▶ シャンドン シムセレ バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】抗ヒトＣＤ３抗体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240905BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240905BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240905BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240905BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240905BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240905BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240905BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240905BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240905BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240905BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240905BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C07K16/46
C07K16/30
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N5/0783
C12P21/08
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
A61K35/17
A61K35/15
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516404
(86)(22)【出願日】2022-09-13
(85)【翻訳文提出日】2024-03-15
(86)【国際出願番号】 CN2022118334
(87)【国際公開番号】W WO2023036326
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111069892.7
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524094963
【氏名又は名称】シャンドン シムセレ バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＳＩＭＣＥＲＥ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100230891
【弁理士】
【氏名又は名称】里見 紗弥子
(72)【発明者】
【氏名】ワン チョン
(72)【発明者】
【氏名】フー ヤーユエン
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ ペイペイ
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ ジュオシャオ
(72)【発明者】
【氏名】タン レンホン
(72)【発明者】
【氏名】レン ジンション
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA94X
4B065AA94Y
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB63
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
抗ヒトＣＤ３抗体及びその用途が提供され、具体的には、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、単離された核酸分子、ベクター、細胞、免疫エフェクター細胞、前記抗体又はその抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子及び前記免疫エフェクター細胞の製造方法、医薬組成物、製薬用途並びに疾患の治療方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１－３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１－３を含み、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は表１０又は表１８から選択され、好ましくは、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１～３３、４４～４６、５７～５９、７０～７２、８３～８５、９６～９８及び１０９～１１１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４～３６、１３７、４７～４９、６０～６２、７３～７５、８６～８８、９９～１０１及び１１２～１１４のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～３８、１３８～１３９、５０～５１、１４２～１４３、６３～６４、７６～７７、８９～９０、１０２～１０３及び１１５～１１６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び／又は
前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４０、１４０～１４１、５２～５３、６５～６６、７８～７９、９１～９２、１０４～１０５及び１１７～１１８のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４２、５４～５５、６７～６８、８０～８１、９３～９４、１０６～１０７及び１１９～１２０のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５６、６９、８２、９５、１０８及び１２１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、
さらに好ましくは、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴ方法に従って確定される、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４及び１３６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び／又は前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３及び１３５のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異を有する配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記少なくとも７０％の同一性は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性であり、及び／又は前記多くとも３つの突然変異は、多くとも３、２、１又は０個の突然変異であり、及び／又は前記多くとも１５個の突然変異は、多くとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個の突然変異であり、好ましくは、前記突然変異は、挿入、欠失又は置換であり、さらに好ましくは、前記置換は、保存的アミノ酸置換であり、最も好ましくは、前記突然変異は、復帰突然変異又はホットスポット突然変異である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示すとおりであり、前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５に示すとおりである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、任意選択的に、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択され、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４から選択され、さらに好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３から選択され、及び／又は
前記軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖から選択され、
好ましくは、前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、操作された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、インタクトな抗体、インタクトな抗体の断片、裸抗体、抱合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ及び単一ドメイン抗体から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合断片は、治療剤又はトレーサーとコンジュゲートし、好ましくは、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬及び免疫調節剤から選択され、及び／又は前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合断片は、さらにサルＣＤ３に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
前記ＣＤ３は、ＣＤ３εサブユニット、及びＣＤ３εサブユニットを含む二量体、例えば、ＣＤ３ε／δ二量体から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
多重特異性抗原結合分子であって、前記多重特異性抗原結合分子は、少なくとも第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分とを含み、前記第１の抗原結合部分は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、及び／又は前記第２の抗原結合部分は、前記第１の抗原結合部分と異なる他の標的に結合するか又は同じ標的の異なるエピトープに結合し、好ましくは、前記他の標的は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）から選択され、任意選択的に、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、多重特異性抗原結合分子。
【請求項11】
単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、又は請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子をコードし、任意選択的に、前記核酸分子は、さらにキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項14】
免疫エフェクター細胞であって、キメラ抗原受容体を発現し、及び／又は請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子を発現し、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、単球、マクロファージ、樹状細胞及び肥満細胞から選択され、さらに好ましくは、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞から選択され、及び／又は
好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、自家免疫エフェクター細胞又は同種異体免疫エフェクター細胞である、免疫エフェクター細胞。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、又は請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、前記方法は、（１）請求項１３に記載の細胞を培養すること、及び／又は（２）前記細胞により発現される抗体もしくはその抗原結合断片、又は多重特異性抗原結合分子を単離することを含む、方法。
【請求項16】
請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、前記方法は、（１）ａ．前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子及びｂ．請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする核酸分子を初期免疫エフェクター細胞に導入すること、及び／又は（２）上記核酸分子が導入された免疫エフェクター細胞に、キメラ抗原受容体及び請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子を発現させることを含む、方法。
【請求項17】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞又は請求項１５又は１６に記載の方法で製造された生成物を含み、好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は助剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項18】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞、請求項１５又は１６に記載の方法で製造された生成物、又は請求項１７に記載の医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療する医薬品の製造における用途であって、好ましくは、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍及び固形腫瘍から選択され、さらに好ましくは、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択され、及び／又は前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択される、用途。
【請求項19】
腫瘍又は癌を治療する方法であって、前記方法は、被験体に有効量の医薬品を投与することを含み、前記医薬品は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞、請求項１５又は１６に記載の方法で製造された生成物又は請求項１７に記載の医薬組成物を含み、好ましくは、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍及び固形腫瘍から選択され、さらに好ましくは、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択され、及び／又は前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択される、方法。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞、請求項１５又は１６に記載の方法で製造された生成物又は請求項１７に記載の医薬組成物であって、腫瘍又は癌を治療するためのものであり、好ましくは、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍及び固形腫瘍から選択され、さらに好ましくは、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択され、及び／又は前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、請求項１４に記載の免疫エフェクター細胞、請求項１５又は１６に記載の方法で製造された生成物又は請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０２１年９月１３日に中国国家知的財産局に出願された、発明名称が『抗ヒトＣＤ３抗体及びその応用』であり、出願番号がＣＮ２０２１１１０６９８９２．７である発明特許出願の優先権を主張し、その内容の全ては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本出願は、バイオ医薬分野に関し、具体的には、抗ヒトＣＤ３抗体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｔ細胞（抗原）受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面の特異的受容体であり、ＴＣＲαβ及びＴＣＲγδという二つのサブユニットがあり、主な機能が、ＭＨＣ分子によって提示される抗原を認識しそれに結合することであり、ＴＣＲの細胞質ドメインが非常に短く、単独のＴＣＲでシグナルを伝達することができず、ＣＤ３分子の助けを借りる必要がある。ＣＤ３分子は、Ｔ細胞膜上の重要な分化抗原であり、主にε、δ、γ及びζの四種類の鎖からなる。ＣＤ３－ＴＣＲ複合体では、ＣＤ３γ、δ及びεは、非共有結合形態の二種類のγε及びδεヘテロ二量体で存在し、大多数のζ鎖は、ホモ二量体、即ちζ－ζの形態で存在する。ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ及びＣＤ３ζの細胞質ドメインのいずれかにも、保存的な免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）が含まれている。ここで、ＣＤ３ζは三つのＩＴＡＭを有するが、他のＣＤ３鎖はそれぞれ一つのＩＴＡＭを含み、異なる抗原刺激は、ＴＣＲの１０個のＩＴＡＭの異なるリン酸化を誘導し、最終的に異なる下流シグナル経路を誘発することができる。ＣＤ３εの細胞質ドメインは、膜近傍領域に塩基性アミノ酸に富む配列（ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｒｉｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＢＲＳ）があり、続いてプロリン残基に富む非冗長配列（ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｒｉｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＰＲＳ）及びＩＴＡＭがある。そのため、ＣＤ３εサブユニットにおけるＢＲＳは、イオン間相互作用によってＬｃｋを効果的に動員して、ＴＣＲリン酸化を開始することができる。ＣＤ３εに対するいくつかの抗体はＴＣＲシグナル伝達を誘導することができるが、他の抗体はできないことが既に証明された。ＣＤ３のＴＣＲシグナル伝達及び免疫応答における重要な作用に基づいて、ＣＤ３に対する抗体を開発することは重要な意義がある。
