特表 2024-533507 定量的および半定量的シード増幅アッセイのための不活性マトリックス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】定量的および半定量的シード増幅アッセイのための不活性マトリックス

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240905BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516490

(86)(22)【出願日】2022-09-09

(85)【翻訳文提出日】2024-04-23

(86)【国際出願番号】 US2022076243

(87)【国際公開番号】W WO2023039552

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/243,470

(32)【優先日】2021-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/328,443

(32)【優先日】2022-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519404919

【氏名又は名称】アンプリオン、インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】524096082

【氏名又は名称】コンチャ、ルイス

(71)【出願人】

【識別番号】522080672

【氏名又は名称】ファリス、カーリー

(71)【出願人】

【識別番号】522447196

【氏名又は名称】マ、イフア

(71)【出願人】

【識別番号】524095100

【氏名又は名称】グエン、ヒエウ フウ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コンチャ、ルイス

(72)【発明者】

【氏名】ファリス、カーリー

(72)【発明者】

【氏名】マ、イフア

(72)【発明者】

【氏名】グエン、ヒエウ フウ

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045BA11

2G045BA13

2G045BB42

2G045CB30

2G045DA36

2G045DA38

2G045FA11

2G045GC15

(57)【要約】

α－シヌクレインシード増幅アッセイ「ａＳ－ＳＡＡ」と共に使用するための不活性マトリックスが提供される。不活性マトリックスは、陰性対照として使用される場合、αＳ基質自己凝集がない、知覚的に低い、または遅延した形態で、ミスフォールドαＳタンパク質の非存在を正確に反映するが、陽性対照として使用される場合、シードとのαＳ基質の凝集を容易に可能にする。不活性マトリックスを使用してαＳ－ＳＡＡ試薬の適格性をスクリーニングすることができる。不活性マトリックスを使用して周辺生体マトリックスから採取された試料を希釈することができる。最後に、不活性マトリックスをαＳ－ＳＡＡ試料の段階希釈のための希釈剤として使用して、αＳ－ＳＡＡの半定量的バージョンを可能にすることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）
（１）ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）；または
（２）ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＢＳＡ前駆体タンパク質、トランスフェリン、および免疫グロブリンＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群
のいずれかを含む血漿タンパク質と；
（Ｂ）ＮａＣｌを含む生理的塩類水溶液と
を含む組成物。

【請求項2】

前記血漿タンパク質がＨＳＡから本質的になる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記血漿タンパク質が約１．５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡから本質的になる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記血漿タンパク質が約１５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡから本質的になる、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（「ＨＥＰＥＳ」）を含む緩衝組成物をさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項6】

１００ｍＭのＨＥＰＥＳを含む緩衝組成物をさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項7】

ＨＥＰＥＳを含む緩衝組成物をさらに含み、前記緩衝組成物が組成物のｐＨを約７．５に維持する、請求項２に記載の組成物。

【請求項8】

サルコシルを含む洗浄剤をさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項9】

約０．５％のサルコシルを含む洗浄剤をさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項10】

前記生理的塩類水溶液が約７５ｍＭのＮａＣｌから本質的になる、請求項２に記載の組成物。

【請求項11】

（１）組成物のｐＨを約７．５に維持する、ＨＥＰＥＳを含む緩衝組成物と；
（２）約０．５％のサルコシルを含む洗浄剤と
をさらに含み、前記生理的塩類水溶液が約７５ｍＭのＮａＣｌから本質的になる、請求項２に記載の組成物。

【請求項12】

前記血漿タンパク質が、ＢＳＡ、トランスフェリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記血漿タンパク質が０．１～０．３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡから本質的になる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記血漿タンパク質が、０．１～０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．０２～０．０６ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンから本質的になる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項15】

前記血漿タンパク質が、０．１５５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．０４２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンから本質的になる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

前記生理的塩類水溶液が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２ ^．２Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ_２ ^．６Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ、およびＮａＨ_２ＰＯ_４ ^．Ｈ_２Ｏから本質的になる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項17】

６～７．５のｐＨを有する、請求項１２に記載の組成物。

【請求項18】

前記血漿タンパク質が、約０．１５５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび約０．４２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンから本質的になり；
前記生理的塩類水溶液が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２ ^．２Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ_２ ^．６Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ、およびＮａＨ_２ＰＯ_４ ^．Ｈ_２Ｏから本質的になる、
請求項１２に記載の組成物。

【請求項19】

前記血漿タンパク質が約０．２０１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡから本質的になり；
前記生理的塩類水溶液が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２ ^．２Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ_２ ^．６Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ、およびＮａＨ_２ＰＯ_４ ^．Ｈ_２Ｏから本質的になる、
請求項１２に記載の組成物。

【請求項20】

（１）約１．５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと；
（２）ｐＨ約７．５を有する（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）と；
（３）約７５ｍＭのＮａＣｌと；場合により
（４）約０．５％のサルコシルと
から本質的になる組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２４３，４７０号および２０２２年４月７日に出願された米国仮特許出願第６３／３２８，４４３号の利益を主張する。これらの出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
配列表はＸＭＬ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年９月９日に作成されたＸＭＬコピーは、Ａｍｐｒｉｏｎ－ｓＣＳＦＱ＿ＳＴ２６．ｘｍｌという名前でサイズが３，７０５バイトである。

【背景技術】

【0003】

シード増幅アッセイ（「ＳＡＡ」）は、組織および体液中のバイオマーカーミスフォールドタンパク質凝集体を、伝統的なイムノアッセイ法による検出には低すぎる力価で検出するための高感度かつ特異的な手段を提供している。全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｏ ＭＪ、Ｏｒｒｕ ＣＤ、Ｃｏｎｃｈａ－Ｍａｒａｍｂｉｏ ＬらＨｉｇｈ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｓｅｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１年１１月２６日；９（１）：１９０に公開された補正が記載されている］．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１；９（１）：１７９．２０２１年１１月６日公開．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０４７８－０２１－０１２８２－８を参照されたい。ＳＡＡは、ミスフォールドタンパク質を伴う病態のはるかに早期の診断を可能にし、これは疾患の処置および症状の予防または緩和にとって重要であると分かり得る。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｃｈａ－Ｍａｒａｍｂｉｏ Ｌ、Ｆａｒｒｉｓ，Ｃａｒｌｙ ＭらＳｅｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｅａｒｌｙ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．２０２１；３６（１０）：２４４４．２０２１年７月８日．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｍｄｓ．２８７１を参照されたい。

【0004】

ＳＡＡは、アッセイ基質として使用されるのと同じタイプの単量体タンパク質を犠牲にして、アッセイ基質の自己凝集を回避しながら、生体試料（「シード」）に対して内因性であるミスフォールドタンパク質凝集体の増幅促進に依存する。陰性対照として、この目的のための信頼できる市販の合成対照溶液が存在しないため、ＳＡＡは、一般に、既知の健康な対照（「ＨＣ」）ドナーからの生体試料を使用する。陰性対照は、断続的な振盪ならびに基質、緩衝液および蛍光プローブの添加を含む、目的の生体試料と同じ条件に供される。陰性対照が凝集を示さず、生体試料が凝集を示さない場合（すなわち、シードの増幅がない）、患者が「陰性」とみなされるか、または凝集が「検出されない」とみなされる。陰性対照が凝集を示さず、生体試料が凝集を示す場合、患者が「陽性」とみなされるか、または凝集が「検出された」とみなされる。陰性対照が凝集を示す場合、陰性対照の陽性は、取り扱い、試薬安定性、または消耗品の品質のいずれかに関するアッセイの問題を示すので、結果を破棄し、アッセイを繰り返さなければならない。したがって、陰性対照は、基質の自己凝集を誘導も許容もしてはならない。

【0005】

陽性対照として、ＳＡＡは、一般に、関連するタンパク質ミスフォールディング障害の診断が確認された患者由来の生体試料、または既知量の生物学的バイオマーカーと同じタイプの合成ミスフォールドタンパク質凝集体（「合成シード」）を「スパイクされた」生体試料を使用する。ここでも、基質の自己凝集を抑制しながら合成シードの増幅を維持することができる市販の合成対照溶液が存在しないので、ヒト試料が使用される。陽性対照は、生体試料と同じ条件に供される。陽性対照が凝集を示す場合、アッセイ条件はシード増幅に適合し、これは、試薬（基質を含む）、消耗品、および取り扱いがバイオマーカーを検出するのに必要な品質であったことを意味する。陽性対照が凝集を示さない場合、陽性対照の凝集の欠如は、取り扱い、試薬安定性、または消耗品の品質のいずれかに関するアッセイの問題を示すので、結果を破棄し、アッセイを繰り返さなければならない。

【0006】

最近の研究は、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）がミスフォールドタンパク質の存在に関して脳物質を密接に反映することを示している。例えば、Ｓｈａｈｎａｗａｚ，Ｍ．、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ａ．、Ｐｒｉｔｚｋｏｗ，Ｓ．らＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５７８、２７３～２７７（２０２０）を参照されたい。したがって、ＣＳＦ中のミスフォールドタンパク質の検出は特に重要である。残念なことに、研究の状況で陽性対照および陰性対照のための不活性または中性アッセイマトリックスとして使用される組成物は、あまりに頻繁に（陰性対照では）基質の自己凝集を誘導もしくは許容するか、または（陽性対照では）シード、内因性もしくは合成の存在下で凝集を妨げる。

【0007】

さらに、診断目的のためのＳＡＡの臨床使用のための再現性のあるマトリックスとして健康なドナー由来のヒトＣＳＦに依存することは不可能である。第１に、ＣＳＦは、個々のドナー間で劇的な差を示す非常に複雑な生物流体である。これらの差は、健康な患者と病気の患者を比較すると大きくなるが、同様の健康状態の患者が、非常に異なるＣＳＦ組成を有することがある。場合によっては、健康なドナー由来のＣＳＦ試料が自己凝集を誘導し得、他の場合では、健康なドナー由来のＣＳＦ試料がシード凝集を部分的に阻害し得る。さらに、実際問題として、健康なヒトＣＳＦ試料は無制限の供給で入手できるわけではない。

【0008】

したがって、そのまま使用することができ、容易に入手可能であり、豊富に供給され、陰性対照として使用される場合、基質自己凝集がない、知覚的に低い、または遅延した形態で、ミスフォールドタンパク質の非存在を正確に反映するが、陽性対照として使用される場合、シードとの基質の凝集を容易に可能にする、対照溶液として使用するための不活性マトリックスが必要とされている。

