特表 2024-533562 ＳＮ３８を含む抗体－薬物コンジュゲートの中間体及びその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】ＳＮ３８を含む抗体－薬物コンジュゲートの中間体及びその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/10 20060101AFI20240905BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20240905BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240905BHJP

【ＦＩ】

C07K5/10

A61P35/00

A61K39/395 C

A61K39/395 L

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516810

(86)(22)【出願日】2022-11-01

(85)【翻訳文提出日】2024-03-14

(86)【国際出願番号】 CN2022128912

(87)【国際公開番号】W WO2023078230

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】202111285580.X

(32)【優先日】2021-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524098695

【氏名又は名称】煙台邁百瑞国際生物医薬股▲フン▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＭＡＢＰＬＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ６０， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｉｎａ （Ｓｈａｎｄｏｎｇ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】黄 長江

(72)【発明者】

【氏名】熊 就凱

(72)【発明者】

【氏名】▲ヤン▼ 新新

(72)【発明者】

【氏名】于 紅霞

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085AA26

4C085DD36

4C085DD41

4C085DD52

4C085GG02

4H045AA10

4H045BA13

4H045BA72

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、そのリンカーに生物活性のある水溶性基ＰＥＧを導入しかつＰＥＧを構造的に修飾した、ＳＮ３８含有の抗体－薬物コンジュゲートの中間体及びその調製方法を提供する。この調製方法は、手順が簡単でコストが低い、かつ、反応時に重金属イオンを導入せず、より環境にやさしい。そして、この調製方法によって合成された抗体－薬物コンジュゲートの中間体は、従来の技術におけるＳＮ３８を毒素とする抗体－薬物コンジュゲートの中間体に比べて、より高い安定性と薬効を持っている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の式（Ｉ）で表される抗体－薬物コンジュゲートの中間体。

【化1】

（式中、
Ｘ_１は、アルカン鎖又はＰＥＧ鎖であり、
Ｘ_２は、Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であり、かつ、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、置換又は非置換のＣ_１－６アルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６ヒドロキシアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アミノアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルコキシル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアシル基、及び置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアルデヒド基からなる群より選択され、
Ｒ^２は、水素或いは置換されていないか又はそれぞれに独立して、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、５－１０員ヘテロシクリル基（ここには、該５－１０員ヘテロシクリル基は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群より選択された１～３個のヘテロ原子を有する）、及びＣ_１－６ハロアルキル基からなる群より選択された１～５個の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１－６アルキル基である。）

【請求項2】

前記Ｘ_１は、

【化2】

であり（ただし、ｍは１、２、３、４、５、又は６であり、好ましくは、ｍは５であり、ｐは１、２、３、４、５、又は６であり、好ましくは、ｐは２である）、
好ましくは、前記Ｘ_１は、

【化3】

からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲートの中間体。

【請求項3】

前記Ｒ^１又はＲ^２は、独立してＨ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基、メトキシル基、エトキシル基、Ｃｌ、Ｂｒ、

【化4】

からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲートの中間体。

【請求項4】

前記Ｘ_２は、

【化5】

からなる群より選択されることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲートの中間体。

【請求項5】

前記抗体－薬物コンジュゲートの中間体が下記の式（１）～（１６）で表される構造を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲートの中間体：

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

。

【請求項6】

【化10】

の式（ただし、前記Ｒ^１は、水素、置換又は非置換のＣ_１－６アルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６ヒドロキシアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アミノアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルコキシル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアシル基及び置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアルデヒド基からなる群より選択され、
前記Ｒ^２は、水素、或いは、置換されていないか又はそれぞれに独立してハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、５－１０員ヘテロシクリル基（ここには、該５－１０員ヘテロシクリル基は、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択された１～３個のヘテロ原子を有する）及びＣ_１－６ハロアルキル基からなる群より選択された１～５個の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１－６アルキル基であり、
好ましくは、Ｒ^１又はＲ^２はＨ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基、メトキシル基、エトキシル基、Ｃｌ、Ｂｒ、

【化11】

である）で表される抗体－薬物コンジュゲートの中間体の調製方法であって、
前記調製方法は、下記の反応過程１～４：
反応過程１：

【化12】

又は
反応過程２：

【化13】

又は
反応過程３：

【化14】

又は
反応過程４：

【化15】

から選択される抗体－薬物コンジュゲートの中間体の調製方法。

【請求項7】

前記化合物（Ｉ－１）は、

【化16】

【化17】

からなる群より選択され、又は、前記化合物（Ｉ－２）は、

【化18】

【化19】

からなる群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載の調製方法。

【請求項8】

前記反応過程１が、以下の条件：
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温条件下で還元剤を加え、適当な時間に撹拌した後、室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温条件下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、また低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含むことを特徴とする請求項６に記載の調製方法。

【請求項9】

前記反応過程２が、以下の条件：
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温条件下で還元剤を加え、その後適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うこと、を含むことを特徴とする請求項６に記載の調製方法。

【請求項10】

前記反応過程３が、以下の操作条件：
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温条件下で還元剤を加え、その後、適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)酸及び有機アルカリを加え、固定温度下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｅ：反応Ｄで得られた生成物とアミン系化合物を溶剤に溶解し、有機アルカリを加え、低温条件下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｆ：反応Ｅで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含むことを特徴とする請求項６に記載の調製方法。

【請求項11】

前記反応過程４が、以下の操作条件：
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温条件下で還元剤を加え、その後、適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)酸及び有機アルカリを加え、固定温度下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｅ：反応Ｄで得られた生成物とアミン系化合物を溶剤に溶解し、有機アルカリを加え、低温条件下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｆ：反応Ｅで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含むことを特徴とする請求項６に記載の調製方法。

【請求項12】

前記「低温条件下」を氷水浴中でのことにする、請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項13】

前記溶媒がＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ及びそれらの組み合わせからなる群より選択された極性溶媒及び／又はジクロロメタン、四塩化炭素及びそれらの組み合わせからなる群より選択された非極性溶媒である、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項14】