【0004】
また、多重特異性抗体は、腫瘍細胞上の標的抗原及びＴ細胞上のＣＤ３に結合することによって、ＴＣＲに依存しない人為的免疫シナプスを形成し、ＨＬＡの制限を回避する。しかし、ＣＤ３抗体は、サイトカインストームが発生するリスクがある。Ｆａｒｏｕｄｉらは、標的細胞溶解の活性化閾値が、サイトカイン放出の活性化閾値よりも１０００倍高い感度を有することを観察し、このような差異は、主に標的細胞の表面抗原濃度及びｐＭＨＣ：ＴＣＲ複合体の数の違いによるものである。低い親和性は、いくつかのペプチド－ＭＨＣ複合体が、連続的で迅速な結合及び解離により、多くのＴＣＲを連続的に誘発することに役立ち、このような連続的な誘発は、Ｔ細胞が最終的に活性化閾値に達することを可能にする一定期間にわたるシグナル伝達の維持に非常に重要である。一方、親和性の高い抗ＣＤ３抗体は、解離しにくく、ＴＣＲを連続的に誘発することができず、それによりＴ細胞を効果的に刺激することができない可能性があり、これは、適切な親和性範囲の抗体が、ＴＣＲシグナル伝達によってＴ細胞をより効果的に刺激し得ることを示唆している。
【0005】
そのため、新規な抗ＣＤ３抗体の開発に対する大きなニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
本出願は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、単離された核酸分子、ベクター、細胞、免疫エフェクター細胞、前記抗体又はその抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子及び前記免疫エフェクター細胞の製造方法、医薬組成物、製薬用途並びに疾患の治療方法を提供する。
【0007】
第１の態様では、本出願は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１－３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１－３を含み、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は表１０又は表１８から選択される。
【0008】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１～３３、４４～４６、５７～５９、７０～７２、８３～８５、９６～９８及び１０９～１１１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４～３６、１３７、４７～４９、６０～６２、７３～７５、８６～８８、９９～１０１及び１１２～１１４のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～３８、１３８～１３９、５０～５１、１４２～１４３、６３～６４、７６～７７、８９～９０、１０２～１０３及び１１５～１１６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び／又は
前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４０、１４０～１４１、５２～５３、６５～６６、７８～７９、９１～９２、１０４～１０５及び１１７～１１８のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４２、５４～５５、６７～６８、８０～８１、９３～９４、１０６～１０７及び１１９～１２０のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５６、６９、８２、９５、１０８及び１２１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含む。
前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４～３６、１３７、４７～４９、６０～６２、７３～７５、８６～８８、９９～１０１及び１１２～１１４のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～３８、１３８～１３９、５０～５１、１４２～１４３、６３～６４、７６～７７、８９～９０、１０２～１０３及び１１５～１１６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び／又は
前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４０、１４０～１４１、５２～５３、６５～６６、７８～７９、９１～９２、１０４～１０５及び１１７～１１８のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４２、５４～５５、６７～６８、８０～８１、９３～９４、１０６～１０７及び１１９～１２０のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５６、６９、８２、９５、１０８及び１２１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含む。
【0009】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴ方法に従って確定される。
【0010】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４及び１３６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含む。
【0011】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３及び１３５のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異又は差異を有する配列を含む。
【0012】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記少なくとも７０％の同一性は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性である。
【0013】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記多くとも３つの突然変異又は差異は、多くとも３、２、１又は０個の突然変異又は差異である。
【0014】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記多くとも１５個の突然変異又は差異は、多くとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個の突然変異又は差異である。
【0015】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記突然変異は、挿入、欠失又は置換である。いくつかの実施形態において、前記置換は、保存的アミノ酸置換である。
【0016】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記突然変異は、復帰突然変異又はホットスポット突然変異である。
【0017】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示すとおりであり、前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５に示すとおりである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示すとおりであり、前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５に示すとおりである。
【0018】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含む。
【0019】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される。
【0020】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４から選択されてもよい。
【0021】
第１の態様のいくつかの具体的な実施形態において、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３から選択されてもよい。
【0022】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖から選択される。
【0023】
第１の態様のいくつかの具体的な実施形態において、前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２から選択されてもよい。
【0024】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、操作された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、インタクトな抗体、インタクトな抗体の断片、裸抗体、抱合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及び単一ドメイン抗体から選択される。
【0025】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、治療剤又はトレーサーとコンジュゲートする。
【0026】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬及び免疫調節剤から選択されてもよい。
【0027】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択されてもよい。
【0028】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、さらにサルＣＤ３に結合する。
【0029】
第１の態様のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ３は、ＣＤ３εサブユニット、及びＣＤ３εサブユニットを含む二量体、例えば、ＣＤ３ε／δ二量体から選択される。
【0030】
第２の態様では、本出願は、多重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、前記多重特異性抗原結合分子は、少なくとも第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分とを含み、前記第１の抗原結合部分は、第１の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、及び／又は前記第２の抗原結合部分は、前記第１の抗原結合部分と異なる他の標的に結合するか又は同じ標的の異なるエピトープに結合する。
【0031】
第２の態様のいくつかの実施形態において、前記他の標的は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）から選択される。
【0032】
第２の態様のいくつかの実施形態において、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
【0033】
第３の態様では、本出願は、単離された核酸分子を提供し、ここで、前記核酸分子は、第１の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする。
【0034】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記核酸分子は、さらにキメラ抗原受容体をコードする。
【0035】
第３の態様のいくつかの実施形態において、第１の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする核酸は、自己切断ペプチドをコードする核酸配列又はＩＲＥＳ核酸配列を介して、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸に連結される。
【0036】
第４の態様では、本出願は、ベクターを提供し、それは、第３の態様に記載の核酸分子を含む。
【0037】
第５の態様では、本出願は、細胞を提供し、それは、第４の態様に記載のベクターを含む。
【0038】
第６の態様では、本出願は、免疫エフェクター細胞を提供し、それは、キメラ抗原受容体を発現し、及び／又は第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子を発現する。
【0039】
第６の態様のいくつかの実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）、単球、マクロファージ、樹状細胞及び肥満細胞から選択される。
【0040】
第６の態様のいくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞から選択される。
【0041】
第６の態様のいくつかの実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、自家免疫エフェクター細胞又は同種異体免疫エフェクター細胞である。
【0042】
第７の態様では、本出願は、第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子を製造する方法を提供し、ここで、前記方法は、（１）第５の態様に記載の細胞を培養すること、及び／又は（２）前記細胞により発現される抗体もしくはその抗原結合断片、又は多重特異性抗原結合分子を単離することを含む。
【0043】
第８の態様では、本出願は、第６の態様に記載の免疫エフェクター細胞を製造する方法を提供し、ここで、前記方法は、（１）ａ．前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子及びｂ．第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする核酸分子を初期免疫エフェクター細胞に導入すること、及び／又は（２）上記核酸分子が導入された免疫エフェクター細胞に、前記キメラ抗原受容体及び第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子を発現させることを含む。
【0044】
第９の態様では、本出願は、医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は、第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載のベクター、第５の態様に記載の細胞、第６の態様に記載の免疫エフェクター細胞又は第７もしくは第８の態様に記載の方法で製造された生成物を含む。
【0045】
第９の態様のいくつかの実施形態において、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、希釈剤又は助剤をさらに含む。
【0046】
第１０の態様では、本出願は、第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載のベクター、第５の態様に記載の細胞、第６の態様に記載の免疫エフェクター細胞、第７もしくは第８の態様に記載の方法で製造された生成物、又は第９の態様に記載の医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療する医薬品の製造における用途を提供する。
【0047】
第１０の態様のいくつかの実施形態において、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍又は固形腫瘍から選択される。
【0048】
第１０の態様のいくつかの実施形態において、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択されてもよい。
【0049】
第１０の態様のいくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択されてもよい。
【0050】
第１１の態様では、本出願は、腫瘍又は癌を治療する方法を提供し、ここで、前記方法は、被験体に有効量の医薬品を投与することを含み、前記医薬品は、第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載のベクター、第５の態様に記載の細胞、第６の態様に記載の免疫エフェクター細胞、第７もしくは第８の態様に記載の方法で製造された生成物又は第９の態様に記載の医薬組成物を含む。
【0051】
第１１の態様のいくつかの実施形態において、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍又は固形腫瘍から選択される。
【0052】
第１１の態様のいくつかの実施形態において、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択されてもよい。
【0053】
第１１の態様のいくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択されてもよい。
【0054】
第１２の態様では、本出願は、第１の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載のベクター、第５の態様に記載の細胞、第６の態様に記載の免疫エフェクター細胞、第７もしくは第８の態様に記載の方法で製造された生成物又は第９の態様に記載の医薬組成物を提供し、それは、腫瘍又は癌を治療するためのものである。
【0055】
第１２の態様のいくつかの実施形態において、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍又は固形腫瘍から選択される。
【0056】
第１２の態様のいくつかの実施形態において、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択されてもよい。
【0057】
第１２の態様のいくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌又は肝臓癌から選択されてもよい。
【0058】
本出願の第１の態様から第１２の態様のうちのいずれか一つの態様に記載の実施形態は、少なくとも以下の一つ又は複数の有益な効果を有し、
（１）本出願に記載の方法でスクリーニングして、従来の抗体とは異なる新規なＣＤ３抗体を得て、それは、ＣＤ３εサブユニットもしくはその複合体に特異的に結合し、又は前記ＣＤ３εサブユニットもしくはその複合体を発現する細胞、特にＴ細胞に特異的に結合し、
（２）本開示に記載の抗体は、ＣＤ３に対して適切な親和性を有し、ＴＣＲシグナル伝達によってＴ細胞を効果的に刺激し、好ましくは、Ｔ細胞を効率的に活性化する抗体を得ることができる。
（１）本出願に記載の方法でスクリーニングして、従来の抗体とは異なる新規なＣＤ３抗体を得て、それは、ＣＤ３εサブユニットもしくはその複合体に特異的に結合し、又は前記ＣＤ３εサブユニットもしくはその複合体を発現する細胞、特にＴ細胞に特異的に結合し、
