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特表2024-533400腫瘍の非毒性コロニー形成のために操作されたサルモネラ菌
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】腫瘍の非毒性コロニー形成のために操作されたサルモネラ菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240905BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240905BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20240905BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20240905BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/09 20060101ALI20240905BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12N1/20 E
C12N15/31
A61K35/74
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 121
A61K31/05
A61K45/00
A61K31/09
A61P31/04
A61K31/661
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515462
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 US2022043112
(87)【国際公開番号】W WO2023039194
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/242,975
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513112245
【氏名又は名称】リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＮＮＥＳＯＴＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】サルツマン、ダニエル アラン
(72)【発明者】
【氏名】ショッテル、ジャネット ルイーズ
(72)【発明者】
【氏名】オーガスティン、ランス ビショフ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B065AA46X
4B065AA46Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC15
4B065BA02
4B065BD50
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA07
4C084NA13
4C084ZB26
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA34
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA07
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC35
4C087NA07
4C087NA13
4C087ZB26
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA19
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206NA06
4C206NA13
4C206ZB35
4C206ZC75
(57)【要約】
本明細書では、敗血症性副作用を伴わない細菌の静脈内送達する能力、および全身毒性のある免疫調節タンパク質を、いかなる全身毒性も伴わずに腫瘍微小環境に直接送達する能力が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
弱毒化サルモネラ菌細胞であって、ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子における変異または欠失であって、前記１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、変異または欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、細胞。
【請求項2】
前記細胞がＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項3】
前記１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項4】
前記１以上のサルモネラ菌遺伝子が、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである、請求項１に記載の細胞。
【請求項5】
前記１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、請求項１に記載の細胞。
【請求項6】
腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項7】
ｒｐｏＳ遺伝子の欠失、ｇｌｍＳの欠失、および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項8】
ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を更に含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項9】
ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、請求項１に記載の細胞。
【請求項10】
前記腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊プロモーターである、請求項９に記載の細胞。
【請求項11】
前記細胞は、外因性免疫調節因子タンパク質を発現する１以上の外因性免疫調節因子遺伝子を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項12】
前記免疫調節因子遺伝子が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９－１０、αＣＴＬＡ－４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、αＣＴＬＡ－４単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂおよび／またはαＣＤ４７ ｓｄＡｂを発現する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項13】
前記免疫調節因子タンパク質が前記細胞から分泌されている、請求項１１に記載の細胞。
【請求項14】
前記１以上の外因性免疫調節因子遺伝子が、腫瘍特異的発現プロモーターの制御下にある、請求項１１に記載の細胞。
【請求項15】
前記腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項16】
請求項１に記載の細胞集団またはその組み合わせと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物。
【請求項17】
がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１に記載の細胞集団を、前記がんを処置するように投与することを含む、方法。
【請求項18】
腫瘍成長／増殖を阻害するか、または腫瘍の体積／サイズを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍成長を抑制するか、または前記腫瘍の体積を減少させるように、有効量の請求項１に記載の細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項19】
転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害する方法であって、それを必要とする対象に、転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害するように、有効量の請求項１に記載の細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項20】
前記腫瘍、がん、または転移が、肺、肝臓、腎臓、乳房、前立腺、膵臓、結腸、頭頸部、卵巣、および／もしくは消化器系腫瘍、腫瘍関連細胞、がん、または転移である、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞または組成物が、全身投与、例えば静脈内投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が２回以上投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項23】
血管破壊剤（ＶＤＡ）および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）を投与することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項24】
前記ＶＤＡおよび／またはＣＢＤが、処置前および／または処置中に（前記細胞の少なくとも１回の投与後に）投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項25】
前記ＶＤＡおよび／またはＣＢＤが２回以上投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記ＶＤＡが、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェートおよび／またはＶＤＡ ＣＫＤ－５１６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）が投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項28】
サルモネラ菌の毒性を低減する方法であって、前記サルモネラ菌が、ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子の欠失であって、前記１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、方法。
【請求項29】
前記サルモネラ菌が、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記１以上のサルモネラ菌遺伝子が、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項34】
ｒｐｏＳ遺伝子の欠失および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項35】
ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項36】
ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、請求項２８に記載の方法。
【請求項37】
前記腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊プロモーターである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍の非毒性コロニー形成のために操作されたサルモネラ菌に関する。
【背景技術】
【0002】
開発されている細菌抗がん治療の多くは、細菌が腫瘍に特異的に定着（コロニー形成）する能力に依存している。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の前臨床結果を臨床環境に応用する初期の試みは、主に腫瘍定着がないことと、全身投与されたグラム陰性菌による有意な毒性とにより失敗した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本明細書において、細菌表面分子と哺乳動物細胞上の受容体との相互作用による毒性の低減が提供される。これは、細菌ゲノムを編集して、哺乳動物細胞上のｔｏｌｌ様受容体に結合するフラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、およびリポ多糖タンパク質を除去することによって達成される。加えて、補体活性化を阻害する外膜プロテアーゼの発現が増加した。更に、免疫調節因子タンパク質の全身投与により、毒性が低減／排除される。これは、腫瘍微小環境にタンパク質を発現および分泌するための遺伝子カセットを有するプラスミドを含有する細菌株によって達成され、全身毒性が低減された抗がん免疫応答をもたらす。したがって、本明細書では、敗血症性副作用を伴わない細菌の静脈内送達能力、および全身毒性のある免疫調節タンパク質を、いかなる全身毒性も伴わずに腫瘍微小環境に直接送達する送達能力が提供される。
【0004】
一態様は、弱毒化サルモネラ菌細胞であって、ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子における変異または欠失であって、該１以上のタンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、変異または欠失と、任意選択で、ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、を含む、弱毒化サルモネラ菌細胞を提供する。一態様において、細胞はＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である。一態様において、１以上のサルモネラ菌遺伝子は、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする。別の態様において、１以上のサルモネラ菌遺伝子は、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである。一態様において、１以上の外膜プロテアーゼはＰｇｔＥである。
【0005】
一態様は、腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む。別の態様は、ｒｐｏＳ遺伝子の欠失および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む。別の態様は、ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を更に含む。いくつかの態様において、サルモネラ菌の内因性ｆｌｈＤＰプロモーターは、腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている。一実施形態において、腫瘍特異的発現プロモーターは、ＦＦ＋２０＊プロモーターである。
【0006】
一態様において、細胞は、外因性免疫調節因子タンパク質を発現する１以上の外因性免疫調節因子遺伝子を含む。いくつかの態様において、免疫調節因子遺伝子は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９－１０、αＣＴＬＡ－４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、αＣＴＬＡ－４単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂおよび／またはαＣＤ４７ ｓｄＡｂタンパク質をコードする／発現する。一態様において、免疫調節因子タンパク質は細胞から分泌されている。いくつかの態様において、１以上の外因性免疫調節因子遺伝子は、腫瘍特異的発現プロモーターの制御下にある。一態様において、腫瘍特異的発現プロモーターは、ＦＦ＋２０＊である。
【0007】
一態様は、本明細書に記載される細胞集団またはその組み合わせと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。
一態様は、がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載される細胞集団、その組み合わせ、または本明細書に記載される組成物を、がんを処置するように投与することを含む、方法を提供する。
一態様は、がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載される細胞集団、その組み合わせ、または本明細書に記載される組成物を、がんを処置するように投与することを含む、方法を提供する。
【0008】
一態様は、腫瘍成長／増殖を阻害するか、または腫瘍の体積／サイズを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍成長を抑制するか、または腫瘍の体積を減少させるように、有効量の本明細書に記載される細胞集団、その組み合わせ、または本明細書に記載される組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0009】
別の態様は、転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害する方法であって、それを必要とする対象に、転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害するように、有効量の本明細書に記載される細胞集団、その組み合わせ、または本明細書に記載される組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0010】
一態様において、腫瘍、がん、または転移は、肺、肝臓、腎臓、乳房、前立腺、膵臓、結腸、頭頸部、卵巣、および／もしくは消化器系腫瘍、がん、または転移である。
別の態様において、細胞または組成物は、全身投与される。一態様において、細胞は２回以上投与される。別の態様は、血管破壊剤（ＶＤＡ）および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）を投与することを更に含む。一態様において、ＶＤＡおよび／またはＣＢＤは、処置前および／または処置中に（細胞の少なくとも１回の投与後に）投与される。ある態様において、ＶＤＡおよび／またはＣＢＤは２回以上投与される。一態様において、ＶＤＡは、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェートおよび／またはＶＤＡ ＣＫＤ－５１６である。一態様において、抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）が投与される。
別の態様において、細胞または組成物は、全身投与される。一態様において、細胞は２回以上投与される。別の態様は、血管破壊剤（ＶＤＡ）および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）を投与することを更に含む。一態様において、ＶＤＡおよび／またはＣＢＤは、処置前および／または処置中に（細胞の少なくとも１回の投与後に）投与される。ある態様において、ＶＤＡおよび／またはＣＢＤは２回以上投与される。一態様において、ＶＤＡは、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェートおよび／またはＶＤＡ ＣＫＤ－５１６である。一態様において、抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）が投与される。
【0011】
一態様は、サルモネラ菌の毒性を低減する方法であって、該サルモネラ菌が、ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子の欠失であって、該１以上のタンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、欠失と、任意選択で、ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、を含む、方法である。一実施形態において、サルモネラ菌はＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である。一態様において、１以上のサルモネラ菌遺伝子は、フラジェリン、フィンブリア（ｆｉｍｂｒｉａｅ）、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする。別の態様において、１以上のサルモネラ菌遺伝子は、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである。一態様において、１以上の外膜プロテアーゼはＰｇｔＥである。一態様は、腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む。別の態様は、ｒｐｏＳ遺伝子の欠失および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む。更なる態様は、ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を含む。一態様において、ｆｌｈＤＰプロモーターは、腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている。別の態様において、腫瘍特異的発現プロモーターは、ＦＦ＋２０＊プロモーターである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】抗ＩＬ－６抗体は、全身性Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ＋ＶＤＡの毒性を低減する。４００ｍｍ３の腫瘍を有するＢＡＬＢ－ｎｅｕＴ雌マウスを、５×１０５または１×１０６ｃｆｕのＢＣＴ１株（ｐＮＧ）のいずれかで静脈内処置した。細菌ｃｆｕ数は０日目に送達された総ｃｆｕを示しており、細菌の５０％が３時間間隔で２回の注射で投与された。全てのマウスにＣＡ４Ｐ ＶＤＡを、１回の注射につき０．４ｍｇ、３時間間隔で２回の静脈内注射を行い、これは－２日目と－１日目とに投与された。示されている場合、１ｍｇの抗ＩＬ－６ ｍＡｂを、最初のＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ注射の直後に腹腔内投与した。マウスを、７日間の処置後の体重減少および生存についてモニターした。各群において処置された生存マウス／全マウスを、各列の下に分数として表す。ｙ軸値は、各群における生存マウスの平均体重減少率（％）を表す。エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。
【図2】ＢＣＴ２株の構築。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＢＣＴ２株は、ΔｆｌｉＣ、ΔｆｌｊＢ、ΔｆｉｍＨ、ｐｇｔＥｐ（ＮＣ＿０１６８６３．１：ｇ．２５０６７９４Ｇ＞Ａ）、およびΔｒｆａＬ変異を、χ１１０９１株（リピドＡ変異（２３）を含有する）に導入し、ＣＲＳの全身誘導を回避するように表面分子を改変することによって構築された。遺伝子は最後の列に列挙され、それらがコードする分子は中央の列に、対応する免疫応答は最初の列に列挙される。
【図3】Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＢＣＴ２毒性。１×１０７ｃｆｕ（黒記号）または１×１０６ｃｆｕ（白記号）の株ＶＮＰ２０００９またはＢＣＴ２（ｐＰｆｌＥＰＬｕｘ）を非腫瘍負荷ＢＡＬＢ／ｃマウスに細菌投与した後の体重変化を、細菌注射後７日間追跡した。エラーバー（明確にするために単一方向で示される）は、４匹のマウスからの測定値の標準偏差を表す。
【図4】Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＢＣＴ２毒性および腫瘍定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）。株ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）およびＶＤＡで処置した腫瘍負荷ＢＡＬＢ－ｎｅｕＴマウスにおいて、体重変化を追跡した。ＣＫＤ－５１６ ＶＤＡを、－４、－３、－２および－１日目に０．１ｍｇの腹腔内注射を１回実施した後、０日目に３時間間隔で２回の１．５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）用量を静脈内投与し、１時間後にＣＫＤ－５１６の０．０５ｍｇの腹腔内注射を実施した。エラーバーは、３匹のマウスからの測定値の標準偏差を表す。挿入図：ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）およびＶＤＡで処置した３匹のＢＡＬＢ－ｎｅｕＴマウスにおける腫瘍からの生物発光である。各マウスの４つの図が示されている。
【図5A】Ｂａｌｂ－ｎｅｕＴ腫瘍負荷マウスにおける操作された細菌株の有効性。このデータは、ＢＣＴ２、ＢＣＴ５およびＢＣＴ１４株の抗がん治療有用性を実証する。全てのマウスに、１００マイクロリットルの示された株を注射した。処置（Ａ）～（Ｄ）は以前に記載されたものである（１１）。全ての処置マウスに、－２日目に４ｍｇ／ｋｇのＶＤＡ（血管破壊剤）＋５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ ＩＰ（カンナビジオール）を投与した。処置（Ｅ）では、０日目に、マウスに２×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）－２時間－２×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）を、続いて１４日目に、５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ５（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）－２時間－５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ５（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）を静脈内注射した。処置（Ｆ）では、マウスに、０日目に２．５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ（ｐｆｌｉＣ－Ｐ）－２時間－２．５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ（ｐｆｌｉＣ－Ｐ）を投与した。コホート（Ｅ）および（Ｆ）のマウスには、０日目の細菌の２回目の静脈内注射の２時間後に、２ｍｇ／ｋｇのＶＤＡ＋５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ ＩＰを投与した。腫瘍体積差（パネルＡ）および平均生存時間差（パネルＢ）についての統計は、ｐ値＜０．０５を有する比較についてのみ提供される。
【図5B】Ｂａｌｂ－ｎｅｕＴ腫瘍負荷マウスにおける操作された細菌株の有効性。このデータは、ＢＣＴ２、ＢＣＴ５およびＢＣＴ１４株の抗がん治療有用性を実証する。全てのマウスに、１００マイクロリットルの示された株を注射した。処置（Ａ）～（Ｄ）は以前に記載されたものである（１１）。全ての処置マウスに、－２日目に４ｍｇ／ｋｇのＶＤＡ（血管破壊剤）＋５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ ＩＰ（カンナビジオール）を投与した。処置（Ｅ）では、０日目に、マウスに２×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）－２時間－２×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）を、続いて１４日目に、５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ５（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）－２時間－５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ５（ｐＦＦ＋２０＊－Ｑｕａｄ）を静脈内注射した。処置（Ｆ）では、マウスに、０日目に２．５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ（ｐｆｌｉＣ－Ｐ）－２時間－２．５×１０６ｃｆｕのＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ（ｐｆｌｉＣ－Ｐ）を投与した。コホート（Ｅ）および（Ｆ）のマウスには、０日目の細菌の２回目の静脈内注射の２時間後に、２ｍｇ／ｋｇのＶＤＡ＋５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ ＩＰを投与した。腫瘍体積差（パネルＡ）および平均生存時間差（パネルＢ）についての統計は、ｐ値＜０．０５を有する比較についてのみ提供される。