前記有機アルカリは、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、好ましくは、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項15】

前記酸が塩酸、トリフルオロ酢酸、及びクエン酸の中の一種又は２種である、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項16】

前記アミン系化合物が一級アミン又は二級アミンである、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項17】

前記反応Ａにおいて、前記抽出が酢酸エチルを用いて行われ、前記精製がジクロロメタンとメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項18】

前記反応Ｂにおいて、前記トリチュレーションが、酢酸エチル、ｎ－ヘキサン、ジクロロメタンの中の１種又は複数種の組合せを用いて行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項19】

前記反応Ｃにおいて、前記精製が、ジクロロメタンとメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項20】

前記反応Ｄにおいて、前記精製が、ジクロロメタンとメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項21】

前記反応Ｅにおいて、前記精製が、ジクロロメタンとメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項22】

前記反応Ｆにおいて、前記精製が、移動相ＡとしてＭｅＣＮ及び０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相ＢとしてＨ_２Ｏ及び０．１％ＨＣＯＯＨを用いて分取液体クロマトグラフィー法により行われる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項23】

前記反応のいずれも窒素ガス保護下で行われることを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体－薬物コンジュゲートの分野に関し、具体的には、抗体－薬物コンジュゲートの中間体及びその調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

抗体－薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新規な生物学的標的薬として、モノクローナル抗体の標的効果と小分子薬物細胞毒性の強力な組み合わせを実現し、腫瘍標的療法の分野で最も急速に成長している分野の１つである。ＡＤＣの三つの構成ユニット（抗体、細胞毒素及びリンカー）は、一緒になって標的化薬物送達システムを形成する。その中で、抗体は、標的化を達成し、リンカーは、ＡＤＣの血液輸送中の安定性を保証し、毒素は、標的点に到達した後、癌細胞に殺傷効果を発揮する。現在、抗腫瘍治療の臨床試験中になっている６０種類以上のＡＤＣにおいては、ほとんどの毒素はチューブリン阻害剤であり、少数はＤＮＡ阻害剤である。ＤＮＡ阻害剤は、チューブリン阻害剤に比べて、１）ＤＮＡ阻害剤（ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ＩＣ ５０ ｖａｌｕｅｓ）はチューブリン阻害剤（ｓｕｂ－ｎａｎｏｍｏｌａｒ ＩＣ ５０ ｖａｌｕｅｓ）よりも活性が高く、抗原の少ない腫瘍の治療により優れた効果を発揮することと、２）分裂期になってない癌細胞を殺すことができ、固形腫瘍に対する治療の優位性があること、二つのメリットを有する。

【0003】

カンプトテシン系化合物は、臨床的に用いられているトポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）阻害剤であり、臨床における緩徐に増殖する固形腫瘍に対して良好な効果を有する。しかしながら、カンプトテシンの特殊な構造はその水溶性および脂質溶解性が悪くなる要因であるので、水溶性を改善する必要がある。カンプトテシンを「弾頭」とするＡＤＣ薬物は上記の欠点に対する新しい解決策を提供する。

【0004】

現在、カンプトテシン誘導体を弾頭とするＡＤＣ薬物として、既にエンヘルトゥ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）とトロデルヴィ（サシツズマブ・ゴビテカン）２剤が承認されている。これらは、腫瘍、特に悪性腫瘍の治療における臨床ニーズに応えるものである。アストラゼネカ社／第一三共社が開発したエンヘルトゥは、カテプシンＢで活性化されたＧＧＦＧテトラペプチドをリンカーとして用い、自己切断構造の小断面を導入して、エキサテカンの誘導体であるＤｘｄを放出するものである。ＨＥＲ２陽性転移性乳癌に対して、エンヘルトゥが使用された９９例の患者は、客観的寛解率が５４．５％であり、病勢コントロール率が９３．９％であった。サシツズマブ・ゴビテカンは、リンカーがＭｃｃ－トリアゾールスペーサー－ＰＥＧ７－ｘ－リジン－ＰＡＢＣであり、細胞内のリソソーム（ｐＨ約５）で分解してカンプトテシン（ＳＮ３８）を放出する。トリプルネガティブ乳癌は臨床的にほぼ「不治の病」と言われているが、トリプルネガティブ乳癌に対するサシツズマブ・ゴビテカンの臨床第ＩＩ相試験の結果では、その有効率が３０％と高く、６９．５％の患者で腫瘍縮小が認められた。また、複数の治療法を使用しても無効になった小細胞肺がんに対して、サシツズマブ・ゴビテカンは６０％の患者の腫瘍を縮小させることができる。化学療法、分子標的治療及びＰＤ－１治療をすべて使用しても無効になった非小細胞肺癌に対しては、サシツズマブ・ゴビテカンによるコントロール率が４３％と高い。しかし、臨床試験において、治療効果が顕著であるものの、その一方で、例えば、血液システム毒性、神経毒性、肺毒性、皮膚毒性、肝毒性、眼毒性、代謝異常、心毒性などの、ＡＤＣ毒性に起因する重大な安全性の問題もある。そのため、ＡＤＣ薬物の安全性を向上させることは、現在の薬物開発中で強く懸念され、解決されなければならない問題である。

【0005】

また、一部のＡＤＣのリンカーと載荷の合成には、金属イオン反応の生成物の除去が困難であるという問題もある。例えば、サシツズマブ・ゴビテカンに用いられるＣＬ２Ａ－ＳＮ３８が合成過程でクリックケミストリー反応（Ｃｌｉｃｋ反応）を伴うため（中国特許出願公開第ＣＮ１０２４４８４９４Ａ号の明細書５０頁の段落［０２７３］を参照）、この反応生成物中にＣｕ^２＋が含有し、容易に除去できない。

