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特表2024-533535高いレベルのアポカロテノイド化合物を生産するトランスジェニック植物およびそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】高いレベルのアポカロテノイド化合物を生産するトランスジェニック植物およびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/82 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20240905BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20240905BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20240905BHJP
A01H 5/04 20180101ALI20240905BHJP
A01H 5/08 20180101ALI20240905BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20240905BHJP
A23L 27/60 20160101ALI20240905BHJP
A23L 23/00 20160101ALI20240905BHJP
A23L 2/02 20060101ALI20240905BHJP
A23L 19/18 20160101ALI20240905BHJP
A23L 19/00 20160101ALI20240905BHJP
A61K 36/81 20060101ALI20240905BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240905BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240905BHJP
A23L 33/105 20160101ALN20240905BHJP
A61K 131/00 20060101ALN20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/82 124Z
C12N15/29 ZNA
A01H6/82
A01H5/00 A
A01H5/04
A01H5/08
A01H5/10
A23L27/60 B
A23L23/00
A23L2/02 F
A23L19/18
A23L19/00 Z
A61K36/81
A61P25/16
A61P25/28
A23L33/105
A61K131:00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516659
(86)(22)【出願日】2022-09-15
(85)【翻訳文提出日】2024-04-24
(86)【国際出願番号】 EP2022075670
(87)【国際公開番号】W WO2023041661
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】21382833.8
(32)【優先日】2021-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507383714
【氏名又は名称】ユニバーシダ デ カスティーリャ ラマンチャ
(71)【出願人】
【識別番号】593005895
【氏名又は名称】コンセホ・スペリオル・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス（セエセイセ）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）
(71)【出願人】
【識別番号】507299334
【氏名又は名称】ウニベルシタット ポリテクニカ デ バレンシア
(74)【代理人】
【識別番号】110001210
【氏名又は名称】弁理士法人ＹＫＩ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴメス ゴメス マリア ルルド
(72)【発明者】
【氏名】アフラゼム エル カディリ ウサマ
(72)【発明者】
【氏名】グラネル リヒャルト アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ルビオ モラガ アンジェラ
(72)【発明者】
【氏名】アルガンドーニャ ピカソ ハビエル
(72)【発明者】
【氏名】プレサ シルビア
(72)【発明者】
【氏名】ランブラ ホセ ルイス
【テーマコード（参考）】
4B016
4B018
4B036
4B047
4B117
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B016LE01
4B016LE05
4B016LG06
4B016LG11
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB03
4B018LB08
4B018MD48
4B018ME06
4B018ME10
4B018MF01
4B036LF03
4B036LH29
4B036LP05
4B047LB09
4B047LG39
4B047LG66
4B117LG09
4C088AB48
4C088AC04
4C088NA14
4C088ZA15
4C088ZA16
(57)【要約】
本発明は、特異的なプロモーターのコントロール下においてサフラン植物クロッカス・サティバスからの異種遺伝子を発現するトランスジェニック植物、より具体的にはトマトおよびジャガイモ植物からアポカロテノイドを組み換え生産するための方法および材料を提供する。その上、本開示は、異種遺伝子を含む遺伝子コンストラクト、および植物における発現のためのそれらの使用、ならびに上述の遺伝子コンストラクトを発現しかつ高濃度のアポカロテノイド産物、具体的にはクロシンおよびピクロクロシンを有するトランスジェニック植物を得るための方法にもまた関する。さらにその上、本開示は、かかるトランスジェニック植物から得られる食品産物、それらを含むニュートラシューティカルズ的および薬学的組成物、ならびに好ましくはアルツハイマー病などの神経変性疾患の処置のための薬としてのかかる組成物の使用にもまた関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アポカロテノイド化合物生合成、好ましくはクロシン、クロセチン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールのための３つの蛋白質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡコンストラクトであって、ここで、前記蛋白質はＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌ、またはその機能的に同等の配列から選択され、ここで、好ましくは、これらの蛋白質は、好ましくはＣ．サティバスからのクロッカス属に属し、
ここで、ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、配列番号６、および配列番号２からなるリストから選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から選択され、
ここで、各ヌクレオチド配列は、果実特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、および／または恒常的プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結され、
ここで、ＣＣＤ２Ｌをコードする前記ヌクレオチド配列は、果実特異的プロモーターまたは塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結される、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項2】
前記ＵＧＴ２蛋白質が、配列番号３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、前記ＵＧＴ７０９Ｇ１蛋白質が、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、前記ＣＣＤ２Ｌ蛋白質が、配列番号１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項3】
前記果実特異的プロモーターがトマトＥ８プロモーター（配列番号７）およびｐ２Ａ１１プロモーター（配列番号８）からなるリストから選択され、前記恒常的プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号９）であり、前記塊茎特異的プロモーターがパタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）である、請求項１または２のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項4】
前記コンストラクトが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号３４からなるリストから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項5】
ナス科植物におけるアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールのレベルを増大させるための方法であって、前記方法が、請求項１～４に記載のＤＮＡコンストラクトを前記ナス科植物に導入および発現することを含む、方法。
【請求項6】
対応する野生型ナス科植物と比較して増大したレベルのアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールを有するトランスジェニックナス科植物を生産するための方法であって、前記方法が、請求項１～４に記載のＤＮＡコンストラクトを前記ナス科植物に導入および発現することを含む、方法。
【請求項7】
前記ナス科植物がソラヌム・ツベロスム（ジャガイモ植物）およびソラヌム・リコペルシカム（トマト植物）種から選択される、請求項５または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトをそのゲノム上に含むトランスジェニックナス科植物であって、ここで、前記ナス科植物が、対応する野生型ナス科植物と比較して増大したレベルのアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールを蓄積する、トランスジェニックナス科植物。
【請求項9】
請求項８に記載のトランスジェニックナス科植物であって、ここで、それが、ソラヌム・ツベロスム（ジャガイモ植物）およびソラヌム・リコペルシカム（トマト植物）からなるリストから選択される、トランスジェニックナス科植物。
【請求項10】
前記増大したレベルのアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールが、好ましくは前記植物の収穫可能部分において、好ましくは塊茎、果実組織、または種子において増大する、請求項８または９のいずれか１項に記載のトランスジェニックナス科植物。
【請求項11】
塊茎、種子、および果実から選択される、請求項８～１０のいずれか１項に記載のナス科植物の収穫可能部分。
【請求項12】
請求項１１に記載のナス科植物の収穫可能部分を含む食品産物であって、前記食品産物が、増強されたアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールレベルを有する、食品産物。
【請求項13】
前記食品産物が、トマト、トマトに基づく産物、ジャガイモ、およびジャガイモに基づく産物からなるリストから選択され、好ましくは、ここで、前記トマトに基づく産物は、ケチャップ、トマトに基づくソース、ピザソース、トマトスープ、またはトマトジュースからなるリストから選択され、ここで、好ましくは、前記ジャガイモに基づく産物は、ジャガイモフレーク、ポテトチップス、または馬鈴薯粉からなるリストから選択される、請求項１２に記載の食品産物。
【請求項14】
請求項１１に記載のナス科植物の収穫可能部分、または請求項１２または１３のいずれか１項に記載の食品産物、その断片または抽出物と、薬学的またはニュートラシューティカルズ的な許容される担体とを含む薬学的またはニュートラシューティカルズ的組成物。
【請求項15】
医薬としての使用のための、好ましくは、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなるリストから好ましくは選択される神経変性疾患の防止および／または処置における使用のための、請求項１１に記載のナス科植物の収穫可能部分、請求項１２または１３のいずれか１項に記載の食品産物、請求項１４に記載のニュートラシューティカルズ的な組成物または薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書において開示される発明は一般的に遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本明細書において開示される発明は、塊茎、果実、および／または恒常的プロモーターのコントロール下においてサフラン植物クロッカス・サティバス（Crocus sativus）からの異種遺伝子を発現するトランスジェニック植物、好ましくはソラヌム属からの植物、より好ましくはトマトおよびジャガイモ植物から、アポカロテノイドを組み換え生産するための方法および材料を提供する。その上、本開示は、異種遺伝子を含む遺伝子コンストラクト、それらを含むプラスミドまたはベクター、植物、好ましくはナス科植物、より好ましくはトマトおよびジャガイモにおける発現のためのそれらの使用、ならびに上述の遺伝子コンストラクトを発現しかつ高濃度のアポカロテノイド産物、具体的にはクロシンおよびピクロクロシンを有するかかる遺伝子改変された植物を得るための方法にもまた関する。さらにその上、本開示は、トランスジェニック植物から得られる食品産物、好ましくはジャガイモ、ジャガイモに基づく産物、トマト、および／またはトマトに基づく産物、ならびに好ましくはアルツハイマー病などの神経変性疾患の処置のためのニュートラシューティカルズ的および薬学的組成物としてのそれらの使用にもまた関する。
【背景技術】
【0002】
植物におけるカロテノイド生合成は、プラスチドに搬入される、核にコードされる酵素によって触媒される。カロテノイドは５炭素イソプレノイド、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）から作出される。全トランスリコペンは熟したトマトにおいて生産される主要なカロテノイドである。さらなる全トランスリコペン環化およびヒドロキシル化反応はルテインおよびゼアキサンチン化合物をもたらす。植物において、ゼアキサンチンおよびルテインは、光防御、活性酸素種および他のラジカルの解毒、ならびに生体膜の機能的および構造的インテグリティ維持を包含するいくつかの機能を有する。さらにその上、ゼアキサンチンは、全ての植物におけるアブシジン酸（ＡＢＡ）、ならびにサフラン、ブッドレア、およびガーデニアにおけるクロシンおよびピクロクロシンのようなアポカロテノイドの前駆体として作用する。よって、アポカロテノイド化合物は、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）によって触媒される反応におけるカロテノイドの酸化開裂に由来する。もたらされる産物は異なる修飾を経過して、全ての生きている生物において幅広い範囲の生物学的な機能を有する活性な最終化合物を与える。植物において、アポカロテノイドは植物の体力維持におよび発生の種々の側面に関わり、動物において類似の役割が果たされる。
【0003】
クロシンおよびピクロクロシンは水溶性アポカロテノイドであり、サフラン（クロッカス・サティバス）の主要な構成成分である。これらのアポカロテノイドはサフランの柱頭に大量に蓄積し、それらは、これらの特徴的なアポカロテノイドが部分的に担う治療上の特性、例えば抗酸化、抗痙攣、神経保護、抗炎症、抗鬱、および抗増殖活性をもまた呈する。サフランからのアポカロテノイドの抗酸化および抗炎症特性は心血管系、消化系、および眼系疾患、ならびに白血病において実証されている。さらにその上、アルツハイマー病におけるクロシン－１の効果もまた、インビトロおよびインビボ研究において、ならびに軽症から中等症のアルツハイマーを患う患者による人間の治験において実証されており、ここで、１５ｍｇのサフランを１日２回１６週間受けた患者はプラセボを受けた患者よりも良い認知機能を示した。サフランはスパイスとしてもまた使用され、その高い経済的価値を原因として赤い金と言われる。これはその栽培および管理の特定の特徴の直接的帰結である。クロシンはサフランの強い赤色を担い、ピクロクロシンはその苦い味に関連し、独特な芳香および香味を担う化合物のサフラナールの前駆体である。
【0004】
これらのサフランアポカロテノイドは、特異的なカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ酵素（ＣｓＣＣＤ２Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＬＭ２３５４７．１）によって触媒される反応における７，８：７’，８’位置でのゼアキサンチンの開裂に由来する。それらの水溶性は、グルコシルトランスフェラーゼＣｓＵＧＴ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４８７８．１）およびＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰＵ５４６７７．１）の作用によってそれらの骨格に追加されるグルコース分子によって提供される。
