知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】化学修飾を有するガイドＲＮＡを使用する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/52 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240905BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/52 Z
C12N15/09 110
C12Q1/68
C12N5/10 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515702
(86)(22)【出願日】2022-09-14
(85)【翻訳文提出日】2024-05-13
(86)【国際出願番号】 US2022043553
(87)【国際公開番号】W WO2023043856
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】63/243,985
(32)【優先日】2021-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/339,737
(32)【優先日】2022-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】ライアン，ダニエル，イー．
(72)【発明者】
【氏名】デリンジャー，ダグラス，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】カイザー，ロバート
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ52
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR40
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA05
4B065BB21
(57)【要約】
１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを組み込んでいる修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡもしくは標的ＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの編集を誘導するための、またはインビトロもしくは細胞内での標的核酸の発現をモジュレートするための組成物および方法が、本明細書に提供される。一部の態様では、これらの修飾ｇＲＮＡは、困難な状況下で優れた性能を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内の核酸において、標的領域を編集する、または標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記細胞に、ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質；ならびに
ｂ）５’末端および３’末端と、
前記標的領域内の前記標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
前記Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
前記５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾と、
前記３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む修飾ガイドＲＮＡを提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、前記標的領域の編集または前記標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす、方法。
【請求項2】
前記ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレートおよびチオホスホノカルボキシレート修飾が、２’－Ｏ－メチルも含むヌクレオチド中に各々存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記修飾ガイドＲＮＡが、前記５’末端の５ヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ホスホノカルボキシレートがホスホノアセテートであり、前記チオホスホノカルボキシレートがチオホスホノアセテートである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記修飾ガイドＲＮＡが、前記３’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（ＭＳＰ）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記修飾ガイドＲＮＡが、前記５’末端および３’末端内の５つのヌクレオチドの外側に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記修飾ガイドＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして提供される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｃａｓタンパク質および前記修飾ガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｃａｓタンパク質および／または修飾ガイドＲＮＡが、ナノ粒子中に提供される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記編集またはモジュレーションが、修飾以外の点で前記修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ｇＲＮＡによるものよりも高い効率で起こる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記効率が少なくとも１０％高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ヌクレアーゼ含有液が血清である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記ヌクレアーゼ含有液が脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヌクレアーゼ含有液が細胞培養培地である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記ヌクレアーゼ含有液が体液である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞がインビボで存在する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞がヌクレアーゼ含有液の存在下でエクスビボで存在する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年９月１４日に出願された米国特許仮出願第６３／２４３，９８５号、および２０２２年５月９日に出願された同第６３／３３９，７３７号の優先権の利益を主張し、それらの各々の全内容は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
本出願は、２０２１年９月１４日に出願された米国特許仮出願第６３／２４３，９８５号、および２０２２年５月９日に出願された同第６３／３３９，７３７号の優先権の利益を主張し、それらの各々の全内容は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
【0002】
本開示は、分子生物学の分野に関する。特に、本開示は、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ＣＲＩＳＰＲ）技術に関する。
【背景技術】
【0003】
ネイティブな原核生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一定長の介在可変配列を有する短いリピートのアレイ（すなわち、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター、または「ＣＲＩＳＰＲ」）と、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質とを含む。転写されたＣＲＩＳＰＲアレイのＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質のサブセットによって低分子ガイドＲＮＡにプロセシングされ、低分子ガイドＲＮＡは、一般的に下記のような２つの構成要素を有する。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型の少なくとも６つの異なるシステムがある。これらの６つのシステムでは、ＲＮＡの成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングに関与する酵素が異なる。ネイティブな原核生物ＩＩ型システムにおいて、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）およびトランス作用性ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と称される２つの短鎖ノンコーディングＲＮＡを含む。ネイティブなＶ型システムでは、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａはＣｐｆ１としても知られる）タンパク質と活性複合体を形成するのに十分なｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを有しない。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（リボ核タンパク質「ＲＮＰ」複合体）と複合体を形成する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）とプロトスペーサーとを有する標的ポリヌクレオチド配列と結合し、プロトスペーサーはｇＲＮＡの一部分と相補的な配列を含む。ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドの認識および結合は、標的ポリヌクレオチドの切断を誘導する。ネイティブなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、原核生物において免疫システムとして機能し、そこで、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の様式で外因性遺伝要素を認識およびサイレンシングし、それにより、プラスミドおよびファージなどの外因性遺伝要素に対する抵抗性を付与する。
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ技術の多くの向上および洗練が進展しており、開発され続けている。初期のアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して標的ＤＮＡの両方の鎖を切断することを含み、編集は、二本鎖切断による相同組換えまたは非相同末端結合によって行われる。より新しい技術は、遺伝子発現および他の遺伝子編集方法のモジュレーションを含む。例えば、プライム編集は、ＤＮＡ内の標的とされた配列を編集するためのＣＲＩＳＰＲベースの技術であり、これは、トランスバージョンおよび対変異などの様々な形態の塩基置換を可能にする。これはまた、最大約７００ｂｐ長の大きな欠失を含む正確な挿入および欠失を可能にする。注目すべきことに、プライム編集は外因性ＤＮＡ修復鋳型を必要としない。その代わりに、所望の編集を含有する重合鋳型がガイドＲＮＡ内に含まれ、それが、ポリメラーゼ（逆転写酵素など）と融合したＣａｓタンパク質と複合体を形成する。標的部位と結合すると、Ｃａｓタンパク質は標的部位にニックを入れ、ポリメラーゼは、重合鋳型を使用してＤＮＡの新しい鎖を合成することができる。塩基編集は、シチジンデアミナーゼなどの塩基エディター酵素が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡと共に送達される別の遺伝子編集技術である。塩基エディター酵素は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的部位に方向付けられ、標的部位での脱アミノを、したがってシチジン残基の変異を触媒する。遺伝子発現のモジュレーションは、例えば、転写アクティベーターまたは阻害剤を、切断活性を有しないがｇＲＮＡと複合体を形成して標的部位と結合することができるＣａｓタンパク質と融合させることによって達成されうる。結果として、転写アクティベーターまたは阻害剤は、標的部位で遺伝子発現を調節することができる。したがって、この技術はそれぞれＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉと呼ばれ、ここで、「ａ」は活性化を表し、「ｉ」は阻害を表す。
【0005】
これらの進歩にかかわらず、当技術分野において、ＣＲＩＳＰＲ技術をさらに改善する、特に、ＣＲＩＳＰＲベースシステムの効率および安定性を改善する、例えばＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集またはモジュレーションの採用を支持する必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】２０万個のＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクションのために漸増する量のｇＲＮＡを一定量のＣａｓ９タンパク質と混合したタイトレーション研究の結果を示すグラフであり、トランスフェクションでは、標的部位でのインデルの創出のためにＨＢＢ遺伝子を標的とした。これらの結果は、量を漸増することで編集活性がプラトーに達し、一定数の細胞では量のさらなる増加が編集収率を増加させないという、編集のためのトランスフェクトされた構成要素の飽和量の概念を示している。
【図2】残留した血清を除去するために細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、飽和量未満のＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（２０万個の細胞について０．０６２５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０ｐｍｏｌのｇＲＮＡ）をトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢのオンターゲットおよびオフターゲット編集を示すグラフである。
【図3】残留した血清を除去するために細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、飽和量未満のＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（２０万個の細胞について０．０６２５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０ｐｍｏｌのｇＲＮＡ）をトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢのオンターゲットおよびオフターゲット編集を示すグラフである。
【図4】トランスフェクションの前に残留した血清を除去するためのＰＢＳ緩衝液による細胞洗浄を行わなかった場合の、飽和量未満のＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（２０万個の細胞について０．５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび３０ｐｍｏｌのｇＲＮＡ）をトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢのオンターゲットおよびオフターゲット編集を示すグラフである。
【図5】トランスフェクションの前に血清を除去するための緩衝液による細胞洗浄を行わなかった場合の、飽和量未満のＣａｓタンパク質およびｇＲＮＡ（２０万個の細胞について１２．５ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質および３０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢのオンターゲットおよびオフターゲット編集を示すグラフである。
【図6】５’および３’末端に３ｘＭＳ（上）、または５’末端に３ｘＭＳおよび３’末端に３ｘＭＰ（下）を組み込んでいる２つの例示的なｇＲＮＡを図示する。
【図7】Ｋ５６２細胞における化学修飾ｇＲＮＡの経時的な相対レベルを評価した実験の結果を示すグラフである。細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄して残留した血清を除去した後、Ｃａｓタンパク質の非存在下で細胞にｇＲＮＡをトランスフェクトした。
【図8】細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄して残留した血清を除去した後、飽和量未満のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（２０万個の細胞について０．０６２５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび５ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトされた初代ヒトＴ細胞におけるＨＢＢのオンターゲットおよびオフターゲット編集を示すグラフである。
【図9】未修飾ｇＲＮＡを使用する対照と比べて３’末端にＭＳまたはＭＰを有する化学修飾ｇＲＮＡを使用するＫ５６２細胞におけるＨＢＢのシチジン塩基編集の結果を示すグラフである。シチジンデアミナーゼと融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｇＲＮＡおよびｍＲＮＡを細胞に同時トランスフェクトした。
【図10】例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用するプライム編集を描写する図解である。
【図11】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図12】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図13】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの第２のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図14】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの第２のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図15】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図16】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図17】本明細書に開示されたｐｅｇＲＮＡに組み込まれることがある化学修飾ヌクレオチドの２つの例である２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）の化学構造を図示する。
【図18】例示的な標的配列を使用するＥＭＸ１およびＲＵＮＸ１のプライム編集を図示する。
【図19】Ｋ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためにプライム編集を使用した。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図20】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためにプライム編集を使用した。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図21】Ｋ５６２細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集を使用した。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図22】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集を使用した。細胞にｐｅｇＲＮＡと、逆転写酵素と融合されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【図23】ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡを共トランスフェクトされた、未洗浄のＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢ鎌状赤血球アレル（および公知の遺伝子間オフターゲット座位）の編集を判定した実験の結果を示すグラフである。
【図24】Ｃａｓ９タンパク質と予備複合体形成した化学修飾ｓｇＲＮＡから形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をトランスフェクトされた未洗浄ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢ鎌状赤血球アレル（および公知の遺伝子間オフターゲット座位）の編集を判定した実験の結果を示すグラフである。
【図25】Ｃａｓ９タンパク質と予備複合体形成した、化学修飾された１６３塩基長ｓｇＲＮＡによって形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をトランスフェクトされた未洗浄ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢＢ鎌状赤血球アレル（および公知の遺伝子間オフターゲット座位）の編集を判定した実験の結果を示すグラフである。ＣＲＩＳＰＲａ ＳＡＭシステムのために１６３塩基長ｓｇＲＮＡを設計したが、ＣＲＩＳＰＲａによる遺伝子活性化のためにそれらを使用する代わりに、ＳｐＣａｓ９タンパク質と共に使用してインデルを産生した。
【発明を実施するための形態】
【0007】
細胞（例えば、エクスビボ療法に使用するための初代細胞）またはインビボ細胞（例えば、ヒトなどの対象の臓器もしくは組織中の細胞）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集および／または遺伝子発現のモジュレーションのための方法が、本明細書に提供される。特に、本明細書に提供される方法は、対応する未修飾ｇＲＮＡと比較して遺伝子編集または調節において高い活性または収率を有する化学修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を利用する。一部の態様では、本開示は、標的核酸とハイブリダイズする化学修飾ｇＲＮＡを、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターのいずれかと一緒に導入することによって、細胞において標的核酸の配列を編集するため、または標的核酸の発現をモジュレートするための方法を提供する。一部の態様では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠如する（例えば、ｄＣａｓ９）、またはニッカーゼ活性を有するバリアントでありうる。一部の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓポリペプチドと逆転写酵素ポリペプチドとを含む融合タンパク質である。一部の態様では、本開示は、化学修飾されたｇＲＮＡの十分量を投与して、疾患に関連する遺伝子変異を修正することによって（例えば、患者のゲノムＤＮＡを編集することによって、または疾患に関連する遺伝子の発現をモジュレートすることによって）、対象における遺伝性疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【0008】
本開示の態様は、当業者の技能の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照されたい。
【0009】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９～１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法により、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９～６１６８（１９８４）に記載された自動合成装置を使用して化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において承認されている任意の戦略、例えば、ネイティブなアクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７～１４９（１９８３）に記載される陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行われる。
【0010】
［定義および略語］
別段の具体的な指示がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。加えて、本明細書に記載される方法または材料と類似または等価の任意の方法または材料を、本明細書に記載される方法の実施および組成物の調製に使用することができる。本開示のために、以下の用語が定義される。
別段の具体的な指示がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。加えて、本明細書に記載される方法または材料と類似または等価の任意の方法または材料を、本明細書に記載される方法の実施および組成物の調製に使用することができる。本開示のために、以下の用語が定義される。
【0011】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」という用語は、１つのメンバーによる態様を含むだけでなく、１つよりも多いメンバーによる態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への参照は、複数のこのような細胞を含み、「薬剤」への参照は、当業者に公知の１つまたは複数の薬剤への参照を含むなどである。
【0012】
「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」または「Ｃａｓポリペプチド」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、またはその変異体もしくはバリアントを指す。「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質またはポリペプチド誘導体、例えば、１つもしくは複数の点変異、挿入、欠失、短縮化を有するタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組合せを指す。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、一方または両方のヌクレアーゼドメインが不活性であるように変異している（このタンパク質は、それぞれＣａｓニッカーゼまたはデッド型Ｃａｓタンパク質と称されることがある）。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」はヌクレアーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部またはすべてを欠如する。「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」という用語はまた、原核生物の様々な種の、Ｃａｓ１２ａとも称される野生型Ｃｐｆ１タンパク質（ブレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート１リボ核タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１リボ核タンパク質にちなんで名付けられる）、その断片またはその変異体もしくはバリアントを含む。Ｃａｓタンパク質は、以下に限定されないが、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型の６つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムのいずれか１つを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のいずれかを含む。
【0013】
Ｃａｓタンパク質の「ヌクレアーゼドメイン」という用語は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有するタンパク質内のポリペプチド配列またはドメインを指す。Ｃａｓ９は、典型的に、ＰＡＭ配列上流の二本鎖切断を触媒する。ヌクレアーゼドメインがポリペプチド一本鎖に含有されることがあり、また、切断活性は、２つ（またはそれよりも多い）ポリペプチドの会合に起因することがある。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内のアミノ酸の１つよりも多い単離されたストレッチからなることがある。これらのドメインの例は、ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号１内のアミノ酸７～２２、７５９～７６６および９８２～９８９）およびＨＮＨモチーフ（アミノ酸８３７～８６３）を含む；Ｇａｓｉｕｎａｓら（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ １０９：３９、Ｅ２５７９～Ｅ２５８６およびＷＯ／２０１３１７６７７２を参照されたい。
【0014】
「ｇＲＮＡの機能性」を有する合成ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、Ｃａｓタンパク質と会合してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成すること、またはＣａｓタンパク質と会合したガイドＲＮＡによって実行される機能（すなわち、ＲＮＰ複合体の機能）などの天然に存在するガイドＲＮＡの機能のうち１つまたは複数を有するものである。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドと結合することを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の標的とすることを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質と会合または結合することを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質またはその部分、例えば転写因子エンハンサーまたはリプレッサー、デアミナーゼタンパク質、逆転写酵素、ポリメラーゼなどと融合された「デッド型」Ｃａｓタンパク質（ｄＣａ）であるように操作されることがあり、その結果、融合されたタンパク質またはその部分は、標的部位でその機能を発揮することができる。ある特定の実施形態では、機能性は、塩基編集の機能性を含む。他の実施形態では、機能性は、プライム編集の機能性を含む。ある特定の実施形態では、機能性は、遺伝子発現の活性化、抑制または干渉を含む。他の実施形態では、機能性は、エピジェネティック修飾を含む。ある特定の実施形態では、機能性は、操作Ｃａｓタンパク質を用いた人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、Ｃａｓタンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡの任意の他の公知の機能である。ある特定の実施形態では、機能性は天然ガイドＲＮＡの任意の他の機能である。合成ガイドＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡよりも大きなまたは小さな程度でｇＲＮＡの機能性を有することがある。ある特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、類似の天然に存在するガイドＲＮＡと比較して１つの機能に関して大きな活性を有することがあり、別の機能に関して小さな活性を有することがある。
【0015】
一本鎖「ニッキング」活性を有するＣａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質と比較してｄｓＤＮＡの２つの鎖のうち１つを切断する能力が低減している、Ｃａｓ変異体またはＣａｓバリアントを含むＣａｓタンパク質を指す。例えば、ある特定の実施形態では、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（またはＨＮＨドメイン）の機能を低減し、結果として標的ＤＮＡの１つの鎖を切断する能力を低減する変異（例えば、アミノ酸置換）を有する。このようなバリアントの例は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｈ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、および／またはＮ８６３Ａ置換を含み、他の種のＣａｓ９酵素における同等部位に同じまたは類似の置換も含む。
【0016】
「結合」活性を有する、または標的ポリヌクレオチドと「結合する」Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質を指し、このような複合体では、ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡの塩基とその他のポリヌクレオチドとの間の水素結合を介して標的ポリヌクレオチド配列などの別のポリヌクレオチドとハイブリダイズして塩基対を形成する。水素結合は、ワトソン－クリックモデル塩基対形成によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こりうる。ハイブリッドは、二重鎖を形成する２つの鎖、多重鎖の三重鎖を形成する３つ以上の鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことがある。
【0017】
「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、少なくとも１つのＣａｓタンパク質および少なくとも１つのｇＲＮＡを利用して、以下に限定されないが、遺伝子編集、ＤＮＡ切断、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、遺伝子発現の調節、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、およびＣａｓタンパク質を別のエフェクターに連結することによって達成できる任意の他の機能を含む機能または効果を提供し、それにより、Ｃａｓタンパク質によって認識される標的配列に対してエフェクター機能を果たすシステムである。例えば、ヌクレアーゼを含まないＣａｓタンパク質は、転写因子、デアミナーゼ、メチラーゼ、逆転写酵素などと融合することができる。結果として生じる融合タンパク質を使用して、標的のためのガイドＲＮＡの存在下で、標的を編集する、その転写を調節する、脱アミノする、またはメチル化することができる。プライム編集における別の例として、ｐｅｇＲＮＡの存在下で標的核酸を編集するためにＣａｓタンパク質は逆転写酵素または他のポリメラーゼと共に（必要に応じて融合タンパク質として）使用される。
【0018】
「融合タンパク質」は、相互に共有結合的に連結している少なくとも２つのペプチド配列（すなわち、アミノ酸配列）を含むタンパク質であり、ここで、当該２つのペプチド配列は自然界で共有結合的に連結していない。２つのペプチド配列は、直接的に（結合が間に入る）または間接的に（リンカーが間に入る、ここでリンカーは、以下に限定されないが第３のペプチド配列を含む任意の化学構造を含むことがある）連結することができる。
【0019】
「プライムエディター」は、Ｃａｓタンパク質活性と逆転写酵素活性との両方を有する分子または複数の分子の集合である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はニッカーゼである。一部の実施形態では、プライムエディターは、Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素との両方を含む融合タンパク質である。本開示の他の箇所に示すように、プライム編集に逆転写酵素の代わりに他のポリメラーゼを使用することができ、それでプライムエディターは、ＲＴの代わりに逆転写酵素ではないポリメラーゼを含むことがある。種々のバージョンのプライムエディターが開発されており、ＰＥＩ、ＰＥ２、ＰＥ３などと称される。例えば、「ＰＥ２」は、構造［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）］－［リンカー］－［ＭＭＬＶ＿ＲＴ（Ｄ２００Ｎ）（Ｔ３３０Ｐ）（Ｌ６０３Ｗ）（Ｔ３０６Ｋ）（Ｗ３１３Ｆ）］を有するＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼおよびＭＭＬＶ ＲＴのバリアントを含む融合タンパク質（ＰＥ２タンパク質）と、所望のｐｅｇＲＮＡとを含むＰＥ複合体を指す。「ＰＥ３」は、細胞を標的領域の修復へと刺激するためにＰＥ２タンパク質と複合体を形成し、未編集ＤＮＡ鎖にニックを導入する、第２鎖ニッキングガイドＲＮＡをＰＥ２に加えたものを指し、これは、ゲノムへの編集の組入れを促進する（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９を参照；Ｌｉｕ、Ｗ０２０２０１９１１５３を参照）。プライムエディターは、本開示の他の箇所に詳細に記載される、プライム編集ｇＲＮＡまたは「ｐｅｇＲＮＡ」と称される特化されたｇＲＮＡを使用する。
【0020】
