知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーの特許一覧
特表2024-533461シス作用性調節エレメントによるプライム編集システム効率の改善
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】シス作用性調節エレメントによるプライム編集システム効率の改善
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240905BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/54 ZNA
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C12N9/10
C12N9/16 Z
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515892
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 US2022076175
(87)【国際公開番号】W WO2023039508
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/243,423
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/363,247
(32)【優先日】2022-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】311016949
【氏名又は名称】シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】カン，チャオホア
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ｉｉ）逆転写酵素をコードする配列、およびｉｉｉ）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む合成核酸組成物、および、その使用の方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ｉｉ）逆転写酵素をコードする配列、およびｉｉｉ）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む、合成核酸組成物。
【請求項2】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項3】
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、請求項１または２のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項4】
前記シス作用性調節エレメントがｄＥＮＥまたはＥＮＥである、請求項１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項5】
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、請求項１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項6】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項7】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項8】
前記組成物がさらに発現プロモーターを含む、請求項１－７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項9】
前記組成物が発現ベクターに含まれる、請求項８に記載の合成核酸組成物。
【請求項10】
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、請求項８に記載の合成核酸組成物。
【請求項11】
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、請求項１－１０のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項12】
さらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ２のうち１つに由来する、請求項１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項13】
請求項１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物によってコードされる、アミノ酸配列。
【請求項14】
内因性ＤＮＡ配列を改変する方法であって、ａ）ｉ）１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質をコードする配列、２）逆転写酵素をコードする配列、および３）シス作用性調節エレメントを含む配列、を含む合成核酸組成物を含む、動作可能な発現ベクター；ｉｉ）プライム結合部位（ＰＢＳ）を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）；およびｉｉｉ）ＰＢＳと少なくとも５０％相補的である標的内因性ＤＮＡ配列を含む細胞、を提供すること；
ｂ）対象の内因性ＤＮＡ配列を含む細胞を、本発明の合成核酸組成物およびｐｅｇＲＮＡでトランスフェクトすること；および
ｃ）前記トランスフェクトされた細胞を、内因性ＤＮＡ配列に所望の改変が為されるように培養すること
を含む、方法。
【請求項15】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも７５％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９０％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９５％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９８％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと１００％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、請求項１４－２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、請求項１４－２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
前記シス作用性調節エレメントがＤｅｎｅまたはＥＮＥである、請求項１４－２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、請求項１４－２２のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
前記動作可能な発現ベクターがＤＮＡである、請求項１４－２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
前記動作可能な発現ベクターがＲＮＡである、請求項１４－２４のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、請求項１４－２６のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項28】
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、請求項１４－２７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
【請求項29】
前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ３のうち１つに由来する、請求項１４－２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ２システムタンパク質が、動作可能な発現ベクターにおいてコードされて細胞に導入される、請求項１４－２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本願は、２０２１年９月１３日に出願の米国仮出願第63/243,423号、および２０２２年４月２０日に出願の米国仮出願第63/363,247号を基礎とする優先権の効果を主張する。両出願の内容すべてが、参照によって本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年９月１３日に出願の米国仮出願第63/243,423号、および２０２２年４月２０日に出願の米国仮出願第63/363,247号を基礎とする優先権の効果を主張する。両出願の内容すべてが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
標的化ゲノム改変は、真核生物の細胞、胚および動物の操作を含む、ＤＮＡの遺伝子操作のための強力なツールである。例えば、外因性の配列をゲノムの標的部位へと統合することができ、および／または、特定の内因性ＤＮＡ（例えば染色体ＤＮＡ）配列を除去、不活性化あるいは改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法論（Perez-Pinera P, Ousterout DG, Gersbach CA, Advances in targeted genome editing, Curr Opin Chem Biol., 2012, 16(3-4):268-77; Hsu PD, Lander ES, Zhang F, Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Cell, 2014, 157(6): 1262-1278）以前は、本方法は例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの合成ヌクレアーゼ酵素の使用に依存していた。これらのキメラヌクレアーゼは、非特異的ＤＮＡ切断ドメインと連結された、プログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールを含む。しかしながら、新たなゲノム標的ごとに、新たな配列特異的ＤＮＡ結合モジュールを含むＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを新たに設計することが求められる。したがって、このようなカスタム設計されたヌクレアーゼは調製するのに費用および時間を要する傾向にある。さらに、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性は、オフターゲット切断を引き起こし得るものである。
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーは、ＤＮＡ配列、特にインビボにおける真核生物の配列を標的とし、操作する技術者の能力を大きく高めた。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲシステムそのものに制限が無いわけではない。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成することで作用し、このＤＳＢは、切断部位における挿入、欠失または塩基置換を可能にする。しかしながら、ＤＳＢは、例えば転座などの望まない結果にも関連する。さらに、不幸なことではあるが、病的アレルは非常に正確な挿入、欠失または塩基置換に起因するため、これを修正するためには正確な遺伝子編集が求められる。現存のテクノロジーは、必要とされる精度および／または効率を欠いているか、または許容できない結果をもたらすことが多い。
【0004】
最近、Anzaloneらは、ＣＲＩＳＰＲをベースとした、プライム編集と呼ばれるシステムを開発した（Anzalone, et al., Nature, 05 Dec. 2019. 576:149-157）。プライム編集システムは二重鎖切断またはドナーＤＮＡを伴わずに“探索および置換”ゲノム編集を行うことを可能にする。著者によって、このシステムは“標的化した、挿入、欠失およびあり得る塩基－塩基置換１２通りの全て、およびそれらの組み合わせを、ヒトの細胞において媒介する、遺伝子編集”を可能にすると説明されている（同上, p 149）。しかしながら、プライム編集については“......効率に影響する因子は未だ幅広く調べられていない”ことが、当技術において知られている（Kim, et al., Nature Biotechnology, Feb. 2021, Vol 39, 198 - 206）。必要なのは、プライム編集システムの効率を向上させる組成物および方法である。
【発明の概要】
【0005】
本発明の様々な態様には、プライム編集システムの効率を実質的に向上させる組成物および方法がある。
【0006】
非限定的な例示において、本発明のプライム編集システム（Prime Editing System:ＰＥＳ）は、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－逆転写酵素（ＲＴ）融合タンパク質およびプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含む。ＰＥ：ｐｅｇＲＮＡ複合体は標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）を含む鎖に切れ目を入れる。これによって生じた３’末端はプライマー結合部位とハイブリダイズし、また次に、ｐｅｇＲＮＡの転写酵素テンプレートを用いて、所望の編集を含む新たなＤＮＡの逆転写を促す。そして、編集された３’フラップと未編集の５’フラップとの間の平衡、細胞による５’フラップ切断および接合、およびＤＮＡ修復によって、安定な編集済ＤＮＡをもたらす（Anzalone, et al., 2019）（図１：先行技術を参照）。図１において表されたシステムに代表されるような現存のプライムエディターは、所望の高い効率を示さず、そのせいで、研究または医療の分野のいずれにおいてもそれらのさらなる使用が制限されている。
【0007】
現存のプライム編集テクノロジーは、例えばＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－逆転写酵素（ＲＴ）融合タンパク質と、それに組み合わされたプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を採用している。プライム編集テクノロジーによる所望の編集は、編集された３’フラップと未編集の５’フラップとの間の平衡に依存している。Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－ＲＴ融合タンパク質の大きなサイズのせいで、前記Ｃａｓ９（Ｈ８４０）ニッカーゼ－ＲＴ融合タンパク質を標的細胞に安定的かつ効率的に発現させるのは一貫して達成困難であり、また、このことは、ＰＥＳによって所望の編集を得ることに影響する。
【0008】
この問題に対処するため、発明者らは、シス作用性調節エレメント（cis-acting regulatory element）（例えばｄＥＮＥまたはｓＲＳＭ１）をＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－ＲＴ融合タンパク質発現カセットに組み込むことで（図２）、そのｍＲＮＡの安定性およびタンパク質発現を向上させた。発明者らは、これによって、プライム編集だけでなく、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ＣＲＩＳＰＲａなどを含む、エフェクタータンパク質の発現を含むその他任意の遺伝子編集テクノロジーの効率が大きく向上し得ると考える。下記の実施例のセクションで示されるように、本発明は、所望の編集の特徴を変更することなく、また、プライム編集複合体にいかなる追加の構成要素も加えることなく、現存のプライム編集システムの効率を大きく向上させる。
【0009】
したがって、本発明は、プライム編集の効率を実質的に向上させる組成物および方法を目指すものである。
【0010】
ある態様において、本発明は、i)ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ii）逆転写酵素をコードする配列、およびiii）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む、合成核酸組成物を企図する。
【0011】
本発明の合成核酸組成物によってコードされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、当業者に知られるいずれのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質であってもよい。本発明のある態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである。
【0012】
合成核酸組成物によってコードされる逆転写酵素は、当業者に知られるいずれの逆転写酵素であってもよい。本発明のある態様において、逆転写酵素はＭ－ＭＬＶ－ＲＴである。
【0013】
本発明の合成核酸組成物によってコードされるシス作用性調節エレメントは、当業者に知られるいずれのシス作用性調節エレメントであってもよい。本発明のある態様において、シス作用性調節エレメントはｄＥＮＥ、ＥＮＥまたはｓＲＳＭ１である。
【0014】
本発明のある態様において、本発明の合成核酸組成物はＤＮＡである。
【0015】
本発明のある態様において、本発明の合成核酸組成物はＲＮＡである。
【0016】
本発明は、本発明の合成核酸組成物がさらに発現プロモーターを含むことを企図する。
【0017】
本発明はさらに、本発明の合成核酸組成物が発現ベクターに含まれることを企図する。
【0018】
本発明はさらに、本発明の合成核酸組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれていることを企図する。
【0019】
本発明はさらに、本発明の合成核酸組成物のシス作用性調節エレメントが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡのターミネーターの前に位置することを企図する。
【0020】
本発明はさらに、本発明の合成核酸組成物がさらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、このｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２およびＰＥ２のうちの１つに由来することを企図する。
【0021】
本発明はさらに、本発明の合成核酸組成物によってコードされるアミノ酸配列も企図する。
【0022】
本発明は、使用方法も対象とする。ある態様において、本発明は内因性ＤＮＡ配列を改変する方法を企図し、この方法は、ｉ）１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質をコードする配列、２）逆転写酵素をコードする配列、および３）シス作用性調節エレメントを含む配列、を含む合成核酸組成物を含む、動作可能な発現ベクター、ｉｉ）プライム結合部位（ＰＢＳ）を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、およびｉｉｉ）ＰＢＳに対して少なくとも５０％相補的な標的内因性ＤＮＡ配列を含む細胞を提供すること、対象の内因性ＤＮＡ配列を含む細胞を、本発明の合成核酸組成物およびｐｅｇＲＮＡでトランスフェクトすること、および、内因性ＤＮＡ配列に所望の改変が為されるように前記トランスフェクトされた細胞を培養すること、を含む。
【0023】
本発明はさらに、本発明の方法において使用する合成核酸組成物が、当業者に知られるいずれのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質であってもよいことを企図する。本発明のある態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
【0024】
本発明の方法はさらに、内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも７５％相補的であることを企図する。
【0025】
本発明の方法はさらに、内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９０％相補的であることを企図する。
【0026】
本発明の方法はさらに、内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９５％相補的であることを企図する。
【0027】
本発明の方法はさらに、内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９８％相補的であることを企図する。
【0028】
本発明の方法はさらに、内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと１００％相補的であることを企図する。
【0029】
本発明の方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が当業者に知られるいずれのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質であってもよいことを企図する。本発明のある態様において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである。
【0030】
本発明の方法はさらに、逆転写酵素が当業者に知られるいずれの逆転写酵素であってもよいことを企図する。本発明のある態様において、逆転写酵素はＭ－ＭＬＶ－ＲＴである。
【0031】
本発明の方法はさらに、シス作用性調節エレメントが当業者に知られるいずれのシス作用性調節エレメントであってもよいことを企図する。本発明のある態様において、シス作用性調節エレメントはｄＥＮＥ、ＥＮＥおよびｓＲＳＭ１から選択される。
【0032】
本発明の方法はさらに、本発明の合成核酸をコードする動作可能な発現ベクターがＤＮＡであることを企図する。
【0033】
本発明の方法はさらに、本発明の合成核酸をコードする動作可能な発現ベクターがＲＮＡであることを企図する。
【0034】
本発明の方法はさらに、本発明の合成核酸組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれていることを企図する。
【0035】
本発明の方法はさらに、本発明の合成核酸組成物のシス作用性調節エレメントが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡのターミネーターの前に位置することを企図する。
【0036】
本発明の方法はさらに、ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２およびＰＥ３のうちの１つに由来することを企図する
【0037】
本発明の方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ２システムが、動作可能な発現ベクターにおいてコードされ、細胞に導入されることを企図する。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】先行技術で説明されるような、プライム編集テクノロジーの図解を示す。ｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）＝Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ、ＲＴ＝逆転写酵素、ＰＢＳ＝プライム結合部位。
【図2】プライム編集発現カセットに対するシス作用性調節エレメントの導入の図解を示す。
【図3】ＰＥ２－ｄＥＮＥがＰＥ２の編集効率を高めることを示す。
【図4】ＰＥ３－ｄＥＮＥがＰＥ３の編集効率を高めることを示す。
【図5】３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥが、Ｋ５６２細胞において、ＨＥＫ３標的におけるＰＥの編集効率を向上させることを示す。
【図6】３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥが、ＨＥＫ２９３細胞において、ＨＥＫ３標的におけるＰＥの編集効率を向上させないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0039】
定義
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：（Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)）。他に述べられない限り、本明細書で用いられる以下の用語は、これらの技術文献に則った意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：（Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)）。他に述べられない限り、本明細書で用いられる以下の用語は、これらの技術文献に則った意味を有する。
【0040】
本開示の要素またはその好ましい実施形態について述べるとき、冠詞“a”、“an”、“the”、および“前記”は、１つまたはそれ以上の要素が存在することを意味すると意図される。“含む”および“有する”という用語は、包含的であると意図され、列挙した要素以外にも追加の要素が存在し得ることを意味する。
【0041】
“～を含む”、“本質的に～からなる”および“～からなる”という移行句は、MPEP2111.03（特許審査手続便覧；米国特許商標庁）に示される意味を有する。移行句“本質的に～からなる”を用いるあらゆる請求項は、本発明の本質的な要素のみを記載していると理解され、従属する請求項に記載される他のいかなる要素も、従属の基礎となる請求項に記載される発明にとって本質的ではないと理解される。
【0042】
本明細書で用いる“内因性配列”という用語は、その細胞にとって天然の染色体配列のことを表す。
【0043】
本明細書で用いる“外因性”という言葉は、その細胞にとって天然ではない配列、または、染色体配列であって、細胞のゲノムにおけるその天然の位置が、異なる染色体上の位置にある配列のことを表す。
【0044】
本明細書で用いる“遺伝子”は、遺伝子産物をコードする（エキソンおよびイントロンを含む）ＤＮＡ領域だけでなく、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域のことを、コードする配列および／または転写される配列にそのようなＤＮＡ領域が隣接しているかどうかに関わりなく、表す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント（boundary elements）、複製起点、マトリックス付着領域、および遺伝子座制御領域（locus control region）を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【0045】
“異種性の”という用語は、対象の細胞において内因性ではない、または天然のものではない物質を指す。例えば、異種性のタンパク質とは、外因性の供給源に由来するか、または本来由来していたタンパク質のことを表す。場合によっては、異種性のタンパク質は、通常は対象の細胞によって産生されない。
【0046】
“核酸”または“ポリヌクレオチド”という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーであって、直鎖状あるいは環状の構造をとり、一本鎖あるいは二重鎖のいずれかの形態であるポリマーを表す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定としては解釈されない。これらの用語は天然ヌクレオチドの既知のアナログだけでなく、塩基、糖および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾を受けたヌクレオチドを含む。一般的には、特定のヌクレオチドのアナログは、それと同様の塩基対形成の特異性を有する。すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成する。
【0047】
