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特表2024-533474様々な内部修飾を有するループ型プライマーおよび標的検出のためのループドループ法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】様々な内部修飾を有するループ型プライマーおよび標的検出のためのループドループ法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20240905BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240905BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20240905BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240905BHJP
C12Q 1/6853 20180101ALI20240905BHJP
C12Q 1/6825 20180101ALI20240905BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20240905BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240905BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z ZNA
C12N15/11 Z
C12Q1/689 Z
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6853 Z
C12Q1/6825 Z
C12Q1/6816 Z
C12N9/10
C12Q1/6844 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515930
(86)(22)【出願日】2022-09-10
(85)【翻訳文提出日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 US2022076247
(87)【国際公開番号】W WO2023039553
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/243,625
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522362257
【氏名又は名称】ユーエイチ－オーエイチ ラブス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100141195
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 恵美子
(72)【発明者】
【氏名】ボール，キャメロン スコット
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR57
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、バイオセンサー標識オリゴヌクレオチドを使用して標的核酸を検出する新規ループドループ法を提供する。本明細書においてさらに、様々な内部修飾を有するループ型プライマーおよび方法に使用するためのキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的配列のループドループ増幅（ＬｄＬ）のためのループ型プライマーであって、５’から３’に：第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、前記第１のセンサー分子および前記第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記第２のセンサー分子、前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、前記第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含むループ型プライマー。
【請求項2】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である、請求項１に記載のループ型プライマー。
【請求項3】
前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、または前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造において一本鎖である、請求項１または２に記載のループ型プライマー。
【請求項4】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記第１のプライマー配列が重複する、請求項１～３のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項5】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のプライマー配列が重複しない、請求項１～３のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項6】
前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項7】
前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、前記ヘアピン構造において一本鎖である、請求項６に記載のループ型プライマー。
【請求項8】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～３０ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項9】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～１５ヌクレオチド長である、請求項８に記載のループ型プライマー。
【請求項10】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～１０ヌクレオチド長である、請求項９に記載のループ型プライマー。
【請求項11】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～９ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のループ型プライマー。
【請求項12】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～８ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のループ型プライマー。
【請求項13】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～７ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のループ型プライマー。
【請求項14】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、３～６ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のループ型プライマー。
【請求項15】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記第２のセンサー分子、前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造を形成する場合、前記第１のセンサー分子および前記任意選択の第２のセンサー分子が、９～１００Å離れている、請求項１～１４のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項16】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記第２のセンサー分子、前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造を形成する場合、前記第１のセンサー分子および前記任意選択の第２のセンサー分子が、１０～５０Å離れている、請求項１５に記載のループ型プライマー。
【請求項17】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、少なくとも１０ヌクレオチド長である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項18】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、少なくとも１８ヌクレオチド長である、請求項１７に記載のループ型プライマー。
【請求項19】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、少なくとも１９ヌクレオチド長である、請求項１８に記載におループ型プライマー。
【請求項20】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチドが、合わせると、少なくとも２０ヌクレオチド長である、請求項１９に記載のループ型プライマー。
【請求項21】
前記第１のバイオセンサーペアが、エネルギー供与体および受容体ペアである、請求項１または２０に記載のループ型プライマー。
【請求項22】
前記第１のバイオセンサーペアが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のエネルギー供与体および受容体ペアである。請求項２１に記載のループ型プライマー。
【請求項23】
前記第１のセンサー分子がＦＲＥＴフルオロフォアであり、前記第２のセンサー分子がＦＲＥＴクエンチャーである、請求項２１に記載のループ型プライマー。
【請求項24】
前記第１のセンサー分子がＦＲＥＴクエンチャーであり、前記第２のセンサー分子がＦＲＥＴフルオロフォアである。請求項２１に記載のループ型プライマー。
【請求項25】
前記第１のセンサー分子がＢＲＥＴエネルギー供与体であり、前記第２のセンサー（sensory）分子がＢＲＥＴエネルギー受容体である、請求項２１に記載のループ型プライマー。
【請求項26】
前記第１のセンサー分子がＢＲＥＴエネルギー受容体であり、前記第２のセンサー（sensory）分子がＢＲＥＴエネルギー供与体である、請求項２１に記載のループ型プライマー。
【請求項27】
前記第１のセンサー分子および前記第２のセンサー分子が、検出可能な光シグナルを生成する複合体を形成することができる、請求項１～２６のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項28】
前記第１のセンサー分子および前記第２のセンサー分子が、前記ヘアピン構造が形成された場合に有意に減損された光シグナルを生成する、請求項１～２６のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項29】
前記第２のセンサー分子が、チミジン（Ｔ）またはデオキシチミジン（ｄＴ）に結合している、請求項１～２７のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項30】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、６０℃より高い、請求１～２９のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項31】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、６５℃より高い、請求項３０に記載のループ型プライマー。
【請求項32】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、７０℃より高い、請求項３１に記載のループ型プライマー。
【請求項33】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、８０℃より高い、請求項３２に記載のループ型プライマー。
【請求項34】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、７０～８０℃である、請求項３２に記載のループ型プライマー。
【請求項35】
前記ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）が、７０～７５℃である、請求項３４に記載のループ型プライマー。
【請求項36】
前記第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、約７２℃である、請求項３５に記載のループ型プライマー。
【請求項37】
前記第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、６０℃より低い、請求項１～２９のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項38】
前記第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、６０～６５℃である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項39】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または（ｖｉｉ）その組合せを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項40】
前記ループ型プライマーの５’末端で第１の追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項41】
前記第１のセンサー分子および前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドの間に第２の追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項42】
前記第１または前記第２の追加のオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、請求項４０または４１に記載のループ型プライマー。
【請求項43】
前記標的配列が病原体ゲノムに対して特異的である、請求項１～４２のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項44】
前記標的配列が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対して特異的である、請求項４３に記載のループ型プライマー。
【請求項45】
前記標的配列が、ｏｒｆ８またはｃｄｓ２に由来する、請求項４４に記載のループ型プライマー。
【請求項46】
前記標的配列が、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に対して特異的である、請求項４３に記載のループ型プライマー。
【請求項47】
前記標的配列が、ｐｏｒＡまたはｇｌｎＡに由来する、請求項４３に記載のループ型プライマー。
【請求項48】
前記標的配列が、ウイルスに対して特異的である、請求項４３に記載のループ型プライマー。
【請求項49】
前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項４８に記載のループ型プライマー。
【請求項50】
前記標的配列が、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的である、請求項１～４２のいずれか一項に記載のループ型プライマー。
【請求項51】
前記標的配列がＲＮＡ配列である、請求項５０に記載のループ型プライマー。
【請求項52】
前記標的配列が、ＰＯＰ７ｂをコードするＲＮＡ配列である、請求項５０に記載のループ型プライマー。
【請求項53】
前記標的配列が、ｔｂｃ１ｄ３に由来する、請求項５０に記載のループ型プライマー。
【請求項54】
請求項１～５３のいずれか一項に記載のループ型プライマーを含む、前記標的配列のループドループ増幅のためのプライマー混合物。
【請求項55】
（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および逆方向プライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、および前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項５４に記載のプライマー混合物。
【請求項56】
（ｉ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｉｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦおよび前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項５４に記載のプライマー混合物。
【請求項57】
前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、または前記ＬＢが、前記標的配列上の前記第１の結合部位に結合する、請求項５５～５６のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項58】
前記ＦＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＦＩＰの量と前記ループ型プライマーの量の間の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である、請求項５５に記載のプライマー混合物。
【請求項59】
前記ＢＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＢＩＰの量と前記ループ型プライマーの量の間の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である、請求項５５に記載のプライマー混合物。
【請求項60】
前記ＬＦが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中のＬＦの量とループ型プライマーの量の間の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である、請求項５５に記載のプライマー混合物。
【請求項61】
前記ＬＢが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＢの量と前記ループ型プライマーの量の間の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である、請求項５５に記載のプライマー混合物。
【請求項62】
前記Ｆ３が、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、または前記ＬＢが、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項63】
前記Ｆ３が、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、および前記ＬＢが、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項64】
前記Ｆ３が、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、または前記ＬＢが、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項65】
前記Ｆ３が、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、および前記ＬＢが、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項位記載のプライマー混合物。
【請求項66】
前記Ｆ３が、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、または前記ＬＢが、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項67】
前記Ｆ３が、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、および前記ＬＢが、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項68】
第２のループ型プライマーをさらに含み、前記第２のループ型プライマーが５’から３’に第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のセンサー分子、
（ここで、前記第３のセンサー分子および前記第４のセンサー分子は、第２のバイオセンサーペアであり、および前記第２のバイオセンサーペアは、前記第１のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記第４のセンサー分子、前記任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、前記第３および前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含む、請求項５４～６７のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項69】
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチドが前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である、請求項６８に記載のプライマー混合物。
【請求項70】
前記標的配列および前記第２の標的配列が同一である、請求項６８または６９に記載のプライマー混合物。
【請求項71】
前記標的配列および前記第２の標的配列が異なる、請求項６８または６９に記載のプライマー混合物。
【請求項72】
（ｉ）第２の順方向インナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２の逆方向インナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２の順方向プライマー（ＳＦ３）、および（ｉｖ）第２の逆方向プライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３、および前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項６８～７１のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項73】
（ｉ）第２のループ順方向プライマー（ＳＬＦ）および（ｉｉ）第２のループ逆方向プライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦおよび前記ＳＬＢが前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項６８～６９のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項74】
第３のループ型プライマーをさらに含み、前記第３のループ型プライマーが、５’から３’に：第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のセンサー分子、
（ここで、前記第５のセンサー分子および前記第６のセンサー分子は、第３のバイオセンサーペアであり、および前記第３のバイオセンサーペアは、前記第１のバイオセンサーペアおよび前記第２のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第５のスペーシングオリゴヌクレオチド、前記第６のセンサー分子、前記任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド、および前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、前記第５および前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第３のプライマー配列
を含む、請求項５４～７３のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項75】
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチドが前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である、請求項７４に記載のプライマー混合物。
【請求項76】
前記標的配列、前記第２の標的配列、および前記第３の標的配列が同一である、請求項７４または７５に記載のプライマー混合物。
【請求項77】
前記標的配列、前記第２の標的配列、および前記第３の標的配列が異なる、請求項７４または７５に記載のプライマー混合物。
【請求項78】
（ｉ）第３の順方向インナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３の逆方向インナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３の順方向プライマー（ＴＦ３）、および（ｉｖ）第３の逆方向プライマー（ＴＢ３）をさらに含み、前記ＴＦＩＰ、前記ＴＢＩＰ、前記ＴＦ３、および前記ＴＢ３が、前記第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項７４～７７のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項79】
（ｉ）第３のループ順方向プライマー（ＴＬＦ）および（ｉｉ）第３のループ逆方向プライマー（ＴＬＢ）をさらに含み、前記ＴＬＦおよび前記ＴＬＢが前記第３の標的配列上の２つの異なる部位に結合する、請求項７４～７８のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項80】
第４のループ型プライマーをさらに含む、請求項７４～７９のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
【請求項81】
第５のループ型プライマーをさらに含む、請求項８０に記載のプライマー混合物。
【請求項82】
請求項１～５３のいずれか一項に記載のループ型プライマー、または請求項５４～８１のいずれか一項に記載のプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られる乾燥プライマー混合物。
【請求項83】
標的配列のループドループ増幅のためのキットであって、請求項１～５３のいずれか一項に記載のループ型プライマー、または請求項５４～８１のいずれか一項に記載のプライマー混合物、または請求項８０に記載の乾燥プライマー混合物を含むキット。
【請求項84】