（２）本開示に記載の抗体は、ＣＤ３に対して適切な親和性を有し、ＴＣＲシグナル伝達によってＴ細胞を効果的に刺激し、好ましくは、Ｔ細胞を効率的に活性化する抗体を得ることができる。
【0059】
用語の定義及び説明
本出願において特に定義しない限り、本出願に関連する科学用語及び技術用語は、当業者に理解されている意味を有する。
本出願において特に定義しない限り、本出願に関連する科学用語及び技術用語は、当業者に理解されている意味を有する。
【0060】
また、本明細書において特に説明されていない限り、本明細書における単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。より具体的には、別途明らかに指摘されていない限り、本明細書及び添付される特許請求の範囲において使用される単数形「１つ」及び「このような」は、複数の指示対象を含む。
【0061】
本明細書における「含む」、「包含する」及び「有する」という用語は、同義的に使用され、スキームの包括性を示すことが意図され、前記スキームには、列挙された要素以外の他の要素が存在し得ることを意味する。同時に、本明細書で使用される「含む」、「包含する」及び「有する」という記述はまた、「……からなる」というスキームを提供することを理解すべきである。例示的に、「ＡとＢとを含む組成物」は、以下の技術案として理解されるべきである：Ａ及びＢからなる組成物、及びＡ及びＢに加えて、他の成分をさらに含む組成物は、いずれも前述の「組成物」の範囲内に入る。
【0062】
「及び／又は」という用語は、本明細書で使用される場合、「及び」、「又は」及び「属する用語によってリンクされる要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【0063】
本明細書において、「特異的結合」という用語は、抗原結合分子（例えば、抗体）が、通常、抗原及び実質的に同じ抗原に高親和性で特異的に結合するが、関連性のない抗原に高親和性で結合しないことを指す。親和性は、通常、平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）によって反映され、ここで、低いＫＤは、高い親和性を表す。抗体を例として、高親和性は、通常、約１０－６Ｍ又はそれ以下、約１０－７Ｍ又はそれ以下、約１０－８Ｍ又はそれ以下、約１×１０－９Ｍ又はそれ以下、約１×１０－１０Ｍ又はそれ以下、約１×１０－１１Ｍ又はそれ以下、又は約１×１０－１２Ｍ又はそれ以下のＫＤを有することを指す。ＫＤの計算方式は以下のとおりである：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ、ここで、Ｋｄは解離速度を表し、Ｋａは結合速度を表す。平衡解離定数ＫＤは、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）又は平衡透析アッセイのような当分野で周知の方法を用いて測定することができ、例示的に、本明細書の実施例８に示すＫＤ値取得方法を参照することができる。
【0064】
本明細書において、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で使用され、抗原に特異的に結合する分子を指す。例示的に、抗原結合分子は、抗体又は抗体模倣体を含むが、それらに限らない。「抗体模倣体」は、抗原に特異的に結合することができるが、抗体構造とは無関係である有機化合物又は結合ドメインを指し、例示的に、抗体模倣体は、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｆｆｉｌｉｎ、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、核酸アプタマー又はＫｕｎｉｔｚ型ドメインペプチドを含むが、それらに限らない。
【0065】
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、免疫グロブリン重鎖可変領域からの十分な配列及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域からの十分な配列を含み、それによって抗原に特異的に結合することができるポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせを指す。本明細書において、「抗体」は、所望の抗原結合活性を示す限り、様々な形態及び様々な構造を包含する。本明細書において、「抗体」は、移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質足場又は人工足場を含む。このような足場は、抗体由来の足場（それは、例えば、抗体の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む）と、例えば、生体適合性ポリマーを含む全合成足場とを含む。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１－１２９（２００３）、Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４（２００４）を参照されたい。このような足場は、非抗体由来の足場、例えば、当分野に既知の、ＣＤＲ移植に用いられ得る足場タンパク質をさらに含んでもよく、テネイシン、フィブロネクチン、ペプチドアプタマーなどを含むが、それらに限らない。
【0066】
本明細書において、「抗体」は、典型的な「四鎖抗体」を含み、それは、二本の重鎖（ＨＣ）及び二本の軽鎖（ＬＣ）からなる免疫グロブリンに属し、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン、重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなり、且つ、前記全長抗体がＩｇＥアイソタイプである場合、任意選択的に、重鎖定常領域ＣＨ４ドメインをさらに含むポリペプチド鎖を指し、軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるポリペプチド鎖であり、重鎖と重鎖、重鎖と軽鎖は、ジスルフィド結合によって連結され、形成「Ｙ」字型構造を形成する。免疫グロブリン重鎖定常領域は、アミノ酸の組成及び配列順序が異なるため、その抗原性も異なる。これにより、本明細書の「免疫グロブリン」を五つのクラスに分けることができ、又は免疫グロブリンのアイソタイプ、即ちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと呼ばれてもよく、その該当する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖とε鎖である。同じクラスＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置の違いにより、様々なサブクラスに分けられ得、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ得、ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられ得る。軽鎖は、定常領域により、κ鎖又はλ鎖に分けられる。五つのクラスのＩｇのうちの各クラスのＩｇは、いずれもκ鎖又はλ鎖を有し得る。
【0067】
本明細書において、「抗体」は、軽鎖を含まない抗体、例えば、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌａｍａ ｇｕａｎｉｃｏｅ）及びアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）などから産生された重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＣＡｂｓ）、並びにサメなどの軟骨魚綱に見られる免疫グロブリン新抗原受容体（Ｉｇ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩｇＮＡＲ）をさらに含む。
【0068】
本明細書において、「抗体」は、任意の動物に由来してもよく、ヒト及び非ヒト動物を含むが、それらに限らず、前記非ヒト動物は、霊長類動物、哺乳動物、齧歯動物及び脊椎動物、例えば、ラクダ科動物、ラマ、グアナコ、アルパカ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット又は軟骨魚綱（例えば、サメ）から選択され得る。
【0069】
本明細書において、「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、インタクトな抗体、インタクトな抗体の断片、裸抗体、抱合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含むが、それらに限らない。
【0070】
本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から入手された抗体を指し、即ち、可能な変異体（例えば、天然に存在する突然変異を含むか、又は製剤製造中に産生され、このような変異体は、通常、少量で存在する）を除いて、前記集団に含まれる各抗体は、同じであり、及び／又は同じエピトープに結合する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは異なり、モノクローナル抗体製剤における各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。本明細書において、「モノクローナル」という修飾語は、前記抗体又はその抗原結合分子を産生するには何らかの特定の方法を必要とすると解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ方法、ファージライブラリーディスプレイ技術、及び全て又は一部のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニック動物を利用する方法及び当分野で既知の他の方法を含む（それらに限らない）様々な技術で製造され得る。
【0071】
本明細書において、「天然抗体」という用語は、多細胞生物の免疫系によって製造され、ペアリングされた抗体を指す。本明細書において、「操作された抗体」という用語の抗体は、遺伝子工学、抗体工学などの技術によって得られた非天然抗体を指し、例示的に、「操作された抗体」は、ヒト化抗体、低分子抗体（例えば、ｓｃＦｖなど）、二重特異性抗体などを含む。
【0072】
本明細書において、「単一特異性」という用語は、一つ又は複数の結合部位を有することを指し、ここで、各結合部位は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。
【0073】
本明細書において、「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも二つの抗原結合部位を有することを指し、前記少なくとも二つの抗原結合部位のうちの各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープに結合する。そのため、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」などのような用語は、抗体／抗原結合分子が結合できる異なるエピトープの数を指す。
【0074】
本明細書において、「価」という用語は、抗体／抗原結合分子における所定の数の結合部位の存在を示す。そのため、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、それぞれ抗体／抗原結合分子における一つの結合部位、二つの結合部位、四つの結合部位及び六つの結合部位の存在を示す。
【0075】
本明細書において、「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書において、同義的に使用され、天然抗体の構造と実質的に似ている構造を有することを指す。
【0076】
本明細書において、「抗原結合断片」及び「抗体断片」という用語は、本明細書において、同義的に使用され、それは、全抗体の全ての構造を有さず、全抗体の局所又は局所的変異体のみを含み、前記局所又は局所的変異体は抗原に結合する能力を有する。本明細書において、「抗原結合断片」又は「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及び単一ドメイン抗体を含むが、それらに限らない。
【0077】
インタクトな抗体のパパイン消化は、二つの同一の抗原結合断片を生成し、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。このように、本明細書において、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメインと定常ドメイン（ＣＬ）とを含む軽鎖断片、及び重鎖のＶＨドメインと第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が増加するためＦａｂ断片とは異なり、抗体ヒンジ領域からの一つ又は複数のシステインを含む。Ｆａｂ’－ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【0078】
本明細書において、「Ｆｄ」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体を指す。本明細書において、「Ｆｖ」は、単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を指す。Ｆｖ断片は、通常、完全な抗原結合部位を形成できる最小の抗体断片であると考えられる。一般的には、六つのＣＤＲは、抗体の抗原結合特異性を付与すると考えられる。しかしながら、一つの可変領域（例えば、抗原に特異的な三つのＣＤＲのみを含有するＦｄ断片）であっても、その親和性が完全な結合部位より低いかもしれないが、抗原に認識し結合することができる。
【0079】
本明細書において、「ｓｃＦｖ」（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、ＶＬ及びＶＨドメインを含む単一のポリペプチド鎖を指し、ここで、前記ＶＬ及びＶＨは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結される（例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，Ｒｏｓｅｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅによる編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク，ページ２６９～３１５（１９９４）を参照されたい）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨという一般的な構造を有してもよい。適切な従来技術のリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを使用してもよいが、その変異体を使用してもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８）。本出願に用いられ得る他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１，Ｃｈｏｉら（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４－１０６，Ｈｕら（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓら（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記述されている。いくつかの場合に、さらにｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合が存在して、ジスルフィド結合を介して連結されるＦｖ（ｄｓＦｖ）を形成してもよい。
【0080】
本明細書において、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、そのＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現するが、短すぎる連結体を使用するため同じ鎖の二つのドメインの間でのペアリングが許容されず、それによりドメインを別の鎖の互補的ドメインとペアリングさせ、且つ二つの抗原結合部位を産生する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照されたい）。
【0081】
本明細書において、「単一ドメイン抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）、「ＶＨＨ」及び「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」という用語は、同じ意味を有し、同義的に使用され、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築することを指し、それは、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、軽鎖及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）が天然に欠失している抗体を得てから、抗体重鎖の可変領域をクローニングすることで、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築する。単一ドメイン抗体は、ラクダ科重鎖抗体又は軟骨魚綱ＩｇＮＡＲに由来してもよい。
【0082】
本明細書において、「裸抗体」という用語は、治療剤又はトレーサーとコンジュゲートしない抗体を指し、「抱合抗体」という用語は、治療剤又はトレーサーとコンジュゲートする抗体を指す。
【0083】
本明細書において、「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、その軽鎖又は／及び重鎖の一部が一つの抗体（それは、ある特定の種に由来するか又はある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属してもよい）に由来し、軽鎖又は／及び重鎖の別の部分が別の抗体（それは、同じもしくは異なる種に由来するか又は同じもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属してもよい）に由来が、それでもなお、目的抗原に対する結合活性を保持している抗体を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ ４，８１６，５６７，Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が第１の抗体（例えば、マウス抗体）に由来するが、抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域が第２の抗体（例えば、ヒト抗体）に由来する抗体（例えば、ヒト／マウスキメラ抗体）を含んでもよい。
