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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】がんの治療のためのＣＤ３３×Ｖδ２多重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240905BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240905BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C12N1/15 ZNA
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N15/62
C12N15/13
A61K39/395 N
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515863
(86)(22)【出願日】2022-09-12
(85)【翻訳文提出日】2024-04-24
(86)【国際出願番号】 IB2022058572
(87)【国際公開番号】W WO2023037333
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/243,493
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】21202685.0
(32)【優先日】2021-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】ドーナン，パトリック ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ラ ポルテ，シェリー リン
(72)【発明者】
【氏名】シン，サンジャヤ
(72)【発明者】
【氏名】パレン，ポール ウィレム ヘンリ イダ
(72)【発明者】
【氏名】ムラ，サブリナ ジュリア ルイーザ
(72)【発明者】
【氏名】ルーヴァーズ，ロベルツス コルネリス
(72)【発明者】
【氏名】エラシュカル，サラ モハメド エー
(72)【発明者】
【氏名】フィリッパー，ウルリケ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA24
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、多重特異性抗体及び当該抗体を含む医薬組成物、当該抗体を調製するためのプロセス、並びにＣＤ３３を標的とする当該抗体の使用、並びに疾患、例えば、がんの治療におけるそれらの使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域と、を含む、単離された多重特異性抗体であって、前記第１の抗原結合領域が、
ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６、
ａ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２、
ｄ）それぞれ、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８、又は
ｅ）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記第２の抗原結合領域が、前記Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合する、単離された多重特異性抗体。
【請求項2】
前記第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、ａ）それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０、
ｂ）それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７、
ｃ）それぞれ、配列番号３１、３２、及び３３、
ｄ）それぞれ、配列番号３４、３５、及び３６、
ｅ）それぞれ、配列番号３７、３８、及び３９、
ｆ）それぞれ、配列番号４０、４１、及び４２、
ｇ）それぞれ、配列番号４３、４４、及び４５、又は
ｈ）それぞれ、配列番号４６、４７、及び４８、のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び前記ＬＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項4】
前記第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び前記ＬＣＤＲ３を含み、前記第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項5】
前記第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び前記ＬＣＤＲ３を含み、前記第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３を含む、請求項２に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項6】
前記第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３を含む、請求項１に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項7】
ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域とを含み、前記第１の抗原結合領域が、
ａ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、若しくはそれらからなり、又は
かつ
前記第２の抗原結合領域が、
ａ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、若しくは
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、若しくはそれらからなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項8】
ａ）前記単離された多重特異性抗体が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦｄを含み、前記Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦｄが、ヒトＣＤ３３に結合することができる前記第１の抗原結合領域を含むか、又はｂ）前記単離された多重特異性抗体が、
－ヒトＣＤ３３に結合することができる前記第１の抗原結合領域を含むＦａｂと、
－ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる前記第２の抗原結合領域を含む単一ドメイン抗体と、を含むか、又は、
ｃ）前記単離された多重特異性抗体が、
－ヒトＣＤ３３に結合することができる前記第１の抗原結合領域を含むｓｃＦｖと、
－ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる前記第２の抗原結合領域を含む単一ドメイン抗体と、を含む、請求項１に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項9】
前記単離された多重特異性抗体が、ヒトＣＤ３３に結合することができる前記第１の抗原結合領域を含むｓｃＦｖと、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる前記第２の抗原結合領域を含むＶＨＨと、を含み、前記ｓｃＦｖが、配列番号６７～９９に記載のリンカーの群から任意選択的に選択されるペプチドリンカーを含む、請求項８に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項10】
前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、ペプチドリンカーを介して直接的又は間接的に共有結合で連結されており、任意選択的に、前記ペプチドリンカー配列番号１００に記載のリンカー、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項11】
前記第１の抗原結合領域が、前記第２の抗原結合領域のＮ末端に位置している、請求項１０に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項12】
第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項13】
前記単離された多重特異性抗体が、ヒトＣＤ３３に結合することができる前記第１の抗原結合領域を含むＦａｂ、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる前記第２の抗原結合領域を含むＶＨＨを含み、前記単離された多重特異性抗体が、Ｆｃ領域を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項14】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択されるＩｇ定常領域又はその断片を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項15】
前記Ｆｃ領域が、不活性である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項16】
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドのうちの一方又は両方における前記Ｆｃ領域が、２３４に対応する位置にＡｌａ、２３５に対応する位置にＡｌａ、及び２６５に対応する位置にＳｅｒを含み、番号付けがＥｕに従う、請求項１５に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項17】
前記第１のＦｃポリペプチドが、３６６に対応する位置にＴｒｐを含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、３６６に対応する位置にＳｅｒ、３６８に対応する位置にＡｌａ、及び４０７に対応する位置にＶａｌを含むか、又はその逆であり、番号付けがＥｕに従う、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項18】
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドのうちの一方又は両方における前記Ｆｃ領域が、２５２に対応する位置にＴｙｒ、２５４に対応する位置にＴｈｒ、及び２５６に対応する位置にＧｌｕを含み、番号付けがＥｕに従う、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項19】
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドのうちの一方における前記Ｆｃ領域が、４３５に対応する位置にＡｒｇ、及び４３６に対応する位置にＰｈｅを含み、番号付けがＥｕに従う、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項20】
前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項21】
ａ）配列番号１０１、１０２及び１０３に記載のポリペプチド、ｂ）配列番号１０４、１０５及び１０６に記載のポリペプチド、
ｃ）配列番号１０７、１０８及び１０９に記載のポリペプチド、
ｄ）配列番号１１０、１１１及び１１２に記載のポリペプチド、
ｅ）配列番号１１３、１１４及び１１５に記載のポリペプチド、
ｆ）配列番号１１６、１１７及び１１８に記載のポリペプチド、
ｇ）配列番号１１９、１２０及び１２１に記載のポリペプチド、又は
ｈ）配列番号１２２、１２３及び１２４に記載のポリペプチド、を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項23】
医薬としての使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
【請求項24】
血液がんの治療に使用するための、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体であって、任意選択的に、前記血液がんが、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＤＰＤＣＮ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及び混合表現型急性白血病からなる群から選択される、単離された多重特異性抗体。
【請求項25】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸構築物又は核酸構築物の組み合わせ。
【請求項26】
請求項２５に記載の核酸構築物又は核酸構築物の組み合わせを含む、発現ベクター。
【請求項27】
請求項２５に記載の核酸構築物若しくは核酸構築物の組み合わせ、又は請求項２６に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項28】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体の、それを必要とするヒト対象への投与を含む、疾患を治療する方法。
【請求項29】
前記疾患が、血液がんであり、任意選択的に、前記血液がんが、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＤＰＤＣＮ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及び混合表現型急性白血病からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年０３月０８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称はＳＥＱＬＴＸＴ－１．ｔｘｔであり、サイズは２１２キロバイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年０３月０８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称はＳＥＱＬＴＸＴ－１．ｔｘｔであり、サイズは２１２キロバイトである。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、多重特異性抗体及び当該抗体を含む医薬組成物、当該抗体を調製するためのプロセス、及びＣＤ３３を標的とする当該抗体の使用、及び疾患、例えばがんの治療におけるそれらの使用に関する。
本発明は、多重特異性抗体及び当該抗体を含む医薬組成物、当該抗体を調製するためのプロセス、及びＣＤ３３を標的とする当該抗体の使用、及び疾患、例えばがんの治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）における標的化免疫療法には、ＡＭＬ芽球の不均一性及びＡＭＬ特異的抗原の欠如に起因して、依然として実質的な臨床的課題がある。ＣＤ３３を標的とするいくつかの免疫療法、例えば、ＣＤ３３ｘＣＤ３ Ｔ細胞リダイレクト分子及び複数の自己又は同種異系ＣＡＲ Ｔ又はＮＫ細胞療法は、現在、ＡＭＬにおける第１相又は第２相臨床試験を受けている。
【0004】
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、腫瘍細胞の免疫療法を探索するためのＴ細胞の興味深いサブセットである。それらは、循環Ｔ細胞集団の１～５％に相当し、広範ながん群において優勢であり、それらは、変異負荷とは無関係に浸潤する。これらのＴ細胞は、標的細胞上のリガンドのブチロフィリン（butyrophilin、ＢＴＮ）ファミリーにおけるリン酸化抗原媒介性コンフォメーション変化を感知し、これらの細胞を効率的に死滅させる。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対するＰＤＬ１による阻害の影響をあまり受けず、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞集団はＴｒｅｇを含まない。これは、ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャによるＴｒｅｇの活性化に関連する後者の活性を制限することが示されている。加えて、リン酸化抗原活性化ブチロフィリン（ＢＴＮ３Ａ、ＣＤ２２７）の差次的発現は、正常細胞よりもがん細胞に対するγδＴ細胞のより大きな抗腫瘍活性に寄与し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の目的は、ＣＤ３３依存性γδＴ細胞リダイレクションが可能な多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0006】
本発明の目的は、高親和性又は低親和性Ｖδ２結合部のいずれかと対になった異なるＣＤ３３結合部から構成される多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0007】
本発明の目的は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と併せて、ＣＤ３３＋がん細胞及び初代ＡＭＬ芽球に対して細胞傷害性である多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0008】
本発明の目的は、様々な細胞株において強力かつ選択的なＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導する多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0009】
本発明の目的は、既存の療法と比較して安全性及び有効性に関して利点を示す多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0010】
本発明の目的は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の標的依存性脱顆粒、活性化及び増殖を誘導する多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【0011】
本発明の目的は、健康なＣＤ１４＋細胞（単球）よりもＴＨＰ－１がん細胞の優先的な死滅を示す多重特異性又は二重特異性抗体を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体はＣＤ３３発現細胞に結合する。ＴＨＰ－１細胞を様々な濃度のＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘＶδ２二重特異性抗体）とともにインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して、ＦＡＣＳによって結合を検出した。（Ａ）ＣＤ３３結合ドメインとしてＪＬ２、ＪＬ３、ＪＬ５、又はＪＬ６、及びＶδ２結合ドメインとして６Ｈ４を含有するＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体。（Ｂ）ＣＤ３３結合ドメインとしてＪＬ２、ＪＬ３、ＪＬ５又はＪＬ６、及びＶδ２結合ドメインとして５Ｄ３を含有するＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体。
【図2】ＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に結合する。健常ドナーから単離して増殖させたポリクローナルＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、様々な濃度のＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体、ＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘＶδ２二重特異性抗体又は陰性対照抗体（ＬＡＶＡ－１８８、２つの無関係な標的に対する二重特異性抗体）とともにインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して、ＦＡＣＳによって結合を検出した。（Ａ）ＣＤ３３結合ドメインとしてＪＬ２、ＪＬ３、ＪＬ５、又はＪＬ６、及びＶδ２結合ドメインとして６Ｈ４、及びＬＡＶＡ－１８８を含有するＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体。（Ｂ）ＣＤ３３結合ドメインとしてＪＬ２、ＪＬ３、ＪＬ５又はＪＬ６、及びＶδ２結合ドメインとして５Ｄ３、及びＬＡＶＡ－１８８を含有するＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体。
