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特表2024-533596トランスファーＲＮＡの組成、及び非標準アミノ酸を含むタンパク質の生産における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】トランスファーＲＮＡの組成、及び非標準アミノ酸を含むタンパク質の生産における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240905BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240905BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240905BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240905BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/113 130Z
C12P21/00 C
C12N1/21
C12N1/19
C12N5/10
C12N5/04
C12N5/071
C12N15/63 Z
C07K16/00
C12P21/00 H
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517054
(86)(22)【出願日】2022-09-16
(85)【翻訳文提出日】2024-04-22
(86)【国際出願番号】 US2022076575
(87)【国際公開番号】W WO2023044431
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】63/245,789
(32)【優先日】2021-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524101629
【氏名又は名称】アブサイ コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】チャン イ
(72)【発明者】
【氏名】ウェインストック マシュー
(72)【発明者】
【氏名】ガンダー マイルズ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG13
4B064AG26
4B064CA01
4B064CA06
4B064CA10
4B064CA11
4B064CC24
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA72X
4B065AA87
4B065AA89X
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AB03
4B065AB04
4B065AB05
4B065AB06
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA09
4H045BA54
4H045CA11
4H045DA46
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、非標準アミノ酸を含むタンパク質を効率的に生産するための改変ｔＲＮＡ及び対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を提供する。これらの改変された直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）／直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）のペア（すなわち、直交性翻訳系（ＯＴＳ））は、改変ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンに応じて、成長中のポリペプチドの特定の位置に非標準アミノ酸を組み込むために使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつ直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）の核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、前記Ｏ－ｔＲＮＡが、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）によって少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化され得る、前記Ｏ－ｔＲＮＡ。
【請求項2】
前記核酸配列が、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である、請求項１に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項3】
核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１または２に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項4】
配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項３に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項5】
核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１または２に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項6】
配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項５に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項7】
配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項8】
核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１または２に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項9】
配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡであって、前記配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、前記Ｏ－ｔＲＮＡ。
【請求項10】
３位にシトシンを含む、請求項９に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項11】
４位にアデニンを含む、請求項９または１０に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項12】
５位にウラシルを含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項13】
６位にシトシンを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項14】
７位にウラシルを含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項15】
４６位にグアニンを含む、請求項９～１４のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項16】
４８位にウラシルを含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項17】
５０位にアデニンを含む、請求項９～１６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項18】
５１位にグアニンを含む、請求項９～１７のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項19】
５３位にアデニンを含む、請求項９～１８のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項20】
６３位にウラシルを含む、請求項９～１９のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項21】
６５位にシトシンを含む、請求項９～２０のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項22】
６６位にウラシルを含む、請求項９～２１のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項23】
６７位にアデニンを含む、請求項９～２２のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項24】
６８位にグアニンを含む、請求項９～２３のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項25】
６９位にアデニンまたはウラシルを含む、請求項９～２４のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項26】
７０位にウラシルを含む、請求項９～２５のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項27】
７１位にグアニンを含む、請求項９～２６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項28】
３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む、請求項９～２７のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項29】
４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む、請求項９～２８のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項30】
６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む、請求項９～２９のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項31】
配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む、Ｏ－ｔＲＮＡ。
【請求項32】
アミノアシル化されている、請求項１～３１のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項33】
ｎｓＡＡでアミノアシル化されている、請求項３２に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項34】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である、請求項３３に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項35】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項36】
前記ｎｓＡＡが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３～３５のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項37】
前記ｎｓＡＡが、チロシン類似体を含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項38】
前記チロシン類似体が、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される、請求項３７に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項39】
前記置換チロシンが、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項40】
前記ｎｓＡＡが、グルタミン類似体を含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項41】
前記グルタミン類似体が、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む、請求項４０に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項42】
前記ｎｓＡＡが、フェニルアラニン類似体を含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項43】
前記フェニルアラニン類似体が、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である、請求項４１に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項44】
前記フェニルアラニン類似体が、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項４２または４３に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項45】
前記置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む、請求項４４に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項46】
前記ｎｓＡＡがパラ－アセチルフェニルアラニンを含む、請求項４５に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項47】
前記ｎｓＡＡが、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項48】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項49】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む、請求項４８に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項50】
前記ｎｓＡＡが、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む、請求項４８に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項51】
前記ｎｓＡＡが、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む、請求項４８に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項52】
前記ｎｓＡＡが、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む、請求項４８に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項53】
化学的にアミノアシル化されている、請求項３２～３４のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項54】
酵素的にアミノアシル化されている、請求項３２～３４のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項55】
リボザイムによって酵素的にアミノアシル化されている、請求項５４に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項56】
古細菌ｔＲＮＡに由来する、請求項１～５５のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項57】
Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来する、請求項５６に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項58】
配列番号３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、直交性ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）。
【請求項59】
請求項１～５７のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡとＯ－ＲＳとを含む、直交性翻訳系（ＯＴＳ）。
【請求項60】
前記Ｏ－ＲＳが、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳを含む、請求項５９に記載のＯＴＳ。
【請求項61】
前記Ｏ－ＲＳが、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載のＯＴＳ。
【請求項62】
前記ｎｓＡＡをさらに含む、請求項５９または６０に記載のＯＴＳ。
【請求項63】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である、請求項５９～６２のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項64】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６２または６３に記載のＯＴＳ。
【請求項65】
前記ｎｓＡＡが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６２～６４のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項66】
前記ｎｓＡＡが、チロシン類似体を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項67】
前記チロシン類似体が、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される、請求項６６に記載のＯＴＳ。
【請求項68】
前記置換チロシンが、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６７に記載のＯＴＳ。
【請求項69】
前記ｎｓＡＡが、グルタミン類似体を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項70】
前記グルタミン類似体が、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む、請求項６９に記載のＯＴＳ。
【請求項71】
前記ｎｓＡＡが、フェニルアラニン類似体を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項72】
前記フェニルアラニン類似体が、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である、請求項７１に記載のＯＴＳ。
【請求項73】
前記フェニルアラニン類似体が、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項７１または７２に記載のＯＴＳ。
【請求項74】
前記置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む、請求項７３に記載のＯＴＳ。
【請求項75】
前記ｎｓＡＡが、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む、請求項７４に記載のＯＴＳ。
【請求項76】
前記ｎｓＡＡが、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項６２～６５のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項77】
前記ｎｓＡＡが、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシンを含む、請求項７６に記載のＯＴＳ。
【請求項78】
前記ｎｓＡＡが、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニンを含む、請求項７６に記載のＯＴＳ。
【請求項79】
前記Ｏ－ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識する、請求項５９～７８のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項80】
前記セレクターコドンがアンバーコドンである、請求項７９に記載のＯＴＳ。
【請求項81】
前記Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７９または８０に記載のＯＴＳ。
【請求項82】
変異体ＥＦ－Ｔｕをさらに含む、請求項５９～８１のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項83】
前記ＯＴＳが無細胞翻訳系である、請求項５９～８２のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項84】
前記無細胞翻訳系が細胞ライセートである、請求項８３に記載のＯＴＳ。
【請求項85】
前記無細胞翻訳系が、再構成された系である、請求項８３に記載のＯＴＳ。
【請求項86】
前記ＯＴＳが細胞翻訳系である、請求項５９～８２のいずれか１項に記載のＯＴＳ。
【請求項87】
請求項５９～８６のいずれか１項に記載のＯＴＳを含む、細胞。
【請求項88】
非真核細胞または原核細胞である、請求項８７に記載の細胞。
【請求項89】
前記原核細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項８８に記載の細胞。
【請求項90】
真核細胞である、請求項８４に記載の細胞。
【請求項91】
酵母細胞である、請求項９０に記載の細胞。
【請求項92】
真菌細胞である、請求項９０に記載の細胞。
【請求項93】
哺乳類細胞である、請求項９０に記載の細胞
【請求項94】
昆虫細胞である、請求項９０に記載の細胞。
【請求項95】
植物細胞である、請求項９０に記載の細胞。
【請求項96】
ＥＦ－Ｔｕの変異をコードする、請求項８４～９０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項97】
翻訳終結因子１の発現が減少している以外は同一の野生型細胞と比較して、翻訳終結因子１の発現が減少している、請求項８４～９６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項98】
少なくとも１つのｎｓＡＡを含むポリペプチドであって、請求項５９～８１のいずれか１項に記載のＯＴＳまたは請求項８４～９０のいずれか１項に記載の細胞によって産生される、前記ポリペプチド。
【請求項99】
抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項９８に記載のポリペプチド。
【請求項100】
ヒト成長ホルモンを含む、請求項９８に記載のポリペプチド。
【請求項101】
配列番号２～３１のいずれか１項に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡの核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項102】
配列番号２～３１のいずれか１つに記載の配列からなるＯ－ｔＲＮＡ配列に相補的な核酸配列をさらに含む、請求項１０１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項103】
配列番号３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含むＯ－ＲＳをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項104】
配列番号３９に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ＲＳに相補的な核酸配列をさらに含む、請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項105】
配列番号２～３１のいずれか１つに記載の核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡの核酸配列と、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡのＯ－ＲＳをコードする核酸配列とを含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
【請求項106】
前記Ｏ－ＲＳが、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項１０５に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
【請求項107】
請求項１０１～１０５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項108】
発現ベクターである、請求項１０７に記載のベクター。
【請求項109】
プラスミド、コスミド、ファージ、及びウイルスからなる群から選択される、請求項１０８に記載のベクター。
【請求項110】
請求項１０１～１０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０７～１０９のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項111】
請求項１０１～１０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド（複数可）、請求項１０７～１０９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項８４～９０もしくは１１０のいずれか１項に記載の細胞のうちの１つ以上と、使用説明書と、を含む、キット。
【請求項112】
少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程であって、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、前記Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって前記少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、前記工程
を含む、前記方法。
【請求項113】
前記核酸配列が、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項115】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項117】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項118】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号４に記載の核酸配列を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項119】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項120】
少なくとも１つのｎｓＡＡを含むポリペプチドを生産する方法であって、配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡであって、前記配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、前記Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程
を含む、前記方法。
【請求項121】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが３位にシトシンを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項122】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４位にアデニンを含む、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項123】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５位にウラシルを含む、請求項１１８～１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項124】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６位にシトシンを含む、請求項１１８～１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項125】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７位にウラシルを含む、請求項１１８～１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項126】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４６位にグアニンを含む、請求項１１８～１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項127】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４８位にウラシルを含む、請求項１１８～１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項128】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５０位にアデニンを含む、請求項１１８～１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項129】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５１位にグアニンを含む、請求項１１８～１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項130】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５３位にアデニンを含む、請求項１１８～１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項131】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６３位にウラシルを含む、請求項１１８～１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項132】
６５位にシトシンを含む、請求項１１８～１２９のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項133】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６６位にウラシルを含む、請求項１１８～１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項134】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６７位にアデニンを含む、請求項１１８～１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項135】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６８位にグアニンを含む、請求項１１８～１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項136】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６９位にアデニンまたはウラシルを含む、請求項１１８～１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項137】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７０位にウラシルを含む、請求項１１８～１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項138】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７１位にグアニンを含む、請求項１１８～１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項139】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む、請求項１１８～１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項140】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む、請求項１１８～１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項141】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む、請求項１１８～１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項142】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１１８～１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項143】
前記細胞内でＯ－ＲＳを発現させる工程をさらに含む、請求項１１２～１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項144】
前記Ｏ－ＲＳが、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳである、請求項１１２～１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項145】
前記Ｏ－ＲＳが、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項146】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の核酸を含み、前記Ｏ－ＲＳが、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項147】
前記Ｏ－ＲＳが、前記Ｏ－ｔＲＮＡを前記ｎｓＡＡでアミノアシル化する、請求項１１２～１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項148】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である、請求項１４２～１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項149】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項150】
前記ｎｓＡＡが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、及びポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１０～１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項151】
前記ｎｓＡＡが、チロシン類似体を含む、請求項１１０～１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項152】
前記チロシン類似体が、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項153】
前記置換チロシンが、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記ｎｓＡＡが、グルタミン類似体を含む、請求項１１０～１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項155】
前記グルタミン類似体が、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項156】
前記ｎｓＡＡが、フェニルアラニン類似体を含む、請求項１１０～１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項157】
前記フェニルアラニン類似体が、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項158】
前記フェニルアラニン類似体が、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１５６または１５７に記載の方法。
【請求項159】
前記置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む、請求項１１０～１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項160】
前記ｎｓＡＡが、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項161】
前記ｎｓＡＡが、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１１０～１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項162】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される、請求項１４２～１５０のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項163】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項164】
前記ｎｓＡＡが、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項165】
前記ｎｓＡＡが、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項166】
前記ｎｓＡＡが、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項167】
前記ｎｓＡＡが前記細胞によって生合成される、請求項１１０～１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項168】
前記ｎｓＡＡが前記細胞に外因的に与えられる、請求項１１０～１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項169】
前記細胞が非真核細胞または原核細胞である、請求項１４２～１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項170】
前記原核細胞が大腸菌である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項171】
前記細胞が真核細胞である、請求項１１０～１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項172】
前記真核細胞が酵母細胞である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項173】
前記真核細胞が真菌細胞である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項174】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項175】
前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項176】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項177】
前記Ｏ－ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識する、請求項１１０～１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項178】
前記セレクターコドンがアンバーコドンである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項179】
前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１１０～１７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項180】
前記ポリペプチドがヒト成長ホルモンを含む、請求項１１０～１７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項181】
少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、ｉ）配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、前記Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、前記Ｏ－ｔＲＮＡと、
ｉｉ）ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡをアミノアシル化するＯ－ＲＳと、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含む、前記ポリヌクレオチドと、
を提供する工程
を含む、前記方法。
【請求項182】
前記核酸配列が、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項183】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１８１または１８２に記載の方法。
【請求項184】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１８３に記載の方法。
【請求項185】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１８１または１８２に記載の方法。
【請求項186】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項187】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項188】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、前記核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものである、請求項１８１または１８２に記載の方法。
【請求項189】
少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、ｉ）配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡであって、前記配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、前記Ｏ－ｔＲＮＡと、
ｉｉ）ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡをアミノアシル化するＯ－ＲＳと、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含む、前記ポリヌクレオチドと、
を提供する工程
を含む、前記方法。
【請求項190】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが３位にシトシンを含む、請求項１８６に記載の方法。
【請求項191】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４位にアデニンを含む、請求項１８６または１８７に記載の方法。
【請求項192】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５位にウラシルを含む、請求項１８６～１８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項193】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６位にシトシンを含む、請求項１８６～１８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項194】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７位にウラシルを含む、請求項１８６～１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項195】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４６位にグアニンを含む、請求項１８６～１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項196】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが４８位にウラシルを含む、請求項１８６～１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項197】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５０位にアデニンを含む、請求項１８６～１９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項198】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５１位にグアニンを含む、請求項１８６～１９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項199】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが５３位にアデニンを含む、請求項１８６～１９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項200】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６３位にウラシルを含む、請求項１８６～１９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項201】