【0084】
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、遺伝子操作された非ヒト抗体を指し、そのアミノ酸配列が、ヒト抗体の配列との相同性を向上させるように修飾される。通常、ヒト化抗体の全て又は一部のＣＤＲ領域は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、全て又は一部の非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は、通常、ドナー抗体の所望の特性を保持するか又は部分的に保持し、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞の活性を向上させる能力、免疫応答を増強する能力などを含むがそれらに限らない。
【0085】
本明細書において、「完全ヒト抗体」は、ＦＲ及びＣＤＲの両方がいずれもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。また、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書において、完全ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的誘発又はインビボの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書において、「完全ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まない。
【0086】
本明細書において、「可変領域」は、抗体の重鎖又は軽鎖において、抗体を抗原に結合させることに関与する領域を指し、「重鎖可変領域」は、「ＶＨ」、「ＨＣＶＲ」と同義的に使用され、「軽鎖可変領域」は、「ＶＬ」、「ＬＣＶＲ」と同義的に使用される。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬである）は、一般的には、似ている構造を有し、各ドメインは、四つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐ．９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分である。本明細書において、「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、同義的に使用され、通常、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の超可変領域（ＨＶＲ）を指し、該部位は、立体構造的に抗原エピトープと精密な相補性を形成できるため、相補性決定領域とも呼ばれ、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲは、ＨＣＤＲと略されてもよく、軽鎖可変領域ＣＤＲは、ＬＣＤＲと略されてもよい。本用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」は、交換可能であり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域におけるＣＤＲ以外のアミノ酸残基を指す。通常、典型的な抗体可変領域は、４つのＦＲ領域及び３つのＣＤＲ領域により、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で構成される。
【0087】
ＣＤＲに対するさらなる記述は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，米国保健社会福祉省、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（１９９７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎとＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７（２００３）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７－６７０（２００１）を参照されたい。「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義されてもよく、ツールサイトは、ａｂＹｓｉｓウェブサイト（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）を含む
【0088】
本明細書において、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」という用語は、通常、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔにより提案された免疫グロブリンアラインメント及び番号付けシステムを指す（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい）。
【0089】
本明細書において、「重鎖定常領域」は、抗体重鎖のカルボキシル末端部分を指し、それは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のようなエフェクター子機能を表し、抗体の可変ドメインに対してより保存的なアミノ酸配列を有する。「重鎖定常領域」は、少なくとも、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はその変異体もしくは断片を含む。「重鎖定常領域」は、「完全長重鎖定常領域」と「重鎖定常領域断片」とを含み、前者は天然抗体の定常領域と実質的に似ている構造を有する一方、後者は「完全長重鎖定常領域の一部」のみを含む。例示的に、典型的な「完全長抗体重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン－ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインからなり、抗体がＩｇＥである場合、それはＣＨ４ドメインをさらに含み、抗体が重鎖抗体である場合、それはＣＨ１ドメインを含まない。例示的に、典型的な「重鎖定常領域断片」は、ＣＨ１、Ｆｃ又はＣＨ３ドメインから選択されてもよい。
【0090】
本明細書において、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖のカルボキシル末端部分を指し、それは、抗体と抗原との結合に直接関与せず、前記軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定常λドメインから選択されてもよい。
【0091】
本明細書において、「Ｆｃ」という用語は、インタクトな抗体をパパインによって加水分解して生成された抗体カルボキシ末端部分を指し、典型的に、それは、抗体のＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む。Ｆｃ領域は、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界がわずかに変化可能であるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位置のアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシ末端まで延びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基４４７）が、例えば、抗体の産生もしくは精製中、又は抗体の重鎖をコードする核酸に対する組換え及び操作によって除去され得るため、Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を含むか又は含まなくてもよい。
【0092】
本明細書において、「保存的アミノ酸」という用語は、通常、同一のクラスに属するか又は類似している特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性、親水性、主鎖のコンホメーション及び剛性）を有するアミノ酸を指す。例示的に、下記各群のアミノ酸は、互いの保存的アミノ酸残基に属し、群内のアミノ酸残基の置換は保存的アミノ酸の置換に属する：
例示的に、以下の６つの群は、互いの保存的置換であると考えられるアミノ酸の例であり、
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
例示的に、以下の６つの群は、互いの保存的置換であると考えられるアミノ酸の例であり、
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【0093】
本明細書において、「同一性」は以下の方式によって計算して得られる：二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の「同一性」の割合を確定するために、最適な比較を目的として前記配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入するか又は比較するために非相同配列を棄却してもよい）。その後に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列中の対応する位置における同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、前記分子はこの位置において同じである。
【0094】
この二つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、二つの配列の間の同一性の割合は、前記配列に共通する同じ位置の変化に従って変化する。
【0095】
二つの配列の間の配列比較及び同一性割合の計算は、数学的アルゴリズムを利用して実現され得る。例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのアミノ酸配列の間の同一性割合を確定する。さらに例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びにギャップ重み４０、５０、６０、７０又は８０及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定する。特に好ましいパラメータセット（及び別段の説明がない限り使用されるべきパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。
【0096】
さらに、ＰＡＭ１２０重み付け余数表、ギャップ長さペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム、（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７）を利用して、二つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定することができる。
【0097】
任意選択的に、本出願に記載の核酸配列及びタンパク質配列は、共通データベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバー配列又は関連する配列を同定するために、「照会配列」としてさらに使用されてもよい。例えば、このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）により実行することができる。本出願の核酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア＝１００、ワード長さ＝１２であるＮＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施してもよい。本出願のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、スコア＝５０、ワード長さ＝３であるＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためにギャップありアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載のように使用してもよい。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【0098】
本明細書において、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、免疫エフェクター細胞で発現し、且つ抗原に特異的に結合するように改造された人工細胞表面受容体を指し、それは、少なくとも（１）細胞外抗原結合ドメイン、例えば、抗体の可変重鎖又は軽鎖、（２）ＣＡＲを免疫エフェクター細胞に進入するようにアンカリングする膜貫通ドメイン、及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを利用して、選択された標的、例えば、癌細胞にＴ細胞及び他の免疫エフェクター細胞を非ＭＨＣ拘束的にリダイレクトすることができる。
【0099】
本明細書において、「核酸」という用語は、ヌクレオチドを含むポリマーの任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、特にプリン又はピリミジン塩基（即ちシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ちデオキシリボース又はリーボス）及びリン酸基からなる。通常、核酸分子は、塩基の配列により説明され、これにより前記塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’～３’で表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とゲノムＤＮＡとを含むデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、リーボス核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及び二つ又はそれ以上のこれらの分子の混合を含むポリマーを包含する。核酸分子は、線状又は環状であってもよい。また、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方、及び一本鎖と二本鎖の形態を含む。そして、本文に記載の核酸分子は、天然に存在するか又は非天然に存在するヌクレオチドを含んでもよい。非天然に存在するヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子をさらに包含し、ベクターとして本出願の抗体をインビトロ及び／又はインビボで、例えば、宿主又は患者において直接発現することに適する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくても又は修飾されていてもよい。例えば、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するようにｍＲＮＡを化学的に修飾してもよく、それによってｍＲＮＡを被験体に注入して体内で抗体を産生することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１７年６月１２日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１を参照されたい）。本明細書において、「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、下記細胞に含有される核酸分子を含み、前記細胞は、通常、該核酸分子を含有するが、該核酸分子は、染色体外に存在するか又はその天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。
【0100】
本明細書において、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を増幅させることができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに統合されるベクターを含む。いくつかのベクターは、それらに操作可能に連結される核酸の発現を指導することができ、このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【0101】
本明細書において、「宿主細胞」は、細胞に外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それは、継代数を考慮せず、初代の形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸物質について親細胞と完全に同じではない場合があり、突然変異を含んでもよい。本明細書において、初期に形質転換された細胞からスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫を含む。
【0102】
本明細書において、「薬物組成物」は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形態で存在し、且つ前記薬物組成物が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する他の成分を含有しない製剤を指す。
【0103】
本明細書において、「治療」という用語は、外科手術又は薬物処置（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指し、その目的は、治療対象における望ましくない生理的変化又は病変、例えば、癌の進行を予防、減速（減少）させることである。有益な又は望ましい臨床結果は、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の軽減、疾患程度の低下、疾患状態の安定化（即ち、悪化していない）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的寛解又は完全な寛解を問わず）を含むが、それらに限らない。治療を必要とする対象は、障害又は疾患に罹患している対象、及び障害又は疾患に罹患しやすい対象、又は障害又は疾患を予防しようとする対象を含む。減速、軽減、低下、緩和、寛解などの用語が言及されている場合、その意味には、除去、消失、発生しないなどの場合も含まれている。
【0104】
本明細書において、「被験体」という用語は、本出願に記載の特定の疾患又は障害に対する治療を受ける生体を指す。対照及び患者の例は、疾患又は障害の治療を受ける哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類動物（例えば、サル）又は非霊長類哺乳動物を含む。
【0105】