【0005】
１ｋｇの乾燥されたサフラン柱頭スレッドを生産するためには、１２０，０００から２００，０００の間の花が必要とされ、これは３７０～４７０時間の作業に等しい。帰結として、プロセスは非常に労働集約的でありかつリスクを伴う。なぜなら、それは環境条件に高度に依存的であり、高いコストに至り、他の産業セクターによるサフランの利用を制限するからである。サフランアポカロテノイドは、２０１９年に８．８１７億米ドルと見積もられる世界的市場規模を有する。
【0006】
サフランアポカロテノイドを得ることならびに代謝工学の進歩および合成生物学へのその発展を考慮に入れることについて存在する制限を克服するために、科学コミュニティはサフランからのアポカロテノイドの合成を他のホストに敷衍し、サフランアポカロテノイドなどのこれらの希少な代謝物の低コスト生産を探している。
【0007】
サフランＣｓＣＣＤ２Ｌ酵素の使用は、サッカロマイセス・セレビシエ（非特許文献１、非特許文献２）および大腸菌（非特許文献３）においてそれぞれ１．２２ｍｇ／Ｌ、１５．７０ｍｇ／Ｌ、および４．４２ｍｇ／Ｌのクロセチンという最大の蓄積をもたらしたということが公知である。ピクロクロシン生合成における新規ＵＧＴの役割を植物界において確認することを狙ったその後の研究では（非特許文献４）、ニコチアナ・ベンサミアナの葉が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって、単独のまたはＵＧＴ７０９Ｇ１との組み合わせのＣｓＣＣＤ２Ｌによって一過的に形質転換され、これは１から４の範囲であるグリコシル化度を有する３０．５μｇ／ｇ乾燥重量のクロシンの生産に至った（クロシン１～４）。加えて、Ｍ．マルティらは、成体Ｎ．ベンサミアナ植物においてＣｓＣＣＤ２Ｌのウイルスによって駆動される発現を使用して、ＣｓＣＣＤ２Ｌ発現単独が、一過的に形質転換されたタバコにおける有意なクロシン蓄積のために十分であるということを実証した（最高で２ｍｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ））（非特許文献５）。ＣｓＣＣＤ２Ｌ単独を発現するニコチアナ・グラウカおよびＮ．タバカムにおける安定な形質転換は、それぞれ４００μｇ／ｇＤＷおよび３６μｇ／ｇＤＷの蓄積を可能にした（非特許文献６）。これらの結果は、有望だが、サフランの高価値アポカロテノイドの生産のための産業システムの開発という面においては、効率的かつ持続可能とは見なされ得ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Chai et al., Microb. Cell Factories, 2017; 16; pp: 54
【非特許文献2】Tan et al., J. Exp. Bot., 2019; 70, pp: 4819－4834
【非特許文献3】Wang et al., Microb. Cell Factories, 2019;18
【非特許文献4】Diretto et al., New Phytol., 2019; 224; pp: 725－740
【非特許文献5】Marti, M. et al. Metabolic Engineering. 2020; 61: 238－250
【非特許文献6】Ahrazem et al. Frontiers in Plant Science. 2022; 13:861140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
代替の異種システムにおいて、サフランアポカロテノイド、具体的にはクロシンおよびピクロクロシンの生産を増大させるためのさらなる改善された方法を利用可能にする定常的な必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、植物、好ましくはソラヌム属に属する植物、より好ましくはトマトおよびジャガイモ植物を操作することによって、ジャガイモのケースではそれらの果実および塊茎、このケースではトマト果実において、クロッカス柱頭におけるアポカロテノイドの生合成に関わる３つのサフラン特異的な遺伝子が発現され、それゆえに、上記の果実および塊茎における高いレベルのクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールの生合成および蓄積を達成するということを実証する。
【0011】
クロシンおよびピクロクロシン生合成のための経路が、塊茎、果実特異的、および恒常的プロモーターを使用してトマトおよびジャガイモに導入された。具体的には、果実特異的であるプロモーターｐＥ８およびｐ２Ａ１１ならびに恒常的プロモーターであるＣａＭＶｐ３５Ｓプロモーターは、トマトＤＷ中に１２．４８ｍｇ／ｇのクロシンおよび２．９２ｍｇ／ｇのピクロクロシンをもたらした。これは、植物の生育を落とすことなしに一過的なまたは安定した代謝工学の結果として異種システムにおいてサフランアポカロテノイドについて報告された最も高いレベルであった（例４、表８参照)。加えて、ジャガイモにおいては、使用されたプロモーターはパタチン（patatin）プロモーター（ｐＰａｔ）であり、クロシンおよびピクロクロシンの蓄積をもたらし、それぞれ、コンストラクトＯ６（配列番号３４）を発現するｃｖ．デジレにおける３６０μｇ／ｇおよび８００μｇ／ｇＤＷならびにｃｖ．ＯＩＨ１５ＷＴにおける３．０２ｍｇ／ｇＤＷおよび５．９０ｍｇ／ｇに達した（例７、表１１参照）。戦略には、クロセチンジアルデヒドおよび２，６，６－トリメチル－４－ヒドロキシ－１－カルボキシアルデヒド－１－シクロヘキセンを生産するための配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬＭ２３５４７．１）で定められるＣｓＣＣＤ２Ｌ蛋白質をコードする果実特異的プロモーターのコントロール下の配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８８７１１０．１）で定められるＣｓＣＣＤ２Ｌ遺伝子配列を含む第１のプラスミドによる、ならびにピクロクロシンおよびクロシンを生産するためのそれぞれ配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰＵ５４６７７．１）で定められる配列を含むグリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７０９Ｇ１と配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４８７８．１）で定められる配列を含むＣｓＵＧＴ２とをコードする果実特異的プロモーターおよび／または恒常的プロモーターのコントロール下の、それらの１つである配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ３８５１８６．１）で定められるＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１遺伝子配列と、別の１つである配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２６２０３７．１）で定められるＣｓＵＧＴ２遺伝子配列とを含む２つの追加のプラスミドによるトマト植物の形質転換が関わった。ジャガイモでは、ｐＰａｔプロモーターのコントロール下の３つの遺伝子を含むユニークなコンストラクトが使用され、２つの異なる変種デジレおよびＯＩＨ１５ＷＴを使用した。最後の１つは高い含量のゼアキサンチンを蓄積する。加えて、記載されるアプローチは、他のホスト、例えば繰り返し一過的に形質転換されなければならないＮ．ベンサミアナの葉ではなく安定して形質転換されたトマトおよびジャガイモを使用するという利点を有し（Marti, M. et al. Metabolic Engineering. 2020, 61, 238－250）、それゆえに、価値あるアポカロテノイドの容易なかつ定常的に利用可能な発生源を提供する。
【0012】
よって、本開示は、３つの遺伝子ＣｓＣＣＤ２Ｌ（配列番号１）、ＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１（配列番号５）、およびＣｓＵＧＴ２（配列番号３）を本明細書において述べられる特定のプロモーター、好ましくは果実、塊茎、および／または恒常的プロモーターのコントロール下で発現することによって、高いレベルのこれらの価値あるサフランアポカロテノイド代謝物が特にトマト果実においておよびジャガイモ塊茎においてもまた得られるということを実証し、これらの遺伝子が、トマトおよびジャガイモにそれらを生産するそれらの能力を授けるために十分であったということを示している。この戦略は、減少したトマト果実のリコペンレベル（例３および表７）、ならびにｃｖ．デジレのビオラキサンチンレベル、ならびにＯＩＨ１５ＷＴのゼアキサンチンおよびビオラキサンチン（例８および表１３）をもたらした。これにもかかわらず、ゼアキサンチンは依然としてトマト果実においてもｃｖ．デジレにおいても主要なカロテノイドではなかった。これは、ＣｓＣＣＤ２Ｌが、リコペン、β－カロテン、およびα－カロテン（表７）、ならびにｃｖ．デジレのルテイン、ビオラキサンチン、およびアンテラキサンチン、ならびにＯＩＨ１５ＷＴのゼアキサンチン（表１３）のレベルの著しい縮減によって、果実の代謝フラックスを遮ってそれをアポカロテノイドの生産の方に押しやることができるということを示した。
【0013】
縮減された脂溶性カロテノイドおよび高い水溶性アポカロテノイドを有するトランスジェニックトマトおよびジャガイモ塊茎系統のトータルの抗酸化活性は、野生型植物（ＷＴ）よりもずっと高かった。サフランはトマトまたはジャガイモと比較してより高い抗酸化活性レベルを有するということが報告されており、それゆえに、クロシンおよびピクロクロシン生産のための操作された作物はそれらの親水性抗酸化剤レベルを実質的に増大させ得る。加えて、慢性ストレスによって誘導される酸化ダメージに対するクロシンの保護効果およびそれらの抗炎症効果が広く報告されており、それらの存在はこれらのトマトの健康特性を増強することを助けるであろう。これらは生鮮または加工産物どちらか、例えばジュース、スープ、およびソースとして消費され得る。加えて、クロシンおよびピクロクロシンは、また、トマトの圧搾ジュースからまたはジャガイモ塊茎から単純に抽出され、医薬品としてのまたは飼料、食品、および飲料品産業の着色料としてのこれらの化合物の手頃な生産のために使用され得る。
【0014】
トマト（ソラヌム・リコペルシカム）は世界的にポピュラーなかつ高度に消費される食品であり、これはモデル作物としてバイオテクノロジー用途に使用される。この研究では、トマトがサフラン経路の導入のために選択された。なぜなら、この果実は高いレベルのカロテノイドを基質として蓄積し、人間の消費のための濃縮物、ジュースを包含する良く確立された下流のプロセスがあるからである。加えて、多くの商業生産されるトマトは不良な味を有すると広く考えられ、それらの香味は消費者の不満足の主要な発生源である。サフランのアポカロテノイドはサフランスパイスの特徴的な香味および芳香を提供し、それらの可溶性はトマトジュースのニュートラシューティカルズ的な特性を増強するであろう。他方で、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスムＬ．）は生鮮および加工食品産業両方にとって世界中で商業的に重要な作物である。世界的に最も大きい栄養繁殖作物であることに加えて、ジャガイモ塊茎は、限定された土地に対する増大する圧力および食品の増大する需要がある世界の地域において主要産物になって来ている。なぜなら、この植物は短期栽培作物であり、長い期間貯蔵され得、最小限の投入を必要とするからである。それは広範囲の気候において生育するので、塊茎ジャガイモは、天然の代謝物を生産するための貯蔵庫として使用されるべき優良な植物候補を代表する。それゆえに、クロシンを有するジャガイモ塊茎は強度の黄色を呈し、抗酸化活性を増大させる。
【0015】
本開示において示される通り、トマト果実およびジャガイモ塊茎は、サフランの特徴的なアポカロテノイドの生産のための良いプラットフォームであることが明らかにされている。成熟するトマト果実では、カロテノイド経路は高度に活性であり、この理由から、トマト果実は、以前より、異なる外来のカロテノイド化合物、例えばケトカロテノイドを生産するために使用されている。ケトカロテノイドの生合成には細胞の単一の細胞内の場所のプラスチドが関わったが、クロシンおよびピクロクロシンの経路はより難題である。なぜなら、それはクロシンが蓄積する２つの主な区画のプラスチド（発生源）および液胞（吸い込み口）の関与を必要とするからである。中心液胞は親水性の二次代謝物の貯蔵区画として機能し、莫大な量の代謝物の蓄積を可能にし、それゆえに、対象の極性の二次代謝物の蓄積のための魅力的な区画を提供する。トマトにおける他の代謝物、例えばケトカロテノイド（３ｍｇ／ｇＤＷ）（Nogueira, M. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2017, 114, 10876－10881）、アントシアニン（５ｍｇ／ｇＤＷ）（Butelli, E. et al. Nature Biotechnology. 2008, 26, 1301－1308）、レスベラトロール（５～６ｍｇ／ｇＤＷ）（Zhang, Y. et al. Nature Communications. 2015, 6, 8635）、およびベタシアニン（５０ｍｇ／Ｌ）（Polturak, G. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017, 114, 9062－9067）のトマトジュースにおける生産との我々のデータの比較は、対象の化合物について良い収量を有するトマト果実の経済的に重要な代謝経路を操作することのフィジビリティを実証している。これらのトマト果実において生産されるサフランアポカロテノイドは、概算の１５０倍のコスト節約を提供し得るということが推算された。なぜなら、３２米ドル前後という１キログラムのサフランアポカロテノイドを含有するトマト材料の生産コストを前提とすると、現在、サフランスパイスの生産コストはキログラムあたり３，０００～６，０００米ドルの範囲であるからである。
【0016】
ジャガイモ塊茎における対象の他の代謝物の生産と、本文書において示されるデータの比較は、このアポカロテノイド代謝工学の首尾良い成果を明らかにした。実際に、β－ケトラーゼをコードする藻類ｂｋｔ１遺伝子を発現するケトカロテノイドを蓄積するジャガイモ系統は、１４μｇ／ｇＤＷという量を示し（Morris et al. Metabolic engineering (2006) 8(3):253－63.）、トランスジェニックｃｒｔＢおよびｃｒｔＢ＋ｃｒｔＩ＋ｃｒｔＹデジレ系統の発育中のおよび成熟した塊茎は、それぞれ約１１および４７μｇ／ｇＤＷのβ－カロテンに達した（Ducreux et al. Journal of experimental botany (2005) 56(409):81－9、Diretto G et al. PLoS One (2007) 2(4):e350.、Diretto et al. Plant physiology (2010) 154(2):899－912.）。一方で、クロモプラスト分化に関わるオレンジ（Ｏｒ）遺伝子を過剰発現する塊茎は、コールドルームにおける５ヶ月の貯蔵後に最高で３０μｇ／ｇＤＷのβ－カロテンを蓄積する（Li et al. Molecular Plant (2012) 5(2):339－52）。より最近では、トランスジェニック系統におけるＣｒｔＲｂ２およびＰＳＹ２の安定した発現はトータルのカロテノイドを増大させ、約２５μｇ／ｇＤＷに達した（Pasare et al. Protoplasma (2013) 250(6):1381－92）。
【0017】
総体的に、この研究は、コンビナトリアルアプローチによる、栄養促進性の親油性のかつ希少な高価値の親水性アポカロテノイド化合物、例えばクロシン、ピコクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールの同時生産のためのバイオテクノロジーツールとして、ソラヌム属、特にトマト（ソラヌム・リコペルシカム）およびジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）からの異なる種を使用することの潜在力およびフィジビリティを実証する。これにおいては、特定のプロモーターのコントロール下でサフラン（Ｃ．サティバス）からの３つの遺伝子ＣｓＣＣＤ２Ｌ（配列番号１）、ＣｓＵＧＴ２（配列番号３）、およびＵＧＴ７０９Ｇ１（配列番号５）を発現することによって、高いレベルのこれらの価値ある代謝物が異種システムにおいて得られ、これらの３つの遺伝子が、トマトおよびジャガイモにそれらを生産するその能力を授けるのに十分であるということを示す。それゆえに、トマト、ジャガイモ、ならびにトマトに基づく産物、例えばケチャップ、トマトに基づくソース、ピザソース、トマトスープ、またはトマトジュース、およびジャガイモに基づく産物、例えばジャガイモフレーク、ポテトチップス、または馬鈴薯粉は従って、ニュートラシューティカルズおよび医薬として有用である。好ましくは、医薬は、医薬としての使用のための、より好ましくはアルツハイマー病などの神経変性疾患の防止および／または処置における使用のための薬学的組成物である。
【0018】