「塩基エディター」または「ＢＥ」は、Ｃａｓタンパク質（または変異型タンパク質）と、デアミナーゼまたはトランスグリコシル化活性との両方を有する分子または複数の分子の集合である。塩基エディター（ＢＥ）は、典型的にはＣａｓドメインとヌクレオチド修飾ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド１」）、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）、およびＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」）またはアデノシンデアミナーゼ、例えば、ＴａｄＡ（細菌ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ）などの天然または進化デアミナーゼ）との融合体である。今までに、標的Ｃ：Ｇ塩基対をＴ：Ａ塩基対に変換するシトシン塩基エディター（「ＣＢＥ」）、およびＡ：Ｔ塩基対をＧ：Ｃ塩基対に変換するアデノシン塩基エディター（「ＡＢＥ」）の２つのクラスのデアミナーゼ塩基エディターが、一般的に記載されている。まとめると、これらの２つのクラスの塩基エディターは、すべての可能性のある対変異（ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、ＴからＣ、ＣからＵ、およびＡからＵ）の標的化された導入を可能にする。参照により本明細書に組み込まれているＧａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ：Ｔ ｔｏ Ｇ：Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）を参照されたい。塩基編集に使用される別のヌクレオチド修飾ドメインは、野生型ｔＲＮＡグアニントランスグリコシラーゼ（ＴＧＴ）、またはそのバリアント、例えば、リボース－核塩基グリコシド結合での第２の核塩基の代わりに第１の核塩基（すなわち、チミン）に置換するＴＧＴなどの、トランスグリコシラーゼドメインである。トランスグリコシラーゼエディターは、チミンからグアニンもしくは「ＴＧＢＥ」（またはアデニンからシトシンもしくは「ＡＣＢＥ」）トランスバージョン塩基エディターを提供する。場合によっては、塩基エディターはまた、細胞性ＤＮＡ修復過程を変更して、結果として生じる単一ヌクレオチド変化の効率および／または安定性を増大させるタンパク質またはドメインを含むことがある。一部の実施形態では、塩基エディターは、１つまたは複数のＮＬＳ（核移行配列）を含み、１つまたは複数のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含むことがあり、それらは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを阻害し、それにより、ＣからＴへの塩基エディタータンパク質の塩基編集効率を改善することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓドメインはニッカーゼ（例えばｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は完全ヌクレアーゼ不活性化タンパク質またはデッド型Ｃａｓ９「ｄＣａｓ９」である。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓタンパク質（またはその部分）とデアミナーゼ（またはその部分）との両方を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓタンパク質（またはその部分）とトランスグリコシラーゼ（またはその部分）との両方を含む融合タンパク質である。以前のシステムと比べて改善を示す異なるバージョンの塩基エディター、例えば、異なるまたは拡張されたＰＡＭ適合性を有する塩基エディター（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｂ．ら Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５、３７１～３７６（２０１７）；Ｈｕ，Ｊ．Ｈ．ら Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ＰＡＭ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５５６、５７～６３（２０１８）；Ｌｉ，Ｘ．ら Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ Ｃｐｆ１－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６、３２４～３２７（２０１８）を参照されたい）、オフターゲット活性が低減した高忠実度塩基エディター（Ｈｕ，Ｊ．Ｈ．ら Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ＰＡＭ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５５６、５７～６３（２０１８）；Ｒｅｅｓ，Ｈ．Ａ．ら Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８、１５７９０（２０１７）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．、Ｐｒｅｗ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｎａｔｕｒｅ，Ｔ．－Ｓ．Ｑ．Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）；Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．ら Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｇｏｖｅｒｎｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５５０、４０７～４１０（２０１７）；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１、８４～８８（２０１６）を参照されたい）、より狭い編集ウインドウを有する塩基エディター（通常約５つのヌクレオチド幅）（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｂ．ら Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５、３７１～３７６（２０１７）を参照されたい）、および副産物が低減したシチジン塩基エディター（ＢＥ４）（Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ．Ｓｃｉ Ａｄｖ ３、ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい）が開発されている。異なるバージョンの塩基エディターは、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４などと称される。プライムエディターとは異なり、塩基エディターは、核酸を所望の配列位置において標的とするための塩基エディターのＣａｓエフェクター部分をプログラムする「従来の」ｇＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９スタイルまたはＣｐｆ１スタイル）と協力して機能する。
【0021】
「ガイドＲＮＡ」（または「ｇＲＮＡ」）は、一般的に、Ｃａｓタンパク質と結合し、標的ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）内の特異的位置にＣａｓタンパク質を標的とすることを助けることができるＲＮＡ分子（またはまとめてＲＮＡ分子の群）を指す。したがって、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、ガイドＲＮＡの別の部分（「足場」）は、Ｃａｓタンパク質と結合して、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように機能する。以下に限定されないが、Ｃａｓ９様式およびＣｐｆ１様式のガイドＲＮＡを含む様々な様式のガイドＲＮＡがある。「Ｃａｓ９様式」のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含む。本明細書で使用される場合、「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、ポリヌクレオチド標的化ガイド配列と；Ｃａｓタンパク質との相互作用を助ける足場配列と；必要に応じて５’－オーバーハング配列とを含むＲＮＡ分子またはその部分を指す。本明細書で使用される場合、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用できるタンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子またはその部分を指す。Ｃａｓ９に加えて、Ｃａｓ９様式のガイドＲＮＡを利用する他のＣａｓタンパク質があり、「Ｃａｓ９」という語句は、「Ｃａｓ９様式」という用語の中でこの様式を利用する様々なＣａｓタンパク質の代表的なメンバーを単に特定するために使用される。「Ｃｐｆ１様式」は、ガイド配列の５’である足場を含む一分子ガイドＲＮＡである。文献では、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡではなくｃｒＲＮＡだけを有するとしばしば記載されている。用語法にかかわらず、すべてのガイドＲＮＡは、標的と結合するためのガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用できる足場領域とを有することに注目すべきである。特化されたｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を使用するプライム編集とは異なり、塩基編集は従来のｇＲＮＡ（すなわちＣａｓ９スタイルおよびＣｐｆ１スタイル）を使用する。
【0022】
「ガイドＲＮＡ」という用語は、一分子中にすべての機能的部分を含有する単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）を包含する。例えば、Ｃａｓ９様式のｓｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、同じＲＮＡ分子に位置する。別の例として、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡは、本来、単一ガイドＲＮＡ分子である。「ガイドＲＮＡ」という用語はまた、まとめて２つ以上のＲＮＡ分子の群を包含し；例えばｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、別々のＲＮＡ分子に位置することがある。さらに、本明細書で使用される場合の「ｇＲＮＡ」という用語は、プライム編集（ｐｅｇＲＮＡ）、塩基編集および遺伝子発現モジュレーションおよびｇＲＮＡを採用する任意の他のＣＲＩＳＰＲ技術に使用されるガイドＲＮＡを包含する。
【0023】
必要に応じて、「ガイドＲＮＡ」は、ｇＲＮＡと会合したＣａｓタンパク質の機能と一緒に分子機能を実行するコグネートポリペプチドまたは酵素による認識および結合を受けて１つまたは複数の補助機能を果たす、１つまたは複数の追加的なセグメントを含みうる。例えば、プライム編集のためのｇＲＮＡ（一般に「ｐｅｇＲＮＡ」と称される）は、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含むことがある。別の例では、ｇＲＮＡは、アプタマー結合ポリペプチドを認識しそれと結合する１つまたは複数のアプタマー（例えばＭＳ２アプタマー）を形成する、１つまたは複数のポリヌクレオチドセグメントを含むことがある（アプタマー結合ポリペプチドは、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓ融合タンパク質（例えばｄＣａｓ９－ＶＰ６４）と並んで転写活性化などの補助的機能を果たす他のポリペプチドと融合されており（例えばＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）、これらのシステムは、相乗活性化メディエータ「ＳＡＭ」システムとして知られる；Ｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎら、Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ．５１７、５８３～５８８（２０１５）参照、Ｍ．Ａ．Ｈｏｒｌｂｅｃｋら、Ｃｏｍｐａｃｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ｅＬｉｆｅ．５、ｅ１９７６０（２０１６）参照）。
【0024】
必要に応じて、「ガイドＲＮＡ」は、例えばエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによって起こりうるように、その分解を妨げることによってｇＲＮＡの安定性を増大させることができる追加的なポリヌクレオチドセグメント（３’（または５’）－末端ポリウリジンテール、ヘアピン、ステムループ、トウループなど）を含むことがある。
【0025】
「ガイド配列」という用語は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列と部分的または完全な相補性を有し、Ｃａｓタンパク質によって促進される塩基対形成により標的配列とハイブリダイズできる、ｇＲＮＡ（またはｐｅｇＲＮＡ）におけるヌクレオチドの連続配列を指す。場合によっては、標的配列はＰＡＭ部位（ＰＡＭ配列）と隣接する。場合によっては、標的配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流に位置することがある。ガイド配列とハイブリダイズする標的配列は、ＰＡＭ配列の相補体のすぐ下流にあってもよい。Ｃｐｆ１などの他の例では、ガイド配列とハイブリダイズする標的配列の位置は、ＰＡＭ配列の相補体の上流にあってもよい。
【0026】
ガイド配列は、約１４ヌクレオチドと短いこともあれば、約３０ヌクレオチドと長いこともある。典型的なガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４ヌクレオチド長である。ガイド配列の長さは、上述の２つのクラスおよび６つの型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって異なる。Ｃａｓ９のための合成ガイド配列は、通常２０ヌクレオチド長であるが、より長いまたは短いことがある。ガイド配列が２０ヌクレオチドよりも短い場合、これは、典型的には２０ヌクレオチドガイド配列と比較して５’末端からの欠失である。例として、ガイド配列は、標的配列と相補的な２０ヌクレオチドからなることがある。言い換えると、ガイド配列は、ＤＮＡとＲＮＡとの間のＡ／Ｕの差異を除きＰＡＭ配列上流の２０ヌクレオチドと同一である。このガイド配列が、５’末端から３つのヌクレオチドだけ切断された場合、２０ヌクレオチドのガイド配列のヌクレオチド４は今や１７塩基長のヌクレオチド１になり、２０ヌクレオチドガイド配列のヌクレオチド５は今や１７塩基長のヌクレオチド２になるなどである。１７塩基長ガイド配列についての新しい位置は、本来の位置から３を引いたものである。
【0027】
本明細書で使用される場合、「プライム編集ガイドＲＮＡ」（または「ｐｅｇＲＮＡ」）という用語は、核酸の標的配列への１つまたは複数の編集をコードする逆転写酵素の鋳型配列と、標的領域内の配列と結合できるプライマー結合部位（標的部位とも呼ばれる）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を指す。例えば、ｐｅｇＲＮＡは、標的領域内の配列への１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含む逆転写酵素の鋳型配列を含みうる。ｐｅｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、通常は細胞のゲノムにおける標的領域内の標的配列とハイブリダイズして、結果として標的領域内の配列の編集をもたらす機能を有する。理論に縛られるわけではないが、一部の実施形態では、ｐｅｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とＲＮＰ複合体を形成し、標的領域内の標的配列と結合し、Ｃａｓタンパク質が標的領域の一本鎖にニックを作り、結果としてフラップを生じ、ｐｅｇＲＮＡのプライマー結合部位がフラップとハイブリダイズし、逆転写酵素が、ハイブリダイズしたｐｅｇＲＮＡの逆転写酵素の鋳型上のプライマーとしてフラップを使用し、それがフラップのニック入り末端上で新しいＤＮＡ配列を合成するための鋳型として作用し、そのとき、この新しいＤＮＡ配列は所望の編集を含有し、最終的にこの新しいＤＮＡ配列が標的領域内の本来の配列と置き換わり、結果として標的の編集をもたらす。
【0028】
「ｐｅｇＲＮＡ」は、その５’末端または３’末端近くに逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含むことがある。「プライム編集末端」は、ガイド配列よりも逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位に近い、５’または３’のいずれかのｐｅｇＲＮＡの一方の末端である。ｐｅｇＲＮＡの他方の末端は、逆転写酵素の鋳型またはプライマー結合部位よりもガイド配列に近い「遠位末端」である。したがって、これらの構成要素の順序は、５’方向または３’方向に：
プライム編集末端－（プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型）－（ガイド配列および足場）－遠位末端
であり、この場合カッコは、ｐｅｇＲＮＡの様式（例えば、Ｃａｓ９様式またはＣｐｆ１様式）のみならず、プライム編集末端の位置（すなわち、５’末端または３’末端）に応じて、中に記載した２つのセグメントの順序を相互に切り替えできることを示す。ｐｅｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡではなく、１つよりも多いＲＮＡ分子を含むならば、プライム編集末端は、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含有するＲＮＡ分子内でこれらの構成要素により近い末端を指すのに対し、このＲＮＡ分子の反対の末端は遠位末端であることに留意すべきである。ガイド配列は、プライム編集末端および遠位末端を有するＲＮＡ分子とは別個の、ｐｅｇＲＮＡの異なるＲＮＡ分子内にあってもよい。
プライム編集末端－（プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型）－（ガイド配列および足場）－遠位末端
であり、この場合カッコは、ｐｅｇＲＮＡの様式（例えば、Ｃａｓ９様式またはＣｐｆ１様式）のみならず、プライム編集末端の位置（すなわち、５’末端または３’末端）に応じて、中に記載した２つのセグメントの順序を相互に切り替えできることを示す。ｐｅｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡではなく、１つよりも多いＲＮＡ分子を含むならば、プライム編集末端は、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含有するＲＮＡ分子内でこれらの構成要素により近い末端を指すのに対し、このＲＮＡ分子の反対の末端は遠位末端であることに留意すべきである。ガイド配列は、プライム編集末端および遠位末端を有するＲＮＡ分子とは別個の、ｐｅｇＲＮＡの異なるＲＮＡ分子内にあってもよい。
【0029】
「ニッキングガイドＲＮＡ」または「ニッキングｇＲＮＡ」は、必要に応じてプライム編集に追加されて、標的領域内またはその近くで未編集の鎖のニッキングを引き起こすことができるガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡではない）である。このようなニッキングは、関連領域、すなわち標的領域を修復するためにプライム編集が行われる細胞を刺激することを助ける。
【0030】
「伸長テール」は、ｐｅｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに付加することができる１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０個のヌクレオチドのヌクレオチドストレッチである。「ポリ（Ｎ）テール」は、同じ核酸塩基、例えばＡ、Ｕ、ＣまたはＴを有する１～１０個のヌクレオチドを含有するホモポリマー伸長テールである。「ポリウリジンテール」または「ポリＵテール」は、１～１０個のウリジンを含有するポリ（Ｎ）テールである。同様に、「ポリＡテール」は１～１０個のアデノシンを含有する。
【0031】
「核酸」、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本、二本、または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。この用語は、以下に限定されないが、一本、二本、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基または他の天然の、化学修飾された、生化学修飾された、非天然の、合成もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体の混合物を含みうる。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドンの置換）、アレル、オーソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列を暗示的に包含するのみならず、明示された配列を包含する。具体的には、縮重コドンの置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することによって達成されることがある（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５～２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１～９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
【0032】
「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の含窒素塩基内／上に、ヌクレオシドの糖部分内／上に（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、六員糖類似体、もしくは開環糖類似体）、またはホスフェートに、１つもしくは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。
【0033】
「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコード領域に先行および後続する領域（リーダーおよびトレーラー）のみならず、個別のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含むことがある。
【0034】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのみならず、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、これらの用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結されている。
【0035】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの類似体を指す。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、以下に限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子、およびガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含む。そのうえ、本明細書で使用される場合、これらの用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
【0036】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」という用語は、完全または部分的に相補性のポリヌクレオチド鎖が適切なハイブリダイゼーション条件で一緒になって、２つの構成鎖が水素結合によってつながった二本鎖構造または領域を形成する過程を指す。本明細書で使用される場合、「部分的ハイブリダイゼーション」という用語は、二本鎖構造または領域が１つまたは複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合は典型的にアデニンとチミン、またはアデニンとウラシル（それぞれＡおよびＴ、またはＡおよびＵ）またはシトシンとグアニン（ＣおよびＧ）の間で形成するものの、他の非定型の塩基対が形成することがある（例えば、Ａｄａｍｓら、「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、第１１版、１９９２を参照されたい）。修飾ヌクレオチドは、非定型的にハイブリダイゼーションを可能にするまたは促進する水素結合を形成しうることが考えられている。
【0037】
「相補性」という用語は、核酸が別の核酸配列と従来のワトソン－クリック型または他の非伝統型のいずれかによって水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９つ、１０個は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成することができる、核酸分子内の残基のパーセントを示す。「完全に相補性」は、核酸配列のすべての連続残基が第２の核酸配列内の同じ数の連続残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補性」は、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、もしくはそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指す、またはストリンジェントな条件でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、配列の「部分」、「セグメント」、「エレメント」、または「断片」という用語は、完全な配列よりも短い、配列の任意の部分（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポリヌクレオチドの部分、セグメント、エレメント、または断片は、１よりも大きな任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００もしくは５００ヌクレオチド長またはそれよりも長いことがある。
【0039】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドのマルチマーを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドは、約２～約２００ヌクレオチド長、最大約５０ヌクレオチド長、最大約１００ヌクレオチド長、最大約５００ヌクレオチド長、または２から５００の間の任意の整数値のヌクレオチド長を有することがある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３０～３００ヌクレオチド長または３０～４００ヌクレオチド長の範囲でありうる。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドでありうる）および／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含有しうる。オリゴヌクレオチドは、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、または３５０～４００ヌクレオチド長、例えばこれらの範囲の間の任意の整数値でありうる。
【0040】
「組換え発現ベクター」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を許す一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的または合成的に生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部でありうる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターと作動可能に連結された転写すべきポリヌクレオチドを含む。これに関連する「作動可能に連結された」は、コード配列の転写を指示するプロモーターなどのエレメントの適正な生物学的機能が発揮されるような相対位置に置かれた、ポリヌクレオチドコード配列およびプロモーターなどの２つ以上の遺伝エレメントを意味する。「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイを指すために本明細書において使用される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなどの転写開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、必要に応じて転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置しうる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。発現ベクター内に存在しうる他のエレメントには、転写を高めるもの（例えば、エンハンサー）および転写を終止するもの（例えば、ターミネーター）のみならず、発現ベクターから産生された組換えタンパク質に、ある特定の結合親和性または抗原性を付与するものが含まれる。
【0041】
「組換え」は、遺伝的に修飾されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織、または生物を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体）は、周知の方法を使用して操作されたものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）と作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒトの操作の結果として（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１～３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４～１９９８）に記載された方法により）第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含みうる。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、典型的には、ポリヌクレオチドを自然界に見出されない組合せで含む。例えば、ヒト操作制限部位またはプラスミドベクター配列は、プロモーターを他の配列と隣接させるまたは他の配列から分離することがある。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現されるものであり、組換え細胞、組織、および生物は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。
【0042】
核酸標的を「編集すること」は、標的のヌクレオチド配列に変化を起こすことを意味する。変化は、単一ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドそれぞれの挿入、欠失または置換でありうる。複数のヌクレオチドが挿入、欠失または置換される場合、これらのヌクレオチドは、連続的または非連続的でありうる。変化は、上記のいずれかの組合せであってもよい。「編集」は、「塩基編集」および「プライム編集」技術を含む。
【0043】
「編集効率」は、１つまたは複数の細胞で達成されたＣａｓ誘導性編集の尺度である。標的でのゲノム編集の結果および潜在的オフターゲット部位は、当技術分野において公知の標準的な方法、例えば、標的部位および任意の目的のオフターゲット部位のゲノムＤＮＡシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、またはＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングを使用して測定することができる。また、ゲノムＤＮＡにおけるインデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）またはＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して同定することができる。加えて、タンパク質の存在または非存在を測定する技術、例えばゲルもしくはキャピラリー電気泳動、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、または質量分析技術を使用して、タンパク質コード遺伝子を導入またはノックアウトすることを目的とする編集の効率を定量することができる。これらの技術を、バルク調製において、または単一細胞レベルで細胞集団に適用することができる。一部の実施形態では、効率は、バルクにおいてまたは単一細胞レベルで測定された細胞集団内の正しい編集の数を使用して測定される。一部の実施形態では、効率は、正しく編集された標的のパーセント、または修正された遺伝子型もしくは表現型を示す細胞の数もしくはパーセントとして測定される。
【0044】
「遺伝子の発現をモジュレートすること」は、特異的遺伝子産物の発現を変更すること（減少させることまたは活性化すること）を意味する。ＣＲＩＳＰＲ活性化または「ＣＲＩＳＰＲａ」は、遺伝子の活性化を指すのに対し、ＣＲＩＳＰＲ干渉または「ＣＲＩＳＰＲｉ」は、遺伝子発現の干渉を指す。両方のシステムは、転写エフェクター（アクティベーターまたはリプレッサー）と組み合わせて融合されたまたは相互作用するヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ９）を使用する。ＣＲＩＳＰＲａは、前記のようにＳＡＭシステム（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）で行われることがある。遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲａで使用される場合、ＭＳ２アプタマーを含むｇＲＮＡは、標的とされた遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）にＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１融合物を動員して活性化を開始する。ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉは、両方とも行われ、多重的に組み合わされることがある（例えば、複数の遺伝子を標的とする）。ＣＲＩＳＰＲｏｆｆは、遺伝子発現を遺伝的に変更できるＤＮＡメチル化および抑制的ヒストン修飾を確立するデッド型Ｃａｓ９融合タンパク質からなるプログラム可能なエピジェネティックメモリライタである（Ｎｕｎｅｚら、Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ、Ｃｅｌｌ．（２０２１）１８４（９）：２５０３～２５１９）。
【0045】
「遺伝子発現モジュレーション効率」は、例えば、異なるＲＮＡの相対もしくは絶対レベルを測定する技術、例えばｑＲＴ－ＰＣＲもしくはＲＮＡシーケンシングによって、またはタンパク質の相対もしくは絶対レベルを測定する様々な方法、例えばゲルもしくはキャピラリー電気泳動、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、もしくは質量分析技術によって測定することができる。これらの技術は、バルク調製物中の細胞の集団に、または単一細胞レベルで適用することができる。一部の実施形態では、効率は、バルクとして測定された細胞集団内の、または単一細胞レベルで標的遺伝子から発現されたタンパク質またはＲＮＡの量を使用して測定される。
【0046】
「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、アレル内を含むポリヌクレオチドに関する単一ヌクレオチドの変化を指す。これは、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる交換のみならず、単一ヌクレオチドの欠失または挿入を含みうる。もっとも典型的には、ＳＮＰはバイアレル型マーカーであるが、トリおよびテトラアレル型マーカーが存在することもある。非限定的な例として、ＳＮＰ Ａ＼Ｃを含む核酸分子は、多型位置にＣまたはＡを含みうる。
【0047】
「ヌクレアーゼ」は、本明細書で使用される場合、核酸のヌクレオチド間のホスホジエステル連結を切断できる酵素を意味する。ヌクレアーゼは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子の一本鎖および／または二本鎖切断の両方を様々に引き起こすことができる。生きた生物では、それらは、ＤＮＡ修復の多くの態様に不可欠な機構である。本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方を指し、リボヌクレアーゼのみならずデオキシリボヌクレアーゼを包含する。
【0048】
「初代細胞」という用語は、多細胞生物から直接単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には集団倍加をほとんど経ておらず、したがって、連続（腫瘍または人工的に不死化された）細胞株と比べて、それらが由来する組織の主要機能的構成要素をより大きく代表している。場合によっては、初代細胞は、単離されてから直ちに使用される細胞である。他の場合に、初代細胞は無制限に分裂することができず、したがって、インビトロで長期間培養することができない。
【0049】
「ヌクレアーゼ含有液」という用語は、ヌクレアーゼが存在する任意の培地を指すために本明細書において使用される。例えば培地は、細胞培養培地または細胞培養培地に由来する培地のことがあり、細胞を洗浄してまたは洗浄せずに、本来の培地中に含有されるすべての構成要素を除去するわけでなく、細胞が細胞培養培地から新しい培地に移動されたことを意味し、したがって、ヌクレアーゼをまだ含有しうる。例えば、細胞は、細胞を洗浄せずに、また、細胞培養培地の実質的にすべての構成要素の除去も行わずに、細胞培養培地から反応培地に移動されることがあり、したがって、細胞をｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質（ＲＮＰ）、またはｇＲＮＡおよび編集ＣａｓエフェクターをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡベクターと接触させるときにヌクレアーゼが存在することがある。液体は、血清、ヒト血清、動物血清、ウシ血清（ＢＳＡ）、胎仔血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）または別の体液でありうる。
【0050】
細胞培養自体または培養過程を指す場合の「培養する」、「培養すること」、「成長する」、「成長すること」、「維持する」、「維持すること」、「拡大増殖させる」、「拡大増殖させること」などの用語を互換的に使用して、細胞（例えば、初代細胞）がその通常の環境外の制御された条件で、例えば生存に適した条件で維持されることを意味することができる。培養細胞を生存させ、培養することは、細胞の成長、静止、分化または分裂を結果としてもたらすことができる。一部の細胞は自然に死滅または老化しうるので、この用語は培養物中のすべての細胞が生存、成長、または分裂することを意味するわけでない。細胞は、典型的には、培養過程の間に交換することができる培地中で培養される。
【0051】
「対象」、「患者」、および「個体」という用語は、ヒトまたは動物を含むために本明細書において互換的に使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類の動物（例えば、サル）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギ）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に意義のある動物、または経済的に意義のある動物でありうる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、くも膜下腔内、鼻腔内、または皮下投与を含む。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬間隙、舌下、口蓋、歯肉、経鼻、経腟、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内を含む。他の送達様式は、以下に限定されないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどを含む。
【0053】
「処置すること」という用語は、以下に限定されないが、治療的利益および／または予防的利益を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益によって、処置されている１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対する任意の治療的に意義のある改善または効果が意味される。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、もしくは症状を発生する危険のある対象に、または疾患の生理学的症状のうちの１つもしくは複数を報告している対象に、たとえ疾患、状態、または症状がまだ出現していないことがあるにしても投与されうる。
【0054】