【0006】

リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）はＡＤＣ構造において、重要な役割を果たし、ＡＤＣの薬物動態パラメータ、治療指標および有効性に影響を及ぼす。リンカーは、血流中でＡＤＣコンジュゲートの安定性を維持することができる。リンカーの設計にあたっては、まず安定性を考慮しなければならない。ＡＤＣ薬剤は半減期が長いため、リンカーが血液中で分解されて毒素が放出されるのを防ぐために、リンカーの安定性が必要となる。リンカーは血液中で十分に安定しないと、ＡＤＣが腫瘍細胞に入る前に分解されてしまく、腫瘍に対する薬効が低下する恐れがあり、誤って他の細胞を殺してしまった場合もある。そして、ＡＤＣが腫瘍細胞に内在化する過程で、リンカーは細胞毒性薬物を速やかに放出できると要求される。このように、リンカーは開発されたＡＤＣ薬品の安全性と有効性に重要な決定的役割を果たす。そして、リンカーの異なる構造は、ＡＤＣの調製過程の易しさ、調製コスト及び環境に優しさに大きく影響し、また、ＡＤＣ薬品の品質、例えばＡＤＣの安定性などに大きく影響し、さらにＡＤＣ薬物の安全性に影響する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ＳＮ３８を含む抗体－薬物コンジュゲートの中間体及びその調製方法を提供する。この調製方法は、工程が簡便であり、コストが低く、かつ、反応時に重金属イオンを導入することがなく，環境によりやさしく、さらに、この調製方法によって合成された抗体－薬物コンジュゲートの中間体が良好な安定性を有し、ＡＤＣ薬物の安全性が著しく向上する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、式（Ｉ）で表れる抗体－薬物コンジュゲートの中間体に関する。

【化1】

式中：
Ｘ_１はアルカン鎖又はＰＥＧ鎖であり、
Ｘ_２はＨ又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であり、かつ、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、置換又は非置換のＣ_１－６アルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６ヒドロキシアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アミノアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルコキシル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアシル基及び置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアルデヒド基からなる群より選択され、
Ｒ^２は、水素、或いは、置換されていないか又はそれぞれに独立してハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、５－１０員ヘテロシクリル基（ここには、該５－１０員ヘテロシクリル基は、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択された１～３個のヘテロ原子を有する。）及びＣ_１－６ハロアルキル基からなる群より選択された１～５個の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１－６アルキル基である。

【0009】

好ましくは、上記Ｘ_１が

【化2】

から選択される。ただし、ｍは、１、２、３、４、５、及び６から選択され、好ましくは５であり；ｐは１、２、３、４、５、及び６から選択され、好ましくは２である。

【0010】

好ましくは、上記Ｘ_１は、

【化3】

から選択される。

【0011】

好ましくは、上記Ｒ^１又はＲ^２は、Ｈ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基、Ｃｌ、Ｂｒ、

【化4】

である。

【0012】

好ましくは、上記Ｘ_２は以下の基から選択される：

【化5】

【0013】

好ましくは、上記抗体－薬物コンジュゲートの中間体の構造が以下の（１）－（１６）式で表れる：

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【0014】

また、本発明は抗体－薬物コンジュゲートの中間体の調製方法も提供する。

【0015】

さらに、上記抗体－薬物コンジュゲートの中間体は以下の構造を有する：

【化10】

【0016】

上記Ｒ^１は、水素、置換又は非置換のＣ_１－６アルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６ヒドロキシアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アミノアルキル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルコキシル基、置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアシル基、及び置換又は非置換のＣ_１－６アルキルアルデヒド基からなる群より選択される。

【0017】

上記Ｒ^２は、水素、或いは、置換されていないか又はそれぞれに独立してハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、５～１０員ヘテロシクリル基（ここには、該５～１０員ヘテロシクリル基は、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択された１～３個のヘテロ原子を有する）及びＣ_１－６ハロアルキル基からなる群より選択された１～５個の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１－６アルキル基である。

【0018】

好ましくは、Ｒ^１又はＲ^２はＨ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基、メトキシル基、エトキシル基、Ｃｌ、Ｂｒ、

【化11】

である。

【0019】

さらに、上記式（４）化合物の調製方法は、下記の反応過程１に示すように、
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温下で還元剤を加えて、適当な時間に撹拌した後、室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温条件下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、また低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含む。

【0020】

反応過程１：

【化12】

【0021】

さらに、上記式（１２）化合物の調製方法は、下記の反応過程２に示すように、
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温下で還元剤を加え、その後適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温条件下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含む。

【0022】

反応過程２：

【化13】

【0023】

さらに、上記化合物（Ｉ－１）の調製方法は、下記の反応過程３に示すように、
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温下で還元剤を加え、その後、適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)酸及び有機アルカリを加え、固定温度下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｅ：反応Ｄで得られた生成物とアミン系化合物を溶剤に溶解し、有機アルカリを加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｆ：反応Ｅで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含む。

【0024】

反応過程３：

【化14】

【0025】

さらに、上記化合物（Ｉ－２）の調製方法は、下記の反応過程４に示すように、
反応Ａ：化合物ａと化合物ｂを溶剤に溶解し、室温下で適当な時間に撹拌した後、低温下で還元剤を加え、その後、適当な時間に撹拌し、また室温下で一晩撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして抽出、乾燥、及び精製を行うことと、
反応Ｂ：ＳＮ３８とＤＮＰＣを溶剤に溶解し、有機アルカリを加えて、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そしてトリチュレーション及び濾過を行うことと、
反応Ｃ：反応Ｂで得られた生成物を溶剤に溶解し、反応Ａで得られた生成物と有機アルカリを加え、室温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｄ：反応Ｃで得られた生成物を溶剤に溶解し、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)酸及び有機アルカリを加え、固定温度下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｅ：反応Ｄで得られた生成物とアミン系化合物を溶剤に溶解し、有機アルカリを加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、
反応Ｆ：反応Ｅで得られた生成物を溶剤に溶解し、酸を加え、低温下で適当な時間に撹拌し、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させた後、ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰとともに溶剤に溶解し、低温下で適当な時間に撹拌し、有機アルカリを加え、反応終了後、溶剤を除去するように回転乾燥させ、そして精製を行うことと、を含む。