ポリメラーゼをさらに含み、前記ポリメラーゼが、任意選択でバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼである、請求項８３に記載のキット。
【請求項85】
ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、および緩衝液をさらに含む、請求項８３～８４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項86】
逆転写酵素をさらに含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項87】
ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項８３～８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項88】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタまたはマウスＲＮａｓｅ阻害剤である、請求項８７に記載のキット。
【請求項89】
試料中の標的配列を検出する方法であって、以下のステップ：試料を提供するステップ；
（ｉ）請求項１～５３のいずれか一項に記載のプライマー、（ｉｉ）請求項５４～８１のいずれか一項に記載のプライマー混合物、または（ｉｉｉ）請求項８２に記載の乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた復元されたプライマー混合物、およびポリメラーゼを前記試料に添加し、それによって反応混合物を生成するステップ；ならびに
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項90】
前記インキュベーションが、５０～７０℃で実施される、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
前記インキュベーションが、６０～６５℃で実施される、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記インキュベートションが、６２～６５℃で実施される、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記ポリメラーゼが、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼである、請求項８９～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記反応混合物からのシグナルを検出するステップをさらに含む、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
前記シグナルが蛍光シグナルである、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記検出するステップが、インキュベーションのステップの間に実施される、請求項９４～９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項97】
前記試料中の前記標的配列の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項８９～９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
前記試料を調製する事前のステップをさらに含む、請求項８９～９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項99】
前記試料を調製するステップが、ＲＮＡ分子を逆転写酵素と相互作用させ、それによってＤＮＡ分子を含む試料を生成するステップを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
前記試料を調製するステップが、前記逆転写酵素との相互作用の前または間に、前記ＲＮＡ分子を事前に加熱するステップをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
前記反応混合物が、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項８９～１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項102】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタまたはマウスＲＮＡ阻害剤である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記試料が、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス全部、ヒト細胞全部、唾液もしくは鼻スワブ、または鼻もしくは鼻咽頭スワブを含む、請求項８９～１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項104】
前記試料が、膣スワブからのゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、細菌全部またはヒト細胞全部を含む、請求項８９～１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項105】
前記標的配列の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項８９～１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項106】
前記第２の標的配列または前記第３の標的配列の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２４３，６２５号の優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２４３，６２５号の優先権を主張する。
【0002】
２．配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＸＸＸ配列を有する配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸに作成され、名称は４９１４５ＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズはＸＸＸバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＸＸＸ配列を有する配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸに作成され、名称は４９１４５ＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズはＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【0003】
３．背景
核酸配列の相補性を使用して標的核酸を検出する方法は、今日まで従来のサザンハイブリダイゼーションから様々に改善または改変されている。特に、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）の確立により、少量の標的核酸を検出することが可能となっている。方法は、感染症の医学的診断、突然変異体遺伝子型の決定、一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異の検出等のための、試料中の標的核酸の配列特異的検出および定量のために使用されている。核酸増幅法は、その高い特異度および感度のために検査の至適基準となっている。
核酸配列の相補性を使用して標的核酸を検出する方法は、今日まで従来のサザンハイブリダイゼーションから様々に改善または改変されている。特に、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）の確立により、少量の標的核酸を検出することが可能となっている。方法は、感染症の医学的診断、突然変異体遺伝子型の決定、一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異の検出等のための、試料中の標的核酸の配列特異的検出および定量のために使用されている。核酸増幅法は、その高い特異度および感度のために検査の至適基準となっている。
【0004】
しかし、現行の核酸増幅法は、増幅反応およびシグナル検出が、制御された環境および高価な機器による精密な測定を必要とすることから制限を有する。このため、方法は、臨床現場の状況で使用するためには膨大な費用がかかる。加えて、方法は、単一の患者試料中の多重標的を検出する場合には最適ではない。多重標的の検出は、ワンポット反応でのシグナル多重化（蛍光スペクトル多重化、電気化学検出器のアレイ）、多重反応の一意的反応容器への物理的分離、またはその組合せによって達成され得る。しかし、ＣＬＩＡ ｗａｉｖｅｄ試験の場合、ユーザーが単一の患者試料を使用して核酸標的パネルを同時に問い合わせるために、必要となるのは３つ以下の単純なステップでなければならない。したがって、複雑なデバイスまたは使い捨ての自動ハンドル処理がなければ、試料を別個のチャンバーに迅速に物理的に分離することは、ＣＬＩＡ ｗａｉｖｅｄ試験の場合、実行不可能となる。蛍光によるスペクトル多重化は、核酸標的のパネルを標的とするために必要な一意的反応の数を低減させることができるが、スペクトル多重化ＬＡＭＰ反応は、アッセイ速度またはシグナル強度の大きい犠牲を必要とし、ＰＯＣ試験に適用して成功する見通しが弱められる。
【0005】
したがって、低い費用で高い感度および特異度を有する、標的核酸、特に多重標的の容易な増幅および検出を可能にする新規方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0006】
４．概要
本開示は、クローズドシステムで標的核酸の容易な検出を可能にする新規増幅法を提供する。方法は、バイオセンサーペアを有するループ型（looped）プライマーを使用することによって、高い特異度および感度で少量の標的核酸の検出を可能にする。バイオセンサーペアは、例えば蛍光／クエンチャーＦＲＥＴ技術を使用することによって、ループ型プライマーの立体構造の変化を検出することにより標的配列のループドループ（loop-de-loop）（「ＬＤＬ」）増幅の決定を可能にする。具体的には、核酸増幅は、ループ型プライマーにおける第１および第２のクランピング配列間の相互作用と競合し、蛍光／クエンチャー対を生成するシグナルを分離させ、観察されるシグナルに測定可能な変化（例えば、蛍光）をもたらす。
本開示は、クローズドシステムで標的核酸の容易な検出を可能にする新規増幅法を提供する。方法は、バイオセンサーペアを有するループ型（looped）プライマーを使用することによって、高い特異度および感度で少量の標的核酸の検出を可能にする。バイオセンサーペアは、例えば蛍光／クエンチャーＦＲＥＴ技術を使用することによって、ループ型プライマーの立体構造の変化を検出することにより標的配列のループドループ（loop-de-loop）（「ＬＤＬ」）増幅の決定を可能にする。具体的には、核酸増幅は、ループ型プライマーにおける第１および第２のクランピング配列間の相互作用と競合し、蛍光／クエンチャー対を生成するシグナルを分離させ、観察されるシグナルに測定可能な変化（例えば、蛍光）をもたらす。
【0007】
加えて、様々なバイオセンサーを有する複数のループ型プライマーの使用は、単一のチューブにおける多重化標的の検出を可能にする。ループ型プライマーは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）との組合せのみならず、鎖置換型ポリメラーゼを利用する任意の他の核酸増幅法と共に使用することができる。
【0008】
本出願人は、ループドループ増幅法が、阻害性蛍光プローブ、例えばＤＡＲＱ（クエンチングの放出による増幅の検出）、およびＯＳＤ（１ステップ置換）プローブを伴う以前に公知の方法と比較して、改善された感度および特異度、より急速な反応回転（ｔｕｒｎａｒｏｕｎｄ）時間で標的核酸分子の配列特異的増幅を可能にすることを実証した。さらに、ループドループ増幅法は、ＱＵＡＳＲ（取り込まれていない増幅シグナルレポーターのクエンチング）とは異なり、増幅シグナルのリアルタイム検出を可能にする。ループドループ法は未処理（crude）試料であっても強いシグナルを提供することから、方法を低コスト機器によって実施することができる。
【0009】
本開示は、ループドループ（「ＬＤＬ」）増幅法に使用することができる２つのタイプのループ型プライマー、すなわちＮＢＭループ型プライマーおよびＢＭループ型プライマーを提供する。ＮＢＭループ型プライマーおよびＢＭループ型プライマーはいずれも、蛍光／クエンチャーペア、すなわち蛍光シグナルを適切にクエンチするために互いに十分に近接しており、その相互作用が変化すると増幅シグナルを提供する第１の（外部）センサー分子および第２の（内部）センサー分子を含む。しかし、ＮＢＭループ型プライマー（図１）およびＢＭループ型プライマー（図２３）は、内部クランピングオリゴヌクレオチドおよび標的配列と相補的なプライマー配列と比較して異なる位置に内部センサー分子を含む。ＮＢＭループ型プライマーは、内部クランピングオリゴヌクレオチドとプライマー配列との間に内部センサー分子を含むが、ＢＭループ型プライマーは、内部クランピングオリゴヌクレオチドの５’末端に内部センサー分子を含む。
【0010】
ＮＢＭループ型プライマーは、内部クランピングオリゴヌクレオチドとプライマー配列の間に内部センサー分子を含むことから、一部の内部センサーは、図２７に例証されるようにＢｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のような鎖置換型ポリメラーゼの内部クランピングオリゴヌクレオチドへの順方向の進行を遮断または妨害し得る。
【0011】
ＮＢＭループ型プライマーとは異なり、ＢＭループ型プライマーは、内部クランピングオリゴヌクレオチドの５’末端に内部センサー分子を含むことから、等温増幅アッセイにおける鎖置換型ポリメラーゼは、内部センサー分子に到達する前に、標的配列および内部クランピングオリゴヌクレオチドに対して相補的な連続する配列を合成することができる（図２３）。このことは、たとえ内部センサー分子が、鎖置換型ポリメラーゼの進行を遮断する場合であっても、標的配列および内部クランピングオリゴヌクレオチドの増幅を可能にする。これは、その遮断効果によらず、様々な内部センサー分子の使用を可能にする。このことは、複数のループ型プライマーを、複数の標的の同時検出のために共に使用する場合、および様々なセンサー分子の使用が必要である場合には、特に重要である。
【0012】
ＢＭループ型プライマーを使用する増幅から産生された二本鎖ＤＮＡ分子は、クランピング配列より高い融解温度を有する傾向があり、したがって開いたループの立体配置はさらにより好ましい。これは、ＮＢＭループ型プライマーによって達成される蛍光と類似の明るい蛍光をもたらす。加えて、ＢＭループ型プライマーの開いた立体配置は、室温を含む広い温度範囲にわたって安定である。この特色により、遮断性の内部修飾が存在する場合であっても、蛍光によるエンドポイント決定が許容される。
【0013】
本開示は、さらに標的ポリヌクレオチドの増幅のためのＮＢＭループ型プライマーまたはＢＭループ型プライマーを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＭＢループ型プライマーおよびＢＭループ型プライマーは、単一の反応で共に使用される。一部の実施形態では、ＮＭＢループ型プライマーまたはＢＭループ型プライマーは、単一の反応において個々に使用される。本開示はまた、増幅法のための組成物も提供する。
【0014】
したがって、本発明は、標的配列のループドループ増幅（ＬｄＬ）方法のためのＢＭループ型プライマーを提供する。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
【0015】
一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、第１のスペーシングオリゴヌクレオチドまたは任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造において一本鎖である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のプライマー配列は、重複する。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のプライマー配列は、重複しない。
【0016】
一部の実施形態では、ループ型プライマーは、第２のスペーシングオリゴヌクレオチドを含む。
【0017】
一部の実施形態では、第１のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび第２のスペーシングオリゴヌクレオチドはいずれも、ヘアピン構造において一本鎖である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると（together）、３～３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～６ヌクレオチド長である。
【0018】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および任意選択の第２のセンサー分子は、９～１００Å離れている。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および任意選択の第２のセンサー分子は、１０～５０Å離れている。
【0019】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【0020】
一部の実施形態では、第１のバイオセンサーペアは、エネルギー供与体および受容体ペアである。一部の実施形態では、第１のバイオセンサーペアは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のエネルギー供与体および受容体対である。
【0021】
一部の実施形態では、第１のセンサー分子はＦＲＥＴフルオロフォアであり、第２のセンサー分子はＦＲＥＴクエンチャーである。一部の実施形態では、第１のセンサー分子はＦＲＥＴクエンチャーであり、第２のセンサー分子はＦＲＥＴフルオロフォアである。一部の実施形態では、第１のセンサー分子は、ＢＲＥＴエネルギー供与体であり、第２のセンサー（sensory）分子はＢＲＥＴエネルギー受容体である。一部の実施形態では、第１のセンサー分子はＢＲＥＴエネルギー受容体であり、第２のセンサー（sensory）分子はＢＲＥＴエネルギー供与体である。
【0022】
一部の実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、検出可能な光シグナルを生成する複合体を形成することができる。一部の実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、ヘアピン構造が形成された場合に有意に減損した光シグナルを生成する。
【0023】
一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、チミジン（Ｔ）またはデオキシチミジン（ｄＴ）に結合している。
【0024】
一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は６０℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は６５℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は７０℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、８０℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、７０～８０℃である。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、７０～７５℃である。
【0025】
一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は約７２℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は６０℃より低い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０～６５℃である。
【0026】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または（ｖｉｉ）その組合せを含む。
【0027】
一部の実施形態では、ループ型プライマーは、ループ型プライマーの５’末端で第１の追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、第１のセンサー分子および第１のクランピングオリゴヌクレオチドの間に第２の追加のオリゴヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第１または第２の追加のオリゴヌクレオチドは、バーコード配列である。
【0028】
一部の実施形態では、標的配列は、病原体ゲノムに対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、ｏｒｆ８またはｃｄｓ２に由来する。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、ｐｏｒＡまたはｇｌｎＡに由来する。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、配列番号５または７のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ウイルスに対して特異的である。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列はＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ＰＯＰ７ｂをコードするＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列はｔｂｃ１ｄ３に由来する。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、配列番号２２のオリゴヌクレオチドを含む。
【0029】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるループ型プライマーを含む、標的配列のループドループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）順方向（forward）インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向（backward）インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および逆方向プライマー（Ｂ３）を含み、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、およびＢ３は、標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0030】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｉｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）を含み、ＬＦおよびＬＢは、標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0031】
一部の実施形態では、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、またはＬＢは、標的配列上の第１の結合部位に結合する。
【0032】
一部の実施形態では、ＦＩＰは、第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＦＩＰの量とループ型プライマーの量の間の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＢＩＰは、第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＢＩＰの量とループ型プライマーの量の間の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＬＦは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＬＦの量とループ型プライマーの量の間の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＬＢは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＬＢの量とループ型プライマーの量の間の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。
【0033】
一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、またはＬＢは、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号１３を含み、またはＬＢは、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰ は、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、またはＬＢは、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。
【0034】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第２のループ型プライマーを含み、第２のループ型プライマーは、５’から３’に：
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は、第２のバイオセンサーペアであり、第２のバイオセンサーペアは第１のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド、第４のセンサー分子、任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含む。
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は、第２のバイオセンサーペアであり、第２のバイオセンサーペアは第１のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド、第４のセンサー分子、任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含む。
【0035】