“合成核酸”という用語は、インビトロで（例えば研究室で、かつ手動あるいは核酸合成機で）合成されたヌクレオチド配列であって、かつその配列が天然に存在しないものを表す。合成核酸の配列は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらが下記のような修飾を受けたものであってよく、その配列が天然産生のものでない限りは、いかなる長さであってもよく、かつ、いかなるヌクレオチド配列であってもよい。
【0048】
“ヌクレオチド”という用語はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを表す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）であってもよく、またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログとは、修飾プリンまたは修飾ピリミジン塩基、または修飾リボース部分を有するヌクレオチドのことを表す。ヌクレオチドアナログは天然のヌクレオチド（例えばイノシン）、または天然のものでないヌクレオチドであってもよい。糖部分または塩基部分における非限定的な修飾の例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、ヒドロキシ基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の追加または除去、および、塩基の炭素原子および窒素原子を別の原子で置換すること（例えば７－デアザプリン）を含む。ヌクレオチドアナログはジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノも含む。
【0049】
“ポリペプチド”および“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、互換的に用いられる。
【0050】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための手法が、当技術で知られている。典型的には、そのような手法は、ある遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定することを含み、また、これらの配列を、第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノムの配列もまた、この方法で決定および比較され得る。一般的には、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、それぞれヌクレオチド－ヌクレオチド間またはアミノ酸－アミノ酸間の正確な対応を表す。２つ以上の配列（ポリペプチドまたはアミノ酸）が、それらの同一性パーセントを決定することで比較され得る。２つの配列の同一性パーセントは、ヌクレオチド配列であれアミノ酸配列であれ、整列された２つの配列の正確な一致の数を、短い方の配列の長さで割り、１００をかけた値である。核酸配列の近似的アラインメントが、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）（Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)）によって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoffのスコアマトリックス（Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA）を用いることでアミノ酸配列に適用することができ、また、Gribskov（Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)）によって正規化することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装は、Genetics Computer Group （Madison, Wis.）によって、“BestFit”というユーティリティアプリケーションにおいて提供される。配列の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するその他の適切なプログラムが、当技術で一般的に知られている。例えば、別のアラインメントプログラムにはBLASTがあり、既定のパラメーターで用いられる。例えば、BLASTNおよびBLASTPが、以下の既定のパラメーター：genetic code=standard；filter=none；strand=both；cutoff=60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Descriptions=50 sequences；sort by=HIGH SCORE；Databases=non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR、を用いて使用され得る。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウェブサイトで見ることができる。
【0051】
上記の細胞および方法には、本発明の範囲から外れることなく様々な改変を加えることが可能であるため、上記の説明および下記の実施例に含まれる全ての事項は、例示的であって、限定的な意味ではないと解釈されることが意図される。
【0052】
プライム編集システム
プライム編集システム（ＰＥＳ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーの改良版である。Anzaloneらによって最初に説明されたように、ＰＥＳは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をゲノムの所望の標的部位に導くため、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を用いる。ＰＥＧは、標的ＤＮＡ鎖に対して相補的なスペーサーのみでなく、プライマー結合部位（ＰＢＳ）領域および標的ＤＮＡ領域に導入される配列も含むと説明される（Marzec, et al., Trends in Cell Biology, April 2020, 33:4, 257 - 259）。ＰＢＳは第２のＤＮＡ鎖に対して相補的であり、かつ、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結された逆転写酵素（ＲＴ）のプライマーを形成する。ＲＴは、ｐｅｇＲＮＡの配列を鋳型として用いるＲＮＡ依存性ポリメラーゼである。配列はｐｅｇＤＮＡから標的ＤＮＡ配列へと直接複製される。すなわち、標的配列が、所望のように変更される。
プライム編集システム（ＰＥＳ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーの改良版である。Anzaloneらによって最初に説明されたように、ＰＥＳは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をゲノムの所望の標的部位に導くため、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を用いる。ＰＥＧは、標的ＤＮＡ鎖に対して相補的なスペーサーのみでなく、プライマー結合部位（ＰＢＳ）領域および標的ＤＮＡ領域に導入される配列も含むと説明される（Marzec, et al., Trends in Cell Biology, April 2020, 33:4, 257 - 259）。ＰＢＳは第２のＤＮＡ鎖に対して相補的であり、かつ、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結された逆転写酵素（ＲＴ）のプライマーを形成する。ＲＴは、ｐｅｇＲＮＡの配列を鋳型として用いるＲＮＡ依存性ポリメラーゼである。配列はｐｅｇＤＮＡから標的ＤＮＡ配列へと直接複製される。すなわち、標的配列が、所望のように変更される。
【0053】
非限定的な例示において、プライム編集（ＰＥ）は、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－逆転写酵素（ＲＴ）融合タンパク質およびプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、ＰＥ：ｐｅｇＲＮＡ複合体は標的ＤＮＡに結合して、ＰＡＭを含む鎖に切れ目を入れる。これによって生じた３’末端はプライマー結合部位とハイブリダイズし、また次に、ｐｅｇＲＮＡの転写酵素テンプレートを用いて、所望の編集が加わった新たなＤＮＡの逆転写を促す。そして、編集された３’フラップと未編集の５’フラップとの間の平衡、内因性の細胞による５’フラップ切断および接合、およびＤＮＡ修復は、安定な編集済ＤＮＡをもたらす（Anzalone, et al., 2019、図１参照）。現在に至るまで、プライムエディター（ＰＥ）の複数のバージョンが開発されてきた。ＰＥ１［配列番号１］は、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼのＣ末端に融合された野生型のモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ－ＲＴ）を用いることによって指定される。ＰＥ２［配列番号２］は合成Ｍ－ＭＬＶ－ＲＴを用いる。ＰＥ３［配列番号３］は、編集されない方の鎖に切れ目を入れるための追加のガイドＲＮＡを導入することによって定義され、このガイドＲＮＡの導入により、インデル頻度にも拘わらず、編集効率が向上する。ＰＥ３ｂ（Anzalone, et al.,）では、この切れ目を入れるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、編集済の配列を標的とし、それによって、編集が起こるまで、編集されない方の配列に切れ目が入れられることが防がれ、結果として、哺乳類の細胞において、インデルが少なくなる。
【0054】
シス調節エレメント
本発明は、１つ以上のシス調節エレメント（ＣＲＥ）をプライム編集システムに組み込むことで、システムの効率を実質的に向上させる。当業者には、本明細書の開示を以てすれば、本明細書で特に例示したもの以外のシス調節エレメントも本発明において適切に使用され得ることが理解され、また、本明細書の説明に従い、過度の実験を行うことなく前記シス調節エレメントをスクリーニングすることは、当業者の技術および知識の範囲内であることが理解されるであろう。
本発明は、１つ以上のシス調節エレメント（ＣＲＥ）をプライム編集システムに組み込むことで、システムの効率を実質的に向上させる。当業者には、本明細書の開示を以てすれば、本明細書で特に例示したもの以外のシス調節エレメントも本発明において適切に使用され得ることが理解され、また、本明細書の説明に従い、過度の実験を行うことなく前記シス調節エレメントをスクリーニングすることは、当業者の技術および知識の範囲内であることが理解されるであろう。
【0055】
WittappおよびKalayが述べるように（Nature Reviews Genetics, Jan. 2012, vol. 13, pp. 59 - 69）、シス調節エレメントとは、定められた空間的および／または時間的発現ドメインにおいて転写を活性化（または阻害）するために十分な、転写因子結合部位およびその他のノンコーディングＤＮＡの集合体を表す用語である。シス調節エレメントは、転写を活性化し、かつ維持するために必要なシス調節配列のタイプの１つである。シス調節エレメントは、転写因子および他の調節性分子の結合部位を含むＤＮＡ（典型的にはノンコーディングＤＮＡ）で構成される。プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーは最も一般的に知られているＣＲＥ（シス調節エレメント）のタイプである。
【0056】
プロモーターは真核生物において転写のために要求されるが、典型的には、基礎レベルのｍＲＮＡのみしか産生しない。エンハンサーはプロモーターよりも多様であり、発現および転写のアップレギュレーションに寄与する。
【0057】
シス調節エレメントおよびトランス調節エレメントによる遺伝子発現の調節について、別の視点から見ると、シス調節エレメントは、しばしば１つ以上のトランス作用性因子の結合部位となっている。シス調節エレメントは、シス調節エレメントが調節する遺伝子が存在しているのと同じＤＮＡ分子に存在しているが、一方トランス調節エレメントは、トランス調節エレメントが転写される遺伝子から離れた遺伝子を調節することができる。転写因子はトランス作用性因子の１例である。
【0058】
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の遺伝子の転写に影響する（転写を向上させる）ＣＲＥであり、かつ、イントロンの上流、下流、内部、またはエンハンサーが調節する遺伝子から比較的離れた位置に見られ得る。複数のエンハンサーが、１つの遺伝子の転写を調節するため連携して働き得る（Ibid., Wittkapp and Kalay.）。数々のゲノムワイドシークエンシングプロジェクトによって、エンハンサーはしばしば長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）またはエンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）へと転写され、これらＲＮＡのレベルの変化は、標的遺伝子ｍＲＮＡのレベルの変化と相関することが多いことが明らかになった（Melamed P., Yosefzun Y., et al., Transcription, 2 March 2016, 7 (1): 26-31.）。
【0059】
発明者は、任意のシス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲベースの核酸改変テクノロジーに有利な効果をもたらすことを意図しているが、好ましい適切なシス作用性調節エレメントの非限定的な例は、以下である：
【0060】
核内発現エレメント（Element for Nuclear Expression: ENE）：ＲＮＡの安定化をもたらす短い二重らせんに隣接する、Ｕリッチな内部ループ（ＵＲＩＬ）を含む。例にはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＥＮＥ、ヒト転移関連肺腺癌転写物１（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1: MALAT1）のＥＮＥ、多発性内分泌腫瘍症β（ＭＥＮβ）のＥＮＥ、などが含まれる。
【0061】
核発現二重エレメント（Double Element for Nuclear Expression: dENE）：推定される（predicated）二重らせん領域によって分割された２つのＵＲＩＬを含む。例にはイネＴＷＩＦＢ１のｄＥＮＥ、およびその２０種の変異体（Ｍ１からＭ２０）が含まれ、これらは当技術で知られており、また、Torabiらの（"RNA stabilization by a poly(A) tail 3'-end binding pocket and other modes of poly(A)-RNA interaction", Science, 2021, 371(6529)）のFigure 5に記載されている。
【0062】
ＫＳＨＶのＥＮＥの配列：
UGUUUUGGCUGGGUUUUUCCUUGUUCGCACCGGACACCUCCAGUGACCAGACGGCAAGGUUUUUAUCCCAGUGUAUAUU ［配列番号４］
UGUUUUGGCUGGGUUUUUCCUUGUUCGCACCGGACACCUCCAGUGACCAGACGGCAAGGUUUUUAUCCCAGUGUAUAUU ［配列番号４］
【0063】
アカゲザルラジノウイルス（ＰＲＶ）のＥＮＥの配列：
CGUUUGUGUUGGUUUUUAUGACCAGCUUGGUACAAAACCUGCUGGUGAUUUUUUACCCAACAAAUAAUAAAUAAAA ［配列番号５］
CGUUUGUGUUGGUUUUUAUGACCAGCUUGGUACAAAACCUGCUGGUGAUUUUUUACCCAACAAAUAAUAAAUAAAA ［配列番号５］
【0064】
ＭＡＬＡＴ１のＥＮＥの配列：
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUU ［配列番号６］
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUU ［配列番号６］
【0065】
ＭＡＬＡＴ１のＥＮＥ＋Ａリッチなトラクト（A-rich tract）の配列：
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAA ［配列番号７］
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAA ［配列番号７］
【0066】
ＭＡＬＡＴ１のＥＮＥ＋Ａリッチなトラクト＋ｍａｓｃＲＮＡの配列：
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGAUGCUGGUGGUUGGCACUCCUGGUUUCCAGGACGGGGUUCAAAUCCCUGCGGCGUCUUUGCUUUGACU［配列番号８］
UAGGGUCAUGAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGAUGCUGGUGGUUGGCACUCCUGGUUUCCAGGACGGGGUUCAAAUCCCUGCGGCGUCUUUGCUUUGACU［配列番号８］
【0067】
ＭＡＬＡＴ１のＥＮＥ＋Ａリッチなトラクトのバリアントの配列：
GAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAA［配列番号９］
GAAGGUUUUUCUUUUCCUGAGAAAACAACACGUAUUGUUUUCUCAGGUUUUGCUUUUUGGCCUUUUUCUAGCUUAAAAAAAAAAAAAGCAAAA［配列番号９］
【0068】
ＭＥＮβのＥＮＥの配列：
GCCGCCGCAGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUG［配列番号１０］
GCCGCCGCAGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUG［配列番号１０］
【0069】
ＭＥＮβのＥＮＥ＋Ａリッチなトラクトの配列：
GCCGCCGCAGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUGUGAAAGAGUGAGCAGGAAAAAGCAAAA［配列番号１１］
GCCGCCGCAGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUGUGAAAGAGUGAGCAGGAAAAAGCAAAA［配列番号１１］
【0070】
ＭＥＮβのＥＮＥ＋Ａリッチなトラクトのバリアントの配列：
AGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUGUGAAAGAGUGAGCAGGAAAAAGCAAAA ［配列番号１２］
AGGUGUUUCUUUUACUGAGUGCAGCCCAUGGCCGCACUCAGGUUUUGCUUUUCACCUUCCCAUCUGUGAAAGAGUGAGCAGGAAAAAGCAAAA ［配列番号１２］
【0071】
イネＴＷＩＦＢ１のｄＥＮＥの配列：
UGUUGGCUGUACUCUUUUCUUUGUCAUGGUUUUCUCAAAUAUGAGUUUUUACAUGACAAAGUUUUUAACGAGGCAGCAUGUA ［配列番号１３］
UGUUGGCUGUACUCUUUUCUUUGUCAUGGUUUUCUCAAAUAUGAGUUUUUACAUGACAAAGUUUUUAACGAGGCAGCAUGUA ［配列番号１３］
【0072】
ＭＣＤｉＶのＥＮＥの配列：
GAGUGUAACUCAACAGUUUUUCCUAACCACGCGUCGCGUGGCAGGUUUUUUAAUCUGAGAGUUACAUUC［配列番号１４］
GAGUGUAACUCAACAGUUUUUCCUAACCACGCGUCGCGUGGCAGGUUUUUUAAUCUGAGAGUUACAUUC［配列番号１４］
【0073】
ＡＴＣＯＰＩＡ２７＿ＡＴｈ－ＩのＥＮＥの配列：
GUGCUGUACUCUUUUUCCUCACUAUGGUUUUGUCCCGAAAGGGUUUUCCUAGUAAGGUUUUAAUGAGGCAGCAU［配列番号１５］
GUGCUGUACUCUUUUUCCUCACUAUGGUUUUGUCCCGAAAGGGUUUUCCUAGUAAGGUUUUAAUGAGGCAGCAU［配列番号１５］
【0074】
ＴＵＣＰ＿ＺＭａのＥＮＥの配列：
GGCUGUACUCUUUUUUCCUGUCUAGGGUUUCUCACAAGGGUGAGUUUUACCUAGACAGGUUUUUAACGAGGCAACC［配列番号１６］
GGCUGUACUCUUUUUUCCUGUCUAGGGUUUCUCACAAGGGUGAGUUUUACCUAGACAGGUUUUUAACGAGGCAACC［配列番号１６］
【0075】
他のＥＮＥまたはｄＥＮＥおよびそれらのバリアントまたは変異体が当技術で知られており、Tycowskiらの（"Conservation of a Triple-Helix-Forming RNA Stability Element in Noncoding and Genomic RNAs of Diverse Viruses", Cell Rep., 2012, 2: 26-32）およびTycowskiらの（"Myriad Triple-Helix-Forming Structures in the Transposable Element RNAs of Plants and Fungi", Cell Rep., 2016, 15: 1266-1276）に記載されている。
【0076】
いくつかの計算フレームワーク（例えばTool for Eliciting Informative Structural Elements in RNA: TEISER）が、ＲＮＡを安定化させる統計的に最も顕著な３’ＵＴＲエレメントである、構造的ＲＮＡ安定化モチーフ１（structural RNA stability motif: sRSM1）を同定するために用いられた。ｓＲＳＭ１はGoodarziらの（"Systematic discovery of structural elements governing stability of mammalian messenger RNAs", Nature, 2012, 485(264)）に記載されている。
【0077】
構造的ＲＮＡ安定化モチーフ１（ｓＲＳＭ１）の配列セット１：
AAAACUAUUUUGAAGAUGGUGGUGAGCUGCAAAAUAGCUGGAUGGAUUUGAAUGAUUGGGAUGAUACAUCAUUGAACUGCACUUUAUAUAACCAAAGCUUAGCAGUUUGUUAGAUAAGAGUCUAUGUAUGUCUCUGGUUAGGAUGAAGUUAAUUUUAUGUUUUUAACAUGGUAUUUUUGAAGGAGCUAAUGAAACACUGG ［配列番号１７］
AAAACUAUUUUGAAGAUGGUGGUGAGCUGCAAAAUAGCUGGAUGGAUUUGAAUGAUUGGGAUGAUACAUCAUUGAACUGCACUUUAUAUAACCAAAGCUUAGCAGUUUGUUAGAUAAGAGUCUAUGUAUGUCUCUGGUUAGGAUGAAGUUAAUUUUAUGUUUUUAACAUGGUAUUUUUGAAGGAGCUAAUGAAACACUGG ［配列番号１７］
【0078】
構造的ＲＮＡ安定化モチーフ１（ｓＲＳＭ１）の配列セット２：
AUUGUUUCUGGAAACUGCUUGCCAAGACAACAUUUAUUAACUGUUAGAACACUUGCUUUAUGUUUGUGUGUACAUAUUUUCCACAAAUGUUAUAAUUUAUAUAGUGUGGUUGAACAGGAUGCAAUCUUUUGUUGUCUAAAGGUGCUGCAGUUAAAAAAAAAACAACCUUUUCUUUCAAUAUGGCAUGUAGUGGAGUUUUU ［配列番号１８］
AUUGUUUCUGGAAACUGCUUGCCAAGACAACAUUUAUUAACUGUUAGAACACUUGCUUUAUGUUUGUGUGUACAUAUUUUCCACAAAUGUUAUAAUUUAUAUAGUGUGGUUGAACAGGAUGCAAUCUUUUGUUGUCUAAAGGUGCUGCAGUUAAAAAAAAAACAACCUUUUCUUUCAAUAUGGCAUGUAGUGGAGUUUUU ［配列番号１８］
【0079】
他のｓＲＳＭの配列が当業者に知られており、その例はGoodarziらの（"Systematic discovery of structural elements governing stability of mammalian messenger RNAs", Nature, 2012, 485: 264）において見られる。
【0080】
他の適切な３’ＵＴＲ配列が当業者に知られており、また、ｃ－ｆｏｓ遺伝子およびｖ－ｆｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ、ＣＤ４７の３’ＵＴＲ、ＢＩＲＣ３の３’ＵＴＲ、βアクチンの３’ＵＴＲ、βグロブリンの３’ＵＴＲ、Ｈｍｇａ２の３’ＵＴＲ、Ｃａｍｋ２ａの３’ＵＴＲ、ＣｙｃｌｉｎＢ１の３’ＵＴＲ、およびｍＲＮＡの安定性増加に関連するＵリッチモチーフを含むが、これらに限定されることはない。
【0081】
他のシス作用性調節エレメントが当業者に知られており、本明細書に組み込まれる。当業者は、本明細書の開示を以てすれば、過度な実験を行うことなく適切なシス作用性調節エレメントを同定および最適化することができるだろう。
【0082】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質およびシステム
一般的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質システムおよび本発明の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質システムを理解することによって、本発明の理解が助けられるだろう。
一般的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質システムおよび本発明の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質システムを理解することによって、本発明の理解が助けられるだろう。
【0083】
プライム編集ガイドＲＮＡ
上記のように、プライムエディター（ＰＥ）の複数のバリエーションが開発されてきた。ＰＥは、ＲＮＡをプログラム可能なニッカーゼと融合した逆転写酵素およびプライム編集ガイドＲＮＡを含み、ｐｅｇＲＮＡの突出部分から標的遺伝子座へ、遺伝子情報を直接コピーする。すなわち、ｐｅｇＲＮＡはＰＥ編集装置を特定の部位、標的ＤＮＡへ“操縦”し、ここで二重鎖ＤＮＡのうち１本の鎖がＣａｓ９酵素によって切られる。ｐｅｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに対する所望の編集をコードする配列も含む。ｐｅｇＲＮＡの設計に依存して、ＰＥは、正確かつ効率的に、ＤＮＡのあらゆる１塩基を別のいかなる塩基にも置換することができ、また、欠失および挿入の両方を生成することができる。当業者には、特定の標的部位に対する適切なｐｅｇＲＮＡをどのように構築するか理解される。
上記のように、プライムエディター（ＰＥ）の複数のバリエーションが開発されてきた。ＰＥは、ＲＮＡをプログラム可能なニッカーゼと融合した逆転写酵素およびプライム編集ガイドＲＮＡを含み、ｐｅｇＲＮＡの突出部分から標的遺伝子座へ、遺伝子情報を直接コピーする。すなわち、ｐｅｇＲＮＡはＰＥ編集装置を特定の部位、標的ＤＮＡへ“操縦”し、ここで二重鎖ＤＮＡのうち１本の鎖がＣａｓ９酵素によって切られる。ｐｅｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに対する所望の編集をコードする配列も含む。ｐｅｇＲＮＡの設計に依存して、ＰＥは、正確かつ効率的に、ＤＮＡのあらゆる１塩基を別のいかなる塩基にも置換することができ、また、欠失および挿入の両方を生成することができる。当業者には、特定の標的部位に対する適切なｐｅｇＲＮＡをどのように構築するか理解される。
