▶ ガーディアン セラピューティクス エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】核酸の脂肪酸コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240905BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240905BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240905BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240905BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/115 Z ZNA
C12N15/113 Z
A61K47/54
A61P43/00 105
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515579
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 US2022076198
(87)【国際公開番号】W WO2023039522
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/242,679
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524090725
【氏名又は名称】ガーディアン セラピューティクス エルエルシー
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＲＤＩＡＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】チュー、シューハオ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC26
4C076CC41
4C076DD41
4C076EE59
4C076FF31
4C084AA13
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZB21
4C086AA01
4C086EA16
4C086NA12
4C086NA13
4C086ZB21
(57)【要約】
本開示は、脂肪酸部分および核酸部分を含むコンジュゲートに関し、脂肪酸部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグルタミン酸基を介して、核酸にコンジュゲートされる。核酸部分は、アプタマーまたはそのバリアント、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびにｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、環状ＲＮＡなどの治療用ＲＮＡであってもよい。コンジュゲートを製造する方法およびその使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸部分および少なくとも一つの脂肪酸部分を含むコンジュゲートであって、前記脂肪酸部分が前記核酸部分の一方の末端にコンジュゲートされ、前記脂肪酸部分が－（ＣＨ２）ａ－ＣＯＯＨを含み、式中、ａが１２～２６の整数である、コンジュゲート。
【請求項2】
少なくとも一つの追加のカルボキシル基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項3】
少なくとも一つまたは二つの追加のカルボキシル基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項4】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つのエチレングリコール基（－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－）を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項5】
前記脂肪酸部分が、１～１０つのエチレングリコール基を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項6】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項7】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つのアミド基（－ＮＨ－ＣＯ－）を含む、請求項１、請求項４、または請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項8】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つの－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
前記脂肪酸部分が、少なくとも一つのグルタミン酸基を含む、請求項１、請求項４、請求項６または請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項11】
前記脂肪酸部分が、【化1】
を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項12】
前記グルタミン酸基がγ－グルタミン酸基である、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項13】
前記脂肪酸部分が、【化2】
を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
前記脂肪酸部分が、ピペラジン基を含む、請求項１、請求項４、請求項６、請求項７または請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項15】
前記脂肪酸部分がピペラジン－２－カルボン酸基（【化3】
）を含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項16】
前記脂肪酸部分が、【化4】
基を含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項17】
前記脂肪酸部分が、【化5】
基を含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項18】
前記脂肪酸部分が、【化6】
（式Ｉ）の構造を含み、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【化7】
【化8】
または
【化9】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【化10】
であり、
ｎｃは、０または１である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項19】
前記脂肪酸部分が、ＧＴＦＡ－１’、ＧＴＦＡ－２’、またはＧＴＦＡ－３’を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項20】
核酸分子が、アプタマーまたはそのバリアント、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、環状ＲＮＡなどを含む、治療用核酸である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項21】
前記治療用核酸が、アプタマーまたはそのバリアントである、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項22】
前記アプタマーが少なくとも一つの修飾を含み、前記修飾がヌクレオシド修飾または骨格修飾であってもよい、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項23】
前記アプタマーが少なくとも一つのヌクレオシド修飾を含み、前記修飾が２’－Ｏ－メチル修飾である、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか一項に記載の治療有効量のコンジュゲートと、一つ以上の治療的に許容可能な担体と、を含む、組成物。
【請求項25】
核酸配列および少なくとも一つの脂肪酸部分を含むアプタマーを含む組成物であって、前記アプタマーの前記核酸配列の５’末端がＤＢＣＯ基を有する、組成物。【化11】
【請求項26】
前記脂肪酸部分が、前記アプタマーの前記核酸配列の前記５’末端に共有結合している、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
前記脂肪酸部分が、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－２、またはＧＴＦＡ－３を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記アプタマーが、修飾ヌクレオシドを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記アプタマーが、少なくとも一つの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシドを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
一般式【化12】
（式ＩＩ）を含む脂肪酸部分であって、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【化13】
【化14】
または
【化15】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【化16】
であり、
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＤは、核酸に共有結合的に結合することができる官能基を含み、
ｎｄは、０または１である、脂肪酸部分。
【請求項31】
ブロックＤが、アジド基、アルキン基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、またはアミノ基を含む、請求項３０に記載の脂肪酸部分。
【請求項32】
ブロックＤが、Ｒｄ－Ｎ３であり、式中、Ｒｄが、アルキル基、アミノアルキル基、アミン基、および／またはアルコキシル基を含む、請求項３０に記載の脂肪酸部分。
【請求項33】
ブロックＤが、【化17】
【化18】
または
【化19】
である、請求項３２に記載の脂肪酸部分。
【請求項34】
前記脂肪酸部分が、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－２、またはＧＴＦＡ－３である、請求項３０に記載の脂肪酸部分。
【請求項35】
配列番号１によって提示される核酸配列と、配列番号１の配列の一方の末端にコンジュゲートされた脂肪酸部分と、を含むポリヌクレオチドであって、前記脂肪酸部分が、オクタデカン二酸、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－２およびＧＴＦＡ－３からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項36】
配列番号３によって提示される核酸配列と、配列番号３の５’末端にコンジュゲートされたパルミチン酸と、を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項37】
配列番号４によって提示される核酸配列と、配列番号４の５’末端にコンジュゲートされたＧＴＦＡ－１と、を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項38】
配列番号５によって提示される核酸配列と、配列番号５の５’末端にコンジュゲートされたＧＴＦＡ－３と、を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項39】
請求項３５～３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年９月１０日に出願された米国仮出願第６３／２４２，６７９号に対する優先権およびその利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表への参照）
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表と共に出願されている。２０２２年９月８日に作成された前述のＸＭＬコピーは、ＧＢＴ－００３ＷＯ．ＸＭＬと名付けられ、サイズは１７，７０７バイトであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月１０日に出願された米国仮出願第６３／２４２，６７９号に対する優先権およびその利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表への参照）
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表と共に出願されている。２０２２年９月８日に作成された前述のＸＭＬコピーは、ＧＢＴ－００３ＷＯ．ＸＭＬと名付けられ、サイズは１７，７０７バイトであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
核酸系治療薬は、古典的な小分子アプローチでは標的とされない疾患および遺伝子を標的とする薬剤の新規カテゴリーを表す。核酸系薬剤の開発の主な課題の一つは、そのインビボ安定性、半減期、クリアランス、および組織分布を強化し、したがって、薬剤の治療有効性を増加させることである。
【0003】
化学修飾されたヌクレオシドは、核酸分子への組み込みに日常的に使用され、例えばヌクレアーゼ抵抗性、薬物動態、または標的に対する親和性などの一つ以上の特性を強化する。一部の事例では、化学部分などの追加の修飾は、核酸化合物の効力および有効性を改善するために、核酸治療薬にコンジュゲートされる。
【0004】
ヒト血清アルブミンの長い血液循環特性は、魅力的な薬剤半減期の延長を可能にする技術を提供する。アルブミン結合を増加させる一つの戦略は、アルブミンに結合することができる脂肪酸コンジュゲートを用いて標的薬剤を修飾することである。一つの成功例は、グルカゴン様ペプチド－１受容体作動薬（ＧＬＰ－１ ＲＡ）であるセマグルチドである。ヒトＧＬＰ－１は、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）酵素によって急速に分解され、短い半減期をもたらす。９４％相同体を有するヒトＧＬＰ－１類似体であるセマグルチドは、二つの構造改変、すなわち、Ｇｌｙの２位の非タンパク質原性アミノ酸２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）での置換、および短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーおよびγ－グルタミン酸リンカーを介したＬｙｓ－２６の側鎖へのオクタデカン二酸の付着を含む。１８－炭素脂肪酸部分の存在は、血清アルブミンに対する高い結合親和性をもたらし、これはヒトにおいて約７日間の半減期に変換される（非特許文献１）。
【0005】
同様に、脂肪酸コンジュゲーションを含む脂質コンジュゲーションは、ｓｉＮＲＡなどの治療用核酸に影響を与えることが示されている（例えば、非特許文献２）。
本開示は、治療用核酸、例えば、アプタマーおよび低分子ＲＮＡ分子への新規脂肪酸コンジュゲーションに関する。かかる脂肪酸部分は、血液中の修飾アプタマーの半減期の延長などのインビボ有効性に影響を与える。
本開示は、治療用核酸、例えば、アプタマーおよび低分子ＲＮＡ分子への新規脂肪酸コンジュゲーションに関する。かかる脂肪酸部分は、血液中の修飾アプタマーの半減期の延長などのインビボ有効性に影響を与える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｗｉｔｔｅｌｏｏｓｔｕｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ． Ｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．， ２０１６， １１（２２）：２４７４－２４９５
【非特許文献2】Ｂｉｓｃａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｖａｌｅｎｃｙ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｍｐａｃｔ ｓｉＲＮＡ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２０１９， ３０２：１１６－１２５
【発明の概要】
【0007】
本発明は、核酸治療薬の性能を増加させるために、例えば、インビボ半減期を延長するために、核酸－脂肪酸コンジュゲートを作製するために使用され得る新規の脂肪酸を提供する。
【0008】
本発明は、核酸部分と、脂肪酸部分が核酸部分に共有結合している少なくとも一つの脂肪酸部分とを含むコンジュゲート、ならびにその組成物および使用方法を提供する。脂肪酸部分は、コンジュゲートの核酸部分の特徴、例えば半減期を修飾する。
【0009】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）ａ－ＣＯＯＨを含み、式中、ａは１２～２６の整数である。コンジュゲートは、少なくとも一つの追加のカルボキシル基を含んでもよい。一部の実施例では、コンジュゲートは、一つまたは二つの追加のカルボキシル基を含んでもよい。一実施形態では、コンジュゲートは、一つの追加のカルボキシル基を含む。別の実施形態では、コンジュゲートは二つの追加的なカルボキシル基を含む。
【0010】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのエチレングリコール基（－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－）を含む。一部の実施例では、脂肪酸部分は、１～１０個のエチレングリコール基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のエチレングリコール基を含む。
【0011】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む。脂肪酸部分は、少なくとも一つのアミド基（－ＮＨ－ＣＯ－）をさらに含んでもよい。
【0012】
一実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む。
別の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む。
別の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む。
【0013】
さらに別の実施形態では、脂肪酸部分は少なくとも一つのグルタミン酸基を含む。一部の実施例では、グルタミン酸基はγ－グルタミン酸基である。
一実施形態では、脂肪酸部分は、
一実施形態では、脂肪酸部分は、
【0014】
【化1】
【0015】
を含む。別の実施形態では、脂肪酸部分は、
【0016】
【化2】
【0017】
を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基（
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基（
【0018】
【化3】
【0019】
）、
【0020】
【化4】
【0021】
基、および
【0022】
【化5】
【0023】
基などのピペラジン基を含む。
一実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を含む脂肪酸部分を含み、
一実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を含む脂肪酸部分を含み、
【0024】
【化6】
【0025】
（式Ｉ）、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【0026】
【化7】
【0027】
【化8】
【0028】
または
【0029】
【化9】
【0030】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【0031】
【化10】
【0032】
であり、
ｎｃは、０または１である。
非限定的な例として、コンジュゲートは、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－１’、ＧＴＦＡ－２、ＧＴＦＡ－２’、ＧＴＦＡ－３およびＧＴＦＡ－３’からなる群から選択される脂肪酸部分を含む。
ｎｃは、０または１である。
非限定的な例として、コンジュゲートは、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－１’、ＧＴＦＡ－２、ＧＴＦＡ－２’、ＧＴＦＡ－３およびＧＴＦＡ－３’からなる群から選択される脂肪酸部分を含む。
【0033】
本コンジュゲートの核酸部分は、アプタマーまたはそのバリアント、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、環状ＲＮＡなどを含むがこれらに限定されない、治療用核酸である。
【0034】
一部の実施形態では、核酸部分は、アプタマーまたはそのバリアントである。アプタマーは、約１５～１００個のヌクレオチド、約１５～７５個のヌクレオチド、または約１５～５０個のヌクレオチド、または約１５～３０個のヌクレオチド、または約２０～５０個のヌクレオチド、または約２０～３０個のヌクレオチドを含む。
【0035】
一部の実施形態では、アプタマーは、ヌクレオシド修飾および骨格修飾などの少なくとも一つの化学修飾を含む。