一部の実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。
【0036】
一部の実施形態では、標的配列および第２の標的配列は同一である。一部の実施形態では、標的配列および第２の標的配列は異なる。
【0037】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第２の順方向インナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２の逆方向インナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２の順方向プライマー（ＳＦ３）、および（ｉｖ）第２の逆方向プライマー（ＳＢ３）を含み、ＳＦＩＰ、ＳＢＩＰ、ＳＦ３、およびＳＢ３は第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0038】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第２のループ順方向プライマー（ＳＬＦ）および（ｉｉ）第２のループ逆方向プライマー（ＳＬＢ）を含み、ＳＬＦおよびＳＬＢは、第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0039】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第３のループ型プライマーを含み、第３のループ型プライマーは、５’から３’に：
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は第３のバイオセンサーペアであり、第３のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアおよび第２のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチド、第６のセンサー分子、任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第３のプライマー配列
を含む。
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は第３のバイオセンサーペアであり、第３のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアおよび第２のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチド、第６のセンサー分子、任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第３のプライマー配列
を含む。
【0040】
一部の実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、標的配列、第２の標的配列および第３の標的配列は同一である。一部の実施形態では、標的配列、第２の標的配列および第３の標的配列は異なる。
【0041】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第３の順方向インナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３の逆方向インナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３の順方向プライマー（ＴＦ３）、および（ｉｖ）第３の逆方向プライマー（ＴＢ３）を含み、ＴＦＩＰ、ＴＢＩＰ、ＴＦ３、およびＴＢ３は、第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0042】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第３のループ順方向プライマー（ＴＬＦ）および（ｉｉ）第３のループ逆方向プライマー（ＴＬＢ）を含み、ＴＬＦおよびＴＬＢは、第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0043】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第４のループ型プライマーを含む。一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第５のループ型プライマーを含む。
【0044】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるループ型プライマーまたはプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られた乾燥プライマー混合物を提供する。
【0045】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるループ型プライマー、プライマー混合物、または乾燥プライマー混合物を含む、標的配列のループドループ増幅のためのキットを提供する。
【0046】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、任意選択でバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼである。一部の実施形態では、キットはさらに、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、および緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットはさらに、逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、キットはさらに、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ブタまたはマウスＲＮａｓｅ阻害剤である。
【0047】
本開示はさらに、試料中の標的配列を検出する方法であって、
試料を提供するステップ；
（ｉ）プライマー、（ｉｉ）プライマー混合物、または（ｉｉｉ）その乾燥混合物を再水和すること（rehydrating）によって得られた復元された（reconstituted）プライマー混合物、およびポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成するステップ；ならびに
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートするステップ
を含む方法を開示する。
試料を提供するステップ；
（ｉ）プライマー、（ｉｉ）プライマー混合物、または（ｉｉｉ）その乾燥混合物を再水和すること（rehydrating）によって得られた復元された（reconstituted）プライマー混合物、およびポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成するステップ；ならびに
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートするステップ
を含む方法を開示する。
【0048】
一部の実施形態では、インキュベーションは、５０～７０℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、６０～６５℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、６２～６５℃で実施される。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼである。
【0049】
一部の実施形態では、方法は、反応混合物からのシグナルを検出するステップをさらに含む。
【0050】
一部の実施形態では、シグナルは、蛍光シグナルである。一部の実施形態では、検出するステップは、インキュベーションステップの間に実施される。一部の実施形態では、方法はさらに、試料中の標的配列の存在または非存在を決定するステップを含む。
【0051】
一部の実施形態では、方法はさらに、試料を調製する事前のステップ（preceding step）を含む。一部の実施形態では、試料を調製するステップは、ＲＮＡ分子を逆転写酵素と相互作用させ、それによってＤＮＡ分子を含む試料を生成するステップを含む。
【0052】
一部の実施形態では、試料を調製するステップはさらに、逆転写酵素との相互作用の前または間にＲＮＡ分子を事前に加熱する（preheating）ステップを含む。一部の実施形態では、反応混合物はさらに、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ブタまたはマウスＲＮＡ阻害剤である。
【0053】
一部の実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス全部（whole）、ヒト細胞全部、唾液もしくは鼻スワブ、または鼻もしくは鼻咽頭スワブを含む。一部の実施形態では、試料は、膣スワブからのゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、細菌全部またはヒト細胞全部を含む。
【0054】
一部の実施形態では、方法はさらに、標的配列の存在または非存在を決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法はさらに、第２の標的配列または第３の標的配列の存在または非存在を決定するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【図2】図２Ａは、インターカレート色素（ＳＹＴＯ）によって可視化した、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（ＣＴ）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（ＮＧ）のＬＡＭＰアッセイの結果を提供する。増幅は、ＣＴに関して[ＤＮＡ]の少なくとも５対数、およびＮＧに関して６対数にわたって急速（＜３０分）であった。ＮＧアッセイ分析感度（ＬＯＤ５０）は、ＰＲＯＢＩＴ解析によって３５ｃｐ／１０μＬ反応である。図２Ｂは、新規ＮＢＭループ型プライマーを使用する標的増幅からの読み出しを提供する。結果は、ＳＹＴＯ色素に対して最少の阻害および増強された特異度での標的の極めて明るいリアルタイム検出を示す。図２Ｃは、新規ＮＢＭループ型プライマーによる淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出を提供する。結果は、方法が反復可能で急速、強固で高いシグナル対ノイズ比の増幅を生成することを示している。プローブは、偽陽性を排除する。
【図3】図３は、５０％置換を有するＦＡＭ標識ＬＦプライマーによるループドループ法を使用するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の標的核酸の増幅を示す、経時的なリアルタイム蛍光シグナルのプロットである。陽性および陰性試料の両方を、右の表に示すように試験した。ｙ軸の各「サイクル」は、セ氏６５度で３０秒の経過時間を表す。
【図4】図４は、５０％置換を有するＦＡＭ標識ＬＦプライマーによるループドループ法を使用する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の標的核酸の増幅を示す、経時的なリアルタイム蛍光シグナルのプロットである。陽性および陰性試料の両方を、右の表に示すように試験した。ｙ軸の各「サイクル」は、セ氏６５度で３０秒の経過時間を表す。
【図5】図５は、５０％置換を有するＦＡＭ標識ＬＦプライマーによるループドループ法を使用するヒト（Homo sapiens）の標的核酸の増幅を示す、経時的なリアルタイム蛍光シグナルのプロットである。陽性および陰性試料の両方を、右の表に示すように試験した。ｙ軸の各「サイクル」は、セ氏６５度で３０秒の経過時間を表す。
【図6】図６は、ＮＢＭループ型プライマーによる４つの陽性（左）および４つの陰性（右）反応を含有するチューブの画像を提供する。蛍光を青色ＬＥＤで励起し、青色ゲルフィルターを通して光らせ、カメラフォンまで保持したアンバープラスチックフィルターによって放射を可視化した。
【図7】図７は、ＰＣＲチューブ中で凍結乾燥によって調製したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（上）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（中央）、およびヒト（Homo sapiens）（下）に関するＮＢＭループ型プライマーアッセイのための乾燥（凍結乾燥）混合物を含有するチューブの画像を提供する。
【図8】図８は、使用前に復元した図７の乾燥混合物を使用するループドループ反応におけるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、およびヒト（Homo sapiens）の標的核酸の増幅を示すリアルタイム蛍光シグナルを提供する。結果は、乾燥され、その後復元されたプライマーのアッセイ活性および感度が維持されたことを示す。
【図9】図９Ａ（第１の試験）および９Ｂ（第２の試験）は、様々な温度でＰＯＰ７ｂ（ヒト（H. sapiens）ＲＮＡ転写物）またはＯＲＦ１ａｂ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ）プライマーセットを使用するループドループＬＡＭＰ反応からの結果を得るために必要な時間をプロットする。
【図10】図１０は、ヒト（H. Sapiens）、Ｃ．トラコマチス（C. Trachomatis）、淋菌（N. Gonorrhoeae）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＤＮＡを標的とするＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。ＮＢＭループ型プライマーは、反応温度６５℃より約１０℃上でアンフォールディングされるように設計される。曲線は、ループドループプライマーのステムループ配列が蛍光シグナルの原因であることを実証している。
【図11】図１１は、ＮＢＭループ型プライマーを２５％、５０％、または１００％強度で使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。この文脈において、「強度」は、プライマーがループドループ法のループ型バージョンに置換されている程度である。データは、より強いプライマーが、結果までの時間が１～２分遅れる代わりにより大きいシグナルを提供する傾向があることを示している。１００％強度のループドループプライマーは、アッセイを遅らせるが、他のリアルタイムＬＡＭＰ鎖置換プローブ法の程度ではない。ｙ軸の各「サイクル」は、セ氏６５度で３０秒の経過時間を表す。
【図12】図１２は、０．４μＭ ＮＢＭループ型プライマーおよび２μＭ ＳＹＴＯインターカレート色素の両方を含むループドループ反応からの相対的蛍光シグナルを提供する。２チャンネル蛍光データは、インターカレート色素（ＳＹＴＯ）の顕色およびループドループシグナル発生のタイミングが同一であることを実証する。ループドループをインターカレート色素と比較するとシグナルの遅れはなく、ループドループ反応は、ＳＹＴＯより大きいシグナルを提供した。
【図13】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＮＢＭループ型プライマーを使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の標的配列の増幅からのリアルタイム蛍光シグナルを示す。図１３Ａは、新たに混合した反応混合物からの結果であり、図１３Ｂは、フリーズドライした反応混合物からの結果である。フリーズドライしたアッセイ混合物は、３カ月より長く安定であり、良好な読み出しを提供した。アッセイを、１４の反復実験で実施し、これらはアッセイ（２０．７コピー／μＬ）のＬｏＤ９５（低い陽性）での各々のＣｔ Ｅ ＢＯＵＲ（クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の株）、プラス２つの鋳型なし対照（ＮＴＣ）であった。新たに調製した反応混合物とフリーズドライ反応混合物の間で、感度（各々ＬｏＤ９５で１２／１４）または結果までの平均時間（１６分、Ｔ検定、Ｐ値＝０．６６）に変化はなかった。
【図14】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ＮＢＭループ型プライマーを使用して単一チューブ反応（ワンポット）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的配列のループドループ増幅からのスペクトル二重化蛍光シグナルを示す。破線のシグナルはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＦＡＭ）に由来し、実線のシグナルはヒト内部対照（Ｃｙ５）に由来する。３つのタイプの試料、すなわち標的配列を有しない対照（図１４Ａ）、未処理ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、および熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ゲノムＲＮＡ標的配列を有するインタクトウイルス）と組み合わせた未処理ヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）を使用した。データは、標的配列の存在下に限って特異的増幅シグナルを示す。データはさらに、単一の反応容器中でのループドループ法による反応のスペクトル多重化をさらに実証する。
【図15】図１５Ａは、様々な濃度のＰＯＰ７ｂプライマーによるループドループ増幅からのリアルタイム蛍光シグナルを示す。シグナル強度は、ＰＯＰ７ｂプライマーの濃度が低減すると減少した（矢印）。単一反応体積中の１つより多くのプライマーセットによる多重化応用では、任意の所定のプライマーセットの濃度は、プライマーの１００％が単一のセットに属する反応と比較して減少した。図１５Ｂは、様々な濃度のＰＯＰ７ｂプライマーでの結果までの時間（分）をプロットする。結果までの時間は、プライマー濃度が、単一チューブ中の２つより多くの標的を多重化する利点が、臨床または市場での速度の要求を上回る多くの応用において認容される、４０％未満に低下すると、影響を受けた。反応において、１０－４ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡを、２１μＬの反応体積で使用した。
【図16】図１６は、コロナウイルス陽性対象から得た無処理鼻スワブにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＯＲＦ１ａｂ）に対して特異的なＲＮＡ標的配列、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的なＲＮＡ標的配列（ＰＯＰ７ｂ）、両方の標的に対して特異的なＲＮＡ標的配列、またはいずれの標的も存在しない場合のいずれかのループドループＲＴ－ＬＡＭＰ増幅からのリアルタイム蛍光シグナルを示す。鼻スワブをループドループＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に直接溶出させ、反応混合物中で４つの濃度に希釈した。１×スワブは、この試験構成で使用した試料の標準濃度を、単位体積あたりに溶出したスワブの単位で表す。この例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒトＲＮＡプライマーセットを単一のチューブで二重化した。各プライマーセットは、１つのＮＢＭループ型プライマーを含有し、各々は、同じフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識された（単一の蛍光チャンネル）。結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒトＲＮＡの両方を検出した反応が、二重増幅シグナルを特色としたことであった。両方の標的の検出をもたらす希釈液を、「二重陽性」と表示し、いずれかの標的の検出をもたらすものを「単一陽性」と表示し；いずれの標的の検出ももたらさないものを「二重陰性」として表示する。このデータは、このコロナウイルス陽性ボランティアのスワブ試料に関して、リアルタイムループドループＲＴ－ＬＡＭＰアッセイが、反応中の両方の標的を検出するために必要な感度より少なくとも３７０倍の感度であったことを実証した。
【図18】図１８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的配列の多重化ループドループ増幅からの蛍光シグナルを示し、ループドループ反応の特異度を実証する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒトプライマーセットの両方を、二重陽性対照が２つの増幅事象を示すように、ＦＡＭ標識プライマーを使用するループドループのために修飾した。ＲＰＰＯＳは、２２個の非標的呼吸器病原体からの遺伝子材料を含有する呼吸器病原体パネル陽性（Ｅｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ）である。ＰＲＮＥＧは、核酸を有しないＲＰＰＯＳ産物のバックグラウンドマトリックス対照である。データは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的を検出するためのループドループＲＴ－ＬＡＭＰ反応が、オフターゲット核酸を増幅しないことを示している。
【図19】図１９は、高コピー数のＣ．トラコマチス（C. trachomatis）（Ｃｔ）（１０，０００コピー当量／反応）および高コピー数の淋菌（N. gonorrhoeae）（Ｎｇ）（１０，０００コピー当量／反応）を含有する試料のループドループ増幅からの蛍光シグナルを示す。
【図20】図２０は、高コピー数のＣ．トラコマチス（C. trachomatis）（Ｃｔ）（１０，０００コピー当量／反応）および低コピー数の淋菌（N. gonorrhoeae）（Ｎｇ）を含有する試料のループドループ増幅からの蛍光シグナルを示す。
【図21】図２１は、低コピー数のＣ．トラコマチス（C. trachomatis）（Ｃｔ）および低コピー数の淋菌（N. gonorrhoeae）（Ｎｇ）を含有する試料のループドループ増幅からの蛍光シグナルを示す。
【図24】図２４は、フルオレセイン（ＦＡＭ）によって標識した内部ｄＴを含むＮＢＭループ型プライマーを使用する増幅からの融解曲線を提供する。融解曲線は、非増幅反応の場合は正の勾配（－ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ＜０）、陽性増幅の場合は負の勾配を示す。
【図25】図２５は、ＮＢＭループ型プライマー、ヒトＰＯＰ７ｂ－ＬＢ－Ｃｙ５を使用する増幅からの融解曲線を提供する。内部Ｃｙ５は、鎖置換型ポリメラーゼの順方向進行を遮断し、したがって、ＮＢＭループ型プライマー構造と共に使用される遮断性内部修飾である。
【図26】図２６は、内部Ｚｅｎクエンチャーを有するＮＢＭループ型プライマーを使用する増幅からの融解曲線を提供する。内部Ｚｅｎクエンチャーは、鎖置換型ポリメラーゼの順方向進行を遮断し、したがって、ＮＢＭループ型プライマー構造と共に使用される遮断性内部修飾である。
【図28】図２８Ａは、５’－ＦＡＭフルオロフォアおよびｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応のリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図２８Ｂは、５’－ＦＡＭフルオロフォアおよびｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図29】図２９Ａは、５’－ＨＥＸフルオロフォアおよび内部Ｏｎｙｘ Ａ（ＯＱＡ）クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図２９Ｂは、５’－ＨＥＸフルオロフォアおよび内部Ｏｎｙｘ Ａ（ＯＱＡ）クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図30】図３０Ａは、５’－ＶＩＣフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３０Ｂは、５’－ＶＩＣフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図31】図３１Ａは、５’－ＡＢＹフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３１Ｂは、５’－ＡＢＹフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図32】図３２Ａは、５’－ＱＳＹ７クエンチャーおよび内部ｄＴ－ＴＡＭＲＡを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３２Ｂは、５’－ＱＳＹ７クエンチャーおよび内部ｄＴ－ＴＡＭＲＡを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図33】図３３Ａは、５’－ＪＵＮフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３３Ｂは、５’－ＪＵＮフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図34】図３４Ａは、５’－ＱＳＹ７クエンチャーおよび内部ｄＴ－ＦＡＭフルオロフォア；または５’－ＦＡＭフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３４Ｂは、５’－ＱＳＹ７クエンチャーおよび内部ｄＴ－ＦＡＭフルオロフォア；または５’－ＦＡＭフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図35】図３５Ａは、５’－ＨＥＸフルオロフォアおよび内部Ｏｎｙｘ Ａ（ＯＱＡ）クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３５Ｂは、５’－ＨＥＸフルオロフォアおよび内部Ｏｎｙｘ Ａ（ＯＱＡ）クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図36】図３６Ａは、５’－ＶＩＣフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３６Ｂは、５’－ＶＩＣフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＢＭまたはＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図37】図３７Ａは、５’－ＡＢＹフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３７Ｂは、５’－ＡＢＹフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図38】図３８Ａは、５’－ＪＵＮフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。図３８Ｂは、５’－ＪＵＮフルオロフォアおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７クエンチャーを含有するＮＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。