【0009】

ＣＳＦのアルファ－シヌクレイン（「αＳ」）－ＳＡＡは、ミスフォールドαＳ凝集体を検出するためのゴールドスタンダードであるが、ＣＳＦを得るには、脊椎のくも膜下腔からＣＳＦの試料を取り出すために、脊椎穿刺としても知られる侵襲的腰椎穿刺が必要である。周辺マトリックス（例えば、血液、唾液、皮膚および嗅粘膜）のαＳ－ＳＡＡは公知であるが（例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，９８９，７１８号明細書、同第１１，０７９，３９６号明細書および同第１１，０９９，１９７号明細書参照）、そのような周辺マトリックスの試料処理における希釈剤として使用するための信頼性の高い不活性マトリックスが依然として必要とされている。全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年９月９日に出願された米国仮特許出願第６３／３７５，１２６号を参照されたい。

【0010】

ＳＡＡの最も困難な態様の１つは、適格な基質、すなわち自己凝集しないが、生体試料環境中のシードの存在下で凝集する基質を特定することであるので、基質の適格性（ならびにＳＡＡで使用される他の試薬および消耗品の適格性）をスクリーニングするために使用され得る対照溶液として使用するための不活性マトリックスの必要性も存在する。

【0011】

最後に、バイオマーカーの定量化が依然として課題である。定量的アッセイは、標準を使用して所与の分析物の濃度（Ｍまたはｍｇ／ｍＬ）を測定する。例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，２１５，７６３号明細書および米国特許出願公開第２０１９０１３７５１５号明細書（「プリオン参考文献」）を参照されたい。αＳ－ＳＡＡは理想的な条件（緩衝液中の合成シード）下では定量的であるが（例えば、Ｓｈａｈｎａｗａｚ，Ｍ．らＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ α－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．７４、１６３（２０１７）；およびＧｒｏｖｅｍａｎ，Ｂ．Ｒ．らＲａｐｉｄ ａｎｄ ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｓｅｅｄｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｂｙ αＳｙｎ ＲＴ－ＱｕＩＣ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．６、７（２０１８）参照）、プリオン参考文献に記載される定量化は、少なくとも２つの理由で生体試料のαＳ－ＳＡＡの文脈では実行不可能である。第１に、内因性αＳ凝集体と同じ凝集活性を有する濃度基準は存在しない；合成シードははるかに速く凝集し、内因性αＳ凝集体の甚だしい過小評価をもたらすであろう。さらに、異なる種は異なるシーディング活性を有し得るので、濃度基準はαＳ凝集体の分子量分布と一致すべきである。したがって、合成シードを絶対濃度基準として正確に使用することはできない。第２に、体液は複雑なマトリックスであり、凝集の動態が患者ごとに異なる。例えば、ＣＳＦ中のαＳの濃度が同じ患者が、それぞれのＣＳＦマトリックスの差のために異なる凝集パターンを示す可能性がある。したがって、相対的αＳ凝集体レベルを推定し、生体試料間での比較を可能にしてそれらをランク付けするＳＡＡの半定量的バージョンを可能にするために、ＳＡＡ試料の段階希釈のための希釈剤として使用するための不活性マトリックスが必要とされている。

【発明の概要】

【0012】

一態様では、αＳ－ＳＡＡに使用するための不活性マトリックスが提供される。一態様では、不活性マトリックス（以下、合成ＣＳＦまたは「ｓＣＳＦ」と呼ばれることもある）は、（Ａ）（１）ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）、または（２）ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＢＳＡ前駆体タンパク質、トランスフェリン、および免疫グロブリンＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるもののいずれかを含む血漿タンパク質と；（Ｂ）ＮａＣｌを含む生理的塩類水溶液とを含む。血漿タンパク質がＨＳＡを含む場合、ｓＣＳＦは、洗浄剤、例えばサルコシル、および緩衝組成物、例えば（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（「ＨＥＰＥＳ」）をさらに含み得る。一態様では、ＨＥＰＥＳは、ＨＳＡを含むｓＣＳＦのｐＨを約７．５に維持する。

【0013】

一態様では、αＳ－ＳＡＡにおいて陰性対照としてｓＣＳＦを使用する方法であって、（Ｉ）本明細書に開示されるｓＣＳＦを用意するステップと；（ＩＩ）（Ａ）単量体αＳ基質；（Ｂ）緩衝組成物；（Ｃ）塩組成物；（Ｄ）蛍光タンパク質凝集指示薬；および場合により（Ｅ）ビーズを含むプレインキュベーション混合物を用意するステップと；（ＩＩＩ）ｓＣＳＦとプレインキュベーション混合物を組み合わせて、インキュベーション混合物を形成するステップと；（ＩＶ）インキュベーション混合物を、断続的な撹拌サイクルを用いてインキュベートして、インキュベートされた混合物を形成するステップと；（Ｖ）蛍光タンパク質凝集指示薬がタンパク質凝集体に結合している場合、蛍光タンパク質凝集指示薬を励起するのに十分な波長の光で、インキュベートされた混合物を照射するステップと；（ＶＩ）第１の蛍光強度を決定するステップと；（ＶＩＩ）第１の蛍光強度を所定の第２の蛍光強度と比較し、第１の蛍光強度よりも大きい第２の蛍光強度は、ｓＣＳＦ中に知覚可能な量の自己凝集αＳ基質が存在しないことを示す、ステップとを含む方法が提供される。

【0014】

一態様では、αＳ－ＳＡＡ基質としてのαＳ単量体タンパク質の適格性および／またはＳＡＡ緩衝組成物の適格性を含む、αＳ－ＳＡＡにおける試薬および消耗品の１つまたは複数の適格性を決定するのに適したｓＣＳＦが提供される。一態様では、ビーズを使用しない図１に示されるように、本方法は、（Ａ）（１）単量体αＳタンパク質；（２）緩衝組成物；（３）塩組成物；（４）蛍光タンパク質凝集指示薬；（５）本明細書に開示されるｓＣＳＦ；および場合により（６）ビーズを含むインキュベーション混合物を用意するステップと；（Ｂ）インキュベーション混合物を、断続的な撹拌サイクルを用いてインキュベートして、インキュベートされた混合物を形成するステップと；（Ｃ）蛍光タンパク質凝集指示薬がタンパク質凝集体に結合している場合、蛍光タンパク質凝集指示薬を励起するのに十分な波長の光で、インキュベートされた混合物を照射するステップと；（Ｄ）インキュベーション中に蛍光強度を決定し、蛍光の有意な増加がないことは、単量体αＳタンパク質の自己凝集がないことを示し、単量体αＳタンパク質の自己凝集がないことは、αＳ－ＳＡＡ基質としてのαＳ単量体タンパク質の適格性および緩衝組成物の適格性を示すステップとを含む。

【0015】

一態様では、αＳ－ＳＡＡ基質としてのαＳ単量体タンパク質の適格性および／またはＳＡＡ緩衝組成物の適格性を含む、αＳ－ＳＡＡにおける試薬および消耗品の１つまたは複数の適格性を決定するのに適したｓＣＳＦが提供される。一態様では、ビーズを使用しない図２に示されるように、本方法は、（Ａ）本明細書に開示されるｓＣＳＦ中に組換え合成αＳを用意するステップと；（Ｂ）（１）単量体αＳタンパク質；（２）緩衝組成物；（３）塩組成物；（４）蛍光タンパク質凝集指示薬；および場合により（５）ビーズを含むプレインキュベーション混合物を用意するステップと；（Ｃ）組換え合成αＳシードとプレインキュベーション混合物を組み合わせて、インキュベーション混合物を形成するステップと；（Ｄ）インキュベーション混合物を、断続的な撹拌サイクルを用いてインキュベートして、インキュベートされた混合物を形成するステップと；（Ｅ）蛍光タンパク質凝集指示薬がタンパク質凝集体に結合している場合、蛍光タンパク質凝集指示薬を励起するのに十分な波長の光で、インキュベートされた混合物を照射するステップと；（Ｆ）インキュベーション中に蛍光強度を決定し、蛍光の有意な増加は、単量体αＳタンパク質を犠牲にして、合成シードの増幅を示し、これは、αＳ－ＳＡＡ基質としてのαＳ単量体タンパク質の適格性および緩衝組成物の適格性を示すステップとを含む。

【0016】

一態様では、ミスフォールドαＳ凝集体の存在を検出するための半定量的方法における希釈剤として適したｓＣＳＦが提供される。一態様では、本方法は、（Ａ）（１）第１のヒト生体試料；および（２）第２のヒト生体試料を用意するステップと；（Ｂ）本明細書に記載されるプレインキュベーション混合物を用意するステップと；（Ｃ）（１）第１の生体試料の一部を取り出し、取り出された部分を一定の体積の本明細書に開示されるｓＣＳＦと組み合わせて希釈された第１の生体試料を形成することにより、第１の生体試料を；および（２）第２の生体試料の一部を取り出し、取り出された部分を一定の体積のｓＣＳＦと組み合わせて希釈された第２の生体試料を形成することにより、第２の生体試料を段階希釈するステップと；（Ｄ）連続的に希釈された第１の生体試料および連続的に希釈された第２の生体試料を用いて、ステップ（Ｃ）を所定回数繰り返すステップと；（Ｅ）連続的に希釈された第１の生体試料および第２の生体試料の各々をαＳ－ＳＡＡに供するステップとを含む。

