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▶ イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】疾患の治療における使用のための多重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240905BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240905BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240905BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/21
C12N5/10
C12N1/19
C12P21/08
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516472
(86)(22)【出願日】2022-09-14
(85)【翻訳文提出日】2024-05-13
(86)【国際出願番号】 IL2022050995
(87)【国際公開番号】W WO2023042202
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】286430
(32)【優先日】2021-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500018608
【氏名又は名称】イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド
【住所又は居所原語表記】ａｔ ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＰＯ Ｂｏｘ ９５，７６１０００２ Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アミット、イド
(72)【発明者】
【氏名】ダハン、ローニ
(72)【発明者】
【氏名】シャピール、ユヴァル
(72)【発明者】
【氏名】バルボーイ、オーレン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
多重特異性抗体が提供される。その抗体は、腫瘍内Ｔ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する第１抗原結合部分と、従来型樹状細胞１（ｃＤＣ１）に特異的に結合する第２抗原結合部分とを含む。また、がん治療におけるそのような抗体の使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍内Ｔ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する第１抗原結合部分と、従来型樹状細胞１（ｃＤＣ１）に特異的に結合する第２抗原結合部分とを含む多重特異性抗体。
【請求項2】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲおよびＯＸ－４０からなる群より選択される請求項１記載の多重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１抗原結合部分が、Ｔ細胞のＰＤ－１とＰＤＬ－１発現細胞との間の結合を阻止する請求項１記載の多重特異性抗体。
【請求項4】
前記第２抗原結合部分が、Ｃｌｅｃ９ａと結合する請求項１～３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項5】
前記免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ－１である請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項6】
前記第１抗原結合部分が、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号１～３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号４～６に規定される相補性決定領域とを含む請求項５記載の多重特異性抗体。
【請求項7】
前記第１抗原結合部分が、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号１１～１３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号１４～１６に規定される相補性決定領域とを含む請求項５記載の多重特異性抗体。
【請求項8】
前記第２抗原結合部分が、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号２１～２３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号２４～２６に規定される相補性決定領域とを含む請求項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項9】
前記第２抗原結合部分が、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号３１～３３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号３４～３６に規定される相補性決定領域とを含む請求項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項10】
前記多重特異性抗体のＦｃ領域は、前記抗体のＦｃγＲへの結合を低下させる役割を果たす変異を含む請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項11】
ノブ・イントゥ・ホール変異を含む請求項１～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項12】
前記変異が、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む当該多重特異性抗体の第１抗体のＣＨ３ドメインに、およびＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを含む該多重特異性抗体の第２抗体のＣＨ３ドメインに、存在する請求項１１記載の多重特異性抗体。
【請求項13】
前記第１部分が、配列番号７および８；または配列番号１７および１８に規定されるアミノ酸配列を含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項14】
前記第１部分が、配列番号２７および２８；または配列番号３７および３８に規定されるアミノ酸配列を含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項15】
二重特異性抗体である請求項１～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項16】
がんの治療における使用のための請求項１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を含む医薬組成物。
【請求項18】
請求項１～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項19】
請求項１８記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項20】
請求項１９記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項21】
（ａ）請求項２０記載の細胞を多重特異性抗体の発現を可能とする条件下で培養すること；および（ｂ）多重特異性抗体を細胞から単離すること
を含む多重特異性抗体の製造方法。
【請求項22】
必要とする対象におけるがんの治療方法であって、対象に治療上有効な量の請求項１７記載の医薬組成物を投与し、それにより対象のがんを治療することを含む方法。
【請求項23】
前記がんの腫瘍が、所定のレベルよりも上のＴ細胞：樹状細胞比を有することにより特徴づけられる請求項２２記載の方法。
【請求項24】
がんが、膀胱がん、乳がん、子宮／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、大腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、胚細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんからなる群より選択される請求項１６記載の多重特異性抗体または請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願］
本出願は、２０２１年９月１４日に出願されたイスラエル国特許出願第２８６４３０号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月１４日に出願されたイスラエル国特許出願第２８６４３０号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
［配列表陳述］
本出願と同時に提出された、２０２２年９月１４日に作成された５２，０７５バイトからなる９３９４９．ｘｍｌとの表題のＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願と同時に提出された、２０２２年９月１４日に作成された５２，０７５バイトからなる９３９４９．ｘｍｌとの表題のＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
［技術分野］
本発明は、そのいくつかの実施態様において、疾患の治療に使用するための多重特異性抗体に関する。
本発明は、そのいくつかの実施態様において、疾患の治療に使用するための多重特異性抗体に関する。
【背景技術】
【0004】
近年、免疫療法は多数の種類のがんの治療に革命をもたらしている。免疫療法の中でも特に期待されているのがチェックポイント阻害剤療法である。がん細胞は、免疫チェックポイント、すなわち免疫系の活性を抑制するためのシグナルを出す経路を「ハイジャックする」ことにより免疫系を回避する。チェックポイント阻害剤治療は、免疫細胞によるこの抑制的シグナル伝達をブロックし、それによって免疫系が悪性細胞を攻撃できるようにする。抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）などの承認されたチェックポイント阻害剤は、すでに多くの種類のがんに対する第一選択薬となっている。しかし、ほとんどの患者はこれらの阻害剤に応答せず、また急速に耐性を獲得する患者もいる。したがって、この治療法の有効性を高める方法を見つけることが、主要な研究目標である。
【0005】
腫瘍細胞は細胞傷害性Ｔ細胞のサブタイプによって破壊される。これらの細胞は、ＣＤ８と呼ばれる糖タンパク質の存在を必要とする相互作用であるクラスＩ ＭＨＣ分子を識別して結合することにより、がん細胞を認識する。したがって、細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞としても知られている。しかしながら、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内での抗ＰＤ－１薬力学を探索した最近の研究では、抗ＰＤ－１療法の成功にはＴ細胞と樹状細胞（ＤＣｓ）の相互作用が不可欠であることが示された。さらに、従来の１型樹状細胞（ｃＤＣ１ｓ）が抗腫瘍免疫に重要であることも示された［１］。このＴ細胞とＤＣのクロストークには、抗ＰＤ－１活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出と、腫瘍浸潤ＤＣｓによるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）の放出が関与しており、これらの細胞タイプ間でトランス的に作用して、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を効果的に刺激する。
【0006】
背景技術には、特許文献１が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０２１／０１３０４３８号明細書
【発明の概要】
【0008】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、腫瘍内Ｔ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する第１抗原結合部分と、従来型樹状細胞１（ｃＤＣ１）に特異的に結合する第２抗原結合部分を含む多重特異性抗体が提供される。
【0009】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、本明細書に記載された多重特異性抗体を含む医薬組成物が提供される。
【0010】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、本明細書に記載された多重特異性抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸配列が提供される。
【0011】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、本明細書に記載された核酸を含む発現ベクターが提供される。
【0012】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞が提供される。
【0013】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、
（ａ）多重特異性抗体の発現を可能にする条件下で本明細書に記載された細胞を培養する工程；および
（ｂ）細胞から多重特異性抗体を単離する工程
を含む多重特異性抗体を調製する方法が提供される。
（ａ）多重特異性抗体の発現を可能にする条件下で本明細書に記載された細胞を培養する工程；および
（ｂ）細胞から多重特異性抗体を単離する工程
を含む多重特異性抗体を調製する方法が提供される。
【0014】
本発明のいくつかの実施態様の一側面によれば、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、対象に治療上有効な量の請求項２０に記載の医薬組成物を投与し、それにより対象においてがんを治療することを含む、方法が提供される。
【0015】
本発明のいくつかの実施態様によれば、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲおよびＯＸ－４０からなる群より選択される。
【0016】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第１抗原結合部分は、Ｔ細胞のＰＤ－１とＰＤＬ－１発現細胞との結合を阻止する。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第２抗原結合部分は、ＸＣＲ１またはＣｌｅｃ９ａと結合する。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫チェックポイントタンパク質はＰＤ－１である。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１抗原結合部分は、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号１～３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号４～６に規定される相補性決定領域とを含む。
【0020】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第１抗原結合部分は、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号１１～１３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号１４～１６に規定される相補性決定領域とを含む。
【0021】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第２抗原結合部分は、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号２１～２３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号２４～２６に規定される相補性決定領域とを含む。
【0022】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第２抗原結合部分は、ＮからＣへの方向で重鎖に配列番号３１～３３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖に配列番号３４～３６に規定される相補性決定領域とを含む。
【0023】
本発明のいくつかの実施態様によれば、多重特異性抗体のＦｃ領域は、当該抗体のＦｃγＲへの結合を低下させる役割を果たす変異を含む。
【0024】
本発明のいくつかの実施態様によれば、多重特異性抗体はノブ・イントゥ・ホール（Knobs-into-holes）変異を含む。
【0025】
本発明のいくつかの実施態様によれば、変異は、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む当該多重特異性抗体の第１抗体のＣＨ３ドメインに、そしてＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを含む該多重特異性抗体の第２抗体のＣＨ３ドメインに存在する。
【0026】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第１部分は、配列番号７および８；または配列番号１７および１８に規定されるアミノ酸配列を含む。
【0027】
本発明のいくつかの実施態様によれば、第１部分は、配列番号２７および２８；または配列番号３７および３８に規定されるアミノ酸配列を含む。
【0028】
本発明のいくつかの実施態様によれば、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
【0029】
本発明のいくつかの実施態様によれば、多重特異性抗体は、がんの治療における使用のためのものである。
【0030】
本発明のいくつかの実施態様によれば、がんは、所定のレベルよりも上のＴ細胞：樹状細胞比を有することにより特徴づけられる。
【0031】
本発明のいくつかの実施態様によれば、膀胱がん、乳がん、子宮／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、大腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、胚細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんから選択される。
【0032】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の当業者によって共通して理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施態様の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾がある場合は、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、必ずしも限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【0033】
本発明のいくつかの実施態様を、添付の図面を参照して、例示のためにのみ、本明細書で説明する。ここで図面を具体的に詳細に参照すると、示された特定事項は、例示のためであり、本発明の実施態様の説明の議論のためのものであることが強調される。この点に関して、図面でなされた説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【0034】
【図1】１Ａ～１Ｄは、有効なＰＤ－１免疫療法がＴ／ＤＣクロストークに依存していることを示している。（１Ａ）腫瘍、脾臓、リンパ節からの抗ＰＤ－１処置後のＣＤ８＋ Ｔ細胞の包括的ｓｃＲＮＡ地図。（１Ｂ）抗ＰＤ－１治療に劇的に反応する細胞傷害性Ｔ細胞のサブセット。（１Ｃ）ＤＣの走化性リガンドＸＣＬ１は、ＰＤ－１に反応するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のサブセットによって高度かつ独自に発現される。（１Ｄ）ＸＣＲ１－ｉＤＴＲモデルを用いてαＰＤ－１投与の活性期でのｃＤＣ１の一時的な枯渇が、ＭＣ３８腫瘍モデルで期待された抗腫瘍応答を廃止する。腫瘍細胞を皮下に接種した。治療は、腫瘍が～５０ｍｍ３に達した接種７日後に開始した。治療は３日間隔で３回注射した。ジフテリア毒素は２０ｎｇ／ｇ体重で、接種後４日目から１日おきに注射した。（ｎ＝２０匹／群、ｐ＝０．０２０４、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００１およびｐ＝＜０．０００１、スチューデントｔ検定）。
【図2】２Ａ～２Ｃは、二重特異性抗体の作製と特性評価を示している。（２Ａ）二重特異性Ｔ細胞／ＤＣエンゲージャーの新規ファミリーの設計図。抗ＰＤ－１は特異的ＤＣマーカーを標的とする抗体と結合している。（２Ｂ）異なるコンストラクトのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。非還元サンプルの均質なバンドは、単一のヘテロ二量体へのアセンブリを確認する。サンプルの還元は、二重特異性ヘテロ二量体が、各パートナー抗体から２つの４つの抗体鎖を含むということを確認する。（２Ｃ）二重特異性抗体の分析的サイズ排除クロマトグラム；数字は抗体のネイティブ－ＩｇＧ構造形成分子量を示す。