【図39】図３９Ａは、５’－Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）フルオロフォアおよび内部Ｚｅｎクエンチャーを含有するＮＢＭまたはＢＭループ型プライマーを使用するループドループ反応からのリアルタイム蛍光シグナルを提供する。ＢＭループ型プライマーからのシグナルは、ＢＭループ型プライマーヘアピンが、鎖置換型ポリメラーゼが第２のクランピングおよび任意選択のスペーサー配列の逆相補体を合成後に開き、図２３に示される立体配置をもたらすことから、ＮＢＭループ型プライマーのシグナルより明るい。ＮＢＭループ型プライマーでは、ポリメラーゼは内部Ｚｅｎクエンチャーによって遮断され、第２のクランピング配列の逆相補体を合成することができず、図２７に示される立体配置をもたらす。図３９Ｂは、５’－Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）フルオロフォアおよび内部Ｚｅｎクエンチャーを含有するＮＢＭまたはＢＭループ型プライマーの融解曲線を提供する。融解曲線は、第２のセンサー分子がＺｅｎのような遮断性修飾である場合、ＢＭループ型プライマーは、たとえ室温まで冷却した場合であっても、標的の存在下で安定なオープンプライマー立体配置を生成することを実証している。これに対し、ＮＢＭループ型プライマーは、室温に冷却された場合に、蛍光を発しない安定なヘアピン立体配置を保持する。
【発明を実施するための形態】
【0056】
図面は、単なる例証目的のために本発明の様々な実施形態を示す。当業者は、本明細書に例証する構造および方法の代替の実施形態を、本明細書に記載される本発明の原理から逸脱することなく使用してもよいことを、以下の考察から容易に認識するであろう。
【0057】
６．詳細な説明
６．１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の内容に帰する意味を有する。
６．１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の内容に帰する意味を有する。
【0058】
「バイオセンサーペア」という用語は、本明細書で使用される場合、２つのセンサー分子間のある特定の物理的相互作用により検出可能なシグナルを生成することができるセンサー分子のペアを指す。例えば、バイオセンサーペアは、フェルスター共鳴エネルギー移動、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のために使用される供与体分子および受容体分子のペアであり得る。この場合、蛍光シグナルは、供与体分子から受容体分子への距離依存的エネルギー移動によって生成され得る。他の実施形態では、バイオセンサーペアは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に使用されるセンサー分子のペアである。この場合、生物発光シグナルは、供与体分子から受容体分子への距離依存的エネルギー移動によって生成され得る。当技術分野で公知の他のバイオセンサーペアを、本開示の様々な実施形態に使用することができる。
【0059】
「ループドループ増幅」、または「ＬｄＬ増幅」という用語は、本明細書で使用される場合、距離依存的エネルギー移動によって蛍光シグナルを生成することができるループ型プライマーを使用する標的核酸の増幅を指す。
【0060】
「ループ型プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で記載されるＬｄＬ増幅に使用することができるプライマーを指す。ループ型プライマーは、距離依存的エネルギー移動によって蛍光シグナルを生成することができるバイオセンサーペアを含む。ループ型プライマーは、ＢＭループ型プライマーまたはＮＢＭループ型プライマーであり得る。
【0061】
「ＮＢＭループ型プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
スペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第２のセンサー分子
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含むループ型プライマーを指す。
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
スペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第２のセンサー分子
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含むループ型プライマーを指す。
【0062】
ＮＢＭループ型プライマーは、非遮断性修飾と適合性であるが、遮断性修飾との適合性が低いかまたは適合性でない形態である。
【0063】
ＬｄＬ増幅を、ＮＢＭループ型プライマーによって実施する場合、第２のセンサー分子は、鎖置換型ポリメラーゼの順方向進行を遮断し得る。したがって、ポリメラーゼの進行を遮断しないセンサー分子（例えば、化学結合のための骨格としてヌクレオチド塩基（例えば、ｄＴ）を利用するセンサー）を第２のバイオセンサーとして使用することは、好ましいが必要ではない。一部の実施形態では、ＮＢＭループ型プライマーは、鎖置換型ポリメラーゼの順方向の進行を部分的に遮断するセンサー分子を含む。一部の実施形態では、ＮＢＭループ型プライマーは、鎖置換型ポリメラーゼの順方向の進行を遮断しないセンサー分子を含む。
【0064】
「ＢＭループ型プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列、
を含むループ型プライマーを指す。
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列、
を含むループ型プライマーを指す。
【0065】
ＢＭループ型プライマーは、遮断性および非遮断性修飾の両方と適合性の形態にある。したがって、一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、遮断性修飾（例えば、ポリメラーゼの進行を遮断する第２のセンサー分子）を含む。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、非遮断性修飾（例えば、ポリメラーゼの進行を遮断しない第２のセンサー分子）を含む。
【0066】
「ＬＯＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、検出限界を指す。例えば、ＬＯＤ９５は、９５パーセンタイルの検出限界である。これは、アッセイが時間の９５％で陽性結果を検出することが統計学的に予想される標的の濃度である。
【0067】
６．２．他の解釈上の慣例
本明細書で列挙した範囲は、列挙された終点を含む範囲内の全ての値の省略であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
本明細書で列挙した範囲は、列挙された終点を含む範囲内の全ての値の省略であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【0068】
特に示していない限り、１つまたは複数の立体中心を有する化合物という言及は、各々の立体異性体、および立体異性体のその全ての組合せを意図する。
【0069】
６．３．ループ型プライマー
本開示は、本明細書に記載されるＬｄＬ増幅に使用することができるループ型プライマーを提供する。ループ型プライマーは、距離依存的エネルギー移動によって蛍光シグナルを生成することができるバイオセンサーペアを含む。ループ型プライマーは、ＢＭループ型プライマーまたはＮＢＭループ型プライマーであり得る。
本開示は、本明細書に記載されるＬｄＬ増幅に使用することができるループ型プライマーを提供する。ループ型プライマーは、距離依存的エネルギー移動によって蛍光シグナルを生成することができるバイオセンサーペアを含む。ループ型プライマーは、ＢＭループ型プライマーまたはＮＢＭループ型プライマーであり得る。
【0070】
ＮＢＭループ型プライマー
一態様では、本発明は、ループドループ増幅のためのＮＢＭループ型プライマーを提供する。ＮＢＭループ型プライマーは、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
スペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
一態様では、本発明は、ループドループ増幅のためのＮＢＭループ型プライマーを提供する。ＮＢＭループ型プライマーは、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
スペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
【0071】
一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドに結合することができるが、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的ではない。
【0072】
第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは互いに相補的であり、そのため互いに結合することができる。第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる。
【0073】
一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃より高い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は６５℃より高い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は７０℃より高い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、８０℃より高い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０～８０℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７２．５～７７．５℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は約７５℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃より低い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０～６５℃である。
【0074】
一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、鎖置換型ポリメラーゼを使用するアッセイの伸長温度より１０℃高い。一部の実施形態では、融解温度は、アッセイの伸長温度より低い、それに等しい、または任意の量高い。
【0075】
Ｔｍが、反応の伸長温度より低い場合、リアルタイム検出を、エンドポイント検出に交換することができ（反応を、クランピング配列のＴｍ付近またはそれより下に冷却する）、完全な強度（１００％置換）のＮＢＭループ型プライマーを使用する場合であっても、反応の阻害が存在しないことがあり得る。
【0076】
Ｔｍが、反応の伸長温度に等しい場合、リアルタイム検出はなおも実行可能であり得るが、エンドポイント決定のために反応を冷却するまで高いバックグラウンド蛍光が存在し得る。
【0077】
Ｔｍが、反応の伸長温度より高い場合、リアルタイム検出は、主要な操作様式であり得て、バックグラウンド蛍光は最小である。
【0078】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３～１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３～７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長である。典型的な実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、同じ長さを有する。
【0079】
一部の実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、５～３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１０～２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３～１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３ヌクレオチド長である。
【0080】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、合わせると、１５～３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、合わせると、２０～３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、合わせると、２３～２８ヌクレオチド長である。
【0081】
ループ型プライマーは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または（ｖｉｉ）その組合せを含み得る。第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または（ｖｉｉ）その組合せを含む。
【0082】
一部の実施形態では、ＮＢＭループ型プライマーはさらに、ループ型プライマーの５’末端に第１の追加のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態ではさらに、ＮＢＭループ型プライマーは、第１のセンサー分子および第１のクランピングオリゴヌクレオチドの間に第２の追加のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１または第２の追加のオリゴヌクレオチドは、バーコード配列である。
【0083】
一部の実施形態では、ＮＢＭループ型プライマーは、ループ型プライマーのさらに５’末端に追加のバーコード配列、プローブ配列、または他の配列を含む。追加の配列は、核酸塩基またはその修飾を含み得る。
【0084】
一部の実施形態では、標的配列は、病原体ゲノムに対して特異的である。実施形態では、標的配列は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、ｏｒｆ８またはｃｄｓ２に由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号１５の配列を有し得る。
【0085】
一部の実施形態では、標的配列は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、ｐｏｒＡまたはｇｌｎＡに由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号５または７の配列を有し得る。
【0086】
一部の実施形態では、標的配列は、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列は、ｔｂｃ１ｄ３に由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号２２の配列を有し得る。
【0087】
ＢＭループ型プライマー
別の態様では、本開示は、ＢＭループ型プライマーを提供する。ＢＭループ型プライマーは、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択で第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
別の態様では、本開示は、ＢＭループ型プライマーを提供する。ＢＭループ型プライマーは、５’から３’に：
第１のセンサー分子；
第１のクランピングオリゴヌクレオチド；
第１のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のセンサー分子、
（ここで、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は第１のバイオセンサーペアである）；
任意選択で第２のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第２のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
標的配列上の第１の結合部位と相補的な第１のプライマー配列
を含む。
【0088】
ＮＢＭループ型プライマーおよびＢＭループ型プライマーは、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと比較して異なる位置で第２のセンサー分子を含む。
【0089】
ＮＢＭループ型プライマーと比較して、ＢＭループ型プライマーは、それらがヘアピン構造を形成する場合により離れた距離で第１のセンサー分子および第２のセンサー分子を含む。しかし、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子はなおも、蛍光シグナルを適切にクエンチするために互いに物理的に十分に近い。
【0090】
第２のセンサー分子は、第２のクランピングオリゴヌクレオチドの５’末端に存在することから、等温増幅アッセイにおける鎖置換型ポリメラーゼは、第２のセンサー分子に達する前に標的配列および第２のクランピングオリゴヌクレオチドに対して相補的な連続する配列を合成することができる。得られた二本鎖ＤＮＡの区分は、クランピング配列より高い融解温度を有し、したがって、開いたループの（非ヘアピン）立体配置はなおさら都合がよい。これは明るい蛍光を生じる。加えて、開いた立体配置は、室温を含む広い温度範囲に対して安定である。この特色により、たとえ等温増幅アッセイにおいて鎖置換型ポリメラーゼの順方向進行を遮断する第２のセンサー分子が存在する場合であっても、蛍光によってエンドポイントを決定することが許容される。
【0091】
開いたループの立体配置は、第２のセンサー分子および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの間に追加の塩基（すなわち、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド）を付加することによってさらに安定化させることができる。このように、一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、第２のスペーシングオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、第２のスペーシングオリゴヌクレオチドを含まない。
【0092】
一部の例では、ＢＭループ型プライマーは、センサー分子間の物理的距離によって決定されるクエンチング効率（フェルスター共鳴エネルギー移動の効率）と、平衡時の開いた立体配置に存在するループ型プライマー分子の割合との間のトレードオフを特色とする。
【0093】
一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと部分的に相補的である。
【0094】
一部の実施形態では、第１のスペーシングオリゴヌクレオチドまたは任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造において一本鎖である。
【0095】
一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のプライマー配列は重複する。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のプライマー配列は重複せず、個別の配列である。
【0096】
一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドおよび任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、３～６ヌクレオチド長である。
【0097】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、１５０Å未満離れている。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、９～１００Å離れている。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、１０～５０Å離れている。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、２０～４０Å離れている。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、第２のセンサー分子、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成する場合、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、２５～３５Å離れている。
【0098】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１３、１４、または１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１６、１７、または１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも１９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第１のスペーシングオリゴヌクレオチドは、合わせると、少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【0099】
一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、６０℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、６５℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、７０℃より高い。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、８０℃より高い。
【0100】
一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、６０～８０℃である。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、７０～８０℃である。一部の実施形態では、ヘアピン構造の融解温度（Ｔｍ）は、７０～７５℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、約７２℃である。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０～６５℃でる。
【0101】
一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃より低い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０℃より低い。一部の実施形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、８０℃より低い。
【0102】
一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または（ｖｉｉ）その組合せを含む。一部の実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、第１のスペーシングオリゴヌクレオチド、任意選択の第２のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、および（ｖｉｉ）その組合せからなる群から選択される１つまたは複数を含む。
【0103】
一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーはさらに、ループ型プライマーの５’末端に第１の追加のオリゴヌクレオチドを含む。
【0104】
一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーはさらに、第１のセンサー分子と第１のクランピングオリゴヌクレオチドの間に第２の追加のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１または第２の追加のオリゴヌクレオチドはバーコード配列である。
【0105】
一部の実施形態では、標的配列は、病原体ゲノムに対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列はウイルスに対して特異的である。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的である。一部の実施形態では、標的配列はＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、配列番号２５のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、配列番号２６のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ＰＯＰ７ｂをコードするＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列はｔｂｃ１ｄ３に由来する。
【0106】
センサー分子
当技術分野で公知の様々なバイオセンサーを、本明細書に記載されるＮＢＭまたはＢＭループ型プライマーに組み込むことができる。例えば、非常に近位のまたは十分な距離で色を変化させるかまたは検出可能なシグナルを産生する分子ペア（例えば、発光タンパク質に基づくＮａｎｏＬｕｃ、Ｎａｎｏｂｉｔ、ＮｏｎｏＢＲＥＴ技術）を使用することができる。
当技術分野で公知の様々なバイオセンサーを、本明細書に記載されるＮＢＭまたはＢＭループ型プライマーに組み込むことができる。例えば、非常に近位のまたは十分な距離で色を変化させるかまたは検出可能なシグナルを産生する分子ペア（例えば、発光タンパク質に基づくＮａｎｏＬｕｃ、Ｎａｎｏｂｉｔ、ＮｏｎｏＢＲＥＴ技術）を使用することができる。
【0107】
