特表 2024-533530 複合ジンセノシド組成物を含む抗炎症組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】複合ジンセノシド組成物を含む抗炎症組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/258 20060101AFI20240905BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20240905BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240905BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240905BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

A61K36/258

A61K8/9789

A61Q19/00

A61Q11/00

A61P1/02

A61P17/00

A61P29/00

A23L33/105

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516622

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(85)【翻訳文提出日】2024-03-13

(86)【国際出願番号】 KR2021015893

(87)【国際公開番号】W WO2023042959

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】10-2021-0122350

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514012085

【氏名又は名称】ビーティージン カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110003579

【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(72)【発明者】

【氏名】オー、ジン‐ファン

(72)【発明者】

【氏名】ハ、ユル

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジン－ヘ

(72)【発明者】

【氏名】リ、ヒュン－チョル

(72)【発明者】

【氏名】ハ、ヨ－ジン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C083

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018LE03

4B018LE05

4B018MD64

4B018MD90

4B018ME14

4B018MF01

4B018MF06

4B018MF12

4C083AA111

4C083AA112

4C083CC02

4C083CC41

4C083DD17

4C083DD23

4C083EE13

4C083EE31

4C083FF01

4C088AB18

4C088AC11

4C088BA08

4C088CA03

4C088CA25

4C088MA02

4C088MA17

4C088MA43

4C088NA14

4C088ZA67

4C088ZA89

4C088ZB11

(57)【要約】

【課題】 副作用が少ないかないと共に抗炎症活性効果を示す天然物質組成物を提供する
【解決手段】本発明者らは、溶媒を用いて紅参から複合ジンセノシドを抽出し、これを吸着樹脂に吸着させた後に溶媒で脱離させて部分精製し、紅参濃縮液を混合して抗炎症活性を試験した結果、抗炎症活性が顕著であることを確認し、これを用いて抗炎症組成物を製造した。この組成物は、食品、皮膚外用剤、化粧料組成物などに利用可能である。
【選択図】 図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）紅参を抽出及び濃縮して紅参濃縮物を得る段階；
２）紅参濃縮物を溶解した後、合成吸着樹脂カラムに通過させて吸着した後にエタノールで脱離させ、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄを含む複合ジンセノシドを得る段階；
３）複合ジンセノシドをアルファ－ガラクトシダーゼで処理して発酵複合ジンセノシドを得る段階；及び
４）前記１）段階で得た紅参濃縮物に、前記３）段階で得た発酵複合ジンセノシドを加えて複合ジンセノシド組成物を得る段階により得られ、ジンセノシド化合物Ｋ１００重量部に対して、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ７重量部以上で含まれている複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する抗炎症組成物。

【請求項2】

前記複合ジンセノシド組成物は、ジンセノシド化合物Ｋ１００重量部に対して、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）が２０重量部以上、ジンセノシドＦ２が８重量部以上、ジンセノシドＲｈ２が１２重量部以上、及びジンセノシドＲｂ１が８重量部以上含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症組成物。

【請求項3】

前記複合ジンセノシド組成物は、ジンセノシド化合物Ｋが１００ｍｇ／ｇ以上、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ８ｍｇ／ｇ以上含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症組成物。

【請求項4】

１）、２）及び４）段階の紅参濃縮物は、粉末状態又は液状であることを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症組成物。

【請求項5】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、皮膚炎症治療用の皮膚外用剤組成物。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、化粧料組成物。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、薬学組成物。

【請求項8】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、口腔内炎症予防又は改善用の歯磨き組成物。

【請求項9】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、口腔内炎症予防又は改善用の口腔清潔剤組成物。

【請求項10】

請求項１～３のいずれか一項の抗炎症組成物を含む、食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、紅参から抽出及び加工した複合ジンセノシド組成物を含む抗炎症組成物及びこれを含む薬学組成物、化粧料、食品、歯磨き、口腔清潔剤などに関する。

【0002】

本発明は、韓国中小ベンチャー企業部の支援によって行った課題の結果であることを明らかにする（課題固有番号：１４２５１４７７８０、課題名：抗ムシ歯効能を有する紅参特異サポニン抽出物の事業化及び効能検定）。