【図3】３Ａ～３Ｄは、二重特異性エンゲージャーの単一抗原結合および遮断特性を示す。（３Ａ）それぞれｍＰＤ－１およびｍＣＬＥＣ９Ａへの結合を示すＥＬＩＳＡ。組換えタンパク質に対する単一特異性および二重特異性抗体の標準結合ＥＬＩＳＡ滴定アッセイ。（３Ｂ）ｍＸＣＲ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合を示すＦＡＣＳ。単一特異性および二重特異性抗体の標準結合滴定アッセイ。（３Ｃ）ＰＤ－１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳ遮断アッセイ。細胞はＢｉＳＥまたは親のｍＰＤ－１ ｍＡｂとインキュベートした後、ｍＰＤ－Ｌ１ビオチンとインキュベートした。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、結合されたストレプトアビジンで検出した。（３Ｄ）ＢｉＳＥ、対照ＰＤ－１／シナジス（Synagis）、親ＰＤ－１ ｍＡｂの用量依存的遮断能。
【図4】４Ａ～４Ｂは、インビトロにおける二重特異性エンゲージャーの二重抗原結合特性を示す。（４Ａ）各標的タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞に対するタブレット・エンゲージメント・アッセイ。ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅで染色した過剰発現細胞の１：１ミックスに対するＢｉＳＥの標準的な結合滴定アッセイ。ＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅペアのパーセンテージはライブダブレットから定量され、用量依存的であることが示された。（４Ｂ）ＰＤ－１＋ Ｔ細胞と脾臓細胞に対するインビトロアッセイ。ＯＴ－１マウスの脾臓からＣＤ８＋細胞を単離し、インビトロでＯＶＡに長時間暴露するとＰＤ－１＋が上昇した。細胞を、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥまたはＰＤ－１／シナジスの標準的な滴定で、ナイーブ脾細胞と１：１０の割合でインキュベートした。ダブレットはＦＡＣＳで定量した。
【図5】図５Ａ～５Ｃは、インビボにおける二重特異性エンゲージャーの二重抗原結合特性を示す。Ｂ１６腫瘍モデルにおけるＢｉＳＥ処置後の腫瘍ｄＬＮにおけるＴ／ＤＣダブレット形成の評価。担がんマウスをＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥ、ＰＤ－１／シナジス、ＰＤ－１ ｍＡｂまたはＰＢＳで処置し、２４時間後にｄＬＮを採取してＦＡＣＳ解析を行った。（５Ａ）ダブレット形成（ｎ＝５、ｐ＝０．００１２およびｐ＝＜０．０００１、一元配置分散分析）および（５Ｂ）ｃＤＣ１浸潤（ｎ＝５、ｐ＝０．００５６、ｐ＝０．００５８、ｐ＝０．０００８、ｐ＝０．０００７、一元配置分散分析）は、ＢｉＳＥ処置マウスで有意に増加したが、従来のＰＤ－１ ｍＡｂで処置したマウスにおいてはそうではなかった。（Ｃ）ＢｉＳＥ投与２４時間後にｄＬＮをＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍに取り込み、ダブレット形成とＢｉＳＥ局在を評価した。全ＣＤ３＋細胞からＢｉＳＥ＋ダブレットの割合を算出した（ｎ＝２～３マウス、ｐ＝０．００１８、ｐ＝０．００１、ｐ＝＜０．０００１、一元配置分散分析）。ＢｉＳＥは代表的な画像に示すようにＴ／ＤＣ免疫シナプスに局在した。
【図6】６Ａ～６Ｃは、インビボでの二重特異性抗体の活性を示す。（６Ａ）二重特異性フォーマットにおける従来のＰＤ－１遮断と比較した、Ｂ１６メラノーマ腫瘍モデルを用いたＢｉＳＥの治療的抗腫瘍活性。腫瘍細胞を皮下接種し、処置後の腫瘍体積と全生存期間を評価した。処置１０日目において、腫瘍体積はＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ処置マウスで対照に比して有意に減少した（ｎ＝１０マウス／群、ｐ＝０．０１、（一元配置分散分析））。全生存期間は処置マウスで有意に延長した（ｐ＝０．０１３４、ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｌｅ－Ｃｏｘ）検定）。（６Ｂ）二重特異性フォーマットによる従来のＰＤ－１遮断と比較した、ＭＣ３８結腸腺がんモデルにおけるＢｉＳＥの抗腫瘍活性も。ＰＤ－１／ＸＣＲ１およびＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥによる処置では、治療６日目の腫瘍体積が対照に比べて減少した（ｎ＝１０マウス／群、ｐ＝０．００７およびｐ＝０．０００３、ｐ＝０．０２７９およびｐ＝０．００４２、一元配置分散分析）。（６Ｃ）ＫＰ肺がんモデルにおけるＢｉＳＥ活性の評価。ＫＰ細胞を尾静脈に静脈注射した。抗体注射は１５、２１、２４、および２７日目に行った。２８日目に右肺葉をパラフィンブロックに採取し、Ｈ＆Ｅスライドを調製した。肺病巣はｐａｎｏｒａｍｉｃ ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いて定量した。ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥ処置マウス４匹中３匹は腫瘍を認めなかった。
【図7】７Ａ～７Ｃは、ＢｉＳＥ処置後のＴ細胞コンパートメントを示す。ＭＣ３８腺がんまたはＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍モデルを用いたＢｉＳＥ処置後の腫瘍微小環境におけるＴ細胞のコンパートメント化と活性化。マウスは指定された単一特異性抗体または二重特異性抗体で処置された。処置は３日間隔で行い、腫瘍は３回目の処置の５日後にＦＡＣＳ解析に供した（ｎ＝５マウス／群）。（７Ａ）ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、ＴＭＥ中のＣＤ４５＋免疫細胞の総パーセントのうち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（左、ｐ＝０．０２）、Ｔ制御細胞（中央、ｐ＝０．００４）、およびＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－細胞（右）のパーセンテージを計算した。ＣＤ４＋ＣＤ８ Ｔ細胞とＴｒｅｇの比率（右、ｐ＝０．０４０３とｐ＝０．００２６）は、ＴＭＥのＣＤ４５＋細胞のうち、ＣＤ８、ＣＤ４エフェクター細胞とＴｒｅｇ細胞の割合から計算した。（７Ｂ）ＴＭＥにおけるＣＤ４５＋免疫細胞の総パーセントのうち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（左、ｐ＝０．０１６７、ｐ＝０．１４５）、Ｔ制御細胞（中央、ｐ＝０．０１８９）、およびＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－細胞（右、ｐ＝０．０１９０、ｐ＝０．０１３８）のパーセンテージを計算した。ＣＤ８＋、ＣＤ４エフェクター、Ｔｒｅｇの比率（ｐ＝０．０３１３、ｐ＝０．０３８４）を算出した。ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥは、未処置マウスおよびＰＤ－１ ｍＡｂ処置マウスの両方と比較して、有意な抗腫瘍応答を示した。（７Ｃ）ＴＭＥにおけるＣＤ４５＋免疫細胞の全パーセントのうち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（左、ｐ＝０．０１１６）、Ｔ制御細胞（中央、ｎｓ）、ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－細胞（右、ｐ＝０．０１６３、ｐ＝０．００３４）のパーセンテージを計算した。ＣＤ８＋、ＣＤ４エフェクター、およびＴｒｅｇの比率（ｐ＝０．００２７、ｐ＝０．００７６、ｐ＝＜０．０００１）を算出した。ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥは、未処置マウス、ＰＤ－１／シナジス処置マウス、さらにＰＤ－１／ＸＣＲ１処置マウスと比較して、有意な抗腫瘍効果を示した。
【図8】８Ａ～８Ｄ。ＴＭＥおよびｄＬＮにおけるダブレットとＴ細胞コンパートメントの動態。Ｔ細胞コンパートメント形成およびダブレット形成は、Ｂ１６メラノーマ腫瘍モデルを用いて、ＢｉＳＥ処置後のＴＭＥおよびｄＬＮにおいて経時的に評価した。マウスはＰＤ－１／ＸＣＲ１、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ、ＰＤ－１／シナジスまたはＰＢＳで処置された。ＢｉＳＥ処置は３日間隔で行い、腫瘍／ｄＬＮは、各処置の２４時間後と最終処置の５日後にＦＡＣＳ解析に供した（ｎ＝５マウス／群）。（８Ａ）実験レイアウト。（８Ｂ）ダブレット形成は、ＢｉＳＥ処置後の腫瘍およびｄＬＮで、対照群と比較して富化された。（８Ｃ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞（左、ｐ＝０．００８、ｐ＝０．０１２）、ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－細胞（中央、ｐ＝０．０１６、ｐ＝０．００３）、Ｔ制御細胞（右）の割合を経時的に評価した。（８Ｄ）ＴＭＥにおけるＣＤ４５＋ 細胞のうちＣＤ８＋、ＣＤ４＋、およびＴｒｅｇの割合から、Ｔエフェクター／Ｔ制御比を経時的に算出した（ｐ＝＜０．０００１、ｐ＝０．００２７、ｐ＝０．００７６）。ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ処置マウスは、未処置マウス、ＢｉＳＥ対照マウスおよびＰＤ－１／ＸＣＲ１処置マウスと比較して、経時的に有意な改善を示した。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、そのいくつかの実施態様において、疾患の治療における使用のための多重特異性抗体に関する。
【0036】
本発明の少なくとも1つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載され、または実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施態様が可能であり、または様々な方法で実行もしくは実施することが可能である。
【0037】
免疫療法はすでにがん治療に革命をもたらしているが、ＰＤ－１に基づくチェックポイント阻害療法の成功率はまだ限られている。そこで本発明者らは、抗ＰＤ－１治療に対する細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答に関する分子的かつ細胞的知見を得るために、超並列単一細胞ＲＮＡシーケンシングを用いて腫瘍細胞を解析した。その結果、これらの腫瘍浸潤細胞のわずかなサブセットのみがその治療に応答することが示された。これらの応答細胞は、従来の１型樹状細胞（ｃＤＣ１）上に発現するＸＣＲ１に結合するＸＣＬ１を高レベルで発現していた－図１Ａ～１Ｃ。これらの知見をさらに評価するため、本発明者らは、ＸＣＲ１－ｉＤＴＲマウスモデルを用いて、ＰＤ－１免疫療法の活動期に条件付きでｃＤＣ１ｓを枯渇させたところ、ｃＤＣ１ｓがないと抗ＰＤ－１治療の有効性が完全に消失することを見出した（図１Ｄ）。そこで、本発明者らは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるｃＤＣ１の頻度が低いことが、ＰＤ－１阻害に対する効果的なＴ細胞応答を損なう主要な制限因子であるという仮説を立てた。
【0038】
この仮説を検証し、この制限を克服するために、本発明者らは、本明細書において「二重特異性免疫シナプス・エンゲージャー（ＢｉＳＥ）」と呼ばれる新しいアプローチを開発した。彼らは、ＰＤ－１遮断モノクローナル抗体とｃＤＣ１特異的標的を組み合わせることによって、ＰＤ－１＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との間に物理的結合を形成するヘテロ二量体コンストラクトを作製した（図２Ａに示されるように）。
【0039】
本発明者らは、ＢｉＳＥ試薬がそれらの指定された標的に同時かつ特異的に結合し（図３Ａ～３Ｂ）、Ｔ細胞－ｃＤＣ１ダブレット形成をもたらすが（図４Ａ～４Ｂ）、ＢｉＳＥが一価であるためそれらのＰＤ－１遮断能は損なわれる（図３Ｃ～３Ｄ）ことを示した。
【0040】
本発明をさらに実用化する一方で、本発明者らは、この新しい方法の抗腫瘍活性をインビボで分析し、ＢｉＳＥ処置腫瘍モデルマウスが、ＢｉＳＥを介するダブレット形成の増加、およびダブレットおよびｃＤＣ１ｓのドレナージリンパ節への短期移動を示すということを示した（図５Ａ～５Ｃ）。これらのマウスはまた、ＴＭＥにおいて制御性Ｔ細胞を犠牲にして、エフェクターＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の有意な増加を示した（図７Ａ～７Ｃ）。これらのマウスは、未処置マウスやアイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、全生存期間の延長と腫瘍増殖の抑制を示した（図６Ａ～６Ｃ）。
【0041】
したがって、本発明者らは、ＢｉＳＥを新しい免疫療法のクラスとして提案する。これは、二重特異性Ｔ細胞－ｃＤＣ１シナプス・エンゲージャーとして機能することにより、がん免疫療法の活性に革命をもたらす可能性がある。
【0042】
本発明の一側面によれば、腫瘍内Ｔ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する第一抗原結合部分と、従来型樹状細胞１（ｃＤＣ１）に特異的に結合する第二抗原結合部分とを含む多重特異性抗体が提供される。
【0043】
本明細書で用いられる「免疫チェックポイント」とは、抗原のＴ細胞受容体認識の振幅と質を調節する共刺激性シグナルと抑制性シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。いくつかの実施形態において、阻害シグナルは、プログラム死－１（ＰＤ－１）とプログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）との間の相互作用である。
【0044】
本明細書で使用する「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、がん細胞に対する免疫応答を制御することができる、Ｔ細胞表面に存在する受容体またはそれらの同族リガンドを指す。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲおよびＯＸ－４０が挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
特定の実施形態によれば、免疫チェックポイントタンパク質はＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）である。「プログラム死－１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボにおいて、先に活性化されたＴ細胞に主に発現し、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。本明細書で使用する「ＰＤ－１」という用語は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む。ｈＰＤ－１の完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ５１７７３で見出され得る。１つの実施形態において、ＰＤ－１は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ５１７７３に規定されるような配列を有する。
【0046】
免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体は、ヒトのチェックポイントタンパク質および／またはマウスのチェックポイントタンパク質と結合する可能性があることが理解されよう。ヒトとマウスの両方に結合する抗体は、一般に「汎特異性抗体」と呼ばれる。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態による、多重特異性抗体で使用することができる第１部分相補性決定配列（ＣＤＲ）は、以下に列挙する抗体で見出すことができる：
・クローンＲＭＰ１－１４の抗ＰＤ－１ ＣＤＲ配列は配列番号：１～６に記載されている；
・クローンＪ４３の抗ＰＤ－１配列は配列番号：１１～１６に記載されている；
・ペムブロリズマブ（別名ラムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５またはＳＣＨ ９００４７５）、ＰＤ－１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体）；
・ニボルマブ（ＭＤＸ １１０６、ＢＭＳ ９３６５５８、ＯＮＯ ４５３８）、ＰＤ－１に結合し、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１の活性化を阻害する完全ヒトＩｇＧ４抗体；
・ドスタルリマブ（ジェンペルリ）は、ＰＤ－１に結合し、そのリガンドによるＰＤ－１の活性化を阻害するヒト化ＩｇＧ４抗体である。
・ＣＴＬＡ－４－ イピリムマブ、トレメリムマブ；
・ＴＩＧＩＴ－ チラゴルマブ、ＢＭＳ－９８６２０７、ＣＯＭ－９０２、ＥＯＳ－４４８；
・ＬＡＧ－３－ ＢＭＳ－９８６０１６（レラトリマブ）、フィアンリマブ（ＦＩＡＮＬＩＭＡＢ）、ファベゼリマブ；
・ＴＩＭ－３－ ＢＭＳ－９８６２５８、Ｓｙｍ０２３、ＩＮＣＡＧＮ０２３９０；
・ＩＣＯＳ－ ＭＥＤＩ－５７０、ＢＭＳ－９８６２２６、ＧＳＫ３３５９６０９；
・ＢＴＬＡ－ ＴＡＢ００４；
・４－１ＢＢ－ ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）、ＧＩＴＲ－ＴＲＸ００５Ｍ、ＲＥＧＮ６５６９、ＭＫ－４１６６；
・ＯＸ－４０－ ＭＥＤＩ６４６９、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ ９８６１７８。
・クローンＲＭＰ１－１４の抗ＰＤ－１ ＣＤＲ配列は配列番号：１～６に記載されている；
・クローンＪ４３の抗ＰＤ－１配列は配列番号：１１～１６に記載されている；
・ペムブロリズマブ（別名ラムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５またはＳＣＨ ９００４７５）、ＰＤ－１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体）；
・ニボルマブ（ＭＤＸ １１０６、ＢＭＳ ９３６５５８、ＯＮＯ ４５３８）、ＰＤ－１に結合し、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１の活性化を阻害する完全ヒトＩｇＧ４抗体；
・ドスタルリマブ（ジェンペルリ）は、ＰＤ－１に結合し、そのリガンドによるＰＤ－１の活性化を阻害するヒト化ＩｇＧ４抗体である。
・ＣＴＬＡ－４－ イピリムマブ、トレメリムマブ；
・ＴＩＧＩＴ－ チラゴルマブ、ＢＭＳ－９８６２０７、ＣＯＭ－９０２、ＥＯＳ－４４８；
・ＬＡＧ－３－ ＢＭＳ－９８６０１６（レラトリマブ）、フィアンリマブ（ＦＩＡＮＬＩＭＡＢ）、ファベゼリマブ；
・ＴＩＭ－３－ ＢＭＳ－９８６２５８、Ｓｙｍ０２３、ＩＮＣＡＧＮ０２３９０；
・ＩＣＯＳ－ ＭＥＤＩ－５７０、ＢＭＳ－９８６２２６、ＧＳＫ３３５９６０９；
・ＢＴＬＡ－ ＴＡＢ００４；
・４－１ＢＢ－ ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）、ＧＩＴＲ－ＴＲＸ００５Ｍ、ＲＥＧＮ６５６９、ＭＫ－４１６６；
・ＯＸ－４０－ ＭＥＤＩ６４６９、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ ９８６１７８。
【0048】
前述のように、多重特異性抗体は、特定の樹状細胞（ＤＣ）型－従来型樹状細胞１（ｃＤＣ１）－に特異的に結合する第２部分を含む。
【0049】
本明細書で使用する「樹状細胞」（ＤＣ）または複数形の「樹状細胞」（ＤＣｓ）は、専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞群に属する細胞を指す。樹状細胞は、樹状細胞本体から数方向に伸びる薄いシート（ラメリポディア）を有する特徴的な形態を有する。いくつかの表現型の基準も典型的であるが、樹状細胞の供給源によって異なることがある。これらには、高レベルのＭＨＣ分子（例えば、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ）および共刺激分子（例えば、Ｂ７－１およびＢ７－２）が含まれ、顆粒球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞に特異的なマーカーの欠如が含まれる。樹状細胞の多くは、以下に挙げるような特定のマーカーを発現している。樹状細胞はインビトロおよびインビボで一次Ｔ細胞応答を開始することができる。これらの応答は抗原特異的である。樹状細胞は、末梢血白血球、脾臓細胞、Ｂ細胞および単球と比較して、強い混合白血球反応（ＭＬＲ）を誘導する。樹状細胞は任意に、細胞によるサイトカイン発現パターンによって特徴づけられる（Zhou AND Tedder (1995) Blood 3295-3301）。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体は未熟なＤＣｓと結合し、おそらく成熟と活性化を仲介する。
【0050】
本明細書で使用する「特異的」とは、他のＤＣ型（形質細胞（ｐＤＣｓ）、および単球由来のＤＣｓ（ｍＤＣｓ））と比較して、ＤＣｓに対する結合優先性を意味する。
【0051】