６５位にシトシンを含む、請求項１８６～１９７のいずれか１項に記載のＯ－ｔＲＮＡ。
【請求項202】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６６位にウラシルを含む、請求項１８６～１９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項203】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６７位にアデニンを含む、請求項１８６～１９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項204】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６８位にグアニンを含む、請求項１８６～２００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項205】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが６９位にアデニンまたはウラシルを含む、請求項１８６～２０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項206】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７０位にウラシルを含む、請求項１８６～２０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項207】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが７１位にグアニンを含む、請求項１８６～２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項208】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む、請求項１８６～２０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項209】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む、請求項１８６～２０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項210】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む、請求項１８６～２０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項211】
前記Ｏ－ｔＲＮＡが、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む、請求項１８６～２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項212】
前記Ｏ－ＲＳが、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳを含む、請求項１８６～２０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項213】
前記Ｏ－ＲＳが、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項214】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である、請求項１８６～２０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項215】
前記ｎｓＡＡが、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１４に記載の方法。
【請求項216】
前記ｎｓＡＡが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８６～２１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項217】
前記ｎｓＡＡが、チロシン類似体を含む、請求項１８６～２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項218】
前記チロシン類似体が、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される、請求項２１７に記載の方法。
【請求項219】
前記置換チロシンが、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１８に記載の方法。
【請求項220】
前記ｎｓＡＡが、グルタミン類似体を含む、請求項１８６～２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項221】
前記グルタミン類似体が、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、アミド置換グルタミン誘導体を含む、請求項２２０に記載の方法。
【請求項222】
前記ｎｓＡＡが、フェニルアラニン類似体を含む、請求項１８６～２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項223】
前記フェニルアラニン類似体が、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である、請求項２２２に記載の方法。
【請求項224】
前記フェニルアラニン類似体が、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項２２２または２２３に記載の方法。
【請求項225】
前記置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む、請求項２２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項226】
前記ｎｓＡＡが、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項227】
前記ｎｓＡＡが、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１８６～２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項228】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される、請求項１８６～２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項229】
前記ｎｓＡＡが、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項230】
前記ｎｓＡＡが、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項231】
前記ｎｓＡＡが、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項232】
前記ｎｓＡＡが、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項233】
前記セレクターコドンがアンバーコドンである、請求項１８６～２３２に記載の方法。
【請求項234】
前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１８６～２３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項235】
前記ポリペプチドがヒト成長ホルモンを含む、請求項１８６～２３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項236】
前記ポリペプチドが無細胞翻訳系によって産生される、請求項１８６～２３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項237】
前記無細胞翻訳系が細胞ライセートである、請求項２３６に記載の方法。
【請求項238】
前記無細胞翻訳系が、再構成された系である、請求項２３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、全容を参照により本明細書に援用するところの２０２１年９月１７日出願の米国特許仮出願第６３／２４５，７８９号の利益及び当該出願に基づく優先権を主張する。
本出願は、全容を参照により本明細書に援用するところの２０２１年９月１７日出願の米国特許仮出願第６３／２４５，７８９号の利益及び当該出願に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
タンパク質はほぼすべての生物学的プロセスに遍在的に関与しているが、その大部分は、限られた官能基群（アミン、カルボン酸、アミド、アルコール、チオールなど）を有するわずか２０種類の標準アミノ酸から生合成される。合成生物学の目標の１つは、生物によって利用される元素記号（ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｐｈａｂｅｔ）を拡大することである。非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）をタンパク質に組み込むことができれば、従来製造が困難だった分子の製造を効率化する新しい化学的手法が可能となることから、タンパク質発現系において非常に望ましい特性である。例えば、穏やかな水性条件下で部位特異的結合を助けるｎｓＡＡを生物製剤に組み込むことで、半減期延長部分（例えば、ＰＥＧ）、均一なグリカン構造、及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を結合させるための極めて単純化された経路が与えられると考えられる。
タンパク質はほぼすべての生物学的プロセスに遍在的に関与しているが、その大部分は、限られた官能基群（アミン、カルボン酸、アミド、アルコール、チオールなど）を有するわずか２０種類の標準アミノ酸から生合成される。合成生物学の目標の１つは、生物によって利用される元素記号（ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｐｈａｂｅｔ）を拡大することである。非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）をタンパク質に組み込むことができれば、従来製造が困難だった分子の製造を効率化する新しい化学的手法が可能となることから、タンパク質発現系において非常に望ましい特性である。例えば、穏やかな水性条件下で部位特異的結合を助けるｎｓＡＡを生物製剤に組み込むことで、半減期延長部分（例えば、ＰＥＧ）、均一なグリカン構造、及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を結合させるための極めて単純化された経路が与えられると考えられる。
【0003】
タンパク質及びペプチドへのｎｓＡＡの組み込みは、一般的には、新規ｔＲＮＡ上に目的のｎｓＡＡをアミノアシル化できる改変トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のペア、すなわち、直交性翻訳系（ＯＴＳ）の発現によって行われる。ｎｓＡＡを含む目的のタンパク質の効率的な生産を行うには、改変ｔＲＮＡがその同族のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって選択的にアミノアシル化される一方でタンパク質発現系内のすべての内因性ａａＲＳに対して不活性を維持する必要がある。得られたアミノアシルｔＲＮＡがリボソームのＡ部位に移動するには、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ－Ｔｕ）によって効率的に認識されなければならない。すなわち、アミノアシルｔＲＮＡは、リボソームのＡ部位に結合した後、ペプチジルトランスフェラーゼの基質として翻訳において効率的に機能する必要があり、最後に、成長するペプチド鎖を保持するｔＲＮＡがＰ部位に転座し、別のアシル転移反応を受けて、リボソームから放出される必要がある。
【0004】
ＯＴＳのパフォーマンスは、忠実度と効率という２つの主要なパラメータの観点から定義できる。忠実度とは、再割り当てされたコドンがリボソームによって、他のアミノ酸として誤って読み取られるのではなく、ｎｓＡＡとして読み取られる精度を指す。ＯＴＳの忠実度が低いと、再割り当てされた各コドンにｎｓＡＡ及び１つ以上の他のアミノ酸を有するタンパク質の混合物が生成され、精製プロセスが大幅に複雑になり、さらには分離が不可能になる場合もある。効率は、ＯＴＳ及びｎｓＡＡの存在下でリボソームが再割り当てされるコドンをどれだけ効果的に読み取ることができるかを反映する。ｎｓＡＡの組み込み系の効率が低いと、目的のタンパク質の収量が低下する。望ましいＯＴＳは、発酵の全過程を通じて忠実度と効率の両方の点でバランスの取れたプロファイルを備えている必要がある。理想的には、標準アミノ酸のミスチャージが無視できる程度であり、リードスルー効率が野生型ＤＮＡ配列の翻訳と比較して良くないまでもそれに近いものであることである。
【0005】
さまざまな由来源のＯＴＳが改変され、細菌タンパク質発現系において、ｎｓＡＡを含むタンパク質の生産に使用されている。例えば、古細菌メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のＯＴＳが、光親和性標識及び光異性化可能なアミノ酸、光架橋性アミノ酸を含む、新規な化学的、物理的または生物学的特性を有する多くの新たなアミノ酸用に改変されており（Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０－１１０２４（非特許文献１）；及びＣｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６－９０２７（非特許文献２）を参照）、ケトアミノ酸（Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５６－６１（非特許文献３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５－６７４６（２００３）（非特許文献４）を参照）、重原子含有アミノ酸、及びグリコシル化アミノ酸が、アンバーコドン（ＴＡＧ）に応じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内のタンパク質に効率的かつ高い忠実度で組み込まれている。グルタミニル系（例えば、Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０－４７８５（非特許文献５）を参照）、アスパルチル系（例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３：２２７７ ２２８６（非特許文献６）を参照）、チロシル系（例えば、Ｏｈｎｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊｐｎ．）１２４：１０６５－１０６８（非特許文献７）；及びＫｏｗａｌ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８－２２７３（非特許文献８）を参照）、及び酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｔＲＮＡ及び合成酵素に由来する系が、大腸菌における非標準アミノ酸の潜在的な組み込みについて記載されている。
【0006】
非標準アミノ酸は通常、許容可能な効率と忠実度でタンパク質に組み込まれるが、タンパク質の収量を向上させるためには、さらなる体系的な最適化が強く望まれている。非標準アミノ酸の組み込みの程度はさまざまであるが、定量可能であることはごく稀であり、そのため、製品の量及び品質のプロファイルは最適とはいえない。従来知られているＯＴＳでは、細菌発現系の高細胞密度の発酵中に忠実度または効率が低下することが示されている。これらの短所は、生物製剤の生産専用に高度に最適化された細菌発現系で特に顕著である。したがって、ｎｓＡＡの応用範囲をさらに拡大するため、ＯＴＳの改良された、及び／またはさらなる構成成分、例えばｔＲＮＡの開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０－１１０２４
【非特許文献2】Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６－９０２７
【非特許文献3】Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５６－６１
【非特許文献4】Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５－６７４６（２００３）
【非特許文献5】Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０－４７８５
【非特許文献6】Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３：２２７７ ２２８６
【非特許文献7】Ｏｈｎｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊｐｎ．）１２４：１０６５－１０６８
【非特許文献8】Ｋｏｗａｌ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８－２２７３
【発明の概要】
【0008】
概要
特定の態様では、本明細書において、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつ直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）の核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）によって少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡが開示される。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。
特定の態様では、本明細書において、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつ直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）の核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）によって少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡが開示される。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。
【0009】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含み、配列は、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは３位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４６位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５０位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５３位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６３位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６４位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６５位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６６位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６７位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６８位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６９位にアデニンまたはウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７０位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む。
【0010】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２～１６に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、アミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、ｎｓＡＡでアミノアシル化される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡはチロシン類似体を含む。特定の実施形態では、チロシン類似体は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換チロシンは、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、グルタミン類似体を含む。特定の実施形態では、グルタミン類似体は、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、フェニルアラニン類似体を含む。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む。
