特表 2024-533407 無機ピロリン酸の濃度を決定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】無機ピロリン酸の濃度を決定するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20240905BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20240905BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20240905BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

C12Q1/66

C12Q1/48 Z

C12N9/12

C12N9/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024515504

(86)(22)【出願日】2022-09-09

(85)【翻訳文提出日】2024-03-12

(86)【国際出願番号】 EP2022075142

(87)【国際公開番号】W WO2023036949

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】21306235.9

(32)【優先日】2021-09-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】505351201

【氏名又は名称】セントレ ナシオナル デ ラ ルシェルシェ シエンティフィーク

(71)【出願人】

【識別番号】520100435

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・コート・ダジュール

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃｏｔｅ ｄ’Ａｚｕｒ

(71)【出願人】

【識別番号】517442373

【氏名又は名称】シュ デ ニース

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(72)【発明者】

【氏名】デュラントン クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ルベラ イザベル

(72)【発明者】

【氏名】ファヴレ ギヨーム アレクサンドレ

(72)【発明者】

【氏名】ローレン オードリー

(72)【発明者】

【氏名】レフテリオティス ジョルジュ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA13

2G045AA16

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB07

2G045DB04

2G045FB01

2G045FB06

2G045GC15

2G045JA01

4B063QA01

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ22

4B063QQ27

4B063QQ63

4B063QR02

4B063QR07

4B063QR42

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4B063QR72

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS28

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

生物学的試料中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）のレベルを決定するための方法であって、ａ）酵素反応に基づくアッセイを使用した、生体試料の第１の画分におけるＰＰｉの濃度の測定、ｂ）イオンクロマトグラフィーに基づくアッセイを使用した、生体試料の第２の画分におけるＰＰｉの濃度の測定、ｃ）ステップａ）で測定された値とステップｂ）で測定された値との比較、及び差が所定の閾値を上回るかを評価することを含む、方法。ステップａ）及びステップｂ）でそれぞれ測定された値の間の差が、所定の閾値以下である場合、生体試料中のＰＰｉの濃度は、ステップａ）及びステップｂ）で測定された当該値の平均として決定される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）のレベルを決定するための方法であって、
ａ）酵素反応に基づくアッセイを使用して、前記生体試料の第１の画分におけるＰＰｉの濃度を測定すること
ｂ）イオンクロマトグラフィーに基づくアッセイを使用して、前記生体試料の第２の画分におけるＰＰｉの濃度を測定すること
ｃ）ステップａ）で測定された値とステップｂ）で測定された値とを比較して、差が所定の閾値を超えるかを評価すること
ｄ）ステップａ）及びステップｂ）でそれぞれ測定された前記値の間の前記差が前記所定の閾値以下である場合、前記生体試料中のＰＰｉの前記濃度が、ステップａ）及びステップｂ）で測定された前記値の平均として決定され、ステップａ）及びステップｂ）でそれぞれ測定された前記値の間の前記差が前記所定の閾値を超える場合、ステップａ）～ｃ）が、前記生体試料の新たな画分に対して繰り返されること、を含む、方法。

【請求項2】

前記所定の閾値が、１５％に等しい、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記所定の閾値が、１０％に等しい、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ステップａ）の酵素アッセイが、
ｉ）ＡＴＰスルフリラーゼによって触媒される反応によってＰＰｉをＡＴＰに変換するステップ
ｉｉ）ルシフェリンの存在下でルシフェラーゼを使用してＡＴＰから光を生成するステップ
ｉｉｉ）前記試料中のＰＰｉの尺度として生成された生物発光を検出するステップ、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ステップａ）において、増加していく濃度の外因性ＰＰｉを前記生体試料の画分に添加すること、及び外因性ＰＰｉを含有する前記画分に対して酵素反応に基づく前記アッセイを行うことによって、較正曲線が最初に確立される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ステップｂ）において、前記イオンクロマトグラフィーを行う前に、前記生体試料の前記画分にカルシウムキレート剤を添加する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記カルシウムキレート剤が、ＥＧＴＡである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記生体試料が、血液、血漿、尿、唾液、滑液、ＣＳＦ、及び細胞培養培地から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ステップａ）を行う前に、タンパク質、脂質、細胞、及び細胞断片から選択される汚染物質の存在を除去又は低減するための前記生体試料の前処理を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

限外濾過及び遠心分離から選択される方法による前記生体試料の前記前処理を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ステップａ）において、前記生体試料中の基礎ＡＴＰレベルによって生成される前記生物発光が、ＡＴＰスルフリラーゼを添加することによって測定される前記生物発光から減算される、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ステップａ）において、組換えルシフェラーゼを使用して生物発光を生成する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

個体における調節解除された無機ピロリン酸レベルに関連する状態を検出するためのインビトロ方法であって、前記個体由来の生体試料を、前記生体試料中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の前記レベルを決定するための請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に供することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、無機ピロリン酸のレベルの決定、より具体的には、生体試料中の無機ピロリン酸のレベルを決定するための方法に関する。本発明はまた、異常なレベルの循環無機ピロリン酸に関連する状態のインビトロ検出のための方法に関する。

【0002】

無機ピロリン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＰｉ）は、ミネラル沈着及びいくつかの細胞内化合物の生合成を調節する重要な因子である。現在、循環ＰＰｉが、血管壁、腎臓、細胞周囲骨基質を含む様々な結合組織におけるヒドロキシアパタイトの望ましくない結晶化を防止することが実証されている（総説について、Ｔｅｒｋｅｌｔａｕｂ，２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１，Ｃ１～Ｃ１１を参照されたい）。インビトロ実験において、マイクロモルのＰＰｉは、ミリモルのカルシウム及びリン酸溶液を阻害して不溶性ヒドロキシアパタイト結晶を形成する能力を有する。

【0003】

循環ＰＰｉのレベルは、いくつかのタンパク質の活性に関連している。これらのタンパク質のうちの１つの機能を変化させるいくつかの遺伝性変異は、異所性組織石灰化に関連するＰＰｉ欠損の中心的役割を強調している。