【図3】ＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体は健常なＣＤ１４＋細胞よりも腫瘍細胞の死滅を優先的に媒介する。ＴＨＰ－１標的細胞（パネルＡ）又はＣＤ１４＋標的細胞（パネルＢ）を、様々な濃度のＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体（ＪＬ３ｘ６Ｈ４、ＪＬ５ｘ６Ｈ４、ＪＬ６ｘ６Ｈ４若しくはＪＬ５ｘ５Ｄ３）又は陰性対照抗体（ＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘ６Ｈ４若しくはＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘ５Ｄ３）とともにインキュベートした。ドナーＰＢＭＣ（エフェクタ細胞）を５：１のエフェクタ細胞対標的細胞比で添加し、インキュベーション後、特異的溶解を決定した。
【図4】ＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を誘導する。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクタ細胞）及びＴＨＰ－１細胞（標的細胞）を、１ｎＭのＣＤ３３ｘＶδ２二重特異性抗体（ＪＬ３ｘ６Ｈ４、ＪＬ５ｘ６Ｈ４、ＪＬ６ｘ６Ｈ４又はＪＬ５ｘ５Ｄ３）とともに、１：２０のエフェクタ細胞対標的細胞比でインキュベートした。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞数の増加倍率を、インキュベーションの１、４、７、１１及び１４日後に決定した。パネルＡ及びＢは、２人の異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を表す。陰性対照は、抗体ＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘ６Ｈ４及びＲＳＶ（Ｂ２１Ｍ）ｘ５Ｄ３並びに培地であった。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
「第１の」及び「第２の」抗原結合領域という用語は、本明細書で使用される場合、抗体におけるそれらの配向／位置を指さず、すなわち、それらは、Ｎ末端又はＣ末端に関しても意味を有さない。「第１」及び「第２」という用語は、特許請求の範囲及び説明における２つの異なる抗原結合領域を正確かつ一貫して指すためにのみ役立つ。
「第１の」及び「第２の」抗原結合領域という用語は、本明細書で使用される場合、抗体におけるそれらの配向／位置を指さず、すなわち、それらは、Ｎ末端又はＣ末端に関しても意味を有さない。「第１」及び「第２」という用語は、特許請求の範囲及び説明における２つの異なる抗原結合領域を正確かつ一貫して指すためにのみ役立つ。
【0014】
「ＣＤ３３」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＣＤ３３を指し、その配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２０１３８に記載されている。
【0015】
「ヒトＶδ２」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）の再構成されたδ２鎖を指す。ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ５１１６６．１は、δ２配列の例を与える。ＴＲＤＶ２（T cell receptor delta variable 2）、Ｔ細胞受容体デルタ可変２は、可変領域を表す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０ＪＤ３６（Ａ０ＪＤ３６＿ＨＵＭＡＮ）は、ＴＲＤＶ２配列の例を与える）。「Ｖγ９Ｖδ２－ＴＣＲのＶδ２鎖に結合する」とは、抗体が、別個の分子として及び／又はＶγ９Ｖδ２－ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）の一部としてδ２鎖に結合することができることを意味する。しかし、抗体は、別個の分子としてγ９鎖に結合しない。
【0016】
「ヒトＶγ９」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の再構成されたγ９鎖を指す。ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＧ＿００１３３６．２は、γ９配列の例を与える。ＴＲＧＶ９（T cell receptor gamma variable 9）、Ｔ細胞受容体ガンマ可変９は、可変領域を表す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６０３＿ＨＵＭＡＮは、ＴＲＧＶ９配列の例を与える）。
【0017】
免疫グロブリンのＦｃ（断片結晶化可能）領域は、抗体の断片として定義され、これは典型的にはパパインによる抗体の消化後に生成され、免疫グロブリンの２つのＣＨ２－ＣＨ３領域及び連結領域、例えばヒンジ領域を含む。抗体重鎖の定常ドメインは、抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥを定義する。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系のタンパク質を有する抗体のエフェクタ機能を媒介する。
【0018】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸２１６～２３０に対応する。
【0019】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２領域」又は「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸２３１～３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書に記載の他の抗体アイソタイプのいずれであってもよい。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ３領域」又は「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ３領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸３４１～４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書に記載の他の抗体アイソタイプのいずれであってもよい。
【0021】
しかしながら、いくつかの実施形態では、抗体のＦｃ領域は、不活性になるように修飾されている。「不活性」は、任意のＦｃガンマ受容体に結合する能力、ＦｃＲのＦｃ媒介性架橋を誘導する能力、又は個々の抗体の２つのＦｃ領域を介して標的抗原のＦｃＲ媒介性架橋を誘導する能力が最小限であるか、又は全くないＦｃ領域を意味する。不活性Ｆｃ領域は、更に、Ｃ１ｑに結合することができなくてもよい。
【0022】
「アイソタイプ」という用語は、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリン（サブ）クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はそれらの任意のアロタイプ、例えば、以下の表２のアロタイプ）を指す。各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。
【0023】
本発明の文脈において、「競合」又は「競合することができる」又は「競合する」は、結合パートナーに結合する別の分子（例えば、同じ標的に結合する異なる抗体）の存在下で、特定の結合分子（例えば、抗体）が特定の結合パートナー（例えば、標的）に結合する傾向の任意の検出可能な有意な低減を指す。典型的には、競合は、例えば、十分な量の２つ又は３つ以上の競合分子、例えば、抗体を使用するＥＬＩＳＡ分析又はフローサイトメトリによって決定されるような、抗体などの別の分子の存在によって引き起こされる結合の少なくとも約２５パーセントの減少、例えば少なくとも約５０パーセント、例えば少なくとも約７５パーセント、例えば少なくとも９０パーセントの減少を意味する。競合阻害によって結合特異性を決定するための更なる方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，５８９－６０１（１９８３））に見出すことができる。
【0024】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせ等が含まれる。
【0025】
「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」という移行句は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、及び、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲を制限する。「備える／含む」という語句（又はその同義語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態を実施形態として提供する。
【0026】
「約」は、当業者によって求められた特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は本明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の慣行による１標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【0027】
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」又は「刺激された」は、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、増殖、又は標的細胞の細胞傷害の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化されてもよい。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制し得、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能をもたらす。
【0028】
「代替足場」は、立体配座許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する、単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、足場の完全性を損なうことなく、導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように操作及び選択され得る。
【0029】
「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合ドメイン又はＴ細胞受容体が結合することができる任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得るか、当該サンプルから合成され得るか、又は当該サンプルから精製され得る。
【0030】
「抗原結合領域」又は「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」とは、抗原に結合する抗体の部分を指す。抗原結合領域は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの一部、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（domain antibodies、ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合する代替足場、並びに抗原結合領域を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合ドメイン（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して一緒に連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合に、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成し得る、様々な種類の単一抗体設計を形成してもよい。抗原結合領域はまた、二重特異性タンパク質及び多重特異性タンパク質を操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得るその他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替足場にコンジュゲートさせてもよい。
【0031】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）で構成される。軽鎖は、存在する場合、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）及び軽鎖定常領域（light chain constant region、ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に細分化され得る。ＶＨ又はＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【0032】
「二重特異性」は、同じ抗原内の２つの異なる抗原、又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（抗体など）を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト、サル、又は類人猿、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ，ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、あるいは、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
【0033】
異なるクラスの二重特異性抗体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ヘテロ二量体化を強制するための相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、（ｉｉ）組換えＩｇＧ様二重標的化分子（この分子の２つの側面は各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部を含む）、（ｉｉｉ）完全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部に融合されているＩｇＧ融合分子、（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子若しくは安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、若しくはその一部に融合されているＦｃ融合分子、（ｖ）異なるＦａｂ断片は一緒に融合され、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合される、Ｆａｂ融合分子、及び（ｖｉ）異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））が、互いに、又は重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域若しくはその一部に融合された別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている、ｓｃＦｖ及びダイアボディに基づく重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ （登録商標））。
【0034】
相補的ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子の例としては、Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ （Ｒｏｃｈｅ）及び静電的にマッチさせたもの（Ａｍｇｅｎ、Ｃｈｕｇａｉ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧ－ｂｏｄｙ及びＰＩＧ－ｂｏｄｙ（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ、国際公開第２０１０１３４６６６号、国際公開第２０１４０８１２０２号）、鎖交換組換えドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（Ｍｅｒｕｓ、国際公開第２０１３１５７９５３号）、ＦｃΔＡｄｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ２（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ）、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ）、ｍＡｂ－Ｆｖ（Ｘｅｎｃｏｒ）、二価二重特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２００９０８０２５４号）及びＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
組換えＩｇＧ様二重標的化分子の例としては、二重標的化（Dual Targeting、ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ、国際公開第２００９０５８３８３号）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．２００９。Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ｚｙｎｇｅｎｉａ、ＬａＦｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８）、共通軽鎖を用いるアプローチ、κλボディ（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ、国際公開第２０１２０２３０５３号）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（登録商標）（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ、Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５０１－５０６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0036】
ＩｇＧ融合分子の例としては、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、二重ドメインダブルヘッド抗体（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ；Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、国際公開第２０１０１１１６２５号）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ｓｃＦｖ融合体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｓｃＦｖ融合体（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
Ｆｃ融合分子の例としては、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ；４２（６）：１１７９）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ＃５４６５）；Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ、国際公開第２０１０１１１６２５号）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0038】
Ｆａｂ融合二重特異性抗体としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（登録商標）（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