【図6A】免疫調節因子タンパク質を発現および分泌するプラスミド。ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙプラスミド（Ａ）およびｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４Ｈｌｙで表されるｓｃＦｖ分泌プラスミド（Ｂ）の両方が、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢ遺伝子座転写ターミネーター配列、ｐ１５Ａ複製起点、およびＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＹＡ２９２由来の配列を含む。それらはまた、Ｃ末端６０アミノ酸の溶血素分泌シグナル配列（ＨｌｙＡ）に融合された免疫調節因子タンパク質ｃＤＮＡと、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨｌｙＢ）および（ＨｌｙＤ）溶血素輸送タンパク質をコードするｃＤＮＡからなるＦＦ＋２０＊促進型オペロンを含有する。ＩＬ１５免疫調節因子ｃＤＮＡは、マウスＩＬ－１５受容体アルファサブユニットのスシドメインをコードする配列（ＩＬ１５Ｒａ）、続いてｇｌｙ／ｓｅｒフレキシブルリンカー（Ｌ１）、続いてマウスＩＬ－１５をコードする配列（ＩＬ１５）、続いて第２のｇｌｙ／ｓｅｒフレキシブルリンカーをコードする配列（Ｌ２）からなる。ｓｃＦｖ免疫調節因子ｃＤＮＡは、フレキシブルｇｌｙ／ｓｅｒリンカー（Ｌ）によって分離された可変軽鎖（Ｖｌ）および可変重鎖（Ｖｈ）抗体配列をコードする配列、続いて６×ヒスチジンおよびヘマグルチニンタグ（Ｔ）からなる。ｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１（図示せず）を構築するための戦略は、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４と同一であった。
【図6B】免疫調節因子タンパク質を発現および分泌するプラスミド。ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙプラスミド（Ａ）およびｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４Ｈｌｙで表されるｓｃＦｖ分泌プラスミド（Ｂ）の両方が、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢ遺伝子座転写ターミネーター配列、ｐ１５Ａ複製起点、およびＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＹＡ２９２由来の配列を含む。それらはまた、Ｃ末端６０アミノ酸の溶血素分泌シグナル配列（ＨｌｙＡ）に融合された免疫調節因子タンパク質ｃＤＮＡと、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨｌｙＢ）および（ＨｌｙＤ）溶血素輸送タンパク質をコードするｃＤＮＡからなるＦＦ＋２０＊促進型オペロンを含有する。ＩＬ１５免疫調節因子ｃＤＮＡは、マウスＩＬ－１５受容体アルファサブユニットのスシドメインをコードする配列（ＩＬ１５Ｒａ）、続いてｇｌｙ／ｓｅｒフレキシブルリンカー（Ｌ１）、続いてマウスＩＬ－１５をコードする配列（ＩＬ１５）、続いて第２のｇｌｙ／ｓｅｒフレキシブルリンカーをコードする配列（Ｌ２）からなる。ｓｃＦｖ免疫調節因子ｃＤＮＡは、フレキシブルｇｌｙ／ｓｅｒリンカー（Ｌ）によって分離された可変軽鎖（Ｖｌ）および可変重鎖（Ｖｈ）抗体配列をコードする配列、続いて６×ヒスチジンおよびヘマグルチニンタグ（Ｔ）からなる。ｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１（図示せず）を構築するための戦略は、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４と同一であった。
【図7A】免疫調節因子タンパク質分泌のウェスタン分析。培地（Ｍ）から採取した可溶性タンパク質および免疫調節因子分泌プラスミドを有するχ４５５０株の培養物由来の超音波処理した細菌（Ｂ）をゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。３つ全ての膜を、非分泌タンパク質の対照として抗ＤｎａＫ抗体でプローブした。パネルＡでは、赤色蛍光色素に融合した二次抗体を用いてＤｎａＫが同定されたが、パネルＢおよびＣでは、ＤｎａＫは緑色蛍光バンドとして検出された。パネルＡではゲルからのタンパク質を抗マウスＩＬ－１５抗体でプローブし、パネルＢおよびＣではゲルからのタンパク質を抗体でプローブして、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖのＣ末端に位置する６つの連続したヒスチジン残基を同定した。パネルＡのゲルに含まれるタンパク質ラダー（ｌａｄｄｅｒ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ ｃａｔ．９２８－４００００）の分子量（レーンＭ．Ｗ．）が示される。
【図7B】免疫調節因子タンパク質分泌のウェスタン分析。培地（Ｍ）から採取した可溶性タンパク質および免疫調節因子分泌プラスミドを有するχ４５５０株の培養物由来の超音波処理した細菌（Ｂ）をゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。３つ全ての膜を、非分泌タンパク質の対照として抗ＤｎａＫ抗体でプローブした。パネルＡでは、赤色蛍光色素に融合した二次抗体を用いてＤｎａＫが同定されたが、パネルＢおよびＣでは、ＤｎａＫは緑色蛍光バンドとして検出された。パネルＡではゲルからのタンパク質を抗マウスＩＬ－１５抗体でプローブし、パネルＢおよびＣではゲルからのタンパク質を抗体でプローブして、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖのＣ末端に位置する６つの連続したヒスチジン残基を同定した。パネルＡのゲルに含まれるタンパク質ラダー（Ｌｉ－Ｃｏｒ ｃａｔ．９２８－４００００）の分子量（レーンＭ．Ｗ．）が示される。
【図7C】免疫調節因子タンパク質分泌のウェスタン分析。培地（Ｍ）から採取した可溶性タンパク質および免疫調節因子分泌プラスミドを有するχ４５５０株の培養物由来の超音波処理した細菌（Ｂ）をゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。３つ全ての膜を、非分泌タンパク質の対照として抗ＤｎａＫ抗体でプローブした。パネルＡでは、赤色蛍光色素に融合した二次抗体を用いてＤｎａＫが同定されたが、パネルＢおよびＣでは、ＤｎａＫは緑色蛍光バンドとして検出された。パネルＡではゲルからのタンパク質を抗マウスＩＬ－１５抗体でプローブし、パネルＢおよびＣではゲルからのタンパク質を抗体でプローブして、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖのＣ末端に位置する６つの連続したヒスチジン残基を同定した。パネルＡのゲルに含まれるタンパク質ラダー（Ｌｉ－Ｃｏｒ ｃａｔ．９２８－４００００）の分子量（レーンＭ．Ｗ．）が示される。
【図8】処置の有効性。５０ｍｍ３未満と測定される最大腫瘍を有するＢＡＬＢ－ｎｅｕＴ雌マウスを、処置しないか、または材料および方法に記載されるようにＶＤＡ、ＣＢＤおよび細菌を投与した。実験中、経時的に各マウスの腫瘍サイズを測定し、総腫瘍質量を実験開始時の腫瘍質量と比較して、倍率変化を算出した。明確にするために、１標準偏差を表す正のエラーバーのみを示す。２標本両側不等分散スチューデントｔ検定を使用した２８日目の平均腫瘍量の比較では、示されたＰ値が得られた。Ａ対ＢおよびＢ対Ｃは、それらのＰ値が０．０５より大きかったため、有意差ありとはみなされなかった（ｎｄ）。
【図9】カプラン・マイヤー生存分析。図８に記載した有効性実験からのマウスの生存を、処置後９週間追跡した。腫瘍の１つが２ｃｍ３を超えたときに、マウスを安楽死させた。平均生存時間の差は、ＳＡＳ ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェアバージョン１５．１．０を用いて計算したログランクＰ値と共に報告される。Ａ対ＢおよびＡ対Ｃは、それらのＰ値が０．０５より大きかったため、有意差ありとはみなされなかった（ｎｄ）。
【図10】処置毒性。０日目からのマウスの体重変化をプロットして、処置の結果としてマウスが被った体重あたりの毒性量を示す。最大耐容量ドキソルビシンデータ（ＭＴＤドキソルビシン）は、腫瘍負荷ＢＡＬＢ－ｎｅｕＴマウスにおいて以前に公開された研究からインポートした［２７］。これらのマウスには、体表面積換算でヒトでの最大耐容量に匹敵する５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンを注射した。
【発明を実施するための形態】
【0013】
サルモネラ菌は、固形腫瘍に定着する固有の性向を有する。有意な量のサルモネラ菌を静脈内送達すると腫瘍定着率は有意に高くなるが、グラム陰性菌の毒性により多数の細菌を注射することはできない。本明細書では、毒性副作用を低下させるために更に弱毒化されているが、腫瘍に定着する有効性を維持するように遺伝子改変された、弱毒化サルモネラ菌が提供される。加えて、本明細書では、有意な抗腫瘍効果を有する様々な免疫調節因子タンパク質を発現および分泌する複数の遺伝子操作されたサルモネラ構築物が提供される。治療用量で投与される場合、これらの免疫調節因子タンパク質は毒性であり得、本送達方法は、このような毒性を低減し、更には排除する。
【0014】
自然発症腫瘍の強固な治療的定着に必要な細菌数の投与を可能にするレベルまでの毒性の低下は報告されていない。細菌株に導入されたフラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、ＬＰＳおよび外膜プロテアーゼ変異の組み合わせは、自然発症腫瘍の広範囲にわたる強固な定着を達成するのに十分な数の細菌の非毒性投与を可能にする。更に、投与された免疫調節因子タンパク質の抗がん有効性を制限する全身毒性は、複数の免疫調節因子タンパク質を直接腫瘍微小環境に同時に連続的に分泌させることによって、現在のがん免疫療法の有効性を制限する全身毒性を伴わずに対処される。
【0015】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価ないかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、方法および材料に関するいくつかの実施形態が本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、この節においてそれに関連する意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価ないかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、方法および材料に関するいくつかの実施形態が本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、この節においてそれに関連する意味を有する。
【0016】
明確さおよび簡潔な説明のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書に記載され得る。しかしながら、本発明の範囲は、記載された特徴の全てまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解されるであろう。
【0017】
本明細書における「１つの実施形態」、「一実施形態」などへの言及は、記載の実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、または特性を含み得るが、全ての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、部分、または特性を含むわけではないことを示す。更に、このような語句は、本明細書の他の部分で言及されているのと同じ実施形態を指す場合があるが、必ずしもそうである必要はない。更に、特定の態様、特徴、構造、部分、または特性が実施形態に関連して説明されている場合、明示的に説明されているか否かにかかわらず、このような態様、特徴、構造、部分、または特性を他の実施形態に用いるかもしくは結び付けることは、当業者の知識の範囲内である。
【0018】
本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で別段明確に示されない限り、複数形の指示対象を含むことを理解されたい。
本明細書で使用される「および／または」という語句は、そのように接続された要素の「いずれかまたは両方」、例えば、いくつかの場合では共同して存在し、他の場合では選言的に存在する要素を意味すると理解されたい。
本明細書で使用される「および／または」という語句は、そのように接続された要素の「いずれかまたは両方」、例えば、いくつかの場合では共同して存在し、他の場合では選言的に存在する要素を意味すると理解されたい。
【0019】
本明細書で使用される場合、「または」は、上で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、項目のリストを分離するとき、「および／または」または「または」は、包括的である、例えば、多数の項目のうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意選択で、追加の列挙されていない項目を含むものとして解釈するものとする。「のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「のうちのちょうど１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲において使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの明確に反対に示される用語のみが、多数の要素もしくは要素のリストのうちのちょうど１つの要素の包含を指す。概して、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちのちょうど１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈するものとする。
【0020】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることが意図される。
【0021】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示された値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、約１００は、９０～１１０を意味する。端点によって本明細書に記載される数値範囲は、その範囲内の全ての数値および分数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、全ての数およびその分数は、用語「約」によって修飾されると推定されることも理解されたい。
【0022】
用語「個体」、「対象」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の対象、例えば哺乳動物を指す。哺乳動物としては、ヒト、家畜、競技用動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。「対象」は、哺乳動物などの脊椎動物、例えばヒトである。哺乳動物としては、ヒト、家畜、競技用動物および伴侶動物が挙げられるが、これらに限定されない。用語「動物」に含まれるのは、イヌ、ネコ、魚、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびトリである。
【0023】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」などの用語は、本明細書において、全般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ること、例えば、障害の発症もしくは進行を停止もしくは阻害すること、または停止もしくは阻害を試みること、ならびに／または障害および／もしくはその症状の低減、抑制、退行、もしくは寛解を引き起こすこと、もしくは引き起こすことを試みることを意味するために使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。当業者によって理解されるように、種々の臨床的および科学的な方法論およびアッセイが、障害の発症または進行を評価するために使用され得、同様に、種々の臨床的および科学的な方法論およびアッセイが、障害またはその症状の低減、退行、または寛解を評価するために使用され得る。加えて、処置は、対象または細胞培養物に（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）適用され得る。
【0024】
用語「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」は、疾患、感染、状態、細胞群、タンパク質またはその発現の成長または進行を遅延、停止、または逆転させることを指す。阻害は、例えば、処置または接触の非存在下で生じる成長または進行と比較して、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９９％超であり得る。
【0025】
「発現」は、ＤＮＡからのＲＮＡの産生および／または遺伝物質（例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ））によって指示されるタンパク質の産生を指す。誘導性発現は、構成的発現（常に発現される）とは対照的に、特定の条件下、例えば、特定の分子（例えば、アラビノース）または環境条件の存在下でのみ生じる発現である。
【0026】
核酸（またはタンパク質）および宿主に関して本明細書で使用される「外因性」という用語は、天然に見出されたままの特定のタイプの細胞中に発生しない（そしてそこから得ることができない）核酸、またはそのような核酸によってコードされるタンパク質を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主内に入ると宿主に対して外因性であるとみなされる。天然に存在しない核酸は、核酸が全体として天然に存在しない場合に天然に見出される核酸配列の核酸部分配列またはフラグメントを含み得ることに留意することが重要である。例えば、発現ベクター内にゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は天然に存在しない核酸であり、したがって、その核酸分子は全体（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）として天然には存在しないため、宿主に導入されると宿主細胞に対して外因性である。したがって、全体として天然に存在しない任意のベクター、自律複製プラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、天然に存在しない核酸であるとみなされる。ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処置によって産生されたゲノムＤＮＡフラグメントおよびｃＤＮＡは、天然に見出されない別個の分子として存在するため、天然に存在しない核酸であるとみなされるということになる。したがって、外因性配列は、宿主のゲノムに組み込まれ得る。天然に見出されない配置でプロモーター配列およびポリペプチドコード配列を含む任意の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、天然に存在しない核酸であるということにもなる。天然に存在する核酸は、特定の宿主微生物に対して外因性であり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された染色体全体は、その染色体が酵母ｙの細胞に導入されると、酵母ｙの細胞に対して外因性核酸である。
【0027】
対照的に、核酸（例えば、遺伝子）（またはタンパク質）および宿主に関して本明細書で使用される用語「内因性」は、天然に見出されたままの特定の宿主において発生する（そしてそこから得ることができる）核酸（またはタンパク質）を指す。更に、核酸（またはタンパク質）を「内因的に発現する」細胞は、天然に見出されるのと同じ特定の型の宿主が発現するように、その核酸（またはタンパク質）を発現する。更に、核酸、タンパク質または他の化合物を「内因的に産生する（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「内因的に産生する（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｓ）」宿主は、天然に見出されるのと同じ特定の型の宿主が産生するように、その核酸、タンパク質または化合物を産生する。
【0028】
用語「接触」は、例えば、溶液中、反応混合物中、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、生理学的反応、化学反応、または物理的変化を引き起こすために、細胞レベルまたは分子レベルを含めて、触れる、接触させる、またはすぐ近くもしくは近くに接近させる行為を指す。
【0029】
「有効量」は、前臨床または臨床結果などの有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。本明細書に記載される化合物、生物製剤、および医薬組成物に適用される「有効量」という用語は、所望の治療結果をもたらすのに必要な量を意味する。例えば、有効量は、治療用化合物、生物製剤または組成物が投与される障害および／または疾患の症状を処置、治癒または緩和するのに有効なレベルである。求められる特定の治療目標に有効な量は、処置される障害ならびにその重症度および／または発生／進行の段階；使用される特定の化合物、生物製剤または医薬組成物の生物学的利用能および活性；投与の経路または方法ならびに対象における導入部位；特定の化合物または生物製剤のクリアランス速度および他の薬物動態学的特性；処置期間；接種レジメン；特定の化合物、生物製剤または組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；処置される対象の年齢、体重、性別、食事、生理機能および全体的な健康状態；ならびに関連する科学分野の当業者に周知の同様の因子、を含む様々な因子に応じて異なる。処置される対象の状態に応じて、投薬量のいくらかの変動が生じ得、処置を施す医師または他の個人が、いかなる場合においても、個々の患者に対する適切な用量を決定する。
【0030】
本明細書で使用される場合、「障害」は、障害、疾患もしくは状態、または健康もしくは正常な生物学的活性からの他の逸脱を指し、これらの用語は互換的に使用することができる。この用語は、正常な機能を損なう任意の状態を指す。この状態は、散発性または遺伝性の遺伝子異常によって引き起こされ得る。この状態はまた、非遺伝子異常によっても引き起こされ得る。この状態はまた、限定されないが、対象の細胞、組織、器官、系などを切断、粉砕、燃焼、穿刺、伸長、剪断、注入、または他の方法で改変するなど、環境因子による対象への傷害によって引き起こされ得る。
【0031】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は、互換的に使用され得る。これらの用語の全てはまた、それらの子孫も含み、それらは、ありとあらゆる後続の世代である。意図的な変異または偶発的な変異によって、全ての子孫が同一でなくてもよいということが理解される。
【0032】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基と、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同または相補的である遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドとからなる。
【0033】
本明細書で使用される「相補的」は、２つの核酸間、例えば、２つのＤＮＡ分子間のサブユニット配列相補性の広い概念を指す。両方の分子におけるヌクレオチド位置が、通常互いに塩基対合することができるヌクレオチドによって占められている場合、核酸は、この位置で互いに相補的であるとみなされる。したがって、２つの核酸は、分子の各々における相当な数（少なくとも５０％）の対応する位置が、通常互いに塩基対合するヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である（例えば、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）。したがって、第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域に対して逆平行である第２の核酸領域の該残基と、特異的水素結合を形成（「塩基対合」）し得ることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖に対して逆平行である第２の核酸鎖の該残基と、塩基対合し得ることが知られている。核酸の第１の領域が、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的であるのは、その２つの領域が逆平行様式で配置される場合に、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、該第１の部分および第２の部分が逆平行様式で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分中のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分中のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【0034】
「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列が、規定されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または規定されたアミノ酸配列のいずれかによる生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび巨大分子を合成するための鋳型として機能する固有の特性、ならびにそこから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子がタンパク質をコードするのは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合である。コード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に提供される）および非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される）の両方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言われ得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、特定のタンパク質またはペプチドの「本質的に純粋な」調製物は、調製物中のタンパク質またはペプチドの少なくとも約９５重量％、好ましくは少なくとも約９９重量％が特定のタンパク質またはペプチドである、調製物である。
【0036】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部分、または少なくとも１つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部分である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0037】
本明細書で使用される場合、「機能的」生物学的分子は、それが特徴付けられる特性を示す形態の生物学的分子である。機能的酵素は、例えば、酵素が特徴付けられる特徴的な触媒活性を示す、酵素である。
【0038】
本明細書で使用される「相同」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致するまたは相同である位置の数の直接関数であり、例えば、２つの化合物配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマー中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば、１０のうちの９が一致するまたは相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣ５’は、５０％の相同性を共有する。
【0039】
本明細書で使用される場合、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と同義で使用される。
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８）のアルゴリズムであり、これはＫａｒｌｉｎ およびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７）において改変されている。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトでＢＬＡＳＴツールを使用してユニバーサルリソースロケータを有するＮＣＢＩのワールドワイドウェブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と命名されている）で、以下のパラメータ：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸長ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１を使用して行い、本明細書に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と命名されている）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで、以下のパラメータ：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して行い、本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためギャップ付きアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ－Ｂｌａｓｔを用いて、繰り返し検索を行い、分子間の遠縁関係（同上）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８）のアルゴリズムであり、これはＫａｒｌｉｎ およびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７）において改変されている。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトでＢＬＡＳＴツールを使用してユニバーサルリソースロケータを有するＮＣＢＩのワールドワイドウェブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と命名されている）で、以下のパラメータ：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸長ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１を使用して行い、本明細書に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と命名されている）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで、以下のパラメータ：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して行い、本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためギャップ付きアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ－Ｂｌａｓｔを用いて、繰り返し検索を行い、分子間の遠縁関係（同上）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【0040】