【0003】

【背景技術】

【0004】

炎症は、損傷、感染又は免疫系によって外来物質として認識された分子に対する体内反応のことをいう。炎症は、組織の疼痛、腫脹又は機能変化を特徴とする。炎症性疾患は、組織又は器官において免疫系が異常レベルに活性化されることを特徴とし、これは組織又は器官において機能異常や疾患を誘発することがある。

【0005】

炎症性疾患は全世界的に主要な死亡原因の一つである。炎症性疾患は、様々な器官及び組織、例えば、血管、心臓、脳、神経、関節、皮膚、肺、眼、胃腸管、腎臓、甲状腺、副腎、膵臓、肝及び筋肉に侵犯する。炎症性疾患の治療は、製薬会社と研究者等にとって関心の対象である。この分野における最近の多い研究にもかかわらず、現在の炎症性疾患に対する療法には、非特異的薬物によって症状を緩和させること、炎症を減少させること、及び疾病への進行を遅らせることなどがあるが、このような療法には薬物副作用及び耐性という深刻な問題がある。

【0006】

現在、抗炎症剤としては非ステロイド性消炎剤（ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ，ＮＳＡＩＤＳ）が広く使用されている。しかし、非ステロイド性消炎剤は、腎臓障害、胃腸管障害、肝障害などの深刻な副作用を伴うことが知られている（Ｒａｉｎｓｆｏｒｄ ＫＤ．，Ｓｕｂｃｅｌｌ ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２：３－２７，２００７；Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄ Ｐ．Ａｉｔｈａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．，７：１３９－１５０，２０１１；Ｐｒａｖｅｅｎ Ｐ．Ｎ．Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．，３：１５３０－１５４９，２０１０）。

【0007】

そこで、天然物質から抗炎症活性効果を示し、副作用が少ないかない新しい薬物を見出すための研究が活発に行われている。

【0008】

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、副作用が少なすかないと共に抗炎症活性効果を示す天然物質組成物を提供することを目的に、人参から抽出したジンセノシド及びこれを含む混合物が抗炎症作用を示すことを究明し、これに基づいて強力な抗炎症物質を提供しようとする。

【0010】

また、本発明は、上記の抗炎症物質を用いた食品、薬品、化粧料、口腔清潔剤、歯磨きなどを提供しようとする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、溶媒、好ましくは食用可能な溶媒を用いて人参から複合ジンセノシドを抽出し、これを吸着樹脂に吸着させた後に溶媒で脱離させて部分精製した後、紅参抽出濃縮物を混合して複合ジンセノシド組成物を製造した後、抗炎症活性を試験した結果、抗炎症活性が顕著であることを確認した。

【0012】

この組成物は、口内炎、歯肉炎などの口腔炎症の予防又は治療剤、歯磨き組成物、皮膚外用剤、化粧料組成物、食品などに利用可能である。

【発明の効果】

【0013】

本発明の複合ジンセノシド組成物は、ＮＯ生成抑制、親炎症性サイトカイン発現抑制、及び優れた抗炎症活性を示した。

【0014】

したがって、本発明の複合ジンセノシド組成物は、抗炎症薬学組成物、口内炎症予防又は治療用の歯磨き組成物、口腔清潔剤をはじめとする口腔用組成物、皮膚炎症治療用皮膚外用剤組成物、化粧料組成物、食品組成物などに応用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＢＴＥＸ－Ｋ試料を濃度別に処理した後にＬＰＳで炎症を誘発し、４８時間後にＮＯ生成を確認した結果である（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は対照群と比較）。

【0016】

【図2】ＢＴＥＸ－Ｋ試料を濃度別に処理した後にＬＰＳで炎症を誘発し、４８時間後に親炎症性サイトカイン生成を確認した結果である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は対照群と比較）。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、

【0018】

１）紅参を抽出及び濃縮して紅参濃縮物を得る段階；

【0019】

２）紅参濃縮物の一部を溶解させて吸着樹脂カラムに通過させて吸着させた後にエタノールで脱離させ、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、及びＲｄを含む複合ジンセノシドを得る段階；