本明細書において、「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合し、他の抗原には結合しないことを意味する。典型的には、抗体は、（ｉ）例えば、所定の抗原、例えば組換えＤＣマーカーを被検体として、抗体をリガンドとして用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定された場合、または抗原陽性細胞への抗体の結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定された場合、おおよそ１０-7Ｍ未満、例えばおおよそ１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、または１０-10Ｍ未満、あるいはさらに低い平衡解離定数（ＫD）で結合し、かつ（ｉｉ）所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）に結合する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原に結合する。よって、「免疫チェックポイントタンパク質」またはｃＤＣ１マーカーに「特異的に結合する」抗体とは、ＫDが１０-6Ｍ以下、例えばおおよそ１０-7Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、または１０-10Ｍ未満、またはさらに低い値で細胞に結合したマーカーに結合する抗体を指す。
【0052】
特定の実施形態によれば、樹状細胞は、Ｃｌｅｃ９ａおよびＸＣＲ１からなる群より選択されるマーカー発現によって特徴づけられる。
【0053】
特定の実施形態によれば、ｃＤＣ１ｓはヒトｃＤＣ１ｓである。
【0054】
したがって、本発明の一実施形態によれば、ＮからＣへの方向で重鎖において配列番号２５～２７に記載の相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖において配列番号２８～３０に記載の相補性決定領域とを含む第２部分を含む多重特異性抗体が提供される。
【0055】
具体的な実施形態によれば、第２部分はＣｌｅｃ９ａと結合する。
【0056】
したがって、本発明の一実施形態によれば、ＮからＣへの方向で重鎖における配列番号３１～３３に記載の相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖における配列番号３４～３６に記載の相補性決定領域とを含む第２部分（１０Ｂ４のＣＤＲ）を含む多重特異性抗体が提供される。
【0057】
具体的な実施形態によれば、第２部分はＸＣＲ１と結合する。
【0058】
したがって、本発明の一実施形態によれば、ＮからＣへの方向で重鎖において配列番号２１～２３に規定される相補性決定領域と、ＮからＣへの方向で軽鎖において配列番号２４～２６に規定される相補性決定領域とを含む第２部分（ＭＡＲＸ１０のＣＤＲ）を含む多重特異性抗体が提供される。
【0059】
Ｃｌｅｃ９ａに結合できる抗体は当技術分野でよく知られている。１０Ｂ４などは米国特許出願公開第２０１３／０２７３１５０号明細書［１５］（例えば、１Ｆ６，３９７、および７Ｈ１１は［４］に記載されている）に記載されている。追加の抗ヒトＣｌｅｃ９ａ抗体またはそのＣＤＲは、米国特許出願公開第２０２１／００２４６３７号明細書および同第２０１９／０３５２４０６号明細書に記載されている。
【0060】
ＸＣＲ１と結合できる抗体は当技術分野でよく知られている。ＭＡＲＸ１０は欧州特許出願公開第２６４１９１５号明細書［５］に記載されている。
【0061】
特定の実施形態によれば、多重特異性抗体は配列番号７および８、ならびに配列番号２７および２８を含む。
【0062】
特定の実施形態によれば、多重特異性抗体は配列番号７および８、ならびに配列番号３７および３８を含む。
【0063】
特定の実施形態によれば、多重特異性抗体は配列番号１７および１８、ならびに配列番号２７および２８を含む。
【0064】
特定の実施形態によれば、多重特異性抗体は配列番号１７および１８、ならびに配列番号３７および３８を含む。
【0065】
本発明で使用する「抗体」という用語には、インタクトな分子だけでなく、その機能的断片（抗原のエピトープに結合可能なもの）も含まれる。
【0066】
本明細書では、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は通常、アミノ酸や炭水化物の側鎖のような化学的に活性な分子の表面基から構成され、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。
【0067】
特定の実施形態によれば、抗体断片には、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2断片、Ｆｄ、Ｆｃａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、Ｆａｂ発現ライブラリー、またはＨＬＡ制限様式で抗原のエピトープに結合可能なＶＨおよびＶＬのような単一ドメイン分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0068】
本発明のいくつかの実施形態を実施するのに適した抗体断片としては、免疫グロブリン軽鎖（本明細書において「軽鎖」と称する）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（本明細書において「重鎖」と称する）の相補性決定領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、およびＦｖ、一本鎖Ｆｖ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、または抗体のＦｃ領域を含む抗体断片などの軽鎖および重鎖の両方の可変領域の本質的に全体を含む抗体断片が挙げられる。
【0069】
本明細書において使用される用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される抗原結合領域を指すために互換的に使用される。一般に、抗体は、ＶＨのそれぞれに３つのＣＤＲ（ＣＤＲ ＨＩまたはＨＩ；ＣＤＲ Ｈ２またはＨ２；およびＣＤＲ Ｈ３またはＨ３）と、ＶＬのそれぞれに３つのＣＤＲ（ＣＤＲ ＬＩまたはＬＩ；ＣＤＲ Ｌ２またはＬ２；およびＣＤＲ Ｌ３またはＬ３）とを含む。
【0070】
可変領域またはＣＤＲを構成する特定の抗体中のアミノ酸残基の同一性は、当該技術分野において周知の方法を用いて決定することができ、Ｋａｂａｔらにより定義されるような配列可変性（例えば、Kabat et al., 1992、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed、Public Health Service, NIH, Washington D.C.参照）、Chothiaらによって定義された構造ループ領域の位置（例えば、Chothiaet al., Nature 342:877-883, 1989.参照）、Oxford Molecular's AbM antibody modeling software（現在のＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）、Martinet al., 1989, Proc. Natl Acad Sci USA.86:9268; and world wide web site www(dot)bioinf-org(dot)uk/abs参照）、接触の定義により規定される利用可能な複合体結晶構造（MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996参照）および「コンフォメーションの定義」(例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008参照)などの方法を含む。
【0071】
本明細書で使用される場合、「可変領域」および「ＣＤＲ」は、アプローチの組み合わせを含め、当技術分野で公知の任意のアプローチによって定義される可変領域およびＣＤＲを指すことができる。
【0072】
軽鎖および重鎖の両方の可変領域全体または本質的に全体を含む機能的抗体断片は、以下のように定義される：
（ｉ）Ｆｖ、二本鎖として表現される軽鎖の可変領域（ＶＬ）と重鎖の可変領域（ＶＨ）からなる遺伝子操作断片と定義される；
（ii）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、遺伝的に融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、遺伝子工学的に操作された一本鎖分子；
（iii）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、遺伝子工学的に操作されたジスルフィド結合によって連結された遺伝子工学的に操作された抗体；
（iv）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで処理して、インタクトな軽鎖と、その可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる重鎖のＦｄ断片を得ることにより得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片；
（ｖ）Ｆａｂ’、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次いで還元することにより得られる（抗体分子１個につき２個のＦａｂ’断片が得られる）抗体分子の一価の抗原結合部分を含む断片；
（vi）Ｆ（ａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理することにより得られる抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片（すなわち、２つのジスルフィド結合により保持されたＦａｂ’断片の二量体）；
（vii）単一ドメイン抗体またはナノボディは、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨまたはＶＬドメインから構成される；および
（viii）Ｆｃａｂ：抗体のＦｃ領域に抗原結合能を導入することにより、抗原結合ドメインとして開発された抗体のＦｃ部分を含む抗体分子の断片。
（ｉ）Ｆｖ、二本鎖として表現される軽鎖の可変領域（ＶＬ）と重鎖の可変領域（ＶＨ）からなる遺伝子操作断片と定義される；
（ii）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、遺伝的に融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、遺伝子工学的に操作された一本鎖分子；
（iii）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、遺伝子工学的に操作されたジスルフィド結合によって連結された遺伝子工学的に操作された抗体；
（iv）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで処理して、インタクトな軽鎖と、その可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる重鎖のＦｄ断片を得ることにより得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片；
（ｖ）Ｆａｂ’、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次いで還元することにより得られる（抗体分子１個につき２個のＦａｂ’断片が得られる）抗体分子の一価の抗原結合部分を含む断片；
（vi）Ｆ（ａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理することにより得られる抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片（すなわち、２つのジスルフィド結合により保持されたＦａｂ’断片の二量体）；
（vii）単一ドメイン抗体またはナノボディは、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨまたはＶＬドメインから構成される；および
（viii）Ｆｃａｂ：抗体のＦｃ領域に抗原結合能を導入することにより、抗原結合ドメインとして開発された抗体のＦｃ部分を含む抗体分子の断片。
【0073】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそれらの断片を生成する方法は、当該技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【0074】
抗体を作製するための例示的な方法は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi D.R. et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:3833-3837; Winter G. et al., 1991. Nature 349:293-299)、または連続培養細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製が採用される。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術などが含まれるが、これらに限定されるものではない（Kohler G. et al. Nature 256:495-497; Kozbor D. et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote RJ. et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:2026-2030; Cole SP. et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）。
【0075】
標的抗原が小さすぎて、インビボで抗体を作製する際に十分な免疫原性応答を惹起できない場合には、そのような抗原（ハプテン）を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミン［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］担体のような抗原的に中性の担体に結合させることができる（例えば、米国特許第５，１８９，１７８号明細書および同第５，２３９，０７８号明細書を参照］。ハプテンと担体とのカップリングは、当技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングが有効であり、任意には、その後形成されたイミノ結合を還元する。あるいは、ジシクロヘキシルカルボジイミドや他のカルボジイミド脱水剤などの縮合剤を用いて担体を結合させることもできる。リンカー化合物を、カップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能リンカーおよびヘテロ二官能リンカーの両方がピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ州から入手可能である。その後、得られた免疫原性複合体は、マウス、ウサギなどの好適な哺乳動物に注射することができる。好適なプロトコールは、血清中の抗体の産生を高めるスケジュールにしたがって、アジュバントの存在下で免疫原を繰り返し注射することである。免疫血清の力価は、当技術分野で周知の免疫測定法を用いて容易に測定することができる。
【0076】
得られた抗血清は、そのまま使用することもできるし、本明細書に記載するようにモノクローナル抗体を得ることもできる。
【0077】
本発明のいくつかの実施形態による抗体断片は、抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）での発現によって調製することができる。
【0078】
抗体断片は、従来の方法で全抗体をペプシンまたはパパイン消化することによって得ることができる。例えば、抗体をペプシンで酵素的に切断し、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓ断片を与えることにより、抗体断片を生成することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意でジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロッキング基を用いてさらに切断し、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを用いた酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ’断片とＦｃ断片が直接生成される。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書、およびそこに含まれる参考文献に記載されており、これらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Porter, R. R. ［Biochem. J. 73: 119-126 (1959)］も参照。重鎖を分離して一価の軽重鎖断片を形成する、断片をさらに切断する、あるいは他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術などの、抗体を切断する他の方法も、断片がインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、用いることができる。
【0079】
上述したように、Ｆｖ断片はＶＨ鎖とＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら［Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720)］に記載されているように、非共有結合であってもよい。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結され得るか、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーで連結されたＶＨ鎖とＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを橋渡しするリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えば、［Whitlow and Filpula, Methods 2：97-105 (1991); Bird et al., Science 242：423-426 (1988); Pack et al., Bio／Technology 11: 1271-77 (1993)；および米国特許第４，９４６，７７８号明細書］に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0080】
抗体断片のもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、LarrickおよびFry［Methods, 2: 106-10 (1991)］を参照。
【0081】
前述したように、抗体断片は「Ｆｃａｂ」と呼ばれる抗体のＦｃ領域を含む場合がある。このような抗体断片は、典型的には抗体のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃａｂは、抗体の構造ループ領域、すなわち重鎖のＣＨ３領域に少なくとも１つの修飾を含むように工学的に設計されている。このような抗体断片は、例えば、以下のようにして作製することができる：少なくとも１つの構造ループ領域（例えばＦｃ領域）を含む抗体をコードする核酸を提供すること、少なくとも１つの構造ループ領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾すること、修飾された核酸を発現系に導入すること、修飾された抗体を発現させること、発現された修飾された抗体をエピトープと接触させること、および修飾された抗体がエピトープに結合するかどうかを決定すること。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０４５，５２８号明細書および同第９，１３３，２７４号明細書を参照されたい。
【0082】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ２’）．ｓｕｂ．２または抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲやフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである［Jones et al., Nature, 321：522-525 (1986); Riechmann et al., Nature、332：323-329（1988）；およびPresta、Curr．Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)］。