ｓｃＦｖ－、ダイアボディベースの及びドメイン抗体の例としては、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標））（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的化技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７９－８４）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、国際公開第２０１００５９３１５号）及びＣＯＭＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５）、二重標的化ナノボディ（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ、Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、二重標的化重鎖単独ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の多重特異性抗体は、ＶＨＨ－Ｆｃ形式であってもよく、すなわち、抗体は、ヒトＦｃ領域二量体を介して互いに連結された２つ又は３つ以上の単一ドメイン抗原結合領域を含む。この形式において、各単一ドメイン抗原結合領域は、Ｆｃ領域ポリペプチドに融合され、２つの融合ポリペプチドは、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して二量体二重特異性抗体を形成する。このような構築物は、典型的には、完全なＣＨ１配列又は軽鎖配列を含まないか、又は全く含まない。国際公開第０６０６４１３６号の図１２Ｂは、この形式の例の説明図を提供する。
【0040】
二重特異性抗体は、混合形式であってもよい。例えば、一方の抗原結合領域は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ形式であってもよく、他方の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体で構成されるか、又は単一ドメイン抗体からなってもよい。このような構築物は、ヒンジ領域を介してＦｃポリペプチドを連結するＦｃ領域を更に含んでもよい。
【0041】
「相補性決定領域」（Complementarity determining region、ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには、存在する場合、３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、ＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）、又はＣｏｎｔａｃｔなどの様々な記述を使用して定義することができ、これらは利用可能な複合体結晶構造の解析に基づいている（ＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｒ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）。様々な記述と、可変領域の番号付けとの対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照されたい）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを記述することができる。「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。配列番号１～４８を有する配列のＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔに従って定義される。
【0042】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系で利用することができるベクターを指す。
【0043】
「単一ドメイン抗体」、「ｄＡｂ」、「ＶＨＨ」、又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。本発明の第２の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）又はＶＨＨとも呼ばれる）は、当業者に周知であり、例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６、Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９：３２７及びＫｒａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ３８：２１を参照されたい。単一ドメイン抗体は、単一のＣＤＲ１、単一のＣＤＲ２及び単一のＣＤＲ３を含む。単一ドメイン抗体の例は、重鎖のみの抗体、天然に軽鎖を含まない抗体、従来の抗体に由来する単一ドメイン抗体、及び操作された抗体の可変断片である。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、天然に存在するＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、及びグアナコで産生された抗体に由来し得る。全抗体と同様に、単一ドメイン抗体は、単一の特異的抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、免疫グロブリン鎖の可変ドメイン、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにフレームワーク領域のみを含有し得る。
【0044】
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
【0045】
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含有する抗体断片を指す。
【0046】
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
【0047】
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。
【0048】
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
【0049】
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限になるように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、その定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットである。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク、ＣＤＲ、若しくは定常領域への体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【0050】
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【0051】
「単離された」は、組換え細胞などにおいて分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されているタンパク質を指す。「単離された」とは、その他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
【0052】
「多重特異性」は、２つ若しくは３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ若しくは３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト、サル、又は類人猿、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル（cynomolgus）、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
【0053】
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネータ配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。動作可能に連結されたペプチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
【0054】
「医薬組成物」は、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
【0055】
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、緩衝液、安定剤、又は防腐剤である。
【0056】
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」は、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
【0057】
２つの配列間の「配列同一性」のパーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定されてもよく、同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ＿ｇｃｇ＿ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、ギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することもできる。
【0058】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、ＶＬ及びＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を基準として、いずれの順序で有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでも、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
【0059】
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合すること」、又は「結合する」は、タンパク質性分子が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合すること、又は結合することができることを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さいＫＤで、抗原又は抗原内のエピトープに結合する。
【0060】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
【0061】
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は、互換的であり、本明細書では同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も挙げられるが、これは、半不変異体αβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの、典型的にはＮＫ細胞と関連する様々な分子マーカーもまた発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣＩ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で、独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。「ガンマ－デルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、非古典的Ｔ細胞抗原を認識する能力を有する別個のＴＣＲをその表面上に有するＴ細胞の特殊化された集団を指し、ＴＣＲがα－及びβ－ＴＣＲ鎖と称される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。異なるタイプのγ鎖及びδ鎖、例えば、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞上で同時発現されるＶγ９及びＶδ２鎖などが存在する。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、また、ＩＬ－１７の重要な供給源でありかつ強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、また、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性制御性Ｔ細胞も含み得る。
【0062】
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってもよい。有効な治療薬又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の増殖の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所へのがん細胞の転移の非存在が含まれる。
【0063】
がんなどの疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、以下のうちの１つ若しくは２つ以上を達成することを指す：障害の重症度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害の特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害の症状を有していた対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
【0064】
「腫瘍細胞」又は「がん細胞」は、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自発的な又は誘導された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
【0065】
「バリアント」、「変異体」、又は「変化した」は、１つ若しくは２つ以上の修飾、例えば、１つ若しくは２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【0066】
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載されない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
【0067】
【表1-1】
【0068】
【表1-2】
【0069】
【表1-3】
【0070】
【表1-4】
【0071】
【表1-5】
【0072】
【表1-6】
【0073】
【表1-7】
【0074】
【表1-8】
【0075】
【表1-9】
【0076】
本発明の更なる態様及び実施形態
上記のように、第１の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域とを含む、単離された多重特異性抗体に関し、第１の抗原結合領域が、
ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６、
ａ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２、
ｄ）それぞれ、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８、又は
ｅ）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
第２の抗原結合領域が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合する。
上記のように、第１の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域とを含む、単離された多重特異性抗体に関し、第１の抗原結合領域が、
ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６、
ａ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２、
ｄ）それぞれ、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８、又は
ｅ）それぞれ、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
第２の抗原結合領域が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合する。
【0077】
第２の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体であってもよく、
ａ）それぞれ、配列番号２５、２６及び２７、
ｂ）それぞれ、配列番号２８、２９及び３０、
ｃ）それぞれ、配列番号３１、３２及び３３、
ｄ）それぞれ、配列番号３４、３５及び３６、
ｅ）それぞれ、配列番号３７、３８及び３９、
ｆ）それぞれ、配列番号４０、４１及び４２、
ｇ）それぞれ、配列番号４３、４４、及び４５、又は
ｈ）それぞれ、配列番号４６、４７、及び４８、のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
ａ）それぞれ、配列番号２５、２６及び２７、
ｂ）それぞれ、配列番号２８、２９及び３０、
ｃ）それぞれ、配列番号３１、３２及び３３、
ｄ）それぞれ、配列番号３４、３５及び３６、
ｅ）それぞれ、配列番号３７、３８及び３９、
ｆ）それぞれ、配列番号４０、４１及び４２、
ｇ）それぞれ、配列番号４３、４４、及び４５、又は
ｈ）それぞれ、配列番号４６、４７、及び４８、のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【0078】
第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含んでもよい。
【0079】
第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含んでもよく、第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【0080】
第１の抗原結合領域が、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含んでもよく、第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３を含む。
【0081】
第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３を含む。
【0082】
本発明の多重特異性抗体は、
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、若しくはそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、若しくはそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0083】
本発明の多重特異性抗体は、ヒトＶδ２への結合について、配列番号５７～６６から選択される配列を有する抗体と競合する第２の抗原結合領域を含み得る。
【0084】
本発明の多重特異性抗体は、配列番号５７～６６から選択される配列を有する抗体と同じヒトＶδ２上のエピトープに結合する第２の抗原結合領域を含み得る。
【0085】
本発明の多重特異性抗体は、
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0086】
本発明の多重特異性抗体は、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0087】
本発明の多重特異性抗体は、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0088】
本発明の多重特異性抗体は、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５９に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号６０に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｅ）配列番号６１に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｆ）配列番号６２に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｇ）配列番号６３に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｈ）配列番号６４に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、又は
ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0089】
本発明の多重特異性抗体は、
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ｂ）配列番号５８に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0090】
本発明の多重特異性抗体は、
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含み、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
ａ）配列番号４９のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５０のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５１のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５２のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５３のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５４のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５５のＶＨ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及び配列番号５６のＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含み、又はそれらからなる、第１の抗原結合領域、
並びに
ａ）配列番号５７に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列、を含むか、又はそれからなる、第２の抗原結合領域、を含み得る。
【0091】
本明細書中に開示される配列のバリアントは、好ましくは、開示される配列の保存的修飾を含む。「保存的修飾」は、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、アラニンスキャニング変異誘発（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）について以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によって行うことができる。代替的に、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば、１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、その特徴について試験することができる。
【0092】
本発明の多重特異性抗体は、任意の適切な抗体形式を有し得る。多くの抗体形式が当技術分野において記載されている。
【0093】
多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域を含むＦａｂ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｄを含み得る。
【0094】
ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域は、任意の適切な形式、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ又は単一ドメイン抗体であり得る。多重特異性抗体は、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域を含むか、又はそれからなる単一ドメイン抗体を含み得る。
【0095】
多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域を含むＦａｂと、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域を含む単一ドメイン抗体とを含み得る。
【0096】
多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域を含むｓｃＦｖと、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域を含む単一ドメイン抗体とを含み得る。
【0097】
抗体形式に応じて、抗原結合領域又はその一部は、同じポリペプチド鎖の一部であってもよく、単一のオープンリーディングフレームから発現されてもよい。そのような実施形態では、抗原結合領域配列間にリンカー配列を使用することができる。
【0098】
多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域を含むｓｃＦｖと、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域を含むＶＨＨとを含んでもよく、ｓｃＦｖは、配列番号６７～９９、例えば配列番号６７に記載のリンカーの群から任意選択的に選択されるペプチドリンカーを含む。
【0099】
第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、ペプチドリンカーを介して直接的又は間接的に共有結合で連結されてもよく、任意選択的にペプチドリンカーは、配列番号１００に記載の配列を含むか、又はそれからなる。
【0100】
多重特異性抗体は、第１の抗原結合領域が第２の抗原結合領域のＮ末端側に位置する単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。Ｎ末端からＣ末端への順序は、ＶＬ－第１のリンカー－ＶＨ－第２のリンカー－ＶＨＨであってもよく、ここでＶＬは第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変領域であり、第１のリンカーはペプチドリンカーであり、ＶＨは第１の抗原結合ドメインの重鎖可変領域であり、第２のリンカーはペプチドリンカーであり、ＶＨＨは第２の抗原結合領域を含む単一ドメイン抗体である。多重特異性抗体は、第１の抗原結合領域が第２の抗原結合領域のＣ末端側に位置する単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
【0101】
本発明の多重特異性抗体は、定常領域配列、例えば、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み得る。したがって、多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３に結合することができる第１の抗原結合領域を含むＦａｂ、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合領域を含むＶＨＨ、及びＦｃ領域を含み得る。
【0102】
多重特異性抗体は、
－配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0103】
多重特異性抗体は、
－配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0104】
多重特異性抗体は、
－配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0105】
多重特異性抗体は、
－配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0106】
多重特異性抗体は、
－配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0107】
多重特異性抗体は、
－配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0108】
多重特異性抗体は、
－配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0109】
多重特異性抗体は、
－配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
－配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常配列を含む第１のポリペプチドと、
－配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常配列を含む第２のポリペプチドと、
－配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃ配列を含む第３のポリペプチドと、を含み得る。
【0110】
本発明の単離された多重特異性抗体は、
ａ）配列番号１０１、１０２及び１０３に記載のポリペプチド、
ｂ）配列番号１０４、１０５及び１０６に記載のポリペプチド、
ｃ）配列番号１０７、１０８及び１０９に記載のポリペプチド、
ｄ）配列番号１１０、１１１及び１１２に記載のポリペプチド、
ｅ）配列番号１１３、１１４及び１１５に記載のポリペプチド、
ｆ）配列番号１１６、１１７及び１１８に記載のポリペプチド、
ｇ）配列番号１１９、１２０及び１２１に記載のポリペプチド、又は
ｈ）配列番号１２２、１２３及び１２４に記載のポリペプチド、を含み得るか、又はそれらからなり得る。
ａ）配列番号１０１、１０２及び１０３に記載のポリペプチド、
ｂ）配列番号１０４、１０５及び１０６に記載のポリペプチド、
ｃ）配列番号１０７、１０８及び１０９に記載のポリペプチド、
ｄ）配列番号１１０、１１１及び１１２に記載のポリペプチド、
ｅ）配列番号１１３、１１４及び１１５に記載のポリペプチド、
ｆ）配列番号１１６、１１７及び１１８に記載のポリペプチド、
ｇ）配列番号１１９、１２０及び１２１に記載のポリペプチド、又は
ｈ）配列番号１２２、１２３及び１２４に記載のポリペプチド、を含み得るか、又はそれらからなり得る。
【0111】
本発明の単離された多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり得る。
【0112】
本発明の単離された多重特異性抗体は、ＣＤ３３に一価で結合し得、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体に一価で結合し得る。
【0113】
本発明の抗体の第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ヒトであってもヒト化されていてもよい。
【0114】
多重特異性抗体は、例えば、本明細書に記載の実施例に記載されたように試験された場合、１ｎＭの抗体濃度で１０日後に１０倍超又は５０倍超の増加で、標的細胞の存在下でヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を誘導することが可能であり得る。
【0115】
本発明の多重特異性抗体は、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の存在下で、低いエフェクタ対標的細胞比を含めて、ＴＨＰ－１細胞の死滅を媒介することが可能であり得る。したがって、本発明の多重特異性抗体は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように試験した場合、Ｅ：Ｔ比は１：２０にて、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（Ｅ）の存在下で、１ｎＭ未満、例えば０．５ｎＭ、例えば２００ｐＭ未満、例えば１５０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＴＨＰ－１細胞（Ｔ）の死滅を媒介することができ得る。
【0116】
本発明の多重特異性抗体は、血液がん患者由来のヒトＣＤ３３発現細胞の死滅を媒介することができ得る。
【0117】
本発明の多重特異性抗体は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように試験した場合、非腫瘍細胞、例えば健常ドナー由来のＣＤ１４＋細胞よりも、ＣＤ３３陽性腫瘍細胞、例えばＴＨＰ－１細胞の死滅を優先的に媒介することができ得る。
【0118】
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ操作
本開示の抗体中に存在するＩｇ定常領域、Ｉｇ定常領域又は断片、例えばＦｃ領域は、いずれのアロタイプ又はアイソタイプのものであってもよい。
本開示の抗体中に存在するＩｇ定常領域、Ｉｇ定常領域又は断片、例えばＦｃ領域は、いずれのアロタイプ又はアイソタイプのものであってもよい。
【0119】
本開示の単離された多重特異性抗体は、Ｉｇ定常領域又はその断片、例えば、断片結晶化可能領域（「fragment crystallizable、Ｆｃ」領域）を含み得る。当該Ｉｇ定常領域又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択される。
【0120】
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクタ機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。その断片のＩｇ定常領域を含む治療用抗体の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮と関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。その断片のＩｇ定常領域を含む治療用抗体が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表２は、選択されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
【0121】
【表2】
【0122】
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量は、既知の方法を使用して測定することができる。
【0123】
抗原結合断片にコンジュゲートされたＩｇ定常領域は、０％～１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約８０％、約４０％～約７０％、約５５％～約７０％、又は約６０％のＣ末端リジン含量を有し得る。
【0124】
Ｉｇ定常領域又は抗原結合ドメインにコンジュゲートされたその断片に対してＦｃ領域変異を行って、Ｆｃ受容体へのそれらの結合を調節し、それによってＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／若しくはＡＤＣＰなどのそれらのエフェクタ機能並びに／又は薬物動態特性を調節することができる。これは、（ｉ）変異Ｆｃの活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、及び阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を調節する、及び／又は（ｉｉ）Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）若しくは食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクタ機能を低下させ、Ｆｃ受容体陽性細胞への二重特異性抗体の結合を介する抗原非依存性Ｔ細胞活性化を減少させる、変異を、Ｆｃに導入することによって達成され得る。
【0125】
本開示の単離された多重特異性抗体のＦｃ領域は不活性であり得る。本開示の単離された多重特異性抗体の不活性Ｆｃ領域は、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方又は両方において、２３４に対応する位置にＡｌａ、２３５に対応する位置にＡｌａ、及び２６５に対応する位置にＳｅｒを含んでもよく、番号付けはＥｕに従う。
【0126】
Ｆｃ領域は、抗体のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合の低減をもたらす少なくとも１つの変異を含み得る。活性化ＦｃγＲへの抗体の結合を低減させ、続いて、エフェクタ機能を低減させるために変異させ得るＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低減した抗体をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
【0127】
ＣＤＣが低減した抗体をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
【0128】
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
【0129】
任意選択的に、ＦｃγＲへの抗原の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され得、残基番号付けはＥＵインデックスに従う。
【0130】
本開示の抗体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の結合を増強し、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクタ機能を増強する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含み得る。
【0131】
Ｆｃ領域は、ＦｃγＲへの抗体の増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含み得る。タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0132】
抗体の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させる、かつ／又はＦｃエフェクタ機能を増強するために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６，２９０，２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（残基番号付けはＥＵインデックスに従う）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加した抗体をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
【0133】
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加した抗体をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
【0134】
本明細書に記載の特異性変異は、配列番号１２５、１２６、及び１２７それぞれのＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
【0135】
抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合は、フローサイトメトリを使用して、各受容体を発現するように遺伝子操作された細胞にて評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中、４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体とともにインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬの染色緩衝液中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用してＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲーティングし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
【0136】
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることが可能なＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
【0137】
言い換えれば、本開示の単離された多重特異性抗体において、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方又は両方におけるＦｃ領域は、２５２に対応する位置にＴｙｒ、２５４に対応する位置にＴｈｒ、及び２５６に対応する位置にＧｌｕを含んでもよく、番号付けはＥｕに従う。
【0138】