【0020】

３）複合ジンセノシドをアルファ－ガラクトシダーゼで処理して発酵複合ジンセノシドを得る段階；及び

【0021】

４）上記の１）段階で得た紅参濃縮物に上記の３）段階で得た発酵複合ジンセノシドを加えて複合ジンセノシド組成物を得る段階；を経て得、

【0022】

ジンセノシド化合物Ｋ １００重量部に対してジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ７重量部以上、好ましくは７重量部以上３０重量部以下、より好ましくは１０重量部以上３０重量部以下で含まれている複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する抗炎症組成物に関する。

【0023】

上記の４）段階において、紅参濃縮物：発酵複合ジンセノシド＝１～９：９～１（ｗ／ｗ）、好ましくは２～８：８～２、より好ましくは３～７：７～３、さらに好ましくは４～６：６～４の比率に混合し、特に好ましくはジンセノシド化合物Ｋ １００重量部に対してジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ７重量部以上、とりわけ好ましくは７重量部以上３０重量部以下、なかんずく好ましくは１０重量部以上３０重量部以下で含まれるように混合する。

【0024】

また、本発明は、前記複合ジンセノシド組成物がジンセノシド化合物Ｋ １００重量部に対してジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ） ２０重量部以上、ジンセノシドＦ２ ８重量部以上、ジンセノシドＲｈ２ １２重量部以上、及びジンセノシドＲｂ１ ８重量部以上が含まれていることを特徴とする抗炎症組成物に関する。

【0025】

また、本発明は、前記複合ジンセノシド組成物がジンセノシド化合物Ｋ １００ｍｇ／ｇ以上、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ８ｍｇ／ｇ以上、好ましくは８ｍｇ／ｇ以上３０ｍｇ／ｇ以下、より一層好ましくは１０ｍｇ／ｇ以上３０ｍｇ／ｇ以下で含まれていることを特徴とする抗炎症組成物に関する。

【0026】

前記吸着樹脂カラムは、特に制限はないが、多孔性吸着樹脂カラムが好ましく、より好ましくはＨＰ２ＭＧ又はＨＰ－２０のうち一つ以上であることを特徴とする。

【0027】

また、本発明は、上記の１）、２）及び４）段階の紅参濃縮物が粉末状態又は液状であることを特徴とする抗炎症組成物に関する。

【0028】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む皮膚炎症治療用の皮膚外用剤組成物に関する。

【0029】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む化粧料組成物に関する。

【0030】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む炎症予防又は治療用の薬学組成物に関する。一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液、及び噴霧剤からなる群から選ばれる一つ以上の剤形であってよい。

【0031】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む口腔炎症予防又は改善用の歯磨き組成物に関する。

【0032】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む口腔炎症予防又は改善用の口腔清潔剤組成物に関する。

【0033】

また、本発明は、前記抗炎症組成物を含む炎症予防又は改善用の食品組成物に関する。

【0034】

本発明で使われる用語「食品」とは、栄養素を１種又はそれ以上含有している天然物又は加工品を意味し、好ましくは、ある程度の加工工程を経て直接食べられるような状態のものを意味し、通常の意味として、食品、食品添加剤、機能性食品、健康機能食品、健康補助食品及び飲料などのいずれをも含んでよい。本発明の食品組成物は、非制限的な例として、各種の飲料、ガム、茶、菓子、ビタミン複合体、健康補助食品などの形態で製造されてよい。本発明の食品組成物の好ましい摂取量は、摂取者の状態、体重、症状の程度、食品形態、摂取期間によって異なり、適切に選択されてよい。本発明の食品組成物は、有効成分が１日に０．２ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇで摂取されるようにすることが最適の効果のために好ましい。

【0035】

前記複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する抗炎症組成物は、薬剤学的分野において通常的に許容される担体と共に配合して通常の方法によって注射剤、経口投与、塗布剤の形態などに剤形化できる。例えば、液剤、シロップ剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末、軟膏、エマルジョン、ゲル、クリームなどに製剤化でき、それは様々な経路で投与できる。様々な剤形のうち、例えば、注射用組成物は等張性水溶液又は懸濁液が好ましく、言及した組成物は滅菌され、及び／又は補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩／又は緩衝剤）を含有する。また、これらは、その他治療的に有用な物質を含有できる。薬剤学的に許容可能な担体には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガムアカシア、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどが含まれる。前記組成物には、また、潤滑剤、潤滑剤、風味剤、乳化剤及び防腐剤などがさらに含まれてよい。本発明の組成物は、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤又は乾燥シロップ剤などの経口用製剤又は注射剤などの非経口用剤形に製剤化できるが、このような剤形に限定されるものではない。