【0004】

生体液中のＰＰｉレベルの測定は、現在、５０年以上前から行われている。異なる技術的アプローチが、放射性、比色、酵素、及びクロマトグラフィー技法に及んで開発されている。しかしながら、ヒト血漿中に検出される正確な濃度のＰＰｉは、異なる試験間で大きく変動している。

【0005】

生体試料中のＰＰｉ濃度は、最初にＦｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａｒｏｗの方法（Ｆｉｓｋｅ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒｏｗ，１９２５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６，３７５－４００）を使用して測定され、これは、ＰＰｉのリン酸への酸加水分解及び続いてその定量化を介して機能する。しかし、この方法は、その低い感度及びリン酸の内因的存在との相互作用によって強く制限された。

【0006】

３２Ｐピロリン酸を使用する同位体希釈に基づく放射性方法を使用した健常なヒト血漿中のＰＰｉレベルの定量化によって、血漿ＰＰｉ濃度が１．２～最大５．６μＭの範囲であり、３．５０±０．１１μＭの平均を有することが報告された（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７１，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）。試料からリン酸及びタンパク質を除去した後に酵母ピロホスファターゼによる、還元されたリンモリブデン酸の測定を通した分光定量化に基づく方法（Ｓｉｌｃｏｘ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｙ，１９７３ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２，１８６３－１８７０）によって、健常な患者血漿中で１．８０±０．０６μＭの値（０．１６～３．４μＭの範囲）が報告された。新たに形成されたＮＡＤＰＨの蛍光測定と結合させたＵＤＰＧ－ピロホスホリラーゼ酵素方法を使用して、Ｌｕｓｔ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｓｔ ａｎｄ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ，１９７６ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６６，２４１－２４９）は、２．７２±０．１４μＭのＰＰｉ濃度を見出した。影響力のある試験において、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２２，８８６－８９１）は、いくつかの試験からのＰＰｉの血漿濃度を再検討し、「平均正常血漿ＰＰｉが低い１．８μＭから高い３．５μＭまで変動するため、１つ以上の未制御変数の存在の可能性を推測することができる」という結論に至った。その後、Ｌｏｍａｓｈｖｉｌｉ ｅｔ ａｌ．は、Ｌｕｓｔ ａｎｄ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒから改良した［１４Ｃ］ＵＤＰグルコースを使用する方法を記載し、正常な対象におけるＰＰｉの３．０μＭの平均血漿レベルを示した（Ｌｏｍａｓｈｖｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１６，２４９５－２５００）。

【0007】

Ｐｒｏｓｄｏｃｉｍｏ ｅｔ ａｌ（２００９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２９６，Ｃ８２８－Ｃ８３９．）は、生体液中のＰＰｉ濃度を定量化するために、ＰＰｉのＡＴＰへの変換に基づく酵素方法を使用し、著者らは、健常な患者における１．３９±０．３０μＭのＰＰｉ濃度を報告した。より最近では、この方法を使用して、ヒト健常ボランティアで行われた試験は、約１．１μＭのＰＰｉ濃度を示した（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３４，１９８５－１９８９）が、第２の試験は、μＭ範囲未満の基礎ＰＰｉ濃度を示した。

【0008】

異なる方法で得られた血漿ＰＰｉ濃度の値の不一致は、異なる試験間のデータの比較を強く制限し、ＰＰｉを臨床バイオマーカーとして使用する可能性を排除する。

【0009】

したがって、正確で再現性がある、生体液中のＰＰｉの濃度を決定するための方法が必要とされている。

【0010】

また、ミネラル及び骨障害並びに異所性石灰化などの、個体における調節解除されたＰＰｉレベルに関連する状態を検出及び監視することを可能にするインビトロ方法が必要とされている。

【0011】

また、石灰化の障害に関連する状態の治療を、期間中に再現性がある生物学的マーカーを測定することによって監視するための信頼できる方法が必要とされている。

【0012】

これは、ＰＰｉ濃度を定量化する２種類の技術、すなわち酵素方法及びイオンクロマトグラフィー方法を組み合わせた技術によって達成できることが、本発明の文脈において見出されている。

【0013】

これは、本発明が、生体試料中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）のレベルを決定するための方法に関する理由であり、方法は、
ａ）酵素反応に基づくアッセイを使用して、生体試料の第１の画分におけるＰＰｉの濃度を測定すること
ｂ）イオンクロマトグラフィーに基づくアッセイを使用して、生体試料の第２の画分におけるＰＰｉの濃度を測定すること
ｃ）ステップａ）で測定された値とステップｂ）で測定された値とを比較して、差が所定の閾値を超えるかを評価すること。
ｄ）ステップａ及びステップｂでそれぞれ測定された値の間の差が所定の閾値以下である場合、生体試料中のＰＰｉの濃度は、ステップａ）及びステップｂ）で測定された当該値の平均として決定されること、を含む。

【0014】

ステップａ）及びステップｂ）でそれぞれ測定された値の間の差が所定の閾値を超える場合、いずれの値も生体試料中のＰＰｉの濃度に対応するとみなされず、試験は偽としてみなされる。

【0015】

有利には、ステップｃ）の後、ステップａ）及びステップｂ）でそれぞれ測定された値の間の差が所定の閾値を超える場合、ステップａ）～ｃ）が、生体試料の新たな画分に対して繰り返される。

【0016】

驚くべきことに、いずれかの方法によって得られた結果に大きな変動性が存在するが、ＰＰｉについて測定された値のクロスコントロールを実現する２つの方法の使用により、生体試料中の実際の濃度に対応する正確なＰＰｉ濃度を計算することが可能となることが認められている。ＰＰｉは、各方法についてそれぞれ得られた値の平均値として計算される。

【0017】

２つの技術を用いてそれぞれ測定された値について許容可能な差における適切な所定の閾値の選択は、非常に良好な相関指標を与える。それにより、バイアス及び外れ値測定を排除することが可能となる。