【0026】

反応過程４：

【化15】

【0027】

さらに、上記化合物（Ｉ－１）は、

【化16】

【化17】

から選択される。
上記化合物（Ｉ－２）は、

【化18】

【化19】

から選択される。

【0028】

さらに、上記いずれの反応過程に記載の「低温条件下」は氷水浴中である。

【0029】

さらに、上記いずれの反応過程中で、上記溶媒は独立して極性溶媒及び／又は非極性溶媒である。上記極性溶媒はＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、及びＮＭＰの中の１種また複数種である。上記非極性溶媒はジクロロメタン及び四塩化炭素中の１種また複数種である。

【0030】

さらに、上記いずれの反応過程に記載の有機アルカリは、独立して、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、およびピリジンの中の１種また複数種であってよく、好ましくはＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、及びピリジンの中の一種又は２種である。

【0031】

さらに、上記の酸は塩酸、トリフルオロ酢酸、及びクエン酸の中の一種又は２種である。

【0032】

さらに、上記のアミン系化合物は第一アミン又は第二アミンである

【0033】

さらに、上記の反応Ａにおいて、酢酸エチルで抽出を行い、ジクロロメタン及びメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより上記の精製を行う。

【0034】

さらに、上記の反応Ｂにおいて、酢酸エチル、ｎ－ヘキサンおよびジクロロメタンの中の一種、又は多種を組み合わせたものを用いてトリチュレーションを行う。

【0035】

さらに、上記の反応Ｃにおいて、ジクロロメタン及びメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより精製を行う。

【0036】

さらに、上記の反応Ｄにおいて、ジクロロメタン及びメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより精製を行う。

【0037】

さらに、上記の反応Ｅにおいて、ジクロロメタン及びメタノールを溶離剤としてカラムクロマトグラフィーにより精製を行う。

【0038】

さらに、上記の反応Ｆにおいて、移動相ＡとしてＭｅＣＮ及び０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相ＢとしてＨ２Ｏ及び０．１％ＨＣＯＯＨを用いて分取液体クロマトグラフィー法により精製を行う。

【0039】

さらに、上記の反応はすべて窒素ガス保護下で行われる。

【発明の効果】

【0040】

本発明で提供される抗体－薬物コンジュゲートの中間体（具体的には、リンカー－ＳＮ３８共有結合体）の調製方法は、工程が簡単であることに加えて、該方法により重金属の残留による安全性の問題の低減が図れる。さらに、この抗体－薬物コンジュゲートの中間体を用いて調製された抗体－薬物コンジュゲートは生体内でより高い安定性を有する。

【0041】

さらに、驚くべきことに、発明人は本発明におけるリンカーとＳＮ３８を組み合わせて調製された抗体－薬物コンジュゲートが有意な阻害効果を示すことを見出した。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】図１は、マウスの体重の変化を示す。

【図2】図２は、腫瘍の体積の変化を示す。

【図3】図３は、相対的腫瘍体積を示す。 ［略語］

【0043】

なお、特に断らない限り、本発明で使用されている全ての略語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用されている一般的な略語及びその定義は以下に示されている。

【表1】

【表2】

［定義］

【0044】

明細書の様々な側面に関連する様々な用語は、明細書及び特許請求の範囲全体で使用されている。特に明記しない限り、そのような用語は、当技術分野においてそれらの通常の意味を有する。その他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供されている定義と一致ものと理解する必要がある。

【0045】

本明細書で使用される「１つ」、「１種」及び「前記」という用語は、標準的な慣習に従って使用され、文脈上別段の指示がない限り、１つ又は複数を意味する。従って、例えば、「抗体－薬物コンジュゲート」が言及されている場合は、２つ又はそれ以上の抗体－薬物コンジュゲートの組み合わせなどを含む。

【0046】

本明細書において「含む」という言葉を使用して説明する場合以外は、さらに「．．．からなる」及び／又は「基本に．．．からなる」という言葉で説明する類似の場合があることを理解されたい。

【0047】

本発明で使用されている用語「抗体－薬物コンジュゲート」とは、抗体／抗体の機能断片、リンカー及び薬物部分が化学反応による結合した化合物を指し、通常、その構造は、抗体又は抗体様リガンド、薬物部分、及び抗体又は抗体様リガンドと薬物を連結するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）の三つの部分からなる。現在、抗体－薬物コンジュゲートの調製は、通常、リンカーと薬物部分とを化学反応により「リンカー－薬物」コンジュゲートを形成する第１のステップと、「リンカー－薬物」コンジュゲートのリンカー部分を抗体／抗体機能性断片とチオール基又はアミノ基を介して共有結合する第２のステップという２つのステップに分けられる。本発明に係る「抗体－薬物コンジュゲートの中間体」という用語は、以上に係る「リンカー－薬物」コンジュゲートを意味し、さらに、本発明に係る「抗体－薬物コンジュゲートの中間体」とは、「リンカー」とＳＮ３８との共有結合コンジュゲートを一般に指す。

【0048】

本発明で使用されている「抗体－薬物コンジュゲート」は、当該技術分野における通常の方法により調製される。例えば、本発明で使用されている抗体－薬物コンジュゲートの調製方法には、抗体をｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液で１０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、適切な当量のＴＣＥＰを添加して１時間振とうしてよく混合した後、また、５．０モル当量のリンカー－毒素（すなわち、１式－１６式で示される化合物）を添加して振とうしてよく混合し、１時間反応させ、反応終了後、限外濾過によって残留小分子を除去し、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）にロードして、ＤＡＲ、薬物分布、および抗体比を測定した。