本明細書において、「有効量」という用語は、細胞、組織又は対象に単独で又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合、疾患障害又は該疾患の進行を有効に防止又は寛解することができる治療剤用量を指す。「有効量」はさらに、症状を寛解し、例えば、関連する医学的障害を治療、治癒、防止もしくは寛解するか、又はこれらの障害を治療、治癒、防止もしくは寛解する速度を増加させるのに十分な化合物の用量を指す。活性成分を個体に単独で投与する場合、治療有効用量は該成分のみを指す。ある組み合わせを適用する場合、治療有効用量は、組み合わせ、連続投与又は同時投与のいずれであっても、治療効果を導く活性成分の組み合わせ用量を指す。
【0106】
本明細書において、「癌」という用語は、哺乳動物で典型的に、無秩序な細胞成長を特徴とする生理的状態を指すか又は説明する。この定義には、良性及び悪性の癌が含まれる。本明細書において、「腫瘍」又は「腫」は、悪性又は良性を問わず、全ての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、互いに排他的というわけではない。
【0107】
本明細書において、「ＥＣ５０」という用語は、半最大有効濃度を指し、それは、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の途中応答を誘導する抗体濃度を含む。ＥＣ５０は、本質的に、その最大作用が観察される抗体濃度の５０％を表し、当分野に既知の方法によって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0108】
【図1】Ｊｕｒｋａｔ細胞とＳＰ３４、ＯＫＴ３抗体とのＦＡＣＳ検出結果である。
【図2】ＳＰ３４抗体によるヒトＴ細胞表面におけるＣＤ３の発現の検出を示した図である。
【図3】ＳＰ３４抗体によるサルＴ細胞表面におけるＣＤ３の発現の検出を示した図である。
【図4】ＦＡＣＳによるヒト／マウスキメラ抗体とヒトＴ細胞との結合の検出を示した図である。
【図5】ＦＡＣＳによるヒト／マウスキメラ抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合の検出を示した図である。
【図6】ＦＡＣＳによるヒト／マウスキメラ抗体とサルＴ細胞との結合の検出を示した図である。
【図7】ルシフェラーゼレポーター遺伝子により検出された、ヒト／マウスキメラ抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞のシグナル経路の活性化を示した図である。
【図8】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体とヒトＣＤ３ε／δタンパク質との結合反応の検出を示した図である。
【図9】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体とヒトＣＤ３εタンパク質との結合反応の検出を示した図である。
【図10】ＦＡＣＳによるヒト化抗体とヒトＴ細胞との結合反応の検出を示した図である。
【図11】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体とサルＣＤ３ε／δとの結合反応の検出を示した図である。
【図12】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体とサルＣＤ３εとの結合反応の検出を示した図である。
【図13】ＦＡＣＳによるヒト化抗体とサルＴ細胞との結合反応の検出を示した図である。
【図14】ＦＡＣＳにより検出された、ヒト化抗体によるＴ細胞の活性化の反応を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0109】
以下では、具体的な実施例を参照しながら本出願をさらに説明し、本出願の利点及び特徴は説明により明らかになるであろう。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、従来の条件又はメーカーが提案した条件に従って実施する。使用される試薬又は機器はメーカーが明記されていない場合、いずれも市販で購入することができる一般的な製品である。
【0110】
本出願の実施例は、例示に過ぎず、本出願の範囲を制限するものではない。当業者であれば、本出願の精神及び範囲を逸脱することなく本出願の技術案の詳細及び形態に対して修正又は置換を行うことができるが、これらの修正及び置換がいずれも本出願の保護範囲内に含まれることを理解するであろう。
【0111】
実施例１ 対照抗体の製造
陽性対照抗体（ＶＨ、ＶＬ配列の詳細は表１を参照）：ＳＰ３４、ＯＫＴ３、Ｉ２Ｃ、４０Ｇ５ｃ、Ｆ２Ｂ及び７２２１Ｇ２０は、いずれもヒトＣＤ３の抗体を認識し、ここで、ＳＰ３４、Ｉ２Ｃ及び４０Ｇ５ｃクローンは、ヒトＣＤ３εタンパク質、ＣＤ３ε／δヘテロ二量体及びＣＤ３γ／δヘテロ二量体を認識し、ＯＫＴ３、Ｆ２Ｂ及び７２２１Ｇ２０クローンは、ヒトＣＤ３ε／δヘテロ二量体のみを認識する。
陽性対照抗体（ＶＨ、ＶＬ配列の詳細は表１を参照）：ＳＰ３４、ＯＫＴ３、Ｉ２Ｃ、４０Ｇ５ｃ、Ｆ２Ｂ及び７２２１Ｇ２０は、いずれもヒトＣＤ３の抗体を認識し、ここで、ＳＰ３４、Ｉ２Ｃ及び４０Ｇ５ｃクローンは、ヒトＣＤ３εタンパク質、ＣＤ３ε／δヘテロ二量体及びＣＤ３γ／δヘテロ二量体を認識し、ＯＫＴ３、Ｆ２Ｂ及び７２２１Ｇ２０クローンは、ヒトＣＤ３ε／δヘテロ二量体のみを認識する。
【0112】
陽性対照抗体の製造方法は以下のとおりであり、陽性対照抗体の軽鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１の軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＬＫクローニングし、重鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＨ１にクローニングして、ＳＰ３４－ｈＩｇＧ１、ＯＫＴ３－ｈＩｇＧ１、Ｉ２Ｃ－ｈＩｇＧ１、４０Ｇ５ｃ－ｈＩｇＧ１、７２２１Ｇ２０－ｈＩｇＧ１及びＦ２Ｂ－ｈＩｇＧ１を得て、以下では、それぞれＳＰ３４、ＯＫＴ３、Ｉ２Ｃ、４０Ｇ５ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂと略称される。確立された標準的な分子生物学的方法に従ってプラスミドを製造し、具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。また、同じ方法に従って抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をそれぞれ、シグナルペプチドとマウスＩｇＧ１軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＭＬＫ、及びシグナルペプチドとマウスＩｇＧ１重鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＭＨ１にクローニングした。具体的な配列情報は表１を参照されたい。
【0113】
ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号：２４７６５－１）の取扱説明書に従って、発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞バンクから購入）に一過的にトランスフェクトし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＴＭ ２９３（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１２３３８０１８）を用いて、３７℃で５日間連続的に培養し、遠心分離して細胞成分を除去して、抗体を含有する培養上清を得た。培養上清をプロテインＡクロマトグラフィー用カラム（プロテインＡフィーラーＡＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｉａｍｏｎｄ及びクロマトグラフィー用カラムＢＸＫ１６／２６はいずれも博格隆から購入、カタログ番号：ＡＡ０２７３及びＢ－１６２０）にサンプリングし、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後に２０ｍＭ ＰＢ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．２）で洗浄し、最後にｐＨ３．４のクエン酸緩衝液で溶出させ、プロテインＡクロマトグラフィー用カラムから溶出した抗体を収集し、１／１０体積のｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓで中和し、ＰＢＳにより４℃の条件で一晩透析し、透析されたタンパク質を０．２２マイクロメートルの濾過膜で無菌濾過した後に－８０℃で分注して保存した。
【0114】
陰性対照抗体ｈＩｇＧ１は、鶏卵リゾチームに対する抗体抗ｈｅｌ－ｈＩｇＧ１（百英から購入、カタログ番号：Ｂ１１７９０１）であり、以下ではｈＩｇＧ１と略称される。
【0115】
陰性対照抗体ｍＩｇＧ１は、鶏卵リゾチームに対する抗体抗ｈｅｌ－ｍＩｇＧ１（百英から購入、カタログ番号：Ｂ１１８３０１）であり、ｍＩｇＧ１と略称される。
【0116】
【表1-1】
【表1-2】
【0117】
実施例２ ＣＤ３を発現する細胞の同定
２．１ ＣＤ３を内因的に発現する細胞株の同定
浮遊細胞のＪｕｒｋａｔ細胞（中国科学院細胞バンクから購入）をＴ－１７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。前のステップの細胞に対して細胞カウントを行った後、細胞ペレットを［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ］封入液で４×１０６個の細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、遠心分離して上清を除去し、開始濃度が１００ｎＭであり、１：５の勾配で希釈された検出抗体及びＩｇＧ陰性対照をウェルあたり１００μｌで加え、細胞を均一に混合し、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０８８）を加え、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で５回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ社から購入）により検出し、結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析して、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。ここで、検出抗体はＳＰ３４、ＯＫＴ３抗体であり、対照はｈＩｇＧ１である。分析結果は、表２及び図１に示すとおりである。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＳＰ３４及びＯＫＴ３に結合することができ、ｈＩｇＧ１に結合せず、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３抗体スクリーニングの陽性細胞とすることができる。
２．１ ＣＤ３を内因的に発現する細胞株の同定
浮遊細胞のＪｕｒｋａｔ細胞（中国科学院細胞バンクから購入）をＴ－１７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。前のステップの細胞に対して細胞カウントを行った後、細胞ペレットを［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ］封入液で４×１０６個の細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、遠心分離して上清を除去し、開始濃度が１００ｎＭであり、１：５の勾配で希釈された検出抗体及びＩｇＧ陰性対照をウェルあたり１００μｌで加え、細胞を均一に混合し、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０８８）を加え、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で５回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ社から購入）により検出し、結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析して、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。ここで、検出抗体はＳＰ３４、ＯＫＴ３抗体であり、対照はｈＩｇＧ１である。分析結果は、表２及び図１に示すとおりである。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＳＰ３４及びＯＫＴ３に結合することができ、ｈＩｇＧ１に結合せず、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３抗体スクリーニングの陽性細胞とすることができる。
【0118】
【表2】
【0119】
２．２ ＣＤ３を発現しない細胞株の同定
ＭＯＬＴ４細胞（中国科学院細胞バンクから購入、ＴＣＨＵ２２４）をＴ－１７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。ここで、検出抗体はＳＰ３４及びＯＫＴ３抗体であり、対照はｈＩｇＧ１である。分析結果は、表３に示すとおりである。その結果、ＭＯＬＴ４細胞は、ＳＰ３４及びＯＫＴ３に結合せず、ＭＯＬＴ４細胞は、ＣＤ３抗体スクリーニングの陰性細胞とすることができる。
ＭＯＬＴ４細胞（中国科学院細胞バンクから購入、ＴＣＨＵ２２４）をＴ－１７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。ここで、検出抗体はＳＰ３４及びＯＫＴ３抗体であり、対照はｈＩｇＧ１である。分析結果は、表３に示すとおりである。その結果、ＭＯＬＴ４細胞は、ＳＰ３４及びＯＫＴ３に結合せず、ＭＯＬＴ４細胞は、ＣＤ３抗体スクリーニングの陰性細胞とすることができる。
【0120】
【表3】
【0121】
２．３ ヒトＴ細胞の増幅
ヒトＰＢＭＣ細胞（澳賽爾斯生物技術（上海）有限公司から購入）に対して、Ｔ細胞活性化／増幅キット（Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト、ミルテニーから購入、カタログ番号：１３０－０９１－４４１））の取扱説明書の記述に従ってＴ細胞の増幅実験を完了した。細胞を１４日間培養した後、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体としてＳＰ３４抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を用い、実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表４及び図２に示すとおりである。その結果、ヒトＰＢＭＣを増幅することによりＣＤ３陽性Ｔ細胞を得た。
ヒトＰＢＭＣ細胞（澳賽爾斯生物技術（上海）有限公司から購入）に対して、Ｔ細胞活性化／増幅キット（Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト、ミルテニーから購入、カタログ番号：１３０－０９１－４４１））の取扱説明書の記述に従ってＴ細胞の増幅実験を完了した。細胞を１４日間培養した後、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体としてＳＰ３４抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を用い、実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表４及び図２に示すとおりである。その結果、ヒトＰＢＭＣを増幅することによりＣＤ３陽性Ｔ細胞を得た。
【0122】
【表4】
【0123】
２．４ カニクイザルＴ細胞の増幅
カニクイザルＰＢＭＣ（以下ではサルＰＢＭＣと略称され、上海メディシロン生物医薬株式会社から購入）に対して、Ｔ細胞活性化／増幅キット（Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（非ヒト霊長目動物、ミルテニーから購入、カタログ番号：１３０－０９２－９１９））の取扱説明書の記述に従ってカニクイザル（以下は、サルと略称）Ｔ細胞の増幅実験を完了した。細胞を１４日間培養した後、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体としてＳＰ３４抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を用い、実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表５及び図３に示すとおりである。その結果、サルＰＢＭＣを増幅することによりＣＤ３陽性Ｔ細胞を得た。
カニクイザルＰＢＭＣ（以下ではサルＰＢＭＣと略称され、上海メディシロン生物医薬株式会社から購入）に対して、Ｔ細胞活性化／増幅キット（Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（非ヒト霊長目動物、ミルテニーから購入、カタログ番号：１３０－０９２－９１９））の取扱説明書の記述に従ってカニクイザル（以下は、サルと略称）Ｔ細胞の増幅実験を完了した。細胞を１４日間培養した後、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体としてＳＰ３４抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を用い、実施例２．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表５及び図３に示すとおりである。その結果、サルＰＢＭＣを増幅することによりＣＤ３陽性Ｔ細胞を得た。
【0124】
【表5】
【0125】
実施例３ 抗ヒトＣＤ３ハイブリドーマモノクローナル抗体の製造
３．１ マウス免疫及びハイブリドーマ融合
免疫原として、ヒトＣＤ３ε－ＥＣＤを含有するタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、１０９７７－Ｈ０２Ｈ）を用い、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ ＡｎＮＣｒｌマウス、ＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス又はＣ５７マウス（いずれも上海斯莱克社から購入）を免疫した。初回免疫の際、免疫原をＴｉｔｅｒＭａｘ（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｔ２６８４）で乳化した後に皮下及び腹腔内にそれぞれ０．１ミリリットル注射し、即ち各マウスに５０マイクログラムの免疫原タンパク質を注射した。強化免疫の際、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号：７７１６１）を用いて、免疫原を皮下及び腹腔内にそれぞれ０．１ミリリットル注射し、即ち各マウスに２５マイクログラムの免疫原を注射した。
３．１ マウス免疫及びハイブリドーマ融合