【0018】

実施形態により、所定の閾値は、１５％に等しい。

【0019】

本発明による方法は、次いで、以下のステップ：
ａ）酵素反応に基づくアッセイを使用して、生体試料の第１の画分におけるＰＰｉの濃度を測定するステップ
ｂ）イオンクロマトグラフィーに基づくアッセイを使用して、生体試料の第２の画分におけるＰＰｉの濃度を測定するステップ
ｃ）ステップａで測定された値とステップｂで測定された値とを比較して、差が約１５％を超えるかを評価するステップ
ｄ）ステップａ及びステップｂでそれぞれ測定された値の間の差が１５％以下である場合、生体試料中のＰＰｉの濃度が、ステップａ及びステップｂで測定された当該値の平均として決定されるステップ、を含む。

【0020】

ステップａ及びステップｂでそれぞれ測定された値の間の差が１５％を超える場合、ステップａ～ｃが繰り返される。

【0021】

ＰＰｉ濃度は、好ましくはモル濃度（マイクロモル／体積）として表される。

【0022】

所定の閾値は、当業者によって適用され、それは、例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、又は特に１０％に等しくあり得る。

【0023】

酵素アッセイによって測定された値（Ｖ_ｅｎｚ）とイオンクロマトグラフィーに基づくアッセイによって測定された値（Ｖ_ｉｃ）との差は、［Ｖ_ｅｎｚ－Ｖ_ｉｃ］／Ｖ_ｅｎｚとして計算することができる。

【0024】

１５％の所定の閾値を用いて、アッセイされた試料の３０％程度について、測定ａ）～ｃ）を繰り返すことが必要であり得る。

【0025】

１０％の所定の閾値では、アッセイされた試料の５０％程度について、測定ａ～ｃを繰り返すことが必要であり得る。

【0026】

矛盾する結果のこれらのパーセンテージは変動し得、例示としてのみ与えられる。

【0027】

好ましくは、ステップａ）の酵素アッセイは、酵素の存在下でのＰＰｉのＡＴＰへの変換、続いて、光学シグナル、好ましくは化学発光シグナル又は蛍光シグナルの生成をもたらすＡＴＰの変換に基づいている。

【0028】

好ましくは、ステップａ）の酵素アッセイは、ＰＰｉが、酵素スルフリラーゼによって、より具体的には酵素ＡＴＰスルフリラーゼによって触媒される反応によってＡＴＰに変換される、第１のステップｉ）を含む。このステップｉ）は、ヌクレオチドの存在下で、より具体的にはアデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）の存在下で行われる。

【0029】

ステップａ）の酵素アッセイは、第２のステップを含み、新たに合成されたＡＴＰが、続いてルシフェリン／ルシフェラーゼ生物発光アッセイを使用して定量化される。システムは、ルシフェリン／ルシフェラーゼシステムによって光を生成するＡＴＰの分解、及び生成された光の測定を含む。当該反応は当技術分野で既知であり、例えば、Ｎｙｒｅｎ ｅｔ ａｌ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５０４，１９８５）又はＲｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：３６３，１９９８）によって記載された。

【0030】

簡潔に述べると、ＡＴＰは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介性変換を駆動し、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生成する。ルシフェラーゼ触媒反応で生成された光は、例えば、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ、ＣＣＤ）カメラ、フォトダイオード、及び／又は光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ、ＰＭＴ）によって検出され得る。光シグナルは、ＰＰｉの初期濃度に比例する。検出されたシグナルは、結果に対応するシステム出力に変換することができ、ユーザは見ることができる。

【0031】

典型的には、ステップａ）の酵素アッセイは、
ｉ）ＡＴＰスルフリラーゼによって触媒される反応によってＰＰｉをＡＴＰに変換するステップ
ｉｉ）ルシフェリンの存在下でルシフェラーゼを使用してＡＴＰから光を生成するステップ
ｉｉｉ）試料中のＰＰｉの尺度として生成された生物発光を検出するステップ、を含む。

【0032】

好ましい実施形態では、組換えルシフェラーゼタンパク質をステップｉｉ）で使用して、経時的に（少なくとも１０分間）安定性及び信頼性のある発光を生成する。かかるタンパク質は、特にＡＴＰ決定キット（（ＡＴＰｌｉｔｅ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で市販されており、これは製造業者の説明書に従って使用される。

【0033】

本発明の好ましい実施形態では、較正曲線は、標準外因性ＰＰｉ溶液を生体試料の画分に添加すること、及び外因性ＰＰｉを含有する当該画分に対して、本明細書で上記に開示されるように、酵素反応に基づくアッセイを行うことによって実現される。標準曲線は、増加していく濃度の当該外因性ＰＰｉを含有する媒体中で生成された光学シグナル、より具体的には生物発光を測定することによって得られる。

【0034】

本発明において、媒体の組成が、反応に関与する酵素（例えば、ＡＴＰ－スルフリラーゼ及び／又はルシフェラーゼ）の活性に影響を及ぼし、したがって、測定の再現性を変化させることができることが証明されている。本実験において示されるように、マトリックス（イオン、タンパク質、物質）は、酵素反応の測定を変化させ得る。結果として、水、ＨＢＳＳ、又は尿などの異なる媒体中で測定された生物発光は、同じＰＰｉ濃度について大きく変動する可能性があり、較正曲線はそのまま置き換え可能ではない。

【0035】

好ましい実施形態により、各試料について、酵素反応に基づくアッセイで生体試料中のＰＰｉの濃度を測定する前に、較正曲線が確立される。各生体試料を、増加していく濃度の外因性ＰＰｉでスパイクし（新鮮なＰＰｉ溶液の添加）、各生体試料のＰＰｉ濃度は、それ自体の直線回帰方程式を使用して決定される。

【0036】

ステップｂ）において、ＰＰｉの検出は、イオンクロマトグラフィー（ｉｏｎｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＣ）方法を使用して行われる。ＩＣ方法による投与量は、ＨＰＬＣ方法をイオン伝導度の検出器（伝導度測定法）と組み合わせる。ＩＣ方法は、ＰＰｉ濃度の増加に比例したそれらの表面の増加を示した有意なピーク（溶離プロトコル及びこのステップに使用されるカラムによる保持時間およそ２３分、下記を参照されたい）を検出することを可能にする。

【0037】

異なる濃度のＰＰｉについて測定されたピーク面積（μｓ・分－１）の計算は、水中又はＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳ溶液中の溶液間で有意には異ならず、マトリックスの組成がこのＩＣ技術を使用するＰＰｉ濃度に対して影響を有しないことを示唆している。