それゆえに、第１の態様において、本開示は、ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌ、またはその機能的に同等の配列から選択されるアポカロテノイド化合物生合成、好ましくはクロシン、クロセチン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールのための３つの蛋白質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡコンストラクト、以下では本発明のＤＮＡコンストラクトを提供し、これらは、好ましくはクロッカス属に、好ましくはクロッカス・サティバス、クロッカス・アンガスティフォリウス、クロッカス・アンシレンシス、クロッカス・クリサントゥス、クロッカス・プルケルス、クロッカス・シーベリイ、およびクロッカス・スペシオサスからなるリストから選択される種に、より好ましくはＣ．サティバスに属し、ここで、ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、配列番号６、および配列番号２からなるリストから選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から選択され、各ヌクレオチド配列は、塊茎特異的プロモーター、果実特異的プロモーター、または恒常的プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結され、ここで、ＣＣＤ２Ｌをコードするヌクレオチド配列は果実または塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結される。
【0019】
第２の態様において、本開示は、植物のアポカロテノイド化合物のレベルを増大させるための方法、以下では本発明のアポカロテノイド化合物のレベルを増大させるための方法を提供し、ここで、アポカロテノイド化合物は好ましくは植物のクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールであり、方法は、本明細書に記載されるＤＮＡコンストラクトを植物に導入および発現することを含む。
【0020】
第３の態様において、本開示は、対応する野生型植物と比較して、増大したレベルのアポカロテノイド化合物を有するトランスジェニック植物を生産するための方法、以下では本発明のトランスジェニック植物を生産するための方法を提供し、ここで、アポカロテノイド化合物は好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールであり、方法は、本明細書において開示されるＤＮＡコンストラクトを植物に導入および発現することを含む。
【0021】
第４の態様において、本開示は、本明細書において開示されるＤＮＡコンストラクトをそれらのゲノム上に含むトランスジェニック植物、以下では本発明のトランスジェニック植物を提供し、ここで、植物は、対応する野生型植物と比較して、増大したレベルのアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールを蓄積する。
【0022】
第５の態様において、本開示は、本発明のトランスジェニック植物の種子、果実、塊茎、子孫、および交配種、以下では本発明の種子、果実、塊茎、子孫、および交配種を提供する。
【0023】
第６の態様において、本開示は、本発明のアポカロテノイドのレベルを増大させるための方法によって調製される食品産物を提供し、食品産物は、増強されたアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールレベルを有する。
【0024】
第７の態様において、本開示は、本発明の食品産物、その断片または抽出物と、薬学的なまたはニュートラシューティカルズ的な許容される担体とを含む薬学的またはニュートラシューティカルズ的組成物を提供する。
【0025】
第８の態様において、本開示は、薬としての使用のための本発明の薬学的組成物を提供する。
【0026】
第９の態様において、本開示は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の防止および／または処置のための薬としての使用のための本発明の薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
本明細書を完結させるために、かつ本発明のより良い理解を可能にするために、図面のセットが提供される。上記の図面は本明細書の不可欠な部分を形成し、本明細書において開示される態様および実施形態を例示する。これらは本発明の範囲を制限するのではなく、単にいかに本発明が実施され得るかの例として解釈されるべきである。図面は次の図を含む。
【図1A】トマト植物を形質転換するために使用された４つのコンストラクト Ａ）Ｏ１（ｐＤＧＢ３α１［ｐ３５ＳＵＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐ３５ＳＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８ＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］）（配列番号２１）の模式図である。
【図1B】トマト植物を形質転換するために使用された４つのコンストラクト Ｂ）Ｏ２（ｐＤＧＢ３α１［ｐ２Ａ１１ＳＵＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐ３５ＳＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８ＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］）（配列番号２２）の模式図である。
【図1C】トマト植物を形質転換するために使用された４つのコンストラクト Ｃ）Ｏ３（ｐＤＧＢ３α１：［ｐ３５ＳＵＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐ３５ＳＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐ３５ＳＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］）（配列番号２３）の模式図である。
【図1D】トマト植物を形質転換するために使用された４つのコンストラクト Ｄ）Ｏ４（ｐＤＧＢ３α１［ｐＥ８ＵＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐ３５ＳＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐ２Ａ１１ＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］）（配列番号２４）の模式図である。
【図1E】ジャガイモ植物を形質転換するために使用された１つのコンストラクト Ｅ）Ｏ６（ｐＤＧＢ３α２［ｐＰａｔａｔｉｎＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔａｔｉｎＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔａｔｉｎＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］）（配列番号３４）の模式図である。
【図2】ＣｓＣＣＤ２Ｌ、ＣｓＵＧＴ２、およびＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１遺伝子の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。Ａ）野生型（ＷＴ）およびトランスジェニックトマトの熟した果実（Ｏ３－２Ｂ、Ｏ１－１１Ａ、Ｏ４－１２、およびＯ２－２Ｂ）におけるトランスジーン、ならびにＢ）野生型（ＷＴ－ｃｖ．デジレおよびＯＩＨ１５ＷＴ）およびジャガイモ塊茎（Ｏ６－５ＣおよびＯＩＨ１５ＷＴ－Ｏ６）におけるトランスジーン。ＲＴ－ｑＰＣＲによって得られた。これのＢ部分では、元のデータの拡大を示す挿入図が包含されている。
【図3A】Ｏ３プラスミドによって操作されたトランスジェニック系統の熟した果実および花の表現型を示す写真である。（Ａ）および（Ｂ）それぞれ外側および内側の、Ｏ３プラスミドを有する果実の見た目。（Ｃ）それぞれＯ３およびＯ１プラスミドによって形質転換されたトランスジェニック系統の花。（Ｄ）Ｏ３およびＯ１トランスジェニック系統の解剖された葯。Ｏ１プラスミド：３５ＳＵＧＴ２－３５ＳＵＧＴ７０９Ｇ１－Ｅ８ＣＣＤ２Ｌ（配列番号２１）およびＯ３プラスミド：３５ＳＵＧＴ２－３５ＳＵＧＴ７０９Ｇ１－３５ＳＣＣＤ２Ｌ（配列番号２３）。ＷＴおよびＯ１果実の表現型は図４に示されている。
【図3B】Ｏ３プラスミドによって操作されたトランスジェニック系統の熟した果実および花の表現型を示す写真である。（Ｅ）Ｏ６プラスミドによって操作されたジャガイモＷＴおよびトランスジェニック系統。
【図4】Ｏ１（配列番号２１）、Ｏ２（配列番号２２）、およびＯ４（配列番号２４）コンストラクトを持つＷＴおよびトランスジェニックの熟したトマトの表現型を示す写真である。
【図5】フリーラジカルスカベンジング（ＦＲＳ）活性のパーセンテージとして測定された果実の抗酸化活性が分析された棒グラフである。１．１－ジフェニル－２－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）のスカベンジングによるＷＴおよびトマトトランスジェニック系統からの熟したトマト果実の親油性の抗酸化活性の分析。結果はＷＴおよびトランスジェニックトマト系統の抽出物についてラジカルスカベンジング能のパーセンテージとして提示されている。値は３つのレプリケートの平均である。
【図6】ＷＴおよびトランスジェニック果実（Ｏ２－２、Ｏ１－１１Ａ、Ｏ３－２、およびＯ４－１２）におけるアブシジン酸（ＡＢＡ）代謝物の相対的なレベルを示す棒グラフである。
【図7】ＷＴおよび選択されたトランスジェニック系統（Ｏ２－Ｂ、Ｏ４－１２、およびＯ１－１１Ａ）の果実および漿液ジュースのクロシンおよびピクロクロシン分析。ＷＴおよびトランスジェニック系統からの漿液ジュースの４４０ｎｍにおける代表的なクロマトグラムである。挿入図：ＷＴおよびＯ１－１１Ａトランスジェニック漿液ジュースの２Ｄクロマトグラムプロット。
【図8A】熟したＷＴおよびトランスジェニックトマト系統の漿液ジュースの分析。Ａ．トランスジェニック果実におけるクロシン蓄積は橙色の着色をトマト果実の内側に授けるということを示す写真である。
【図8B】熟したＷＴおよびトランスジェニックトマト系統の漿液ジュースの分析。Ｂ．フラボノイドの検出のための２５４ｎｍにおける漿液ジュースの代表的なＨＰＬＣ－ＤＡＤクロマトグラムである。
【図8C】熟したＷＴおよびトランスジェニックトマト系統の漿液ジュースの分析。Ｃ．フェノール系化合物の検出のための３３０ｎｍにおける漿液ジュースの代表的なＨＰＬＣ－ＤＡＤクロマトグラムである。
【図9】インタクトな乾燥または粉末トマトの熟した果実およびサフラン柱頭を使用する色素拡散実験。Ａ、Ｂ、およびＣ．異なる時点の水中のクロシン検出のための４４０ｎｍにおいて示されたＨＰＬＣ－ＤＡＤクロマトグラムである。
【図10】野生型（対照）およびトランスジェニックトマトの異なる抽出物によるＣ．エレガンスＣＬ４１７６において誘導された麻痺に対する効果を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0028】
次の定義および方法は、本発明をより良く定義するためにかつ本発明の実施において当業者を案内するために提供される。別様に注記されない限り、用語は当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。そのように定義された各態様は、明確に反対に示されない限り、いずれかの他の態様（単数または複数）と組み合わせられ得る。具体的には、好ましいまたは有利として示されるいずれかの特徴は、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれかの他の特徴（単数または複数）と組み合わせられ得る。
【0029】
本発明の実施は、別様に示されない限り、植物学、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、および組み換えＤＮＡテクノロジー、バイオインフォマティクスの従来の技術を採用するであろう。これらは当分野の技術水準の内である。かかる技術は文献中に詳しく説明されている。
【0030】
本明細書において使用される言葉「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、天然に存在する、変異した、合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、およびヌクレオチドアナログを使用して作出されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを包含するように意図される。それは一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸またはポリヌクレオチドは、構造遺伝子のコード配列、アンチセンス配列、およびｍＲＮＡまたは蛋白質産物をコードしない非コード制御配列を包含するが、これらに限定されない。これらの用語は遺伝子をもまた包摂する。用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、生物学的機能に関連するＤＮＡ核酸を言うために幅広く使用される。それゆえに、遺伝子は、ゲノム配列のようにイントロンおよびエキソンを包含し得るか、またはｃＤＮＡのようにコード配列のみを含み得、および／または制御配列との組み合わせでｃＤＮＡを包含し得る。１つの実施形態においては、ｃＤＮＡが好ましい。それゆえに、核酸を使用する本明細書に記載される態様の全てにおいては、別様に規定されない限り、ｃＤＮＡが使用され得る。
【0031】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「蛋白質」は、本明細書においては交換可能に使用され、ペプチド結合によって一緒に連結されたいずれかの長さのポリマー形態のアミノ酸を言う。
【0032】
用語「ＤＮＡコンストラクト」は、周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して機能的に作動的な様式で連結されている１つ以上のトランスジーンＤＮＡ配列を含む、植物ゲノムインテグレーションができる天然においては正常では関連しないＤＮＡ分子（単数または複数）を言う。「複数」のＤＮＡコンストラクトは２つ以上を言う。本発明は、色々なレベルのアポカロテノイド、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＣＣ、およびサフラナールが本発明のトランスジェニック植物において発見されるという予期せぬ発見に基づく。
【0033】
「プロモーター」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（または蛋白質コード領域）の翻訳開始コドンの上流にまたは５’に所在し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび他の蛋白質（トランス作用転写因子）の認識および結合に関わる核酸配列を言う。「恒常的プロモーター」は、植物発生の間に植物のほとんどのまたは全ての組織において機能的である。組織、器官、または細胞特異的なプロモーターは、それぞれ特定の組織、器官、または細胞型においてのみまたは優位に発現される。それゆえに、「果実プロモーター」は果実細胞において機能的である自然のまたは非自然のプロモーターであり、「塊茎プロモーター」は塊茎細胞において機能的である自然のまたは非自然のプロモーターである。所与の組織、器官、または細胞型において「特異的に」発現されるよりもむしろ、プロモーターは、植物の他の部分と比較して、植物の１つの部分（例えば細胞型、組織、または器官）において「増強された」発現、すなわちより高いレベルの発現を呈し得る。
【0034】
「１つ以上のプロモーターに作動可能に連結される」は、遺伝子またはＤＮＡ配列が、その機能を保証するようなやり方でプロモーターに対して位置付けられるかまたは接続されるということを意味する。プロモーターはＤＮＡが転写されることを可能にするのに十分ないずれかの配列である。遺伝子およびプロモーター配列が繋がれた後に、プロモーターの活性化によって、遺伝子は発現されるであろう。
【0035】
「異種」配列は、外来性の発生源もしくは種に起源を発するか、または同じ発生源からである場合にはその元の形態から改変されている配列を言う。
【0036】
「組み換え」核酸は、２つ以上のさもなければ分離された配列セグメントの人工的組み合わせによって、例えば、化学合成によってまたは遺伝子工学技術による単離された核酸セグメントの操作によって作られる。核酸操作のための技術は当分野において周知である。
【0037】
用語「形質転換された」、「トランスフェクションされた」、または「トランスジェニック」は、組み換えコンストラクトなどの外来性の核酸が導入された細胞、組織、器官、または生物を言う。好ましくは、導入された核酸はレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡ上にインテグレーションされ、その結果、導入された核酸はその後の子孫に受け継がれる。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物は、細胞または生物の子孫、および交配における親としてかかる「トランスジェニック」植物を採用する育種プログラムから生じ、かつ組み換えコンストラクトまたはコンストラクトの存在からもたらされる変調した表現型を見せる子孫をもまた包含する。