別の態様では、本発明は、核酸－脂肪酸コンジュゲートを含む組成物、および治療剤のための組成物を使用する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、核酸－脂肪酸コンジュゲートを含む組成物、および治療剤のための組成物を使用する方法を提供する。
【0036】
一部の実施形態では、本発明は、核酸分子の半減期を延長する方法を提供し、方法は、核酸分子を脂肪酸部分で修飾することを含む。
別の態様では、本発明は、以下の一般式を含む脂肪酸部分を提供する：
別の態様では、本発明は、以下の一般式を含む脂肪酸部分を提供する：
【0037】
【化11】
【0038】
（式ＩＩ）、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【0039】
【化12】
【0040】
【化13】
【0041】
または
【0042】
【化14】
【0043】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【0044】
【化15】
【0045】
であり、
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＤは、核酸部分に共有結合的に結合することができる官能基を含み、
ｎｄは、０または１である。
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＤは、核酸部分に共有結合的に結合することができる官能基を含み、
ｎｄは、０または１である。
【0046】
一部の実施形態では、脂肪酸部分のブロックＤは、アジド基、アルキン基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、またはアミノ基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分のブロックＤは、Ｒｄ－Ｎ３であり、式中、Ｒｄは、アルキル基、アミノアルキル基、アミン基、および／またはアルコキシル基を含む。一部の実施例では、ブロックＤは、
【0047】
【化16】
【0048】
【化17】
【0049】
または
【0050】
【化18】
【0051】
である。非限定的な例として、脂肪酸部分は、ＧＴＦＡ－１、ＧＴＦＡ－１’、ＧＴＦＡ－２、ＧＴＦＡ－２’、ＧＴＦＡ－３、またはＧＴＦＡ－３’である。
別の態様では、本発明は、配列番号１によって提示される核酸配列と、配列番号１の一方の末端にコンジュゲートされた脂肪酸部分と、を含むポリヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。非限定的な例として、コンジュゲートは、ＢＴ５００（配列番号３）、ＢＴ６００（配列番号４）、およびＢＴ７００（配列番号５）である。一部の実施形態では、コンジュゲートを含む組成物が提供され、コンジュゲートは、ＢＴ５００（配列番号３）、ＢＴ６００（配列番号４）、またはＢＴ７００（配列番号５）を含む。
別の態様では、本発明は、配列番号１によって提示される核酸配列と、配列番号１の一方の末端にコンジュゲートされた脂肪酸部分と、を含むポリヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。非限定的な例として、コンジュゲートは、ＢＴ５００（配列番号３）、ＢＴ６００（配列番号４）、およびＢＴ７００（配列番号５）である。一部の実施形態では、コンジュゲートを含む組成物が提供され、コンジュゲートは、ＢＴ５００（配列番号３）、ＢＴ６００（配列番号４）、またはＢＴ７００（配列番号５）を含む。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【発明を実施するための形態】
【0053】
本開示の一つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載される。本明細書に記載の材料および方法と類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法をこれから記述する。本開示のその他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかであろう。説明において、単数形は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数も含む。本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、本説明が優先される。
【0054】
はじめに
部分と、例えば小治療用核酸分子などの核酸分子とのコンジュゲーションは、核酸の特徴を改変するために、例えば、体内での半減期、安定性、標的への結合、機能的有効性などを増加させるために有用である。合成後標識および様々なコンジュゲーション化学物質を介して直接的または間接的に他の機能性分子を核酸にコンジュゲートする技術は、大きく進歩している。例えば、クリックケミストリーは、生体分子コンジュゲーションに有用な最も堅牢かつ効率的なケミストリーの一つであり、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡコンジュゲーションで広く使用されている。
部分と、例えば小治療用核酸分子などの核酸分子とのコンジュゲーションは、核酸の特徴を改変するために、例えば、体内での半減期、安定性、標的への結合、機能的有効性などを増加させるために有用である。合成後標識および様々なコンジュゲーション化学物質を介して直接的または間接的に他の機能性分子を核酸にコンジュゲートする技術は、大きく進歩している。例えば、クリックケミストリーは、生体分子コンジュゲーションに有用な最も堅牢かつ効率的なケミストリーの一つであり、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡコンジュゲーションで広く使用されている。
【0055】
遊離脂肪酸は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することができることが観察された（Ｃｕｒｒｙ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ： ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９９９， １４４１： １３１－１４０）。ＨＳＡは血液中に豊富であり、薬物代謝に重要な役割を果たす（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ， Ａ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２０００， ３０３： ７２１－７３２）。ほとんどの薬剤はＨＳＡに結合し、血液循環および組織移植のために解離される（Ｇｈｕｍａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２００５， ３５３：３８－５２）。ＨＡＳへの結合の機能により、脂肪酸は、薬剤の血液保持時間、すなわち半減期の延長に非常に有用なツールとなる。多くの研究は、脂肪酸と、例えばペプチドおよびｓｉＲＮＡなどの治療剤とのコンジュゲーションが、吸収速度を遅延させ、循環期間を延長させ、タンパク質分解から保護し得ることを実証している（例えば、Ｔｒｏｉｂｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔｒｉｍｅｒｓ ｏｎ ｐＤＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２０１３， ３４： １６２４－１６３３、およびＨａｃｋｅｔｔ， Ｍ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｆｏｒ ａｌｂｕｍｉｎ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．， ２０１２， １０１：３２９２－３３０４）。Ｃ１６脂肪酸のコンジュゲーションは、ＧＬＰ－１ペプチドの半減期の有意な増加をもたらしたと報告された（Ｍａｄｓｅｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｌｏｎｇ－ａｃｔｉｎｇ ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｎｇｔｈ， ｐｏｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｂｕｌｋｉｎｅｓｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ２００７， ５０， ｄｏｉ： １０．１０２１／ｊｍ０７０８６１ｊ）。脂肪酸コンジュゲーションは、この効率および臨床的に非毒性効果のために、治療薬（例えば、ペプチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ）の半減期および安定性を延長するための有用な戦略として開発されてきた。
【0056】
脂肪酸の長さおよび構造は、異なる治療薬に影響を与える可能性がある。脂肪酸と活性治療薬とのコンジュゲーションは、複雑な工程を必要とする。多くの場合、治療薬中の官能基は、その化学的特性および物理的特性、例えば、その構造的立体配座により制限される。脂肪酸中の活性部位も、それらの用途を制限する可能性がある。この障害を克服するために、活性基を脂肪酸および／または治療薬に導入することができる。修飾は、薬剤および脂肪酸をコンジュゲートするための分子修飾またはリンカーを介して達成することができる。
【0057】
本開示は、修飾脂肪酸の類似体、および核酸分子、特に低核酸分子、例えばアプタマー、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓａＲＮＡなどへの脂肪酸コンジュゲーションのための最適化されたコンジュゲーション戦略を提供する。本開示の脂肪酸様分子（本明細書では「脂肪酸部分」と呼ばれる）は、二つ以上のカルボキシル基などの一つ以上の官能基、ならびにアジド基、アルキン基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、およびアミノ基などの追加の活性基を含む。
【0058】
定義
特許請求の範囲となる本開示の主題をより明確かつ簡潔に説明するために、以下の定義が特定の用語について提供され、これは以下の説明および添付の特許請求の範囲で使用される。本明細書全体を通して、特定の用語の例証は、非限定的な実施例とみなされるべきである。
特許請求の範囲となる本開示の主題をより明確かつ簡潔に説明するために、以下の定義が特定の用語について提供され、これは以下の説明および添付の特許請求の範囲で使用される。本明細書全体を通して、特定の用語の例証は、非限定的な実施例とみなされるべきである。
【0059】
本明細書で使用される場合、「脂肪族」という用語は、完全に飽和している、もしくは一つ以上の不飽和単位を含有する直鎖（すなわち、非分岐）もしくは分枝、置換もしくは非置換の炭化水素鎖、または完全に飽和している、もしくは一つ以上の不飽和単位を含有する（ただし芳香族ではない）置換もしくは非置換の単環式、二環式、もしくは多環式の炭化水素環、またはそれらの組み合わせを意味する。一部の事例では、脂肪族基は、２～５０個の脂肪族炭素原子、または２～２０個の脂肪族炭素原子、または８～３０個の脂肪族炭素原子、または１０～２０個の脂肪族炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪族基は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の脂肪族炭素原子を含有する。本開示によれば、脂肪族基としては、直鎖または分枝、置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル基、およびそれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。全体として相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）。こうした相互作用は、一般的に１０ ６ Ｍ １以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」という用語は、結合強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。
【0061】
本明細書で使用される場合、「分子量」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、材料の質量または平均質量を指す。ポリマーまたはオリゴマーの場合、分子量は、バルクポリマーの相対平均鎖長または相対鎖質量を指すことができる。分子の分子量は、コンジュゲートの式中の各原子の原子量に各原子の数を掛けた和として計算されてもよい。また、質量分析、ＮＭＲ、クロマトグラフィー、光散乱、粘度、および／または当技術分野で公知の任意の他の方法によって測定されてもよい。分子量の単位は、ｇ／ｍｏｌ、ダルトン（Ｄａ）、または原子質量単位（ａｍｕ）であってもよいことが当技術分野で公知であり、１ｇ／ｍｏｌ＝１Ｄａ＝１ａｍｕである。
【0062】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤（例えば、治療用核酸）と、不活性または活性の担体との組み合わせを指し、組成物を、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に対して特に好適なものにする。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合性があり、それを安定化することができるという意味で、許容可能でなければならない。一つ以上の可溶化剤は、活性剤の送達のための医薬担体として利用され得る。薬学的に許容可能な担体の例としては、剤形として使用可能な組成物を達成するために、生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」という用語は、概して安全であり、非毒性であり、生物学的またはその他の方法で望ましくないものでもない、医薬組成物の調製に有用な担体または賦形剤を意味し、獣医学的使用ならびにヒト医薬使用に許容可能な担体または賦形剤を含む。本明細書および特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」は、一つおよび二つ以上のそのような担体または賦形剤の両方を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、および油／水または水／油エマルションなどのエマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを包含する。一部の実施例では、組成物および製剤はまた、安定化剤および防腐剤を含み得る。
【0064】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、生理学的に忍容性があり、典型的には、ヒトに投与されたときに好ましくない反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方、もしくは動物、より具体的にはヒトで使用する、または非経口製品での使用が安全であると一般的に認識される、他の一般的に認識されている薬局方に列挙されることを意味する。
【0065】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、治療的処置および予防的または予防的処置の両方を指す。それらは、病態、疾患進行、疾患の原因物質（例えば、細菌またはウイルス）、または他の異常な状態の有害作用の予防、治癒、逆転、減弱、緩和、最小化、抑制、または停止を指す。
【0066】
本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、対象に投与されたとき、治療効果を有する、および／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、治療薬は、疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状または特徴を軽減、改善、緩和、阻害、予防、発症の遅延、重症度の低減、および／または発生率の低減に使用され得る任意の物質である。治療薬の例としては、低分子薬剤、化学療法剤、免疫療法剤、治療用抗体およびその断片、毒素（例えば、免疫毒素）、放射性同位体、酵素（例えば、標的部位で細胞毒性薬剤にプロドラッグを切断する酵素）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（またはＣｐＧ ＯＤＮ）、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、マイクロＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子、ｓａＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ分子）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤および染料が含まれてもよいが、これらに限定されない。治療薬はまた、健康な細胞と比較して、標的細胞を放射線療法に対してより感受性にするために放射線増感剤として作用するキレート剤に結合された金属、金属合金、金属間またはコアシェルナノ粒子を含んでもよい。
【0067】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は概して、所望の生物学的応答に影響を与えるための本開示のアプタマーの量を指す。こうした応答は、疾患または障害の症状の改善、低減、予防、または除去を含むがこれらに限定されない、有益な結果である場合がある。したがって、アプタマーまたは方法の各活性成分の総量は、癌の治療を含むがこれに限定されない、必要とする対象において意義のある利益を示すのに十分である。治療有効量は、一つ以上の予防投与または治療投与を介して投与されてもよい。「治療有効レベル」が単剤投与される単一成分に適用される場合、この用語は、その組成物のみを指す。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせて、連続的に、または同時投与されるかどうかにかかわらず、治療効果を生じさせる活性組成物の組み合わせ量を指す。必要とされる正確な量は、例えば、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、特定の対象抗原、免疫学的応答の場合、例えば、抗体を合成する対象の免疫系の能力、および所望の保護の程度、ならびに投与様式に応じて、対象によって変化する。任意の個々の事例における適切な「有効」量は、当業者によって決定されてもよい。したがって、「治療有効量」は、典型的には、日常的な試験を通して決定され得る、比較的広い範囲に収まる。
【0068】
本明細書で使用される場合、「患者」、「個人」、または「対象」という用語は、互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。例示的なヒト対象としては、癌、特にＨＣＣに罹患しているヒト患者が挙げられる。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非哺乳類（ニワトリ、両生類、爬虫類など）、および哺乳類（非ヒト霊長類、家畜動物および／または農業に有用な動物（ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタなど）、ならびに齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど））を含む。
【0069】
組成物
脂肪酸－核酸コンジュゲート
本開示は、脂肪酸－核酸コンジュゲートに関する。本明細書に開示されるコンジュゲートは、少なくとも一つの脂肪酸部分および核酸部分を含み、脂肪酸部分は、核酸にコンジュゲートされる。脂肪酸部分は、核酸の一つの末端にコンジュゲートされることが好ましい。コンジュゲートは、脂肪酸部分を含まない核酸単独と比較して、延長された半減期を有する。本明細書に記載の脂肪酸－核酸コンジュゲートを含む組成物も提供される。
脂肪酸－核酸コンジュゲート
本開示は、脂肪酸－核酸コンジュゲートに関する。本明細書に開示されるコンジュゲートは、少なくとも一つの脂肪酸部分および核酸部分を含み、脂肪酸部分は、核酸にコンジュゲートされる。脂肪酸部分は、核酸の一つの末端にコンジュゲートされることが好ましい。コンジュゲートは、脂肪酸部分を含まない核酸単独と比較して、延長された半減期を有する。本明細書に記載の脂肪酸－核酸コンジュゲートを含む組成物も提供される。
【0070】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、直接的または間接的な共有結合または非共有結合相互作用によって連結される二つ以上の実体（例えば、部分）を指すために使用される。一部の実施形態では、相互作用は共有結合である。一部の実施形態では、共有結合相互作用は、リンカー部分により介在される。一部の実施形態では、相互作用は、非共有結合性である（例えば、電荷相互作用、親和性相互作用、金属配位、物理的吸着、ホストゲスト相互作用、疎水性相互作用、スタッキング相互作用、「粘着性配列」によるなどの水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子－双極子相互作用など）。
【0071】
本明細書で使用される場合、「部分」という用語は、対応する試薬と比較して一つ以上の原子を欠く分子または化合物（例えば、コンジュゲート）の特定の部分または官能基を意味する。例えば、式「Ｈ－－Ｘ－－Ｈ」の試薬が別の試薬と反応し、反応生成物の一部となる場合である。
【0072】