【0011】
特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む。
【0012】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、化学的にアミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、酵素的にアミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、リボザイムによって酵素的にアミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、古細菌ｔＲＮＡに由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来する。
【0013】
特定の態様では、本明細書において、配列番号３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む直交性ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）が開示される。特定の態様では、本明細書に開示されるＯ－ｔＲＮＡとＯ－ＲＳとを含む直交翻訳系（ＯＴＳ）が本明細書に開示される。
【0014】
特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＯＴＳは、ｎｓＡＡをさらに含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡはチロシン類似体を含む。特定の実施形態では、チロシン類似体は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換チロシンは、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、グルタミン類似体を含む。特定の実施形態では、グルタミン類似体は、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、フェニルアラニン類似体を含む。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む。
【0015】
特定の実施形態では、ＯＴＳのｎｓＡＡは、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシンを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。特定の実施形態では、セレクターコドンはアンバーコドンである。
【0016】
特定の実施形態では、ＯＴＳは、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＯＴＳは、変異体ＥＦ－Ｔｕをさらに含む。特定の実施形態では、ＯＴＳは、無細胞翻訳系である。特定の実施形態では、無細胞翻訳系は、細胞ライセートである。特定の実施形態では、無細胞翻訳系は、再構成された系である。
【0017】
特定の実施形態では、ＯＴＳは、細胞翻訳系である。
【0018】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＯＴＳを含む細胞に関する。特定の実施形態では、細胞は、非真核細胞または原核細胞である。特定の実施形態では、原核細胞は、大腸菌である。特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。特定の実施形態では、細胞は、酵母細胞である。特定の実施形態では、細胞は、真菌細胞である。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態では、細胞は、植物細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＥＦ－Ｔｕの変異をコードする。特定の実施形態では、細胞は、翻訳終結因子１の発現が減少している以外は同一の野生型細胞と比較して、翻訳終結因子１の発現が減少している。
【0019】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むポリペプチドであって、本明細書に記載のＯＴＳまたは細胞によって産生される、ポリペプチドに関する。特定の実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドはヒト成長ホルモンを含む。
【0020】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の配列からなるＯ－ｔＲＮＡ配列に相補的な核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＯ－ＲＳをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｏ－ＲＳをコードする核酸配列に相補的な核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の核酸配列からなるＯ－ｔＲＮＡの核酸配列と、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列とを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。
【0021】
別の態様では、本明細書に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に記載される。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、及びウイルスからなる群から選択される。
【0022】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞に関する。
【0023】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（複数可）、ベクター、または細胞のうちの１つ以上と、使用説明書とを含むキットに関する。
【0024】
別の態様では、本明細書は、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産するための方法であって、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程を含む、方法に関する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。別の態様では、本開示は、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むポリペプチドを生産するための方法であって、配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡであって、配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程を含む、方法に関する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは３位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４６位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５０位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５３位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６３位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６４位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６５位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６６位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６７位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６８位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６９位にアデニンまたはウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７０位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む。
【0025】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む。
【0026】
特定の実施形態では、方法は、細胞内でＯ－ＲＳを発現させる工程をさらに含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは配列番号２～１６のいずれか１つに記載の核酸を含み、Ｏ－ＲＳは配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。
【0027】
この方法の特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、Ｏ－ｔＲＮＡをｎｓＡＡでアミノアシル化する。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、及びポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡはチロシン類似体を含む。特定の実施形態では、チロシン類似体は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換チロシンは、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、グルタミン類似体を含む。特定の実施形態では、グルタミン類似体は、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、またはアミド置換グルタミン誘導体を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、フェニルアラニン類似体を含む。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む。
【0028】
この方法の特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される。
【0029】
この方法の特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは細胞により生合成される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは細胞に外因的に与えられる。
【0030】
この方法の特定の実施形態では、細胞は、非真核細胞または原核細胞である。特定の実施形態では、原核細胞は、大腸菌である。特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、真菌細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。
【0031】
この方法の特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。特定の実施形態では、セレクターコドンはアンバーコドンである。特定の実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドはヒト成長ホルモンを含む。特定の態様では、本明細書において、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産するための方法であって、ｉ）配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡと、ｉｉ）ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡをアミノアシル化するＯ－ＲＳと、ｉｉｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと、を提供する工程を含む、方法が開示される。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニン、及び核酸の６３位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。
【0032】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、ｉ）配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含み、配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、Ｏ－ｔＲＮＡと、ｉｉ）ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡをアミノアシル化するＯ－ＲＳと、ｉｉｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含む、ポリヌクレオチドと、を提供する工程を含む、方法に関する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは３位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４６位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５０位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５３位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６３位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６４位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６５位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６６位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６７位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６８位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６９位にアデニンまたはウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７０位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む。
【0033】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素のＯ－ＲＳを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。
【0034】
この方法の特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸において使用される対応する置換基以外の任意の置換基である。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、式Ｉに従う構造を有し、ここで、Ｒ基は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、少なくとも１つの新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡはチロシン類似体を含む。特定の実施形態では、チロシン類似体は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換チロシンは、ケト基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、グルタミン類似体を含む。特定の実施形態では、グルタミン類似体は、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、アミド置換グルタミン誘導体を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、フェニルアラニン類似体を含む。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、アミノ含有、イソプロピル含有、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である。特定の実施形態では、フェニルアラニン類似体は、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基、またはアセチル基を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、パラ－アセチルフェニルアラニンを含む。
【0035】
特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）、及び４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アセチル－フェニルアラニン（ＡｃＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）を含む。特定の実施形態では、ｎｓＡＡは、４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）を含む。
【0036】
この方法の特定の実施形態では、セレクターコドンはアンバーコドンである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、抗体、その抗原結合フラグメントまたは成分、例えば、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖、抗体軽鎖、またはｓｃＦＶを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドはヒト成長ホルモンを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、無細胞翻訳系により産生される。特定の実施形態では、無細胞翻訳系は、細胞ライセートである。特定の実施形態では、無細胞翻訳系は、再構成された系である。
【0037】
本発明のこれらの特徴、態様、及び利点、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文及び添付の図面に関してより深い理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】本開示による候補ＯＴＳを含む例示的なコンストラクトのプラスミドマップの図である。
【0039】
【図2】振盪フラスコ発酵条件下で産生された、さまざまな戦略的部位にｎｓＡＡが組み込まれたトラスツズマブのＰｒｏＡ／ＰｈｙＴｉｐ精製後のウエスタンブロットの画像である。
【0040】
【図3】振盪フラスコ発酵条件下で産生された、Ｓ１２３がｐ－アセチルフェニルアラニンに置換されたトラスツズマブのＡＫＴＡ（商標）精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果の画像である。
【0041】
【図4】ＲＦＰ－ＧＦＰ融合タンパク質レポーターを使用して既知のＦ１２、Ｆ１３及びＦ１４ ＯＴＳと比較したＭＧ７２、ＭＧ３３及びＭＧ２４候補ＯＴＳの忠実度（平均最大誤組み込み頻度「ＭＭＦ」）及び効率（平均リードスルー効率「ＲＲＥ」）の評価を示すグラフである。平均ＯＤも示されている。
【0042】
【図5】ＭＧ７２、ＭＧ３３、ＭＧ２４及びＦ１２ ｔＲＮＡのｔＲＮＡクローバーリーフ構造及び配列の図である。
【0043】
【図6-1】本明細書に開示される候補ｔＲＮＡのさらなるｔＲＮＡクローバーリーフ構造及び配列の図である。
【図6-2】本明細書に開示される候補ｔＲＮＡのさらなるｔＲＮＡクローバーリーフ構造及び配列の図である。
【図6-3】本明細書に開示される候補ｔＲＮＡのさらなるｔＲＮＡクローバーリーフ構造及び配列の図である。
【図6-4】本明細書に開示される候補ｔＲＮＡのさらなるｔＲＮＡクローバーリーフ構造及び配列の図である。
【0044】
【図7】本明細書に開示される候補ｔＲＮＡ及びＦ１２、Ｆ１３、及びＦ１４ ｔＲＮＡの配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
詳細な説明
定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、特に断らない限り、以下に記載されるように定義される。
定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、特に断らない限り、以下に記載されるように定義される。
【0046】
本明細書で使用する場合、「直交性」という用語は、目的の系（例えば、翻訳系、例えば、細胞）によって利用される効率が低いか、または細胞の内因性成分では機能できない分子（例えば、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）及び／または直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ））を指す。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素との関連において、直交性とは、直交性ｔＲＮＡ及び／または直交性ＲＳが目的の翻訳系で機能できないか、または低い効率、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、または例えば１％未満の効率で機能することを指す。直交性分子は、細胞内の機能的な内因性相補分子を欠いている。例えば、目的の翻訳系内の直交性ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較した場合、目的の翻訳系の任意の内因性ＲＳによってアミノアシル化される効率が低いか、さらにはゼロである。別の例では、直交性ＲＳは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較した場合、目的の翻訳系の任意の内因性Ｏ－ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率が低いか、さらにはゼロである。第１の直交性分子とともに機能する第２の直交性分子を細胞に導入することができる。例えば、直交性ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、ｔＲＮＡ／ＲＳ標準アミノ酸ペアの効率に対して細胞内で一定の効率（例えば、約５０％の効率、約６０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８０％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、または約９９％以上の効率）で共に機能する導入された相補的成分を含む。