【0084】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、および少なくとも１つの、ｐｅｇＲＮＡと相互作用してエンドヌクレアーゼを特定のヌクレオチド配列に標的化し切断するドメインを含み得る。また、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、および真核生物の細胞または胚の染色体配列を改変するためにＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用する方法も知られている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは特異的ｐｅｇＲＮＡと相互作用し、各ｐｅｇＲＮＡが、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に導く。この部位では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが鎖の切断を引き起こし、これは染色体配列が改変されるようにＤＮＡ修復プロセスによって修復され得る。特異性はｐｅｇＲＮＡによってもたらされるため、ＲＮＡベースのエンドヌクレアーゼは普遍的であり、様々なｐｅｇＲＮＡと共に用いて様々なゲノム配列を標的とすることができる。本明細書で開示される方法は、特定の染色体配列を標的とし、改変するため、および／または、細胞または胚のゲノムの標的部位に外因性配列を導入するため（または内因性配列を欠失させるため）に用いることができる。さらに、標的化は特異的であり、オフターゲット効果は限られている。
Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、および少なくとも１つの、ｐｅｇＲＮＡと相互作用してエンドヌクレアーゼを特定のヌクレオチド配列に標的化し切断するドメインを含み得る。また、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、および真核生物の細胞または胚の染色体配列を改変するためにＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用する方法も知られている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは特異的ｐｅｇＲＮＡと相互作用し、各ｐｅｇＲＮＡが、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に導く。この部位では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが鎖の切断を引き起こし、これは染色体配列が改変されるようにＤＮＡ修復プロセスによって修復され得る。特異性はｐｅｇＲＮＡによってもたらされるため、ＲＮＡベースのエンドヌクレアーゼは普遍的であり、様々なｐｅｇＲＮＡと共に用いて様々なゲノム配列を標的とすることができる。本明細書で開示される方法は、特定の染色体配列を標的とし、改変するため、および／または、細胞または胚のゲノムの標的部位に外因性配列を導入するため（または内因性配列を欠失させるため）に用いることができる。さらに、標的化は特異的であり、オフターゲット効果は限られている。
【0085】
本開示は、融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメント、およびエフェクタードメインを含む。適切なエフェクタードメインは、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、および転写抑制ドメインを含むが、これらに限定されることはない。各融合タンパク質は、特異的ｐｅｇＲＮＡによって特定の染色体配列へと誘導され、ここでエフェクタードメインは標的ゲノムの改変または遺伝子調節を媒介する。ある態様において、融合タンパク質はダイマーとして機能して、それによって標的部位の長さが増大し、また、ゲノムにおいて標的部位がユニークである可能性が増大する（すなわち、オフターゲット効果が減少する）。例えば、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ結合ワード長およそ１３－２０ｂｐに基づいたゲノム部位を改変する（Cong, et al., Science, 339:819-823）。このワードサイズでは、ゲノム中でユニークな標的部位は、５－７％のみである（Iseli, et al., PLos One 2(6):e579）。対照的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼのＤＮＡ結合ワードサイズは、典型的には３０－３６ｂｐにおよび、結果として、およそ８５－８７％の標的部位がヒトゲノム中でユニークである。ＣＲＩＳＰＲベースのシステムによって利用される、短いサイズのＤＮＡ結合部位は、所望の部位、例えば疾患ＳＮＰ、スモールエキソン（small exon）、開始コドン、および終止コドンなど、および複雑なゲノム中のその他の部位、の近くに標的化したＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの設計を制限し、かつ複雑化させる。本開示はＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ワード長を（オフターゲット活性を制限するため）増大させる手段を提供するのみでなく、さらに、改変された機能性を有するＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質も提供する。従って、開示されるＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質は、向上した標的特異性およびユニークな機能性を有する。また、本明細書では、標的染色体配列の発現を改変または調節するために、前記融合タンパク質を使用する方法も提供する。
【0086】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、真核生物の細胞および胚、例えば非ヒト１細胞胚などの核へとエンドヌクレアーゼが進入するのを可能にする、少なくとも１つの核局在化シグナルを含んでもよい。また、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、および少なくとも１つの、ｐｅｇＲＮＡと相互作用するドメインも含む。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｐｅｇＲＮＡによって特定の核酸配列（または標的部位）に導かれる。ｐｅｇＲＮＡはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼだけでなく標的部位とも相互作用し、これによって、いったん標的部位に導かれると、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは標的部位の核酸配列に鎖の切断を導入することができるようになる。標的化された切断の特異性はｐｅｇＲＮＡがもたらすため、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは普遍的であり、また、様々なｐｅｇＲＮＡと共に用いて様々な標的核酸配列を切断することができる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはタンパク質であってもよく、単離された核酸（すなわちＲＮＡまたはＤＮＡ）によってコードされてもよく、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターによってコードされてもよく、また、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに加えｐｅｇＲＮＡを含む、タンパク質－ＲＮＡ複合体であってもよい。
【0087】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（clustered regularly interspersed short palindromic repeats: CRISPR）／ＣＲＩＳＰＲ関連（CRISPR-associated: Cas）システムに由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはタイプ１、タイプ２、またはタイプ３システムであり得る。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（またはCasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(またはCasA)、Cse2（またはCasB）、Cse3（またはCasE）、Cse4（またはCasC）、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、およびCu1966を含む。
【0088】
ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはタイプ２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに由来する。特定の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp.）、ノカルジオプシス・ダソンヴィレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトポランギウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトポランギウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリシクロバシラス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バシラス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バシラス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エグジゴバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、マイクロスシーラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属（Cyanothece sp.）、ミクロキスチス・エルギノーザ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラバチクム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ammonifex degensii）、カルジセルロシラプター・ベシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジダタス・デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクラム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシドチオバシラス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシドチオバシラス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノサム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノデゥラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストク属（Nostoc sp.）、アロスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アロスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アロスロスピラ属（Arthrospira sp.）、リングビア属（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、またはアカリオクロリス・マリーナ（Acaryochloris marina）に由来し得る。
【0089】
一般的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼドメイン（すなわちＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、ダイマー形成ドメイン、およびその他のドメインも含み得る。
【0090】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質、または野生型または改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は核酸結合の親和性および／または特異性を高めるため、酵素活性を変更するため、および／またはタンパク質のその他の性質を変化させるために、改変され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわちＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、改変、除去、または不活性化され得る。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質の機能に必要でないドメインを除くために、切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化するために、切断または改変され得る。
【0091】
ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメントに由来し得る。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は改変Ｃａｓ９タンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列が、１つ以上の性質（例えばヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変更するために改変され得る。代わりに、改変Ｃａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるように、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡ誘導性の切断に関わらないドメインがＣａｓ９タンパク質から除かれ得る。
【0092】
一般的には、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわちＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは、共に作用してそれぞれ一本鎖を切断し、ＤＮＡの二重鎖切断を引き起こす（Jinek et al., Science, 337: 816-821）。ある実施形態において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、機能性のヌクレアーゼドメインを１つだけ（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）含むように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうち１つが除去されるように、または機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が無くなる）ように変異するように改変され得る。ヌクレアーゼドメインのうち１つが不活性である実施形態のいくつかにおいて、Ｃａｓ９由来のタンパク質は二重鎖核酸に切れ目を入れることができる（このようなタンパク質は“ニッカーゼ”と呼ばれる）が、二重鎖ＤＮＡを切断はしない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼへと変換する。同様に、ＨＮＨ様ドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの置換（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼへと変換する。各ヌクレアーゼドメインは、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、および遺伝子全合成などの当技術でよく知られる方法、および当技術で知られる他の方法を用いて改変され得る。
【0093】
ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは少なくとも１つの核局在化シグナルを含んでもよい。一般的には、ＮＬＳは塩基性アミノ酸が連なったものを含む。核局在化シグナルは当技術で知られている（例えばLange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105を参照）。例えば、ある実施形態において、ＮＬＳは、PKKKRKV（配列番号１９）またはPKKKRRV（配列番号８）などの単節型（monopartite）配列であり得る。別の実施形態において、ＮＬＳは双節型（bipartite）配列であり得る。さらに別の実施形態においては、ＮＬＳはKRPAATKKAGQAKKKK（配列番号２０）であり得る。ＮＬＳはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【0094】
ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはさらに、少なくとも１つの細胞膜透過ドメインを含み得る。ある実施形態において、細胞膜透過ドメインはＨＩＶ－１のＴＡＴタンパク質に由来する細胞膜透過ペプチド配列であり得る。例として、ＴＡＴの細胞膜透過配列はGRKKRRQRRRPPQPKKKRKV（配列番号２１）である。別の実施形態において、細胞膜透過ドメインは、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞膜透過ペプチド配列である、ＴＬＭ（PLSSIFSRIGDPPKKKRKV；配列番号２２）であり得る。さらに別の実施形態において、細胞膜透過ドメインはＭＰＧ（GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV；配列番号２３、またはGALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；配列番号２４）であり得る。追加の実施形態において、細胞膜透過ドメインは、Ｐｅｐ－１（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；配列番号２５）、単純ヘルペスウイルスの細胞膜透過ペプチドであるＶＰ２２、またはポリアルギニンペプチド配列であり得る。細胞膜透過ドメインは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部に位置し得る。
【0095】
さらに別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは少なくとも１つのマーカードメインを含む。マーカードメインの非限定的な例は、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグを含む。ある実施形態において、マーカードメインは蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（例えば、GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Azami Greenモノマー、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1）、黄色蛍光タンパク質（例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1）、青色蛍光タンパク質（例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan）、赤色蛍光タンパク質（mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred）およびオレンジ色蛍光タンパク質（mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Kusabira-Orangeモノマー、mTangerine、tdTomato）、またはその他任意の適切な蛍光タンパク質を含む。他の実施形態において、マーカードメインは精製タグおよび／またはエピトープタグであり得る。例示的なタグは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（TRX）、ポリＮＡＮＰ、タンデムアフィニティ精製（TAP）タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（BCCP）、およびカルモジュリンを含むが、これらに限定されることはない。
【0096】
特定の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはｐｅｇＲＮＡを含むタンパク質－ＲＮＡ複合体の一部であってもよい。ｐｅｇＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用し、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位へと導き、ここでガイドＲＮＡの５’末端が、特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成する。
【0097】
（II）融合タンパク質
本開示の別の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントおよびエフェクタードメインを、ｐｅｇＲＮＡおよびシス作用性調節エレメントと組み合わせて含む、融合タンパク質を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はｐｅｇＲＮＡによって標的部位に導かれ、この部位でエフェクタードメインが標的核酸配列を改変するか、または影響を与える。エフェクタードメインは、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインであり得る。融合タンパク質はさらに、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、またはマーカードメインから選択される少なくとも１つの追加ドメインを含み得る。
本開示の別の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントおよびエフェクタードメインを、ｐｅｇＲＮＡおよびシス作用性調節エレメントと組み合わせて含む、融合タンパク質を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はｐｅｇＲＮＡによって標的部位に導かれ、この部位でエフェクタードメインが標的核酸配列を改変するか、または影響を与える。エフェクタードメインは、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインであり得る。融合タンパク質はさらに、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、またはマーカードメインから選択される少なくとも１つの追加ドメインを含み得る。
【0098】
（a）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質
融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は上記セクション（I）で詳しく述べた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は上記セクション（I）で詳しく述べた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【0099】
ある実施形態において、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はＣａｓ９タンパク質に由来し得る。Ｃａｓ９由来のタンパク質は野生型、改変型、またはそれらのフラグメントであり得る。ある実施形態において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、機能性のヌクレアーゼドメインを１つだけ（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）含むように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうち１つが除去される、または機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が無くなる）ように変異するように改変され得る。ヌクレアーゼドメインのうち１つが不活性化される実施形態のいくつかにおいて、Ｃａｓ９由来のタンパク質は二重鎖核酸に切れ目を入れることができる（このようなタンパク質は“ニッカーゼ”と呼ばれる）が、二重鎖ＤＮＡを切断はしない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼへと変換する。同様に、ＨＮＨ様ドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの置換（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼへと変換する。他の実施形態において、Ｃａｓ９由来タンパク質が二重鎖核酸に切れ目を入れることも切断することもできないように、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの両方が改変または除去され得る。さらに他の実施形態においては、Ｃａｓ９由来タンパク質が全てのヌクレアーゼ活性を失うように、Ｃａｓ９由来タンパク質の全てのヌクレアーゼドメインが改変または除去されてもよい。
【0100】
上記の実施形態のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたは全てが、１つ以上の欠失変異、挿入変異、および／または置換変異によって、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、および遺伝子全合成などの当技術でよく知られる方法、および当技術で知られるその他の方法を用いて、不活性化され得る。例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はＣａｓ９タンパク質に由来し、ここでは全てのヌクレアーゼドメインが不活性化または除去されている。
【0101】
（b）エフェクタードメイン
融合タンパク質はエフェクタードメインも含む。エフェクタードメインは、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインであり得る。エフェクタードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
融合タンパク質はエフェクタードメインも含む。エフェクタードメインは、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインであり得る。エフェクタードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【0102】
（i）切断ドメイン
ある実施形態において、エフェクタードメインは切断ドメインである。本明細書で用いる“切断ドメイン”は、ＤＮＡを切断するドメインのことを表す。切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来となり得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼ（homing endonuclease）を含むが、これらに限定されることはない。（例えば、New England Biolabs Catalog or Belfort, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照）。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、リョクトウヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ（micrococcal nuclease）、酵母菌ＨＯエンドヌクレアーゼ（yeast HO endonuclease））。（Linn, et al., (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993）も参照。これらの１つ以上の酵素（またはその機能性フラグメント）が、切断ドメインの供給源として用いられ得る。