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記のものと同様の技術を使用して決定することができる。同一性パーセントを計算する際に、典型的には、正確な一致がカウントされる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの長さ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの因子によって影響を受ける。
【0042】
本明細書で使用される場合、「説明資料（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、本明細書に列挙される種々の疾患または障害の緩和をもたらすためのキットにおける本発明のペプチドの有用性を伝達するために使用され得る、刊行物、記録、図表、または任意の他の表現媒体を含む。任意選択で、または代替的に、説明資料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を緩和する１つ以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の同定された化合物を収容する容器に添付されてもよく、または同定された化合物を収容する容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明資料は、説明資料および化合物がレシピエントによって協同的に使用されることを意図して、容器とは別個に出荷され得る。
【0043】
用語「核酸」は、通常、大きなポリヌクレオチドを指す。「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから構成されるか否かにかかわらず、そしてホスホジエステル結合または修飾結合、例えば、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびこのような結合の組み合わせから構成されるか否かにかかわらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も具体的に含む。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。更に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および類似の用語はまた、核酸アナログ、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。例えば、当該技術分野において知られており、そして骨格においてホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であるとみなされる。「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから構成されるか否かにかかわらず、そしてホスホジエステル結合または修飾結合、例えば、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびこのような結合の組み合わせから構成されるか否かにかかわらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）以外の塩基から構成される核酸を具体的に含む。本明細書では、ポリヌクレオチド配列を記載するのに以下の従来の表記法が使用されている：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物への５’から３’へのヌクレオチド付加方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれる；ＤＮＡ上の基準点の５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれる；ＤＮＡ上の基準点の３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【0045】
本明細書で使用される用語「核酸構築物」は、ゲノム法によって得られたものであるか合成法によって得られたものであるかにかかわらず、所望の特定の遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。
【0046】
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【0047】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、短いポリヌクレオチドを意味し、概ね、約５０ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これは「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むと理解される。
【0048】
「実質的に相同な核酸配列」とは、参照核酸配列に対応する核酸配列であって、該対応する配列が、参照核酸配列によってコードされるペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するペプチドをコードする、例えば、ペプチド機能に有意には影響を及ぼさないアミノ酸の変化のみが生じるペプチドをコードする、核酸配列を意味する。好ましくは、実質的に同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされるペプチドをコードする。実質的に類似の核酸配列と参照核酸配列との間の同一性のパーセンテージは、少なくとも約５０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上である。核酸配列の実質的同一性は、例えば、物理的／化学的方法（すなわち、ハイブリダイゼーション）によって、またはコンピュータアルゴリズムを介した配列アラインメントによって、２つの配列の配列同一性を比較することにより決定することができる。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列と実質的に類似しているかどうかを判定するための好適な核酸ハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：５０℃での７％ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡであり、５０℃での２×標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；好ましくは、５０℃での７％（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中であり、５０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；好ましくは、５０℃での７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡであり、５０℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；より好ましくは、５０℃での７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中であり、６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。２つの核酸配列間の実質的な類似性を決定するための好適なコンピュータアルゴリズムとしては、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）、およびＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９０ ８７：１４：５５０９－１３；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ ２１５：３：４０３－１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）が挙げられる。これらのプログラムで提供されるデフォルト設定は、本発明の目的のための核酸配列の実質的な類似性を決定するのに好適である。
【0049】
２つのポリヌクレオチドを「作動可能に連結された」と記載することは、一本鎖または二本鎖の核酸部分が、２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、それが特徴とする生理学的効果を他方に対して及ぼすことができるような様式で核酸部分内に配置された２つのポリヌクレオチドを含むことを意味する。例として、遺伝子のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
【0050】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、適切な化合物または誘導体と組み合わせることができ、組み合わせた後に適切な化合物を対象に投与するために使用することができる化学的組成物を意味する。「薬学的に許容される」とは、ヒトまたは獣医学的適用のいずれかについて、生理学的に耐容されることを意味する。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「精製された」および類似の用語は、分子または化合物の、天然環境において通常その分子または化合物に伴う他の成分に対する濃縮（富化）（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に関する。用語「精製された」は、特定の分子の完全な純度がプロセス中に達成されたことを必ずしも示さない。本明細書で使用される「高度に精製された」化合物は、純度が９０％を超える化合物を指す。具体的には、精製された精子細胞ＤＮＡは、精製された精子細胞ＤＮＡのＰＣＲ増幅と、その増幅されたＤＮＡのその後の分析の際に、有意な検出可能レベルの非精子細胞ＤＮＡを産生しないＤＮＡを指す。「有意な検出可能レベル」は、提示されたデータにおいて視認でき、法医学的証拠の分析中に対処／説明が必要となる夾雑物質の量である。
【0052】
「組換えポリヌクレオチド」は、天然では一緒に連結されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅または組み立てられた組換えポリヌクレオチドは、好適なベクターに含まれ得、そしてこのベクターは、好適な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【0053】
組換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）も果たし得る。
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞において発現される遺伝子は、「組換えポリペプチド」を産生する。
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞において発現される遺伝子は、「組換えポリペプチド」を産生する。
【0054】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現の際に産生されるものである。
「組換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。また、トランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、細胞が導入遺伝子を含むトランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラ哺乳動物から得られた細胞、トランスジェニック哺乳動物またはその胎児もしくは胎盤組織から得られた細胞、および導入遺伝子を含む原核細胞を包含するが、これらに限定されない。
「組換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。また、トランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、細胞が導入遺伝子を含むトランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラ哺乳動物から得られた細胞、トランスジェニック哺乳動物またはその胎児もしくは胎盤組織から得られた細胞、および導入遺伝子を含む原核細胞を包含するが、これらに限定されない。
【0055】
「調節する」という用語は、目的の機能または活性を、刺激することまたは阻害することを指す。
本明細書で使用される「標準」という用語は、比較するために使用されるものを指す。例えば、それは、試験化合物を投与する場合に結果を比較するために投与および使用される公知の標準的な薬剤もしくは化合物であってもよく、パラメータもしくは機能に対する薬剤もしくは化合物の効果を測定する場合に対照値を得るために測定される標準的なパラメータもしくは機能であってもよい。標準はまた、「内部標準」、例えば、試料に既知の量で添加され、そして試料が処理された、または精製もしくは抽出手順に供された後に目的のマーカーが測定される際に、精製率または回収率などを決定するのに有用である薬剤または化合物も指し得る。内部標準は、多くの場合、放射性同位体などで標識された目的の精製マーカーであり、内因性マーカーと区別することができる。
本明細書で使用される「標準」という用語は、比較するために使用されるものを指す。例えば、それは、試験化合物を投与する場合に結果を比較するために投与および使用される公知の標準的な薬剤もしくは化合物であってもよく、パラメータもしくは機能に対する薬剤もしくは化合物の効果を測定する場合に対照値を得るために測定される標準的なパラメータもしくは機能であってもよい。標準はまた、「内部標準」、例えば、試料に既知の量で添加され、そして試料が処理された、または精製もしくは抽出手順に供された後に目的のマーカーが測定される際に、精製率または回収率などを決定するのに有用である薬剤または化合物も指し得る。内部標準は、多くの場合、放射性同位体などで標識された目的の精製マーカーであり、内因性マーカーと区別することができる。
【0056】
従来の分子生物学技術を伴う方法が本明細書に記載されている。そのような技法は、当該技術分野において概ね知られており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的更新あり）などの方法論の論文で詳細に記述されている。核酸の化学合成のための方法は、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９－１８６２，１９８１、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１で考察されている。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることが意図される。
【0058】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、米国特許法に基づく意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」などは、限定なしに含むことを意味する。
【0059】
細菌
本発明において有用な細菌としては、サルモネラ菌が挙げられるが、これに限定されない。
本発明において有用な細菌としては、サルモネラ菌が挙げられるが、これに限定されない。
【0060】
本発明で使用することができるサルモネラ菌株の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７２５１）およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１１）が挙げられる。弱毒化サルモネラ菌株としては、Ｓ．ｔｙｐｈｉ－ａｒｏＣ－ａｒｏＤ（Ｈｏｎｅら、Ｖａｃｃ．９：８１０（１９９１）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ－ａｒｏＡ変異型（ｍｕｔａｎｔ）（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉら、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：４７７（１９９２））およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ７２０７が挙げられる。本発明で使用することができる更なる弱毒化サルモネラ菌株には、１つ以上の他の弱毒化変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、例えば、（ｉ）栄養要求性変異、例えば、ａｒｏ（Ｈｏｉｓｅｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，２９１：２３８－２３９（１９８１））、ｇｕａ（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈ．，３：１２９－１４１（１９８７））、ｎａｄ（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂａｃｔ，１７０：３７２５－３７３０（１９８８）、ｔｈｙ（Ｎｎａｌｕｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：９５５－９６２（１９８７））、およびａｓｄ（Ｃｕｒｔｉｓｓ，上記）変異；（ｉｉ）全体的な調節機能を不活性化する変異、例えばｃｙａ（Ｃｕｒｔｉｓｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：３０３５－３０４３（１９８７））、ｃｒｐ（Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８７）、上記）、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ（Ｇｒｏｉｓｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：７０７７－７０８１（１９８９）；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５０５４－５０５８（１９８９））、ｐｈｏｐ．ｓｕｐ．ｃ（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔ，１７２：２４８５－２４９０（１９９０））またはｏｍｐＲ（Ｄｏｒｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７：２１３６－２１４０（１９８９））変異；（ｉｉｉ）ストレス応答を改変する変異、例えば、ｒｅｃＡ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒら、ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏ．，７：９３３－９３６（１９９３））、ｈｔｒＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏ．，５：４０１－４０７（１９９１））、ｈｔｐＲ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１００：８９４－９００（１９８１））、ｈｓｐ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，１８：２９５－３２９（１９８４））およびｇｒｏＥＬ（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒら、Ｓｃｉ．，２４８：７３０－７３２（１９９０））変異；特定の病原性因子における変異、例えば、ＩｓｙＡ（Ｌｉｂｂｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：４８９－４９３（１９９４））、ｐａｇまたはｐｒｇ（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）、上記；およびＭｉｌｌｅｒら（１９８９）、上記）、ｉｓｃＡまたはｖｉｒＧ（ｄ’Ｈａｕｔｅｖｉｌｌｅら、ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏ．，６：８３３－８４１（１９９２））、ｐｌｃＡ（Ｍｅｎｇａｕｄら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：３６７－７２（１９９１）；Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１７３：７５１－７５４（１９９１））、およびａｃｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０－１１８９４（１９９３））変異；（ｖ）ＤＮＡトポロジーに影響を及ぼす変異、例えば、ｔｏｐＡ（Ｇａｌａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１８７９－１８８５（１９９０））；（ｖｉ）細胞周期を破壊または改変する変異、例えば、ｍｉｎ（ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｃｅｌｌ，５６：６４１－６４９（１９８９））；（ｖｉｉ）自殺システムをコードする遺伝子の導入、例えば、ｓａｃＢ（Ｒｅｃｏｒｂｅｔら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，５９：１３６１－１３６６（１９９３）；Ｑｕａｎｄｔら、Ｇｅｎｅ，１２７：１５－２１（１９９３））、ｎｕｃ（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．，６０：３７４６－３７５１（１９９４））、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ、またはｐｈｌＡ（Ｍｏｌｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：１３９－１６６（１９９３））；（ｖｉｉｉ）リポ多糖および／またはリピドＡの生合成を改変する変異、例えば、ｒＦｂ（Ｒａｅｔｚ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，Ｅｄ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．ｐｐ１０３５－１０６３（１９９６））、ｇａｌＥ（Ｈｏｎｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５６：１６４－１６７（１９８７））およびｈｔｒＢ（Ｒａｅｔｚ、上記）、ｍｓｂＢ（Ｒｅａｔｚ、上記；および米国特許第７，５１４，０８９号）；ならびに（ｉｘ）バクテリオファージ溶解系、例えば、Ｐ２２によってコードされる溶原菌（Ｒｅｎｎｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌ，１４３：２８０－２８９（１９８５））、ラムダムレイントランスグリコシラーゼ（Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋａ－Ｓｚｅｗｃｚｙｋら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１８４：１１１－１１４（１９８１））またはＳ－遺伝子（Ｒｅａｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌ，４３：６２３－６２８（１９７１））の導入が含まれる。
【0061】
弱毒化変異は、構成的に発現されるか、または誘導性プロモーターの制御下のいずれかであり得、誘導性プロモーターとしては、例えば以下である：温度感受性熱ショックファミリーのプロモーター（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、上記）、または嫌気的に誘導されたｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６：２８０５－２８１３（１９９２））、または抑制的プロモーター、例えば、ｕａｐＡ（Ｇｏｒｆｉｎｋｉｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２３３７６－２３３８１（１９９３））もしくはｇｃｖ（Ｓｔａｕｆｆｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７６：６１５９－６１６４（１９９４））。
【0062】
一実施形態において、細菌株は、ＶＮＰ２０００９、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの派生株である。その遺伝子ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩの２つの欠失は、その完全な弱毒化（動物宿主における毒性ショックを防止することによる）と、生存のためのプリンの外部供給源への依存と、をもたらした。この依存性により、この生命体は肝臓や脾臓などの正常組織では複製できなくなるが、プリン体が利用可能な腫瘍では依然として増殖可能である。別の実施形態において、細菌株はＳＬ３２６１またはχ１１０９１である。
【0063】
ベクター／プラスミド
本発明の組成物および／または方法において、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質は、組換え法によって産生され得る。核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクター成分としては、概して、以下：複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、ならびに転写終結配列およびコード配列、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、例えば、サルモネラ菌において、遺伝子および／またはプロモーター（目的の配列）は、宿主細胞染色体に組み込まれてもよく、または例えばプラスミド／ベクター上に存在してもよい。
本発明の組成物および／または方法において、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質は、組換え法によって産生され得る。核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクター成分としては、概して、以下：複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、ならびに転写終結配列およびコード配列、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、例えば、サルモネラ菌において、遺伝子および／またはプロモーター（目的の配列）は、宿主細胞染色体に組み込まれてもよく、または例えばプラスミド／ベクター上に存在してもよい。
【0064】
発現ベクターは通常、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培養培地中で成長させた形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手することができない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【0065】
発現ベクターは、宿主生命体によって認識され、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターは、それらが作動可能に連結されている特定の核酸配列の転写を制御する構造遺伝子（概ね約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列である。細菌細胞では、全体的な調節を制御する領域はオペレーターと呼ばれ得る。プロモーターは、典型的には、誘導性および構成的の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、それらの制御下で、培養条件のいくらかの変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化に応答して、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