【0047】
「同族」という用語は、一緒に機能する成分、例えば、ｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を指す。これらの成分は、相補的ともいえる。
【0048】
「アミノアシル化する」という用語は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によるアミノ酸のｔＲＮＡへの転移を指す。
【0049】
「選択的にアミノアシル化する」という用語は、Ｏ－ＲＳが天然ｔＲＮＡまたはＯ－ｔＲＮＡを生産するために使用される出発物質をアミノアシル化する場合と比較して、Ｏ－ＲＳが選択されたアミノ酸、例えばｎｓＡＡで、Ｏ－ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率、例えば約７０％の効率、約７５％の効率、約８０％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、または約９９％以上の効率を指す。次いで、ｎｓＡＡは、高い忠実度、例えば、約７０％を超える忠実度、約７５％を超える忠実度、約８０％を超える忠実度、約８５％を超える忠実度、約９０％を超える忠実度、約９５％を超える忠実度、または約９９％を超える忠実度で、成長中のポリペプチド鎖に組み込まれる。
【0050】
「セレクターコドン」という用語は、翻訳プロセスにおいてＯ－ｔＲＮＡによって認識されるが、内因性ｔＲＮＡによっては認識されないコドンを指す。Ｏ－ｔＲＮＡのアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、その非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）をポリペプチドのこの部位に組み込む。セレクターコドンとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、アンバー、オーカー、オパールコドン、４個以上の塩基からなるコドン、稀少コドン、天然または非天然の塩基対に由来するコドンなどを含む終止コドンなどのナンセンスコドンが挙げられる。特定の系では、セレクターコドンは、内因性の系によって使用されない（または稀にしか使用されない）天然の３塩基コドンの１つを含んでもよい。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡが欠如している系、及び／または天然の３塩基コドンが稀少コドンである系が含まれる。
【0051】
「非標準アミノ酸」（ｎｓＡＡ）という用語は、タンパク質中に天然に存在しない任意のアミノ酸（例えば、天然に存在しない修飾アミノ酸またはアミノ酸類似体）を指す。言い換えると、非標準アミノ酸とは、セレノシステイン及び／またはピロリシン、ならびに遺伝暗号に用いられる以下の２０種類のα－アミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外のアミノ酸のことである。
【0052】
本出願で使用される略語としては、非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）、及び直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）が挙げられる。
【0053】
「翻訳系」という用語は、天然に存在するアミノ酸を成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）に組み込むために必要な構成成分を指す。翻訳系の構成成分には、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡなどが含まれ得る。本開示の構成成分は、インビトロまたはインビボの翻訳系に添加することができる。翻訳系の例としては、これらに限定されるものではないが、非真核細胞、例えば細菌（大腸菌など）、真核細胞、例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、無細胞翻訳系、例えば細胞ライセート、及び／またはこれらに類するものが挙げられる。
【0054】
２つ以上のポリペプチドまたは核酸の配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視により測定される、最大の一致について比較及び整列させた場合に、特定の比率（％）の同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【0055】
配列比較では、通常、１つの配列が、試験配列を比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一率（％）を算出する。
【0056】
比較を行うための配列同士の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．下記参照）によって行うことができる。
【0057】
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。
【0058】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示対象を含む点に留意されなければならない。
【0059】
本開示は、非標準アミノ酸を含むタンパク質を効率的に生産するためのｔＲＮＡ及び対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を提供する。これらの改変された直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）／直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）のペア（すなわち、直交性翻訳系（ＯＴＳ））は、ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンに応じて、成長中のポリペプチドの特定の位置にｎｓＡＡを組み込むために使用することができる。本開示は、既知の系と比較して、ｎｓＡＡの組み込みにおいて優れた忠実度及び効率を有する直交性翻訳系（ＯＴＳ）を提供する。
【0060】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）
本明細書では、非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化された直交性トランスファーＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）が記載される。Ｏ－ｔＲＮＡは、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質へのｎｓＡＡの組み込みを媒介する。
本明細書では、非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化された直交性トランスファーＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）が記載される。Ｏ－ｔＲＮＡは、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質へのｎｓＡＡの組み込みを媒介する。
【0061】
特定の態様では、本明細書において、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつ直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）の核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）によって少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）でアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡが記載される。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニンを、核酸の６３位にウラシルを含み、ここで、核酸の位置は配列番号１に記載の配列に対応する。いくつかの実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、アミノ酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。
【0062】
特定の実施態様では、本開示は、配列番号３６に記載の配列からなる核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡであって、配列が、配列番号１、配列番号３７、または配列番号３８を含まない、Ｏ－ｔＲＮＡに関する。
【0063】
配列番号３６は、以下のコンセンサス配列を提供する：
ＣＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＵＡＧＵＵＣＡＧＸ６ＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＣＵＡＡＡＵＣＣＧＣＡＸ７ＧＸ８ＣＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＵＣＡＡＡＵＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＧＧＡＣＣＡ
ここで、Ｘ１は、ＣまたはＧであり、Ｘ２は、ＡまたはＧであり、Ｘ３は、Ａ、ＵまたはＣであり、Ｘ４は、ＣまたはＧであり、Ｘ５は、ＵまたはＧであり、Ｘ６は、Ｃまたはｄｅｌであり、Ｘ７は、ＧまたはＵであり、Ｘ８は、ＧまたはＵであり、Ｘ９は、ＡまたはＧであり、Ｘ１０は、ＧまたはＣであり、Ｘ１１は、Ｇ、Ｃ、ＡまたはＵであり、Ｘ１２は、ＧまたはＡであり、Ｘ１３は、ＣまたはＵであり、Ｘ１４は、Ｇ、Ｃ、ＡまたはＵであり、Ｘ１５は、ＧまたはＣであり、Ｘ１６は、ＵまたはＣであり、Ｘ１７は、ＡまたはＣであり、Ｘ１８は、ＧまたはＣであり、Ｘ１９は、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｘ２０は、ＵまたはＣであり、Ｘ２１は、ＣまたはＧである。
ＣＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＵＡＧＵＵＣＡＧＸ６ＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＣＵＡＡＡＵＣＣＧＣＡＸ７ＧＸ８ＣＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＵＣＡＡＡＵＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＧＧＡＣＣＡ
ここで、Ｘ１は、ＣまたはＧであり、Ｘ２は、ＡまたはＧであり、Ｘ３は、Ａ、ＵまたはＣであり、Ｘ４は、ＣまたはＧであり、Ｘ５は、ＵまたはＧであり、Ｘ６は、Ｃまたはｄｅｌであり、Ｘ７は、ＧまたはＵであり、Ｘ８は、ＧまたはＵであり、Ｘ９は、ＡまたはＧであり、Ｘ１０は、ＧまたはＣであり、Ｘ１１は、Ｇ、Ｃ、ＡまたはＵであり、Ｘ１２は、ＧまたはＡであり、Ｘ１３は、ＣまたはＵであり、Ｘ１４は、Ｇ、Ｃ、ＡまたはＵであり、Ｘ１５は、ＧまたはＣであり、Ｘ１６は、ＵまたはＣであり、Ｘ１７は、ＡまたはＣであり、Ｘ１８は、ＧまたはＣであり、Ｘ１９は、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｘ２０は、ＵまたはＣであり、Ｘ２１は、ＣまたはＧである。
【0064】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは３位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４６位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５０位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは５３位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６３位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６４位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６５位にシトシンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６６位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６７位にアデニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６８位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは６９位にアデニンまたはウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７０位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは７１位にグアニンを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、３位にシトシン、６位にシトシン、及び７位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、４６位にグアニン、及び４８位にウラシルを含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、６７位にアデニン、６８位にグアニン、及び７１位にグアニンを含む。
【0065】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５２位にアデニン、核酸の６２位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５２位にグアニン、核酸の６２位にシトシンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５１位にグアニン、核酸の６５位にシトシンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６６位にアデニン、及び核酸の６７位及び７０位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５位及び７位にウラシル、核酸の６７位及び６９位にアデニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の４位及び６７位にアデニン、核酸の７位及び７０位にウラシル、核酸の６位にシトシン、及び核酸の６８位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５位にアデニン、核酸の６９位及び７０位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の４８位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の４６位にグアニン、核酸の４８位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５１位にグアニン、核酸の４８位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の４６位及び５１位にグアニン、核酸の４８位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。
【0066】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＯ－ｔＲＮＡは、野生型Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ（配列番号３２）と比較して１つ以上の突然変異を含むか、または、Ｆ１２ Ｏ－ｔＲＮＡ配列（配列番号１）、Ｆ１３ Ｏ－ｔＲＮＡ配列（配列番号３７）、またはＦ１４ Ｏ－ｔＲＮＡ配列（配列番号３８）と比較して１つ以上の変異を含む。例えば、特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのＴループのステムに存在するヌクレオチドが変異しており、例えば、Ｇ５３とＣ６３が、Ａ５２とＵ６２に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのＴループのステムに存在する対合ヌクレオチド、すなわち、Ｃ５２とＧ６４、またはＵ５２とＡ６４、またはＡ５２とＵ６４が、Ｇ５２とＣ６２に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのＴループのステムに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｃ５１とＧ６５が、Ｇ５１とＣ６５に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのアクセプターステムのステムに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｇ３、Ｇ６、Ｇ７、Ｃ６７、Ｃ６８及びＣ７１が、Ｃ３、Ｃ６、Ｕ７、Ａ６６、Ｇ６７及びＧ７０に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのアクセプターステムのステムに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｃ５、Ｇ７、Ｃ６７及びＧ６９が、Ｕ５、Ｕ７、Ａ６７及びＡ６９に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのアクセプターステムのステムに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ７、Ｃ６７、Ｃ６８及びＣ７０が、Ａ４、Ｃ６、Ｕ７、Ａ６７、Ｇ６８及びＵ７０に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡのアクセプターステムのステムに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｃ５、Ｇ６９及びＣ７０が、Ａ５、Ｕ６９及びＵ７０に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡの可変ループに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｇ４８が、Ｕ４８に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、可変ループに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｃ５１が、Ｇ５１に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、可変ループに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｕ４６及びＧ４８が、Ｇ４６及びＵ４８に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、可変ループに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｇ４８及びＣ５１が、Ｕ４８及びＧ５１に変異しており、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、可変ループに存在するヌクレオチド、すなわち、Ｕ４６、Ｇ４８、及びＣ５１が、Ｇ４６、Ｕ４８、及びＧ５１に変異している。
【0067】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む。
【0068】
ｔＲＮＡは、化学的または酵素的アミノアシル化を含むがこれらに限定されない任意の方法または技術によって所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって、またはリボザイムを含むがこれに限定されない他の酵素分子によって行われ得る。「リボザイム」という用語は、「触媒ＲＮＡ」と同義である。したがって、特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、化学的にアミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、酵素的にアミノアシル化される。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、リボザイムによって酵素的にアミノアシル化される。
【0069】
本明細書に記載されるＯ－ｔＲＮＡは、さまざまな生物、例えば非脊椎動物、例えば、原核生物（例えば、大腸菌、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）など）、または古細菌、または例えば脊椎動物に由来するものであってよい。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、古細菌ｔＲＮＡに由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、メタノコックス・ヤンナスキイのｔＲＮＡに由来する。
【0070】
一態様では、Ｏ－ｔＲＮＡは、セレクターコドンと対合するアンチコドンを有する。特定の実施形態では、セレクターコドンはアンバー終止コドン（ＴＡＧ）であり、ＴＡＧコドンにおけるｎｓＡＡの組み込みを可能とする。ＴＡＧコドンは本来、翻訳終結因子Ｉ（タンパク質合成を終結させる）による認識を通じて終止コドンとして機能するため、ｎｓＡＡの組み込みとタンパク質合成の終結との間で競合が起こる。
【0071】
ＯＴＳの機能は、アンバーコドンにおけるｎｓＡＡの組み込みと競合する翻訳終結因子Ｉの機能をノックアウトまたは低下させること、ＯＴＳ ｔＲＮＡをより効果的に適合させるようにタンパク質伸長因子を改変すること、及びＯＴＳ指向性進化の新しい方法によってさらに改善することができる。したがって、特定の実施形態では、ＯＴＳは、他の点では同一である野生型細胞と比較して、翻訳終結因子１の発現が減少している（例えば、約１５～５０％少ない、約２５～７５％少ない、約５０～１００％少ない、または約７５～１００％少ない）。特定の実施形態では、ＯＴＳは、翻訳終結因子Ｉを有さない。
【0072】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、細胞内で発現される際に転写後修飾される。
【0073】
直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）
本明細書では、直交性ｔＲＮＡをｎｓＡＡでアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）について記載する。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、メタノコックス・ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に示されるアミノ酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。