【0049】

本発明は新規な薬物コンジュゲートの中間体を提供することを目的としており、例として、技術の効果を検証するためにヘーセプチン（Ｈｅｃｅｐｔｉｎ）を使用して複数のＡＤＣを調製したが、抗体の選択は本発明を限定するものではなくいことは、理解されたい。以下、具体的なＡＤＣの構造を例示的に挙げる。ここには、ＡＤＣ－１では、リンカー及び毒素が用いられた（１）式の化合物に対応じ、ヘーセプチンを利用して当該技術分野における一般的な「抗体－薬物コンジュゲート」の調製方法により製造される（以下同様に、ＡＤＣ－２におけるリンカー及び毒素は（２）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－３におけるリンカー及び毒素は（３）化合物に対応する；ＡＤＣ－４におけるリンカー及び毒素は（４）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－５におけるリンカー及び毒素は（５）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－６におけるリンカー及び毒素は（６）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－７におけるリンカー及び毒素は（７）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－８におけるリンカー及び毒素は（８）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－９におけるリンカー及び毒素は（９）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１０におけるリンカー及び毒素は（１０）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１１におけるリンカー及び毒素は（１１）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１２におけるリンカー及び毒素は（１２）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１３におけるリンカー及び毒素は（１３）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１４におけるリンカー及び毒素は（１４）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１５におけるリンカー及び毒素は（１５）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１６におけるリンカー及び毒素は（１６）式の化合物に対応する；ＡＤＣ－１７におけるリンカー及び毒素はＣＬ２Ａ－ＳＮ３８に対応する）。ただし、ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択してよい。

【化20】

【化21】

【化22】

【化23】

【0050】

本発明に係る用語「リンカー」とは、２官能又は多官能を有する分子であって、タンパク質／抗体分子及びＳＮ３８反応とそれぞれ反応することができるため、タンパク質／抗体をＳＮ３８に結合する「架橋」として機能する。本発明に係るリンカーは特に構造中にアシルを含む基を指す。

【発明を実施するための形態】

【0051】

以下、具体的な実施例を挙げながら本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するために使用されているものにすぎなく、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。次の実施例に具体的な条件が明示されていない実験方法は、一般的に、通常の条件又はメーカーが推奨する条件に従って実行する。具体的な来源が明示されていない試薬は、市販として購入された通常の試薬である。すべての百分率、比率、割合又は部は、断りがない限り、重量によるものである。

【0052】

本明細書で用いられるすべての専門及び科学的用語は、断りがない限り、当業者に周知である意味と同じである。なお、記載された内容に類似又は等しい任意の方法及び材料は、本発明の方法に使用されることができる。本明細書に記載されている好ましい実施形態及び材料は、例示としてのみ使用される。

【0053】

実施例１ 式（１２）化合物の調製方法

【化24】

【0054】

１）化合物ｃ（２－Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチレングリコール）の合成方法

【0055】

０．６ｇの化合物ａ（アミノエチレングリコール）と１．０ｇの化合物ｂ（Ｎ－Ｂｏｃ－アセトアルデヒド）を２０ｍＬのメタノールに溶解し、室温下で６時間撹拌した。反応系を氷水浴に入れ、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを加え、氷水浴で１時間撹拌した後、室温に戻し、一晩撹拌した。生成物をＬＣ－ＭＳ法により検出したところたところ、ＵＶ吸収が見られなかった。回転乾燥して溶媒を除去し、酢酸エチルで２回抽出し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、回転乾燥し、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより精製し、水洗して、１．０ｇの生成物を収率６６％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝２６２．６

【0056】

２）ＳＮ３８－ＰＮＰ（１０－ｐ－ニトロフェニルカーボネート－カンプトテシン）の合成方法

【0057】

ＳＮ３８（カンプトテシン）１．０ｇとＤＮＰＣ（炭酸ビス(4-ニトロフェニル)）１．６ｇをテトラヒドロフラン１００ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを加え、室温下で１．５時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝２０ｍＬ：１００ｍＬの混合溶剤を使用してトリチュレーションした後、ろ過して固形物を得た。この固形物をジクロロメタン２０ｍＬトリチュレーションし、ろ過し、ＬＣ－ＭＳでモニターしながら生成物を回収し、７００ｍｇのＳＮ３８－ＰＮＰ固形物を収率４９．３％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５５７．４。

【0058】

３）化合物ｄ（Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチルグリコール－カンプトテシン）の合成方法

【0059】

ＳＮ３８－ＰＮＰ２５０ｍｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、Ｂｏｃ－ＤＭＥＤＡ－ＰＥＧ２３５ｍｇ及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２３３ｕＬを加え、室温下で１６時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１を溶離液とするカラムクロマトグラフィーにより精製した後、水洗した。ＬＣ－ＭＳでモニタリングしながら生成物を収集し、２１３ｍｇのＢｏｃ－ＤＭＥＤＡ－ＰＥＧ－ＳＮ３８固形物を收率７０％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６８０．５。

【0060】

４）化合物ｇ（１０－（２－Ｎ－メチルエチレングリコール）－カンプトテシントリフルオロ酢酸塩）の合成方法

【0061】

化合物ｄ７３．０ｍｇをジクロロメタン３ｍＬとトリフルオロ酢酸３ｍＬに溶解し、氷水浴に入れ、恒温下で１時間撹拌１した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、その後、メチルベンゼン２ｍＬとジクロロメタン２ｍＬを加え、２回で回転乾燥した。ＬＣ－ＭＳでモニターしながら生成物を回収し、ＳＮ３８－ＤＭＥＤＡ－ＴＦＡを得た。そのままに次の反応に使用した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５８０．６

【0062】

５）式（１２）化合物（マレイミドジエトキシ－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－（２－Ｎ－メチルエチレングリコール）－カンプトテシン）の合成方法

【0063】

ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰ５０ｍｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド４ｍＬに溶解し、氷水浴に置いて温度を一定に保ち、窒素で保護した。反応系に化合物ｇ ３８ｍｇを加え、また、トリエチルアミン４２ｕＬを加えて恒温下で０．５時間撹拌した後、室温に戻し、０．５時間反応させた。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、低温下で回転乾燥して溶剤を除去し、ＳｕｎＦｉｒｅ（登録商標）ＰｒｅｐＣ１８ＯＢＤＴＭ５ｕｍ、１９×２５０ｍｍＣｏｌｕｍｎを分取カラムとし、ＭｅＣＮを移動相Ａとし、Ｈ_２Ｏを移動相Ｂとして分取精製クロマトグラフィーを行った。ＬＣ－ＭＳによりモニターしながら純品を収集し、式（１２）の化合物固形物１８ｍｇを收率２２％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝１１９７．２