【0036】

このように製造された薬剤学的製剤は、目的に応じて、皮下投与、筋肉投与、経口投与、静脈投与、皮膚塗布、口腔塗布、歯肉塗布などで投与でき、容量は、１日投与量０．００１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇを１回又は数回に分けて投与できる。特定患者に対する投与容量の程度は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、疾患の重症度などによって変化できる。

【0037】

また、前記複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する抗炎症組成物は、皮膚炎症治療用の皮膚外用剤であることを特徴とする。本発明の抗炎症組成物を有効成分とする塗布剤は、通常の製造方法によっていかなる形態でも容易に製造できる。例えば、クリーム型塗布剤を製造する場合には、一般的な水中油型（Ｏ／Ｗ）又は油中水型（Ｗ／Ｏ）のクリームベースに本発明の抗炎症組成物を含有させ、ここに香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤などを必要によって使用する一方、物性改善を目的にタンパク質、ミネラル、ビタミンなどの合成又は天然素材を併用できる。

【0038】

また、本発明は、前記複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する抗炎症組成物を主成分とする化粧料組成物に関する。ｐＨ調節剤、香料、乳化剤、防腐剤などを必要によって付加し、通常の化粧料製造方法によって化粧水、ゲル、水溶性パウダー、脂溶性パウダー、水溶性リキッド、クリーム又はエッセンスなどに剤形化できる。

【0039】

また、本発明は、前記複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する口腔内炎症予防又は改善用の歯磨き組成物に関する。マスティックオイル、プロポリス抽出物、ピロリン酸ナトリウム、フルオロ化ナトリウム、酢酸トコフェロール、ヒドロキシアパタイト、甘味剤、粘増剤、研磨剤、湿潤剤又は界面活性剤などを必要によって付加し、通常の歯磨き組成物の製造方法によって剤形化できる。

【0040】

また、本発明は、前記複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する口腔内炎症予防又は改善用の口腔用組成物に関する。可溶化剤、湿潤剤、界面活性剤、潤滑剤、香料、甘味剤、防腐剤又は薬効剤などを必要によって付加し、通常の口腔用組成物の製造方法によって剤形化でき、ガム（ｇｕｍ）、口腔洗浄剤、口腔清潔剤、口腔用スプレー、口腔用軟膏剤、口腔用パッチ又はこれらの組合せからなる群から選ばれる剤形に製造できる。

【実施例】

【0041】

以下、本発明の具体的な方法を、実施例を挙げてより詳細に説明する。ただし、本発明の範囲がこれらの実施例の記載によって限定されるものでないことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって自明である。

【0042】

【0043】

実施例１：複合ジンセノシド製造

【0044】

韓国産乾燥紅参（４年根）を購入して実験原料とした（チュンチョンナムドクムサン，ドクウォン人参）。複合ジンセノシドは乾燥紅参から抽出した。乾燥紅参１０ｋｇを５０％エタノールで６０℃で１２時間３回反復抽出及び濃縮して紅参濃縮液を得た。

【0045】

紅参濃縮液は合計５．６ｋｇ（６３ｂｒｉｘ）であったし、その５．５ｋｇを水に溶かした後、合成吸着樹脂（ＨＰ２ＭＧ，ミツビシケミカル、又はＨＰ－２０，Ｄｉａｉｏｎ）が充填されているカラムに通過させて吸着させた後に９５％エタノールで脱離させ、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄなどを含む複合ジンセノシド４６０ｇを得た。

【0046】

【0047】

実施例２：紅参濃縮液粉末製造

【0048】

実施例１で製造した紅参濃縮液５．６ｋｇのうち１００ｇを別に取って減圧濃縮し、７１ｇの紅参濃縮液粉末を得た。

【0049】

【0050】

実施例３：発酵複合ジンセノシド製造

【0051】

上の実施例１で得た複合ジンセノシド１００ｇを基質にして５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ４．５）でアスペルギルス属由来のアルファ－ガラクトシダーゼ（０．７５ｇ）と６０℃恒温水槽で８４時間以上反応させて発酵複合ジンセノシド（４１ｇ）を製造した。

