示し、ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の実施形態が示されている。さらに、図４Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞の大部分が同種異系（ＣＤ３及びＴＣＲネガティブ）であったことを示し、これは、本発明の ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された患者には、より多くのアロ ＣＡＲ Ｔ細胞が注入されることを意味する。

【0093】

以下の実施例６に詳述するさらなる実験では、図５に示すように、異なるＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞構築物の腫瘍殺傷能力を評価した。特に、図５は、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（例えば、本開示の前に使用された構築物）、ＣＤ３δノックアウト（Ｄ１）、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４）、及びＣＤ３γノックアウト（Ｇ４）を含む同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力を示すグラフを示す。結果は、ＰＳＭＡ Ｅ４同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が最高の殺傷能力を有していることを示す。標的細胞はヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞であった。予想外に、Ｅ４はＤ１及びＧ４よりも強力であることがわかった。ＣＤ３ε分子を標的として作られたアロＣＡＲ Ｔ細胞は、評価した他のアロＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、より強力であった（例えば、腫瘍細胞をより速く殺す等）。ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４）ＣＡＲ Ｔ細胞の効力が高いということは、これらのＣＡＲ Ｔ細胞が標的とする腫瘍細胞が、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３δノックアウト（Ｄ１）ＣＡＲ Ｔ細胞及び／又はＣＤ３γノックアウト（Ｇ４）ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、はるかに速く根絶されることを意味する。そして、私たちの同種療法戦略を患者さんで成功させるためには、時間が最も重要である。

【0094】

実施例７は、標的遺伝子のノックアウトを効果的に行うＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ方法論の有効性の評価について記述している。特に、図６Ａ～６Ｄは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ不一致検出アッセイ（Ｔ７Ｅ１）で示されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性を示す。図６Ａは、３つの異なるｇＲＮＡを使用して３つの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子の部位から増幅されたＴ７Ｅ１処理ＰＣＲ産物の代表的なゲル電気泳動画像を示す。図６Ｂ－６Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集効率を示すＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ電気泳動図によって生成された電気泳動図を示す。

【0095】

さらに、図７Ａ～Ｄは、Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）ＣＲＩＳＰＲ編集効率の結果を示す、コントロール及びＴ７Ｅ１処理ＰＣＲのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ電気泳動図及びゲル電気泳動を示す。図７Ａは、サンプルＣ２ＴＡ－１－ＰＣＲの全体結果を示し、図７Ｂは、サンプルＣ２ＴＡ－１－Ｔ７Ｅ１の全体結果を示し、図７ＣはサンプルＣ２ＴＡ－２－ＰＣＲの全体結果を示し、図７Ｄは、サンプルＣ２ＴＡ－２－Ｔ７Ｅ１の全体結果を示す。

【0096】

最後に、混合リンパ球アッセイ（ＭＬＡ）を実施した。図８は、アロ細胞のみ、Ｔ細胞（第２ドナー、別のドナーからのＴ細胞）のみ、共培養のアロ細胞、共培養のＴ細胞（第２ドナー）を用いた混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイの結果を示すグラフである。特に、レシピエントのＴ細胞（別のドナーからのＴ細胞）を同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞と１４日間共培養し、Ｔ細胞の増殖を分析した。結果は、コントロールＴ細胞（２番目のドナー）、単独又は共培養された同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率を示し、「レシピエントの」Ｔ細胞は同種異形細胞の存在に反応しなかった（増殖しない）ことを示している。したがって、図８は、ＨＬＡ不一致が存在するにもかかわらず、共培養の同種ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に反応して２番目の（無関係な）ドナーからのＴ細胞が増殖しなかったことを示している。同種異形ＣＡＲ Ｔは、ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ及びＣＲＩＳＰＲ編集されたＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／Ｃ２ＴＡ ｇＲＮＡを含む。したがって、本発明の同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントの免疫系（すなわち、Ｔ細胞）によって検出されずに腫瘍細胞を殺す機会を有するになる。
ＩＩＩ． 同種異形Ｔ細胞：
Ａ． 内因性免疫タンパク質の下方制御：

【0097】

本開示の一態様は、（１）内因性免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失、（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸、を含む修飾免疫細胞を提供する。したがって、本発明の修飾細胞は、本明細書に記載される内因性遺伝子の任意の何れかの発現を破壊するように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、本発明の組み換えＴＣＲ又はＣＡＲ発現系を含む修飾細胞は、本明細書に記載される１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊するように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）のうちの１つ又は複数が破壊され、同種異形Ｔ細胞（すなわち、ユニバーサル免疫細胞（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ））が生成される。本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサル免疫細胞（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）」又は「ユニバーサルＴ細胞（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｃｅｌｌ）」は、任意の患者に投与するために事前に修飾（ｐｒｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）／事前に製造された（ｐｒｅ－ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ）同種異形免疫細胞又はＴ細胞を指す。いくつかの実施形態では、本発明の修飾免疫細胞は、同種異形Ｔ細胞応答が低下又は抑制された同種異形Ｔ細胞製品である。いくつかの実施形態では、内因性免疫タンパク質の１つ又は複数の遺伝子座の下方制御により、ＧｖＨＤ及び／又はＨｖＨＤが低下及び／又は排除される。

【0098】

いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞が対象に投与されると、免疫細胞は、同じ対象に投与された非修飾免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、修飾免疫細胞が対象に投与された場合、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる挿入及び／又は欠失を含む免疫細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）又は宿主対移植片病（ＨｖＨＤ；移植片拒絶）応答である。いくつかの実施形態では、低下したＧｖＨＤ応答は、ＨＬＡ－Ｉ不一致細胞に対して又はＨＬＡ－ＩＩ不一致細胞に対して誘発される。いくつかの実施形態では、ＧｖＨＤ応答は、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約９５％以上低下する。いくつかの実施形態では、ＧｖＨＤ応答は、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上又は約２００倍以上低下する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞によるＧｖＨＤ応答の低下は、１つ又は複数の遺伝子座の欠失及び／又は挿入のない同等の免疫細胞、又は、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの欠失及び／又は挿入を含む免疫細胞と比較される。

【0099】

いくつかの実施形態では、１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失は、１つ又は複数の内因性免疫タンパク質座の遺伝子発現を下方制御することができる。いくつかの実施形態では、内因性免疫タンパク質は、ＴＣＲ複合体の構成要素の１つである。いくつかの実施形態では、内因性免疫タンパク質は、ヘテロ二量体として組織化され、ＴＣＲαβヘテロ二量体に結合するリガンドによって生成されたシグナルを伝達する３つの二量体モジュールＣＤ３δ／ＣＤ３ε、ＣＤ３γ／ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζを形成するＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの１つ又は複数である。いくつかの実施形態では、前記リガンドは、主要組織適合性複合体クラスＩ及びクラスＩＩ（ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ）分子に結合した抗原であり、これは、ＴＣＲαβヘテロ二量体によって認識される。

【0100】

いくつかの実施形態では、前記内因性免疫タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及び／又はＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）分子である。いくつかの実施形態では、前記内因性免疫タンパク質は、Ｂ２Ｍ（ベータ２－ミクログロブリン（Ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ），）、ＣＩＩＴＡ（クラスＩＩトランス活性化因子（ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ））、ＴＡＰ１（抗原処理１に関連するＡＢＣトランスポーター、トランスポート１、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ １；Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ１，ＡＴＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ Ｍｅｍｂｅｒ））、ＴＡＰ２（抗原処理２に関連するＡＢＣトランスポータ－、トランスポート２、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢ（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ２；Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ２， ＡＴＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ Ｍｅｍｂｅｒ））、ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ結合タンパク質、タパシン、ＴＡＰ関連タンパク質（ＴＡＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔａｐａｓｉｎ；ＴＡＰ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ））、ＮＬＲＣ５（ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲ Ｆａｍｉｌｙ ＣＡＲＤ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５））、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５（調節因子Ｘ５（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ５））、ＲＦＸＡＮＫ（調節因子Ｘ関連アンキリン含有タンパク質（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ））、ＲＦＸＡＰ（調節因子Ｘ関連タンパク質（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）である。

【0101】

ＴＣＲと同様に、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩは、Ｔリンパ球に抗原を提示する（ｐｒｅｓｅｎｔ）ことによって適応免疫応答（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の活性化に重要な役割を果たす。ヒトは、３つの主要なＭＨＣ－Ｉ遺伝子座 （ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）を有し、これらはウイルス、癌細胞、移植細胞の検出と排除に不可欠である。さらに、３つの非古典的な（ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ＭＨＣ－Ｉ分子（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇ）が存在し、免疫調節機能を有する。ヒトのＭＨＣ－ＩＩ分子も３つの遺伝子座（ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲ）を含む。ＭＨＣクラスＩ及びＩＩはそれぞれ、いくつかの調節タンパク質を含む。ＭＨＣ－Ｉ調節タンパク質には、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ等の抗原処理分子（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及びＮＬＲＣ５等の転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）が含まれる。前記Ｔａｐ１、Ｔａｐ２及びＴＡＰＢＰは、ペプチド抗原を前記クラスＩ ＨＬＡ複合体にロード（ｌｏａｄ）するために不可欠なＴＡＰトランスポーター複合体の一部である。Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、Ｔａｐ１、Ｔａｐ２及びＴＡＰＢＰの任意の何れかの発現が下方制御されると、ＭＨＣクラスＩタンパク質の細胞表面発現が減少し、免疫応答が損なわれる。いくつかの実施形態では、本開示によって考慮される前記内因性免疫タンパク質は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子である。

【0102】

ＭＨＣ－ＩＩ調節タンパク質には、転写調節因子ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ；及びＭＨＣクラスＩＩペプチド、インバリアン鎖（Ｉｉ鎖）及びヒト白血球抗原ＤＭ（ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ）、ＨＬＡ－ＤＯＡ及びＨＬＡ－ＤＯＢの形成及び輸送に関与するシャペロンタンパク質（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が含まれる。ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰは、全てのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子プロモーターと特異的に結合してその転写を制御する三量体ＲＦＸ ＤＮＡ結合複合体のサブユニットである。前記インバリアント鎖（Ｉｉ）は、ＥＲでのペプチドのロードを防ぎ、ＥＲからの放出（ｅｘｉｔ）を刺激し、抗原ペプチドのロードを調節するＭＨＣクラスＩＩシャペロンとして機能する。ＴＡＰＢＰと同様に、ＨＬＡ－ＤＭ（例えば、ＨＬＡ－ＤＭＡ）は、細胞内輸送中にＭＨＣ－ＩＩ分子のペプチドのロードをアシストする。ＨＬＡ－ＤＭは、抗原の「免疫優勢（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）」領域に対するＴ細胞応答を誘導することにより、ＭＨＣ－ＩＩタンパク質への弱い結合ペプチドが出現する（ｄｉｓｐｌａｙ）を排除／防止する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＭ（例えば、ＨＬＡ－ＤＭＡ）は、自己タンパク質の処理において潜在的に自己反応性のＴ細胞の排除を促進する。いくつかの実施形態では、本開示によって考慮される前記内因性免疫タンパク質は、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子である。

【0103】

したがって、ＨＬＡバリアの効率的な除去によるＨｖＨＤ又はＧｖＨＤの低下は、以下の１つ又は複数を下方制御することによって達成できる：（１）多型ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ）及び／又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子（ＨＬＡ－ＤＰ、－ＤＱ、－ＤＲ）を標的とする；（２）Ｂ２Ｍ等の全てのＭＨＣ－Ｉ分子の細胞表面への輸送を調節する分子、又はＴＡＰ１、ＴＡＰ２又はＴＡＰＢＰ等のＭＨＣ－Ｉ抗原処理分子を標的とする；（３）インバリアント鎖（Ｉｉ又はＣＤ７４））又はＨＬＡ－ＤＭ等のＭＨＣ－ＩＩ分子の輸送を調節する分子を標的とする；及び／又は（４）ＭＨＣ－Ｉ（ＮＬＲＣ５）又はＭＨＣ－ＩＩ発現（ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ－ＡＰ）の転写調節因子を標的とする。

【0104】

いくつかの実施形態では、挿入及び／又は欠失によって遺伝子発現が下方制御される前記内因性免疫タンパク質は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖；ＣＤ７４）、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖、ＣＤ７４）及びそれらの組み合わせから選択される内因性免疫タンパク質の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞）は、同種環境（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）において免疫原性が低下している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖；ＣＤ７４）又はそれらの任意の組み合わせの前記遺伝子発現を下方制御することにより、ＨｖＨＤ及び／又はＧｖＨＤを引き起こす可能性のあるＴ細胞上の同アロ抗原の表面出現（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）が除去され及び／又はＴ細胞受容体の膜発現が防止される。

【0105】

いくつかの実施形態では、同種異形Ｔ細胞産物を生成するために使用される前記修飾免疫細胞は、１つのＴ細胞受容体サブユニット、１つのＨＬＡクラスＩ分子及び１つのＨＬＡクラスＩＩ分子の下方制御を含むトリプルノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体サブユニットは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γから選択され、前記ＨＬＡクラスＩ分子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ又はＮＬＲＣ５から選択され、前記ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択される。いくつかの実施形態では、前記同種異形Ｔ細胞産物は、３つ以上の内因性免疫タンパク質ノックアウトを含む。このような実施形態では、前記Ｔ細胞受容体サブユニットは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γから選択され、前記ＨＬＡクラスＩ分子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ及び／又はＮＬＲＣ５から選択され、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、及び／又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択される。いくつかの実施形態では、同種異系Ｔ細胞産物を生成するための前記修飾免疫細胞は、少なくとも２つのＴ細胞受容体サブユニット、少なくとも２つのＨＬＡクラスＩ分子及び少なくとも２つのＨＬＡクラスＩＩ分子の下方制御を含む１つ又は複数の内因性免疫タンパク質ノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞受容体サブユニットは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γのうちの少なくとも２つから選択され、前記ＨＬＡクラスＩ分子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ及びＮＬＲＣ５のうちの少なくとも２つから選択され及び前記ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）のうちの少なくとも２つから選択される。

【0106】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ３δ遺伝子発現及びＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御する挿入及び／又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ３ε遺伝子発現及びＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御する挿入及び／又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ３γ遺伝子発現及びＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御する挿入及び／又は欠失を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γの遺伝子発現が下方制御されると、Ｔ細胞受容体アルファー及びベータの表面発現は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％下方制御される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３εの下方制御は、ＣＤ３γ及び／又はＣＤ３δの下方制御と比較して、より高いＴ細胞受容体ノックアウト効率を生成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３εの下方制御によって誘導されるＴ細胞受容体ノックアウト効率は、ＴＲＡＣの下方制御より高いか同等である。

【0108】

いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞産物を生成するために使用される前記修飾免疫細胞は、トリプルノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫（ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｅ）は、以下の遺伝子発現の減少又は除去を含む：（１）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（２）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（３）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（４）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（５）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（６）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（７）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（８）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（９）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（１０）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（１１）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（１２）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（１３）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（１４）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（１５）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（１６） ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（１７）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（１８）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（１９）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（２０）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（２１）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（２２）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（２３）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（２４）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（２５）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（２６）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（２７）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（２８）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（２９）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は、（３０）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0109】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫は、以下の遺伝子発現の減少又は除去を含む：（１）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（２）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（３）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（４）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（５）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（６）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（７）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（８）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（９）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（１０）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（１１）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（１２）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（１３）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（１４） ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（１５）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（１６） ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（１７）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（１８）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（１９）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（２０）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（２１）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（２２）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（２３）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（２４）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（２５）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（２６）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（２７）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（２８）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（２９）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は、（３０）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0110】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫は、以下の遺伝子発現の減少又は除去を含む：（１）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、（２）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５、（３）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ、（４）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ、（５）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ、（６）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖、（７）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ、（８）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５、（９）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ、（１０）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ、（１１）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ、（１２）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖、（１３）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ、（１４）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５、（１５）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ、（１６）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ、（１７）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ、（１８）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖、（１９）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ、（２０）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５、（２１）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ、（２２）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ、（２３）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ、（２４）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖、（２５）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ、（２６）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５、（２７）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ、（２８）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ、（２９）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ、又は、（３０）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0111】

いくつかの実施形態では、本開示の修飾免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ又は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、修飾非刺激免疫細胞又はその前駆細胞である。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、修飾非刺激Ｔ細胞、修飾非刺激ＮＫ細胞又は修飾非刺激ＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、同種異形Ｔ細胞又は自己ヒトＴ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ）である。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ヒト細胞、又は哺乳動物細胞である。
Ｂ． 修飾免疫細胞：

【0112】

本発明の一態様は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む単離修飾Ｔ細胞を提供する。本明細書で使用される場合、用語「機能障害ポリペプチド（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ポリペプチドが変異している（例えば、欠失、挿入を含む又は切断型バリアント（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）である）ため、ＴＣＲ複合体の他の成分に容易に結合できない、又はＴＲＣ複合体に組み込まれないことを意味する。いくつかの実施形態では、前記機能障害ポリペプチドは、機能障害ＴＣＲ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐａｉｒｅｄ ＴＣＲ）をもたらすか又は細胞表面上の機能的なＴＣＲ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＴＣＲ）の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、障害ポリペプチド（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、ＴＣＲ複合体の活性を実質的に阻害するドミナントネガティブポリペプチドであり得る。前述の機能障害ポリペプチドを含む修飾Ｔ細胞は、機能的なＴＣＲを産生しないか又は細胞表面で機能的なＴＣＲをほとんど発現しないＴＣＲ欠損Ｔ細胞（ＴＣＲ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ）である。いくつかの実施形態では、前記障害ポリペプチドは、ＴＣＲシグナル伝達複合体の構成要素である。いくつかの実施形態では、前記障害ポリペプチドは、機能的なＴＣＲの形成を調節する。いくつかの実施形態では、障害ポリペプチドは、機能的なタンパク質の機能又は発現に影響を及ぼす変異を含む。いくつかの実施形態では、前記変異は、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、障害ポリペプチドは、欠陥のある遺伝子産物の発現又は所望の遺伝子又は遺伝子産物の発現の欠如によって引き起こされる。

【0113】

ＴＣＲが適切に機能するには、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比が必要である。図１に示すように、ＴＣＲ複合体は、可変ＴＣＲ－アルファー鎖（ＴＣＲ－α、ＴＲＡＣ）及びＴＣＲ－ベータ鎖（ＴＣＲ－β、ＴＲＢＣ）を含み、これらは、３つのモジュールＣＤ３δ／ＣＤ３ε、ＣＤ３γ／ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζに結合している。３つの二量体モジュールは、ＴＣＲシグナル伝達の不可欠な部分である。各ＣＤ３受容体は、ＴＣＲ－α／βヘテロ二量体がＭＨＣペプチドリガンドと結合すると、ＴＣＲ受容体の活性化を伝播及び増幅するシグナル伝達モチーフを含む。リガンドがＴＣＲαβに結合すると、前記ＣＤ３サブユニットの構造変化が起こり、ＣＤ３細胞質テール内の前記シグナル伝達モチーフ（例えば、ＩＴＡＭ）が細胞内タンパク質チロシンキナーゼによってリン酸化される。その後、細胞内シグナル伝達及びアダプター分子を含むＳＨ２ドメインが細胞膜にリクルートされ（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）、そこで前記ＣＤ３シグナル伝達モチーフと直接相互作用して前記ＴＣＲ 活性化シグナルを増幅する。したがって、ＴＣＲαβヘテロ二量体は、前記抗原の結合を担い、前記ＣＤ３サブユニットはシグナル伝達要素として機能する。そのため、必要なＣＤ３受容体の１つが欠損又は障害されている場合、前記ＴＣＲ複合体は、機能的に不安定になるか又は少なくともＴＣＲのシグナル伝達機能が弱まる。理論に縛られることは望まないが、前記ＴＣＲ複合体及び／又は機能の表面発現には、６つのタンパク質全ての協調発現が必要である。

【0114】

前記ＴＣＲ複合体の各成分は、細胞表面でのＴＣＲ複合体の組み立てに必要である。前記ＴＣＲ複合体の１つの成分が失われると、細胞表面でのＴＣＲ発現が失われる可能性がある。いくつかの実施形態では、１つの成分が失われても、前記ＴＣＲ複合体の表面発現が消失しない可能性がある。このような実施形態では、ＴＣＲ発現のいくつか又は全てが残存する可能性があるが、前記ＴＣＲ受容体が免疫応答を誘導するかどうかを決定するのは、前記ＴＣＲ受容体の機能である。本発明は、細胞表面における完全なＴＣＲ複合体の不在ではなく、機能的欠陥を考慮している。理論に縛られることは望まないが、ＴＣＲの発現が低いほど、前記ＴＣＲ複合体を介してＴ細胞の活性化につながる十分なＴＣＲ架橋が起こる可能性が低くなる。

【0115】

いくつかの実施形態では、前記単離修飾Ｔ細胞は、２つ以上の機能障害ポリペプチドを含む。このような実施形態では、１つの障害ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＲＡＣ）であり得る。前記ＴＣＲ複合体は、細胞内に保持され、ＴＲＡＣが存在しない場合は細胞膜に移行しない。さらに、ＴＲＡＣを欠くＴＣＲ受容体は不安定になり、急速に分解されてもよい。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、又はインバリアント（Ｉｉ）鎖から選択される３つ以上の機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つの機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３α、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される３つの機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される機能障害ポリペプチド、及び、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γからなる群から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチド、及び、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、（ａ）少なくとも１つの機能障害ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３γ並びに（ｂ）ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される少なくとも１つの機能障害ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖から選択される２つ以上の機能障害ポリペプチドを含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、前記機能障害ポリペプチドは、タンパク質の発現を減少させる。このような実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖、又はそれらの任意の組み合わせの発現が減少している。いくつかの実施形態では、前記機能障害ポリペプチドは、コード化された遺伝子発現の欠如である。このような実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖、又はそれらの任意の組み合わせを発現しない。

【0118】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、Ｃ２ＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、Ｉｉ鎖からなる群から選択されるポリペプチドの発現が減少した又は発現が欠如した修飾Ｔ細胞は、さらに、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣ２ＴＡから選択される機能障害ポリペプチドを含む。このような実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ又はＣ２ＴＡの発現が減少しており及び／又はＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ又はＣ２ＴＡを発現していない。