ある実施形態において、エフェクタードメインは切断ドメインである。本明細書で用いる“切断ドメイン”は、ＤＮＡを切断するドメインのことを表す。切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来となり得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼ（homing endonuclease）を含むが、これらに限定されることはない。（例えば、New England Biolabs Catalog or Belfort, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照）。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、リョクトウヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ（micrococcal nuclease）、酵母菌ＨＯエンドヌクレアーゼ（yeast HO endonuclease））。（Linn, et al., (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993）も参照。これらの１つ以上の酵素（またはその機能性フラグメント）が、切断ドメインの供給源として用いられ得る。
【0103】
ある実施形態において、切断ドメインは、タイプ２Ｓエンドヌクレアーゼに由来し得る。タイプ２Ｓエンドヌクレアーゼは、典型的には認識部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、また、そのため、分離可能な認識ドメインおよび切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般的には、一過性に会合してダイマーを形成し、ねじれの位置にあるＤＮＡのそれぞれの鎖を切断するモノマーである。適切なタイプ２Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏｌＩ、およびＳａｐＩを含む。例示的な実施形態において、融合タンパク質の切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたはその誘導体である。
【0104】
特定の実施形態において、タイプ２Ｓエンドヌクレアーゼは異なる２つの切断ドメイン（それぞれがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントに取り付けられる）のダイマー形成を促進するために改変され得る。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異させることで改変され得る。非限定的な例として、ＦｏｋＩ切断ドメインの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８番目のアミノ酸残基が、改変の標的となる。例えば、偏性ヘテロダイマー（obligate heterodimer）を形成する改変されたＦｏｋＩの切断ドメインは、第１の改変切断ドメインが４９０番目および５３８番目のアミノ酸残基の変異を含み、第２の改変切断ドメインが４８６番目および４９９番目のアミノ酸残基の変異を含む、ペアを含む（Miller et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:778-785; Szczpek et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:786-793）。例えば、一方のドメインの４９０番目のＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）に、かつ５３８番目のＩｌｅ（Ｉ）がＫに置換され得（Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ）、また、もう一方の切断ドメインの４８６番目のＧｌｎ（Ｑ）がＥに、かつ４９９番目のＩがＬｅｕ（Ｌ）に置換され得る（Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ）。他の実施形態において、改変ＦｏｋＩ切断ドメインは３つのアミノ酸置換を含み得る（Doyon et al., 2011, Nat. Methods, 8:74-81）。例えば、一方の改変ＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤと呼ばれる）がＱ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、Ｎ４９６Ｄ変異を含み得、またもう一方の改変ＦｏｋＩドメイン（ＫＫＲと呼ばれる）がＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、Ｈ５３７Ｒ変異を含み得る。
【0105】
例示的な実施形態において、エフェクタードメインはＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメインである。
【0106】
エフェクタードメインが切断ドメインであり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質がＣａｓ９タンパク質由来である実施形態において、Ｃａｓ９由来タンパク質は、本明細書に記載されるように、そのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを、ヌクレアーゼ活性を持たないように変異させることで、改変され得る。
【0107】
（ii）エピジェネティック修飾ドメイン
他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインはエピジェネティック修飾ドメインであり得る。一般的には、エピジェネティック修飾ドメインは、ＤＮＡの配列を変更することなく、ヒストンの構造および／または染色体の構造を変更する。ヒストンの構造および／または染色体の構造の変化は、遺伝子発現の変化をもたらし得る。エピジェネティック修飾の例は、ヒストンタンパク質のリシン残基のアセチル化またはメチル化、およびＤＮＡのシトシン残基のメチル化を含むが、これらに限定されることはない。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインを含む。
他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインはエピジェネティック修飾ドメインであり得る。一般的には、エピジェネティック修飾ドメインは、ＤＮＡの配列を変更することなく、ヒストンの構造および／または染色体の構造を変更する。ヒストンの構造および／または染色体の構造の変化は、遺伝子発現の変化をもたらし得る。エピジェネティック修飾の例は、ヒストンタンパク質のリシン残基のアセチル化またはメチル化、およびＤＮＡのシトシン残基のメチル化を含むが、これらに限定されることはない。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインを含む。
【0108】
エフェクタードメインがヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインである実施形態において、ＨＡＴドメインは、ＥＰ３００（すなわちＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）、ＣＲＥＢＢＰ（すなわちＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＣＤＹ１、ＣＤＹ２、ＣＤＹＬ１、ＣＬＯＣＫ、ＥＬＰ３、ＥＳＡ１、ＧＣＮ５（ＫＡＴ２Ａ）、ＨＡＴ１，ＫＡＴ２Ｂ、ＫＡＴ５、ＭＹＳＴ１、ＭＹＳＴ２、ＭＹＳＴ３、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＡＴ、Ｐ／ＣＡＦ、Ｔｉｐ６０、ＴＡＦＩＩ２５０、またはＴＦ３Ｃ４に由来し得る。このような実施形態の１つにおいて、ＨＡＴドメインはｐ３００である。
【0109】
エフェクタードメインがエピジェネティック修飾ドメインであり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質がＣａｓ９タンパク質由来である実施形態において、Ｃａｓ９由来タンパク質は、本明細書に記載されるように、そのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを、ヌクレアーゼ活性を持たないように変異させることで、改変され得る。
【0110】
（iii）転写活性化ドメイン
他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインである。一般的には、転写活性化ドメインは転写制御エレメント（transcriptional control element）および／または転写調節タンパク質（例えば転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を増加および／または活性化する。ある実施形態において、転写活性化ドメインは単純ヘルペスウイルスＶ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６のテトラマー型誘導体）、ＮＦ－ｋＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、およびＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）活性化ドメインであり得るが、これらに限定されることはない。他の実施形態において、転写活性化ドメインはＧａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、ＧＩｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、およびＬｅｕ３であり得る。転写活性化ドメインは野生型であってもよく、または、天然の転写活性化ドメインの改変バージョンであってもよい。ある実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインはＶＰ１６またはＶＰ６４転写活性化ドメインである。
他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインである。一般的には、転写活性化ドメインは転写制御エレメント（transcriptional control element）および／または転写調節タンパク質（例えば転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を増加および／または活性化する。ある実施形態において、転写活性化ドメインは単純ヘルペスウイルスＶ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６のテトラマー型誘導体）、ＮＦ－ｋＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、およびＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）活性化ドメインであり得るが、これらに限定されることはない。他の実施形態において、転写活性化ドメインはＧａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、ＧＩｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、およびＬｅｕ３であり得る。転写活性化ドメインは野生型であってもよく、または、天然の転写活性化ドメインの改変バージョンであってもよい。ある実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインはＶＰ１６またはＶＰ６４転写活性化ドメインである。
【0111】
エフェクタードメインが転写活性化ドメインであり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質がＣａｓ９タンパク質由来である実施形態において、Ｃａｓ９由来タンパク質は、本明細書に記載されるように、そのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを、ヌクレアーゼ活性を持たないように変異させることで、改変され得る。
【0112】
（iv）転写抑制ドメイン
さらに他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは転写抑制ドメインであり得る。一般的には、転写抑制ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（例えば転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を減少および／または終了させる。適切な転写抑制ドメインの非限定的な例は、誘導型ｃＡＭＰ早期リプレッサー（inducible cAMP early repressor: ICER）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｉ会合ボックスＡ（Kruppei-associated box A: KRAB-A）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ－１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩＫＢリプレッサー、およびＭｅＣＰ２を含む。
さらに他の実施形態において、融合タンパク質のエフェクタードメインは転写抑制ドメインであり得る。一般的には、転写抑制ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（例えば転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を減少および／または終了させる。適切な転写抑制ドメインの非限定的な例は、誘導型ｃＡＭＰ早期リプレッサー（inducible cAMP early repressor: ICER）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｉ会合ボックスＡ（Kruppei-associated box A: KRAB-A）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ－１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩＫＢリプレッサー、およびＭｅＣＰ２を含む。
【0113】
エフェクタードメインが転写抑制ドメインであり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質がＣａｓ９タンパク質由来である実施形態において、Ｃａｓ９由来タンパク質は、本明細書に記載されるように、そのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変され得る。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを、ヌクレアーゼ活性を持たないように変異させることで、改変され得る。
【0114】
（c）追加ドメイン
ある実施形態において、融合タンパク質はさらに、少なくとも１つの追加ドメインを含む。適切な追加ドメインの非限定的な例は、核局在化シグナル、細胞膜透過または転座ドメイン、およびマーカードメインを含む。適切な核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、およびマーカードメインの非限定的な例は、セクション（I）に示される。
ある実施形態において、融合タンパク質はさらに、少なくとも１つの追加ドメインを含む。適切な追加ドメインの非限定的な例は、核局在化シグナル、細胞膜透過または転座ドメイン、およびマーカードメインを含む。適切な核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、およびマーカードメインの非限定的な例は、セクション（I）に示される。
【0115】
（d）融合タンパク質ダイマー
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメインである実施形態において、少なくとも１つの融合タンパク質を含むダイマーが形成され得る。ダイマーはホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。ある実施形態において、ヘテロダイマーは２つの異なる融合タンパク質を含む。他の実施形態において、ヘテロダイマーは１つの融合タンパク質および追加のタンパク質を含む。
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメインである実施形態において、少なくとも１つの融合タンパク質を含むダイマーが形成され得る。ダイマーはホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。ある実施形態において、ヘテロダイマーは２つの異なる融合タンパク質を含む。他の実施形態において、ヘテロダイマーは１つの融合タンパク質および追加のタンパク質を含む。
【0116】
ある実施形態において、ダイマーは、２つの融合タンパク質モノマーが一次アミノ酸配列に関して同一であるホモダイマーである。ダイマーがホモダイマーである実施形態の１つにおいて、Ｃａｓ９由来タンパク質は、それらのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように、すなわち、それらが機能性のヌクレアーゼドメインを有さないように改変される。Ｃａｓ９由来タンパク質が、それらのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変される、特定の実施形態において、各融合タンパク質モノマーは同一のＣａｓ９様タンパク質および同一の切断ドメインを含む。切断ドメインは、本明細書で提供される例示的な切断ドメインのいずれかなどの、いかなる切断ドメインであってもよい。ある特定の実施形態において、切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメインである。このような実施形態において、特異的ｐｅｇＲＮＡは、融合タンパク質モノマーを、ダイマーを形成すると２つのモノマーのヌクレアーゼドメインが標的ＤＮＡに二重鎖切断を生成するように、異なるが近接した部位に導く。
【0117】
他の実施形態において、ダイマーは２つの異なる融合ドメインのヘテロダイマーである。例えば、各融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または異なる細菌種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質オルソログに由来し得る。例えば、各融合タンパク質は、異なる細菌種に由来するＣａｓ９様タンパク質を含み得る。これらの実施形態において、各融合タンパク質は異なる標的部位（すなわち、プロトスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって特定される標的部位）を認識する。例えば、ｐｅｇＲＮＡは、ヘテロダイマーのヌクレアーゼドメインが標的ＤＮＡに効果的な二重鎖切断をもたらすように、異なるが近接した部位にヘテロダイマーを位置取らせ得る。ヘテロダイマーは、切れ目を入れる部位が異なるような切れ目生成活性を持つ改変Ｃａｓ９タンパク質を有することもできる。
【0118】
代わりに、ヘテロダイマーの２つの融合タンパク質は、異なるエフェクタードメインを有し得る。エフェクタードメインが切断ドメインである実施形態において、各融合タンパク質は異なる改変切断ドメインを含み得る。例えば、各融合タンパク質は、セクション（II）（b）（i）で詳しく述べたように、異なる改変ＦｏｋＩ切断ドメインを含み得る。これらの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、それらのエンドヌクレアーゼ活性が消失するように改変され得る。
【0119】
当業者に理解できるように、ヘテロダイマーを形成する２つの融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質ドメインおよびエフェクタードメインの両方において異なり得る。
【0120】
上記の実施形態のいずれにおいても、ホモダイマーまたはヘテロダイマーは、上で詳しく述べたような、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞膜透過ドメイン、転座ドメイン、およびマーカードメインから選択される、少なくとも１つの追加ドメインを含み得る。
【0121】
上記の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９由来タンパク質の１つまたは両方が、そのエンドヌクレアーゼ活性が消失するか、または改変されるように改変され得る。
【0122】
さらに別の実施形態において、ヘテロダイマーは１つの融合タンパク質および追加のタンパク質を含む。例えば、追加のタンパク質はヌクレアーゼであり得る。ある実施形態において、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。ジンクフィンガーヌクレアーゼはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む。ジンクフィンガーは、３つのヌクレオチドを認識し、結合する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは約３つから約７つのジンクフィンガーを含み得る。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは天然のタンパク質に由来し得、あるいは合成され得る。（例えば、Beerli, et al., (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo, et al., (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan, et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo, et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon, et al., (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708;および Santiago, et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814を参照）。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、上記セクション（II）（b）（i）で詳しく述べたいずれの切断ドメインであってもよい。例示的な実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメインである。このようなジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメインを含む融合タンパク質とダイマーを形成する。
【0123】
ある実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、上で詳しく述べた、核局在化シグナル、細胞膜透過または転座ドメインから選択される、少なくとも１つの追加ドメインを含み得る。
【0124】
特定の実施形態において、上で詳しく述べた融合タンパク質のいずれか、または少なくとも１つの融合タンパク質を含むダイマーが、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡを含むタンパク質－ＲＮＡ複合体の一部となり得る。ｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質と相互作用し、融合タンパク質を特定の標的部位へ導き、ここでｐｅｇＲＮＡの５’末端が、特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成する。
【0125】
（III）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸
本開示の別の態様は、上のセクション（I）および（II）にそれぞれ記載される、いずれかのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはいずれかの融合タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは５’キャップ修飾および／または３’ポリアデニル化修飾を施されたものであり得る。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸はＤＮＡである。ＤＮＡはベクター中に含まれ得る（下記を参照）。
本開示の別の態様は、上のセクション（I）および（II）にそれぞれ記載される、いずれかのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはいずれかの融合タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは５’キャップ修飾および／または３’ポリアデニル化修飾を施されたものであり得る。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸はＤＮＡである。ＤＮＡはベクター中に含まれ得る（下記を参照）。
【0126】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸は、真核生物の細胞または対象の動物において、タンパク質への効率的な翻訳のために、コドン最適化され得る。例えば、コドンはヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、魚類、両生類、植物、酵母、昆虫、などにおける発現のため、最適化され得る。コドン最適化のためのプログラムが、フリーソフトとして利用可能である。市販のコドン最適化プログラムも利用可能である。
【0127】
ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡは、少なくとも１つのプロモーター制御配列に、動作可能に連結され得る。いくつかの反復において、前記ＤＮＡコード配列は、真核生物の細胞または対象の動物における発現のため、プロモーター制御配列に、動作可能に連結され得る。プロモーター配列は、恒常的、調節性または組織特異的であり得る。適切な恒常的プロモーター配列は、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）αプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらのフラグメント、または前記のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されることはない。適切な調節性プロモーター制御配列（regulated promoter control sequence）の例は、ヒートショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節される配列を含むが、これらに限定されることはない。組織特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、Ｎｐｈｓｌプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型であり得、または、効率的な、あるいは効果的な発現のため改変され得る。ある例示的な実施形態において、コードするＤＮＡは、哺乳類の細胞における恒常的な発現のため、ＣＭＶプロモーターに、動作可能に連結され得る。
【0128】