【0017】

別の態様では、複数のヒト生体試料中のミスフォールドαＳ凝集体の存在を検出するための半定量的方法であって、（Ａ）（１）少なくとも２つの反応容器に分割された第１のヒト生体試料を用意して、個々の第１のヒト生体試料アリコートを形成する；（２）少なくとも２つの反応容器に分割された第２のヒト生体試料を用意して、個々の第２のヒト生体試料アリコートを形成する；および（３）少なくとも２つの反応容器に分割された第３のヒト生体試料を用意して、個々の第３のヒト生体試料アリコートを形成するステップと；（Ｂ）（１）単量体αＳタンパク質；（２）緩衝組成物；（３）塩組成物；および（４）フルオロフォアを含む指示薬を含むプレインキュベーション混合物を用意するステップと；（Ｃ）（１）第１の複数の反応容器のうちの１つにおいて、第１の生体試料の第１のアリコートとプレインキュベーション混合物を組み合わせて、第１のベースラインインキュベーション混合物を形成する；（２）第２の複数の反応容器のうちの１つにおいて、第２の生体試料の第１のアリコートとプレインキュベーション混合物を組み合わせて、第２のベースラインインキュベーション混合物を形成する；および（３）第３の複数の反応容器のうちの１つにおいて、第３の生体試料の第１のアリコートとプレインキュベーション混合物を組み合わせて、第３のベースラインインキュベーション混合物を形成するステップと；（Ｄ）ベースラインインキュベーション混合物を、断続的な撹拌サイクルを用いてインキュベートして、ベースラインのインキュベートされた混合物を形成するステップと；（Ｅ）フルオロフォアを励起する波長の光で、ベースラインのインキュベートされた混合物を照射するステップと；（Ｆ）インキュベーション中に蛍光レベルを決定し、蛍光レベルの上昇は、それぞれの生体試料中のαＳ凝集体の存在を示し、蛍光レベルがそれぞれの生体試料の最大蛍光の半分に達するのに必要な時間（ベースラインＴ_５０）を決定するステップと；（Ｇ）（１）第１の生体試料の第２のアリコートに一定量の外因性αＳシードを添加してスパイクされた第１の生体試料を形成する；（２）第２の生体試料の第２のアリコートに等量の外因性αＳシードを添加してスパイクされた第２の生体試料を形成する；（３）第３の生体試料の第２のアリコートに等量の外因性αＳシードを添加してスパイクされた第３の生体試料を形成する；（４）スパイクされた生体試料に対してステップ（Ｃ）～（Ｆ）を繰り返す；ならびに（５）以下の式：（ａ）φ（第１の生体試料）＝ベースラインＴ_５０（第１の生体試料）／スパイクＴ_５０（第１の生体試料）；（ｂ）φ（第２の生体試料）＝ベースラインＴ_５０（第２の生体試料）／スパイクＴ_５０（第２の生体試料）；および（ｃ）φ（第３の生体試料）＝ベースラインＴ_５０（第３の生体試料）／スパイクＴ_５０（第３の生体試料）に従って、各生体試料の正規化された活性係数φを決定することによって、ベースラインＴ_５０を正規化するステップと；（Ｈ）各生体試料についての正規化された活性係数を、疾患進行スケールでの臨床的に推定された評価と比較するステップとを含む方法が提供される。

【0018】

本発明は、以下の図を参照することによってより容易に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】陰性対照としてｓＣＳＦを使用した、および／またはαＳ基質としての単量体αＳタンパク質の適格性の決定における（具体的には、単量体αＳタンパク質が自己凝集する傾向があるかどうかを決定するための）「低速」（すなわち、ビーズを使用しない）αＳ－ＳＡＡの例示的な描写を示す図である。

【0020】

【図2】αＳ基質としての単量体αＳタンパク質の適格性の決定における（具体的には、単量体αＳタンパク質がαＳシードと凝集することができるかどうかを決定するため）組換え合成αＳシードを含有するｓＣＳＦを使用した低速αＳ－ＳＡＡの例示的描写を示す図である。

【0021】

【図3】陰性対照溶液としてＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．１５５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０４２ｍｇ／ｍＬトランスフェリンを使用したαＳ基質の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0022】

【図4】陰性対照溶液としてＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．１５５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０４２ｍｇ／ｍＬトランスフェリンを使用したαＳ基質の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0023】

【図5】陰性対照溶液としてＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．２０１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを使用したαＳ基質の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0024】

【図6】陽性対照溶液としてＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．１５５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０４２ｍｇ／ｍＬトランスフェリン中２０ｆｇの合成シードを使用したαＳ基質の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0025】

【図7】陽性対照溶液としてＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．２０１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中２０ｆｇの合成シードを使用したαＳ基質の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0026】

【図8】陰性対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ｈａｓおよび０．５％サルコシルを使用した適格なαＳ基質の「高速」（すなわち、ビーズを使用）αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0027】

【図9】陰性対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｈａｓＨＳＡおよび０．５％サルコシルを使用した不適格なαＳ基質の高速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0028】

【図10】陽性対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｈａｓｍＬ ＨＳＡおよび０．５％サルコシル中２０ｆｇの合成シードを使用したαＳ基質の高速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す図である。

【0029】

【図11】異なる健康な対照（ＨＣ）ドナー由来のＣＳＦを使用した場合のαＳ－ＳＡＡに対する凝集阻害の変動性を示すグラフを示す図である。

【0030】

【図12】希釈剤としてのＨＣ－ＣＳＦおよび希釈剤としてのＮＰＨ－ＣＳＦと比較した、希釈剤として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ、および０．５％サルコシルを使用した段階希釈レベルでのＰＤ陽性試料の高速αＳ－ＳＡＡ条件中の経時的な蛍光強度の一連のグラフを示す図である。

【0031】

【図13】希釈剤として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、および１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡを使用した段階希釈レベルでのＰＤ陽性試料の代替高速αＳ－ＳＡＡ条件中の経時的な蛍光強度の一連のグラフを示す図である。

【0032】

【図14】不活性マトリックスとしてのＮＰＨ－ＣＳＦまたはｓＣＳＦにおける高速αＳ－ＳＡＡまたは代替高速αＳ－ＳＡＡ条件での２つのＣＳＦ試料のＳＤ_５０値を比較するチャートを示す図である。

【0033】

【図15】ＰＤを有すると診断された患者由来の３つの試料についての正規化されたシーディング係数（ｓｅｅｄｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（φ）対ホーン・ヤール（Ｈ＆Ｙ）スコアを示すグラフを示す図である。

【0034】

【図16】非シヌクレイノパチー対照と比較した、ＰＤを有すると診断された患者由来の嗅粘膜試料の存在下での、配列番号２に対応する単量体αＳ基質を使用したαＳ－ＳＡＡ凝集曲線を示す図である。嗅粘膜試料を、αＳ－ＳＡＡ前に本明細書で提供されるｓＣＳＦを使用して希釈した。

【発明を実施するための形態】

【0035】

ＡＳ ＳＡＡのための不活性マトリックスまたはｓＣＳＦが提供される。ｓＣＳＦは、陰性対照として使用される場合、基質自己凝集がない、知覚的に低い、または遅延した形態で、ミスフォールドタンパク質の非存在を正確に反映するが、陽性対照として使用される場合、シードとの基質の凝集を容易に可能にする。ｓＣＳＦは、基質および他の試薬の適格性をスクリーニングするために使用され得る。ｃＣＳＦは、周辺マトリックスの前処理のための希釈剤として使用され得る。最後に、ｓＣＳＦをＳＡＡ試料の段階希釈のための希釈剤として使用して、ＳＡＡの半定量的バージョンを可能にすることができる。

【0036】

定義
ある数字と合わせた「約」という用語は、その数字の±１０％を含むことを意図している。これは、「約」が、独立した数字を修飾しているか、または数字の範囲の端のいずれかもしくは両方で数字を修飾しているかにかかわらず当てはまる。言い換えると、「約１０」は、９～１１を意味する。同様に、「約１０～約２０」は、９～２２および１１～１８を企図する。「約」という用語または範囲（例えば、±１０％）の明確な指示がない場合、正確な数が意図される。言い換えると、「１０」は１０を意味する。

【0037】

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ビーズ（ａ ｂｅａｄ）」への言及は、複数のビーズを含む。

【0038】

値の範囲が提供される場合、（文脈上明らかにそうでないと指示されていない限り）下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの介在値、および他の明言される値またはその明言される範囲内の介在値が包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立により小さな範囲に含まれてもよく、また明言される範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として包含される。明言される範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれる限界のいずれかまたは両方を除外した範囲も含まれる。

【0039】

「ミスフォールドαＳ凝集体」または「αＳ凝集体」は、ミスフォールドαＳタンパク質の凝集体を指す。凝集体はオリゴマーまたはポリマーと呼ばれることがあり、凝集はオリゴマー化または重合と呼ばれることがある。

【0040】

「ミスフォールドαＳタンパク質」は、生物系内のその典型的な非病原性正常機能に存在するように、タンパク質の構造的コンフォメーションの全部または一部を欠くαＳタンパク質である。ミスフォールドαＳタンパク質は凝集し得る。ミスフォールドαＳタンパク質はタンパク質凝集体に局在し得る。ミスフォールドαＳタンパク質は非機能性タンパク質であり得る。ミスフォールドαＳタンパク質はタンパク質の病原性コンフォーマーであり得る。

【0041】

本明細書で使用される場合、可溶性ミスフォールドαＳ凝集体を含む「可溶性」種は、生理学的条件下で体液中溶液を形成し得るが、「不溶性」種は、このような体液中に沈殿、原線維、堆積物、もつれまたは他の非溶解形態として存在し得る。生理学的条件下で非体液に溶解するが、体液に溶解しない種は、不溶性とみなされる。例えば、αＳなどの原線維は、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の水溶液に溶解することができるが、生理学的条件下で、体液に依然として不溶性であり得、したがって、不溶性とみなされる。

【0042】

核形成依存性凝集は、凝集核が形成し、さらなるおよび／またはより大きな凝集体の急速な形成を刺激する遅い「遅滞期」を特徴とし得る。遅滞期は、予め形成された「核」または「シード」の添加によって最小化または排除され得る。「シード」または「核」は、さらなる凝集を誘導する能力を有するミスフォールドαＳタンパク質または短い断片化された原線維を指す。

【0043】

ミスフォールドαＳタンパク質の凝集体は、「脱凝集」、すなわち崩壊または破壊されて、より小さな断片および凝集体、例えば断片化された原線維およびより小さなミスフォールドａＳ凝集体を放出し得る。ミスフォールドαＳ凝集体シードのコレクションの触媒活性は、混合物中のシードの数に少なくとも部分的に比例し得る。したがって、ミスフォールドαＳ凝集体を破壊して、より小さなミスフォールドαＳ凝集体および断片化された原線維をシードとして放出することは、さらなる凝集のための触媒活性の増加をもたらし得る。

【0044】

「単量体αＳタンパク質」および「単量体αＳ基質」という句は、互換的に使用され、シードに関連する凝集に対する触媒活性を有さない、それらの天然の非病原性構成の１つまたは複数のシードを含まないαＳタンパク質分子を指す。

【0045】

「各」という用語に言及する場合、「すべて、例外なく」を意味するものではない。例えば、インキュベーションサイクルが言及され、「各インキュベーションサイクル」がある特定のステップを含むと言われる場合、インキュベーションサイクルが１０回行われ、インキュベーションサイクルのうちの１つがある特定のステップを含む場合、そのインキュベーションサイクルは制限を満たすことを意図している。

【0046】

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲を、特定されている材料またはステップならびに「特許請求されている発明の基本的なおよび新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。ＭＰＥＰ§２１１１．０３（ＩＩＩ．）。