一部の実施形態では、第１のバイオセンサーペアは、エネルギー供与体および受容体ペアである。一部の実施形態では、第１のバイオセンサーペアは、フェルスター共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体および受容体ペアである。一部の実施形態では、第１のバイオセンサーペアは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のエネルギー供与体および受容体ペアである。一部の実施形態では、第１のセンサー分子は、ＦＲＥＴフルオロフォアであり、第２のセンサー分子はＦＲＥＴクエンチャーである。一部の実施形態では、第１のセンサー分子はＦＲＥＴクエンチャーであり、第２のセンサー分子はＦＲＥＴフルオロフォアである。一部の実施形態では、第１のセンサー分子は、ＢＲＥＴエネルギー供与体であり、第２のセンサー（sensory）分子はＢＲＥＴエネルギー受容体である。一部の実施形態では、第１のセンサー分子はＢＲＥＴエネルギー受容体であり、第２のセンサー分子はＢＲＥＴエネルギー供与体である。
【0108】
一部の実施形態では、ＦＲＥＴクエンチャーは、商品名５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱとしてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な５ＩＡＢｋＦＱである。５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱは、４２０～６２０ｎｍの範囲の広い吸収スペクトルを有し、ピーク吸光度が５３１ｎｍであるＦＲＥＴクエンチャーである。このクエンチャーを、フルオレセインおよび緑色からピンク色のスペクトル範囲で放射する他の蛍光色素と共に使用することができる。一部の実施形態では、クエンチャーは、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）のいずれか、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）のいずれか、Ｚｅｎ（登録商標）クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、Ｏｎｙｘ（登録商標）クエンチャー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから入手可能）のいずれか、またはＡＴＴＯ（登録商標）クエンチャー（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨから入手可能）のいずれかである。
【0109】
一部の実施形態では、ＦＲＥＴフルオロフォアは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩｎｔ６－ＦＡＭ（アジド）の名称で入手可能なｉ６－ＦＡＭＫ（ＦＡＭ（フルオレセイン）アジド）である。この形態のＦＡＭを、クリックケミストリーを使用してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。この修飾の内部版を、ｄＴ塩基を通してオリゴに結合させることができる。ｄＴヌクレオチドを、修飾位置で付加することができる。あるいは、余分なヌクレオチドの付加を回避するために、配列中の既存のＴヌクレオチドを、必要な修飾と交換することができる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、またはＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）である。
【0110】
一実施形態では、ループ型プライマーは、内部クエンチャー（例えば、Ｚｅｎ（登録商標）またはＯｎｙｘ Ａ（登録商標））および５’フルオロフォア（例えば、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）またはＨＥＸ）を含む。
【0111】
一部の実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、検出可能な光シグナルを生成する複合体を形成することができる。一部の実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子は、ヘアピン構造が形成されると有意に減損した光シグナルを生成する。
【0112】
ＮＢＭループ型プライマーの様々な実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子の間の距離は、ヘアピン構造において０である。実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子の間のクエンチングは、「接触クエンチング」により起こり得る。
【0113】
ＢＭループ型プライマーの様々な実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子の間の距離は、ヘアピン構造において０より大きい。一部の実施形態では、第１のセンサー分子および第２のセンサー分子の間の距離は、接触クエンチングを確実にするには互いにかなり離れすぎている。実施形態では、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、クエンチングのための主要な方法であり得る。一部の実施形態では、距離は、５～２００オングストロームの範囲、好ましくは１０～１００オングストロームの範囲である。一部の実施形態では、第１のセンサー分子と第２のセンサー分子の間の３～３０塩基の距離は、クエンチング効果を提供する。
【0114】
一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、チミン（Ｔ）に結合している。一部の実施形態では、第２のセンサー分子はチミジンに結合している。第２のセンサー分子はデオキシチミジンに結合している。
【0115】
一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、チミン（Ｔ）以外の部位に結合している。一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、チミジン以外の部位に結合している。一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、デオキシチミジン以外の部位に結合している。
【0116】
一部の実施形態では、第１のセンサーおよび第２のセンサー分子は、製造効率および商業的入手可能性に基づいて選択される。一部の実施形態では、第２のセンサーは、鎖置換型ポリメラーゼのその遮断に基づいて選択される。したがって、第２のセンサーの選択は、鎖置換型ポリメラーゼに応じて変動し得る。
【0117】
例えば、製造プロセスの間、内部クエンチャーは第２のセンサー分子として好ましくなり得る。内部クエンチャーは、一般的にほとんどのオリゴヌクレオチド製造元から提供され、いかなる合成後反応もなく合成に添加することができる。これに対し、オリゴヌクレオチドの内部でｄＴ（または別の塩基、しかし、あまり一般的ではない）に付加されるほとんどのフルオロフォアは、合成後修飾を必要とする。フルオロフォアを、遮断性修飾として内部に挿入すると、クエンチャーを５’末端でオリゴヌクレオチドに付加しなければならない。５’クエンチャー修飾は、製造元によって一般的に提供されることは少ない。これらの理由から、内部クエンチャーは、第２のセンサー分子として好ましくなり得る。これは、決して方法の必要条件ではないが、商業的検討である。
【0118】
一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、鎖置換型ポリメラーゼを遮断することができる。一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、鎖置換型ポリメラーゼを遮断しない。例えば、一部のセンサー分子（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＱＳＹ７）は、ｄＴ塩基に事前にコンジュゲートされ、遮断しない。非遮断性センサー分子は、好ましくはＮＢＭループ型プライマーのために使用されるが、その必要はない。ＢＭループ型プライマーの場合、遮断性または非遮断性センサー分子のいずれかを、第２のセンサー分子として使用することができる。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、遮断性センサー分子を含む。一部の実施形態では、ＢＭループ型プライマーは、非遮断性センサー分子を含む。
【0119】
一部の実施形態では、ループ型プライマーは、５’フルオロフォア（例えば、フルオレセイン型フルオロフォア、例えばＹａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗまたはＨＥＸのホスホラミダイト）のアミド結合を使用して生成され、これは自動オリゴヌクレオチド合成の際に産生するために十分に効率的である。
【0120】
一部の実施形態では、第２のセンサー分子は、チミンから分岐するように連結した（linked off of a thymine）ＴＡＭＲＡ（非遮断性）である。
【0121】
一部の実施形態では、ループ型プライマーは、鎖置換型ポリメラーゼを遮断し得る第２のセンサー分子と共に５’アミダイトフルオロフォア、例えばＨＥＸ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、およびＴＡＭＲＡを含む。
【0122】
６．４．ループドループ増幅のためのプライマー混合物
別の態様では、本発明は、ループドループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。プライマー混合物は、本明細書に提供されるループ型プライマーを含む。プライマー混合物は、ＮＢＭループ型プライマー、ＢＭループ型プライマー、または両方を含み得る。
別の態様では、本発明は、ループドループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。プライマー混合物は、本明細書に提供されるループ型プライマーを含む。プライマー混合物は、ＮＢＭループ型プライマー、ＢＭループ型プライマー、または両方を含み得る。
【0123】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、１つのループ型プライマーを含む。一部の実施形態では、プライマー混合物は、２つまたはそれより多くのループ型プライマーを含む。
【0124】
２つまたはそれより多くのループ型プライマーを含む場合、混合物中のプライマーは、単一の標的配列または複数の標的配列に結合することができる。一部の実施形態では、複数のループ型プライマーは、複数の起源からの標的配列を検出するように設計される。例えば、混合物は、複数の病原体からの標的配列を検出するように設計された複数のループ型プライマーを含み得る。一部の実施形態では、混合物は、単一の病原体からの複数の標的配列を検出するように設計された複数のループ型プライマーを含む。
【0125】
一部の実施形態では、混合物中の全てのループ型プライマーが、ＢＭループ型プライマーである。一部の実施形態では、混合物中の全てのループ型プライマーが、ＮＢＭループ型プライマーである。一部の実施形態では、混合物は１つまたは複数のＮＢＭループ型プライマーおよび１つまたは複数のＢＭループ型プライマーを含む。
【0126】
プライマー混合物はさらに、増幅反応のための追加のプライマーを含み得る。例えば、プライマー混合物はさらに、（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および逆方向プライマー（Ｂ３）を含み得て、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、およびＢ３は、標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｉｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）を含み、ＬＦおよびＬＢは、標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。一部の実施形態では、追加のプライマー、例えば、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、またはＬＢのうちの１つは、第１の結合部位、すなわちループ型プライマーと同じ、標的配列上の結合部位に結合する。
【0127】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、１つのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、本明細書に提供されるループドループ増幅のためのループ型プライマー（ＢＭループ型プライマーまたはＮＢＭループ型プライマー）、（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および（ｉｖ）逆方向プライマー（Ｂ３）を含む。一部の実施形態では、プライマーセットはさらに、（ｉ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｉｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）を含む。
【0128】
一部の実施形態では、プライマーセットは、本明細書に提供されるループドループ増幅のためのループ型プライマー、ならびに（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および（ｉｖ）逆方向プライマー（Ｂ３）から選択される３つのプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、Ｆ３およびＢ３を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰおよびＢ３を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰおよびＦ３を含む。
【0129】
一部の実施形態では、プライマーセットは、本明細書に提供されるループドループ増幅のためのループ型プライマー、ならびに（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、（ｉｖ）逆方向プライマー（Ｂ３）、（ｖ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｖｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）から選択される５つのプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦおよびＬＢを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦおよびＬＢを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦおよびＬＢを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、ＬＦおよびＬＢを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、およびＬＦを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、ループ型プライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＢを含む。
【0130】
一部の実施形態では、プライマー混合物は２つのプライマーセットを含む。一部の実施形態ではプライマー混合物は３つのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、プライマー混合物は４つまたは５つのプライマーセットを含む。
【0131】
一部の実施形態では、各々のプライマーセットは、一意的標的配列を増幅するためである。一部の実施形態では、プライマー混合物は、同じ標的配列を増幅するために２つまたはそれより多くのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、プライマー混合物は、同じ標的配列上の同じ結合部位に結合する２つまたはそれより多くのループ型プライマーを含む。
【0132】
ループ型プライマーを、増幅反応のために最適化された任意の比率で追加のプライマーと混合することができる。一部の実施形態では、ＦＩＰは、第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＦＩＰの量とループ型プライマーの量の間の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＢＩＰは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＢＩＰの量とループ型プライマーの量の間の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＬＦは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＬＦの量とループ型プライマーの量の間の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。一部の実施形態では、ＬＢは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＬＢの量とループ型プライマーの量の間の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１である。
【0133】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に対して特異的な標的配列を検出するように設計される。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、またはＬＢは、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、Ｆ３は、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループ型プライマーは。配列番号５または７のオリゴヌクレオチドである。
【0134】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対して特異的な標的配列を検出するように設計される。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、またはＬＢは、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｆ３は、配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチドである。
【0135】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、ヒト（Homo sapiens）に対して特異的な標的配列を検出するように設計される。一部の実施形態では、Ｆ３は、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、またはＬＢは、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｆ３は、配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは、配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、およびＬＢは、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ループ型プライマーは、配列番号２２のオリゴヌクレオチドである。
【0136】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、ウイルスに対して特異的な標的配列を検出するように設計される。一部の実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0137】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるプライマー混合物を、複数の標的配列の検出のためにさらに組み合わせる。一部の実施形態では、複数の標的配列は、異なる生物に対して特異的である。例えば、複数の標的配列は、異なる病原体に対して特異的である。一部の実施形態では、複数の標的配列は、単一の生物に対して特異的である。
【0138】
したがって、一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第２のループ型プライマーを含む。
【0139】
第２のループ型プライマーは：
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は第２のバイオセンサーペアであり、および第２のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアとは異なる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含むＮＢＭループ型プライマーであり得る。
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は第２のバイオセンサーペアであり、および第２のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアとは異なる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含むＮＢＭループ型プライマーであり得る。
【0140】
第２のループ型プライマーは、
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は第２のバイオセンサーペアであり、および第２のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド、第４のセンサー分子、任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列、
を含むＢＭループ型プライマーであり得る。
第３のセンサー分子；
第３のクランピングオリゴヌクレオチド；
第３のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のセンサー分子、
（ここで、第３のセンサー分子および第４のセンサー分子は第２のバイオセンサーペアであり、および第２のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第４のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド、第４のセンサー分子、任意選択の第４のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第４のクランピングオリゴヌクレオチドは、第３および第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第２の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列、
を含むＢＭループ型プライマーであり得る。
【0141】
一部の実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドに結合することができるが、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的ではない。
【0142】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第２の順方向インナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２の逆方向インナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２の順方向プライマー（ＳＦ３）、および第２の逆方向プライマー（ＳＢ３）を含み、ＳＦＩＰ、ＳＢＩＰ、ＳＦ３、およびＳＢ３は、第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第２のループ順方向プライマー（ＳＬＦ）および（ｉｉ）第２のループ逆方向プライマー（ＳＬＢ）を含み、ＳＬＦおよびＳＬＢは、第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0143】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、第３のループ型プライマーを含む。
【0144】
一部の実施形態では、第３のループ型プライマーは、
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は第３のバイオセンサーペアであり、および第３のバイオセンサーペアは第１のバイオセンサーペアおよび第２のバイオセンサーペアとは異なる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含むＮＢＭループ型プライマーである。
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチドおよび第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は第３のバイオセンサーペアであり、および第３のバイオセンサーペアは第１のバイオセンサーペアおよび第２のバイオセンサーペアとは異なる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第２のプライマー配列
を含むＮＢＭループ型プライマーである。
【0145】
一部の実施形態では、第３のループ型プライマーは、
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は、第３のバイオセンサーペアであり、および第３のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアまたは第２のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチド、第６のセンサー分子、任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第３のプライマー配列
を含むＢＭループ型プライマーである。
第５のセンサー分子；
第５のクランピングオリゴヌクレオチド；
第５のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のセンサー分子、
（ここで、第５のセンサー分子および第６のセンサー分子は、第３のバイオセンサーペアであり、および第３のバイオセンサーペアは、第１のバイオセンサーペアまたは第２のバイオセンサーペアとは異なる）；
任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド；
第６のクランピングオリゴヌクレオチド、
（ここで、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第５のスペーシングオリゴヌクレオチド、第６のセンサー分子、任意選択の第６のスペーシングオリゴヌクレオチド、および第６のクランピングオリゴヌクレオチドは、第５および第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる）；および