特定の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする配列は、インビトロにおけるＲＮＡ合成のため、ファージＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター配列に、動作可能に連結され得る。このような実施形態において、インビトロで転写されたＲＮＡは、下記セクション（IV）および（V）において詳しく述べられる方法において使用するため、精製され得る。例えば、プロモーター配列はＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーターの変異型であってもよい。例示的な実施形態において、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロｍＲＮＡ合成のため、Ｔ７プロモーターと、動作可能に連結される。
【0129】
異なる実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする配列は、細菌または真核生物の細胞におけるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質のインビトロにおける発現のため、プロモーター配列と、動作可能に連結され得る。このような実施形態において、発現したタンパク質は、下記セクション（IV）および（V）において詳しく述べられる方法において使用するために、精製されうる。適切な細菌プロモーターは、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、それらの変異型、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されることはない。例示的な細菌プロモーターは、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃプロモーターのハイブリッドであるｔａｃプロモーターである。適切な真核生物プロモーターの非限定的な例は、上に列挙される。
【0130】
追加の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列と連結され得る。加えて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする配列は、上記セクション（I）で詳しく述べたような、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインをコードする配列と連結され得る。
【0131】
様々な態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ベクターに含まれ得る。適切なベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡは、プラスミドベクターに含まれる。適切なプラスミドベクターの非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらの変異型を含む。ベクターは追加の発現制御配列（例えばエンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製起点、などを含み得る。追加の情報は、（"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel, et al., John Wiley & Sons, New York, 2003）または（"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001）において見られる。
【0132】
ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターは、さらにｐｅｇＲＮＡをコードする配列を含む。ｐｅｇＲＮＡをコードする配列は、一般的には、対象の細胞または胚におけるｐｅｇＲＮＡ発現のための少なくとも１つの転写制御配列と、動作可能に連結される。例えば、ｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼIII（Ｐｏｌ III）によって認識されるプロモーター配列と、動作可能に連結され得る。適切なＰｏｌ IIIプロモーターの例は、哺乳類のＵ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含むが、これらに限定されることはない。
【0133】
（IV）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用して染色体配列を改変する方法
本開示の別の態様は、真核生物の細胞または胚において染色体配列を改変する方法を含む。本方法は、真核生物の細胞または胚に、（i）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ii）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、および、場合により、（iii）ドナー配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、を導入することを含む。本方法はさらに、各ｐｅｇＲＮＡがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位へ導き、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが標的部位に二重鎖切断を引き起こし、また、染色体配列が改変されるようなＤＮＡ修復プロセスによって二重鎖切断が修復されるように、細胞または胚を培養することを含む。
本開示の別の態様は、真核生物の細胞または胚において染色体配列を改変する方法を含む。本方法は、真核生物の細胞または胚に、（i）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ii）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、および、場合により、（iii）ドナー配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、を導入することを含む。本方法はさらに、各ｐｅｇＲＮＡがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位へ導き、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが標的部位に二重鎖切断を引き起こし、また、染色体配列が改変されるようなＤＮＡ修復プロセスによって二重鎖切断が修復されるように、細胞または胚を培養することを含む。
【0134】
ある実施形態において、本方法は、１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）およびｐｅｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）を細胞または胚へと導入することを含み得、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが標的染色体配列に１つの二重鎖切断を引き起こす。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれない実施形態において、染色体配列における二重鎖切断は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復され得る。ＮＨＥＪはエラーを起こしやすいため、二重鎖切断の修復の過程で、少なくとも１つの塩基の欠失、少なくとも１つの塩基の挿入、少なくとも１つの塩基の置換、またはそれらの組み合わせが起こり得る。したがって、標的染色体配列が改変または不活性化され得る。例えば、一塩基変異（ＳＮＰ）が変異したタンパク質産物をもたらし得、または、コーディング配列のリーディングフレームのシフト変異が、配列を不活性化またはタンパク質産物が作られないように“ノックアウト”し得る。オプションのドナーポリペプチドが含まれる実施形態においては、二重鎖切断の修復の過程で、ドナーポリペプチド中のドナー配列が標的部位の染色体配列と交換または統合され得る。例えば、ドナー配列が、染色体配列の標的部位の上流および下流の配列とそれぞれ実質的に同一な配列を持つ上流配列および下流配列に挟まれている実施形態においては、相同組換え修復プロセスを介した修復の過程で、ドナー配列は、標的部位の染色体配列と交換または統合され得る。代わりに、ドナー配列が適合性のあるオーバーハング（compatible overhangs）に挟まれている（または適合性のあるオーバーハングがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによってインサイチュで生成される）実施形態においては、二重鎖切断の修復の過程における非相同性修復プロセスによって、ドナー配列は切断された染色体配列に直接接合され得る。ドナー配列の、染色体配列との交換または統合は、標的染色体配列を改変するか、または外因性配列を細胞または胚の染色体配列へと導入する。
【0135】
他の実施形態において、本方法はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）および２つのｐｅｇＲＮＡ（またはそれらをコードするＤＮＡ）を、細胞又は胚へと導入することを含み得、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは標的染色体配列に２つの二重鎖切断を引き起こす。図３Ｂを参照。２つの二重鎖切断は数塩基対内、数十塩基対内で起こり得、または数千塩基対離れて起こり得る。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれない実施形態において、結果として起こる二重鎖切断は、二重鎖切断の修復の過程で、２つの切断部位の間の配列が失われるような、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが起こり得るような、非相同性修復プロセスによって修復され得る。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれる実施形態において、ドナーポリペプチドのドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、相同性ベースの修復プロセス（例えば、ドナー配列が染色体配列の標的部位の上流配列および下流配列と実質的に同一な配列を持つ上流配列および下流配列に挟まれている実施形態において）、または非相同性修復プロセス（例えばドナー配列が適合性のあるオーバーハングに挟まれている実施形態において）のいずれかによって、染色体配列と交換または染色体配列へと統合され得る。
【0136】
さらに別の実施形態において、本方法は、二重鎖配列の一方の鎖を切断するように改変されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）および２つのｐｅｇＲＮＡ（またはそれらをコードするＤＮＡ）を細胞もしくは胚に導入することを含み、ここで各ｐｅｇＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを特定の標的部位へ導き、この部位で、改変エンドヌクレアーゼは二重鎖染色体配列の一方の鎖を切断し（すなわち切れ目を入れ）、またここで２つの切れ目は反対の鎖にあり、かつ二重鎖切断を構成するのに十分近接している。図３Ａを参照。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれない実施形態において、結果として生じる二重鎖切断は、二重鎖切断の修復の過程で、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが起こり得るような、非相同性修復によって修復され得る。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれる実施形態において、ドナーポリペプチドのドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、相同性ベースの修復プロセス（例えば、ドナー配列が染色体配列の標的部位の上流配列および下流配列と実質的に同一な配列を持つ上流配列および下流配列に挟まれている実施形態において）、または非相同性修復プロセス（例えばドナー配列が適合性のあるオーバーハングに挟まれている実施形態において）のいずれかによって、染色体配列と交換または統合され得る。
【0137】
（a）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
本方法は、細胞または胚に、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む。このようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、それぞれ上記セクション（I）および（III）において詳しく述べた。このようなＲＮＡ誘導はｐｅｇＲＮＡであってもよい。
本方法は、細胞または胚に、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む。このようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、それぞれ上記セクション（I）および（III）において詳しく述べた。このようなＲＮＡ誘導はｐｅｇＲＮＡであってもよい。
【0138】
ある実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、細胞もしくは胚に、単離されたタンパク質として導入され得る。このような実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはさらに、タンパク質の細胞内取込を促進する少なくとも１つの細胞膜透過ドメインを含み得る。他の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、細胞または胚に、ｍＲＮＡ分子として導入され得る。さらに他の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、細胞または胚に、ＤＮＡ分子として導入され得る。一般的には、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、対象の細胞または胚において機能するプロモーター配列と、動作可能に連結されている。ＤＮＡ配列は直鎖状であり得、あるいは、ＤＮＡ配列はベクターの一部であり得る。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、細胞もしくは胚に、融合タンパク質およびｐｅｇＲＮＡを含むＲＮＡ－タンパク質複合体として導入され得る。
【0139】
異なる実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡはさらに、ｐｅｇＲＮＡをコードする配列を含み得る。一般的には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする配列およびｐｅｇＲＮＡをコードする配列のそれぞれが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびｐｅｇＲＮＡの細胞または胚における発現を可能にする適切なプロモーター制御配列と、動作可能に連結されている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列はさらに、追加の発現制御、調節、および／またはプロセッシング配列を含み得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、直鎖状であり得、またはベクターの一部であり得る。
【0140】
（b）プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）
本方法は、細胞または胚に、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することも含む。ｐｅｇＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用し、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位へ導き、この部位で、ガイドＲＮＡの５’末端が染色体配列の特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成する。
本方法は、細胞または胚に、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することも含む。ｐｅｇＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用し、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位へ導き、この部位で、ガイドＲＮＡの５’末端が染色体配列の特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成する。
【0141】
各ｐｅｇＲＮＡは３つの領域：染色体配列の標的部位と相補的な５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成する内部の第２の領域、基本的に単鎖の状態を維持する３’末端の第３の領域、を含む。各ｐｅｇＲＮＡが融合タンパク質を特定の標的部位へ誘導するように、各ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は異なっている。ｐｅｇＲＮＡの第２の領域および第３の領域は、全てのｐｅｇＲＮＡで同一であり得る。
【0142】
ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は染色体配列の標的部位の配列（すなわちプロトスペーサー配列）と相補的であり、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対を形成できるようになっている。様々な実施形態において、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は、約１０ヌクレオチドから、約２５ヌクレオチドより多くを含み得る。例えば、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域と染色体配列の標的部位との間の塩基対形成の領域は、長さ約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５より多くのヌクレオチドであり得る。例示的な実施形態において、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は、長さ約１９、２０、または２１ヌクレオチドである。
【0143】
また、ｐｅｇＲＮＡは、二次構造を形成する第２の領域も含む。ある実施形態においては、二次構造はステム（またはヘアピン）およびループも含む。ループおよびステムの長さは様々であり得る。例えば、ループは長さ約３から約１０ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは長さ約６から約２０塩基対の範囲であり得る。ステムは１から約１０ヌクレオチドのバルジ（bulge）を１つ以上含み得る。したがって、第２の領域の全長は、長さ約１６から約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。例示的な実施形態において、ループは長さ約４ヌクレオチドであり、また、ステムは約１２塩基対を含む。
【0144】
また、ｐｅｇＲＮＡは、基本的に単鎖の状態を維持する第３の領域も含む。すなわち、第３の領域は対象の細胞の染色体配列のいずれに対しても相補性を有さず、また、ｐｅｇＲＮＡの残りの部分に対しても相補性を有さない。第３の領域の長さは様々であり得る。一般的には、第３の領域は約４ヌクレオチドよりも長い。例えば、第３の領域の長さは、長さ約５から約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。
【0145】
ｐｅｇＲＮＡの第２の領域と第３の領域を組み合わせた長さ（普遍領域（universal region）または足場領域（scaffold region）とも呼ばれる）は、長さ約３０から約１２０ヌクレオチドの範囲であり得る。ある態様において、ｐｅｇＲＮＡの第２の領域と第３の領域を組み合わせた長さは、長さ約７０から約１００ヌクレオチドの範囲である。
【0146】
ある実施形態において、ｐｅｇＲＮＡは３つ全ての領域を含む１つの分子を含む。他の実施形態において、ｐｅｇＲＮＡは２つの分割された分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域、およびｐｅｇＲＮＡの第２の領域の“ステム”の半分を含み得る。第２のＲＮＡ分子は、ｐｅｇＲＮＡの第２の領域の“ステム”のもう半分およびｐｅｇＲＮＡの第３の領域を含み得る。すなわち、この実施形態においては、第１および第２のＲＮＡ分子それぞれが、他方と相補的なヌクレオチドの配列を含む。例えば、ある実施形態において、第１および第２のＲＮＡ分子はそれぞれ、他方の配列と塩基対を形成して機能性のｐｅｇＲＮＡを形成する（約６から約２０ヌクレオチドの）配列を含む。
【0147】
ある実施形態において、ｐｅｇＲＮＡは、細胞または胚に、ＲＮＡ分子として導入され得る。ＲＮＡ分子はインビトロで転写され得る。代わりに、ＲＮＡ分子は化学合成され得る。
【0148】
他の実施形態において、ｐｅｇＲＮＡは、細胞または胚に、ＤＮＡ分子として導入され得る。このような場合において、ｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、対象の細胞または胚におけるｐｅｇＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列と、動作可能に連結され得る。例えば、ＲＮＡをコードする配列は、ＲＮＡポリメラーゼIII（Ｐｏｌ III）によって認識されるプロモーター配列と、動作可能に連結され得る。適切なＰｏｌ IIIプロモーターの例は、哺乳類のＵ６またはＨ１プロモーターを含むが、これに限定されることはない。例示的な実施形態において、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターと連結されている。他の例示的な実施形態において、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターと連結されている。
【0149】
ｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は直鎖状または環状であり得る。ある実施形態において、ｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡはベクターの一部であり得る。適切なベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを含む。適切なプラスミドベクターの非限定的な例はｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらのバリアントを含む。ベクターは追加の発現制御配列（例えばエンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、など）、選択可能なマーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製起点、などを含み得る。
【0150】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびｐｅｇＲＮＡの両方が、細胞または胚に、ＤＮＡ分子として導入される実施形態において、それぞれは別々の分子の一部であり得（例えば、融合タンパク質をコードする配列を含むベクターおよびｐｅｇＲＮＡをコードする配列を含む第２のベクター）、あるいは両方が同じ分子の一部であり得る（例えば、融合タンパク質およびｐｅｇＲＮＡの両方のコーディング配列（および調節配列）を含むベクター）。
【0151】
（c）標的部位
ｐｅｇＲＮＡと組み合わされたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは染色体配列の標的部位へ導かれ、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは染色体配列の切断を引き起こす。標的部位には、コンセンサス配列がすぐ先に（下流に）あるということを除いて、配列の制限はない。このコンセンサス配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）としても知られる。ＰＡＭの例は、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、およびＮＮＡＧＡＡＷ（ここでＮは任意のヌクレオチドと定義され、また、ＷはＡまたはＴのいずれかと定義される）を含むが、これらに限定されることはない。上記セクション（IV）（b）で詳しく述べたように、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域（５’末端）は、標的配列のプロトスペーサーと相補的である。典型的には、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は長さ約１９－２１ヌクレオチドである。したがって、特定の態様において、染色体配列の標的部位の配列は、５’－Ｎ１９－２１－ＮＧＧ－３’である。ＰＡＭはイタリック表記である。
ｐｅｇＲＮＡと組み合わされたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは染色体配列の標的部位へ導かれ、ここでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは染色体配列の切断を引き起こす。標的部位には、コンセンサス配列がすぐ先に（下流に）あるということを除いて、配列の制限はない。このコンセンサス配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）としても知られる。ＰＡＭの例は、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、およびＮＮＡＧＡＡＷ（ここでＮは任意のヌクレオチドと定義され、また、ＷはＡまたはＴのいずれかと定義される）を含むが、これらに限定されることはない。上記セクション（IV）（b）で詳しく述べたように、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域（５’末端）は、標的配列のプロトスペーサーと相補的である。典型的には、ｐｅｇＲＮＡの第１の領域は長さ約１９－２１ヌクレオチドである。したがって、特定の態様において、染色体配列の標的部位の配列は、５’－Ｎ１９－２１－ＮＧＧ－３’である。ＰＡＭはイタリック表記である。
【0152】
標的部位は遺伝子のコーディング領域の中、遺伝子のイントロンの中、遺伝子の制御領域の中、遺伝子間のノンコーディング領域の中、などであり得る。遺伝子はタンパク質をコードする配列またはＲＮＡをコードする配列であり得る。遺伝子は、対象のいかなる遺伝子であってもよい。
【0153】
（d）オプションのドナーポリヌクレオチド
ある実施形態において、本方法はさらに、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを標的部位に導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドは少なくとも１つのドナー配列を含む。ある態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または天然の染色体配列に対応する。例えば、ドナー配列は、標的部位またはその近くの染色体配列の一部と実質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む。すなわち、ドナー配列は、天然の配列と統合または交換されるに際して、標的の染色体上の位置の配列が少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含むように、標的部位の野生型配列の改変バージョンを含み得る。例えば、変化は１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであり得る。改変された配列の統合の結果として、細胞または胚／動物は、標的の染色体配列から改変された遺伝子産物を産生できる。