【0047】

特に定義されない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0048】

ｓＣＳＦ
一態様では、ｓＣＳＦは生理的塩類水溶液と血漿タンパク質とを含み得る。

【0049】

生理的塩類水溶液は生理的ＣＳＦを模倣するように設計され得る。生理的塩類水溶液は、ヒトＣＳＦ中に存在する塩の少なくとも１つに対応する塩を含む水性溶液を含み得る。一部の態様では、生理的塩類水溶液は、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸イオンのうちの１つまたは複数を含む。生理的塩類水溶液中の塩は、ヒトＣＳＦに見られる濃度と同様の濃度で提供され得る。例えば、生理的塩類水溶液は、１３０～１６０ｍＭのＮａＣｌ；２．７～３．９ｍＭのＫＣｌ；１～１０ｍＭのＣａＣｌ_２ ^．２Ｈ_２Ｏ；０．５～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２ ^．６Ｈ_２Ｏ；０．５～５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ；および０．１～２ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４ ^．Ｈ_２Ｏを含み得る。一部の態様では、生理的塩類水溶液は、１４８ｍＭのＮａＣｌ；３ｍＭのＫＣｌ；１．４ｍＭのＣａＣｌ_２ ^．２Ｈ_２Ｏ；０．８ｍＭのＭｇＣｌ_２ ^．６Ｈ_２Ｏ；０．８ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ；および０．２ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４ ^．Ｈ_２Ｏで構成される。例えば、ある生理的塩類水溶液は、約１５０ｍＭのＮａ、約３ｍＭのＫ、約１．４ｍＭのＣａ、約０．８ｍＭのＭｇ、約１．０ｍＭのＰ、および約１５５ｍＭのＣｌを含む。一部の態様では、ｓＣＳＦは、２０～２５ｍＭの炭酸ナトリウムおよび／または０．２～１．５ｍＭのグルコースもしくはスクロースをさらに含む。一部の態様では、ｓＣＳＦは０．２～１．０ｍｇ／ｍＬのスクロースをさらに含む。一部の態様では、生理的塩類溶液は任意選択である。一部の態様では、生理的塩類溶液は、最大約（すなわち、±１０％以内）７５ｍＭのＮａＣｌを含む、最大約１５０ｍＭのＮａＣｌの濃度を有するＮａＣｌ溶液から本質的になる。

【0050】

生理的塩類水溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、生理的塩類水溶液の成分は市販もされている。例えば、一部の態様では、生理的塩類水溶液は、マサチューセッツ州ホリストン所在のＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓから市販されているＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦを含む。一部の態様では、生理的塩類水溶液は、Ｍ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｉｎｃ．から市販されている灌流液を含む。一部の独立した態様では、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工および／または灌流液は、本発明での使用から特に除外される。

【0051】

一部の態様では、ｓＣＳＦは緩衝化溶液であり得る。一態様では、緩衝液はＨＥＰＥＳを含む。一部の態様では、緩衝液は、約５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１ＭのＨＥＰＥＳ、またはそれらの濃度のいずれか２つの間の任意の値もしくは範囲を含む、１ｍＭのＨＥＰＥＳ～１ＭのＨＥＰＥＳの間を含む。

【0052】

ｓＣＳＦは、約８、約７．５、約５～８、約５．５～約７．５、約６～約７．５、約６～約７、約６．５、またはそれらのｐＨ値のいずれか２つの間の任意の値もしくは範囲未満であるｐＨを有し得る。

【0053】

一態様では、ｓＣＳＦは緩衝化溶液であり、緩衝液はＨＥＰＥＳを含み、ｐＨは約７．５である。

【0054】

ｓＣＳＦはまた、１種または複数の血漿タンパク質を含む。血漿タンパク質は、血漿中に通常見られるタンパク質である。ヒトＣＳＦは、はるかに低い濃度であるが、血漿中に見られるタンパク質の一部を含有する。ヒトＣＳＦは、およそ０．３％の血漿タンパク質またはおよそ１５～４０ｍｇ／ｄＬの総血漿タンパク質を含有する。したがって、一部の態様では、溶液中の様々な血漿タンパク質の合計量を表す総血漿タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を有する。

【0055】

血漿タンパク質の例としては、アルブミン（例えば、ＨＳＡおよびＢＳＡ）、フィブリノーゲン、アルブミン前駆体タンパク質（例えば、ＢＳＡ前駆体タンパク質）、トランスサイレチン、ガンマグロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＪ、ＡｐｏＤ等）、リポタンパク質（例えば、高密度または低密度リポタンパク質）、補体タンパク質、プロトロンビン、およびトランスフェリンが挙げられる。一部の態様では、血漿タンパク質は、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＢＳＡ前駆体タンパク質、トランスフェリン、および免疫グロブリンＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0056】

一部の態様では、血漿タンパク質は０．１～０．３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるか、またはから本質的になる。他の態様では、血漿タンパク質は、０．１～０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．０２～０．０６ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンからなるか、またはから本質的になる。さらなる態様では、血漿タンパク質は、０．４～０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０１～０．０３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ前駆体タンパク質、および０．００５～０．０２ｍｇ／ｍＬの免疫グロブリンＧからなるか、またはから本質的になり、ｓＣＳＦは０．２～１．０ｍｇ／ｍＬのスクロースも含む。

【0057】

一部の態様では、血漿タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１．５ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３．０ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約４．０ｍｇ／ｍＬ、約４．５ｍｇ／ｍＬ、約５．０ｍｇ／ｍＬ、約５．５ｍｇ／ｍＬ、約６．０ｍｇ／ｍＬ、約６．５ｍｇ／ｍＬ、約７．０ｍｇ／ｍＬ、約７．５ｍｇ／ｍＬ、約８．０ｍｇ／ｍＬ、約８．５ｍｇ／ｍＬ、約９．０ｍｇ／ｍＬ、約９．５ｍｇ／ｍＬ、約１０．０ｍｇ／ｍＬ、約１０．５ｍｇ／ｍＬ、約１１．０ｍｇ／ｍＬ、約１１．５ｍｇ／ｍＬ、約１２．０ｍｇ／ｍＬ、約１２．５ｍｇ／ｍＬ、約１３．０ｍｇ／ｍＬ、約１３．５ｍｇ／ｍＬ、約１４．０ｍｇ／ｍＬ、約１４．５ｍｇ／ｍＬ、約１５．０ｍｇ／ｍＬ、またはそれらの濃度のいずれか２つの間の任意の値もしくは範囲を含む、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＳＡからなるか、またはから本質的になる。

【0058】

一部の態様では、ｓＣＳＦは洗浄剤または界面活性剤を含む。一態様では、洗浄剤は、サルコシルとしても知られるラウロイルサルコシン酸ナトリウムである。一態様では、洗浄剤はドデシル硫酸ナトリウムである。一態様では、洗浄剤は、約０．１％のサルコシル、約０．２％のサルコシル、約０．３％のサルコシル、約０．４％のサルコシル、約０．５％のサルコシル、約０．６％のサルコシル、約０．７％のサルコシル、約０．８％のサルコシル、約０．９％のサルコシル、約１．０％のサルコシル、またはそれらの濃度のいずれか２つの間の任意の値もしくは範囲である。

【0059】

一態様では、特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，９８９，７１８号明細書に開示されているように、低速αＳ－ＳＡＡの対照溶液として作用する場合、ｓＣＳＦは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ、０．１５５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、および０．０４２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンから本質的になる。約０．１５５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡは、ヒトＣＳＦ中のＢＳＡの生理学的濃度（または「１Ｘ」）であると考えられる。約０．０４２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンは、ヒトＣＳＦ中のトランスフェリンの生理学的濃度の３倍（「３Ｘ」）であると考えられる。別の態様では、ｓＣＳＦは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦおよび０．２０１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（またはヒトＣＳＦ中のＢＳＡの生理学的濃度の「１．３Ｘ」）から本質的になる。

【0060】

一部の態様では、特に、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１１，０７９，３９６号明細書および米国仮特許出願第６３／３７５，１２６号に開示されているように、高速αＳ－ＳＡＡの対照溶液として作用する場合、ｓＣＳＦは、ＨＥＰＥＳ、ＨＳＡ、およびＮａＣｌ溶液（米国特許第１１，０７９，３９６号明細書および米国仮特許出願第６３／３７５，１２６号のこれらの態様では、アッセイがサルコシルを含む）から本質的になり得る。アッセイがサルコシルを含まない一態様では、ｓＣＳＦは、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ溶液、ＨＳＡ、およびサルコシルから本質的になる。一態様では、ｓＣＳＦは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、ＨＳＡ、および０．５％のサルコシルから本質的になる。

【0061】

一部の態様では、ｓＣＳＦは陽性対照の成分として使用される。陽性対照を使用して、αＳ凝集体が生体試料中に存在する場合に予想される結果（すなわち、陽性結果）をもたらすことができる。陽性対照は、内因性であろうと合成であろうと、シードをさらに含む。一部の態様では、ｓＣＳＦは陰性対照の成分である。陰性対照を使用して、αＳ凝集体が生体試料中に存在しない場合に予想される結果（すなわち、陰性結果）をもたらすことができる。陰性対照は、単量体αＳ基質およびプレインキュベーション混合物の全ての成分をさらに含む。さらなる態様では、ｓＣＳＦは、既知の量のシードを含む比較対照である。αＳ－ＳＡＡを使用して形成されたαＳ凝集体の量を決定するためのベンチマークとして、比較対照を使用することができる。さらなる態様では、ｓＣＳＦは、半定量的αＳ－ＳＡＡにおいて希釈剤として使用され得る。

【0062】

一態様では、ｓＣＳＦは、疾患特異的陽性対照として多系統萎縮症（「ＭＳＡ」）またはＰＤまたはレビー小体型認知症（「ＬＢＤ」）合成シードを含有し得、結果は、ヒト試料がＭＳＡ患者、ＰＤ患者、ＬＢＤ患者、またはこれらの病態の２つ以上を示す患者に由来するかどうかを比較および決定するために使用される。

【0063】

別の態様では、合成シードを使用して、ｓＣＳＦにおける較正曲線を作成することができる。そのような曲線の動態パラメータは、生体試料中の内因性シードの濃度を決定するのに役立ち得る。

【0064】

さらに別の態様では、ｓＣＳＦは、皮膚または嗅粘膜などの組織のＳＡＡにおいて希釈剤として使用され得る。ある特定の組織はＳＡＡを妨害し得る。組織中のシード濃度が高い場合、ｓＣＳＦを使用して組織の干渉面を希釈することができるが、検出可能な増幅を受けるのに十分なシードをＳＡＡ中に保持することができる。

【0065】

生体試料
「生体試料」は、ミスフォールドαＳ凝集体を検出するための分析に適した対象由来の任意の生体試料を含むことを意味する。適切な生体試料には、例えば、羊水、胆汁、血液、血漿、ＣＳＦ、耳垢、皮膚、滲出液、糞便、胃液、リンパ液、乳汁、粘液、粘膜、例えば嗅粘膜を含む鼻粘膜、腹水、胸水、膿、唾液、皮脂、精液、汗、滑液、涙、および尿から表される液体または液体が含まれ得る。体液が体から取り出され、適用可能であれば、本明細書に記載される方法およびキットで使用するために処理および／または調製されている場合、それは「生体試料」または単に「試料」と呼ばれる。試料、例えばＣＳＦ試料、皮膚試料、嗅粘膜試料、血液もしくは血漿試料、または唾液試料が特許請求の範囲において「用意される」と言及される場合、意図される意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、試料がＳＡＡの準備ができた処理および／または調製された形態で提供されることである。本明細書に記載される方法およびキットは、インビトロで実施および使用される。