【0052】

このように製造した発酵複合ジンセノシドには、ジンセノシド化合物Ｋ、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２などが含まれている。

【0053】

【0054】

実施例４：複合ジンセノシド組成物（以下、「ＢＴＥＸ－Ｋ」と混用する。）製造

【0055】

実施例３で製造した発酵複合ジンセノシド１００ｇに、実施例２で調製した紅参濃縮液粉末４０ｇを混合し、複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋを製造した。

【0056】

複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋには、ジンセノシド化合物Ｋ＝１００ｍｇ／ｇの他にもジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２などの様々なジンセノシドが含まれている。

【0057】

［表１］

【0058】

実験例１：細胞生存率分析（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）

【0059】

１）９６ウェルプレートに細胞（Ｒａｗ ２６４．７）をウェル当たり８×１０３個シードした後、ＣＯ２培養器内で２４時間培養した。

【0060】

２）培地を除去し、エタノールを用いた試料抽出物が濃度別に添加された１００ｕｌの新しい培地に替えた後、２４時間培養した。

【0061】

［表２］

【0062】

３）ＭＴＴ溶液を添加して４時間反応させた。４）吸光度は、分光光度計を用いて４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で測定した（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅは６００ｎｍ）。

【0063】

【0064】

実験例２：ＮＯ生成測定

【0065】

１）細胞（Ｒａｗ ２６４．７）を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した。

【0066】

２）懸濁した細胞をウェルプレートに各ウェル当たり８×１０３個シードした後、ＣＯ２培養器内で２４時間培養した。

【0067】

３）培養２４時間後に、付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、新しい培地を加え、下表のような濃度に希釈した試料を２４時間前処理した後、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１１１；Ｂ４）を処理した。その後、４８時間培養した。

【0068】

［表３］

【0069】

４）４８時間後に遠心分離して上澄液を取り、グリース試薬（Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（０．２％ Ｎ－（１－ナフチル基）エチレンジアミン溶液：０．２％スルファニルアミド溶液＝１：１）を用いて５４０ｎｍで吸光度を測定した。

【0070】

５）検量線は、亜硝酸ナトリウム溶液を用いて作成し、吸光度によって亜硝酸塩の濃度を計算した。

【0071】

６）活性は、ＬＰＳのみを処理した群と比較する方法で評価した。

【0072】

【0073】

実験例３：サイトカイン測定（ＥＬＩＳＡ）

【0074】

１）細胞（Ｒａｗ ２６４．７）を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した。

【0075】

２）懸濁した細胞を９６ウェルプレートに各ウェル当たり８×１０３個シードした後、ＣＯ２培養器内で２４時間培養した。

【0076】

３）２４時間後に、付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、新しい培地に表３のような濃度に希釈した検索試料を２４時間前処理した後、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１１１；Ｂ４）を処理し、その後、４８時間を培養した。

【0077】

［表４］

【0078】

４）４８時間後に遠心分離して上澄液を取り、マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてＩＬ－１β、ＩＬ－６を定量した。

【0079】

【0080】

結果１：細胞生存力

【0081】

試料が溶けている溶媒がエタノールであるので、エタノールに対するＲａｗ ２６４．７細胞の細胞生存力を調べた。エタノールを濃度別にＲａｗ ２６４．７細胞培養液に添加して２４時間培養後にＭＴＴ分析で確認した結果、２％以上のエタノール濃度から始まってＲａｗ ２６４．７細胞が４０％以上死ぬことを確認した。したがって、試料溶媒のエタノール濃度を１％以下に固定した。

【0082】

また、陽性対照群である濃度別ジンセノシド化合物Ｋに対するＲａｗ ２６４．７の細胞生存力を確認した。２０ｕｇ／ｍｌのジンセノシド化合物Ｋの濃度から始まってＲａｗ ２６４．７細胞の生存力が減少することが確認できた。したがって、ジンセノシド化合物Ｋ試料の濃度を１、５及び１０ｕｇ／ｍｌと固定して次の実験を行った。