【0038】

ＩＣ分析は、当技術分野で既知のクロマトグラフィーシステムを使用して行うことができ、例えば、イオンクロマトグラフィーＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－５０００ ｐｌｕｓシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって市販されている）を使用することができる。システムは、オートサンプラー、ポンプ、溶離液発生器、及び導電率検出器を含む。システムは、溶離液発生器（ＫＯＨ、５００ｍＭ）、ガードプレカラム（ＡＧ１１－ＨＣ、ＲＦＩＣ、２×５０ｍｍ）、及びＰＰｉの検出のための分析用アニオンカラム（ＩｏｎＰａｃ ＡＳ－１１－ＨＣ、２×２５０ｍｍ、ＲＦＩＣ）が装備される。

【0039】

ＰＰｉ測定のため、試料が注入され、溶出プロトコルが、ＫＯＨ続いて線形増加期間を用いて一般に行われ、戻り期間前に安定期間に達する。

【0040】

条件は、好ましい実施形態では、注入ループ：１０μｌであり得る。溶出時間２７分は、７ｍＭのＫＯＨで０～２分、７ｍＭから開始して４５ｍＭまで２～２２分の勾配、５０ｍＭのＫＯＨで２２～２５分、７ｍＭで２５分～２７分を含む。

【0041】

ＰＰｉピークの定量化は、表面積を測定し、対応する標準曲線と比較することによって、適合したソフトウェアを使用して行うことができる。

【0042】

好ましくは、ステップｂ）において、イオンクロマトグラフィーに基づくアッセイによってＰＰｉ濃度を測定する前に、ＥＧＴＡ［エチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸］などのカルシウムキレート剤を生体試料に添加する。かかるカルシウムキレート剤は、カルシウムイオンと錯体を形成することができる。有利には、カルシウムキレート剤は、ＰＰｉの保持ピークとは異なるＩＣにおける保持ピークを示す。本発明に適合したカルシウムキレート剤は、特に、ＥＧＴＡ及びＥＧＴＡの誘導体から選択される。

【0043】

ＰＰｉのレベルを決定するための方法は、ヒト又はげっ歯類（マウス、ラット、・・・）などの哺乳動物由来の生体試料に特に適合される。生体試料は、特に、血液、血漿、尿、唾液、滑液、ＣＳＦ（脳脊髄液）、及び細胞培養培地から選択することができる。

【0044】

本発明の方法の特定の実施形態において、生体試料は、ステップａ）～ｃ）を行う前に、分析前処理に供される。

【0045】

特に、生体試料は、汚染物質の存在を除去又は低減するために前処理に供され、当該汚染物質は、例えば、タンパク質、脂質、細胞（血小板など）、及び細胞断片（赤血球、白血球、血小板・・・）から選択される。当該汚染物質は、試料中の低濃度のＰＰｉの測定に干渉する可能性がある。かかる前処理は、特に、限外濾過である。

【0046】

本発明に適合される前処理としては、遠心分離、限外濾過、及び／又は凝固が挙げられるが、これらに限定されない。限外濾過のためのカットオフは、特に、血液及び血漿試料のために、血漿タンパク質（例えばアルブミン、・・・）及び細胞（血小板及び単球）又はこれら細胞の断片を排除するように選択される。

【0047】

例えば、イオンクロマトグラフィーアッセイの前に、試料はまた、アセトニトリルなどのタンパク質の沈殿を誘導する薬剤による処理に供される。

【0048】

有利には、ステップａ）における酵素アッセイでは、生体試料中の基礎ＡＴＰレベルによって生成された生物発光は、ＡＴＰスルフリラーゼの添加によって得られた生物発光から減算され、生体試料にＡＴＰスルフリラーゼを添加した後に観察された全生物発光は、試料中に存在する基底ＡＴＰ及びＡＴＰスルフリラーゼによるＰＰｉの変換によって生成されたＡＴＰの両方のルシフェリン／ルシフェラーゼ反応に対応する。試料中のＰＰｉのより正確な測定を得るために、ＡＴＰスルフリラーゼが不活性化されている、特に熱不活性化されている試料中で得られた生物発光が測定され、値は試料中のＡＴＰの基礎濃度に対応する。

【0049】

プロセスの概略図が図２に示される。

【0050】

２つの溶液が必要とされる。溶液Ａは、ＡＴＰスルフリラーゼ及びＡＰＳを含有する。ＡＴＰスルフリラーゼを含有する溶液Ｂを処理してＡＴＰスルフリラーゼを不活性化し、次いでＡＰＳを添加する。各試料又は標準の小分けを２つの異なるウェルに加える。ウェルに溶液Ａを添加する。第２のウェルに、同量の溶液Ｂを添加する。次いで、プレートを、例えば３７℃で３０分間、続いて９０℃で１０分間インキュベートして、ＡＴＰスルフリラーゼを不活性化する。生成したＡＴＰを、組換えルシフェラーゼタンパク質を使用して発光によって定量化する。発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＬＵＭ）を測定する。ＰＰｉ値が、溶液Ｂで測定された基礎ＡＴＰレベルを減算することによって得られる。

【0051】

本発明はまた、個体における調節解除された無機ピロリン酸レベルに関連する状態を検出するためのインビトロ方法に関するものであり、方法は、当該個体由来の生体試料を、当該生体試料中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）のレベルを決定するための上記に開示される方法に供することを含む。

【0052】

ＰＰｉは実際に、石灰化の生理学的阻害因子である。

【0053】

ＡＢＣＣ６変異は、いくつかの特定の組織における弾性線維の石灰化を特徴とする遺伝性疾患弾力線維性仮性黄色腫（ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍａ ｅｌａｓｔｉｃｕｍ、ＰＸＥ）を引き起こす。ＰＸＥ表現型は、乳児の全身性動脈石灰化（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ、ＧＡＣＩ、ＯＭＩＭ２０８０００）又は関節及び動脈の石灰化（ＡＣＤＣ、ＯＭＩＭ２１１８００）などの他の遺伝性状態と重複する。対照的に、ｔｎａｐ遺伝子における機能喪失型変異は、低ホスファターゼ血症（ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｉａ、ＨＰＰ）、くる病、及び軟骨石灰化症につながる上昇した循環レベルのＰＰｉをもたらす。更に、細胞外ＰＰｉホメオスタシスは、ＣＫＤ（慢性腎疾患）、肝疾患、並びに骨ジストロフィー性、リウマチ性、及び変性関節の疾患を含むいくつかの後天性疾患において遭遇する異所性石灰化プロセスのキーストーンであると思われる。