【0066】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターとしては、β－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター、ならびに飢餓プロモーター（Ｍａｔｉｎ，Ａ．（１９９４）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＩ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７２２：２７７－２９１）が挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適している。そのようなヌクレオチド配列は公開されており、それによって当業者がそれらをＤＮＡコード配列に作動可能にライゲートすることを可能にする。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、コード配列に作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含み得る。
【0067】
１つ以上の上記成分を含む好適なベクターの構築は、標準的なライゲート技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とされるプラスミドを生成するために所望の形態で切断され、調整され（ｔａｉｌｏｒｅｄ）、そして再ライゲートされる。
【0068】
本発明のいくつかの実施形態において、発現ベクターは、サルモネラ菌における使用に好適なプラスミドまたはバクテリオファージベクターであり、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質は、患者に投与された操作されたサルモネラ菌（一態様において減弱化された）による発現を通じて対象に提供される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸を指し、鎖状または環状核酸および二本鎖または一本鎖核酸を含む。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含んでもよく、メチル化、または保護基もしくはキャップもしくはテール構造の包含によって化学的に修飾されてもよい。
【0069】
がんの処置
サルモネラ菌などの細菌は、固形腫瘍などのがんに対して天然の向性を有する。本発明の方法を使用して処置することができるがんの種類としては、固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌種、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽種、および網膜芽腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
サルモネラ菌などの細菌は、固形腫瘍などのがんに対して天然の向性を有する。本発明の方法を使用して処置することができるがんの種類としては、固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌種、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽種、および網膜芽腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0070】
いくつかの態様において、対象は、本明細書に記載される細菌細胞の投与前、投与後、または投与中に、放射線、手術、および／または化学療法で処置される。
投与
本発明は、本明細書に記載される弱毒化サルモネラ菌株の投与、および医薬組成物を調製し、それを投与する方法も含む。このような方法は、薬学的に許容される担体を、本明細書に記載される１つ以上の弱毒化サルモネラ菌株と共に製剤化することを含む。
投与
本発明は、本明細書に記載される弱毒化サルモネラ菌株の投与、および医薬組成物を調製し、それを投与する方法も含む。このような方法は、薬学的に許容される担体を、本明細書に記載される１つ以上の弱毒化サルモネラ菌株と共に製剤化することを含む。
【0071】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。
【0072】
静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であることが必要とされ、また、他の（望まない）微生物の夾雑作用から保護されることが必要とされる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【0073】
注射液は、上述した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込むことによって調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記の様々な他の成分を含有するビヒクルに組み込むことによって調製される。注射液を調製するための粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分にこれまでに得られた任意の更なる所望の成分を加えた粉末が得られる。
【0074】
経口組成物は、概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。例えば、それらはゼラチンカプセルに封入することができる。経口治療投与の場合、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。
【0075】
薬学的に適合性の結合剤、および／または補助材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または同様の性質の化合物：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味剤、のいずれかを含有することができる。
【0076】
吸入による投与の場合、細菌は、好適な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）を収容する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【0077】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、透過される障壁に対して適切な浸透剤が、製剤において使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において概ね知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成することができる。経皮投与の場合、細菌は、当該技術分野において概ね知られているように軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【0078】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する技術に固有の制限によって規定され、直接左右される。
【0079】
患者に投与される場合、弱毒化サルモネラ菌は、単独で使用され得るか、または任意の生理学的担体と組み合わせられ得る。概して、投与量は、約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０１２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ、任意選択で、約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１×１０２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１×１０４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１×１０５ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０１２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１×１０５ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；任意選択で、約１×１０５ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ～約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇの範囲である。
【実施例】
【0080】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を実証し、更に例示するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例Ｉ
自然発症腫瘍の非毒性の全身的な定着のために操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
序論
前臨床研究では、多数の抗がん機構を発現するように遺伝子操作され病原性を弱められたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の株が、有効性を示した（１）。前臨床研究は、主に、予め形成されたがん組織の移植またはがん細胞株の注入から腫瘍が発生するマウスモデルに依存している。これらの腫瘍はげっ歯類において急速に発生し、腫瘍発生から数週間以内に安楽死させることが要求される。これらの腫瘍の定着は強固であり、多くの場合、腫瘍組織１グラム当たり１×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）を超える細菌に達する（２）。
実施例Ｉ
自然発症腫瘍の非毒性の全身的な定着のために操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
序論
前臨床研究では、多数の抗がん機構を発現するように遺伝子操作され病原性を弱められたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の株が、有効性を示した（１）。前臨床研究は、主に、予め形成されたがん組織の移植またはがん細胞株の注入から腫瘍が発生するマウスモデルに依存している。これらの腫瘍はげっ歯類において急速に発生し、腫瘍発生から数週間以内に安楽死させることが要求される。これらの腫瘍の定着は強固であり、多くの場合、腫瘍組織１グラム当たり１×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）を超える細菌に達する（２）。
【0081】
残念ながら、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍがんの静脈内治療の初期の臨床試験は期待外れであり、その一因は自然発症（自然発生）ヒト腫瘍の細菌定着が乏しかったことである（３～５）。前臨床移植腫瘍モデルとは対照的に、自然発生腫瘍は数ヶ月から数年にわたって発達し、より成熟した脈管構造および限定された壊死空間を伴い（６、７）、これは、臨床試験において見られた細菌による比較的乏しい定着を説明し得る。サルモネラ菌の多くの弱毒株が前臨床の細菌がん治療研究に用いられてきたが、いずれも全身送達による自然発症腫瘍の定着に最適化されたものではなかった。発表されているサルモネラ菌がん治療の研究のほとんどは、移植されたがん組織またはがん細胞のボーラス投与から発生した腫瘍を伴う動物モデルにおけるものであった。最近の例としては、ＶＮＰ２０００９（８、９）、Ａ１－Ｒ（１０、１１）、ＳＬ３２６１（１２、１３）およびｖ４５５０（１４、１５）が挙げられる。また、これらの研究の多くは、必然的に免疫不全動物において行われている。例えば、患者由来の同所性異種移植マウスモデル（１６）においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株Ａ１－Ｒを用いた実験は、自然発症腫瘍の定着を再現しておらず、インタクトな免疫系の患者において免疫応答を正確に評価できない。
【0082】
これまでの研究では、遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）における自然発症腫瘍の強固な細菌定着は、脈管構造破壊剤（ＶＤＡ）で腫瘍をプレコンディショニングして壊死空間の増加を確立することによって改善され得ることが示されている（１７）。しかしながら、細菌の投与を増加させることによって、ＶＤＡでコンディショニングされた自然発症腫瘍の一貫した広範囲にわたる定着を達成しようとする試みは、毒性によって制限された。この制限を克服するために、本明細書では、免疫原性がより低いＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの操作された株が提供された。本明細書では、全身毒性が低減され、ＶＤＡでコンディショニングされた自然発症腫瘍の強固な定着が可能なＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株の発生についての報告が記載される。
【0083】
材料および方法
プラスミドの特徴を表１に列挙する。プラスミドｐＹＡ２９２（１８）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化、および平滑化末端のライゲーションによる再環状化によってプラスミドｐＮＧを構築し、ＬａｃＺ－αペプチドの発現を除去した。プライマーＬａｃＦｗｄおよびＬａｃＲｅｖを用いてＬａｃＵＶ５プロモーター配列を含有するｐＹＡ２９２からのＰＣＲ生成フラグメントを、プライマーＬｕｘＦｗｄおよびＬｕｘＲｅｖを用いてプラスミドｐＡＫｌｕｘ２（１９）からＰＣＲによって増幅されたｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンにライゲートすることによって、プラスミドｐＬｕｘを構築した。プラスミドｐＬｕｘ中のＬａｃＵＶ５プロモーターを腫瘍特異的プロモーターＰｆｌＥＰ（２０）およびＦＦ＋２０＊（２１）で置き換えることによって、プラスミドｐＰｆｌＥＰＬｕｘおよびｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘを構築した。ＰｆｌＥＰおよびＦＦ＋２０＊配列を有するｇＢｌｏｃｋｓをＤｒａＩＩＩおよびＢｌｐＩで消化した。得られたフラグメントを、ＤｒａＩＩＩおよびＢｌｐＩで消化され、アルカリホスファターゼで処置されたｐＬｕｘにライゲートした。制限酵素消化、ライゲーションおよびアルカリホスファターゼ処置は、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のガイドラインに従った。プライマーおよびｇＢｌｏｃｋｓは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手した。プラスミド構築に使用した全ての合成分子のＤＮＡ配列については表２を参照されたい。
プラスミドの特徴を表１に列挙する。プラスミドｐＹＡ２９２（１８）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化、および平滑化末端のライゲーションによる再環状化によってプラスミドｐＮＧを構築し、ＬａｃＺ－αペプチドの発現を除去した。プライマーＬａｃＦｗｄおよびＬａｃＲｅｖを用いてＬａｃＵＶ５プロモーター配列を含有するｐＹＡ２９２からのＰＣＲ生成フラグメントを、プライマーＬｕｘＦｗｄおよびＬｕｘＲｅｖを用いてプラスミドｐＡＫｌｕｘ２（１９）からＰＣＲによって増幅されたｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンにライゲートすることによって、プラスミドｐＬｕｘを構築した。プラスミドｐＬｕｘ中のＬａｃＵＶ５プロモーターを腫瘍特異的プロモーターＰｆｌＥＰ（２０）およびＦＦ＋２０＊（２１）で置き換えることによって、プラスミドｐＰｆｌＥＰＬｕｘおよびｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘを構築した。ＰｆｌＥＰおよびＦＦ＋２０＊配列を有するｇＢｌｏｃｋｓをＤｒａＩＩＩおよびＢｌｐＩで消化した。得られたフラグメントを、ＤｒａＩＩＩおよびＢｌｐＩで消化され、アルカリホスファターゼで処置されたｐＬｕｘにライゲートした。制限酵素消化、ライゲーションおよびアルカリホスファターゼ処置は、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のガイドラインに従った。プライマーおよびｇＢｌｏｃｋｓは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手した。プラスミド構築に使用した全ての合成分子のＤＮＡ配列については表２を参照されたい。
【0084】
【表1】
【0085】
【表2】
【0086】
細菌株
関連する遺伝子型および供給源を含め、細菌株を表１に列挙する。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＶＮＰ２０００９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）。株ＳＬ３２６１は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅから入手した（ＳＧＳＣ＃４３９）。ファージｋ Ｒｅｄリコンビナーゼ法（２２）ならびに２つのＰＣＲプライマーＤＳｆｗｄおよびＤＳｒｅｖ（表２）を使用して、ＳＬ３２６１の染色体からアスパラギン酸－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）遺伝子を欠失することによって、株ＢＣＴ１を構築した。腫瘍定着を測定する場合、細菌は生物発光のためのｌｕｘオペロン（２３）を含むプラスミドで形質転換された。χ１１０９１からｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、およびｒｆａＬ遺伝子を欠失させ（２４）、χ１１０９１染色体内のｐｇｔＥプロモーターに一ヌクレオチド変化を導入することによって、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ２を構築した。ＤＩＲｅｘ法（２５）によってχ１１０９１にこれらの変異を導入するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表２に列挙する。
関連する遺伝子型および供給源を含め、細菌株を表１に列挙する。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＶＮＰ２０００９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）。株ＳＬ３２６１は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅから入手した（ＳＧＳＣ＃４３９）。ファージｋ Ｒｅｄリコンビナーゼ法（２２）ならびに２つのＰＣＲプライマーＤＳｆｗｄおよびＤＳｒｅｖ（表２）を使用して、ＳＬ３２６１の染色体からアスパラギン酸－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）遺伝子を欠失することによって、株ＢＣＴ１を構築した。腫瘍定着を測定する場合、細菌は生物発光のためのｌｕｘオペロン（２３）を含むプラスミドで形質転換された。χ１１０９１からｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、およびｒｆａＬ遺伝子を欠失させ（２４）、χ１１０９１染色体内のｐｇｔＥプロモーターに一ヌクレオチド変化を導入することによって、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ２を構築した。ＤＩＲｅｘ法（２５）によってχ１１０９１にこれらの変異を導入するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表２に列挙する。
【0087】
細菌成長条件
ＢＣＴ１を伴う実験では、株をプラスミドｐＮＧで形質転換し、新鮮な対数増殖期中期の溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ（ＬＢ）培養液から細菌注射剤を調製した。培養物を、３，５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ペレット化し、必要な濃度で再度再懸濁した。株ＢＣＴ２またはＶＮＰ２０００９を伴う実験では、株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）について示したように培養物を成長させることによって細菌注射剤を調製したが、最終細胞再懸濁は冷却した２０％グリセロール／ＰＢＳ（体積／体積）中で行い、細胞試料を－８０℃で保存した。凍結グリセロールストックを解凍し、使用前に所望の濃度までＰＢＳ中に希釈した。動物注射後、注射された細菌の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、３７℃でＬＢ寒天上に希釈プレーティングすることによって検証した。
ＢＣＴ１を伴う実験では、株をプラスミドｐＮＧで形質転換し、新鮮な対数増殖期中期の溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ（ＬＢ）培養液から細菌注射剤を調製した。培養物を、３，５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ペレット化し、必要な濃度で再度再懸濁した。株ＢＣＴ２またはＶＮＰ２０００９を伴う実験では、株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）について示したように培養物を成長させることによって細菌注射剤を調製したが、最終細胞再懸濁は冷却した２０％グリセロール／ＰＢＳ（体積／体積）中で行い、細胞試料を－８０℃で保存した。凍結グリセロールストックを解凍し、使用前に所望の濃度までＰＢＳ中に希釈した。動物注射後、注射された細菌の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、３７℃でＬＢ寒天上に希釈プレーティングすることによって検証した。
【0088】
動物実験
以前に記載されたように（２６）、ＢＡＬＢ－ｎｅｕＴコロニーの維持および管理を行った。各データポイントに使用したマウスの数は、図のキャプションに提供される。腫瘍を外部キャリパーによって測定し、腫瘍体積を０．５（長さ×幅２）として算出した。全ての薬剤を、個々の実験で示された濃度および投与スケジュールで、ＰＢＳ中１００マイクロリットルの注射によってマウスに非経口投与した。細菌を尾静脈（ＩＶ）に注射した。血管破壊剤（ＶＤＡ）を、示されるように、ＩＶまたは腹腔内（ＩＰ）のいずれかで注射した。ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ；ＳＦ２０４、Ｓｅｌｌｅｃｋ）をＩＶ投与し、ＶＤＡ ＣＫＤ－５１６（Ａ０７．０２０．５４８、Ａｕｒｏｒａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＩＰ投与した。抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）モノクローナル抗体（ＭＰ５－２０Ｆ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をＩＰ注射した。発光細菌で処置したマウスにおける腫瘍の放射輝度（ｒａｄｉａｎｃｅ）を測定するために、マウスを酸素中３％のイソフルラン吸入によって麻酔し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して画像化した。全光束（ルミネセンス）を６０秒間取得し、目的の腫瘍の放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として記録した。
以前に記載されたように（２６）、ＢＡＬＢ－ｎｅｕＴコロニーの維持および管理を行った。各データポイントに使用したマウスの数は、図のキャプションに提供される。腫瘍を外部キャリパーによって測定し、腫瘍体積を０．５（長さ×幅２）として算出した。全ての薬剤を、個々の実験で示された濃度および投与スケジュールで、ＰＢＳ中１００マイクロリットルの注射によってマウスに非経口投与した。細菌を尾静脈（ＩＶ）に注射した。血管破壊剤（ＶＤＡ）を、示されるように、ＩＶまたは腹腔内（ＩＰ）のいずれかで注射した。ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ；ＳＦ２０４、Ｓｅｌｌｅｃｋ）をＩＶ投与し、ＶＤＡ ＣＫＤ－５１６（Ａ０７．０２０．５４８、Ａｕｒｏｒａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＩＰ投与した。抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）モノクローナル抗体（ＭＰ５－２０Ｆ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をＩＰ注射した。発光細菌で処置したマウスにおける腫瘍の放射輝度（ｒａｄｉａｎｃｅ）を測定するために、マウスを酸素中３％のイソフルラン吸入によって麻酔し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して画像化した。全光束（ルミネセンス）を６０秒間取得し、目的の腫瘍の放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として記録した。
【0089】
略語
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ＧＥＭＭ：遺伝子操作されたマウスモデル；ＶＤＡ：血管破壊剤；ＬＢ：溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｃｆｕ：コロニー形成単位；ＩＶ：静脈内；ＩＰ：腹腔内；ＣＡ４Ｐ：コンブレタスタチンＡ－４ホスフェート；ＩＬ－６：インターロイキン－６；ＣＲＳ：サイトカイン放出症候群；ＰＡＭＰ：病原体関連分子パターン。
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ＧＥＭＭ：遺伝子操作されたマウスモデル；ＶＤＡ：血管破壊剤；ＬＢ：溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｃｆｕ：コロニー形成単位；ＩＶ：静脈内；ＩＰ：腹腔内；ＣＡ４Ｐ：コンブレタスタチンＡ－４ホスフェート；ＩＬ－６：インターロイキン－６；ＣＲＳ：サイトカイン放出症候群；ＰＡＭＰ：病原体関連分子パターン。
【0090】
結果
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの内在性毒性の除去
ヒトの臨床試験における最大耐容量を推定する場合、毒物学文献では、げっ歯類における医薬品の短期（７日間）投与試験における急性体重減少の上限が１０％と定義されている（２７）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）をＶＤＡと共にＩＶ投与した際に観察された毒性は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）によるものではないかと疑い、インターロイキン－６（ＩＬ－６）受容体活性化に拮抗する抗体の投与を伴う、ＣＲＳによる毒性を軽減することが報告されている治療法を適用した（２８）。抗ＩＬ－６抗体で処置したマウスは、１×１０６ｃｆｕのＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）＋ＶＤＡのＩＶ投与に無害な毒性（＜１０％の体重減少）で耐容性を示したのに対して、抗ＩＬ－６抗体なしのマウス３匹のうち２匹では、許容できない１８％の体重減少および死亡が認められた（図１の第４列および第５列）。５×１０５ｃｆｕの細菌の投与は毒性が低かったが、抗ＩＬ－６抗体を用いてまたは用いずに処置したマウスと比較した場合、体重減少百分率（％）において同様の差が見られた（図１の第２列および第３列）。
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの内在性毒性の除去
ヒトの臨床試験における最大耐容量を推定する場合、毒物学文献では、げっ歯類における医薬品の短期（７日間）投与試験における急性体重減少の上限が１０％と定義されている（２７）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）をＶＤＡと共にＩＶ投与した際に観察された毒性は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）によるものではないかと疑い、インターロイキン－６（ＩＬ－６）受容体活性化に拮抗する抗体の投与を伴う、ＣＲＳによる毒性を軽減することが報告されている治療法を適用した（２８）。抗ＩＬ－６抗体で処置したマウスは、１×１０６ｃｆｕのＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＢＣＴ１（ｐＮＧ）＋ＶＤＡのＩＶ投与に無害な毒性（＜１０％の体重減少）で耐容性を示したのに対して、抗ＩＬ－６抗体なしのマウス３匹のうち２匹では、許容できない１８％の体重減少および死亡が認められた（図１の第４列および第５列）。５×１０５ｃｆｕの細菌の投与は毒性が低かったが、抗ＩＬ－６抗体を用いてまたは用いずに処置したマウスと比較した場合、体重減少百分率（％）において同様の差が見られた（図１の第２列および第３列）。
【0091】
ＩＬ－６シグナル伝達の遮断による毒性の低下が観察された場合、免疫細胞からのＩＬ－６分泌を誘導することが知られているＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ表面分子をコードする遺伝子を変異させて、無害な毒性で増加させた細菌量の投与を可能にし、ＣＲＳが回避された。葉酸栄養要求性によって病原性が弱められ、ｔｏｌｌ様受容体４のリポ多糖活性化の低減のために操作された株であるＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍχ１１０９１（２４）から開始し、ＩＬ－６分泌の誘導に関与する更なる表面分子をコードする遺伝子を欠失させた。フラジェリン遺伝子ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠失させ（２９）、同様に、フィンブリアのマルトース受容体結合アドヘシンサブユニットをコードするｆｉｍＨも欠失させた（３０）。加えて、Ｏ抗原は、ｒｆａＬの欠失によって排除された（３１，３２）。最後に、ｐｇｔＥの転写プロモーター配列を改変して、補体活性化を阻害するＰｇｔＥ外膜プロテアーゼの発現を増加させた（３３）。得られた株をＢＣＴ２と名付けた（図２）。