本開示によれば、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、いかなる点においても限定するものとみなされるべきではなく、本明細書では互換的に使用される場合がある。核酸分子は、一緒に共有結合した少なくとも二つのヌクレオチドからなるヌクレオチドのポリマーである。核酸分子は、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ＲＮＡ（リボヌクレオチド）、ならびに組み換えＲＮＡおよびＤＮＡ分子、またはヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体である。核酸は、一本鎖または二本鎖、直線状または円形であってもよい。この用語はまた、開示される抽出方法を使用して回収され得る天然由来のＲＮＡまたはＤＮＡ、またはインビトロで人工的に合成される人工ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（すなわち、合成ポリヌクレオチド）などの核酸の断片を含む。核酸の分子量はまた、限定されず、数個の塩基対（ｂｐ）～数百個の塩基対、例えば、約２個のヌクレオチド～約１，００００個のヌクレオチド、または約１０個のヌクレオチド～５，０００個のヌクレオチド、または約１０個のヌクレオチド～約１，０００個のヌクレオチドの範囲内で任意選択的であってもよい。「オリゴヌクレオチド」は、関連する核酸分子が典型的には約１００未満の塩基を含む場合に使用される。「ポリヌクレオチド」は、関連する核酸分子が典型的には約１００個以上の塩基を含む場合に使用される。全ての用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾もしくは合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ（合成および天然由来の塩基類似体、ジデオキシもしくは他の糖、チオールもしくは他の非天然もしくは天然のポリマー骨格を含むがこれらに限定されない核酸を含む）、またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡにハイブリダイズすることができるポリマーを含有する他の核酸塩基を意味するために使用される。したがって、この用語は、本明細書で言及され使用される核酸の長さを定義または制限すると解釈されるべきではなく、核酸塩基が結合するポリマー骨格の性質を制限するためにこの用語を使用するべきでもない。核酸の種類としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＣｐＧオリゴヌクレオチド、アプタマーおよびそのバリアントなどのオリゴヌクレオチド、ならびにマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびにｃＤＮＡなどの低分子ＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
本明細書で使用される場合、「脂肪酸部分」という用語は、コンジュゲートとの関連で分子またはラジカルを指し、分子またはラジカルは脂肪酸を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、脂肪酸のカルボキシル基に加えて、少なくとも一つの追加のカルボキシル基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、脂肪酸のカルボキシル基に加えて、一つの追加のカルボキシル基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、脂肪酸のカルボキシル基に加えて、二つの追加のカルボキシル基を含む。
【0074】
一部の実施形態では、コンジュゲートの分子量は、少なくとも５ＫＤａ、例えば、５Ｋ～１０ＫＤａ、１０Ｋ～２０ＫＤａ、２０Ｋ～３０ＫＤａ、３０Ｋ～４０ＫＤａ、または４０Ｋ～５０ＫＤａである。
【0075】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、少なくとも一つのカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、例えば、一つのカルボキシル基、二つのカルボキシル基、または三つのカルボキシル基を有する。
【0076】
アプタマーなどの核酸分子は、アプタマーのその標的への結合などの核酸の機能が悪影響を受けない限り、任意選択のリンカーを介して末端－ＣＯＯＨを除く脂肪酸部分の任意の適切な位置にコンジュゲート化されて、コンジュゲートを形成してもよい。一部の実施形態では、核酸、例えば、アプタマーは、脂肪酸部分の末端に結合している。核酸が脂肪酸部分にコンジュゲートされた後、脂肪部分の末端の水素または官能基が核酸で置換される。
【0077】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、核酸分子の一方の末端にコンジュゲートされる。一部の実施例では、脂肪酸部分は、核酸の５’末端にコンジュゲートされる。他の実施例では、脂肪酸部分は、核酸の３’末端にコンジュゲートされる。
【0078】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、リンカーを介して対象の核酸にコンジュゲートされる。本明細書に記載される脂肪酸部分は、より一般的に使用される脂肪酸残基よりも前記生体分子の半減期をはるかに大きく増加させることが見出されている。一部の実施形態では、脂肪酸部分はアルブミンに結合する。一部の実施形態では、脂肪酸部分および核酸を含むコンジュゲートは、低い腎クリアランスを有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、核酸単独よりも低い腎クリアランスを有する。
【0079】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、本明細書に記載される核酸分子に共有結合している。脂肪酸を核酸に結合する方法は特に限定されない。核酸に対する脂肪酸は、直接またはリンカー（連鎖領域）を介して結合されてもよい。一部の実施形態では、脂肪酸を核酸に結合するために使用されるリンカーは、核酸を含む。一部の実施形態では、脂肪酸を核酸に結合するために使用されるリンカーは、核酸を含まない。例示的なリンカーとしては、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－、－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ１－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）～Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３ＣＨ（ＣＨ２０Ｈ）－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２ＣＯ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝０）２－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－および－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－が挙げられるが、これらに限定されない。
【0080】
本開示によれば、コンジュゲートの核酸は、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ））、アプタマーまたはそのバリアント、アンチセンスＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤、低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ＳａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、環状ＲＮＡなどでもよい。核酸分子は、治療用核酸である。
【0081】
「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、１０～２００個のヌクレオチドの長さ、または１０～１００個のヌクレオチドの長さ、１０～５０個のヌクレオチドの長さ、または５０～１００個のヌクレオチドの長さであってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１３個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、２９個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、３１個のヌクレオチド、３２個のヌクレオチド、３３個のヌクレオチド、３４個のヌクレオチド、３５個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチド、３７個のヌクレオチド、３８個のヌクレオチド、３９個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、４１個のヌクレオチド、４２個のヌクレオチド、４３個のヌクレオチド、４４個のヌクレオチド、４５個のヌクレオチド、４６個のヌクレオチド、４７個のヌクレオチド、４８個のヌクレオチド、４９個のヌクレオチド、または５０個のヌクレオチドを含んでもよい。「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（またはＣｐＧ ＯＤＮ）」は、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）、続いてグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）からなるＣｐＧモチーフを含有する短い一本鎖ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続するヌクレオチド間のホスホジエステルリンクを指す。ＣｐＧ ＯＤＮは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ－９）に結合して活性化するＴｈ－１型免疫刺激剤の新しいクラスである。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＲＮＡを変化させ、いくつかの別個の機構を介してタンパク質発現を低減、回復、または修飾することができる、短い合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
【0082】
「ＲＮＡｉ剤」は、標的ｍＲＮＡ配列を認識し、標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する配列を含む核酸分子である。ＲＮＡｉ剤は、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。ＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡ（短い阻害性ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短いまたは小さなヘアピンＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡなどであってもよい。
【0083】
「低分子ＲＮＡ」は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クロマチン依存性遺伝子サイレンシング（ＣＤＧＳ）、またはＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）を介して細胞質および核の両方で遺伝子発現を調節することができる短い（約１８～３０個のヌクレオチド）非コードＲＮＡ分子である。低分子ＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）の三つの主なクラスがある（例えば、Ｆａｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／Ｐｉｗｉ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００８；１３５（７）：１２０１－１２１４）。
【0084】
「ｍＲＮＡ」は、遺伝子のＤＮＡ鎖の一本鎖に相補的である一本鎖ＲＮＡ分子を指す。これは、遺伝子コードをそれらの対応するタンパク質に翻訳するための遺伝子コードおよびテンプレートを提供する。
【0085】
「アプタマー」は、特定の標的分子に結合し、標的の活性、構造、または機能を調節する生体分子を指す。アプタマーは、核酸またはアミノ酸系であってもよい。本開示の文脈において、アプタマーは核酸アプタマーである。
【0086】
一部の実施形態では、本コンジュゲートの核酸は、治療用核酸である。本明細書で使用される場合、「治療用核酸」という用語は、治療剤として使用される核酸分子を指す。例示的な治療用核酸としては、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子、およびｓａＲＮＡなどが挙げられる。
【0087】
一部の実施形態では、核酸部分は、活性化核酸部分またはアンチセンス核酸部分である。
一部の実施形態では、本コンジュゲートの核酸は、有効性および特異性の強化を促進するように修飾されてもよく、および／または安定性を改善するように修飾されてもよい。修飾（例えば、化学修飾）および／またはコンジュゲートの様々な組み合わせを使用して、本コンジュゲートの核酸を修飾してもよい。ヌクレオチド類似体を使用して、糖および／または骨格修飾リボヌクレオチド、例えばホスホチオエート基、２’ＯＨ基での糖修飾、例えば２’－フルオロ、２’－アミノおよび／または２’－チオ修飾を含む核酸を修飾してもよい。特に例示的な修飾としては、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、および２，６－ジアミノプリン、４’位、例えば４－チオ－ウリジン、ならびに／または５’位、例えば５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、５－フルオロ－シチジン、５－フルオロ－ウリジンおよび５－リボ－チミジンが含まれる。追加の修飾残基としては、デオキシ脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシド、リバビリン、ロック核酸（ＬＮＡ）、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本コンジュゲートの核酸は、有効性および特異性の強化を促進するように修飾されてもよく、および／または安定性を改善するように修飾されてもよい。修飾（例えば、化学修飾）および／またはコンジュゲートの様々な組み合わせを使用して、本コンジュゲートの核酸を修飾してもよい。ヌクレオチド類似体を使用して、糖および／または骨格修飾リボヌクレオチド、例えばホスホチオエート基、２’ＯＨ基での糖修飾、例えば２’－フルオロ、２’－アミノおよび／または２’－チオ修飾を含む核酸を修飾してもよい。特に例示的な修飾としては、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、および２，６－ジアミノプリン、４’位、例えば４－チオ－ウリジン、ならびに／または５’位、例えば５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、５－フルオロ－シチジン、５－フルオロ－ウリジンおよび５－リボ－チミジンが含まれる。追加の修飾残基としては、デオキシ脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシド、リバビリン、ロック核酸（ＬＮＡ）、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【0088】
アプタマー
好ましい一実施形態では、本コンジュゲートの核酸は、アプタマー、例えば、ＳＥＬＥＸによって特定され、高親和性で特定の標的に結合するアプタマーである。標的は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、脂質、糖、化合物、細胞、組織、細菌、および他の分析物であってもよい。
好ましい一実施形態では、本コンジュゲートの核酸は、アプタマー、例えば、ＳＥＬＥＸによって特定され、高親和性で特定の標的に結合するアプタマーである。標的は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、脂質、糖、化合物、細胞、組織、細菌、および他の分析物であってもよい。
【0089】
アプタマーは、特定の標的分子に結合し、標的の活性、構造、または機能を調節することの多い生体分子を指す。アプタマーはしばしば、抗体と類似の特徴を有し、「化学的抗体」と呼ばれる。アプタマーは、核酸系またはアミノ酸系、すなわち、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーのいずれかであり得る。核酸アプタマーは、古典的なワトソン・クリック塩基対以外の相互作用を介して、標的分子に対する特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、高親和性で選択された標的に特異的に結合することができる。一部のアプタマーは、結合を介して、標的の機能を妨げる可能性がある。
【0090】
本開示のアプタマーは、合成オリゴヌクレオチドである。典型的な核酸アプタマーは、およそ１０～１５ｋＤａのサイズであり、ナノモル親和性～準ナノモル親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的と区別する。核酸アプタマーの標的は、タンパク質、核酸分子、ペプチド、小分子、および全細胞であってもよいが、これらに限定されない。
【0091】
核酸アプタマーは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または混合リボ核酸とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であってもよい。アプタマーは、一本鎖であってもよい。アプタマーに好適なヌクレオチドの長さは、約１５～約１５０個のヌクレオチドの範囲であり、様々な他の好ましい実施形態では、１５～３０個のヌクレオチド、２０～２５個のヌクレオチド、２０～４５個のヌクレオチド、３０～１００個のヌクレオチド、３０～６０個のヌクレオチド、２５～７０個のヌクレオチド、２５～６０個のヌクレオチド、４０～６０個のヌクレオチド、２５～４０個のヌクレオチド、３０～４０個のヌクレオチド、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドのいずれか、または３０～５０個のヌクレオチド、４０～７０個のヌクレオチド、または５０～１００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、アプタマーは、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０個のヌクレオチドの長さであってもよい。他の実施形態では、アプタマーは、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドの長さであってもよい。しかしながら、配列は、アプタマーと標的との相互作用に適応することができるように、十分な柔軟性を有して設計することができる。
【0092】
「ヌクレオチド」という用語は、核酸の単量体、複素環式塩基、糖、および一つ以上のリン酸基からなる化合物を指す。塩基はプリンおよびピリミジンの誘導体であり、糖はデオキシリボースまたはリボースのいずれかであるペントースである。
【0093】
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、核酸、例えば、オリゴヌクレオチドを化学試薬と化学的に反応させる技術を指す。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されてもよい。修飾には、２’－位糖修飾、５－位ピリミジン、修飾、８－位プリン修飾、外環アミンでの修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモまたは５－ヨード－ウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエートまたはリン酸アルキル修飾、メチル化、イソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対の組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾はまた、キャッピングなどの３’および５’修飾を含み得る。核酸分子はまた、所望の生物学的特性を有する部分へのコンジュゲーションによって修飾されてもよい。こうした部分には、化合物、ペプチドおよびタンパク質、炭水化物、抗体、酵素、ポリマー、薬剤、ならびにフルオロフォアが含まれ得るが、これらに限定されない。一部の実施例では、ポリヌクレオチドは、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールなどの親油性化合物、またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの非免疫原性の高分子量化合物もしくはポリマー、またはポリアミノアミン（ＰＡＭＡＭ）、およびデキストランもしくはポリオキサゾリン（ＰＯＺ）などの多糖類を含むがこれらに限定されない他の水溶性の薬学的に許容可能なポリマーとコンジュゲートされる。修飾は、例えば、核酸分子のインビボ安定性を増加させること、または分子の送達を強化もしくは媒介することを意図する場合がある。
【0094】
アプタマーは、一価または多価のいずれかであってもよい。アプタマーは、単量体、二量体、三量体、四量体、または他の高多量体であってもよい。個々のアプタマー単量体を連結して、多量体アプタマー融合分子を形成してもよい。非限定的な例として、結合オリゴヌクレオチド（すなわちリンカー）は、ランダムアプタマーの５’－アーム領域と３’－アーム領域の両方に相補的な配列を含有するように設計されて、二量体アプタマーを形成してもよい。三量体または四量体アプタマーについては、小さな三量体または四量体（すなわち、Ｈｏｌｌｉｄａｙ接合型様）ＤＮＡナノ構造を操作して、ランダムアプタマーの３’アーム領域に相補的な配列を含み、従ってハイブリダイゼーションを介して多量体アプタマー融合を生成する。さらに、３～５個または５～１０個のｄＴリッチヌクレオチドを、アプタマー結合モチーフ間の一本鎖領域としてリンカーポリヌクレオチド内に操作することができ、これにより、細胞リガンドまたは受容体との多価相互作用を協調および相乗作用するための複数のアプタマーの柔軟性および自由が提供される。あるいは、多量体アプタマーはまた、ビオチン化アプタマーをストレプトアビジンと混合することによって形成され得る。