「有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果を引き起こすのに十分な薬剤（例えば、Ｃａｓタンパク質、修飾ｇＲＮＡ／ｐｅｇＲＮＡなど）の量を指す。治療有効量は、当業者が容易に決定できる、処置されている対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与方式などのうちの１つまたは複数に応じて変動しうる。特定の量は、選ばれた特定の薬剤、標的細胞の型、対象内の標的細胞の位置、従うべき投薬レジメン、それが他の薬剤と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、およびそれが運搬される物理送達システムのうちの１つまたは複数に応じて変動しうる。
【0055】
本明細書に開示される場合、いくつかの値の範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間の各介在値もまた具体的に考えられることが理解されている。述べられた範囲によって包含される各々のより小さな範囲または介在値もまた、具体的に考えられる。「約」という用語は、一般的に、表示された数の±１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示すことがあり、「約２０」は、１８～２２を意味しうる。丸めることなどの「約」の他の意味は、文脈から明らかなことがあり、それで例えば「約１」は０．５～１．４も意味することがある。
【0056】
いくつかの化学修飾ヌクレオチドが本明細書に記載される。ＭＳ、ＭＰ、およびＭＳＰの各々が、対応する修飾または対応する修飾を含むヌクレオチドを意味できることに留意されたい。以下の略語を関連する文脈で使用するものとする。
【0057】
「ＰＡＣＥ」：ホスホノアセテート
【0058】
「ＭＳ」：２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート
【0059】
「ＭＰ」：２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート
【0060】
「ＭＳＰ」：２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート
【0061】
「２’－ＭＯＥ」：２’－Ｏ－メトキシエチル
【0062】
用語の他の定義は、本明細書の全体にわたり出現することがある。
【0063】
本発明は、特異的位置でのガイドＲＮＡの特定の修飾によって、ガイドＲＮＡがヌクレアーゼによる分解に特に抵抗性になることを実証している。インビボでヌクレアーゼ活性は高いので、これは、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集または遺伝子発現のモジュレーションのためのガイドＲＮＡのインビボ送達に特に重要である。例えば、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）などの体液は、相対的に豊富なヌクレアーゼを含有する。このような困難な環境で、ガイドＲＮＡは分解される傾向にあり、したがってその濃度は、より高い性能を達成できるレベルに到達しない（すなわち、飽和未満）。したがって、ガイドＲＮＡ濃度における、したがって遺伝子編集の機会および遺伝子発現のモジュレーションにおける任意の増大が、この業界では重要である。本発明は、ある特定のガイドＲＮＡ、例えば、５’末端でのホスホロチオエート修飾のみならず、３’末端でのホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾を有するものが、未修飾であるまたは他の修飾を含有する対応物（例えば、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートの代わりにホスホロチオエートを含有するが、その他の点で同じ）と比較して血清の存在下であっても高いＣＲＩＳＰＲ活性をもたらしたという、驚くべき発見を提供する。
【0064】
同様に、エクスビボ療法のためのＣＲＩＳＰＲ媒介編集／モジュレーションに供すべき細胞は、通常、血清を含有する細胞培養培地中にあるか、または、対象から回収したての場合であれば環境中の体液を含有する。そうであるから、血清または体液中に存在するヌクレアーゼが、細胞に送達されたガイドＲＮＡを分解し、ＣＲＩＳＰＲ媒介編集／モジュレーションの効率を低減する。ＣＲＩＳＰＲ処置の前に血清または体液の量を減らすために細胞を洗浄できるものの、大規模な洗浄は細胞にとって有害でありうる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ媒介編集／モジュレーションは、ガイドＲＮＡおよび他のＣＲＩＳＰＲエフェクターが細胞に添加された直後には起こらず、細胞をある期間培養する必要がある。血清の非存在下での培養は、しばしば細胞に支障があり、その後、細胞が患者に送達されるのでエクスビボ療法にとってのリスク因子である。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性がより高い本発明の修飾ガイドＲＮＡは、これらの問題を解決するための顕著な改善である。
【0065】
細胞に「ネイキッド」で導入され、ヌクレアーゼに直接曝された場合、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡと共トランスフェクトされた、またはその他の方法で送達された場合、本発明の修飾ガイドＲＮＡは有用である。しかし、たとえガイドＲＮＡがネイキッドでなく、例えばＣａｓタンパク質を有するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）中に、またはＣａｓタンパク質を有するもしくは有しないナノ粒子中に存在する場合であっても、本明細書に記載される修飾は同様に有利である。
【0066】
本開示の一態様では、細胞内の核酸における標的領域を編集するため、または標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法が提供される。本方法は、細胞に、ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびにｂ）５’末端および３’末端と、標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域とを含む修飾ガイドＲＮＡを提供することを含む。修飾ガイドＲＮＡはまた、５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾を含む。細胞は、ヌクレアーゼ含有液体の存在下でエクスビボで存在する、またはインビボで存在する。本方法では、Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡを細胞に提供することは、標的領域の編集または標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす。
【0067】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、３’末端の５つのヌクレオチド内に２、３、４、または５つのホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾を含む。ｇＲＮＡの３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾は、少なくとも２、３、４、または５つのＭＰヌクレオチドを含むことがあり、それは、２つの連続する修飾ヌクレオチドおよび１もしくは２つの非連続の修飾ヌクレオチド、３つの連続する修飾ヌクレオチドおよび１つの非連続の修飾ヌクレオチド、２つの連続する修飾ヌクレオチドの２つのペア、または２つの連続する修飾ヌクレオチドの５つを含む任意の順序で配列されていることがある。一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、３’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つの連続するＭＰヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、５’末端の５つのヌクレオチド内に１、２、３、４、または５つのホスホロチオエート修飾を含む。ｇＲＮＡの５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのＭＳヌクレオチドを含むことがあり、それらは、連続的または非連続的を含む任意の順序で配列されていることがある。本方法の一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、５’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つの連続するＭＳヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、独立して選択されることがある（例えば、修飾ヌクレオチドの数および／または順序は、ｇＲＮＡの５’および３’末端で異なることがある）。
【0068】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、５’末端および３’末端内の５つのヌクレオチドの外側に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む。修飾ガイドＲＮＡは、標的特異性を高めるガイド配列内に１つまたは複数の修飾を含むことがある（例えば、米国特許第１０，７６７，１７５号に記載）。例えば、修飾ガイドＲＮＡは、修飾されたガイド配列の位置５または位置１１に修飾ヌクレオチドを含むことがある。
【0069】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、正確に４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００個のヌクレオチド、または少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００個のヌクレオチド、および／または最大１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６４、１６３、１６２、１６１、１５９、１５８、１５７、１５６、１５５、１５４、１５３、１５２、１５１、１５０、１４９、１４８、１４７、１４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、もしくは１２０個のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡである。最小が最大よりも小さい限り、前述の最小および最大のいずれかを組み合わせて範囲を形成できることが明示的に意図されている。
【0070】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとして細胞に提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして細胞に提供される。細胞に、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターを、修飾ガイドＲＮＡと別々にまたは一緒にトランスフェクトすることができる。一部の実施形態では、細胞に、修飾ガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターとが共トランスフェクトされる。共トランスフェクトした場合、修飾ガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターとを、別々の送達システムで、または単一の送達システムで細胞に提供することができる。または、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターをトランスフェクトする前または後に、修飾ガイドＲＮＡが細胞にトランスフェクトされることがある。細胞に、電気穿孔、微量注入、リポフェクションまたはナノ粒子もしくは他の送達システムへの曝露（以下により詳細に記載する）によってトランスフェクトすることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質および／または修飾ガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に提供される。
【0071】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される。修飾ガイドＲＮＡをＣａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは融合タンパク質と複合体化して、細胞内に導入するためのＲＮＰを形成させることができる。ＲＮＰは、電気穿孔、微量注入、ウイルス様粒子、リポフェクションまたはナノ粒子もしくは他の送達システムへの曝露（以下により詳細に記載する）などによって、送達システムにおける細胞に提供することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質および／または修飾ガイドＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に提供される。
【0072】
一部の実施形態では、編集またはモジュレートすべき細胞はエクスビボである。他の実施形態では、編集またはモジュレートすべき細胞はインビボである。本方法は、血清を含む培地中で予め培養されたエクスビボ細胞内の核酸において標的領域を編集するため、または標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートするために使用することができ、そこで細胞は、血清または１つもしくは複数の血清構成要素から不完全に分離されたものである。例えば、本方法は、細胞を洗浄せずに、細胞の大規模な洗浄もせずに、細胞を細胞培養培地から反応培地に移動させることを含むことがある。一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、血清または１つもしくは複数の血清構成要素の存在下で、細胞（例えば血液、血漿または血清中のインビボ細胞）に提供される。
【0073】
一部の実施形態では、細胞は、各々が標的領域を含む細胞の集団である。例えば、細胞の集団は、細胞培養物でもよいし、細胞培養物に由来してもよい。細胞または細胞の集団は、修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質が細胞に提供される前に、細胞培養培地またはヌクレアーゼ含有液中にあってもよく、一部の実施形態では、編集構成要素の導入前に、細胞は洗浄されるが、細胞培養培地または細胞培養培地の１つもしくは複数の構成要素を完全に含まないわけではないため、ヌクレアーゼがまだ存在する。例えば、細胞を洗浄せずに、また、細胞培養培地の実質的にすべての構成要素を除去するわけでなく、細胞が細胞培養培地から反応培地に移動されてもよい。または、修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を提供する時点で、細胞または細胞の集団が細胞培養培地中に存在してもよい。このような実施形態では、細胞培養培地は、細胞内の標的配列を編集またはモジュレートするための反応培地として機能することができる。一部の実施形態では、細胞は、血清または１つもしくは複数の他の培地構成要素、例えば、ヒトもしくは動物起源の１つもしくは複数の天然タンパク質を含む細胞培養培地中にある、またはそれから移動される。一部の実施形態では、細胞は、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、またはウシ胎仔血清を含む細胞培養培地中にある、またはそれから移動される。
【0074】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡを細胞に提供することに起因する編集または発現のモジュレーションは、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ガイドＲＮＡによって引き起こされる編集またはモジュレーションよりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％、より効率的である。例えば本発明は、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ガイドＲＮＡを採用する対応する方法で得られる収率よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％高い平均インデル収率または平均編集収率を有する。一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡを細胞に提供することに起因する編集またはモジュレーションは、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ガイドＲＮＡによって引き起こされる編集またはモジュレーションよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍効率的である。例えば、本方法は、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ガイドＲＮＡを採用する対応する方法よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高い平均インデル収率または平均編集収率を有する。
【0075】
本発明において、多重化は、複数の標的領域について複数の修飾ｇＲＮＡを使用することにより企図される。一部の実施形態では、本出願の２つの修飾ガイドＲＮＡは、同じ細胞内の２つの異なる標的領域を、好ましくは同時に、編集（またはモジュレート）するために使用される。一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、第１の標的領域を編集するために使用され、第２の修飾ガイドＲＮＡは、標的領域（第１の標的領域と同じ場合または異なる場合がある）の発現を多重的にモジュレートするために使用される。
【0076】
近年、ＣＲＩＳＰＲベース技術は、潜在的に革新的な治療法として登場した（例えば、遺伝的欠陥を修正するため）。しかし、ＣＲＩＳＰＲシステムの使用は、実用上の問題のせいで限られている。特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素のインビボ送達のためにガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を安定化する方法の必要性がある。以前の研究は、化学修飾ヌクレオチドを有するｇＲＮＡの使用を研究していた。本明細書に説明されるように、本開示は、一部には、ｇＲＮＡの３’末端での特定の修飾ヌクレオチドの組入れが標的核酸のＣａｓ媒介編集またはモジュレーションの収率を改善することができ、ｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡとが厳しい状況で細胞内に導入される場合（例えば共トランスフェクション）に顕著な改善を有するという驚くべき発見に基づく。
【0077】
一部の態様では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡが１つまたは複数の厳しい状況で細胞に導入される適用、例えば、
ｉ．細胞が血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む培地中にある；
ｉｉ．細胞が血清を含む培地中で予め培養されており、ガイドＲＮＡが導入されるときに血清がまだ存在する；
ｉｉｉ．細胞が１つまたは複数のヌクレアーゼを含む培地中で予め培養されており、ガイドＲＮＡが導入されるときにヌクレアーゼがまだ存在する；
ｉｖ．細胞が、相対的に高いレベルのヌクレアーゼ活性、例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼの相対的に高い発現を有する；
ｖ．細胞が相対的に低いレベルのヌクレアーゼ阻害剤活性、例えばヌクレアーゼ阻害剤の相対的に低い発現を有する；
ｖｉ．細胞内に送達する前に、修飾ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体化していない；
ｖｉｉ．細胞がインビボで存在する；および
ｖｉｉｉ．適用可能な場合はそれらの組合せ
において特に有利でありうる。
ｉ．細胞が血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む培地中にある；
ｉｉ．細胞が血清を含む培地中で予め培養されており、ガイドＲＮＡが導入されるときに血清がまだ存在する；
ｉｉｉ．細胞が１つまたは複数のヌクレアーゼを含む培地中で予め培養されており、ガイドＲＮＡが導入されるときにヌクレアーゼがまだ存在する；
ｉｖ．細胞が、相対的に高いレベルのヌクレアーゼ活性、例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼの相対的に高い発現を有する；
ｖ．細胞が相対的に低いレベルのヌクレアーゼ阻害剤活性、例えばヌクレアーゼ阻害剤の相対的に低い発現を有する；
ｖｉ．細胞内に送達する前に、修飾ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体化していない；
ｖｉｉ．細胞がインビボで存在する；および
ｖｉｉｉ．適用可能な場合はそれらの組合せ
において特に有利でありうる。
【0078】
飽和の概念は、当技術分野において周知である。物質がその「飽和レベル」にある場合、物質の量におけるいかなるさらなる増大も、結果としてより高い活性をもたらさない。「飽和未満のレベル」は、飽和レベルよりも低く、問題になっている物質をより多く添加することは、より高い活性をもたらす可能性がある。従来のアッセイを使用して飽和の閾値を経験的に決定してもよい。例えば、図１は、漸増する量の合成ｇＲＮＡおよび一定量のＣａｓタンパク質を共トランスフェクション後にＣａｓ編集活性を評価したアッセイの結果を示す。この図によって示されるように、Ｃａｓ媒介編集活性は、２５～３１．２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡでプラトーに達し、そのとき、ｇＲＮＡのレベルは２０万個の細胞のトランスフェクションについての飽和点に達する。
【0079】
多くの場合に、化学反応によって必要とされる構成要素の飽和レベルを使用することが理想的である。しかし、このような条件は必ずしも実行可能でなく、特に、飽和レベルの１つまたは複数の化合物によりヒトまたは動物を処置することが可能でも安全でもないかもしれない治療法の場合に、実行可能でない。ＣＲＩＳＰＲベースの療法の場合、トランスフェクション効率は、典型的に治療法の有効性を制限するボトルネックである。例えば、現在のＣＲＩＳＲベースの療法は、通常、患者の１つまたは複数の細胞に、ｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトする必要がする。トランスフェクション効率が低い場合、一方または療法の構成要素が、治療効果に必要とされる有効量未満のレベルで送達されることがある。本明細書に開示された修飾ガイドＲＮＡ構築物は、飽和未満のレベルでトランスフェクトされた場合に高レベルのＣａｓ編集活性を典型的に示す点で、当技術分野におけるこの必要性に取り組んでいる。実際に、合成ｇＲＮＡの３’末端での１つまたは複数のホスホノカルボキシレート修飾の組込みは、Ｃａｓ ｍＲＮＡの合成ｇＲＮＡとの共トランスフェクションを伴うＣＲＩＳＰＲベースの方法に特に有利である。
【0080】
上述のように、本開示はまた、厳しい状況で、例えば飽和量未満をトランスフェクトした場合に、高レベルのプライム編集活性を保持する修飾ｐｅｇＲＮＡ構築物および方法を提供する。伝統的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の構造が、プライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）の構造と非常に異なり、本開示の前に、ｐｅｇＲＮＡの化学修飾がその活性にどのように影響するのか不明であったので、この結果は特に驚くべきことである。特に、ｐｅｇＲＮＡは、典型的なｇＲＮＡ（すなわち、逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位の配列）と比較してその３’部分に追加的な配列を含有し、ｐｅｇＲＮＡの３’末端は他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける典型的なｇＲＮＡの３’末端と異なる機能をプライム編集において果たす。したがって、ｐｅｇＲＮＡの３’終端でのホスホリボース（または他の化学）修飾は、プライマー結合部位配列の役割を妨害する潜在性を有する。プライマー結合部位配列は、ＤＮＡ標的部位のニック入り鎖の３’末端とハイブリダイズし、それにより、逆転写酵素は、結果として生じたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を、ニック入り３’末端のプライマー伸長に許容されうる基質として認識して、プライム編集を達成する。
【0081】
この理解に基づき、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡセグメント内のＭＳおよびＭＰなどの一部のホスホリボース修飾が、この二重鎖に対する逆転写酵素の親和性を妨害または低減し、したがってプライム編集活性を低減しうることが予期される。そのうえ、ホスホリボースが（例えばＭＳまたはＭＰによって）修飾される位置および／または位置の組合せは、プライム編集における逆転写酵素の機能を妨害し、したがって、プライム編集活性を低減することが予期される。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖と、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（その逆転写酵素がプライム編集に典型的に採用されるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の近縁である）由来の逆転写酵素の二重鎖複合体化ポリペプチド断片の部分との複合体の公表された共結晶構造は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖内のＲＮＡ鎖の３’終端と相互作用する逆転写酵素の部分を欠如しており（Ｎｏｗａｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３、３８７４～３８８７）、プライム編集においてｐｅｇＲＮＡの３’終端で重要でありうるＲＮＡ－タンパク質接触に関する情報は当技術分野において欠如したままである。
【0082】
本開示は、一部には、３’末端での１つまたは複数のＭＰ修飾を、必要に応じて５’末端での１つまたは複数の修飾と共に含む修飾ｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡが、特に、修飾ガイドＲＮＡが飽和未満レベルで細胞内にトランスフェクトされた場合に、Ｃａｓ媒介編集活性を高めることができるという驚くべき知見に基づく。下にさらに詳細に述べるように、約１００ｎｔ長でありうる様々な設計の化学合成された一本鎖ガイドＲＮＡおよび典型的により長いｐｅｇＲＮＡを、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと共に培養ヒト細胞に共トランスフェクトしたところ、ＭＳまたはＭＰ修飾をｇＲＮＡ／ｐｅｇＲＮＡの３’末端でのホスホリボースに付加した場合に高い活性が観察された。
【0083】
様々な３’および／または５’末端修飾の影響を評価するために、表１に挙げるようにｇＲＮＡの３’末端にＭＳまたはＭＰホスホリボース修飾を系統的に組み込むことによって、ＨＢＢ遺伝子を標的とする一連の合成ｇＲＮＡを創出した。５’および３’末端修飾は、各々の合成ｇＲＮＡの名称に示されている。例えば、ＨＢＢ－１０１－３ｘＭＳ，３ｘＭＰは、ｇＲＮＡの５’末端に３つのＭＳ修飾および３’末端に３つのＭＰ修飾を有する、ＨＢＢ遺伝子についてのガイドＲＮＡを意味する。修飾の正確な位置は、図１に示される配列に下線付きで表記されている。この名称は、ＲＮＡの長さも示す。例えば、ＨＢＢ－１０１－ｅｔｃ．は、１０１個のヌクレオチドから構成される、ＨＢＢ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ鎖を意味する。同様に、ＨＢＢ－９９－ｅｔｃは、ｓｇＲＮＡ鎖が９９個のヌクレオチドから構成されることを意味する。これらの長さと、似たような長さの配列長の差は、表１に定義される配列によって特定されるように、ｓｇＲＮＡの３’終端での短いポリウリジン（ポリＵ）テール内のウリジン数が異なることにある。表１に挙げる例では、３’ポリＵテールは、３、４、５、６または７つの連続するウリジンから構成される（評価の基準として、天然ｔｒａｃｒＲＮＡ上の３’ポリＵテールは、一般的に７つの連続するウリジンから構成される）。また、ガイド配列に修飾がもしあれば、それは標的遺伝子の名称およびＲＮＡの長さの後に表示される。例えば、ＨＢＢ－１０２－１１ＭＰ－３ｘＭＳ，３ｘＭＰは、１０２個のヌクレオチドから構成され、５’末端に３つのＭＳ修飾および３’末端に３つのＭＰ修飾を有し、ガイド配列内の位置１１にＭＰ修飾を含む、ＨＢＢ遺伝子についてのガイドＲＮＡを意味する。修飾の正確な位置は、表１（ならびにガイド配列内のＭＰ修飾に太い下線を付けて注記した表２～４）に示される配列内に下線を付けて表記される。
【0084】
【表1】
【0085】
ｇＲＮＡの３’末端での化学修飾の数および型は、飽和未満量のｇＲＮＡが細胞内に（例えば、ヌクレオフェクションにより）送達される状況でＤＮＡ編集についてのそれらの有効性を実質的に高めることができる。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体としてＣａｓタンパク質との複合体の状態で共トランスフェクトされる場合と対照的に、この利益は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと共トランスフェクトされたｇＲＮＡを使用する方法で特に顕著である。ｇＲＮＡに組み込まれた化学修飾の数および型もまた、血清（ヌクレアーゼを含有することが知られている）を含む成長培地中に懸濁された細胞のトランスフェクションに関して本明細書に提供されるデータによって説明されるＣａｓ ＲＮＰ複合体の編集効率を改善することができる。例えば、図４および５を参照されたい。本明細書に記載される実験データはまた、トランスフェクトされたｇＲＮＡ配列中のある特定の化学修飾およびある特定の配列位置が、例えばｇＲＮＡの３’末端上の連続する３’末端ホスホリボースに１つまたは複数のＭＰ修飾を組み込むことによって編集収率を高めるために特に有利でありうることを示している。
【0086】
本明細書に記載される５’および３’末端修飾のいずれかは、標的特異性を高めるｇＲＮＡのガイド配列内の修飾と組み合わされることがある（例えば、米国特許第１０，７６７，１７５号に記載されている）。例えば、表１に示され、図２～５に試験されたように、３’末端でのＭＰ修飾（例えば、３’末端からの第１のヌクレオチド間連結がホスホノアセテートを含むことを意味する、３’末端からの第２のヌクレオチドでのＭＰ）を、ｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡのガイド配列部分における位置５または１１（ヌクレオチド２０個のガイド配列内のガイド配列の５’末端から数える）でのＭＰまたは他の修飾と組み合わせてもよい。
【0087】
化学修飾は、アミダイトカップリングの選択サイクルに化学修飾ホスホロアミダイトを使用することによってｇＲＮＡの化学合成の間に組み込まれて、所望の配列を産生することができる。合成した後、化学修飾ｇＲＮＡは、未修飾ｇＲＮＡと同様に遺伝子編集または調節のために使用される。好ましい実施形態は、化学修飾された合成ｇＲＮＡを、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡと共トランスフェクトすることである。化学修飾は、電気穿孔、リポフェクションまたは生きた細胞もしくは組織の、Ｃａｓタンパク質をコードするｇＲＮＡおよび／もしくはｍＲＮＡをチャージされたナノ粒子への曝露によって送達される場合を含め、トランスフェクトされた細胞におけるｇＲＮＡの活性を高める。
【0088】
例示的な合成ｐｅｇＲＮＡを下の表２および３に示す。３’末端にＭＳまたはＭＰホスホリボース修飾を系統的に組み込むことによってこれらのｐｅｇＲＮＡを修飾した。各合成ｐｅｇＲＮＡの名称に５’および３’末端修飾を表示し、これは標的遺伝子も表示する。例えば、「ＥＭＸ１－ｐｅｇ－３ｘＭＳ，３ｘＭＰ」は、ｐｅｇＲＮＡの５’末端に３つのＭＳ修飾および３’末端に３つのＭＰ修飾を有する、ＥＭＸ１遺伝子についてのｐｅｇＲＮＡを指す。修飾の正確な位置は、表２に示される配列に下線を付けて表記される。ｐｅｇＲＮＡの設計のいくつかは、ｐｅｇＲＮＡの名称の「＋３’ＵＵ」、「＋３’ＵＵＵ」、または「＋３’ＵＵＵＵ」によって表示されるように３’終端に付加された短いポリウリジン域（すなわち、ポリＵテール）を有する。
【0089】
【表2】
【0090】
【表3】
【0091】
【表4】
【0092】
下記実施例によって実証されるように、ｐｅｇＲＮＡの３’末端での化学修飾の使用は、プライムエディターを有する合成ｐｅｇＲＮＡの有効性を実質的に改善する（３’末端が未修飾のｐｅｇＲＮＡと比べて）。文献に本来報告されたように、ＤＮＡベクターをトランスフェクトされた細胞内でｐｅｇＲＮＡおよびプライムエディターが構成的に発現される場合の持続的編集活性とは対照的に（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）、プライム編集のために合成ｐｅｇＲＮＡを使用することは、編集活性の持続時間を限定することを目指す場合に好ましい可能性がある。データから、３’終端でのプライマー結合セグメントで終止するｐｅｇＲＮＡ鎖上の連続する３’末端ホスホリボースに（３’終端に下流のポリＵテールを付加せずに）２つのＭＰ修飾を組み込むなどの一部の態様において、ｐｅｇＲＮＡ配列内のある特定の化学修飾およびある特定の配列位置が特に有利でありうると、本開示はさらに実証している。
【0093】
Ａ．例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）と、標的ＤＮＡをＣａｓタンパク質の標的とするガイド配列を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む。場合によっては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＨ８６３Ａの変異のうちの１つまたは複数を含有するＣａｓ９変異体などのＣａｓタンパク質のバリアントを使用することができる。他の例では、所望の特性（例えば、一本鎖もしくは二本鎖切断を生成するおよび／または遺伝子発現をモジュレートできる）を有するＣａｓタンパク質（またはそのバリアント）の断片を使用することができる。例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーなどのレポーターポリペプチドと、標的ＤＮＡと相同で遺伝子修飾部位に隣接するホモロジーアームとをコードするヌクレオチド配列を含みうるドナー修復鋳型が一部のＣＲＩＳＰＲ適用に使用されることがある。または、ドナー修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）でありうる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、プライムエディターとして作用できるＣａｓタンパク質（例えば、逆転写酵素タンパク質またはそのドメインと融合された、ニッカーゼ活性を示すＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質）を含みうる。プライムエディターは、プライム編集と称される過程によって標的核酸の配列を修飾するために、標的核酸の配列への１つまたは複数の編集を含有する逆転写酵素の鋳型を組み入れているｐｅｇＲＮＡと共に使用されることがある。
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）と、標的ＤＮＡをＣａｓタンパク質の標的とするガイド配列を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む。場合によっては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＨ８６３Ａの変異のうちの１つまたは複数を含有するＣａｓ９変異体などのＣａｓタンパク質のバリアントを使用することができる。他の例では、所望の特性（例えば、一本鎖もしくは二本鎖切断を生成するおよび／または遺伝子発現をモジュレートできる）を有するＣａｓタンパク質（またはそのバリアント）の断片を使用することができる。例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーなどのレポーターポリペプチドと、標的ＤＮＡと相同で遺伝子修飾部位に隣接するホモロジーアームとをコードするヌクレオチド配列を含みうるドナー修復鋳型が一部のＣＲＩＳＰＲ適用に使用されることがある。または、ドナー修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）でありうる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、プライムエディターとして作用できるＣａｓタンパク質（例えば、逆転写酵素タンパク質またはそのドメインと融合された、ニッカーゼ活性を示すＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質）を含みうる。プライムエディターは、プライム編集と称される過程によって標的核酸の配列を修飾するために、標的核酸の配列への１つまたは複数の編集を含有する逆転写酵素の鋳型を組み入れているｐｅｇＲＮＡと共に使用されることがある。
【0094】
１．Ｃａｓタンパク質およびそのバリアント
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは細菌から発見されたが、遺伝子発現のゲノム編集／モジュレーションのために真核細胞（例えば哺乳動物）において使用されている。これは、多くの微生物および古細菌の適応免疫応答の部分に基づく。ウイルスまたはプラスミドがこのような微生物に侵入した場合、侵入体のＤＮＡのセグメントが微生物ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ座位（または「ＣＲＩＳＰＲアレイ」）に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位の発現は、ノンコーディングＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を産生する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、次いでｃｒＲＮＡが部分相補性領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同な領域へと導く。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有されるヌクレオチド２０個のガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、部位特異的なＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて一つの分子（一本鎖ガイドＲＮＡまたは「ｓｇＲＮＡ」）にできるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：８１６～８２１；Ｊｉｎｅｋら（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００４７１；Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００５６３を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作して、細胞ゲノム内の所望の標的に二本鎖切断を生成し、誘導された切断を相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復する細胞内因性メカニズムを利用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは細菌から発見されたが、遺伝子発現のゲノム編集／モジュレーションのために真核細胞（例えば哺乳動物）において使用されている。これは、多くの微生物および古細菌の適応免疫応答の部分に基づく。ウイルスまたはプラスミドがこのような微生物に侵入した場合、侵入体のＤＮＡのセグメントが微生物ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ座位（または「ＣＲＩＳＰＲアレイ」）に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位の発現は、ノンコーディングＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を産生する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、次いでｃｒＲＮＡが部分相補性領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同な領域へと導く。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有されるヌクレオチド２０個のガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、部位特異的なＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて一つの分子（一本鎖ガイドＲＮＡまたは「ｓｇＲＮＡ」）にできるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：８１６～８２１；Ｊｉｎｅｋら（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００４７１；Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００５６３を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作して、細胞ゲノム内の所望の標的に二本鎖切断を生成し、誘導された切断を相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復する細胞内因性メカニズムを利用することができる。