【0064】

実施例２ 式（４）化合物の調製方法

【化25】

【0065】

実施例１での合成経路に従って化合物ｇ（１０－（２－Ｎ－メチルエチレングリコール）－カンプトテシントリフルオロ酢酸塩）を調製した。化合物ｄ（７３．０ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬとトリフルオロ酢酸３ｍＬに溶解し、氷水浴に置いて恒温下で１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去した。また、ジクロロメタン２ｍＬを加えて２回で回転乾燥した。ＬＣ－ＭＳによりモニターしながら生成物を収集して化合物ｇ（７０ｍｇ）を得た。そのままに次の反応に使用した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５８０．６。

【0066】

実施例１での合成経路に従って式（４）化合物（マレイミドヘキサン酸－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－（２－Ｎ－メチルエチレングリコール）－カンプトテシン）を調製した。具体的には、Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（マレイミドヘキサン酸－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジルーニトロフェニルカーボネート）（５８ｍｇ）と化合物ｇ（４２ｍｇ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２．５ｍＬに溶解した後、氷水浴で３０分間撹拌し、ＤＩＰＥＡ（４２ｍｇ）を滴下して氷水浴で１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法により検出されたところ、反応は終了していなかった。次に、トリエチルアミン（１０ｍｇ）を加え、室温下で１時間撹拌したところ、反応液が黄色に変化し、ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて反応終了を確認した。反応終了後、低温下で回転乾燥して溶剤を除去し、ＳｕｎＦｉｒｅ（登録商標）ＰｒｅｐＣ１８ＯＢＤＴＭ５ｕｍ、１９×２５０ｍｍＣｏｌｕｍｎを分取カラムとし、ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ａとし、Ｈ_２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ｂとして分取精製クロマトグラフィーを行った。ＬＣ－ＭＳによりモニターしながら純品を収集し、式（４）の化合物３４ｍｇを收率４０．５％で固形物として得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝１１７９．２

【0067】

実施例３ 式（１）の化合物の調製方法

【化26】

【0068】

１）化合物ｃ（２－Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチレングリコール）の合成方法

【0069】

化合物ａ（アミノエチレングリコール）０．６ｇと化合物ｂ（Ｎ－Ｂｏｃ－（メチルアミド）アセトアルデヒド）１．０ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、室温下で６時間撹拌した。反応系を氷水浴に置いてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを加え、氷水浴で１時間撹拌した後、室温に戻して一晩撹拌した。生成物をＬＣ－ＭＳ法により検出したところ、ＵＶ吸収が見られなかった。回転乾燥して溶媒を除去し、酢酸エチルで２回抽出し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、有機相を注き出し、回転乾燥した後、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより精製し、水洗して、１．０ｇの生成物を収率６６％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝２６２．６

【0070】

２）ＳＮ３８－ＰＮＰ（１０－ｐ－ニトロフェニルカーボネート－カンプトテシン）の合成方法

【0071】

ＳＮ３８１．０ｇとＤＮＰＣ（炭酸ビス(4-ニトロフェニル)酸）１．６ｇをテトラヒドロフラン１００ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを加え、室温下で１．５時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝２０ｍＬ：１００ｍＬの混合溶剤を使用してトリチュレーションした後、ろ過して固形物を得た。この固形物をジクロロメタン２０ｍＬトリチュレーションし、ろ過し、ＬＣ－ＭＳでモニターしながら生成物を回収し、７００ｍｇのＳＮ３８－ＰＮＰ固形物を収率４９．３％で得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５５７．４

【0072】

３）化合物ｄ （Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチルグリコール－カンプトテシン）の合成方法

【0073】

ＳＮ３８－ＰＮＰ５００ｍｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、化合物ｃ３７０ｍｇとＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２３３ｕＬを加え、室温下で３時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１を溶離液とするカラムクロマトグラフィーにより精製した後、水洗した。ＬＣ－ＭＳでモニターしながら生成物を回収し、化合物ｄ固体を収率４５％で２５０ｍｇ得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６８０．５。

【0074】

４）化合物ｈ（Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチレンジトキシｐ－ニトロ活性エステル－カンプトテシン）の合成方法

【0075】

化合物ｄ２２０．０ｍｇをジクロロメタン５ｍＬに溶解し、炭酸ビス（４－ニトロフェニル）酸１５０ｍｇ及びＤＩＰＥＡ８６ｍｇを加え、恒温下で１６時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去し、ジクロロメタン：メタノール＝５０：１を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を回収して化合物ｈを收率６８．５％で固形物として２２０ｍｇ得た。そのままに次の反応に使用した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝８４５．６

【0076】

５）化合物ｉ（Ｂｏｃ－Ｎ－メチルジエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン－カンプトテシン）の合成方法

【0077】

化合物ｈ（Ｂｏｃ－Ｎ－メチルジエトキシｐ－ニトロ活性エステル－カンプトテシン）２２０ｍｇとＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン５０ｍｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解した後、ＤＩＰＥＡ（６５ｍｇ）を滴下して氷水浴で１時間撹拌した。反応終了はＬＣ－ＭＳ法により検出された後、回転乾燥して溶媒を除去し、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を収集して收率７５％で化合物ｉを１５７ｍｇ固形物として得たまま次の反応に使用した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝８０８．６

【0078】

６）化合物ｊ（Ｎ－メチルジエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン－カンプトテシン－トリフルオロ酢酸塩）の合成方法

【0079】

化合物ｉ（Ｂｏｃ－Ｎ－メチルジエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン－カンプトテシン）１５７．０ｍｇをジクロロメタン３ｍＬ及び１．３ｍＬトリフルオロ酢酸に溶解し、氷水浴に置いて、恒温下で１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法による検出を通じて、反応が終了したことを確認した。反応終了後、回転乾燥して溶媒を除去した。また、ジクロロメタン２ｍＬを加えて２回で回転乾燥した。化合物ｊ１２０ｍｇを得た。そのままに次の反応に使用した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝７０８．３。