【0038】
ある種の実施形態において、本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、それゆえに、上の通り、本発明の方法に使用される核酸は上記の植物のゲノム上のそれらの天然の座位にはなく、核酸は同種的にまたは異種的に発現されることが可能であるということを意味すると理解される。それゆえに、植物はトランスジーンを発現する。トランスジェニックは、好ましくは、ゲノム上の非天然の座位における本発明に従う核酸の発現、すなわち核酸の同種または好ましくは異種発現が生起するということを意味すると理解される。本発明に従うと、トランスジーンは植物に安定してインテグレーションされ、植物は好ましくはトランスジーンについてホモ接合である。
【0039】
本発明のトランスジェニック植物は天然に存在しない。本明細書において使用される用語「天然に存在しない」は、植物を参照して使用されるときには、人によって遺伝子改変された種子植物を意味する。本発明のトランスジェニック植物は、例えば、外因性の核酸分子、例えば異種ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌ遺伝子産物をコードする核酸分子を含み、従って、人によって遺伝子改変された天然に存在しない植物である。
【0040】
本発明の態様には組み換えＤＮＡテクノロジーが関わり、好ましい実施形態においては、従来の育種方法によって植物を作出することに専ら基づく実施形態を除外する。
【0041】
驚くべきことに、本発明者は、ナス科植物、好ましくはトマトおよびジャガイモ植物におけるクロッカスのファミリーに属する、好ましくはＣ．サティバスからのＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌ蛋白質の異種発現が、上記のトランスジェニック植物の果実および塊茎における高いレベルのクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールの増大した生合成および蓄積に至るということを実証した。
【0042】
それゆえに、第１の態様において、本開示は、アポカロテノイド化合物生合成のための３つの蛋白質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む核酸またはＤＮＡコンストラクトに関し、ここで、蛋白質はＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌ、またはその機能的に同等の配列であり、これらは好ましくはクロッカスＬ属に属し、
ここで、ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、配列番号６、および配列番号２からなるリストから選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から選択され、
各ヌクレオチド配列は、果実もしくは塊茎特異的プロモーターおよび／または恒常的プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結される。
ここで、ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、配列番号６、および配列番号２からなるリストから選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から選択され、
各ヌクレオチド配列は、果実もしくは塊茎特異的プロモーターおよび／または恒常的プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結される。
【0043】
本発明のＤＮＡコンストラクトの好ましい実施形態において、ＣＣＤ２Ｌをコードするヌクレオチド配列は果実または塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結される。
【0044】
クロッカスＬ．属（アヤメ科）は、中欧および南東欧に、中欧からトルコ、北アフリカまで、および南西アジアから中国西部まで分布する多年生草本および地中植物の８８よりも多くの異なる種を含む。「クロッカスＬ．」によって、それは、アヤメ科に属し、かつ球茎と呼ばれる地下貯留器官を提示することを特徴とする草本の多年生および地中植物の属と理解される。限定ではなく例示として、本発明の範囲内で使用されるクロッカスＬ．の種、亜種、および／または変種の例は、Ｃ．サティバス、Ｃ．アンシレンシス、Ｃ．キャンセラタス、Ｃ．カルペタヌス、Ｃ．クリサントゥス、Ｃ．ネバデンシス、Ｃ．セロティヌス、Ｃ．セロティヌスｓｓｐ．サルツマニイ、Ｃ．バーナスｖａｒ．「フラワーレコード」、Ｃ．バーナスｖａｒ．「ギールイエロー」、Ｃ．バーナス「ジャンヌダルク」、Ｃ．ベルシコロール、Ｃ．スペシオサス、Ｃ．スペシオサス「アルブス」、Ｃ．スペシオサス「アイチンソニイ」、Ｃ．アンガスティフォリウス、Ｃ．ダルマティカス、Ｃ．プルケルス、Ｃ．コルシカス、Ｃ．コツキアヌス、Ｃ．コツキアヌス「アルブス」、Ｃ．カートライティアヌス、Ｃ．ラエヴィガトゥス「フォンテナイイ」、およびＣ．リグスティカスである。
【0045】
好ましい実施形態において、ＵＧＴ２、ＣＣＤ２Ｌ、およびＵＧＴ７０９Ｇ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列はＣ．サティバスに属する。
【0046】
カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ２Ｌとしてもまた公知の「ＣＣＤ２Ｌポリペプチド」は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ、ＫＰ８８７１１０．１）のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ、ＡＬＭ２３５４７．１）のアミノ酸配列を有し、クロッカス・サティバスに属する。好ましい実施形態において、ＣＣＤ２Ｌポリペプチドは、配列番号２の配列との少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。同じ意味で、ＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列は、配列番号１の配列と少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0047】
クロセチングルコシルトランスフェラーゼ２としてもまた公知の「ＵＧＴ２ポリペプチド」は、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ、ＡＹ２６２０３７．１）のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ、ＡＡＰ９４８７８．１）のアミノ酸配列を有し、クロッカス・サティバスに属する。好ましい実施形態において、ＵＧＴ２ポリペプチドは、配列番号４の配列との少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。同じ意味で、ＵＧＴ２ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列と少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0048】
「ＵＧＴ７０９Ｇ１ポリペプチド」は、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ、ＫＸ３８５１８６．１）のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ、ＡＰＵ５４６７７．１）のアミノ酸配列を有し、クロッカス・サティバスに属する。好ましい実施形態において、ＵＧＴ７０９Ｇ１ポリペプチドは、配列番号６の配列との少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。同じ意味で、ＵＧＴ７０９Ｇ１ヌクレオチド配列は、配列番号５の配列との少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0049】
推定上の配列（単数または複数）のヌクレオチド配列（単数または複数）と配列番号１から６で定められる配列との間の対応は、当分野において公知の方法によって決定され得る。配列比較方法は従来技術において公知であり、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＦＡＳＴＡを包含するが、これらに限定されない（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403－410 (1999)）。
【0050】
本明細書において使用される用語「相同性」は、共通の進化上の祖先を原因とする２つの構造間の類似性を、より具体的には、それぞれパーセントのヌクレオチドまたはアミノ酸の位置の同一性、すなわち配列類似性または同一性に換算した２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の類似性を言う。相同性は、異なる核酸または蛋白質間の類似の機能的特性の概念をもまた言う。
【0051】
本明細書において使用される用語「同一性」は、比較される２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合を言う。配列比較方法は従来技術において公知であり、ＧＡＰを包含するＧＡＧプログラム（Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984)）、遺伝学コンピュータグループ（Genetics Computer Group）、ウィスコンシン大学、マディソン（ＷI）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、またはＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403－410 (1999)）を包含するが、これらに限定されない。
【0052】
本明細書において使用される用語「機能的な同等の配列」は、例えば配列番号１から６または本明細書において述べられるいずれかの配列を参照して、全長の非バリアント配列の生物学的な機能を保持するバリアント遺伝子もしくはペプチド／蛋白質配列または遺伝子もしくはペプチド／蛋白質配列の部分を言う。機能的な同等の配列は、例えば保存されていない残基における、もたらされる蛋白質の機能に影響しない配列の変調を有するペプチドをコードする対象の遺伝子のバリアントをもまた含む。また、本明細書において示される野生型配列と実質的に同一であり、すなわち例えば保存されていない残基におけるいくつかの配列変動のみを有し、かつ生物学的に活性であるバリアントが包摂される。この意味で、配列番号１から６を参照して機能的な同等の配列は、アポカロテノイド化合物生合成をコードし、かつ本発明の配列番号１から６から選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、Ｃ．サティバスとは異なる種、例えば、例えばＣ．アンガスティフォリウス、Ｃ．アンシレンシス、Ｃ．クリサントゥス、Ｃ．プルケルス、Ｃ．シーベリイ、およびＣ．スペシオサスに属するバリアント遺伝子を言う。
【0053】
それゆえに、当業者が了解するように、方法および使用を包含する本発明の態様は、本明細書に記載される核酸またはペプチドのみならず、もたらされる蛋白質の生物学的な活性および機能に影響しないそれらの機能的なバリアントまたはホモログをもまた包摂するということが理解される。所与の部位における異なるアミノ酸の生産をもたらし、しかしながらコードされるポリペプチドの機能的特性には影響しない核酸配列の変調は、当分野において周知である。例えば、疎水性アミノ酸のアミノ酸アラニンのコドンが、グリシンなどの別のより疎水性でない残基、またはバリン、ロイシン、もしくはイソロイシンなどのより疎水性の残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負荷電残基と別のもの、例えばアスパラギン酸とグルタミン酸、または１つの正荷電残基と別のもの、例えばリジンとアルギニンの置換をもたらす変化もまた、機能的に同等の産物を生じ得る。提案される改変のそれぞれは、コードされる産物の生物学的な活性の保持の決定のように、十分に当分野の定型的な技術水準内である。
【0054】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、好ましくは合成されるアポカロテノイド化合物は、とりわけクロシン、クロセチン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールからなるリストから選択される。
【0055】
本発明のＤＮＡコンストラクトの他の好ましい実施形態において、ＣＣＤ２Ｌポリペプチド（配列番号２）は、配列番号１の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0056】
本発明のＤＮＡコンストラクトの他の好ましい実施形態において、ＵＧＴ２ポリペプチド（配列番号４）は、配列番号３の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0057】
本発明のＤＮＡコンストラクトの他の好ましい実施形態において、ＵＧＴ７０９Ｇ１ポリペプチド（配列番号６）は、配列番号５の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらにより好ましくは９９％を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0058】
本発明のＤＮＡコンストラクトの他の好ましい実施形態において、果実特異的プロモーターは、トマトＥ８プロモーター（配列番号７）およびｐ２Ａ１１（配列番号８）ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択される。本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、塊茎特異的プロモーターはパタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）である。本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、恒常的プロモーターはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号９）である。
【0059】
好ましくは、本発明に従うＤＮＡコンストラクトは、ベクター、最も好適には、適当なホスト（植物）細胞における発現に適合した発現ベクター上に含まれる。導入されたＤＮＡ配列を含む植物を生産することができるいずれかのベクターが十分であろうということは了解されるであろう。好適なベクターは当業者に周知であり、一般的な技術リファレンス、例えばPouwels et al, Cloning Vectors. A laboratory manual, Elsevier, Amsterdam (1986)に記載されている。
【0060】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、コンストラクトは、好ましくはｐＥ８である果実プロモーターに作動可能に連結されたＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列、好ましくはｐ３５である恒常的プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ２ヌクレオチド配列、および好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ７０９１ヌクレオチド配列を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトのより好ましい実施形態において、コンストラクトは配列番号２１を含み、本開示ではＯ１と名付けられる。
【0061】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、コンストラクトは、好ましくはｐＥ８である果実プロモーターに作動可能に連結されたＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列、好ましくはｐ２Ａ１１である果実プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ２ヌクレオチド配列、および好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ７０９１ヌクレオチド配列を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトのより好ましい実施形態において、コンストラクトは配列番号２２を含み、本開示ではＯ２と名付けられる。
【0062】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、コンストラクトは、好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結されたＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列、好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ２ヌクレオチド配列を含み、ＵＧＴ７０９１ヌクレオチド配列もまた好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結される。本発明のＤＮＡコンストラクトのより好ましい実施形態において、コンストラクトは配列番号２３を含み、本開示ではＯ３と名付けられる。