【0066】

本明細書で使用される場合、「αＳ」は、完全長の１４０アミノ酸のアルファ－シヌクレインタンパク質、例えば「αＳ－１４０」を指し得る。他のアイソフォームまたはフラグメントには、例えば、エクソン３の喪失のために残基４１～５４を欠く「αＳ－１２６」、α－シヌクレイン－１２６；および例えば、エクソン５の喪失のために残基１０３～１３０を欠く「αＳ－１１２」、α－シヌクレイン－１１２が含まれ得る。

【0067】

一態様では、単量体αＳ基質は、１４０個のアミノ酸を有し、１４，４６０Ｄａの分子質量を有し、以下の配列によって表される野生型または組換えヒトαＳタンパク質を含むか、から本質的になるか、またはからなる：
配列番号１：

【数1】

【0068】

一部の態様では、単量体αＳ基質は、配列番号１の保存的バリアントを含むか、から本質的になるか、またはからなる。保存的バリアントは、類似の生化学的特性を有し、αＳ－ＳＡＡにおいて得られたタンパク質の活性に対して最小のまたは有益な影響を有するアミノ酸への１つまたはいくつかのアミノ酸の置換においてのみ配列番号１から逸脱するペプチドまたはアミノ酸配列であり得る。保存的バリアントは、基本成分、すなわち配列番号１と実質的に同様に機能的に働かなければならない。例えば、配列番号１の保存的バリアントは、ミスフォールドαＳタンパク質と凝集し、同様の反応条件下で実質的に同様の反応速度論で凝集体を形成する。保存的バリアントは、例えば、アミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７（５％）および最大１４個（１０％）の置換を有し得る。

【0069】

一部の態様では、単量体αＳ基質は、１５，２８３Ｄａの分子質量をもたらし、以下の配列によって表される、配列番号１のＣ末端に６個の追加のヒスチジンアミノ酸（すなわち、ポリＨｉｓ精製タグ）を含む組換えαＳタンパク質を含む：
配列番号２：

【数2】

【0070】

一部の態様では、単量体αＳ基質は、米国特許第１１，０７９，３９６号明細書に開示される単量体αＳ基質およびその保存的バリアントのいずれかであり得る。一部の態様では、単量体αＳ基質またはその保存的バリアントは、配列番号１からなる単量体αＳ基質を特に除外する。

【0071】

一部の態様では、単量体αＳ基質は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈａｈｎａｗａｚ，Ｍ．らＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７４、１６３～１７２（２０１７）に記載されるように発現および調製され得る。

【0072】

一部の態様では、単量体αＳ基質は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１１，２５４，７１８号明細書に記載されるように発現および調製され得る。

【0073】

一部の態様では、本方法は、標識化形態の単量体αＳ基質を用意することを含み得る。標識された単量体αＳ基質は、保存的バリアントとみなされ得る。標識化形態の第１の単量体αＳ基質は、共有結合的に組み込まれた放射性アミノ酸、共有結合的に組み込まれた、同位体標識されたアミノ酸、共有結合的に組み込まれたフルオロフォアなどのうちの１つまたは複数を含み得る。したがって、ミスフォールドαＳ凝集体の検出は、ミスフォールドαＳ凝集体の増幅部分に組み込まれる標識化形態の単量体αＳ基質を検出することを含み得る。

【0074】

プレインキュベーション混合物は、インキュベーションサイクルを行う前のプレインキュベーション混合物の総体積の関数として、様々な濃度の単量体αＳ基質を含み得る。一部の態様では、プレインキュベーション混合物は、約５００ｎＭ～約５００μＭの間；約１μＭ～約２００μＭの間；約５μＭ～約１００μＭの間；約１０μＭ～約５０μＭの間；約５０μＭ～約７５μＭの間；約６５μＭ（すなわち、約１ｍｇ／ｍｌ）；６５μＭ；約１０μＭ～約３０μＭの間；１０μＭ超３０μＭ未満；約２０μＭ；約１９．６μＭ（すなわち、約０．３ｍｇ／ｍｌ）；または１９．６μＭの濃度または濃度範囲の単量体αＳ基質を含み得る。一態様では、プレインキュベーション混合物は、インキュベーションサイクルを行う前のプレインキュベーション混合物の総体積の関数として、約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度の単量体αＳ基質を含む。

【0075】

緩衝組成物
プレインキュベーション混合物は、様々な緩衝組成物を含み得る。緩衝組成物は、反応混合物のｐＨを約ｐＨ５～約ｐＨ９、約ｐＨ６～約ｐＨ８、約ｐＨ６～約ｐＨ７、約ｐＨ７～約ｐＨ８、約ｐＨ７、約ｐＨ７．４、約ｐＨ６．２～約ｐＨ６．５（ｐＨ６．３、６．４および６．５を含む）の範囲に維持するのに有効であり得る。一態様では、緩衝組成物は、反応混合物のｐＨを約６．５に維持するのに有効であり得る。一部の態様では、プレインキュベーション混合物は、緩衝液トリス－ＨＣＬ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳのうちの１つまたは複数を含む。一部の態様では、緩衝液は、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、または約７００ｍＭの濃度のＰＩＰＥＳを含む。一態様では、緩衝液は約１００ｍＭの濃度のＰＩＰＥＳを含む。

【0076】

塩溶液
一部の態様では、プレインキュベーション混合物は、所与の濃度の塩を含む。塩は、例えば、蛍光検出におけるシグナル対ノイズ比を増強し得る。一態様では、塩はＮａＣｌを含む。他の適切な塩としては、ＫＣｌが挙げられ得る。一態様では、塩、例えばＮａＣｌは、約５０ｍＭ～約１，０００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０～約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、または約７００ｍＭの濃度でプレインキュベーション混合物中に存在し得る。一態様では、塩、例えばＮａＣｌは、約５００ｍＭの濃度で存在する。

【0077】

指示薬
一部の態様では、プレインキュベーション混合物は、検出可能な量のミスフォールドαＳ凝集体が反応混合物中に存在するかどうかを決定するための指示薬を含む。指示薬は、検出可能な量のミスフォールドαＳ凝集体の存在下では指示状態を示し、検出可能な量のミスフォールドαＳ凝集体の非存在下では非指示状態を示すことを特徴とすることができる。生体試料中のミスフォールドαＳ凝集体の存在を決定することは、ミスフォールドαＳ凝集体の指示薬の指示状態を検出することを含み得る。指示薬の指示状態と指示薬の非指示状態は、蛍光の違いを特徴とし得る。よって、生体試料中のミスフォールドαＳ凝集体の存在を決定するステップは、蛍光の違いを検出することを含み得る。一部の態様では、モル過剰の指示薬を使用してもよく、モル過剰は、例えば、反応混合物中の単量体αＳ基質およびミスフォールドαＳ凝集体の総モル量よりも多い。

【0078】

一部の態様では、指示薬はフルオロフォアを含む。一部の態様では、指示薬は、チオフラビン－Ｔ（ＴｈＴ）、コンゴレッド、ｍ－Ｉ－スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ－２２７、Ｘ－３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ－４、発光共役ポリチオフェン、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質との融合体、それらの誘導体などのうちの１つまたは複数を含み得る。適切な指示薬はＴｈＴである。指示薬がＴｈＴを含む一態様では、プレインキュベーション混合物中のＴｈＴ濃度は約５μＭ～約１０μＭの間である。指示薬がＴｈＴを含む一態様では、プレインキュベーション混合物中のＴｈＴ濃度は１０μＭである。

【0079】

サルコシル
一部の態様では、プレインキュベーション混合物はサルコシルを含む。一部の態様では、サルコシルは、０．０１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖの濃度で存在する。一部の態様では、サルコシルは、０．０５％ｗ／ｖ～約０．２％ｗ／ｖの濃度で存在する。一部の態様では、サルコシルは、約０．１％ｗ／ｖの濃度で存在する。

【0080】

インキュベーション条件
反応混合物は、複数のウェルを有するマルチウェルプレートなどの適切なサイズの容器内に保持され得る。例えば、マルチウェルプレートは、９６個のウェルを含み得る。マルチウェルプレートのウェルは、１００μＬ～１０００μＬ、１５０μＬ～７５０μＬ、または２００μＬ～３５０μＬの体積を有し得る。一部の態様では、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルは、１つまたは複数のビーズを含有する。

【0081】

各インキュベーションサイクルにおける反応混合物の温度は、温度（℃）で、独立して、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または前述の値のいずれか２つの間の範囲、例えば、約１５℃～約５０℃の間、または約２５℃～約４５℃の間、または約３０℃～約４２℃の間であり得る。一部の態様では、インキュベーションは、温血動物についてのほぼ正常な生理学的温度で行われる。さらなる態様では、反応混合物のインキュベーションは、約３５℃～約４５℃の間または約３７℃～約４２℃の間の温度で行われる。一態様では、本方法は、反応混合物を約４２℃の温度でインキュベートすることを含む。

【0082】

いくつかの態様では、インキュベーション混合物を脱凝集させることは、インキュベーション混合物を振盪、超音波処理、撹拌、凍結／解凍、レーザー照射、オートクレーブインキュベーション、高圧、均質化などの物理的破壊に供することを含み得る。振盪は、軌道撹拌などの周期的撹拌を含み得る。周期的撹拌は、約５０回転毎分（ＲＰＭ）～１０，０００ＲＰＭの間で行われ得る。周期的撹拌は、約２００ＲＰＭ～約２０００ＲＰＭの間で行われ得る。周期的撹拌は、約５００ＲＰＭまたは約６００～８００ＲＰＭで行われ得る。一態様では、振盪は、約８００ＲＰＭでの軌道撹拌を含む。インキュベーション混合物の脱凝集は、約５秒～約１０分の間、約３０秒～約１分の間、約４５秒～約１分の間、約１分間など、各インキュベーションサイクル後に行われ得る。

【0083】

反応混合物をインキュベートするステップおよび脱凝集させるステップを必要に応じて繰り返して、生体試料のミスフォールドαＳ凝集体を増幅して、検出可能な量のミスフォールドα－Ｓ凝集体を得る。反応混合物をインキュベートすることおよび反応混合物を脱凝集させることは、インキュベーションサイクルを構成する。インキュベーションサイクルは、１回～約１０００回の間、２回～約５００回の間、約５０回～約５００回の間、約１５０回～約２５０回の間など繰り返され得る。一態様では、インキュベーションサイクルの最終ラウンドについて、検出ステップを実施する前の脱凝集ステップを省略することが有利であり得る。