【0092】
ＢＣＴ２株の毒性
非腫瘍負荷マウスを使用して、多くの前臨床研究およびＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍがん治療のいくつかの臨床試験で使用されている株であるＶＮＰ２０００９株と比較して、ＢＣＴ２株の毒性を試験した（１、３～５）。非腫瘍負荷マウスを１×１０６ｃｆｕのこれらの株で処置することにより、ＢＣＴ２（ｐＰｆｌＥＰＬｕｘ）で５％未満の体重減少、ＶＮＰ２０００９で１０％未満の体重減少をもたらした（図３）。ｐＰｆｌＥＰＬｕｘプラスミドを、この実験において、染色体ａｓｄ変異を補完するためのａｓｄ遺伝子の供給源として使用し、非抗生物質平衡致死性プラスミド維持をもたらした（３４）。１×１０７ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＰｆｌＥＰＬｕｘ）による処置は、３日後に約１２％の体重減少をもたらしたが、７日後に約１０％の体重減少に回復した。１×１０７ｃｆｕの株ＶＮＰ２０００９の同一の投与は、３日後に１５％の体重減少、そして７日後に２５％近くの体重減少をもたらした（図３）。これらの結果は、株ＢＣＴ２が株ＶＮＰ２０００９よりも有意に毒性が低いことを示す。
非腫瘍負荷マウスを使用して、多くの前臨床研究およびＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍがん治療のいくつかの臨床試験で使用されている株であるＶＮＰ２０００９株と比較して、ＢＣＴ２株の毒性を試験した（１、３～５）。非腫瘍負荷マウスを１×１０６ｃｆｕのこれらの株で処置することにより、ＢＣＴ２（ｐＰｆｌＥＰＬｕｘ）で５％未満の体重減少、ＶＮＰ２０００９で１０％未満の体重減少をもたらした（図３）。ｐＰｆｌＥＰＬｕｘプラスミドを、この実験において、染色体ａｓｄ変異を補完するためのａｓｄ遺伝子の供給源として使用し、非抗生物質平衡致死性プラスミド維持をもたらした（３４）。１×１０７ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＰｆｌＥＰＬｕｘ）による処置は、３日後に約１２％の体重減少をもたらしたが、７日後に約１０％の体重減少に回復した。１×１０７ｃｆｕの株ＶＮＰ２０００９の同一の投与は、３日後に１５％の体重減少、そして７日後に２５％近くの体重減少をもたらした（図３）。これらの結果は、株ＢＣＴ２が株ＶＮＰ２０００９よりも有意に毒性が低いことを示す。
【0093】
細菌定着のための腫瘍脈管構造のコンディショニング
腫瘍負荷マウスをＶＤＡで前処置して、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの通性嫌気性菌による定着のために腫瘍内の低酸素壊死空間を増加させた場合、３×１０６ｃｆｕの株ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）の投与は、全ての処置マウスにおいて少なくとも１つの腫瘍の定着をもたらさなかった（データは示さず）。ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘプラスミドは、染色体ａｓｄ変異を補完するためのａｓｄ遺伝子と、全身の生物発光によって細菌を追跡するための発現ｌｕｘオペロンとを含有する。したがって、ＶＤＡ前処置に加えて、ＶＤＡの細菌後投与を追加して、腫瘍内の細菌を「トラップ」した。－４、－３、－２および－１日目にＶＤＡを投与した後０日目に投与された３×１０６ｃｆｕの株ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）の毒性および定着を、３×１０６ｃｆｕの細菌をパルス注射した１時間後のＶＤＡのＩＰ投与と共に試験した。このプロトコルは、全てのマウスにおいて無害な（ｂｅｎｉｇｎ）毒性および腫瘍定着のみをもたらした（図４）。
腫瘍負荷マウスをＶＤＡで前処置して、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの通性嫌気性菌による定着のために腫瘍内の低酸素壊死空間を増加させた場合、３×１０６ｃｆｕの株ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）の投与は、全ての処置マウスにおいて少なくとも１つの腫瘍の定着をもたらさなかった（データは示さず）。ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘプラスミドは、染色体ａｓｄ変異を補完するためのａｓｄ遺伝子と、全身の生物発光によって細菌を追跡するための発現ｌｕｘオペロンとを含有する。したがって、ＶＤＡ前処置に加えて、ＶＤＡの細菌後投与を追加して、腫瘍内の細菌を「トラップ」した。－４、－３、－２および－１日目にＶＤＡを投与した後０日目に投与された３×１０６ｃｆｕの株ＢＣＴ２（ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ）の毒性および定着を、３×１０６ｃｆｕの細菌をパルス注射した１時間後のＶＤＡのＩＰ投与と共に試験した。このプロトコルは、全てのマウスにおいて無害な（ｂｅｎｉｇｎ）毒性および腫瘍定着のみをもたらした（図４）。
【0094】
考察
細菌は多くの医療用途に使用されてきたが、標的組織に細菌を送達し、抗細菌免疫応答から生じる毒性を回避することは困難であった。細菌治療の１つの用途は、ヒトおよび他の動物におけるサルモネラ症の処置のためのワクチン株としてのサルモネラ菌ベースの株の開発であった（３５）。これらの場合、細菌が全身に投与されると、毒性は重大な問題となる。毒性を低減する試みでは、リポ多糖エンドトキシンまたは鞭毛の免疫原性を弱毒化することに焦点が当てられてきた（３５～３７）。株χ１１０９１におけるようにリピドＡ合成をコードする遺伝子を変異させることによって（図２）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの毒性は大幅に減少した。
細菌は多くの医療用途に使用されてきたが、標的組織に細菌を送達し、抗細菌免疫応答から生じる毒性を回避することは困難であった。細菌治療の１つの用途は、ヒトおよび他の動物におけるサルモネラ症の処置のためのワクチン株としてのサルモネラ菌ベースの株の開発であった（３５）。これらの場合、細菌が全身に投与されると、毒性は重大な問題となる。毒性を低減する試みでは、リポ多糖エンドトキシンまたは鞭毛の免疫原性を弱毒化することに焦点が当てられてきた（３５～３７）。株χ１１０９１におけるようにリピドＡ合成をコードする遺伝子を変異させることによって（図２）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの毒性は大幅に減少した。
【0095】
ワクチン株の開発に加えて、細菌の別の用途は、固形腫瘍の処置におけるものであった（３８）。がん治療に特異なものとして、微生物ベースのがん治療の「究極の目標」は、非毒性様式で固形腫瘍の強固な定着を伴う全身送達である（３９）。これらの実験で使用した細菌としては、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが挙げられ、これらは腫瘍の低酸素壊死空間で増殖することができる。細菌の抗がん能力の前臨床研究では、主に、マウスの移植腫瘍モデルにおけるＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの使用に焦点が当てられてきた（３８）。これらの実験において、腫瘍定着は強固であり、したがって、処置に必要な細菌の数が少なく、結果として毒性はほとんどないか全くない。これらの前臨床研究において、いくつかの異なるタイプの固形腫瘍で、有効性に関する非常に有望な結果が報告された。
【0096】
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのがん治療の初期の臨床試験において、アミノ酸栄養要求性によって病原性が弱められ、リポ多糖毒性が低減された株であるＶＮＰ２０００９が静脈内投与された（４）。本研究者らは、有効性に乏しいことを報告し、腫瘍の定着を増加させるためには細菌用量の増加が必要となるが、細菌の毒性は克服されるべきであることを示唆した。その試験において観察された用量制限毒性は、その免疫原性の高い病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）分子、例えば、鞭毛およびフィンブリアのほとんどがインタクトなままであったため、生命体に対する全身性免疫応答の過剰刺激によるものであり得る（４０）。移植された腫瘍を使用する前臨床試験におけるＶＮＰ２０００９株の適用の成功にもかかわらず、臨床試験において腫瘍定着および毒性が制限となっており、このことは、前臨床結果をヒト試験に応用することの難しさを示している。
【0097】
前臨床研究において使用された移植腫瘍モデルとは対照的に、ヒト腫瘍は、時間、脈管構造および壊死空間に関して異なって発達し、このことは、前臨床マウス研究からヒト試験への応用の障害の原因である可能性がある。免疫応答性であるＢＡＬＢ－ｎｅｕＴマウスなどの自然発症腫瘍モデルを前臨床研究に使用することは、ヒトで発生する腫瘍によりよく似ているため、より適切である。これはまさに、本発明者らが本発明者らの研究において自然発症モデルを使用した理由である。しかしながら、マウスにおける移植腫瘍との比較のために自然発症腫瘍の定着を使用した場合、腫瘍の壊死空間を増加させるためにＶＤＡを使用しない限り、定着が数桁少ないことが観察された（１７）。したがって、自然発症腫瘍の強固な定着を達成するために、処置に使用される細菌数および腫瘍内の壊死空間の量を最適化する必要があり、また結果として生じる毒性に対処する必要がある。
【0098】
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを使用して自然発症腫瘍を全身的に標的化する場合、毒性の過剰刺激された全身性抗菌免疫応答の誘導は回避されるべきである。細菌の表面上のＰＡＭＰ分子は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を効果的に刺激するが、許容できない毒性をもたらす全身性免疫応答も誘発する。免疫刺激ＰＡＭＰをコードする遺伝子の破壊による細菌の改変は、最小限の毒性で治療分子を腫瘍微小環境に分泌するための生物学的工場としての細菌の使用を可能にする。
【0099】
ＩＶ投与されたＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍによって引き起こされる毒性に対処することは、ＰＡＭＰの発現に関与するいくつかの遺伝子の破壊（２９～３１）および補体の活性化を低減するための変異（３３）を伴う、遺伝子操作された生命体ＢＣＴ２の構築をもたらした。血管破壊剤と組み合わせた場合、この株は、前臨床研究において自然発症腫瘍の強固な非毒性定着を促進する。
【0100】
文献
【0101】
【表3-1】
【0102】
【表3-2】
【0103】
【表3-3】
【0104】
【表3-4】
【0105】
実施例ＩＩ
免疫調節因子を分泌するように操作された病原性を弱めたサルモネラ菌が、乳癌の自然発症モデルマウスにおいて腫瘍の増殖を低減し、生存率を向上させる
序論
最近まで、がん治療の主流は手術、放射線、および化学療法であった。第４の治療戦略である免疫療法が急速に台頭し、広く採用されつつある。しかしながら、免疫系を刺激してがんを攻撃し、その再発を防ぐよう用心することは、全身免疫応答の危険な過剰活性化によって妨げられており、これは、健康な組織が許容できないほど破壊され、重大な全身毒性を引き起こす可能性がある［１］。免疫系を調節する分子を腫瘍微小環境に標的化することで、全身毒性を回避し、抗がん免疫療法の可能性を高めることが実現され得る［２］。本明細書では、腫瘍の非毒性定着および免疫調節因子の送達のために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の病原性を弱めた株［１８］が提供される。
免疫調節因子を分泌するように操作された病原性を弱めたサルモネラ菌が、乳癌の自然発症モデルマウスにおいて腫瘍の増殖を低減し、生存率を向上させる
序論
最近まで、がん治療の主流は手術、放射線、および化学療法であった。第４の治療戦略である免疫療法が急速に台頭し、広く採用されつつある。しかしながら、免疫系を刺激してがんを攻撃し、その再発を防ぐよう用心することは、全身免疫応答の危険な過剰活性化によって妨げられており、これは、健康な組織が許容できないほど破壊され、重大な全身毒性を引き起こす可能性がある［１］。免疫系を調節する分子を腫瘍微小環境に標的化することで、全身毒性を回避し、抗がん免疫療法の可能性を高めることが実現され得る［２］。本明細書では、腫瘍の非毒性定着および免疫調節因子の送達のために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の病原性を弱めた株［１８］が提供される。
【0106】
このアプローチの治療可能性を実証するために、本明細書ではサイトカインおよび２つの免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ送達が提供される。インターロイキン－１５スーパーアゴニストであるＩＬ－１５Ｒａ－ＩＬ－１５（ＲＬＩ）［３］は、その毒性制限能力から選択され、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ［５］と同様に、強力な抗がん有効性［４］を提供する。更に、この治療は、臨床応用が成功する可能性をより厳密に試験するため、移植がんモデルではなく自然発症乳癌のモデルにおいて試験した。自然発症腫瘍の発生は、より成熟した脈管形成を可能にし、その結果、壊死空間が少なくなる。したがって、脈管構造破壊剤（ＶＤＡ）が、壊死空間を増加させて、投与された細菌が定着することを可能にするよう、含まれた［６］。ＶＤＡ誘導性壊死空間を拡張および維持し、任意の急性細菌誘導性全身性炎症応答を低減するために、カンナビジオール（ＣＢＤ）がその抗血管新生作用および抗炎症作用のために含まれた［７、８］。
【0107】
本明細書では、腫瘍微小環境への直接的な免疫調節因子の標的化分泌のために操作された、非病原性Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの抗がん有効性の報告が開示される。これらの細菌は、免疫刺激分子の全身投与からもたらされるがん免疫療法に固有の毒性応答を誘発しない。
【0108】
材料および方法
プラスミド
本研究で使用したプラスミドは、抗がん治療について試験することができる様々な免疫調節因子を発現および分泌するように設計した（表１）。プラスミドは、ＦＦ＋２０＊［１０］促進型オペロンでプラスミドｐＹＡ２９２中のＴｒｃプロモーターおよびＬａｃＺα配列を置き換えること［９］によって構築した。ＦＦ＋２０＊プロモーターを腫瘍特異的遺伝子発現に使用した。オペロンは、ＦＦ＋２０＊プロモーター、Ｃ末端に６０アミノ酸のＥ．Ｃｏｌｉ ＨｌｙＡ分泌シグナルとインフレームである免疫調節因子ｃＤＮＡ配列［１１］、続いてＥ．ｃｏｌｉ溶血素分泌タンパク質ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードするｃＤＮＡ配列からなっていた（図６）。プラスミドｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４ＨｌｙおよびｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１Ｈｌｙは、それらの完全なＤＮＡ配列を含めて、Ａｄｄｇｅｎｅに寄託された。ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ中のＩＬ－１５配列は、ＲＬＩ［３］からモデル化される。プラスミドｐＯＲＦ９－ｍＩＬ１５ＲＡａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｃａｔ．ｐｏｒｆ－ｍｉｌ１５ｒａａ）からＰＣＲによって単離されたマウスＩＬ－１５Ｒａスシドメインを、２０アミノ酸ＲＬＩフレキシブルリンカーを介して、プラスミドｐＯＲＦ９－ｍＩＬ１５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｃａｔ．ｐｏｒｆ－ｍｉｌ１５）からＰＣＲによって単離されたマウスＩＬ－１５遺伝子をコードするｃＤＮＡに連結した。第２の１８アミノ酸のグリシン／セリンリッチのフレキシブルリンカーＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ［１２］を使用して、ＩＬ－１５のＣ末端アミノ酸をＨｌｙＡシグナル配列のＣ末端の６０アミノ酸に連結した。Ｃ末端６×ヒスチジンおよびヘマグルチニンタグを含む抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列を、以前に記載されたように［１３］、免疫化ニワトリ抗体ライブラリーから単離した。それらは、それらのＣ末端アミノ酸で、Ｃ末端６０アミノ酸ＨｌｙＡシグナル配列に直接連結された。各免疫調節因子プラスミド中のＥ．ｃｏｌｉ溶血素オペロン配列を、プラスミドｐＮｉｒＢ－ＰＡｏｐ－ｈｌｙＡ［１４］から、フォワードおよびリバースプライマーＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣおよびＴＴＡＡＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣをそれぞれ使用してＰＣＲによって単離した。免疫調節因子発現および分泌のウェスタン分析のために、ＦＦ＋２０＊プロモーターおよびコンセンサスＡＧＧＡＧＧシャイン・ダルガーノ配列のすぐ上流の配列を、ｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５Ｈｌｙ中のＬａｃＵＶ５プロモーター［１５］を含む配列ＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴならびにｐＴｒｃａＣＴＬＡ４ＨｌｙおよびｐＴｒｃａＰＤＬ１Ｈｌｙ中のＴｒｃプロモーター［１６］を含む配列ＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴによって置き換えた。
プラスミド
本研究で使用したプラスミドは、抗がん治療について試験することができる様々な免疫調節因子を発現および分泌するように設計した（表１）。プラスミドは、ＦＦ＋２０＊［１０］促進型オペロンでプラスミドｐＹＡ２９２中のＴｒｃプロモーターおよびＬａｃＺα配列を置き換えること［９］によって構築した。ＦＦ＋２０＊プロモーターを腫瘍特異的遺伝子発現に使用した。オペロンは、ＦＦ＋２０＊プロモーター、Ｃ末端に６０アミノ酸のＥ．Ｃｏｌｉ ＨｌｙＡ分泌シグナルとインフレームである免疫調節因子ｃＤＮＡ配列［１１］、続いてＥ．ｃｏｌｉ溶血素分泌タンパク質ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードするｃＤＮＡ配列からなっていた（図６）。プラスミドｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４ＨｌｙおよびｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１Ｈｌｙは、それらの完全なＤＮＡ配列を含めて、Ａｄｄｇｅｎｅに寄託された。ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ中のＩＬ－１５配列は、ＲＬＩ［３］からモデル化される。プラスミドｐＯＲＦ９－ｍＩＬ１５ＲＡａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｃａｔ．ｐｏｒｆ－ｍｉｌ１５ｒａａ）からＰＣＲによって単離されたマウスＩＬ－１５Ｒａスシドメインを、２０アミノ酸ＲＬＩフレキシブルリンカーを介して、プラスミドｐＯＲＦ９－ｍＩＬ１５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｃａｔ．ｐｏｒｆ－ｍｉｌ１５）からＰＣＲによって単離されたマウスＩＬ－１５遺伝子をコードするｃＤＮＡに連結した。第２の１８アミノ酸のグリシン／セリンリッチのフレキシブルリンカーＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ［１２］を使用して、ＩＬ－１５のＣ末端アミノ酸をＨｌｙＡシグナル配列のＣ末端の６０アミノ酸に連結した。Ｃ末端６×ヒスチジンおよびヘマグルチニンタグを含む抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列を、以前に記載されたように［１３］、免疫化ニワトリ抗体ライブラリーから単離した。それらは、それらのＣ末端アミノ酸で、Ｃ末端６０アミノ酸ＨｌｙＡシグナル配列に直接連結された。各免疫調節因子プラスミド中のＥ．ｃｏｌｉ溶血素オペロン配列を、プラスミドｐＮｉｒＢ－ＰＡｏｐ－ｈｌｙＡ［１４］から、フォワードおよびリバースプライマーＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣおよびＴＴＡＡＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣをそれぞれ使用してＰＣＲによって単離した。免疫調節因子発現および分泌のウェスタン分析のために、ＦＦ＋２０＊プロモーターおよびコンセンサスＡＧＧＡＧＧシャイン・ダルガーノ配列のすぐ上流の配列を、ｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５Ｈｌｙ中のＬａｃＵＶ５プロモーター［１５］を含む配列ＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴならびにｐＴｒｃａＣＴＬＡ４ＨｌｙおよびｐＴｒｃａＰＤＬ１Ｈｌｙ中のＴｒｃプロモーター［１６］を含む配列ＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴによって置き換えた。
【0109】
全てのプラスミドは、株χ４５５０およびＢＣＴ２におけるＤａｓｄ変異を補完するａｓｄ遺伝子を含んでいた。
【0110】
【表4】
【0111】
細菌株
関連する遺伝子型および供給源を含む細菌株を表１に列挙する。株χ４５５０をｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＴｒｃαＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＰＤＬ１Ｈｌｙで形質転換することによって、３つの免疫調節因子タンパク質の発現および分泌を試験するために、３つの株を樹立した。株ＢＣＴ２をプラスミドｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ、ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４Ｈｌｙ、またはｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１Ｈｌｙで形質転換することによって、有効性および毒性実験のために４つの株を樹立した。単一のｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ形質転換株（ＢＣＴ２ｐＬｕｘ）、またはＢＣＴ２ｐＬｕｘを含む４つ全ての株を組み合わせたもの（ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ）のいずれかを用いて実験を行い、腫瘍定着をモニターした。
関連する遺伝子型および供給源を含む細菌株を表１に列挙する。株χ４５５０をｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＴｒｃαＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＰＤＬ１Ｈｌｙで形質転換することによって、３つの免疫調節因子タンパク質の発現および分泌を試験するために、３つの株を樹立した。株ＢＣＴ２をプラスミドｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ、ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊αＣＴＬＡ４Ｈｌｙ、またはｐＦＦ＋２０＊αＰＤＬ１Ｈｌｙで形質転換することによって、有効性および毒性実験のために４つの株を樹立した。単一のｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ形質転換株（ＢＣＴ２ｐＬｕｘ）、またはＢＣＴ２ｐＬｕｘを含む４つ全ての株を組み合わせたもの（ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ）のいずれかを用いて実験を行い、腫瘍定着をモニターした。
【0112】
タンパク質発現の分析
免疫調節因子プラスミドで形質転換された株χ４５５０の単一コロニーを用いて、５０ｍＬの溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ（ＬＢ）に接種した。培養物を通気しながら３７℃で約１７時間、６００ｎｍでの光学密度が約６．０になるまで増殖させた。２０ｍＬの培養物を４０００×ｇ、４℃で２０分間採取し、培養培地を保存しておいた。細菌ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、再遠心分離し、２ｍＬのＰＢＳ＋１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｃａｔ．７８４３０）に再懸濁した。培養培地を、０．２μｍフィルターを通して真空濾過し、１０ｋＤａのカットオフＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）を通して遠心分離することによって約４００μｌに濃縮し、次いで、ＰＢＳで２ｍＬの最終容量に希釈した。再懸濁した細菌細胞（元の２ｍＬのうち０．５ｍＬ）を、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｄｅｌ ３００）を使用して、氷上で１５秒間、４０％の出力で６回超音波処理し、２１，０００×ｇで１２分間遠心分離した。１０μｌの６×ローディングバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃａｔ．ＢＰ－１１１Ｒ）を５０μｌアリコートの超音波処理上清（可溶性細胞タンパク質を表す）および濃縮培養培地に添加し、試料を沸騰水浴中で１０分間インキュベートした。煮沸した各試料（２５μｌ）を、トリス－トリシン１０％から２０％勾配ポリアクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタン分析に供した。これらの実験で使用した一次抗体は、マウス抗ＤｎａＫ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ．ＡＤＩ－ＳＰＡ－８８０）、ラット抗マウス－ＩＬ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ．ＭＡＢ４４７）またはマウス抗Ｈｉｓタグ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃａｔ．６５２０１）であった。二次抗体は、ヤギ抗マウス（ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ ｃａｔ．９２６－６８０７０）またはヤギ抗ラット（ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ｃａｔ．９２６－３２２１９）であった。
免疫調節因子プラスミドで形質転換された株χ４５５０の単一コロニーを用いて、５０ｍＬの溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ（ＬＢ）に接種した。培養物を通気しながら３７℃で約１７時間、６００ｎｍでの光学密度が約６．０になるまで増殖させた。２０ｍＬの培養物を４０００×ｇ、４℃で２０分間採取し、培養培地を保存しておいた。細菌ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、再遠心分離し、２ｍＬのＰＢＳ＋１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｃａｔ．７８４３０）に再懸濁した。培養培地を、０．２μｍフィルターを通して真空濾過し、１０ｋＤａのカットオフＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）を通して遠心分離することによって約４００μｌに濃縮し、次いで、ＰＢＳで２ｍＬの最終容量に希釈した。再懸濁した細菌細胞（元の２ｍＬのうち０．５ｍＬ）を、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｄｅｌ ３００）を使用して、氷上で１５秒間、４０％の出力で６回超音波処理し、２１，０００×ｇで１２分間遠心分離した。１０μｌの６×ローディングバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃａｔ．ＢＰ－１１１Ｒ）を５０μｌアリコートの超音波処理上清（可溶性細胞タンパク質を表す）および濃縮培養培地に添加し、試料を沸騰水浴中で１０分間インキュベートした。煮沸した各試料（２５μｌ）を、トリス－トリシン１０％から２０％勾配ポリアクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタン分析に供した。これらの実験で使用した一次抗体は、マウス抗ＤｎａＫ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ．ＡＤＩ－ＳＰＡ－８８０）、ラット抗マウス－ＩＬ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ．ＭＡＢ４４７）またはマウス抗Ｈｉｓタグ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃａｔ．６５２０１）であった。二次抗体は、ヤギ抗マウス（ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ ｃａｔ．９２６－６８０７０）またはヤギ抗ラット（ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ｃａｔ．９２６－３２２１９）であった。