本開示の抗原結合断片は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成される完全長多重特異性抗体に遺伝子操作してもよく、インビトロでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に置換が導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を操作してもよい。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithiothreitol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができる。
【0139】
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電的マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ、Ｍｅｒｕｓ）、鎖交換組換えドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
【0140】
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。言い換えれば、本開示の単離された多重特異性抗体において、第１のＦｃポリペプチドは、３６６に対応する位置にＴｒｐを含んでもよく、第２のＦｃポリペプチドは、３６６に対応する位置にＳｅｒ、３６８に対応する位置にＡｌａ、及び４０７に対応する位置にＶａｌ、又はその逆を含んでもよく、番号付けは、Ｅｕに従う。
【0141】
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
【0142】
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
【0143】
ＳＥＥＤｂｏｄｙ変異は、米国特許出願公開第２００７０２８７１７０号に記載のように、選択ＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
【0144】
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
【0145】
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９１５０６６３号及び米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
【0146】
追加の二重特異性又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）（国際特許公開第２００９／１３４７７６号、ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択的である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、同第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び遺伝子操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、二重標的化（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、二重親和性再標的化技術（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Bispecific T Cell Engager、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Tandem Diabody、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的化技術（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
【0147】
本開示の単離された多重特異性抗体において第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、プロテインＡへの結合を調節する少なくとも１つの変異を含み得る。そのような修飾は、抗体産生中の精製目的に有利であり得る。そのような少なくとも１つの変異は、第１若しくは第２のＦｃポリペプチド、又はその両方に存在し得る。
【0148】
プロテインＡへの結合を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ及びＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆの変異を含み得、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0149】
本開示の抗原結合ドメインはまた、３本のポリペプチド鎖を含む多重特異性抗体に操作してもよい。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては以下が挙げられる（「１」は第１の抗原結合ドメインを示し、「２」は第２の抗原結合ドメインを示し、「３」は第３の抗原結合ドメインを示す。
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
【0150】
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
【0151】
糖鎖操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインのＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化され得る。ここで、グリカンの大部分は、既知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介して抗体のＡＤＣＣが増強される。そのような抗体は、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの同時発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６、Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）を使用して達成することができる。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインのＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化され得る。ここで、グリカンの大部分は、既知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介して抗体のＡＤＣＣが増強される。そのような抗体は、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの同時発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６、Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）を使用して達成することができる。
【0152】
本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインは、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有し得る。代替的に、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインは、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含量を有するグリカン構造を有し得る。
【0153】
「フコース含量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらの糖構造は、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６２号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量化、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性評価及び定量化され得る。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリクス支援レーザ脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリ電気泳動－レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び同定することができる。
【0154】
「低フコース」又は「低フコース含量」は、本明細書で使用される場合、約１％～１５％のフコース含量を有する、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインを指す。
【0155】
「正常フコース」又は「正常フコース含量」は、本明細書で使用される場合、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含量を有する、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした抗原結合ドメインを指す。
【0156】
ポリヌクレオチド、宿主細胞、及びベクター
本開示はまた、本開示の多重特異性抗体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせも提供する。これらの多重特異性抗体は、ＣＤ３３に結合する抗原結合ドメインと、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合する抗原結合ドメインと、を含む。
本開示はまた、本開示の多重特異性抗体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせも提供する。これらの多重特異性抗体は、ＣＤ３３に結合する抗原結合ドメインと、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合する抗原結合ドメインと、を含む。
【0157】
本発明はまた、ＣＤ３３結合抗体又はその断片のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0158】
本発明はまた、配列番号４９、５１、５３、又は５５のＶＨをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0159】
本発明はまた、配列番号５０、５２、５４、又は５６のＶＬをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0160】
本開示のいくつかの実施形態はまた、本開示のＣＤ３３及びＶδ２結合二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド、又は本開示のＣＤ３３及びＶδ２結合二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離又は精製核酸を提供する。
【0161】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオチドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は点在するミスマッチをほんのわずかに含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列とマッチしたいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を有することになったランダム配列と識別する条件を含む。そのような相補的な小領域は、１４～１７以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物によって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間の不一致を、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
【0162】
本開示のポリヌクレオチド配列は、意図とする宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させる１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサ）に動作可能に連結し得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。プロモータは、強い、弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモータであってもよい。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられる。メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含むプロモータなどの誘導性プロモータを使用することもできる。
【0163】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってもよい。本開示のＣＤ３３及びＶδ２結合抗体をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３３及びＶδ２結合タンパク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、１つ若しくは２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサ、他の５’若しくは３’隣接非転写配列、５’若しくは３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ部位、又は転写終結配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
【0164】
発現ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない若しくは改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
【0165】
ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる本開示のＣＤ３３及びＶδ２結合抗体を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
【0166】
本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム侵入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部の抗体の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方式で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【0167】
本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来してもよい。
【0168】
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
【0169】
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に、薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【0170】
ベクターはまた、当技術分野において周知の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノール×耐性遺伝子）、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流にあっても下流にあってもよい。
【0171】
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってよい。
【0172】
ベクターは、（ｉ）配列番号４９、５１、５３、若しくは５４のＶＨをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号５０、５２、５４、又は５６のＶＬをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５７若しくは５８のＶＨＨをコードするポリヌクレオチド、（ｉｖ）又はそれらの任意の組み合わせ、を含み得る。これらのポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上の発現ベクターから同じ宿主細胞において同時発現され得る。
【0173】
いくつかの実施形態では、ベクターは、
ａ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号５０のＶＬ、
ｂ）配列番号５１のＶＨ及び配列番号５２のＶＬ、
ｃ）配列番号５３のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ、
ｄ）配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｅ）配列番号６７～１００のいずれかのリンカー、
ｆ）配列番号１３０～１３３のＳｃＦｖ、
ｇ）配列番号５７又は５８のＶＨＨ、
ｈ）配列番号１２８のＦｃ領域、又は
ｉ）それらの任意の組み合わせ、を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
ａ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号５０のＶＬ、
ｂ）配列番号５１のＶＨ及び配列番号５２のＶＬ、
ｃ）配列番号５３のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ、
ｄ）配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｅ）配列番号６７～１００のいずれかのリンカー、
ｆ）配列番号１３０～１３３のＳｃＦｖ、
ｇ）配列番号５７又は５８のＶＨＨ、
ｈ）配列番号１２８のＦｃ領域、又は
ｉ）それらの任意の組み合わせ、を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【0174】
また、本発明は、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後続世代においてある特定の修飾が生じ得るため、そのような後代は、親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、及びサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＰｉｃｈｉａである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞は、ハイブリドーマなどの不死化細胞株、又はＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株などの骨髄腫細胞株を含む。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【0175】
本開示はまた、本開示の抗体を産生する方法であって、Ｋ２結合タンパク質が発現される条件で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された抗体を収集することと、を含む、方法を提供する。タンパク質を作製し、それを精製する方法は既知である。合成されたら（化学的に又は組換えによって）、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などの標準的な手順に従って抗体を精製することができる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）。対象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約８０％～８５％、純度が少なくとも約８５％～９０％、純度が少なくとも約９０％～９５％、又は純度が少なくとも約９８％～９９％、若しくはそれ以上であってよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてよい。
【0176】
本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学的方法を使用してベクターに組み込まれ得る。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチドを発現させることを含む、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【0177】