【0095】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤＮＡ切断活性を有する。Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列内の位置に一方または両方の鎖の切断を指示することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を切断する１つまたは複数の不活性化触媒ドメインを有するニッカーゼでありうる（例えば、プライムエディターＣａｓタンパク質の場合と同様）。
【0096】
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓΦ、ＣａｓＸ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、それらのバリアント、それらの断片、それらの変異体、およびそれらの誘導体が含まれる。少なくとも６つの型のＣａｓタンパク質（Ｉ～ＶＩ型）、および少なくとも３３個の亜型がある（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０２０、１８：２、６７～８３を参照されたい）。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ９を含む。Ｃａｓタンパク質は、当業者に公知である。例えば、化膿性連鎖球菌野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＮＰ＿２６９２１５に示され、ストレプトコッカス サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＷＰ０１１６８１４７０に示される。本開示の態様に有用なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，２６７，１３５号；同第９，７４５，６１０号；および同第１０，２６６，８５０号に開示されている。
【0097】
Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９ポリペプチドは、これらに限定されないが、ベイロネラ アティピカル（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ）、フソバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、ソロバクテリウム モーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、トレポネーマ デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ペプトニフィルス デューデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、スタフィロコッカス シューディンテルメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、アシダミノコッカス インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、オルセネラ ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）、オエノコッカス キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ラクトバシルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシルス ガゼリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、フィネゴルディア マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、マイコプラズマ モビレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、マイコプラズマ ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ オビニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、マイコプラズマ シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、ユーバクテリウム レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ストレプトコッカス サーモフィルス、ユーバクテリウム ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ラクトバシルス コリニフォルミス亜種トルケンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、イリオバクター ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、ルミノコッカス アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、アッケルマンシア ムチニフィリア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アシドテルムス セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）、コリネバクテリウム ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エルシミクロビウム ミヌタム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）、ニトラティフラクター サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、スフェロキエータ グロブス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター スクシノゲネス亜種スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス カプノサイトファーガ オクラセア（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）、ロドシュードモナス パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、プレボテラ ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）、プレボテラ ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、フラボバクテリウム コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、アミノモナス ポーシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドスピリルム ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、カンジデーテス プニセイスピリルム マリヌム（Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、ベルミネフロバクター アイゼニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア シジギイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ディノロセオバクター シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ニトロバクター ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター ジェジュニ亜種ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、バシルス セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アシドボラックス エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）、クロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、パルビバキュラム ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロセブリア インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、スッテレラワズウォルテンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、パラスッテレラ エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ウォリネラ サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、およびフランシセラ ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）を含む多様な細菌種に由来しうる。
【0098】
「Ｃａｓ９」は、ＲＮＡガイド二本鎖ＤＮＡ結合性ヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能的ドメイン、例えばＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、両方の機能的ドメインが活性の場合にゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓ９酵素は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、スッテレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロキエータ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバキュルム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の１つまたは複数の触媒ドメインを含みうる。一部の実施形態では、２つの触媒ドメインは、異なる細菌種に由来する。
【0099】
「Ｃａｓ１２」（バリアントＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、ＣａｓＸ、およびＣａｓＹを含む）は、混合アルファ／ベータドメイン、ＲｕｖＣ－Ｉに続いて、ヘリックス領域、ＲｕｖＣ－ＩＩと、ジンクフィンガー様ドメインまたはニッカーゼタンパク質とを含有するＲＮＡガイド二本鎖ＤＮＡ結合ヌクレアーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡ標的配列にねじれ形の５’オーバーハングを作り、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。Ｃａｓ１２およびそのバリアントは、標的ｄｓＤＮＡ上の５’ＡＴリッチのＰＡＭ配列を認識する。Ｃａｓ１２ａタンパク質のＮｕｃと呼ばれる挿入ドメインは、標的鎖の切断を担うことが実証されている。Ｃａｓ１２酵素は、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）およびプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）からなる群に属する細菌に由来するＣａｓ１２タンパク質の１つまたは複数の触媒ドメインを含みうる。
【0100】
Ｃａｓ９タンパク質の有用なバリアントは、両方ともニッカーゼであるＲｕｖＣまたはＨＮＨ酵素などの単一の不活性触媒ドメインを含みうる。このようなＣａｓタンパク質は、例えばプライム編集の状況で有用である。Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つの機能的ドメインだけを有し、標的ＤＮＡの一本鎖だけを切断し、それにより、一本鎖切断またはニックを生成することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくともＤ１０Ａ変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、かつＣａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくともＨ８４０Ａ変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、かつＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼに存在する変異の他の例は、以下に限定されないが、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａを含む。二本鎖切断は、向かい合うＤＮＡ鎖を標的とする少なくとも２つのＤＮＡ標的化ＲＮＡを使用する場合にＣａｓ９ニッカーゼを使用して導入することができる。ずれた二重ニック導入二本鎖切断はＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復することができる（Ｒａｎら、２０１３、Ｃｅｌｌ、１５４：１３８０～１３８９；Ａｎｚａｌｏｎｅら Ｎａｔｕｒｅ ５７６：７７８５、２０１９、１４９～１５）。この遺伝子編集戦略は、ＨＤＲに有利であり、副産物としてのインデル変異の頻度を減少させる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば、米国特許第８，８９５，３０８号；同第８，８８９，４１８号；同第８，８６５，４０６号；同第９，２６７，１３５号；および同第９，７３８，９０８号；ならびに米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物のためにコドン最適化することができる。
【0101】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９と称される、ＲｕｖＣｌおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの２つのサイレンシング変異（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を含有するＣａｓ９ポリペプチドでありうる（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ、１５２（５）：１１７３～１１８３）。一実施形態では、化膿性連鎖球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７またはそれらの任意の組合せに少なくとも１つの変異を含む。このようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそのバリアントの説明は、例えば、国際特許公報番号ＷＯ２０１３／１７６７７２に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６での変異のみならず、Ｈ８４０またはＮ８６３での変異を含有しうる。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ変異を含有する。また、ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含みうる。一部の実施形態では、本開示の態様に使用されるｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎ置換を含む。置換は、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的に不活性にし、標的ＤＮＡと結合できるようにするための保存的または非保存的置換でありうる。
【0102】
ｄＣａｓ９ポリペプチドは触媒的に不活性であり、ヌクレアーゼ活性を欠如する。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を遮断し、場合によってはＲＮＡポリメラーゼを遮断することができる。他の例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列、例えば転写アクティベーターポリペプチドと融合した場合に、標的配列の転写を活性化することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはタンパク質バリアントは、１つまたは複数のＮＬＳ配列を含む。
【0103】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、第２のタンパク質の１つまたは複数の異種機能性ドメインと必要に応じて介在リンカーにより融合した１つまたは複数のＣａｓヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、リンカーは、融合タンパク質の活性を妨害しない。これに関連する異種は、機能性ドメインがＣａｓタンパク質以外のタンパク質由来であることを意味する。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、酵素ドメインおよび／または結合ドメインを含む。一部の実施形態では、異種酵素ドメインは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写アクティベーター、または転写リプレッサードメインである。一部の実施形態では、異種酵素ドメインは、塩基編集活性、ヌクレオチドデアミナーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、クロマチン修飾もしくはリモデリング活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、検出可能な活性、またはそれらの任意の組合せを含む。
【0104】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、例えば、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、もしくはＡＰＯＢＥＣ４を含む触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼ；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）由来のシチジンデアミナーゼドメインなどの塩基エディターである異種機能性ドメインを含む。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を修飾するデアミナーゼであり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）である。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは生物学的テザーである。一部の実施形態では、生物学的テザーは、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である。一部の実施形態では、異種機能性ドメインはＦｏｋＩである。
【0105】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、内因性ＤＮＡ修復または塩基切断修復（ＢＥＲ）経路を阻害または高める酵素、ドメイン、またはペプチド、例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ－グリコシラーゼ、もしくはＵＮＧとしても知られる）が媒介するウラシルの切断を阻害してＢＥＲを開始するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）；またはバクテリオファージＭｕ由来のＧａｍなどのＤＮＡ末端結合タンパク質である異種機能性ドメインを含む。
【0106】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４ドメイン、ｐ６５ドメイン、ＭｙｏＤ１ドメイン、またはＨＳＦ１ドメインである異種機能性ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、転写抑制ドメイン、例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）ドメイン、ＳＩＤ４Ｘドメイン、ＮｕＥドメイン、またはＮｃｏＲドメインである異種機能性ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋ１ドメインである異種機能性ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は転写サイレンサードメイン、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１ａまたはＨＰ１Ｄを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の異種機能性ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素である。一部の実施形態では、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。一部の実施形態では、ＴＥＴタンパク質はＴＥＴ１である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質の異種機能性ドメインは、ヒストンサブユニットを修飾する酵素である。一部の実施形態では、ヒストンサブユニットを修飾する酵素はヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである。
【0107】
遺伝子調節（例えば、標的ＤＮＡの転写をモジュレートする）のために、これらに限定されないが、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質を、転写活性化または転写抑制のために使用することができる。ヌクレアーゼ－ヌルＣａｓタンパク質を使用する遺伝子発現を不活性化する方法は、例えば、Ｌａｒｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１３、８（１１）：２１８０～２１９６に記載されている。
【0108】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含む。１つまたは複数のＮＬＳドメインは、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃ２ｃ２）の終端にまたはその近くにまたはそれに近接して位置することがあり、２つ以上のＮＬＳがある場合、それら２つの各々は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃ２ｃ２）の終端にまたはその近くにまたはそれに近接して位置することがある。
【0109】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に存在する。場合によっては、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。例えば、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどに基づきうる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳がんウイルスなどに由来するベクターに基づきうる。有用な発現ベクターは、当業者に公知であり、多くが市販されている。真核生物宿主細胞のための例として、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０のベクターが提供される。しかし、宿主細胞と適合するならば任意の他のベクターを使用してもよい。
【0110】
使用される標的細胞／発現系に応じて、プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むいくつかの転写および翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用されることがある。有用なプロモーターは、ウイルス、または任意の生物、例えば、原核生物もしくは真核生物から導出されうる。適切なプロモーターには、以下に限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）Ｕ６プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが含まれる。
【0111】
Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして、細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などの細胞または患者内などのインビボ細胞）内に導入することができる。
【0112】
２．化学修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用するための修飾されたｇＲＮＡは、典型的に、標的核酸配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域とを含む。
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用するための修飾されたｇＲＮＡは、典型的に、標的核酸配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域とを含む。
【0113】
修飾ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を指示するのに十分な相補性を標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列）と有する任意のポリヌクレオチド配列でありうる。一部の実施形態では、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、修飾ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上である、または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上よりも大きい。最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されることがあり、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えばＢｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長、またはそれよりも長い。場合によっては、ガイド配列は約２０ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約１５ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約２５ヌクレオチド長である。ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価されることがある。結合は、例えば、代用として編集または切断を使用することによって直接的または間接的に判定することができる。例えば、被験ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターのトランスフェクションに続く標的配列内の編集または切断の評価などにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されることがある。同様に、標的配列と、被験ガイド配列および被験ガイド配列と異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素とを提供し、試験ガイド配列反応物と対照ガイド配列反応物の間で標的配列での結合または切断速度を比較することによって、標的ポリヌクレオチド配列の切断が試験管内で評価されることがある。
【0114】
ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記のウェブベースのソフトウェアのいずれかを使用して選択することができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡを選択するための考慮は、使用すべきＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）についてのＰＡＭ配列、およびオフターゲット修飾を最小化するための戦略を含む。ＣＲＩＳＰＲ設計ツールなどのツールは、修飾ｇＲＮＡを調製するため、標的修飾効率を判定するため、および／またはオフターゲット部位での切断を判定するための配列を提供することができる。修飾ガイドＲＮＡの配列を選択するための別の考慮は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減することを含む。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定されることがある。一部のプログラムは、最小Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーを計算することに基づく。適切なアルゴリズムの例には、ｍＦｏｌｄ（ＺｕｋｅｒおよびＳｔｉｅｇｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、９（１９８１）、１３３～１４８）、ＵＮＡＦｏｌｄパッケージ（Ｍａｒｋｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００８、４５３：３～３１）およびＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージからのＲＮＡｆｏｌｄが含まれる。
【0115】
修飾ガイドＲＮＡのガイド配列の１つもしくは複数のヌクレオチドおよび／または足場領域の１つもしくは複数のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドでありうる。例えば、約２０ヌクレオチド長のガイド配列は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを有することがある。場合によっては、ガイド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。他の例では、ガイド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の任意の核酸位置に位置することがある。言い換えると、修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の第１および／もしくは最後のヌクレオチドもしくはその近く、ならびに／またはそれらの間の任意の位置にありうる。例えば、２０ヌクレオチド長であるガイド配列について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の核酸位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９、および／または位置２０に位置しうる。場合によっては、ガイド配列の約１０％～約３０％、例えば、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約１５％～約３０％、約２０％～約３０％、または約２５％～約３０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。他の例では、ガイド配列の約１０％～約３０％、例えば、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。
【0116】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡの足場領域は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する。例えば、約８０ヌクレオチド長の足場領域は、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを有することがある。場合によっては、足場領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。他の例では、足場領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、足場領域の任意の核酸位置に位置することがある。例えば、修飾ヌクレオチドは、足場領域の第１および／もしくは最後のヌクレオチドもしくはその近く、ならびに／またはそれらの間の任意の位置にありうる。例えば、約８０ヌクレオチド長である足場領域について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、配列の核酸位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９、位置２０、位置２１、位置２２、位置２３、位置２４、位置２５、位置２６、位置２７、位置２８、位置２９、位置３０、位置３１、位置３２、位置３３、位置３４、位置３５、位置３６、位置３７、位置３８、位置３９、位置４０、位置４１、位置４２、位置４３、位置４４、位置４５、位置４６、位置４７、位置４８、位置４９、位置５０、位置５１、位置５２、位置５３、位置５４、位置５５、位置５６、位置５７、位置５８、位置５９、位置６０、位置６１、位置６２、位置６３、位置６４、位置６５、位置６６、位置６７、位置６８、位置６９、位置７０、位置７１、位置７２、位置７３、位置７４、位置７５、位置７６、位置７７、位置７８、位置７９、および／または位置８０に位置しうる。場合によっては、足場領域の約１％～約１０％、例えば、約１％～約８％、約１％～約５％、約５％～約１０％、または約３％～約７％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。他の例では、足場領域の約１％～約１０％、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。
【0117】
ガイドＲＮＡの修飾ヌクレオチドは、リボース（例えば、糖）基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの任意の組合せに修飾を含むことがある。一部の実施形態では、リボース基における修飾は、リボースの２’位に修飾を含む。
【0118】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、トリサイクル（ｔｒｉｃｙｃｌｅ）－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、またはそれらの組合せを含む。
【0119】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、糖修飾および／または骨格修飾リボヌクレオチド（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾を含む）を含むことがある。例えば、ネイティブなまたは天然ＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾されることがある。いくつかの骨格修飾されたリボヌクレオチドのうち、隣接リボヌクレオチドを接続しているホスホエステル基は、修飾基、例えば、ホスホロチオエート基によって置き換えられることがある。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基であり、ここで、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【0120】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは糖修飾を含有する。糖修飾の非限定的な例には、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、およびそれらの組合せが含まれる。
【0121】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の２’－フルオロ、２’－アミノおよび／または２’－チオ修飾を含有する。場合によっては、修飾は、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、および／または５－フルオロ－ウリジンである。
【0122】
９６個よりも多い天然に存在するヌクレオシド修飾が哺乳動物ＲＮＡに見出される。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（１２）：２１８３～２１９６（１９９４）を参照されたい。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよびヌクレオシドの調製は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号に記載されている。本明細書に記載される使用に適した数多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、市販されている。ヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドの類似体でありうる。場合によっては、類似体は、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルウリジン、メチルシュードウリジン、チオウリジン、デオキシシチジン（ｄｅｏｘｙｃｙｔｏｄｉｎｅ）、およびデオキシウリジンである。
【0123】
場合によっては、本明細書に記載される修飾ガイドＲＮＡは、核塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核塩基を含有するリボヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドに組み込むことができる修飾核塩基の非限定的な例には、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）、ｍ’Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（低修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（キューオシン）、ｏＱ（エポキシキューオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）－キューオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アーキオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２－Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、およびそれらの組合せが含まれる。