【0119】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及び／又はＣＤ３γの修飾により、ＴＣＲ／ＣＤ３受容体複合体の機能障害がもたらされる。いくつかの実施形態では、本発明で想定される機能障害ポリペプチドは、遺伝子編集技術を使用して生成される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系又はメガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γの１つ又は複数のエクソン、任意選択で、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１を標的とすることによって修飾される。

【0120】

Ｔ細胞が機能的なＴＣＲを発現しているかどうかは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載されているような既知のアッセイ方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ αβ及びＣＤ３の発現は、フローサイトメトリー及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ－ＰＣＲ）によって評価することができる。ＴＣＲ－α、ＴＣＲ－β、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ及びＣＤ３－ζ ｍＲＮＡの発現は、Ｓｅｎｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７６０－６７６６（２００４）で使用されている方法と同様の方法を使用して、ＡＢＩ７３００リアルタイムＰＣＲ装置と遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマーを使用したＱＲＴ－ＰＣＲによって分析できる。細胞表面発現の変化は、ＴＣＲ－α、ＴＣＲ－β、ＣＤ３ε、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ５及びＣＤ４５に特異的な抗体を使用して判定できる。フローサイトメトリーを使用してＴＣＲ／ＣＤ３発現をテストするには、ＴＣＲ複合体の特定のサブユニットに対する蛍光色素標識抗体を使用する。いくつかの実施形態では、生細胞は、例えば、ＣＤ５、ＣＤ８及びＣＤ４に対する抗体と、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ又はＴＣＲδに対する抗体との組み合わせで染色される。ＣＤ３又はＴＣＲ遺伝子の何れかの発現が使用される場合、非修飾Ｔ細胞又はコントロールベクターを発現するＴ細胞と比較すると、前記修飾Ｔ細胞では、ＴＣＲタンパク質及びＣＤ３タンパク質の両方の発現が大幅に減少するはずである。アイソタイプコントロール抗体は、バックグラウンド蛍光を制御するために使用される。

【0121】

前記修飾Ｔ細胞における機能障害ポリペプチドの発現が、ＴＣＲ機能及び／又は修飾Ｔ細胞機能を変化させるのに十分であるかどうかを判断するために、前記修飾Ｔ細胞を、（１）インビトロでの細胞生存、（２）マイトマイシンＣ処理した同種異形ＰＢＭＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ－ｔｒｅａｔｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＰＢＭＣｓ）の存在下での増殖及び／又は（３）同種異形ＰＢＭＣ、抗ＣＤ３ ｍＡｂｓ、又は抗ＴＣＲ ｍＡｂｓに対するサイトカイン産生について試験する。

【0122】

前記ＴＣＲ複合体の機能不全を試験するために、Ｔ細胞の増殖を促進する重要なエフェクターサイトカイン（ｋｅｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の産生不足を判定することができる。例えば、修飾Ｔ細胞に対する抗ＣＤ３刺激の効果は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の産生及び／又はインターフェロン（ＩＦＮ）－ガンマ産物の産生を決定するために使用できる。

【0123】

いくつかの実施形態では、機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、非修飾Ｔ細胞と比較して、Ｔ細胞受容体の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、障害ポリペプチドの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体の表面発現が完全に欠如していることを示す。いくつかの実施形態では、機能障害ポリペプチドを含む前記修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体の架橋が減少しているか不十分である。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、細胞表面上に存在し得るＴＣＲサブユニットのいくつか又は全てを発現する。表面に機能的なＴＣＲがなければ、前記修飾Ｔ細胞は完全に活性化されない。したがって、本発明で想定される前記修飾Ｔ細胞は、宿主に導入されたときに望ましくない反応を起こすことはできない。その結果、前記修飾Ｔ細胞は、宿主のＭＨＣ分子からのシグナルを伝達できないため、ＧｖＨＤ又はＨｖＨＤを引き起こすことができない。

【0124】

いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞が対象に投与されると、修飾Ｔ細胞は、同じ対象に投与された非修飾Ｔ細胞によって発揮される免疫応答と比較して、対象において低下した免疫応答を発揮する。本発明の修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞療法のあらゆる用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞療法が望ましい任意の方法又は組成物で使用される。いくつかの実施形態では、本発明の修飾Ｔ細胞は、癌、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、感染症、１つ若しくは複数の自己免疫障害（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、放射線病、又は、その他の疾患又は状態を、軽減、改善若しくは予防又は治療するために使用することができる。
ＩＶ． 遺伝子編集系：
Ａ． ＣＲＩＳＰＲ：

【0125】

いくつかの実施形態では、本開示の修飾免疫細胞は、遺伝子編集された修飾免疫細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の内因性免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失は、遺伝子編集の結果である。ある実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はｌｉ鎖をコードする遺伝子は、遺伝子編集系によって修飾される。いくつかの例では、前記遺伝子編集系は、クラスター規則配列短回文核酸（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ系等のＲＮＡガイドヌクレアーゼを含む。前記ＣＲＩＳＰＲ系（ここでは ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含み、細胞に導入された後、細胞内に導入された後、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に切断（例えば、二本鎖切断）を導入することを可能にする複合体を形成する。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して編集され、１つ又は複数の内因性免疫タンパク質を破壊する。

【0126】

いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、１つ又は複数の内因性のＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖を破壊するために使用され、それによってＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖の遺伝子発現の下方制御をもたらす。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の内因性免疫タンパク質の遺伝子発現を下方制御することができる挿入及び／又は欠失は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はＩｉ鎖からなる群から選択される１つ又は複数の内因性タンパク質の発現を下方制御する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を下方制御することができる挿入及び／又は欠失のそれぞれは、ＣＲＩＳＰＲ関連系を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連系は、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである。

【0127】

いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの例では、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＳａＣａｓ９）又はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのＣａｓ９分子に由来するか（ｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）又はこれらに基づく（ｂａｓｅｄ ｏｎ）。いくつかの例では、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ ｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｍｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｄ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｌｉｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｌｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｌｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ． Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｌｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．、又はＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅのＣａｓ９分子に由来するか又はこれらに基づく。

【0128】

いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ １０２７０、ＭＧＡＳ １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ－１株（ｓｔｒａｉｎ））、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＬＭＤ－９株）、Ｓ． ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ（例えば、ＳＰＩＮ ２００２６株）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．ｍａｃａｃａｅ（例えば、ＮＣＴＣ１ １５５８株）、Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｌｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２０６９株）、Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ（例えば、ＡＴＣＣ ９８１２、ＭＧＣＳ １２４株）、Ｓ． ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ（例えば、ＧＧＳ １２４株）、Ｓ．ｂｏｖｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ７００３３８株）、Ｓ．ｃｍｇｉｎｏｓｕｓ（例えば、Ｆ０２１ １株）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａ（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例えば、Ｆ６８５４株）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、例えば、Ｃｌｉｐ １１２６２株）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ（例えば、ＤＳＭ １５９５２株）又はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（例えば、１，２３，４０８株）。

【0129】

いくつかの例では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＭＡＤ７ヌクレアーゼ（タイプＶ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）又はそれらの任意の組み合わせを含む。
Ｂ． ガイドＲＮＡ：

【0130】

いくつかの実施形態では、前記ガイド核酸は、Ｃａｓ－ＲＮＡ複合体を標的配列に誘導する（ｄｉｒｅｃｔ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子である。いくつかの例では、前記誘導（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）は、ｇＲＮＡの一部とＤＮＡのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡ標的ドメインを介して）及びｇＲＮＡ分子の一部とＲＮＡガイドヌクレアーゼ又はその他のエフェクター分子の結合（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）によって達成される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」（「ｓｇＲＮＡ」）と呼ばれる、単一の連続したポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数（通常は２つ）のポリヌクレオチド分子からなり、これらのポリヌクレオチド分子自体は、通常はハイブリダイゼーションを介して結合することができ、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ（ｄｕａｌ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」（「ｄｇＲＮＡ」）と呼ばれる。

【0131】

いくつかの例では、前記ｇＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒを含み、これらは任意で単一のポリヌクレオチド上又は別々のポリヌクレオチド上に存在することができる。いくつかの例では、前記ｃｒＲＮＡは、標的ドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用して旗竿領域（ｆｌａｇｐｏｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を形成する領域とを含む。前記ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡ分子の部分を含む。いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に特異的に結合する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、旗竿の一部を形成する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記標的ドメインは、標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー配列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を認識する、例えば、その配列と相補的なｇＲＮＡ分子の部分である。

【0132】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、プロトスペーサーの３’末端に隣接して位置し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される２～６塩基対のＤＮＡ配列である。いくつかの例では、各Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、特定のＰＡＭ配列を認識する。例示的なＰＡＭ配列には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識されるＮＧＧ配列、又は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識されるＮＧＧＮＧ又はＮＮＡＧＡＡＷ配列が含まれ、ここでＮは任意のヌクレオチドである。当業者であれば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが認識するＰＡＭ配列とともに使用される特定のＣａｓエンドヌクレアーゼに基づいてｇＲＮＡ分子を設計する方法を理解するであろう。

【0133】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質遺伝子座の標的配列と十分に相補的なガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、１つ又は複数のＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン内の配列と相補的である。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのエクソン１内の配列と相補的である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）のｇＲＮＡ核酸配列は、表４に開示される核酸配列を有する。

【0134】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは配列番号５３で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３ε遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５２で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＤ３γ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５４で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５５で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ（Ｃ２ＴＡ）遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６１で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰ１遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５６で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰ２遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５７で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＴＡＰＢＰ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５９又はそれらの任意の組み合わせで示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＮＬＲＣ５ 遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６０で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６２で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸ５遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号６４又はそれらの組み合わせで示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６５で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＲＦＸＡＰ遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡは、配列番号６６で示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、Ｉｉ鎖遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含み、前記ガイドＲＮＡは、配列番号６７、配列番号６８又はそれらの任意の組み合わせで示される核酸配列を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、１つ以上、２つ以上、３つ以上又は４つ以上のガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して免疫細胞にトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）される。いくつかの例では、約１つ、２つ又は３つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して免疫細胞にトランスフェクトされる。いくつかの例では、約３つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して免疫細胞にトランスフェクトされる。いくつかの例では、約２つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して免疫細胞にトランスフェクトされる。いくつかの例では、約１つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ分子）が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して免疫細胞にトランスフェクトされる。

【0136】

いくつかの実施形態では、ベクターがＣＲＩＳＰＲ系の発現を駆動する。当該技術分野には、本発明に有用な適切なベクターが豊富に存在する。使用されるベクターは、複製、及び必要に応じて真核細胞への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に適している。典型的なベクターには、目的の核酸配列の発現を制御するのに役立つ転写及び翻訳ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）、開始配列及びプロモーターが含まれている。本発明のベクターは、核酸標準遺伝子送達プロトコル（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）にも使用することができる。遺伝子送達の方法は当該技術分野で既知である。さらに、前記ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２、及び、その他のウイルス学及び分子生物学ノーマーニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、ガンマレトロウイルス、レンチウイルス等が含まれるが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望むものではないが、好適なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ又は複数の選択可能マーカーを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ｐＡｄ５／Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターを含む。
Ｃ． ＴＡＬＥＮ：

【0137】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集系は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって人工的に生成される。転写活性化因子様効果（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｓ）（ＴＡＬＥ）は、標的ＤＮＡに結合するように組み換えられる。組み換えＴＡＬＥとＤＮＡ切断ドメインを組み合わせることで、任意の標的ＤＮＡ配列に固有の制限酵素を生成できる。

【0138】

ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ）によって分泌されるタンパク質である。前記ＤＮＡ結合ドメインには、１２番目及び１３番目のアミノ酸を除いて、繰り返しの高度に保存された３３～３４個のアミノ酸配列が含まれている。これら２つの位置は可変性が高く、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示しているため、標的ＤＮＡ配列に結合するように組み換えることができる。

【0139】

ＴＡＬＥＮを製造するために、ＴＡＬＥタンパク質は、例えば野生型又は変異型Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ（Ｎ）に融合される。前記Ｆｏｋ１ドメインは、二量体として機能し、適切な方向と間隔で標的ゲノム内の部位に固有のＤＮＡ結合ドメインを持つ２つの構築物を必要とする。特異性とオフターゲット効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋ１切断ドメイン間のアミノ酸残基の数と、２つの個別のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数を変更することによって調整できる。
Ｄ． ジンクフィンガーヌクレアーゼ：

【0140】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集系ファージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系である。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１つ又は複数の標的核酸配列の核酸部位を修飾するために使用できる人工ヌクレアーゼである。前記ＴＡＬＥＮ編集系と同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＦｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ又は複数のジンクフィンガーで構成される。ジンクフィンガーは、１つ又は複数の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含み、約３ｂｐの配列を認識することができる。特異性が知られているさまざまなジンクフィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５又は１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを生成することができる。

【0141】

ＺＦＮは、非回文ＤＮＡ部位を認識する。標的部位を切断するために、一対のＺＦＮが二量体化し、標的部位の反対側の鎖に組み立てられる。ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッド系、哺乳類細胞を含む、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するために、さまざまな選択及びモジュールアセンブリ技術が利用可能である。
Ｅ． メガヌクレアーゼ：

【0142】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集系は、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系である。メガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の切断部位を認識する人工ヌクレアーゼである。いくつかの例では、メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及びＤＮＡ認識に影響を与える構造モチーフに基づいてファミリーに分類される。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを１つ又は２つ有することが特徴である。いくつかの例では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーが１つあるＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーが２つあるメンバーは単量体として見つかる。ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーのメンバーには、７０～１００残基の長さのＧＰ－ＹＩＧモジュールがあり、４つ又は５つの保存された配列モチーフと４つのインバリアント残基が含まれており、そのうち２つは活性に必要である。Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を含む領域にわたって高度に保存された一連のヒスチジンとシステインを特徴とする。ＮＨＮファミリーのメンバーは、アスパラギン残基に囲まれた２対の保存されたヒスチジンを含むモチーフによって定義される。ＤＮＡ結合特異性を変更したメガヌクレアーゼを組み換える戦略（例えば、所定の核酸配列に結合する）は、当技術分野で既知である。

【0143】

いくつかの例では、前記メガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼのＮ末端に融合したＴＡＬＥドメインを含むメガＴＡＬと呼ばれるハイブリッドヌクレアーゼである。いくつかの例では、前記メガヌクレアーゼはＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーである。

【0144】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、遺伝子サイレンシング系である。例示的な遺伝子サイレンシング系は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを介した遺伝子サイレンシング系を含む。
Ｖ． 外因性核酸：

【0145】

本発明は、内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子座に挿入及び／又は欠失を含み、内因性免疫タンパク質及び外因性核酸の遺伝子発現を下方制御することができる修飾免疫細胞又はその前駆細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドを発現する修飾免疫細胞が本明細書に開示される。いくつかの例では、前記外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの例では、外因性核酸は抗原結合ポリペプチドをコードする。いくつかの例では、前記外因性核酸は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）をコードする。追加の例では、前記外因性核酸は、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする。
Ａ． キメラ抗原受容体：

【0146】

本発明には、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾Ｔ細胞及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含む修飾Ｔ細胞を包含し、該ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載の任意の抗原結合ドメイン、任意のヒンジ、任意の膜貫通ドメイン、任意の共刺激ドメイン及び任意の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含む任意の修飾細胞が想定されており、本明細書の開示を考慮して、当業者によって容易に理解され、作製され得る。

【0147】

前記抗原結合ドメインは、免疫細胞内で発現するために、本明細書に記載の膜貫通ドメイン又は細胞内ドメイン等のＣＡＲの別のドメインに操作可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）てもよい。一実施形態では、前記抗原結合ドメインをコードする第１の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列に操作可能に連結され、さらに、細胞内ドメインをコードする第３の核酸配列に操作可能に連結される。

【0148】

本明細書に記載の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の膜貫通ドメインの何れか、本明細書に記載の細胞内ドメイン又は細胞質ドメインの何れか、又は本発明のＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインの何れかと組み合わせることができる。本発明の対象ＣＡＲには、本明細書に記載のスペーサードメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）も含まれ得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインのそれぞれは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって分離されている。
１． 抗原結合ドメイン：

【0149】

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、タンパク質、炭水化物、糖脂質等の特定の標的抗原に結合するＣＡＲの細胞外領域である。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、標的細胞（例えば、癌細胞）上の標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する親和性を含む。前記標的抗原には、標的細胞に関連する任意のタイプのタンパク質又はそのエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）が含まれてもよい。例えば、前記ＣＡＲは、標的細胞の特定の状態を示す標的細胞上の標的抗原に対する親和性を備えていてもよい。

【0150】

本明細書に記載のように、標的細胞上の特定の標的抗原に対する親和性を有する本開示のＣＡＲは、標的特異的結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、前記標的特異的結合ドメインは、マウスの標的特異的結合ドメインであり、例えば、該標的特異的結合ドメインは、マウス由来である。いくつかの実施形態では、前記標的特異的結合ドメインは、ヒト標的特異的結合ドメインであり、例えば、該標的特異的結合ドメインは、ヒト由来である。

【0151】

前記抗原結合ドメインには、抗原に結合する任意のドメインが含まれ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体及びそれらの任意のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。したがって、一実施形態では、前記抗原結合ドメイン部分は、哺乳動物抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは、全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単一特異性Ｆａｂ_２、二重特異性Ｆａｂ_２、三重特異性Ｆａｂ_２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ、タンデムｓｃＦｖ、ＶｈＨ、Ｖ－ＮＡＲ、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ又はテトラボディを含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、１つ又は複数の標的細胞上の１つ又は複数の標的抗原に対する親和性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、単一の標的細胞上の１つ又は複数の標的抗原に対する親和性を有し得る。このような実施形態では、前記ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲ又は多重特異性ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、１つ又は複数の標的抗原に対する親和性を付与する１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、同じ標的抗原に対する親和性を付与する１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含む。例えば、同じ標的抗原に対して親和性を有する１つ又は複数の標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲは、標的抗原の異なるエピトープに結合することができる。ＣＡＲ内に複数の標的特異的結合ドメインが存在する場合、前記結合ドメインは、直列に配置され、リンカーペプチドによって分離され得る。例えば、２つの標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲでは、前記結合ドメインは、ポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジ領域又は膜ヒンジ領域を介して、単一のポリペプチド鎖上で互いに共有結合している。

【0153】

本明細書で使用される場合、用語「単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリン（例えば、マウス又はヒト）の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域が共有結合してＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成する融合タンパク質である。重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ）（ＶＨ）と軽鎖（ｌｉｇｈｉｔ ｃｈａｉｎ）（ＶＬ）は直接結合するか、又はペプチドをコードするリンカー又はスペーサーによって結合され、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端、又は、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端が接続される。本明細書では、用語「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」及び「スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン、ＰＳＭＡ結合ドメイン又はメソテリン結合ドメイン）は、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－ リンカー －ＶＬの構成を有するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン、ＰＳＭＡ結合ドメイン、又はメソテリン結合ドメイン）は、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＨの構成を有するｓｃＦｖを含む。当業者であれば、本発明で使用するための適切な構成を選択することができるであろう。

【0154】

前記リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンを多く含み、溶解性のためにセリン又はトレオニンを多く含む。前記リンカーは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結することができる。前記リンカーの非限定的な例は、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０（６）：１９１０－１９１７（２００８）及びＷＯ２０１４／０８７０１０に開示されている。当該技術分野では、様々なリンカー配列が公知であり、これには、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４８）及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４９）等のグリシンセリン（ＧＳ）リンカーが含まれるが、これらに限定されない。ここで、ｎは少なくとも１の整数を表す。例示的なリンカー配列は、限定されないが、ＧＧＳＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号４９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５０）等を含むアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、本発明で使用するための適切なリンカー配列を選択することができるであろう。一実施形態では、本発明の抗原結合ドメイン（例えば、Ｔｎ－ＭＵＣ１結合ドメイン、ＰＳＭＡ結合ドメイン又はメソテリン結合ドメイン）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５０）を有するリンカー配列によって分離されている。いくつかの実施形態では、前記リンカー核酸配列は、ヌクレオチド配列ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴ（配列番号５１）を含む。

【0155】

定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持している。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３（１９８８）に記載されているような配列をコードするＶＨ及びＶＬを含む核酸から発現できる。阻害活性を有するアンタゴニスティク（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）ｓｃＦｖが開示されている。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ），２７（６）：４５５－５１（２００８）を参照されたい。刺激活性を有するアゴニスティク（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）ｓｃＦｖが開示されている。例えば、Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２５２７８（３８）：３６７４０－７（２００３）を参照されたい。

【0156】

本明細書において、「Ｆａｂ」とは、抗原に結合するが一価であり、Ｆｃ部分を持たない抗体構造のフラグメントを指し、例えば、パパイン酵素によって消化された抗体は、２つのＦａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメント（例えば、重鎖（Ｈ）定常領域、抗原に結合しないＦｃ領域）を生成する。

【0157】

いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来してもよい。例えば、ヒトに使用する場合、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載されているようなヒト抗体又はそのフラグメントを含み得る。

【0158】

したがって、例えば、本明細書に記載の方法によって得られる免疫細胞は、以下の癌関連抗原（腫瘍抗原）のうちの１つを標的とするＣＡＲを発現するように組み換えることができる：ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２（シグレック２（Ｓｉｇｌｅｃ ２））；ＣＤ３７；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；ＣＤ１３３；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－ｌ）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オ－ファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファー（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テストシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；葉酸受容体アルファー；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ １）；ＧａｌＮＡｃａ１－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔｎ）ＭＵＣ １（ＴｎＭＵＣ１）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；変異型伸長因子２（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファー（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレークポイントクラスタ－領域（ＢＣＲ）とアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量－メラノーマー関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；悪性黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座変異遺伝子６、染色体１２ｐに位置する（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥｌ）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；悪性黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；悪性黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３バリアント；プロステイン；サヴァイヴィング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される悪性黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴＩ）；ラット肉腫（Ｒａｓ）バリアント；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；悪性黒色腫アポトーシス抑制因子（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃ鳥類骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ又はインプリント部位の調節因子のブラザー（ＢＯＲＩＳ ｏｒ Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ））、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ｂｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ３）（ＳＡＲＴ３）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳｌ）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異体（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ 受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン２（ＧＰＣ２）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；ＮＫＧ２Ｄ；ＫＲＡＳ；ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）；ＩＬ１３Ｒａ２；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；及び免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。