ポリペプチドが異なる核酸によってコードされる別々の鎖から形成される場合、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチドを発現させることを含む、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【0178】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0179】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0180】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0181】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５８のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0182】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号４９のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５０のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0183】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５１のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５２のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0184】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５３のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５４のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0185】
本発明の第１のポリヌクレオチドは、配列番号５５のＶＨ及び重鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第２のポリヌクレオチドは、配列番号５６のＶＬ及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドをコードし得、本発明の第３のポリヌクレオチドは、配列番号５７のＶＨＨ及びＦｃポリペプチドを含むポリペプチドをコードし得る。
【0186】
修飾ヌクレオチドを使用して、本開示のポリヌクレオチドを生成することができる。例示的な修飾ヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５”－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンである。
【0187】
医学的使用及び治療方法
本開示の単離された多重特異性又は二重特異性抗体は、特にがんの処置のための薬剤として使用され得る。
本開示の単離された多重特異性又は二重特異性抗体は、特にがんの処置のための薬剤として使用され得る。
【0188】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体による治療に適した例示的ながんとしては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome、ＭＤＳ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄白血病（chronic myeloid leukemia、ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm、ＤＰＤＣＮ）、骨髄増殖性新生物（myeloproliferative neoplasm、ＭＰＮ）、及び混合表現型急性白血病からなる群から選択される血液がんが挙げられる。
【0189】
本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の単離された二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体を、それを必要とする患者に、がんを治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、がんを有する対象を治療する方法において使用するための、特許請求の範囲で定義される多重特異性又は二重特異性抗体である。
【0190】
投与／医薬組成物
本開示は、本明細書に開示される多重特異性又は二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び医薬的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の多重特異性又は二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、それとともに活性化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本開示の分子又は本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで大きく変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
本開示は、本明細書に開示される多重特異性又は二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び医薬的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の多重特異性又は二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、それとともに活性化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本開示の分子又は本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで大きく変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
【0191】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体を治療的に使用するための投与方法は、宿主に薬剤を送達する任意の好適な経路であり得、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子の、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに入れられた製剤を使用する非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与であり、又は当該技術分野において周知の、当業者によって認識される他の手段に収容されていてもよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【0192】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体と、を含むように調製することができる。
【0193】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、例えば、静脈内（intravenous、ＩＶ）注射又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の好適な経路によって患者に投与することができる。ＩＶ注射は、１５分ほどで投与してもよいが、多くの場合、３０分、６０分、９０分、又は更には２、３、４、５、６若しくは７時間にわたって投与することができる。本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、疾患の部位（例えば、腫瘍自体）に直接注射することもできる。がんを有する患者に投与される用量は、治療される疾患を緩和するか又は少なくとも部分的に抑制するうえで十分な量（「治療有効量」）であり、しばしば、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８，９、又は１０ｍｇ／ｋｇであるが、更に高くてもよく、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、５０、１００、２００、５００、又は１０００ｍｇの固定単位用量が与えられるか、又は用量は、患者の表面積、例えば、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２に基づいてもよい。がんを治療するには、通常、１～８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８回）を投与することができるが、１０、１２、２０回以上の用量が投与される場合もある。本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に繰り返すことができる。また、治療過程を繰り返すことも、長期にわたる投与として可能である。繰り返し投与は、同一用量であっても異なる用量であってもよい。
【0194】
例えば、本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体を含む静脈内注入用の医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与する際には、約２００ｍＬの減菌リンガー液と、約８ｍｇ～約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ～約８００ｍｇの二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体とを含有するように調製することができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【0195】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体を、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成させてもよい。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【0196】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、第２の治療剤と組み合わせて、同時、順次、又は別々に投与することができる。第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん療法であり得る。
【0197】
二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、化学療法薬又は当業者に既知の他の抗がん治療薬のうちのいずれか１つ又は２つ以上と一緒に投与され得る。
【0198】
本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体が第２の治療剤と組み合わせて投与される場合、組み合わせは、任意の好都合な時間枠にわたって行われ得る。例えば、二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び第２の治療薬は、同日に、更に同じ静脈内注入で患者に投与されてよい。ただし、二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び第２の治療剤はまた、隔日又は隔週又は隔月などで投与されてもよい。いくつかの方法では、二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び第２の治療剤は、それらが、治療される患者内に感知可能な濃度で同時に（例えば、血清中に）存在する十分近接した時間内に投与される。いくつかの方法では、ある期間にわたる多数の投与回数からなる二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体による治療のコース全体は、多数の投与回数からなる第２の治療剤による治療のコースがその後に続くか、又はそれに先立って行われる。いくつかの方法では、２番目に投与される二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体による治療は、患者が最初に投与された第２の治療剤に対して耐性を有するか又は耐性を生じる場合に開始される。患者は、二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体及び第２の治療剤の一方又は両方による治療の単一コースのみを受けても又は複数コースを受けてもよい。１日、２日、若しくは数日、又は数週間の回復期間が、二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体の投与と第２の治療剤の投与との間に用いられてよい。第２の治療剤について適切な治療レジメンが既に確立されている場合、そのレジメンは、本発明の二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体と組み合わせて使用され得る。
【0199】
二重特異性ＣＤ３３／δ２抗体は、任意選択的に、第２の治療薬と組み合わせて、任意の形態の放射線療法、及び任意の形態の放射線手術、及び／又は手術と一緒に投与され得るが、そのような放射線療法には、体外照射療法、強度変調放射線療法（intensity modulated radiation therapy、ＩＭＲＴ）が挙げられ、放射線手術には、ガンマナイフ、サイバーナイフ、リニアック、及び組織内放射線照射（例えば、放射性シードの埋め込み、ＧｌｉａＳｉｔｅバルーン）が挙げられる。
【0200】
表３は、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ及びＣｏｎｔａｃｔシステムに従って定義されたＪＬ５抗体（配列番号４９のＶＨ及び配列番号５０のＶＬを有する抗体）のＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示す。
【0201】
【表3】
【0202】
表４は、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ及びＣｏｎｔａｃｔシステムに従って定義されたＪＬ６抗体（配列番号５１のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを有する抗体）のＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示す。
【0203】
【表4】
【0204】
表５は、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ及びＣｏｎｔａｃｔシステムに従って定義されたＪＬ２抗体（配列番号５３のＶＨ及び配列番号５４のＶＬを有する抗体）のＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示す。
【0205】
【表5】
【0206】
表６は、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ及びＣｏｎｔａｃｔシステムに従って定義されたＪＬ３抗体（配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬを有する抗体）のＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示す。
【0207】
【表6】
【0208】
本発明は一般論として記述されてきたが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【0209】
実施例１．ＣＤ３３抗原生成
ヒトＣＤ３３細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）又はそのサブドメインをコードする発現構築物は、骨髄系細胞表面抗原ＣＤ３３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８）の配列と、６Ｘ Ｈｉｓタグ配列（配列番号２４６）、又はＣ末端に６Ｘ Ｈｉｓタグ配列（配列番号２４６）を有するヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）のＣ３４Ｓバリアントとの融合タンパク質としてのドメインアノテーションに基づいて設計された。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＣＤ３３（ＥＣＤ）又はそのサブドメインをコードする同様の発現構築物を、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００５５９０１３８．１に基づいて設計した。生成された抗原のアミノ酸配列を表７に示す。
ヒトＣＤ３３細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）又はそのサブドメインをコードする発現構築物は、骨髄系細胞表面抗原ＣＤ３３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８）の配列と、６Ｘ Ｈｉｓタグ配列（配列番号２４６）、又はＣ末端に６Ｘ Ｈｉｓタグ配列（配列番号２４６）を有するヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）のＣ３４Ｓバリアントとの融合タンパク質としてのドメインアノテーションに基づいて設計された。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＣＤ３３（ＥＣＤ）又はそのサブドメインをコードする同様の発現構築物を、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００５５９０１３８．１に基づいて設計した。生成された抗原のアミノ酸配列を表７に示す。
【0210】
製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にヒト及びｃｙｎｏ ＣＤ３３完全長ＥＣＤ又はサブドメイン発現構築物を一過的にトランスフェクトした。細胞を採取前にオービタルシェーカー上で、８％ＣＯ２、３７℃で５日間インキュベートした。タンパク質を発現する細胞を遠心分離によって除去し、ｈｉｓタグを有する可溶性ＣＤ３３タンパク質を、Ｎｉ ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（immobilized metal-ion affinity chromatography、ＩＭＡＣ）を使用して培地から精製し、その後、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、１０ｍＬ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号：製造業者の仕様書による８９８９３）を使用して、カルシウム又はマグネシウムを含まない１ＸＤｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓａｌｉｎｅ緩衝液ｐＨ７．２に緩衝液交換した。
【0211】
【表7-1】
【0212】
【表7-2】
【0213】
【表7-3】
【0214】
実施例２．抗ＣＤ３３ｘδ２抗体の生成
以下のようにＡｂｌｅｘｉｓトランスジェニックマウス技術を使用して抗体を生成した。ＡｌｉｖａＭａｂマウスは、ヒト／マウス免疫グロブリンを産生するように操作された。ＡｌｉｖａＭａｂトランスジェニックマウスを、組換えヒトＣＤ３３タンパク（表７からの抗原の選択）で免疫化した。リンパ球を二次リンパ器官から抽出し、ハイブリドーマ生成のためにＦＯマウス骨髄腫細胞株と融合させたか、又はＦＡＣＳを介して単一細胞選別に供した。ハイブリドーマ上清を、ヒトＣＤ３３ ＥＣＤを過剰発現するヒト胚腎臓（human embryonic kidney、ＨＥＫ）細胞への結合について、ＭＳＤ電気化学発光によってスクリーニングした。スクリーニングから同定された試料を、親ＨＥＫ細胞（陰性シグナル）と比較してヒトＣＤ３３ ＥＣＤ（陽性シグナル）を過剰発現するＨＥＫ細胞への結合について、ＦＡＣＳで更にアッセイした。確認された細胞結合部は、ＥＬＩＳＡを介してアイソタイプ分類された軽鎖であった。シングルセルソーティング上清を、組換えヒトＣＤ３３タンパク質への結合について、ＭＳＤ電気化学発光によってスクリーニングした。所望の結合プロファイルを有するいくつかのヒットを選択し、配列決定した。