【0083】

また、試料ＢＴＥＸ－Ｋを濃度別に投与してＲａｗ ２６４．の細胞生存力を確認した。３０ｕｇ／ｍｌのＢＴＥＸ－Ｋ濃度から始まってＲａｗ ２６４．７細胞の生存力が減少することが確認できた。したがって、ＢＴＥＸ－Ｋ試料濃度を５、１０及び２０ｕｇ／ｍｌと固定して次の実験を行った。

【0084】

炎症誘導試薬であるＬＰＳを濃度別にＲａｗ ２６４．７細胞に処理し、細胞生存力とＮＯ生成を試験した。１００ｎｇ／ｍｌと２００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度で細胞生存力が増加したし、ＮＯ生成は、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ濃度でのみ増加した。したがって、ＬＰＳの濃度を１００ｎｇ／ｍｌと確定して実験を行った。

【0085】

【0086】

結果２：酸化窒素生成

【0087】

図１のようにＲａｗ ２６４．７細胞にＢＴＥＸ－Ｋを濃度別に処理して２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加して４８時間後にＮＯ濃度を確認した結果、２０ｕｇ／ｍｌ ＢＴＥＸ－Ｋの濃度において有意な減少を確認した（＊＊ｐ＜０．０１）。

【0088】

【0089】

結果３：親炎症性サイトカイン測定

【0090】

Ｒａｗ ２６４．７細胞にＢＴＥＸ－Ｋを濃度別に処理して２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加して４８時間後にサイトカイン生産を確認した結果、２０ｕｇ／ｍｌ ＢＴＥＸ－Ｋの濃度においてＩＬ－６とＩＬ－１βにおいて有意な減少をそれぞれ確認した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

【0091】

【0092】

抗炎症実験前にジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋの両試料ともエタノールに溶けているので、抗炎症実験に使用するＲａｗ ２６４．７細胞のエタノールに対する細胞生存力をまず確認した。約１％エタノールまでは細胞生存力への影響が少なかったが、それ以上の濃度ではＲａｗ ２６４．７細胞の生存力に影響を及ぼすことを確認した。したがって、エタノールの濃度が１％を超えることは適切でないことが分かる。

【0093】

また、ジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋの濃度によるＲａｗ ２６４．７細胞の生存力を確認し、実験に使用する適正濃度を決めた。その結果、ジンセノシド化合物Ｋは、２０ｕｇ／ｍｌの濃度においてＲａｗ ２６４．７細胞の生存力が減少したし、ＢＴＥＸ－Ｋは、３０ｕｇ／ｍｌの濃度から始まってＲａｗ ２６４．７細胞の生存力が減少することを確認した。したがって、後に行われる抗炎症実験の適正濃度を、ジンセノシド化合物Ｋは１、５、１０ｕｇ／ｍｌと、ＢＴＥＸ－Ｋは５、１０、２０ｕｇ／ｍｌと固定した。

【0094】

また、ＬＰＳの炎症誘発最適濃度をＮＯ生成によって確認した結果、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌの濃度においてＮＯ生成が最適であった。したがって、ジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋの両試料を、上で決めた濃度別にＲａｗ ２６４．７細胞に処理した後、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌを処理してＮＯ生成を確認した結果、ＢＴＥＸ－Ｋ２０ｕｇ／ｍｌの濃度において有意なＮＯ生成減少を確認した。

【0095】

また、サイトカイン生成実験においてもＢＴＥＸ－Ｋ ２０ｕｇ／ｍｌの処理時に、ＩＬ－６とＩＬ－１βのサイトカインの減少が有意に確認された。しかし、ジンセノシド化合物ＫではＮＯ及びサイトカインの生成がそれぞれ減少及び増加する傾向性を示し、有意性はなかった。

【0096】

【産業上の利用可能性】

【0097】

本発明の複合ジンセノシド組成物は、抗炎症薬学組成物、口内炎症予防又は治療用歯磨き組成物、口腔清潔剤を始めとする口腔用組成物、皮膚炎症治療用の皮膚外用剤組成物、化粧料組成物、食品組成物などに応用可能である。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】