【0083】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからそこに導入された１つまたはそれより多くのアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしばインポート残基と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから導入される。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］にしたがい、げっ歯類のＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによって行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基と場合によってはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【0084】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581(1991)］。ColeらおよびBoernerらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である［Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77（1985）およびBoerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95（1991）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製することができる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーなどあらゆる点でヒトに見られるものと酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、および以下の科学刊行物に記載されている：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783（1992）; Lonberg et al., Nature 368: 856-859（1994）; Morrison, Nature 368 812-13（1994）; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51（1996）; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826（1996）; およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93（1995）。
【0085】
特に断りのない限り、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般的に知られているアイソタイプのいずれであってもよい。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種においてサブクラスに分けられる：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３である。免疫グロブリン、例えばヒトＩｇＧ１にはいくつかのアロタイプが存在し、それらは互いにせいぜい数個のアミノ酸が異なるだけである。
【0086】
特定の実施形態によれば、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。抗体が得られたら、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ドットブロットおよび抗体適格性のための他の任意の方法を介して、活性を試験することができる。
【0087】
本明細書で使用する「多重特異性抗体」とは、前述のように、異なる構造、２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープがある少なくとも２つの標的、１つは腫瘍内Ｔ細胞上（免疫チェックポイントタンパク質上）、少なくとももう１つはｃＤＣ１上に同時に結合できる抗体である。
【0088】
特異性は、抗体が結合することができる抗原またはエピトープがいくつか；すなわち、二重特異性、三重特異性、四重特異性などを示す。特定の実施形態によれば、抗体は二特異性抗体である
【0089】
これらの定義を用いると、例えばＩｇＧのような天然抗体は、２つの結合アームを有するため二価であるが、１つのエピトープに結合するため単一特異的である。
【0090】
「二重特異性抗体」とは、腫瘍内Ｔ細胞上の１つ（免疫チェックポイントタンパク質）とｃＤＣ１上の別の１つの、構造の異なる２つの標的に同時に結合できる抗体である。
【0091】
価数は、単一抗原またはエピトープに公害が結合するアームまたは部位をいくつ有するかを示し、すなわち、一価、二価、三価または多価である。抗体の多価性は、抗原との結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、その結果、抗原への結合性が向上する。
【0092】
多重特異性、多価抗体とは、特異性の異なる複数の結合部位を有するコンストラクトである。例えば、一方の結合部位がある抗原と反応し、もう一方の結合部位が別の抗原と反応するダイアボディなどである。
【0093】
本明細書において用いる「部位」とは、示された標的と結合することができる多重特異性（例えば、二重特異性）抗体の抗体構成成分を指す。
【0094】
本発明のいくつかの実施形態の多重特異性抗体を生成するために、本部位は、当該技術分野で周知のように、Ｆｃ領域、例えばＣＨ３ドメイン（ｋａｂａｔに従う）で修飾され得る。このような修飾は、重鎖を介した多重特異性抗体の正しいアセンブリを確実にする。
【0095】
したがって、一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更され、多重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に接する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞に位置決め可能な突起が作製され；そして、もう一方の重鎖のＣＨ３ドメインは、３価の二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面に接する第２のＣＨ３ドメインの元の界面内でアミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されるように変更され、それにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起が位置決め可能な空洞が生成される（ジェネンテック社による「ノブ・イン・ホール」アプローチとしても知られている）。
【0096】
特定の実施形態によれば、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【0097】
特定の実施形態によれば、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【0098】
特定の実施形態によれば、両ＣＨ３ドメインは、両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド橋が形成され得るように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによってさらに変更される。
【0099】
具体的な実施形態では、二重特異性は「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。ＣＨ３ドメイン間の付加的な鎖間ジスルフィド橋（Merchant, A. M., et AL., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）もまた、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入し、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ変異またはＳ３５４Ｃ変異を導入することによって使用され得る。したがって、別の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、かつ２つのＣＨ３ドメインの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含むか、または二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける追加のＹ３４９Ｃ変異と、他方のＣＨ３ドメインにおける追加のＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異は鎖間ジスルフィド架橋を形成している）（番号は常にＫａｂａｔのＥＵ指数による）。しかし、欧州出願公開第１８７０４５９号明細書に記載されているような他のノブ・イン・ホール技術も、代替的または追加的に使用することができる。二重特異性抗体の具体例としては、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異、および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異である（番号は常にＫａｂａｔのＥＵ指数による）。
【0100】
別の実施形態では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、さらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異、および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。
【0101】
別の実施形態では、二特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異、および２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含むか、または二特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異、および２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、そしてさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異とを含む。
【0102】
具体的な実施形態によれば、１番目のｍＡｂ（例えば、抗ＰＤ－１）にはＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異が導入され、２番目のｍＡｂ（例えば、抗ｃＤＣ１）にはＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異が導入される。
【0103】
代替的または付加的に、重－軽鎖を正しくペアリングさせるために、少なくとも１つの部分をＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットで発現させることができる（ＣＨ１－ＣＬスワッピング）。
【0104】
ＣｒｏｓｓＭａｂ技術の基本は、二重特異性ＩｇＧ抗体の片方のアーム内で抗体ドメインをクロスオーバーさせることで、正しい鎖の結合を可能にする一方で、重鎖の正しいヘテロ二量化は、上述のノブ・イン・ホール技術や電荷相互作用によって達成できる。これは、Ｆａｂ断片内の異なるドメインの交換によって達成できる。Ｆａｂドメイン（ＣｒｏｓｓＭａｂFabフォーマット）、またはＦａｂ断片内の可変ＶＨ－ＶＬドメイン（ＣｒｏｓｓＭａｂVH-VLフォーマット）、または定常ＣＨ１－ＣＬドメイン（ＣｒｏｓｓＭａｂCH1-CLフォーマット）のいずれかをこの目的のために交換することができる。実際、ＣｒｏｓｓＭａｂCH1-CLフォーマットに関して、それぞれの元の軽鎖および新規のＶＬ－ＣＨ１軽鎖は、それぞれの元の重鎖およびＶＨ－ＣＬ含有重鎖との望ましくない相互作用をもたらさず、理論的な副産物は形成されない。対照的に、ＣｒｏｓｓＭａｂFabフォーマットの場合、非機能性一価抗体（ＭｏＡｂ）と非機能性Ｆａｂ断片が形成され得る。これらの副産物はクロマトグラフィー技術によって除去することができる。ＣｒｏｓｓＭａｂVH-VLフォーマットの場合、Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓタンパク質で知られているＶＬ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬドメイン会合による望ましくない副生成物が、ＶＬ－ＣＨ１含有重鎖と元の未修飾のＶＬ－ＣＬ軽鎖との間に生じ得る。野生型抗体フレームワークに存在する保存電荷対に基づく反発電荷対を、野生型非クロスＦａｂ断片の定常ＣＨ１およびＣＬドメインに導入することで、ＣｒｏｓｓＭａｂVH-VL+/-フォーマットにおける、このＢｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ様副産物の形成を克服することができる。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術の詳細は、Klein et al. Methods 154, 1 February 2019, Pages 21-31cに記載されている。
【0105】
あるいは、本明細書に記載の多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて部分を結合させることにより調製することができる。例えば、多重特異性抗体の各部分を別々に作製した後、互いに結合させることができる。共有結合には、様々なカップリング剤や架橋剤を用いることができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）などが挙げられる（例えば、Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:8648）参照）。その他の方法としては、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132； Brennan et al., (1985) Science 229：81-83）、およびGlennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されている方法が挙げられる。好ましいコンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ピアス・ケミカル・コーポレーション（ロックフォード、イリノイ州）から入手可能である。
【0106】
代替的または付加的に、多重特異性抗体の各部分の結合は、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して行うことができる。具体的な実施形態では、ヒンジ領域は結合前に奇数、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【0107】
具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体に対する結合特異性を低下させるように改変されている。
【0108】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体や代替スプライシング型も含まれる。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化型受容体（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）と１つの抑制型受容体（ＦｃγＲＩＩｂ、または同等にＲｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの様々な特性は米国特許出願公開第２０１７／０２５３６５９号明細書に要約されている。
【0109】
固有のエフェクター細胞型の大部分は、１つまたは複数の活性型ＦｃγＲと抑制型ＦｃγＲＩＩｂを同時発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１つの活性型Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩ、ヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現し、マウスおよびヒトにおいて抑制性ＦｃγＲＩＩｂは発現しない。ヒトＩｇＧ１はほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性型Ｆｃ受容体の種類に関してはマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられている。
【0110】
修飾（変異）Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２６７Ｅ（「ＳＥ」）、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３８２Ｆ（「ＳＥＬＦ」）、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ（「Ｖ９」）、またはＧ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ（「Ｖ１１」）（配列番号２）、または（「Ｖ１２」）からなる群より選択されるヒトＩｇＧ重鎖（配列番号４１）における１つまたは複数の変異に対応する１つまたは複数の変異を有する。
【0111】
本明細書に記載の別の態様は、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド処理、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、およびその他当技術分野で周知のものなどの標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界で単離されたＤＮＡに連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から離れて精製された場合に、「単離された」または「実質的に純粋になった」という。F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。特定の実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【0112】
本明細書に記載の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ｛例えば、以下にさらに記載するヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ｝により発現される抗体については、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体については（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収することができる。
【0113】
ＶHおよびＶLセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ技術でさらに操作することができる。例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換する。これらの操作において、ＶL－またはＶH－をコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーのような別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と動作可能に連結される。この文脈で使用される「動作可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することを意図している。
【0114】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨＩ、ＣＨＩ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することにより、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、そしてこれらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えばＩｇＧｌ領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨＩ定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することができる。
【0115】
ＶL 領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（Ｆａｂ軽鎖遺伝子も同様）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【0116】
本発明のいくつかの実施形態の抗体を発現させる宿主発現系として、様々な原核細胞又は真核細胞を使用することができる。これらには、限定されるものではないが、コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させるか、またはコード配列を含む、Ｔｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系などが含まれる。哺乳動物発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態の抗体を発現するために使用され得る。培養における発現の条件は、使用する発現系による。
【0117】
培養液からの抗体の回収は、適切な培養時間の後に行われる。「組換え抗体を回収する」という表現は、抗体を含む発酵培地全体を回収することを意味し、分離または精製の追加工程を意味する必要はない。上記にかかわらず、本発明のいくつかの実施形態の抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差可溶化などの様々な標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができるが、これらに限定されるものではない。
【0118】
本明細書に記載の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＰＤ－１＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との間に物理的な橋渡しを形成することを含む、数多くのインビトロおよびインビボでの有用性を有する。好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。例えば、本明細書に記載の多重特異性抗体は、培養細胞、インビトロもしくはｅｘ ｖｉｖｏ、またはヒト対象、例えばインビボに投与して、様々な疾患における免疫を増強することができる。