以下のようにＡｂｌｅｘｉｓトランスジェニックマウス技術を使用して抗体を生成した。ＡｌｉｖａＭａｂマウスは、ヒト／マウス免疫グロブリンを産生するように操作された。ＡｌｉｖａＭａｂトランスジェニックマウスを、組換えヒトＣＤ３３タンパク（表７からの抗原の選択）で免疫化した。リンパ球を二次リンパ器官から抽出し、ハイブリドーマ生成のためにＦＯマウス骨髄腫細胞株と融合させたか、又はＦＡＣＳを介して単一細胞選別に供した。ハイブリドーマ上清を、ヒトＣＤ３３ ＥＣＤを過剰発現するヒト胚腎臓（human embryonic kidney、ＨＥＫ）細胞への結合について、ＭＳＤ電気化学発光によってスクリーニングした。スクリーニングから同定された試料を、親ＨＥＫ細胞（陰性シグナル）と比較してヒトＣＤ３３ ＥＣＤ（陽性シグナル）を過剰発現するＨＥＫ細胞への結合について、ＦＡＣＳで更にアッセイした。確認された細胞結合部は、ＥＬＩＳＡを介してアイソタイプ分類された軽鎖であった。シングルセルソーティング上清を、組換えヒトＣＤ３３タンパク質への結合について、ＭＳＤ電気化学発光によってスクリーニングした。所望の結合プロファイルを有するいくつかのヒットを選択し、配列決定した。
【0215】
Ｖ領域クローニングは以下のように行った。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔによって精製されたＲＮＡ、及びＢ細胞溶解物の両方を使用し、Ｓｍａｒｔｅｒ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成を容易にするために、ｏｌｉｇｏｄＴを使用して、全てのメッセンジャーＲＮＡの逆転写をプライムし、続いて、Ｓｍａｒｔｅｒ ＩＩＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを用いた「５’キャッピング」を行った。ＶＨ及びＶＬ断片の後続の増幅を、Ｓｍａｒｔｅｒ ＩＩＡキャップを標的とする５’プライマー及びＣＨ１内のコンセンサス領域を標的とする３’プライマーを使用して、２段階ＰＣＲ増幅により実施した。簡潔には、各５０μＬのＰＣＲ反応物は、２０μＭのフォワード及びリバースプライマミックス、２５μＬのＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼプレミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μＬの未精製ｃＤＮＡ、並びに２１μＬの２回蒸留Ｈ２Ｏからなる。サイクリングプログラムは、９４℃で３分間で開始し、続いて３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１分間）であり、７２℃で７分間で終了する。第２ラウンドのＰＣＲは、それぞれのＬｏｎｚａマザーベクター（ＶＨ及びＶＬ）中のそれぞれの領域と「重複する」１５ｂｐの相補的伸長を含む、ＶＬ及びＶＨ第２ラウンドプライマーを用いて行った。第２ラウンドのＰＣＲを次のプログラムで実施した：９４℃で３分間、３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１分間）、７２℃において７分間で終了する。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、ＶＬ遺伝子のＬｏｎｚａ ｈｕＩｇＫ又はＬａｍｂｄａベクターへの、及びＶＨ遺伝子のＬｏｎｚａ ｈｕＩｇＧ１ベクターへの方向性クローニングのために使用した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇを容易にするために、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇの前に、Ｃｌｏｎｉｎｇ ＥｎｈａｎｃｅｒでＰＣＲ生成物を処理した。製造業者のプロトコル（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って、クローニング及び形質転換を実施した。Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ ＤＮＡをサンガー配列決定に供して、完全なＶ遺伝子断片が得られたことを確認した。
【0216】
抗ＣＤ３３抗体をＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号Ａ２９１２７）において、製造業者の推奨に従って、タンパク質をコードする精製プラスミドＤＮＡを用いた一過性トランスフェクションによって発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、及び１２５ＲＰＭに設定された軌道振動インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中に懸濁させて維持した。細胞を継代し、トランスフェクションの前に、６．０×１０６細胞／ｍＬに希釈し、細胞生存率を９９．０％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされるべき各ｍＬの希釈細胞について、０．５マイクログラムのＤＮＡをコードするｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、及び０．５マイクログラムのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７１１）を使用して、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体化培地中に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：４比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを、製造業者の標準プロトコルのとおり、細胞に添加した。細胞を軌道振盪（１２５ｒｐｍ）により、３７℃で７日間インキュベートした後、培養ブロスを採取した。一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、３０００ｒｃｆ）、続いて濾過（０．２μｍのＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）によって浄化した。
【0217】
タンパク質精製を以下のように実施した。濾過した細胞培養上清を、ＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓクロマトグラフィシステムを使用して、予め平衡化した（１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。充填後、カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍの酢酸ナトリウム（Ｎａ）、ｐＨ３．５で溶出した。タンパク質画分を、２．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を溶出分画量の２０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和した。ピーク画分をプールし、濾過した（０．２μｍ）。精製したタンパク質の量を、分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステム）によって評価した。
【0218】
実施例３．二重特異性ＣＤ３３×Ｖデルタ２抗体の生成
Ｆｃに融合したＣＤ３３結合部及びＦｃに融合したＶＨＨ Ｖデルタ２結合部のヘテロ二量体を生成するためにノブインホール変異を使用して二重特異性分子を作製した。使用したＶデルタ２結合ＶＨＨ配列は、国際公開第２０１５１５６６７３号に記載されている抗体６Ｈ４及び抗体５Ｄ３であった。６Ｈ４配列は、配列番号５８に記載される。５Ｄ３配列は、配列番号５７に記載される。
Ｆｃに融合したＣＤ３３結合部及びＦｃに融合したＶＨＨ Ｖデルタ２結合部のヘテロ二量体を生成するためにノブインホール変異を使用して二重特異性分子を作製した。使用したＶデルタ２結合ＶＨＨ配列は、国際公開第２０１５１５６６７３号に記載されている抗体６Ｈ４及び抗体５Ｄ３であった。６Ｈ４配列は、配列番号５８に記載される。５Ｄ３配列は、配列番号５７に記載される。
【0219】
ＣＤ３３結合ＦａｂはホールＦｃ上にあり、Ｖデルタ２結合ＶＨＨはノブＦｃ上にあった。ＣＤ３３ ＶＨ及びヒトＣＨ１定常領域を、いくつかの変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ＿Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＿Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ＿Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含有するＦｃ上でヒンジと融合させた。Ｆｃ受容体をサイレントにするために、ＡＡＳ変異を両方の重鎖のＦｃ部分に導入した。ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）変異をＪＬ５の両方の重鎖のＦｃ部分に導入して、半減期を増加させた。デルタ２結合ＶＨＨを、次の変異を含むヒンジ及びノブＦｃに融合させた：Ｃ２２０Ｓ＿Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ＿Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＿Ｔ３６６Ｗ。
【0220】
精製を助けるために、ＲＦ変異をホール重鎖に導入した。
【0221】
以下のＦａｂ（ＣＤ３３）ｘＶＨＨ（Ｖδ２）構築物を調製した。
配列番号１０１、１０２及び１０３の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたＣＤ３３抗体ＪＬ５（ＪＬ５ｘ６Ｈ４）。
配列番号１０４、１０５及び１０６の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたＣＤ３３抗体ＪＬ５（ＪＬ５ｘ５Ｄ３）。
配列番号１０７、１０８及び１０９の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ６（ＪＬ６ｘ６Ｈ４）。
配列番号１１０、１１１及び１１２の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ６（ＪＬ６ｘ５Ｄ３）。
配列番号１１３、１１４及び１１５の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ２（ＪＬ２ｘ６Ｈ４）。
配列番号１１６、１１７及び１１８の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ２（ＪＬ２ｘ５Ｄ３）。
配列番号１１９、１２０及び１２１の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ３（ＪＬ３ｘ６Ｈ４）。
配列番号１２２、１２３及び１２４の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ３（ＪＬ３ｘ５Ｄ３）。
配列番号１０１、１０２及び１０３の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたＣＤ３３抗体ＪＬ５（ＪＬ５ｘ６Ｈ４）。
配列番号１０４、１０５及び１０６の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたＣＤ３３抗体ＪＬ５（ＪＬ５ｘ５Ｄ３）。
配列番号１０７、１０８及び１０９の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ６（ＪＬ６ｘ６Ｈ４）。
配列番号１１０、１１１及び１１２の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ６（ＪＬ６ｘ５Ｄ３）。
配列番号１１３、１１４及び１１５の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ２（ＪＬ２ｘ６Ｈ４）。
配列番号１１６、１１７及び１１８の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ２（ＪＬ２ｘ５Ｄ３）。
配列番号１１９、１２０及び１２１の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体６Ｈ４と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ３（ＪＬ３ｘ６Ｈ４）。
配列番号１２２、１２３及び１２４の配列に対応する、Ｖデルタ２抗体５Ｄ３と組み合わせたが、ＹＴＥ変異を有しない、ＣＤ３３抗体ＪＬ３（ＪＬ３ｘ５Ｄ３）。
【0222】
分子をＣＨＯ細胞株で発現させ、ＰｒｏＡ捕捉、続いてＣＨ１親和性捕捉によって精製した。簡単に説明すると、抗体を、最初にＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。カラムをＰＢＳ ｐＨ７．２で平衡化し、２ｍＬ／分の流速で発酵上清を充填した。充填後、カラムを４カラム容量のＰＢＳで洗浄し、続いて、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出した。２８０ｎｍでの吸光度によってモニターされるようなタンパク質ピークを含有する画分をプールし、１％の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ９．０を添加することによってｐＨ５．０に中和した。抗体をＣＨ１捕捉によって更に精製し、ヒスチジン緩衝液中に溶出した。
【0223】
実施例４：二重特異性ＣＤ３３×Ｖδ２抗体は、ＣＤ３３発現細胞及びＶγ９Ｖδ２細胞に結合する。
導入
ＣＤ３３発現細胞及びＶγ９Ｖδ２細胞に結合する二重特異性ＣＤ３３×Ｖδ２抗体の能力を試験した。
導入
ＣＤ３３発現細胞及びＶγ９Ｖδ２細胞に結合する二重特異性ＣＤ３３×Ｖδ２抗体の能力を試験した。
【0224】
材料及び方法
細胞株
ＣＤ３３発現急性単球性白血病（acute monocytic leukemia、ＡＭＬ）細胞株ＴＨＰ－１（ＥＣＡＣＣ、Ｓｉｇｍａ）を、ＲＰＭＩ １６４０ ＡＴＣＣ ｍｏｄ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び２－メルカプトエタノール中で培養した。精製されたＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞株を、以前に記載されたように生成した（ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：ｅ１３７５６４１）。簡単に説明すると、ＦＩＴＣ結合抗Ｖδ２ＴＣＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、クローンＩＭＭＵ３８９）を抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と組み合わせて使用して、健常ドナー（ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ、ＨＤ）ＰＢＭＣからＶδ２＋－Ｔ細胞を単離し、２人の健常ドナー由来のＰＢＭＣ、ＪＹ細胞、ＩＬ－７（１０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びフィトヘマグルチニン（５０ｎｇ／ｍＬ ＰＨＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなる照射済みフィーダーミックスで毎週培養した。Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞株の純度は＞９０％及び＜５％ＣＤ４＋で維持された。
細胞株
ＣＤ３３発現急性単球性白血病（acute monocytic leukemia、ＡＭＬ）細胞株ＴＨＰ－１（ＥＣＡＣＣ、Ｓｉｇｍａ）を、ＲＰＭＩ １６４０ ＡＴＣＣ ｍｏｄ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び２－メルカプトエタノール中で培養した。精製されたＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞株を、以前に記載されたように生成した（ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：ｅ１３７５６４１）。簡単に説明すると、ＦＩＴＣ結合抗Ｖδ２ＴＣＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、クローンＩＭＭＵ３８９）を抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と組み合わせて使用して、健常ドナー（ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ、ＨＤ）ＰＢＭＣからＶδ２＋－Ｔ細胞を単離し、２人の健常ドナー由来のＰＢＭＣ、ＪＹ細胞、ＩＬ－７（１０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びフィトヘマグルチニン（５０ｎｇ／ｍＬ ＰＨＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなる照射済みフィーダーミックスで毎週培養した。Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞株の純度は＞９０％及び＜５％ＣＤ４＋で維持された。
【0225】
二重特異性抗体結合
ＣＤ３３結合を評価するために、ＴＨＰ－１細胞を、３１６～０．００３１６ｎＭの濃度範囲の二重特異性抗体ＪＬ２ｘ６Ｈ４、ＪＬ３ｘ６Ｈ４、ＪＬ５ｘ６Ｈ４、ＪＬ６ｘ６Ｈ４、Ｂ２１Ｍｘ６Ｈ４、ＪＬ２ｘ５Ｄ３、ＪＬ３ｘ５Ｄ３、ＪＬ５ｘ５Ｄ３、ＪＬ６ｘ５Ｄ３又はＢ２１Ｍｘ５Ｄ３とともに、４℃で４５～６０分間インキュベートした。
ＣＤ３３結合を評価するために、ＴＨＰ－１細胞を、３１６～０．００３１６ｎＭの濃度範囲の二重特異性抗体ＪＬ２ｘ６Ｈ４、ＪＬ３ｘ６Ｈ４、ＪＬ５ｘ６Ｈ４、ＪＬ６ｘ６Ｈ４、Ｂ２１Ｍｘ６Ｈ４、ＪＬ２ｘ５Ｄ３、ＪＬ３ｘ５Ｄ３、ＪＬ５ｘ５Ｄ３、ＪＬ６ｘ５Ｄ３又はＢ２１Ｍｘ５Ｄ３とともに、４℃で４５～６０分間インキュベートした。
【0226】
Ｖδ２結合を評価するために、Ｖγ９Ｖδ２細胞を、３１６～０．００３１６ｎＭの濃度範囲の二重特異性抗体ＪＬ２ｘ６Ｈ４、ＪＬ３ｘ６Ｈ４、ＪＬ５ｘ６Ｈ４、ＪＬ６ｘ６Ｈ４、Ｂ２１Ｍｘ６Ｈ４、ＪＬ２ｘ５Ｄ３、ＪＬ３ｘ５Ｄ３、ＪＬ５ｘ５Ｄ３、ＪＬ６ｘ５Ｄ３若しくはＢ２１Ｍｘ５Ｄ３とともに、又はｇｐ１２０及び別の無関係な標的に結合する二重特異性抗体とともに、４℃で４５～６０分間インキュベートした。
【0227】
結合した二重特異性抗体を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに４℃で３０分間インキュベートすることによって検出した。
【0228】
ＦＡＣＳ
試料をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用してデータを分析した。
試料をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用してデータを分析した。
【0229】
結果
全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞に結合することが見出された（図１）。予想通り、ＣＤ３３結合ドメインの代わりに呼吸器合胞体ウイルス（Respiratory syncytial virus、ＲＳＶ）結合ドメイン（Ｂ２１Ｍ）を有する陰性対照抗体は、ＴＨＰ－１細胞に結合しなかった。
全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞に結合することが見出された（図１）。予想通り、ＣＤ３３結合ドメインの代わりに呼吸器合胞体ウイルス（Respiratory syncytial virus、ＲＳＶ）結合ドメイン（Ｂ２１Ｍ）を有する陰性対照抗体は、ＴＨＰ－１細胞に結合しなかった。
【0230】
更に、全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に結合することが見出された（図２）。予想通り、ＲＳＶｘＶδ２抗体はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞にも結合したが、Ｖδ２結合ドメインを含まない陰性対照抗体はこれらの細胞に結合しなかった。Ｖδ２結合ドメインとして６Ｈ４を含有する二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、Ｖδ２結合ドメインとして５Ｄ３を含有する二重特異性抗体よりも高い親和性でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に結合した。
【0231】
実施例５：二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現細胞に対する細胞傷害を媒介することができる。
導入