【0159】

いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３７、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＲＡＳ又はＷＴ１を標的とするＣＡＲを発現するように組み換えられる。
２． 膜貫通ドメイン：

【0160】

膜貫通ドメインに関しては、前記ＣＡＲは、該ＣＡＲの抗原結合ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含むように設計することができる。対象ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞（例えば、免疫細胞又はその前駆細胞）の細胞膜を貫通することができる領域である。前記膜貫通ドメインは、細胞膜、例えば、真核生物の細胞膜に挿入するためのものである。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインとＣＡＲの細胞内ドメインとの間に介在する。

【0161】

一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲ内の１つ又は複数のドメインと自然に関係する。いくつかの例において、前記膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小にするために、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避けるように、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。

【0162】

いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、天然ソース又は合成ソースの何れかに由来し得る。前記ソースが天然である場合、前記ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質、例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来し得る。前記ソースが合成である場合、前記膜貫通ドメインは、前記ＣＡＲの細胞膜への挿入を容易にする任意の人工配列、例えば人工疎水性配列であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明で特に使用される膜貫通ドメインは、限定されないが、Ｔ細胞受容体のアルファー、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に由来する膜貫通ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファー、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも１つの膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは合成であってもよい。いくつかの実施形態では、前記合成膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリン等の疎水性残基を含む。ある例示的な実施形態では、合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが見られる。

【0163】

本明細書に記載の膜貫通ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインの何れか、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインの何れか、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの何れか又は対象ＣＡＲに含まれる可能性がある本明細書に記載の他のドメインの何れかと組み合わせることができる。

【0164】

一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２４で示されるヌクレオチド配列を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２８で示されるヌクレオチド配列を含む。

【0166】

意図された機能を維持しながら、前記膜貫通ドメイン及び／又はヒンジドメインの許容可能なバリエーションは、当業者には公知である。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３及び／又は配列番号２７で示されるアミノ酸配列の任意の何れかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２４及び／又は２８で示されるヌクレオチド配列の任意の何れかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。前記膜貫通ドメインは、任意のヒンジドメインと組み合わせることができ、及び／又は本明細書に記載の１つ又は複数の膜貫通ドメインを含むことができる。

【0167】

いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、任意の抗原結合ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファー、ベータ又はゼータ鎖のＴ膜貫通ドメイン（ｔｈｅ ｔ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）からなる群から選択される膜貫通ドメイン、任意の共刺激シグナル伝達ドメイン及び任意の細胞内ドメイン又は本明細書に記載される細胞質ドメイン、又はＣＡＲに含まれる可能性のある本明細書に記載される他のドメインの何れか、及び任意選択でヒンジドメイン、を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、又は、ＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインをさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「スペーサードメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）」は、一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインの何れかに連結する機能を果たす任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大約３００個のアミノ酸、例えば、約１０個～約１００個のアミノ酸又は約２５個～約５０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、前記スペーサードメインは、例えば、長さが約２個～約１０個のアミノ酸の短いオリゴ又はポリペプチドリンカーであってもよい。例えば、グリシン－セリンダブレット（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅｔ）は、対象ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に特に適したリンカーを提供する。

【0169】

したがって、本開示のＣＡＲは、本明細書に記載の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、又はスペーサードメインの任意の何れかを含み得る。
３． ヒンジドメイン：

【0170】

いくつかの実施形態では、本発明の対象ＣＡＲは、ヒンジ領域を含む。前記ＣＡＲのヒンジ領域は、前記抗原結合ドメイン及び前記膜貫通ドメインの間に位置する親水性領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、ＣＡＲの適切なタンパク質折り畳みを促進する。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、ＣＡＲの任意選択の成分である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工ヒンジ配列又はそれらの組み合わせから選択されるドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、ＣＤ８ａヒンジ、３つのグリシン（Ｇｌｙ）ほど小さくてもよいポリペプチドからなる人工ヒンジから選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、受容体に由来するヒンジ領域ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８由来のヒンジ領域である。一実施形態では、前記ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８に由来するアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、対象ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメイン及びＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２６で示されるヌクレオチド配列を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号２５で示されるアミノ酸配列の任意の何れかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、配列番号２６で示されるヌクレオチド配列の任意の何れかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。

【0172】

いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、前記抗原結合ドメインを、前記膜貫通ドメインに接続し、該膜貫通ドメインは、前記細胞内ドメインに連結される。例示的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、前記抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原を認識して結合することをサポートすることが可能である。例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，３（２）：１２５－１３５（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、柔軟なドメインであり、これにより、前記抗原結合ドメインは、腫瘍細胞等の細胞上の標的抗原の特定の構造及び密度を最適に認識する構造を有することができる。前記ヒンジ領域の柔軟性により、該ヒンジ領域はさまざまな立体構造をとることができる。

【0173】

いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインの長さは、約４～約５０、約４～約１０、約１０～約１５、約１５～約２０、約２０～約２５、約２５～約３０、約３０～約４０又は約４０～約５０個のアミノ酸から選択される。

【0174】

適切なヒンジ領域は容易に選択することができ、約１個のアミノ酸（例えば、グリシン（Ｇｌｙ））～約２０個のアミノ酸、約２～約１５、約３～約１２個のアミノ酸、約４～約１０、約５～約９、約６～約８又は約７～約８個のアミノ酸を含む、任意の数の適切な長さとすることができ、約１、約２、約３、約４、約５、約６又は約７個のアミノ酸とすることができる。

【0175】

いくつかの実施形態では、前記アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）である。グリシン及びグリシン－セリンポリマーを使用でき、グリシンとセリンはどちらも比較的構造化されていないため、成分間の中立的な結合剤として機能する。グリシンポリマーも使用可能であり、グリシンは、アラニンよりもはるかに広いファイ－プサイ空間にアクセスし、長い側鎖を持つ残基よりもはるかに制限が少なくなっている（例えば、Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２：７３－１４２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマーを含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４７）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４８）からなる群から選択されるグリシン－セリンポリマーを含み、ここでｎは少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、これらに限定されないが、ＧＧＳＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー又は当技術分野で知られている他の柔軟なリンカーを含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンヒンジドメインは、ＤＫＴＨＴ（配列番号３５）、ＣＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号３７）（例えば、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：４１４９４－４１５０３を参照されたい）、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号３８）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号３９）、ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号４０）、ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号４１）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４２）（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号４３）（ヒトＩｇＧ２ヒンジ）、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号４４）（ヒトＩｇＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号４５）（ヒトＩｇＧ４ヒンジ）等からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジは、ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換及び／又は挿入及び／又は欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジの位置２２９のヒスチジン（Ｈｉｓ２２９）がチロシン（Ｔｙｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、前記ヒンジドメインは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰ（配列番号４６）を含む。
４． 共刺激ドメイン：

【0178】

本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインも含む。ＣＡＲの細胞内ドメイン又は細胞質ドメインは、ＣＡＲが発現する細胞の活性化を担う。したがって、用語「細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）」は、活性化シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の部分を含むことを意味する。一実施形態では、前記細胞内ドメインには、エフェクター機能を担うドメインが含まれる。用語「エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」は、細胞の特殊な機能を指する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインには、シグナル活性化及び／又は伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を担うドメインが含まれる。前記細胞内ドメインは、タンパク質間相互作用、生化学的変化、又はその他の反応を介してシグナル活性化を伝達し、キメラ細胞内シグナル伝達分子の活性化に対する細胞の代謝、形状、遺伝子発現又はその他の細胞反応を変化させ得る。

【0179】

本発明で使用される細胞内ドメインの例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質部分、任意の共刺激分子、又は抗原受容体の結合後にＴ細胞内でシグナル伝達を開始するためにＴＣＲと協調して作用する任意の分子、並びにこれらの要素の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能能力を有する任意の合成配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0180】

いくつかの実施形態では、前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達を含む。ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質からのシグナル伝達ドメインの一部、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に由来する細胞内ドメイン、それらの任意の誘導体又はバリアント、同じ機能能力を有するそれらの任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に由来する細胞内ドメイン、又はそれらのバリアントからなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２又はそれらの組み合わせのタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。

【0182】

一実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２又は３で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８（ＹＭＦＭ）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ２８（ＹＭＦＭ）共刺激ドメインは、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＩＣＯＳ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号９又は配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むＩＣＯＳ（ＹＭＮＭ）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＩＣＯＳ（ＹＭＮＭ）共刺激ドメインは、配列番号１２で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ２共刺激ドメインを含む。 。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ２共刺激ドメインは、配列番号１４で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ２７共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号１６で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むＯＸ４０共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ＯＸ４０共刺激ドメインは、配列番号１８で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。
５． 細胞内ドメイン：

【0183】

ある実施形態では、前記細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。前記細胞内ドメインの例には、以下の１つ又は複数の分子又は受容体からのフラグメント又はドメインが含まれるが、これらに限定されるわけではない：ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（Ｆｃイプシロンリブ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲ１１ａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ９、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＫＩＲファミリータンパク質、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファー、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファー、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１Ｉｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｉｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、本明細書に記載のその他の共刺激分子、それらの誘導体、バリアント又はフラグメント、同じ機能能力を有する共刺激分子の合成配列、及びそれらの組み合わせ。

【0184】

いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質テール、細胞質受容体を有する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ、又はそれらのバリアントからなる群から選択される細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0185】

細胞内ドメインのさらなる例には、ＣＤ３、Ｂ７ファミリー共刺激因子、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体を含む第１、第２、及び第３世代のＴ細胞シグナル伝達タンパク質を含むがこれらに限定されない。いくつかの種類の様々な他の免疫シグナル伝達受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。さらに、細胞内シグナル伝達ドメインには、ＮＫｐ３０（Ｂ７－Ｈ６）、ＤＡＰ１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０及びＣＤ３ｚのシグナル伝達ドメインなど、ＮＫ及びＮＫＴ細胞によって使用されるシグナル伝達ドメインが含まれ得る。

【0186】

本発明のＣＡＲに使用するのに適した細胞内シグナル伝達ドメインには、ＣＡＲの活性化（すなわち、抗原及び二量化剤による活性化）に応答してシグナルを伝達する任意の所望のシグナル伝達ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、明確かつ検出可能なシグナルには、例えば、細胞による１つ又は複数のサイトカインの産生の増加、標的遺伝子の転写の変化、タンパク質の活性の変化、細胞挙動の変化（例えば、細胞死）、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、及び／又は細胞シグナル伝達応答の調節が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインには、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８タイプのシグナル伝達鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合型ＣＡＲに共有結合されておらず、代わりに細胞質内に拡散している。

【0187】

本発明のＣＡＲに使用するのに適した細胞内シグナル伝達ドメインには、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、以下に記載されるように、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは、細胞内シグナル伝達ドメイン内で２回繰り返され、該ＩＴＡＭモチーフの最初と２番目のインスタンス（ｉｎｓｔａｎｃｅｓ）は、６～８個のアミノ酸によって互いに分離されている。一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、３個のＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインには、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩＡ、ＦｃガンマＲＩＩＣ、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ、ＦｃＲＬ５等の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

【0188】

適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチド由来のＩＴＡＭモチーフ含有部分であり得る。例えば、適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質からのＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであり得る。したがって、適切な細胞内シグナル伝達ドメインには、それが由来するタンパク質全体の配列全体が含まれている必要はない。適切なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例には、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファー鎖）が含まれるが、これらに限定されない。

【0189】

一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質、ＫＡＲＡＰ、ＰＬＯＳＬ、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２、ＫＡＲ関連タンパク質、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質、キラー活性化受容体関連タンパク質、キラー活性化受容体関連タンパク質等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ、Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、ｆｃ－イプシロンＲＩ－ガンマ、ｆｃＲガンマ、ｆｃｅＲ１ガンマ、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ、免疫グロブリンＥ受容体、高親和性ガンマ鎖等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３デルタ、Ｔ３Ｄ、ＣＤ３抗原、デルタサブユニット、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）、ＯＫＴ３デルタ鎖、Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅ等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３ガンマ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファー鎖、ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファー）、ＭＢ－１膜糖タンパク質、Ｉｇ－アルファー、膜結合免疫グロブリン関連タンパク質、表面ＩｇＭ関連タンパク質等とも呼ばれる）に由来する。一実施形態では、本開示のＣＡＲに使用するのに適した細胞内シグナル伝達ドメインには、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖が含まれる。一実施形態では、本開示の対象ＣＡＲで使用するのに適した細胞内シグナル伝達ドメインには、ＺＡＰ７０ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインには、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる。一実施形態では、ＣＡＲ内の細胞内シグナル伝達ドメインには、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる。

【0190】

通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。前記細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎ）が使用される限り、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全な鎖の代わりに使用することができる。前記細胞内シグナル伝達ドメインには、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれる。

【0191】

本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインの何れか、本明細書に記載の抗原結合ドメインの何れか、本明細書に記載の膜貫通ドメインの何れか又はＣＡＲに含まれる可能性のある本明細書に記載の他のドメインの何れかと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメイン（ｄｕａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ）を含む。前記二重シグナル伝達ドメインには、本明細書に記載の分子の何れかからのフラグメント又はドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、前記細胞内ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインには、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からの少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、それらの任意の誘導体又はバリアント、同じ機能能力を持つそれらの任意の合成配列及びそれらの任意の組み合わせ等の共刺激分子の任意の部分が含まれる。

【0192】

さらに、対象ＣＡＲに使用するのに適したバリアント細胞内シグナル伝達ドメインは、当該技術分野で公知である。前記ＹＭＦＭモチーフは、ＩＣＯＳに存在し、ＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットとｐ５０アルファーサブユニットの両方をリクルートする（ｒｅｃｒｕｉｔｓ）ＳＨ２結合モチーフであり、ＡＫＴシグナル伝達を増強する（ｅｎｈａｎｃｅｄ）。一実施形態では、ＣＤ２８細胞内ドメンバーリアントは、ＹＭＦＭモチーフを含むように生成され得る。

【0193】

一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号１９又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これは、それぞれ配列番号２０又は配列番号２２で示されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされ得る。

【0194】

特定の活性を維持しながら細胞内ドメインを許容できる範囲で変化させることは、当業者には公知である。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号１９又は２１で示されるアミノ酸配列の何れかと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内ドメインは、配列番号２０又は２２で示されるヌクレオチド配列の何れかと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる。

【0195】

一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８ＹＭＦＭバリアント共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一つの例示な実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一つの例示な実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２共刺激ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0196】

表２は、本明細書に記載のＣＡＲのドメインの例示的な配列を示す。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

Ｂ． 追加の抗原結合ポリペプチド：

【0197】

いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド、又は腫瘍抗原に結合するポリペプチドを発現する。いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、細胞表面タンパク質又は腫瘍細胞上に発現する受容体を認識する抗体を含む。いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原を認識する抗体を含む。いくつかの例では、前記抗原結合ドメインは、全長抗体又はその抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、単一特異性Ｆａｂ_２、二重特異性Ｆａｂ_２、三重特異性Ｆａｂ_２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、Ｖ－ＮＡＲ又はＶｈＨを含む。
Ｃ． 細胞表面受容体リガンド：

【0198】

いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、細胞表面受容体リガンドを発現する。いくつかの例では、前記リガンドは、腫瘍細胞上に発現する細胞表面受容体に結合する。いくつかの例では、前記リガンドは、細胞表面受容体に結合する野生型タンパク質又はそのバリアントを含む。いくつかの例では、前記リガンドは、細胞表面受容体に結合する全長タンパク質又はその機能的フラグメントを含む。いくつかの例では、前記機能的フラグメントは、タンパク質の全長バ－ジョンと比較して、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％又は約４０％の長さを含むが、細胞表面受容体への結合は保持される。いくつかの例では、前記リガンドは細胞表面受容体に結合する新規な組み換えタンパク質である。例示的なリガンドには、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）又はＷｎｔ３Ａが含まれるが、これらに限定されない。
Ｄ． 腫瘍抗原：

【0199】

いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、腫瘍抗原に結合するポリペプチドを発現する。いくつかの例では、腫瘍抗原は血液悪性腫瘍と関連する。例示的な腫瘍抗原には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＩＬ１３Ｒａ２が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３７、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＧＤ２、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＲＡＳ又はＷＴ１を含む。いくつかの例では、前記ポリペプチドは、腫瘍抗原のリガンド、例えば、腫瘍抗原に結合する全長タンパク質、その機能的フラグメント、又は腫瘍抗原に結合する新規な組み換えリガンドである。いくつかの例では、前記ポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する抗体である。
Ｅ． スイッチ受容体及びドミナントネガティブ受容体：

【0200】

一態様では、本開示には、本明細書に記載のように遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞も含まれ、さらに、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はドミナントネガティブ受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、さらに、ＣＡＲ及びスイッチ受容体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、組み換えＴＣＲ及びスイッチ受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、組み換えＴＣＲ及びドミナントネガティブ受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、ＫＩＲ及びスイッチ受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞は、ＫＩＲ及びドミナントネガティブ受容体をさらに含む。
１． スイッチ受容体：

【0201】

本発明は、ＣＡＲ及びスイッチ受容体を含む、遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞又はその前駆細胞のための組成物及び方法を提供する。腫瘍細胞は、免疫による認識や排除から保護するために免疫抑制性の微小環境を生成する。この免疫抑制性微小環境は、ＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞療法等の免疫抑制療法の有効性を制限する可能性がある。例えば、分泌されたサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＴＧＦβ）は、細胞傷害性Ｔ細胞の機能を直接阻害し、さらに制御性Ｔ細胞の形成を誘導して免疫反応をさらに抑制する。前立腺癌におけるＴＧＦβによるＴ細胞免疫抑制は、以前にＤｏｎｋｏｒ ｅｔ ａｌ（２０１１）及びＳｈａｌａｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ（２０１５）によって実証されている。免疫細胞上のＴＧＦの免疫抑制効果を軽減するために、免疫細胞を修飾して、例えばインターロイキン１２受容体（ＩＬ１２Ｒ、ＴＧＦβＲ－ＩＬ１２Ｒ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合したＴＧＦβＲの細胞外リガンド結合ドメインを含む組み換えＴＧＦβＲを発現させることができる。したがって、スイッチ受容体を含む修飾免疫細胞は、該修飾免疫細胞の微小環境内の負のシグナル伝達分子に結合し、該修飾免疫細胞に及ぼす阻害分子の負のシグナル伝達シグナルを、該修飾免疫細胞を刺激する正のシグナルに変換し得る。本発明のスイッチ受容体は、正のシグナルに関連する細胞内ドメインを含むことにより、負のシグナル伝達分子の影響を低減するか、又は負のシグナルを正のシグナルに変換するように設計され得る。

【0202】

したがって、。いくつかの実施形態では、内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子座に挿入及び／又は欠失を含む修飾免疫細胞は、スイッチ受容体を発現するようにさらに遺伝子修飾されている。本明細書で使用される場合、用語「スイッチ受容体（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、本発明の修飾免疫細胞に対する負のシグナル伝達分子の影響を低減するように設計された分子を指す。前記スイッチ受容体は、負のシグナル（細胞又はＴ細胞の活性化を抑制又は阻害するシグナル伝達）に関連する第１のポリペプチド由来の第１のドメインと、正のシグナル（細胞又はＴ細胞を刺激するシグナル伝達シグナル）に関連する第２のポリペプチド由来の第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、前記負のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記正のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ及びＣＤ２７からなる群から選択される。

【0203】

一実施形態では、前記第１ドメインは、負のシグナルに関連する第１ポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも一部を含み、前記第２ドメインは、正のシグナルに関連する第２ポリペプチドの細胞内ドメインの少なくとも一部を含む。したがって、スイッチ受容体は、正のシグナルに関連する細胞内ドメインに融合された負のシグナルに関連する細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体は、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び正のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体の膜貫通ドメインは、負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通ドメイン又は負のシグナルに関連するタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体の膜貫通ドメインは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＴＧＦβＲＩＩ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＬ１２Ｒβ１、ＩＬ１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。

【0204】

いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１、及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択される。

【0205】

いくつかの実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－ＣＤ２８であり、配列番号７８で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８であり、配列番号８２で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＰＤ－１－４－１ＢＢであり、配列番号８４で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体はＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢであり、配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１であり、配列番号８８で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２であり、配列番号９０で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記スイッチ受容体は、配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９又は９１で示される核酸配列でコードされる。

【0206】

意図された生物学的活性（例えば、細胞内で発現されたときに負のシグナルを正のシグナルに変換すること）を維持しながらの、前記スイッチ受容体の許容可能な変異は、当業者には公知である。したがって、。いくつかの実施形態では、本発明のスイッチ受容体は、配列番号７９、８１、８３、８５、８７、８９又は９１で示される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明のスイッチ受容体は、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、８８又は９０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0207】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ３、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ、ＣＡＲ、並びにＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２、からなる群から選択されるスイッチ受容体を下方制御することができる挿入及び／又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される内因性免疫タンパク質、ＣＡＲ、及びＰＤ－１－ＣＤ２８、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２８、ＰＤ－１－ＣＤ２７、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＣＤ２７、ＰＤ－１－４－１ＢＢ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－４－１ＢＢ、ＰＤ－１－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＣＯＳ、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ１、ＰＤ－１－ＩＬ１２Ｒβ２、ＰＤ－１^{Ａ１３２Ｌ}－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２８、ＶＳＩＧ３－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ８－ＣＤ２７、ＶＳＩＧ３－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ８－４－１ＢＢ、ＶＳＩＧ３－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ８－ＩＣＯＳ、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ１、ＶＳＩＧ３－ＩＬ１２Ｒβ２、ＶＳＩＧ８－ＩＬ１２Ｒβ２、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２７、ＴＧＦβＲＩＩ－ＣＤ２８、ＴＧＦβＲＩＩ－４－１ＢＢ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＣＯＳ、ＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ１及びＴＧＦβＲＩＩ－ＩＬ１２Ｒβ２からなる群から選択されるスイッチ受容体をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座における挿入及び／又は欠失を含む。
２． ドミナントネガティブ受容体：