【0084】

インキュベーションサイクルは、約１分～約５時間の間、約１０分～約２時間の間、約１５分～約１時間の間、約２５分～約４５分の間などの時間行われ得る。一部の態様では、反応混合物をインキュベートすることおよびミスフォールドαＳ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させることは、約０．１～１時間続くインキュベーションサイクルを含む。各インキュベーションサイクルは、約１分間～約５時間の間のインキュベーションと約５秒間～約１０分間の間の脱凝集；約１０分間～約２時間の間のインキュベーションと約３０秒間～約１分間の間の脱凝集；約１４分間～約１時間の間のインキュベーションと約４５秒間～約１分間の間の脱凝集；約２５分間～約４５分間の間のインキュベーションと約４５秒間～約１分間の間の脱凝集；および約１分間のインキュベーションと約１分間の脱凝集のうちの１つまたは複数で、反応混合物を独立にインキュベートすることおよび脱凝集させることを含み得る。一態様では、各インキュベーションサイクルは、約１４分間のインキュベーションと約１分間の脱凝集を含む。

【0085】

ビーズ
一部の態様では、プレインキュベーション混合物は、１つまたは複数のビーズを含み得る。ビーズは、ベアリングビーズとして一般的に使用される低摩擦表面を有する高密度ビーズなどの小型の、典型的には球形の物体である。反応混合物中にビーズを含めると、単量体αＳ基質および生体試料の可溶性ミスフォールドαＳタンパク質からのミスフォールドαＳ凝集体の形成速度が増加する。これらのビーズは、本明細書の他の箇所に記載される濃縮および／または免疫枯渇ステップで使用される抗体コーティング磁性もしくは常磁性ビーズまたは粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）とは組成および機能が異なる。

【0086】

ビーズは、様々な化学的に不活性な材料から構成され得る。例えば、一部の態様では、ビーズは、シリカ、ガラス、ホウケイ酸ガラス、またはＳｉ_３Ｎ_４から構成される。

【0087】

一部の態様では、ビーズは、Ｓｉ_３Ｎ_４を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の態様では、ビーズは、ホウケイ酸ガラスを含むか、から本質的になるか、またはからなる。一態様では、ジルコニウム／シリカビーズは除外される。一態様では、ホウケイ酸ガラスビーズ以外のガラスビーズは除外される。

【0088】

一部の態様では、インキュベーション混合物に含まれるビーズは、０．５ｍｍ超の平均直径を有し得る。一部の態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約１０ｍｍの平均直径を有する。一部の態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。一部の態様では、ビーズは約１．０～約１０ｍｍの平均直径を有するが、追加の態様では、ビーズは約１．０ｍｍ～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、１．０ｍｍ超～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。一部の態様では、ビーズは２．３８ｍｍ～約１０ｍｍの平均直径を有するが、追加の態様では、ビーズは２．３８ｍｍ～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、約２．３ｍｍ以上～約３．５ｍｍ、約２．３８～約３．５ｍｍ、または約２．４５ｍｍ～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、約２．４５ｍｍ、または約３．１７５ｍｍの平均直径を有し得る。一部の態様では、ビーズは、Ｓｉ_３Ｎ_４を含むか、から本質的になるか、またはからなり、２．３８ｍｍの平均直径を有し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングされている。一部の態様では、ビーズは、Ｓｉ_３Ｎ_４を含むか、から本質的になるか、またはからなり、３．１７５ｍｍの平均直径を有し、ブロッキングされていない。一部の態様では、ビーズは、ホウケイ酸ガラスを含むか、から本質的になるか、またはからなり、２．４５ｍｍの平均直径を有し、ブロッキングされていない。一部の態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するビーズは本発明から除外される。一部の態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するガラスビーズは本発明から除外される。一部の態様では、３ｍｍ以下の平均直径を有するビーズは本発明から除外される。ビーズの径分布は、ビーズの９０％超が平均ビーズ直径の８０～１２０％の間または平均ビーズ直径の９０～１１０％の間で見られるように定義される。

【0089】

プレインキュベーション混合物に含まれるビーズの数は変化し得る。一部の態様では、プレインキュベーション混合物は１つのビーズからなる。一部の態様では、プレインキュベーション混合物は２つのビーズからなる。一部の態様では、プレインキュベーション混合物は複数のビーズを含む。一態様では、プレインキュベーション混合物は、２つのブロッキングされていない１／８インチ（３．１７５ｍｍ）のＳｉ_３Ｎ_４ビーズからなる。

【0090】

一部の態様では、１つまたは複数のビーズの表面はタンパク質で「ブロッキングされている」。ビーズの表面をタンパク質でブロッキングすることは、ビーズの表面の全部またはかなりの部分の上にコーティングまたは層を提供することを指す。任意の適切な生体適合性タンパク質を使用して、ビーズの表面をコーティングすることができる。ビーズの表面のブロッキングに使用するのに適したタンパク質は、ＢＳＡなどのアルブミンである。他の適切なブロッキングタンパク質としては、カゼインまたは粉乳が挙げられ得る。１つまたは複数のビーズは、１つまたは複数のビーズを、タンパク質を含む溶液に浸漬することによってブロッキングされ得る。溶液は、ＰＩＰＥＳ、トリス－ＨＣｌ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳなどの水溶液および／または緩衝化溶液であり得る。

【0091】

インキュベーション混合物は、試験管などの適切なサイズの容器内に保持される。適切な滅菌インキュベーション容器は当業者に公知である。一部の態様では、インキュベーション混合物は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートに含有される。例えば、マルチウェルプレートは、９６個のウェルを含むことができる。一態様では、例えばビーズがＳｉ_３Ｎ_４ビーズである場合、容器は黒色底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１６）であり得る。一態様では、例えばビーズがＳｉ_３Ｎ_４ビーズである場合、容器は底部読み取りＧｒｅｉｎｅｒ ＣＢＰプレートであり得る。一態様では、例えばビーズがホウケイ酸ガラスビーズである場合、容器は透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６０３）であり得る。

【0092】

検出
検出は、反応混合物をインキュベートするステップおよび脱凝集させるステップを必要に応じて繰り返して、生体試料中に存在する十分なミスフォールドαＳ凝集体を増幅して、検出可能な量のミスフォールドαＳ凝集体を有する増幅されたインキュベーション混合物を得ることを含む。インキュベーション混合物を指示薬と接触させ、増幅された反応混合物の蛍光レベルを決定することができる。

【0093】

適切な指示薬は、ベーシックイエロー１としても知られているＴｈＴである。アミロイド原線維のクロスβシート四次構造などのβシートに富む沈着物を含有する試料にＴｈＴを添加すると、ＴｈＴはそれぞれ約４３５ｎｍ（または蛍光光度計もしくは分光蛍光光度計に応じて約４４０ｎｍ）および約４８５ｎｍ（または蛍光光度計もしくは分光蛍光光度計に応じて約４９０ｎｍ）で励起および発光極大を有して強く蛍光を発する。

【0094】

ＴｈＴ蛍光は、典型的には、フィルター蛍光光度計または分光蛍光光度計を使用する蛍光分光法によって測定される。一部の態様では、ＴｈＴ蛍光発光強度は、生体試料中のミスフォールドαＳ凝集体の量を定量化するために分析を行う場合に、対応する対照試料のレベルと比較され得る。ＴｈＴ蛍光レベルが決定されると、それは様々な方法で表示され得る。例えば、レベルは、数値、比例バー（すなわち、棒グラフ）、または当業者に公知の任意の他の表示方法としてディスプレイ上にグラフィック表示され得る。

【0095】

蛍光レベルの上昇は、生体試料中のαＳ凝集体の存在を示す。一部の態様では、蛍光レベルの有意な上昇は、生体試料中のαＳ凝集体の存在を示す。一部の態様では、「有意な上昇」は、遅滞期の間の任意の時点でのインキュベートされた混合物の蛍光レベルと比較した、最大蛍光でのインキュベートされた混合物の蛍光の標準偏差の少なくとも２倍の最大蛍光でのインキュベートされた混合物の蛍光レベルの上昇であり、生体試料中のαＳ凝集体の存在を示す。

【0096】

神経障害およびシヌクレイノパチー
αＳ凝集は、タンパク質ミスフォールディング障害（ＰＭＤ）、例えばＰＤ、ＬＢＤおよびＭＳＡに関連し得る。しかしながら、既存の技術では、この凝集現象がこれらの疾患の原因であるかどうかは明らかではない；これらのミスフォールドαＳ凝集体が、数ある他の影響の中でも、細胞機能障害および組織損傷を引き起こし得ると推測されるにすぎない。すなわち、本明細書に記載される方法およびキットは、個体がミスフォールドαＳ凝集体を有するかどうかに基づいて、個体がある特定の疾患を有するかどうかを直接決定するものではない。

【0097】

試料中にミスフォールドαＳ凝集体が存在するかどうかを決定するために本明細書に記載される方法およびキットによって得られる情報は、中間的な結果または一種の参照情報にすぎず、その結果に基づいて個体がある特定の疾患を有するという結論を直接導き出すことはできない。したがって、少なくとも１つの態様において、本出願において特許請求されるものは、疾患を診断する方法ではない。

【0098】

別の態様では、神経障害を有する対象におけるＰＤ、ＬＢＤ、ＭＳＡ、またはそれぞれの態様のスペクトルの診断を補助する方法が提供される。神経障害は、神経系の任意の障害である。神経障害の例としては、ＰＤなどの運動障害、ＭＳＡなどの自律神経系疾患、およびＬＢＤなどの精神神経疾患が挙げられる。

【0099】

一部の態様では、神経障害はシヌクレイノパチーである。シヌクレイノパチーは、ニューロン、神経線維、およびグリア細胞などの神経系の細胞におけるαＳの凝集体の異常な蓄積を特徴とする神経変性疾患である。一部の態様では、シヌクレイノパチーは、例えば認知障害、睡眠障害および胃腸管機能障害を含む、ＰＤ、ＬＢＤまたはＭＳＡに関連する症状を有する。

【0100】

一部の態様では、試料は、ＰＤ、ＬＢＤ、またはＭＳＡの臨床徴候を示さない対象から採取され得る。他の態様では、生体試料は、ＰＤ、ＭＳＡ、ＬＢＤ、またはそれらの任意の組み合わせの臨床徴候を示す対象から採取され得る。ＰＤの最も認識可能な症状は、運動関連機能障害である。