【0124】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのリン酸骨格は変更される。修飾ｇＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート（ＮＰ））、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、および／またはメチルホスホネート連結を含むことがある。
【0125】
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列の修飾ヌクレオチドのうちの１つもしくは複数および／または足場領域の修飾ヌクレオチドの１つもしくは複数は、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドを含む。他の例では、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数のＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドを含む。さらに他の例では、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドおよび１つまたは複数のＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドを含む。さらなる例では、ガイドＲＮＡはＭヌクレオチドを含まない。場合によっては、ガイドＲＮＡは、１つもしくは複数のＭＳヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数のＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドを含み、１つまたは複数のＭヌクレオチドをさらに含む。ある特定の他の例では、ＭＳヌクレオチドおよび／またはＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドだけが、ガイドＲＮＡに存在する修飾ヌクレオチドである。
【0126】
一部の態様では、本明細書に記載される修飾ガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（またはそれをコードするｍＲＮＡ）は、組成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ反応混合物）中に、特定の量、比、または範囲で存在することがある。例えば、反応混合物は、ａ）１～２００ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ；ｂ）１～１００ｐｍｏｌのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする０．０１～３．０ｐｍｏｌのＤＮＡもしくはｍＲＮＡ；ｃ）０．１：１～３：１のモル比のガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質；ならびに／またはｄ）１：１～２００：１のモル比のガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡを含みうる。例えば、一部の態様では、反応混合物は複数の細胞と；ｉ）細胞１００，０００個あたり１～１００ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ（もしくはｐｅｇＲＮＡ）、および／またはｉｉ）細胞１００，０００個あたり１～５０ｐｍｏｌのＣａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質をコードする０．０１～３．０ｐｍｏｌのＤＮＡもしくはｍＲＮＡとを含む。同様に、一部の態様では、反応混合物は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ １ｐｍｏｌあたり少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｐｍｏｌ、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｐｍｏｌ、または最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ、または前記値の任意の組合せによって境界が定められる範囲内の量を含みうる。一部の態様では、ガイドＲＮＡの、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに対するモル比は、少なくとも２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、もしくは１０：１、約２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、もしくは１０：１、または最大で２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、もしくは１０：１、または前記比の任意の組合せによって境界が定められる範囲内の比である。一部の態様では、本開示による反応混合物は、１ｐｍｏｌのＣａｓタンパク質あたり少なくとも１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３．０ｐｍｏｌ、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３．０ｐｍｏｌ、または最大で１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３．０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ、または前記値の任意の組合せによって境界が定められる範囲内の量を含む。
【0127】
修飾ｇＲＮＡのガイド配列および／または足場領域内に、本明細書に記載される修飾のいずれかが組合せおよび組込みされうることに留意すべきである。
【0128】
場合によっては、ガイドＲＮＡはまた、ステムループ、例えば、ＭＳ２ステムループまたはテトラループなどの構造修飾を含む。
【0129】
ガイドＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって合成することができる。修飾ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用して合成することができる。方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３、１１５４０～１１５５６（２０１１）；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌら、Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、７４６～７５４（２０１２）；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５、９４０～９５０（２００３）に記載されている。
【0130】
化学修飾ｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡは、任意のＣＲＩＳＰＲ関連技術、例えば、ＲＮＡガイド技術を用いて使用することができる。本明細書に記載される場合、ガイドＲＮＡは、任意の操作されたまたは人工のＣａｓ９ポリペプチドを含む任意のＣａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは断片のためのガイドとして役立ちうる。修飾ｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡは、エクスビボ療法またはインビボ（例えば、動物における）のための単離された初代細胞におけるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を標的とすることができる。本明細書に開示される方法は、ゲノム編集、遺伝子調節、イメージング、および任意の他のＣＲＩＳＰＲベースの適用に適用することができる。
【0131】
３．ドナー修復鋳型
一部の実施形態では、本開示は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）切断部位の両側に、標的ＤＮＡ配列（例えば、標的遺伝子または座位）の部分と相同の２つのホモロジーアームを含む組換えドナー修復の鋳型を提供する。場合によっては、組換えドナー修復鋳型は、レポーターポリペプチド（例えば、検出可能なポリペプチド、蛍光ポリペプチド、または選択マーカー）をコードするヌクレオチド配列を含むレポーターカセットと、レポーターカセットに隣接し、Ｃａｓタンパク質切断部位の両側で標的ＤＮＡの部分と相同である２つのホモロジーアームとを含む。レポーターカセットは、自己切断ペプチド、１つもしくは複数の核移行シグナル、および／または蛍光ポリペプチド、例えばスーパーフォールダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）をコードする配列をさらに含みうる。
一部の実施形態では、本開示は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）切断部位の両側に、標的ＤＮＡ配列（例えば、標的遺伝子または座位）の部分と相同の２つのホモロジーアームを含む組換えドナー修復の鋳型を提供する。場合によっては、組換えドナー修復鋳型は、レポーターポリペプチド（例えば、検出可能なポリペプチド、蛍光ポリペプチド、または選択マーカー）をコードするヌクレオチド配列を含むレポーターカセットと、レポーターカセットに隣接し、Ｃａｓタンパク質切断部位の両側で標的ＤＮＡの部分と相同である２つのホモロジーアームとを含む。レポーターカセットは、自己切断ペプチド、１つもしくは複数の核移行シグナル、および／または蛍光ポリペプチド、例えばスーパーフォールダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）をコードする配列をさらに含みうる。
【0132】
一部の実施形態では、ホモロジーアームは同じ長さである。他の実施形態では、ホモロジーアームは異なる長さである。ホモロジーアームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４５ｂｐ、５５ｂｐ、６５ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１．１キロ塩基（ｋｂ）、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、またはそれよりも長いことがある。ホモロジーアームは、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ～約２０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０ｂｐ～約２００ｂｐ、約１０ｂｐ～約５００ｂｐ、約１０ｂｐ～約１ｋｂ、約１０ｂｐ～約２ｋｂ、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１ｋｂ、約１００ｂｐ～約２ｋｂ、約１００ｂｐ～約４ｋｂ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約５００ｂｐ～約２ｋｂ、約５００ｂｐ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、または約２ｋｂ～約４ｋｂのことがある。
【0133】
ドナー修復鋳型を、発現ベクター内にクローニングすることができる。当業者に公知の従来のウイルスおよび非ウイルスベースの発現ベクターを使用することができる。
【0134】
組換えドナー修復鋳型の代わりに、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナー鋳型を、相同組換え媒介修復のために使用することができる。ｓｓＯＤＮは、標的ＤＮＡ内に短い修飾を導入するために有用である。例えば、ｓｓＯＤＮは、ＳＮＰなどの遺伝子変異を正確に修正するために適している。ｓｓＯＤＮは、Ｃａｓタンパク質の切断の標的部位の各々の側に２つの隣接相同配列を含有することがあり、標的ＤＮＡに対してセンス方向またはアンチセンス方向に配向することがある。各隣接配列は、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、４ｋｂ、またはそれよりも長いことがある。一部の実施形態では、各ホモロジーアームは、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ～約２０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０ｂｐ～約２００ｂｐ、約１０ｂｐ～約５００ｂｐ、約１０ｂｐ～約１ｋｂ、約１０ｂｐ～約２ｋｂ、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１ｋｂ、約１００ｂｐ～約２ｋｂ、約１００ｂｐ～約４ｋｂ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約５００ｂｐ～約２ｋｂ、約５００ｂｐ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、または約２ｋｂ～約４ｋｂである。ｓｓＯＤＮは、少なくとも約２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば、少なくとも約２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、８０ｎｔ、８５ｎｔ、９０ｎｔ、９５ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、またはそれよりも長いことがある。一部の実施形態では、ｓｓＯＤＮは、約２５～約５０；約５０～約１００；約１００～約１５０；約１５０～約２００；約２００～約２５０；約２５０～約３００；または約２５ｎｔ～約３００ｎｔ長である。
【0135】
一部の実施形態では、ｓｓＯＤＮ鋳型は、本明細書に記載される少なくとも１つ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。場合によっては、ｓｓＯＤＮの配列の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％は、修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ｓｓＯＤＮの末端の一方または両方に位置する。修飾ヌクレオチドは、末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０番目のヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せでありうる。例えば、修飾ヌクレオチドは、ｓｓＯＤＮ鋳型の両末端での３つの末端ヌクレオチドにありうる。追加的に、修飾ヌクレオチドは、末端に対して内部に位置することがある。
【0136】
一部の態様、例えばプライム編集では、外因性ＤＮＡ修復鋳型は必要ない。例えば、本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡは、標的核酸に対する１つまたは複数の編集を含有する逆転写酵素配列を（例えば、プライマー結合部位配列に近接した３’末端に）含み、それが、標的核酸のプライム編集を行う場合にプライムエディターＣａｓタンパク質によって鋳型として使用される。
【0137】
４．標的ＤＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡ配列の直後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列がありうる。標的ＤＮＡ部位は、使用されるＣａｓタンパク質Ｃａｓ９の細菌種に特異的なＰＡＭ配列の５’に直接位置することがある。例えば、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧであり；ナイセリア メニンギティディス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり；ストレプトコッカス サーモフィルス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡであり；トレポネーマ デンティコラ由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ（Ｎは任意のヌクレオチドである）；５’－ＮＲＧ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）；または５’－ＮＮＧＲＲ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）でありうる。化膿性連鎖球菌システムについて、選択された標的ＤＮＡ配列は、５’ＮＧＧ ＰＡＭの直前（例えば５’に位置する）にあるべきであり（Ｎは任意のヌクレオチドである）、それにより、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のガイド配列は、反対鎖と塩基対を形成して、ＰＡＭ配列の約３塩基対上流で切断を媒介する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡ配列の直後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列がありうる。標的ＤＮＡ部位は、使用されるＣａｓタンパク質Ｃａｓ９の細菌種に特異的なＰＡＭ配列の５’に直接位置することがある。例えば、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧであり；ナイセリア メニンギティディス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり；ストレプトコッカス サーモフィルス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡであり；トレポネーマ デンティコラ由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ（Ｎは任意のヌクレオチドである）；５’－ＮＲＧ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）；または５’－ＮＮＧＲＲ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）でありうる。化膿性連鎖球菌システムについて、選択された標的ＤＮＡ配列は、５’ＮＧＧ ＰＡＭの直前（例えば５’に位置する）にあるべきであり（Ｎは任意のヌクレオチドである）、それにより、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のガイド配列は、反対鎖と塩基対を形成して、ＰＡＭ配列の約３塩基対上流で切断を媒介する。
【0138】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）のガイド配列とその対応する標的ＤＮＡ配列との相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上、または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上よりも大きい。最適なアライメントは、配列をアライメントするために適した任意のアルゴリズムを使用して決定されることがあり、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅｌａｎｇｏｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ）、およびＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【0139】
標的ＤＮＡ部位は、ＺｉＦｉＴ Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Ｓａｎｄｅｒら、２００７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５：５９９～６０５；Ｓａｎｄｅｒら、２０１０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３８：４６２～４６８）、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（Ｈｅｉｇｗｅｒら、２０１４、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１：１２２～１２３）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｂａｅら、２０１４、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３０（１０）：１４７３～１４７５）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（Ａａｃｈら、２０１４、ｂｉｏＲｘｉｖ）、ＤＮＡ２．０ ｇＮＲＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＣＲＩＳＰｉｃｋ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）などのウェブベースソフトウェアを使用して前定義されたゲノム配列（遺伝子）内から選択することができる。このようなツールは、ゲノム配列（例えば、目的の遺伝子または座位）を解析し、遺伝子編集に適した標的部位を特定する。各々のＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のためのオフターゲット遺伝子修飾を判定するために、オフターゲット部位のコンピュータ予測は、塩基対形成ミスマッチの同一性、位置および分布の量的特異性解析に基づき行われる。
【0140】
５．遺伝子発現をモジュレートする
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子発現を阻害することまたは遺伝子発現を活性化することなどの遺伝子発現を調節するために使用されることがある。非限定的な例として、Ｃａｓ９バリアントまたは断片と、標的ＤＮＡ配列と結合することができるｇＲＮＡとを含む複合体は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始および／伸長を遮断または妨害することができる。これは、今度は、標的ＤＮＡの遺伝子発現を阻害または抑制することができる。または、異なるＣａｓ９バリアントまたは断片と、標的ＤＮＡ配列と結合することができるｇＲＮＡとを含む複合体は、標的ＤＮＡの遺伝子発現を誘導または活性化することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子発現を阻害することまたは遺伝子発現を活性化することなどの遺伝子発現を調節するために使用されることがある。非限定的な例として、Ｃａｓ９バリアントまたは断片と、標的ＤＮＡ配列と結合することができるｇＲＮＡとを含む複合体は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始および／伸長を遮断または妨害することができる。これは、今度は、標的ＤＮＡの遺伝子発現を阻害または抑制することができる。または、異なるＣａｓ９バリアントまたは断片と、標的ＤＮＡ配列と結合することができるｇＲＮＡとを含む複合体は、標的ＤＮＡの遺伝子発現を誘導または活性化することができる。
【0141】
遺伝子発現を不活性化または低減するためにＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を行うための方法の詳細な説明は、例えば、Ｌａｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１３、８（１１）：２１８０～２１９６、およびＱｉら、Ｃｅｌｌ、１５２、２０１３、１１７３～１１８３に見出すことができる。ＣＲＩＳＰＲｉでは、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９バリアント複合体は、タンパク質－コード領域の非テンプレート鎖と結合し、転写伸長を遮断することができる。場合によっては、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９バリアント複合体が遺伝子のプロモーター領域と結合する場合、複合体は、転写開始を防止または妨害する。
【0142】
遺伝子発現を増大させるためにＣＲＩＳＰＲ活性化を行うための方法の詳細な説明は、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３、２３：１１６３～１１７１、Ｋｏｎｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１５、５１７：５８３～５８８、および米国特許第８，６９７，３５９号に見出すことができる。
【0143】
遺伝子発現のＣＲＩＳＰＲベースの制御のために、ヌクレオチド鎖内切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を欠如するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）の触媒不活性バリアントを使用することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様およびＨＮＨヌクレアーゼドメインに少なくとも２つの点変異を含有するＣａｓ９バリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｄＣａｓ９と称されるＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａアミノ酸置換を有する（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ、１５２（５）：１１７３～１１８３）。場合によっては、化膿性連鎖球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７またはそれらの任意の組合せに少なくとも１つの変異を含む。このようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそれらのバリアントの説明は、例えば、国際特許出願公報番号ＷＯ２０１３／１７６７７２に提供される。ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６での変異のみならず、Ｈ８４０またはＮ８６３での変異を含有しうる。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ変異を含有する。また、ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含むことがある。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎ置換を含む。置換は、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的に不活性にし、標的ＤＮＡと結合できるようにするために保存的または非保存的置換でありうる。
【0144】
ある特定の実施形態では、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、触媒的に不活性であり、例えばヌクレアーゼ活性を欠損する。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を遮断し、場合によってはＲＮＡポリメラーゼを遮断することができる。他の例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を活性化することができる。
【0145】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド鎖内切断活性を欠如するＣａｓ９バリアント（例えば、ｄＣａｓ９）を転写抑制ドメイン、例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、または転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメインと融合することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｄＣａｓ９および転写因子、例えば、ＲＮＡポリメラーゼオメガ因子、熱ショック因子１、またはそれらの断片を含む融合ポリペプチドである。他の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｄＣａｓ９およびＤＮＡメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、またはその断片を含む融合ポリペプチドである。
【0146】
ＲＮＡ結合および／またはＲＮＡ切断によって媒介される遺伝子発現のＣＲＩＳＰＲベースの制御のために、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５１６：２６３～２６６に記載されるようなエンドリボヌクレアーゼ活性を有する適切なＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）バリアントを使用することができる。他の有用なＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）バリアントは、例えば、米国特許第９，７４５，６１０号に記載されている。ＲＮＡを切断することができる他のＣＲＩＳＰＲ関連酵素には、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ６酵素、Ｃａｓ５ファミリーメンバー酵素、Ｃａｓ６ファミリーメンバー酵素、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、およびそれらのバリアントが含まれる。
【0147】
ＣＲＩＳＰＲベースのＲＮＡ切断の一部の実施形態では、ＰＡＭ配列を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＡＭｍｅｒ）は、一本鎖ＲＮＡ転写物と結合し、それを切断するために、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）バリアントと共に使用される。適切なＰＡＭｍｅｒ配列の詳細な説明は、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５１６：２６３－２６６に見出される。
【0148】
一部の実施形態では、複数の修飾ｇＲＮＡおよび／またはｐｅｇＲＮＡは、標的遺伝子の異なる領域を標的として、その標的遺伝子の遺伝子発現を調節するために使用される。複数の修飾ｇＲＮＡおよび／またはｐｅｇＲＮＡは、各々の修飾されたｇＲＮＡ単独と比較して単一の標的遺伝子の遺伝子発現の相乗的モジュレーション（例えば、阻害または活性化）を提供することができる。他の実施形態では、複数の修飾ｇＲＮＡ／ｐｅｇＲＮＡは、少なくとも２つの異なる標的遺伝子の遺伝子発現を調節するために使用される。
【0149】
Ｂ．エクスビボの細胞
本方法の一部の態様では、標的配列は細胞内にある。本方法を使用して、初代細胞、不死化細胞、細胞系由来の細胞、細胞培養物由来の細胞、およびその他を含む目的の任意の細胞内の核酸における標的配列を編集する、モジュレートする、切断する、それにニックを入れる、またはそれと結合させることができる。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは厳しい状況を有する細胞型、例えば、高いヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ）の発現、濃度および／または活性を有する細胞、例えば、特定のヌクレアーゼが高い細胞型である。
本方法の一部の態様では、標的配列は細胞内にある。本方法を使用して、初代細胞、不死化細胞、細胞系由来の細胞、細胞培養物由来の細胞、およびその他を含む目的の任意の細胞内の核酸における標的配列を編集する、モジュレートする、切断する、それにニックを入れる、またはそれと結合させることができる。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは厳しい状況を有する細胞型、例えば、高いヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ）の発現、濃度および／または活性を有する細胞、例えば、特定のヌクレアーゼが高い細胞型である。
【0150】
本明細書に開示される組成物および方法を使用して、目的の初代細胞における標的核酸の発現を編集または調節することができる。初代細胞は、任意の多細胞生物から単離された細胞、例えば、植物細胞（例えば、イネ細胞、コムギ細胞、トマト細胞、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）細胞、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞など）、多細胞原生生物からの細胞、多細胞性真菌からの細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）からの細胞または脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）からの細胞、ヒトからの細胞、健康なヒトからの細胞、ヒト患者からの細胞、がん患者からの細胞などでありうる。場合によっては、ゲノム編集または誘導遺伝子調節を有する初代細胞を対象（例えば患者）に移植することができる。例えば、初代細胞は、処置すべき対象（例えば、患者）に由来することがある。
【0151】
任意の型の初代細胞、例えば、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、臓器幹細胞）、前駆細胞、体細胞（例えば、線維芽細胞、肝実質細胞、心臓細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋細胞、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、免疫細胞）、および身体、例えばヒト身体の任意の他の細胞が、目的の細胞でありうる。初代細胞は、典型的には対象、例えば、動物対象またはヒト対象に由来し、限られた継代数の間、インビトロで成長させられる。一部の実施形態では、細胞は疾患細胞である、または疾患を有する対象に由来する。例えば、細胞はがん細胞または腫瘍細胞でありうる。
【0152】
初代細胞は、任意の標準的な方法によって対象から回収することができる。例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織からの細胞を、組織生検または細針吸引によって回収することができる。血液細胞および／または免疫細胞は、全血、血漿または血清から単離することができる。場合によっては、適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセット、例えば以下に限定されないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ、または非多能性幹細胞が含まれる。場合によっては、細胞は、以下に限定されないが、任意のＴ細胞、例えば腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、または任意の他の型のＴ細胞を含む任意の免疫細胞でありうる。Ｔ細胞はまた、メモリーＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、またはエフェクターＴ細胞を含みうる。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に偏ることがある。例えば、表現型が偏ることがあるＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）を含む。ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）を含むリストから選択される１つまたは複数のマーカーを含む適切な細胞を選択することができる。人工多能性幹細胞は、例えば、米国特許第７，６８２，８２８号、同第８，０５８，０６５号、同第８，５３０，２３８号、同第８，８７１，５０４号、同第８，９００，８７１号および同第８，７９１，２４８号に記載された標準的なプロトコールにより分化細胞から生成しうる。
【0153】
Ｃ．エクスビボ療法
本明細書に記載される方法は、エクスビボ療法に使用することができる。エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された組成物（例えば、細胞）を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがある。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって組成物（例えば、細胞を含む）を生成または修飾することができる。例えば、エクスビボ療法は、生物の外側で生成または修飾された初代細胞を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがあり、ここで、初代細胞は、初代細胞における標的核酸を、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと接触させることを含む本開示の方法によりインビトロで培養され、編集／モジュレートされている。
本明細書に記載される方法は、エクスビボ療法に使用することができる。エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された組成物（例えば、細胞）を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがある。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって組成物（例えば、細胞を含む）を生成または修飾することができる。例えば、エクスビボ療法は、生物の外側で生成または修飾された初代細胞を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがあり、ここで、初代細胞は、初代細胞における標的核酸を、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと接触させることを含む本開示の方法によりインビトロで培養され、編集／モジュレートされている。
【0154】
一部の実施形態では、組成物（例えば、細胞）は、エクスビボ療法により処置すべき対象（例えば、患者）に由来しうる。一部の実施形態では、エクスビボ療法は、養子免疫療法などの細胞ベースの療法を含みうる。
【0155】
一部の実施形態では、エクスビボ療法に使用される組成物は細胞でありうる。細胞は、以下に限定されないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセットを含む初代細胞でありうる。初代細胞は、免疫細胞でありうる。初代細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞もしくは非多能性幹細胞、幹細胞、または前駆細胞でありうる。初代細胞は、造血幹または前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでありうる。初代細胞はヒト細胞でありうる。初代細胞は、単離、選択、および／または培養することができる。初代細胞は、エクスビボで拡大増殖させることができる。初代細胞は、インビボで拡大増殖させることができる。初代細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）でありうる。初代細胞は、細胞を受け入れている対象に対して自己でありうる。または初代細胞は、対象に対して非自己でありうる。初代細胞は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則（ＧＭＰ）に適合する試薬でありうる。初代細胞は、がん、感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む疾患を、このような疾患を有するまたはそのリスクのある対象において処置するための併用療法の一部でありうる。