【0208】

本発明は、ＣＡＲ及びドミナントネガティブ受容体を含む、遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞又はその前駆細胞のための組成物及び方法を提供する。したがって、。いくつかの実施形態では、内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子座に挿入及び／又は欠失を含む修飾免疫細胞は、ドミナントネガティブ受容体を発現するようにさらに遺伝子的に修飾されている。本明細書で使用される場合、用語「ドミナントネガティブ受容体（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、負のシグナル伝達分子の効果（例えば、本発明の修飾免疫細胞に対する負のシグナル伝達分子の効果）を低減するように設計された分子を指す。ドミナントネガティブ受容体は、負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断バリアント（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）である。いくつかの実施形態では、負のシグナルに関連するタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。

【0209】

本発明のドミナントネガティブ受容体は、負のシグナル伝達分子（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、及びＴＩＭ－３）に結合し、負のシグナル伝達分子に関連する細胞外ドメインによって負のシグナル伝達分子の効果を低減することができる。例えば、ドミナントネガティブ受容体を含む修飾免疫細胞は、該修飾免疫細胞の微小環境内の負のシグナル伝達分子に結合し得るが、この結合によって細胞内にこのシグナルが伝達され、修飾Ｔ細胞の活動が改変されることはない。むしろ、前記結合により負のシグナル伝達分子が隔離され、内因性受容体／リガンドへの結合が防止され、それによって負のシグナル伝達分子が修飾免疫細胞に及ぼす影響が低減される。そのため、ある分子の免疫抑制効果を低減するために、免疫細胞を修飾して、ドミナントネガティブ受容体であるドミナントネガティブ受容体を発現させることができる。

【0210】

いくつかの実施形態では、前記ドミナントネガティブ受容体は、負のシグナルに関連する野生型タンパク質の切断バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを実質的に欠く負のシグナルに関連する野生型タンパク質のバリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記ドミナントネガティブ受容体は、負のシグナルに関連するシグナル伝達タンパク質の細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８又はＴＩＭ－３ドミナントネガティブ受容体である。いくつかの実施形態では、前記ドミナントネガティブ受容体は、ＰＤ－１又はＴＧＦβＲＩＩである。いくつかの実施形態では、前記ＴＧＦβＲＩＩは、配列番号７６で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩは、配列番号７７で示される核酸配列によってコードされる。

【0211】

その意図された生物学的活性（例えば、負のシグナルを遮断すること及び／又は細胞内で発現されたときに負のシグナルを有する分子を隔離すること）を維持しながらの、ドミナントネガティブ受容体の許容可能な変異は、当業者には公知である。したがって、。いくつかの実施形態では、本発明のドミナントネガティブ受容体は、配列番号７７で示される核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明のドミナントネガティブ受容体は、配列番号７６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Ｆ． 健康増進のための免疫増強因子としてのケモカイン及びサイトカイン：

【0212】

本発明は、ＣＡＲを含み、さらに、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９又はそれらの組み合わせを含む、免疫遺伝子発現が下方制御された修飾免疫細胞のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣモチーフ ケモカイン リガンド２１（Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ ２１）（ＣＣＬ２１）又はＣＣモチーフ ケモカイン リガンド １９ （ＣＣＬ１９）は、特許請求された修飾免疫細胞の適応性を向上させる免疫機能増強因子（ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）である。理論に縛られることを望まないが、修飾免疫細胞にケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９を添加すると、修飾免疫細胞の免疫誘導効果（ｉｍｍｕｎｉｔｙ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）及び抗腫瘍活性（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増強される。

【0213】

理論に縛られることは望まないが、インターロイキン及びケモカインは、固形腫瘍におけるＴ細胞プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）及び／又はＴ細胞浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の増加を促進し得る。例えば、Ｔ細胞浸潤が低いマイクロサテライト安定大腸がん（ＣＲＣ）では、ＩＬ－１５がＴ細胞のプライミングを促進する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲとケモカイン／インターロイキン受容体複合体の組み合わせが、Ｔ細胞のプライミングを促進する。さらに、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の浸潤を誘発し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡ複合体に対する応答により、ＮＫ細胞の浸潤が起こる可能性がある。ある実施形態では、本明細書に記載の修飾免疫細胞は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、ＮＩＺ９８５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＴＬ－８０３（Ａｌｔｏｒ）又はＣＹＰ０１５０（Ｃｙｔｕｎｅ）から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡ複合体は、ＮＩＺ９８５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー細胞を刺激して膵臓癌細胞を排除（例えば、殺す）する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒａをさらに含む、本明細書に記載の修飾免疫細胞に対する治療反応は、大腸癌の動物モデルにおけるナチュラルキラー細胞浸潤と関連している。いくつかの実施形態では、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、可溶性形態のヒトＩＬ－１５Ｒａと複合体を形成したヒトＩＬ－１５を含む。前記複合体は、可溶性形態のＩＬ－１５Ｒａ に共有結合又は非共有結合したＩＬ－１５を含み得る。特定の実施形態では、ヒトＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒａの可溶性形態に非共有結合している。

【0214】

固形腫瘍に対するＣＡＲ Ｔ細胞療法の無効性は、固形腫瘍における免疫細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞のリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）及び蓄積が限られていることに部分的に起因している。この問題を解決する１つの方法は、Ｔゾーン線維芽細胞網状細胞（ＦＲＣ）の機能を模倣するＣＡＲ Ｔ細胞を設計することである。リンパ節は病原体や免疫原を検出する役割を担っている。Ｔゾーン（Ｔ－ｚｏｎｅ）には、（１）樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球等の自然免疫細胞、（２）ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球等の適応免疫細胞、（３）間質細胞（ＦＲＣ）の３種類の細胞が含まれている。これらの細胞は協力して、ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化、分化、成熟を促進し、病原体に対する効果的な免疫反応を起こす。ＦＲＣは、樹状細胞とＴ細胞がリンパ節全体を移動し、Ｂ細胞を引き付けるネットワークを形成するため、特に重要である。特に、ＦＲＣは、（ｉ）２つのケモカイン（ＣＣＬ２１及びＣＣＬ１９）を放出してナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、Ｂ細胞及び樹状細胞をリンパ節にリクルートすること、（ｉｉ）特にナイーブＴ細胞の生存因子であるＩＬ－７を分泌してＴ細胞を生存させること、（ｉｉｉ）ＣＤ４ Ｔ細胞を胚中心（ＧＣ、リンパ節の別の部分）に向けて移動させること、のためのネットワークを提供する。したがって、外因性のＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９とＩＬ－７で補強された（ａｒｍｏｒｅｄ ｗｉｔｈ）ＣＡＲは、固形腫瘍へのＴ細胞、Ｂ細胞及び樹状細胞のリクルートを増強する。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞は、免疫機能増強因子をコードする核酸を含み、免疫機能増強因子をコードする核酸は、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１をコードする核酸である。

【0215】

いくつかの実施形態では、免疫機能増強因子（すなわち、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９）の核酸がＣＡＲに融合される。いくつかの実施形態では、前記ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ等の自己切断ペプチド（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を介してＣＡＲに融合される。
ＶＩ． 修飾Ｔ細胞の生成方法：

【0216】

本発明の一態様は、修飾免疫細胞（例えば、同種異形Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）を生成する方法を提供する。本発明の修飾免疫細胞は、一般的に、（１）内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を免疫細胞に導入すること、（２）組み換え受容体をコードする外因性核酸を免疫細胞に導入すること、及び（３）修飾免疫細胞を増殖させて修飾免疫Ｔ細胞を生成することによって操作される。このような修飾免疫細胞は、治療用組成物に含められ、それを必要とする患者に投与され得る。

【0217】

いくつかの実施形態では、本発明の修飾免疫細胞を生成する方法は、１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を免疫細胞に導入することを含む。前記の１つ又は複数の免疫遺伝子は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質をコードする。さらに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸も免疫細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記方法は、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。
Ａ． 細胞への核酸導入方法：

【0218】

細胞内に核酸を導入する方法としては、物理的方法、生物学的方法、化学的方法等がある。ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、粒子衝撃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法等がある。ＲＮＡは、電気穿孔法（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、ケルン））、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州、ボストン）、又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、コロラド州、デンバー）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ、ハンブルク）等の市販の方法を使用して標的細胞に導入できる。ＲＮＡは、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカープセル化、ペプチド媒介トランスフェクション又は「遺伝子銃」等のバイオリスティック粒子送達システムを使用して細胞に導入することもできる。
１． 生物学的方法：

【0219】

目的のポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば免疫細胞）に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用等がある。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳類（例えばヒトの細胞）に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等から得ることができる。例えば、米国特許５，３５０，６７４号及び５，５８５，３６２号を参照されたい。

【0220】

いくつかの実施形態では、本発明の主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸が、発現ベクターによって細胞に導入される。本明細書では、主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。適切な発現ベクターには、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、組み換えハイブリッドウイルス、裸のＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）が含まれ、これには、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｃｋ等のトランスポゾン媒介ベクター及びＰｈｉ３１等のインテグラーゼ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。その他の適切な発現ベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びレトロウイルス発現ベクター等がある。

【0221】

アデノウイルス発現ベクターは、ゲノムＤＮＡへの組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）能力は低いが、宿主細胞へのトランスフェクション効率は高いアデノウイルスをベースにしている。アデノウイルス発現ベクターには、（ａ）発現ベクターのパッケージングをサポートし、（ｂ）宿主細胞内で主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列が含まれている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスゲノムは、外来ＤＮＡ配列を含む３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡである。例えば、本発明の発現ベクターを作成するために、主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸を挿入して、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片（ｐｉｅｃｅｓ）を置換することができる。

【0222】

別の発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスに基づいており、アデノウイルス結合系を利用している。このＡＡＶ発現ベクターは、宿主ゲノムへの高い組み込み頻度を有する。分裂していない細胞にも感染できるため、例えば、組織培養及びインビボで哺乳類細胞に遺伝子を送達するのに有用である。ＡＡＶベクターは、広い感染性の宿主範囲を有する。ＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。

【0223】

レトロウイルス発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれ、大量の外来遺伝物質を送達し、広範囲の種及び細胞タイプに感染し、特殊な細胞株にパッケージ化されることができる。レトロウイルスベクターは、核酸（例えば、主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸）をウイルスゲノムの特定の位置に挿入して、複製欠陥のあるウイルスを生成することによって構築される。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞タイプに感染することができるが、主題のＣＡＲ、主題の組み換えＴＣＲ、主題のＫＩＲ、主題の抗原結合ポリペプチド、主題の細胞表面受容体リガンド、主題の腫瘍抗原、主題のスイッチ受容体及び／又は主題のドミナントネガティブ受容体の統合及び安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である。

【0224】

レンチウイルスベクターは、レンチウイルスに由来する。レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、制御又は構造機能を持つ他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号を参照されたい。レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＶ－１、ＨＴＶ－２）やサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）等がある。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子が削除され、ベクターが生物学的に安全になる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、対象のＣＡＲ、対象の組み換えＴＣＲ、対象のＫＩＲ、対象の抗原結合ポリペプチド、対象の細胞表面受容体リガンド、対象の腫瘍抗原、対象のスイッチ受容体及び／又は対象のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸のインビボ及びエクスビボの両方での遺伝子移入及び発現に使用することができる。例えば、米国特許第５，９９４，１３６号を参照されたい。

【0225】

本開示の核酸を含む発現ベクターは、当業者に知られている任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。必要に応じて、前記発現ベクターにトランスフェクション用のウイルス配列を含めることができる。あるいは、前記発現ベクターは、融合、電気穿孔法、バイオリスティックス、トランスフェクション、リポフェクション等によって導入されてもよい。発現ベクターを導入する前に、宿主細胞（免疫細胞等）を培養して増殖させ、その後、ベクターの導入及び組み込みのための適切な処理を施すことができる。その後、宿主細胞（例えば、免疫細胞）が増殖され、ベクター内に存在するマーカーによってスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、対象のＣＡＲ、対象の組み換えＴＣＲ、対象のＫＩＲ、対象の抗原結合ポリペプチド、対象の細胞表面受容体リガンド、対象の腫瘍抗原、対象のスイッチ受容体及び／又は対象のドミナントネガティブ受容体をコードする核酸は、ウイルス形質導入（ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって免疫細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記ウイルス形質導入は、免疫細胞を、１つ又は複数の核酸を含むウイルスベクターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。使用可能な様々なマーカーが当該技術分野で公知であり、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等が含まれる。本明細書で使用される場合、「細胞（ｃｅｌｌ）」、「細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」、及び「細胞培養（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞又はその前駆細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、及び治療上重要な子孫を生じ得るマクロファージである。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、幹細胞、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は同種異形Ｔ細胞又は自己Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ）である。いくつかの実施形態では、同種異形Ｔ細胞又は自己Ｔ細胞はヒトのものである。

【0226】

本発明の修飾免疫細胞（例えば、遺伝子、ＣＡＲ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ドミナントネガティブ受容体及び／又はスイッチ受容体を下方制御することができる核酸を含む）は、本開示の核酸を含む発現ベクターを宿主細胞（例えば、免疫細胞）に安定的にトランスフェクトすることによって生成することができる。本開示の修飾細胞を生成するための追加の方法には、限定されないが、化学的変換方法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム及び／又はカチオン性ポリマーの使用）、非化学的変換方法（例えば、電気穿孔法、光学的変換、遺伝子電気伝達及び／又は流体力学的送達）、及び／又は粒子ベースの方法（例えば、インパレフェクション、遺伝子銃及び／又はマグネトフェクションの使用）が含まれる。本発明の遺伝子、ＣＡＲ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ドミナントネガティブ受容体及び／又はスイッチ受容体を下方制御することができる核酸を発現するトランスフェクトされた細胞（すなわち、免疫細胞）は、エクスビボで増殖させることができる。
２． 物理的方法：

【0227】

発現ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、粒子衝撃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法等が挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい。
３． 化学的方法：

【0228】

発現ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム等の脂質ベースの系が含まれる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソーム等の脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0229】

宿主細胞に外因性核酸を導入する方法、又は本発明の阻害剤に細胞をさらす方法にかかわらず、宿主細胞内の核酸の存在を確認するために、さまざまなアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等の当業者によく知られている分子生物学的アッセイ、特定のペプチドの有無を検出する等の生化学的アッセイ（例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）又は本発明の範囲内に含まれる因子を識別するための本明細書に記載のアッセイ）が含まれる。

【0230】

さらに、前記核酸は、増殖した宿主細胞（例えば、免疫細胞）の形質導入、増殖した宿主細胞（例えば、免疫細胞）のトランスフェクション、増殖した宿主細胞（例えば、免疫細胞）の電気穿孔等の任意の手段によって導入することができる。ある核酸は１つの方法で導入され、別の核酸は別の方法で宿主細胞（免疫細胞等）に導入され得る。
４． ＲＮＡ：

【0231】

一実施形態では、前記宿主細胞（例えば、免疫細胞）に導入される前記核酸は、ＲＮＡである。別の実施形態では、前記ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ又は合成ＲＮＡを含むｍＲＮＡである。前記ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成されたテンプレートを使用したインビトロ転写によって生成される。適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、任意のソースからの目的のＤＮＡをＰＣＲによって直接インビトロｍＲＮＡ合成のテンプレートに変換できる。前記ＤＮＡのソースとしては、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列又はその他の適切なＤＮＡソースが考えられる。

【0232】

ＰＣＲは、ｍＲＮＡのインビトロ転写のためのテンプレートを生成するために使用することができ、その後、細胞に導入される。ＰＣＲを実行する方法は、当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲで使用するプライマーは、ＰＣＲのテンプレートとして使用されるＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を持つように設計されている。本明細書に使用される場合、「実質的に相補的（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、プライマー配列中の塩基の大部分又は全てが相補的であるか又は１つ又は複数の塩基が非相補的であるか、又は不一致であるヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図した標的ＤＮＡとアニーリング又はハイブリダイズすることができる。前記プライマーは、ＤＮＡテンプレートの任意の部分と実質的に相補的になるように設計できる。例えば、前記プライマーは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む、細胞内で通常転写される遺伝子の一部（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計できる。前記プライマーは、特定の対象ドメインをコードする遺伝子の一部を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、前記プライマーは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの全て又は一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野で周知の合成方法によって生成される。「フォワ－ドプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）」とは、増幅されるＤＮＡ配列の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にあるＤＮＡテンプレート上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。ここで、「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」とは、コード鎖を基準として増幅されるＤＮＡ配列の位置５を指すために使用される。「リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）」とは、増幅されるＤＮＡ配列の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にある二本鎖ＤＮＡテンプレートに実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。ここで使用される「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」は、コード鎖に対して増幅されるＤＮＡ配列の位置３’を指すために使用される。

【0233】

ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用することができる。ＲＮＡは、好ましくは５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、０～３０００ヌクレオチドの長さを有する。コード領域に追加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、限定されるわけではないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用プライマーの設計等、さまざまな方法によって変更できる。このアプローチを使用すると、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの長さを変更することができる。

【0234】

５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の自然に発生する内因性の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードプライマーとリバースプライマーに組み込むか、テンプレートをその他の方法で変更することによって追加できる。目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性や翻訳効率を変更するのに役立つ。例えば、３’ＵＴＲ配列内のＡＵに富む要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させる可能性があることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当技術分野でよく知られているＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように選択又は設計することができる。

【0235】

一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のコザック配列を含むことができる。あるいは、上記のように、ＰＣＲによって目的の遺伝子に内因性ではない５’ＵＴＲが追加される場合は、５’ＵＴＲ配列を追加することでコンセンサスコザック配列を再設計できる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要なわけではないようである。多くのｍＲＮＡにコザック配列が必要であることは、当技術分野で知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスから得ることができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を阻害するために、３’又は５’ＵＴＲでさまざまなヌクレオチド類似体を使用することができる。

【0236】

遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡテンプレートからＲＮＡを合成できるようにするには、転写される配列の上流のＤＮＡテンプレートに転写プロモーターを付加する必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列をフォワ－ドプライマーの５’末端に追加すると、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれる。一実施形態では、前記プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されているように、Ｔ７ポリメラーゼプロである。その他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。

【0237】

一実施形態では、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳の開始、及び細胞内でのｍＲＮＡの安定性を決定する５’末端のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。環状ＤＮＡテンプレート（例えばプラスミドＤＮＡ）上では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には適さない長い連結生成物を生成する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されても真核生物のトランスフェクションには効果のない通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。線状ＤＮＡテンプレート上では、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、転写産物の３’末端をテンプレートの最後の塩基を超えて延長することができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２７０：１４８５－６５（２００３））。

【0238】

ポリＡ／Ｔストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）をＤＮＡテンプレートに組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性を引き起こす可能性があるため、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡテンプレートには欠失やその他の異常が高度に混入していることがよくある。このため、クローン作製には手間と時間がかかるだけでなく、信頼性に欠けることが多い。そのため、クローニングせずにポリＡ／Ｔ３’ストレッチを持つＤＮＡテンプレートを構築できる方法が非常に望ましい。転写ＤＮＡテンプレートのポリＡ／Ｔセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、１００Ｔテール（サイズは５０～５０００Ｔであり得る）等のポリＴテ－ルを含むリバースプライマーを使用してＰＣＲ中に生成することも、ＰＣＲ後にＤＮＡライゲーションやインビトロ組換え等の他の方法（ただしこれらに限定されない）で生成することもできる。ポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡに安定性を与え、ＲＮＡの分解を低減する。一般的に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関関係にある。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、１００～５０００個のアデノシンである。

【0239】

ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）等のポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用したインビトロ転写後にさらに伸長することができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍に増加する。さらに、３’末端に異なる化学基を付加することで、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる。このような付加物（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）には、修飾された／人工のヌクレオチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）及びその他の化合物が含まれ得る。例えば、ＡＴＰ類似体（ａｎａｌｏｇｓ）は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。５’キャップも、ＲＮＡ分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡには、５’キャップが含まれる。前記５’キャップは、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている技術を使用して提供される。Ｃｏｕｇｏｔ， ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０：９５８－９６６（２００５）。

【0240】

本明細書に開示された方法によって産生されるＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。前記ＩＲＥＳ配列は、キャップ非依存性リボソームのｍＲＮＡへの結合を開始し、翻訳の開始を促進する、任意のウイルス配列、染色体配列又は人工的に設計された配列である。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、界面活性剤等、細胞の透過性及び生存性を促進する因子を含むことができる、細胞の電気穿孔に適した任意の溶質を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡのような細胞に電気穿孔される。

【0241】

開示された方法は、遺伝子修飾宿主細胞が標的癌細胞を殺す能力の評価を含む、癌、幹細胞、急性及び慢性感染症並びに自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）の分野における基礎研究及び治療における宿主細胞活性の調節に適用することができる。

【0242】

また、本方法は、例えばプロモーターやインプットＲＮＡ（ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ）の量を変えることによって、広い範囲にわたって発現レベルを制御する能力を提供し、発現レベルを個別に制御することを可能にする。さらに、ＰＣＲベースのｍＲＮＡ産生技術により、さまざまな構造やドメインの組み合わせを持つｍＲＮＡの設計が大幅に容易になる。本発明のＲＮＡトランスフェクション方法の利点の１つは、ＲＮＡトランスフェクションが、本質的に一過性でベクターフリーであることである。ＲＮＡトランス遺伝子は、リンパ球に送達され、短期間のインビトロ細胞活性化の後、最小限の発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ）として、付加的なウイルス配列を必要とせずに、そこで発現させることができる。このような条件下では、トランス遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる可能性は低い。ＲＮＡのトランスフェクションの効率とリンパ球集団全体を均一に修飾する能力により、細胞のクローニングは必要ない。