【0063】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、コンストラクトは、好ましくはｐＥ８である果実プロモーターに作動可能に連結されたＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列、好ましくはｐＥ８である果実プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ２ヌクレオチド配列を含み、ＵＧＴ７０９１ヌクレオチド配列は好ましくはｐ３５Ｓである恒常的プロモーターに作動可能に連結される。本発明のＤＮＡコンストラクトのより好ましい実施形態において、コンストラクトは配列番号２４を含み、本開示ではＯ４と名付けられる。
【0064】
本発明のＤＮＡコンストラクトの別の好ましい実施形態において、コンストラクトは、好ましくはｐＰａｔである塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣＣＤ２Ｌヌクレオチド配列、好ましくはｐＰａｔである塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結されたＵＧＴ２ヌクレオチド配列を含み、ＵＧＴ７０９１ヌクレオチド配列もまた好ましくはｐＰａｔである塊茎特異的プロモーターに作動可能に連結される。本発明のＤＮＡコンストラクトのより好ましい実施形態において、コンストラクトは配列番号３４を含み、本開示ではＯ６と名付けられる。
【0065】
別の態様において、本開示は、本発明のＤＮＡコンストラクトを含まない野生型植物に対して、植物におけるアポカロテノイド化合物のレベルを増大させるための上に記載されたＤＮＡコンストラクトの使用にもまた関する。
【0066】
用語「増大させる」、「改善する」、または「増強する」は本明細書においては交換可能に使用され、それらは、例えば、対照または野生型植物と比較して、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはこれより多く、例えば少なくとも１５％もしくは２０％、または２５％、３０％、３５％、４０％、もしくは５０％の増大を言う。
【0067】
別の態様において、本開示は、植物においてアポカロテノイド化合物のレベルを増大させるための方法にもまた関し、方法は、本発明のＤＮＡコンストラクトを植物に導入および発現することを含む。
【0068】
本発明のアポカロテノイドのレベルを増大させるための方法の好ましい実施形態において、それは、アポカロテノイドはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールからなるリストから選択されるということを特徴とする。
【0069】
本発明のアポカロテノイドのレベルを増大させるための方法の別の好ましい実施形態において、それは、植物がソラヌム属に属し、好ましくは、トマト、ジャガイモ、ペチュニア、ナス、タバコ、および胡椒、より好ましくはトマト、ジャガイモ、およびペチュニア、さらにより好ましくはトマト（ソラヌム・リコペルシカム）およびジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）からなる群から選択されるということを特徴とする。
【0070】
本発明のアポカロテノイドのレベルを増大させるための方法のより好ましい実施形態において、それは、上記の植物のアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールが、トランスジェニック植物の収穫可能部分において、好ましくはそれらの塊茎、果実、および種子において増大するということを特徴とする。
【0071】
別の態様において、本開示は、対応する野生型植物と比較して増大したレベルのアポカロテノイド化合物を有するトランスジェニック植物を生産するための方法にもまた関し、方法は、本発明のＤＮＡコンストラクトを導入および発現することを含む。
【0072】
本発明のトランスジェニック植物を生産するための方法の１つの実施形態において、上記の植物は、上述の通り、ソラヌム属に属し、好ましくはトマト、ジャガイモ、ペチュニア、ナス、タバコ、および胡椒、より好ましくはトマト、ジャガイモ、およびペチュニア、さらにより好ましくはトマト（ソラヌム・リコペルシカム）およびジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）からなる群から選択される。
【0073】
本発明のトランスジェニック植物を生産するための方法の別の好ましい実施形態において、アポカロテノイドはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールからなるリストから選択される。より好ましい実施形態において、上記のアポカロテノイドは、トランスジェニック植物の収穫可能部分において、好ましくはそれらの果実、塊茎、および種子において増大する。
【0074】
本発明に従うＤＮＡコンストラクトをホスト細胞に導入するための形質転換技術は当分野において周知であり、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコールを使用すること、エレクトロポレーション、または高速度弾道学的透過などの方法を包含する。本発明に従う使用のための好ましい方法は、アグロバクテリウムによって媒介される形質転換に依拠する。
【0075】
本発明の方法は、任意に、上の通りＤＮＡコンストラクトを含み、対照または野生型植物と比較して増大したアポカロテノイド化合物を有するものを、植物からスクリーニングおよび選択するステップをもまた含み得る。好ましくは、本明細書に記載される方法に従うと、子孫の植物は安定して形質転換され、植物細胞中に維持されるＤＮＡの断片として遺伝可能である外因性のポリヌクレオチドを含み、方法は、コンストラクトが安定してインテグレーションされているということを検証するためのステップを包含し得る。方法は、植物からまたはそれらの選択された子孫から収穫可能部分を収集する追加のステップをもまた含み得る。
【0076】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法によって得られるかまたは得られ得る植物にもまた関した。
【0077】
別の態様において、本開示は、トランスジェニック植物にもまた関し、これは本明細書において開示されるＤＮＡコンストラクトをそのゲノム上に含み、ここで、上記の植物は、対応する野生型植物と比較して増大したレベルのアポカロテノイド化合物、好ましくはクロシン、ピクロクロシン、ＨＴＴＣ、およびサフラナールを蓄積する。
【0078】
好ましい実施形態において、ソラヌム属に属する本発明のトランスジェニック植物は、好ましくはトマト、ジャガイモ、ペチュニア、ナス、タバコ、および胡椒、より好ましくはトマト、ジャガイモ、およびペチュニア、より好ましくはトマト（ソラヌム・リコペルシカム）およびジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）からなる群から選択される。
【0079】
好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック植物、それは、増大したレベルのアポカロテノイドがトランスジェニック植物の収穫可能部分に、好ましくは果実、塊茎、および種子にあるということを特徴とする。
【0080】
本明細書に記載される本発明の種々の態様は、別様に規定されない限り、本明細書に記載される方法のいずれかによって生産されるか、得られるか、または得られ得るいずれかの植物細胞またはいずれかの植物に、ならびにそれらの全ての植物部分および散布体に明確に拡張される。本発明は、前述の方法のいずれかによって生産された一次形質転換またはトランスフェクション細胞、組織、器官、または全植物体の子孫を包摂するようにさらに拡張され、唯一の要件は、子孫が、本発明に従う方法において親によって生ずるものと同じ遺伝子型および／または表現型特徴（単数または複数）を見せるということである。
【0081】
本開示は、食品産物または薬学的組成物の調製における本発明に従うトランスジェニック植物またはそれらの所望の部分の使用にもまた関する。
【0082】
別の態様において、本開示は、上に記載されたトランスジェニック植物の収穫可能部分、またはそれらに由来する産物にもまた関した。
【0083】
好ましい実施形態において、トランスジェニック植物の収穫可能部分は種子、葉、果実、花、茎、根、根茎、塊茎、および球根から選択される。より好ましくは、収穫可能部分は種子、塊茎、および果実から選択され、それらは、野生型植物の収穫可能部分と比較して増大したレベルの、本明細書において開示されるアポカロテノイドを有することを特徴とする。
【0084】
本開示は、本発明のトランスジェニック植物の収穫可能部分に由来する、好ましくはかかる植物の収穫可能部分に直接的に由来する産物、例えば乾燥ペレットまたは粉末、油、脂肪および脂肪酸、ファイバーまたは蛋白質にもまた関する。
【0085】
本開示は、好ましくは本発明のトランスジェニック植物の収穫可能部分、より好ましくは塊茎、果実、および／または種子を含む食品産物および食品サプリメントにもまた関する。食品産物および食品サプリメントは、対照または野生型植物の収穫可能部分を含む食品産物または食品サプリメントと比較して、本明細書において開示される増大したアポカロテノイド化合物を有する。
【0086】
好ましい実施形態において、食品産物または食品サプリメントは好ましくはトマト、ジャガイモ、トマトに基づく産物、およびジャガイモに基づく産物である。より好ましい実施形態において、トマトに基づく産物はとりわけケチャップ、トマトに基づくソース、ピザソース、トマトスープ、またはトマトジュースからなるリストから選択され、ジャガイモに基づく産物はとりわけポテトチップス、ジャガイモフレーク、または馬鈴薯粉からなるリストから選択される。
【0087】
別の態様において、本開示は、本明細書において開示される食品産物、その断片または抽出物と、ニュートラシューティカルズ的な許容される担体とを含むニュートラシューティカルズ的組成物にもまた関する。
【0088】
本明細書において使用される「ニュートラシューティカルズ的組成物」は、植物材料から単離または精製され、かつ通常は食品に関連しないフォーマットで一般的に提供される産物を言う。ニュートラシューティカルズ的組成物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患に対する保護のための実証可能な生理学的なベネフィットを有する。
【0089】
本明細書において使用される「ニュートラシューティカルズ的な担体」は、生体適合性でありかつニュートラシューティカルズ的に許容される好適な基剤を言い、消費に好適である１つ以上の固体、半固体、または液体の希釈剤、賦形剤、香味料、またはカプセル化物質を含み得る。
【0090】
別の態様において、本開示は、有効量の本明細書において開示される食品産物、その断片または抽出物と、薬学的な許容される担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物にもまた関する。
【0091】
本明細書において使用される「有効量」は、哺乳動物、好ましくは人間に投与されるときに、哺乳動物、好ましくは人間における対象の疾患または病理学的状態の下で定義される防止および／または処置を生ずるのに十分である所与の化合物の量を言う。治療上有効量は、例えば、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食生活、投与のモードおよび時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、具体的な障害または病理学的状態の重症度、ならびに治療を経過する対象者に従って変動するであろうが、当業者によって当業者自身の知識に従って決定され得る。
【0092】
用語「賦形剤」は、本発明の産物の構成成分のいずれかの吸収を助けるか、これらの構成成分を安定化するか、またはそれにコンシステンシーを与えるかもしくはそれをより快適にする香味を提供するという意味で薬学的組成物の調製を助ける物質を言う。それゆえに、この段落で述べられない他の型の賦形剤を除外することなしに、賦形剤は、澱粉、糖、またはセルロースなどの構成成分を一緒に保つ機能、甘味料機能、染料機能、例えば薬物を空気および／または湿気から隔離するための薬物保護機能、錠剤、カプセル、またはいずれかの他の剤形を充填する機能、構成成分の溶解および腸におけるそれらの吸収を容易にするための崩壊機能を有し得る。
【0093】
用語「基剤」または「担体」は好ましくは不活性の物質である。基剤の機能は、他の化合物の組み込みを容易にすること、より良い用量および投与を可能にすること、または薬学的組成物にコンシステンシーおよび形態を与えることである。よって、担体は、本発明の薬学的組成物の構成成分のいずれかを所与の体積もしくは重量まで希釈するために使用されるか、または上記の構成成分を希釈することさえなしに、より良い用量および投与を可能にすることもしくは薬にコンシステンシーおよび形態を与えることができる物質である。その基剤は薬学的に許容される。剤形が液体であるときには、薬学的に許容される担体は希釈剤である。
【0094】
加えて、賦形剤および基剤は薬理学的に許容されなければならない。つまり、賦形剤および基剤は、それが投与される生物にダメージを引き起こさないように許容され、評価される。
【0095】
本発明の薬学的組成物は別の有効物質を含み得る。治療上の効能の要件に加えて、上記の薬学的組成物が他の治療薬剤の使用を要求し得る場合、本発明の化合物と別の治療薬剤の組み合わせの使用を強制または強く推奨する追加の根本的理由があり得る。用語「有効成分」は、人間、動物、植物、化学物質、または他のその起源にかかわらず、薬を構成するための適当な活性が帰せられるいずれかの物質である。
【0096】
各ケースにおいて、医薬の剤形は使用される投与の型に適合するであろう。よって、本発明の組成物は、溶液の形態または臨床的に許可される投与のいずれかの他の形態で、かつ治療上有効量で提示され得る。本発明の薬学的組成物は、固体、半固体、液体、または気体形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射剤、吸入剤、ゲル、シロップ、ネブライザー、マイクロスフェア、またはエアロゾルに、好ましくは錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、座薬、またはシロップの形態に製剤され得る。
【0097】
上述の組成物は、従来の方法、例えば異なる国の薬局方および他の参照テキストに記載されているものを使用して調製され得る。
【0098】
本発明の化合物および組成物は、組み合わせ治療において他の医薬と一緒に使用され得る。他の薬物は、同じまたは異なる時間における投与のための同じ組成物のまたは異なる組成物の一部であり得る。
【0099】
別の態様において、本開示は、薬または医薬としての使用のための本発明の薬学的組成物にもまた関する。
【0100】
別の態様において、本開示は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、または他の形態の認知症、例えばパーキンソン病の防止および／または処置における使用のための本発明の薬学的組成物にもまた関する。
【実施例】
【0101】
次に示すものは、本発明者によって実施されたアッセイによる本発明の例であり、これらは本発明の産物の有効性を証明する。次の例は本発明を例示する役割を果たし、その範囲を限定すると見なされてはならない。
【0102】
＜材料および方法＞
［植物材料および生育条件］
トマト（Ｓ．リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー（ＭＭ））を野生型（ＷＴ）および全てのトマト植物形質転換の遺伝学的バックグラウンドとして使用した。トマト果実を熟した段階において収集し、果皮組織を種子および胎座から分離したら、細切りにし、さらなる分析まで液体窒素中で直ちに凍結した。
［植物材料および生育条件］
トマト（Ｓ．リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー（ＭＭ））を野生型（ＷＴ）および全てのトマト植物形質転換の遺伝学的バックグラウンドとして使用した。トマト果実を熟した段階において収集し、果皮組織を種子および胎座から分離したら、細切りにし、さらなる分析まで液体窒素中で直ちに凍結した。
【0103】
ジャガイモ植物（ソラヌム・ツベロスムｃｖ．デジレおよびｃｖ．ＯＩＨ１５ＷＴ）を、コンポストを含有する１０ｃｍ径ポットで種塊茎またはインビトロ繁殖した組織培養植物から生育させた。ジャガイモ植物を２０／１５℃の昼／夜温度に維持された温室で育てた。最大照度はおよそ１０５００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１であり、平均日長は１６時間であった。塊茎を、開花後だが老化前の植物から収穫した。
【0104】
［プラスミド構築］