【0156】
エクスビボ療法の非限定的な例として、初代細胞は、初代細胞内の標的核酸をＣａｓタンパク質および修飾ｇＲＮＡと接触させる前に、多細胞生物（例えば、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、無脊椎動物、脊椎動物、例えばヒトなど）から単離することができる。標的核酸をＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡと接触させた後、初代細胞またはその後代（例えば、初代細胞に由来する細胞）を多細胞生物に戻すことができる。
【0157】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、生きた生物中またはそれに由来する血清含有液（例えば、全血、血漿または血清）への導入などによって、生きた生物に導入される。
【0158】
Ｄ．核酸および／またはポリペプチドを標的細胞に導入するための方法
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）に導入するための方法は、当技術分野において公知であり、核酸（例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、修飾ガイドＲＮＡ、相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのドナー修復鋳型など）、ポリペプチド（Ｃａｓタンパク質、ポリメラーゼ、デアミナーゼなど）、またはＲＮＰ（例えばｇＲＮＡ／Ｃａｓタンパク質複合体）を細胞、例えば、幹細胞、前駆細胞、または分化した細胞などの初代細胞に導入するために本方法に採用することができる。適切な方法の非限定的な例には、電気穿孔、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、微量注入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介送達（例えば、脂質ナノ粒子媒介送達、ポリマーナノ粒子媒介送達、ハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子媒介送達）、その他が含まれる。
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）に導入するための方法は、当技術分野において公知であり、核酸（例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、修飾ガイドＲＮＡ、相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのドナー修復鋳型など）、ポリペプチド（Ｃａｓタンパク質、ポリメラーゼ、デアミナーゼなど）、またはＲＮＰ（例えばｇＲＮＡ／Ｃａｓタンパク質複合体）を細胞、例えば、幹細胞、前駆細胞、または分化した細胞などの初代細胞に導入するために本方法に採用することができる。適切な方法の非限定的な例には、電気穿孔、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、微量注入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介送達（例えば、脂質ナノ粒子媒介送達、ポリマーナノ粒子媒介送達、ハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子媒介送達）、その他が含まれる。
【0159】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、送達システムを使用して細胞内に導入することができる。場合によっては、送達システムは、送達すべき構成要素を含むナノ粒子、マイクロ粒子（例えば、ポリマーマイクロポリマー）、リポソーム、ミセル、ビロソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、核酸複合体、トランスフェクション剤、電気穿孔剤（例えば、ＮＥＯＮトランスフェクションシステムを使用する）、ヌクレオフェクション剤、リポフェクション剤、および／または緩衝剤システムを含む。例えば、構成要素は、陽イオン性サブミクロン水中油型エマルジョンに封入またはパッケージングされるようにリポフェクション剤と混合することができる。または、構成要素は、送達システムなしに、例えば水溶液として送達することができる。
【0160】
リポソームを調製し、ポリペプチドおよび核酸をリポソームに封入する方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９およびＨｅｙｅｓら（２００５）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６～８７に記載されている。マイクロ粒子を調製し、ポリペプチドおよび核酸を封入する方法は、例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、（ＡｒｓｈａｄｙおよびＧｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ、２００２およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、（ＣｏｈｅｎおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６に記載されている。脂質、ポリマーまたはハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子などのナノ粒子の調製に関する総説についてはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０２１、第１６８巻を参照されたい。
【0161】
Ｅ．ゲノム編集の効率を判定する方法
正しいゲノム編集修飾の存在を機能的に試験するために、標的ＤＮＡを当業者に公知の標準的な方法によって分析することができる。例えば、インデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）またはＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を使用する配列決定によって同定することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）、塩基編集またはプライム編集媒介編集をＰＣＲベースの方法によって、および配列決定またはＲＦＬＰ解析と組み合わせて検出することができる。ＰＣＲベースのキットの非限定的な例には、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ変異検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ゲノム切断検出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。特に多数の試料または潜在的標的／オフターゲット部位についてディープシーケンシングも使用することができる。
正しいゲノム編集修飾の存在を機能的に試験するために、標的ＤＮＡを当業者に公知の標準的な方法によって分析することができる。例えば、インデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）またはＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を使用する配列決定によって同定することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）、塩基編集またはプライム編集媒介編集をＰＣＲベースの方法によって、および配列決定またはＲＦＬＰ解析と組み合わせて検出することができる。ＰＣＲベースのキットの非限定的な例には、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ変異検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ゲノム切断検出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。特に多数の試料または潜在的標的／オフターゲット部位についてディープシーケンシングも使用することができる。
【0162】
ある特定の実施形態では、ゲノム編集の効率（例えば、特異性）は、オンターゲットおよびオフターゲット事象を含むすべてのゲノム編集事象の数またはパーセントに対するオンターゲットゲノム編集事象の数またはパーセントに対応する。一部の実施形態では、標的領域の編集効率は、単一細胞または細胞集団のレベルでその標的領域の予期される編集数に対応する。
【0163】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、対応する未修飾ｇＲＮＡと比べて初代細胞などの細胞において標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を強化することができる。ゲノム編集は、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、挿入、欠失、もしくは点変異）、プライム編集、塩基編集、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むことがある。
【0164】
ある特定の実施形態では、細胞における標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介ゲノム編集効率は、対応する未修飾ｇＲＮＡ配列と比較して、本明細書に記載されるガイドＲＮＡの存在下で少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、またはそれよりも大きく高まる。一部の他の実施形態では、効率は、異なる修飾を有する対応するｇＲＮＡと比較され、上記の強化レベルを達成する。例えば、５’末端での１ｘ、２ｘ、または３ｘＭＳのみならず、３’末端に２ｘ、３ｘ、または４ｘＭＰまたはＭＳＰを有するｇＲＮＡが、ＭＰ／ＭＳＰの代わりに同じ数のＭＳを有するｇＲＮＡと比較されることがある（すなわち、５’末端での１ｘ、２ｘ、または３ｘＭＳのみならず、３’末端での２ｘ、３ｘ、または４ｘＭＳ）。
【0165】
Ｆ．対象における遺伝性疾患を予防または処置する方法
修飾ｇＲＮＡを、遺伝性疾患の標的化されたヌクレアーゼベースの治療法に適用することができる。初代患者細胞のゲノムにおける遺伝子変異を正確に修正するための現行のアプローチは、非常に効率的でありうる（細胞の１％未満を正確に編集できるときがある）。本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ゲノム編集の活性を高め、ゲノム編集ベース療法の有効性を増大させることができる。特定の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、遺伝性疾患を有する対象における遺伝子のインビボ遺伝子編集のために使用されることがある。修飾ｇＲＮＡは、任意の適切な投与経路を介して、ヌクレアーゼベースの療法の効果を高める（例えば、ゲノム編集効率を改善する）のに十分な用量または量で対象に投与することができる。
修飾ｇＲＮＡを、遺伝性疾患の標的化されたヌクレアーゼベースの治療法に適用することができる。初代患者細胞のゲノムにおける遺伝子変異を正確に修正するための現行のアプローチは、非常に効率的でありうる（細胞の１％未満を正確に編集できるときがある）。本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ゲノム編集の活性を高め、ゲノム編集ベース療法の有効性を増大させることができる。特定の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、遺伝性疾患を有する対象における遺伝子のインビボ遺伝子編集のために使用されることがある。修飾ｇＲＮＡは、任意の適切な投与経路を介して、ヌクレアーゼベースの療法の効果を高める（例えば、ゲノム編集効率を改善する）のに十分な用量または量で対象に投与することができる。
【0166】
遺伝性疾患に関連する遺伝子変異を修正することによって、それを必要とする対象における当該疾患を予防または処置する方法が、本明細書に提供される。方法は、変異を修正するのに十分な量の本明細書に記載される修飾ガイドＲＮＡを対象に投与することを含む。遺伝性疾患に関連する遺伝子変異を修正することによって、それを必要とする対象における当該疾患を予防または処置するための医薬の製造への、本明細書に記載される修飾ガイドＲＮＡの使用も、本明細書に提供される。修飾ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓポリペプチド）、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも含む組成物中に含有されうる。場合によっては、修飾ガイドＲＮＡは、上記の送達システムに含まれる。
【0167】
方法によって修正されることがある遺伝性疾患には、これらに限定されないが、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、新形成、がん、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチド反復障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物嗜癖、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液および凝固疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝疾患および障害、腎疾患および障害、筋／骨格疾患および障害（例えば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、神経および神経細胞疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、眼疾患および障害、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）などが含まれる。
【実施例】
【0168】
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、これらの実施例は、本教示の範囲を何らかの点で限定するものと理解すべきではない。
【0169】
本明細書における教示により、調製、試験および他の詳細において変形および代替が採用されうると理解すべきであるが、様々な一般的な方法および試薬が以下の実施例に使用され、実施例の理解を促すために下に説明される。
【0170】
ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製。以前に記載された手順により、Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ ４８および９６合成装置（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いて、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅ）を使用して制御孔ガラス（ＬＧＣ）上にＲＮＡオリゴマーを合成した。ＭＰ修飾されたＲＮＡを合成するために使用した２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）－ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドをＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅから購入した。ホスホロチオエート含有オリゴマーについて、カップリング反応後のヨウ素酸化ステップを、３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのピリジン－アセトニトリル（３：２）混液中０．０５Ｍ溶液を使用する６分間の硫化ステップによって置き換えた。特に述べない限り、固相ＲＮＡ合成のための試薬をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌから購入した。以前の刊行物（例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、２００３およびＴｈｒｅｌｆａｌｌら、２０１２、上記を参照されたい）から適合させたプロトコールを使用して、上記の市販の保護ヌクレオシドホスフィノアミダイトモノマーを使用することによって、ＭＰ修飾されたｇＲＮＡに組み込まれたホスホノアセテート修飾を合成した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用してすべてのオリゴヌクレオチドを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析機と結合されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＬＣシステムを使用する液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。すべての場合で、精製ｇＲＮＡの質量スペクトルにおいて複数の荷電状態を含む一連のピークの逆畳み込みによって決定された質量は、較正された機器の誤差の範囲内で予想質量とマッチし（このアッセイに使用される品質保証のための規格は、精製ｇＲＮＡの観測質量が計算質量の０．０１％内であることである）、したがって、各合成ｇＲＮＡの組成が確認された。
【0171】
５－メトキシウリジンで全置換されたＣｌｅａｎＣａｐ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ（Ｌ－７２０６）から購入した。提供したコード配列にＴｒｉＬｉｎｋが独自の専売５’および３’ＵＴＲを付加することによって、それぞれＢＥ４－Ｇａｍタンパク質およびＰＥ２タンパク質をコードするＢＥ４－Ｇａｍ ｍＲＮＡおよびＰＥ２ ｍＲＮＡを特注としてＴｒｉＬｉｎｋから購入した。注文のｍＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に置換されており、ＣｌｅａｎＣａｐ ＡＧのキャップおよびポリＡテールを有した。
【0172】
細胞培養およびヌクレオフェクション。ヒトＫ５６２細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎仔血清（ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ培地（ｇｉｂｃｏ）中で培養した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（９６ウェルシャトルデバイス、プログラムＦＦ－１２０）を製造業者の使用説明書により使用して、Ｌｏｎｚａ ＳＦ細胞系キット（Ｖ４ＳＣ－２９６０）を利用し、シチジン塩基編集のためのＰＢＳ緩衝液中１２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡおよび１．８７ｐｍｏｌのＢＥ４－Ｇａｍ ｍＲＮＡ ６μＬと組み合わせた、またはプライム編集のためのＰＢＳ緩衝液中１００ｐｍｏｌのニッキングｇＲＮＡおよび１．３５ｐｍｏｌのＰＥ２ ｍＲＮＡを有する１２５ｐｍｏｌのｐｅｇＲＮＡ ８μＬと組み合わせた、ＳＦ緩衝液２０μＬ中でトランスフェクション１回あたり２０万個の細胞を用いてＫ５６２細胞（継代数４～１４以内）にヌクレオフェクションを行った。環境酸素および５％二酸化炭素中、３７℃で細胞を培養し、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。
【0173】
ヒトＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ培地中で培養した。ＰＢＳ緩衝剤中１２５ｐｍｏｌのｐｅｇＲＮＡ、１００ｐｍｏｌのニッキングｇＲＮＡおよび１．３５ｐｍｏｌのＰＥ２ ｍＲＮＡ ８μＬと組み合わせたＳＥ緩衝液２０μＬ中で２０万個の細胞を用いてＬｏｎｚａ ＳＥ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅキット（Ｖ４ＳＣ－１９６０）を利用してＪｕｒｋａｔ細胞（継代数７～２０以内）にヌクレオフェクションを行った（プログラムＣＬ－１２０）。トランスフェクションの７２時間後に培養細胞を回収した。
【0174】
ヒトＨｅｐＧ２細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋Ｌ－グルタミン＋４．５ｇ／Ｌ Ｄ－グルコース培地（ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞（継代数４～１３以内）を培地から遠心沈殿し、ＰＢＳによるすすぎを行うか、または行わず、再度遠心沈殿した。ＰＢＳ緩衝液中１０ｐｍｏｌのｇＲＮＡおよび０．０６２５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡ ３μＬと組み合わせたＳＦ緩衝液２０μＬ中２０万個の細胞を用いて、Ｌｏｎｚａ ＳＦ細胞系キット（Ｖ４ＳＣ－２９６０）を利用して細胞にヌクレオフェクションを行った（プログラムＥＨ－１００）か、またはＳＦ緩衝液２０μＬ中２０万個の細胞を、ＰＢＳ緩衝液中３０ｐｍｏｌのｇＲＮＡおよび０．５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡまたは１２．５ｐｍｏｌの化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質（Ａｌｄｅｖｅｒｏｎ）５μＬと組み合わせることによって残留血清の存在下でヌクレオフェクションを行った。１６３残基ｇＲＮＡについて、これらを、ＰＢＳ緩衝液中１２５ｐｍｏｌの１６３残基ｇＲＮＡおよび５０ｐｍｏｌのＳｐＣａｓ９タンパク質５μＬと組み合わせることによって、残留血清およびＳＦ緩衝液の存在下で２０万個の細胞に同様にヌクレオフェクションを行った。すべてのＲＮＰトランスフェクションについて、ヌクレオフェクションのためにＳＦ緩衝液中で細胞と組み合わせる前に組み合わせ、室温で約２０分間インキュベートすることによって、ＰＢＳ緩衝液中でＳｐＣａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）とｇＲＮＡを予備複合体化した。ｍＲＮＡトランスフェクションのために、ｇＲＮＡをＰＢＳ緩衝液中でＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）と同様に組み合わせて、ヌクレオフェクションのためにＳＦ緩衝液中で細胞と組み合わせるまで約２０分間氷上に保持した。トランスフェクションの約７２時間後に培養ＨｅｐＧ２細胞を回収した。
【0175】
ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）からヒト初代Ｔ細胞（ＬＰ、ＣＲ、ＣＤ３＋、ＮＳ）を得て、１０％ウシ胎仔血清、５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７および５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１５（ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ培地中で培養した。抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、３：１のビーズ：細胞濃度で初代Ｔ細胞を４８時間活性化させた。Ｌｏｎｚａ Ｐ３初代細胞キット（Ｖ４ＳＰ－３９６０）を利用して、ＰＢＳ緩衝液中５ｐｍｏｌのｇＲＮＡおよび０．０６２５ｐｍｏｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡ ２．７μＬと組み合わせた、Ｐ３緩衝液 ２０μＬ中２０万個の細胞を用いて、ビーズを除去した初代Ｔ細胞にヌクレオフェクションを行った（プログラムＥＯ－１１５）。トランスフェクション後７日目に培養細胞を回収した。培養期間全体にわたり、Ｔ細胞をおよそ１００万個／ｍＬ培地の密度に維持した。電気穿孔後、追加的な培地を２日毎に添加した。
【0176】
ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ。ヒトＫ５６２細胞を上記のように培養し、反復１つあたり２０万個の細胞に、記載のような１２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡもタンパク質も有しない）をヌクレオフェクションした。各時点で、１．７ｍＬのエッペンドルフチューブに細胞を収集し、ＰＢＳですすぎ、次いで７５０μＬのＱｉａｚｏｌ中に再懸濁し、－２０℃のフリーザーに移す前に室温に５分間保った。ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＱｉａＣｕｂｅ ＨＴ上でＱｉａｚｏｌ＋クロロホルム抽出物からＰＢＳ中に総ＲＮＡを単離し、その直後、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＮＥＢ）を使用してそれを逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ装置で、一方がＦＡＭで標識されたｇＲＮＡに対し、他方がΔＣｔとして計算される単離された総ＲＮＡ量に対する規準化のためのＶＩＣで標識されたＵ６ ｓｎＲＮＡに対する、２つのＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブを用いるＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。３つ組試料についてのΔＣｔ値を平均し、最低観測平均ΔＣｔ値に対して規準化して、ΔΔＣｔ値を計算した。相対ｇＲＮＡレベルを２－ΔΔＣｔとして計算した。
【0177】
ＰＣＲ標的化ディープシーケンシングおよび標的化ゲノム修飾の定量。ゲノムＤＮＡの精製およびＰＣＲ標的化ディープシーケンシングライブラリーの構築を前記のように行った。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してライブラリーの濃度を決定した。ペアードエンドの２×２２０ｂｐのリードを、０．８ｎｇ／μＬのＰＣＲ増幅されたライブラリーで、２０．５％ ＰｈｉＸと共にＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。
【0178】
ＦＬＡＳＨバージョン１．２．１１ソフトウェアを使用してペアードエンドリードを併合し、次いでデフォルトのパラメーターに設定したＢＷＡ－ＭＥＭソフトウェア（ｂｗａ－０．７．１０）を使用してヒトゲノムに対してマッピングした。挿入または欠失がＣａｓ９切断部位の１０ｂｐ以内に見い出されたかにより、インデルを有するかまたは有しないとリードをスコア化した。プライム編集分析について、所望の編集がリード内から同定されたならば、編集を有するとリードをスコア化した。シチジン塩基編集分析について、シチジンがＰＡＭ部位の１０～２０ｂｐ上流のウインドウ内で編集されたならば、塩基が編集されたとしてリードをスコア化した。各実験での各反復について、マッピングしたアンプリコン座位に応じてマッピングリードを分離し、インデルまたは編集の存在または非存在によってビン分けした。ビンあたりのリードの集計を使用して、各座位で産生された％インデルまたは％編集を計算した。プロットのためにインデルまたは編集収率および標準偏差を、正規分布に近似するためにｌｎ（ｒ／（１－ｒ））として変換された％インデルまたは％編集のロジット変換によって計算した（式中、ｒは、特定の座位あたりの％インデルまたは％編集である）。３つ組モックトランスフェクションは平均モック対照（または陰性対照）を与えたが、対応する陰性対照よりも有意に高い（ｔ検定でｐ＜０．０５）平均インデル収率または平均編集収率を示す３つ組試料を、バックグラウンドよりも高いと見なした。
【0179】
［実施例１］
本実施例は、３’末端に２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾を有するガイドＲＮＡの安定性を評価した。トランスフェクトされた細胞における３’末端にＭＳまたはＭＰ修飾を有する単一ガイドＲＮＡの相対寿命を評価するために、５’末端の最初の３つのヌクレオチド間連結でのＭＳ修飾と、３’末端の最後の３つのヌクレオチド間連結でのＭＳ修飾（３ｘＭＳ，３ｘＭＳと表示）または３’末端での末端ヌクレオチド間連結での２、３もしくは４つの連続するＭＰ修飾のいずれかとを有するガイドＲＮＡ（それぞれ３ｘＭＳ，２ｘＭＰ；３ｘＭＳ，３ｘＭＰ；および３ｘＭＳ，４ｘＭＰと表示）を合成した。各々の修飾ｇＲＮＡをＣａｓ９の非存在下でヒトＫ５６２細胞に個別にトランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、トランスフェクションの１～９６時間後の一連の時点で収集した細胞内に残るｓｇＲＮＡの相対量を測定した。
本実施例は、３’末端に２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾を有するガイドＲＮＡの安定性を評価した。トランスフェクトされた細胞における３’末端にＭＳまたはＭＰ修飾を有する単一ガイドＲＮＡの相対寿命を評価するために、５’末端の最初の３つのヌクレオチド間連結でのＭＳ修飾と、３’末端の最後の３つのヌクレオチド間連結でのＭＳ修飾（３ｘＭＳ，３ｘＭＳと表示）または３’末端での末端ヌクレオチド間連結での２、３もしくは４つの連続するＭＰ修飾のいずれかとを有するガイドＲＮＡ（それぞれ３ｘＭＳ，２ｘＭＰ；３ｘＭＳ，３ｘＭＰ；および３ｘＭＳ，４ｘＭＰと表示）を合成した。各々の修飾ｇＲＮＡをＣａｓ９の非存在下でヒトＫ５６２細胞に個別にトランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、トランスフェクションの１～９６時間後の一連の時点で収集した細胞内に残るｓｇＲＮＡの相対量を測定した。
【0180】
図７に示すように、３’末端がＭＰ（２、３、または４つの連続するＭＰのいずれか）で修飾されたｇＲＮＡのいずれかと比較して、トランスフェクションの１、６、および２４時間後にわたり検出された３ｘＭＳ，３ｘＭＳ ｇＲＮＡの相対レベルに、より急激な低下が観察された。具体的には、トランスフェクションの１時間後に、トランスフェクトされたｇＲＮＡの相対量は、わずかに２．６倍だけ異なり、エラーバーは、３’末端保護の全部で４つの変形の間で大きく重複していたが、一方で、トランスフェクションの６時間後にずっと大きな差が観察され、３ｘＭＳ，３ｘＭＳ保護ｇＲＮＡの残量は、３ｘＭＳ，３ｘＭＰおよび３ｘＭＳ，４ｘＭＰ保護ｇＲＮＡの残量（０．３４１～０．３５１）の約１／１０の相対レベル（０．０３９）に低下した。差異は、２４時間の時点でいっそう大きくなり、そのとき、それらは、３’末端保護レベルに沿って、３’末端に３ｘＭＳを有することから、２ｘＭＰ、３ｘＭＰ、４ｘＭＰを有することへの論理的順序で変動し、約２５０倍に及ぶ残留ｇＲＮＡレベルを結果として生じ、これは、３’末端保護のレベルと一致した。したがって、複合体を形成していないｇＲＮＡの３’末端にＭＰ修飾を組み込むことは、ＭＳ修飾と比べてトランスフェクトされた細胞におけるそれらの安定性を有意に、具体的にはＭＳのみで修飾されたｇＲＮＡと平行して試験された３つの異なるＭＰ修飾ｇＲＮＡについて１～２桁高めることができることが見い出された。３’末端に３または４つの連続ＭＰを有する設計は、いっそう長期の時点（トランスフェクションの７２および９６時間後）にわたり遊離ｇＲＮＡの寿命を延長することができる。
【0181】
［実施例２］
ホスホネート修飾は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドに安定的に組み込むことができ、ホスホロチオエートと比べてそれらのヌクレアーゼ抵抗性を増大させることが実証されている。ＭＰを２０ｎｔガイド配列部分に組み込むことによってｇＲＮＡの特異性を高めるためのＭＰの使用を探究している以前の報告では、例えば、Ｒｙａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６、７９２～８０３（２０１８）に記載のように、位置５または１１（２０個のヌクレオチドの５’末端から数える）などの特異的配列位置でのＭＰがオフターゲット編集を有意に低減することができ、一方で高いオンターゲット編集を維持することが見出された。しかし、ｇＲＮＡの５’末端での最初の１、２または３つのヌクレオチド内にＭＰ修飾を組み込むことが、いくつかのガイド配列で、それらのオンターゲット切断活性を減少させ、かつ／またはそれらのオフターゲット活性を増大させ、したがって特異性を低下させる可能性があることも報告された（例えば、Ｒｙａｎら、２０１８を参照されたい）。
ホスホネート修飾は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドに安定的に組み込むことができ、ホスホロチオエートと比べてそれらのヌクレアーゼ抵抗性を増大させることが実証されている。ＭＰを２０ｎｔガイド配列部分に組み込むことによってｇＲＮＡの特異性を高めるためのＭＰの使用を探究している以前の報告では、例えば、Ｒｙａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６、７９２～８０３（２０１８）に記載のように、位置５または１１（２０個のヌクレオチドの５’末端から数える）などの特異的配列位置でのＭＰがオフターゲット編集を有意に低減することができ、一方で高いオンターゲット編集を維持することが見出された。しかし、ｇＲＮＡの５’末端での最初の１、２または３つのヌクレオチド内にＭＰ修飾を組み込むことが、いくつかのガイド配列で、それらのオンターゲット切断活性を減少させ、かつ／またはそれらのオフターゲット活性を増大させ、したがって特異性を低下させる可能性があることも報告された（例えば、Ｒｙａｎら、２０１８を参照されたい）。
【0182】
ガイドＲＮＡにおけるホスホネート修飾の潜在的有用性をさらに探究するために、３’末端に異なる数の連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ、または「ＭＰ」）修飾を含有するｇＲＮＡの性能を、その末端に２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（または「ＭＳ」）修飾を有するガイドＲＮＡと比較して評価した。この研究の結果は、Ｒｙａｎら「Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｃａｓ９ Ｅｄｉｔｏｒｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０２２）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌｃ００７６８にさらに記載されている。
【0183】
標的遺伝子としてＨＢＢを使用して、比較的低い（飽和未満）量の化学修飾ガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとによるＨｅｐＧ２細胞の共トランスフェクション後のＣａｓ活性を評価するためにこの実験を計画した。このような飽和未満量は、細胞の標的領域を編集するための厳しい状況を構成する。
【0184】
試料の３つのセットについて、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを、ＨＢＢを標的とする修飾ｇＲＮＡと共にヒト肝実質細胞（ＨｅｐＧ２細胞）に共トランスフェクトした（上の表１参照）。第４のセットのＨｅｐＧ２細胞について、ＨＢＢ内の同じ部位を標的とする修飾ｇＲＮＡを、精製組換えＣａｓ９タンパク質と予備複合体化してＲＮＰを形成させ、次いでそれを細胞内にトランスフェクトした。別々に培養した細胞の３つ組試料で各トランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡを回収し、それぞれＨＢＢ遺伝子および遺伝子間オフターゲット部位に特異的なプライマーを使用してＨＢＢ標的およびオフターゲット配列を増幅して、アンプリコンを産生し、それをシーケンシングし、標的およびオフターゲット部位での編集の程度（「％インデル」）をシーケンシングの結果から決定した。ＯＮおよびＯＦＦは、それぞれオンターゲット配列およびオフターゲット配列を示す。ＨＢＢ遺伝子内の選ばれた標的配列を標的とした場合に高い副次的活性を受けることが知られていることから、遺伝子間オフターゲット座位をモニタリングした。表１に記載された修飾ｇＲＮＡについての編集収率を図２～５に棒グラフとしてプロットした。
【0185】
図２～５によって実証されるように、ＨＢＢを標的とする飽和未満レベルの修飾ガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ（または修飾ガイドＲＮＡのＲＮＰ複合体）との共トランスフェクションは、同等量の未修飾ｇＲＮＡを共トランスフェクトされた試料と比べて高レベルの編集収率を結果としてもたらした。さらに、修飾ｇＲＮＡの３’末端での２、３、または４つのＭＰ修飾の付加は、修飾ｇＲＮＡの３’末端に３つのＭＳ修飾を含む修飾ｇＲＮＡと比べた実質的な増大に加えて、編集収率における漸進的に高い増大を結果としてもたらした。例えば、図２および４を参照されたい。図３および５によって示されるように、位置５または１１（ｇＲＮＡ中の２０ｎｔガイド配列の５’末端から数える）でのＭＰ修飾の包含も、オフターゲット活性を低減した。特に、ｇＲＮＡ中の位置５でのＭＰの包含は、編集収率に最小限の影響を有したのに対し、オフターゲット活性を実質的に低減した。
【0186】
３’末端のＭＰ修飾がＨｅｐＧ２細胞における編集収率を有意に高めたことがさらに観察された（図３）。例えば、３’末端に２、３または４つの連続するＭＰ修飾を有する設計は、３’末端に３ｘＭＳを有する同等の設計よりも少なくとも２倍多いＣａｓ９媒介インデルを与えた（３’末端での２ｘＭＰ、３ｘＭＰおよび４ｘＭＰ修飾についてオンターゲット部位で８１％～８３％に対し、３ｘＭＳについて３８％）。３’末端に３ｘＭＳを使用する場合よりも２ｘＭＰ、３ｘＭＰおよび４ｘＭＰ修飾が１．３倍高いレベルのオンターゲットインデルを与えた点で、増大は、より控えめであったものの、初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトされた同じｇＲＮＡについて類似の傾向が観察された（図８）。ｇＲＮＡの２０ｎｔガイド配列部分における位置５にさらなるＭＰを組み込むことで、両方の細胞型においてＯＦＦ１部位での編集が有意に低下した一方で、特異性を高めるための手段として以前に報告されたように高いオンターゲット編集効率は維持された（例えば、Ｒｙａｎら、２０１８を参照されたい）。実際に、ＯＦＦ１部位でのインデルは、位置５にＭＰを組み込むことによってＨｅｐＧ２細胞において１／７～１／１０に低減し、同様に初代Ｔ細胞において１／６～１／７に低減した。
【0187】
図９によって示されるように、塩基エディターと組み合わせた場合の化学修飾されたｇＲＮＡの使用も評価した。塩基エディターは、二本鎖切断を作らずに細胞におけるゲノムＤＮＡの編集を可能にする様々なデアミナーゼの１つと融合されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）またはデッド型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を中心に作られた代替的なゲノム編集システムのクラスである。シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）およびアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）の両方が報告されており、これらは、塩基編集のためのいくつかの変形を起こさせた。このようなｇＲＮＡの３’末端でのＭＳ修飾と対照的にＭＰ修飾を使用する潜在的利益を、ＣＢＥ、すなわちＢＥ４－Ｇａｍ ｍＲＮＡに関連して試験した。３’末端にＭＳを有する代替設計と比べて、３’末端がＭＰで修飾されたｇＲＮＡを共トランスフェクトされたＫ５６２細胞においてＣＢＥ ｍＲＮＡを使用することによって１．４倍高いレベルのシチジン編集が観察された。