【0095】
本明細書で使用される場合、「多量体アプタマー」または「多価アプタマー」という用語は、複数の単量体単位を含むアプタマーを指し、単量体単位の各々は、それ自体がアプタマーであり得る。多価アプタマーは、多価結合特性を有する。多量体アプタマーは、ホモ多量体またはヘテロ多量体であってもよい。「ホモ多量体」という用語は、同じ種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、すなわち、各単位は、同じ標的分子の同じ結合部位に結合する。「ヘテロ多量体」という用語は、異なる種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、すなわち、各結合単位は、同じ標的分子の異なる結合部位に結合するか、または各結合単位は、異なる標的分子上の結合部位に結合する。したがって、ヘテロ多量体は、異なる結合部位で一つの標的分子に結合する多量体アプタマー、または異なる標的分子に結合する多量体アプタマーを指すことができる。異なる標的分子に結合するヘテロ多量体はまた、多選択性多量体と称され得る。
【0096】
核酸アプタマーは、一連の連結ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。本発明の例示的な核酸分子またはポリヌクレオチドとしては、Ｄ－核酸またはＬ－核酸のいずれか、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）を含むＬＮＡ）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、および２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）またはそのハイブリッドを含むが、これらに限定されない。
【0097】
核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、または混合リボ核酸とデオキシリボ核酸であってもよい。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、または混合リボ核酸とデオキシリボ核酸であってもよい。
【0098】
アプタマーは、インビトロ選択（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９０； ３４６： ８１８－８２２）またはＳＥＬＥＸ（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ； Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９０， ２４９： ５０５－５１０）のいずれかと呼ばれるプロセスを使用して、標的分子（例えば、対象のタンパク質）に対して生成され得る。この方法は、高度に特異的な結合標的分子を有する核酸分子のインビトロでの進化を可能にする。ＳＥＬＥＸ法は、例えば、米国特許 第７，０８７，７３５号、米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号に記載され、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。核酸アプタマーは、当技術分野で公知の方法を使用して合成することができる。例えば、開示されたアプタマーは、当技術分野で公知の標準オリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成されてもよい。
【0099】
一部の実施形態では、アプタマーは、少なくとも一つの化学修飾を含む。一部の実施形態では、化学修飾は、糖位置での核酸の化学的置換、リン酸位置での化学的置換、および塩基位置での化学的置換から選択される。他の実施形態では、化学修飾は、修飾ヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング、高分子量の非免疫原性化合物へのコンジュゲーション、親油性化合物へのコンジュゲーション、およびリン酸骨格へのホスホロチオエートの組み込みから選択される。好ましい実施形態では、高分子量の非免疫原性化合物はポリアルキレングリコールであり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることがより好ましい。別の分子、通常は薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合のプロセスは、ＰＥＧ化として知られている。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体と標的分子とのインキュベーションによって日常的に達成される。薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、宿主の免疫系から薬剤をマスクし、それによって、低減された免疫原性および抗原性を提供し、腎クリアランスを低減することによってその循環時間を延長する薬剤の流体力学的サイズ（溶液のサイズ）を増加させることができる。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬剤およびタンパク質に対する水溶性を提供することができる。
【0100】
一部の実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）、または３’－アミン（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）によって置き換えられる核酸アプタマーが提供され、式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。連鎖基は、－Ｏ－、－Ｎ－、または－Ｓ－連鎖を介して隣接するヌクレオチドに結合することができる。核酸アプタマー中の全ての連鎖が同一である必要はない。
【0101】
非限定的な例として、核酸アプタマーは、Ｄ－リボースまたはＬ－リボース核酸残基を含むことができ、また限定されないが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシドを含む少なくとも一つの修飾リボヌクレオシドを含むことができ、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連鎖された末端ヌクレオシド、ロックされたヌクレオシドと、脱塩基性ヌクレオシド、逆位デオキシヌクレオシドまたは逆位リボヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミダートまたは非天然塩基、またはそれらの任意の組み合わせである。あるいは、核酸アプタマーは、分子の全長まで、少なくとも２個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含み得る。修飾は、核酸分子中のこのような複数の修飾デオキシヌクレオシドまたはリボヌクレオシドの各々に対して同じである必要はない。
【0102】
本発明のアプタマーは、核酸塩基（多くの場合、当技術分野では単に「塩基」と称される）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「非修飾」核酸塩基または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）などの他の合成核酸塩基および天然核酸塩基、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（疑似ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルアナール、他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、 特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている核酸塩基、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ． ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８； Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８－８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３によって開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９－３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されているものが挙げられる。
【0103】
一部の実施形態では、核酸アプタマーは、二本鎖の特徴の一つ以上の領域を含む。こうした二本鎖領域は、第二またはさらなるアプタマーまたはオリゴヌクレオチド分子との内部自己相補性または相補性から生じてもよい。一部の実施形態では、二本鎖領域は、４～１２、４～１０、４～８個の塩基対の長さであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖領域は、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の塩基対の長さであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖領域は、ステム領域を形成してもよい。二本鎖の特徴を有するかかる伸長ステム領域は、核酸アプタマーを安定化するように機能し得る。本明細書で使用される場合、「二本鎖の特徴」という用語は、二つの核酸分子の任意の長さにわたって、それらの配列が、長さの５０パーセント超の塩基対（標準または非標準）を形成することを意味する。
【0104】
アプタマーは、ヌクレアーゼおよび他の酵素活性からの保護を提供するようにさらに修飾されてもよい。アプタマー配列は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって修飾することができる。例えば、ホスホロチオエートを骨格に組み込むことができ、５’修飾ピリミジンをＤＮＡアプタマーのｓｓＤＮＡの５’末端に含めることができる。ＲＮＡアプタマーについては、例えば、２’－デオキシ－ＮＴＰまたは２’－フルオロ－ＮＴＰによるリボース骨格の２’－ＯＨ基の置換などの修飾ヌクレオチドを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体を使用してＲＮＡ分子に組み込むことができる。これらの修飾アプタマーのヌクレアーゼに対する耐性は、マウス血清由来の精製ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼのいずれかをインキュベートすることによって試験することができ、アプタマーの完全性はゲル電気泳動によって分析することができる。
【0105】
一部の実施形態では、かかる修飾核酸アプタマーは、修飾ヌクレオチドを完全に、または修飾ヌクレオチドのサブセットで合成されてもよい。修飾は、同一であっても異なっていてもよい。全てのヌクレオチドは修飾されてもよく、全てが同じ修飾を含有してもよい。全てのヌクレオチドが修飾され得るが、異なる修飾を含有してもよく、例えば、同じ塩基を含有する全てのヌクレオチドは、一つのタイプの修飾を有してもよく、一方で、他の塩基を含有するヌクレオチドは、異なるタイプの修飾を有してもよい。例えば、全てのプリンヌクレオチドは、一つのタイプの修飾（または非修飾）を有してもよく、一方で全てのピリミジンヌクレオチドは、別の異なるタイプの修飾（または非修飾）を有してもよい。このようにして、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドのライブラリは、本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを使用して生成される。
【0106】
本発明の特定の実施形態によると、アプタマーのバリアントおよび誘導体が提供される。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義的に使用され、基準アプタマーまたは開始アプタマーに対して何らかの方法で修飾または変更された分子を指す。アプタマーバリアントの核酸配列は、基準配列または開始配列と比較して、ヌクレオチド配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。通常、バリアントは、基準配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、基準配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同性）である。
【0107】
一部の実施形態では、アプタマーは、脂肪酸部分に共有結合するために使用され得る官能基で修飾される。官能基は、アプタマーの３’末端または５’末端に付加され得る。一部の実施形態では、追加のリンカー基またはヌクレオチド置換を、コンジュゲーションのためにアプタマーに添加してもよい。
【0108】
一部の実施形態では、アプタマーの５’末端は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基を有する：
【0109】
【化19】
【0110】
ＤＢＣＯ基は、アジド基との銅を含まないクリックケミストリー反応を起こす場合がある。
一部の実施形態では、本開示のアプタマーのバリアント模倣体が提供される。本明細書で使用される場合、「バリアント模倣体」という用語は、活性化配列を模倣するであろう一つ以上の核酸を含有するものである。バリアント模倣体の核酸配列は、天然由来の核酸、または代替的に非天然核酸を含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示のアプタマーのバリアント模倣体が提供される。本明細書で使用される場合、「バリアント模倣体」という用語は、活性化配列を模倣するであろう一つ以上の核酸を含有するものである。バリアント模倣体の核酸配列は、天然由来の核酸、または代替的に非天然核酸を含んでもよい。
【0111】
脂肪酸部分
本開示によれば、脂肪酸部分は、アプタマーなどの核酸にコンジュゲートされる。脂肪酸部分は、天然脂肪酸または脂肪酸様分子であってもよい。
本開示によれば、脂肪酸部分は、アプタマーなどの核酸にコンジュゲートされる。脂肪酸部分は、天然脂肪酸または脂肪酸様分子であってもよい。
【0112】
一部の実施形態では、脂肪酸または脂肪酸部分の分子量は、少なくとも５００Ｄａ、例えば、５００～１ＫＤａ、１Ｋ～１．５ＫＤａ、１．５Ｋ～２ＫＤａ、２Ｋ～２Ｋ２．５ＫＤａ、または２．５Ｋ～３ＫＤａである。
【0113】
脂肪酸は、メチル末端（－ＣＨ３）、炭化水素鎖（Ｒ）（「脂肪族尾部」とも呼ばれる）、および末端カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）からなる典型的なＲＣＯＯＨ構造を有するカルボン酸である。炭化水素鎖は、４～３０個の炭素原子を含んでもよく、飽和であっても不飽和であってもよく（少なくとも一つの二重結合または三重結合を有する）、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を有してもよい。これらは、ＣＮ：ｐ ｎ－ｘのように概略式としてしばしば示され、ＣＮは、炭素原子の総数を表し、ｐは、二重結合の数であり、ｘは、メチル末端（ｎ）からの第一の二重結合の位置を示す（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７７， ７９：１１－２１）。一部の実施形態では、脂肪酸は、偶数の炭素原子の直鎖からなり、鎖の長さに沿って、鎖の一方の末端に水素原子を有し、他方の末端にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する。
【0114】
脂肪酸は、その構造、生理学的役割、および生物学的効果に関していくつかの群に分けることができる。脂肪酸は、それらの構造に従って飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸として分類することができる。脂肪酸様分子は、特定の炭素原子が他の原子または原子の基によって置換されてもよく、かつ置換されてもよい修飾脂肪酸を指す。脂肪酸様分子は、コンジュゲーション戦略をより良好に促進するために修飾される。非限定的な例として、天然脂肪酸は、アミノ末端を含有するように修飾されてもよい。他の実施例では、脂肪酸分子は、コンジュゲーション反応を促進するための一つ以上の親水性基を含んでもよい。
【0115】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはアラルキル基を含む。このアルキル基、アルケニル基、アルキル基、アリール基、またはアラルキル基は、約１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個以上の炭素原子を含んでもよい。
【0116】
一部の実施形態では、アルキル基は、約１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれ以上の炭素原子を含有する。
【0117】
特定の実施形態では、脂肪酸部分領域は、飽和または不飽和、線状または分枝、置換または非置換の脂肪族鎖を含んでもよい。
一部の実施形態では、脂肪酸部分領域は、一つ以上の不飽和炭素結合を含有してもよい。一部の実施形態では、不飽和結合はすべて、同じ鎖内に含有される。
一部の実施形態では、脂肪酸部分領域は、一つ以上の不飽和炭素結合を含有してもよい。一部の実施形態では、不飽和結合はすべて、同じ鎖内に含有される。
【0118】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基を含んでもよい。一部の実施形態では、アルキルは、２～１００個の炭素原子、または２～５０個の炭素原子、または１０～５０個の炭素原子、または２～３０個の炭素原子、または１０～３０個の炭素原子、または１２～２０個の炭素原子を有する。
【0119】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する分枝炭化水素または非分岐炭化水素を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する分枝炭化水素または非分岐炭化水素を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する分枝炭化水素または非分岐炭化水素を指す。
【0120】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」のようなより大きな部分の一部として使用され、合計５～３０個の環員を有する単環式、二環式、または多環式環系を指し、系中の少なくとも一つの環は芳香族である。
【0121】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれ以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１０個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１１個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１２個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１３個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１４個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１５個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１６個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１７個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１８個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１９個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、２０個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、２５個以上の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、３０個以上の炭素原子を含有する。
【0122】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）ａ－ＣＯＯＨを含み、式中、ａ＝１２～２６である。一部の実施形態では、ａ＝１６である。他の実施形態では、ａ＝１８である。
【0123】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、以下の少なくとも一つのエチレングリコール基：－（ＯＣＨ２ＣＨ２）を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１～１０個のエチレングリコール基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１個、２個、３個、４個、または５個のエチレングリコール基を含む。