異なるプロモーター組み合わせを有する一連のプラスミドを作製して、異種遺伝子の配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８８７１１０．１）で定められるＣｓＣＣＤ２Ｌ遺伝子配列、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ３８５１８６）で定められるＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１遺伝子配列、および配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２６２０３７．１）で定められるＣｓＵＧＴ２遺伝子配列を発現するトマトおよびジャガイモにおけるサフランアポカロテノイド経路を操作するそれらの能力を評価した。３つのプロモーターｐＥ８（配列番号７）、ｐ２Ａ１１（配列番号８）、およびｐ３５Ｓ（配列番号９）を、トマトにおいてサフラン遺伝子の発現を駆動するために、１つのプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）を、ジャガイモにおいてサフラン遺伝子の発現を駆動するために選択した（図１）。Ｇｏｌｄｅｎｂｒａｉｄ戦略に従ってプラスミドを構築した（Sarrion－Perdigones, A., et al. Methods Mol Biol. 2014, 1116, 133－151）。下の表１に列記されているプライマーを使用した。
異なるプロモーター組み合わせを有する一連のプラスミドを作製して、異種遺伝子の配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８８７１１０．１）で定められるＣｓＣＣＤ２Ｌ遺伝子配列、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ３８５１８６）で定められるＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１遺伝子配列、および配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２６２０３７．１）で定められるＣｓＵＧＴ２遺伝子配列を発現するトマトおよびジャガイモにおけるサフランアポカロテノイド経路を操作するそれらの能力を評価した。３つのプロモーターｐＥ８（配列番号７）、ｐ２Ａ１１（配列番号８）、およびｐ３５Ｓ（配列番号９）を、トマトにおいてサフラン遺伝子の発現を駆動するために、１つのプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）を、ジャガイモにおいてサフラン遺伝子の発現を駆動するために選択した（図１）。Ｇｏｌｄｅｎｂｒａｉｄ戦略に従ってプラスミドを構築した（Sarrion－Perdigones, A., et al. Methods Mol Biol. 2014, 1116, 133－151）。下の表１に列記されているプライマーを使用した。
【0105】
【表1】
【0106】
産物を、（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｂｃｌｏｎｉｎｇ．ｕｐｖ．ｅｓ、バレンシア、スペイン）から得られたレベル０ベクターｐＵＰＤ２にクローニングした。それから、もたらされたプラスミドｐＵＰＤ２－ＣｓＣＣＤ２Ｌ（配列番号１８）、ｐＵＰＤ２－ＣｓＵＧＴ２（配列番号１９）、およびｐＵＰＤ－ＣｓＵＧＴ７０９Ｇ１（配列番号２０）を使用して、次の通り、Ｇｏｌｄｅｎｂｒａｉｄモジュラークローニングシステムに従って、４つの組み換えバイナリプラスミドを構築した：
・Ｏ１（配列番号２１）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ａ）、
・Ｏ２（配列番号２２）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ２Ａ１１：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｂ）、
・Ｏ３（配列番号２３）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｃ）、および
・Ｏ４（配列番号２４）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐＥ８：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐ２Ａ１１：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｄ）。
・Ｏ６（配列番号３４）＝ｐＤＧＢ３α２［ｐＰａｔＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］（図１Ｅ）
・Ｏ１（配列番号２１）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ａ）、
・Ｏ２（配列番号２２）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ２Ａ１１：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐＥ８：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｂ）、
・Ｏ３（配列番号２３）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｃ）、および
・Ｏ４（配列番号２４）＝ｐＤＧＢ３α１［ｐＥ８：ＵＧＴ２：Ｔ３５Ｓ－ｐ３５Ｓ：ＵＧＴ７０９Ｇ１：Ｔ３５Ｓ－ｐ２Ａ１１：ＣＣＤ２Ｌ：Ｔ３５Ｓ－ｐＮｏｓ：Ｈｙｇ：Ｔ３５Ｓ］（図１Ｄ）。
・Ｏ６（配列番号３４）＝ｐＤＧＢ３α２［ｐＰａｔＧＴ２Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔＵＧＴ７０９Ｔ３５Ｓ－ｐＰａｔＣＣＤ２ＬＴ３５Ｓ－ｐＮｏｓ－Ｈｙｇ－Ｔ３５Ｓ］（図１Ｅ）
【0107】
［トマト形質転換］
バイナリプラスミド（Ｏ１からＯ４、それぞれ配列番号２１から２４）をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移入し、それから、先に記載された通りＳ．リコペルシカム（ｖａｒ．マネーメーカー）へのトマトの安定した形質転換に使用した（Ellul, P. et al. Theor Appl Genet. 2003, 106, 231－238）。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン選択培地上で発根するそれらの能力について選択し、ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用してさらに検証して、対応する遺伝子の存在についてチェックした（下記参照）。全てのインビトロステップは長日生育チャンバーで実施した（１６時間明／８時間暗、２４℃、６０～７０％湿度、２５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）。当たりのトランスジェニックトマト植物を土壌に移入し、温室で１４／１０時間の昼／夜光周期によって２２℃で生育させた。
バイナリプラスミド（Ｏ１からＯ４、それぞれ配列番号２１から２４）をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移入し、それから、先に記載された通りＳ．リコペルシカム（ｖａｒ．マネーメーカー）へのトマトの安定した形質転換に使用した（Ellul, P. et al. Theor Appl Genet. 2003, 106, 231－238）。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン選択培地上で発根するそれらの能力について選択し、ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用してさらに検証して、対応する遺伝子の存在についてチェックした（下記参照）。全てのインビトロステップは長日生育チャンバーで実施した（１６時間明／８時間暗、２４℃、６０～７０％湿度、２５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）。当たりのトランスジェニックトマト植物を土壌に移入し、温室で１４／１０時間の昼／夜光周期によって２２℃で生育させた。
【0108】
［ジャガイモ形質転換］
バイナリプラスミドＯ６（配列番号３４）をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移入し、先に記載された通りＳ．ツベロスムへの安定したジャガイモｃｖ．デジレおよびｃｖ．ＯＩＨ１５Ｗｔ形質転換に使用した（Tavazza et al. Plant Science 59(2): 175－181. 1989）。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン選択培地上で発根するそれらの能力について選択し、ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用してさらに検証して、対応する遺伝子の存在についてチェックした（下記参照）。全てのインビトロステップは長日生育チャンバーで実施した（１６時間明／８時間暗、２４℃、６０～７０％湿度、２５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）。当たりのトランスジェニックジャガイモ植物を土壌に移入し、温室で１４／１０時間の昼／夜光周期によって２２℃で生育させた。
バイナリプラスミドＯ６（配列番号３４）をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移入し、先に記載された通りＳ．ツベロスムへの安定したジャガイモｃｖ．デジレおよびｃｖ．ＯＩＨ１５Ｗｔ形質転換に使用した（Tavazza et al. Plant Science 59(2): 175－181. 1989）。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン選択培地上で発根するそれらの能力について選択し、ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用してさらに検証して、対応する遺伝子の存在についてチェックした（下記参照）。全てのインビトロステップは長日生育チャンバーで実施した（１６時間明／８時間暗、２４℃、６０～７０％湿度、２５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）。当たりのトランスジェニックジャガイモ植物を土壌に移入し、温室で１４／１０時間の昼／夜光周期によって２２℃で生育させた。
【0109】
［アポカロテノイドおよびカロテノイド分析］
代謝物抽出および分析は代謝物の性質に依存して異なった。極性および非極性代謝物を、それぞれ５０ｍｇおよび５ｍｇの凍結乾燥された果実／塊茎組織から抽出した。極性代謝物分析（クロシンおよびピクロクロシン）のために、組織を冷７５％メタノールによって抽出した。可溶性画分を、高速液体クロマトグラフィー－ダイオードアレイ検出器－高分解能質量分析（ＨＰＬＣ－ＤＡＤ－ＨＲＭＳ）およびＨＰＬＣ－ＤＡＤを使用して先に記載された通り分析した（Diretto, G. et al. New Phytol. 2019; 16079）。無極性画分（クロセチン、ＨＴＣＣ（４－ヒドロキシ－２，６，６－トリメチル－１－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド）、およびカロテノイド）を１：２の冷抽出溶媒（５０：５０メタノール：ＣＨＣｌ３）によって抽出し、先に記載された通りＨＰＬＣ－ＤＡＤ－ＨＲＭＳおよびＨＰＬＣ－ＤＡＤによって分析した（Diretto, G. et al. New Phytol. 2019; 16079）。
代謝物抽出および分析は代謝物の性質に依存して異なった。極性および非極性代謝物を、それぞれ５０ｍｇおよび５ｍｇの凍結乾燥された果実／塊茎組織から抽出した。極性代謝物分析（クロシンおよびピクロクロシン）のために、組織を冷７５％メタノールによって抽出した。可溶性画分を、高速液体クロマトグラフィー－ダイオードアレイ検出器－高分解能質量分析（ＨＰＬＣ－ＤＡＤ－ＨＲＭＳ）およびＨＰＬＣ－ＤＡＤを使用して先に記載された通り分析した（Diretto, G. et al. New Phytol. 2019; 16079）。無極性画分（クロセチン、ＨＴＣＣ（４－ヒドロキシ－２，６，６－トリメチル－１－シクロヘキセン－１－カルボキシアルデヒド）、およびカロテノイド）を１：２の冷抽出溶媒（５０：５０メタノール：ＣＨＣｌ３）によって抽出し、先に記載された通りＨＰＬＣ－ＤＡＤ－ＨＲＭＳおよびＨＰＬＣ－ＤＡＤによって分析した（Diretto, G. et al. New Phytol. 2019; 16079）。
【0110】
代謝物を、標準との同時移動を使用して、利用可能なときには標準のものに対して各ピークのＵＶスペクトルをマッチングすることによって、モノアイソトピック質量同定のためのＰｕｂｃｈｅｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に報告されたｍ／ｚ精密質量および文献データに基づいて、またはアダクト検出のケースではメタボロミクス・フィーン（Fiehn）ラボ質量分析アダクトカリキュレータ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｈｎｌａｂ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｓｔａｆｆ／ｋｉｎｄ／Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ／ＭＳ－Ａｄｄｕｃｔ－Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ／）を使用して、同定した。色素を、ピーク面積を積分することによって定量し、これを、標準との比較によって、かつ先に報告された通り濃度に変換した（Marti, M. et al. Metabolic Engineering. 2020, 61, 238－250）。
【0111】
［揮発成分分析］
揮発性化合物をヘッドスペース固相マイクロ抽出（ＨＳ－ＳＰＭＥ）によって捕捉し、質量分析とカップリングされたガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）によって分析した。トマト果実を赤熟段階において収集し、果皮の切片を切り出し、直ちに液体窒素中で凍結した。代謝物抽出のために、形質転換イベントを代表する３～５つの果実からの凍結されたトマト果皮切片をクライオミルで粉砕し、分析まで－８０℃で貯蔵した。一方、植物の葉群が枯れ込んだ３週後に、成熟したジャガイモを収穫し、３～５つのジャガイモからの凍結された塊茎ジャガイモ切片をクライオミルで粉砕した。揮発性化合物の分析は先に記載されたプロセスに類似して行った（Raines, C., et al. Journal of experimental botany. 2017, 68, 347－349）。大体５００ｍｇのもたらされた粉末を１５ｍＬガラスバイアルに導入し、３７℃において水浴上で１０分間インキュベーションした。それから、５００μＬの１００ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５溶液および１．１ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを追加し、穏やかに混合し、５分間ソニケーションした。これの後に、１ｍＬのもたらされたペーストをシリコン／ＰＴＦＥセプタムを有する１０ｍＬスクリューキャップヘッドスペースバイアルに移入し、１２時間以内に分析した。揮発性化合物を６５μｍのＰＤＭＳ／ＤＶＢ固相マイクロ抽出ファイバー（ＳＵＰＥＬＣＯ）によってヘッドスペースから抽出した。揮発成分抽出をＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣアナリティクス）によって自動で行った。バイアルを、まず、５００ｒｐｍにおける攪拌をしながら５０℃で１０分間インキュベーションした。それから、ファイバーを同じ温度および攪拌条件においてバイアルのヘッドスペースに２０分間露出した。脱着を、６８９０Ｎガスクロマトグラフ（アジレント・テクノロジー）のインジェクションポートにおいてスプリットレスモードを使用して、２５０℃で１分間行った。脱着後に、ファイバーを、ＳＰＭＥファイバーコンディショニングステーション（ＣＴＣアナリティクス）によって２５０℃で５分間、ヘリウム流下においてクリーニングした。クロマトグラフィーをＤＢ－５ｍｓ（６０ｍ、０．２５ｍｍ、１．００μｍ）キャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ）によってヘリウムをキャリアガスとして１．２ｍＬ／分の定常流で行った。ＧＣインターフェースおよびＭＳソース温度はそれぞれ２６０℃および２３０℃であった。オーブンプログラム条件は２分間の４０℃、２５０℃まで５℃／分のｒａｍｐ、および５分間の２５０℃における最後のホールドであった。データは、５９７５Ｂ質量分析計（アジレント・テクノロジー）によって、３５～２５０ｍ／ｚ範囲において、７０ｅＶでの電子衝撃イオン化による６．２スキャン／ｓで記録した。クロマトグラムを拡張版ケミステーションＥ．０２．０２ソフトウェア（アジレント・テクノロジー）を使用して処理した。