【0119】
したがって、本明細書には、本明細書に記載の多重特異性抗体の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与することによってがんを治療する方法が提供される。
【0120】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、障害、例えばがん、慢性ウイルス感染症に罹患しているあらゆる年齢のヒトなどの哺乳類を含む。具体的な実施形態によれば、この用語は、障害を発症する危険性のある個体を包含する。
【0121】
好ましい実施形態において、対象は腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が増強される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液学的悪性腫瘍であり得る。特定の実施形態において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。特定の実施形態において、腫瘍は非免疫原性である。特定の実施形態において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陽性である。特定の実施形態において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルスを保有する対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が増強される。
【0122】
さらに、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように、本明細書に記載の多重特異性抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載の多重特異性抗体は、補助療法として対象に投与される。本明細書に記載される多重特異性抗体によるがんを有する対象の治療は、現在の標準治療と比較して長期にわたる耐久性のある応答；少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれより長い長期生存、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれより長い無再発生存をもたらし得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の多重特異性抗体によるがんを有する対象の治療は、がんの再発を予防するか、またはがんの再発を、例えば、１年、２年、３年、４年、５年、または１０年またはそれより長く遅らせる。本発明の二重特異性免疫シナプス・エンゲージャーによる治療は、一次治療または二次治療として用いることができる。
【0123】
本明細書に提供されるのは、がんを有する対象を治療するための方法であって、対象が治療されるように、例えば、がん性腫瘍の増殖が阻害もしくは低減されるように、および／または腫瘍が退縮するように、本明細書に記載の多重特異性抗体を対象に投与することを含む方法である。本明細書に記載の多重特異性抗体は、がん性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用することができる。あるいは、本明細書に記載の多重特異性抗体は、以下に記載するように、別の薬剤、例えば、他の免疫原性薬剤、標準的ながん治療薬、または他の抗体と併用することができる。
【0124】
したがって、本明細書において提供されるのは、対象において、例えば腫瘍細胞の増殖を阻害することによってがんを治療する方法であって、本明細書に記載される治療上有効な量の多重特異性抗体を対象に投与することを含む方法である
【0125】
本発明の抗体を用いて増殖が阻害され得るがんには、免疫療法に典型的に反応するがんおよび免疫療法に抵抗性のがんが含まれる。治療のためのがんの非限定的な例としては、扁平上皮がん腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸がん、腎がん（renal cancer）（例えば、明細胞がん腫）、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎がん（kidney cancer）（例えば、腎細胞がん腫（ＲＣＣ））、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺腫）、甲状腺がん、神経芽腫、膵臓がん、膠芽腫（多形膠芽腫）、子宮頸がん、胃がん（stomach cancer）、膀胱がん、肝がん、乳がん、大腸がん腫、および頭頸部がん（またはがん腫）、胃がん（gastric cancer）、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、メラノーマ（例えば、皮膚または眼球内悪性メラノーマなどの転移性悪性メラノーマ）、骨肉腫、皮膚がん、子宮がん、肛門部のがん、精巣がん、卵管がん腫、子宮内膜がん腫、子宮頸がん腫、膣がん腫、外陰がん腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、尿管のがん、腎盂のがん腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されたものを含む環境誘発がん、ウイルス関連がん（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）、および２つの主要な血液細胞系統、すなわち骨髄系細胞系統（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する）またはリンパ系細胞系統（Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する）のいずれかに由来する血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫および骨髄腫の全種類、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの急性、慢性、リンパ球および／または骨髄性白血病、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変種［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増多を伴うＭ４変種［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤芽球性白血病（Ｍ６）、巨核球性白血病（Ｍ７）、孤立性顆粒球肉腫、および緑色腫；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えばＫｉ １＋）大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫；およびリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性胸水リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系造血器腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）、およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、および多発性骨髄腫などの骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫などの間葉系由来の腫瘍；セミノーマ、奇形がん、星細胞腫、神経鞘腫などの中枢神経および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫などの間葉系由来の腫瘍；およびメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞がんおよび奇形がん腫を含むその他の腫瘍、リンパ系の造血器腫瘍、例えば、小細胞型および大脳細胞型を含むＴリンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含むがこれらに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ型Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜型）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部がん、腎がん、直腸がん、甲状腺がん；急性骨髄性リンパ腫、ならびに前記がんの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書に記載の方法はまた、転移性がん、難治性がん（例えば、ブロックＣＴＬＡ－４抗体またはＰＤ－１抗体を用いた従前の免疫療法に不応のがん）、および再発性がんの治療に使用することもできる。
【0126】
特定の実施形態によれば、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、大腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、胚細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんからなる群より選択される。
【0127】
本明細書に記載の多重特異性抗体は、単剤療法として、または唯一の免疫刺激療法として投与することができ、あるいはがんワクチン戦略における免疫原性薬剤、例えば、作動性抗体および組換えタンパク質およびリガンド、がん細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、ならびに免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞などと組み合わせることができる（He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。
【0128】
本明細書に記載の多重特異性抗体は、本明細書に記載の多重特異性抗体と目的の抗原、例えばワクチンとを共投与することにより、抗原特異的免疫応答を増強するために使用することができる。したがって、本明細書において提供されるのは、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、（ｉ）抗原；および（ii）本明細書に記載の多重特異性抗体を投与することを含む方法である。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。
【0129】
前述したように、本明細書に記載の多重特異性抗体は、１つ以上の治療剤、例えば細胞毒性剤、放射性毒性剤と共投与することができる。抗体は薬剤と連結して（免疫複合体として）投与することもできるし、薬剤と分離して投与することもできる。後者（分離投与）の場合、抗体は薬剤の前、後、または薬剤と同時に投与することができ、他の既知の治療法、例えば抗がん療法、例えば放射線と共投与することもできる。このような治療薬としては、特に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン、シクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗悪性腫瘍剤が挙げられるが、これらはそれ自体、患者にとって毒性または亜毒性レベルでのみ有効である。シスプラチンは４週間に１回１００ｍｇ／ｍｌを静脈内投与し、アドリアマイシンは２１日に１回６０～７５ｍｇ／ｍｌを静脈内投与する。本明細書に記載された多重特異性抗体と化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果をもたらす異なるメカニズムで作用する２つの抗がん剤を提供する。このような共投与は、薬剤に対する耐性の発現や、抗体と反応しなくなるような腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
【0130】
多重特異性抗体（multispecific antibody）（複数形では「多重特異性抗体（multispecific antibodies）」ともいう）は、それ自体で対象に提供することもできるし、適切な担体または賦形剤と混合した医薬組成物において提供することもできる。
【0131】
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、本明細書に記載される１つまたは複数の活性成分と、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分との調製物（preparation）を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【0132】
本明細書において用語「活性成分」とは、生物学的効果を担う多重特異性抗体を指す。
【0133】
以下本明細書において、「生理学的に許容され得る担体」および「薬学的に許容され得る担体」とは、生物に対して有意な刺激を与えず、かつ投与化合物の生物学的活性および特性を損なわない担体または希釈剤を意味する。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【0134】
本明細書において「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。限定するものではないが、賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類およびデンプンの類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【0135】
薬物の製剤化および投与に関する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0136】
適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達が挙げられ、これには、筋肉内、皮下および髄内注射ならびに髄腔内、直接脳室内、心臓内、例えば右心室腔または左心室腔内、総冠状動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が含まれる。
【0137】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチには、神経外科的戦略（例えば、脳内注射や脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の一つを利用しようとする薬剤の分子操作（例えば、内皮細胞表面分子に親和性のある輸送ペプチドとそれ自身ではＢＢＢを通過できない薬剤とを組み合わせたキメラ融合タンパク質の産生）；薬剤の脂質溶解度を増加させるように設計された薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤の脂質またはコレステロール担体への共役）；高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入やアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用による）がある。しかしながら、これらの戦略のそれぞれには、侵襲的な外科的処置に伴う固有のリスク、内因性輸送系に固有の制限によって課されるサイズの制限、ＣＮＳの外部で活性化しうるキャリアモチーフで構成されたキメラ分子の全身投与に伴う潜在的に望ましくない生物学的副作用、ＢＢＢが破壊された脳の領域内で起こりうる脳損傷のリスクなどの限界があり、準最適な送達方法となっている。
【0138】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接医薬組成物を注射することによって、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与することもできる。
【0139】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠化、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【0140】
したがって、本発明のいくつかの実施形態による使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を用いて、従来の方法で製剤化することができ、これにより、薬学的に使用することができる製剤への活性成分の加工が容易になる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【0141】
注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくはＨａｎｋ’ｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液、または生理学的塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液で製剤化することができる。経粘膜投与の場合、浸透させるバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は一般に当該技術分野で知られている。
【0142】
経口投与のために、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に処方することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者による経口摂取のために、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口用の医薬製剤は、固体の賦形剤を使用し、任意には得られた混合物を粉砕し、そして所望により適当な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーなどの充填剤である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【0143】
糖衣錠のコアには適切なコーティングが施される。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含む濃縮糖溶液を使用することができる。識別のため、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【0144】
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られるソフトな密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意で安定剤と混合して活性成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択された投与経路に適した投与量でなければならない。
【0145】
口腔投与に関しては、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。
【0146】
鼻腔吸入による投与に関しては、本発明のいくつかの実施形態による使用のための活性成分は、好都合には、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用とともに、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。ディスペンサーで使用するための、例えばゼラチンのカプセルやカートリッジは、化合物と、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末ベースとの粉末ミックスを含むように調合することができる。
【0147】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射のための製剤は、単位剤形、例えば、アンプル中または任意に添加される保存剤を伴う多剤量容器中に存在させ得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤（formulatory agent）を含んでもよい。
【0148】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性の形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性の注射用懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる。任意で、懸濁液はまた、高濃度溶液の製剤を可能にするために、好適な安定化剤または活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含むことができる。
【0149】
あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば無菌でピロゲンフリーの水性溶液で構成するために粉末状であってもよい。
【0150】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を用いて、坐薬または保持浣腸などの直腸組成物に製剤化することもできる。
【0151】
本発明のいくつかの実施形態の文脈において使用するのに適した医薬組成物には、活性成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療上有効な量とは、障害（例えば、がん）の症状を予防、緩和もしくは改善する、または治療される対象の生存を延長するのに有効な量の活性成分（多重特異性抗体）を意味する。
【0152】