ある実施形態において、本方法はさらに、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを標的部位に導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドは少なくとも１つのドナー配列を含む。ある態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または天然の染色体配列に対応する。例えば、ドナー配列は、標的部位またはその近くの染色体配列の一部と実質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む。すなわち、ドナー配列は、天然の配列と統合または交換されるに際して、標的の染色体上の位置の配列が少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含むように、標的部位の野生型配列の改変バージョンを含み得る。例えば、変化は１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであり得る。改変された配列の統合の結果として、細胞または胚／動物は、標的の染色体配列から改変された遺伝子産物を産生できる。
【0154】
他の態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、外因性配列に対応する。本明細書で用いる“外因性”配列は、胚または細胞天然のものではない配列、あるいは、細胞または胚のゲノムにおける天然の位置が異なる位置である配列を表す。例えば、外因性配列は、タンパク質をコードする配列を含み、この配列は、ゲノムへの統合に際して、細胞または胚／動物が、統合された配列にコードされるタンパク質を発現できるように、外因性のプロモーター制御配列と動作可能に連結され得る。代わりに、外因性配列は、その発現が外因性プロモーター制御配列によって調節されるように、染色体配列へと統合され得る。他の反復において、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡをコードする配列、などであり得る。外因性配列の染色体配列への統合は、“ノックイン”と呼ばれる。
【0155】
当業者には理解できるように、ドナー配列の長さは様々であり得るし、また、様々であろう。例えば、ドナー配列は長さ数ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、数十万ヌクレオチドまで様々であり得る。
【0156】
上流配列および下流配列を含むドナーポリヌクレオチド。ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は上流配列および下流配列に挟まれており、これらの配列は、染色体配列の標的部位のそれぞれ上流および下流に位置する配列との実質的な配列同一性を有している。これらの配列の類似性から、ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、ドナー配列が染色体配列と統合される（または交換される）ような、ドナーポリヌクレオチドと標的の染色体配列との間の相同組み換えを可能にする。
【0157】
本明細書で用いる上流配列とは、標的部位の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列のことを表す。同様に、下流配列は、標的部位の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列のことを表す。本明細書で用いる“実質的な配列同一性”というフレーズは、少なくとも７５％の配列同一性を有することを表す。すなわち、ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、標的部位の上流または下流の配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、標的部位の上流または下流の染色体配列と、約９５％から１００％の配列同一性を有し得る。ある実施形態において、上流配列は、標的部位のすぐ上流に位置する（すなわち標的部位に隣接している）染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態において、上流配列は、標的部位から約百（１００）ヌクレオチド以内の上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。すなわち、例えば上流配列は、標的部位から、約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。ある実施形態において、下流配列は、標的部位のすぐ下流に位置する（すなわち標的部位に隣接している）染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態において、下流配列は、標的部位から約百（１００）ヌクレオチド以内の下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。すなわち、例えば下流配列は、標的部位から、約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。
【0158】
各上流配列または下流配列は、長さ約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドまでの範囲であり得る。ある実施形態において、上流配列および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。例示的な実施形態において、上流配列および下流配列は、長さ約５０から約１５００ヌクレオチドの範囲であり得る。
【0159】
標的の染色体配列と配列の類似性を有する上流配列および下流配列を含むドナーポリヌクレオチドは、直鎖状または環状であり得る。ドナーポリペプチドが環状である実施形態において、ドナーポリペプチドはベクターの一部であり得る。例えば、ベクターはプラスミドベクターであり得る。
【0160】
標的化切断部位を含むドナーポリペプチド。他の実施形態において、ドナーポリペプチドは追加で、少なくとも１つの、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによって認識される標的化切断部位を含み得る。ドナーポリヌクレオチドに加えられた標的化切断部位は、ドナー配列の上流または下流、あるいは上流および下流の両方に位置し得る。例えば、ドナー配列は標的化切断部位に挟まれ得、これにより、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる切断に際して、ドナー配列は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる切断に際して生成された染色体配列のオーバーハングと適合性のあるオーバーハングによって挟まれる。したがって、非相同性修復プロセスによる二重鎖切断の修復の過程で、ドナー配列は、切断された染色体配列と接合され得る。一般的には、標的化切断部位を含むドナーポリヌクレオチドは、環状である（例えばプラスミドベクターの一部であり得る）。
【0161】
オプションのオーバーハングを有する短いドナー配列を含むドナーポリヌクレオチド。さらに別の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングと適合性のある、オプションの短いオーバーハングを有する短いドナー配列を含む、直鎖状の分子であり得る。このような実施形態において、ドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、切断された染色体配列と直接接合され得る。ある場合において、ドナー配列は約１０００未満、約５００未満、約２５０未満、または約１００未満のヌクレオチドであり得る。特定のケースにおいて、ドナーポリヌクレオチドは、平滑末端を有する短いドナー配列を含む、直鎖状の分子であり得る。他の場合において、ドナーポリヌクレオチドは、５’および／または３’オーバーハングを有する短いドナー配列を含む、直鎖状の分子であり得る。オーバーハングは１，２、３、４、または５ヌクレオチドを含み得る。
【0162】
典型的には、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡは単鎖または二重鎖、かつ／または、直鎖状または環状であってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの直鎖状の断片、ＰＣＲ断片、遊離核酸、またはリポソームまたはポロキサマー（poloxamer）のようなデリバリー用の媒体であってもよい。特定の実施形態において、ドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドはプラスミドベクターの一部であり得る。これらの状況のいずれにおいても、ドナー配列を含むドナーヌクレオチドは、さらに少なくとも１つの追加配列を含み得る。
【0163】
（e）細胞または胚への導入
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）、ｐｅｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）、およびオプションのドナーポリヌクレオチドは、細胞または胚に、様々な手段で導入され得る。ある実施形態において、細胞または胚は、トランスフェクトされる。適切なトランスフェクションの方法は、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、ヌクレオフェクション（nucleofection）（またはエレクトロポレーション）、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えばＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、バイロソーム（virosome）トランスフェクション、ビリオン（virion）トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、免疫リポソーム（immunoliposome）トランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマー（dendrimer）トランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネトフェクション（magnetofection）、リポフェクション、遺伝子銃（gene gun）デリバリー、インペイルフェクション（impalefection）、ソノポレーション（sonoporation）、光トランスフェクション、および商品の試薬（proprietary agent）による核酸取込の促進を含む。トランスフェクションの方法は当技術でよく知られている（例えば"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel, et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001を参照）。他の実施形態において、分子は細胞または胚にマイクロインジェクションによって導入される。典型的には、胚は、対象の生物種の、受精した１細胞期の胚である。例えば、分子は１細胞の胚の前核に注射される。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）、ｐｅｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）、およびオプションのドナーポリヌクレオチドは、細胞または胚に、様々な手段で導入され得る。ある実施形態において、細胞または胚は、トランスフェクトされる。適切なトランスフェクションの方法は、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、ヌクレオフェクション（nucleofection）（またはエレクトロポレーション）、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えばＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、バイロソーム（virosome）トランスフェクション、ビリオン（virion）トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、免疫リポソーム（immunoliposome）トランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマー（dendrimer）トランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネトフェクション（magnetofection）、リポフェクション、遺伝子銃（gene gun）デリバリー、インペイルフェクション（impalefection）、ソノポレーション（sonoporation）、光トランスフェクション、および商品の試薬（proprietary agent）による核酸取込の促進を含む。トランスフェクションの方法は当技術でよく知られている（例えば"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel, et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001を参照）。他の実施形態において、分子は細胞または胚にマイクロインジェクションによって導入される。典型的には、胚は、対象の生物種の、受精した１細胞期の胚である。例えば、分子は１細胞の胚の前核に注射される。
【0164】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）、ｐｅｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）、およびオプションのドナーポリヌクレオチドは、細胞または胚に、同時に、または逐次導入され得る。ｐｅｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）に対するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸）の比は、一般的には、これらがＲＮＡ－タンパク質複合体を形成し得るように、化学量論的である。ある実施形態においては、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡおよびｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、共にプラスミドベクターで送達される。
【0165】
（f）細胞または胚の培養
本方法はさらに、ｐｅｇＲＮＡがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位へ導き、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが染色体配列に少なくとも１つの二重鎖切断を引き起こすように、細胞または胚を適切な条件下で維持することを含む。二重鎖切断は、染色体配列が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせによって改変されるようなＤＮＡ修復プロセスによって、修復され得る。
本方法はさらに、ｐｅｇＲＮＡがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位へ導き、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが染色体配列に少なくとも１つの二重鎖切断を引き起こすように、細胞または胚を適切な条件下で維持することを含む。二重鎖切断は、染色体配列が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせによって改変されるようなＤＮＡ修復プロセスによって、修復され得る。
【0166】
ドナーポリヌクレオチドが細胞または胚に導入されない実施形態において、二重鎖切断は非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復され得る。ＮＨＥＪはエラーを起こしやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが、二重鎖切断の修復の過程で起こり得る。したがって、染色体配列上のその配列は、コーディング領域のリーディングフレームがシフトし得、染色体配列が不活性化または“ノックアウト”されるように、改変され得る。不活性化された、タンパク質をコードする染色体配列は、野生型の染色体配列によってコードされるタンパク質を生み出さない。
【0167】
上流配列および下流配列を含むドナーポリヌクレオチドが細胞または胚に導入される実施形態において、二重鎖切断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）プロセスによって、ドナー配列が染色体配列に統合されるように修復され得る。したがって、外因性配列が細胞または胚のゲノムに統合され得、あるいは標的の染色体配列が、野生型染色体配列の改変配列との交換によって改変され得る。
【0168】
標的化切断部位を含むドナーポリペプチドが細胞または胚に導入される実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的の染色体配列およびドナーポリヌクレオチドの両方を切断し得る。直鎖状になったドナーポリヌクレオチドは、二重鎖切断の部位で、ドナーポリヌクレオチドと切断された染色体配列との間の接合によって、ＮＨＥＪプロセスを介して、染色体配列へと統合され得る。
【0169】
短いドナー配列を含むドナーポリペプチドが細胞または胚に導入される実施形態において、短いドナー配列は、二重鎖切断の部位で、ＮＨＥＪプロセスを介して、染色体配列へと統合され得る。統合は、短いドナー配列と二重鎖切断の位置の染色体配列との間の平滑末端の接合を介して進行し得る。代わりに、統合は、切断された染色体配列においてＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングと適合性のあるオーバーハングによって挟まれた短いドナー配列と染色体配列の間の、粘着末端（すなわち５’または３’オーバーハングを有する末端）の接合を介して進行し得る。
【0170】
一般的には、細胞は、細胞の成長および／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は当技術でよく知られており、例えば（Santiago, et al., (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle, et al., (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov, et al., (2005) Nature 435:646-651; and Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306）において記載されている。当業者には、細胞を培養する方法が当技術で知られており、細胞のタイプに依存して異なり得、また、異なるであろうことが、理解されるだろう。日常的な最適化が、全てのケースにおいて、特定の細胞タイプに最適な手法を決定するために用いられてもよい。
【0171】
胚はインビトロで培養され得る（例えば細胞培地において）。典型的には、胚は、適した温度で、かつ必要であれば、ＲＮＡエンドヌクレアーゼおよびｐｅｇＲＮＡの発現を可能にするために必要なＯ２／ＣＯ２比を有する、適した培地において培養される。適した培地の非限定的な例は、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣ、およびＨＴＦ培地を含む。当業者には、培養条件が胚の生物種に依存して異なり得、また、異なるであろうことが理解されるだろう。日常的な最適化が、全てのケースにおいて、胚の特定の種に最適な培養条件を決定するために用いられてもよい。ある実施形態において、細胞株はインビトロで培養した胚（例えば胚性幹細胞株）に由来し得る。
【0172】
代わりに、胚は、インビボで、胚を雌の宿主の子宮に移植することによって培養されてもよい。一般的には、雌の宿主は、胚の生物種と同じまたは類似の生物種である。好ましくは、雌の宿主は偽妊娠である。偽妊娠の雌の宿主を調製する方法は当技術で知られている。加えて、胚を雌の宿主へ移植する方法が知られている。インビボにおける胚の培養は、胚が発生することを可能にし、結果として胚に由来する動物が誕生し得る。このような動物は、全ての体細胞において改変された染色体配列を含む。
【0173】
（g）細胞および胚のタイプ
様々な真核生物の細胞および胚が、本方法における使用に適切である。例えば、細胞は、ヒトの細胞、非ヒト哺乳類の細胞、非哺乳類脊椎動物の細胞、無脊椎動物の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、酵母の細胞、または単細胞の真核生物であり得る。一般的には、胚は非ヒト哺乳類の細胞である。特定の実施形態において、胚は１細胞の非ヒト哺乳類の胚である。例示的な哺乳類の胚は、１細胞胚を含み、マウス、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、 ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含むが、これらに限定されることはない。さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞であり得る。適切な幹細胞は、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多能性幹細胞、乏性幹細胞、単能性幹細胞およびその他を含むが、これらに限定されることはない。例示的な実施形態において、細胞は哺乳類の細胞である。
様々な真核生物の細胞および胚が、本方法における使用に適切である。例えば、細胞は、ヒトの細胞、非ヒト哺乳類の細胞、非哺乳類脊椎動物の細胞、無脊椎動物の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、酵母の細胞、または単細胞の真核生物であり得る。一般的には、胚は非ヒト哺乳類の細胞である。特定の実施形態において、胚は１細胞の非ヒト哺乳類の胚である。例示的な哺乳類の胚は、１細胞胚を含み、マウス、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、 ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含むが、これらに限定されることはない。さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞であり得る。適切な幹細胞は、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多能性幹細胞、乏性幹細胞、単能性幹細胞およびその他を含むが、これらに限定されることはない。例示的な実施形態において、細胞は哺乳類の細胞である。
【0174】
適切な哺乳類の細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞、マウス胚性線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞、マウス胚性間葉系Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳房ＥＭＴ６細胞、マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞、マウス黒色腫Ｘ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽腫Ｂ３５細胞；ラット肝腫細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞；ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞を含む。哺乳類細胞株の広範なリストは、American Type Culture Collection catalog （ATCC, Mamassas, Va.）で見られる。
【0175】
（V）染色体配列の改変、または染色体配列の発現調節のため融合タンパク質を使用する方法
本開示の別の態様は、細胞または胚における、染色体配列の改変または染色体配列の発現調節のための方法を含む。本方法は、細胞または胚に、（a）少なくとも１つの融合タンパク質または少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸、ここで融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントおよびエフェクタードメインを含む、および（b）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ここでｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を染色体配列の標的部位へと誘導し、融合タンパク質のエフェクタードメインが染色体配列を改変または染色体配列の発現を調節する、を導入することを含む。
本開示の別の態様は、細胞または胚における、染色体配列の改変または染色体配列の発現調節のための方法を含む。本方法は、細胞または胚に、（a）少なくとも１つの融合タンパク質または少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸、ここで融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントおよびエフェクタードメインを含む、および（b）少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ここでｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を染色体配列の標的部位へと誘導し、融合タンパク質のエフェクタードメインが染色体配列を改変または染色体配列の発現を調節する、を導入することを含む。
【0176】
ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはそのフラグメントおよびエフェクタードメインを含む融合タンパク質は、上記セクション（II）で詳しく述べた。一般的には、本明細書で開示される融合タンパク質は、さらに少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。融合タンパク質をコードする核酸は上記セクション（III）で詳しく述べた。ある実施形態において、融合タンパク質は、細胞または胚に、単離されたタンパク質（さらに細胞膜透過ドメインを含み得る）として導入され得る。さらに、単離された融合タンパク質は、ｐｅｇＲＮＡを含むＲＮＡ－タンパク質複合体の一部であり得る。他の実施形態において、融合タンパク質は、細胞または胚に、ＲＮＡ分子（キャップ修飾および／またはポリアデニル化修飾を施され得る）として導入され得る。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、細胞または胚に、ＤＮＡ分子として導入され得る。例えば、融合タンパク質およびｐｅｇＲＮＡは、細胞または胚に、別々のＤＮＡ分子として、または同じＤＮＡ分子の一部として導入され得る。このようなＤＮＡ分子は、プラスミドベクターであり得る。
【0177】
ある実施形態において、本方法はさらに、細胞または胚に、少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼを導入することを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼは上記セクション（II）（d）で記載した。さらに他の実施形態において、本方法はさらに、細胞または胚に、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドは上記セクション（IV）（d）で詳しく述べた。分子を細胞または胚に導入する手段、および細胞または胚の培養の手段は、それぞれ上記セクション（IV）（e）および（IV）（f）で詳しく述べた。適切な細胞および胚は、上記セクション（IV）（g）で記載した。
【0178】