【0124】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基：－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｂ－を含み、式中、ｂ＝１～１０である。一部の実施形態では、ｂ＝４である。
【0125】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのアミド基（－ＮＨ－ＣＯ－）を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１、２、３、４または５つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１、２、３、４または５つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ）－基を含む。
【0126】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、１～１０つの（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、二つの－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－基を含む。
【0127】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくともアミノ酸基、またはその誘導体／類似体を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのグルタミン酸基、またはその誘導体／類似体、例えば
【0128】
【化20】
【0129】
を含む。一部の実施形態では、グルタミン酸基はγ－グルタミン酸基
【0130】
【化21】
【0131】
である。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基
【0132】
【化22】
【0133】
を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、
【0134】
【化23】
【0135】
基を含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、
【0136】
【化24】
【0137】
基を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、アジド（－Ｎ３）基を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、以下の一般式を含み、
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、アジド（－Ｎ３）基を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、以下の一般式を含み、
【0138】
【化25】
【0139】
（式Ｉ）、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【0140】
【化26】
【0141】
【化27】
【0142】
または
【0143】
【化28】
【0144】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【0145】
【化29】
【0146】
であり、
ｎｃは、０または１である。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、以下の一般式を含み、
ｎｃは、０または１である。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、以下の一般式を含み、
【0147】
【化30】
【0148】
（式ＩＩ）、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
式中、ｎは１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
【0149】
【化31】
【0150】
【化32】
【0151】
または
【0152】
【化33】
【0153】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【0154】
【化34】
【0155】
であり、
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＤは、核酸に共有結合的に結合することができる官能基を含み、
ｎｄは、０または１である。
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＤは、核酸に共有結合的に結合することができる官能基を含み、
ｎｄは、０または１である。
【0156】
一部の実施形態では、ブロックＤは、アジド基、アルキン基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、またはアミノ基を含む。一部の実施形態では、ブロックＤは、Ｒｄ－Ｎ３であり、Ｒｄは、アルキル基、アミノアルキル基、アミン基、および／またはアルコキシル基を含む。一部の実施形態では、ブロックＤは、
【0157】
【化35】
【0158】
【化36】
【0159】
または
【0160】
【化37】
【0161】
である。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨを含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２）－基をさらに含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのγ－グルタミン酸基をさらに含む。非限定的な例としては、
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨを含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つの－（ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２）－基をさらに含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、少なくとも一つのγ－グルタミン酸基をさらに含む。非限定的な例としては、
【0162】
【化38】
【0163】
の構造を有するＧＴＦＡ－１、
【0164】
【化39】
【0165】
の構造を有するＧＴＦＡ－１’、
【0166】
【化40】
【0167】
の構造を有するＧＴＦＡ－３、または
および
および
【0168】
【化41】
【0169】
の構造を有するＧＴＦＡ－３’が挙げられる。
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨを含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をさらに含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基をさらに含む。非限定的な例としては、以下の構造を有するが挙げられる：
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨを含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をさらに含む。一部の実施形態では、脂肪酸部分は、ピペラジン－２－カルボン酸基をさらに含む。非限定的な例としては、以下の構造を有するが挙げられる：
【0170】
【化42】
【0171】
の構造を有するＧＴＦＡ－２、または
【0172】
【化43】
【0173】
の構造を有するＧＴＦＡ－２’が挙げられる。
脂肪酸コンジュゲートの合成
本明細書に開示される核酸分子は、天然核酸および合成核酸または修飾核酸を包含する。修飾核酸は、核酸に新しいまたは強化された特徴（例えば、安定性の改善）を提供するために、例えば塩基修飾、骨格修飾などの一つ以上の修飾を有する。核酸分子および脂肪酸は、当技術分野で公知の任意の適切な方法で合成することができる。次いで、核酸および脂肪酸は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を介して結合することができる。非限定的な例では、核酸および脂肪酸は、アジド－アルキン環化付加などのクリックケミストリーを介して結合される。
脂肪酸コンジュゲートの合成
本明細書に開示される核酸分子は、天然核酸および合成核酸または修飾核酸を包含する。修飾核酸は、核酸に新しいまたは強化された特徴（例えば、安定性の改善）を提供するために、例えば塩基修飾、骨格修飾などの一つ以上の修飾を有する。核酸分子および脂肪酸は、当技術分野で公知の任意の適切な方法で合成することができる。次いで、核酸および脂肪酸は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を介して結合することができる。非限定的な例では、核酸および脂肪酸は、アジド－アルキン環化付加などのクリックケミストリーを介して結合される。
【0174】
「クリックケミストリー」という用語は、選択的であり、かつ単純な反応条件および溶媒下で副生成物がほとんどまたは全くない高収率で進行する様々な反応を網羅する。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」という用語は、１，２，４－トリアゾールを形成するために、アジドと末端アルキンとの間のヒュスゲン環化付加または２，３－ジポーラ環化付加を指す。本明細書で使用される場合、「環化付加」という用語は、二つ以上のπ－電子系（例えば、不飽和分子または同じ分子の不飽和部分）を組み合わせて、結合多重度の正味減少がある環状生成物を形成する化学反応を指す。環化付加では、π電子を使用して新しいシグマ結合を形成する。環化付加の生成物は、「付加物」または「環化付加物」と呼ばれる。［３＋２］環化付加物およびディールス・アルダー反応を含むがこれらに限定されない、異なるタイプの環化付加物が当技術分野で公知である。［３＋２］環化付加は、２，３－双極子環化付加物とも呼ばれ、１，３－双極子と親双極子の間で発生し、典型的には五員複素環の構築に使用される。「［３＋２］環化付加」という用語はまた、Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００４， １２６：１５０４６－１５０４７によって記載される、アジドとシクロオクチンおよびジフルオロシクロオクチンの間の「無銅」 ［３＋２］ 付加環化も網羅する。ヒュスゲン環化付加を促進するために使用できる任意の試薬を、クリックケミストリー試薬として使用することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー試薬は、ピリジルアジドを含む。一部の実施形態では、クリックケミストリー試薬は、ピコリルアジドを含む。限定されないが、ピコリルアジドの任意の異性体を使用することができる。
【0175】
一部の実施形態では、脂肪酸部分は、核酸配列の５’末端に共有結合される。その他の実施形態では、脂肪酸部分は、核酸配列の３’末端に共有結合される。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、
一部の実施形態では、コンジュゲートは、
【0176】
【化44】
【0177】
（式ＩＩＩ）の一般式を有し、式中、ｎは、１２～２６の整数であり、
ブロックＡは、
ブロックＡは、
【0178】
【化45】
【0179】
【化46】
【0180】
または
【0181】
【化47】
【0182】
であり、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
ｎａは、０または１であり、
ブロックＢは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－または－（ＣＯ－ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＯＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ）－であり、
ｎｂは、１～１０の整数であり、
ブロックＣは、
【0183】
【化48】
【0184】
であり、
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＥは任意のリンカーであり、
ｎｅは、１～１０の整数である。
ｎｃは、０または１であり、
ブロックＥは任意のリンカーであり、
ｎｅは、１～１０の整数である。
【0185】
一部の実施形態では、ブロックＥは、ＤＢＣＯとアジドとの間のクリックケミストリー反応によって形成される基である。一部の実施形態では、ブロックＥは、
【0186】
【化49】
【0187】
を含む。
一部の実施形態では、脂肪酸－核酸コンジュゲートは、１）例えば、ヌクレオチド配列の一方の末端にＤＢＣＯ基を付加することなど、核酸を修飾して活性基を加えることと、２）脂肪酸部分を一つ以上の官能基、例えば、本開示の実施例１で考察される脂肪酸部分で合成することと、３）脂肪酸部分の官能基と核酸との間の化学反応を介して脂肪酸－核酸コンジュゲートを合成することと、という一般的な工程に従って生成されてもよい。反応混合液をさらに処理して、脂肪酸－核酸コンジュゲートを単離してもよい。
一部の実施形態では、脂肪酸－核酸コンジュゲートは、１）例えば、ヌクレオチド配列の一方の末端にＤＢＣＯ基を付加することなど、核酸を修飾して活性基を加えることと、２）脂肪酸部分を一つ以上の官能基、例えば、本開示の実施例１で考察される脂肪酸部分で合成することと、３）脂肪酸部分の官能基と核酸との間の化学反応を介して脂肪酸－核酸コンジュゲートを合成することと、という一般的な工程に従って生成されてもよい。反応混合液をさらに処理して、脂肪酸－核酸コンジュゲートを単離してもよい。
【0188】
一部の実施形態では、抗ＶＷＦアプタマーの脂肪酸コンジュゲーションが、本開示によって提供される。抗ＶＷＦアプタマーは、ポリヌクレオチド配列：ＮＨ２－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣ－ｉｄＴ（配列番号１、ＢＴ１００）を含んでもよく、式中、「ＮＨ」は５’－ヘキシルアミンリンカーホスホロアミダイトであり、「ｉｄＴ」は逆方向デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は２’－Ｏ－メチル含有残基である。非限定的な例として、ＢＴ１００の脂肪酸コンジュゲーションは、ポリヌクレオチド配列：（５’－）パルミチン酸－リンカー－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣｉｄＴ （－３’） （配列番号３、ＢＴ５００）を含む。
【0189】
別の例として、ＢＴ１００の脂肪酸コンジュゲーションは、ポリヌクレオチド配列：（５’－）ＧＴＦＡ－１－リンカー－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣｉｄＴ （－３’） （配列番号４、ＢＴ６００）を含む。
【0190】
別の例として、ＢＴ１００の脂肪酸コンジュゲーションは、ポリヌクレオチド配列：（５’－）ＧＴＦＡ－３－リンカー－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣｉｄＴ （－３’） （配列番号５、ＢＴ７００）を含む。
【0191】
医薬組成物および投与方法
別の態様では、本開示は、本開示の核酸－脂肪酸コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。コンジュゲートの核酸は、治療用核酸である。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸－脂肪酸コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。コンジュゲートの核酸は、治療用核酸である。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
【0192】
組成物は、非経口投与、経腸投与、経口投与、または他の適切な経路などの特定の投与経路用に製剤化されてもよい。非経口投与は、注射によって、または埋め込みカテーテルの挿入によって実施されてもよく、これには静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、経皮注射、硬膜外注射、大脳内（大脳内）投与、脳室内（大脳室内）投与、羊膜外投与、鼻腔内投与、動脈内、心臓内、骨内注入（ＩＯ）、腹腔内注入または注射、経皮拡散、経腸経路および胃腸経路、局所投与および経口経路を含むが、これに限定されない。
【0193】
さらに、本開示の医薬組成物は、カプセル、錠剤、丸剤、顆粒剤、凍結乾燥物、粉末、もしくは座薬を含むがこれらに限定されない固体形態、または溶液、懸濁液、もしくは乳剤を含むが限定されない液体形態で作製されてもよい。医薬組成物は、無菌製造、滅菌などの従来の医薬操作を受けることができ、および／または従来の不活性希釈剤、ケーク形成剤、等張化剤、潤滑剤、もしくは緩衝剤、ならびに防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、および緩衝液などのアジュバントを含有することができる。
【0194】
一部の実施形態では、注射用途に適した医薬組成物には、典型的には、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌散剤が含まれ得る。
【0195】
静脈内投与については、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は注射のために滅菌される。好ましい医薬製剤は、製造および保管の条件下で安定である。一般に、関連する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合液を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合において、例えば糖類、例えばマンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。一部の実施形態では、溶解性を改善し、活性成分の投与および放出を支援するために、分解または凝集からのコンジュゲート生成物の安定化を促進するために、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤を製剤プロセスに組み込まれてもよい。（ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ２０１２， ２３（３）：４０－４４）。
【0196】
特定の注射用組成物は、等張水溶液または懸濁液であり、座薬は、有利なことに、脂肪エマルションまたは懸濁液から調製される。前記組成物は、滅菌されてもよく、および／または例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液プロモーター、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝液などのアジュバントを含有してもよい。
【0197】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせと、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌によって調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒を含有する滅菌ビヒクル、および上に列記される物質から必要とされる他の成分と組み合わせることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥法および凍結乾燥法である。当該方法により、すでに滅菌ろ過されたその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【0198】
経口組成物は概して、不活性希釈剤、または食用担体を含む。経口治療用投与の目的に対し、活性化合物は、賦形剤と組み込まれて、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用されてもよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似した性質の化合物のいずれかを含有してもよい：例えば微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤；例えばデンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；例えばコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；例えばスクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；または例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味剤。経口送達のための製剤は、有利なことには、胃腸管内の安定性を改善するため、および／または吸収を強化するための薬剤を組み込まれてもよい。
【0199】
吸入による投与については、組成物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガス、またはネブライザーを含有する加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーという形態で送達されることが好ましい。肺は、治療薬の全身送達のための広い表面積を提供することに注目されたい。
【0200】
一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、静脈内、経粘膜、または経皮手段による全身投与のために製剤化される。
経皮用途に好適な組成物は、好適な担体を用いた本開示のコンジュゲートの有効量を含む。経皮送達に適した担体には、宿主の皮膚を通過するのを助けるための吸収性の薬理学的に許容可能な溶媒が含まれる。例えば、経皮装置は、裏打ち部材と、化合物を任意選択的に担体とともに含む貯蔵部と、任意選択的に宿主の皮膚に化合物を長時間にわたり制御された所定の速度で送達するためのバリアを制御する速度と、装置を皮膚に固定するための手段と、を含む包帯の形態である。