【0243】

したがって、本発明は、本明細書に記載の、又は当業者に知られている遺伝子編集技術の何れかを使用して、本明細書に記載の１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を免疫細胞に導入することを含む、修飾免疫細胞又はその前駆細胞を生成する方法を提供する。ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＨＬＡ－Ｉ分子（例えば、ベータ２ミクログロブリン、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ又はＮＬＲＣ５）又はＨＬＡ－ＩＩ分子（例えば、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖）等、細胞に対する免疫応答の生成に関与する内因性遺伝子の発現を下方制御すると、修飾Ｔ細胞の免疫介在性拒絶が減少する。例えば、内因性ＴＣＲ受容体成分、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ、ベータ２ミクログロブリン、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を下方制御すると、宿主免疫系による拒絶反応を引き起こす可能性のあるＴ細胞上の同種抗原の表面提示（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）が除去される。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子発現を下方制御することができる核酸が、電気穿孔法、トランスフェクション又はレンチウイルス若しくは他のウイルス形質導入等によって、Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、本発明は、内因性遺伝子発現を下方制御することができる電気穿孔された核酸を含む修飾Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ウイルス形質導入によって免疫細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記ウイルス形質導入は、１つ又は複数の核酸を含むウイルスベクターと免疫細胞を接触させることを含む。一実施形態では、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。
Ｂ． 免疫細胞の遺伝子編集方法：

【0244】

一態様において、本開示は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質をコードする１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる１つ又は複数の核酸を免疫細胞に導入することを含む、免疫細胞の遺伝子編集方法を提供する。一実施形態では、修飾免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γから選択されるＴ細胞受容体サブユニットの遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、修飾免疫細胞を遺伝子編集する方法は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ又はＮＬＲＣ５から選択されるＨＬＡクラスＩ分子の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、修飾免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ又はインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＤ３δの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＤ３εの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＤ３γの遺伝子発現並びにＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、インバリアント鎖（Ｉｉ鎖）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＬＡ分子の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＤ３γの遺伝子発現並びにＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む：（１）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５；（２）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ；（３）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ；（４）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ；（５）ＣＤ３ε、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖；（６）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ；（７）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５；（８）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ；（９）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ；（１０）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ；（１１）ＣＤ３ε、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖；（１２）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ；（１３）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５；（１４）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ；（１５）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ；（１６）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ；（１７）ＣＤ３ε、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖；（１８）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ；（１９）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５；（２０）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ；（２１）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ；（２２）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ；（２３）ＣＤ３ε、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖；（２４）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ；（２５）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５；（２６）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ；（２７）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ；（２８）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ；又は（２９）ＣＤ３ε、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0247】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む：（１）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５；（２）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ；（３）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ；（４）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ；（５）ＣＤ３δ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖；（６）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ；（７）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５；（８）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ；（９）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ；（１０）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ；（１１）ＣＤ３δ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖；（１２）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ；（１３）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５；（１４）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ；（１５）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ；（１６）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ；（１７）ＣＤ３δ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖；（１８）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ；（１９）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５；（２０）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ；（２１）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ；（２２）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ；（２３）ＣＤ３δ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖；（２４）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ；（２５）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５；（２６）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ；（２７）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ；（２８）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ；又は（２９）ＣＤ３δ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0248】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、以下の遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む：（１）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５；（２）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＰ；（３）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸＡＮＫ；（４）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－ＤＭ；（５）ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ及びＩｉ鎖；（６）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＣＩＩＴＡ；（７）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸ５；（８）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＰ；（９）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＲＦＸＡＮＫ；（１０）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＨＬＡ－ＤＭ；（１１）ＣＤ３γ、ＴＡＰ１及びＩｉ鎖；（１２）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＣＩＩＴＡ；（１３）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸ５；（１４）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＰ；（１５）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＲＦＸＡＮＫ；（１６）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＨＬＡ－ＤＭ；（１７）ＣＤ３γ、ＴＡＰ２及びＩｉ鎖；（１８）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＣＩＩＴＡ；（１９）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸ５；（２０）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＰ；（２１）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＲＦＸＡＮＫ；（２２）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＨＬＡ－ＤＭ；（２３）ＣＤ３γ、ＮＬＲＣ５及びＩｉ鎖；（２４）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＣＩＩＴＡ；（２５）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸ５；（２６）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＰ；（２７）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＲＦＸＡＮＫ；（２８）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＨＬＡ－ＤＭ又は（２９）ＣＤ３γ、ＴＡＰＢＰ及びＩｉ鎖。

【0249】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲシステムからなる群から選択される遺伝子編集系を含む、遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。内因性免疫遺伝子の発現は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系等によって下方制御、ノックダウン、低減及び／又は阻害され得る。一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系及びガイドＲＮＡを含む、遺伝子発現を下方制御できる核酸を免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を下方制御することができる核酸は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）、ＭＡＤ７ヌクレアーゼ（タイプＶ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。細胞を遺伝子編集する方法は、当該技術分野でよく知られており、本明細書に記載されている。

【0250】

いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、免疫細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを導入して、修飾細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）内の１つ又は複数の内因性免疫遺伝子を破壊することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される１つ又は複数の内因性免疫タンパク質を破壊するために使用される。ある例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、内因性のＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）の１つ又は複数を破壊し、それによってＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）の下方制御がもたらされる。内因性のＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及び／又はＰＤ１の１つ又は複数を破壊するのに使用するのに適したｇＲＮＡは、図２６及び２７に記載されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、免疫細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びガイドＲＮＡを導入して、修飾細胞（例えば、修飾Ｔ細胞）内の１つ又は複数の内因性免疫遺伝子を破壊することを含む。一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、免疫細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びガイドＲＮＡを導入することを含み、ガイドＲＮＡは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子座内の配列と相補的なガイド配列を含む。内因性のＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）の１つ又は複数を破壊するのに適したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を表４に示す。

【0251】

一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系を含む遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系を含む遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、メガヌクレアーゼ遺伝子編集系を含む遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法は、メガＴＡＬＥＮ遺伝子編集系を含む遺伝子発現を下方制御できる核酸を免疫細胞に導入することを含む。一実施形態では、修飾免疫細胞を遺伝子編集する方法は、アンチセンスＲＮＡ、アンチゴマーＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される遺伝子サイレンシング系を含む遺伝子発現を下方制御することができる核酸を免疫細胞に導入することを含む。
Ｃ． 修飾免疫細胞の増殖：

【0252】

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞を生成する方法は、修飾免疫細胞を増殖させて修飾Ｔ細胞の集団を生成することをさらに含む。ＣＡＲ、ＴＣＲ、ドミナントネガティブ受容体及び／又はスイッチ受容体を発現するように免疫細胞を修飾する前又は後のいずれであっても、修飾された細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して活性化され、その数を増やすことができる。例えば、本発明の免疫細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、修飾免疫細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとが付着した表面と接触させることによって増殖させることができる。特に、修飾免疫細胞集団は、抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、又は、カルシウムイオノフォア（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）と組み合わせたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。修飾免疫細胞の表面上の補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の共刺激のために、補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、修飾免疫細胞は、免疫細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）が挙げられ、これらを本発明で使用することができるほか、当技術分野で知られている他の方法や試薬も使用することができる。

【0253】

本明細書に開示された方法による修飾免疫細胞の増殖は、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍又はそれ以上、及び、それらの間の任意の整数又は一部の整数に増加され得る。一実施形態では、修飾免疫細胞は約２０倍から約５０倍の範囲で増殖する。

【0254】

培養後、修飾免疫細胞は、培養装置内の細胞培地中で一定期間インキュベートするか、又は細胞が最適な継代のためにコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）又は高い細胞密度に達するまでインキュベートし、その後、細胞を別の培養装置に移すことができる。前記培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般的に使用される任意の培養装置であり得る。細胞を別の培養装置に移す前に、コンフルエンスのレベルが７０％以上であることが好ましい。より好ましくは、コンフルエンスのレベルは９０％以上である。期間は、インビトロでの細胞の培養に適した任意の時間であり得る。免疫細胞培地は、免疫細胞の培養中にいつでも交換することができる。免疫細胞培地は、約２～３日ごとに交換することが望ましい。次に、免疫細胞を培養装置から採取し、修飾免疫細胞をすぐに使用することも、後で使用するために凍結保存することもできる。一実施形態では、本発明は、増殖した修飾免疫細胞を凍結保存することを含む。凍結保存された免疫細胞は、免疫細胞に核酸を導入する前に解凍される。

【0255】

別の実施形態では、この方法は、免疫細胞を単離し、免疫細胞を増殖させることを含む。別の実施形態では、本発明は、増殖前に免疫細胞を凍結保存することをさらに含む。さらに別の実施形態では、凍結保存された免疫細胞を解凍し、キメラ膜タンパク質をコードするＲＮＡを用いて電気穿孔する。

【0256】

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞を生成する方法は、修飾免疫細胞をエクスビボで増殖させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞のエクスビボ培養及び増殖は、細胞増殖因子の添加を含む。ただし、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ｃ－ｋｉｔリガンド等の他の因子を追加することもできる。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞を増殖させることは、修飾Ｔ細胞を、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＴＧＦベータ、ＩＬ－１０及びｃ－ｋｉｔリガンドからなる群から選択される因子と共に培養することを含む。本明細書に記載の培養ステップ（本明細書に記載の薬剤との接触又は電気穿孔後）は、非常に短く、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３時間等、２４時間未満であってもよい。培養ステップは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれ以上と長くなり得る。

【0257】

培養中の細胞を説明するために様々な用語が使用されている。細胞培養（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、一般的に、生体から採取され、制御された条件下で培養された細胞を指す。一次細胞培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、生物から直接採取され、最初の継代培養の前に行われる細胞、組織、又は臓器の培養である。細胞は、細胞の成長や分裂を促進する条件下で成長培地に置かれると培養中に増殖し、結果として細胞集団が大きくなる。細胞が培養で増殖する場合、細胞増殖率は通常、細胞数が２倍になるまでの時間、つまり倍加時間によって測定される。

【0258】

免疫細胞培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎児血清又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦ－ベータ、及びＴＮＦ－ａ、並びに、当業者に知られている細胞成長用のその他の添加剤、を含む成長及び生存に必要な因子を含む可能性のある適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。前記細胞成長用のその他の添加物には、界面活性剤、プラズマネート及びＮ－アセチルシステインや２－メルカプトエタノール等の還元剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0259】

培地には、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ等があり、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミンが添加されており、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）又は定義された一連のホルモン、及び／又は免疫細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカインが補充されている。ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質は、実験培養にのみ含まれており、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、適切な温度（例えば、３７℃）や雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）等、成長をサポートするために必要な条件下で維持される。

【0260】

免疫細胞を培養するために使用される培地には、免疫細胞を共刺激することができる薬剤が含まれていてもよい。例えば、ＣＤ３を刺激できる薬剤は、ＣＤ３に対する抗体であり、ＣＤ２８を刺激できる薬剤は、ＣＤ２８に対する抗体である。これは、本明細書に開示されたによって実証されているように、本明細書に開示された方法によって単離された細胞は、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍又はそれ以上に増殖することができるためである。一実施形態では、電気穿孔された集団を培養することにより、免疫細胞は約２０倍から約５０倍又はそれ以上の範囲で増殖する。一実施形態では、抗ＣＤ３抗体でコーティングされたＫＴ６４．８６人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（ａＡＰＣ）を介してヒトＴ制御細胞（ｈｕｍａｎ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）が増殖される。免疫細胞を増殖及び活性化する方法は、米国特許第７，７５４，４８２号、第８，７２２，４００号、及び第９，５５５，１０５号に記載されており、その内容は本明細書に全体として組み込まれている。
Ｄ． 免疫細胞のソース：

【0261】

増殖の前に、エクスビボ操作のために対象から免疫細胞の供給源を得る。エクスビボ操作の対象となる細胞の供給源としては、例えば、自己又は異種ドナーの血液、臍帯血、骨髄等も挙げられる。例えば、免疫細胞の供給源は、本発明の修飾免疫細胞で治療される対象、例えば対象の血液、対象の臍帯血、又は対象の骨髄から採取され得る。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。

【0262】

免疫細胞は、血液、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、リンパ又はリンパ器官を含む、いくつかの供給源から得ることができる。免疫細胞とは、免疫系の細胞であり、例えば自然又は適応免疫（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の細胞、例えばリンパ球を含む骨髄系細胞やリンパ系細胞、典型的にはＴ細胞やＮＫ細胞等である。他の例示的な細胞には、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）等の幹細胞が含まれる。いくつかの側面では、細胞はヒト細胞である。治療対象となる対象に関して、細胞は、同種異形及び／又は自己細胞であってもよい。細胞は典型的には、対象から直接単離された細胞及び／又は対象から単離されて凍結された細胞等の一次細胞である。

【0263】

ある実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、又はエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、又は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、単球又は顆粒球、例えば骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球及び／又は好塩基球である。一実施形態では、標的細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞又はｉＰＳ細胞に由来する細胞であり、例えば、対象から生成され、変化するよう操作されるか（例えば、変異を誘導する）又は１つ又は複数の標的遺伝子の発現を操作され、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞又はエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞又は造血幹細胞に分化されるｉＰＳ細胞である。

【0264】

いくつかの実施形態では、細胞には、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、局在及び／又は持続能力（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ）、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器又は区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は、分化の程度によって定義されるもの等、Ｔ細胞集団全体、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞及びそれらのサブ集団等のＴ細胞又はその他の細胞タイプの１つ又は複数のサブセットが含まれる。

【0265】

Ｔ細胞及び／又はＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のサブタイプ及びサブポピュレーション（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞及びそのサブタイプ（例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）又は終末分化エフェクターメモリー（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ）Ｔ細胞等）、腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然及び適応性制御性（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）ヘルパーＴ細胞、アルファー／ベータＴ細胞及びデルタ／ガンマＴ細胞等）がある。ある実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。

【0266】

いくつかの実施形態では、前記方法は、対象から免疫細胞を単離し、それらを調製し、処理し、培養し及び／又は組み換えることを含む。いくつかの実施形態では、組み換え細胞の調製には、１つ又は複数の培養及び／又は調製ステップが含まれる。記載された組み換え用の細胞は、例えば、対象から得られた又は対象に由来する生物学的サンプル等のサンプルから単離され得る。いくつかの実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患又は症状を有するか、細胞療法を必要とするか又は細胞療法が投与される対象である。いくつかの実施形態における対象は、細胞が単離、処理、及び／又は組み換えられる養子細胞療法等の特定の治療介入を必要とするヒトである。したがって、いくつかの実施形態における細胞は、一次細胞、例えば一次ヒト細胞である。前記サンプルには、対象から直接採取された組織、体液、その他のサンプルのほか、分離、遠心分離、遺伝子組み換え（ウイルスベクターによる形質導入等）、洗浄、インキュベーション等の１つ又は複数の処理ステップから得られたサンプルも含まれる。前記生物学的サンプルは、生物学的ソースから直接得られたサンプル又は処理されたサンプルであり得る。前記生物学的サンプルには、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗等の体液、組織及び臓器サンプル（それらから得られた処理済みサンプルを含む）が含まれるが、これらに限定されない。

【0267】

ある態様では、免疫細胞が由来する又は単離されるサンプルは、血液若しくは血液由来のサンプルであるか、あるいは、アフェレーシス若しくは白血球生成物であるか又はそれらに由来する。例示的なサンプルには、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、その他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、又はその他の臓器、及び／又は、それらに由来する細胞が含まれる。前記サンプルには、細胞療法（例えば、養子細胞療法）の文脈では、自己及び同種異形ソースからのサンプルが含まれる。

【0268】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、細胞株、例えばＴ細胞株に由来する。いくつかの実施形態における細胞は、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類及びブタ等の異種起源から得られる。いくつかの実施形態では、前記細胞の単離には、１つ又は複数の準備及び／又は非親和性に基づく細胞分離ステップが含まれる。いくつかの例では、前記細胞は、例えば、不要な成分を除去したり、所望の成分を濃縮したり、特定の試薬に敏感な細胞を溶解又は除去したりするために、１つ又は複数の試薬の存在下で洗浄、遠心分離及び／又はインキュベートされる。いくつかの例では、細胞は、密度、接着特性、サイズ、感度及び／又は特定の成分に対する耐性等の１つ又は複数の特性に基づいて分離される。

【0269】

いくつかの例では、対象の循環血液からの細胞は、例えば、アフェレーシス又は白血球除去によって得られる。前記サンプルは、ある態様では、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球及び／又は血小板を含むリンパ球が含まれ、またある態様では、赤血球及び血小板以外の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から採取された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために適切な緩衝液又は培地に細胞を配置するために洗浄される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。ある場合には、製造元の指示に従ってタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって洗浄ステップが実行される。ある実施形態では、前記細胞は、洗浄後に様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。ある実施形態では、血液細胞サンプルの成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁される。いくつかの実施形態では、前記方法には、赤血球を溶解し、パーコール又はフィコール勾配を通して遠心分離することによって末梢血から白血球を調製する等の密度ベースの細胞分離方法が含まれる。

【0270】

一実施形態では、前記免疫細胞は、個体の循環血液からアフェレーシス又は白血球除去によって得られる。アフェレーシス製品には、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板等のリンパ球が含まれる。アフェレーシスによって回収された細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され、その後の処理工程のために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は洗浄液のような適切な緩衝液又は培地（カルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、すべての二価陽イオンでなくても多くの二価陽イオンを欠く可能性がある）に配置される。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、製造元の指示に従って、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ セルプロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ５）を使用する等、当業者に既知の方法によって達成することができる。洗浄後、前記細胞は、例えば、Ｃａ^２＋を含まない、Ｍｇ^２＋を含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ又は緩衝液の有無にかかわらず他の生理食塩水等のさまざまな生体適合性緩衝液に再懸濁することができる。いくつかの実施形態では、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、前記細胞を培養培地に直接再懸濁することができる。

【0271】

いくつかの実施形態では、前記単離方法には、表面マーカー（例えば、表面タンパク質）、細胞内マーカー又は核酸等の１つ又は複数の特定の分子の細胞内における発現又は存在に基づいて、異なる細胞タイプを分離することが含まれる。いくつかの実施形態では、このようなマーカーに基づく任意の既知の分離方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、前記分離は、親和性又は免疫親和性に基づく分離である。例えば、ある態様における単離には、１つ又は複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現又は発現レベルに基づいて細胞及び細胞集団を分離すること、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーション、続いて一般に洗浄ステップ、及び抗体又は結合パートナーに結合した細胞と抗体又は結合パートナーに結合していない細胞の分離が含まれる。このような分離ステップは、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）及び／又は抗体又は結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）に基づくことができる。いくつかの例では、両方のフラクションがさらに使用するために保持される。ネガティブ選択は、異種集団中の細胞タイプを特異的に同定する抗体が利用できない場合に特に有用であり、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離を行うのが最適である。前記分離によって、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞が１００％濃縮又は除去される必要はない。例えば、マーカーを発現している細胞のような特定のタイプの細胞に対するポジティブ選択又は濃縮は、そのような細胞の数又は割合を増加させることを意味するが、マーカーを発現していない細胞を完全になくなる（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｂｓｅｎｃｅ）必要はない。同様に、マーカーを発現している細胞等、特定のタイプの細胞のネガティブ選択、除去、又は枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、そのような細胞の数又は割合を減少させることを意味するが、そのような細胞をすべて完全に除去する（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｍｏｖａｌ）必要はない。ある例示的な実施形態では、分離工程を複数回実施し、あるステップからのポジティブ又はネガティブに選択されたフラクションは、後続のポジティブ又はネガティブ選択等の別の分離ステップに供する。ある例示的な実施形態では、ネガティブ選択の対象となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体又は結合パートナーと細胞をインキュベートすること等により、単一の分離ステップで複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させる（ｄｅｐｌｅｔｅ）ことができる。同様に、様々な細胞タイプで発現する複数の抗体又は結合パートナーと細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時にポジティブ選択することができる。

【0272】

いくつかの実施形態では、１つ又は複数のタイヤＴ細胞集団（ｔｉｒｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）は、表面マーカー等の１つ又は複数の特定のマーカーに対してポジティブ（マーカー陽性（ｍａｒｋｅｒｉ－））又は高レベル（マーカー高（ｍａｒｋｅｒ^ｈｉｇｈ））に発現する細胞、又は１つ又は複数のマーカーに対してネガティブ（マーカー陰性（ｍａｒｋｅｒ－））又は比較的低レベル（マーカー低（ｍａｒｋｅｒ^ｌｏｗ））に発現する細胞が濃縮されるか、又は枯渇される。例えば、ある特定の態様では、ＣＤ２８陽性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＣＲ７陽性、ＣＤ２７陽性、ＣＤ１２７陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、ＣＤ４５ＲＡ陽性及び／又はＣＤ４５ＲＯ陽性Ｔ細胞等の１つ又は複数の表面マーカーを陽性又は高レベルで発現する細胞等のＴ細胞の特定のサブ集団が、ポジティブ又はネガティブ選択技術によって単離される。いくつかの例では、このようなマーカーは、あるＴ細胞集団（非メモリー細胞等）では存在しないか、比較的低いレベルで発現しているが、他のあるＴ細胞集団（メモリー細胞等）では存在するか、比較的高いレベルで発現しているマーカーである。一実施形態では、前記細胞（例えば、ＣＤ８陽性細胞又はＴ細胞、例えば、ＣＤ３陽性細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ１２７、及び／又はＣＤ６２Ｌがポジティブであるか又は高い表面レベルを発現している細胞が濃縮され（すなわち、ポジティブ選択されている）、及び／又は、ＣＤ４５ＲＡがポジティブであるか又は高い表面レベルを発現している細胞が枯渇している（例えば、ネガティブ選択されいる）。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ２５、ＣＤ２７及び／又はＩＬ７－Ｒａ（ＣＤ１２７）のポジティブ細胞又は高表面レベルを発現する細胞が濃縮されるか、又は枯渇される。ある例示的な実施形態では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯポジティブ（又はＣＤ４５ＲＡネガティブ）及びＣＤ６２Ｌポジティブ陽の細胞について濃縮される。例えば、ＣＤ３陽性、ＣＤ２８陽性Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞エクスパンダー（Ｅｘｐａｎｄｅｒ））を使用して確実に選択できる。