【0188】
［実施例３］
本実施例は、化学合成されたｐｅｇＲＮＡの３’末端での２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾の使用を評価した。ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入する、文献から採用されたプライム編集のための２つのアプローチを探究するための実験を行った。これらのアプローチのどちらも１５個のヌクレオチドを含むプライマー結合配列を有するｐｅｇＲＮＡを利用する。本実験で評価した特定の配列編集を図１８に示す。プライムエディター（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）をコードするｍＲＮＡを、ＥＭＸ１遺伝子を標的とするｐｅｇＲＮＡと共にＫ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞内に導入した。別々に培養した３つ組の細胞試料で各トランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡを回収し、ＥＭＸ１に特異的なプライマーを使用してＥＭＸ１標的配列を増幅してアンプリコンを産生し、アンプリコンを配列決定し、配列決定の結果からプライム編集度（「％編集」）を決定した。配列決定の結果から、ＥＭＸ１標的配列内のニッカーゼ部位での望まれないインデル形成度（「％インデル」）も決定した。このようなインデルは、プライム編集の公知の副産物であり、一般的に望ましくないと見なされる（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）。ｐｅｇＲＮＡあたりのプライム編集の収率およびインデル副産物の収率を図１１～１６に棒グラフとしてプロットする。このアッセイに使用した配列を、表２に示される配列から選択した。図１１～１２におけるデータを、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第１のバッチ合成を使用して得たが、一方で図１３～１４におけるデータは、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第２のバッチ合成を使用して得た。同じ配列のいくつかを第２のバッチ合成で再度合成したことに留意されたい。逆に、ＲＵＮＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡを使用して図１５～１６におけるデータを得た（すなわち、表３に記載される配列を使用する）。
本実施例は、化学合成されたｐｅｇＲＮＡの３’末端での２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾の使用を評価した。ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入する、文献から採用されたプライム編集のための２つのアプローチを探究するための実験を行った。これらのアプローチのどちらも１５個のヌクレオチドを含むプライマー結合配列を有するｐｅｇＲＮＡを利用する。本実験で評価した特定の配列編集を図１８に示す。プライムエディター（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）をコードするｍＲＮＡを、ＥＭＸ１遺伝子を標的とするｐｅｇＲＮＡと共にＫ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞内に導入した。別々に培養した３つ組の細胞試料で各トランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡを回収し、ＥＭＸ１に特異的なプライマーを使用してＥＭＸ１標的配列を増幅してアンプリコンを産生し、アンプリコンを配列決定し、配列決定の結果からプライム編集度（「％編集」）を決定した。配列決定の結果から、ＥＭＸ１標的配列内のニッカーゼ部位での望まれないインデル形成度（「％インデル」）も決定した。このようなインデルは、プライム編集の公知の副産物であり、一般的に望ましくないと見なされる（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）。ｐｅｇＲＮＡあたりのプライム編集の収率およびインデル副産物の収率を図１１～１６に棒グラフとしてプロットする。このアッセイに使用した配列を、表２に示される配列から選択した。図１１～１２におけるデータを、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第１のバッチ合成を使用して得たが、一方で図１３～１４におけるデータは、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第２のバッチ合成を使用して得た。同じ配列のいくつかを第２のバッチ合成で再度合成したことに留意されたい。逆に、ＲＵＮＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡを使用して図１５～１６におけるデータを得た（すなわち、表３に記載される配列を使用する）。
【0189】
図１１～１６に示す結果によって説明されるように、ｐｅｇＲＮＡのそれぞれ５’末端および３’末端での化学修飾としてのＭＳおよびＭＰヌクレオチドの包含は、プライム編集活性を増大させる。ｐｅｇＲＮＡの３’末端が追加的な機能性部位（例えば、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型配列）を含有するという事実を考えると、ｐｅｇＲＮＡの３’末端に修飾ヌクレオチドを有する構築物の高い活性は、特に驚くべきことである。上述のように本開示の前には、この部位での化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＭＳおよび／またはＭＰ）の包含が、ｐｅｇＲＮＡのこれらの他の３’末端構成要素によって提供される機能性に干渉することが予期されていた。
【0190】
［実施例４］
本実施例は、化学合成されたｐｅｇＲＮＡの３’末端でのＭＰまたはＭＳ修飾の組込みを評価した。本実験に使用した方法は、上記方法と一致する。手短に言えば、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集アプローチを採用した。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のためにＫ５６２細胞に、プライムエディターｍＲＮＡ（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）と、５’末端で３ｘＭＳにより、および３’末端で様々な修飾スキームにより（表示のように）修飾された合成ｐｅｇＲＮＡとを共トランスフェクトした。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、同じｐｅｇＲＮＡを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に同様にトランスフェクトした。所望の編集（％編集）および任意の夾雑インデル副産物（％Ｂｙ－インデル）の両方について、標的座位のＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングによって編集効率を測定した。添付の図面中の棒線は、標準偏差付きの平均を表す（ｎ＝３）。
本実施例は、化学合成されたｐｅｇＲＮＡの３’末端でのＭＰまたはＭＳ修飾の組込みを評価した。本実験に使用した方法は、上記方法と一致する。手短に言えば、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集アプローチを採用した。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のためにＫ５６２細胞に、プライムエディターｍＲＮＡ（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）と、５’末端で３ｘＭＳにより、および３’末端で様々な修飾スキームにより（表示のように）修飾された合成ｐｅｇＲＮＡとを共トランスフェクトした。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、同じｐｅｇＲＮＡを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に同様にトランスフェクトした。所望の編集（％編集）および任意の夾雑インデル副産物（％Ｂｙ－インデル）の両方について、標的座位のＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングによって編集効率を測定した。添付の図面中の棒線は、標準偏差付きの平均を表す（ｎ＝３）。
【0191】
図１９～２２によって示すように、本実験は、両方の標的について３’末端に３ｘＭＳを有するｐｅｇＲＮＡを、３’末端に１、２または３つの連続するＭＰを有する代替的な設計と比較した。Ｋ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞において各ｐｅｇＲＮＡをＰＥ２のｍＲＮＡと共トランスフェクトした、結果は、３’末端にＭＰ修飾を有するｐｅｇＲＮＡが良好な性能を示し、３ｘＭＳと類似の、または場合によっては幾分高い編集収率を達成できることを示している。ここで試験した２つのｐｅｇＲＮＡ配列について、３’末端に２×ＭＰおよび／または３ｘＭＰを有する設計は、３’末端に１ｘＭＰを有する設計よりも一貫して良好な性能を示した（具体的には１．２～１．４倍良好）。
【0192】
［実施例５］
本実施例では、化学合成されたｇＲＮＡの３’末端でのＭＰ修飾の使用が、血清の存在下で編集収率を最大化することを助けることを実証した。インビボで（ナノキャリアまたは他の細胞透過性製剤により）送達した場合にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素が遭遇することがある、より厳しい細胞環境を刺激するために、培地から単離されたが残った血清を除去するためにＰＢＳ緩衝液ですすがなかった細胞内に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをｇＲＮＡと共トランスフェクトする実験を行った。血清は、ヌクレアーゼを含有することが知られている。
本実施例では、化学合成されたｇＲＮＡの３’末端でのＭＰ修飾の使用が、血清の存在下で編集収率を最大化することを助けることを実証した。インビボで（ナノキャリアまたは他の細胞透過性製剤により）送達した場合にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素が遭遇することがある、より厳しい細胞環境を刺激するために、培地から単離されたが残った血清を除去するためにＰＢＳ緩衝液ですすがなかった細胞内に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをｇＲＮＡと共トランスフェクトする実験を行った。血清は、ヌクレアーゼを含有することが知られている。
【0193】
本実験に使用した方法は、上記方法と一致する。しかし、この実験条件下で、実質的な編集レベルを達成するためにより多量のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡが必要であったことが注目される。具体的には、実験のためにトランスフェクション１回あたり３倍多いｇＲＮＡおよび８倍多いＣａｓ９を使用し、結果として図２３に示されるデータがもたらされた。これを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素を導入する前にトランスフェクション１回あたり同数の細胞を緩衝液で洗浄した、図３に示されるデータをもたらした実験と比較した。
【0194】
本研究の結果に基づき、細胞からすすぎ切れなかった血清中の細胞外ヌクレアーゼが、トランスフェクトされたＲＮＡを分解したように見える。本発明者らは、未洗浄のＨｅｐＧ２細胞にＣａｓ９ ｍＲＮＡを共トランスフェクトした場合に、３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡが、３’末端にＭＳ修飾を有するｇＲＮＡと比較して実質的に高い（１桁以上の）編集収率を与えたことを見出した（図２３）。具体的には、３’末端に３ｘＭＳを有する場合の２％未満と比べて、３’末端に１つまたは複数のＭＰを有するｇＲＮＡについて１５％～４４％編集収率が観察された。
【0195】
並行する実験で、ＰＢＳ緩衝液中のＣａｓ９タンパク質との予備複合体化によって各ｇＲＮＡのＲＮＰバージョンを調製し、未洗浄のＨｅｐＧ２細胞のアリコートにトランスフェクトした。予想通り、ＲＮＰ製剤としての未修飾および３ｘＭＳ修飾されたｇＲＮＡは、これらをＣａｓ９ ｍＲＮＡと共トランスフェクトした場合よりも高いインデル収率を与えた。それは、ＲＮＰの状態でのｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質との予備複合体化が、ｇＲＮＡを核酸分解から遮蔽することを助けるからである（図２４および図２３に示す結果を比較）。３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡを組み込んでいるＲＮＰと、ＭＳ修飾を有するｇＲＮＡを組み込んでいるＲＮＰとの間の編集効率における改善は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとの共トランスフェクションにこれらの修飾を使用する場合ほど劇的でなかったにせよ、３’末端にＭＰを有する設計は、３’末端に３ｘＭＳを有する類似の設計よりも有意に高いＣａｓ９媒介インデルを与えた（ＯＮターゲット部位で３’末端での３ｘＭＳについての５２％と比べて、３’末端での２ｘＭＰ、３ｘＭＰおよび４ｘＭＰ修飾についての７０％～７３％のインデル、約１．３倍の差）（図２４参照）。ＣＲＩＳＰＲａによる遺伝子活性化のためにそれらを使用する代わりにインデルを産生するために、ＣＲＩＳＰＲａ ＳＡＭシステムのために設計されたがＲＮＰ製剤の状態でＳｐＣａｓ９タンパク質と共に使用した異なるセットの合成１６３残基ｇＲＮＡについて、類似のアウトカムが観察された（図２５）。
【0196】
［例示的な実施形態］
＜改変セクションＡ＞
実施形態Ａ１． １つまたは複数の困難な状況下で核酸中の標的領域を編集する方法であって、
細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場とを含む修飾ガイドＲＮＡであって、修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドおよびヌクレオチド間連結修飾を含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートである、修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記１つまたは複数の困難な状況が、
ｉ．標的領域または標的領域を含む細胞が血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む培地中にあること；
ｉｉ．標的領域を含む細胞が、血清を含む培地中で以前に培養されたものであり、細胞が、血清と不完全に分離されたものであること；
ｉｉｉ．標的領域を含む細胞が１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼを含む培地中で以前に培養されたものであり、細胞が、１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼと不完全に分離されたものであること；
ｉｖ．標的領域を含む細胞は、１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼの比較的高い発現などのエキソリボヌクレアーゼ活性の比較的高いレベルを有すること；
ｖ．標的領域を含む細胞が、リボヌクレアーゼ阻害剤の比較的低い発現などのリボヌクレアーゼ阻害剤活性の比較的低いレベルを有すること；
ｖｉ．修飾ガイドＲＮＡが、標的領域を含む細胞への送達前にＣａｓタンパク質と複合体を形成していないこと；および
ｖｉｉ．それらの適用可能な組合せ
からなる群から選択され；
Ｃａｓタンパク質と修飾ガイドＲＮＡとが、標的領域の編集を結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ２． ヌクレオチド間連結修飾がホスホノカルボキシレートである、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ３． ホスホノカルボキシレートがホスホノアセテートである、実施形態Ａ２に記載の方法。
実施形態Ａ４． チオホスホノカルボキシレートがチオホスホノアセテートである、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ５． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして導入される、実施形態Ａ１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ６． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードする発現ベクターとして導入される、実施形態Ａ１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ７． Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターが、標的領域に導入される場合にナノ粒子中に含有される、実施形態Ａ５またはＡ６に記載の方法。
実施形態Ａ８． Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入される、実施形態Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ９． ２’修飾が２’－Ｏ－メチルである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１０． ２’修飾が２’－フルオロである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１１． ２’修飾が２’－ＭＯＥである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１２． ２’修飾が２’－デオキシである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１３． １つまたは複数の編集が、１つもしくは複数の単一ヌクレオチド変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１４． 標的領域が無細胞アッセイに存在する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１５． 細胞を溶解することなどによって細胞から核酸を抽出するステップ、抽出された核酸と、エキソリボヌクレアーゼまたは他の酵素などの１つまたは複数の他の細胞構成要素とを含むアッセイ混合物を形成するステップ、およびガイドＲＮＡをアッセイ混合物に導入するステップをさらに含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
実施形態Ａ１６． 標的領域が、高いリボヌクレアーゼの発現、濃度および／または活性を有する細胞、例えば、高い特定のヌクレアーゼの細胞型にある、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１７． 細胞が初代細胞を含む、実施形態Ａ１６に記載の方法。
実施形態Ａ１８． 細胞がエクスビボで存在し、方法が、生きた生物から細胞を分離するための１つまたは複数のステップをさらに含む、実施形態Ａ１７に記載の方法。細胞は、反応混合物中に分離することができる、または分離された細胞を反応混合物中に移すことができる。
実施形態Ａ１９． 細胞が、修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を細胞内の標的領域に導入する前に多細胞生物から単離される、実施形態Ａ１６～Ａ１８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２０． 修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を細胞内の標的領域に導入した後に、細胞またはその子孫が多細胞生物に戻される、実施形態Ａ１９に記載の方法。
実施形態Ａ２１． 細胞が初代細胞である、実施形態Ａ１６～Ａ２０のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２２． 初代細胞が幹細胞または免疫細胞である、実施形態Ａ２１に記載の方法。
実施形態Ａ２３． 幹細胞が、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または臓器幹細胞である、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２４． 免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２５． 細胞がＴ細胞である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
実施形態Ａ２６． 細胞が肝実質細胞である、実施形態Ａ１６～Ａ２０のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２７． 細胞が、各々標的領域を含む細胞の集団である、実施形態Ａ１６～Ａ２６のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２８． 細胞が細胞培養物中にあり、細胞が、血清または１つもしくは複数の他の培地構成要素を含む細胞培養培地中にある、実施形態Ａ１６～Ａ２７のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２９． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが導入される前に、細胞が細胞培養培地から分離される、実施形態Ａ２８に記載の方法。
実施形態Ａ３０． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが生きた生物に導入される、実施形態Ａ１～１３およびＡ１６～Ａ２９のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３１． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、生きた生物中または生きた生物からの血清含有液に導入される、実施形態Ａ３０に記載の方法。
実施形態Ａ３２． 編集がプライム編集であり、修飾ガイドＲＮＡが、所望の編集を含む領域をさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３３． 編集が、相同組換え修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、プライム編集、または塩基編集を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３４． Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３５． Ｃａｓタンパク質が、ＤＮＡの一本鎖にニックを入れることができるＣａｓニッカーゼである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３６． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓドメインと異種機能性ドメインとを含む融合タンパク質であり、異種機能性ドメインが、塩基編集活性、ヌクレオチドデアミナーゼ活性、トランスグリコシラーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、逆転写酵素活性、ポリメラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、クロマチン修飾またはリモデリング活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、検出可能な活性、またはそれらの任意の組合せを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３７． 融合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼドメインおよびヌクレオチドデアミナーゼを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ３８． ヌクレオチドデアミナーゼが、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ３９． 融合タンパク質が、１つまたは複数の核酸修飾ドメインを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４０． 核酸修飾ドメインが、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リボヌクレオチドレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ジアデノシン四リン酸ヒドロラーゼドメイン、ＤＮＡヘリカーゼドメイン、またはＲＮＡヘリカーゼドメインである、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４１． 融合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼドメインおよび逆転写酵素ドメインを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４２． ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４３． 修飾ガイドＲＮＡが、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、ｏｒ １３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００個のヌクレオチド、および／または
最大１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６４、１６３、１６２、１６１、１５９、１５８、１５７、１５６、１５５、１５４、１５３、１５２、１５１、１５０、１４９、１４８、１４７、１４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、もしくは１２０個のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ａ４２に記載の方法。
実施形態Ａ４４． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内に、または５’末端の３つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４５． ５’末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、およびホスホロチオエートから選択される、実施形態Ａ４４に記載の方法。
実施形態Ａ４６． ガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の両方から少なくとも５つのヌクレオチド以外の１つまたは複数の位置に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４７． １つまたは複数の厳しい状況で、細胞内の核酸における標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、ならびに
ｂ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する領域とを含む修飾ガイドＲＮＡであって、修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートである、ガイドＲＮＡ
を提供することを含み；
Ｃａｓタンパク質と修飾ガイドＲＮＡとが、標的領域の発現のモジュレーションを結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ４８． Ｃａｓタンパク質または修飾ガイドＲＮＡが、エピジェネティック修飾因子、または転写もしくは翻訳活性化もしくは抑制シグナルをさらに含む、実施形態Ａ４７に記載の方法。
実施形態Ａ４９． Ｃａｓタンパク質が、不活性Ｃａｓヌクレアーゼドメインと、転写活性化ドメインおよび転写抑制ドメインから選択される異種機能性ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態Ａ４７に記載の方法。
実施形態Ａ５０． 異種機能性ドメインが転写活性化ドメインである、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５１． 転写活性化ドメインが、ＶＰ６４ドメイン、ｐ６５ドメイン、ＭｙｏＤ１ドメイン、またはＨＳＦ１ドメインである、実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５２． 異種機能性ドメインが転写抑制ドメインである、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５３． 転写抑制ドメインが、ＫＲＡＢドメイン、ＳＩＤドメイン、ＳＩＤ４Ｘドメイン、ＮｕＥドメイン、またはＮｃｏＲドメインである、実施形態Ａ５２に記載の方法。
実施形態Ａ５４． １つまたは複数の厳しい状況で核酸内の標的領域をプライム編集する方法であって、
ａ）細胞に、
核酸の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質と、
逆転写酵素と、
ｉ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列、
ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と相互作用する領域、
ｉｉｉ）核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型配列、および
ｉｖ）標的領域の相補体と結合することができるプライマー結合部位配列
を含む修飾プライム編集ガイドＲＮＡ（「ｐｅｇＲＮＡ」）と
を提供するステップを含み；
修飾ｐｅｇＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ｐｅｇＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾がホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートであり；
Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、標的領域の編集を結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ５５． Ｃａｓタンパク質および逆転写酵素がリンカーによって接続されて融合タンパク質を形成する、実施形態Ａ５４に記載の方法。
実施形態Ａ５６． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結とを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５７． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノアセテートまたはチオホスホノアセテートヌクレオチド間連結とを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５８． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのＭＳと、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するＭＰまたはＭＳＰとを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５９． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の３つのＭＳと、３’末端の５つのヌクレオチド内の３つのＭＰまたはＭＳＰとを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６０． 標的遺伝子の発現の編集および／またはモジュレーションが、多重的に（すなわち、少なくとも２つの標的遺伝子または少なくとも２つの標的領域に対して）行われる、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
＜改変セクションＡ＞
実施形態Ａ１． １つまたは複数の困難な状況下で核酸中の標的領域を編集する方法であって、
細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場とを含む修飾ガイドＲＮＡであって、修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドおよびヌクレオチド間連結修飾を含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートである、修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記１つまたは複数の困難な状況が、
ｉ．標的領域または標的領域を含む細胞が血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む培地中にあること；
ｉｉ．標的領域を含む細胞が、血清を含む培地中で以前に培養されたものであり、細胞が、血清と不完全に分離されたものであること；
ｉｉｉ．標的領域を含む細胞が１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼを含む培地中で以前に培養されたものであり、細胞が、１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼと不完全に分離されたものであること；
ｉｖ．標的領域を含む細胞は、１つまたは複数のエキソリボヌクレアーゼの比較的高い発現などのエキソリボヌクレアーゼ活性の比較的高いレベルを有すること；
ｖ．標的領域を含む細胞が、リボヌクレアーゼ阻害剤の比較的低い発現などのリボヌクレアーゼ阻害剤活性の比較的低いレベルを有すること；
ｖｉ．修飾ガイドＲＮＡが、標的領域を含む細胞への送達前にＣａｓタンパク質と複合体を形成していないこと；および
ｖｉｉ．それらの適用可能な組合せ
からなる群から選択され；
Ｃａｓタンパク質と修飾ガイドＲＮＡとが、標的領域の編集を結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ２． ヌクレオチド間連結修飾がホスホノカルボキシレートである、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ３． ホスホノカルボキシレートがホスホノアセテートである、実施形態Ａ２に記載の方法。
実施形態Ａ４． チオホスホノカルボキシレートがチオホスホノアセテートである、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ５． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして導入される、実施形態Ａ１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ６． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードする発現ベクターとして導入される、実施形態Ａ１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ７． Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターが、標的領域に導入される場合にナノ粒子中に含有される、実施形態Ａ５またはＡ６に記載の方法。
実施形態Ａ８． Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入される、実施形態Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ９． ２’修飾が２’－Ｏ－メチルである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１０． ２’修飾が２’－フルオロである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１１． ２’修飾が２’－ＭＯＥである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１２． ２’修飾が２’－デオキシである、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１３． １つまたは複数の編集が、１つもしくは複数の単一ヌクレオチド変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１４． 標的領域が無細胞アッセイに存在する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１５． 細胞を溶解することなどによって細胞から核酸を抽出するステップ、抽出された核酸と、エキソリボヌクレアーゼまたは他の酵素などの１つまたは複数の他の細胞構成要素とを含むアッセイ混合物を形成するステップ、およびガイドＲＮＡをアッセイ混合物に導入するステップをさらに含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
実施形態Ａ１６． 標的領域が、高いリボヌクレアーゼの発現、濃度および／または活性を有する細胞、例えば、高い特定のヌクレアーゼの細胞型にある、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ１７． 細胞が初代細胞を含む、実施形態Ａ１６に記載の方法。
実施形態Ａ１８． 細胞がエクスビボで存在し、方法が、生きた生物から細胞を分離するための１つまたは複数のステップをさらに含む、実施形態Ａ１７に記載の方法。細胞は、反応混合物中に分離することができる、または分離された細胞を反応混合物中に移すことができる。
実施形態Ａ１９． 細胞が、修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を細胞内の標的領域に導入する前に多細胞生物から単離される、実施形態Ａ１６～Ａ１８のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２０． 修飾ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を細胞内の標的領域に導入した後に、細胞またはその子孫が多細胞生物に戻される、実施形態Ａ１９に記載の方法。
実施形態Ａ２１． 細胞が初代細胞である、実施形態Ａ１６～Ａ２０のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２２． 初代細胞が幹細胞または免疫細胞である、実施形態Ａ２１に記載の方法。
実施形態Ａ２３． 幹細胞が、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または臓器幹細胞である、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２４． 免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２５． 細胞がＴ細胞である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
実施形態Ａ２６． 細胞が肝実質細胞である、実施形態Ａ１６～Ａ２０のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２７． 細胞が、各々標的領域を含む細胞の集団である、実施形態Ａ１６～Ａ２６のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２８． 細胞が細胞培養物中にあり、細胞が、血清または１つもしくは複数の他の培地構成要素を含む細胞培養培地中にある、実施形態Ａ１６～Ａ２７のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ２９． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが導入される前に、細胞が細胞培養培地から分離される、実施形態Ａ２８に記載の方法。