経皮用途に好適な組成物は、好適な担体を用いた本開示のコンジュゲートの有効量を含む。経皮送達に適した担体には、宿主の皮膚を通過するのを助けるための吸収性の薬理学的に許容可能な溶媒が含まれる。例えば、経皮装置は、裏打ち部材と、化合物を任意選択的に担体とともに含む貯蔵部と、任意選択的に宿主の皮膚に化合物を長時間にわたり制御された所定の速度で送達するためのバリアを制御する速度と、装置を皮膚に固定するための手段と、を含む包帯の形態である。
【0201】
実施形態において、医薬組成物は皮下投与用に製剤化される。
使用方法
別の態様では、本開示のコンジュゲートを患者に投与することを含む、そのような治療を必要とする患者における疾患または障害を治療するための方法が本明細書で提供される。
使用方法
別の態様では、本開示のコンジュゲートを患者に投与することを含む、そのような治療を必要とする患者における疾患または障害を治療するための方法が本明細書で提供される。
【0202】
脂肪酸コンジュゲート核酸および脂肪酸コンジュゲート核酸を含む組成物は、様々な異なる医薬、治療、診断、および生物医学の用途で使用することができる。本脂肪酸修飾は、核酸（例えば、アプタマー）の効力および有効性を改善し、経口送達の可能性を明らかにするとともに、皮下投与および静脈内投与を強化する。本脂肪酸コンジュゲーションは、治療用核酸の効力を増加させて、より低い用量の投与を可能にし、これが毒性および免疫原性の可能性を低減する場合がある。本脂肪酸コンジュゲーションは、安定性を増加させ、より少ない頻度の投与を可能にする場合がある。
【0203】
非限定的な例として、脂肪酸コンジュゲート核酸および脂肪酸コンジュゲート核酸を含む組成物は、治療用途での使用がある。
疾患または障害の非限定的な例としては、血管形成障害、心血管障害、脳卒中、神経変性障害、癌、遺伝性障害、および奇病などが挙げられる。
疾患または障害の非限定的な例としては、血管形成障害、心血管障害、脳卒中、神経変性障害、癌、遺伝性障害、および奇病などが挙げられる。
【0204】
一部の実施形態では、本治療方法は、疾患または障害の症状の発症を変化させる場合がある。
一態様では、本開示は、対象に治療有効量の本開示のコンジュゲートを投与することによって、上述の疾患または障害を対象において予防するための方法を提供する。疾患のリスクがある対象は、例えば、診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって特定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が予防される、または代替的にはその進行が遅延するように、疾患または障害に特徴的な症状の発現の前に発生することができる。
一態様では、本開示は、対象に治療有効量の本開示のコンジュゲートを投与することによって、上述の疾患または障害を対象において予防するための方法を提供する。疾患のリスクがある対象は、例えば、診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって特定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が予防される、または代替的にはその進行が遅延するように、疾患または障害に特徴的な症状の発現の前に発生することができる。
【0205】
一実施形態では、対象は、本開示のコンジュゲートの初回用量および一回以上の維持用量を投与される。維持用量は、概して初回用量よりも低く、例えば、初回用量の半量である。維持レジメンは、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇの範囲の用量、例えば、１日当たり体重１ｋｇ当たり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇで対象を治療することを含み得る。維持用量は、２日、５日、１０日、または３０日毎に１回以下投与されることが好ましい。さらに、治療レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態に応じて、様々な期間にわたって継続する場合がある。好ましい実施形態では、投与量は、１日１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以上、例えば、５日または８日毎に１回、送達されてもよい。治療後、患者は、状態の変化、および病態の症状の軽減についてモニタリングされ得る。化合物の投与量は、患者が現在の投与量レベルに著しく応答しない場合は増量してもよく、または病態の症状の軽減が観察された場合、病態が除去された場合、または望ましくない副作用が観察された場合には減量し得る。
【0206】
一部の実施形態では、ＢＴ１００（例えば、ＢＴ５００、ＢＴ６００およびＢＴ７００）の脂肪酸コンジュゲーションを使用して、ＶＷＦ抗原に結合することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、原発性虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を有する患者における脳卒中およびＴＩＡ、ならびに脳卒中再発を治療および／または予防するために使用され得る。例えば、治療および予防方法は、ＢＴ５００、ＢＴ６００、またはＢＴ７００を一つ以上の抗血栓薬と組み合わせて使用する。
【0207】
均等物および範囲
当業者は、日常的な実験作業のみを使用して、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できるであろう。本開示の範囲は、上記の記述に制限されることを意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記述される通りである。
当業者は、日常的な実験作業のみを使用して、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できるであろう。本開示の範囲は、上記の記述に制限されることを意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記述される通りである。
【0208】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの物品は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、一つ以上を意味し得る。グループの一つまたは複数のメンバーとの間に「または」を含むクレームまたは説明は、グループメンバーの一つ、１以上、またはすべてが、文脈から逆のまたはそうでないことが示されていない限り、所与の製品またはプロセスに存在し、採用され、またはそうでなければ関連する場合に満足されると考えられる。本開示は、グループのちょうど一つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。本開示はまた、二つ以上の、またはグループメンバー全体が所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態も含む。
【0209】
また、「含む」という用語は、開放的であることが意図され、追加の要素またはステップの包含を許可するが、必要とはしないことに留意されたい。本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用されるとき、それゆえ、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含され、開示される。
【0210】
範囲が与えられる場合は、終点が含まれる。さらに、別段の示唆がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が別途明確に示さない限り、本開示の異なる実施形態で記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲から、範囲の下限の単位の１０分の１までを仮定することができることが理解されるべきである。
【0211】
さらに、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちのいずれか一つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。こうした実施形態は当業者に公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分、または活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の理由により、任意の一つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
【0212】
使用された言葉は、限定ではなく説明するための言葉であり、そのより広範な態様における本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【0213】
本開示は、いくつかの説明された実施形態に関して、ある程度の長さかつある程度の詳細を述べて説明されてきたが、任意のかかる詳細、または実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるべきではなく、先行技術を考慮して、最も広い解釈による特許請求の範囲の提供し、したがって、本開示の意図された範囲を効果的に包含するように、かかる添付の特許請求の範囲を参照しながら解釈されるべきである。
【実施例】
【0214】
以下の実施例は、例示目的で提供され、限定する目的で提供されるものではない。
実施例１：例示的な脂肪酸部分の合成方法
ＧＴＦＡ－１合成
実施例１：例示的な脂肪酸部分の合成方法
ＧＴＦＡ－１合成
【0215】
【化50】
【0216】
工程１：
無水ＴＨＦ（２５ｍｌ）中の化合物Ａ１（２．４６ｇ、９．４ｍｍｏｌ）および化合物Ａ２（９４０ｍｇ、９．４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（９ｍｌ、ＥＡ中５０％、１４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３．３ｍｌ、１８．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ａ３（２．８ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：３４６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＴＨＦ（２５ｍｌ）中の化合物Ａ１（２．４６ｇ、９．４ｍｍｏｌ）および化合物Ａ２（９４０ｍｇ、９．４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（９ｍｌ、ＥＡ中５０％、１４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３．３ｍｌ、１８．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ａ３（２．８ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：３４６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0217】
工程２：
化合物Ａ３（２．７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのメタノールに溶解し、ＨＣｌ（２０ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、８０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で３時間撹拌し、濃縮して化合物Ａ４（２．２ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：２４６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物Ａ３（２．７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのメタノールに溶解し、ＨＣｌ（２０ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、８０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で３時間撹拌し、濃縮して化合物Ａ４（２．２ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：２４６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0218】
工程３：
無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の化合物Ａ４（１．５ｇ、５．２ｍｍｏｌ）および化合物Ａ１（１．４ｇ、５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（４．６ｍｌ、ＥＡ中５０％、７．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３．６ｍｌ、２０．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ａ５（２．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：４９１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の化合物Ａ４（１．５ｇ、５．２ｍｍｏｌ）および化合物Ａ１（１．４ｇ、５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（４．６ｍｌ、ＥＡ中５０％、７．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３．６ｍｌ、２０．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ａ５（２．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：４９１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0219】
工程４：
化合物Ａ５（２．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのメタノールに溶解し、ＨＣｌ（１２ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、４８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で４時間撹拌し、濃縮して化合物Ａ６（１．７ｇ、４ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：３９１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物Ａ５（２．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのメタノールに溶解し、ＨＣｌ（１２ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、４８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で４時間撹拌し、濃縮して化合物Ａ６（１．７ｇ、４ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：３９１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0220】
工程５：
無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）中の化合物Ａ６（１．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）および化合物Ａ７（１．１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（３ｍｌ、ＥＡ中５０％、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．３ｍｌ、１３．２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１．５時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、粗化合物Ａ８（２．３ｇ）を得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＬＣＭＳ：７９８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）中の化合物Ａ６（１．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）および化合物Ａ７（１．１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（３ｍｌ、ＥＡ中５０％、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．３ｍｌ、１３．２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１．５時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、粗化合物Ａ８（２．３ｇ）を得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＬＣＭＳ：７９８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0221】
工程６：
３０ｍｌのＤＣＭ中の化合物Ａ８（２．３ｇ）の溶液に、ＤＢＵ（１ｍＬ）を加えた。得られた混合液を、室温で２時間攪拌し、次いでＤＣＭ（１００ｍｌ）で希釈し、水（５０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機相を濃縮し、残留物を水（２０ｍＬ）で溶解し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で抽出した。水相を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物９（１．２ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：５７６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
３０ｍｌのＤＣＭ中の化合物Ａ８（２．３ｇ）の溶液に、ＤＢＵ（１ｍＬ）を加えた。得られた混合液を、室温で２時間攪拌し、次いでＤＣＭ（１００ｍｌ）で希釈し、水（５０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機相を濃縮し、残留物を水（２０ｍＬ）で溶解し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で抽出した。水相を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物９（１．２ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：５７６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0222】
工程７：
無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物Ａ９（１．０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）および化合物Ａ１０（６４０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（１．５ｍｌ、ＥＡ中５０％、２．６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６０５μ、３．４８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１１（１．４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：９２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物Ａ９（１．０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）および化合物Ａ１０（６４０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（１．５ｍｌ、ＥＡ中５０％、２．６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６０５μ、３．４８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１１（１．４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：９２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0223】
工程８：