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメイン（例えばＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメイン）である特定の実施形態において、本方法は、細胞または胚に、１つの融合タンパク質（または１つの融合タンパク質をコードする核酸）および２つのｐｅｇＲＮＡ（または２つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することを含む。２つのｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質を染色体配列の２つの異なる標的部位へ導き、ここで融合タンパク質は、２つの切断ドメインが染色体配列に二重鎖切断を引き起こし得るように、ダイマーを形成（例えばホモダイマーを形成）する。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれない実施形態において、染色体配列の二重鎖切断は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復され得る。ＮＨＥＪはエラーを起こしやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが、切断の修復の過程で起こり得る。したがって、標的の染色体配列は改変または不活性化され得る。例えば、一塩基変異（ＳＮＰ）が変更されたタンパク質産物を生じ得、または、コーディング配列のリーディングフレームのシフトが、タンパク質産物が作られないように、配列を不活性化または“ノックアウト”し得る。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれる実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、標的部位の染色体配列と交換または統合され得る。例えば、ドナー配列が、染色体配列の標的部位の上流および下流の配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれている実施形態において、ドナー配列は、相同組換え修復プロセスを介した修復の過程で、標的部位の染色体配列と交換または統合され得る。代わりに、ドナー配列が適合性のあるオーバーハングに挟まれる（または適合性のあるオーバーハングがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによって細胞内で生成される）実施形態において、ドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、非相同性修復プロセスによって、切断された染色体配列と直接接合され得る。ドナー配列の、染色体配列との交換または統合は、標的の染色体配列を改変するか、あるいは細胞または胚の染色体配列に外因性配列を導入する。
【0179】
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメイン（ＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメイン）である他の実施形態において、本方法は、細胞または胚に、２つの異なる融合タンパク質（または２つの異なる融合タンパク質をコードする核酸）および２つのｐｅｇＲＮＡ（または２つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することを含み得る。融合タンパク質は、上記セクション（II）で詳しく述べたように、様々であり得る。各ｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質を染色体配列の標的部位へと導き、ここで融合タンパク質は、２つの切断ドメインが染色体配列に二重鎖切断を引き起こし得るように、ダイマーを形成（例えばヘテロダイマーを形成）する。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれない実施形態において、結果として生じる二重鎖切断は、二重鎖切断の修復の過程で少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが起こり得るような、非相同性修復プロセスによって修復され得る。オプションのドナーポリヌクレオチドが含まれる実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、相同性ベースの修復プロセス（例えばドナー配列が染色体配列の標的部位の上流および下流の配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれている実施形態において）、または非相同性修復プロセス（例えばドナー配列が適合性のあるオーバーハングに挟まれている実施形態において）のいずれかによって、染色体配列と交換または統合され得る。
【0180】
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメイン（例えばＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメイン）であるさらに他の実施形態において、本方法は、細胞または胚に、１つの融合タンパク質（または１つの融合タンパク質をコードする核酸）、１つのｐｅｇＲＮＡ（または１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）、および１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ（またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸）を導入することを含み得、ここでジンクフィンガーヌクレアーゼはＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。ｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質を特定の染色体配列へ導き、また、ジンクフィンガーヌクレアーゼは別の染色体配列へ導かれ、ここで、融合タンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼは、融合タンパク質の切断ドメインおよびジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインが染色体配列に二重鎖切断を引き起こし得るように、ダイマーを形成する。図１Ｂを参照。オプションのドナーポリペプチドが含まれない実施形態において、結果として生じる二重鎖切断は、二重鎖切断の修復の過程で少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせが起こり得るような非相同性修復プロセスによって修復され得る。オプションのドナー配列が含まれる実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、二重鎖切断の修復の過程で、相同性ベースの修復プロセス（例えばドナー配列が染色体配列の標的部位の上流および下流の配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれている実施形態において）、または非相同性修復プロセス（例えばドナー配列が適合性のあるオーバーハングに挟まれている実施形態において）のいずれかによって、染色体配列と交換または統合され得る。
【0181】
融合タンパク質のエフェクタードメインが転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインであるさらに他の実施形態において、本方法は、細胞または胚に、１つの融合タンパク質（または１つの融合タンパク質をコードする核酸）および１つのｐｅｇＲＮＡ（または１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することを含み得る。ｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質を特定の染色体配列へと導き、ここで転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインが、標的の染色体配列の発現を、それぞれ活性化または抑制する。図２Ａを参照。
【0182】
融合タンパク質のエフェクタードメインがエピジェネティック修飾ドメインである別の実施形態において、本方法は、細胞または胚に、１つの融合タンパク質（または１つの融合タンパク質をコードする核酸）および１つのｐｅｇＲＮＡ（または１つのｐｅｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することを含み得る。ｐｅｇＲＮＡは融合タンパク質を特定の染色体配列へ導き、ここでエピジェネティック修飾ドメインが標的の染色体配列の構造を変化させる。図２Ｂを参照。エピジェネティック修飾は、ヒストンタンパク質のアセチル化、メチル化、および／またはヌクレオチドのメチル化を含む。ある場合において、染色体配列の構造変化は、染色体配列の発現の変化をもたらす。
【0183】
（VI）遺伝子改変細胞および遺伝子改変動物
本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質を介したプロセスを用いて、例えば本明細書に記載された方法を用いて改変された少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子改変を受けた細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物を含む。本開示は、対象の染色体配列に標的化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、または融合タンパク質、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、および場合により１つ以上のドナーポリヌクレオチド、を含む細胞を提供する。本開示はまた、対象の染色体配列に標的化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、および場合により１つ以上のドナーポリヌクレオチド、を含む非ヒト胚も提供する。
本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質を介したプロセスを用いて、例えば本明細書に記載された方法を用いて改変された少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子改変を受けた細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物を含む。本開示は、対象の染色体配列に標的化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、または融合タンパク質、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、および場合により１つ以上のドナーポリヌクレオチド、を含む細胞を提供する。本開示はまた、対象の染色体配列に標的化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、少なくとも１つのｐｅｇＲＮＡ、および場合により１つ以上のドナーポリヌクレオチド、を含む非ヒト胚も提供する。
【0184】
本開示は、改変された少なくとも１つの染色体配列を含む、遺伝子改変を受けた非ヒト動物、非ヒト胚、または動物細胞を提供する。改変された染色体配列は、（１）不活性化されるように、（２）変更された発現を有し、または変更されたタンパク質産物を産生するように、または（３）統合された配列を含むように、改変されてもよい。染色体配列は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを介したプロセス、または融合タンパク質を介したプロセスで、本明細書に記載した方法を用いて、改変される。
【0185】
上記のように、本開示のある態様は、少なくとも１つの染色体配列が改変された、遺伝子改変動物を提供する。ある実施形態において、遺伝子改変動物は、少なくとも１つの不活性化された染色体配列を含む。改変された染色体配列は、配列が転写されないように、および／または、機能性タンパク質が産生されないように、不活性化されてもよい。すなわち、不活性化された染色体配列を含む遺伝子改変動物は、“ノックアウト”または“コンディショナルノックアウト”と呼ばれ得る。不活性化された染色体配列は、欠失変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの挿入）、ナンセンス変異（すなわち、終止コドンが導入されるような、１つのヌクレオチドの、別のヌクレオチドへの置換）を含み得る。変異の結果として、標的の染色体配列は不活性化され、機能性のタンパク質は生産されない。不活性化された染色体配列は、外因性に導入された配列を含まない。また、本開示には、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の染色体配列が不活性化された遺伝子改変動物も含まれる。
【0186】
別の実施形態において、改変された染色体配列は、バリアントタンパク質産物をコードするように変更され得る。例えば、改変された染色体配列を含む遺伝子改変動物は、変更されたタンパク質が産生されるような、標的化点変異またはその他の改変を含み得る。ある実施形態において、染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドが変化し、かつ、発現するタンパク質が１つの変化したアミノ酸残基を含むように、改変され得る（ミスセンス変異）。別の実施形態において、染色体配列は、１つより多くのアミノ酸が変化するように、１つより多くのミスセンス変異を含むよう改変され得る。加えて、染色体配列は、発現するタンパク質が１アミノ酸の欠失または挿入を含むように、３つのヌクレオチドの欠失または挿入を有するよう改変され得る。変更されたタンパク質、またはバリアントタンパク質は、野生型タンパク質と比較して変更された性質または活性、例えば変更された基質特異性、変更された酵素活性、変更された動態速度（kinetic rate）、などを有し得る。
【0187】
別の実施形態において、遺伝子改変動物は、少なくとも１つの、染色体に統合された配列を含み得る。統合された配列を含む遺伝子改変動物は、“ノックイン”または“コンディショナルノックイン”と呼ばれ得る。染色体に統合された配列は、例えば、オルソログタンパク質、内因性タンパク質、またはその両方の組み合わせをコードし得る。ある実施形態において、オルソログタンパク質または内因性タンパク質をコードする配列が、染色体配列が不活性化される一方で外因性配列が発現するように、タンパク質をコードする染色体配列へと統合され得る。このようなケースにおいて、オルソログタンパク質または内因性タンパク質をコードする配列は、プロモーター制御配列と、動作可能に連結されてもよい。代わりに、オルソログタンパク質または内因性タンパク質をコードする配列は、染色体配列の発現に影響を与えることなく、染色体配列へと統合されてもよい。例えば、タンパク質をコードする配列が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＨＰＲＴ遺伝子座、またはＡＡＶ遺伝子座などの、“セーフハーバー（safe harbor）”遺伝子座へと統合され得る。本開示はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の、タンパク質をコードする配列を含む配列が、ゲノムへと統合される、遺伝子改変動物も含む。
【0188】
染色体に統合されたタンパク質をコードする配列は、対象のタンパク質の野生型をコードし得、または、タンパク質の変更されたバージョンが産生されるように、少なくとも１つの改変を含むタンパク質をコードし得る。例えば、染色体に統合された、疾患または障害に関連するタンパク質をコードする配列は、産生されたタンパク質の変更されたバージョンが、関連する障害を引き起こすか、または増強するような、少なくとも１つの改変を含み得る。代わりに、染色体に統合された、疾患または障害に関連するタンパク質をコードする配列は、タンパク質の変更されたバージョンが、関連する障害の発症を防ぐような、少なくとも１つの改変を含み得る。
【0189】
追加の実施形態において、遺伝子改変動物は、機能性のヒトタンパク質をコードする、少なくとも１つの染色体に統合された配列を含む、“ヒト化”動物であり得る。機能性のヒトタンパク質は、遺伝子改変動物において対応するオルソログを有さないこともある。代わりに、遺伝子改変動物の由来となる野生型動物は、機能性のヒトタンパク質と対応するオルソログを含んでもよい。この場合、“ヒト化”動物におけるオルソログの配列は、機能性のタンパク質が作られないように不活性化され、また、“ヒト化”動物は、ヒトタンパク質をコードする少なくとも１つの染色体に統合された配列を含む。
【0190】
さらに別の実施形態において、遺伝子改変動物は、タンパク質の発現パターンが変更されるように改変された、タンパク質をコードする少なくとも１つの染色体配列を含み得る。例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のようなタンパク質の発現を制御する調節性領域が、タンパク質が過剰に産生されるように、または、タンパク質の組織特異的または経時的な発現が変化するように、あるいはそれらの組み合わせが起こるように、変更され得る。代わりに、タンパク質の発現パターンは、コンディショナルノックアウトシステムを用いて変更され得る。コンディショナルノックアウトシステムの非限定的な例は、Ｃｒｅ－ｌｏｘ組み換えシステムを含む。Ｃｒｅ－ｌｏｘ組み換えシステムは、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素という、核酸分子の特定の部位（ｌｏｘ部位）間の核酸配列の組み換えを触媒する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを含む。経時的発現および組織特異的発現を実現するためにこのシステムを用いる方法は、当技術で知られている。一般的には、遺伝子改変動物は、染色体配列を挟むｌｏｘ部位とともに生成される。ｌｏｘに挟まれた染色体配列を含む遺伝子改変動物は、次に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する別の遺伝子改変動物と掛け合わせられ得る。次に、ｌｏｘに挟まれた染色体配列およびＣｒｅリコンビナーゼを含む子孫マウスが生産され、ｌｏｘに挟まれた染色体配列が組み替えられて、タンパク質をコードする染色体配列の欠失または反転をもたらす。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、経時的および条件的に調節された染色体配列の組み換えを引き起こすために、経時的および条件的に調節され得る。
【0191】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書で開示された遺伝子改変動物は、改変された染色体配列についてヘテロ接合体であり得る。代わりに、遺伝子改変動物は、改変された染色体配列についてホモ接合体であり得る。
【0192】
本明細書で開示された遺伝子改変動物は、１つより多くの改変された染色体配列を含む動物を作製するため、あるいは１つ以上の改変された染色体配列についてホモ接合体である動物を作製するため、交配され得る。例えば、同じ改変された染色体配列を含む２匹の動物が交配され、改変された染色体配列についてホモ接合体である動物を作製し得る。代わりに、異なる改変された染色体配列を持つ動物が交配され、両方の改変された染色体配列を含む動物を作製し得る。
【0193】
例えば、不活性化された染色体配列遺伝子“ｘ”を含む第１の動物を、染色体に統合されたヒト遺伝子“Ｘ”タンパク質をコードする配列を含む第２の動物と掛け合わせて、不活性化された染色体配列遺伝子“ｘ”および染色体に統合されたヒト遺伝子“Ｘ”配列の両方を含む“ヒト化”遺伝子“Ｘ”子孫を生じ得る。また、ヒト化遺伝子“Ｘ”動物を、ヒト化遺伝子“Ｙ”動物と掛け合わせて、ヒト化遺伝子Ｘ／遺伝子Ｙ子孫を作製し得る。当業者には、多くの組み合わせが可能であることが理解されるだろう。
【0194】
他の実施形態において、改変された染色体配列を含む動物は、改変された染色体配列を他の遺伝的バックグラウンドと組み合わせるために、交配され得る。非限定的な例として、他の遺伝的バックグラウンドは、野生型遺伝的バックグラウンド、欠失変異を有する遺伝的バックグラウンド、別の標的化統合を有する遺伝的バックグラウンド、非標的化統合を有する遺伝的バックグラウンドを含み得る。
【0195】
本明細書で用いる“動物”という用語は、非ヒト動物のことを表す。動物は、胚、幼体、または成体であってもよい。適切な動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、貝類、および魚類などの脊椎動物を含む。適切な哺乳類の例は、げっ歯類、コンパニオンアニマル（companion animal）、家畜、および霊長類を含むが、これらに限定されることはない。げっ歯類の非限定的な例は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットを含む。適切なコンパニオンアニマルの例は、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットを含むが、これらに限定されることはない。家畜の非限定的な例は、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、およびアルパカを含む。適切な霊長類は、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびベルベットモンキーを含むが、これらに限定されることはない。鳥類の非限定的な例は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウを含む。代わりに、動物は、昆虫、線形動物などの非脊椎動物であってもよい。昆虫の非限定的な例は、ショウジョウバエおよび蚊を含む。例示的な動物はラットである。適切なラットの系統の非限定的な例は、ダール食塩感受性（Dahl Salt-Sensitive）ラット、フィッシャー３４４（Fischer 344）ラット、ルイス（Lewis）ラット、ロングエバンスフーデッド（Long Evans Hooded）ラット、スプラグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラット、およびウィスター（Wistar）ラットを含む。ある実施形態において、動物は遺伝子改変マウスではない。本発明のための適切な動物の前記反復のそれぞれにおいて、動物は、外因性に導入された、ランダムに統合されたトランスポゾン配列を含まない。
【0196】
本開示のさらなる態様は、少なくとも１つの改変された染色体配列を含む、遺伝子改変細胞または細胞株を提供する。遺伝子改変細胞または細胞株は、本明細書で開示された遺伝子改変動物のいずれかに由来し得る。代わりに、染色体配列は、細胞において、本明細書で上に（動物の染色体配列の改変を記載する段落において）記載されるように、本明細書に記載した方法を用いて、改変され得る。本開示は、前記細胞または細胞株の溶解液も含む。
【0197】
一般的には、細胞は真核生物の細胞である。適切な宿主細胞は、ピキア（Pichia）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、またはシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）などの真菌または酵母、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）のＳＦ９細胞またはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＳ２細胞などの昆虫の細胞、および、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類などの動物の細胞、またはヒトの細胞を含む。例示的な細胞は哺乳類の細胞である。哺乳類の細胞は、霊長類の細胞であり得る。一般的には、二重鎖切断に感受性のある任意の霊長類の細胞を用いてもよい。細胞は、様々な細胞タイプの細胞、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴまたはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞、などであってもよい。
【0198】
哺乳類の細胞株が用いられる場合、細胞株は、任意の樹立細胞株、または、まだ記載されていない、初代培養細胞株であり得る。細胞株は、接着性または非接着性であり得、あるいは、細胞株は、接着性、非接着性または器官型の成長を促進する条件下で、当業者に知られる標準的な手法を用いて、生育させられ得る。適切な哺乳類の細胞および細胞株の非限定的な例は、本明細書セクション（IV）（g）において提供される。さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞であり得る。適切な幹細胞の非限定的な例は、セクション（IV）（g）において提供される。
【0199】
本開示は、少なくとも１つの改変された染色体配列を含む、遺伝子改変された非ヒト胚も提供する。染色体配列は、胚において、本明細書において上に（動物の染色体配列の改変を記載する段落において）記載されるように、本明細書に記載した方法を用いて、改変され得る。ある実施形態において、胚は、非ヒトの、受精した、１細胞期の、対象の動物種の胚である。例示的な哺乳類の胚は、１細胞期の胚を含み、マウス、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、および霊長類の胚を含むが、これらに限定されることはない。
【実施例】
【0200】
シス作用性調節エレメントは、ＰＥ２およびＰＥ３の効率を大きく向上させる
概念実証（proof-of-concept）実験において、イネＴＷＩＦＢ１の野生型のヌクレアーゼ発現二重エレメント（ｄＥＮＥ）を、プライムエディター発現カセットの３’末端に直接、終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーター、例えば図２に示されるようなＢＧＨの前に、加えた。ここで、ｄＥＮＥはプライムエディターのｍＲＮＡに含まれるＲＮＡ配列へと逆転写される。Ｋ５６２細胞を、ｄＥＮＥ配列がコンストラクトに含まれる、もしくは含まれないプライムエディター（ＰＥ２）発現コンストラクトで、ＨＥＫ３部位を標的とする、図３および図４に示されるような異なるタイプの編集のためのｐｅｇＲＮＡと共に、ヌクレオフェクト（nucleofect）した。ＰＥ３のケースにおいては、追加の切れ目生成ガイドＲＮＡ発現コンストラクト１つをヌクレオフェクション混合試薬（nucleofection mix）に加えた。ヌクレオフェクションの３日後、プライム編集効率の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）解析のため、細胞を収集した。示されるように、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることで、ＨＥＫ３標的における＋１ＣＴＴ挿入および＋５Ｇ欠失編集について８倍まで（図３）、また、ＨＥＫ３標的における＋１ＴからＡへの置換編集、およびＰＥ３のケースにおける＋１Ｔ欠失および＋５ＧからＣへの置換編集については２倍まで（図４）、編集効率が大きく向上した。
概念実証（proof-of-concept）実験において、イネＴＷＩＦＢ１の野生型のヌクレアーゼ発現二重エレメント（ｄＥＮＥ）を、プライムエディター発現カセットの３’末端に直接、終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーター、例えば図２に示されるようなＢＧＨの前に、加えた。ここで、ｄＥＮＥはプライムエディターのｍＲＮＡに含まれるＲＮＡ配列へと逆転写される。Ｋ５６２細胞を、ｄＥＮＥ配列がコンストラクトに含まれる、もしくは含まれないプライムエディター（ＰＥ２）発現コンストラクトで、ＨＥＫ３部位を標的とする、図３および図４に示されるような異なるタイプの編集のためのｐｅｇＲＮＡと共に、ヌクレオフェクト（nucleofect）した。ＰＥ３のケースにおいては、追加の切れ目生成ガイドＲＮＡ発現コンストラクト１つをヌクレオフェクション混合試薬（nucleofection mix）に加えた。ヌクレオフェクションの３日後、プライム編集効率の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）解析のため、細胞を収集した。示されるように、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることで、ＨＥＫ３標的における＋１ＣＴＴ挿入および＋５Ｇ欠失編集について８倍まで（図３）、また、ＨＥＫ３標的における＋１ＴからＡへの置換編集、およびＰＥ３のケースにおける＋１Ｔ欠失および＋５ＧからＣへの置換編集については２倍まで（図４）、編集効率が大きく向上した。