第３の標的配列上の第１の結合部位と相補的な第３のプライマー配列
を含むＢＭループ型プライマーである。
【0146】
一部の実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドに結合するが、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的ではない。
【0147】
一部の実施形態では、プライマー混合物はさらに、（ｉ）第３の順方向インナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３の逆方向インナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３の順方向プライマー（ＴＦ３）、および第３の逆方向プライマー（ＴＢ３）を含み、ＴＦＩＰ、ＴＢＩＰ、ＴＦ３、およびＴＢ３は、第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0148】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第３のループ順方向プライマー（ＴＬＦ）および（ｉｉ）第３のループ逆方向プライマー（ＴＬＢ）を含み、ＴＬＦおよびＴＬＢは第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0149】
一部の実施形態では、プライマー混合物は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのループ型プライマーを含む。プライマー混合物が２つまたはそれより多くのループ型プライマーを含む場合、各々のループ型プライマーは、各々が独自の検出シグナルを提供する一意的バイオセンサーペアを含み得る。一部の実施形態では、各々のバイオセンサーペアは、一意的な視覚的検出シグナル（例えば、一意的な色）を提供する。一部の実施形態では、各々のバイオセンサーペアは、一意的色素分子を含む。
【0150】
一部の実施形態では、プライマー混合物中の２つまたはそれより多くのループ型プライマーは、同一のバイオセンサーペアを含む。一部の実施形態では、プライマー混合物中の２つまたはそれより多くのループ型プライマーは、ＦＡＭによって標識される。一部の実施形態では、プライマー混合物中の２つの異なるループ型プライマーは、ＦＡＭによって標識される。
【0151】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるプライマー混合物は、凍結乾燥される。乾燥プライマー混合物は、本明細書に記載されるループ型プライマーまたはプライマー混合物のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのループ型プライマーを含むプライマー混合物を凍結乾燥する。一部の実施形態では、プライマー混合物は、凍結乾燥ビーズの形態にある。
【0152】
６．５．ループドループ増幅のためのキット
別の態様では、ループドループ増幅のためのキットを提供する。キットは、本明細書に提供されるループ型プライマーまたはプライマー混合物のいずれかを含み得る。
別の態様では、ループドループ増幅のためのキットを提供する。キットは、本明細書に提供されるループ型プライマーまたはプライマー混合物のいずれかを含み得る。
【0153】
一部の実施形態では、キットは、１つのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、本明細書に提供されるループドループ増幅のためのループ型プライマー、（ｉ）順方向インナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）逆方向インナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）順方向プライマー（Ｆ３）、および逆方向プライマー（Ｂ３）を含む。一部の実施形態では、プライマーセットはさらに、（ｉ）ループ順方向プライマー（ＬＦ）および（ｉｉ）ループ逆方向プライマー（ＬＢ）を含む。
【0154】
一部の実施形態では、キットは、２つのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、キットは、３つのプライマーセットを含む。一部の実施形態では、キットは、４つまたは５つのプライマーセットを含む。
【0155】
一部の実施形態では、キットは、単一の容器に含有される複数のプライマーセットを含む。一部の実施形態では、キットは、各々のプライマーセットが個別の容器に個々に含有される複数のプライマーセットを含む。
【0156】
一部の実施形態では、キットはさらに、ポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼである。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｎＳｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢから入手可能）である。一部の実施形態では、キットは、２つまたはそれより多くのポリメラーゼを含む。
【0157】
一部の実施形態では、キットはさらに、他の反応酵素、例えば、逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴｘ逆転写酵素（ＮＥＢから入手可能）である。一部の実施形態では、キットはさらに、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ブタまたはマウスＲＮａｓｅ阻害剤である。
【0158】
一部の実施形態では、キットはさらに、増幅反応のための試薬を含む。一部の実施形態では、試薬は、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、および緩衝液を含む。一部の実施形態では、緩衝液は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、緩衝液は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む。一部の実施形態では、試薬はトレハロースを含む。一部の実施形態では、試薬はスクロースを含む。一部の実施形態では、試薬は安定化のためのポリマーを含む。増幅試薬は、ポリメラーゼに応じて選択および最適化することができる。
【0159】
一部の実施形態では、キットは、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、緩衝液を含む混合物、ループドループ増幅のための１つまたは複数のプライマーセット、およびポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、キットは、ｄＮＴＰを含む混合物、ループドループ増幅のための１つまたは複数のプライマーセット、ポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮａｓｅ阻害剤を含む。
【0160】
一部の実施形態では、混合物は液体形態である。一部の実施形態では、混合物は乾燥形態である。一部の実施形態では、混合物は、凍結乾燥粉末、ビーズ、またはペレットに製剤化される。
【0161】
一部の実施形態では、キットはさらに、増幅反応のためのデバイスを含む。一部の実施形態では、キットは、ループ型プライマー媒介等温増幅のためのデバイスを含む。
【0162】
一部の実施形態では、キットはさらに、増幅反応を実行するための反応チューブを含む。一部の実施形態では、キットはさらに、増幅反応の前に試料の濾過または精製のための成分を含む。
【0163】
一部の実施形態では、キットは、感染疾患の診断のためである。一部の実施形態では、キットは、病原体、例えばクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）感染症の診断のためである。一部の実施形態では、キットは、一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異の決定のために使用される。一部の実施形態では、キットは、突然変異体の遺伝子型の決定のために使用される。一部の実施形態では、キットは、薬物耐性表現型に関連する突然変異体遺伝子型の決定のために使用される。例えば、薬物耐性マーカー、例えばセフトリアキゾン／セフィキシム耐性マーカー、キノロン（シプロフロキサシン）耐性マーカー、マクロライド耐性マーカー（アジスロマイシン）を検出することができる。
【0164】
６．６．ループドループ増幅法
別の態様では、ループドループ増幅法を提供する。方法は以下のステップ：
試料を提供するステップ；
（ｉ）プライマー、プライマー混合物、または本明細書に提供される乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた復元されたプライマー混合物、および（ｉｉ）ポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成するステップ；ならびに
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートするステップ
を含み得る。
別の態様では、ループドループ増幅法を提供する。方法は以下のステップ：
試料を提供するステップ；
（ｉ）プライマー、プライマー混合物、または本明細書に提供される乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた復元されたプライマー混合物、および（ｉｉ）ポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成するステップ；ならびに
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートするステップ
を含み得る。
【0165】
反応温度を、ポリメラーゼおよび標的配列に応じて調節することができる。一部の実施形態では、インキュベーションは、５０～７０℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、５５～７０℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、６０～６５℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、６２～６５℃で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃で実施される。
【0166】
一部の実施形態では、方法はさらに、反応混合物からシグナルを検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、蛍光シグナルを検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、色または濁度の変化を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、非視覚的シグナルを検出するステップを含む。一部の実施形態では、検出するステップは、インキュベーションステップの間に実施される。一部の実施形態では、検出するステップは、インキュベーションステップの完了後に実施される。一部の実施形態では、シグナルは、リアルタイムで検出される。一部の実施形態では、シグナルは、リアルタイムで記録され、インキュベーションステップの完了後に分析される。
【0167】
一部の実施形態では、方法はさらに、ループドループ増幅のための試料を調製するステップを含む。一部の実施形態では、試料を調製するステップは、ＲＮＡ分子を逆転写酵素と相互作用させて、それによってＤＮＡ分子を含む試料を生成するステップを含む。一部の実施形態では、試料を調製するステップはさらに、逆転写酵素と相互作用する前にＲＮＡ分子を含有する試料または反応混合物を事前に加熱するステップを含む。
【0168】
一部の実施形態では、ループドループ増幅のための試料は、精製ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス全部、ヒト細胞全部、唾液もしくは鼻スワブ、または鼻もしくは鼻咽頭スワブを含む。一部の実施形態では、試料は、膣スワブからのゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、細菌全部、またはヒト細胞全部を含む。一部の実施形態では、ループドループ増幅のための試料は、未処理試料である。一部の実施形態では、ループドループ増幅のための試料は精製試料である。
【0169】
一部の実施形態では、１つより多くのタイプのシグナルを検出する。一部の実施形態では、複数の蛍光または他の可視シグナルを検出する。一部の実施形態では、複数のシグナルを検出して、複数の標的配列の存在または非存在を決定する。一部の実施形態では、複数のシグナルを検出して、単一の標的配列の存在または非存在を確認する。一部の実施形態では、複数のシグナルを検出して、方法に対する追加の感度および特異度を提供する。
【0170】
標的配列を増幅するため、当技術分野で公知の様々な増幅法を使用することができる。
【0171】
典型的な実施形態では、ループ媒介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）を、標的核酸のループドループ増幅のために使用する。ＬＡＭＰは、ヌクレオチド塩基を、伸長するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に塩基特異的に付加して、相補的配列と二本鎖核酸を形成する、ポリメラーゼとして知られる酵素の鎖置換活性に依存する等温ＤＮＡ増幅法である。等温増幅法では、鎖置換型ポリメラーゼ、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（GeoBacillus stearothermophilus）細菌からのポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼおよびそのバリアント）は、それらが相補鎖を重合すると二本鎖ＤＮＡの１つの鎖を置換し、それによってサーマルサイクリングを必要としない。
【0172】
ＬＡＭＰ法は、標的ＤＮＡ配列の６つの別個の領域を認識するように特異的に設計された４つの異なるプライマー（Ｆ３、Ｂ３、順方向インナープライマーまたはＦＩＰ、および逆方向インナープライマーまたはＢＩＰ）を使用することができる。反応速度を改善するために、２つの追加の「ループ」プライマーを添加してもよい。反応混合物中のプライマーの濃度は、異なり得るが、典型的にはＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに関して１．６μＭに設定され、順方向および逆方向ループプライマー（ＬＦ、ＬＢ）に関しては０．８μＭ、ならびにＦ３およびＢ３プライマーに関して０．２μＭに設定される。ＬＡＭＰ法の一部の実施形態では、５つのプライマーを利用してもよい（２つの可能性があるＬＡＭＰプライマーのうちの１つのみを使用する）。ＬＡＭＰ反応は、鎖置換反応を使用して一定の温度（およそ６５℃）で進行する。標的の増幅および検出は、試料、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、および基質を一定温度でインキュベートすることによって１ステップで完了し得る。ＬＡＭＰのための典型的な混合物の組成物は、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔポリメラーゼ、上記の濃度のプライマー、および水を含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調節した。反応体積は、典型的に５μＬ～５０μＬの間である。反応の温度は、使用される特定の酵素およびプライマーに関して最適化され、反応は、５～６０分間進行する。ＬＡＭＰは、非常に感度が高く、特異的、および効率的である。
【0173】
ＬＡＭＰは、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ標的（ＲＮＡ標的は最初にＤＮＡへの逆転写を必要とする）を増幅するために６つの標的部位（例えば、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰ）を認識する少なくとも４つのプライマーに依存する。ループプライマー（例えば、ＬＦおよびＬＢ）を含む場合、標的核酸における全体で８個の一意的部位が、６つのプライマーによって認識される。本明細書に提供される様々な実施形態では、全体で８個の一意的部位の１つが本明細書に記載されるループ型プライマーによって認識され得る。標的が試料に存在する場合、増幅反応が起こり得て、大量のＤＮＡを提供し得る。
【0174】
本明細書に記載される新規ループドループ法を、ＬＡＭＰ以外の他の等温増幅法に適用してもよい。多数の等温増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の温度サイクリング依存性に対処するために作成されている。これらの方法は、かなり変動し得るが、それらは全て、一部の特色を共通に有する。例えば、ＤＮＡ鎖は、熱変性しないことから、全ての等温法は、増幅反応のプライマー結合および開始を可能にする代替アプローチに依存する。反応が始まると、ポリメラーゼは、目的の配列になおもアニールしている鎖を置換しなければならない。等温法は、典型的に、二重鎖ＤＮＡを分離するためにＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を使用する。この能力を有するポリメラーゼは、中等度の温度反応（２５～４０℃）の場合はクレノウ断片（３’－５’エキソ）、Ｂｓｕラージ断片、およびｐｈｉ２９を含み、高温（５０～６５℃）の反応の場合はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージ断片を含む。ＲＮＡ種を検出するために、反応温度と適合性の逆転写酵素を添加して、増幅の等温的性質を維持する。ｄｓＤＮＡを分離するための鎖置換機構に加えて、等温法は、開始のために最初に変性することを避けるための酵素またはプライマーの設計を必要とし得る。
【0175】
上記のように、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）は、標的ＤＮＡの６～８個の別個の領域を認識する４～６個のプライマーを使用する。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが、合成を開始し、プライマーの２つがループ構造を形成して、その後の増幅ラウンドを容易にする。ＬＡＭＰは、迅速で感度がよく、増幅は非常に広範囲にわたるために、ＬＡＭＰは、フィールド診断にとって十分に好適である。ループドループプライマーを、インナーおよび／またはループプライマーの単一のまたは任意の組合せのために使用してもよい。
【0176】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、典型的にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージ断片またはクレノウ断片（３’－５’エキソ－）に依存して、プライマーに含有される部位で鎖限定制限エンドヌクレアーゼまたはニッキング酵素によって作製されるニックで始まる。ＳＤＡは、１つのフォワードおよび１つのリバースプライマー、ならびに１つのバンピングフォワードプライマーおよび１つのバンピングリバースプライマーを必要とする。ニッキング部位は、各ポリメラーゼ置換ステップで再生され、指数的増幅をもたらす。ＳＤＡは、典型的に臨床診断において使用される。既存の蛍光モニタリング技術がＳＤＡに関して存在するが（Nadeau et al., Real-Time, Sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification, 276m 2 177-187 (1999)）、蛍光を生成するために制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用に依存する。フォワードまたはリバースＳＤＡプライマーのいずれかを、ループドループ法と共に使用するために適合させることができるが、この方法ではフルオロフォアとクエンチャー対の間に切断部位が位置する必要はない。切断部位は、プライマーの３’末端に向かってループドループプライマーのクランピング配列の次に存在し、そのため、制限エンドヌクレアーゼによってプライマーが切断される前に、相補鎖上でポリメラーゼによるプライマーの５’末端の完全な伸長により、蛍光が産生される。
【0177】
ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）は、ヘリカーゼの二本鎖ＤＮＡ巻き戻し活性を使用して鎖を分離し、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーのアニーリングおよび伸長を可能にする。ＰＣＲと同様に、このシステムは２つのみのプライマー、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを必要とする。ＨＤＡは、いくつかの診断デバイスおよびＦＤＡ承認試験において使用されている。ＨＤＡにおける任意のプライマーを、ループドループ法と共に使用するために適合させて、反応のリアルタイムの閉管モニタリングをリアルタイムで生じることができる。ＨＤＡでは、ヘリカーゼ酵素は、ループドループプライマーのループ構造を開くことができ、これを、一本鎖結合タンパク質によって安定化させることができ、次にＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖蛍光アンプリコンにすることができる。
【0178】
ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用してニッキング酵素によって作製されたニックで始まり、標的配列からの多くの短い核酸を迅速に産生する。このプロセスは、極めて迅速かつ感度が高く、少量の標的の数分での検出を可能にする。ＮＥＡＲは、臨床および生体安全応用において病原体検出のために一般的に使用される。ＮＥＡＲのフォワードまたはリバースプライマーはいずれも、ループドループ法を使用して、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによるループの伸長を介してリアルタイム蛍光を生成することができる。
【0179】
６．７．使用方法
本明細書に提供されるループドループ増幅法を使用して、様々な起源からの標的配列を検出することができる。例えばループドループ増幅法を使用して、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、古細菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、原生生物ゲノム、原核生物ゲノム、または真核生物ゲノムに対して特異的な標的配列を検出することができる。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＡ（例えば、ポジティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＲＮＡ）、またはＤＮＡを検出するために使用される。一部の実施形態では、方法は、合成により生成された標的配列を検出するために使用される。
本明細書に提供されるループドループ増幅法を使用して、様々な起源からの標的配列を検出することができる。例えばループドループ増幅法を使用して、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、古細菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、原生生物ゲノム、原核生物ゲノム、または真核生物ゲノムに対して特異的な標的配列を検出することができる。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＡ（例えば、ポジティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＲＮＡ）、またはＤＮＡを検出するために使用される。一部の実施形態では、方法は、合成により生成された標的配列を検出するために使用される。
【0180】
一部の実施形態では、ループドループ法は、病原体に対して特異的なＤＮＡを検出するために使用される。一部の実施形態では、病原体はウイルス、細菌、真菌、原虫、またはワームである。一部の実施形態では、ループドループ法を使用して、ＳＴＤに関連する病原体を検出する。一部の実施形態では、病原体は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）である。一部の実施形態では、病原体は淋菌（Neisseria gonorrhoeae）である。一部の実施形態では、病原体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0181】
一部の実施形態では、ループドループ法は、感染症の診断のために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、突然変異体遺伝子型の決定のために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、薬物耐性表現型に関連する突然変異体遺伝子型を決定するために使用される。例えば、薬物耐性マーカー、例えばセフトリアキゾン／セフィキシム耐性マーカー、キノロン（シプロフロキサシン）耐性マーカー、マクロライド耐性マーカー（アジスロマイシン）を検出することができる。
【0182】
一部の実施形態では、ループドループ法は、一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、突然変異を決定するために使用される。
【0183】
一部の実施形態では、ループドループ法は、単一の標的を検出するために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、１つより多くの標的を検出するために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、２、３、４、または５つの標的を検出するために使用される。
【0184】
一部の実施形態では、ループドループ法は、試料の分析または特徴付けのために使用される。一部の実施形態では、ループドループ法は、試料の起源を同定するために使用される。例えば、ループドループ法は、ヒト試料を同定するために使用される。
【0185】
本明細書に記載されるループドループ法を、様々な試料の分析に使用することができる。一部の実施形態では、血液、尿、精液、組織、または唾液試料を分析する。一部の実施形態では、試料を、動物またはヒト患者から収集する。一部の実施形態では、精製試料を分析する。一部の実施形態では、未処理試料を分析する。一部の実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス全部、ヒト細胞全部、唾液もしくは鼻スワブ、または中鼻甲介もしくは鼻咽頭スワブを含む。一部の実施形態では、試料は、膣スワブからのゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、細菌全部またはヒト細胞全部を含む。