化合物Ａ１１（１．４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＣＭに溶解し、ＴＦＡ（５ｍｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で３時間撹拌し、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、最終生成物ＧＴＦＡ－１（８５０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を得た。Ｃ３８Ｈ６９Ｎ７Ｏ１２ ＬＣＭＳ：８１６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．００－１１．００（ｂｒ，２Ｈ），８．００－８．０２（ｍ，１Ｈ），７．８８－７．８５（ｍ，１Ｈ），７．７７－７．７４（ｍ，１Ｈ），７．６６－７．６３（ｍ，１Ｈ），４．１５－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），３．５９－３．５１（ｍ，８Ｈ），３．４４－３．４３（ｍ，２Ｈ），３．４１－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３３－３．２５（ｍ，４Ｈ），３．２１－３．１３（ｍ，４Ｈ），２．１７－２．０６（ｍ，６Ｈ），１．９５－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．７５－１．７０（ｍ， １Ｈ），１．６８－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．４７－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｓ，２４Ｈ）．
ＧＴＦＡ－２合成
化合物Ａ１１（１．４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＣＭに溶解し、ＴＦＡ（５ｍｌ）を０℃で添加した。反応混合液を室温で３時間撹拌し、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、最終生成物ＧＴＦＡ－１（８５０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を得た。Ｃ３８Ｈ６９Ｎ７Ｏ１２ ＬＣＭＳ：８１６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．００－１１．００（ｂｒ，２Ｈ），８．００－８．０２（ｍ，１Ｈ），７．８８－７．８５（ｍ，１Ｈ），７．７７－７．７４（ｍ，１Ｈ），７．６６－７．６３（ｍ，１Ｈ），４．１５－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），３．５９－３．５１（ｍ，８Ｈ），３．４４－３．４３（ｍ，２Ｈ），３．４１－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３３－３．２５（ｍ，４Ｈ），３．２１－３．１３（ｍ，４Ｈ），２．１７－２．０６（ｍ，６Ｈ），１．９５－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．７５－１．７０（ｍ， １Ｈ），１．６８－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．４７－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｓ，２４Ｈ）．
ＧＴＦＡ－２合成
【0224】
【化51】
【0225】
【化52】
【0226】
【化53】
【0227】
工程１：
無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中の化合物Ｂ１（１６０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および化合物Ｂ２（１５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（５００μｌ、ＥＡ中５０％、０．８４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６０μｌ、１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ｂ３（２００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：５４８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中の化合物Ｂ１（１６０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および化合物Ｂ２（１５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（５００μｌ、ＥＡ中５０％、０．８４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６０μｌ、１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ｂ３（２００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：５４８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0228】
工程２：
化合物３（２００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を２ｍｌのジオキサン中に溶解し、ＨＣｌ（２ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で４０分間撹拌し、濃縮して、化合物Ｂ４（１８０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：４４８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物３（２００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を２ｍｌのジオキサン中に溶解し、ＨＣｌ（２ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で４０分間撹拌し、濃縮して、化合物Ｂ４（１８０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：４４８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0229】
工程３：
無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中の化合物４（１８０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）および化合物Ｂ５（１３５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（４００μｌ、ＥＡ中５０％、０．６７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６０μｌ、１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ｂ６（１３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：８００ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中の化合物４（１８０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）および化合物Ｂ５（１３５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（４００μｌ、ＥＡ中５０％、０．６７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６０μｌ、１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合液を１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物Ｂ６（１３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：８００ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0230】
工程４：
化合物Ｂ６（１３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を４ｍｌのＭｅＯＨ中に溶解し、ＮａＯＨ（１ｍｌ、水中４Ｎ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で１時間撹拌し、減圧下でＭｅＯＨを除去した。残留物を水で希釈し、０℃まで冷却し、ＨＣｌ（２ｍｌ、２Ｎ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合液をＤＣＭで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、化合物Ｂ７（１３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：７８６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物Ｂ６（１３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を４ｍｌのＭｅＯＨ中に溶解し、ＮａＯＨ（１ｍｌ、水中４Ｎ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で１時間撹拌し、減圧下でＭｅＯＨを除去した。残留物を水で希釈し、０℃まで冷却し、ＨＣｌ（２ｍｌ、２Ｎ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合液をＤＣＭで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、化合物Ｂ７（１３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ：７８６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0231】
工程５：
化合物Ｂ７（１３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶解し、ＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合液を室温で１時間撹拌し、濃縮して、最終生成物ＧＴＦＡ－２（１１０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を得た。Ｃ３５Ｈ６３Ｎ５Ｏ１１ ＬＣＭＳ：７３０ ［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．６０－４．３５（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１５（ｍ，１Ｈ），３．７９－３．６１（ｍ，２０Ｈ），３．５４－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．４１－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３５－３．２８（ｍ， １Ｈ），３．０５－２．９３（ｍ， １Ｈ），２．８０－２．７０（ｍ，１Ｈ），２．４３－２．３３（ｍ，４Ｈ），１．６８－１．６０（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｍ，２４Ｈ）．
ＧＴＦＡ－３合成
化合物Ｂ７（１３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶解し、ＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合液を室温で１時間撹拌し、濃縮して、最終生成物ＧＴＦＡ－２（１１０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を得た。Ｃ３５Ｈ６３Ｎ５Ｏ１１ ＬＣＭＳ：７３０ ［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．６０－４．３５（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１５（ｍ，１Ｈ），３．７９－３．６１（ｍ，２０Ｈ），３．５４－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．４１－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３５－３．２８（ｍ， １Ｈ），３．０５－２．９３（ｍ， １Ｈ），２．８０－２．７０（ｍ，１Ｈ），２．４３－２．３３（ｍ，４Ｈ），１．６８－１．６０（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｍ，２４Ｈ）．
ＧＴＦＡ－３合成
【0232】
【化54】
【0233】
【化55】
【0234】
工程１：
無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の化合物Ｃ１（３．８３ｇ、９ｍｍｏｌ）および化合物Ｃ２（１．５ｍｇ、９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（７．５ｍｌ、ＥＡ中５０％、１．３当量）およびＤＩＰＥＡ（５ｍｌ、３当量）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、化合物Ｃ２（１００ｍｇ）を加えた。反応混合液を５０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ３（約４．２ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：５３８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の化合物Ｃ１（３．８３ｇ、９ｍｍｏｌ）および化合物Ｃ２（１．５ｍｇ、９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｔ３Ｐ（７．５ｍｌ、ＥＡ中５０％、１．３当量）およびＤＩＰＥＡ（５ｍｌ、３当量）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、化合物Ｃ２（１００ｍｇ）を加えた。反応混合液を５０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ３（約４．２ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：５３８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0235】
工程２：
ＤＣＭ（２０ｍＬ）溶液中の０℃の化合物Ｃ３（約４．２ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（３ｍＬ、１９．７ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で３０分間攪拌し、水で希釈した。水層をＤＣＭで抽出した。組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物にブラインを添加し、ＭＴＢＥで洗浄した。ブライン層をＤＣＭで抽出した。組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ４（約２ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：３１６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＣＭ（２０ｍＬ）溶液中の０℃の化合物Ｃ３（約４．２ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（３ｍＬ、１９．７ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で３０分間攪拌し、水で希釈した。水層をＤＣＭで抽出した。組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物にブラインを添加し、ＭＴＢＥで洗浄した。ブライン層をＤＣＭで抽出した。組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ４（約２ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：３１６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0236】
工程３：
ＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）中の化合物Ｃ４（約２ｇ）および化合物Ｃ５（１．７ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（７．５ｍｌ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（７ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ６（約３．６ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：６８３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）中の化合物Ｃ４（約２ｇ）および化合物Ｃ５（１．７ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（７．５ｍｌ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（７ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を３０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ６（約３．６ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：６８３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0237】
工程４：
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ６（約３．６ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（１ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で１０分間攪拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ７（約１．６ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：４６１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ６（約３．６ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（１ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で１０分間攪拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ７（約１．６ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：４６１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0238】
工程５：
ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中の化合物Ｃ７（約１．６ｇ）および化合物Ｃ５（１．１８ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（４ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（３ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を１８０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ８（約２．５ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：８２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中の化合物Ｃ７（約１．６ｇ）および化合物Ｃ５（１．１８ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（４ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（３ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を１８０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ８（約２．５ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：８２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0239】
工程６：