治療上有効な量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、まったく当業者の能力の範囲内である。
【0153】
本発明の方法において使用される任意の製剤について、治療上有効な量または用量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために、動物モデルで用量を処方することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。
【0154】
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効果は、インビトロ、細胞培養物または実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を処方する際に使用することができる。投与量は、採用される剤形や利用する投与経路によって変えることができる。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。(例えば、Fingl, et al., 1975, “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1参照）。
【0155】
投与量および投与間隔は、生物学的効果を誘発または抑制するのに十分な活性成分の組織レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）となるように個別に調整することができる。ＭＥＣは製剤ごとに異なるが、インビトロのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特性や投与経路によって異なる。血漿中濃度の測定には検出アッセイを用いることができる。
【0156】
具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～１００ｍｇ／ｋｇとすることができる。
【0157】
具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～８０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～６０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～４０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～３０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は０．１～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は１～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は１０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、２０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、３０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、４０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、５０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、６０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は７０～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【0158】
具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は１～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１～１５ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１～５ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、２～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、４～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、６～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、８～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１０～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１２～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１５～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１８～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、１～５ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は、２～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。具体的な実施形態によれば、多重特異性抗体の投与量は５～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【0159】
治療する状態の重篤度や反応性に応じて、投与は、数日から数週間、または治癒もしくは病状の軽減が達成されるまで持続する治療コースを伴い、単回または複数回とすることができる。
【0160】
投与する組成物の量は、もちろん、治療対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医の判断などに依存する。
【0161】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望により、ＦＤＡ認可キットのようなパックまたはディスペンサー装置中に提示することができ、これらは、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含むことができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書を添付することができる。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知により収容されてもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与に対する政府機関による承認を反映するものである。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認された表示、または承認された製品挿入物であってもよい。適合する医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述したように、表示された状態の治療のために調製され、適切な容器に入れられ、そしてラベルされ得る。
【0162】
本出願から満了までの特許の存続期間中に、免疫チェックポイントタンパク質に対する多くの関連抗体が開発されることが予想され、抗チェックポイント抗体という用語の範囲は、そのようなすべての新技術を先験的に含むことを意図している。
【0163】
本明細書で使用する「約」という用語は、±１０％を指す。
【0164】
用語「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「含む（includes）」、「含むこと（including）」、「有すること（having）」およびそれらの共役語は、「～を含むがそれに限定されない（including but not limited to）」ことを意味する。
【0165】
「からなる（consisting of）」という用語は、「～を含みかつ限定される」という意味である
【0166】
「本質的にからなる（consisting essentially of）」とは、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいが、追加の成分、ステップおよび／または部分が、クレームされた組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
【0167】
本明細書において使用される場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈から明らかに指示がない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【0168】
本出願を通じて、本発明の様々な実施形態が範囲形式で示される場合がある。範囲形式での記載は、単に便宜上、簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を無制限に限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様に、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの部分範囲、およびその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したとみなされるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。
【0169】
本明細書において数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用数字（分数または積分）を含むことを意味する。本明細書では、第一の指示数値と第二の指示数値との「間の範囲／範囲（ranging/ranges between）」、および第一の指示数値「から」第二の指示数値「までの範囲／範囲（ranging/ranges from）」という表現は、互換的に使用され、第一および第二の指示数値ならびにその間のすべての分数および積分数を含むことを意味する。
【0170】
本明細書で使用する「方法」という用語は、化学、薬学、生物学、生化学および医学の専門家により公知であるか、または公知のやり方、手段、技術および手順から容易に開発されたやり方、手段、技術および手順を含むが、これらに限定されない、所定の課題を達成するためのやり方、手段、技術および手順を指す。
【0171】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語には、病態の進行を阻止すること、実質的に阻害すること、遅らせること、または逆転させること、病態の臨床的または審美的症状を実質的に改善すること、または病態の臨床的または審美的症状の出現を実質的に予防することが含まれる。
【0172】
特定の配列表に言及する場合、その言及は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変に起因する軽微な配列変異を含むように、その相補配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるが、そのような変異の頻度は、５０ヌクレオチドに１個未満、あるいは１００ヌクレオチドに１個未満、あるいは２００ヌクレオチドに１個未満、あるいは５００ヌクレオチドに１個未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１個未満であることを条件とする。
【0173】
明確にするために別々の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されることもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴も、別個に、または任意の適切な下位組み合わせで、または本発明の他の記載された実施形態において適切であるように提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とはみなされない。
【0174】
本明細書の上記において明確にされ、以下の特許請求の範囲に記載された本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【0175】
次に、上記の説明とともに、本発明のいくつかの実施形態を非限定的に示す以下の実施例を参照する。
【0176】
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順には、分子生物学的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書および同第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法論；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)；利用可能な免疫測定法は、特許文献および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８，８７６号明細書；同第４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書；および同第５，２８１，５２１号明細書; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)など参照、これらはすべて、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本書を通して提供される。その中の手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0177】
材料および方法
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６マウスはエンヴィーゴ社（Envigo）から購入した。Ｘｃｒ１－ｉＤＴＲマウスは、Ｒｏｓａ－ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘ－ｉＤＴＲマウス［Jung, S. et al. Immunity 17, 211-220 (2002)］とＸｃｒ１－Ｃｒｅ－ｍＴＦＰ［Buch, T. et AL. Nat. Methods 2, 419-426 (2005)］を交配して作製した。すべてのインビボ実験は、特定の病原体を含まない施設で行われた。雌は８～１０週齢のものを用い、無作為化し、実験群に割り付けた。
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６マウスはエンヴィーゴ社（Envigo）から購入した。Ｘｃｒ１－ｉＤＴＲマウスは、Ｒｏｓａ－ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘ－ｉＤＴＲマウス［Jung, S. et al. Immunity 17, 211-220 (2002)］とＸｃｒ１－Ｃｒｅ－ｍＴＦＰ［Buch, T. et AL. Nat. Methods 2, 419-426 (2005)］を交配して作製した。すべてのインビボ実験は、特定の病原体を含まない施設で行われた。雌は８～１０週齢のものを用い、無作為化し、実験群に割り付けた。
【0178】
ＢｉＳＥおよび親ｍＡｂの作製と特性解析：抗マウスＰＤ－１抗体、クローンＲＭＰ１－１４およびＪ４３の可変ドメインは、各抗体ハイブリドーマから塩基配列を決定した。抗マウスＣＬＥＣ９Ａ抗体クローン１０Ｂ４および抗マウスＸＣＲ１抗体クローンＭＡＲＸ１０の配列は、それぞれ特許、米国特許出願公開第２０１３／０２７３１５０号明細書および欧州特許出願公開第２６４１９１５号明細書から取得した。抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４またはＪ４３）、抗ＸＣＲ１（クローンＭＡＲＸ１０）および抗ＣＬＥＣ９Ａ（クローン１０Ｂ４）の可変重および軽領域は、それらの公開された配列（シンテザ（Syntezza）社）に基づいて合成した。親Ａｂｓの可変領域配列は、モノヒトＩｇＧ１またはヒトカッパＦｃ骨格を有する哺乳類発現ベクター、または二重特異性ベクターに挿入した。重鎖と軽鎖のペアリングを正しく行うため、親ＤＣ標的化アームはＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットで発現させ（ＣＨ１－ＣＬスワッピング）、ＰＤ－１標的化アームは野生型ドメイン構造を維持した。重鎖ヘテロ二量化のために、ＣＨ３ドメインに点変異を導入した：ＤＣ標的化アームではＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ＰＤ－１標的化アームではＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン変異体（Ｎ２９７Ａ）を作製するために、特異的プライマーを用いた部位特異的変異誘発を、製造業者の指示にしたがってＰＣＲ（アジレント・テクノロジーズ社）によって行った。変異したプラスミドの配列は、ダイレクトシークエンシング（ライフサイエンスコアファシリティ、ワイツマン科学研究所）により検証した。抗体を産生するために、抗体重鎖および軽鎖発現ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞（サーモフィッシャー社）に一過性にトランスフェクトした。上清中の分泌抗体をプロテインＧセファロース４ファストフロー（ＧＥヘルスケア社）で精製した。精製した抗体をＰＢＳで透析し、滅菌ろ過した（０．２２μｍ）。純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシー染色で評価し、９０％以上と推定された。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、Ａeｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステムでＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。
【0179】
結合ＥＬＩＳＡ：組換えマウスＰＤ－１（シノ・バイオロジカル（Sino Biological）社）およびマウスＣＬＥＣ９Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いてＥＬＩＳＡにより、単一特異性Ａｂおよび二特異性Ａｂの結合特異性および親和性を測定した。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク）にマウスＰＤ－１またはマウスＣｌｅｃ９ａの組換え細胞外ドメイン（１μｇ／ｍＬ／ウェル）を４℃で一晩コートした。すべての連続工程は室温で行った。洗浄後、プレートを２％ＢＳＡ含有１×ＰＢＳで１時間ブロッキングし、続いて連続希釈ＩｇＧ（２％ＢＳＡ含有１×ＰＢＳで１：５連続希釈）で１時間インキュベートした。二重結合ＥＬＩＳＡアッセイでは、プレートを１μｇ／ｍＬのビオチン化マウスＰＤ－１（シノ・バイオロジカル社）と１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch））または西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（バイオレジェンド社）で１時間インキュベートした。検出は１液性基質溶液（ＴＭＢ）を用いて行い、反応は０．１８Ｍ硫酸の添加で停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計（モレキュラー・デバイス（Molecular Devices）社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を直ちに記録し、陰性対照サンプルのバックグラウンド吸光度を差し引いた。
【0180】
トランスフェクションとｍＰＤ－１、ｍＸＣＲ１およびｍＣＬＥＣ９Ａを発現する安定な細胞株の樹立：７０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞を、６ウェル細胞培養プレート（コーニング社）中で３μｇのｐｃＤＮＡ３．１－ＰＤ－１、ｐｃＤＮＡ３．１－ＸＣＲ１もしくはｐｃＤＮＡ－Ｃｌｅｃ９ａの発現ベクター（ジーンスクリプト社（Genescript））、または空ベクター（ｐｃＤＮＡ ３．１）を、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を用いて、製造者の推奨手順にしたがってトランスフェクトした。トランスフェクション後、１４日間のＧ４１８セレクション（８００μｇ／ｍｌ）の後に安定細胞株を樹立した。安定細胞株は、１０％ ＦＢＳ、８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１％ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ギブコ社）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。培養は、３７℃、５％ＣＯ2の加湿インキュベーターで維持した。
【0181】