【0080】

７）式（１）の化合物（マレイミドヘキサン酸－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－（Ｎ－メチルジエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン）－カンプトテシン）の合成方法

【0081】

Ｍｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（マレイミドヘキサン酸－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－ｐ－ニトロフェニル基カーボネート）５２ｍｇと化合物ｊ３５ｍｇをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２．５ｍＬに溶解した後、氷水浴で３０分間撹拌し、ＤＩＰＥＡ１２９ｍｇを滴下して氷水浴で０．５時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法により検出されたところ、反応は終了していなかった。次に、ＤＩＰＥＡ１２９ｍｇを加え、室温下で０．５時間撹拌したところ、反応液が黄色に変化し、ＬＣ－ＭＳ法により反応終了を確認した。反応終了後、低温下で回転乾燥して溶剤を除去し、ＳｕｎＦｉｒｅ（登録商標）ＰｒｅｐＣ１８ＯＢＤＴＭ５ｕｍ、１９×２５０ｍｍＣｏｌｕｍｎを分取カラムとし、ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ａとし、Ｈ_２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ｂとして分取精製クロマトグラフィーを行った。ＬＣ－ＭＳによりモニターしながら純品を収集し、式（１）の化合物２０ｍｇを收率２０．５％で固形物として得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝１３０７．６。

【0082】

実施例４ 式（９）化合物の調製方法

【化27】

【0083】

実施例３での合成経路に従って式（９）化合物（マレイミディエトキシ－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－（Ｎ－メチルジエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエチレンジアミン）－カンプトテシン）調製した。具体的には、ＭＰ２－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（マレイミドジエトキシ－Ｌ－バリル－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジル－ｐ－ニトロフェニル基カーボネート）（５２ｍｇ）と化合物ｊ（３４ｍｇ）ｊをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２．５ｍＬに溶解した後、氷水浴で３０分間撹拌し、ＤＩＰＥＡ（３６ｍｇ）を滴下して氷水浴で０．５時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳ法により検出されたところ、反応は終了していなかった。次に、ＤＩＰＥＡ（８ｍｇ）を加え、室温下で１．５時間撹拌したところ、反応液が黄色に変化し、ＬＣ－ＭＳ法により反応終了を確認した。反応終了後、低温下で回転乾燥して溶剤を除去し、ＳｕｎＦｉｒｅ（登録商標）ＰｒｅｐＣ１８ＯＢＤＴＭ５ｕｍ、１９×２５０ｍｍＣｏｌｕｍｎを分取カラムとし、ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ａとし、Ｈ_２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨを移動相Ｂとして分取精製クロマトグラフィーを行った。ＬＣ－ＭＳによりモニターしながら純品を収集し、式（９）の化合物２３ｍｇを收率３５．２％で固形物として得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋＝１３２５．４。

【0084】

実施例５ ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対するＡＤＣ－１の阻害効果

【0085】

式（１）の化合物とＣＬ２Ａ－ＳＮ３８中間体を、それぞれ本技術分野での常法によりヘーセプチンにスルフヒドリル基コンジュゲートし（例えば、中国特許出願公開第ＣＮ１０２４４８４９４Ａ号明細書の実施例１２を参照）、平均ＤＡＲ値８のＡＤＣ－１及びＨＥＲ２－ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（ＡＤＣ－１７）抗体－薬物コンジュゲートを調製した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞をトリプシンで消化し、細胞密度５００００個／ｍｌに調整した後、１００μＬ／ウェルで細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１４～２０時間培養した。それぞれ基礎培地でサンプル群及び対照群（被験試料の組成は表１を参照のこと）を勾配希釈し、１００μＬ／ウェルで細胞をプレートした細胞培養プレートに移し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで７０～７４時間培養した。ＣＣＫ－８を培地で１０倍希釈し、９６ウェルプレートの古い培地を捨て、希釈したＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１００μＬ加え、５％ＣＯ_２で２～４時間発色させ、遠心して気泡を除去した後、プレートをマイクロプレートリーダーで検出波長４５０ｎｍ／６５５ｎｍで検出して読み取った。結果を表２に示す。

【0086】

【表3】

【0087】

【表4】

【0088】

試験の結果、ＡＤＣ－１群とＡＤＣ－１７群はＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して同等の阻害効果を示したことが明らかになった。

【0089】

実施例６ 安定性に関する実験研究

【0090】

１）式（１）の化合物（２．１ｍｇ）とＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（２．１ｍｇ）を精密に秤量し、それぞれＤＭＳＯ７００μＬに溶解した

【0091】

２）ｐＨが６、７、８であるＰＢ（０．２Ｍ）緩衝液をそれぞれ調製した。

【0092】

３）式（１）の化合物のＤＭＳＯ溶液５０μＬを取って遠心チューブに加え、化合物濃度が６０μｇ／ｍＬとなるようにｐＨ＝６のＰＢ（０．２Ｍ）緩衝液９５０μＬを加えた。３７℃の恒温系に置かれた。ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８のＤＭＳＯ溶液５０μＬを取って遠心チューブに加え、化合物濃度が６０μｇ／ｍＬとなるようにｐＨ＝６のＰＢ（０．２Ｍ）緩衝液９５０μＬを加えた。３７℃の恒温系に置かれた。

【0093】

４）０ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、２４ｈ、４８ｈにそれぞれ４０μＬの試料を採取し、１２０μＬのアセトニトリルを加え、遠心分離した。上清をＬＣ－ＭＳによる定量に供した。

【0094】

５）結果の処理：

【0095】

Ｔ＝０ｈのＬＣ－ＭＳ濃度を基準とし、Ｔ／Ｔ_０ ^×１００％で算出した。結果をそれぞれ表３及び表４に示す。

【0096】

【表5】

【0097】

ｐＨが６である場合は、式（１）の化合物は４８時間後に２１．２％分解した。

【0098】

ｐＨが７である場合は、式（１）の化合物は４８時間後に８７．８％分解した。

【0099】

ｐＨが８である場合は、式（１）の化合物は４８時間後に９８．７％分解した。

【0100】

【表6】

【0101】

ｐＨが６である場合は、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８は４８時間後に９８．０％分解した。