本明細書では、直交性ｔＲＮＡをｎｓＡＡでアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）について記載する。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、メタノコックス・ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に示されるアミノ酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、配列番号３５または３９に記載の配列からなるアミノ酸配列を含む。
【0074】
特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。「選択的にアミノアシル化する」という用語は、Ｏ－ＲＳが天然ｔＲＮＡをアミノアシル化する場合と比較して、Ｏ－ＲＳが選択されたアミノ酸、例えばｎｓＡＡで、Ｏ－ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率、例えば約７０％の効率、約７５％の効率、約８０％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、または約９９％以上の効率を指す。特定の実施形態では、効率は、平均リードスルー効率「ＲＲＥ」によって決定される。特定の実施形態では、ＴＡＧコドンの相対リードスルー効率（ＲＲＥ）は、ｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧアッセイプラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比をｍｃｈｅｒｒｙＴＡＣ対照プラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比で割ったものである。
【0075】
特定の実施形態では、その後、ｎｓＡＡは、高い忠実度、例えば、特定のセレクターコドンについて約７０％を超える忠実度、特定のセレクターコドンについて約７５％を超える忠実度、特定のセレクターコドンについて約８０％を超える忠実度、特定のセレクターコドンについて約８５％を超える忠実度、特定のセレクターコドンについて約９０％を超える忠実度、特定のセレクターコドンについて約９５％を超える忠実度、または特定のセレクターコドンについて約９９％を超える忠実度で、成長中のポリペプチド鎖に組み込まれる。特定の実施形態では、忠実度は、平均最大誤組み込み頻度「ＭＭＦ」によって決定される。特定の実施形態では、最大誤組み込み頻度（ＭＭＦ）は、ｎｓＡＡが増殖培地に添加されなかった場合のＲＲＥを、ｎｓＡＡが存在する場合のＲＲＥで割ることによって計算される。
【0076】
本明細書に記載されるＯ－ＲＳは、さまざまな生物、例えば非脊椎動物、例えば、原核生物（例えば、大腸菌、バチルス・ステアロサーモフィルスなど）、または古細菌、または例えば脊椎動物に由来するものであってよい。特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは古細菌メタノコックス・ヤンナスキイに由来する。
【0077】
特定の実施形態では、Ｏ－ＲＳは、天然アミノ酸と比較して、ｎｓＡＡに対して１つ以上の改善または増強された酵素特性を有する。例えば、天然アミノ酸と比較した場合のｎｓＡＡの改善または増強された特性には、例えば、より高いＫｍ、より低いＫｍ、より高いｋｃａｔ、より低いｋｃａｔ、より低いｋｃａｔ／ｋｍ、より高いｋｃａｔ／ｋｍなどのいずれかが含まれる。
【0078】
直交翻訳系（ＯＴＳ）
本開示では、本明細書に記載の直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）及び直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）を含む直交翻訳系（ＯＴＳ）について記載する。特定の実施形態では、ＯＴＳは、本明細書に記載のｎｓＡＡをさらに含む。場合により、ｎｓＡＡはＯＴＳに外因的に提供される。あるいは、例えば、ＯＴＳが細胞である場合、非標準アミノ酸はＯＴＳによって生合成され得る。特定の実施形態では、ＯＴＳは、変異体ＥＦ－Ｔｕをさらに含む。特定の実施形態では、ＯＴＳの翻訳終結因子Ｉが除去または改変されているか、または翻訳終結因子Ｉの発現が減少している。特定の実施形態では、ＯＴＳは、翻訳時にＯＴＳ ｔＲＮＡをより効果的に適合させる（例えば、有効性及び／または忠実度を高める）ために操作または改変されたタンパク質伸長因子を含む。特定の実施形態では、修飾された伸長因子は、Ｈａｒｕｎａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ ４２，Ｉｓｓｕｅ １５，２ Ｓｅｐｔ ２０１４，９９７６－９９８３に記載されるようなＥＦ－Ｔｕである。
本開示では、本明細書に記載の直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）及び直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）を含む直交翻訳系（ＯＴＳ）について記載する。特定の実施形態では、ＯＴＳは、本明細書に記載のｎｓＡＡをさらに含む。場合により、ｎｓＡＡはＯＴＳに外因的に提供される。あるいは、例えば、ＯＴＳが細胞である場合、非標準アミノ酸はＯＴＳによって生合成され得る。特定の実施形態では、ＯＴＳは、変異体ＥＦ－Ｔｕをさらに含む。特定の実施形態では、ＯＴＳの翻訳終結因子Ｉが除去または改変されているか、または翻訳終結因子Ｉの発現が減少している。特定の実施形態では、ＯＴＳは、翻訳時にＯＴＳ ｔＲＮＡをより効果的に適合させる（例えば、有効性及び／または忠実度を高める）ために操作または改変されたタンパク質伸長因子を含む。特定の実施形態では、修飾された伸長因子は、Ｈａｒｕｎａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ ４２，Ｉｓｓｕｅ １５，２ Ｓｅｐｔ ２０１４，９９７６－９９８３に記載されるようなＥＦ－Ｔｕである。
【0079】
Ｏ－ｔＲＮＡ／Ｏ－ＲＳペアの個々の構成成分は、同じ生物に由来する場合もあれば、異なる生物に由来する場合もある。一実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡ／Ｏ－ＲＳペアは同じ生物に由来する。あるいは、Ｏ－ｔＲＮＡ／Ｏ－ＲＳペアのＯ－ｔＲＮＡとＯ－ＲＳは異なる生物に由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡ及びＯ－ＲＳは古細菌に由来する。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡ及びＯ－ＲＳはＭ．ヤンナスキイに由来する。
【0080】
特定の実施形態では、本開示は、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）と、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）と、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、場合により本明細書に記載のｎｓＡＡと、を含む細胞を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドは、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含む。一態様では、Ｏ－ＲＳは、細胞内のｎｓＡＡを用いて直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）を選択的にアミノアシル化し、細胞は、ｎｓＡＡの非存在下では、ｎｓＡＡの存在下でのポリペプチドの収率の例えば３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満、１％未満などの収率で目的のポリペプチドを生成する。
【0081】
翻訳系は細胞系でも無細胞系でもよく、原核生物のものでも真核生物のものでもよい。細胞翻訳系には、これらに限定されるものではないが、所望の核酸配列をｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡを翻訳することができる、透過処理細胞または細胞培養物などの全細胞調製物が含まれる。無細胞翻訳系は市販されており、多くの異なるタイプや系がよく知られている。
【0082】
特定の実施形態では、本開示は、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）と、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）と、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、ｎｓＡＡと、を含む無細胞ＯＴＳを提供する。
【0083】
無細胞系の例としては、これらに限定されるものではないが、大腸菌ライセートなどの原核生物ライセート、小麦胚芽抽出物、昆虫細胞ライセート、ウサギ網状赤血球ライセート、ウサギ卵母細胞ライセート、及びヒト細胞ライセートなどの真核生物ライセートが挙げられる。得られるタンパク質がグリコシル化、リン酸化、またはその他の修飾を受ける場合、そのような修飾の多くは真核生物系でのみ可能であることから、真核生物の抽出物またはライセートが好ましい場合がある。これらの抽出物及びライセートの一部は市販されている。分泌タンパク質の翻訳に有用である、ミクロソーム膜を含むイヌ膵臓抽出物のような膜抽出物も入手可能である。
【0084】
再構成した翻訳系を使用することもできる。精製された翻訳因子の混合物、ならびにライセートの組み合わせ、または開始因子－１（ＩＦ－１）、ＩＦ－２、ＩＦ－３（ＣまたはＢ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ－Ｔｕ）、または終結因子などの精製された翻訳因子を添加したライセートも、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するうえで効果的に使用されている。
【0085】
無細胞系はまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３）に記載される、ＤＮＡが系に導入されてｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが翻訳されるような転写／翻訳系と組み合わせることもできる。真核生物の転写系で転写されるＲＮＡは、核内不均一ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または５’末端キャップ（７－メチルグアノシン）及び３’末端ポリＡテールを有する成熟ｍＲＮＡの形態を有することがあり、これは特定の翻訳系では利点となり得る。例えば、キャップが付加されたｍＲＮＡは、網状赤血球ライセート系で高効率で翻訳される。
【0086】
さらに、複合転写／翻訳系を使用することもできる。複合転写／翻訳系は、導入ＤＮＡが対応するｍＲＮＡに転写されることを可能とし、このｍＲＮＡが反応成分によって翻訳される。例えば、リボソーム及び翻訳因子などの翻訳成分を与えるための大腸菌ライセートを含む混合物を含む系を使用することができる。
【0087】
非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）
非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）は、本明細書に記載の直交性翻訳系によってポリペプチドに組み込まれる。αアミノ酸の一般構造は式Ｉで示される。
非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）は、本明細書に記載の直交性翻訳系によってポリペプチドに組み込まれる。αアミノ酸の一般構造は式Ｉで示される。
【0088】
非標準アミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸であり、式Ｉを有する任意の構造を含み、ここで、Ｒ基は、非標準アミノ酸を天然アミノ酸から区別する、２０種類の天然アミノ酸において使用される置換基以外の任意の置換基である。特定の実施形態では、式ＩのＲは、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミンなど、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0089】
他の非標準アミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合を介して相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸、光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸、光切断可能なアミノ酸、約５個を超える、または約１０個を超える炭素を含む（ただし、これらに限定されない）、天然アミノ酸と比較してより長い側鎖を有するアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【0090】
特定の実施形態では、非標準アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸の誘導体である。特定の実施形態では、非標準アミノ酸はチロシン類似体である。特定の実施形態では、チロシン類似体には、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが含まれ、置換チロシンは、ケト基（アセチル基を含むがそれに限定されない）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含む。複数置換されたアリール環も想到される。グルタミン類似体としては、これらに限定されるものではないが、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては、これらに限定されるものではないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むがそれに限定されない）などを含む。
【0091】
非標準アミノ酸の具体例としては、これらに限定されるものではないが、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（式ＩＩ）、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（式ＩＩＩ）、ｐ－プロパルギルフェニルアラニン（式ＩＶ）、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチルフェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃＢ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンが挙げられる。
【0092】
特定の実施形態では、非標準アミノ酸はＯ－メチル－Ｌ－チロシンである。特定の実施形態では、非標準アミノ酸はＬ－３－（２－ナフチル）アラニンである。特定の実施形態では、非標準アミノ酸は、アミノ－、イソプロピル－、またはＯ－アリル含有フェニルアラニン類似体である。特定の実施形態では、非標準アミノ酸はアセチルフェニルアラニン（ＡｃＦ）である。特定の実施形態では、非標準アミノ酸は、４－アジド－フェニルアラニン（ＡｚＦ）を含む。特定の実施形態では、非標準アミノ酸は４－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ＰａＦ）である。特定の実施形態では、非標準アミノ酸は４－アミノフェニルアラニン（ＡｍＦ）である。
【0093】
核酸
本開示は、本明細書に記載のＯ－ｔＲＮＡの核酸配列を含む、及び／またはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む。本開示は、本明細書に記載されるＯ－ｔＲＮＡ及び／またはＯ－ＲＳに相補的な核酸配列も含む。
本開示は、本明細書に記載のＯ－ｔＲＮＡの核酸配列を含む、及び／またはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む。本開示は、本明細書に記載されるＯ－ｔＲＮＡ及び／またはＯ－ＲＳに相補的な核酸配列も含む。
【0094】
さらに、本開示は、１つ以上のセレクターコドンを含む、本明細書に記載の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、またはさらには１０以上のセレクターコドンを含む。
【0095】
一態様では、本明細書において、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、ポリヌクレオチドであって、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである、ポリヌクレオチドが記載される。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。一実施形態では、核酸配列は、核酸の５２位にアデニン、及び核酸の６２位にチミンまたはウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、アミノ酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にチミンまたはウラシル、核酸の６６位にアデノシン、及び核酸の６７位及び７０位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、核酸の１３～２２位に核酸配列ＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の配列からなる核酸配列を含む。
【0096】
一態様では、本明細書において、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡの核酸配列を含むポリヌクレオチドについて記載する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡに相補的な核酸配列をさらに含む。
【0097】
一態様では、本明細書において、配列番号３５または３９に記載のアミノ酸配列を含むＯ－ＲＳをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドについて記載する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５または３９に記載のアミノ酸配列を含むＯ－ＲＳをコードする核酸配列に相補的な核酸配列をさらに含む。
【0098】
一態様では、本明細書において、配列番号２～３１のいずれか１つに記載の核酸配列を含むＯ－ｔＲＮＡの核酸配列と、配列番号３５または３９に記載のアミノ酸配列を含むＯ－ＲＳをコードする核酸配列とを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットが記載される。
【0099】
ベクター
特定の実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなど）は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。特定の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの１つ以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
特定の実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなど）は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。特定の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの１つ以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【0100】
細胞
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＯ－ｔＲＮＡ、Ｏ－ＲＳ、ｎｓＡＡ、及び／またはＯＴＳを含む細胞を含む。本明細書に記載される細胞には、例えば、原核細胞（例えば、大腸菌）、非原核細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などのいずれかが含まれる。特定の実施形態では、細胞は、ＥＦ－Ｔｕの変異をコードする。特定の実施形態では、細胞は、翻訳終結因子１の発現が減少している以外は同一の野生型細胞と比較して、翻訳終結因子１の発現が減少している。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＯ－ｔＲＮＡ、Ｏ－ＲＳ、ｎｓＡＡ、及び／またはＯＴＳを含む細胞を含む。本明細書に記載される細胞には、例えば、原核細胞（例えば、大腸菌）、非原核細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などのいずれかが含まれる。特定の実施形態では、細胞は、ＥＦ－Ｔｕの変異をコードする。特定の実施形態では、細胞は、翻訳終結因子１の発現が減少している以外は同一の野生型細胞と比較して、翻訳終結因子１の発現が減少している。
【0101】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＯ－ｔＲＮＡ、Ｏ－ＲＳ、ｎｓＡＡ、及び／またはＯＴＳを含む細胞は、参照によって本明細書にそれらの全容を援用するところの米国特許第９，６１７，３３５号、米国特許第１０，４６５，１９７号、米国特許第１０，６０４，７６１号、及び米国特許出願第１５／２６１，９８４号、米国特許出願第１６／８７１，７３６号に記載されるような細胞である。
【0102】
特定の態様では、本明細書において、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞であって、ポリヌクレオチドが、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含む、細胞について記載する。一態様では、ｎｓＡＡを含む目的のポリペプチドの収率は、ポリヌクレオチドがセレクターコドンを欠いている細胞から天然に存在する目的のポリペプチドについて得られる収率の例えば少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％またはそれ以上である。別の態様では、細胞は、ｎｓＡＡの非存在下で目的のポリペプチドを、ｎｓＡＡの存在下でのポリペプチドの収率の例えば５０％未満、３５％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満などの収率で産生する。