免疫原として、ヒトＣＤ３ε－ＥＣＤを含有するタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、１０９７７－Ｈ０２Ｈ）を用い、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ ＡｎＮＣｒｌマウス、ＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス又はＣ５７マウス（いずれも上海斯莱克社から購入）を免疫した。初回免疫の際、免疫原をＴｉｔｅｒＭａｘ（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｔ２６８４）で乳化した後に皮下及び腹腔内にそれぞれ０．１ミリリットル注射し、即ち各マウスに５０マイクログラムの免疫原タンパク質を注射した。強化免疫の際、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号：７７１６１）を用いて、免疫原を皮下及び腹腔内にそれぞれ０．１ミリリットル注射し、即ち各マウスに２５マイクログラムの免疫原を注射した。
【0126】
脾細胞融合の３日前に、生理食塩水で調製した抗原溶液を５０μｇ／匹で皮下及び腹膜内に注射して、最後の強化免疫を行った。脾臓を分離した後、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号：Ａ１０４９２０１）を加え、脾細胞中にドープした赤血球を溶解し、脾細胞懸濁液を得た。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１０５６９－０１０）基礎培地を用いて、１分間あたり１０００回転で細胞を３回遠心分離し洗浄し、そして生細胞数２：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ－１５８１）と混合し、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１＋高効率電気融合法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２２０を参照）を用いて細胞融合を行った。融合後の細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、カタログ番号ＦＳＤ５００）、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号：Ｈ０２６２）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号：１０５６９－０１０）中に希釈し、前記パーセントは体積パーセントである。そして、ウェルあたり２×１０４／２００マイクロリットルで９６ウェルの細胞培養プレートに加え、５％ ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れて培養し、ハイブリドーマが抗体を分泌した後の培地上清をハイブリドーマ上清として、陽性クローンスクリーニングを行った。
【0127】
３．２マウスハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマ上清とヒトＣＤ３ε／δ－Ｈｉｓ（北京義翹神州科技有限公司から購入、カタログ番号：ＣＴ０３８－Ｈ２５０８Ｈ）及びサルＣＤ３ε／δ－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、ＣＤＤ－Ｃ５２Ｗ４）との結合をＥＬＩＳＡにより検出し、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした（以下の実施例１０．１を参照されたい）。ＥＬＩＳＡ陽性クローンのハイブリドーマ上清とＪｕｒｋａｔ細胞、サルＴ細胞との結合をフローサイトメトリーにより検出し、レポーター遺伝子システム（方法は、実施例２．１、実施例２．４及び以下の実施例７．１を参照）により、ハイブリドーマ上清がＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、カタログ番号ｊｋｔｌ－ｎｆａｔ）細胞を活性化する状況を検出した。ハイブリドーマ上清の検出結果に基づいて、優れたクローン（詳細は表６～８を参照）を選択し、拡大培養し、液体窒素で凍結保存すれば、本出願のハイブリドーマ細胞を得た。
ハイブリドーマ上清とヒトＣＤ３ε／δ－Ｈｉｓ（北京義翹神州科技有限公司から購入、カタログ番号：ＣＴ０３８－Ｈ２５０８Ｈ）及びサルＣＤ３ε／δ－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、ＣＤＤ－Ｃ５２Ｗ４）との結合をＥＬＩＳＡにより検出し、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした（以下の実施例１０．１を参照されたい）。ＥＬＩＳＡ陽性クローンのハイブリドーマ上清とＪｕｒｋａｔ細胞、サルＴ細胞との結合をフローサイトメトリーにより検出し、レポーター遺伝子システム（方法は、実施例２．１、実施例２．４及び以下の実施例７．１を参照）により、ハイブリドーマ上清がＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、カタログ番号ｊｋｔｌ－ｎｆａｔ）細胞を活性化する状況を検出した。ハイブリドーマ上清の検出結果に基づいて、優れたクローン（詳細は表６～８を参照）を選択し、拡大培養し、液体窒素で凍結保存すれば、本出願のハイブリドーマ細胞を得た。
【0128】
【表6】
【0129】
【表7】
【0130】
【表8】
【0131】
実施例４ ハイブリドーマ陽性クローンの軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列決定及びヒト／マウスキメラ抗体の産生
４．１ハイブリドーマ陽性クローンの軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列決定
対数増殖期にある陽性ハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５５９６－０１８）で十分に溶解した後に－８０℃で保存してアッセイに待った。試料は、蘇州金唯智生物科技有限公司に委託して、ハイブリドーマ陽性クローンの軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は表９に示すとおりであり、対応するＣＤＲは表１０に示すとおりである。
４．１ハイブリドーマ陽性クローンの軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列決定
対数増殖期にある陽性ハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５５９６－０１８）で十分に溶解した後に－８０℃で保存してアッセイに待った。試料は、蘇州金唯智生物科技有限公司に委託して、ハイブリドーマ陽性クローンの軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は表９に示すとおりであり、対応するＣＤＲは表１０に示すとおりである。
【0132】
【表9】
【0133】
【表10-1】
【表10-2】
【0134】
４．２ ヒト／マウスキメラ抗体の産生
泰州市百英生物科技有限公司に委託して、表９にリストされている重鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＨ１（重鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すとおりである）にクローニング、軽鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドと対応するヒト抗体ＩｇＧ１ κ軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＬＫ（軽鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すとおりである）又はシグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１のλ軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ＢＩＨＬ５（軽鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示すとおりである）にクローニングして、ヒト／マウスキメラ抗体の発現ベクターを得て、実施例１に示す方法を参照して、キメラ抗体を発現し精製した。
泰州市百英生物科技有限公司に委託して、表９にリストされている重鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＨ１（重鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すとおりである）にクローニング、軽鎖可変領域配列をそれぞれ、シグナルペプチドと対応するヒト抗体ＩｇＧ１ κ軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－Ｂ１ＨＬＫ（軽鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すとおりである）又はシグナルペプチドとヒト抗体ＩｇＧ１のλ軽鎖定常領域とを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ＢＩＨＬ５（軽鎖定常領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示すとおりである）にクローニングして、ヒト／マウスキメラ抗体の発現ベクターを得て、実施例１に示す方法を参照して、キメラ抗体を発現し精製した。
【0135】
【化1】
【0136】
実施例５ ＣＤ３ヒト／マウスキメラ抗体の同定
５．１ フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるキメラ抗体と異なるＣＤ３発現細胞との結合の検出
キメラ抗体と細胞表面ＣＤ３との結合を、検出抗体とＪｕｒｋａｔ細胞及びヒトＴ細胞との結合によって分析した。浮遊細胞のＪｕｒｋａｔ細胞をＴ－７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、待機した。増幅されたヒトＴ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、待機した。前のステップの細胞に対して細胞カウントを行った後、細胞ペレットを［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ］封入液で４×１０６個の細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、５０μｌ／ウェルで測定対象のキメラ抗体を加え、４℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を加え、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で５回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ、ＢＤ社から購入）により検出し、結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。それとともにキメラ抗体と内因性ＣＤ３陰性細胞であるＭＯＬＴ４細胞との結合を同じ方法で検出した。分析結果は、表１１－１～１１－４並びに図４Ａ～４Ｄ及び図５Ａ～５Ｃに示すとおりであり、キメラ抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びヒトＴ細胞に結合することができるが、ＭＯＬＴ４細胞に結合せず、良好な特異性を有する。また、キメラ抗体とヒトＴ細胞との結合は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株よりも抗体と免疫細胞上のＣＤ３との結合をより良く反映することができるため、８－１８．１キメラ抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合が検出されなかった。
５．１ フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるキメラ抗体と異なるＣＤ３発現細胞との結合の検出
キメラ抗体と細胞表面ＣＤ３との結合を、検出抗体とＪｕｒｋａｔ細胞及びヒトＴ細胞との結合によって分析した。浮遊細胞のＪｕｒｋａｔ細胞をＴ－７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、遠心分離して培地上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、待機した。増幅されたヒトＴ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、待機した。前のステップの細胞に対して細胞カウントを行った後、細胞ペレットを［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ］封入液で４×１０６個の細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、５０μｌ／ウェルで測定対象のキメラ抗体を加え、４℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を加え、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で５回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ、ＢＤ社から購入）により検出し、結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。それとともにキメラ抗体と内因性ＣＤ３陰性細胞であるＭＯＬＴ４細胞との結合を同じ方法で検出した。分析結果は、表１１－１～１１－４並びに図４Ａ～４Ｄ及び図５Ａ～５Ｃに示すとおりであり、キメラ抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びヒトＴ細胞に結合することができるが、ＭＯＬＴ４細胞に結合せず、良好な特異性を有する。また、キメラ抗体とヒトＴ細胞との結合は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株よりも抗体と免疫細胞上のＣＤ３との結合をより良く反映することができるため、８－１８．１キメラ抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合が検出されなかった。
【0137】
【表11】
【0138】
【表12】
【0139】
【表13】
【0140】
【表14】
【0141】
実施例６ キメラ抗体の種間交差結合活性の検出
６．１ ＦＡＣＳによるキメラ抗体とサルＣＤ３発現細胞との結合の検出
実施例２．４で凍結保存したサルＴ細胞に対して、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表１２－１～１２－３及び図６Ａ～６Ｄに示すとおりであり、全てのキメラ抗体は、いずれもサルＴ細胞との結合活性を有する。
６．１ ＦＡＣＳによるキメラ抗体とサルＣＤ３発現細胞との結合の検出
実施例２．４で凍結保存したサルＴ細胞に対して、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、表１２－１～１２－３及び図６Ａ～６Ｄに示すとおりであり、全てのキメラ抗体は、いずれもサルＴ細胞との結合活性を有する。
【0142】
【表15】
【0143】
【表16】
【0144】
【表17】
【0145】
【表18】
【0146】
実施例７ ＣＤ３キメラ抗体の機能同定
７．１ ルシフェラーゼレポーター遺伝子（レポーターアッセイ）によるキメラ抗体機能の検出
キメラ抗体によるＣＤ３細胞内のシグナル経路の活性化を検出するために、検出対象の抗体をＰＢＳで希釈し、開始濃度が１３３ｎＭであり、１：２の勾配で希釈した後、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた。蓋を閉め、３７℃で３時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。対数増殖期にあるＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、カタログ番号ｊｋｔｌ－ｎｆａｔ）を収集し、２％ ＦＢＳを含有する培地（ＲＰＭＩ １６４０、Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１２６３３０１２）で細胞濃度を２ｅ６／ｍＬに調節し、洗浄された９６ウェルプレートに細胞を２００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２４時間インキュベートした後に４００ｇを５分間遠心分離し、上清２０μＬを黒色の不透明な９６ウェル検出プレートに入れ、５０μＬの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃから購入、ブランド：Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｌｃ２）を加え、ＰｅｒｋｉＥｌｍｅｒ Ｅｎｓｉｇｈｔマイクロプレートリーダーによって応答値を読み取り、次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。結果は、表１３－１～１３－４及び図７Ａ～７Ｄに示すとおりであり、レポーターアッセイにおいて、全ての抗体は、いずれもＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞の下流シグナル経路を活性化することができる。
７．１ ルシフェラーゼレポーター遺伝子（レポーターアッセイ）によるキメラ抗体機能の検出
キメラ抗体によるＣＤ３細胞内のシグナル経路の活性化を検出するために、検出対象の抗体をＰＢＳで希釈し、開始濃度が１３３ｎＭであり、１：２の勾配で希釈した後、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた。蓋を閉め、３７℃で３時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。対数増殖期にあるＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入、カタログ番号ｊｋｔｌ－ｎｆａｔ）を収集し、２％ ＦＢＳを含有する培地（ＲＰＭＩ １６４０、Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１２６３３０１２）で細胞濃度を２ｅ６／ｍＬに調節し、洗浄された９６ウェルプレートに細胞を２００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２４時間インキュベートした後に４００ｇを５分間遠心分離し、上清２０μＬを黒色の不透明な９６ウェル検出プレートに入れ、５０μＬの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃから購入、ブランド：Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｌｃ２）を加え、ＰｅｒｋｉＥｌｍｅｒ Ｅｎｓｉｇｈｔマイクロプレートリーダーによって応答値を読み取り、次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。結果は、表１３－１～１３－４及び図７Ａ～７Ｄに示すとおりであり、レポーターアッセイにおいて、全ての抗体は、いずれもＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞の下流シグナル経路を活性化することができる。