【0054】

したがって、本発明の方法は、特に、血管石灰化、弾力線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）、くる病、軟骨石灰化症、慢性腎疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＫＤ）、肝疾患、骨ジストロフィー性疾患、リウマチ性疾患、変性関節病の中から選択される状態を検出又は監視するために使用することができる。それはまた、１つの当該状態を有する個体、並びに透析中及び他の未決定の石灰化促進性又は抗石灰化性の石灰化病状を有する患者の治療をモニタリングするために使用することができる。

【0055】

本発明の方法は、好ましくは、血漿試料に使用して、限外濾過した血漿中のＰＰｉ濃度を酵素方法及びＩＣ方法を使用して定量化し、測定された値を持続的にクロスコントロールし、結果の信頼性を増加させる。それにより、可変的な石灰化促進性又は抗石灰化性表現型を有する遺伝子疾患及び代謝疾患を理解するために、ＰＰｉの再現性のある測定が可能となる。

【0056】

本発明はまた、上記の方法を行うためのキットに関する。本発明によるキットは、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びＰＰｉ較正溶液、並びにアセトニトリル及びＥＧＴＡを含み、それはまた、血漿限外濾過フィルターを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0057】

本発明は、以下の実施例によってより良く理解されるであろう。実施例は、図を参照する。

【図1】酵素方法及びＩＣ方法を使用したＰＰｉ濃度の測定に対するマトリックス組成の影響。ａ：酵素生物発光方法によって得られた、増加していく濃度のＰＰｉについて測定された発光値（任意単位）測定は、２つの異なるマトリックス溶液（超純水及びＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳ）において行われた。ＰＰｉ濃度は、ストック溶液（１０ｍＭ）からの外因性ＰＰｉの添加によって、０．７５、１．５、３、５、及び１０μＭに調整した。値は、４つの異なる測定の平均±ＳＥＭである（ｐ^＊＊＊＊＜０．００５でのＡＮＯＶＡ ｔ検定）。ｂ：２つの異なるマトリックス溶液（超純水又は１０％ＦＢＳを補充したＨＢＳＳ）において、増加していく濃度についてＰＰｉをイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）方法を使用して測定した用量反応曲線。ＰＰｉ濃度は、各個々のｐｉｃの測定された表面にフィッティングさせた。値は、各実験条件における５つの異なる測定の平均±ＳＥＭである。ｃ：酵素方法及びＩＣ方法の両方を使用して測定されたヒト尿試料中のＰＰｉ濃度の比較。ｄ：酵素方法及びＩＣ方法の両方を使用して、ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞又はｒＡＢＣＣ６トランスポーターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞の上清において測定されたＰＰｉ濃度の比較。値は、４つの異なる測定の平均±ＳＥＭである。

【図2】ヒト血漿中のＰＰｉ濃度を定量化するために使用された酵素方法及びＩＣ方法における異なるステップの説明。

【図3】ヒト血漿中のＰＰｉ濃度の測定及び酵素方法とＩＣ方法との間の比較。ａ．ＰＰｉスパイクした限外濾過血漿で測定された発光傾きの図。ｂ．酵素方法及びＩＣ方法の両方を使用して測定されたＰＰｉ血漿濃度（限外濾過血漿、８０人の異なるドナー）の比較。ｃ．４２人のドナーから得られたＰＰｉの酵素定量化を使用する、古典的に使用された方法（フィルターカットオフ３００ｋＤａ＋ＥＤＴＡ）及び改善された分析前方法（カットオフ５０ｋＤａ、ＥＤＴＡなし）の比較。ｄ．血漿ＰＰｉ濃度の減少又は増加を誘導することが知られている異なる疾患に罹患している異なる患者集団の血漿（限外濾過液）で測定されたＰＰｉ濃度。

【実施例】

【0058】

ＰＰｉ較正溶液
１０ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム二塩基性（ＰＰｉ、ｓｃ－２５１０４７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）ストック溶液の独立した希釈物（０．５～１０μｍｏｌ／Ｌ）を、超純水（抵抗率≧１８．２ＭΩ／ｃｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ｆｒａｎｃｅ）又はハンクス平衡塩溶液（ＨＢＢＳ、Ｈ８２６４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製し、較正溶液として使用した。

【0059】

細胞培養及び細胞ＰＰｉ放出プロトコル。
不死化したＨＥＫ－２９３野生型及びＨＥＫ－２９３ ｒＡＢＣＣ６細胞株（Ｐｒ．Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎｇによって厚意により提供された（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用した。これらの細胞は、ラット型のＡＢＣＣ６トランスポーターを構成的に発現する。両方の細胞株を、１０％血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ培地培養物で古典的に培養した。培養は使用前に、３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気の水飽和雰囲気中に維持した。細胞を１５～２５継代で使用した。ｒＡＢＣＣ６の発現によって媒介された細胞外ＰＰｉの測定を、プロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下でサブコンフルエンスまで２日間培養した細胞に対して行った。実験当日、培養した培地を、１０％ウシ胎児血清、グルコース（最終４．５ｇ／ｌ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭグルタミンを含有するＨＢＳＳ培地（レッドフェノールフリー）と交換した。ＨＢＳＳ上清を０．５、１、３、及び６時間後に収集し、遠心分離（５分、２０００ｇ、４℃）して、ＰＰｉ定量化を変化させ得る懸濁液中の推定細胞を除去した。試料を使用前に－８０℃で凍結した。全ての実験について、各ウェルにおける正確なタンパク質含量を、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定した。