【0113】
動物実験
動物実験のために、注射に使用される細菌培養物を、ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ、ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊ａＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＦＦ＋２０＊ａＰＤＬ１Ｈｌｙのいずれかを含有する株ＢＣＴ２の新鮮な対数増殖期中期ＬＢ培養物から調製した。培養物を、３，５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを冷却したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ペレット化し、次いで冷却した２０％グリセロール／ＰＢＳ（体積／体積）に再懸濁した。細胞試料を－８０℃で保存した。凍結グリセロールストックを解凍し、使用前に所望の濃度までＰＢＳ中に希釈した。－８０℃で保存する前および動物注射後に、注射された細菌の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、３７℃でＬＢ寒天上に希釈プレーティングすることによって検証した。
動物実験のために、注射に使用される細菌培養物を、ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘ、ｐＦＦ＋２０＊ＩＬ１５Ｈｌｙ、ｐＦＦ＋２０＊ａＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＦＦ＋２０＊ａＰＤＬ１Ｈｌｙのいずれかを含有する株ＢＣＴ２の新鮮な対数増殖期中期ＬＢ培養物から調製した。培養物を、３，５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを冷却したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ペレット化し、次いで冷却した２０％グリセロール／ＰＢＳ（体積／体積）に再懸濁した。細胞試料を－８０℃で保存した。凍結グリセロールストックを解凍し、使用前に所望の濃度までＰＢＳ中に希釈した。－８０℃で保存する前および動物注射後に、注射された細菌の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、３７℃でＬＢ寒天上に希釈プレーティングすることによって検証した。
【0114】
以前に記載されたように［２０］、ＢＡＬＢ－ｎｅｕＴコロニーの維持および管理を行った。毒性の判定のために、マウスの体重を測定し、運動性の低下および毛羽立ちについて観察した。腫瘍を外部キャリパーによって測定し、腫瘍体積を０．５（長さ×幅２）として計算した。マウスは腫瘍が２ｃｍ３を超えるたびに安楽死させた。全ての薬剤を、個々の実験で示された濃度および投与スケジュールで、ＰＢＳ中１００μｌの注射によってマウスに非経口投与した。－２日目に、マウスに４ｍｇ／ｋｇのＶＤＡ（ＣＫＤ－５１６、Ａｕｒｏｒａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｃａｔ．Ａ０７．０２０．５４８）および５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ（純度９９％の結晶ＣＢＤ、Ｅｎｄｏｃａ ＵＳＡ）を単回腹腔内注射した。０日目に、マウスに１．５×１０６ｃｆｕの細菌を外側尾静脈（ＩＶ）に注射し、その３時間後に１．５×１０６ｃｆｕの細菌をもう１度ＩＶ注射した。この手順の１時間後に、２ｍｇ／ｋｇ ＶＤＡ＋５０ｍｇ／ｋｇ ＣＢＤをＩＰ注射した。マウスを、対照としてＢＣＴ２ｐＬｕｘ単独で、またはＢＣＴ２ｐＱｕａｄで処置した。ＢＣＴ２ｐＱｕａｄを使用した場合、４つの細菌株の各々を等量で混合し、１．５×１０６ｃｆｕの注射濃度になるようにした。
【0115】
発光細菌で処置したマウスにおける腫瘍の放射輝度を測定するために、マウスを酸素中３％のイソフルラン吸入によって麻酔し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して画像化した。全光束（ルミネセンス）を６０秒間取得し、目的の腫瘍の放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として記録した。
【0116】
略語
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ＶＤＡ：血管破壊剤；ＬＢ：溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｃｆｕ：コロニー形成単位；ＩＶ：静脈内；ＩＰ：腹腔内；ＩＬ－１５：インターロイキン－１５；ＣＢＤ：カンナビジオール；ＭＴＤ：最大耐容量。
Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ＶＤＡ：血管破壊剤；ＬＢ：溶原培地Ｍｉｌｌｅｒ；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｃｆｕ：コロニー形成単位；ＩＶ：静脈内；ＩＰ：腹腔内；ＩＬ－１５：インターロイキン－１５；ＣＢＤ：カンナビジオール；ＭＴＤ：最大耐容量。
【0117】
結果
免疫調節因子の分泌。
Ｉ型溶血素分泌装置による免疫調節因子の分泌を試験した。プラスミドｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＰＤ－Ｌ１Ｈｌｙで形質転換されたＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ４５５０において発現された免疫調節因子タンパク質のウェスタン分析により、３つ全ての免疫調節因子の分泌が確認された（図７）。細胞内ＤｎａＫタンパク質が細菌超音波処理物（Ｂ）には存在するが、培地（Ｍ）には存在しないことは、培地（Ｍ）で観察された免疫調節因子タンパク質バンドが細菌溶解ではなく分泌によるものであることを示した。更に、これらの分泌された免疫調節因子が生物学的に活性であることが確認された（データは示さず）。
免疫調節因子の分泌。
Ｉ型溶血素分泌装置による免疫調節因子の分泌を試験した。プラスミドｐＬａｃＵＶ５ＩＬ１５ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＣＴＬＡ４ＨｌｙまたはｐＴｒｃαＰＤ－Ｌ１Ｈｌｙで形質転換されたＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ４５５０において発現された免疫調節因子タンパク質のウェスタン分析により、３つ全ての免疫調節因子の分泌が確認された（図７）。細胞内ＤｎａＫタンパク質が細菌超音波処理物（Ｂ）には存在するが、培地（Ｍ）には存在しないことは、培地（Ｍ）で観察された免疫調節因子タンパク質バンドが細菌溶解ではなく分泌によるものであることを示した。更に、これらの分泌された免疫調節因子が生物学的に活性であることが確認された（データは示さず）。
【0118】
以前に、ｌｕｘオペロンの転写を構成的に促進するＬａｃＵＶ５プロモーターを腫瘍特異的ＦＦ＋２０＊プロモーター［１０］で置き換えると、ｌｕｘオペロン［１９］の腫瘍特異的発現がもたらされることが観察された。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫調節因子タンパク質の分泌を確認した後、これらのプラスミド中のＬａｃＵＶ５およびＴｒｃプロモーターをＦＦ＋２０＊プロモーターで置き換えた。がん免疫療法の実現可能な有効性を制限することが多いサイトカイン放出症候群を引き起こす可能性のある全身性免疫細胞の炎症刺激による毒性を回避するため、免疫調節因子の発現を腫瘍微小環境に限定することを利用した［２１］。
【0119】
有効性。
ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘで、または３種類の免疫調節因子タンパク質のうちの１つの産生をコードするプラスミドのうちの１つで株ＢＣＴ２を形質転換することによって、４種類の個々の株を樹立した。腫瘍負荷マウスを、細菌を投与する２日前にＶＤＡで処置し、細菌定着のための壊死空間を生成させた。ＶＤＡは細菌の１時間後にも投与され、以前の実験で示されたように、腫瘍定着の増加をもたらした（データは示さず）。－２日目に、４ｍｇ／ｋｇのＶＤＡを、体表面積換算で、ヒト臨床試験で決定された最大耐容量（ＭＴＤ）に等しい用量でＩＰ注射した［２２］。０日目に、３時間間隔で２回の尾静脈注射によってマウスに細菌を投与した。細菌のこの「パルス」投与は、単回ボーラス用量の注射と比較して腫瘍の細菌定着を増加させることが実証されており［２３］、この戦略は実験によって確認された（データは示さず）。０日目に注射されたＶＤＡは、ＭＴＤ ＶＤＡが細菌の後に投与された場合に観察された毒性により、５０％ＭＴＤ（２ｍｇ／ｋｇ）に低減された（下記参照）。ＶＤＡ誘導性壊死に続く急性血管新生を一時的に阻害し［２４］、細菌に対する任意の初期の全身性炎症応答を抑制するために、ＣＢＤを全てのＶＤＡ注射に含めた。投与されたＣＢＤ用量５０ｍｇ／ｋｇは、体表面積換算で、ヒト臨床試験で決定されたＭＴＤに等しい［２５］。４日目または５日目の生物発光イメージングにより、１５匹のＢＣＴ２ｐＬｕｘ注射マウスのうち１０匹、１４匹のＢＣＴ２ｐＱｕａｄ注射マウスのうち９匹において、少なくとも１つの腫瘍が細菌によって定着されたことが明らかとなった（データは示さず）。
ｐＦＦ＋２０＊Ｌｕｘで、または３種類の免疫調節因子タンパク質のうちの１つの産生をコードするプラスミドのうちの１つで株ＢＣＴ２を形質転換することによって、４種類の個々の株を樹立した。腫瘍負荷マウスを、細菌を投与する２日前にＶＤＡで処置し、細菌定着のための壊死空間を生成させた。ＶＤＡは細菌の１時間後にも投与され、以前の実験で示されたように、腫瘍定着の増加をもたらした（データは示さず）。－２日目に、４ｍｇ／ｋｇのＶＤＡを、体表面積換算で、ヒト臨床試験で決定された最大耐容量（ＭＴＤ）に等しい用量でＩＰ注射した［２２］。０日目に、３時間間隔で２回の尾静脈注射によってマウスに細菌を投与した。細菌のこの「パルス」投与は、単回ボーラス用量の注射と比較して腫瘍の細菌定着を増加させることが実証されており［２３］、この戦略は実験によって確認された（データは示さず）。０日目に注射されたＶＤＡは、ＭＴＤ ＶＤＡが細菌の後に投与された場合に観察された毒性により、５０％ＭＴＤ（２ｍｇ／ｋｇ）に低減された（下記参照）。ＶＤＡ誘導性壊死に続く急性血管新生を一時的に阻害し［２４］、細菌に対する任意の初期の全身性炎症応答を抑制するために、ＣＢＤを全てのＶＤＡ注射に含めた。投与されたＣＢＤ用量５０ｍｇ／ｋｇは、体表面積換算で、ヒト臨床試験で決定されたＭＴＤに等しい［２５］。４日目または５日目の生物発光イメージングにより、１５匹のＢＣＴ２ｐＬｕｘ注射マウスのうち１０匹、１４匹のＢＣＴ２ｐＱｕａｄ注射マウスのうち９匹において、少なくとも１つの腫瘍が細菌によって定着されたことが明らかとなった（データは示さず）。
【0120】
細菌を含まないＶＤＡ＋ＣＢＤで処置したマウスにおける腫瘍の増殖は、増殖が遅い傾向はあったが、非処置マウスにおいて観察された腫瘍増殖と有意に異ならなかった（図８、２８日目、Ａ対Ｂ、Ｐ＝０．１）。株ＢＣＴ２ｐＬｕｘを処置に加えた場合、２８日目までの腫瘍の増殖は、非処置マウスにおける腫瘍増殖と比較して４０％有意に減少した（図８、２８日目、Ａ対Ｃ、Ｐ＝０．０２）。このことは、ＢＣＴ２ｐＬｕｘを伴うＶＤＡ＋ＣＢＤと伴わないＶＤＡ＋ＣＢＤとの間に有意差は観察されなかったが（図８、２８日目、Ｂ対Ｃ、Ｐ＝０．２）、免疫調節因子発現を伴わないＢＣＴ２がこの治療にわずかな有効性を付加し得ることを示唆する。ＢＣＴ２ｐＱｕａｄで処置したマウスにおいて、非処置動物と比較して、６４％の腫瘍増殖の有意な減少が観察された（図８、Ａ対Ｄ、Ｐ＝０．０００４）。それぞれＢＣＴ２ｐＬｕｘを伴うまたは伴わないＶＤＡ＋ＣＢＤを注射されたマウスにおいて観察されたものと比較して、ＢＣＴ２ｐＱｕａｄを注射されたマウスにおける腫瘍増殖の４１％および５１％の更なる遅延（図８、２８日目、Ｃ対Ｄ、Ｐ＝０．００４またはＢ対Ｄ、Ｐ＝０．０００６）は、免疫調節因子の腫瘍特異的発現が、細菌単独によって提供される任意の抗腫瘍有効性に加えて抗腫瘍免疫応答を誘導することを示唆している。
【0121】
細菌処置後９週間、マウスの生存を追跡した（図９）。ＶＤＡ＋ＣＢＤ単独での処置は、９５％未満の有意性ではあるが（図９、Ａ対Ｂ、Ｐ＝０．０９）、未処置マウスと比較して生存期間が１２％減少する傾向があった。このことは、ＣＢＤの抗炎症特性による抗がん免疫の阻害の可能性を示唆している［８］。ＢＣＴ２ｐＬｕｘの添加は、非処置と比較して生存に有意な影響を及ぼさなかった（図９、Ａ対Ｃ、Ｐ＝０．６）が、ＶＤＡ＋ＣＢＤ単独と比較して生存率は１５％増加した（図９、Ｂ対Ｃ、Ｐ＝０．０１）。ＢＣＴ２ｐＱｕａｄが治療戦略に含まれた場合、マウスは非処置マウスよりも２５％長く生存し（図９、Ａ対Ｄ、Ｐ＝０．０００２）、ＶＤＡ＋ＣＢＤのみで処置したマウスよりも３３％長く生存し（図９、Ｂ対Ｄ、Ｐ＝０．００００２）、ＢＣＴ２ｐＬｕｘが治療戦略に含まれた唯一の株である場合よりも２１％長く生存した（図９、Ｃ対Ｄ、Ｐ＝０．０００１）。このデータは、細菌が送達する免疫調節因子が腫瘍微小環境において有効な抗がん免疫応答を引き起こすという結論を更に支持する。
【0122】
毒性。
ＶＤＡ＋ＣＢＤ＋ＢＣＴ２ｐＱｕａｄによる処置の有害作用は最小限であった。毒性は、体重減少によって経験的に決定され、ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ投与の２日後に最大の－６．９％±２．０％に達した（図１０）。３日目の体重は、マウスが未処置動物と比較して正常な体重増加を再開したことを示した。この結果は、げっ歯類で試験された医薬品をヒト臨床試験に応用するための上限であると考えられる７日間１０％の体重減少の範囲内である［２６］。加えて、この経験的に決定された無害な毒性は、最大耐容量の化学療法で観察されたものよりもはるかに低かった（図１０、ＭＴＤドキソルビシン）。ＭＴＤドキソルビシンを注射されたマウスは、１４日目までに２５％を超える体重減少が続き、２１日目まで体重増加が再開されなかった（以前に公開されたデータ）［２７］。毒性はまた、以下の０～３のスケールで活動性および被毛の滑らかさを観察することによって主観的に決定した：０）未処置動物との活動性の差がなく、滑らかで光沢のある毛羽立ちのない被毛、１）わずかに動きが少なく、わずかに毛羽立ちのある被毛、２）明らかに遅い動きおよび毛羽立ちのある被毛、ならびに３）強制なしでは動きがなく、鈍く極端に毛羽立ちのある被毛。この運動性／被毛スケールでは、ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ注射マウスの全てが、１日目～４日目に０／０、１／０または０／１のいずれかであることが観察され、７日目に全てが０／０とスコア付けされた。したがって、この治療戦略ではある程度の毒性が明らかであったが、それは無害の性質であり、十分にヒト臨床応用に適した限界内である。
ＶＤＡ＋ＣＢＤ＋ＢＣＴ２ｐＱｕａｄによる処置の有害作用は最小限であった。毒性は、体重減少によって経験的に決定され、ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ投与の２日後に最大の－６．９％±２．０％に達した（図１０）。３日目の体重は、マウスが未処置動物と比較して正常な体重増加を再開したことを示した。この結果は、げっ歯類で試験された医薬品をヒト臨床試験に応用するための上限であると考えられる７日間１０％の体重減少の範囲内である［２６］。加えて、この経験的に決定された無害な毒性は、最大耐容量の化学療法で観察されたものよりもはるかに低かった（図１０、ＭＴＤドキソルビシン）。ＭＴＤドキソルビシンを注射されたマウスは、１４日目までに２５％を超える体重減少が続き、２１日目まで体重増加が再開されなかった（以前に公開されたデータ）［２７］。毒性はまた、以下の０～３のスケールで活動性および被毛の滑らかさを観察することによって主観的に決定した：０）未処置動物との活動性の差がなく、滑らかで光沢のある毛羽立ちのない被毛、１）わずかに動きが少なく、わずかに毛羽立ちのある被毛、２）明らかに遅い動きおよび毛羽立ちのある被毛、ならびに３）強制なしでは動きがなく、鈍く極端に毛羽立ちのある被毛。この運動性／被毛スケールでは、ＢＣＴ２ｐＱｕａｄ注射マウスの全てが、１日目～４日目に０／０、１／０または０／１のいずれかであることが観察され、７日目に全てが０／０とスコア付けされた。したがって、この治療戦略ではある程度の毒性が明らかであったが、それは無害の性質であり、十分にヒト臨床応用に適した限界内である。
【0123】
考察
本明細書では、がん免疫療法の潜在的有効性を制限してきた毒性を伴わずに、腫瘍微小環境への複数の免疫調節因子タンパク質の送達を標的化する方法が提供される。細菌の静脈内投与を使用するこれまでに報告された研究では、グラム陰性菌によって誘発される多くの炎症カスケードの過剰活性化によると思われる有意な毒性が示されており（２８、２９）、これはその後、この治療戦略の採用を制限してきた。毒性の問題に対処するために、本発明者らは、これらの細菌の非毒性静脈内投与を可能にするＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株を開発することに成功し（１８）、また、ステルス性、および免疫調節因子の腫瘍特異的発現のために細菌を操作した。重要なことに、これらの細菌は、移植腫瘍を使用するモデルよりもより臨床的に関連性がある自然発症乳癌のマウスモデルにおいて非毒性抗がん有効性を実証している（３０）。
本明細書では、がん免疫療法の潜在的有効性を制限してきた毒性を伴わずに、腫瘍微小環境への複数の免疫調節因子タンパク質の送達を標的化する方法が提供される。細菌の静脈内投与を使用するこれまでに報告された研究では、グラム陰性菌によって誘発される多くの炎症カスケードの過剰活性化によると思われる有意な毒性が示されており（２８、２９）、これはその後、この治療戦略の採用を制限してきた。毒性の問題に対処するために、本発明者らは、これらの細菌の非毒性静脈内投与を可能にするＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株を開発することに成功し（１８）、また、ステルス性、および免疫調節因子の腫瘍特異的発現のために細菌を操作した。重要なことに、これらの細菌は、移植腫瘍を使用するモデルよりもより臨床的に関連性がある自然発症乳癌のマウスモデルにおいて非毒性抗がん有効性を実証している（３０）。
【0124】
腫瘍定着は、細菌を投与する前後にＶＤＡで壊死空間を確立することによって増強された。低分子ＶＤＡはチューブリンに結合し、未成熟血管内皮細胞における細胞骨格に干渉して、腫瘍における血流の破壊を引き起こす。その結果、低酸素および虚血の領域が生じ、周囲の腫瘍細胞の死および壊死空間の形成をもたらす（３１）。本発明者らは、これらの形成された壊死空間によって、これらの細菌が増殖し、続いて免疫調節因子を放出するための培養環境がもたらされると考える。ＶＤＡコンブレタスタチンを使用して自然発症腫瘍のＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ定着の増強を実証したことから［６］、本発明者らは、より安定なＶＤＡであるＣＫＤ－５１６（３２）を使用して、本研究における投薬を最適化した。本発明者らは、細菌の投与の２日前のＭＴＤ ＶＤＡによる単回前処置が、細菌の投与の最大４日前までの１日１回のＶＤＡによる投与と同程度の腫瘍の細菌定着をもたらすことを見出した。このことは、単回ＭＴＤのＶＤＡが、利用可能な未成熟腫瘍内脈管構造の大部分を破壊し得ることを示唆している（３３）。更に、－１日目にＶＤＡを投与することが、定着の量を減少させたことから（未発表の結果）、ＶＤＡが細菌処置に近すぎる時間に投与された場合、血管から腫瘍への細菌の通過を妨害し得ることを示唆している。循環ＣＫＤ－５１６の半減期は、約５時間であり（３４）、したがって、ＶＤＡのクリアランスのために２日間の猶予を与えることは、新生脈管構造の成長のための時間を確保することによって細菌定着を促進し得る。細菌で処置した後、この研究で報告された治療戦略で使用される１時間の間隔ではなく、ＶＤＡを投与する前に２時間待ち、脈管構造をもう一度破壊して腫瘍内で細菌を潜在的に捕捉することにより腫瘍定着を増加させることが有益であり得る。
【0125】
ＣＢＤの抗血管新生および抗炎症特性は、血管新生を一時的に阻害し、壊死空間を維持し、細菌刺激された全身性炎症による急性毒性を低減するために利用された。ＶＤＡ処置は、脈管構造を破壊し、それによって腫瘍における血管新生応答を刺激することが知られているので（３５）、循環における２４時間の半減期（３６）および抗血管新生特性（７）を有するＣＢＤは、ＶＤＡ誘導性壊死の時間を延長し、それによって腫瘍の細菌定着のための壊死空間を拡大し得る。
【0126】
腫瘍微小環境は、抗がん免疫の抑制をもたらす相互作用する細胞および分子の複雑なアレイである［３８］。単一の免疫調節因子を用いるいくつかの単剤治療は、抗がん有効性を実証したが、単一の治療において免疫調節因子を組み合わせることは、はるかに有効である。例えば、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の組み合わせの投与は、いずれかの処置が単独で投与された場合の２倍を超えて生存する患者をもたらした［３９］。より多くの細胞機能に影響を及ぼすために追加の免疫調節因子で治療を増強することは、腫瘍微小環境の免疫抑制の性質を更に克服し、ますます活性化される抗腫瘍免疫応答を誘導し得る［４０］。しかしながら、全ての全身送達された免疫調節因子の場合と同様に、免疫関連有害事象による毒性は、特に免疫調節因子が組み合わされる場合、現在の抗がん免疫療法の達成可能な有効性を制限する［４１］。全身送達された抗がん免疫療法の有効性を制限する有害作用を克服することが、本研究において組み合わされたＩＬ－１５サイトカインならびに抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤以外の免疫調節因子の追加の組み合わせの送達を可能とする。免疫原性ステルス性Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＢＣＴ２）の本発明者らの系、および免疫調節因子の腫瘍特異的発現は、自然発症乳癌のマウスモデルにおいて有意な有効性を維持しながら全身毒性を回避し、ヒトにおいてがんを処置するための臨床応用が成功する可能性を高める。
【0127】
文献
【0128】
【表5-1】
【0129】
【表5-2】
【0130】
【表5-3】
【0131】
【表5-4】
【0132】
実施例ＩＩＩ
プラスミド構築
溶血素分泌系
プラスミドｐＹＡ２９２中のＴｒｃプロモーターおよびＬａｃＺα配列をＦＦ＋２０＊プロモーター配列で置き換える（１）ことによって、プラスミドを構築し、ＦＦ＋２０＊プロモーター配列は腫瘍特異的遺伝子発現のために使用された（２）。オペロンは、ＦＦ＋２０＊プロモーター、Ｃ末端に６０アミノ酸のＥ．Ｃｏｌｉ ＨｌｙＡ分泌シグナルとインフレームである免疫調節因子ｃＤＮＡ配列（３）、続いてＥ．ｃｏｌｉ溶血素分泌タンパク質ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードするｃＤＮＡ配列からなっていた。これらの構築物に使用される免疫調節ｃＤＮＡ配列には、ＩＬ－１５、αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、およびαＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖが含まれる。これらの免疫調節因子遺伝子を含むプラスミドの構築は、以前に記載された（４）。
プラスミド構築
溶血素分泌系
プラスミドｐＹＡ２９２中のＴｒｃプロモーターおよびＬａｃＺα配列をＦＦ＋２０＊プロモーター配列で置き換える（１）ことによって、プラスミドを構築し、ＦＦ＋２０＊プロモーター配列は腫瘍特異的遺伝子発現のために使用された（２）。オペロンは、ＦＦ＋２０＊プロモーター、Ｃ末端に６０アミノ酸のＥ．Ｃｏｌｉ ＨｌｙＡ分泌シグナルとインフレームである免疫調節因子ｃＤＮＡ配列（３）、続いてＥ．ｃｏｌｉ溶血素分泌タンパク質ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードするｃＤＮＡ配列からなっていた。これらの構築物に使用される免疫調節ｃＤＮＡ配列には、ＩＬ－１５、αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、およびαＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖが含まれる。これらの免疫調節因子遺伝子を含むプラスミドの構築は、以前に記載された（４）。
【0133】
同様のアプローチ（４）を用いて、以下の免疫調節因子のｃＤＮＡをクローニングした。
＊ｐＦＦ＋２０＊－ＣＸＣＬ９－１０。
＊ｐＦＦ＋２０＊－ＣＸＣＬ９－１０。
【0134】
ｐＦＦ＋２０＊－ＣＸＣＬ９－１０を構築するために、ｐＦＦ＋２０＊－ＩＬ１５およびＣＸＣＬ９－１０ ｇＢｌｏｃｋをＢｓｒＧＩおよびＥｓｐ３Ｉで切断した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦＦ＋２０＊－ＣＸＣＬ９－１０構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ２を形質転換するのに使用した。
【0135】
ＣＸＣＬ９－１０ ｇＢｌｏｃｋ配列（１１２６ｂｐ）：
ＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＣＣＧＧＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＣＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＣＣＧ
＊ｐＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎを構築するために、ｐＦＦ＋２０＊－ＩＬ１５およびＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで切断した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ２を形質転換するのに使用した。
ＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＣＣＧＧＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＣＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＣＣＧ
＊ｐＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎを構築するために、ｐＦＦ＋２０＊－ＩＬ１５およびＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで切断した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦＦ＋２０＊－αＰＤ－Ｌ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ２を形質転換するのに使用した。
【0136】
ＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋ配列（５５７ｂｐ）：
ＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＧＣＴＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＴＧＣＧＴＡＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＴＣＴＣ
鞭毛分泌系（Ｆｌａｇｅｌｌａｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）
鞭毛分泌系（５）を利用するため、ＦｌｉＣプロモーター配列、および免疫調節ＤＮＡ配列に融合したＦｌｉＣ分泌シグナルを含むようにプラスミドを構築した。プラスミドＦｌｉＣプロモーターの活性は、染色体鞭毛遺伝子座によって制御され、これは、免疫調節因子の発現および分泌を腫瘍微小環境に限定するために腫瘍特異的ＦＦ＋２０＊プロモーター（２）によって駆動される。株ＢＣＴ１４の説明を参照されたい。
ＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＧＣＴＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＴＧＣＧＴＡＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＴＣＴＣ
鞭毛分泌系（Ｆｌａｇｅｌｌａｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）
鞭毛分泌系（５）を利用するため、ＦｌｉＣプロモーター配列、および免疫調節ＤＮＡ配列に融合したＦｌｉＣ分泌シグナルを含むようにプラスミドを構築した。プラスミドＦｌｉＣプロモーターの活性は、染色体鞭毛遺伝子座によって制御され、これは、免疫調節因子の発現および分泌を腫瘍微小環境に限定するために腫瘍特異的ＦＦ＋２０＊プロモーター（２）によって駆動される。株ＢＣＴ１４の説明を参照されたい。
【0137】
これらの構築物に使用される免疫調節ｃＤＮＡ配列は以下のものを含む。
＊ｐＦｌｉＣ－ＩＬ－１５
ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５を作製するために、ＦＬＩＣ－ＩＬ１５ ｇＢｌｏｃｋ－２およびプラスミドｐＬａｃＵＶ５－ｍＩＬ１５Ｒａ－ｍＩＬ１５（４）をＤｒａＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＩＬ１５構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
＊ｐＦｌｉＣ－ＩＬ－１５
ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５を作製するために、ＦＬＩＣ－ＩＬ１５ ｇＢｌｏｃｋ－２およびプラスミドｐＬａｃＵＶ５－ｍＩＬ１５Ｒａ－ｍＩＬ１５（４）をＤｒａＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＩＬ１５構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0138】
ＦＬＩＣ－ＩＬ１５ ｇＢｌｏｃｋ－２配列（３８０ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧ
以下の免疫調節因子遺伝子を有するｐＦｌｉＣプラスミドの構築は、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５の構築と同様のプロトコルに従った。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧ
以下の免疫調節因子遺伝子を有するｐＦｌｉＣプラスミドの構築は、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５の構築と同様のプロトコルに従った。
【0139】
＊ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ
ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを作製するために、ｐＬａｃＵＶ５－ＯｍｐＡ－αＰＤ－Ｌ１プラスミドおよびαＰＤ－Ｌ１ ｇＢｌｏｃｋをＢｓｔＥＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを作製するために、ｐＬａｃＵＶ５－ＯｍｐＡ－αＰＤ－Ｌ１プラスミドおよびαＰＤ－Ｌ１ ｇＢｌｏｃｋをＢｓｔＥＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0140】
ＦＬＩＣ－αＰＤＬ１ ｇＢｌｏｃｋ（１０５３ｂｐ）：
ＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＧＣＴＴＡＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＡＡＴＡＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＴＣ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ
ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖを作製するために、ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖプラスミドおよびαＣＴＬＡ４ ｇＢｌｏｃｋをＮｓｉＩおよびＳｐｅＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ４構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＧＣＴＴＡＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＡＡＴＡＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＴＣ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ
ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖを作製するために、ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖプラスミドおよびαＣＴＬＡ４ ｇＢｌｏｃｋをＮｓｉＩおよびＳｐｅＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ４構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0141】
ＦＬＩＣ－ａＣＴＬＡ４ ｇＢｌｏｃｋ（１０７０ｂｐ）：
ＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＣＴＡＧ
＊ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０
ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０を作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびＣＸＣＬ９－１０ ｐＦｌｉｃ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＣＴＡＧ
＊ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０
ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０を作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびＣＸＣＬ９－１０ ｐＦｌｉｃ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0142】
ＣＸＣＬ９－１０ ｐＦｌｉｃ ｇＢｌｏｃｋ（９９１ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＡＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＣＴＬＡ４Ｎ ｐＦｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＡＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＣＴＬＡ４Ｎ ｐＦｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＴＬＡ－４Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0143】
αＣＴＬＡ４Ｎ ｐｆｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋ（７２７ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＰＤＬ１Ｎ ｐＦｌｉｃ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＰＤＬ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＰＤ－Ｌ１Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＰＤＬ１Ｎ ｐＦｌｉｃ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＰＤＬ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0144】
αＰＤＬ１Ｎ ｐＦＬｉｃ ｇＢｌｏｃｋ（７３０ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＣＡＣＧＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧＧＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＡＣＧＴＡＣＣＴＣＧＴＴＡＣＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＣＤ４７ ｐＦｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＣＡＣＧＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧＧＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＡＣＧＴＡＣＣＴＣＧＴＴＡＣＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
＊ｐＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎを作製するために、ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミドおよびαＣＤ４７ ｐＦｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－αＣＤ４７Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0145】
αＣＤ４７ ｐＦｌｉＣ ｇＢｌｏｃｋ（７５１ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＡＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＴＣＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＡＡＧＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
免疫調節遺伝子の組み合わせを含むプラスミドの構築
１．ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）バイシストロン性オペロン
バイシストロン性プラスミドであるｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎを作製するために、ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋおよびｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミド（上記参照）をＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＡＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＴＣＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＡＡＧＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
免疫調節遺伝子の組み合わせを含むプラスミドの構築
１．ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）バイシストロン性オペロン
バイシストロン性プラスミドであるｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎを作製するために、ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋおよびｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミド（上記参照）をＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0146】
ＩＬ１５－αＰＤＬ１Ｎ ｇＢｌｏｃｋ（１５５５ｂｐ）：
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣ
２．ｐＦｌｉＣ－Ｐは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ１５、αＰＤＬ１Ｎ、およびαＣＴＬＡ４Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）を有するペンタシストロン性オペロンを含有する
ペンタシストロン性オペロンを有するｐＦｌｉＣ－Ｐプラスミドを作製するために、２つのステップを使用した。第１のステップは、ＩＬ１２遺伝子のクローニングを伴っていた。第２のステップでは、残りの４つの遺伝子配列をｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２プラスミドに付加した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣ
２．ｐＦｌｉＣ－Ｐは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ１５、αＰＤＬ１Ｎ、およびαＣＴＬＡ４Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）を有するペンタシストロン性オペロンを含有する
ペンタシストロン性オペロンを有するｐＦｌｉＣ－Ｐプラスミドを作製するために、２つのステップを使用した。第１のステップは、ＩＬ１２遺伝子のクローニングを伴っていた。第２のステップでは、残りの４つの遺伝子配列をｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２プラスミドに付加した。
【0147】
ステップ１：ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２Ｄ ｇＢｌｏｃｋおよびｐＦｌｉＣ－ＩＬ１５プラスミド（上記参照）をＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－ＩＬ１２Ｄ構築物を確認した。
【0148】
ｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２Ｄ ｇＢｌｏｃｋ（１９６０ｂｐ）：
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ステップ２：「ｐｅｎｔａ ｇＢｌｏｃｋ ２ Ｍ－Ｈ」ｇＢｌｏｃｋおよびプラスミドｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２ＤをＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－Ｐ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
ＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＡＡＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＡＡＣＴＴＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＡＣＴＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＣＧＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＴＣＧＧＴＴＴＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＡＧＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＧＴＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＴＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＣＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＴＣＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＧＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＣＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＣＧＴＧＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＧＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＡＧＧＴＡＧＴＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＣＧＡＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＴＴＡＡＴＣＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧ
ステップ２：「ｐｅｎｔａ ｇＢｌｏｃｋ ２ Ｍ－Ｈ」ｇＢｌｏｃｋおよびプラスミドｐＦｌｉＣ－ＩＬ１２ＤをＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてＦｌｉＣ－Ｐ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１３を形質転換するのに使用した。
【0149】
「ｐｅｎｔａ ｇＢｌｏｃｋ ２ Ｍ－Ｈ」ｇＢｌｏｃｋ（２６６３ｂｐ）：
ＧＡＴＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＴＴＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＧＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣ
３．ｐＦｌｉＣ－Ｐ－Ｌｕｘは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ１５、αＰＤＬ１Ｎ、およびαＣＴＬＡ４Ｎを有するペンタシストロン性オペロンと、ｌｕｘオペロンとを含有する（Ｎ＝ナノボディ）
生物発光により腫瘍定着を追跡するために、ｌｕｘオペロンをｐＦｌｉＣ－Ｐプラスミドに挿入した。
ＧＡＴＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＴＴＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＧＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣ
３．ｐＦｌｉＣ－Ｐ－Ｌｕｘは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ１５、αＰＤＬ１Ｎ、およびαＣＴＬＡ４Ｎを有するペンタシストロン性オペロンと、ｌｕｘオペロンとを含有する（Ｎ＝ナノボディ）
生物発光により腫瘍定着を追跡するために、ｌｕｘオペロンをｐＦｌｉＣ－Ｐプラスミドに挿入した。
【0150】
ｐＧＲＧ３６－ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘを、ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘオペロンの供給源として使用した。
ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘオペロンを、以下のプライマーを用いてｐＬｕｘ（６）から増幅した。
ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘオペロンを、以下のプライマーを用いてｐＬｕｘ（６）から増幅した。
【0151】
Ｌｕｘ ＰａｃＩ Ｆｗｄ ６０．２：
５’ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＴＣ ＴＧ ３’
Ｌｕｘ ＸｈｏＩ Ｒｅｖ ６０．４：
５’－ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＴＡＡ Ｇ－３’
ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＧＲＧ３６（７）にライゲートした。組換えｐＧＲＧ３６－ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘプラスミドを、プラスミドの制限消化およびこのプラスミドを含む細菌の生物発光によって確認した。ｐＧＲＧ３６－ＬａｃＵＶ５－ＬｕｘプラスミドをＰａｃＩおよびＸｈｏＩで切断し、末端を平滑にした。ｐＦｌｉＣ－ＰをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端を平滑化し、アルカリホスファターゼで処置した。これらの２つの切断プラスミドをライゲートし、株χ６２１２を形質転換するのに使用した。得られたコロニーを生物発光についてスクリーニングし；プラスミドを陽性クローンから単離し、構築物をＰＣＲ及シークエンシングによって確認した。このプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し、プラスミドを形質転換体から単離した。このプラスミドを使用して株ＢＣＴ１４を形質転換し、Ｌｕｘ発現をコロニー生物発光によって再び確認した。
５’ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＴＣ ＴＧ ３’
Ｌｕｘ ＸｈｏＩ Ｒｅｖ ６０．４：
５’－ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＴＡＡ Ｇ－３’
ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＧＲＧ３６（７）にライゲートした。組換えｐＧＲＧ３６－ＬａｃＵＶ５－Ｌｕｘプラスミドを、プラスミドの制限消化およびこのプラスミドを含む細菌の生物発光によって確認した。ｐＧＲＧ３６－ＬａｃＵＶ５－ＬｕｘプラスミドをＰａｃＩおよびＸｈｏＩで切断し、末端を平滑にした。ｐＦｌｉＣ－ＰをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端を平滑化し、アルカリホスファターゼで処置した。これらの２つの切断プラスミドをライゲートし、株χ６２１２を形質転換するのに使用した。得られたコロニーを生物発光についてスクリーニングし；プラスミドを陽性クローンから単離し、構築物をＰＣＲ及シークエンシングによって確認した。このプラスミドを使用して株χ３７３０Ａを形質転換し、プラスミドを形質転換体から単離した。このプラスミドを使用して株ＢＣＴ１４を形質転換し、Ｌｕｘ発現をコロニー生物発光によって再び確認した。
【0152】
文献
【0153】
【表6】
【0154】
実施例ＩＶ
株の構築
ＢＣＴ２（χ１１０９１＋ｆｌｉＣ－ｆｌｊＢ－ｆｉｍＨ－ｒｆａＬ－ｐｇｔＥ＊）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ１１０９１を出発点として使用し、毒性低減のために以下の変更を行ったＢＣＴ２株を作製した：ｆｌｉＣ遺伝子の欠失；ｆｌｊＢ遺伝子の欠失；ｆｉｍＨ遺伝子の欠失；ｒｆａＬ遺伝子の欠失；および発現を増加させるために、ｐｇｔＥプロモーターにおける一ヌクレオチド変更
これらの変更は全て、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）を用いて行った。これらの実験の詳細は、以前に記載された（２）。
株の構築
ＢＣＴ２（χ１１０９１＋ｆｌｉＣ－ｆｌｊＢ－ｆｉｍＨ－ｒｆａＬ－ｐｇｔＥ＊）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ１１０９１を出発点として使用し、毒性低減のために以下の変更を行ったＢＣＴ２株を作製した：ｆｌｉＣ遺伝子の欠失；ｆｌｊＢ遺伝子の欠失；ｆｉｍＨ遺伝子の欠失；ｒｆａＬ遺伝子の欠失；および発現を増加させるために、ｐｇｔＥプロモーターにおける一ヌクレオチド変更
これらの変更は全て、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）を用いて行った。これらの実験の詳細は、以前に記載された（２）。
【0155】
ＢＣＴ２Ｅ（ＢＣＴ２＋ｅｃａ－）
腸内細菌共通抗原（３）遺伝子座（ｅｃａ）を、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および以下のプライマーを使用して、毒性を低減するためにＢＣＴ２において欠失させた：
ｅｃａ ＦＰ１：
ＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｅｃａ ＲＰ１：
ＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
腸内細菌共通抗原（３）遺伝子座（ｅｃａ）を、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および以下のプライマーを使用して、毒性を低減するためにＢＣＴ２において欠失させた：
ｅｃａ ＦＰ１：
ＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｅｃａ ＲＰ１：
ＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
【0156】
【表7】
【0157】
表１．株ＢＣＴ２およびＢＣＴ２Ｅの毒性。各々９匹のマウスの２つのコホートからのデータに基づいて、非腫瘍負荷Ｂａｌｂ／Ｃマウスの尾静脈に注射された株ＢＣＴ２Ｅは、株ＢＣＴ２で観察された毒性の半分未満をもたらす。全てのマウスは、以前に記載されたように（２、１１）１００マイクロリットルの注射を受け、以下のように改変された。２日目：（４ｍｇ／ｋｇ ＶＤＡ＋５０ｍｇ／ｋｇ ＣＢＤ）ＩＰ。０日目：４×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＬｕｘ）またはＢＣＴ２Ｅ（ｐＬｕｘ）－３時間－４×１０６ｃｆｕのＢＣＴ２（ｐＬｕｘ）またはＢＣＴ２Ｅ（ｐＬｕｘ）－２時間－（１ｍｇ／ｋｇ ＶＤＡ＋５０ｍｇ／ｋｇ ＣＢＤ）。０～３＝正常～不良のスケールで被毛／運動性を観察した。ＢＣＴ２コホートのうち、極度の体重減少を起こし瀕死になったマウス１匹と、１日目に死亡が確認されたＢＣＴ２Ｅコホートのマウス１匹は異常値とみなし、解析には含めなかった。
【0158】
ＢＣＴ５（ＢＣＴ２＋ｒｐｏＳ－＋ｖｉａＢ）
ｒｐｏＳ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子をコードする（４）。この遺伝子を、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および以下のプライマーを用いて欠失させた。
ｒｐｏＳ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子をコードする（４）。この遺伝子を、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および以下のプライマーを用いて欠失させた。
【0159】
ｒｐｏＳ ＦＰ１：
ＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｐｏＳ ＲＰ１：
ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２（５、６）からＶｉａＢ莢膜をコードする遺伝子座をＰＣＲ増幅し、λｒｅｄ組換え（７）を用いてａｔｔＴｎ７部位でＢＣＴ２染色体に挿入した。
ＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｐｏＳ ＲＰ１：
ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２（５、６）からＶｉａＢ莢膜をコードする遺伝子座をＰＣＲ増幅し、λｒｅｄ組換え（７）を用いてａｔｔＴｎ７部位でＢＣＴ２染色体に挿入した。
【0160】
ｖｉａＢ ＰＣＲフォワードプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴ－３’
ｖｉａＢ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ－３’
ＢＣＴ１４（ＢＢＣＴ２＋ｆｌｊＡ－ｒｆｌＰ－ｆｌｇＫＬ－ｍｏｔＡＢ－；ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊；ｅｃａ－）
細菌から発現された免疫調節因子を腫瘍微小環境に分泌するために鞭毛ＩＩＩ型分泌系（８）を利用し、毒性を更に低減するために、ＢＣＴ２株にいくつかの欠失を作製した。全ての変更は、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および示されたプライマーを用いて行った。
ｖｉａＢ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ－３’
ＢＣＴ１４（ＢＢＣＴ２＋ｆｌｊＡ－ｒｆｌＰ－ｆｌｇＫＬ－ｍｏｔＡＢ－；ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊；ｅｃａ－）
細菌から発現された免疫調節因子を腫瘍微小環境に分泌するために鞭毛ＩＩＩ型分泌系（８）を利用し、毒性を更に低減するために、ＢＣＴ２株にいくつかの欠失を作製した。全ての変更は、ＤＩＲｅｘプロトコル（１）および示されたプライマーを用いて行った。
【0161】
ｆｌｊＡ遺伝子の欠失
ｆｌｊＡ ＦＰ１：
ＡＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｊＡ ＲＰ１：
ＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＧＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｆｌＰ遺伝子の欠失
ｒｆｌＰ ＦＰ１：
ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＡＧＣＧＣＣＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧＴＡ ＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｆｌＰ ＲＰ１：