【0201】
シス作用性調節エレメントは、細胞タイプ依存的にプライム編集効率を向上させる
２つの別々の実験において、Ｋ５６２またはＨＥＫ２９３を、ｄＥＮＥ配列がコンストラクトに含まれる、もしくは含まれないプライムエディター（ＰＥ２）発現コンストラクトで、ＨＥＫ３部位を標的とする、図５および図６に示されるような異なるタイプの編集のためのｐｅｇＲＮＡ（GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG［配列番号２６］、下線の塩基はＰＡＭを示す）と共に、ヌクレオフェクトした。ＰＥ３のケースにおいては、１つの追加の切れ目生成ガイドＲＮＡ発現コンストラクト１つをヌクレオフェクション混合試薬に加えた。ヌクレオフェクションの３日後、プライム編集効率の次世代シークエンシング解析のため、細胞を収集した。図５に示されるように、Ｋ５６２細胞において、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることで、ＨＥＫ３標的における＋１ＣＴＴ挿入編集および＋５Ｇ欠失編集についてはおよそ５０％編集効率が向上し、また同様に、ＨＥＫ３標的における＋１Ｔ＞Ａ置換、＋１ＣＴＴ挿入および＋５Ｇ欠失編集、ＰＥ３のケースにおける＋１Ｔ欠失および＋５Ｇ＞Ｃ編集についてもおよそ５０％、編集効率が向上した。一方で、図６に示されるように、ＨＥＫ２９３細胞においては、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることによる、同じＨＥＫ３標的の同じタイプの編集、およびＰＥ３のケースにおける、編集効率の向上は実証されなかった。この結果は、試験した特定の細胞タイプの標的において、３’－ＵＴＲエレメントのｄＥＮＥが、細胞タイプ依存的にプライム編集効率を向上させるよう働くことを示唆する。
２つの別々の実験において、Ｋ５６２またはＨＥＫ２９３を、ｄＥＮＥ配列がコンストラクトに含まれる、もしくは含まれないプライムエディター（ＰＥ２）発現コンストラクトで、ＨＥＫ３部位を標的とする、図５および図６に示されるような異なるタイプの編集のためのｐｅｇＲＮＡ（GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG［配列番号２６］、下線の塩基はＰＡＭを示す）と共に、ヌクレオフェクトした。ＰＥ３のケースにおいては、１つの追加の切れ目生成ガイドＲＮＡ発現コンストラクト１つをヌクレオフェクション混合試薬に加えた。ヌクレオフェクションの３日後、プライム編集効率の次世代シークエンシング解析のため、細胞を収集した。図５に示されるように、Ｋ５６２細胞において、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることで、ＨＥＫ３標的における＋１ＣＴＴ挿入編集および＋５Ｇ欠失編集についてはおよそ５０％編集効率が向上し、また同様に、ＨＥＫ３標的における＋１Ｔ＞Ａ置換、＋１ＣＴＴ挿入および＋５Ｇ欠失編集、ＰＥ３のケースにおける＋１Ｔ欠失および＋５Ｇ＞Ｃ編集についてもおよそ５０％、編集効率が向上した。一方で、図６に示されるように、ＨＥＫ２９３細胞においては、３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥをプライムエディター（ＰＥ２）発現カセットに含めることによる、同じＨＥＫ３標的の同じタイプの編集、およびＰＥ３のケースにおける、編集効率の向上は実証されなかった。この結果は、試験した特定の細胞タイプの標的において、３’－ＵＴＲエレメントのｄＥＮＥが、細胞タイプ依存的にプライム編集効率を向上させるよう働くことを示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ｉｉ）逆転写酵素をコードする配列、およびｉｉｉ）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む、合成核酸組成物。
【請求項2】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項3】
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項4】
前記シス作用性調節エレメントがｄＥＮＥまたはＥＮＥである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項5】
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項6】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項7】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項8】
前記組成物がさらに発現プロモーターを含む、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項9】
前記組成物が発現ベクターに含まれる、請求項８に記載の合成核酸組成物。
【請求項10】
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、請求項８に記載の合成核酸組成物。
【請求項11】
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項12】
さらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ３のうち１つに由来する、請求項１に記載の合成核酸組成物。
【請求項13】
請求項１に記載の合成核酸組成物によってコードされる、アミノ酸配列。
【請求項14】
内因性ＤＮＡ配列を改変する方法であって、ａ）ｉ）１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質をコードする配列、２）逆転写酵素をコードする配列、および３）シス作用性調節エレメントを含む配列、を含む合成核酸組成物を含む、動作可能な発現ベクター；ｉｉ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）；およびｉｉｉ）ＰＢＳと少なくとも５０％相補的である標的内因性ＤＮＡ配列を含む細胞、を提供すること；
ｂ）前記細胞を、前記合成核酸組成物および前記ｐｅｇＲＮＡでトランスフェクトすること；および
ｃ）前記トランスフェクトされた細胞を、内因性ＤＮＡ配列に所望の改変が為されるように培養すること
を含む、方法。
【請求項15】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも７５％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９０％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９５％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９８％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと１００％相補的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、請求項１４に記載の方法。
【請求項22】
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、請求項１４に記載の方法。
【請求項23】
前記シス作用性調節エレメントがｄＥＮＥまたはＥＮＥである、請求項１４に記載の方法。
【請求項24】
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項25】
前記動作可能な発現ベクターがＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項26】
前記動作可能な発現ベクターがＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項27】
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項28】
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、請求項１４に記載の方法。
【請求項29】
前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ３のうち１つに由来する、請求項１４に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0037】
本発明の方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ２システムが、動作可能な発現ベクターにおいてコードされ、細胞に導入されることを企図する。
例えば、本開示は下記の実施態様を提供する。
［１］
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ｉｉ）逆転写酵素をコードする配列、およびｉｉｉ）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む、合成核酸組成物。
［２］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、前記１に記載の合成核酸組成物。
［３］
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、前記１または２のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［４］
前記シス作用性調節エレメントがｄＥＮＥまたはＥＮＥである、前記１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［５］
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、前記１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［６］
前記核酸がＤＮＡである、前記１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［７］
前記核酸がＲＮＡである、前記１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［８］
前記組成物がさらに発現プロモーターを含む、前記１－７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［９］
前記組成物が発現ベクターに含まれる、前記８に記載の合成核酸組成物。
［１０］
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、前記８に記載の合成核酸組成物。
［１１］
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、前記１－１０のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［１２］
さらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ２のうち１つに由来する、前記１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［１３］
前記１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物によってコードされる、アミノ酸配列。
［１４］
内因性ＤＮＡ配列を改変する方法であって、
ａ）ｉ）１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質をコードする配列、２）逆転写酵素をコードする配列、および３）シス作用性調節エレメントを含む配列、を含む合成核酸組成物を含む、動作可能な発現ベクター；ｉｉ）プライム結合部位（ＰＢＳ）を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）；およびｉｉｉ）ＰＢＳと少なくとも５０％相補的である標的内因性ＤＮＡ配列を含む細胞、を提供すること；
ｂ）対象の内因性ＤＮＡ配列を含む細胞を、本発明の合成核酸組成物およびｐｅｇＲＮＡでトランスフェクトすること；および
ｃ）前記トランスフェクトされた細胞を、内因性ＤＮＡ配列に所望の改変が為されるように培養すること
を含む、方法。
［１５］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、前記１４に記載の方法。
［１６］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも７５％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１７］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９０％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１８］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９５％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１９］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９８％相補的である、前記１４に記載の方法。
［２０］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと１００％相補的である、前記１４に記載の方法。
［２１］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、前記１４－２０のいずれかに記載の方法。
［２２］
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、前記１４－２１のいずれかに記載の方法。
［２３］
前記シス作用性調節エレメントがＤｅｎｅまたはＥＮＥである、前記１４－２２のいずれかに記載の方法。
［２４］
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、前記１４－２２のいずれかに記載の方法。
［２５］
前記動作可能な発現ベクターがＤＮＡである、前記１４－２４のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記動作可能な発現ベクターがＲＮＡである、前記１４－２４のいずれかに記載の方法。
［２７］
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、前記１４－２６のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［２８］
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、前記１４－２７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［２９］
前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ３のうち１つに由来する、前記１４－２８のいずれかに記載の方法。
［３０］
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ２システムタンパク質が、動作可能な発現ベクターにおいてコードされて細胞に導入される、前記１４－２９のいずれかに記載の方法。
例えば、本開示は下記の実施態様を提供する。
［１］
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列、ｉｉ）逆転写酵素をコードする配列、およびｉｉｉ）シス作用性調節エレメントをコードする配列を含む、合成核酸組成物。
［２］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、前記１に記載の合成核酸組成物。
［３］
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、前記１または２のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［４］
前記シス作用性調節エレメントがｄＥＮＥまたはＥＮＥである、前記１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［５］
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、前記１－３のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［６］
前記核酸がＤＮＡである、前記１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［７］
前記核酸がＲＮＡである、前記１－５のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［８］
前記組成物がさらに発現プロモーターを含む、前記１－７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［９］
前記組成物が発現ベクターに含まれる、前記８に記載の合成核酸組成物。
［１０］
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、前記８に記載の合成核酸組成物。
［１１］
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、前記１－１０のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［１２］
さらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ２のうち１つに由来する、前記１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［１３］
前記１－１１のいずれかに記載の合成核酸組成物によってコードされる、アミノ酸配列。
［１４］
内因性ＤＮＡ配列を改変する方法であって、
ａ）ｉ）１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質をコードする配列、２）逆転写酵素をコードする配列、および３）シス作用性調節エレメントを含む配列、を含む合成核酸組成物を含む、動作可能な発現ベクター；ｉｉ）プライム結合部位（ＰＢＳ）を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）；およびｉｉｉ）ＰＢＳと少なくとも５０％相補的である標的内因性ＤＮＡ配列を含む細胞、を提供すること；
ｂ）対象の内因性ＤＮＡ配列を含む細胞を、本発明の合成核酸組成物およびｐｅｇＲＮＡでトランスフェクトすること；および
ｃ）前記トランスフェクトされた細胞を、内因性ＤＮＡ配列に所望の改変が為されるように培養すること
を含む、方法。
［１５］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ２システムタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、前記１４に記載の方法。
［１６］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも７５％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１７］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９０％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１８］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９５％相補的である、前記１４に記載の方法。
［１９］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと少なくとも９８％相補的である、前記１４に記載の方法。
［２０］
前記内因性ＤＮＡ配列がＰＢＳと１００％相補的である、前記１４に記載の方法。
［２１］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がｎＣａｓ９－Ｈ８４０Ａである、前記１４－２０のいずれかに記載の方法。
［２２］
前記逆転写酵素がＭ－ＭＬＶ－ＲＴである、前記１４－２１のいずれかに記載の方法。
［２３］
前記シス作用性調節エレメントがＤｅｎｅまたはＥＮＥである、前記１４－２２のいずれかに記載の方法。
［２４］
前記シス作用性調節エレメントがｓＲＳＭ１である、前記１４－２２のいずれかに記載の方法。
［２５］
前記動作可能な発現ベクターがＤＮＡである、前記１４－２４のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記動作可能な発現ベクターがＲＮＡである、前記１４－２４のいずれかに記載の方法。
［２７］
前記組成物がトランスフェクションウイルスに組み込まれている、前記１４－２６のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［２８］
前記シス作用性調節エレメントがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の終止コドンの後かつｍＲＮＡターミネーターの前に位置する、前記１４－２７のいずれかに記載の合成核酸組成物。
［２９］
前記ｐｅｇＲＮＡがＰＥ１、ＰＥ２、およびＰＥ３のうち１つに由来する、前記１４－２８のいずれかに記載の方法。
［３０］
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ２システムタンパク質が、動作可能な発現ベクターにおいてコードされて細胞に導入される、前記１４－２９のいずれかに記載の方法。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0038】
【図1】先行技術で説明されるような、プライム編集テクノロジーの図解を示す。ｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）＝Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ、ＲＴ＝逆転写酵素、ＰＢＳ＝プライム結合部位。
【図2】プライム編集発現カセットに対するシス作用性調節エレメントの導入の図解を示す。
【図3】ＰＥ２－ｄＥＮＥがＰＥ２の編集効率を高めることを示す。図は配列番号２６を開示する。
【図4】ＰＥ３－ｄＥＮＥがＰＥ３の編集効率を高めることを示す。図は配列番号２６を開示する。
【図5】３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥが、Ｋ５６２細胞において、ＨＥＫ３標的におけるＰＥの編集効率を向上させることを示す。
【図6】３’－ＵＴＲ ｄＥＮＥが、ＨＥＫ２９３細胞において、ＨＥＫ３標的におけるＰＥの編集効率を向上させないことを示す。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0053】
非限定的な例示において、プライム編集（ＰＥ）は、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼ－逆転写酵素（ＲＴ）融合タンパク質およびプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み、ＰＥ：ｐｅｇＲＮＡ複合体は標的ＤＮＡに結合して、ＰＡＭを含む鎖に切れ目を入れる。これによって生じた３’末端はプライマー結合部位とハイブリダイズし、また次に、ｐｅｇＲＮＡの転写酵素テンプレートを用いて、所望の編集が加わった新たなＤＮＡの逆転写を促す。そして、編集された３’フラップと未編集の５’フラップとの間の平衡、内因性の細胞による５’フラップ切断および接合、およびＤＮＡ修復は、安定な編集済ＤＮＡをもたらす（Anzalone, et al., 2019、図１参照）。現在に至るまで、プライムエディター（ＰＥ）の複数のバージョンが開発されてきた。ＰＥ１［配列番号１］は、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼのＣ末端に融合された野生型のモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ－ＲＴ）を用いることによって指定される。ＰＥ２［配列番号２］は合成Ｍ－ＭＬＶ－ＲＴを用いる。ＰＥ３は、編集されない方の鎖に切れ目を入れるための追加のガイドＲＮＡを導入することによって定義され、このガイドＲＮＡの導入により、インデル頻度にも拘わらず、編集効率が向上する。ＰＥ３ｂ（Anzalone, et al.,）では、この切れ目を入れるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、編集済の配列を標的とし、それによって、編集が起こるまで、編集されない方の配列に切れ目が入れられることが防がれ、結果として、哺乳類の細胞において、インデルが少なくなる。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは少なくとも１つの核局在化シグナルを含んでもよい。一般的には、ＮＬＳは塩基性アミノ酸が連なったものを含む。核局在化シグナルは当技術で知られている（例えばLange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105を参照）。例えば、ある実施形態において、ＮＬＳは、PKKKRKV（配列番号１９）またはPKKKRRV（配列番号３）などの単節型（monopartite）配列であり得る。別の実施形態において、ＮＬＳは双節型（bipartite）配列であり得る。さらに別の実施形態においては、ＮＬＳはKRPAATKKAGQAKKKK（配列番号２０）であり得る。ＮＬＳはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0095】
さらに別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは少なくとも１つのマーカードメインを含む。マーカードメインの非限定的な例は、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグを含む。ある実施形態において、マーカードメインは蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（例えば、GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Azami Greenモノマー、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1）、黄色蛍光タンパク質（例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1）、青色蛍光タンパク質（例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan）、赤色蛍光タンパク質（mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred）およびオレンジ色蛍光タンパク質（mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Kusabira-Orangeモノマー、mTangerine、tdTomato）、またはその他任意の適切な蛍光タンパク質を含む。他の実施形態において、マーカードメインは精製タグおよび／またはエピトープタグであり得る。例示的なタグは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（TRX）、ポリＮＡＮＰ、タンデムアフィニティ精製（TAP）タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His（配列番号２９）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（BCCP）、およびカルモジュリンを含むが、これらに限定されることはない。
【国際調査報告】