【0060】

ヒト生体試料調製
ＰＸＥ患者由来の生体試料は、フランス人ＰＸＥコホートを表現型決定するためのプロトコル（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１４４６３８０）の一部として、ｎａｔｉｏｎａｌ ＰＸＥ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＡＧＥＣ Ｎｏｒｄ，Ａｎｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｎｇｅｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ）のバイオバンクから提供された。

【0061】

ＰＰｉ尿定量化のために、一晩の絶食期間後に血液試料と同時に尿試料を朝に収集した。尿を尿モノベット収集チューブに収集した。酵素方法のために、尿試料を超純水で１６×希釈した。ＩＣ測定のために、尿試料並びに較正溶液を蒸留水で４×希釈した。

【0062】

ＰＰｉ血漿定量化のために、患者の血液試料を、一晩の絶食期間後の朝に、クエン酸ナトリウム収集チューブ（クエン酸３．２％（２．７ｍＬ、ｒｅｆ：３６３０４８）に直接収集した（静脈穿刺）。チューブは限度まで又はそのすぐ下まで満たした。

【0063】

ヒト血漿分析前試料調製
遠心分離（１０００～１２００ｇ、１５分、４℃）して全ての血液細胞（主に赤血球及び白血球）を積層するまで、クエン酸塩チューブを氷上で垂直に保った。血漿を収集し、溶血のレベルを測光測定（ヘモグロビンについて５４６ｎｍでの吸収）によって定量的に評価した（Ｄｕｒａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３９，８４７－８５５．）。０．２％未満のＲＢＣ溶血を最大レベルとして固定して、遊離ヘモグロビンが血漿限外濾過プロトコル及びＰＰｉ定量化方法に干渉しないとみなした。血漿を、Ａｍｉｃｏｎ ０．５ｍＬ ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）５０Ｋフィルター（５０ｋＤａカットオフ、ＵＦＣ５０５０９６、１４０００ｇで２０分間スピン）又はＣｅｎｔｒｉｓａｒｔ濾過ユニット（３００．ｋＤａカットオフ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ １３２７９、２２００ｇで３０分間スピン）を使用して４℃で限外濾過した。Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔフィルターは、血小板及び分子量＞３００ｋＤａのタンパク質を血漿から除去する。Ａｍｉｃｏｎフィルターは、製造業者の説明書に示されるように、血小板だけでなくタンパク質（すなわち、アルブミン）の９５％も除去することを可能にする。限外濾過液は透明及び無色であり、－８０℃で保存した。限外濾過液中のＰＰｉの測定値を変化させ得るＰＰｉの分解又は血液細胞溶解を回避するために、分析前方法の全ての異なるステップを可能な限り迅速及び連続して行った。

【0064】

酵素方法を使用したＰＰｉ定量化：ルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ。
［ＰＰｉ］は、過剰のＡＰＳ（アデノシン－５’－ホスホ硫酸）の存在下でＰＰｉをＡＴＰに変換するＡＴＰスルフリラーゼを使用して酵素的に決定される。２つの溶液が必要とされる。溶液Ａは、０．１Ｕ／ｍＬのＡＴＰスルフリラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＯ３９４）及び８０μＭのＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ５５０８）を含有する。０．１Ｕ／ｍＬのＡＴＰスルフリラーゼを含有する溶液Ｂを９０℃で１０分間処理してＡＴＰスルフリラーゼを不活性化し、次いでＡＰＳを添加する。１５μｌの各試料又は標準を、２つの異なるウェルに加える。ウェルに５μｌの溶液Ａを添加する。第２のウェルに５μｌの溶液Ｂを添加する。次いで、サーモサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、プレートを３７℃で３０分間、次いで９０℃で１０分間インキュベートし、ＡＴＰスルフリラーゼを不活性化する。生成されたＡＴＰは、ＡＴＰ決定キット（（ＡＴＰｌｉｔｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者の説明書に従って使用して定量化した。このＡＴＰキットは、組換えルシフェラーゼタンパク質を使用して経時的に（少なくとも１０分間）安定的及び信頼性のある発光を生成するその能力のために選択された。発光（ＬＵＭ）を、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳ）で白色マイクロプレートにおいて１０分間にわたって３回測定する。ＰＰｉ値が、溶液Ｂで測定された基礎ＡＴＰレベルを減算することによって得られる。

【0065】

特別な注意が、マトリックス（イオン、タンパク質、又は任意の物質）の任意の潜在的な影響に払われている。したがって、細胞培養培地中のＰＰｉ決定のために、ＰＰｉの標準曲線を同じ無色培地で実現した。尿試料中のＰＰｉ測定のために、試料を１６倍希釈して、水中のＰＰｉの較正曲線に基づいて試料濃度を計算しなければならなかった。各血漿試料（５μｌ）に１０μｌの増加していく濃度のＰＰｉ溶液をスパイクし、各血漿試料のＰＰｉ濃度を、それ自体の直線回帰方程式を使用して決定した。

【0066】

イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）を使用したＰＰｉの定量化
ＩＣ分析前に、４０μｌの全ての生体試料（細胞培養培地、尿試料、又は患者血漿限外濾過液）にＥＧＴＡ（１ｍＭ最終濃度）を補充し、アセトニトリル（希釈１：１体積）の添加を使用して混合及び除タンパクした。試料を強く混合し、１２０００ｇで遠心分離した（４℃で１０分間）。同じプロトコル（ＥＧＴＡ及びアセトニトリルの添加）を、較正試料（水又はＨＢＳＳ中の０．７５、１．５、３、５、１０μＭのＰＰｉ）の定量化にも使用して、最終的に同じ希釈係数及び同じマトリックス組成を有した。

【0067】

ＰＰｉの検出は、イオンクロマトグラフィーＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－５０００ ｐｌｕｓシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。システムは、オートサンプラー、ポンプ、溶離液発生器、及び導電率検出器を含んだ。システムは、溶離液発生器（ＫＯＨ、５００ｍＭ）、ガードプレカラム（ＡＧ１１－ＨＣ、ＲＦＩＣ、２×５０ｍｍ）、及びＰＰｉの検出のための分析用アニオンカラム（ＩｏｎＰａｃ ＡＳ－１１－ＨＣ、２×２５０ｍｍ、ＲＦＩＣ）が装備される。ＰＰｉ測定プロトコル：０．２５ｍＬ／分の水デビット、試料注入ループ：１０μｌ、溶離プロトコル：７ｍＭのＫＯＨ（２分）、続いて５０ｍＭに達するまでの直線増加期間（２０分）、及び安定期間（５０ｍＭ、４分）後に復帰期間（７ｍＭ、２分）。（合計時間＝２８分）。