【0102】

ｐＨが７である場合は、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８は４８時間後に９８．１％分解した。

【0103】

ｐＨが８である場合は、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８は４８時間後に９８．１％分解した。

【0104】

表３～表４の結果から、以下のことが分かった。

【0105】

１）弱酸性条件下では、式（１）の化合物の方がＣＬ２Ａ－ＳＮ３８よりも安定であった。

【0106】

２）式（１）の化合物は中性条件下で６ｈで１８％分解し、２４ｈで７５％分解し、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８は中性条件で６ｈで４３％分解し、２４ｈで９８％分解した。

【0107】

３）アルカリ性条件下では、式（１）の化合物は２４ｈで９７％分解し、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８は２４ｈで９８％分解した。

【0108】

したがって、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８と比較して、本発明で調製された式（１）の化合物は、生体内の弱酸性又は中性条件下でより高い安定性を有しており、ＡＤＣ医薬品の安全性を著しく向上させることが期待される。

【0109】

実施例７ 同所性乳癌の発症に対する抗Ｈｅｒ２薬物コンジュゲートの阻害効果の評価

【0110】

１．試験方法

【0111】

ＢＴ４７４細胞株を１～２世代復活増殖させ、細胞増殖状態が安定した後、拡大培養を行い、腫瘍細胞懸濁液を調製し、ＢＴ４７４細胞をヌードマウスクリームパッドに０．２×１０^７個接種し、合計６０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに接種した。平均腫瘍体積が約７０ｍｍ^３達した時点で、４２匹のマウスを選択し、腫瘍体積に応じて無作為に各群７匹ずつ６群に分けた：陰性対照群である対照群１（通常生理食塩水群）、対照群２（ＡＤＣ－１７）、実験群１（ＡＤＣ－４）、実験群２（ＡＤＣ－１２）、実験群３（ＡＤＣ－１）、実験群４（ＡＤＣ－９）。モデルの確立に成功した後、上記のグループ分けに従って、対照群１には通常の生理食塩水を静脈内投与し、残りの群には対照群２には５ｍｇ／ｋｇ、実験群１には５ｍｇ／ｋｇ、実験群２には５ｍｇ／ｋｇ、実験群３には５ｍｇ／ｋｇ、実験群４には５ｍｇ／ｋｇの用量の薬剤を週１回、２１週間静脈内投与した。マウスの体重と腫瘍体積を週３回測定し、２１日目にマウスの体重と腫瘍体積を測定した。

【0112】

２．試験結果と解析

【0113】

１）マウス体重の変化：

【0114】

【表7】

【0115】

試験中に死亡したマウスはいなかった。試験終了時、対照群１と比べて、対照群２（ＡＤＣ－１７群）、実験群１（ＡＤＣ－４）、実験群２（ＡＤＣ－１２）、実験群３（ＡＤＣ－１）、実験群４（ＡＤＣ－９）の各群は、体重に有意差は認められなかった。詳細は表５および図１を参照のこと。

【0116】

２）マウス腫瘍体積：

【0117】

【表8】

注：各群を対照群１である生理食塩水群と比較した場合、「^＊」はＰ＜０．０５を表し、「^＊＊」はＰ＜０．０１を表す。
各群を対照群２と比較した場合、「^＃」はＰ＜０．０５を表し、「^＃＃」はＰ＜０．０１を表す。

【0118】

対照群１における腫瘍体積は投与後２１日目に１０７±１９．３０ｍｍ^３に達し、対照群２、実験群１、実験群２、実験群３、実験群４の五つの群における腫瘍体積はそれぞれ４９．１７±１３．２９、５７．１２±２０．２８、６６．２６±２１．３７、６１．３２±１２．８２、７５．７６±４６．１８、７５．１９±２５．９９ｍｍ^３（表６を参照）に達した。対照群２、実験群１、実験群２、実験群３の四つの群は対照群１（生理食塩水群）と比べると統計学的に非常に有意な差（Ｐ＜０．０１）を示し、実験群４は対照群１と比べると統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。実験群１、実験群２、実験群３の四つの群における腫瘍体積は対照群２と比べると統計学的に有意な差（Ｐ＞０．０５）を示さなく、また相対腫瘍体積も有意な差（Ｐ＞０．０５）を示さなかったので、効果は同等であったと言える。また、対照群２、実験群１、実験群２、実験群３、実験群４の五つの群における相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）は、それぞれ４９．３０％、５５．００％、６２．５８％、６２．４８％、６７．１９％及び６３．２０％であった。以上のデータから、本実験で試験された対照群２、実験群１、実験群２、実験群３に対応する四つの抗体－薬物コンジュゲートはいずれも、ＢＴ４７４腫瘍の増殖を同等の効果で非常的有意に抑制することができ、実験群４もＢＴ４７４腫瘍の増殖を抑制することができたことがわかる。試験中の各群の腫瘍体積および相対腫瘍体積の変化をそれぞれ図２および図３に示す。

【0119】

要するに、本発明の薬物コンジュゲートの中間体を用いて構築されたＡＤＣは、乳癌ＢＴ４７４細胞モデルに対して有意な抗腫瘍活性を示した。好ましいＡＤＣ－１、ＡＤＣ－４、およびＡＤＣ－１２は、明らかな利点を有し、体内の条件下での安全性を大幅に改善するとともに、ＡＤＣ－１７群に匹敵する腫瘍抑制効果を提供することが期待された。

【0120】

本発明については、様々な具体例を挙げながら説明したが、本発明は諸具体例に限定されず、通常の技術者が本発明の範囲内で様々な変更または修正を行い得、また、本明細書に言及された各技術的特徴は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、互いに組み合わせる可能性があり、そのような変更や修正も本発明の範囲内にあることが、当業者であれば理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】