実施形態Ａ３０． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが生きた生物に導入される、実施形態Ａ１～１３およびＡ１６～Ａ２９のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３１． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、生きた生物中または生きた生物からの血清含有液に導入される、実施形態Ａ３０に記載の方法。
実施形態Ａ３２． 編集がプライム編集であり、修飾ガイドＲＮＡが、所望の編集を含む領域をさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３３． 編集が、相同組換え修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、プライム編集、または塩基編集を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３４． Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３５． Ｃａｓタンパク質が、ＤＮＡの一本鎖にニックを入れることができるＣａｓニッカーゼである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３６． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓドメインと異種機能性ドメインとを含む融合タンパク質であり、異種機能性ドメインが、塩基編集活性、ヌクレオチドデアミナーゼ活性、トランスグリコシラーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、逆転写酵素活性、ポリメラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、クロマチン修飾またはリモデリング活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、検出可能な活性、またはそれらの任意の組合せを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ３７． 融合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼドメインおよびヌクレオチドデアミナーゼを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ３８． ヌクレオチドデアミナーゼが、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ３９． 融合タンパク質が、１つまたは複数の核酸修飾ドメインを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４０． 核酸修飾ドメインが、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リボヌクレオチドレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ジアデノシン四リン酸ヒドロラーゼドメイン、ＤＮＡヘリカーゼドメイン、またはＲＮＡヘリカーゼドメインである、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４１． 融合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼドメインおよび逆転写酵素ドメインを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
実施形態Ａ４２． ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４３． 修飾ガイドＲＮＡが、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、ｏｒ １３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００個のヌクレオチド、および／または
最大１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６４、１６３、１６２、１６１、１５９、１５８、１５７、１５６、１５５、１５４、１５３、１５２、１５１、１５０、１４９、１４８、１４７、１４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、もしくは１２０個のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ａ４２に記載の方法。
実施形態Ａ４４． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内に、または５’末端の３つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４５． ５’末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、およびホスホロチオエートから選択される、実施形態Ａ４４に記載の方法。
実施形態Ａ４６． ガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の両方から少なくとも５つのヌクレオチド以外の１つまたは複数の位置に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
実施形態Ａ４７． １つまたは複数の厳しい状況で、細胞内の核酸における標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、ならびに
ｂ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する領域とを含む修飾ガイドＲＮＡであって、修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾が、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートである、ガイドＲＮＡ
を提供することを含み；
Ｃａｓタンパク質と修飾ガイドＲＮＡとが、標的領域の発現のモジュレーションを結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ４８． Ｃａｓタンパク質または修飾ガイドＲＮＡが、エピジェネティック修飾因子、または転写もしくは翻訳活性化もしくは抑制シグナルをさらに含む、実施形態Ａ４７に記載の方法。
実施形態Ａ４９． Ｃａｓタンパク質が、不活性Ｃａｓヌクレアーゼドメインと、転写活性化ドメインおよび転写抑制ドメインから選択される異種機能性ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態Ａ４７に記載の方法。
実施形態Ａ５０． 異種機能性ドメインが転写活性化ドメインである、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５１． 転写活性化ドメインが、ＶＰ６４ドメイン、ｐ６５ドメイン、ＭｙｏＤ１ドメイン、またはＨＳＦ１ドメインである、実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５２． 異種機能性ドメインが転写抑制ドメインである、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５３． 転写抑制ドメインが、ＫＲＡＢドメイン、ＳＩＤドメイン、ＳＩＤ４Ｘドメイン、ＮｕＥドメイン、またはＮｃｏＲドメインである、実施形態Ａ５２に記載の方法。
実施形態Ａ５４． １つまたは複数の厳しい状況で核酸内の標的領域をプライム編集する方法であって、
ａ）細胞に、
核酸の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質と、
逆転写酵素と、
ｉ）標的領域とハイブリダイズできるガイド配列、
ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と相互作用する領域、
ｉｉｉ）核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型配列、および
ｉｖ）標的領域の相補体と結合することができるプライマー結合部位配列
を含む修飾プライム編集ガイドＲＮＡ（「ｐｅｇＲＮＡ」）と
を提供するステップを含み；
修飾ｐｅｇＲＮＡが、５’末端および３’末端を含み、修飾ｐｅｇＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’修飾およびヌクレオチド間連結修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－デオキシから選択され、ヌクレオチド間連結修飾がホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートであり；
Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、標的領域の編集を結果としてもたらす複合体を形成する、方法。
実施形態Ａ５５． Ｃａｓタンパク質および逆転写酵素がリンカーによって接続されて融合タンパク質を形成する、実施形態Ａ５４に記載の方法。
実施形態Ａ５６． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結とを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５７． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノアセテートまたはチオホスホノアセテートヌクレオチド間連結とを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５８． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも１つのＭＳと、３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するＭＰまたはＭＳＰとを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５９． ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内の３つのＭＳと、３’末端の５つのヌクレオチド内の３つのＭＰまたはＭＳＰとを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６０． 標的遺伝子の発現の編集および／またはモジュレーションが、多重的に（すなわち、少なくとも２つの標的遺伝子または少なくとも２つの標的領域に対して）行われる、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0197】
＜セクションＢ＞
実施形態Ｂ１． 細胞内の核酸における標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）５’末端および３’末端と；
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ１．１． 細胞内の核酸における標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）一方がプライム編集末端であり、他方が遠位末端である５’末端および３’末端を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である修飾ガイドＲＮＡであって、
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、およびプライム編集末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
をさらに含む修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ２． 前記編集が、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ｇＲＮＡによるものよりも高い効率で起こる、実施形態Ｂ１またはＢ１．１に記載の方法。
実施形態Ｂ３． 細胞内の核酸における標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）５’末端および３’末端と；
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む修飾ガイドＲＮＡを提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ４． モジュレーションが、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ｇＲＮＡによるものよりも高い効率で起こる、実施形態Ｂ３に記載の方法。
実施形態Ｂ５． 細胞がインビボで存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ６． 細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下でエクスビボで存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ７． 修飾ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）を含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法（例外：本実施形態が実施形態Ｂ１．１に従属する場合は「５’末端」の代わりに「遠位末端」）。
実施形態Ｂ８． ホスホノカルボキシレートがホスホノアセテートであり、チオホスホノカルボキシレートがチオホスホノアセテートである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ９． 修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（ＭＳＰ）を含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法（例外：本実施形態が実施形態Ｂ１．１に従属する場合は「５’末端」の代わりに「プライム終止末端」）。
実施形態Ｂ１０． 修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端内の５つのヌクレオチドの外側に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１１． 修飾ガイドＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１２． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして提供される、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１３． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡとして提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１４． ＤＮＡがウイルス発現ベクターである、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
実施形態Ｂ１５． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１６． Ｃａｓタンパク質および／または修飾ガイドＲＮＡが、ナノ粒子中に提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１７． 効率が少なくとも５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１８． 効率が少なくとも１０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１９． 効率が少なくとも１５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２０． 効率が少なくとも２０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２１． 効率が少なくとも２５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２２． 効率が少なくとも３０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２３． 効率が少なくとも３５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２４． 効率が少なくとも４０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２５． 効率が少なくとも４５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２６． 効率が少なくとも５０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２７． Ｃａｓタンパク質がＤＮＡの両方の鎖を切断することができる、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２８． Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２９． Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有しない、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３０． Ｃａｓタンパク質が、異種タンパク質をさらに含む融合タンパク質の一部である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３１． Ｃａｓタンパク質がＩＩ型Ｃａｓタンパク質である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３２． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３３． Ｃａｓ９タンパク質が化膿性連鎖球菌に由来する、実施形態Ｂ３２に記載の方法。
実施形態Ｂ３４． Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片である、実施形態Ｂ１～Ｂ３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３５． Ｃａｓタンパク質が、少なくとも２つの異なる野生型Ｃａｓタンパク質からの配列を有するハイブリッドタンパク質である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３６． 修飾ガイドＲＮＡが４０～７０ヌクレオチド長である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３７． 修飾ガイドＲＮＡが４０～１００ヌクレオチド長である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３８． 修飾ガイドＲＮＡが９０～１１０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３９． 修飾ガイドＲＮＡが９０～１３０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４０． 修飾ガイドＲＮＡが１３０～１６０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４１． 修飾ガイドＲＮＡが１６０～２００ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４２． 修飾ガイドＲＮＡがｐｅｇＲＮＡである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４３． ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾が、各々、２’－Ｏ－メチル修飾も含むヌクレオチドに存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４４． ５’末端および３’末端と、
第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾（本実施形態がＢ１．１に従属する場合はこれが遠位末端であることを除く）、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾（本実施形態がＢ１．１に従属する場合はこれがプライム編集末端であることを除く）と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡを使用して細胞内の第２の標的領域を編集するステップをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４５． ５’末端および３’末端と、
第３の標的領域内の第３の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第３の修飾ガイドＲＮＡを使用して細胞内の第３の標的領域における第３の標的遺伝子の発現をモジュレートするステップをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４６． ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４７． ヌクレアーゼがリボヌクレアーゼである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１． 細胞内の核酸における標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）５’末端および３’末端と；
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ１．１． 細胞内の核酸における標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）一方がプライム編集末端であり、他方が遠位末端である５’末端および３’末端を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である修飾ガイドＲＮＡであって、
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、およびプライム編集末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
をさらに含む修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ２． 前記編集が、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ｇＲＮＡによるものよりも高い効率で起こる、実施形態Ｂ１またはＢ１．１に記載の方法。
実施形態Ｂ３． 細胞内の核酸における標的領域内の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質、ならびに
ｂ）５’末端および３’末端と；
標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む修飾ガイドＲＮＡを提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｂ４． モジュレーションが、その他の点で修飾ガイドＲＮＡと同一である未修飾ｇＲＮＡによるものよりも高い効率で起こる、実施形態Ｂ３に記載の方法。
実施形態Ｂ５． 細胞がインビボで存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ６． 細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下でエクスビボで存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ７． 修飾ガイドＲＮＡが、５’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）を含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法（例外：本実施形態が実施形態Ｂ１．１に従属する場合は「５’末端」の代わりに「遠位末端」）。
実施形態Ｂ８． ホスホノカルボキシレートがホスホノアセテートであり、チオホスホノカルボキシレートがチオホスホノアセテートである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ９． 修飾ガイドＲＮＡが、３’末端の５つのヌクレオチド内に少なくとも２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（ＭＳＰ）を含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法（例外：本実施形態が実施形態Ｂ１．１に従属する場合は「５’末端」の代わりに「プライム終止末端」）。
実施形態Ｂ１０． 修飾ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端内の５つのヌクレオチドの外側に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１１． 修飾ガイドＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１２． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして提供される、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１３． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡとして提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１４． ＤＮＡがウイルス発現ベクターである、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
実施形態Ｂ１５． Ｃａｓタンパク質および修飾ガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１６． Ｃａｓタンパク質および／または修飾ガイドＲＮＡが、ナノ粒子中に提供される、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１７． 効率が少なくとも５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１８． 効率が少なくとも１０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１９． 効率が少なくとも１５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２０． 効率が少なくとも２０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２１． 効率が少なくとも２５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２２． 効率が少なくとも３０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２３． 効率が少なくとも３５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２４． 効率が少なくとも４０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２５． 効率が少なくとも４５％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２６． 効率が少なくとも５０％高い、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２７． Ｃａｓタンパク質がＤＮＡの両方の鎖を切断することができる、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２８． Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２９． Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有しない、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３０． Ｃａｓタンパク質が、異種タンパク質をさらに含む融合タンパク質の一部である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３１． Ｃａｓタンパク質がＩＩ型Ｃａｓタンパク質である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３２． Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３３． Ｃａｓ９タンパク質が化膿性連鎖球菌に由来する、実施形態Ｂ３２に記載の方法。
実施形態Ｂ３４． Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片である、実施形態Ｂ１～Ｂ３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３５． Ｃａｓタンパク質が、少なくとも２つの異なる野生型Ｃａｓタンパク質からの配列を有するハイブリッドタンパク質である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３６． 修飾ガイドＲＮＡが４０～７０ヌクレオチド長である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３７． 修飾ガイドＲＮＡが４０～１００ヌクレオチド長である、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３８． 修飾ガイドＲＮＡが９０～１１０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３９． 修飾ガイドＲＮＡが９０～１３０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４０． 修飾ガイドＲＮＡが１３０～１６０ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４１． 修飾ガイドＲＮＡが１６０～２００ヌクレオチド長である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４２． 修飾ガイドＲＮＡがｐｅｇＲＮＡである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４３． ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾が、各々、２’－Ｏ－メチル修飾も含むヌクレオチドに存在する、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４４． ５’末端および３’末端と、
第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾（本実施形態がＢ１．１に従属する場合はこれが遠位末端であることを除く）、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾（本実施形態がＢ１．１に従属する場合はこれがプライム編集末端であることを除く）と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡを使用して細胞内の第２の標的領域を編集するステップをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４５． ５’末端および３’末端と、
第３の標的領域内の第３の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第３の修飾ガイドＲＮＡを使用して細胞内の第３の標的領域における第３の標的遺伝子の発現をモジュレートするステップをさらに含む、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４６． ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ４７． ヌクレアーゼがリボヌクレアーゼである、前記のＢ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0198】
＜セクションＣ＞
実施形態Ｃ１． 細胞内の第１の標的領域および第２の標的領域を含む２つ以上の核酸標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質；
ｂ）５’末端および３’末端と、
第１の標的領域内の第１の標的配列とハイブリダイズできる第１のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第１の修飾ガイドＲＮＡ；ならびに
ｃ）５’末端および３’末端と、
第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできる第２のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、第１および第２の標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｃ２． 細胞内の第２の標的領域における第１の標的領域および第２の標的遺伝子のうちの少なくとも第１の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質；
ｂ）５’末端および３’末端と、
第１の標的領域内の第１の標的配列とハイブリダイズできる第１のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第１の修飾ガイドＲＮＡ；ならびに
ｃ）５’末端および３’末端と、第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできる第２のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、第１および第２の標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｃ３． 第１の標的領域の編集または第１の標的遺伝子のモジュレーションが、第１の修飾ガイドＲＮＡとその他の点で同一の未修飾ガイドＲＮＡのものよりも高い第１の効率を有する、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
実施形態Ｃ４． 第２の標的領域の編集または第２の標的遺伝子のモジュレーションが、第２の修飾ガイドＲＮＡとその他の点で同一の未修飾ガイドＲＮＡのものよりも高い第２の効率を有する、実施形態Ｃ３に記載の方法。
実施形態Ｃ５． 細胞がインビボで存在する、前記のＣ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ６． 細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在する、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ７． Ａ実施形態またはＢ実施形態の各々から適用可能な追加的な限定をさらに含む、前記のＣ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１． 細胞内の第１の標的領域および第２の標的領域を含む２つ以上の核酸標的領域を編集する方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質；
ｂ）５’末端および３’末端と、
第１の標的領域内の第１の標的配列とハイブリダイズできる第１のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第１の修飾ガイドＲＮＡ；ならびに
ｃ）５’末端および３’末端と、
第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできる第２のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、第１および第２の標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｃ２． 細胞内の第２の標的領域における第１の標的領域および第２の標的遺伝子のうちの少なくとも第１の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質；
ｂ）５’末端および３’末端と、
第１の標的領域内の第１の標的配列とハイブリダイズできる第１のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第１の修飾ガイドＲＮＡ；ならびに
ｃ）５’末端および３’末端と、第２の標的領域内の第２の標的配列とハイブリダイズできる第２のガイド配列と、
Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場領域と、
５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、および３’末端の５つのヌクレオチド内の少なくとも２つの連続するホスホノカルボキシレートまたはチオホスホノカルボキシレート修飾と
を含む第２の修飾ガイドＲＮＡ
を提供するステップを含み；
前記細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在し、またはインビボで存在し、
前記提供するステップが、第１および第２の標的遺伝子の発現のモジュレーションを結果としてもたらす、方法。
実施形態Ｃ３． 第１の標的領域の編集または第１の標的遺伝子のモジュレーションが、第１の修飾ガイドＲＮＡとその他の点で同一の未修飾ガイドＲＮＡのものよりも高い第１の効率を有する、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
実施形態Ｃ４． 第２の標的領域の編集または第２の標的遺伝子のモジュレーションが、第２の修飾ガイドＲＮＡとその他の点で同一の未修飾ガイドＲＮＡのものよりも高い第２の効率を有する、実施形態Ｃ３に記載の方法。
実施形態Ｃ５． 細胞がインビボで存在する、前記のＣ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ６． 細胞が、ヌクレアーゼ含有液の存在下のエクスビボで存在する、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ７． Ａ実施形態またはＢ実施形態の各々から適用可能な追加的な限定をさらに含む、前記のＣ実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
例示的なまたは好ましい実施形態の前述の説明は、特許請求の範囲によって定義される場合の本開示を限定するのではなく、例示するものと見なすべきである。容易に認識されるように、上に示される特徴の多数の変形形態および組合せは、特許請求の範囲に示される本開示から逸脱せずに利用することができる。このような変形形態は、本開示の範囲からの逸脱と見なされず、すべてのこのような変形形態は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。
【0200】
本明細書に言及するすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照により本明細書の一部をなすものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】