【0068】

Ｃｈｒｏｍａｌｅｏｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、表面積を測定することによってＰＰｉ ｐｉｃ定量化を行い、対応する標準曲線と比較した。

【0069】

データ分析
グラフィックス及びデータ分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で行われている。ダンの多重比較検定事後検定を用いるＡＮＯＶＡ ｔ検定が、異なる患者群間の血漿ＰＰｉ濃度について行われている。

【0070】

結果
酵素方法を使用するＰＰｉの測定は、（Ｐｒｏｓｄｏｃｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）から適合され、ＰＰｉをＡＴＰに変換し、続いてＡＴＰを加水分解して生物発光反応を使用して光を生成する２つのステップを必要とする。第１のステップにおいて、ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）及びＡＴＰスルフリラーゼの存在下でＡＴＰに変換される。第２のステップにおいて、新たに合成されたＡＴＰは、その後、ルシフェリン／ルシフェラーゼ生物発光アッセイを使用して定量化される。この酵素方法を使用して、一連の測定が行われ、外因性ＰＰｉ（Ｎａ２ＰＰｉ、最終濃度０．７５、１．５、３、５、１０μＭ）を超純水又はより生理学的な溶液（１０％血清を補充したＨＢＳＳ）に添加した。水又はＨＢＳＳ＋１０％血清溶液中のＰＰｉの量を増加させると、最大１０μＭの濃度で直線的に発光に増加をもたらした。媒体の組成は、用量反応曲線の傾きに影響を強く及ぼした（図１ａ）。

【0071】

したがって、媒体の組成は、ＡＴＰ－スルフリラーゼ又はルシフェリン／ルシフェラーゼ反応を変化させることができ、そのため、ＰＰｉ濃度の決定に誤差を生じ得る（マトリックス効果）。これは特に、異なるイオン組成又はタンパク質組成を示す生体試料（尿、培養培地、血漿・・・）を用いる場合である。

【0072】

次に、ＰＰｉ濃度は、同じ試料でイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）方法を使用して測定した。ＰＰｉ濃度の測定は、酵素実験に以前使用したのと同じ溶液で行った。ＩＣ方法は、ＰＰｉ濃度の増加に比例するそれらの表面の増加を示す、有意なピーク（およそ２３分の保持時間）を検出することを可能にする。異なる濃度のＰＰｉについて測定されたピーク面積（μｓ・分－１）の計算は、２つの溶液間で有意には異ならず（図１ｂ）、マトリックスの組成がこのＩＣ技術を使用するＰＰｉ濃度に対して影響を有しなかったことを示唆している。

【0073】

異なる生体液の状況において２つの方法（酵素的及びＩＣ）で得られた値を比較するために、最初に、細胞外ＰＰｉのレベルを培養した細胞の上清（培養培地）中で定量化した。ＨＥＫ２９３－ＡＢＣＣ６細胞は良好なモデルを代表するが、それは、ＡＢＣＣ６タンパク質の過剰発現が、数時間の培養後に上清中のＰＰｉの顕著及び重要な増加を誘導することが以前に実証されているためである。上清を２つの異なる細胞株：ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞又は安定なラットＡＢＣＣ６トランスポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒ．Ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ Ｋによって厚意で提供された）から得た。時間０で、培養培地を１０％血清を含有するＨＢＳＳ培地と交換し、上清を０．５、１、３及び６時間後に収集し、ＰＰｉ濃度を酵素方法及びＩＣ方法の両方を使用して同時に決定した。両方の方法で、較正ＰＰｉ溶液を同じ培養培地（ＨＢＳＳ＋１０％血清）中に調製した。値を、各ウェルで測定されたタンパク質含量に対して正規化し、図１ｄに示される。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞の上清において、ＰＰｉ濃度に有意な増加が、両方の技術で、動態の全ての時点で検出されなかった。対照的に、ＰＰｉ濃度は、ＨＥＫ２９３－ＡＢＣＣ６細胞の上清で測定された場合、インキュベーションの時間とともに有意に増加し、両方の技術で得られたＰＰｉ値は、動態の各時点についてほとんど同様である。要するに、この実験は、細胞培養試料中のＰＰｉ濃度を定量化するために本発明者らが使用した方法が信頼でき、同等の結果を与えることを確証する。

【0074】

次に、両方法を、ヒト尿試料中のＰＰｉを定量化するために使用した。ＰＰｉ定量化は、２５例の独立した尿試料から両方の方法を用いて行った。両方法について、増加していく濃度の外因性ＰＰｉ（酵素方法では０～１０μＭ、ＩＣ方法では最大５０μＭまで）を補充した超高純度蒸留水を使用して用量反応曲線を行った。尿試料を超純水で希釈して、酵素方法を使用して以前に観察された、推定マトリックス効果を制限した。結果として、両方法で測定された値を比較し、直線回帰でフィッティングさせた（図１ｃ）。試料に、尿ＰＰｉ濃度の広い分布が、＜１μＭ～最大＞３０μＭで観察された。両方法で測定されたＰＰｉ濃度をフィッティングさせると、ｒ＝０．８８（ｐ＜０．０００１）のスピアマン相関が明らかになる。２つの方法で得られた値の比較のためのブランド－アルトマン分析は、有意なバイアスを示さず、方法が、この試験において使用されたＰＰｉ範囲内及び実験条件内で信頼できることを示唆する。