【実施例】
【0186】
６．８．実施例
以下の実施例は、例証のために提供され、限定ではない。
以下の実施例は、例証のために提供され、限定ではない。
【0187】
[実施例１]
６．８．１．実施例１：インターカレート色素（ＳＹＴＯ）を使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＬＡＭＰアッセイ
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡおよび淋菌（Niesseria gonorrhea）ゲノムＤＮＡを個別に検出するために、ＬＡＭＰ反応混合物を調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６、８～１４）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、２．５μＭ ＳＹＴＯ ８５インターカレート色素、および水と共に含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍希釈した。標的ＤＮＡ、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリーの緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加した。反応温度は６５℃であり、反応を、ＳＹＴＯ ８５蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定するために使用した。反応を６０分間実行した。図２Ａに示すデータは、各３つのゲノムＤＮＡ標的レベル、つまり、高い（保存液濃度）、低い（Ｃｔに関してＤＮＡ保存液の１０－５倍希釈液、Ｎｇに関してＤＮＡ保存液の１０－６倍希釈液）、および鋳型なし対照（ＤＮＡなし（ＮＴＣ））に関する、インターカレート色素によってモニターしたクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（緑色）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（青色）のＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間をとった代表的な曲線を示す。
６．８．１．実施例１：インターカレート色素（ＳＹＴＯ）を使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＬＡＭＰアッセイ
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡおよび淋菌（Niesseria gonorrhea）ゲノムＤＮＡを個別に検出するために、ＬＡＭＰ反応混合物を調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６、８～１４）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、２．５μＭ ＳＹＴＯ ８５インターカレート色素、および水と共に含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍希釈した。標的ＤＮＡ、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリーの緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加した。反応温度は６５℃であり、反応を、ＳＹＴＯ ８５蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定するために使用した。反応を６０分間実行した。図２Ａに示すデータは、各３つのゲノムＤＮＡ標的レベル、つまり、高い（保存液濃度）、低い（Ｃｔに関してＤＮＡ保存液の１０－５倍希釈液、Ｎｇに関してＤＮＡ保存液の１０－６倍希釈液）、および鋳型なし対照（ＤＮＡなし（ＮＴＣ））に関する、インターカレート色素によってモニターしたクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（緑色）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（青色）のＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間をとった代表的な曲線を示す。
【0188】
[実施例２]
６．８．２．実施例２：ループドループ増幅によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号９～１５）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、および水と共に含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリーの緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内で９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって推定した。
６．８．２．実施例２：ループドループ増幅によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号９～１５）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、および水と共に含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリーの緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内で９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって推定した。
【0189】
【表1】
【0190】
[実施例３]
６．８．３．実施例３：ループドループ増幅による淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６～８）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、および水を含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリー緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図２Ｂ～２Ｃに示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間とった代表的な曲線を示す。図２Ｂは、図２Ａに示すように、ループドループアッセイからのシグナルを、ループドループプライマーの非存在下およびＳＹＴＯ ８５色素の存在下で実施したＬＡＭＰアッセイのシグナルと比較する。ループドループアッセイは、陽性増幅の場合にはかなり大きいシグナルを提供する。図２Ｃでは、ループドループアッセイの再現性を実証し、ならびにバックグラウンド蛍光は無視できる程度であり、鋳型なし対照では低減された遅い、偽の増幅産物を実証した。図４に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光シグナル（任意の単位）および水平軸に時間をとった（各「サイクル」は、３０秒間を表す）代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって段階希釈試験結果から推定した。
６．８．３．実施例３：ループドループ増幅による淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６～８）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、および水を含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリー緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図２Ｂ～２Ｃに示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間とった代表的な曲線を示す。図２Ｂは、図２Ａに示すように、ループドループアッセイからのシグナルを、ループドループプライマーの非存在下およびＳＹＴＯ ８５色素の存在下で実施したＬＡＭＰアッセイのシグナルと比較する。ループドループアッセイは、陽性増幅の場合にはかなり大きいシグナルを提供する。図２Ｃでは、ループドループアッセイの再現性を実証し、ならびにバックグラウンド蛍光は無視できる程度であり、鋳型なし対照では低減された遅い、偽の増幅産物を実証した。図４に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光シグナル（任意の単位）および水平軸に時間をとった（各「サイクル」は、３０秒間を表す）代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって段階希釈試験結果から推定した。
【0191】
【表2】
【0192】
[実施例４]
６．８．４．実施例４：ループドループ増幅によるヒト（Homo sapiens）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、ヒト（Homo sapiens）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１６～２２）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、ならびに水を含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリー緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、ヒト（Homo sapiens）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって推定した。
６．８．４．実施例４：ループドループ増幅によるヒト（Homo sapiens）の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、ヒト（Homo sapiens）ゲノムＤＮＡを検出するために調製した。反応は、１０μＬ体積で調製され、以下の試薬：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１６～２２）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、ならびに水を含有し、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した保存溶液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で１０倍または２倍（よりよい解像度のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈液、または鋳型なし対照のためのＤＮＡフリー緩衝液１μＬを、各ＰＣＲチューブ内の９μＬ溶液混合物に添加し、いくつかの対数濃度範囲にわたって濃度あたり最大２０の反復実験を使用して、アッセイ感度を調べた。反応温度は６５℃であり、反応を、ループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、ヒト（Homo sapiens）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。次に、アッセイ感度（検出限界、５０％および９５％確率）を、アッセイのエンドポイント決定に基づくＰＲＯＢＩＴ解析によって推定した。
【0193】
【表3】
【0194】
[実施例５]
６．８．５．実施例５：ループドループ増幅のための乾燥プライマー混合物
フリーズドライした試薬への製剤化を、５ステップのフリーズドライプロトコールによって施設内凍結乾燥試験によって実施した。淋菌（Neisseria gonorrhoeae）を検出するように設計されたループドループＬＡＭＰ反応混合物を、チューブあたり２５μＬ体積で調製し、各チューブに分注した。凍結乾燥混合物は、以下の試薬：１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、グリセロールフリー製剤としての０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６～８）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、５％トレハロース、および水（反応あたり最大２５μＬ）を含有した。チューブの蓋を凍結乾燥のために除去した。チューブ片を、製薬および生物工学産業において標準的な機器の一部である加熱棚式凍結乾燥ユニットの金属棚上に置いた。凍結乾燥器を５ステップで実行するようにプログラムした。ステップ１：コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を４１°Ｆに３０分間冷却。コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を２３Ｆに、３０分間冷却。ステップ３：コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を－２３Ｆに２時間冷却。ステップ４：コンデンサーＯＮ、真空ＯＮ、棚および試薬を－２３Ｆで１０時間維持。ステップ５：コンデンサーＯＮ、真空ＯＮ、棚および試薬を７７Ｆに５時間加熱。このプロセスの完了後、チューブを取り出して蓋をし、図７に示される産物を生じた。フリーズドライアッセイの活性を、様々な環境条件で一定期間にわたってインキュベーション後に試験した。図８は、再水和させた反応の代表的なリアルタイムループドループＬＡＭＰアッセイ活性を表す。再水和プロトコールは、再水和緩衝液２４μＬを、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）標的ゲノムＤＮＡ１μＬと共に乾燥試薬に添加することからなった。再水和緩衝液は：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、および水で構成され、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。緩衝液を、チューブに添加し、これを再度密封し、次にボルテックスミキサーでの攪拌または混合することなくリアルタイムｑＰＣＲ機器に直接入れた。反応温度は６５℃であり、反応を、およびループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を、６０分間実行した。図８に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。凍結乾燥したループドループアッセイの速度、感度、および特異度は、新たに製剤化した場合のアッセイ速度、感度、および特異度とは差がないことが見出された。さらに、蛍光の大きさは、乾燥および再水和によって影響を受けず、ループドループ法が、病原体の検出のための貯蔵安定なｉｎ ｖｉｔｒｏ診断キットを提供することができることを示す。
６．８．５．実施例５：ループドループ増幅のための乾燥プライマー混合物
フリーズドライした試薬への製剤化を、５ステップのフリーズドライプロトコールによって施設内凍結乾燥試験によって実施した。淋菌（Neisseria gonorrhoeae）を検出するように設計されたループドループＬＡＭＰ反応混合物を、チューブあたり２５μＬ体積で調製し、各チューブに分注した。凍結乾燥混合物は、以下の試薬：１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、グリセロールフリー製剤としての０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、プライマー（配列番号１～４、６～８）のＦＩＰおよびＢＩＰを１．６μＭ、ＬＦおよびＬＦ－ＬｄＬを０．４μＭ、ＬＢを０．８μＭ、Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、５％トレハロース、および水（反応あたり最大２５μＬ）を含有した。チューブの蓋を凍結乾燥のために除去した。チューブ片を、製薬および生物工学産業において標準的な機器の一部である加熱棚式凍結乾燥ユニットの金属棚上に置いた。凍結乾燥器を５ステップで実行するようにプログラムした。ステップ１：コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を４１°Ｆに３０分間冷却。コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を２３Ｆに、３０分間冷却。ステップ３：コンデンサーＯＮ、真空ＯＦＦ、棚および試薬を－２３Ｆに２時間冷却。ステップ４：コンデンサーＯＮ、真空ＯＮ、棚および試薬を－２３Ｆで１０時間維持。ステップ５：コンデンサーＯＮ、真空ＯＮ、棚および試薬を７７Ｆに５時間加熱。このプロセスの完了後、チューブを取り出して蓋をし、図７に示される産物を生じた。フリーズドライアッセイの活性を、様々な環境条件で一定期間にわたってインキュベーション後に試験した。図８は、再水和させた反応の代表的なリアルタイムループドループＬＡＭＰアッセイ活性を表す。再水和プロトコールは、再水和緩衝液２４μＬを、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）標的ゲノムＤＮＡ１μＬと共に乾燥試薬に添加することからなった。再水和緩衝液は：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、および水で構成され、ｐＨを２０℃で８．８に調整した。緩衝液を、チューブに添加し、これを再度密封し、次にボルテックスミキサーでの攪拌または混合することなくリアルタイムｑＰＣＲ機器に直接入れた。反応温度は６５℃であり、反応を、およびループドループプライマーから放出されたＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を、６０分間実行した。図８に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈液に関する、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループドループＬＡＭＰ反応からの垂直軸にリアルタイム蛍光（任意の単位）および水平軸に時間（各「サイクル」は３０秒間を表す）をとった代表的な曲線を示す。凍結乾燥したループドループアッセイの速度、感度、および特異度は、新たに製剤化した場合のアッセイ速度、感度、および特異度とは差がないことが見出された。さらに、蛍光の大きさは、乾燥および再水和によって影響を受けず、ループドループ法が、病原体の検出のための貯蔵安定なｉｎ ｖｉｔｒｏ診断キットを提供することができることを示す。
【0195】
[実施例６]
６．８．６．実施例６：ループドループ増幅の温度
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、上記のように調製し、１つはＯＲＦ１ａｂプライマーセットを含み、他方はＰＯＰ７ｂプライマーセットを含んだ。ＯＲＦ１ａｂプライマーセットは、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して特異的である。ＰＯＰ７ｂプライマーセットは、ＤＮＡ鋳型として天然に存在しないヒトＲＮＡ標的に対して特異的である；したがって、このプライマーセットは、試料中のヒトＲＮＡの特異的指標として有用である。両方の例において、ループドループを使用して、ＬＡＭＰのために使用される６つの構成要素プライマーの１つを修飾し、第７のループ型プライマーを作製した。ループ型プライマーは、フルオロフォアおよびクエンチャー対を利用して、観察可能なシグナルを生成した。この実験に関して、各プライマーセットに関するＲＮＡ標的の配列に対応するそのポジティブセンス鎖上の配列を含有する合成二本鎖ＤＮＡ鋳型の中等度に高い濃度を、ＬＡＭＰ反応温度最適化のための標的として利用し、逆転写ステップによる変動または希釈した標的で起こる確率論的ノイズを最小限にした。標的ＤＮＡ希釈液を、３８４ウェルプレート内の混合物に添加した。それらを、５５～７０℃の範囲の様々な温度でインキュベートし、反応を、ループドループプライマーから放出されるＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。実験を、重複する温度範囲で２回実施し（第１の試験および第２の試験）、データを図９Ａおよび９Ｂに示す。図面は、検出にとって十分なシグナルを得るために必要な時間を示す。結果は、プライマーセットが幅広い温度範囲で活性であることを示している。例えば、ＰＯＰ７ｂおよびＯＲＦ１ａｂプライマーセットの両方に関して、約５７～７０℃が許容範囲であった。最適な成績は、６０℃～６８℃の間で達成された。
６．８．６．実施例６：ループドループ増幅の温度
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、上記のように調製し、１つはＯＲＦ１ａｂプライマーセットを含み、他方はＰＯＰ７ｂプライマーセットを含んだ。ＯＲＦ１ａｂプライマーセットは、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して特異的である。ＰＯＰ７ｂプライマーセットは、ＤＮＡ鋳型として天然に存在しないヒトＲＮＡ標的に対して特異的である；したがって、このプライマーセットは、試料中のヒトＲＮＡの特異的指標として有用である。両方の例において、ループドループを使用して、ＬＡＭＰのために使用される６つの構成要素プライマーの１つを修飾し、第７のループ型プライマーを作製した。ループ型プライマーは、フルオロフォアおよびクエンチャー対を利用して、観察可能なシグナルを生成した。この実験に関して、各プライマーセットに関するＲＮＡ標的の配列に対応するそのポジティブセンス鎖上の配列を含有する合成二本鎖ＤＮＡ鋳型の中等度に高い濃度を、ＬＡＭＰ反応温度最適化のための標的として利用し、逆転写ステップによる変動または希釈した標的で起こる確率論的ノイズを最小限にした。標的ＤＮＡ希釈液を、３８４ウェルプレート内の混合物に添加した。それらを、５５～７０℃の範囲の様々な温度でインキュベートし、反応を、ループドループプライマーから放出されるＦＡＭ蛍光を介してモニターした。リアルタイムＰＣＲ機器を使用して、反応を加熱すると共にリアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。実験を、重複する温度範囲で２回実施し（第１の試験および第２の試験）、データを図９Ａおよび９Ｂに示す。図面は、検出にとって十分なシグナルを得るために必要な時間を示す。結果は、プライマーセットが幅広い温度範囲で活性であることを示している。例えば、ＰＯＰ７ｂおよびＯＲＦ１ａｂプライマーセットの両方に関して、約５７～７０℃が許容範囲であった。最適な成績は、６０℃～６８℃の間で達成された。
【0196】
[実施例７]
６．８．７．実施例７：精製標的および未処理標本中の標的の両方を検出するための多重化ループドループ反応
図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃはそれぞれ、ＯＲＦ１ａｂおよびＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的配列のループドループ増幅からの２つの蛍光シグナルを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａｂ（ＦＡＭ）およびＰＯＰ７ｂヒト内部対照（Ｃｙ５）からのシグナルを示す。３つのタイプの試料、つまり、標的配列を有しない対照試料（鋳型なし対照）（図１４Ａ）、ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、および熱不活化型ウイルスの形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列と組み合わせたヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）を使用した。ヒト鼻スワブを、ボランティアから自己収集し、試料の処理または核酸抽出を行うことなく、反応に直接添加した。スワブを、数秒間ひねることによって反応混合物に溶出させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性反応に添加したインタクトの熱不活化ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）として反応に導入した。ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬ－ＦＡＭおよびＰＯＰ７ｂ ＬｄＬ－Ｃｙ５プライマーセットを、反復反応体積中１：１の比で二重化した。両方のプライマーセットを、非標識プライマーアナログと比較して１：３の比でＬｄＬプライマーを利用した（２５％強度）。反応は、逆転写酵素、鎖置換型ポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤を含有した。リアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ－３８４（登録商標））を使用して、反応をセ氏５５．６度で２．５分間インキュベートし、次に反応をセ氏６３．５度で６０分間インキュベートし、その間にＦＡＭおよびＣｙ５の蛍光測定を記録した。予想されたように、鋳型対照反復実験は、６０分間にわたってループドループ蛍光シグナルを示さなかった。ＣＯＶＩＤ－１９陰性鼻スワブ試料を含有する反応は、Ｃｙ５蛍光の増加によって証明されるように、ＰＯＰ７ｂシグナルの増幅を示したが、ＯＲＦ１ａｂシグナルは、平坦（陰性）のままであった。熱不活化ウイルスを添加した試料は、単一の反応容器中で両方のＲＮＡ標的のスペクトルの二重化検出を示した。結果は、ループドループＲＴ－ＬＡＭＰが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的の単一チューブスペクトル多重化を許容することを示している。
６．８．７．実施例７：精製標的および未処理標本中の標的の両方を検出するための多重化ループドループ反応