揮発性化合物をヘッドスペース固相マイクロ抽出（ＨＳ－ＳＰＭＥ）によって捕捉し、質量分析とカップリングされたガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）によって分析した。トマト果実を赤熟段階において収集し、果皮の切片を切り出し、直ちに液体窒素中で凍結した。代謝物抽出のために、形質転換イベントを代表する３～５つの果実からの凍結されたトマト果皮切片をクライオミルで粉砕し、分析まで－８０℃で貯蔵した。一方、植物の葉群が枯れ込んだ３週後に、成熟したジャガイモを収穫し、３～５つのジャガイモからの凍結された塊茎ジャガイモ切片をクライオミルで粉砕した。揮発性化合物の分析は先に記載されたプロセスに類似して行った（Raines, C., et al. Journal of experimental botany. 2017, 68, 347－349）。大体５００ｍｇのもたらされた粉末を１５ｍＬガラスバイアルに導入し、３７℃において水浴上で１０分間インキュベーションした。それから、５００μＬの１００ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５溶液および１．１ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを追加し、穏やかに混合し、５分間ソニケーションした。これの後に、１ｍＬのもたらされたペーストをシリコン／ＰＴＦＥセプタムを有する１０ｍＬスクリューキャップヘッドスペースバイアルに移入し、１２時間以内に分析した。揮発性化合物を６５μｍのＰＤＭＳ／ＤＶＢ固相マイクロ抽出ファイバー（ＳＵＰＥＬＣＯ）によってヘッドスペースから抽出した。揮発成分抽出をＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣアナリティクス）によって自動で行った。バイアルを、まず、５００ｒｐｍにおける攪拌をしながら５０℃で１０分間インキュベーションした。それから、ファイバーを同じ温度および攪拌条件においてバイアルのヘッドスペースに２０分間露出した。脱着を、６８９０Ｎガスクロマトグラフ（アジレント・テクノロジー）のインジェクションポートにおいてスプリットレスモードを使用して、２５０℃で１分間行った。脱着後に、ファイバーを、ＳＰＭＥファイバーコンディショニングステーション（ＣＴＣアナリティクス）によって２５０℃で５分間、ヘリウム流下においてクリーニングした。クロマトグラフィーをＤＢ－５ｍｓ（６０ｍ、０．２５ｍｍ、１．００μｍ）キャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ）によってヘリウムをキャリアガスとして１．２ｍＬ／分の定常流で行った。ＧＣインターフェースおよびＭＳソース温度はそれぞれ２６０℃および２３０℃であった。オーブンプログラム条件は２分間の４０℃、２５０℃まで５℃／分のｒａｍｐ、および５分間の２５０℃における最後のホールドであった。データは、５９７５Ｂ質量分析計（アジレント・テクノロジー）によって、３５～２５０ｍ／ｚ範囲において、７０ｅＶでの電子衝撃イオン化による６．２スキャン／ｓで記録した。クロマトグラムを拡張版ケミステーションＥ．０２．０２ソフトウェア（アジレント・テクノロジー）を使用して処理した。
【0112】
化合物の同定を、保持時間および質量スペクトルデータ両方を純粋な標準のものと比較することによって行った。標準が利用可能ではなかったときには、暫定的な同定をＮＩＳＴ０５質量スペクトルライブラリの質量スペクトル類似性に基づいて行った。
【0113】
定量化のために、１つの特定のイオンを各化合物について選択し、抽出されたイオンクロマトグラムからの対応するピークを積分した。イオン選択の基準は、最も高いシグナル対ノイズ比を有すること、およびクロマトグラムの特定の領域における良いピーク積分を提供するのに十分に特異的であることであった。混合物参照サンプルを、等量の各サンプルを一様に混合することによって各時期について調製した。混合物の５００ｍｇアリコートを、インジェクションシリーズの一部として必ず分析し（毎６から７サンプルについて１つの混合物サンプル）、正式なサンプルとして処理した。この混合物は、中間濃度で個々のサンプル中に同定された全ての化合物を含有し、時間的変動およびファイバー経時変化について正規化するための参照として使用された。最後に、サンプルについての正規化された結果（時間的変動およびファイバー経時変化について補正された）を、参照混合物中に存在するものに対する特定のサンプル中の各化合物の存在量の比として表現した。
【0114】
［高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）によるノンターゲットメタボローム分析］
２つの生物学的レプリケートおよび２つの技術的レプリケートを独立して処理および分析した。極性の代謝物では、１０ｍｇのフリーズドライされた果実粉末を、０．５ｍｇ／Ｌホルモノネチンを内部標準として０．７５ｍＬの冷７５％（ｖ／ｖ）メタノールによって抽出し、非極性の分析では、３ｍｇの粉末を、０．２５ｍＬの冷１００％（ｖ／ｖ）メタノール、１０ｍｇ／Ｌの酢酸α－トコフェロールを内部標準として１ｍＬのＣＨＣｌ３、および０．２５ｍＬの５０ｍＭトリス緩衝液（１ＭのＮａＣｌによってｐＨ７．５）によって抽出した。高分解能質量分析とカップリングされた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＨＲＭＳ）条件は先に報告された通りであった（Dono, G. et al. Metabolites. 2020, 10）。
２つの生物学的レプリケートおよび２つの技術的レプリケートを独立して処理および分析した。極性の代謝物では、１０ｍｇのフリーズドライされた果実粉末を、０．５ｍｇ／Ｌホルモノネチンを内部標準として０．７５ｍＬの冷７５％（ｖ／ｖ）メタノールによって抽出し、非極性の分析では、３ｍｇの粉末を、０．２５ｍＬの冷１００％（ｖ／ｖ）メタノール、１０ｍｇ／Ｌの酢酸α－トコフェロールを内部標準として１ｍＬのＣＨＣｌ３、および０．２５ｍＬの５０ｍＭトリス緩衝液（１ＭのＮａＣｌによってｐＨ７．５）によって抽出した。高分解能質量分析とカップリングされた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＨＲＭＳ）条件は先に報告された通りであった（Dono, G. et al. Metabolites. 2020, 10）。
【0115】
［ｍＲＮＡ発現研究］
ＲＮＡを、製造者の説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡマイクロプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって１００ｍｇの生鮮果実／塊茎から抽出した。各トランスジェニック系統および野生型からのｃＤＮＡの合成を行った。オリゴｄＴおよびＲｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｙｏｕ－Ｐｒｉｍｅファーストストランドビーズ（Ｇｅヘルスケア）を使用し、製造者の説明書に従った。それから、ｑＰＣＲを実施した。表２に列記されているプライマーおよびＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲマスターミックス（プロメガ、マディソン、ＷＩ、米国）を使用し、製造者の説明書に従った。恒常発現されるアクチン－２遺伝子転写物を参照遺伝子として使用した。方法は次の通りであった：５分間の９４℃における初期変性；３０サイクルの２０秒間の９４℃における変性、２０秒間の６０℃におけるアニーリング、および２０秒間の７２℃における伸長；ならびに５分間の７２℃における最後の伸長。アッセイはＳｔｅｐＯｎｅ（商標）サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）でされ、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアｖ２．０（アプライドバイオシステムズ）を使用して分析された。
ＲＮＡを、製造者の説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡマイクロプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって１００ｍｇの生鮮果実／塊茎から抽出した。各トランスジェニック系統および野生型からのｃＤＮＡの合成を行った。オリゴｄＴおよびＲｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｙｏｕ－Ｐｒｉｍｅファーストストランドビーズ（Ｇｅヘルスケア）を使用し、製造者の説明書に従った。それから、ｑＰＣＲを実施した。表２に列記されているプライマーおよびＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲマスターミックス（プロメガ、マディソン、ＷＩ、米国）を使用し、製造者の説明書に従った。恒常発現されるアクチン－２遺伝子転写物を参照遺伝子として使用した。方法は次の通りであった：５分間の９４℃における初期変性；３０サイクルの２０秒間の９４℃における変性、２０秒間の６０℃におけるアニーリング、および２０秒間の７２℃における伸長；ならびに５分間の７２℃における最後の伸長。アッセイはＳｔｅｐＯｎｅ（商標）サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）でされ、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアｖ２．０（アプライドバイオシステムズ）を使用して分析された。
【0116】
【表2】
【0117】
［２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルスカベンジング活性］
フリーラジカルスカベンジング（ＦＲＳ）活性を、果実／塊茎サンプル（５０ｍｇの凍結乾燥された果実／塊茎）を使用して分析した。これらはアセトンによって抽出され、０．２ｍＭメタノール性ＤＰＰＨラジカル溶液（０．５ｍＬ）と混合された。等体積（１ｍＬ）のトマト果実または塊茎抽出物およびＤＰＰＨ溶液（エタノール中に０．２ｍＭ）を混合し、暗所に室温で３０分間保った。溶液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。ＦＲＳは％＝（Ａ０－Ａ１／Ａ０）×１００によって計算した。
フリーラジカルスカベンジング（ＦＲＳ）活性を、果実／塊茎サンプル（５０ｍｇの凍結乾燥された果実／塊茎）を使用して分析した。これらはアセトンによって抽出され、０．２ｍＭメタノール性ＤＰＰＨラジカル溶液（０．５ｍＬ）と混合された。等体積（１ｍＬ）のトマト果実または塊茎抽出物およびＤＰＰＨ溶液（エタノール中に０．２ｍＭ）を混合し、暗所に室温で３０分間保った。溶液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。ＦＲＳは％＝（Ａ０－Ａ１／Ａ０）×１００によって計算した。
【0118】
［統計］
植物材料の研究のために、３から５つの生物学的レプリケートを生物学的レプリケートあたり３つの技術的レプリケートで毎実験について分析した。得られたデータは、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して一元配置分散分析およびダンカンの有意性検定によって統計分析した。有意性のレベルはｔ検定によって決定した。
植物材料の研究のために、３から５つの生物学的レプリケートを生物学的レプリケートあたり３つの技術的レプリケートで毎実験について分析した。得られたデータは、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して一元配置分散分析およびダンカンの有意性検定によって統計分析した。有意性のレベルはｔ検定によって決定した。
【0119】
＜実施例１．トマトトランスジェニック系統におけるサフランアポカロテノイド経路の異所発現のためのプラスミドの作出＞
初めに、３つの異なるプロモーターを選択し、トマトにおいてサフラン遺伝子発現について評価した（Ｓ．リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー（ＭＭ））。ｐＥ８（配列番号７）およびｐ２Ａ１１（配列番号８）はトマトからの果実特異的プロモーターであり、これらの活性は収量の犠牲なしに所望の代謝物の高いレベルの蓄積をもたらし得る。なぜなら、それらの活性化の時に、果実の結実、発育、および成熟はほとんど完結するからである。これらのプロモーターを、ＣｓＣＣＤ２Ｌ遺伝子発現ではコンストラクトＯ１（配列番号２１）（ｐＥ８）、Ｏ２（配列番号２２）（ｐＥ８）、およびＯ４（配列番号２４）（ｐ２Ａ１１）に、ＣｓＵＧＴ２発現ではコンストラクトＯ２（配列番号２２）（ｐ２Ａ１１）およびＯ４（配列番号２４）（ｐＥ８）に使用した。恒常的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（配列番号９）を使用して、コンストラクトＯ３（配列番号２３）の全ての遺伝子の、コンストラクトＯ１（配列番号２１）のＣｓＵＧＴ２およびＵＧＴ７０９Ｇ１の、コンストラクトＯ２（配列番号２２）のＵＧＴ７０９Ｇ１の、ならびにコンストラクトＯ４（配列番号２４）のＵＧＴ７０９Ｇ１の発現を駆動した。４つの異なるバイナリプラスミドＯ１（配列番号２１）、Ｏ２（配列番号２２）、Ｏ３（配列番号２３）、およびＯ４（配列番号２４）を作製し、トマト形質転換に使用した（図１Ａ～Ｄ）。
初めに、３つの異なるプロモーターを選択し、トマトにおいてサフラン遺伝子発現について評価した（Ｓ．リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー（ＭＭ））。ｐＥ８（配列番号７）およびｐ２Ａ１１（配列番号８）はトマトからの果実特異的プロモーターであり、これらの活性は収量の犠牲なしに所望の代謝物の高いレベルの蓄積をもたらし得る。なぜなら、それらの活性化の時に、果実の結実、発育、および成熟はほとんど完結するからである。これらのプロモーターを、ＣｓＣＣＤ２Ｌ遺伝子発現ではコンストラクトＯ１（配列番号２１）（ｐＥ８）、Ｏ２（配列番号２２）（ｐＥ８）、およびＯ４（配列番号２４）（ｐ２Ａ１１）に、ＣｓＵＧＴ２発現ではコンストラクトＯ２（配列番号２２）（ｐ２Ａ１１）およびＯ４（配列番号２４）（ｐＥ８）に使用した。恒常的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（配列番号９）を使用して、コンストラクトＯ３（配列番号２３）の全ての遺伝子の、コンストラクトＯ１（配列番号２１）のＣｓＵＧＴ２およびＵＧＴ７０９Ｇ１の、コンストラクトＯ２（配列番号２２）のＵＧＴ７０９Ｇ１の、ならびにコンストラクトＯ４（配列番号２４）のＵＧＴ７０９Ｇ１の発現を駆動した。４つの異なるバイナリプラスミドＯ１（配列番号２１）、Ｏ２（配列番号２２）、Ｏ３（配列番号２３）、およびＯ４（配列番号２４）を作製し、トマト形質転換に使用した（図１Ａ～Ｄ）。
【0120】
トマト変種ＭＭをアグロバクテリウムによって媒介される形質転換のために選択した。なぜなら、それはトマトの遺伝学研究に広く使用されるからである。トマトトランスジェニック系統が全てのコンストラクトＯ１（２０系統）、Ｏ２（３系統）、Ｏ３（５系統）、およびＯ４（１２系統）について得られた。果実を生産することができる１０個の系統を選択し、導入されたトランスジーンの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した（図２Ａ）。種子を一次トランスジェニック系統の果実から収集した。コンストラクトＯ３を持つ一次形質転換体はいずれかの生存可能な種子を生ずることをしなかったが（図３Ｂ）、これらの果実は際立った橙色の色を示し、その花部分の着色の違いが観察された（図３Ａ～Ｄ）。その他の一次トランスジェニック系統は全て、花および果実を付け、野生型（ＷＴ）と比較して自明な表現型の違いを有さなかった。興味深いことに、これら後者の系統は生存可能な種子を有する果実を生産し（図４）、これらは次の世代において果実の呈色の違いを示した。
【0121】
加えて、全てのトランスジェニック系統は、そのラジカルスカベンジング活性に基づいて、対照として使用された未形質転換のＷＴ植物よりも高い抗酸化活性を示した（図５）。野生型ＭＭの果実と比較して、トランスジェニック系統の抗酸化能は約３から７倍高かった。加えて、表３は、ＨＰＬＣ－ＤＡＤ－ＨＲＭＳによって決定されたトマトおよびトマト副産物抽出物中の個々のフェノール酸およびフラボノイドのプロファイルを示す。結果はトランスジェニック系統対ＷＴの比として提示されている。＊はｐ値＜０．０５で統計的に有意な違いを示す。
【0122】
【表3】
【0123】
＜実施例２．トマトトランスジェニック植物からの果実のアポカロテノイド評価＞
トランスジェニック系統Ｏ１、Ｏ２、およびＯ４の果実をサフランアポカロテノイドの存在について評価した（表４、５、および６）。分析された系統は、選好的に蓄積されたクロシン３［（クロセチン－（β－Ｄ－ゲンチオビオシル）－（β－Ｄ－グルコシル）－エステル）］を包含するサフランに特徴的である全てのアポカロテノイドの存在を様々なレベルで示した（表４）。果実が解剖され、異なる組織がクロシンについて分析され、クロシンが選好的に胎座組織に、次に果皮に蓄積するということを示した（表５）。ＨＴＣＣおよびサフラナールレベルをもまたこれらの果実で分析した（表６）。３つ全ては、分析された全ての系統で検出され、予期された通りＷＴ植物の果実には存在しなかった。
トランスジェニック系統Ｏ１、Ｏ２、およびＯ４の果実をサフランアポカロテノイドの存在について評価した（表４、５、および６）。分析された系統は、選好的に蓄積されたクロシン３［（クロセチン－（β－Ｄ－ゲンチオビオシル）－（β－Ｄ－グルコシル）－エステル）］を包含するサフランに特徴的である全てのアポカロテノイドの存在を様々なレベルで示した（表４）。果実が解剖され、異なる組織がクロシンについて分析され、クロシンが選好的に胎座組織に、次に果皮に蓄積するということを示した（表５）。ＨＴＣＣおよびサフラナールレベルをもまたこれらの果実で分析した（表６）。３つ全ては、分析された全ての系統で検出され、予期された通りＷＴ植物の果実には存在しなかった。