【0147】
【表19】
【0148】
【表20】
【0149】
【表21】
【0150】
【表22】
【0151】
実施例８ ＣＤ３抗体の親和性アッセイ
８．１ キメラ抗体とヒトＣＤ３ε－Ｈｉｓプロテインとの親和性アッセイ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；２９－１２７－５５８）を用いて抗ヒトＣＤ３キメラ抗体を捕捉した。試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００６－６９）である。フローセルを２５℃に設定した。試料ブロックを１６℃に設定した。両方はいずれもランニング緩衝液で予め処理された。各サイクルにおいて、まずＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出対象抗体を捕捉し、そして単一濃度のＣＤ３ε抗原タンパク質（北京義翹神州科技有限公司から購入、カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８Ｈ）を注入し、抗体と抗原タンパク質との結合及び解離過程を記録し、最後にグリシン溶液（ｐＨ１．５、ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００３－５４）でチップの再生を完了した。溶液における異なる組換えヒトＣＤ３ε－ＥＣＤ Ｈｉｓを２４０秒間注射し続けることによって結合を測定し、ここで、流速は３０μＬ／分間であり、２００ｎＭから開始し（試験の実際の濃度は詳細な結果を参照）、１：１で希釈し、合計５個の濃度があった。解離相を６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発された。１０ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ１．５）を用いて３０μＬ／分間の流速で３０秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトＦｃ表面から得られた応答を減算することによってバルク屈折率（Ｂｕｌｋ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の差異を補正した。ブランク注射（＝二重参照）をも減算した。見かけのＫＤ及び他の動態学的パラメータを計算するために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。キメラ抗体とヒトＣＤ３ε－Ｈｉｓプロテインとの結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）及び結合親和性（ＫＤ）は、表１４に示すとおりである。キメラ抗体とヒトＣＤ３との親和性は、０．１ｎＭ～１０ｎＭである。
８．１ キメラ抗体とヒトＣＤ３ε－Ｈｉｓプロテインとの親和性アッセイ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；２９－１２７－５５８）を用いて抗ヒトＣＤ３キメラ抗体を捕捉した。試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００６－６９）である。フローセルを２５℃に設定した。試料ブロックを１６℃に設定した。両方はいずれもランニング緩衝液で予め処理された。各サイクルにおいて、まずＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出対象抗体を捕捉し、そして単一濃度のＣＤ３ε抗原タンパク質（北京義翹神州科技有限公司から購入、カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８Ｈ）を注入し、抗体と抗原タンパク質との結合及び解離過程を記録し、最後にグリシン溶液（ｐＨ１．５、ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００３－５４）でチップの再生を完了した。溶液における異なる組換えヒトＣＤ３ε－ＥＣＤ Ｈｉｓを２４０秒間注射し続けることによって結合を測定し、ここで、流速は３０μＬ／分間であり、２００ｎＭから開始し（試験の実際の濃度は詳細な結果を参照）、１：１で希釈し、合計５個の濃度があった。解離相を６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発された。１０ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ１．５）を用いて３０μＬ／分間の流速で３０秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトＦｃ表面から得られた応答を減算することによってバルク屈折率（Ｂｕｌｋ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の差異を補正した。ブランク注射（＝二重参照）をも減算した。見かけのＫＤ及び他の動態学的パラメータを計算するために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。キメラ抗体とヒトＣＤ３ε－Ｈｉｓプロテインとの結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）及び結合親和性（ＫＤ）は、表１４に示すとおりである。キメラ抗体とヒトＣＤ３との親和性は、０．１ｎＭ～１０ｎＭである。
【0152】
【表23】
【0153】
実施例９ 抗体のヒト化デザイン
マウス抗体６－４４．５、６－３５．２２、７－３５．６、８－１８．１、５－７．１３、５－４０．２１及び１－２２．６のヒト化デザイン：ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重鎖軽鎖可変領域の生殖細胞系列遺伝子データバンクをアラインメントすることによって、適切な配列をマウス抗体のヒト化軽鎖テンプレート及びヒト化重鎖テンプレートとして選んだ。まず、マウス抗体のＣＤＲをそれぞれそのヒト由来テンプレートのＦＲに移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序の可変領域配列を形成した。抗体の三次元構造シミュレーションに基づいて、元の親和性を保証するように、ヒト化抗体のＦＲ領域配列における鍵となるアミノ酸に対して復帰突然変異を行ってマウス抗体に対応するアミノ酸を形成した。また、具体的なニーズに応じて、ヒト化抗体のＣＤＲ領域配列における一部のアミノ酸を、突然変異させてヒト由来テンプレートに対応する相同のアミノ酸を形成することにより、ヒト化程度を向上させるか、又は突然変異させて他のアミノ酸を形成することにより、分子の物理化学的特性を最適化し（例えば、脱アミド修飾、グリコシル化修飾及び異性化が発生しやすい部位に対してｈｏｔ ｓｐｏｔ突然変異を行い）、ヒト化抗体を得た。本実施例の抗体のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムより確定され、注釈される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）。ここで、マウス抗体に対応するヒト化テンプレートは表１５を参照されたく、最終的なヒト化抗体に対応するＶＬ及びＶＨは表１６を参照されたく、具体的な配列は表１７を参照されたく、一部のヒト化抗体配列のＣＤＲ（ｈｏｔ ｓｐｏｔ突然変異が発生）は表１８を参照されたく、他のＣＤＲ配列は、ヒト化の前後に変化がなく、ここでは再度列挙しなかった。実施例４．２を参照してヒト化抗体を産生した。
マウス抗体６－４４．５、６－３５．２２、７－３５．６、８－１８．１、５－７．１３、５－４０．２１及び１－２２．６のヒト化デザイン：ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重鎖軽鎖可変領域の生殖細胞系列遺伝子データバンクをアラインメントすることによって、適切な配列をマウス抗体のヒト化軽鎖テンプレート及びヒト化重鎖テンプレートとして選んだ。まず、マウス抗体のＣＤＲをそれぞれそのヒト由来テンプレートのＦＲに移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序の可変領域配列を形成した。抗体の三次元構造シミュレーションに基づいて、元の親和性を保証するように、ヒト化抗体のＦＲ領域配列における鍵となるアミノ酸に対して復帰突然変異を行ってマウス抗体に対応するアミノ酸を形成した。また、具体的なニーズに応じて、ヒト化抗体のＣＤＲ領域配列における一部のアミノ酸を、突然変異させてヒト由来テンプレートに対応する相同のアミノ酸を形成することにより、ヒト化程度を向上させるか、又は突然変異させて他のアミノ酸を形成することにより、分子の物理化学的特性を最適化し（例えば、脱アミド修飾、グリコシル化修飾及び異性化が発生しやすい部位に対してｈｏｔ ｓｐｏｔ突然変異を行い）、ヒト化抗体を得た。本実施例の抗体のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムより確定され、注釈される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）。ここで、マウス抗体に対応するヒト化テンプレートは表１５を参照されたく、最終的なヒト化抗体に対応するＶＬ及びＶＨは表１６を参照されたく、具体的な配列は表１７を参照されたく、一部のヒト化抗体配列のＣＤＲ（ｈｏｔ ｓｐｏｔ突然変異が発生）は表１８を参照されたく、他のＣＤＲ配列は、ヒト化の前後に変化がなく、ここでは再度列挙しなかった。実施例４．２を参照してヒト化抗体を産生した。
【0154】
【表24】
【0155】
【表25】
【0156】
【表26】
【0157】
【表27】
【0158】
実施例１０ ヒト化抗体とヒトＣＤ３εとの結合能の同定
１０．１ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗体とＣＤ３タンパク質との結合の検出
ヒト化抗体とＣＤ３タンパク質との結合活性を検出するために、ＣＤ３タンパク質をＰＢＳで最終濃度の１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックフィルムで封止して４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、封入液［ＰＢＳ＋２％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ］を加え、室温で２時間ブロッキングした。封入液を捨て、開始濃度が１００ｎＭであり、１：１０の勾配で希釈された抗体又は陰性対照抗体を５０μＬ／ウェルで加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：３０９－０３５－０８８）を加え、３７℃で半時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を５０μＬ／ウェルで加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入）によりＯＤ４５０ｎｍの数値を読み取った。実験結果は、図８Ａ～８Ｇ、図９Ａ～９Ｇ及び表１９に示すとおりである。ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。表中のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。結果により、ＥＬＩＳＡ実験において、全てのヒト化抗体は、いずれもＣＤ３εタンパク質又はＣＤ３ε／δタンパク質との結合活性を有することが示された。
１０．１ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗体とＣＤ３タンパク質との結合の検出
ヒト化抗体とＣＤ３タンパク質との結合活性を検出するために、ＣＤ３タンパク質をＰＢＳで最終濃度の１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックフィルムで封止して４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、封入液［ＰＢＳ＋２％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ］を加え、室温で２時間ブロッキングした。封入液を捨て、開始濃度が１００ｎＭであり、１：１０の勾配で希釈された抗体又は陰性対照抗体を５０μＬ／ウェルで加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：３０９－０３５－０８８）を加え、３７℃で半時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を５０μＬ／ウェルで加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入）によりＯＤ４５０ｎｍの数値を読み取った。実験結果は、図８Ａ～８Ｇ、図９Ａ～９Ｇ及び表１９に示すとおりである。ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。表中のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。結果により、ＥＬＩＳＡ実験において、全てのヒト化抗体は、いずれもＣＤ３εタンパク質又はＣＤ３ε／δタンパク質との結合活性を有することが示された。
【0159】
【表28】
【0160】
【表29】
【0161】
【表30】
【0162】
１０．２ フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による抗体とＣＤ３発現細胞との結合の検出
増幅されたヒトＰＢＭＣ細胞を収集し、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、図１０Ａ～１０Ｇ及び表２０に示すとおりであり、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。結果により、ヒト化抗体は、ヒトＴ細胞表面のＣＤ３と特異的に結合することが示された。
増幅されたヒトＰＢＭＣ細胞を収集し、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、図１０Ａ～１０Ｇ及び表２０に示すとおりであり、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。結果により、ヒト化抗体は、ヒトＴ細胞表面のＣＤ３と特異的に結合することが示された。
【0163】
【表31】
【0164】
１０．３ 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗体とヒトＣＤ３εタンパク質との親和性の検出
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を用いて、ヒト化抗体とＣＤ３εタンパク質との親和性を測定し、実験方法は以下のとおりであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；２９－１２７－５５８）を用いて抗ヒトＣＤ３抗体を捕捉し、ランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００６－６９）である。フローセルを２５℃に設定した。試料ブロックを１６℃に設定した。両方はいずれもランニング緩衝液で予め処理された。各サイクルにおいて、まずＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出対象抗体を捕捉し、そして単一濃度のＣＤ３ε抗原タンパク質を注入し、抗体と抗原タンパク質との結合及び解離過程を記録し、最後にＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００３－５４）でチップの再生を完了した。溶液における異なる組換えヒトＣＤ３εを２４０秒間注射し続けることによって結合を測定し、ここで、流速は３０μＬ／分間であり、２００ｎＭから開始し（試験の実際の濃度は詳細な結果を参照）、１：１で希釈し、合計５個の濃度があった。解離相を６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発された。１０ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ １．５）を用いて３０μＬ／分間の流速で３０秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトＦｃ表面から得られた応答を減算することによってバルク屈折率（Ｂｕｌｋ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の差異を補正し、それとともにブランク注射（＝二重参照）をも減算した。見かけのＫＤ値及び他の動態学的パラメータを計算するために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。ヒト化抗体とヒトＣＤ３εタンパク質との結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）及び結合親和性（ＫＤ）は表２１～２２に示すとおりであり、検出された全てのヒト化抗体とヒトＣＤ３εとの親和性は約１ｎＭであり、ヒトＣＤ３ε／δとの親和性は１０～２００ｎＭである。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を用いて、ヒト化抗体とＣＤ３εタンパク質との親和性を測定し、実験方法は以下のとおりであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；２９－１２７－５５８）を用いて抗ヒトＣＤ３抗体を捕捉し、ランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００６－６９）である。フローセルを２５℃に設定した。試料ブロックを１６℃に設定した。両方はいずれもランニング緩衝液で予め処理された。各サイクルにおいて、まずＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出対象抗体を捕捉し、そして単一濃度のＣＤ３ε抗原タンパク質を注入し、抗体と抗原タンパク質との結合及び解離過程を記録し、最後にＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００３－５４）でチップの再生を完了した。溶液における異なる組換えヒトＣＤ３εを２４０秒間注射し続けることによって結合を測定し、ここで、流速は３０μＬ／分間であり、２００ｎＭから開始し（試験の実際の濃度は詳細な結果を参照）、１：１で希釈し、合計５個の濃度があった。解離相を６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発された。１０ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ １．５）を用いて３０μＬ／分間の流速で３０秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトＦｃ表面から得られた応答を減算することによってバルク屈折率（Ｂｕｌｋ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の差異を補正し、それとともにブランク注射（＝二重参照）をも減算した。見かけのＫＤ値及び他の動態学的パラメータを計算するために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。ヒト化抗体とヒトＣＤ３εタンパク質との結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）及び結合親和性（ＫＤ）は表２１～２２に示すとおりであり、検出された全てのヒト化抗体とヒトＣＤ３εとの親和性は約１ｎＭであり、ヒトＣＤ３ε／δとの親和性は１０～２００ｎＭである。