図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃはそれぞれ、ＯＲＦ１ａｂおよびＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的配列のループドループ増幅からの２つの蛍光シグナルを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａｂ（ＦＡＭ）およびＰＯＰ７ｂヒト内部対照（Ｃｙ５）からのシグナルを示す。３つのタイプの試料、つまり、標的配列を有しない対照試料（鋳型なし対照）（図１４Ａ）、ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、および熱不活化型ウイルスの形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列と組み合わせたヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）を使用した。ヒト鼻スワブを、ボランティアから自己収集し、試料の処理または核酸抽出を行うことなく、反応に直接添加した。スワブを、数秒間ひねることによって反応混合物に溶出させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性反応に添加したインタクトの熱不活化ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）として反応に導入した。ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬ－ＦＡＭおよびＰＯＰ７ｂ ＬｄＬ－Ｃｙ５プライマーセットを、反復反応体積中１：１の比で二重化した。両方のプライマーセットを、非標識プライマーアナログと比較して１：３の比でＬｄＬプライマーを利用した（２５％強度）。反応は、逆転写酵素、鎖置換型ポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤を含有した。リアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ－３８４（登録商標））を使用して、反応をセ氏５５．６度で２．５分間インキュベートし、次に反応をセ氏６３．５度で６０分間インキュベートし、その間にＦＡＭおよびＣｙ５の蛍光測定を記録した。予想されたように、鋳型対照反復実験は、６０分間にわたってループドループ蛍光シグナルを示さなかった。ＣＯＶＩＤ－１９陰性鼻スワブ試料を含有する反応は、Ｃｙ５蛍光の増加によって証明されるように、ＰＯＰ７ｂシグナルの増幅を示したが、ＯＲＦ１ａｂシグナルは、平坦（陰性）のままであった。熱不活化ウイルスを添加した試料は、単一の反応容器中で両方のＲＮＡ標的のスペクトルの二重化検出を示した。結果は、ループドループＲＴ－ＬＡＭＰが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト標的の単一チューブスペクトル多重化を許容することを示している。
【0197】
ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬプライマーセットによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多重化ループドループ試験は、未処理試料による反応が以下の表に提供されるように良好な結果を提供したことから、ＰＣＲ試験と同程度の感度であり、抽出を必要としなかった。ＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットを、内部対照として使用した。インタクト熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）の段階希釈液を、二重化ループドループ反応に添加し、リアルタイムのシグナル展開に関してモニターした。アッセイの検出限界を、試験キットの特定のフォーマットに関してＬｏＤ９５＝４００ｃｐ／ｓｗａｂ＝２．７ｘ１０３ｃｐ／ｍＬとして推定した。
【0198】
【表4】
【0199】
三重化ループドループ反応もまた、単一チューブで試験した。これは、３つの標的の特異的増幅を示し、迅速な結果までの時間を維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの２つの異なる標的を、ＦＡＭフルオロフォアによって標識した２つのループドループプライマーセットを使用して検出した。Ｃｙ５によって標識したヒト内部対照ループドループプライマーセットは、第３のＲＮＡ標的を検出した。内部Ｃｙ５フルオロフォアを、５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱクエンチャーとペアにした。反応は、未処理鼻スワブ溶出液を含有し、これに熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を添加した。
【0200】
追加のループ型プライマーもまた、ＰＯＰ７ｂヒト内部対照に関してループドループプライマーセットで使用するために試験した。一例では、内部ＴＡＭＲＡフルオロフォア、第２のセンサー分子を、５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー、第１のセンサー分子とペアにした。別の例では、５’Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１のセンサー分子を、内部Ｚｅｎ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）クエンチャー、第２のセンサー分子とペアにした。Ｙａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗおよびＺｅｎの構成では、ループ型プライマーの３つの変形形態を作製し、試験した。第１の変形形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドおよび第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であり、各々は６塩基長を有した。スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３塩基長であった。第２の変形形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドは、その５’末端に追加の塩基を特色とし、それによって第１のクランピングオリゴヌクレオチドは、７塩基長であり、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは６塩基長であった。第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドの間には６つの相補的塩基が存在した。スペーシングオリゴヌクレオチドは１３塩基長であった。第３の変形形態では、第１および第２のクランピングオリゴヌクレオチドはいずれも、７塩基長であり、配列は完全に相補的であった。スペーシングオリゴヌクレオチドは、１０塩基長であった。
【0201】
これらの追加のループ型プライマーを、ＬＡＭＰ反応のために使用した。反応は、標的配列の特異的増幅シグナルを提供する。
【0202】
[実施例８]
６．８．８．実施例８：ループドループ増幅によるヒト試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、無処理ヒト唾液からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために調製した。反応を、ＰＣＲチューブにおいて凍結乾燥酵素、ｄＮＴＰ、およびオリゴヌクレオチドプライマー混合物を、ｐＨ緩衝塩類溶液中のヒト唾液の１０体積／体積％混合物によって再水和することによって調製した。凍結乾燥プライマー混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト内部対照ＲＮＡ配列のためのプライマーセットを含んだ。唾液試料によって再水和した後、反応を、事前加熱温度で既定の期間インキュベートして、ウイルスの溶解、ＲＮａｓｅ阻害、および逆転写を促進した後、ＬＡＭＰ ＤＮＡ増幅のためにより高い反応温度でインキュベートした。温度制御およびリアルタイム蛍光データを、注文の機器を使用して収集した。
６．８．８．実施例８：ループドループ増幅によるヒト試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
ループドループＬＡＭＰ反応混合物を、無処理ヒト唾液からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために調製した。反応を、ＰＣＲチューブにおいて凍結乾燥酵素、ｄＮＴＰ、およびオリゴヌクレオチドプライマー混合物を、ｐＨ緩衝塩類溶液中のヒト唾液の１０体積／体積％混合物によって再水和することによって調製した。凍結乾燥プライマー混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびヒト内部対照ＲＮＡ配列のためのプライマーセットを含んだ。唾液試料によって再水和した後、反応を、事前加熱温度で既定の期間インキュベートして、ウイルスの溶解、ＲＮａｓｅ阻害、および逆転写を促進した後、ＬＡＭＰ ＤＮＡ増幅のためにより高い反応温度でインキュベートした。温度制御およびリアルタイム蛍光データを、注文の機器を使用して収集した。
【0203】
熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、匿名のドナーから収集した新鮮な唾液のプールに添加した。唾液の３倍段階希釈液を調製した。試料２０個を、ループドループ増幅法を使用して試験した。モバイルアプリケーション、肉眼、またはリアルタイム曲線の検分による読み取りを以下に要約する。結果は、ＬｏＤが約２，５００ｃｐ／ｍＬであることを示している。
【0204】
【表5】
【0205】
自己収集鼻スワブを、ボランティア対象から得て、１０回ひねることによって反応混合物に直接添加した。図１６は、後にＰＣＲ検査によってＣＯＶＩＤ陽性であることが確認された症候性のボランティアから得た鼻スワブからの増幅結果を示す。陽性／陰性対照試料からの結果もまた提供する。結果は、試料（１×スワブ）が、ループドループアッセイによって陽性試料を検出するために必要な場合より３６５倍高く濃縮されたことを示している。ＬｏＤは、約２，５００ｃｐ／ｍＬであると推定されることから、特定の試料は、約９．１ｘ１０５ｃｐ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを含有すると推定された。
【0206】
図１７は、陰性ボランティアから得た鼻スワブの増幅結果を示す。患者は、ループドループ反応およびＰＣＲ検査の両方によって陰性であると検出された。
【0207】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための反応混合物を、ヒトゲノム配列を検出するためのプライマーと１：１の比で多重化した。多重化増幅結果を図１８に提供する。結果は、交差反応性なく、２つの標的配列の特異的かつ感度のよい検出を示す。
【0208】
[実施例９]
６．８．９．実施例９：ループドループ増幅によるヒト試料中のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
３つの膣スワブ（一意的な個体ドナーを起源とする、ＢＤ ＢＢＬ培養スワブ、Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＭＯから購入したポリウレタンフォームチップ状スワブ）を、再水和緩衝液１２９４μＬ（スワブあたり４３１μＬ）に３０秒間、１Ｈｚの回転方法（Panpradist et al., 2016）を使用して溶出した。一部の流体がスワブに消失した後、プールした膣スワブ溶出液１０９５μＬを得た。流体回収率は８５％であった。このスワブ溶出液を、ループドループＬＡＭＰのために凍結乾燥反応混合物を含有する注入成形されたプロトタイプの使い捨て商品にピペッティングした（１つはＣｔのため、１つはＮｇのため、および１つはヒト処理対照のため）。
６．８．９．実施例９：ループドループ増幅によるヒト試料中のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
３つの膣スワブ（一意的な個体ドナーを起源とする、ＢＤ ＢＢＬ培養スワブ、Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＭＯから購入したポリウレタンフォームチップ状スワブ）を、再水和緩衝液１２９４μＬ（スワブあたり４３１μＬ）に３０秒間、１Ｈｚの回転方法（Panpradist et al., 2016）を使用して溶出した。一部の流体がスワブに消失した後、プールした膣スワブ溶出液１０９５μＬを得た。流体回収率は８５％であった。このスワブ溶出液を、ループドループＬＡＭＰのために凍結乾燥反応混合物を含有する注入成形されたプロトタイプの使い捨て商品にピペッティングした（１つはＣｔのため、１つはＮｇのため、および１つはヒト処理対照のため）。
【0209】
各反応を以下によって再水和した：
・ スワブ溶出液（再水和緩衝液中で回転させたスワブ）１８μＬ；
・ 再水和緩衝液に懸濁した全Ｃｔ病原体１μＬ
・ 再水和緩衝液に懸濁させた全Ｎｇ病原体１μＬ。
ＣｔおよびＮｇ病原体試料を、使い捨ての各反応チャンバーに入れた。そのため、例えば、Ｃｔアッセイは、Ｎｇおよびヒト標的の同時存在下ならびにスワブ試料中に存在する任意の細菌環境でＣｔを検出することが作業課題であった。
・ スワブ溶出液（再水和緩衝液中で回転させたスワブ）１８μＬ；
・ 再水和緩衝液に懸濁した全Ｃｔ病原体１μＬ
・ 再水和緩衝液に懸濁させた全Ｎｇ病原体１μＬ。
ＣｔおよびＮｇ病原体試料を、使い捨ての各反応チャンバーに入れた。そのため、例えば、Ｃｔアッセイは、Ｎｇおよびヒト標的の同時存在下ならびにスワブ試料中に存在する任意の細菌環境でＣｔを検出することが作業課題であった。
【0210】
増幅結果を、図１９～２２に提供する。図１９は、高コピー数のＣｔ（１０，０００コピー当量／反応）および高コピー数のＮｇ（１０，０００コピー当量／反応）を含有する試料からの蛍光シグナルを示す。図２２は、陰性対照、すなわちスワブのみの対照（左の２つのパネル）または緩衝液のみの対照（右の２つのパネル）からのシグナルを示す。スワブのみの対照にはＣｔまたはＮｇ増幅は認められなかったが、ヒトゲノム配列は予想されたように増幅された。緩衝液のみの対照では、Ｃｔ増幅もＮｇ増幅も認められなかった。ヒト（H. sapiens）の増幅は、おそらくシグナルの遅延を考慮した偽性増幅により緩衝液のみの反応（試験２０）において後に検出された。
【0211】
これらの結果は、アッセイがＣｔを約１００コピー／反応で、およびＮｇを約＞１，０００コピー／反応で検出するための感度を有したことを示す。
【0212】
[実施例１０]
６．８．１０．実施例１０：ＮＢＭループ型プライマーにおける内部センサーの遮断効果
異なる内部センサー分子を含むＮＢＭループ型プライマーを、鎖置換型ポリメラーゼによる増幅に及ぼすその遮断効果に関して試験した。
６．８．１０．実施例１０：ＮＢＭループ型プライマーにおける内部センサーの遮断効果
異なる内部センサー分子を含むＮＢＭループ型プライマーを、鎖置換型ポリメラーゼによる増幅に及ぼすその遮断効果に関して試験した。
【0213】
センサー分子（フルオロフォアまたはクエンチャーのいずれか）の化学結合のための骨格としての、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＴ）を利用する内部修飾を含有するＮＢＭループ型プライマーは、ポリメラーゼを遮断しなかった。図２４は、フルオレセイン（ＦＡＭ）によって標識した内部ｄＴを含むＮＢＭループ型プライマーを使用する増幅からの融解曲線を示す。予想されるように、融解曲線は、非増幅反応に関して正の勾配（－ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ＜０）、および陽性アンプリコンに関して負の勾配を示した。
【0214】
他方で、化学結合のための骨格としてヌクレオチド塩基（例えば、ｄＴ）を利用しない内部修飾を含有するＮＭＢループ型プライマーは、ポリメラーゼを遮断した。ポリメラーゼ自体が、共に移動するためにＤＮＡ塩基のリン酸骨格を必要とすることは可能である。例えば、内部Ｃｙ５構造は、図２５に提供されるようにこれを中断する。図２５は、ヒトＰＯＰ７ｂ－ＬＢ－Ｃｙ５の融解曲線を提供する。このプローブのＴｍは、開始するには非常に高く、増幅が起こった場合にＴｍは大きくシフトしなかった。したがって、６５℃ではほとんどシグナルは発生しなかった。融解曲線は、正の導関数のみを示し、Ｃｙ５が伸長を遮断することを示唆した。
【0215】
同様に、内部Ｚｅｎクエンチャー（ＩＤＴ）を有するループ型プライマー（例えば、ＰＯＰ７ｂ ＬＢ－ＬｄＬ－ＹＹ－１および２）もまた、図２６に提供するように酵素進行を遮断した。
【0216】
【表6】
【0217】
これらの結果は、多くの内部センサー分子が伸長を遮断することができることから、ＮＢＭループ型プライマーの使用が限定的であることを示唆している。ＦＡＭまたはＴＡＭＲＡ（ＩＤＴ）以外のｄＴ修飾として提供される多くの内部修飾はない。
【0218】
クリックケミストリーを使用してＣｙ３、Ｃｙ５、および他のフルオロフォアを内部修飾させて、それらを核酸塩基（ｄＴ）と連結させる方法が存在する。クリックケミストリーは効率的であるが、なおもオリゴヌクレオチド製造元にとって合成後修飾および標準ではない試薬を必要とする。
【0219】
ループ型プライマーの逆相補体の合成が第２のクランピング配列の３’末端の内部センサーの部位で停止すると、ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＬＡＭＰ反応におけるリアルタイム増幅シグナルは存在しないかまたは比較的弱くなり得て、ループ型プライマーのヘアピン構造の融解温度は低くなり得る。これらの伸長遮断性ループ型プライマーは、１）それらが弱い蛍光シグナルを生成したために、２）蛍光が強く温度依存的であったために、３）蛍光のエンドポイント測定が、正の結果と負の結果の間を識別できなかったために、問題であり得る。
【0220】
[実施例１１]
６．８．１１．実施例１１：ＢＭおよびＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ増幅
ＰＯＰ７ｂまたはＣｏＶ－１１を標的化し、様々な内部修飾を含むＢＭおよびＮＢＭループ型プライマーを試験した。標的ヌクレオチドの存在下（＋）または非存在下（－）でのＬＡＭＰ反応におけるそれらのリアルタイム増幅シグナルを、図２８Ａ、２９Ａ、３０Ａ、３１Ａ、３２Ａ、３３Ａ、３４Ａ、３５Ａ、３６Ａ、３７Ａおよび３８Ａに提供し、様々な温度での融解曲線を、図２８Ｂ、２９Ｂ、３０Ｂ、３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ、３７Ｂ、および３８Ｂに提供する。ＰＯＰ－７ｂまたはＣｏＶ－１１を標的化する試験したループ型プライマーを、以下の表に要約する。
６．８．１１．実施例１１：ＢＭおよびＮＢＭループ型プライマーを使用するループドループ増幅
ＰＯＰ７ｂまたはＣｏＶ－１１を標的化し、様々な内部修飾を含むＢＭおよびＮＢＭループ型プライマーを試験した。標的ヌクレオチドの存在下（＋）または非存在下（－）でのＬＡＭＰ反応におけるそれらのリアルタイム増幅シグナルを、図２８Ａ、２９Ａ、３０Ａ、３１Ａ、３２Ａ、３３Ａ、３４Ａ、３５Ａ、３６Ａ、３７Ａおよび３８Ａに提供し、様々な温度での融解曲線を、図２８Ｂ、２９Ｂ、３０Ｂ、３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ、３７Ｂ、および３８Ｂに提供する。ＰＯＰ－７ｂまたはＣｏＶ－１１を標的化する試験したループ型プライマーを、以下の表に要約する。
【0221】
【表7-1】
【0222】
【表7-2】
【0223】
図２８Ａ～３８Ｂは、様々な内部クエンチャー（例えば、Ｏｎｙｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、ｄＴ－ＴＡＭＲＡフルオロフォア、ＱＳＹ７クエンチャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を、ループドループ増幅のためのＮＢＭプライマーにおいて使用することができることを示している。具体的には、ＯｎｙｘクエンチャーのＮＢＭ適合性は、ＰＯＰ７ｂ ＬＢまたはＣｏＶ－１１ ＬＢ、５’ＨＥＸおよびポリ－ＡＴスペーサーの両方、内部ＯＱＡクエンチャーによって実証された；ｄＴ－ＴＡＭＲＡフルオロフォアのＮＢＭ適合性は、５’ＱＳＹ７クエンチャー、ポリ－ＡＴスペーサー、および内部ｄＴ－ＴＡＭＲＡを有するＰＯＰ７ｂ ＬＢによって実証され；ならびにＱＳＹ７クエンチャーのＮＢＭ適合性は、５’ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＡＢＹ、およびＪＵＮを使用するＰＯＰ７ｂ ＬＢまたはＣｏＶ－１１ ＬＢによって実証された。
【0224】
図２８Ａ～３８Ｂはさらに、ＢＭループ型プライマーが、実際に重合を遮断しない様々な内部クエンチャーと適合性であることを示している。例えば、５’ＦＡＭ、５’ＶＩＣ、５’ＡＢＹ、または５’ＪＵＮと組み合わせた内部ＱＳＹ７を有するＰＯＰ７ｂ ＬＢのリアルタイム増幅曲線は、バイオセンサーペアが、ＢＭループ型プライマーおよび同様にＮＢＭループ型プライマーにおいても所望の増幅反応を提供したことを示している（図２８Ａ、３０Ａ、３１Ａ、３３Ａ）。したがって、ＢＭループ型プライマーは、重合を遮断する内部バイオセンサーと共に作用することが既に示されていることから、ＢＭループ型プライマーは、重合を遮断または許容する内部バイオセンサーと適合性である。
【0225】
ＢＭループ型プライマーは、その遮断効果にかかわらず、内部バイオセンサーと適合性である。遮断性修飾を有するＢＭループ型プライマーおよび非遮断性修飾を有するＢＭループ型プライマーの両方を、標的配列の増幅のために使用することができた。
【0226】
他方で、ある特定のＮＢＭループ型プライマーは、遮断性修飾（例えば、高い遮断効果を有するバイオセンサー）と適合性ではなく、遮断効果を有しない内部バイオセンサーの使用を必要とした。例えば、配列番号２３または、配列番号２４のＮＢＭループ型プライマーのいずれかをループ型プライマーとして使用するＰＯＰ７ｂプライマーセットによりＰＯＰ７を標的とする増幅反応は、内部Ｚｅｎクエンチャーからの遮断効果を示し、５’－Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗからの弱い蛍光シグナルの生成および陽性試料における室温でのエンドポイント蛍光の消失をもたらした。これに対し、配列番号２５または配列番号２６のＢＭループ型プライマーのいずれかをループ型プライマーとして使用するＰＯＰ７ｂプライマーセットによりＰＯＰ７を標的とする増幅反応は、内部Ｚｅｎクエンチャーからの遮断効果にもかかわらず、５’－Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗからの強い蛍光シグナル生成を示した。さらに、陽性試料における室温でのエンドポイント蛍光は、遮断性内部修飾（Ｚｅｎクエンチャー）を有するＢＭループ型プライマーを使用して保存された。加えて、第１のセンサー（sensory）分子として５’－Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗの代わりに使用した５’－ＨＥＸは、第２のセンサー（sensory）分子が同様に遮断性の内部Ｚｅｎクエンチャーである配列番号２７および配列番号２８のＢＭループ型プライマー配列と適合性の結果を提供した。
【0227】
クランピング配列のＴｍより低い陰性反応の融解曲線は。ＮＢＭループ型プライマーのバックグラウンド／ベースライン蛍光が、一般的にＢＭループ型プライマーのそれより低いことを示している。これは、ＮＢＭループ型プライマーにおける接触クエンチングが、ＢＭループ型プライマーにおけるＦＲＥＴクエンチングより有効であるためであり得る。さらに、陽性反応のリアルタイム増幅曲線は、ＮＢＭループ型プライマーのエンドポイント蛍光（ｒｘｎ温度で）が、ＢＭループ型プライマーのそれより一般的に高いことを示唆した。これは、蛍光／クエンチャーペアの間の間隔がＮＢＭループ型プライマーでは大きいためであり得る。
【0228】
ある特定の条件では、ＢＭループ型プライマーは、比較可能なＮＢＭループ型プライマーより良好な増幅シグナルを提供した。室温での最大の差次的シグナル（陽性マイナス陰性）は、ポリ－Ｔスペーサーを有するＢＭループ型プライマーに起因した。
【0229】
ＬｄＬクランピング配列の融解温度（Ｔｍ）は、リアルタイム増幅曲線における反応速度およびバックグラウンド／ベースライン蛍光に影響を及ぼす。Ｔｍは、ＢＭループ型プライマー、特にポリ－Ｔスペーサーを有するＢＭループ型プライマーに関して予測されるより低かった。
【0230】
５’－ＶＩＣおよび内部ｄＴ－ＱＳＹ７を有するループ型プライマー（５’－ＶＩＣ－１）は、他のフルオロフォア修飾と比較してＴｍのわずかな（１～２℃）増加にもかかわらず、他の５’－フルオロフォア標識プライマーより有意に遅かった。このように、５’ＶＩＣおよびｄＴ－ＱＳＹ７の組合せは、他の組合せよりあまり好ましくない。
【0231】
７．配列
【0232】
【表8-1】
【0233】
【表8-2】
【0234】
８．参照による組み入れ
本出願において引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、全ての目的に関して、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が、全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれることが個々に示されているのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、全ての目的に関して、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が、全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれることが個々に示されているのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0235】
９．均等物
本開示は、中でもカンナビノイドの組成物および関連組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイドおよび関連組成物を投与することによって神経変性疾患を処置する方法も提供する。様々な特定の実施形態が例証され、記載されてきたが、上記の明細書は限定ではない。本発明（複数可）の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化を行うことができると認識される。多くの変形形態が、本明細書を精査することによって当業者に明らかとなる。
本開示は、中でもカンナビノイドの組成物および関連組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイドおよび関連組成物を投与することによって神経変性疾患を処置する方法も提供する。様々な特定の実施形態が例証され、記載されてきたが、上記の明細書は限定ではない。本発明（複数可）の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化を行うことができると認識される。多くの変形形態が、本明細書を精査することによって当業者に明らかとなる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【国際調査報告】