【0273】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｂ細胞、単球又はＣＤ１４等の他の白血球等の非Ｔ細胞上に発現するマーカーのネガティブ選択によってＰＢＭＣサンプルから分離される。ある態様では、ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性選択ステップを使用して、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞を分離する。このようなＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性集団は、１つ又は複数のナイーブ、メモリー及び／又はエフェクターＴ細胞サブ集団で比較的高い程度に発現されているか又は発現しているマーカーに対するポジティブ選択又はネガティブ選択によって、サブ集団にさらに分類できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、それぞれのサブ集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ選択又はネガティブ選択等によって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及び／又はセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮されるか、又は枯渇される。いくつかの実施形態では、投与後の長期生存、増殖及び／又は移植を改善する等の有効性を高めるために、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮が行われ、これは特定の局面ではそのようなサブ集団において特に強力である。

【0274】

いくつかの実施形態では、ＴＣＭが豊富なＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞を組み合わせることで、有効性がさらに増強される。いくつかの実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８陽性末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ陽性サブセットとＣＤ６２Ｌ陰性サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体や抗ＣＤ６２Ｌ抗体等を使用して、ＣＤ６２Ｌ陰性ＣＤ８陽性及び／又はＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ８陽性画分を濃縮したり枯渇したりすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞集団は、セントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞について濃縮されている。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤＳ及び／又はＣＤ１２７のポジティブ選択又は高い表面発現に基づいており、ある態様では、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現又は高度に発現する細胞のネガティブ選択に基づいている。ある態様では、ＴＣＭ細胞が濃縮されたＣＤ８陽性集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞のポジティブ選択又は濃縮によって実行される。一態様では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞のネガティブ画分から開始して行われ、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択と、ＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に供される。ある態様では、このような選択は、同時に実行され、他の態様では、何れかの順序で順次実行される。ある特定の方法では、ＣＤ８陽性細胞集団又はサブ集団を調製する際に使用されるのと同じＣＤ４発現ベースの選択ステップが、ＣＤ４陽性細胞集団又はサブ集団の生成にも使用され、ＣＤ４ベースの分離からのポジティブ及びネガティブ画分の両方が保持され、方法の後続のステップで、必要に応じて１つ又は複数のさらなるポジティブ又はネガティブ選択ステップに続いて使用される。

【0275】

ＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を持つ細胞集団を識別して、ナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクター細胞に分類される。ＣＤ４陽性リンパ球は標準的な方法で得ることができる。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４陽性Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ陰性、ＣＤ４５ＲＡ陽性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ４陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯである。一例では、ネガティブ選択によってＣＤ４陽性細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤＳに対する抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体又は結合パートナーは、磁性ビーズ又は常磁性ビーズ等の固体支持体又はマトリックスに結合され、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための細胞の分離を可能にする。

【0276】

いくつかの実施形態では、細胞は遺伝子組み換えの前又は遺伝子組み換えに関連してインキュベート及び／又は培養される。インキュベーションのステップには、培養、栽培、刺激、活性化、及び／又は増殖が含まれる。いくつかの実施形態では、前記組成物又は細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件には、集団内の細胞の増殖、拡大、活性化及び／又は生存を誘導し、抗原曝露を模倣し及び／又は組換え抗原受容体の導入等の遺伝子組み換えのために細胞を準備するように設計された条件が含まれる。前記条件には、特定の媒体、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、因子（栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン等）及び／又は刺激因子（サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体等）及び細胞を活性化するように設計されたその他の因子のうちの１つ又は複数が含まれる。いくつかの実施形態では、前記刺激条件又は刺激因子には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つ又は複数の因子、例えばリガンドが含まれる。ある態様では、前記薬剤は、Ｔ細胞内のＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードをオン又は開始する。このような薬剤には、例えばビーズ等の固体支持体に結合した、ＴＣＲ成分及び／又は共刺激受容体に特異的な抗体、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び／又は１つ又は複数のサイトカイン等の抗体が含まれる。必要に応じて、増殖方法は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を培養培地に添加するステップをさらに含んでもよい（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）。いくつかの実施形態では、前記刺激剤としては、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５が含まれ、例えば、ＩＬ－２濃度は少なくとも約１０ユニット／ｍｌである。

【0277】

別の実施形態では、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配による遠心分離によって赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、Ｔ細胞を末梢血から単離する。あるいは、Ｔ細胞を臍帯から単離することもできる。いずれにしても、Ｔ細胞の特定のサブ集団は、ポジティブ又はネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。

【0278】

このように単離された臍帯血単核細胞は、ＣＤ３４、ＣＤＳ、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６を含むがこれらに限定されないある抗原を発現する細胞を枯渇することができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水等の抗体を含む生物学的サンプル、物理的支持体に結合した抗体、及び細胞に結合した抗体を使用して達成することができる。

【0279】

ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーを標的とする抗体の組み合わせを使用して達成することができる。例示的な方法としては、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択がある。例えば、ネガティブ選択によって、ＣＤ４陽性細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには、通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤＳに対する抗体が含まれる。

【0280】

ポジティブ又はネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズ等の粒子）の濃度を変えることができる。ある実施形態では、細胞とビーズの接触を最大限にするために、ビーズと細胞が混合される体積を大幅に減らす（すなわち、細胞の濃度を高める）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億個／ｍｌを超える細胞が使用される。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個又は１億個／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万個／ｍｌ又は１億５０００万個／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、細胞増殖が増加する。

【0281】

Ｔ細胞は洗浄工程後に凍結することもでき、その場合には単球除去工程は不要である。理論に縛られることは望まないが、凍結とそれに続く解凍のステップにより、細胞集団内の顆粒球とある程度の単球が除去され、より均一な製品が提供される。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメータは当該技術分野で知られており、この文脈で有用であるが、限定されない例として、１つの方法としては、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又はその他の適切な細胞凍結媒体を使用することが挙げられる。その後、細胞は毎分１℃の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存される。－２０℃又は液体窒素で直ちに制御されていない凍結だけでなく、他の制御された凍結方法も使用できる。

【0282】

一実施形態では、Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたＴ細胞集団及びＴ細胞株等の細胞内に含まれる。別の実施形態では、末梢血単核細胞が、Ｔ細胞の集団を構成する。さらに別の実施形態では、精製されたＴ細胞が、Ｔ細胞集団を含む。

【0283】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、血液サンプル、全血サンプル、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル又はアフェレーシスサンプルから得られる。いくつかの例では、対象の循環血液からの細胞は、例えば、アフェレーシス又は白血球除去によって得られる。一実施形態では、免疫細胞は、個体の循環血液から、アフェレーシス又は白血球除去によって得られる。アフェレーシス製品には通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板等のリンパ球が含まれる。いくつかの実施形態では、アフェレーシスサンプルは、凍結保存されたサンプルである。いくつかの実施形態では、アフェレーシスサンプルは新鮮なサンプルである。いくつかの実施形態では、免疫細胞はヒト対象から得られる。
Ｖ１１． 組成物：

【0284】

一態様において、本発明は、本明細書に記載された修飾免疫細胞又は本明細書に記載された方法の何れかから得られた修飾免疫細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の修飾非刺激Ｔ細胞又は修飾刺激Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、医薬組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、医薬組成物を含み、さらに１つ又は複数の医薬的又は生理学的に許容される担体、希釈剤、補助剤又は賦形剤を含む。このような組成物には、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の炭水化物、タンパク質、グリシン等のポリペプチド又はアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）及び防腐剤が含まれ得る。本発明の組成物は、好ましくは、非経口投与（例えば、静脈内投与）用に製剤化される。いくつかの実施形態では、前記修飾Ｔ細胞を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することができる。
ＶＩＩＩ． 治療方法：

【0285】

一態様において、本開示は、本発明の修飾免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、養子細胞移植療法のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、対象における疾患又は症状を治療する方法であり、その方法は、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞の集団、例えば、本明細書に記載の修飾非刺激Ｔ細胞の集団又は修飾刺激Ｔ細胞の集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾免疫細胞を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における疾患又は症状を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、対象における疾患又は症状を治療する方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ及びインバリアント鎖（Ｉｉ鎖）からなる群から選択される内因性免疫タンパク質をそれぞれコードする１つ又は複数の遺伝子座位における挿入及び／又は欠失を含む修飾免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、抗原結合ポリペプチド、細胞表面受容体リガンド又は腫瘍抗原をコードする外因性核酸とを投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記挿入及び／又は欠失は、１つ又は複数の内因性免疫遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる。

【0286】

いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、ドミナントネガティブ受容体、スイッチ受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９又はそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの例では、前記疾患は、癌であり、いくつかの例では、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、前記修飾非刺激Ｔ細胞又は修飾刺激Ｔ細胞は、それぞれ、癌によって発現される抗原に特異的な抗原結合ドメインを発現する。いくつかの実施形態では、前記方法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、遺伝子発現を下方制御することができる核酸、ＴＣＲ、ＫＩＲ、ＣＡＲ、ドミナントネガティブ受容体及び／又はスイッチ受容体を含む修飾免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記修飾免疫細胞は、普遍的なＴＣＲリダイレクト（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞）である。

【0287】

いくつかの実施形態では、前記癌は、固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍には、膀胱癌、骨癌、脳癌（例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫）、乳癌、大腸癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌又は胃癌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、前記固形腫瘍は、脳腫瘍（神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫等）、乳がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、膵臓がん又は前立腺がんであり得る。いくつかの例では、前記固形腫瘍は、転移性癌であり得る。いくつかの例では、前記固形腫瘍は、再発性又は難治性の固形腫瘍である。

【0288】

いくつかの実施形態では、前記癌は、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍又はＴ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病又は骨髄腫である。いくつかの実施形態では、前記血液悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。例示的な血液悪性腫瘍には、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの例では、血液悪性腫瘍は転移性の血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、血液悪性腫瘍は再発性又は難治性の血液悪性腫瘍である。

【0289】

いくつかの実施形態では、前記疾患を治療する方法は、対象に追加の治療剤又は追加の療法を投与することをさらに含む。いくつかの例では、本明細書に開示の追加の治療薬には、化学療法薬、免疫療法薬、標的療法、放射線療法又はそれらの組み合わせが含まれる。例示的な追加の治療薬には、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサラプラチン、テモゾロミド又はチオテパ等のアルキル化剤、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート又はペメトレキセド等の代謝拮抗薬、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン等のアントラサイクリン、トポテカン又はイリノテカン（ＣＰＴ－１１）等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド又はミトキサントロン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビン等の有糸分裂阻害剤、又は、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン又はデキサメタゾン等のコルチコステロイド等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、追加の治療薬は、第一選択療法（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）を含む。本明細書において、「第一選択療法（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、癌患者に対する一次治療（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を意味する。いくつかの例では、前記癌は、原発性癌である。他の場合には、前記癌は、転移性癌又は再発性癌である。いくつかの例では、第一選択療法として化学療法が行われる。その他の場合には、第一選択治療は、放射線療法となる。熟練した技術者であれば、異なる種類の癌には異なる第一選択治療が適用可能であることを容易に理解するであろう。いくつかの例では、前記追加の治療薬には、免疫チェックポイント阻害剤が含まれる。いくつかの例では、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、抗体又はそのフラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体）；ＲＮＡｉ分子；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、ＫＩＲ、ＣＤ１３７、ＰＳ、ＴＦＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２又はＳＬＡＭに対する小分子、等の阻害剤を含む。例示的なチェックポイント阻害剤には、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、トレメリムマブ又はイピリムマブが含まれる。いくつかの実施形態では、前記追加の治療は、放射線療法を含む。

【0290】

いくつかの実施形態では、追加の治療は、手術を含む。
ＩＸ． キット及び製造品：

【0291】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキット又は製造品（ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）には、修飾Ｔ細胞（例えば、修飾非刺激Ｔ細胞又は修飾刺激Ｔ細胞）の１つ又は複数の集団が含まれる。いくつかの例では、本明細書に記載のキット又は製造品には、バイアル、チューブ等の１つ又は複数の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）を収容するために区画化されたキャリア、パッケージ又は容器がさらに含まれ、各容器は、本明細書に記載の方法で使用される個別の要素の１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器及び試験管等が挙げられる。一実施形態では、前記容器は、ガラス及びプラスチック等のさまざまな材料から形成される。

【0292】

本明細書で提供される製造品にはパッケージ材料が含まれる。医薬品パッケージ材料の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル及び選択された処方と意図されたモードでの投与及び治療方法に適したあらゆるパッケージ材料が含まれるが、これらに限定されない。

【0293】

キットには通常、内容物及び／又は使用説明書を記載したラベル、及び使用説明書を記載したパッケージ挿入物が含まれる。説明書一式も通常含まれる。
ＩＸ． 定義：

【0294】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法及び材料と同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、本明細書では適切な方法及び材料について説明する。

【0295】

また、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定するものではないことも理解されるべきである。

【0296】

本開示の実施（ｐｒａｃｔｉｃｅ）では、特に断らない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来技術を用いるが、これらは当業者の技術範囲内である。例えば、
Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、
ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、
ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ； ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ（Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．（２０１４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、
Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、
Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、
Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、
Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ ｅｄ．（２００５）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、
Ｂｕｚｄｉｎ ａｎｄ Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｄ．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８６））、
Ｇｒａｎｄｉ ｅｄ．（２００７） ｉｎ ｖｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、
Ｇｕｉｓａｎ ｅｄ．（２００６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ、
Ｐｅｒｂａｌ（１９８８）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、
Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ，（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、
Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）、
Ｌｕｎｄｂｌａｄ ａｎｄ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｄｓ．（２０１０）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、及び、
Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、が挙げられる。

【0297】

本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の定めがない限り、複数の指示対象も含むものとする。例えば、「細胞」という用語には、複数の細胞（それらの混合物を含む）が含まれ、１つの細胞又は１つ又は複数の細胞を意味する。

【0298】

本明細書で使用される場合、用語「約」は、値を決定するために使用されているデバイス又は方法の標準偏差の誤差が値に含まれることを示すために使用される。温度、時間、量、濃度等の数値指定の前に使用される「約」という用語は、範囲を含め、（＋）又は（－）（±）２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％又は１％変化する可能性がある近似値を示す。好ましくは、規定値から±５％、より好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％であり、このような変動は開示された方法を実施するのに適切である。

【0299】

本明細書に使用される場合、用語「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分な刺激を受けたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生や検出可能なエフェクター機能とも関連している可能性がある。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ細胞分裂中のＴ細胞を指す。

【0300】

「同種異形（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」とは、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する物質を指す。２つ以上の個体が、１つ又は複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系物質は、抗原的に相互作用するほど遺伝的に異なっている可能性がある。

【0301】

本明細書で使用される場合、用語「同種異形Ｔ細胞標的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔ）」又は「同種異形Ｔ細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ」」は、宿主対移植片応答を媒介又は寄与する、移植片対宿主応答を媒介又は寄与する又は免疫抑制剤の標的であるタンパク質、並びに前記分子をコードする遺伝子及びそれに関連する調節要素（例えば、プロモーター）を指す。同種異形Ｔ細胞標的という用語は、標的配列又はｇＲＮＡ分子に関連して使用される場合、同種異形Ｔ細胞標的タンパク質をコードする遺伝子（及びそれに関連する調節要素）を指すことが理解されるであろう。理論に拘束されるものではないが、１つ又は複数の同種異形Ｔ細胞標的の阻害又は除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（例えば、本明細書に開示された方法及び組成物による）は、同種異形細胞の有効性、生存、機能及び／又は生存率を改善し得る。いくつかの実施形態では、望ましくない免疫原性（宿主対移植片反応又は移植片対宿主反応等）を低減又は排除することによって、同種異形細胞の有効性、生存、機能及び／又は生存率が改善される。いくつかの実施形態では、移植片対宿主応答又は宿主対移植片応答を媒介又は寄与するタンパク質は、Ｔ細胞受容体複合体の１つ又は複数の成分である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体の成分は、Ｔ細胞受容体アルファー、つまりＴＣＲアルファーの定常ドメイン（ＴＲＡＣ；ＴＣＲα）である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体の成分は、Ｔ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ；ＴＣＲ－β）、例えばＴＣＲベータの定常ドメイン１（ＴＲＢＣ１）又は定常ドメイン２（ＴＲＢＣ２）である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体の成分は、Ｔ細胞受容体デルタ鎖（ＣＤ３δ）、Ｔ細胞受容体イプシロン鎖（ＣＤ３ε）、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖（ＣＤ３ζ；ＣＤ２４７）及び／又はＴ細胞受容体ガンマ鎖（ＣＤ３γ）である。いくつかの実施形態では、同種異形Ｔ細胞標的によってコードされるタンパク質がＴＣＲシグナル伝達複合体の成分である場合、同種異形Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ又はＣＤ３ζ（ＣＤ２４７）、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0302】

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然ソース又は組み換えソースから得られた完全な免疫グロブリンである場合があり、また完全な免疫グロブリン（ｉｎｔａｃｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）の免疫反応性部分である場合もある。抗体は通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２並びに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、抗体とは、関心のある対象の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対して顕著な既知の特異的免疫反応活性を有するアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）（例えば、完全な抗体分子、免疫接着分子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ）又はそれらのバリアント）を指す。抗体と免疫グロブリンは軽鎖と重鎖を含み、それらの間には鎖間共有結合がある場合とない場合がある。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は比較的よく理解されている。

【0303】

用語「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部を指し、完全な抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体等が含まれるが、これらに限定されない。

【0304】

本明細書で使用される場合、用語「抗体重鎖（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、全ての抗体分子に天然に存在する立体配座で存在する２種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。

【0305】

本明細書において、「抗体軽鎖（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」とは、全ての抗体分子に天然に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。α及びβ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅｓ）を指す。

【0306】

本明細書で使用される場合、用語「合成抗体」は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体、例えば本明細書に記載されるバクテリオファージによって発現される抗体を意味する。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、抗体タンパク質又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現するＤＮＡ分子を意味するものとも解釈されるべきであり、当該ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能かつ周知の合成ＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られる。

【0307】

（例えば、キメラ抗原受容体）の抗原結合ドメインには、抗体バリアントが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「抗体バリアント」には、少なくとも２つの重鎖部分を含むが２つの完全な重鎖を含まない抗体（ドメイン削除抗体（ｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）又はミニボディ等）、２つ以上の異なる抗原又は単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された抗体の多重特異性形態（二重特異性、三重特異性等）、ｓｃＦｖ分子に結合された重鎖分子等、自然には存在しないように変更された合成及び組み換えられた抗体の形態が含まれる。さらに、「抗体バリアント」という用語には、抗体の多価形態（例えば、三価、四価等、同じ抗原の３つ、４つ又はそれ以上のコピーに結合する抗体）が含まれる。

【0308】

本明細書で使用される場合、用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫反応には、抗体産生か、特定の免疫担当細胞（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）の活性化あるいはその両方が関与する。熟練した技術者であれば、事実上全てのタンパク質又はペプチドを含むあらゆる高分子が抗原として機能できることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来であり得る。当業者であれば、免疫反応を誘発する（ｅｌｉｃｉｔｓ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、本明細書で使用される用語の意味で「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコード化される必要はないことを理解するであろう。本発明には、１つ以上の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用が含まれるが、これに限定されるものではなく、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコード化される必要が全くないことを理解するであろう。抗原は合成して生成することも、生物学的サンプルから抽出することもできることは明らかである。このような生物学的サンプルには、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞又は生物学的液体が含まれるが、これらに限定されない。

【0309】

本明細書で使用される場合、用語「抗腫瘍効果（ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）」は、腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長又は癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果を指す。いくつかの実施形態では、「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体がそもそも腫瘍の発生を予防する能力によっても発現され得る。

【0310】

本明細書で使用される場合、用語「自己抗原（ａｕｔｏ－ａｎｔｉｇｅｎ）」は、本発明によれば、免疫系によって異物として認識される任意の自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）を意味する。いくつかの実施形態では、自己抗原は、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。

【0311】

本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」という用語は、自己免疫反応に起因する疾患として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例には、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、癌、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎等が含まれるが、これらに限定されない。

【0312】

本明細書で使用される場合、用語「自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」は、後にその材料が再導入され（ｒｅ－ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）得る同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。

【0313】

本明細書で使用される場合、用語「癌」は、異常細胞の急速かつ制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。癌細胞は局所的に広がることもあれば、血流やリンパ系を通じて体の他の部位に広がることもあり得る。各種癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、黒色腫、滑膜肉腫、進行性ＴｎＭｕｃ１陽性固形腫瘍、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍等が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、前記癌は、甲状腺髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。ある実施形態では、前記癌は、前立腺癌である。ある実施形態では、癌は、中皮腫又はメソテリン発現癌（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態では、前記癌は、転移性去勢抵抗性前立腺癌である。本明細書では、「癌」及び「腫瘍」という用語は互換的に使用され、両方の用語は、固形腫瘍及び液性腫瘍、拡散性腫瘍又は循環性腫瘍を包含する。いくつかの実施形態では、前記癌又は腫瘍には、前癌状態（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ）、並びに悪性の癌及び腫瘍が含まれる。