実施例４に記載されるように、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現細胞及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の両方に結合する。続いて、二重特異性抗体がＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害を誘導することができるかどうかを試験した。
導入
実施例４に記載されるように、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現細胞及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の両方に結合する。続いて、二重特異性抗体がＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害を誘導することができるかどうかを試験した。
【0232】
材料及び方法
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例４に記載のように増殖させた。
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例４に記載のように増殖させた。
【0233】
細胞傷害性アッセイ
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、１：１～１：２０（Ｅ：Ｔ）比で（１：２０比の場合、エフェクタ細胞２，５００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。５ｎＭで開始する９つの５倍希釈の抗体濃度系列を試験した。２２及び９４時間後、７－アミノアクチノマイシンＤ（7-Aminoactinomycin D、７ＡＡＤ）を使用して死細胞を染色した。ＣＴＶ＋７ＡＡＤ細胞の割合を決定することによって、ＴＨＰ－１細胞死滅を決定した。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非直線回帰によって決定した。
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、１：１～１：２０（Ｅ：Ｔ）比で（１：２０比の場合、エフェクタ細胞２，５００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。５ｎＭで開始する９つの５倍希釈の抗体濃度系列を試験した。２２及び９４時間後、７－アミノアクチノマイシンＤ（7-Aminoactinomycin D、７ＡＡＤ）を使用して死細胞を染色した。ＣＴＶ＋７ＡＡＤ細胞の割合を決定することによって、ＴＨＰ－１細胞死滅を決定した。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非直線回帰によって決定した。
【0234】
結果
ＴＨＰ－１細胞の死滅を測定し、ＥＣ５０を決定した。陰性対照抗体の存在下では死滅は観察されなかった。しかしながら、全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができた。概して、６Ｈ４ベースのＶδ２結合ドメインを含む抗体は、５Ｄ３ベースの結合ドメインを含む抗体よりも強力であった（より低いＥＣ５０）（表８）。ＪＬ３又はＪＬ５ ＣＤ３３結合ドメインを有する二重特異性抗体は、ＪＬ２又はＪＬ６ドメインを含むものよりも強力であった。エフェクタ対標的細胞比が１：２０であっても、効率的な死滅が見られた。
ＴＨＰ－１細胞の死滅を測定し、ＥＣ５０を決定した。陰性対照抗体の存在下では死滅は観察されなかった。しかしながら、全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができた。概して、６Ｈ４ベースのＶδ２結合ドメインを含む抗体は、５Ｄ３ベースの結合ドメインを含む抗体よりも強力であった（より低いＥＣ５０）（表８）。ＪＬ３又はＪＬ５ ＣＤ３３結合ドメインを有する二重特異性抗体は、ＪＬ２又はＪＬ６ドメインを含むものよりも強力であった。エフェクタ対標的細胞比が１：２０であっても、効率的な死滅が見られた。
【0235】
【表8】
【0236】
実施例６：二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は健常細胞よりも腫瘍細胞の死滅を優先的に誘導する
導入
実施例５に記載されるように、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害性を誘導することができる。続いて、エフェクタ細胞として新鮮な血液からのＰＢＭＣを用いて細胞傷害性を得ることもできるかどうか、及びＣＤ３３ｘＶδ２抗体が健康なＣＤ３３陽性ＣＤ１４＋細胞に対する細胞傷害性も誘導するかどうかを試験した。
導入
実施例５に記載されるように、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害性を誘導することができる。続いて、エフェクタ細胞として新鮮な血液からのＰＢＭＣを用いて細胞傷害性を得ることもできるかどうか、及びＣＤ３３ｘＶδ２抗体が健康なＣＤ３３陽性ＣＤ１４＋細胞に対する細胞傷害性も誘導するかどうかを試験した。
【0237】
材料及び方法
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）を実施例５に記載したように増殖させた。健康なドナーボランティアからの全ヘパリン処理血液を血液供給サービスＳａｎｑｕｉｎから入手し、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）の単離に使用した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣを単離した。
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）を実施例５に記載したように増殖させた。健康なドナーボランティアからの全ヘパリン処理血液を血液供給サービスＳａｎｑｕｉｎから入手し、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）の単離に使用した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣを単離した。
【0238】
Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の割合を決定するために、ＰＢＭＣをＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄクローンＳＫ７）、ＰＥ標識抗ＴＣＲ Ｖγ９ｍＡｂ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄクローンＢ６）及びＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲＶδ２ｍＡｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒクローンＩＭ１４６４）で染色した。ＴＨＰ－１及びＣＤ１４＋単球細胞上のＣＤ３３発現を、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ１４ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄクローン６３Ｄ３）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３３ｍＡｂ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄクローンＷＭ５３）を使用して決定した。
【0239】
細胞傷害性アッセイ
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（cell trace violet、ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＰＢＭＣエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、５：１（Ｅ：Ｔ）比で（エフェクタ細胞２５０，０００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。５ｎＭで開始する６つの５倍希釈の抗体濃度系列を試験した。９４時間後、細胞をＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ１４ｍＡｂ及び７ＡＡＤで染色した。ＴＨＰ－１細胞死滅は、ＣＴＶ＋７ＡＡＤ－細胞の割合に基づいて決定し、一方、単球の死滅は、ＣＴＶ－ＣＤ１４＋７ＡＡＤ細胞の割合に基づいて決定した。
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（cell trace violet、ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＰＢＭＣエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、５：１（Ｅ：Ｔ）比で（エフェクタ細胞２５０，０００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。５ｎＭで開始する６つの５倍希釈の抗体濃度系列を試験した。９４時間後、細胞をＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ１４ｍＡｂ及び７ＡＡＤで染色した。ＴＨＰ－１細胞死滅は、ＣＴＶ＋７ＡＡＤ－細胞の割合に基づいて決定し、一方、単球の死滅は、ＣＴＶ－ＣＤ１４＋７ＡＡＤ細胞の割合に基づいて決定した。
【0240】
結果
標的細胞の死滅を図３に示す。ＰＢＭＣ（全ＰＢＭＣの１．８４％のＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を含有する）は、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体の存在下でＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができることが見出された（パネルＡ）。一方、健康なＣＤ１４＋標的細胞の溶解はほとんど起こらなかった（パネルＢ）。これは、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、健常細胞よりも腫瘍細胞の死滅を優先的に媒介することを示す。ＣＤ３３発現は、ＴＨＰ－１細胞と比較してＣＤ１４＋細胞上で約２倍高いことが見出されたので、この差は、ＴＨＰ－１標的細胞とＣＤ１４＋標的細胞との間のＣＤ３３発現の差によるものではないようである。
標的細胞の死滅を図３に示す。ＰＢＭＣ（全ＰＢＭＣの１．８４％のＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を含有する）は、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体の存在下でＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができることが見出された（パネルＡ）。一方、健康なＣＤ１４＋標的細胞の溶解はほとんど起こらなかった（パネルＢ）。これは、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、健常細胞よりも腫瘍細胞の死滅を優先的に媒介することを示す。ＣＤ３３発現は、ＴＨＰ－１細胞と比較してＣＤ１４＋細胞上で約２倍高いことが見出されたので、この差は、ＴＨＰ－１標的細胞とＣＤ１４＋標的細胞との間のＣＤ３３発現の差によるものではないようである。
【0241】
実施例７：二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を誘導する
導入
続いて、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、ＣＤ３３陽性標的細胞の存在下でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を誘導するかどうかを試験した。
導入
続いて、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、ＣＤ３３陽性標的細胞の存在下でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を誘導するかどうかを試験した。
【0242】
材料及び方法
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）を実施例４に記載したように増殖させた。２人の異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例４に記載のように培養した。
細胞株
ＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）を実施例４に記載したように増殖させた。２人の異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例４に記載のように培養した。
【0243】
増殖アッセイ
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識した。Ｖγ９Ｖδ２エフェクタ細胞を、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下でセルトレース遠赤（cell trace far red、ＣＴＦＲ）で標識した。標的細胞及びエフェクタ細胞を、１ｎＭの二重特異性抗体の存在下で、１：２０のエフェクタ細胞対標的細胞比で（標的細胞５０，０００個、エフェクタ細胞２，５００個）、３７℃、５％ＣＯ２で共インキュベートした（２００ｕＬ／ウェル）。１２３カウントｅＢｅａｄｓ（商標）カウンティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０日目、１日目、４日目、７日目、１１日目及び１４日目に細胞数を評価した。
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識した。Ｖγ９Ｖδ２エフェクタ細胞を、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下でセルトレース遠赤（cell trace far red、ＣＴＦＲ）で標識した。標的細胞及びエフェクタ細胞を、１ｎＭの二重特異性抗体の存在下で、１：２０のエフェクタ細胞対標的細胞比で（標的細胞５０，０００個、エフェクタ細胞２，５００個）、３７℃、５％ＣＯ２で共インキュベートした（２００ｕＬ／ウェル）。１２３カウントｅＢｅａｄｓ（商標）カウンティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０日目、１日目、４日目、７日目、１１日目及び１４日目に細胞数を評価した。
【0244】
結果
Ｖγ９Ｖδ２エフェクタ細胞の増殖を図４に示す。全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、２人の異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２エフェクタ細胞の増殖を誘導することができることが見出された。二重特異性ＲＳＶｘＶδ２抗体の存在では増殖は見られず、増殖が標的細胞の存在に依存していることが示された。
Ｖγ９Ｖδ２エフェクタ細胞の増殖を図４に示す。全ての二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体が、２人の異なるドナーからのＶγ９Ｖδ２エフェクタ細胞の増殖を誘導することができることが見出された。二重特異性ＲＳＶｘＶδ２抗体の存在では増殖は見られず、増殖が標的細胞の存在に依存していることが示された。
【0245】
実施例８：二重特異性ｓｃＦｖ ＣＤ３３ｘＶδ２抗体はＣＤ３３発現細胞に対する細胞傷害性を媒介することができる
導入
ＣＤ３３結合アームがｓｃＦｖ形式で提供された場合に、二重特異性抗体がＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害性を誘導することができるかどうかを試験した。
導入
ＣＤ３３結合アームがｓｃＦｖ形式で提供された場合に、二重特異性抗体がＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する細胞傷害性を誘導することができるかどうかを試験した。
【0246】
材料及び方法
細胞株
２人の異なるドナー（ドナー１０４及びドナー１５６）からのＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例５に記載のように増殖させた。
細胞株
２人の異なるドナー（ドナー１０４及びドナー１５６）からのＣＤ３３発現ＴＨＰ－１細胞（標的細胞）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例５に記載のように増殖させた。
【0247】
ｓｃＦｖ－ＶＨＨ二重特異性分子の産生
ｓｃＦｖ－ＶＨＨ二重特異性分子を以下のように生成した。ＶＬとＶＨとの間に「バード」リンカー、ｓｃＦｖとＶＨＨとの間に固定された短い５アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ（配列番号１００））、及びＣ末端タンパク質にＣタグを有するｓｃＦｖ（ＶＬ－Ｌ－ＶＨ）－Ｌ－ＶＨＨの固定設計を使用した。二重特異性ｓｃＦｖ ＶＨＨ分子のアミノ酸配列をｃＤＮＡに逆翻訳し、次いで、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化した。調節エレメント：Ｎ末端Ｋｏｚａｋ配列及びＣ末端停止コドンを加え、ｃＤＮＡを合成遺伝子として作製した。ｃＤＮＡを好適なベクターにクローニングし、それらの配列を確認した。得られたプラスミドをＨＥＫ２９３＿Ｅ細胞に一過性トランスフェクションすることにより、タンパク質の発現を行った。培養上清からＣ－ｔａｇアフィニティクロマトグラフィ及びゲル濾過によりタンパク質を精製した。
ｓｃＦｖ－ＶＨＨ二重特異性分子を以下のように生成した。ＶＬとＶＨとの間に「バード」リンカー、ｓｃＦｖとＶＨＨとの間に固定された短い５アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ（配列番号１００））、及びＣ末端タンパク質にＣタグを有するｓｃＦｖ（ＶＬ－Ｌ－ＶＨ）－Ｌ－ＶＨＨの固定設計を使用した。二重特異性ｓｃＦｖ ＶＨＨ分子のアミノ酸配列をｃＤＮＡに逆翻訳し、次いで、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化した。調節エレメント：Ｎ末端Ｋｏｚａｋ配列及びＣ末端停止コドンを加え、ｃＤＮＡを合成遺伝子として作製した。ｃＤＮＡを好適なベクターにクローニングし、それらの配列を確認した。得られたプラスミドをＨＥＫ２９３＿Ｅ細胞に一過性トランスフェクションすることにより、タンパク質の発現を行った。培養上清からＣ－ｔａｇアフィニティクロマトグラフィ及びゲル濾過によりタンパク質を精製した。
【0248】
【表9-1】
【0249】
【表9-2】
【0250】
細胞傷害性アッセイ
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、１：１（Ｅ：Ｔ）比で（エフェクタ細胞５０，０００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。３．１６ｎＭで開始する１０の半対数希釈の抗体濃度系列を試験した。２４時間後、フローサイトメトリを使用して７ＡＡＤ－ＣＴＶ＋細胞の割合を決定することによって、ＴＨＰ－１細胞死滅を決定した。
ＴＨＰ－１標的細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識し、二重特異性ＣＤ３３ｘＶδ２抗体又は陰性対照抗体（ＲＳＶｘＶδ２）及びＶγ９Ｖδ２－Ｔエフェクタ細胞（Ｅ）の存在下で、１：１（Ｅ：Ｔ）比で（エフェクタ細胞５０，０００個及び標的細胞５０，０００個）、３７℃でインキュベートした。３．１６ｎＭで開始する１０の半対数希釈の抗体濃度系列を試験した。２４時間後、フローサイトメトリを使用して７ＡＡＤ－ＣＴＶ＋細胞の割合を決定することによって、ＴＨＰ－１細胞死滅を決定した。
【0251】
結果
ＴＨＰ－１細胞の死滅を測定し、ＥＣ５０値を決定した。陰性対照抗体の存在下では死滅は観察されなかった。全ての二重特異性ｓｃＦｖ ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができた。
ＴＨＰ－１細胞の死滅を測定し、ＥＣ５０値を決定した。陰性対照抗体の存在下では死滅は観察されなかった。全ての二重特異性ｓｃＦｖ ＣＤ３３ｘＶδ２抗体は、ＴＨＰ－１腫瘍細胞の死滅を媒介することができた。
【0252】
【表10】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】