【0165】
【表32】
【0166】
【表33】
【0167】
実施例１１ ヒト化抗体の交差結合活性の同定
１１．１ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合の検出
ヒト化抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合活性を検出するために、ＣＤ３タンパク質をＰＢＳで最終濃度の１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、１０．１のＥＬＩＳＡ検出方法に従ってヒト化抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合反応を検出し、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。分析結果は図１１Ａ～１１Ｇ、図１２Ａ～１２Ｇ及び表２３に示すとおりであり、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。結果により、ＥＬＩＳＡ実験において、全てのヒト化抗体は、サルＣＤ３タンパク質との結合活性を有することが示された。
１１．１ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合の検出
ヒト化抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合活性を検出するために、ＣＤ３タンパク質をＰＢＳで最終濃度の１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、１０．１のＥＬＩＳＡ検出方法に従ってヒト化抗体とサルＣＤ３タンパク質との結合反応を検出し、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。分析結果は図１１Ａ～１１Ｇ、図１２Ａ～１２Ｇ及び表２３に示すとおりであり、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。結果により、ＥＬＩＳＡ実験において、全てのヒト化抗体は、サルＣＤ３タンパク質との結合活性を有することが示された。
【0168】
【表34】
【0169】
１１．２ フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による抗体とサルＴ細胞との結合の検出
増幅されたサルＴ細胞を収集し、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、図１３Ａ～１３Ｇ及び表２４に示すとおりであり、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。結果により、全てのヒト化抗体は、サルＴ細胞表面のＣＤ３との特異的結合反応を有することが示された。
増幅されたサルＴ細胞を収集し、実施例５．１の方法に従ってＦＡＣＳ検出及びデータ分析を行った。分析結果は、図１３Ａ～１３Ｇ及び表２４に示すとおりであり、ここで、ＩｇＧ対照はｈＩｇＧ１であり、４０Ｇ５ｃ、Ｉ２Ｃ、７２２１Ｇ２０及びＦ２Ｂは陽性対照である。結果により、全てのヒト化抗体は、サルＴ細胞表面のＣＤ３との特異的結合反応を有することが示された。
【0170】
【表35】
【0171】
実施例１２ ヒト化抗体の機能同定
ヒト化抗体によるＣＤ３細胞内のシグナル経路の活性化を検出するために、検出対象の抗体を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０で希釈し、開始濃度が１＊２μｇ／ｍＬであり、１：５の勾配で希釈し、そして１００μｌ／ウェルで９６ウェルの丸底細胞培養プレートに加えた。凍結保存されたＰＢＭＣ（奥賽爾斯から購入）を蘇生し、細胞濃度を１ｅ６／ｍＬに調節し、抗体が入れた細胞培養プレートに細胞をウェルあたり１００μＬで加えた。３７℃のインキュベーター中で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で１回遠心分離し洗浄した。調製されたＦＡＣＳ染色試薬（抗－ＣＤ２５－ＰＥは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入され、カタログ番号が３０２６０２であり、抗－ＣＤ６９－ＦＩＴＣは、ＢＤから購入され、カタログ番号が５５５５３０である）をウェルあたり５０μＬで加え、４℃で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ、ＢＤ社から購入）で検出し結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析した。分析結果は、図１４Ａ～１４Ｅに示すとおりであり、全てのヒト化抗体は、ヒトＰＢＭＣに対して異なる程度の活性化作用を有した。
ヒト化抗体によるＣＤ３細胞内のシグナル経路の活性化を検出するために、検出対象の抗体を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０で希釈し、開始濃度が１＊２μｇ／ｍＬであり、１：５の勾配で希釈し、そして１００μｌ／ウェルで９６ウェルの丸底細胞培養プレートに加えた。凍結保存されたＰＢＭＣ（奥賽爾斯から購入）を蘇生し、細胞濃度を１ｅ６／ｍＬに調節し、抗体が入れた細胞培養プレートに細胞をウェルあたり１００μＬで加えた。３７℃のインキュベーター中で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で１回遠心分離し洗浄した。調製されたＦＡＣＳ染色試薬（抗－ＣＤ２５－ＰＥは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入され、カタログ番号が３０２６０２であり、抗－ＣＤ６９－ＦＩＴＣは、ＢＤから購入され、カタログ番号が５５５５３０である）をウェルあたり５０μＬで加え、４℃で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ、ＢＤ社から購入）で検出し結果を分析した。ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータを分析し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析した。分析結果は、図１４Ａ～１４Ｅに示すとおりであり、全てのヒト化抗体は、ヒトＰＢＭＣに対して異なる程度の活性化作用を有した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１－３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１－３を含み、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は表１０又は表１８から選択され、好ましくは、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～７２、３１～３３、４４～４６、５７～５９、８３～８５、９６～９８及び１０９～１１１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～７５、３４～３６、１３７、４７～４９、６０～６２、８６～８８、９９～１０１及び１１２～１１４のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６～７７、３７～３８、１３８～１３９、５０～５１、１４２～１４３、６３～６４、８９～９０、１０２～１０３及び１１５～１１６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び／又は
前記ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８～７９、３９～４０、１４０～１４１、５２～５３、６５～６６、９１～９２、１０４～１０５及び１１７～１１８のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０～８１、４１～４２、５４～５５、６７～６８、９３～９４、１０６～１０７及び１１９～１２０のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び
前記ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、４３、５６、６９、９５、１０８及び１２１のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも３つのアミノ酸突然変異を有する配列を含み、
さらに好ましくは、前記ＨＣＤＲ１－３及び／又は前記ＬＣＤＲ１－３は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴ方法に従って確定される、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、２３、１７、１９、２１、２５、２７、２９、１２４、１２８、１３０、１３２、１３４及び１３６のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異を有する配列を含み、及び／又は前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５、２４、１８、２０、２２、２６、２８、３０、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３及び１３５のうちのいずれか一つに示される配列、又はそれに比べて少なくとも７０％の同一性もしくは多くとも１５個のアミノ酸突然変異を有する配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記少なくとも７０％の同一性は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性であり、及び／又は前記多くとも３つの突然変異は、多くとも３、２、１又は０個の突然変異であり、及び／又は前記多くとも１５個の突然変異は、多くとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個の突然変異であり、好ましくは、前記突然変異は、挿入、欠失又は置換であり、さらに好ましくは、前記置換は、保存的アミノ酸置換であり、最も好ましくは、前記突然変異は、復帰突然変異又はホットスポット突然変異である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３に示すとおりであり、又は、
前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６に示すとおりであり、
前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５に示すとおりである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、任意選択的に、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択され、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４から選択され、さらに好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３から選択され、及び／又は
前記軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖から選択され、
好ましくは、前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、操作された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、インタクトな抗体、インタクトな抗体の断片、裸抗体、抱合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ及び単一ドメイン抗体から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合断片は、治療剤又はトレーサーとコンジュゲートし、好ましくは、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬及び免疫調節剤から選択され、及び／又は前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合断片は、さらにサルＣＤ３に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
前記ＣＤ３は、ＣＤ３εサブユニット、及びＣＤ３εサブユニットを含む二量体、例えば、ＣＤ３ε／δ二量体から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
多重特異性抗原結合分子であって、前記多重特異性抗原結合分子は、少なくとも第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分とを含み、前記第１の抗原結合部分は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、及び／又は前記第２の抗原結合部分は、前記第１の抗原結合部分と異なる他の標的に結合するか又は同じ標的の異なるエピトープに結合し、好ましくは、前記他の標的は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）から選択され、任意選択的に、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、多重特異性抗原結合分子。
【請求項11】
単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードし、任意選択的に、前記核酸分子は、さらにキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項14】
免疫エフェクター細胞であって、キメラ抗原受容体を発現し、及び／又は請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現し、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、単球、マクロファージ、樹状細胞及び肥満細胞から選択され、さらに好ましくは、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞から選択され、及び／又は
好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、自家免疫エフェクター細胞又は同種異体免疫エフェクター細胞である、免疫エフェクター細胞。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、前記方法は、（１）所定のベクターを含む細胞を培養すること、及び／又は（２）前記細胞により発現される抗体もしくはその抗原結合断片、又は多重特異性抗原結合分子を単離することを含み、前記所定のベクターは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードし、かつ、任意選択的に、さらにキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸分子を含む、方法。
【請求項16】
免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、前記方法は、（１）ａ．キメラ抗原受容体をコードする核酸分子及びｂ．請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片をコードする核酸分子を初期免疫エフェクター細胞に導入すること、及び／又は（２）上記核酸分子が導入された免疫エフェクター細胞に、キメラ抗原受容体及び請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を発現させることを含む、方法。
【請求項17】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は助剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項18】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の、腫瘍又は癌を治療する医薬品の製造における用途であって、好ましくは、前記腫瘍又は癌は、血液腫瘍及び固形腫瘍から選択され、さらに好ましくは、前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性期ＣＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｒｉｃｈｔｅｒ症候群、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）と小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）とを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症及びバーキットリンパ腫から選択され、及び／又は前記固形腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、胃食道癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌及び肝臓癌から選択される、用途。
【国際調査報告】