【0101】

一部の態様では、本方法は、ＰＤを有すると診断された対象を、ＰＤおよび／またはその症状のための処置で処置することを含む。脳深部刺激療法を使用して、ＰＤに関連する運動症状を軽減することができる。ＰＤの運動症状の処置に有用な薬物には、レボドパ、ドーパミンアゴニストおよびモノアミンオキシダーゼＢ阻害剤が含まれる。しかしながら、ＰＤのためのさらなる処置が開発され続けている。Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ＤＭ、Ｇｏｙａｌ Ｖ、Ｎｅｕｒｏｌ Ｉｎｄｉａ．、６６（補遺）：Ｓ２６～Ｓ３５（２０１８）およびＩａｒｋｏｖら、Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２：４（２０２０）を参照されたい。

【0102】

補足的診断試験
一部の態様では、本方法は、αＳ－ＳＡＡに基づく指示を確認するため、例えば、ＰＤを有するとαＳ－ＳＡＡによって示される患者由来のミスフォールドαＳ凝集体と、ＭＳＡまたはＬＢＤを有するとαＳ－ＳＡＡによって示される患者由来のミスフォールドαＳ凝集体をさらに区別するための追加の試験をさらに含み得る。追加の試験の例としては、ＰＤまたはＭＳＡまたはＬＢＤのミスフォールドαＳ凝集体の１つに対して高い親和性を有するリガンドの使用、ミスフォールドαＳ凝集体からのプロテアーゼ耐性フラグメントのプロファイルの作成、およびＣＤ、ＦＴＩＲまたはｃｒｙｏ－ＥＴを使用した検出されたミスフォールドαＳ凝集体の構造の評価が挙げられる。

【0103】

キット
別の態様は、生体試料中のミスフォールドαＳ凝集体の存在を検出するためのキットを提供する。キットは、既知量の単量体αＳ基質と；既知量の指示薬と；緩衝組成物と；場合により、約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、約２．４５ｍｍ、または約３．１７５ｍｍの平均直径を有する１つまたは複数のビーズと；場合によりサルコシルとを含む。キットはまた、本明細書中に記載されるｓＣＳＦを含む。キットは、本明細書に記載されるミスフォールドαＳ凝集体を検出する方法を行うように使用者に指示する説明書、ならびに単量体αＳ基質およびαＳ－ＳＡＡ緩衝液の適格性を試験するため、周辺マトリックス由来の生体試料を希釈するため、および半定量的αＳ－ＳＡＡのために生体試料を段階希釈するための説明書を含み得る。キットはまた、キットの成分を保持するためのパッケージを含むべきである。

【0104】

キットは、一般的に、試薬を保持する１つまたは複数の容器を有するパッケージを、１つまたは複数の別個の組成物として、または場合により、試薬の適合性が許す場合には混和物として含む。キットは、緩衝液、標識剤、対照、およびミスフォールドαＳ凝集体の検出を行うために必要な任意の他の材料をさらに含み得る。キットはまた、スワブまたは他の体液収集装置などの、対象から試料を得るためのツールを含むことができる。

【0105】

キットはまた、キットを使用して、対象におけるシヌクレイノパチーの処置を導く方法を行うための説明書を含み得る。キットに含まれる説明書は、パッケージング材料に添付することができるか、または添付文書として含めることができる。説明書は、典型的には、書面または印刷物であるが、これらに限定されない。このような説明書を格納し、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、それだけに限らないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれる。本明細書で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。

【0106】

キットは、以下のうちの１つまたは複数を含み得る：１つもしくは複数の個々のプレートもしくは装置として、または組み合わせ装置として含まれる、ビーズ分配装置；複数のウェルを含むマルチウェルプレート；マイクロ流体プレート；振盪装置；インキュベート装置；および蛍光測定装置。例えば、振盪マイクロプレートリーダーを使用して、インキュベーションと振盪のサイクルを実施し、実験中にＴｈＴ蛍光発光を自動的に測定することができる（例えば、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、Ｎ．Ｃ．またはＢｕｅｈｌｅｒ Ｓｈａｋｅｒ ＴＩＭＩＸ ５振盪機）。

【0107】

例
本発明を以下の例によって説明する。しかしながら、特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に示される本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきである。

【0108】

例１：「低速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陰性対照として使用されるｓＣＳＦ
対照溶液を「低速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件下で陰性対照として使用した。「低速アッセイ」αＳ－ＳＡＡの一般的な条件は、米国特許第１０，９８９，７１８号明細書に記載されている。本明細書の結果を得るために使用される具体的なαＳ－ＳＡＡ条件は以下の通りである：

【0109】

陰性対照については、インキュベーション混合物を９６ウェルプレートに用意し、インキュベーション混合物は、総体積２００μＬのために、（１）１ｍｇ／ｍｌの配列番号２によって表されるシードなしαＳ基質；（２）ｐＨ６．５の１００ｍＭ ＰＩＰＥＳを含む緩衝組成物；（３）５００ｍＭ ＮａＣｌを含む塩溶液；（４）１０μＭのＴｈＴを含む指示薬；および（５）４０μＬの対照溶液を含んでいた。

【0110】

インキュベーションサイクルをインキュベーション混合物に対して実施し、各インキュベーションサイクルは、（１）第１のインキュベーション混合物を２９分間インキュベートすること；および（ｂ）Ｏｍｅｇａ ＦＬＵＯｓｔａｒを使用して３７℃の一定温度で合計３００時間、７００ｒｐｍで１分間、インキュベーション混合物を軌道振盪して、インキュベーションされた対照溶液を形成することを含んでいた。４４０ｎｍで励起後、４９０ｎｍで３０分毎にプレートにおいてＴｈＴ蛍光を測定した。

【0111】

４つの異なる対照溶液を使用した：
１．条件 「１Ｂ３Ｔ」：Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．１５５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（１Ｘ）＋０．０４２ｍｇ／ｍＬトランスフェリン（３Ｘ）
２．条件 「１．３Ｂ」：Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．２０１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（１．３Ｘ）
３．条件 「３Ｂ１ＩｇＧ」：Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ＋０．４６５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（３Ｘ）＋０．０１２ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧ（１Ｘ）
４．条件 「Ｈ」：Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ人工ＣＳＦ

【0112】

試験した基質の全てが配列番号２に対応することを意図していたが、基質は異なる時間に、いくつかは異なる発現および／または精製条件によって調製された。

【0113】

結果を表１に示し、「Ｎｅｇ／総Ｎｅｇ対照」は、試行の総数と比較して、基質自己凝集を示さなかった試行の数を意味する。「Ｐｏｓ／総Ｎｅｇ対照」は、試行の総数と比較して、基質自己凝集を示した試行の数を意味する。

【表1】

【0114】

図３は、陰性対照溶液として１Ｂ３Ｔを使用したＡＭＰ－１３の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度（ｋＲＦＵ）のグラフを示す。

【0115】

図４は、陰性対照溶液として１Ｂ３Ｔを使用したＡＭＰ－１４の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度（ｋＲＦＵ）のグラフを示す。

【0116】

図５は、陰性対照溶液として１．３Ｂを使用したＡＭＰ－６の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度（ｋＲＦＵ）のグラフを示す。

【0117】

例２：「低速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陽性対照として使用されるｓＣＳＦ
対照溶液を「低速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陽性対照として使用した。陽性対照については、インキュベーション混合物は、配列番号１によって表される野生型ヒト組換えタンパク質を含む２０ｆｇの合成αＳ凝集体（Ａｂｃａｍから購入）をさらに含んでいた。

【0118】

結果を表２に示し、「Ｐｏｓ／総Ｐｏｓ対照」は、試行の総数と比較して、シードとの基質の凝集を示す試行の数を意味する。「Ｎｅｇ／総Ｐｏｓ対照」は、試行の総数と比較して、シードとの基質の凝集を示さなかった試行の数を意味する。

【表2】

【0119】

図６は、陽性対照溶液としての１Ｂ３Ｔ中２０ｆｇのシードの存在下でＡＭＰ－１３についての低速αＳ－ＳＡＡの経時的な蛍光強度（ｋＲＦＵ）のグラフを示す。

【0120】

図７は、陽性対照溶液としての１．３Ｂ中２０ｆｇのシードの存在下でＡＭＰ－６の低速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度（ｋＲＦＵ）のグラフを示す。

【0121】

例３：「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陰性対照として使用されるｓＣＳＦ
ｓＣＳＦを「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件下で陰性対照として使用した。「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡの一般的な条件は、米国特許第１１，０７９，３９６号明細書に記載されている。具体的には、αＳ－ＳＡＡを、０．３ｍｇ／ｍｌの配列番号２によって表されるシードなしαＳ（これは、米国特許第１１，２５４，７１８号明細書に開示されているプロトコルに従って適切に調製されている）を使用して、２．３８ｍｍの窒化ケイ素ビーズの存在下、８００ｒｐｍで軌道振盪して行った。

【0122】

図８は、陰性対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡおよび０．５％サルコシルを使用したαＳ基質の高速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度の代表的なグラフを示す。図８では、αＳ基質の自己凝集は観察されない。９６個のウェルのうち、３個（３．１％）のみが自己凝集を示した。比較実験では、対照溶液として健康なヒトＣＳＦを使用した自己凝集を有するウェルの割合が５％の自己凝集を生じた。

【0123】

例４：「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件を使用する基質のスクリーニングに使用するためのｓＣＳＦ
ｓＣＳＦを（本質的に陰性対照として）使用して、「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件下で基質をスクリーニングした。この実験では、αＳ基質は、米国特許第１１，２５４，７１８号明細書の教示から逸脱した方法で精製された。図９は、対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡおよび０．５％サルコシルを使用した不適格なαＳ基質の高速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す。図９に示されるように、αＳ基質は自己凝集を示した。

【0124】

例５：「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陽性対照として使用されるｓＣＳＦ
ｓＣＳＦを「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中に陽性対照として使用した。陽性対照については、インキュベーション混合物は、配列番号１によって表される野生型ヒト組換えタンパク質を含む２０ｆｇの合成αＳ凝集体（Ａｂｃａｍから購入）をさらに含んでいた。

【0125】

図１０は、陽性対照溶液として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡおよび０．５％サルコシルを使用した２０ｆｇのシードの存在下でのαＳ基質の高速αＳ－ＳＡＡについての経時的な蛍光強度のグラフを示す。図１０は、予想される凝集を示す。実際、ウェルの１００％が予想される凝集を示した。