【0314】

本明細書で使用される場合、「癌関連抗原」又は「腫瘍抗原」という用語は、互換的に、癌細胞の表面に全体又はフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現し、癌細胞への薬理学的薬剤の優先的標的化に有用な分子（典型的にはタンパク質、炭水化物又は脂質）を互換的に指す。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と癌細胞の両方によって発現されるマーカー（例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９等の系統マーカー（ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒ））である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現される細胞表面分子であり、例えば、正常細胞と比較して１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍又はそれ以上の過剰発現である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞内で不適切に合成される細胞表面分子であり、例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して、欠失、付加又は変異を含む分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞の細胞表面のみに、全体又はフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現され、正常細胞の表面では合成又は発現されない。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲには、ＭＨＣ提示ペプチド（ＭＨＣ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント）を含むＣＡＲが含まれる。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケット（ｐｏｃｋｅｔｓ）を満たし、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての核細胞によって恒常的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）に発現される。前記癌においては、ウイルス特異的及び／又は腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法における細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ａ１又はＨＬＡ－Ａ２のコンテキストでウイルス抗原又は腫瘍抗原に由来するペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が記載されている。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリ等のライブラリをスクリーニングすることで特定できる。

【0315】

本明細書で使用される場合、用語「癌支持抗原（ｃａｎｃｅｒ－ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）」又は「腫瘍支持抗原（ｔｕｍｏｒ－ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、それ自体は癌性ではないが、癌細胞の成長又は生存を促進することによって癌細胞を支持する（例えば、免疫細胞に対する抵抗性）分子（典型的にはタンパク質、炭水化物又は脂質）を互換的に指す。このタイプの例示的な細胞には、間質細胞及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が含まれる。腫瘍支持抗原自体は、癌細胞を支持する細胞上に存在している限り、腫瘍細胞を支持する役割を果たす必要はない。

【0316】

本明細書で使用される場合、用語「Ｃａｓ」、「Ｃａｓ分子（Ｃａｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、又は「Ｃａｓ分子（Ｃａｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ＤＮＡ切断を担う細菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）由来の酵素を指す。Ｃａｓには、野生型タンパク質だけでなく、その機能的及び非機能的なバリアントも含まれる。

【0317】

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」又は「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞又はその前駆細胞上で発現され、抗原に特異的に結合するように組み換えられた人工Ｔ細胞受容体を指す。ＣＡＲは、養子細胞移植による養子細胞療法に使用され得る。いくつかの実施形態では、養子細胞移植（又は治療）は、患者からＴ細胞を除去し、特定の抗原に特異的な受容体を発現するようにＴ細胞を修飾することを含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、選択された標的、例えば、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、葉酸受容体アルファー、葉酸受容体ベータ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴｎＭＵＣ１、ＧＤＮＦファミリー受容体アルファー４（ＧＦＲａ４）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はインターロイキン１３受容体サブユニットアルファー２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）に対して特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインも含み得る。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合された、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）由来のモノクローナル抗体の融合体を含む。ＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞の特異性をリダイレクトすることによって癌を標的とすることができる。

【0318】

本明細書で使用される場合、用語「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、核酸分子の骨格等の共有結合の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むがこれに限定されない、さまざまな方法によって開始できる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断イベントの結果として発生し得る。ＤＮＡ切断により、平滑末端又は交互末端が生成される。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、切断された二本鎖ＤＮＡを標的とするために使用され得る。

【0319】

本明細書で使用される場合、核酸に関連して使用される「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、塩基の対、すなわち、ＡとＴ又はＵ及びＧとＣの対を指す。相補的という用語は、参照配列全体にわたってＡとＴ又はＵの対及びＧとＣの対を形成する、完全に相補的な核酸分子、並びに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。

【0320】

本明細書で使用される場合、用語「保存的配列修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に重大な影響を及ぼさない、又は結合特性を変化させないアミノ酸修飾を指すものとする。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、追加及び削除が含まれる。本発明の抗体には、部位特異的変異誘発やＰＣＲ媒介変異誘発等の当技術分野で知られている標準的な技術によって修飾を導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジン等）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸等）、非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン等）、非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン等）、ベータ分岐側鎖（トレオニン、バリン、イソロイシン等）、芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等）を持つアミノ酸が含まれる。したがって、抗体のＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載された機能アッセイを使用して抗原に結合する能力についてテストすることができる。

【0321】

本明細書で使用される場合、用語「共刺激リガンド（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇａｎｄ）」には、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上の分子が含まれ、Ｔ細胞上の同族共刺激分子（ｃｏｇｎａｔｅ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドをロードしたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。本明細書で使用する場合、「共刺激リガンド」という用語には、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上の分子が含まれる、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上の分子で、Ｔ細胞上の同族共刺激性分子と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドを負荷した（ｌｏａｄ）ＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドには、ＣＤ２、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体及びＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれるが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、特に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３等のＴ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを包含するが、これらに限定されない。

【0322】

本明細書において「共刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答（増殖等）を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（ｃｏｇｎａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）を指す。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子であり、効率的な免疫反応に寄与する。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に由来する細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、共刺激分子には、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファー、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファー、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが含まれる。

【0323】

本明細書で使用される場合、用語「共刺激シグナル（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌ）と組み合わされてＴ細胞の増殖及び／又は主要分子（ｋｅｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の上方制御又は下方制御につながるシグナルを指す。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）及び活性化ＮＫ細胞受容体等のタンパク質ファミリーで表すことができる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等が挙げられる。

【0324】

本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化された規則的に間隔を置いた短い回文反復システムを指す。「ＣＲＩＳＰＲ系」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」又は「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、塩基配列の短い繰り返しを含むＤＮＡ遺伝子座を指す。各繰り返しの後には、以前のウイルスへの曝露からのスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。細菌と古細菌は、短いＲＮＡを使用して外来核酸の分解を誘導するＣＲＩＳＰＲ－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系と呼ばれる適応免疫防御を進化させてきた。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を介して侵入する外来ＤＮＡに対する獲得免疫を提供する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、「スペーサー」と呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に転写及び処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断とサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を誘導する。最近の研究では、Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列と、ｃｒＲＮＡ結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が必要であることが示されている。

【0325】

いくつかの実施形態では、「ＣＲＩＳＰＲ系」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」、又は「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子とｇＲＮＡ分子とを含む分子のセットを指し、これらは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子によって標的配列の核酸の修飾を誘導し、それを実行するのに必要かつ十分である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）タンパク質を含む。Ｃａｓ又は修飾Ｃａｓ分子を含むこのような系は、本明細書では「Ｃａｓ系」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ分子が複合化されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が形成され得る。

【0326】

Ｃａｓ９に目的の配列を切断するように指示するために、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターから、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合転写産物（以下、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ぶ）を設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳを介したゲノム編集と制御は、基礎科学、細胞工学及び治療に対する変革の可能性を強調した。

【0327】

本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡ分子に関連して使用される用語「ｃｒＲＮＡ」は、標的ドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用して旗竿領域を形成する領域とを含むｇＲＮＡ分子の一部である。

【0328】

本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲｉ」は、転写レベル等での配列特異的な遺伝子抑制又は遺伝子発現の阻害のためのＣＲＩＳＰＲシステムを指す。

【0329】

本明細書において、「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、第１の分子と第２の分子との関係を指す。これは、第１分子と第２分子間の構造的類似性を定義するものであり、第２分子から派生した第１分子に対するプロセス又はソースの制限を暗示したり含んだりするものではない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するのに十分なＣＤ３ゼータ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生成する特定のプロセスに対する制限を暗示したり含んだりするものではない。細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から始めて、不要な配列を削除したり、突然変異を課したりして、細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことを意味するものではない。

【0330】

本明細書で使用される場合、用語「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合には動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態を指す。対照的に、動物における「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、動物が恒常性を維持できる健康状態を指すが、その動物の健康状態は障害がない場合よりも好ましくない。治療せずに放置しても、障害によって動物の健康状態が必ずしもさらに悪化するわけではない。

【0331】

本明細書において、「腫瘍抗原の発現に関連する疾患」には、限定はされないが、腫瘍抗原の発現に関連する疾患又は腫瘍抗原を発現する細胞に関連する状態が含まれるが、これらに限定されるものではなく、癌又は悪性腫瘍等の増殖性疾患、又は、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病等の前癌状態、又は、腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非癌関連適応症（ｎｏｎｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）が含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原の発現に関連する癌は、血液癌である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原の発現に関連する癌は、固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）である。腫瘍抗原の発現に関連するさらなる疾患には、非定型及び／又は非典型的な癌、悪性腫瘍、前癌状態、又は腫瘍抗原の発現に関連する増殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の適応症には、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（アレルギー及び喘息）、移植等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又は任意の時点で発現する。いくつかの実施形態では、前記腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は変異体（ｍｕｔａｎｔ））を産生し、前記腫瘍抗原タンパク質は正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。いくつかの実施形態では、前記腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生しなかった。

【0332】

本明細書で使用される場合、用語「下方制御（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」は、１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現の減少又は排除を指す。

【0333】

本明細書で使用される場合、用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、ポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ等）内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指し、定義されたヌクレオチド配列（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ等）又は定義されたアミノ酸配列及びそれらから生じる生物学的特性の何れかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳によって細胞又は他の生物系内でタンパク質が生成される場合に、タンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表で提供される）と非コード鎖（遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される）の両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると呼ぶことができる。別段の定めがない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンでイントロンを含む可能性がある限り、イントロンを含むこともある。

【0334】

本明細書において互換的に使用される「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、医薬品、又は組成物の、それを必要とする対象において所望の生理学的、治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。このような結果には、哺乳動物に投与されたときに、本発明の組成物が存在しない場合に検出される免疫応答と比較して、検出可能なレベルの免疫応答を引き起こす量が含まれるが、これに限定されない。免疫反応は、当技術分野で認められたさまざまな方法によって容易に評価できる。当業者は、本明細書において投与される組成物の量は、処置される疾患又は病状、処置される哺乳動物の年齢及び健康状態及び身体状態、疾患の重症度、投与される特定の化合物等のような多くの因子に基づいて変化し、容易に決定され得ることを理解するであろう。前記有効量は、処置される対象の健康及び身体状態、処置される対象の分類群、組成物の処方、被験体の病状の評価、及び他の関連因子に応じて、対象間で変化し得る。

【0335】

本明細書で使用される場合、用語「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は、生物、細胞、組織又は系由来、又は、生物、細胞、組織又は系の内部で生成される物質を指す。

【0336】

本明細書で使用される場合、用語「拡大（ｅｘｐａｎｄ）」は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の数の増加のように、数が増加することを意味する。いくつかの実施形態では、エクスビボで増殖される免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の数は、培養物中に元々存在していた数に比べて増加する。別の実施形態では、エクスビボで増殖される免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、培養物中の他の細胞タイプと比較して数が増加する。

【0337】

本明細書で使用される場合、用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。

【0338】

本明細書で使用される場合、用語「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」は、生物、細胞、組織又は系の外部から導入されるか、又は、外部で生成される任意の物質を指す。

【0339】

本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含み、発現のためのその他の要素は宿主細胞又はインビトロ発現系によって供給される。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれるもの）及びウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等、当該技術分野で既知のものが全て含まれる。

【0340】

本明細書で使用される場合、用語「エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）」は、生体（例えば、ヒト）から取り出され、生体外（例えば、培養皿、試験管又はバイオリアクター内）で増殖された細胞を指す。

【0341】

本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡ分子に関連して使用される用語「旗竿（ｆｌａｇｐｏｌｅ）」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒが互いに結合又はハイブリダイズするｇＲＮＡの部分を指す。

【0342】

本明細書で使用する場合、「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」又は「ｇＲＮＡ」という用語は互換的に使用され、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子（典型的にはｇＲＮＡ分子との複合体）の標的配列への特異的な誘導を促進する核酸分子のセットを指す。いくつかの実施形態では、前記誘導は、ｇＲＮＡの一部とＤＮＡとのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡ標的ドメインを介して）及びｇＲＮＡ分子の一部とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又はその他のエフェクター分子との結合（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）によって達成される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、単一の連続したポリヌクレオチド分子からなり、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」等と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数（通常は２つ）のポリヌクレオチド分子からなり、これらのポリヌクレオチド分子自体は、通常はハイブリダイゼーションを介して結合することができ、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」等と呼ばれる。ｇＲＮＡ分子については以下で詳しく説明するが、一般的には、標的ドメインとｔｒａｃｒが含まれる。いくつかの実施形態では、前記標的ドメイン及びｔｒａｃｒは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。他の実施形態では、前記標的ドメイン及びｔｒａｃｒは、別々のポリヌクレオチド上に配置される。

【0343】

本明細書で使用される場合、用語「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、２つのポリマー分子間（例えば、２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子間）又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じモノーマーサブユニットによって占有されている場合、それらはその位置で相同である。例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにアデニンの位置がある場合、２つのＤＮＡ分子は相同である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同位置の数に直接依存する。例えば、２つの配列の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーの５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同である。９０％の位置（例えば、１０個中９個）が一致又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。

【0344】

本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト形態を指し、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体は、ほとんどの場合、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、望ましい特異性、親和性及び能力を持つマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に置き換えられている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体にも、インポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含む場合がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するために行われる。一般に、前記ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域になる。前記ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。

【0345】

本明細書で使用される場合、用語「完全ヒト（Ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ）」は、分子全体がヒト由来であるか又は抗体のヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる抗体等の免疫グロブリンを指す。

【0346】

本明細書で使用される場合、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、２つのポリマー分子間、特に２つのアミノ酸分子間、例えば２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を持つ場合、それらはその位置で同一である。例えば、２つのポリペプチド分子のそれぞれの位置がアルギニンで占められている場合、２つのポリペプチドは同一である。２つのアミノ酸配列がアラインメント内の同じ位置に同じ残基を持つ同一性又は程度は、多くの場合、パーセンテージで表される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、一致する位置又は同一の位置の数に直接依存する。例えば、２つの配列の位置の半分（例えば、長さ１０アミノ酸のポリマー内の５つの位置）が同一である場合、２つの配列は５０％同一である。９０％の位置（例えば、１０個中９個）が一致又は同一である場合、２つのアミノ酸配列は９０％同一である。

【0347】

本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」は、抗体として機能するタンパク質のクラスを定義する。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）又は抗原受容体と呼ばれることもある。このクラスのタンパク質には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つのメンバーが含まれる。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、呼吸器や泌尿生殖器の粘液分泌物等の体分泌物に存在する主要な抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象における一次免疫反応で産生される主要な免疫グロブリンである。凝集、補体結合、その他の抗体反応において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌やウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、抗体としての機能は知られていないが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンにさらされると肥満細胞と好塩基球からメディエーターが放出され、即時型過敏症を引き起こす免疫グロブリンである。

【0348】

本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」は、リンパ球が抗原分子を異物として識別し、抗体の形成を誘導し、及び／又はリンパ球を活性化して抗原を除去するときに生じる、抗原に対する細胞応答として定義される。

【0349】

本明細書で使用される場合、用語「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞（例えば、アルファー／イータＴ細胞及びガンマ／デルタＴ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞等が挙げられる。

【0350】

本明細書で使用される場合、用語「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、標的細胞に対する免疫攻撃を増強又は促進する機能又は応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の殺傷又は成長若しくは増殖の阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激と共刺激は免疫エフェクター機能又は応答の例である。

【0351】

本明細書で使用される場合、用語「阻害分子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、活性化されると、細胞の生存、活性化、増殖及び／又は機能の阻害を引き起こすか、又は阻害に寄与する分子、並びに前記分子をコードする遺伝子及びそれに関連する調節要素（例えば、プロモーター）を指す。いくつかの実施形態では、阻害分子は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上に発現される分子である。阻害分子の非限定的な例としては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＴＧＦβＩＩＲ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦベータが挙げられる。阻害分子という用語は、標的配列又はｇＲＮＡ分子に関連して使用される場合、阻害分子タンパク質をコードする遺伝子（及びそれに関連する調節要素）を指すことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、阻害分子をコードする遺伝子は、ＢＴＬＡ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＣＴＬＡ４又はＴＧＦβＩＩＲである。いくつかの実施形態では、阻害分子をコードする遺伝子は、ＶＳＩＧ３である。いくつかの実施形態では、阻害分子をコードする遺伝子は、ＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、阻害分子をコードする遺伝子はＴＧＦβＩＩＲである。

【0352】

本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」又は「ｉＰＳ細胞」という用語は、成人細胞、例えば免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞）から生成される。成人細胞におけるＫｌｆ４、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２等の再プログラミング因子（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）の発現により、細胞は複数の細胞タイプへの増殖及び分化が可能な多能性細胞に変換される。

【0353】

本明細書で使用される場合、用語「説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）」には、本発明の組成物及び方法の有用性を伝えるために使用できる出版物、記録、図表又はその他の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明書は、例えば、本発明の核酸、ペプチド及び／又は組成物を含む容器に貼り付けられてもよいし、又は、核酸、ペプチド及び／又は組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、受取人が説明書と化合物を連携して使用することを目的として、説明書を容器とは別に発送することもできる。

【0354】

本明細書で使用される場合、用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、自然の状態から変更又は除去されたことを意味する。例えば、生きた動物に自然に存在する核酸やペプチドは「単離」されていないが、同じ核酸やペプチドが自然状態で共存する物質から部分的又は完全に分離されたものは「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することも又は例えば、宿主細胞等の非ネイティブな環境に存在することもできる。

【0355】

本明細書で使用される場合、用語「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は、１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現の除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）を指す。

【0356】

本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点でレトロウイルスの中でも独特であり、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボでの遺伝子導入を大幅に向上させる手段を提供する。

【0357】

本明細書において、ｓｃＦｖの文脈で使用される用語「フレキシブルポリペプチドリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）」又は「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を連結するために、単独又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基等のアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、前記フレキシブルポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、ここでｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０（配列番号６５９２）である。一実施形態では、前記フレキシブルポリペプチドリンカーには、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４又は（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、前記リンカーには、（Ｇｌｙ２ Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ Ｓｅｒ）又は（Ｇｌｙ３ Ｓｅｒ）の複数の繰り返しが含まれる。

【0358】

本明細書において、「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」という用語は、本発明の分子又は細胞の変化した状態又は構造を意味する。分子は、化学的、構造的、機能的等、多くの方法で修飾し得る。細胞は、核酸の導入によって修飾され得る。

【0359】

本明細書で使用される場合、用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」は、治療又は化合物がない場合の対象の反応レベルと比較して及び／又はそれ以外は同一であるが治療を受けていない対象の反応レベルと比較して、対象の反応レベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語には、本来のシグナル又は応答を混乱させ、及び／又は影響を与え、それによって対象、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することが包含される。

【0360】

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。

【0361】

別途規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮退したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかの形でイントロンを含む可能性がある限り、イントロンも含まれ得る。

【0362】

本明細書で使用される場合、用語「操作可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、その結果、後者の発現が生じる。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と操作可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結される。一般的に、操作可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。

【0363】

本明細書で使用される場合、用語「過剰発現した（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、患者の特定の組織又は臓器内の固形腫瘍のような疾患領域の細胞における腫瘍抗原の発現レベルが、その組織又は臓器の正常細胞における発現レベルと比較して異常であることを示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を有する患者は、当該技術分野で既知の標準的なアッセイによって判定することができる。

【0364】

本明細書で使用される場合、免疫原性組成物の「非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は胸骨内注射、又は、注入技術が含まれる。

【0365】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸とポリヌクレオチドは互換性がある。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それがモノーマーの「ヌクレオチド」に加水分解される可能性があるという一般的な知識を有している。モノーマーヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解される可能性がある。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、当該技術分野で利用可能なあらゆる手段によって得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではなく、組み換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲ（登録商標）等を使用した組み換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング及び合成手段を含む。

【0366】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質又はペプチドの配列に含まれるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、用語は、当該技術分野で一般的にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当該技術分野で一般的にタンパク質と呼ばれ、多くの種類がある長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質等が含まれる。前記ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0367】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、細胞の合成機構によって認識される、又は導入された合成機構によって認識され、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要なＤＮＡ配列として定義される。

【0368】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター／調節配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの例では、この配列は、コアプロモーター配列（ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である可能性があり、他の例では、この配列には、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列及びその他の調節要素も含まれる可能性がある。前記プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであってもよい。

【0369】

本明細書で使用される場合、用語「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、遺伝子産物をコード又は規定するポリヌクレオチドと操作可能に連結されると、細胞のほとんど又は全ての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0370】

本明細書で使用される場合、用語「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、遺伝子産物をコード又は規定するポリヌクレオチドと操作可能に連結されると、実質的にプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0371】

本明細書で使用される場合、用語「組織特異的プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、遺伝子をコードする又は遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと操作可能に連結されると、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、細胞内で遺伝子産物が生成されるヌクレオチド配列である。

【0372】

本明細書で使用される場合、用語「センダイウイルス」は、パラミクソウイルス科の属を指す。センダイウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれたり、宿主細胞の遺伝情報を変更したりしない、ネガティブ一本鎖ＲＮＡウイルスである。センダイウイルスは、宿主範囲が非常に広く、人間に対して病原性はない。組み換えウイルスベクターとして使用されるセンダイウイルスは、一時的だが強力な遺伝子発現が可能である。

【0373】

本明細書で使用される場合、用語「シグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、細胞の細胞膜を介してシグナルを受信し、シグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体が含まれる。

【0374】

本明細書で使用される場合、用語「一本鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖フラグメントが、アミノ酸の組み換え範囲を介してＦｖ領域に連結される組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を指す。単一鎖抗体を生成するための様々な方法が知られており、その中には、米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－ ５８８３ （１９８８）； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４（１９８９）；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１（１９８８）．に記載されている方法も含まれる。

【0375】

本明細書で使用される場合、用語「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、与えられた標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を指す。キメラ抗原受容体は、単一特異性であり、標的に特異的に結合する１つ又は複数の結合部位を含む場合があり、またキメラ抗原受容体は、多重特異性であり、同じ又は異なる標的に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含む場合もある。ある実施形態では、キメラ抗原受容体は、同じ標的の２つの異なる（例えば、重複しない）部分に特異的である。ある実施形態では、キメラ抗原受容体は、１つ以上の標的に対して特異的である。