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ８（約２．５ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（０．３ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で２時間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ９（約１．５ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：６０６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ８（約２．５ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（０．３ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で２時間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ９（約１．５ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：６０６ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0240】
工程７：
ＤＣＭ（６０ｍｌ）中の化合物Ｃ９（約１．５ｇ）および化合物Ｃ１（０．８９ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（３ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を１２０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ１０（約２．４ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：１０１３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＣＭ（６０ｍｌ）中の化合物Ｃ９（約１．５ｇ）および化合物Ｃ１（０．８９ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（３ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を１２０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ１０（約２．４ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：１０１３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0241】
工程８：
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ１０（約２．４ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（０．３ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で２時間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ１１（約１．４９ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：７８０ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の０℃の化合物Ｃ１０（約２．４ｇ）の粗生成物の溶液に、ＤＢＵ（０．３ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合液を室温で２時間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で希釈した。ブラインをＤＣＭで抽出し、組み合わせたＤＣＭ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物に水を添加し、ヘキサンで洗浄した。水層をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、次のステップに使用する化合物Ｃ１１（約１．４９ｇ）の粗生成物を得た。ＬＣＭＳ：７８０ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0242】
工程９：
ＤＣＭ（３０ｍｌ）中の化合物Ｃ９（約１．４９ｇ）および化合物Ｃ１２（０．５８４ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（２ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を６０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を、ＥｔＯＡｃ／メタノール（２０：１）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物Ｃ１３（１．５８ｇ）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ：５７２［Ｍ＋２Ｈ］＋。
ＤＣＭ（３０ｍｌ）中の化合物Ｃ９（約１．４９ｇ）および化合物Ｃ１２（０．５８４ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の粗生成物の溶液に、Ｔ３Ｐ（２ｍＬ、ＥＡ中５０％）およびＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合液を６０分間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。混合液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を、ＥｔＯＡｃ／メタノール（２０：１）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物Ｃ１３（１．５８ｇ）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ：５７２［Ｍ＋２Ｈ］＋。
【0243】
工程１０：
化合物Ｃ１３（８０７ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）をジオキサン（３ｍＬ）中に溶解し、ＨＣｌ（６ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、２．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で６時間撹拌し、濃縮して、化合物ＧＴＦＡ－３（５７６ｍｇ）を得た。Ｃ４４Ｈ７８Ｎ８Ｏ１６ ＬＣＭＳ： ９７５ ［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．００－１１．００（ｂｒ，３Ｈ），８．０１－８．０３（ｍ，１Ｈ），７．９０－７．８５（ｍ，３Ｈ），７．６８－７．６５（ｍ，１Ｈ），４．２５－４．２１（ｍ，１Ｈ），４．１４－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），３．５７－３．５２（ｍ，１０Ｈ），３．４６－３．３６（ｍ，８Ｈ），３．２９－３．２５（ｍ， ２Ｈ），３．２１－３．１６（ｍ，４Ｈ），２．１８－２．０５（ｍ，８Ｈ），２．０４－１．７（ｍ，４Ｈ），１．４７－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｓ，２４Ｈ）．
実施例２：ＢＴ１００への脂肪酸コンジュゲーション
ＢＴ１００のコア配列（配列番号１）を三つの異なる脂肪酸とコンジュゲートして、それぞれＢＴ５００、ＢＴ６００、およびＢＴ７００を作製した。
化合物Ｃ１３（８０７ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）をジオキサン（３ｍＬ）中に溶解し、ＨＣｌ（６ｍｌ、ジオキサン中４Ｎ、２．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で６時間撹拌し、濃縮して、化合物ＧＴＦＡ－３（５７６ｍｇ）を得た。Ｃ４４Ｈ７８Ｎ８Ｏ１６ ＬＣＭＳ： ９７５ ［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．００－１１．００（ｂｒ，３Ｈ），８．０１－８．０３（ｍ，１Ｈ），７．９０－７．８５（ｍ，３Ｈ），７．６８－７．６５（ｍ，１Ｈ），４．２５－４．２１（ｍ，１Ｈ），４．１４－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），３．５７－３．５２（ｍ，１０Ｈ），３．４６－３．３６（ｍ，８Ｈ），３．２９－３．２５（ｍ， ２Ｈ），３．２１－３．１６（ｍ，４Ｈ），２．１８－２．０５（ｍ，８Ｈ），２．０４－１．７（ｍ，４Ｈ），１．４７－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２２（ｓ，２４Ｈ）．
実施例２：ＢＴ１００への脂肪酸コンジュゲーション
ＢＴ１００のコア配列（配列番号１）を三つの異なる脂肪酸とコンジュゲートして、それぞれＢＴ５００、ＢＴ６００、およびＢＴ７００を作製した。
【0244】
ＤＢＣＯ部分を、ＢＴ１００のアミノ末端に最初に組み込んだ。５’アミノ基（アミノ修飾剤Ｃ６）を有するＨＰＬＣ精製ＢＴ１００を、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０中、室温で一晩、２．５モル当量のＤＢＣＯ－Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステル（ＣＡＳ＃１４００１９１－５２－７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、カタログ番号ＢＰ－２２２８９）と反応させた。
【0245】
陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した後、ｐＨ調整なしで、ＤＢＣＯ標識ＢＴ１００を、２．５モル当量のパルミチン酸、ＧＴＦＡ１、またはＧＴＦＡ３と室温で一晩反応させた。ＢＴ５００（ＢＴ１００へのパルミチン酸コンジュゲート）、ＢＴ６００（ＢＴ１００へのＧＴＦＡ１コンジュゲート）、またはＢＴ７００（ＢＴ１００へのＧＴＦＡ３コンジュゲート）を、陰イオン交換ＨＰＬＣ精製後に得た。
【0246】
ＢＴ５００：ＤＢＣＯ標識アプタマー配列（ＢＴ１００）を、アジドパルミチン酸、末端に窒素を有する飽和Ｃ１６脂肪酸、および他方の末端に一つの遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と相互作用させた。ＤＢＣＯ部分はアジドと反応して安定なトリアゾールを生成し、一つの末端に一つの遊離ＣＯＯＨ基を有するＣ１６脂肪酸コンジュゲートアプタマーを形成する（ＢＴ５００、配列番号３）。
【0247】
【化56】
【0248】
ＢＴ６００：ＤＢＣＯ標識ＢＴ１００を、短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーおよびγ－グルタミン酸リンカー（ＧＴＦＡ－１）を通してオクタデカン二酸と結合させ、ビカルボキシル脂肪酸を含有するコンジュゲート（ＢＴ６００、配列番号４）を形成した。得られた脂肪酸ＢＴ１００アプタマー化合物は、二つの遊離ＣＯＯＨ基を含有する。
【0249】
【化57】
【0250】
ＢＴ７００：ＤＢＣＯ標識ＢＴ１００は、三つの遊離ＣＯＯＨを含有するトリカルボキシル脂肪酸（ＧＴＦＡ－３）（化学式：Ｃ４４Ｈ７８Ｎ８Ｏ１６）とコンジュゲートされ、ＢＴ７００（配列番号５）を形成する。
【0251】
【化58】
【0252】
【表1】
【0253】
実施例３：カニクイザルにおける脂肪酸コンジュゲートのＰＫ－ＰＤ曝露
アプタマー分布（半減期）およびインビボでの有効性に対する脂肪酸コンジュゲーションの影響を定義するために、薬物動態および薬力学（ＰＫ－ＰＤ曝露）パラメータを試験する。
アプタマー分布（半減期）およびインビボでの有効性に対する脂肪酸コンジュゲーションの影響を定義するために、薬物動態および薬力学（ＰＫ－ＰＤ曝露）パラメータを試験する。
【0254】
すべての薬物動態（ＰＫ）試験をカニクイザルで行った。ＰＫ読み出しに加えて、脂肪酸コンジュゲーションはＢＴ１００活性を変化しないことを示唆するＰＫ読み出しと良好に相関したＰＦＡ１００（ＰＤ）読み出しも有する。４０ｋペグ化ＢＴ１００（配列番号２）であるＢＴ２００を比較に使用した。
【0255】
動物実験は、動物飼育倫理の承認およびガイドラインに従って実施された。
ＢＴ５００を、静脈内注射（ｉｖ）を介して１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で、または代替的に皮下注射（ｓｃ）を介して１ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（ｎ＝３）。ＲＥＡＡＤＳ ｖＷＦ活性およびｖＷＦ抗原レベルを、投与前、並びに投与後４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間で測定した（表２および３）。血小板機能解析器１００（ＰＦＡ１００）は、こうした時点で収集された血液サンプルのせん断応力下での一次止血を、ＢＴ５００の機能性についてのＰＤ結果として評価した（表４）。読み出しは、ＢＴ５００がＧｐ１ＢへのｖＷＦＡ１結合を遮断し、血小板機能を阻害することができ、したがって、ＰＦＡ１００読み出しが正常値である＜１００秒から最大約３００秒まで増加したことを示す。読み出しは、ＢＴ１００およびＢＴ２００の投与で観察されたものと同等である。
ＢＴ５００を、静脈内注射（ｉｖ）を介して１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で、または代替的に皮下注射（ｓｃ）を介して１ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（ｎ＝３）。ＲＥＡＡＤＳ ｖＷＦ活性およびｖＷＦ抗原レベルを、投与前、並びに投与後４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間で測定した（表２および３）。血小板機能解析器１００（ＰＦＡ１００）は、こうした時点で収集された血液サンプルのせん断応力下での一次止血を、ＢＴ５００の機能性についてのＰＤ結果として評価した（表４）。読み出しは、ＢＴ５００がＧｐ１ＢへのｖＷＦＡ１結合を遮断し、血小板機能を阻害することができ、したがって、ＰＦＡ１００読み出しが正常値である＜１００秒から最大約３００秒まで増加したことを示す。読み出しは、ＢＴ１００およびＢＴ２００の投与で観察されたものと同等である。
【0256】
【表2】
【0257】
【表3】
【0258】
【表4】
【0259】
ＢＴ６００を、静脈内注射（ｉｖ）を介して１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）で、または代替的に皮下注射（ｓｃ）を介して３ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（ｎ＝２）。ＲＥＡＡＤＳ ｖＷＦ活性およびｖＷＦ抗原レベルを、投与前、並びに投与後４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間で測定した（表５および６）。
【0260】
【表5】
【0261】
【表6】
【0262】
ＢＴ６００は、静脈内注射または皮下注射のいずれかによって少なくとも２４時間持続し得る（表７）。
【0263】
【表7】
【0264】
ＢＴ１００投与（表８）と比較して、ＢＴ６００の半減期が延長される。
【0265】
【表8】
【0266】
４０ｋ ＰＥＧコンジュゲートＢＴ１００アプタマーであるＢＴ２００を投与されたサルおよびヒトの両方におけるＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ抗原レベルの増加とは対照的に、ＢＴ６００投与（例えば、ｓｃ（皮下注射））は、血中ＦＶＩＩＩレベルにもｖＷＦ抗原レベルにも影響を与えない（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｎｇ ａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ （ＶＷＦ） ａｐｔａｍｅｒ， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．， ２０２０， １８（５）： １１１３－１１２３； ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｔｈ２０２１．ａｂｓｔｒａｃｔｓｅｒｖｅｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｇｒａｍ／＃／ｄｅｔａｉｌｓ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／２６６１； ａｎｄ ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｔｈ２０２１．ａｂｓｔｒａｃｔｓｅｒｖｅｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｇｒａｍ／＃／ｄｅｔａｉｌｓ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／１３２７）（表９）。
【0267】
【表9】
【0268】
ＢＴ７００を、静脈内注射（ｉｖ）を介して１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）で、または代替的に皮下注射（ｓｃ）を介して２ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（ｎ＝２）。ＢＴ７００活性を、投与前、ならびに投与後０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間で、ＵＶ－ＨＰＬＣによって測定した（表１０および１１）。
【0269】
【表10】
【0270】
【表11】
【0271】
血小板機能解析器１００（ＰＦＡ１００）は、こうした時点で収集された血液サンプルのせん断応力下での一次止血を、ＢＴ７００の機能性についてのＰＤ結果として評価した（表１２）。読み出しは、ＢＴ７００もＧｐ１ＢへのｖＷＦＡ１結合を遮断し、血小板機能を阻害することができ、したがって、ＰＦＡ１００読み出しが正常値である＜１００秒から最大約３００秒まで増加したことを示す。読み出しは、ＢＴ１００およびＢＴ２００の投与で観察されたものと同等である。
【0272】
【表12】
【0273】
ＢＴ１００およびＢＴ２００を、比較のために静脈内注射（ｉｖ）を介して３ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（表１３および１４）。
【0274】
【表13】
【0275】
【表14】
【0276】
実施例４：ＢＴ６００経口バイオアベイラビリティ
カニクイザルに、５ｍｇ／ｋｇ用量での経口投与（ｐｏ）を介してＢＴ６００コンジュゲートを直接給餌した。ＢＴ６００を、経口摂取のために、吸収促進剤であるナトリウムＮ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）と共製剤化した（５ｍｇ／ｋｇ ＢＴ６００ ＋ １５０ｍｇ ＳＮＡＣ）。ＢＴ６００の経口投与は、試験した動物において１ｎｇ／ｍＬ程度のＢＴ６００を検出できる蛍光ハイブリダイゼーションＨＰＬＣ法を使用した生体分析アッセイによる全身曝露をもたらした（表１５および１６）。
カニクイザルに、５ｍｇ／ｋｇ用量での経口投与（ｐｏ）を介してＢＴ６００コンジュゲートを直接給餌した。ＢＴ６００を、経口摂取のために、吸収促進剤であるナトリウムＮ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）と共製剤化した（５ｍｇ／ｋｇ ＢＴ６００ ＋ １５０ｍｇ ＳＮＡＣ）。ＢＴ６００の経口投与は、試験した動物において１ｎｇ／ｍＬ程度のＢＴ６００を検出できる蛍光ハイブリダイゼーションＨＰＬＣ法を使用した生体分析アッセイによる全身曝露をもたらした（表１５および１６）。
【0277】
【表15】
【0278】
【表16】
【0279】
低いバイオアベイラビリティ（０．２％）が検出され、ＢＴ６００の血漿濃度は、ＰＦＡ１００アッセイに影響を与えるには低すぎる。しかしながら、組織分布は低いものの、ＢＴ６００の長い半減期が試験した動物で観察される。
【0280】
実施例５：アルブミンに結合する脂肪酸コンジュゲート
アミン結合を介してアルブミンでコーティングされたＣＭ５チップを使用した。センサーチップを、ＦＣ－２ヒトアルブミン、ＦＣ－３マウスアルブミン、およびＦＣ－４ウシアルブミンでコーティングした。ＦＣ－１を対照として使用した。アプタマーおよび脂肪酸コンジュゲートＢＴ５００、ＢＴ６００、およびＢＴ７００をチップの表面上に流した。（図１に示すように）ＢＴ１００を対照として使用した。
アミン結合を介してアルブミンでコーティングされたＣＭ５チップを使用した。センサーチップを、ＦＣ－２ヒトアルブミン、ＦＣ－３マウスアルブミン、およびＦＣ－４ウシアルブミンでコーティングした。ＦＣ－１を対照として使用した。アプタマーおよび脂肪酸コンジュゲートＢＴ５００、ＢＴ６００、およびＢＴ７００をチップの表面上に流した。（図１に示すように）ＢＴ１００を対照として使用した。
【0281】
この単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに基づいて、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を計算し、比較した。有意な結合は観察されず、曲線あてはめはＢＴ１００に適用されず、一方で三つの脂肪酸コンジュゲートＢＴ５００、ＢＴ６００、およびＢＴ７００すべてがヒトアルブミンへの結合を示した（表１７）。ＢＴ１００はアルブミンに結合しないため、サルでは半減期が最も短い。ＢＴ５００は、アルブミンに対して低い親和性を有するが（図１）、アルブミンの低い結合は依然として、ＢＴ１００と比較してＢＴ５００により長い半減期をもたらす。ＢＴ６００およびＢＴ７００はアルブミンに対して高い親和性を有し、したがって半減期がはるかに長い（図１）。
【0282】
【表17】
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】