ＡＧＡＣＧＧＴＴＡＡＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧ ＴＡＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｇＫＬ遺伝子の欠失
ｆｌｇＫＬ ＦＰ１：
ＧＣＣＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｇＫＬ ＲＰ１：
ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｍｏｔＡＢ遺伝子の欠失
ｍｏｔＡＢ ＦＰ１：
ＣＴＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｍｏｔＡＢ ＲＰ１：
ＡＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＡ ＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
鞭毛遺伝子の発現のためのｆｌｈＤｐプロモーター配列を腫瘍特異的ＦＦ＋２０＊プロモーターで置き換えて（９）、これらの遺伝子の発現を腫瘍微小環境に限定した。
ｆｌｊＡ ＦＰ１：
ＡＴＴＣＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｊＡ ＲＰ１：
ＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＧＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｆｌＰ遺伝子の欠失
ｒｆｌＰ ＦＰ１：
ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＡＧＣＧＣＣＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧＴＡ ＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｒｆｌＰ ＲＰ１：
ＡＧＡＣＧＧＴＴＡＡＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧ ＴＡＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｇＫＬ遺伝子の欠失
ｆｌｇＫＬ ＦＰ１：
ＧＣＣＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｇＫＬ ＲＰ１：
ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｍｏｔＡＢ遺伝子の欠失
ｍｏｔＡＢ ＦＰ１：
ＣＴＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｍｏｔＡＢ ＲＰ１：
ＡＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＡ ＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
鞭毛遺伝子の発現のためのｆｌｈＤｐプロモーター配列を腫瘍特異的ＦＦ＋２０＊プロモーターで置き換えて（９）、これらの遺伝子の発現を腫瘍微小環境に限定した。
【0162】
プロモーター置き換え：ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊
ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊ＦＰ１－２：
ＧＧＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴ ＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊ＲＰ１：
ＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＢＣＴ２Ｅ株に関して毒性を低減するためのｅｃａ遺伝子座（３）の欠失
ｅｃａ ＦＰ１：
ＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｅｃａ ＲＰ１：
ＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ
ＰＬ－Ｌｕｘオペロンを、λｒｅｄ組換えを用いて染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入した（７）。この構築物において、ｌｕｘオペロンはλＰＬプロモーターによって駆動される（１０）。ｌｕｘオペロンを、ＰＬプロモーター配列および関連する制限酵素部位を含む以下のプライマーを用いてｐＬｕｘ（２）から増幅した。
ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊ＦＰ１－２：
ＧＧＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴ ＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｌｈＤｐ→ＦＦ＋２０＊ＲＰ１：
ＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＢＣＴ２Ｅ株に関して毒性を低減するためのｅｃａ遺伝子座（３）の欠失
ｅｃａ ＦＰ１：
ＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｅｃａ ＲＰ１：
ＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＢＣＴ１４－ＰＬ－Ｌｕｘ
ＰＬ－Ｌｕｘオペロンを、λｒｅｄ組換えを用いて染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入した（７）。この構築物において、ｌｕｘオペロンはλＰＬプロモーターによって駆動される（１０）。ｌｕｘオペロンを、ＰＬプロモーター配列および関連する制限酵素部位を含む以下のプライマーを用いてｐＬｕｘ（２）から増幅した。
【0163】
ＰＬ－Ｌｕｘ ＰａｃＩ Ｆｗｄ：
５’－ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＡＡ ＴＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＴＧＡ ＣＴＡ ＡＡ－３’
Ｌｕｘ ＸｈｏＩ Ｒｅｖ ６０．４：
５’－ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＴＡＡ Ｇ－３’
ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＧＲＧ３６（７）にライゲートした。組換えｐＧＲＧ３６－ＰＬ－Ｌｕｘプラスミドを、プラスミドの制限消化およびこのプラスミドを含む細菌の生物発光によって確認した。次いで、ｐＧＲＧ３６－ＰＬ－ＬｕｘからのＰＬ－Ｌｕｘオペロンを、λｒｅｄ組換え（７）を用いてＢＣＴ１３染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入し、続いてＢＣＴ２Ｅについて記載されるようにｅｃａ遺伝子座（３）を欠失させた。
５’－ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＡＡ ＴＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＴＧＡ ＣＴＡ ＡＡ－３’
Ｌｕｘ ＸｈｏＩ Ｒｅｖ ６０．４：
５’－ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＴＡＡ Ｇ－３’
ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＧＲＧ３６（７）にライゲートした。組換えｐＧＲＧ３６－ＰＬ－Ｌｕｘプラスミドを、プラスミドの制限消化およびこのプラスミドを含む細菌の生物発光によって確認した。次いで、ｐＧＲＧ３６－ＰＬ－ＬｕｘからのＰＬ－Ｌｕｘオペロンを、λｒｅｄ組換え（７）を用いてＢＣＴ１３染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入し、続いてＢＣＴ２Ｅについて記載されるようにｅｃａ遺伝子座（３）を欠失させた。
【0164】
文献
【0165】
【表8-1】
【0166】
【表8-2】
【0167】
実施例Ｖ
株：
ＢＣＴ１５（ＢＣＴ１４＋ｖｉａＢ遺伝子座）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２（χ８０７３）（１、２）からＶｉａＢ莢膜をコードする遺伝子座をＰＣＲ増幅し、λｒｅｄ組換え（３）を用いてＢＣＴ１４染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入した。
株：
ＢＣＴ１５（ＢＣＴ１４＋ｖｉａＢ遺伝子座）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２（χ８０７３）（１、２）からＶｉａＢ莢膜をコードする遺伝子座をＰＣＲ増幅し、λｒｅｄ組換え（３）を用いてＢＣＴ１４染色体のａｔｔＴｎ７部位に挿入した。
【0168】
ｖｉａＢ ＰＣＲフォワードプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴ－３’
ｖｉａＢ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ－３’
ＢＣＴ１６（ＢＣＴ１４＋ｇｌｍＳ－）
株χ６２１２、χ３７３０Ａ、およびＢＣＴ１４においてｇｌｍＳ遺伝子（４）を欠失させ、ａｓｄ欠失に加えて別の平衡致死性選択をもたらした。ＤＩＲｅｘプロトコル（５）を、ＢＣＴ１４における欠失のために以下のプライマーを用いて使用した。
ｖｉａＢ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ－３’
ＢＣＴ１６（ＢＣＴ１４＋ｇｌｍＳ－）
株χ６２１２、χ３７３０Ａ、およびＢＣＴ１４においてｇｌｍＳ遺伝子（４）を欠失させ、ａｓｄ欠失に加えて別の平衡致死性選択をもたらした。ＤＩＲｅｘプロトコル（５）を、ＢＣＴ１４における欠失のために以下のプライマーを用いて使用した。
【0169】
ｇｌｍＳ ＦＰ１
【0170】
【化1】
【0171】
ｇｌｍＳ ＲＰ１
【0172】
【化2】
【0173】
プラスミド：
ｐＧｌｍＳ
ｐＧｌｍＳは、ＢＣＴ１６におけるｇｌｍＳ染色体欠失を補完するｇｌｍＳ遺伝子を含有する。ｐＧｌｍＳを構築するために、ｐＮＧ．１プラスミドをＢｓｐＨ１およびＢｓｐＥ１で消化し、ＢｓｐＨ１およびＥｃｏＲ１－ＨＦで切断したｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ１、ならびにＥｃｏＲ１－ＨＦおよびＢｓｐＥ１で切断したｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ２にライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてｐＧｌｍＳ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａ ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドを形質転換体から単離した。
ｐＧｌｍＳ
ｐＧｌｍＳは、ＢＣＴ１６におけるｇｌｍＳ染色体欠失を補完するｇｌｍＳ遺伝子を含有する。ｐＧｌｍＳを構築するために、ｐＮＧ．１プラスミドをＢｓｐＨ１およびＢｓｐＥ１で消化し、ＢｓｐＨ１およびＥｃｏＲ１－ＨＦで切断したｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ１、ならびにＥｃｏＲ１－ＨＦおよびＢｓｐＥ１で切断したｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ２にライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドをシークエンシングしてｐＧｌｍＳ構築物を確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０Ａ ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドを形質転換体から単離した。
【0174】
ｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ１（１０５８ｂｐ）
【0175】
【化3】
【0176】
ｐＧｌｍＳ ｇＢｌｏｃｋ２（２４０４ｂｐ）
【0177】
【化4】
【0178】
ｐＧｌｍＳ－ＣＸＣＬ９－１０
ｐＧｌｍＳ－ＣＸＣＬ９－１０を作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドをＮｈｅＩで消化し、平滑末端化し、アルカリホスファターゼで処置した。ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０をＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、平滑末端化し、消化したｐＧｌｍＳプラスミドにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
ｐＧｌｍＳ－ＣＸＣＬ９－１０を作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドをＮｈｅＩで消化し、平滑末端化し、アルカリホスファターゼで処置した。ｐＦｌｉＣ－ＣＸＣＬ９－１０をＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、平滑末端化し、消化したｐＧｌｍＳプラスミドにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳを形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
【0179】
ｐＧｌｍＳ－ａＣＤ４７Ｎ（Ｎ＝ナノボディ）
ｐＧｌｍＳ－ａＣＤ４７を作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドをＮｈｅＩで消化し、平滑末端化し、アルカリホスファターゼで処置した。ｐＦｌｉＣ－ａＣＤ４７をＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、平滑末端化し、消化したｐＧｌｍＳプラスミドにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳ－を形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
ｐＧｌｍＳ－ａＣＤ４７を作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドをＮｈｅＩで消化し、平滑末端化し、アルカリホスファターゼで処置した。ｐＦｌｉＣ－ａＣＤ４７をＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、平滑末端化し、消化したｐＧｌｍＳプラスミドにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳ－を形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
【0180】
ｐＧｌｍＳ－ＩＮＦ（インターフェロンα＋λバイシストロン性オペロン）
ｐＧｌｍＳ－ＩＮＦを作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドおよびｐＧｍｓＳ－ＩＮＦ ｇＢｌｏｃｋをＮｈｅＩおよびＢｓａＩで消化した。消化したｐＧｌｍＳプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳ－を形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
ｐＧｌｍＳ－ＩＮＦを作製するために、ｐＧｌｍＳプラスミドおよびｐＧｍｓＳ－ＩＮＦ ｇＢｌｏｃｋをＮｈｅＩおよびＢｓａＩで消化した。消化したｐＧｌｍＳプラスミドをアルカリホスファターゼで処置し、消化したｇＢｌｏｃｋにライゲートした。ライゲーションを使用して株χ６２１２ｇｌｍＳ－を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド構築物をシークエンシングによって確認した。正しいプラスミドを使用して株χ３７３０ＡｇｌｍＳ－を形質転換し；プラスミドを形質転換体から単離し、株ＢＣＴ１６を形質転換するのに使用した。
【0181】
ｐＧｌｍＳ－ＩＮＦ ｇＢｌｏｃｋ（１７１０ｂｐ）
【0182】
【化5】
【0183】
文献
【0184】
【表9】
【0185】
いくつかの実施形態
１．弱毒化サルモネラ菌細胞であって、
ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子における変異または欠失であって、該１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、変異または欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、細胞。
１．弱毒化サルモネラ菌細胞であって、
ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子における変異または欠失であって、該１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、変異または欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、細胞。
【0186】
２．Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である、実施形態１に記載の細胞。
３．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、実施形態１または２に記載の細胞。
３．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、実施形態１または２に記載の細胞。
【0187】
４．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の細胞。
５．１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の細胞。
５．１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の細胞。
【0188】
６．腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の細胞。
７．ｒｐｏＳ遺伝子の欠失、ｇｌｍＳの欠失、および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の細胞。
７．ｒｐｏＳ遺伝子の欠失、ｇｌｍＳの欠失、および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の細胞。
【0189】
８．ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を更に含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の細胞。
９．ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、実施形態１～８のいずれか１つに記載の細胞。
９．ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、実施形態１～８のいずれか１つに記載の細胞。
【0190】
１０．腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊プロモーターである、実施形態９に記載の細胞。
１１．細胞は、外因性免疫調節因子タンパク質を発現する１以上の外因性免疫調節因子遺伝子を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞。
１１．細胞は、外因性免疫調節因子タンパク質を発現する１以上の外因性免疫調節因子遺伝子を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞。
【0191】
１２．免疫調節因子遺伝子が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９－１０、αＣＴＬＡ－４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、αＣＴＬＡ－４単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、αＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂおよび／またはαＣＤ４７ ｓｄＡｂを発現する、実施形態１１に記載の細胞。
【0192】
１３．免疫調節因子タンパク質が細胞から分泌されている、実施形態１１～１２のいずれか１つに記載の細胞。
１４．１以上の外因性免疫調節因子遺伝子が、腫瘍特異的発現プロモーターの制御下にある、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の細胞。
１４．１以上の外因性免疫調節因子遺伝子が、腫瘍特異的発現プロモーターの制御下にある、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の細胞。
【0193】
１５．腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊である、実施形態１４に記載の細胞。
１６．実施形態１～１５のいずれか１つに記載の細胞集団またはその組み合わせと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物。
１６．実施形態１～１５のいずれか１つに記載の細胞集団またはその組み合わせと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物。
【0194】
１７．がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態１～１５のいずれか１つに記載の細胞集団、その組み合わせ、または実施形態１６に記載の組成物を、がんを処置するように投与することを含む、方法。
【0195】
１８．腫瘍成長／増殖を阻害するか、または腫瘍の体積／サイズを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍成長を抑制するか、または腫瘍の体積を減少させるように、有効量の実施形態１～１５のいずれか１つに記載の細胞集団、その組み合わせ、または実施形態１６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【0196】
１９．転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害する方法であって、それを必要とする対象に、転移を処置する、転移の形成／数を減少させる、または転移の広がりを阻害するように、有効量の実施形態１～１５のいずれか１つに記載の細胞集団、その組み合わせ、または実施形態１６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【0197】
２０．腫瘍、がん、または転移が、肺、肝臓、腎臓、乳房、前立腺、膵臓、結腸、頭頸部、卵巣、および／もしくは消化器系腫瘍、腫瘍関連細胞、がん、または転移である、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0198】
２１．細胞または組成物が、全身投与、例えば静脈内投与される、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．細胞が２回以上投与される、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の方法。
２２．細胞が２回以上投与される、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
２３．血管破壊剤（ＶＤＡ）および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）を投与することを更に含む、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．ＶＤＡおよび／またはＣＢＤが、処置前および／または処置中に（細胞の少なくとも１回の投与後に）投与される、実施形態２４に記載の方法。
２４．ＶＤＡおよび／またはＣＢＤが、処置前および／または処置中に（細胞の少なくとも１回の投与後に）投与される、実施形態２４に記載の方法。
【0200】
２５．ＶＤＡおよび／またはＣＢＤが２回以上投与される、実施形態２３または２４に記載の方法。
２６．ＶＤＡが、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェートおよび／またはＶＤＡ ＣＫＤ－５１６である、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
２６．ＶＤＡが、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ４ホスフェートおよび／またはＶＤＡ ＣＫＤ－５１６である、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
【0201】
２７．抗インターロイキン－６（ＩＬ－６）が投与される、実施形態１７～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．サルモネラ菌の毒性を低減する方法であって、該サルモネラ菌が、
ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子の欠失であって、該１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、方法。
２８．サルモネラ菌の毒性を低減する方法であって、該サルモネラ菌が、
ａ）ＩＬ－６分泌を誘導する細胞表面タンパク質をコードする１以上のサルモネラ菌遺伝子の欠失であって、該１以上の細胞表面タンパク質の発現が減少するかまたは全く発現しなくなる、欠失と、任意選択で、
ｂ）対照細胞と比較して、補体活性化を阻害する１以上の外膜プロテアーゼの発現の増加、および／または細胞表面リポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）の発現の減少と、
を含む、方法。
【0202】
２９．サルモネラ菌が、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３０．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、実施形態２８または２９に記載の方法。
３０．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、フラジェリン、フィンブリア、Ｏ抗原、および／またはリポ多糖タンパク質（ＬＰＳ）をコードする、実施形態２８または２９に記載の方法。
【0203】
３１．１以上のサルモネラ菌遺伝子が、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ、ｆｉｍＨ、および／またはｒｆａＬである、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の方法。
３２．１以上の外膜プロテアーゼがＰｇｔＥである、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の方法。
【0204】
３３．腸内細菌共通抗原遺伝子座（ｅｃａ）の欠失を更に含む、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．ｒｐｏＳ遺伝子の欠失および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、実施形態２８～３３のいずれか１つに記載の方法。
３４．ｒｐｏＳ遺伝子の欠失および／またはｖｉａＢ遺伝子座の付加を更に含む、実施形態２８～３３のいずれか１つに記載の方法。
【0205】
３５．ｆｌｊＡ、ｒｆｌＰ、ｆｌｇＫＬ、および／またはｍｏｔＡＢ遺伝子の１つ以上の欠失を更に含む、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、実施形態２８～３５のいずれか１つに記載の方法。
３６．ｆｌｈＤＰプロモーターが腫瘍特異的発現プロモーターで置き換えられている、実施形態２８～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
３７．腫瘍特異的発現プロモーターが、ＦＦ＋２０＊プロモーターである、請求項３６に記載の方法。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個別の刊行物、特許、または特許出願の各々が、具体的かつ個別に、参照により組み込まれるように示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる用語の定義が、本明細書で定義される用語と矛盾する場合、本明細書が優先するものとする。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個別の刊行物、特許、または特許出願の各々が、具体的かつ個別に、参照により組み込まれるように示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる用語の定義が、本明細書で定義される用語と矛盾する場合、本明細書が優先するものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】