ＨＥＫ２９３過剰発現細胞結合アッセイと二重結合アッセイ：上記のＨＥＫ２９３過剰発現細胞から単一細胞懸濁液を調製した。表面染色のために、細胞を１００μｌのＰＢＳ中０．２～１×１０6細胞の濃度でＵ字型９６ウェルプレート（サーモフィッシャー）にプレーティングした。細胞をまずＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャー）で染色し、その後ＰＢＳで２回洗浄した。ｍＡｂｓとＢｉＳＥの標準的な結合滴定アッセイを氷上で３０分間行った。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。二重抗原エンゲージメントＦＡＣＳアッセイでは、ＢｉＳＥの標準滴定を、ＸＣＲ１またはＣＬＥＣ９Ａのいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に行い、さらにＰＤ－Ｌ１ビオチン化組み換えタンパク質（シノ・バイオロジカル社）とインキュベートした。その後、二重結合は、ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ社）を介して検出された。二重結合ＦＡＣＳアッセイでは、それぞれの標的タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞間でダブレットエンゲージメントを評価した。各細胞型は、製造元のプロトコール（サーモフィッシャー社）にしたがってＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅで染色した。ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅで染色した１：１の過剰発現細胞の混合物を、氷上で３０分間、ＢｉＳＥの標準的な結合滴定アッセイに用いた。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。ＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅペアのパーセンテージは、ライブダブレットから定量した。
【0182】
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ブロッキングアッセイ：上記のＨＥＫ２９３－ｍＰＤ－１過剰発現細胞から、１００μｌのＰＢＳ中０．２～１×１０6細胞の濃度で単一細胞懸濁液を調製した。細胞を標準滴定のＢｉＳＥまたは親のｍＰＤ－１ ｍＡｂと氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄した後、ｍＰＤ－Ｌ１ビオチン（シノ・バイオロジカル社）と氷上でさらに１時間インキュベートした。ＰＤ－１／ＰＤ－：１相互作用を検出するために、細胞を２回洗浄し、結合ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ社）に再懸濁した。その後、細胞を２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。
【0183】
インビトロ脾臓細胞二重結合アッセイ：ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１アップレギュレーションのために、ＯＴ－１ ＣＤ４５．１マウスから脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。脾臓を７０μｍのナイロン製セルストレイナーで剥離し、その後、赤血球溶解バッファー（シグマ－アルドリッチ社）で５分間インキュベートして赤血球を溶解し、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８＋ 細胞は、ＥａｓｙＳｅｐTMマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞単離キット（ステムセル社）を用いてネガティブセレクションを行い、製造元のプロトコールにしたがって分離した。その後、細胞を５×１０5の濃度で２４ウェルプレートに播種し、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック社（Peprotech））、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック社）、および１０ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡ（２５７－２６４）ペプチド（シグマ－アルドリッチ社）を添加した完全培地（ＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ Ｌ－グルタミン、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１％ 非必須アミノ酸、１％ ピルビン酸塩、０．０５ｍＭ ベータメルカプトエタノール）中で培養した。２４時間後、１０ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡを各ウェルに追加添加した。細胞は４８時間培養した。未刺激の対照は、サイトカインを含むがＯＶＡは含まない完全培地で培養した。細胞はＦＡＣＳでＰＤ－１発現を評価され、４８時間後、未刺激の対照と比較して１００％の細胞がＰＤ－１＋であった。ＰＤ－１発現が確立されると、ＰＤ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＸＣＲ１－ｃｒｅ－ｍＴＦＰマウスから単離した脾臓細胞と１：１０の割合で、Ｕ字型の９６ウェルプレート（サーモフィッシャー社）で、約５×１０5細胞／ウェルで培養した。細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャー社）で染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、マウスＴｒｕＳｔａｉｎ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（バイオレジェンド社）を加えた２５μｌ ＦＡＣＳ バッファーに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、ＢｉＳＥまたはＢｉＳＥ対照の１：２連続希釈液とともに、暗所、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、表面抗原をＦＡＣＳバッファーで氷上３０分間染色した。細胞を２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。細胞集団は以下のマーカー（バイオレジェンド社）によって定義された：ＣＤ８＋ Ｔ細胞：ＣＤ４５．１＋（Ａ２０）、ＣＤ８＋（５３６．７）。ｃＤＣ１ｓ：ＣＤ４５．１－、ＣＤ１１ｃ＋（Ｎ４１８）、ＭＨＣ ＩＩ＋（Ｍ５／１１４１５．２）、およびＸＣＲ１－ｃｒｅ－ｍＴＦＰマウスの内因性ｍＴＦＰ。Ｔ細胞／ＤＣダブレットはＴ細胞の割合から定量した。ＢｉＳＥは、Ｒ－フィコエリトリン共役抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ社）を用いて同定した。フローサイトメトリー、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍおよび単一細胞ＲＮＡシーケンス解析のための組織処理：リンパ節は７０μｍのナイロン製セルストレイナーで剥離し、ＰＢＳで洗浄した。腫瘍を機械的に小断片に剥離し、フローサイトメトリー解析用に０．３３ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（ロシュ社）と０．２７ｍｇ／ｍＬ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（ロシュ社）、または単一細胞ＲＮＡシーケンシング解析用に０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（ロシュ社）と１ｍｇ／ｍＬ コラゲナーゼ ＩＶ（ワージントン（Worthington）社）を添加したＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳTM Ｃ ｔｕｂｅ（ミルテニー・バイオテック（Miltenyi Biotec）社）に移した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳTM Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ミルテニー社）で腫瘍を２回解離させ、次いで細胞懸濁液をインキュベートした（３７℃、２５ｒｐｍ、４０分－フローサイトメトリー／３７℃、２５ｒｐｍ、１５分－単一細胞ＲＮＡシーケンシング）。その後、腫瘍を７０μｍのナイロン製セルストレイナーで分散させ、ＰＢＳで洗浄した。
【0184】
フローサイトメトリー：単一細胞懸濁液は上記のように調製した。表面染色のために、細胞を１００μｌのＰＢＳ中０．２～１×１０6細胞の濃度でＵ字型９６ウェルプレート（サーモフィッシャー社）にプレーティングした。細胞をまずＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャー社）で染色し、その後ＰＢＳで２回洗浄した後、マウスＴｒｕＳｔａｉｎ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（バイオレジェンド社）を加えた２５μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。氷上で３０分間、ＦＡＣＳバッファーで表面抗原を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。細胞内ＦＯＸＰ３染色については、Ｔｒｕｅ－ＮｕｃｌｅａｒTM転写因子バッファーセットキット（バイオレジェンド社）と抗ＦＯＸＰ３（バイオレジェンド社）を用いて、製造元の指示にしたがって追加の染色工程を行った。すべてのサンプルは、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（ベックマン・コールター社）とＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。特に指定がない限り、細胞集団は以下のマーカー（バイオレジェンド社）によって定義された：ｃＤＣ１ｓ：ＣＤ４５+、ＭＨＣ ＩＩ+、ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１９-、ＣＤ６４-、Ｆ４／８０-、Ｌｙ６Ｃ－、ＳＩＲＰα-。ｃＤＣ２ｓ：ＣＤ４５+、ＭＨＣ ＩＩ+、ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１９-、ＣＤ６４-、Ｆ４／８０-、Ｌｙ６Ｃ－、ＳＩＲＰα+。ＣＤ８エフェクター：ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ３+、ＣＤ８+、ＣＤ４-。ＣＤ４エフェクター：ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ３+、ＣＤ８+、ＣＤ４+、ＦＯＸＰ３-。Ｔｒｅｇｓ：ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ３+、ＣＤ８+、ＣＤ４+、ＦＯＸＰ３+。Ｔ細胞／ｃＤＣ１ダブレットは以下のマーカーによって定義された：ＣＤ４５+、ＭＨＣ ＩＩ+、ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１９-、ＣＤ６４-、Ｆ４／８０-、Ｌｙ６Ｃ－、ＳＩＲＰα-、ＣＤ３+。
【0185】
ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ：ＷＴマウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を前述のように接種した。１１日目にマウスを５００ｕｇ／マウスのＢｉＳＥで腹腔内注射により処置した。１２日目にマウスを犠牲死させ、ドレナージリンパ節を摘出した。単細胞懸濁液を上記のように調製した。細胞はまずＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉｏｌｅｔ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャー社）で染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、マウスＴｒｕＳｔａｉｎ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（バイオレジェンド社）を加えた２５μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。氷上で３０分間、ＦＡＣＳバッファーで表面抗原を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、３０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで解析した。細胞集団は以下のマーカーを用いて定義した（バイオレジェンド社）：ＤＣｓ：ＭＨＣ ＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋。Ｔ細胞：ＣＤ３＋。ＢｉＳＥは、Ｒ－フィコエリトリン共役抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ社）で同定するか、またはＳＡＩＶＩ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社）で注射前に標識した。細胞はマルチスペクトルイメージングサイトメーター（ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ ｍａｒｋ ＩＩ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；アムニス（Amnis）社、ＥＭＤミルポアの一部）を用いて画像化した。各サンプルから少なくとも５×１０３個の細胞を採取し、製造元の画像解析ソフトウェア（ＩＤＥＡＳ ６．２；アムニス社）を用いてデータを解析した。
【0186】
腫瘍チャレンジと治療：腫瘍細胞株は、３７℃、５％ＣＯ2の加湿インキュベーターで維持し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ Ｌ－グルタミン、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１％ 非必須アミノ酸、および１％ ピルビン酸塩を含む完全ＲＰＭＩ培地で培養した。ＭＣ３８（２×１０6）およびＢ１６－Ｆ１０（４×１０5）をマウスの右側腹に皮下移植し、２～３日ごとに腫瘍体積を電子ノギスで盲検測定した。体積は（Ｌ2
2＊Ｌ1）／２の式で報告され、式中、Ｌ1は最長径、Ｌ2は最短径である。腫瘍植え付けから７～１０日後、腫瘍の長さと幅の合計がおおよそ５０ｍｍ3に達した時点で、マウスを腫瘍の大きさで無作為に割り付け（０日目）、各実験に記載されたように腹腔内注射による処置を受けた。ＷＴマウスには、０、３および６日目に５００μｇのＢｉＳＥまたは対照ＰＢＳを投与した。マウスは、処置開始後８～２０日間、またはワイズマン科学研究所ＩＡＣＵＣの腫瘍サイズの制限により未処置対照群の大半が犠牲死されるまでモニターされた。ＫＰモデルについては、マウスに５×１０５個のＫＰ細胞を静脈注射し、腹腔内注射による処置を受け、１５、１８、２１、２４および２７日目に２００μｇの研究所内製抗マウスＰＤ－１ ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａ ｍＡｂ（クローンＲＭＰ１－１４）、５００μｇのＢｉＳＥ、または対照のＰＢＳで処置した。
【0187】
Ｈ＆Ｅ染色：ＷＴ ＫＰ保有マウスを、前述のように腫瘍接種後、５００ｕｇ／マウスのＢｉＳＥまたは単一特異性ａｂｓで腹腔内注射により処置した。２８日後、処置した動物の肺を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一晩置いた後、パラフィン処理し、ワイズマン科学研究所の組織学＆病理学部でヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドはＰａｎｎｏｒａｍｉｃ ｓｃａｎ ＩＩ ｓｃａｎｎｅｒ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）でスキャンし、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒソフトウェアで画像を取得・解析した。
【0188】
細胞枯渇試験：ＸＣＲ１＋ ｃＤＣ１ｓは、腫瘍接種後４日目から、治療終了４日後まで、１日おきに２０ｎｇ／ｇの用量で全治療期間中枯渇させた。枯渇効率は、フローサイトメトリー解析または血小板計数で評価した
【0189】
データおよび統計解析：フローサイトメトリーデータ解析はＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０．６．２を用いて行い、その他のデータ解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。定量データは、特に断りのない限り、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で示した。幾何平均強度が示される場合はＭＦＩが示され、値がアイソタイプ対照から推測されるＡｂの蛍光強度である場合は、デルタ幾何平均強度が示される（ΔＭＦＩ）。統計学的方法は、サンプルサイズを事前に決定するためには用いられなかったが、インビボ試験では、マウスの数は、生物学的効果を確実に検出し、かつ群間比較を可能にするために考慮され、予備実験の結果に基づいて決定された。群の割り付けは、すべてのインビボ実験に関して、上記のように無作為化された。腫瘍の測定は盲検下で行われ、その他のインビボおよびインビトロ試験では、研究者は実験実施時に治療群への盲検化は行わなかった。各データセットについて、母集団および／または母集団残差（ガウス分布）の正規性は、シャピロ－ウィルク（Shapiro-Wilk）検定および／またはダゴスチーノ－ピアソン（D'agostino-Pearson）検定を用いて確認した。正規分布の場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とテューキー事後検定を用い、３つ以上の処理群を比較した。２群を比較する場合は、統計的有意性を決定するために、対応のない両側スチューデントのｔ検定（両側、不等分散）を用いた。データが正規分布していない場合は、ノンパラメトリック検定－多重比較の場合はダンの事後検定を伴うクラスカル－ワリス－または２群比較の場合はマン－ホイットニー検定を用いた。すべての統計検定においてＰ＜０．０５を有意とみなし、図では以下のように表した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0190】
実施例１
腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブセットが抗ＰＤ－１治療に反応する
ほとんどのがん患者は抗ＰＤ－１チェックポイント阻害療法に反応しない。抗ＰＤ－１治療後のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の細胞および分子経路を完全に特徴づけるために、腫瘍、脾臓、およびドレナージリンパ節（ｄＬＮ）からのサンプルについて、超並列単一細胞ＲＮＡシーケンシングが行われた。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから、ＴＭＥ内でＰＤ－１遮断に最も強く反応した細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍に特異的な細胞サブセットであることが明らかになった。これらの細胞は、抗腫瘍免疫に極めて重要であることが示されているｃＤＣ１にのみ発現するＸＣＲ１受容体の特異的リガンドであるＤＣ化学誘引物質ＸＣＬ１を高レベルで発現した。一方、機能不全に陥ったＴ細胞は、ＸＣＬ１を全く発現せずにＰＤ－１を高レベルで発現していた（図１Ａ～１Ｃ）。これらの結果から、抗ＰＤ－１治療の効果はＣＤ８＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との相互作用に依存している可能性が示唆された。
腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブセットが抗ＰＤ－１治療に反応する
ほとんどのがん患者は抗ＰＤ－１チェックポイント阻害療法に反応しない。抗ＰＤ－１治療後のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の細胞および分子経路を完全に特徴づけるために、腫瘍、脾臓、およびドレナージリンパ節（ｄＬＮ）からのサンプルについて、超並列単一細胞ＲＮＡシーケンシングが行われた。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから、ＴＭＥ内でＰＤ－１遮断に最も強く反応した細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍に特異的な細胞サブセットであることが明らかになった。これらの細胞は、抗腫瘍免疫に極めて重要であることが示されているｃＤＣ１にのみ発現するＸＣＲ１受容体の特異的リガンドであるＤＣ化学誘引物質ＸＣＬ１を高レベルで発現した。一方、機能不全に陥ったＴ細胞は、ＸＣＬ１を全く発現せずにＰＤ－１を高レベルで発現していた（図１Ａ～１Ｃ）。これらの結果から、抗ＰＤ－１治療の効果はＣＤ８＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との相互作用に依存している可能性が示唆された。
【0191】
これらの結果を検証するために、ＸＣＲ１－ｃｒｅ－ｉＤＴＲマウス系統を用いて、ＭＣ３８結腸腺がん腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－１免疫療法の活動期にｃＤＣ１ｓを条件付きで枯渇させた。抗ＰＤ－１の有意な抗腫瘍効果は、ｃＤＣ１枯渇後に完全に消失し（図１Ｄ）、抗ＰＤ－１免疫療法中のＴＭＥにおけるＴ／ＤＣクロストークの重要性が強調された。
【0192】
実施例２
Ｔ細胞／樹状細胞ＢｉＳＥの作製