【0075】

次いで、両技術を組み合わせて、ヒト血漿試料中のＰＰｉを定量化する。ヒト血漿中のＰＰｉ濃度の決定前に、試料の特定の分析前調製を行った。

【0076】

新たに採取したヒト血漿を、５０ｋＤａカットオフフィルターを使用する限外濾過手順に供して、懸濁物中のタンパク質の９５％及び全ての推定細胞を除去した（これらのフィルターを用いるこの遠心分離ステップは、従来のベンチ遠心分離機を用いて行われ得、試料が本発明者らの臨床施設において技術的に取り扱われる方法を強力に促進する）。次いで、限外濾過した血漿を、増加していく濃度の外因性ＰＰｉ（０、０．５、１及び２μＭ）でスパイクして、異なるドナー間で変動し易い血漿組成の影響（マトリックス効果）を排除した。図３ａは、この状況を示し、２つの異なるスパイクした限外濾過血漿及び較正ＰＰｉ水溶液にフィッティングさせた直線回帰を示した。結果として、血漿２の傾き（直線回帰によって得られる）は水溶液の傾きと同じであるが、血漿１の傾きは異なることが観察された。

【0077】

これらの結果によって、古典的なＰＰｉ／水較正曲線を使用する代わりに酵素的アプローチを使用する血漿試料中のＰＰｉの測定が、好ましくは、各スパイクした血漿の直線回帰の傾きを計算することによって行われるべきであることが確証された。次に、８０例の血漿試料（８０人の異なるドナー）から酵素方法及びＩＣ方法の両方を用いて同じ限外濾過液中で同時に測定したＰＰｉの値を比較した。同じ血漿試料中のＰＰｉ濃度を定量化する両方の方法の使用により、測定された値をクロスコントロールし、測定の精度を強化することが可能となる。両方法で得られたＰＰｉ値の間の１５％を超える変動は許容できないとみなされ、測定がやり直されなければならない。最初に行われた８０例の対測定のうち、１０例は固定された標準に達しておらず、ＰＰｉ定量化が各方法で２回行われた。この測定の追加実行後、ＰＰｉの値を８０例の異なる試料についてフィッティング（直線回帰）させ（図３ｂ）、ｒ＝０．９６４（ｐ＜０．０００１）のスピアマン相関を得た。ブランド－アルトマン分析は、有意なバイアスを示さず（ｐ＝０．２３７）、この組み合わせた方法が、ヒト限外濾過血漿に見出されるＰＰｉ範囲内で信頼できることを示唆する。

【0078】

この組み合わせた方法を使用することにより、ＰＰｉ定量化の精度を強く増強し、真の循環ＰＰｉ濃度に非常に近いＰＰｉ濃度（両方法から得られた値を平均する）を計算することが可能となる。

【0079】

最初に、記載されているように（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、古典的な分析前処理を使用し、ＥＤＴＡ三ナトリウム（１ｍＭ）を血液試料に添加し、遠心分離して血漿を収集し、続いて３００ｋＤ質量カットオフフィルターに通す濾過によって血小板を枯渇させた。しかしながら、ＥＤＴＡは、ＰＰｉに非常に近い保持時間を示すため、ＥＤＴＡの添加はＩＣ方法の使用を強く制限し、ＰＰｉ決定のためのＩＣ方法の使用を排除する。

【0080】

この古典的に使用される分析前技術を、酵素方法を使用する技術（ＥＤＴＡ＋３００ｋＤカットオフフィルター対ＥＤＴＡなし＋５０ｋＤカットオフフィルター）と比較した。

【0081】

同じ血液試料から、２つの分析前技術を使用して２つの異なる限外濾過液を調製し、ＰＰｉ濃度を各限外濾過液中で測定した。４２人の異なる患者から採取した４２例の血漿試料を用いてこの手順を行い、ＰＰｉ濃度を比較し、直線回帰にフィッティングさせた（図３ｃ）。ｒ＝０．９４７６（ｐ＜０．０００１）のスピアマン相関が、両方の分析前方法から得られた限外濾過液で測定されたＰＰｉ濃度間で観察された。ブランド－アルトマン分析は、有意なバイアスがないことを明らかにし（ｐ＝０．１３７）、両方の分析前方法が、本試験に使用されるＰＰｉ範囲内で信頼できることを示唆した。血液試料へのＥＤＴＡの前添加を伴わない５０ｋＤ質量カットオフフィルタリング技法を、ＩＣ方法及び酵素方法でＰＰｉを添加することができる参照分析前技術として選択した。

【0082】

最後に、新規分析前方法を用いたＰＰｉ定量化のための組み合わせた方法（酵素的及びＩＣ））を、血漿ＰＰｉのレベルを変化させることが知られている遺伝性疾患又は後天性疾患に罹患している患者から得られた血漿試料に適用した（図３ｄ）。これらの異なる群由来の血漿ＰＰｉレベルを検査し、健常な対象の群と比較した。患者は、異所性石灰化及び低ＰＰｉ血漿レベルを特徴とする障害である弾力線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）に罹患した群を含む。それらにはまた、永続的な腎置換療法下の慢性腎疾患を有する血液透析患者（ｈｅｍｏｄｉａｌｙｚｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ、ＨＤ）、並びに骨及び他の石灰化組織の発達に影響を及ぼす稀な遺伝性疾患である低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）を有する患者が含まれる。

【0083】

ＰＰｉ濃度は、健常群において１．６４±０．３７μＭ［１．０７－２．６５、ｎ＝３４］であり、ＰＸＥ患者において有意に低く（０．８９２±０．３５μＭ［０．４３～２．０７、ｎ＝３６］）、ＨＤ患者では１．０５±０．４０４μＭ［０．２６～１．５９、ｎ＝１０］だった。対照的に、ＨＰＰ遺伝性障害を有する４人の患者のＰＰｉ濃度は、４．４８±１．３１μＭ［２．５８～５．５９］の平均で予想通り高かった。要するに、ＰＸＥ患者で測定されたＰＰｉの平均値は、健常な患者における値よりも約５０％低い。この結果は文献と一致する。

【0084】

２つの異なる技術的アプローチ（酵素的及びＩＣ）を組み合わせることによる信頼性及び再現性のある方法は、様々な生体液のＰＰｉ濃度を正確に測定することを可能にする。血漿ＰＰｉ定量化のために、この組み合わせた方法は、試料が技術的に取り扱われる手段を強力に促進する新規分析前方法に関連付けられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】