【0124】
【表4】
【0125】
【表5】
【0126】
【表6】
【0127】
ＡＢＡおよびその貯蔵形態（７ＡＢＡ－グルコースエステル）のレベルをもまたこれらの系統で分析した。総体的に、これらの代謝物のレベルはトランスジェニック果実では縮減され（図６）、３５Ｓプロモーター下のＣｓＣＣＤ２Ｌが種子を生ずることができなかったＯ３系統を例外として、種子の発生または生存能力に影響することなしに、クロセチンジアルデヒドへのゼアキサンチン変換がＡＢＡ生合成を損なうということを示唆した。これは、恒常的なＣｓＣＣＤ２Ｌ発現が種子発生の間の有害な影響を伴うということを示唆した（図４）。
【0128】
＜実施例３．ＷＴおよびトランスジェニックトマト果実におけるカロテノイドおよび関係する化合物のレベル＞
トランスジェニックおよび対照（ＷＴ）果実をカロテノイド抽出およびＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＨＲＭＳ分析に付して、それらのカロテノイドプロファイルを決定した（表７）。一般的に、全てのトランスジェニック果実のカロテノイド含量レベルはＷＴのものと比較して顕著に縮減された。最も際立った違いはリコペン、β－カロテン、およびルテイン含量レベルに関係した。実際、ルテインおよびα－カロテンレベルはトランスジェニック系統では縮減されたかまたは検出不可能であった（表７）。
トランスジェニックおよび対照（ＷＴ）果実をカロテノイド抽出およびＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＨＲＭＳ分析に付して、それらのカロテノイドプロファイルを決定した（表７）。一般的に、全てのトランスジェニック果実のカロテノイド含量レベルはＷＴのものと比較して顕著に縮減された。最も際立った違いはリコペン、β－カロテン、およびルテイン含量レベルに関係した。実際、ルテインおよびα－カロテンレベルはトランスジェニック系統では縮減されたかまたは検出不可能であった（表７）。
【0129】
【表7】
【0130】
＜実施例４．Ｔ２果実におけるクロシンの評価＞
Ｔ２植物からの果実を、それらのトータルのクロシンおよびピクロクロシン含量について分析した（図７）。果実はそれらの皮の変色を示さなかった。しかしながら、半分にカットしたときには、橙色の着色がそれらの内部部分に観察され得た（図８）。これらの選択された系統の完全な果実およびトマトジュース漿液におけるトータルのクロシン含量の評価を行った（図７）。
Ｔ２植物からの果実を、それらのトータルのクロシンおよびピクロクロシン含量について分析した（図７）。果実はそれらの皮の変色を示さなかった。しかしながら、半分にカットしたときには、橙色の着色がそれらの内部部分に観察され得た（図８）。これらの選択された系統の完全な果実およびトマトジュース漿液におけるトータルのクロシン含量の評価を行った（図７）。
【0131】
トマトを圧潰し、遠心後に漿液ジュースを得た（図７）。トランスジェニック系統からのこの漿液はＷＴ果実からのほぼ無色の抽出物と比較して黄色から橙色の色を示した（図７）。クロシンは全ての黄色～橙色の漿液ジュースで４４０ｎｍにおいて検出されたが、対照トマト漿液ジュースでは検出されなかった（図７）。トランスジェニックおよびＷＴ漿液ジュースの間でトータルのフェノール系成分およびフラボノイドの違いは発見されなかった（図８）。最高で１２．４８ｍｇ／ｇの乾燥重量のクロシンを有する果実が系統Ｏ１－１１から得られた（表８）。この系統は漿液ジュース中の最も高いレベルのクロシンを示した（表８）。
【0132】
【表8】
【0133】
追加の実験を行って、乾燥トマトの染色力を模擬的な調理プロセスにおいてサフランスレッドのものと比較した。この実験のために、２つの手続きに従った。第１では、乾燥トランスジェニックトマト（０．６２２ｇ）、同じ数量のトマトＷＴ、およびサフランの１つの花からのスレッド（０．００２ｇ）を、それぞれ９０℃で５０ｍＬの水に浸漬した。第２の手続きでは、０．０２ｇの粉末化乾燥トランスジェニックトマト、ＷＴトマト、およびサフランを５ｍＬの水と組み合わせた。水中のクロシンの拡散を、溶液中のサンプルの導入の１０、３０、および６０分後においてＨＰＬＣ－ＤＡＤによって分析した（図９）。スライスされた乾燥トマトはサフラン柱頭と比較してクロシンの急速な放出を示した。しかしながら、６０分後に、サフランの着色力はずっと高かった。トランスジェニック乾燥トマトの粉末を使用したときには、クロシンの放出および着色力は、カットトマトを使用したときより多大であった。
【0134】
結果は、使用された材料およびサンプル調製の方法に依存して溶液中の異なるクロシン蓄積速度論が観察されたが、操作されたトマトの明確な着色力を示した。トマト果実では、乾燥粉末の均一混合物はスライスされたものよりも効率的であり、これは溶液中のクロシンの拡散に明確に影響した（図９）。かかる違いは、内側からのクロシンの広がりを防止するトマトの皮の存在を原因とし得、これらの高クロシントマトの潜在的な産業的活用についての興味深いヒントを提供する。水中のクロシン蓄積は表９に示されている。
【0135】
【表9】
【0136】
それゆえに、本明細書において示されるデータは、通常のトマトカロテノイドを代償にして、優位なクロシン分子としてのピクロクロシンおよびクロセチン－（β－Ｄ－ゲンチオビオシル）－（β－Ｄ－グルコシル）－エステル、ならびにサフラナールを明らかにした。結果は、異種システムにおいて代謝工学によってこれまでに得られた最も高いクロシン含量を示し、経済的に競争力のあるサフランアポカロテノイドを生産するための新たなプラットフォームを提供する。
【0137】
概要として、本明細書において提供されるデータは、産業および人間の健康両方にとって有益である栄養促進性の親油性のかつ希少な高価値の親水性アポカロテノイド化合物の同時生産のためのバイオテクノロジーツールとしてトマトを使用することの潜在力およびフィジビリティを実証する。結果は、異種システムにおいて代謝工学によってこれまでに得られた最も高いクロシン含量を示し、経済的に競争力のあるサフランアポカロテノイドを生産するための新たなプラットフォームを提供する。
【0138】
＜実施例５．動物モデルとしてＣ．エレガンスを使用するアルツハイマーの処置におけるトランスジェニックトマトによって生産されたクロシンおよびピクロクロシンの効果の研究＞
サフランの抗酸化および抗炎症特性は心血管系、消化系、および眼系疾患、ならびに白血病において実証されている。さらにその上、アルツハイマー病におけるクロシン－１の効果もまた、マウス海馬ニューロン細胞株（ＨＴ２２）において、ならびにマウスやラットモデルなどのアルツハイマー病動物モデルにおいて実証されている。その上、軽症から中等症のアルツハイマーを患う患者での人間の治験において、１５ｍｇのサフランを１日２回１６週間受けた患者は、プラセボを受けた患者よりも良い認知機能を示した（Akhondzadeh et al., J. Clin. Pharm. Ther., 2010; 35, 581-588）。
サフランの抗酸化および抗炎症特性は心血管系、消化系、および眼系疾患、ならびに白血病において実証されている。さらにその上、アルツハイマー病におけるクロシン－１の効果もまた、マウス海馬ニューロン細胞株（ＨＴ２２）において、ならびにマウスやラットモデルなどのアルツハイマー病動物モデルにおいて実証されている。その上、軽症から中等症のアルツハイマーを患う患者での人間の治験において、１５ｍｇのサフランを１日２回１６週間受けた患者は、プラセボを受けた患者よりも良い認知機能を示した（Akhondzadeh et al., J. Clin. Pharm. Ther., 2010; 35, 581-588）。
【0139】
この例の狙いは、Ｃ．エレガンスのアルツハイマーモデルにおいてトマトによって生産されたクロシンおよびピクロクロシンの効果を試験することであった。
【0140】
（材料および方法）
［植物材料］
本発明のトランスジェニック植物から得られた野生型およびトランスジェニックトマト（ソラヌム・リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー）をブレンダーによって独立して圧潰し、得られたジュースを９，０００ｇで１５分間遠心した。液相を収集し、２日間凍結乾燥した。野生型およびトランスジェニック抽出物の凍結乾燥されたものを秤量し、蒸留水に再懸濁し、６つの異なる濃度に希釈した（０．０４、０．２、０．４、４、１０、および２０ｍｇの抽出物／ｍＬ）。トランスジェニック抽出物は抽出物のグラムあたり２．５４ｍｇのクロシンを含有した。各希釈のクロシン力価は下の表１０に列記されている。
［植物材料］
本発明のトランスジェニック植物から得られた野生型およびトランスジェニックトマト（ソラヌム・リコペルシカムｃｖ．マネーメーカー）をブレンダーによって独立して圧潰し、得られたジュースを９，０００ｇで１５分間遠心した。液相を収集し、２日間凍結乾燥した。野生型およびトランスジェニック抽出物の凍結乾燥されたものを秤量し、蒸留水に再懸濁し、６つの異なる濃度に希釈した（０．０４、０．２、０．４、４、１０、および２０ｍｇの抽出物／ｍＬ）。トランスジェニック抽出物は抽出物のグラムあたり２．５４ｍｇのクロシンを含有した。各希釈のクロシン力価は下の表１０に列記されている。
【0141】
【表10】
【0142】
［アルツハイマー病のためのＣ．エレガンス株］
トランスジェニックＣ．エレガンスＣＬ４１７６株を使用して実験を実施した。この株は２５℃で人間のアミロイドβペプチド１－４２（Ａβ１－４２）ペプチドを発現する。虫を１６℃においてＮＧＭ培地（負の対照）または異なる希釈の非トランスジェニックもしくはトランスジェニックトマト抽出物で同調させた（表１０）。温度を２５℃まで上げてＡβ１－４２発現を活性化し、麻痺した虫のパーセンテージを異なる時間（２０、２４、２６、２８、３０、および３２時間）においてスコア付けした。誘導なしの対照を包含した（誘導なしのＮＧＭ）。トータルで２つのレプリカが各抽出物および用量について行われた。
トランスジェニックＣ．エレガンスＣＬ４１７６株を使用して実験を実施した。この株は２５℃で人間のアミロイドβペプチド１－４２（Ａβ１－４２）ペプチドを発現する。虫を１６℃においてＮＧＭ培地（負の対照）または異なる希釈の非トランスジェニックもしくはトランスジェニックトマト抽出物で同調させた（表１０）。温度を２５℃まで上げてＡβ１－４２発現を活性化し、麻痺した虫のパーセンテージを異なる時間（２０、２４、２６、２８、３０、および３２時間）においてスコア付けした。誘導なしの対照を包含した（誘導なしのＮＧＭ）。トータルで２つのレプリカが各抽出物および用量について行われた。
【0143】
（結果）
野生型およびトランスジェニックトマトからの抽出物両方は、異なる分析時間において負の対照と比較して全ての分析された濃度で、虫の麻痺に対する保護効果を示した。両方の抽出物における最も有効な濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、トランスジェニックトマト抽出物中の１０μｇ／ｍＬのクロシンに対応した。同じ効果がより高濃度（１０および２０ｍｇ／ｍＬの抽出物）で観察された。Ａβ１－４２発現による３２時間の麻痺誘導後に、４ｍｇ／ｍＬの野生型抽出物は、４ｍｇ／ｍＬのトランスジェニック抽出物と比較して有意なより低い効果を示した（図１０）。
野生型およびトランスジェニックトマトからの抽出物両方は、異なる分析時間において負の対照と比較して全ての分析された濃度で、虫の麻痺に対する保護効果を示した。両方の抽出物における最も有効な濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、トランスジェニックトマト抽出物中の１０μｇ／ｍＬのクロシンに対応した。同じ効果がより高濃度（１０および２０ｍｇ／ｍＬの抽出物）で観察された。Ａβ１－４２発現による３２時間の麻痺誘導後に、４ｍｇ／ｍＬの野生型抽出物は、４ｍｇ／ｍＬのトランスジェニック抽出物と比較して有意なより低い効果を示した（図１０）。
【0144】
従って、結果は、トランスジェニックトマト抽出物が、対照トマト抽出物よりも有意なより低い、誘導されたＡβ１－４２発現によるＣ．エレガンスＣＬ４１７６の麻痺を示したということを示す。トランスジェニックトマト抽出物の効果は、試験された３つの最も高いクロシン濃度（１０、２５、および５０μｇ／ｍＬ）において同じであった。よって、トランスジェニックトマトによって生産されるクロシンはアルツハイマー病の処置に有用である。
【0145】
＜実施例６．ジャガイモトランスジェニック系統におけるサフランアポカロテノイド経路の異所発現のためのプラスミドの作出＞
サフランアポカロテノイド経路に関わる本発明の３つの遺伝子ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌを過剰発現するために恒常的プロモーターを使用することによるジャガイモ植物発生に対する可能な多面的な影響を回避するために、コンストラクトを操作し、塊茎特異的パタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）を含有することを選択し、パタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）によって駆動されるＣｓＣＣＤ２Ｌ、ＵＧＴ７４ＡＤ１、およびＵＧＴ７０９Ｇ１コード配列を持つバイナリコンストラクトを、Ｇｏｌｄｅｎｂｒａｉｄ戦略を使用して組み立てた。それゆえに、バイナリコンストラクトＯ６（配列番号ＸＸ）を作製し、ジャガイモ形質転換に使用した（図１Ｅ）。
サフランアポカロテノイド経路に関わる本発明の３つの遺伝子ＵＧＴ２、ＵＧＴ７０９Ｇ１、およびＣＣＤ２Ｌを過剰発現するために恒常的プロモーターを使用することによるジャガイモ植物発生に対する可能な多面的な影響を回避するために、コンストラクトを操作し、塊茎特異的パタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）を含有することを選択し、パタチンプロモーターｐＰａｔ（配列番号３３）によって駆動されるＣｓＣＣＤ２Ｌ、ＵＧＴ７４ＡＤ１、およびＵＧＴ７０９Ｇ１コード配列を持つバイナリコンストラクトを、Ｇｏｌｄｅｎｂｒａｉｄ戦略を使用して組み立てた。それゆえに、バイナリコンストラクトＯ６（配列番号ＸＸ）を作製し、ジャガイモ形質転換に使用した（図１Ｅ）。
【0146】
それから、Ａ．ツメファシエンスによって媒介される形質転換を使用して、トランスジーンをＳ．ツベロスムｃｖ．デジレおよびｃｖ．ＯＩＨ１５ＷＴに導入した。各変種のおよそ１０個の独立したトランスジェニック系統が作出された。導入されたトランスジーンの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した（図２Ｂ）。塊茎の色の目視評価に基づいて、２つの系統を詳細な分析のために選択した（図３Ｅ）。
【0147】
加えて、全てのトランスジェニック系統は、そのラジカルスカベンジング活性に基づいて、対照として使用された未形質転換のＷＴ植物よりも高い抗酸化活性を示した（データは示さない）。ＷＴと比較して、トランスジェニック系統の抗酸化能は約２から７倍高かった。
【0148】
＜実施例７．ジャガイモトランスジェニック植物からの塊茎のアポカロテノイド評価＞
ＷＴおよびトランスジェニックの全てのジャガイモ系統は、サフランに特徴的な全てのアポカロテノイドの存在を、ただし様々なレベルで示した（表１１および１２）。分析された系統は、クロシン３［（クロセチン－（β－Ｄ－ゲンチオビオシル）－（β－Ｄ－グルコシル）－エステル）］を包含するサフランに特徴的である全てのアポカロテノイドの存在を様々なレベルで示した（表１１）。ＨＴＣＣおよびサフラナールレベルもまたこれらの系統で分析された（表１２）。３つ全ては、分析された全ての系統で検出され、予期された通りＷＴ植物の塊茎には存在しなかった。
ＷＴおよびトランスジェニックの全てのジャガイモ系統は、サフランに特徴的な全てのアポカロテノイドの存在を、ただし様々なレベルで示した（表１１および１２）。分析された系統は、クロシン３［（クロセチン－（β－Ｄ－ゲンチオビオシル）－（β－Ｄ－グルコシル）－エステル）］を包含するサフランに特徴的である全てのアポカロテノイドの存在を様々なレベルで示した（表１１）。ＨＴＣＣおよびサフラナールレベルもまたこれらの系統で分析された（表１２）。３つ全ては、分析された全ての系統で検出され、予期された通りＷＴ植物の塊茎には存在しなかった。
【0149】
【表11】
【0150】
【表12】
【0151】
＜実施例８．ＷＴおよびトランスジェニックジャガイモ塊茎におけるカロテノイドおよび関係する化合物のレベル＞
トランスジェニックおよび対照（ＷＴ）ジャガイモ塊茎をカロテノイド抽出およびＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＨＲＭＳ分析に付して、それらのカロテノイドプロファイルを決定した（表１３）。一般的に、全てのトランスジェニック果実のカロテノイド含量レベルはＷＴのものと比較して顕著に縮減された。
トランスジェニックおよび対照（ＷＴ）ジャガイモ塊茎をカロテノイド抽出およびＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＨＲＭＳ分析に付して、それらのカロテノイドプロファイルを決定した（表１３）。一般的に、全てのトランスジェニック果実のカロテノイド含量レベルはＷＴのものと比較して顕著に縮減された。
【0152】
【表13】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】