治療後のＴＭＥのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングとｃＤＣ１を誘導的に枯渇させる遺伝子モデルの結果から、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との間の免疫シナプスの形成が、抗ＰＤ－１治療の効力を向上させるという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、複数のＰＤ－１／ｃＤＣ１ ＢｉＳＥ（すなわち、ＰＤ－１とｃＤＣ１との両方と物理的結合を形成する試薬）が作製された。ｃＤＣ１アームには、ｃＤＣ１に制限された表面マーカーＸＣＲ１またはＣＬＥＣ９Ａを、それぞれＭＡＲＸ－１０クローンまたは１０Ｂ－４クローンの可変領域とともに用いた。どちらの標的もマウスとヒトで同様に保存されている。ＰＤ－１標的アームには、よく知られている抗ＰＤ－１ ｍＡｂクローンＲＰＭ１－１４の可変領域を用いた。ＢｉＳＥの生化学的特性が、目的の標的に対するそれらの二重特異性とともに調べられた。対照として、各ＢｉＳＥを構成する親ＭＡｂの単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）バージョンと、ＤＣｓをエンゲージングすることなく、ＰＤ－１／シナジスコンストラクト、高体温１つのアームのみでＰＤ－１を標的化する二重特異性フォーマットにおけるアイソタイプ対照、を作製した。
Ｔ細胞／樹状細胞ＢｉＳＥの作製
治療後のＴＭＥのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングとｃＤＣ１を誘導的に枯渇させる遺伝子モデルの結果から、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とｃＤＣ１との間の免疫シナプスの形成が、抗ＰＤ－１治療の効力を向上させるという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、複数のＰＤ－１／ｃＤＣ１ ＢｉＳＥ（すなわち、ＰＤ－１とｃＤＣ１との両方と物理的結合を形成する試薬）が作製された。ｃＤＣ１アームには、ｃＤＣ１に制限された表面マーカーＸＣＲ１またはＣＬＥＣ９Ａを、それぞれＭＡＲＸ－１０クローンまたは１０Ｂ－４クローンの可変領域とともに用いた。どちらの標的もマウスとヒトで同様に保存されている。ＰＤ－１標的アームには、よく知られている抗ＰＤ－１ ｍＡｂクローンＲＰＭ１－１４の可変領域を用いた。ＢｉＳＥの生化学的特性が、目的の標的に対するそれらの二重特異性とともに調べられた。対照として、各ＢｉＳＥを構成する親ＭＡｂの単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）バージョンと、ＤＣｓをエンゲージングすることなく、ＰＤ－１／シナジスコンストラクト、高体温１つのアームのみでＰＤ－１を標的化する二重特異性フォーマットにおけるアイソタイプ対照、を作製した。
【0193】
目的の二重特異性抗体の組み合わせを作製するためには、既存の抗体の４つの重鎖と軽鎖を正しく組み立てる必要がある。目的の重鎖のヘテロ二量体化を可能にするために、重鎖のＣＨ３ドメインの点変異を同定するｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ技術［２］が用いられた。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術［３］、すなわち、二重特異性抗体を構成する２つの抗体のうち、一方の抗体の重鎖ＣＨ１ドメインと軽鎖ＣＬ１ドメインを交換し、軽鎖とその同族である重鎖との正しい結合を確実にする。ＢｉＳＥのＦｃは、ＦｃγＲとの結合を阻害するために変異させた（Ｎ２９７Ａ）。各ＢｉＳＥの４つのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞に生成のために同時トランスフェクトし、固定化タンパク質Ｇアフィニティーカラムを用いて細胞培地から精製した。二重特異性抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により純度と均一性を評価した（図２Ａ～２Ｃ）。その結果、得られたコンストラクトの純度と同様に、コンストラクトが各抗体から２本の鎖を含む所望のヘテロ二量体に適切に組み立てられていることが示された。
【0194】
実施例３
ＢｉＳＥの結合・遮断能の検討
次に、ＰＤ－１、ＸＣＲ１、またはＣＬＥＣ９Ａのいずれかと組換えタンパク質を発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳのいずれかにより各アームの結合能を評価した。その結果、いずれの単一特異性抗体または二特異性抗体も、関連する特異性をもって３つの標的すべてに結合することが示された（図３Ａ、３Ｂ）。ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックするＢｉＳＥの能力を、ＦＡＣＳベースのＰＤ－１ブロッキングアッセイを用いて試験した（図３Ｃ、３Ｄ）。図４Ｂに見られるように、ＸＣＲ１－およびＣＬＥＣ９Ａ－ＢｉＳＥは両方、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を低下させた。
ＢｉＳＥの結合・遮断能の検討
次に、ＰＤ－１、ＸＣＲ１、またはＣＬＥＣ９Ａのいずれかと組換えタンパク質を発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳのいずれかにより各アームの結合能を評価した。その結果、いずれの単一特異性抗体または二特異性抗体も、関連する特異性をもって３つの標的すべてに結合することが示された（図３Ａ、３Ｂ）。ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックするＢｉＳＥの能力を、ＦＡＣＳベースのＰＤ－１ブロッキングアッセイを用いて試験した（図３Ｃ、３Ｄ）。図４Ｂに見られるように、ＸＣＲ１－およびＣＬＥＣ９Ａ－ＢｉＳＥは両方、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を低下させた。
【0195】
実施例４
ＢｉＳＥの二重結合能の検討
ＢｉＳＥが両方のターゲットに同時に結合し、ＰＤ－１＋細胞とＸＣＲ１＋細胞またはＣＬＥＣ９Ａ＋細胞間のクロストークを強制し、それによってＴ細胞／ＤＣ相互作用をモデル化する能力を、ＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅ染色されたペアの割合を定量する二重結合ＦＡＣＳアッセイ（図４Ａ）によって評価した。その結果、ＰＤ－１とＸＣＲ１、およびＰＤ－１とＣＬＥＣ９Ａへの効果的な同時結合が用量依存的に示された。これらの結果は、ＢｉＳＥがＰＤ－１およびｃＤＣ１表面マーカーにトランス型（すなわち、２つの異なる細胞上）で同時に結合できることを示している。二重結合は、インビトロアッセイで脾臓細胞上でも評価された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＯＴ－１ ＣＤ４５．１マウスから単離され、ＯＶＡ曝露を繰り返すと培養物中のＰＤ－１をアップレギュレートした。その後、標準的なＢｉＳＥ滴定でナイーブ脾細胞とインキュベートし、Ｔ／ＤＣダブレットをＦＡＣＳで解析した。ＢｉＳＥは脾臓細胞の用量依存的なダブレット形成を媒介し、マウス標的細胞上のＰＤ－１とＸＣＲ１／ＣＬＥＣ９Ａの両方に効果的に結合することが示された（図４Ｂ）。
ＢｉＳＥの二重結合能の検討
ＢｉＳＥが両方のターゲットに同時に結合し、ＰＤ－１＋細胞とＸＣＲ１＋細胞またはＣＬＥＣ９Ａ＋細胞間のクロストークを強制し、それによってＴ細胞／ＤＣ相互作用をモデル化する能力を、ＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅ染色されたペアの割合を定量する二重結合ＦＡＣＳアッセイ（図４Ａ）によって評価した。その結果、ＰＤ－１とＸＣＲ１、およびＰＤ－１とＣＬＥＣ９Ａへの効果的な同時結合が用量依存的に示された。これらの結果は、ＢｉＳＥがＰＤ－１およびｃＤＣ１表面マーカーにトランス型（すなわち、２つの異なる細胞上）で同時に結合できることを示している。二重結合は、インビトロアッセイで脾臓細胞上でも評価された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＯＴ－１ ＣＤ４５．１マウスから単離され、ＯＶＡ曝露を繰り返すと培養物中のＰＤ－１をアップレギュレートした。その後、標準的なＢｉＳＥ滴定でナイーブ脾細胞とインキュベートし、Ｔ／ＤＣダブレットをＦＡＣＳで解析した。ＢｉＳＥは脾臓細胞の用量依存的なダブレット形成を媒介し、マウス標的細胞上のＰＤ－１とＸＣＲ１／ＣＬＥＣ９Ａの両方に効果的に結合することが示された（図４Ｂ）。
【0196】
実施例５
ＢｉＳＥのインビボ二重結合活性の検討
ＢｉＳＥのＴ／ＤＣ免疫シナプス形成能をインビボで試験するため、マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を接種し、Ｔ細胞の疲弊を誘導し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１発現を増加させ、ＴＭＥをモデル化した。腫瘍確立後、マウスをＢｉＳＥで処置し、１日後にＴ／ＤＣシナプス形成を評価した。ＢｉＳＥ治療マウスでは、ｄＬＮにおけるダブレット形成が増加し（図５Ａ）、ｄＬＮにおける全免疫細胞からｃＤＣ１ｓの割合が増加したことから、ＢｉＳＥを投与するとｃＤＣ１のｄＬＮへの遊走が誘導される可能性が示された（図５Ｂ）。ＢｉＳＥが免疫シナプス形成の増加を媒介するかどうかを評価するため、腫瘍担持マウスを蛍光色素で標識したＢｉＳＥで処置した。１日後、ダブレット形成をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで評価した。ＢｉＳＥは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ処置マウスでは免疫シナプス内に局在し、ＰＤ－１／シナジス処置マウスと比較してシナプス形成が有意に増加した（図５Ｃ）。
ＢｉＳＥのインビボ二重結合活性の検討
ＢｉＳＥのＴ／ＤＣ免疫シナプス形成能をインビボで試験するため、マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を接種し、Ｔ細胞の疲弊を誘導し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１発現を増加させ、ＴＭＥをモデル化した。腫瘍確立後、マウスをＢｉＳＥで処置し、１日後にＴ／ＤＣシナプス形成を評価した。ＢｉＳＥ治療マウスでは、ｄＬＮにおけるダブレット形成が増加し（図５Ａ）、ｄＬＮにおける全免疫細胞からｃＤＣ１ｓの割合が増加したことから、ＢｉＳＥを投与するとｃＤＣ１のｄＬＮへの遊走が誘導される可能性が示された（図５Ｂ）。ＢｉＳＥが免疫シナプス形成の増加を媒介するかどうかを評価するため、腫瘍担持マウスを蛍光色素で標識したＢｉＳＥで処置した。１日後、ダブレット形成をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで評価した。ＢｉＳＥは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ処置マウスでは免疫シナプス内に局在し、ＰＤ－１／シナジス処置マウスと比較してシナプス形成が有意に増加した（図５Ｃ）。
【0197】
実施例６
ＢｉＳＥのインビボ抗体活性の検討
ＢｉＳＥによる免疫シナプスのインビボエンゲージメントを検証するため、従来の抗ＰＤ－１単剤療法に抵抗性を示すＢ１６Ｆ１０腫瘍マウスモデルとＭＣ３８結腸腺がんモデルを用いた。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥによる治療により、未処置マウスやＰＤ－１／シナジスアイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、全生存期間が有意に延長し、腫瘍増殖が抑制された（図６Ａ）。ＭＣ３８腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＸＣＲ１ ＢｉＳＥでの処置により、治療６日目に中等度の抗腫瘍効果が認められた（図６Ｂ）。ＫＰ肺腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥでの治療により、４匹中３匹のマウスでＫＰ肺腫瘍巣が完全に消失した（図６Ｃ）。
ＢｉＳＥのインビボ抗体活性の検討
ＢｉＳＥによる免疫シナプスのインビボエンゲージメントを検証するため、従来の抗ＰＤ－１単剤療法に抵抗性を示すＢ１６Ｆ１０腫瘍マウスモデルとＭＣ３８結腸腺がんモデルを用いた。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥによる治療により、未処置マウスやＰＤ－１／シナジスアイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、全生存期間が有意に延長し、腫瘍増殖が抑制された（図６Ａ）。ＭＣ３８腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＸＣＲ１ ＢｉＳＥでの処置により、治療６日目に中等度の抗腫瘍効果が認められた（図６Ｂ）。ＫＰ肺腫瘍モデルでは、ＰＤ－１／ＣＬＥＣ９Ａ ＢｉＳＥでの治療により、４匹中３匹のマウスでＫＰ肺腫瘍巣が完全に消失した（図６Ｃ）。
【0198】
実施例７
ＢｉＳＥのインビボＴＭＥ Ｔ細胞調節活性の検討
最後に、ＢｉＳＥ処置後のＴＭＥとｄＬＮにおけるＴ細胞のコンパートメント化および活性化を、ＭＣ３８結腸腺がん腫瘍モデルとＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルを用いて評価した。マウスは３回目のＢｉＳＥ処理から５日後に分析された。ＢｉＳＥによる処置は、未処置マウスと比較して、細胞傷害性ＣＤ８＋およびエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の有意な増加、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ）の有意な減少、およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の有意な増加をもたらした（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）。ＣＤ４エフェクター／Ｔｒｅｇ比およびＣＤ８／ＣＤ４エフェクター／Ｔｒｅｇ比もまた、ＰＤ－１／シナジス処置対照マウス（図７Ａ、７Ｃ）、およびＴＭＥにおける免疫シナプス形成の追加的な効果を示すＰＤ－１ ｍＡｂ処置マウス（図７Ｂ）と比較して、ＢｉＳＥ処理後に有意に増加した。
ＢｉＳＥのインビボＴＭＥ Ｔ細胞調節活性の検討
最後に、ＢｉＳＥ処置後のＴＭＥとｄＬＮにおけるＴ細胞のコンパートメント化および活性化を、ＭＣ３８結腸腺がん腫瘍モデルとＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルを用いて評価した。マウスは３回目のＢｉＳＥ処理から５日後に分析された。ＢｉＳＥによる処置は、未処置マウスと比較して、細胞傷害性ＣＤ８＋およびエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の有意な増加、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ）の有意な減少、およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の有意な増加をもたらした（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）。ＣＤ４エフェクター／Ｔｒｅｇ比およびＣＤ８／ＣＤ４エフェクター／Ｔｒｅｇ比もまた、ＰＤ－１／シナジス処置対照マウス（図７Ａ、７Ｃ）、およびＴＭＥにおける免疫シナプス形成の追加的な効果を示すＰＤ－１ ｍＡｂ処置マウス（図７Ｂ）と比較して、ＢｉＳＥ処理後に有意に増加した。
【0199】
実施例８
ＢｉＳＥタイムラインの検討
最後に、Ｂ１６腫瘍モデルを用いて、ＴＭＥとｄＬＮにおけるダブレット形成、およびＴＭＥにおけるＴ細胞のコンパートメント化と活性化を、ＢｉＳＥ処置後、４つの時点にわたって評価した。マウスは、１回目、２回目、３回目のＢｉＳＥ注射の２４時間後、および３回目のＢｉＳＥ注射の５日後に採取された。ＢｉＳＥ処置により、腫瘍およびｄＬＮにおけるＴ細胞／ＤＣ１ダブレット形成が改善され、未処置群およびアイソタイプ対照群と比較して、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞の有意な増加、およびＴエフェクター／Ｔｒｅｇ比の有意な増加が認められ、ＴＭＥにおける免疫シナプス形成の付加的な有益性が改めて強調された（図８Ａ～８Ｄ）。
ＢｉＳＥタイムラインの検討
最後に、Ｂ１６腫瘍モデルを用いて、ＴＭＥとｄＬＮにおけるダブレット形成、およびＴＭＥにおけるＴ細胞のコンパートメント化と活性化を、ＢｉＳＥ処置後、４つの時点にわたって評価した。マウスは、１回目、２回目、３回目のＢｉＳＥ注射の２４時間後、および３回目のＢｉＳＥ注射の５日後に採取された。ＢｉＳＥ処置により、腫瘍およびｄＬＮにおけるＴ細胞／ＤＣ１ダブレット形成が改善され、未処置群およびアイソタイプ対照群と比較して、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞の有意な増加、およびＴエフェクター／Ｔｒｅｇ比の有意な増加が認められ、ＴＭＥにおける免疫シナプス形成の付加的な有益性が改めて強調された（図８Ａ～８Ｄ）。
【0200】
実施例９
ヒト細胞に結合する抗体の定性
二重結合／ＰＤ－１遮断アッセイ－ヒト抗原標的でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用。
ヒト細胞に結合する抗体の定性
二重結合／ＰＤ－１遮断アッセイ－ヒト抗原標的でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用。
【0201】
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ－ＢｉＳＥまたは対照Ａｂを用いてＰＤ－１遮断およびＭＯＡを評価するためにプレメイドキットを使用。
【0202】
ダブレット、ＤＣ／Ｔ活性化およびサイトカイン分泌共培養アッセイ
ヒト血液ドナー由来のＰＢＭＣを単離した。Ｔ細胞とＤＣｓはそれぞれＣＤ８とＣＤ１４に対する専用抗体を用いて濃縮し、未熟ＤＣｓはＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４などの試薬を用いて分化させ、そしてＢｉＳＥまたは対照抗体とインキュベートする。効果は、サイトカインＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ／ＩＬ－１２サイトカイン放出、ＦＡＣＳによるＤＣ／Ｔ活性化マーカー、ダブレット形成によって決定される。
ヒト血液ドナー由来のＰＢＭＣを単離した。Ｔ細胞とＤＣｓはそれぞれＣＤ８とＣＤ１４に対する専用抗体を用いて濃縮し、未熟ＤＣｓはＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４などの試薬を用いて分化させ、そしてＢｉＳＥまたは対照抗体とインキュベートする。効果は、サイトカインＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ／ＩＬ－１２サイトカイン放出、ＦＡＣＳによるＤＣ／Ｔ活性化マーカー、ダブレット形成によって決定される。
【0203】
ＤＣ：Ｔ相互作用のインビトロイメージング
富化されたＤＣｓ（ヒトＰＢＭＣｓ由来）をコーティングしたカバースリップ上に播種し、ＢｉＳＥ抗体または対照抗体の存在下で、前刺激Ｔ細胞と共培養する。免疫蛍光法で分析する。
富化されたＤＣｓ（ヒトＰＢＭＣｓ由来）をコーティングしたカバースリップ上に播種し、ＢｉＳＥ抗体または対照抗体の存在下で、前刺激Ｔ細胞と共培養する。免疫蛍光法で分析する。
【0204】
Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞についてＰＢＭＣを富化、およびＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅでの標識。抗ＣＤ３抗体での刺激、およびＤＣｓとＢｉＳＥ／対照抗体との存在下で数日間培養。ＦＡＣＳによるＣＦＳＥ／ＣＴ希釈の解析。培養開始から４８時間後にサイトカイン解析用の上清を採取。
Ｔ細胞についてＰＢＭＣを富化、およびＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅでの標識。抗ＣＤ３抗体での刺激、およびＤＣｓとＢｉＳＥ／対照抗体との存在下で数日間培養。ＦＡＣＳによるＣＦＳＥ／ＣＴ希釈の解析。培養開始から４８時間後にサイトカイン解析用の上清を採取。
【0205】
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明したが、多くの代替案、変更例および変形例が当業者に明らかであることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲に属する、そのような代替案、修正例および変形例をすべて包含することを意図している。
【0206】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用または特定は、当該参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈してはならない。節見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。さらに、本出願の優先権文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0207】
参考文献
（他の参考文献は本出願全体にわたり引用される）
（他の参考文献は本出願全体にわたり引用される）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】