【0126】

例６：希釈剤として使用されるＨＣ由来のＣＳＦ
段階希釈を使用して、αＳ－ＳＡＡ反応の５０％が陽性である希釈（ＳＤ_５０）を推定することによってαＳの相対量を決定した。この推定は純粋に陽性ウェルの数に依存するため、特定のＣＳＦマトリックスによる動態変化は関連しない。ＰＤおよびＤＬＢ患者由来のＣＳＦの希釈の増加を評価すると、技術的反復の陽性は減少する。しかしながら、異なるＨＣドナー由来のＣＳＦを使用して希釈する場合、陽性ウェルの数は変化し得る。言い換えると、異なる患者由来のＣＳＦは、凝集に対して異なる効果を有する。この可変効果は、緩衝液にスパイクした場合に非常に再現性よく凝集するｒｅｃ－シード（ｒｅｃ－ｓｅｅｄ）で実証可能である。しかしながら、異なる患者由来のＣＳＦにスパイクした場合、ＣＳＦ試料に基づいて凝集が変化する。図１１を参照されたい。実験を繰り返した場合、ｒｅｃ－シードに対する各ＣＳＦの効果は再現可能であった。したがって、使用されるＨＣ－ＣＳＦに応じて力価が変化するため、段階希釈のための希釈剤としてＨＣ－ＣＳＦを使用することはできない。段階希釈に基づく再現性のある滴定のためには、本明細書に記載されるｓＣＳＦが必要である。

【0127】

例７：半定量的αＳ－ＳＡＡの希釈剤として使用されるｓＣＳＦ
段階希釈は、シードを含有する一定体積のＣＳＦ試料を、シードを含有しない別の溶液（例えば、ｓＣＳＦ）と混合することを指す。段階希釈は、混合試料中のシードの濃度を低下させる。αＳ－ＳＡＡのために混合物のアリコートを取る。混合試料を再び希釈して、さらに低濃度のシードを含むより高い希釈を得る。この手順は、最高の所望の希釈、すなわち最低濃度のシードを有する希釈に達するまで繰り返される。ここでは、１：８１までの１：３段階希釈（各希釈が６６．６％希釈を含有することを意味する）を実施した。このように試料を分析することにより、より多くのシードを含有する試料が、より低い濃度のシードを含む試料よりも高い希釈でシーディング活性を示すので、相対的なシード数を決定することができる。

【0128】

この手順が実用的であるためには、希釈剤が豊富でなければならない。この比較が意味のあるものであるためには、全ての試料を同じ希釈剤で希釈しなければならない。したがって、健康な対照ヒトＣＳＦは、入手しやすさの点と異なる患者由来の異なるＣＳＦ試料にわたる様々なタンパク質および他の生物学的プロファイルの点の両方で実行可能ではない。本明細書に記載されるｓＣＳＦは、αＳ－ＳＡＡのための段階希釈の商業的かつ大規模な使用を可能にする。

【0129】

図１２は、段階希釈レベルでの「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件中の経時的な蛍光強度の一連のグラフを示す。図１２は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ、および０．５％サルコシルから本質的になるｓＣＳＦが、正常圧水頭症（「ＮＰＨ」）患者由来のＣＳＦを使用して得られた結果を再現し、ＨＣ由来のＣＳＦを使用した場合に結果が変化したことを実証している。このアッセイでは、陰性ＮＰＨとＨＣの両方が陰性である。これは、半定量化を可能にするための安定かつ再現性のあるマトリックスの必要性を強調する。ウェルの５０％が陽性であるために必要な希釈である「ＳＤ５０」を計算し、シードの量を推定することができる。しかしながら、標準偏差でシードの数を推定することは可能であるが、「シード」の定義は明確ではない。したがって、この方法は、ミスフォールドαＳの定量化ではなく、試料間のシーディング活性を比較するための半定量的代替物を提供する。さらに、ｓＣＳＦは、ＨＣ－ＣＳＦほど増幅を阻害せず、これにより、より大きな枠を試料間で区別することが可能になる。

【0130】

図１３は、希釈剤として１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、および１．５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡを使用した段階希釈レベルでのＰＤ陽性試料の代替「高速アッセイ」αＳ－ＳＡＡ条件（具体的には、アッセイ自体が、米国特許第１１，０７９，３９６号明細書に記載されるように、サルコシルを含む）中の経時的な蛍光強度の一連のグラフを示す。各グラフの下の３つの円は、希釈毎に分析された３つの反復を表す。灰色の円は検出可能なシード増幅を示した反復を表し、白色の円は、検出可能なシード増幅がないことを示した反復を表す。この表記法は、図１４にも使用されている。

【0131】

図１４をさらに参照すると、高速アッセイ条件で強い（２６０３）および弱い（２９７８）増幅パターンを示した２つのＣＳＦ試料を、３つの基質および高速アッセイの２つのバージョンを使用してＮＰＨ－ＣＳＦおよびｓＣＳＦに３倍段階希釈した。ＳＤ_５０を、Ｓｐｅａｒｍｅｎ－Ｋａｒｂｅｒモデルを使用して各試料について計算した。ＡＭＰ－Ａを使用すると、２６０３のシードの推定数が２９７８のシードの推定数よりも多かったため（６７．５＞１０．８）、これらの２つのＣＳＦ試料間でシーディング活性に実質的な差があった。ＡＭＰ５０でも同様のパターンが観察された。ＳＤ_５０の推定は、通常、数桁の変動を示すため、図１４に示される結果は非常に再現性がある。同じＡＭＰ５０基質を使用すると、ｓＣＳＦへの希釈はＮＰＨ－ＣＳＦへの希釈と顕著に類似していた。代替高速アッセイバージョンは、検出の下限（より高い分析感度）を示しており、これは、２６０３および２９７８のＣＳＦ試料のより高い希釈が陽性反復を示したので、ここでも観察される。全体として、図１４に示される全ての条件は、２９７８の場合よりも２６０３の場合の方がより多いシード数を推定することができた。（Ｎ／Ｔ：試験せず。ＳＥ：標準誤差。）

【0132】

例８：半Ｑ αＳ－ＳＡＡ－動態正規化
ｒｅｃ－シードのＴ_５０は、再現性のある方法でＣＳＦドナーに応じて変化し（図１１）、阻害性またはアミロイド形成性ＣＳＦ成分を明らかにする。したがって、３つのＰＤ－ＣＳＦ試料をニートでおよびスパイクしたｒｅｃ－シードを用いて分析した。正規化シーディング係数（φ）を計算し、Ｈ＆Ｙスコアとの関連性を評価した。際立ったことに、φはＨ＆Ｙスコアと強く関連していた。図１５を参照されたい。統一パーキンソン病評価スケール（ＵＰＤＲＳ）、パーキンソン病－自律神経機能不全における転帰のスケール（ＳＣａｌｅｓ ｆｏｒ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ＰＡｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ－Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＳＣＯＰＡ－ＡＵＴ）、モントリオール認知機能評価（ＭｏＣＡ）試験、およびドーパミントランスポーター特異的結合比（ＤａＴｓｃａｎ ＳＢＲ）などを含む、試料のより大きなコホートおよび追加の臨床パラメータの分析を評価しなければならない。

【0133】

例９：嗅粘膜中のミスフォールドαＳ凝集体の検出
５．１ 収集および前処理
処置の１０分前に患者を局所麻酔（リドカインを用いた鼻スプレー）に供した。硬性ファイバースコープを通して、嗅粘膜（鼻中隔と中鼻甲介との間）を特定する。ファイバースコープを適所に保持したまま、綿棒を鼻孔に挿入し、それが嗅粘膜（ＯＭ）に達したら、鼻孔の壁を穏やかに掻破して試料を収集した。スワブを鼻から取り出し、３ｍＬの生理溶液（生理食塩水緩衝液）を含有する１５ｍＬコニカルチューブに入れた。使い捨てハサミを使用して、スワブの蒸気を１５ｍＬコニカルチューブ内に収まるように切断した。チューブを１分間ボルテックスした。使い捨てピンセットを使用して、スワブを３ｍＬの生理溶液（生理食塩水緩衝液）を含む第２の１５ｍＬコニカルチューブに移し、１分間ボルテックスした。同じ使い捨てピンセットを使用して、スワブを３ｍＬの生理溶液を含む第３の１５ｍＬコニカルチューブに移し、１分間ボルテックスした。スワブを廃棄した。１５ｍＬチューブの各々から３ｍＬ（合計９ｍＬ）を単一の１５ｍＬチューブにプールし、これを４℃で２０分間、８００×ｇで遠心分離した。８ｍＬの上清生理食塩水を廃棄した。ペレットおよび１ｍＬの生理食塩水を－８０℃で保存した。

【0134】

５．２ 前処理。αＳ－ＳＡＡ試料調製。
約２μｇの試料を保持する細菌接種ループを使用して、ペレットからＯＭ試料を収集した。３つのループを収集し（６μｇ）、広範囲のボルテックスおよび上下ピペッティングによって５０μＬの１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ５４９３－１Ｌ）に再懸濁した。最終的な再懸濁液を、それぞれ１６．７μＬ（１アリコート当たり２μｇのＯＭ試料）を含有する３つの単回使用アリコートに等分する。試料を急速凍結し、使用するまで－８０℃で保存した。

【0135】

５．３ αＳ－ＳＡＡのための試料処理。
ＯＭ／ＰＢＳ試料を解凍し、４μＬの試料を７６μＬのｓＣＳＦ（Ａｍｐｒｉｏｎ、カタログ番号Ｓ２０２２）にピペッティングして１：２０希釈を行った。２４μＬの１：２０希釈を４５６μＬのｓＣＳＦにピペッティングすることによって１：４００（１２ｎｇ／４０μＬ）希釈を調製した。

【0136】

５．４ αＳ－ＳＡＡ。
反応混合物は、４０μＬのＯＭ試料（１２ｎｇおよび／または２４ｎｇ）および６０μＬのプレインキュベーション混合物を含有していた。プレインキュベーション混合物は、１００ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＴｈＴ、０．１％のサルコシル、および２つのＳｉ_３Ｎ_４ビーズ（１／８インチ、グレード５）を含んでいた。プレートを４２℃で合計１５分間のサイクルで、１分間軌道振盪し、引き続いて１４分間インキュベートする。Ｏｍｅｇａシェーカー／リーダーに関連するロボットアーム（８プレートずつ）を使用する場合、撹拌を６００ＲＰＭに設定し、スタンドアロンＯｍｅｇａｓ（１プレートずつ）を８００ＲＰＭに設定した。蛍光読み取り値を４４０－１０ｎｍ（励起）および４９０－１０ｎｍ（発光）で取得した。図１６は、非シヌクレイノパチー対照と比較した、ＰＤを有すると診断された患者由来のαＳ－ＳＡＡ凝集曲線を示す。

【0137】

本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料の完全な開示は、本明細書の具体的な引用がそのように述べているか否かにかかわらず、参照により組み込まれる。上記の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。不必要な制限がそこから理解されるべきではない。本発明は、図示および記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】