【0376】

本明細書で使用される場合、抗体に関して「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」という用語は、特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体又はその結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を意味する。例えば、ある種の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ又は複数の種の抗原にも結合する場合がある。しかし、このような種間反応性自体は、抗体の特異的な分類を変更するものではない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型に（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍｓ）も結合する場合がある。しかし、このような交差反応性自体は、抗体の特異的な分類を変更するものではない。いくつかの例では、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、キメラ抗原受容体又はペプチドと第二の化学種との相互作用に関して使用され、相互作用が化学種上の特定の構造（抗原決定基又はエピトープ等）の存在に依存することを意味し、例えば、キメラ抗原受容体は、一般的なタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」と抗体を含む反応中にエピトープＡを含む分子（又は遊離の標識されていないＡ）が存在すると、抗体に結合した標識Ａの量が減少する。

【0377】

本明細書で使用される場合、用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって誘導される一次反応を意味し、それによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達等のシグナル伝達イベントが媒介されるが、これに限定されるものではない。刺激は、ＴＧＦ－ベータの下方制御、細胞骨格構造の再編成、クローンの増殖、異なるサブセットへの分化等、特定の分子の発現の変化を媒介する可能性がある。

【0378】

本明細書で使用される場合、用語「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。

【0379】

本明細書で使用される場合、用語「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ぶ）と特異的に結合し、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖等を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激リガンドは、当該技術分野で周知であり、特に、ペプチドをロードしたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーゴニスト抗ＣＤ２８抗体（ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びスーパーゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。

【0380】

本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」及び「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、非霊長類（例えば、牛、豚、馬、猫、犬、ネズミ等）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）等の哺乳動物であり得る。ある実施形態では、本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳動物等の脊椎動物を指す。哺乳類には、人間、非人間霊長類、野生動物、野生化動物、家畜、スポーツ動物及びペット等が含まれるが、これらに限定されない。免疫反応を誘発できるあらゆる生物が対象又は患者となり得る。ある例示的な実施形態では、対象はヒトである。

【0381】

本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」細胞という用語は、本質的に他の細胞タイプを含まない細胞を意味する。実質的に精製された細胞とは、自然発生状態では通常関連する他の細胞タイプから分離された細胞も指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、自然な状態で自然に関連する細胞から分離された細胞を単に指す。いくつかの実施形態では、前記細胞は、インビトロで培養される。他の実施形態では、前記細胞は、インビトロで培養されない。

【0382】

本明細書で使用される場合、用語「標的部位」又は「標的配列」は、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合し得る核酸の部分を定義するゲノム核酸配列を指す。

【0383】

本明細書において、ｇＲＮＡに関連して使用される用語「標的ドメイン」は、標的配列を認識するか、又は標的配列と相補的であるｇＲＮＡ分子の部分を指す。例えば、細胞の核酸内（例えば、遺伝子内）の標的配列である。

【0384】

本明細書で使用される場合、用語「標的配列」は、ｇＲＮＡ標的ドメインに相補的な、例えば完全に相補的な核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列はゲノムＤＮＡ上に配置される。いくつかの実施形態では、標的配列は、ヌクレアーゼ活性又はその他のエフェクター活性を有するタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列）に隣接する（ＤＮＡの同じ鎖上又は相補鎖上の何れか）。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列である。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、阻害分子の標的配列である。いくつかの実施形態では、前記標的配列は、阻害分子の下流エフェクターの標的配列である。

【0385】

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。前記ＴＣＲは、主要組織適合性複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。ＴＣＲは、３つの二量体モジュールＣＤ３δ／ＣＤ３ε、ＣＤ３γ／ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζに結合したアルファー（ａ）鎖とベータ（β）鎖のヘテロ二量体からなる。一部の細胞では、前記ＴＣＲは、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖（ＣＤ３γ／ＣＤ３ε）からなる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、構造的に類似しているが、解剖学的位置及び機能が異なるアルファー／ベータ及びガンマ／デルタの形態で存在する場合がある。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインの２つの細胞外ドメインからなる。いくつかの実施形態では、前記ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞及びガンマデルタＴ細胞を含む、ＴＣＲを含む任意の細胞上で修飾され得る。

【0386】

本明細書で使用される用語「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」は、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）及び／又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を意味する。治療効果は、病状の抑制、寛解（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）又は根絶（ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）によって得られる。

【0387】

本明細書で使用される場合、用語「治療」は、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善に使用できる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）を指す。いくつかの実施形態では、「療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、生物学的療法（例えば、養子細胞療法）、支持療法（例えば、リンパ球除去療法）及び／又は医療従事者等の当業者に知られている、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善に有用な他の療法を指す。

【0388】

本明細書において、ｇＲＮＡ分子に関連して使用される用語「ｔｒａｃｒ」は、ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの部分を指す。いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒは、旗竿の一部を形成する核酸配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」又は「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」又は「形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」は、外因性の核酸が宿主細胞に移送又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞とは、外因性の核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞である。前記細胞には、主要な対象細胞とその子孫が含まれる。

【0389】

本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、１つ又は複数の治療法（固形腫瘍の治療を目的としたＣＡＲ－Ｔ療法を含むがこれに限定されない）の投与の結果として生じる、疾患又はそれに関連する症状の進行、重症度、頻度及び／又は持続期間の低減又は改善を指す。本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療される対象の疾患の経過を変えることも指す場合がある。治療の治療効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、寛解又は予後の改善が含まれる。

【0390】

本明細書で使用される場合、用語「転写制御下にある」又は「機能的に連結されている（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置及び方向にあり、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御することを意味する。

【0391】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ）を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物である。当該技術分野では、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが知られている。したがって、用語「ベクター」は、自律複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語には、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等、核酸の細胞への移動を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も含まれると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0392】

本明細書で使用される場合、用語「異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。

【0393】

本明細書で使用される場合、用語「完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ）」及び「完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）」は、免疫細胞の成長（例えば、Ｔ細胞の成長）に最適化された細胞培養培地を指す。いくつかの例では、完全培地には、タンパク質、無機塩、微量元素、ビタミン、アミノ酸、脂質、炭水化物、サイトカイン及び／又は成長因子が含まれており、各成分の比率は細胞の成長に合わせて最適化されている。例示的なタンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン及びインスリン等が挙げられる。例示的な炭水化物としては、ブドウ糖が挙げられる。代表的な無機塩としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。例示的な微量元素としては、亜鉛、銅、セレン、トリカルボン酸等が挙げられる。例示的なアミノ酸には、Ｌ－グルタミン（例えば、アラニル－Ｌ－グルタミン又はグリシル－Ｌ－グルタミン）等の必須アミノ酸、又はグリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン及び／又はＬ－セリン等の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）が含まれる。いくつかの実施形態では、前記完全培地には、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、フェノールレッド、抗生物質及び／又はβ－メルカプトエタノールの１つ又は複数も含まれる。いくつかの例では、前記完全培地は、無血清培地である。いくつかの例では、前記完全培地は、異種物質を含まない培地である。

【0394】

本明細書で使用される場合、用語「化学的に定義された培地」は、全ての成分の組成及び濃度が既知である細胞培養培地を指す。完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ）と異なる点は、完全培地には、組成や濃度が不明な動物由来成分等の成分が含まれる場合があることである。

【0395】

いくつかの例では、「ゼノフリー（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）」培地には、動物由来（非ヒト）成分が一切含まれていない。いくつかの例では、ゼノフリー培地には、ヒト血清、成長因子及びインスリン等の１つ又は複数のヒト由来成分が含まれている。

【0396】

いくつかの実施形態では、「無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）」培地には、血清又は血漿は含まれないが、血清又は血漿に由来する成分は含まれていてもよい。いくつかの例では、「無血清」培地にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物由来の成分が含まれる。

【0397】

いくつかの実施形態では、「最小（ｍｉｎｉｍｕｍ）」培地は、標的細胞の成長に最低限必要なものを含む。いくつかの例では、最小培地には、無機塩、炭素源及び水が含まれる。いくつかの例では、サプリメント、サイトカイン及び／又はアルブミン等のタンパク質（ＨＳＡ等）が最小培地に追加される。本明細書において、サプリメントは、微量元素、ビタミン、アミノ酸、脂質、炭水化物、サイトカイン、成長因子又はそれらの組み合わせを含む。

【0398】

範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な側面は範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、全ての可能なサブ範囲を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等のサブ範囲、及びその範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６等が具体的に開示されているとみなされる。これは範囲の広さに関係なく適用される。

【実施例】

【0399】

これらの例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１：

【0400】

本実施例は、本開示の新規同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するために使用される材料及び方法を提供する。

【0401】

一次ヒトＴ細胞の増殖と細胞の凍結保存：
Ｔ細胞は、培地中１×１０^６細胞／ｍＬで培養し、培養開始時にＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を使用して活性化した。ＮＣ２００（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を使用して、１日おきに細胞をカウントした。さらに、細胞生存率と細胞サイズを１日おきに測定した。細胞を新鮮なＴ細胞培地で培養し、５×１０^５細胞／ｍＬに再懸濁した。９～１１日目に細胞を採取し、５％ＤＭＳＯを含む凍結培地で凍結保存した。

【0402】

多色性フローサイトメトリー分析：
細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５％子牛胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁した。特定の蛍光色素に結合した抗体のマスターミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を細胞に添加した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）サイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を使用して分析した。使用した抗体パネル（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌ）には、生存率評価用の、抗ＣＤ３－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＴＣＲａｂ－ＡＰＣ、抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＶｉｏＧｒｅｅｎ、抗ＨＬＡＩ－ＡＢＣ－ＦＩＴＣ、抗ＣＡＲ－ＰＥ及び７ＡＡＤが含まれる。データ解析にはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。

【0403】

一次ヒトＴ細胞の遺伝子編集：
各標的のそれぞれのガイドＲＮＡと結合したヌクレアーゼの形態のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）をヒトＴ細胞にトランスフェクトした。細胞は、５％ヒト血清、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びグルタミンを含む特別なＴ細胞培地で５～８日間培養された。培養終了後、多色性フローサイトメトリーを実施し、各遺伝子標的の遺伝子編集効率レベルを同時に測定した。

【0404】

リアルタイム腫瘍細胞毒性アッセイ：
ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害能力は、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用して評価した。簡単に説明すると、ＣＡＲ Ｔ細胞をマイクロタイタープレートで腫瘍標的細胞と異なるエフェクター対標的比（例えば、１：１０、１：５、１：２．５、１：１）で数日間共培養した。腫瘍細胞死は、各条件で測定された細胞インピーダンスの変化として連続的に決定された。データは、ＲＴＣＡ（登録商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用して取得した。

【0405】

Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイによる遺伝子編集効率：
遺伝子編集の効率を分子レベルで測定するために、それぞれの遺伝子標的に合わせたＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイを用いた。全ゲノムＤＮＡをＴ細胞から単離し、マイナス８０℃で保存するか、直接、評価に使用した。各標的の切断部位にまたがるプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分析し、アンプリコンのサイズ及び量を検証した。その後、ＰＣＲアンプリコンをＴ７Ｅ１ヌクレアーゼで消化し、２１００ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用して解析した。遺伝子編集効率の決定には２１００ Ｅｘｐｅｒｔ（登録商標）ソフトウェアを使用した。

【0406】

混合白血球反応：
同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞及び非血縁ドナー由来のＴ細胞（「第２ドナー」と表示）の共培養を異なる比率で設定し、１６日間追跡した。細胞死は、各特定の細胞タイプ（すなわち、同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞対「第２ドナー」のＴ細胞）を区別し追跡するために、特異的マーカーを用いたフローサイトメトリーによって決定された。フローサイトメトリーの前に１２３ｃｏｕｎｔ（登録商標）ｅＢｅａｄｓを加えて細胞の絶対数を測定し、７ＡＡＤ色素を使用して細胞生存率を評価した。
実施例２：

【0407】

この実施例の目的は、トリプルノックアウト戦略を詳述することであった。

【0408】

以下の表３は、本開示のトリプルノックアウト戦略（３遺伝子ノックアウトの組合せ）を含む新規な同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞プラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を示す。独自のアプローチでは、ＴＣＲモジュール（ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３γ）の１つ又は複数の遺伝子、ＨＬＡ－Ｉの１つ又は複数の遺伝子、ＨＬＡ－ＩＩの１つ又は複数の遺伝子を標的とすることを含む。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0409】

複数の遺伝子をノックアウトする戦略は、修飾された同種異形Ｔ細胞産物を産生することが期待される。
実施例３：

【0410】

本実施例の目的は、少なくとも１つのノックアウト遺伝子を有する、本明細書に記載の様々な構築物を調製することであった。

【0411】

表１は、抗原プロセシング及び提示経路（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ）における代替Ｔ細胞受容体サブユニット（ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及びＣＤ３ε）及び追加の重要な遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を含む、本開示の新規同種異系ＣＡＲ Ｔ戦略を示す。特に、１５の遺伝子標的が選択され、それぞれがＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系を使用して複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で試験された。１５の遺伝子を標的とするために使用されたｇＲＮＡの例を表４に開示する。

【表4】

実施例４：

【0412】

この実施例の目的は、ＣＤ３δ（図２Ａ）、ＣＤ３ε（図２Ｂ）及びＣＤ３γ（図２Ｃ）の標的破壊に焦点を当てた異なる構築物を使用して、ＴＣＲα／βのノックアウト効率を評価することであった。

【0413】

ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ－α鎖及びＴＣＲ－β鎖の破壊効率のパーセンテージを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたＣＤ３δ（図２Ａ）、ＣＤ３ε（図２Ｂ）及びＣＤ３γ（図２Ｃ）遺伝子の標的破壊後、フローサイトメトリーにより測定した。図２Ａは、４つの異なるガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３及びｇＲＮＡ４を用いたＣＤ３δの破壊後の結果を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３ガイドＲＮＡを用いたＣＤ３δの破壊は、ＴＣＲα／βの１００％のＫＯ効率をもたらしたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ４の使用は、ＴＣＲα／βの約９０％以上のＫＯ効率をもたらした。したがって、ＣＤ３δを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｇＲＮＡ１とｇＲＮＡ３を使用することが好ましい。

【0414】

図２Ｂは、５つの異なるガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５を用いたＣＤ３εの標的破壊後の結果を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５ガイドＲＮＡを用いたＣＤ３εの破壊は、ＴＣＲα／βの１００％のＫＯ効率をもたらしたが、ｇＲＮＡ１の使用は、ＴＣＲα／βの約５０％のＫＯ効率しかもたらさず、最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイドｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３を使用すると、ＴＣＲα／βの約９０％以上のＫＯ効率をもたらした。したがって、ＣＤ３εを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５ガイドＲＮＡを使用することが好ましい。

【0415】

図２Ｃは、５つの異なるガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４及びｇＲＮＡ５を用いたＣＤ３γの標的破壊後の結果を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ４ガイドＲＮＡを用いたＣＤ３εの破壊は、ＴＣＲ α／βの１００％のＫＯ効率をもたらしたが、ｇＲＮＡ５を使用すると、ＴＣＲ α／βの約９５％以上のＫＯ効率をもたらし、最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３ガイドＲＮＡを使用すると、ＴＣＲ α／βのＫＯ効率は、あまり好ましくない結果となった。したがって、ＣＤ３γを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｇＲＮＡ４ガイドＲＮＡの使用が好ましい。
実施例５：

【0416】

この実施例の目的は、１０日間にわたる同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の異なる構築物の増殖を評価することであった。

【0417】

試験した異なる構築物には、（１）ＴＲＡＣノックアウト（図３のアロ（ＴＲＡＣ ＫＯ））（例えば、本開示の前に使用されたノックアウト）、（２）ＣＤ３δノックアウト（図３のアロ（Ｄ１ ＫＯ））、（３）ＣＤ３γノックアウト（図３のアロ（Ｇ４ ＫＯ））及び（４）ＣＤ３εノックアウト（図３のアロ（Ｅ４ ＫＯ））を含む同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が含まれた。細胞集団の倍加率をＹ軸に、日数をＸ軸に示す。図３に詳細な結果を示す。

【0418】

図３は、図１の戦略を使用して生成された同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を示すグラフを示し、１０日間にわたる集団倍化の数を示す。
実施例６：

【0419】

この実施例では、ＴＣＲ－α／β鎖の表面発現を比較するために、。いくつかの異なるノックアウト構築物を評価した。

【0420】

図４Ａ及び４Ｂは、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（例えば、本開示の前に使用された構築物）、ＣＤ３δ、ノックアウト（Ｄ１ ＫＯ）、ＣＤ３γノックアウト（Ｇ４ ＫＯ）及びＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）のＣＲＩＳＰＲ媒介下方制御を比較したフローサイトメトリー結果を示す。図４Ａは、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）が、ＴＣＲ－α／β鎖の表面発現によって測定されるように、Ｔ細胞受容体ノックアウトの標的としてより優れていることを示す。図４Ｂは、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４ ＫＯ）を含む同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が、例えばＣＤ３γ又はＣＤ３δノックアウトを含むＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い形質導入効率を有し、機能的に優れていることを示す；ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の実施形態が図示されている。
実施例７：

【0421】

この実施例の目的は、異なるＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞構築物の腫瘍殺傷能力を評価することであった。

【0422】

図５は、ＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（例えば、本開示の前に使用された構築物）、ＣＤ３δ、ノックアウト（Ｄ１）、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４）、及びＣＤ３γノックアウト（Ｇ４）を含む同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力を示すグラフである。その結果、ＰＳＭＡ Ｅ４同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞が最も殺傷能力が高いことが示された。標的細胞は、ヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞であった。

【0423】

１つのＣＤ３サブユニットの標的破壊が、他のＣＤ３サブユニットの標的破壊と比較して、より強力な同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞をもたらすとは予想されていなかったので、これらの結果は意外であり、予想外であった。図５は、アロＴＣＲ－α鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞、アロＣＤ３δ、ノックアウト（Ｄ１）ＣＡＲ Ｔ細胞又はアロＣＤ３γノックアウト（Ｇ４）ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した場合、ＣＤ３εを標的とするアロＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３εノックアウト（Ｅ４））がより強力である（すなわち、腫瘍細胞をより速く死滅させる）という予期せぬ発見を示している。
実施例８：

【0424】

この実施例の目的は、標的遺伝子のノックアウトを実現する際のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ法の有効性を評価することであった。特に

【0425】

図６Ａ～６Ｄは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ不一致検出アッセイ（Ｔ７Ｅ１）を使用して図示したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性を示す。図６Ａは、３つの異なるｇＲＮＡを使用して３つの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子の部位から増幅されたＴ７Ｅ１処理ＰＣＲ産物の代表的なゲル電気泳動像を示す。図６Ｂ～７Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集効率を示すＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒエレクトロフェログラムによって生成された電気泳動図を示す。

【0426】

さらに、図７Ａ～Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集効率を示すＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒエレクトロフェログラムである。７Ａ～Ｄは、Ｃ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）ＣＲＩＳＰＲ編集効率の結果を示す、コントロール及びＴ７Ｅ１処理ＰＣＲのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒエレクトロフェログラム及びゲル電気泳動を示す。
実施例９：

【0427】

この実施例の目的は、異なる細胞タイプの生存率を決定することであった。

【0428】

混合リンパ球アッセイ（ＭＬＡ）を実施した。図８は、アロ細胞単独、Ｔ細胞（第二のドナー）単独、共培養のアロ細胞及び共培養のＴ細胞（第二のドナー）を用いた混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイの結果を示すグラフである。特に、レシピエントのＴ細胞（別のドナー由来のＴ細胞）を同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞と１４日間共培養し、Ｔ細胞の増殖を解析した。

【0429】

この結果は、コントロールＴ細胞（２番目のドナー）、同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞単独又は共培養での生存性を示し、「レシピエントの」Ｔ細胞は同種異形細胞の存在に反応しなかった（増殖しなかった）ことを示している。したがって、図８は、ＨＬＡ不一致が存在するにもかかわらず、２番目の（無関係な）ドナー由来のＴ細胞が、共培養の同種異形ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に反応して増殖しなかったことを示している。同種異形ＣＡＲ Ｔは、ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ及びＣＲＩＳＰＲで編集されたＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／Ｃ２ＴＡ ｇＲＮＡを含む。従って、本発明の同種異形ＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントの免疫系（すなわちＴ細胞）に検出されないまま、腫瘍細胞を死滅させる絶好の機会を有することになる。

【0430】

特定の実施形態が図示され、説明されているが、以下の特許請求の範囲に定義されるような、より広範な態様における技術から逸脱することなく、当業者の通常の技術に従って、変更及び修正がそこで行われ得ることが理解されるべきである。

【0431】

本明細書に例示的に記載された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）又は要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、制限（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）又は制限（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）がない場合にも好適に実施することができる。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、限定することなく拡大解釈されるものとする。さらに、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、具体的に記載された要素、及びクレームされた技術の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えない追加的な要素を含むものと理解される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という表現は、特定されていないいかなる要素も除外する。

【0432】

加えて、本開示の特徴又は態様が、マーカーッシュグループの観点から記載されている場合、当業者は、本開示がそれによってマーカーッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するであろう。

【0433】

当業者には理解されるであろうが、あらゆる目的、特に書面による説明を提供するという観点から、本明細書で開示される全ての範囲は、終点を含む、あらゆる可能な部分範囲及びそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。どのような列挙された範囲も、同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解されることを十分に記述し、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で議論される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１及び上位３分の１等に容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「～まで（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「～より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「～より小さい（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」等の全ての表現は、言及された数を含み、上述したようにその後サブ範囲に分解できる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々のメンバーを含む。

【0434】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、発行済み特許及びその他の一般に入手可能な文書は、個々の刊行物、特許出願、発行済み特許又はその他の文書が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれるテキストに含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲において除外される。

【0435】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【国際調査報告】