【0103】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）を含む細胞を含む組成物も本発明の特徴の１つである。一般的に、Ｏ－ｔＲＮＡは、インビボでＯ－ｔＲＮＡによって認識される選択コドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質へのｎｓＡＡの組み込みを媒介する。一実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、タンパク質へのｎｓＡＡの組み込みを、配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含む、またはそのポリヌクレオチド配列から細胞内でプロセシングされるｔＲＮＡの効率の例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはさらには９９％以上の効率で媒介する。別の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列、またはその保存的バリエーションを含むか、またはそれからプロセシングされる。さらに別の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、再使用可能なＯ－ｔＲＮＡを含む。
【0104】
特定の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、有用な大量のｎｓＡＡを含むタンパク質を合成する能力を有する。例えば、ｎｓＡＡを含むタンパク質は、細胞抽出物、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤及び／またはこれらに類するもので、例えば、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、または少なくとも５００μｇ／リットル以上のタンパク質の濃度で産生させることができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、または少なくとも５００μｇ以上の、ｎｓＡＡを含むタンパク質を含む。
【0105】
組換え宿主細胞株が確立された（すなわち、Ｏ－ｔＲＮＡ及び／またはＯ－ＲＴのポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の発現ベクターが宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離された）時点で、組換え宿主細胞株を目的のポリペプチドの産生に適切な条件下で培養する。当業者には明らかなように、組換え宿主細胞株の培養方法は、使用される発現コンストラクトの性質及び宿主細胞の種類に依存する。組換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養することができ、細胞の回収（目的のポリペプチドが細胞内に蓄積する場合）、またはバッチ式もしくは連続式のいずれかで培養上清の回収のいずれかを行う。原核生物宿主細胞での生産の場合、バッチ培養と細胞回収を行うことができる。特定の実施形態では、流加発酵培養条件が使用される。
【0106】
少なくとも１つのｎｓＡＡを含むポリペプチド
少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質（または目的のポリペプチド）も本明細書に開示される。特定の実施形態では、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾は、第１の反応基を含む少なくとも１つのｎｓＡＡへの［３＋２］環化付加反応による第２の反応基を含む分子（例えば、色素、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティー標識、ビオチンの誘導体、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）など）の結合を含む。例えば、第１の反応基はアルキニル部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニンの）（この基はアセチレン部分と呼ばれる場合もある）であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基はアジド部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンの）であり、第２の反応基はアルキニル部分である。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む少なくとも１つのｎｓＡＡ（例えばケトｎｓＡＡ）を含み、少なくとも１つの翻訳後修飾は糖部分を含む。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、細胞内でインビボで行われる。したがって、特定の実施形態では、産生される非標準アミノ酸を含むタンパク質（複数可）は、細胞依存的にプロセシング及び修飾される。これにより、細胞によって安定的にフォールディングされ、グリコシル化され、または他の形で修飾されたタンパク質の産生が可能となる。
少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質（または目的のポリペプチド）も本明細書に開示される。特定の実施形態では、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾は、第１の反応基を含む少なくとも１つのｎｓＡＡへの［３＋２］環化付加反応による第２の反応基を含む分子（例えば、色素、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティー標識、ビオチンの誘導体、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）など）の結合を含む。例えば、第１の反応基はアルキニル部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニンの）（この基はアセチレン部分と呼ばれる場合もある）であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基はアジド部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンの）であり、第２の反応基はアルキニル部分である。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む少なくとも１つのｎｓＡＡ（例えばケトｎｓＡＡ）を含み、少なくとも１つの翻訳後修飾は糖部分を含む。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、細胞内でインビボで行われる。したがって、特定の実施形態では、産生される非標準アミノ酸を含むタンパク質（複数可）は、細胞依存的にプロセシング及び修飾される。これにより、細胞によって安定的にフォールディングされ、グリコシル化され、または他の形で修飾されたタンパク質の産生が可能となる。
【0107】
特定の実施形態では、タンパク質は、細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、翻訳後修飾は原核細胞によって行われない。翻訳後修飾の例としては、これらに限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが挙げられる。一実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ－アスパラギン結合によるアスパラギンへのオリゴ糖の結合を含む（例えば、オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ）２－Ｍａｎ－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃなどを含む場合）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ－セリン、ＧａｌＮＡｃ－スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ－セリン、またはＧｌｃＮＡｃ－スレオニン結合によるセリンまたはスレオニンへのオリゴ糖（例えば、Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃなど）の結合を含む。特定の実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌配列または局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合体及び／またはこれらに類するものを含むことができる。
【0108】
一般的には、タンパク質は、例えば、利用可能な任意のタンパク質（例えば、治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはそれらの一部、及び／またはそれらに類するもの）と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、さらには少なくとも９９％以上同一であり、これらのタンパク質は１つ以上のｎｓＡＡを含む。一実施形態では、本明細書において、少なくとも１つのｎｓＡＡを含む目的のタンパク質またはポリペプチドと、賦形剤（例えば、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤など）とを含む組成物が本明細書に開示される。
【0109】
目的のタンパク質（またはポリペプチド）の例としては、これらに限定されるものではないが、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、サイトカイン、成長因子、成長因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、がん遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写調節タンパク質（例えば、転写活性化タンパク質（ＧＡＬ４など）、または転写抑制タンパク質など）またはそれらの部分が挙げられる。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはそれらの部分（複数可）を含む。
【0110】
一実施形態では、本明細書に記載の方法によって生産される目的のタンパク質は、１つ以上のｎｓＡＡによってさらに修飾される。例えば、ｎｓＡＡは、例えば、求核求電子反応、［３＋２］環化付加反応などにより修飾することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生産されるタンパク質は、少なくとも１つの翻訳後修飾（例えば、Ｎ－グリコシル化、Ｏ－グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾など）によりインビボで修飾される。
【0111】
一態様では、目的のタンパク質またはポリペプチド（またはその部分）は、核酸によってコードされる。一般的に、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、またはさらには１０以上のセレクターコドンを含む。
【0112】
キット
キットも本開示の特徴の１つである。例えば、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質を生産するためのキットが提供される。特定の実施形態では、キットは、Ｏ－ｔＲＮＡまたはＯ－ｔＲＮＡをコードするもしくはＯ－ｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列、及び／またはＯ－ＲＳもしくはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、キットは、Ｏ－ｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列、及び／またはＯ－ＲＳもしくはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含む細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、キットは少なくとも１つのｎｓＡＡをさらに含む。特定の実施形態において、キットは、タンパク質を産生するための説明文書をさらに含む。
キットも本開示の特徴の１つである。例えば、少なくとも１つのｎｓＡＡを含むタンパク質を生産するためのキットが提供される。特定の実施形態では、キットは、Ｏ－ｔＲＮＡまたはＯ－ｔＲＮＡをコードするもしくはＯ－ｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列、及び／またはＯ－ＲＳもしくはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、キットは、Ｏ－ｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列、及び／またはＯ－ＲＳもしくはＯ－ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含む細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、キットは少なくとも１つのｎｓＡＡをさらに含む。特定の実施形態において、キットは、タンパク質を産生するための説明文書をさらに含む。
【0113】
ｎｓＡＡをポリペプチドの特定の位置に組み込む方法
本明細書には、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産するための方法であって、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程を含む、方法が含まれる。
本明細書には、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産するための方法であって、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡを、細胞内で発現させる工程を含む、方法が含まれる。
【0114】
特定の態様では、少なくとも１つの非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を含むポリペプチドを生産するための方法であって、ｉ）配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％同一の核酸配列を含み、かつＯ－ｔＲＮＡの核酸の１６位に位置するシトシンの欠失を含む、Ｏ－ｔＲＮＡであって、核酸位置が、配列番号１に記載の配列に対応するものであり、Ｏ－ｔＲＮＡが、Ｏ－ＲＳによって少なくとも１つのｎｓＡＡでアミノアシル化され得る、Ｏ－ｔＲＮＡと、ｉｉ）ｎｓＡＡでＯ－ｔＲＮＡをアミノアシル化するＯ－ＲＳと、ｉｉｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｏ－ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと、を提供する工程を含む、方法について記載する。
【0115】
特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９８．７％同一である。
【0116】
特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の５３位にアデニンを、核酸の６３位にウラシルを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の３位及び６位にシトシン、核酸の７位にウラシル、核酸の６７位にアデノシン、及び核酸の６８位及び７１位にグアニンを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号３に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなる核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、核酸の１３～２３位に配列ＣＡＧ－ＡＧＧＧＣＡＧを含み、核酸位置は、配列番号１に記載の配列に対応するものである。特定の実施形態では、Ｏ－ｔＲＮＡは、配列番号２～１６のいずれか１つに記載の核酸配列を含む。
【0117】
特定の実施形態では、方法は、細胞内で本明細書に記載のＯ－ＲＳを発現させることをさらに含む。
【0118】
特定の実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチド（またはその部分）は、少なくとも１つのｎｓＡＡ、少なくとも２つのｎｓＡＡ、少なくとも３つのｎｓＡＡ、少なくとも４つのｎｓＡＡ、少なくとも５つのｎｓＡＡ、少なくとも６つのｎｓＡＡ、少なくとも７つのｎｓＡＡ、少なくとも８つのｎｓＡＡ、少なくとも９つのｎｓＡＡ、または１０以上のｎｓＡＡを含む。
【0119】
本開示はまた、少なくとも１つのｎｓＡＡを含む少なくとも１つの目的のタンパク質を細胞内で産生するための方法も提供する。方法は、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含みかつタンパク質をコードする核酸を含む細胞を、適切な培地中で増殖させる工程を含む。
【0120】
一実施形態では、方法は、第１の反応基を含むｎｓＡＡを目的のタンパク質に組み込む工程と、タンパク質を第２の反応基を含む分子（例えば、色素、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティー標識、ビオチンの誘導体、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）など）と接触させる工程と、をさらに含む。第１の反応基は第２の反応基と反応し、［３＋２］環化付加反応によりｎｓＡＡに分子を結合する。一実施形態では、第１の反応基はアルキニルまたはアジド部分であり、第２の反応基はアジドまたはアルキニル部分である。例えば、第１の反応基はアルキニル部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニンの）であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基はアジド部分（例えば、ｎｓＡＡであるｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンの）であり、第２の反応基はアルキニル部分である。
【0121】
本発明はまた、原核生物（例えば、真正細菌）または真核生物（例えば、酵母、原生哺乳動物、植物、または昆虫）の翻訳系で少なくとも１つのタンパク質を産生する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明のｔＲＮＡを含む細胞、例えば大腸菌細胞は、そのような翻訳系を含む。翻訳系に少なくとも１つの非標準アミノ酸が与えられることにより、少なくとも１つの非標準アミノ酸を含む少なくとも１つのタンパク質が産生される。本明細書に記載の組成物及び方法は、非標準アミノ酸とともに使用することで、例えば、幅広い側鎖のいずれかを使用してタンパク質に特定の分光学的、化学的、または構造的特性を与えることができる。これらの組成物及び方法は、セレクターコドン、例えば、終止コドン、４塩基コドンなどを介した非標準アミノ酸の部位特異的組み込みに有用である。翻訳系には、翻訳系内で機能し、少なくとも１つのセレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）、及びＯ－ｔＲＮＡを翻訳系内の少なくとも１つの非標準アミノ酸で選択的にアミノアシル化する直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ）も与えられる。
【実施例】
【0122】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
【0123】
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法を用いる。かかる手法は、文献に十分に説明されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい）。
【0124】
実施例１：Ｏ－ＲＳの指向性進化のための選択スキーム
本実施例では、タンパク質へのｎｓＡＡの組み込みは、１）適切なｎｓＡＡと、２）アンバーコドンを認識するように改変されたアンチコドンを有する、天然ｔＲＮＡ分子と直交するｔＲＮＡ分子（すなわち、このｔＲＮＡは細胞内の天然ｔＲＮＡ合成酵素によって容易にアミノアシル化されない）と、３）ｎｓＡＡを直交性ｔＲＮＡ上にアミノアシル化できる（かつｎｓＡＡを天然ｔＲＮＡ上には容易にアミノアシル化しない）直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素という３つの構成成分を利用する。以下のセクションでは、大腸菌ＳｏｌｕＰｒｏ（登録商標）のアンバーコドン（ＴＡＧ）における安定したｎｓＡＡの組み込みに適した系の同定について説明する。
本実施例では、タンパク質へのｎｓＡＡの組み込みは、１）適切なｎｓＡＡと、２）アンバーコドンを認識するように改変されたアンチコドンを有する、天然ｔＲＮＡ分子と直交するｔＲＮＡ分子（すなわち、このｔＲＮＡは細胞内の天然ｔＲＮＡ合成酵素によって容易にアミノアシル化されない）と、３）ｎｓＡＡを直交性ｔＲＮＡ上にアミノアシル化できる（かつｎｓＡＡを天然ｔＲＮＡ上には容易にアミノアシル化しない）直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素という３つの構成成分を利用する。以下のセクションでは、大腸菌ＳｏｌｕＰｒｏ（登録商標）のアンバーコドン（ＴＡＧ）における安定したｎｓＡＡの組み込みに適した系の同定について説明する。
【0125】
候補アミノ酸と直交性ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のペアを、さらなる改変の開始点として機能するように選択した。
【0126】
アミノ酸の選択
パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）及びパラ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）の２つのｎｓＡＡが候補として選択された。これらのアミノ酸は、１）市販されており、２）大腸菌に対して比較的非毒性であり、３）Ｍ．ヤンナスキイのｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡペア（後述）と適合性があり、４）一旦タンパク質に組み込まれると、化学選択的ライゲーション反応を促進して、比較的穏やかな条件下でタンパク質に新たな部分を結合させることができるため、魅力的であった。コストが比較的低いことから、ｐＡｃＦについてさらに研究を進めた。
パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）及びパラ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）の２つのｎｓＡＡが候補として選択された。これらのアミノ酸は、１）市販されており、２）大腸菌に対して比較的非毒性であり、３）Ｍ．ヤンナスキイのｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡペア（後述）と適合性があり、４）一旦タンパク質に組み込まれると、化学選択的ライゲーション反応を促進して、比較的穏やかな条件下でタンパク質に新たな部分を結合させることができるため、魅力的であった。コストが比較的低いことから、ｐＡｃＦについてさらに研究を進めた。
【0127】
直交性ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ペア
Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳ）ペアは、大腸菌において非標準アミノ酸を組み込む直交性翻訳系（ＯＴＳ）の進化の出発点として最も広く使用されてきた。ＭｊＹＲＳは、いずれの内因性大腸菌ｔＲＮＡもチロシンでアミノアシル化しないが、変異型チロシンアンバーサプレッサー（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ）をアミノアシル化する。ハイスループットクローニング、ＦＡＣＳ分別法、ＮＧＳ分析、インビトロ進化、合成生物学、構造生物学、人工知能などの相乗的アプローチの組み合わせを適用することにより、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの一連のバリアントが、タンパク質への非標準アミノ酸の組み込み活性が大幅に高いものとして同定されている。実施例２で、候補ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの組み込み効率を評価した。
Ｍ．ヤンナスキイのチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳ）ペアは、大腸菌において非標準アミノ酸を組み込む直交性翻訳系（ＯＴＳ）の進化の出発点として最も広く使用されてきた。ＭｊＹＲＳは、いずれの内因性大腸菌ｔＲＮＡもチロシンでアミノアシル化しないが、変異型チロシンアンバーサプレッサー（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ）をアミノアシル化する。ハイスループットクローニング、ＦＡＣＳ分別法、ＮＧＳ分析、インビトロ進化、合成生物学、構造生物学、人工知能などの相乗的アプローチの組み合わせを適用することにより、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの一連のバリアントが、タンパク質への非標準アミノ酸の組み込み活性が大幅に高いものとして同定されている。実施例２で、候補ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの組み込み効率を評価した。
【0128】
Ｍｊチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、対応するＭｊチロシル－ｔＲＮＡに存在するアンチコドンと相互作用する。これらの系ではアンチコドンは、ｔＲＮＡを天然のチロシンコドン（ＴＡＣ）ではなくアンバーコドン（ＴＡＧ）に誘導するように変異していることから、修飾はアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡとの相互作用に影響し、ｔＲＮＡチャージの効率が低下する。Ｍ．ヤンナスキイのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ複合体の結晶学的及び関連する生化学的研究により、ｔＲＮＡ合成酵素と変異型ｔＲＮＡとの間の相互作用を大きく回復できる変異（Ｄ２８６Ｒ）が同定されている。Ｄ２８６Ｒ変異及びＩ１５Ｖ変異を含む新たなＥ９合成酵素が、アンバーコドンにおけるｎｓＡＡの組み込みに効率的なｔＲＮＡ合成酵素をもたらすことが見出された。
【0129】
最適なｔＲＮＡの進化
Ｍ．ヤンナスキイのチロシルｔＲＮＡから出発し、天然のＣＵＡアンチコドンのスワップアウト（ｔＲＮＡがＴＡＧコドンと対合できるようにするため）、及び大腸菌内でＭｊチロシル－ｔＲＮＡに高い直交性を与える、インビボスクリーニングで以前に同定されている５つの変異など、いくつかの特定の修飾を導入した。Ｍｊチロシル－ｔＲＮＡを大腸菌で使用する場合の課題は、これがリボソームに輸送されてタンパク質合成に利用されるためには、大腸菌の天然の伸長因子Ｔｕ（ＥＦ－Ｔｕ）と効率的に相互作用する必要があることである。大腸菌ｔＲＮＡと古細菌ｔＲＮＡとの間には大きな配列の違いが存在するため、Ｍｊチロシル－ｔＲＮＡと大腸菌ＥＦ－Ｔｕの間の相互作用はさほど効率的ではない。この効率を高めるため、ＥＦ－Ｔｕ４と相互作用することが知られているヌクレオチドに多様性を組み込んだｔＲＮＡ配列のライブラリーを生成した（「ｌｉｂｒａｒｙ＿ｔＲＮＡ」配列番号３４を参照）。
Ｍ．ヤンナスキイのチロシルｔＲＮＡから出発し、天然のＣＵＡアンチコドンのスワップアウト（ｔＲＮＡがＴＡＧコドンと対合できるようにするため）、及び大腸菌内でＭｊチロシル－ｔＲＮＡに高い直交性を与える、インビボスクリーニングで以前に同定されている５つの変異など、いくつかの特定の修飾を導入した。Ｍｊチロシル－ｔＲＮＡを大腸菌で使用する場合の課題は、これがリボソームに輸送されてタンパク質合成に利用されるためには、大腸菌の天然の伸長因子Ｔｕ（ＥＦ－Ｔｕ）と効率的に相互作用する必要があることである。大腸菌ｔＲＮＡと古細菌ｔＲＮＡとの間には大きな配列の違いが存在するため、Ｍｊチロシル－ｔＲＮＡと大腸菌ＥＦ－Ｔｕの間の相互作用はさほど効率的ではない。この効率を高めるため、ＥＦ－Ｔｕ４と相互作用することが知られているヌクレオチドに多様性を組み込んだｔＲＮＡ配列のライブラリーを生成した（「ｌｉｂｒａｒｙ＿ｔＲＮＡ」配列番号３４を参照）。
【0130】
このｔＲＮＡライブラリーを、最初に２段階の選択プロセスでスクリーニングした。ｔＲＮＡライブラリーを、Ｍｊ Ｅ９＿Ｉ１５Ｖ＿Ｄ２８６ＲアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とともに、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子とウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）遺伝子との融合体を含むプラスミドに導入した。この融合タンパク質は、配列全体にわたって複数のＴＡＧコドンを含んでいる。この融合タンパク質は、ポジティブ／ネガティブ選択カセットとして機能する。ＣＡＴはクロラムフェニコール耐性タンパク質であり、クロラムフェニコール存在下での生存を可能にし、ＵＰＲＴは５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）を細胞を殺す毒性化合物に変換する。細胞をアミノ酸ｐＡｃＦの非存在下及び５－ＦＵの存在下で培養した。任意のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって任意のアミノ酸をチャージできる（すなわち、完全に直交していない）ライブラリー内の任意のｔＲＮＡは、アンバーサプレッション、ＵＰＲＴの発現、及びその後の細胞死を引き起こす。このようにして、非直交性ｔＲＮＡをライブラリーから速やかに除去した。生存細胞をアミノ酸ｐＡｃＦ及びクロラムフェニコールの存在下で培養した。この場合、Ｍｊ Ｅ９＿Ｉ１５Ｖ＿Ｄ２８６ＲによってｐＡｃＦをチャージできるｔＲＮＡは細胞にクロラムフェニコール耐性を与え、生存した。濃縮されたｔＲＮＡライブラリーを、Ｍｊ Ｅ９＿Ｉ１５Ｖ＿Ｄ２８６ＲアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、アラビノースｐａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある内部ＴＡＧコドンを含むＧＦＰ遺伝子とを含む新たなプラスミドにサブクローニングした。誘導時にＴＡＧコドンにｐＡｃＦが組み込まれると、蛍光タンパク質が生成された。細胞を分別して、最も効率的なｎｓＡＡ組み込み体に対応する、集団の最も輝度の高いメンバーを回収した。
【0131】
さらなる検証のために、分別からの個別のｔＲＮＡの設計を使用して、ｐＡｃＦをモデル分子（ハーセプチンまたはＴＲＡＳＴ－Ｆａｂなど）に組み込んだ。組み込みの成功をＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニタリングし、ペプチドマッピングで確認した。これらの結果は、本明細書に記載のｔＲＮＡの設計が効率的かつ高い忠実度でｎｓＡＡを目的のタンパク質に組み込むことができることを示している。
【0132】
実施例２：候補ＯＴＳを使用した振盪フラスコまたは流加発酵条件下でのトラスツズマブのさまざまな戦略的部位へのｎｓＡＡの組み込み
生物製剤のｎｓＡＡ組み込みにおける改変ＯＴＳの有用性を調べるために、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの候補バリアントを保有するコンストラクトをトラスツズマブ発現コンストラクトと同時形質転換した。各候補ＯＴＳを含む各コンストラクトには、低コピー数の複製起点ｐＡＣＹＣとテトラサイクリン耐性カセットが含まれる。Ｏ－ｔＲＮＡの発現は構成的プロモーターｐｌｐｐによって誘導され、ｒｒｎＢ１ターミネーターによって停止されるのに対して、Ｏ－ＲＳの発現は構成的プロモーターｐｇｌｎによって制御され、ｒｒｎＣ１ターミネーターによって停止される。
生物製剤のｎｓＡＡ組み込みにおける改変ＯＴＳの有用性を調べるために、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＭｊＹＲＳペアの候補バリアントを保有するコンストラクトをトラスツズマブ発現コンストラクトと同時形質転換した。各候補ＯＴＳを含む各コンストラクトには、低コピー数の複製起点ｐＡＣＹＣとテトラサイクリン耐性カセットが含まれる。Ｏ－ｔＲＮＡの発現は構成的プロモーターｐｌｐｐによって誘導され、ｒｒｎＢ１ターミネーターによって停止されるのに対して、Ｏ－ＲＳの発現は構成的プロモーターｐｇｌｎによって制御され、ｒｒｎＣ１ターミネーターによって停止される。
【0133】
細胞をＬＢ（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で培養した。テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アラビノース（２５０μＭ）、プロピオン酸塩（２０ｍＭ）を必要に応じて加えた。アミノ酸としての４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（Ａ２０６８６５）、４－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン（Ａ７２１５５６）、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン水和物（Ａ９４３０９９）をＡｍｂｅｅｄより購入した。４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（９０９５６４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。Ｌ－チロシンのストック溶液をｄＨ２Ｏ中、５００ｍＭで調製した。４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン水和物及び４－アジド－Ｌ－フェニルアラニンについては、５００ｍＭストック溶液を１Ｍ ＮａＯＨ溶液中で調製した。すべてのアミノ酸ストックを０．２２μｍフィルターを使用して滅菌した。すべてのｎｓＡＡのストック溶液は５００倍として調製した。
【0134】
液体培養中に陽性／陰性株を接種するため、バイオセーフティキャビネット内で、血清ピペットを使用して各チューブに５ｍＬのＬＢブロスを加え、各チューブに５μＬの適切な抗生物質を加え、Ｐ１０００チップを使用して凍結グリセロールストックをスタブ接種した。チップを５ｍＬ ＴＢ＋ＫＡＮチューブに入れ、３回よく混合した。培養チューブを、２７０ｒｐｍで３０℃の振盪インキュベーターに２０～２４時間入れた。血清学的ピペットを使用して、２４－ＤＷプレート（複数可）のウェル当たり３ｍＬの完全発酵生産培地を加えた。０．５ｍＭ ｎｓＡＡを含む完全発酵培地。発酵培地に光学密度＝３の培養物２００μＬを接種し、５回混合した。各プレートをエアロシールで覆い、培養物を２７０ｒｐｍで振盪しながら２７℃で２４時間インキュベートした。
【0135】
培養物の光学密度を回収時に測定した。インキュベーション後、各試料をインキュベーターから取り出し、氷上に置いた。ＯＤプレートで５０倍希釈液を調製した。各ウェルを、誘導プレートの各列につき１列ずつ、１９６μＬのｄＨ２Ｏで満たした。Ｐ－２０またはＰ－１０マルチチャンネルピペットを使用して、各誘導ウェルについて４μＬの２つのアリコートをＯＤプレートに加えた。ＯＤプレートを、光路長補正とブランク減算の両方をオンにして、ＯＤ６００プロトコールを使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで測定した。
【0136】
回収時に、１１００ｕＬの６０％グリセロール及び２２００ｕＬの培養物を、最終濃度２０％グリセロールとなるように２４ＤＷプレートの新しいウェルに加え、混合した。５００ｕＬのグリセロール－試料混合物をチューブラック内の０．７ｍＬマトリックスチューブに加えた。回収したグリセロールストックを－８０℃で保管した。
【0137】
細胞を下流分析のためにペレット化した。各ライブラリーの残りの培養物を使用して、その後の分析用にチューブに回収した（「プレソート」試料の場合）。細胞ペレット試料をさらに溶解し、ウエスタンブロットによって分析した。より具体的には、各試料に加える溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１％ｗ／ｖオクチルグルコシド、０．０８μＬ／ｍＬ ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ、０．０８μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ）の量を変えることにより、試料をＯＤ１０に正規化した。各試料を１時間溶解した。ライセートを３３００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清（可溶性画分）を回収した。可溶性画分を非還元試薬（１×ＬＤＳ ＮｕＰＡＧＥ試料バッファー中、１０ｍＭ ＩＡＡ）及び還元試薬（１×ＬＤＳ ＮｕＰＡＧＥ試料バッファー中、５０ｍＭ ＤＴＴ）で処理した。トラスツズマブ及びトラスツズマブＦＡｂ標準（Ｔｒａｓｔ Ｆａｂ標準）を、非還元試薬（１×ＬＤＳ ＮｕＰＡＧＥ試料バッファー中、１０ｍＭ ＩＡＡ）及び還元試薬（１×ＬＤＳ ＮｕＰＡＧＥ試料バッファー中の５０ｍＭ ＤＴＴ）の両方で処理した。振盪フラスコ発酵条件下で生成されたさまざまな戦略的部位にｎｓＡＡを組み込んだトラスツズマブのＰｒｏＡ／ＰｈｙＴｉｐ精製後にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った（図２）。
【0138】
非標準アミノ酸であるパラ－アセチルフェニルアラニンの、トラスツズマブの戦略的部位ＨＣ＿Ａ１２２への組み込みの成功を実証するため、標準的なＤａｓｂｏｘバイオリアクター発酵条件下でＯＴＳを使用して発酵スケールアップを行った。候補アンバーコドン抑制系を保有するＢＲ７株を、野生型トラスツズマブの産生に関して以前に検証されている最良の遺伝子型をコードするポジティブ対照株ＢＲ２と比較して、同等の力価のｎｓＡＡ組み込みトラスツズマブを産生できるかどうかを確認するために試験した。
【0139】
スケールアップ発酵には以下のプロトコールを使用した。制御設定値、パラメータ設定値、及びバイオリアクタースクリプトを検証した。ｐＨ制御を開始させるか、設定値を適正な値に上げた。ＤＯ制御、ｐＨ制御、撹拌、ガス発生、温度制御、ポンプＡ～Ｃを含むすべての制御プロセスがオンになっていて、適切に動作していることを検証した。現在のプロセスパラメータの設定値をすべて検証した。種フラスコと供給物を滅菌層流フードに移した。接種したバイオリアクターごとに、２０ゲージ針１本と１０ｍＬまたは５ｍＬシリンジ１本を使用した。
【0140】
準備した種培養フラスコごとに、５０ｍＬ血清ピペット１本、５ｍＬ血清ピペット１本、５０ｍＬコニカルチューブ１本、及び１．７ｍＬ微量遠心管１本を使用した。種培養のＯＤ６００を測定し、リアクター内でＯＤ＝０．１に達するのに必要な接種材料を計算した。１ｍＬの培養物をフラスコから微量遠心管に移した。種フラスコのＯＤと接種体積を記録した。５０ｍＬ血清ピペットを使用して、種培養をラベル付きの５０ｍＬコニカルバイアルに等分した。
【0141】
以下のプロトコールを使用して装置及びバイオリアクターを接種用に準備した。ｐＨプローブの両側の添加ポートから２個のルアーキャップを取り外した。接種培養物を、リアクターに添加する前にシリンジ中で静かに反転させた。接種培養物を、トリポートチューブまたはゴム製セプタムのいずれかから各バイオリアクター中に一度に１つずつ排出した。バイオリアクターの接種の完了後、直ちにＤＡＳｗａｒｅ対照上の接種クロックを開始させた。
【0142】
回収時に、下流分析用に細胞をペレット化した。各バイオリアクターの培養物を使用して、その後の分析用にチューブに回収した（「プレソート」試料の場合）。細胞を３３００×ｇ、４℃で７分間遠心分離した。これらの細胞ペレット試料を、市販のＰｈｙＴｉｐプロトコールを使用してさらに溶解及び精製し、ウエスタンブロットによって分析した。図３に、振盪フラスコ発酵条件下で産生された、Ｓ１２３がｐ－アセチルフェニルアラニンに置換されたトラスツズマブの、ＡＫＴＡ精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。
【0143】
これらの結果は、本明細書に記載のアンバーコドン直交性翻訳系を有する細胞が、振盪フラスコ発酵条件下でｐ－アセチルフェニルアラニンを有する抗体を効率的に産生できることを示している。
【0144】
実施例３：候補ＯＴＳの組み込み効率の評価
各直交性翻訳系（ＯＴＳ）のパフォーマンスは、ｎｓＡＡの組み込みの効率と精度の点で大きく異なる。これらの主要なパラメータの迅速かつ体系的な比較を可能にするために、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を再割り当てする大腸菌ＯＴＳを特徴付けるためのツールキットを使用した。このツールキットは、目的のｎｓＡＡの存在下及び非存在下で効率（すなわち相対リードスルー効率（ＲＲＥ））及び忠実度（すなわち最大誤組み込み頻度（ＭＭＦ））を測定することによってＯＴＳ性能を評価するものである。ＴＡＧコドンの相対リードスルー効率（ＲＲＥ）は、ｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧアッセイプラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比をｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧ対照プラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比で割ったものである。効率的なａａＲＳ－ｔＲＮＡペアでは、培地中にｎｓＡＡが存在する場合のＲＲＥは、値１に近づくか上回る必要がある。これは、この指標が、チロシンコドンＴＡＣと比較してアンバーコドンＴＡＧがどの程度良好に翻訳されるかを反映しているためである。ＯＴＳの忠実度を、ｎｓＡＡが存在する場合と存在しない場合で得られたＲＲＥ値を比較することによって評価した。具体的には、（非）忠実度の指標である最大誤組み込み頻度（ＭＭＦ）を、ｎｓＡＡが増殖培地に添加されていない場合のＲＲＥをｎｓＡＡが存在する場合のＲＲＥで割ることによって計算する。理想的なＯＴＳのＭＭＦ値はゼロであり、ｎｓＡＡが存在しない限りＧＦＰが生成されないことを反映している。ただし、ＭＭＦは忠実度の極めて厳密な尺度である点に留意されたい。一部の改変ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、十分に高い濃度で提供された場合には主にｎｓＡＡを組み込むが、より豊富に存在する場合には代わりに標準アミノ酸でｔＲＮＡを非特異的にアミノアシル化することが知られている。
各直交性翻訳系（ＯＴＳ）のパフォーマンスは、ｎｓＡＡの組み込みの効率と精度の点で大きく異なる。これらの主要なパラメータの迅速かつ体系的な比較を可能にするために、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を再割り当てする大腸菌ＯＴＳを特徴付けるためのツールキットを使用した。このツールキットは、目的のｎｓＡＡの存在下及び非存在下で効率（すなわち相対リードスルー効率（ＲＲＥ））及び忠実度（すなわち最大誤組み込み頻度（ＭＭＦ））を測定することによってＯＴＳ性能を評価するものである。ＴＡＧコドンの相対リードスルー効率（ＲＲＥ）は、ｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧアッセイプラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比をｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧ対照プラスミドのＧＦＰ／ＲＦＰ蛍光比で割ったものである。効率的なａａＲＳ－ｔＲＮＡペアでは、培地中にｎｓＡＡが存在する場合のＲＲＥは、値１に近づくか上回る必要がある。これは、この指標が、チロシンコドンＴＡＣと比較してアンバーコドンＴＡＧがどの程度良好に翻訳されるかを反映しているためである。ＯＴＳの忠実度を、ｎｓＡＡが存在する場合と存在しない場合で得られたＲＲＥ値を比較することによって評価した。具体的には、（非）忠実度の指標である最大誤組み込み頻度（ＭＭＦ）を、ｎｓＡＡが増殖培地に添加されていない場合のＲＲＥをｎｓＡＡが存在する場合のＲＲＥで割ることによって計算する。理想的なＯＴＳのＭＭＦ値はゼロであり、ｎｓＡＡが存在しない限りＧＦＰが生成されないことを反映している。ただし、ＭＭＦは忠実度の極めて厳密な尺度である点に留意されたい。一部の改変ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、十分に高い濃度で提供された場合には主にｎｓＡＡを組み込むが、より豊富に存在する場合には代わりに標準アミノ酸でｔＲＮＡを非特異的にアミノアシル化することが知られている。
【0145】
各プラスミドは、柔軟なペプチドリンカーを介して単一のリーディングフレーム内に融合されたｍＲＦＰ１とｓｆＧＦＰをコードしていた。対照プラスミドｍｃｈｅｒｒｙＴＡＣでは、リンカーをコードするＤＮＡ配列にチロシンコドンＴＡＣが含まれていた。アッセイプラスミドｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧは、ＯＴＳによるｎｓＡＡの直接組み込みのためにＴＡＣをＴＡＧアンバーコドンに変換した単一の点突然変異を除いて同じものであった。この構成では、ＧＦＰは焦点となるＴＡＣ／ＴＡＧコドンのリードスルーを示し、ＲＦＰは全体的なタンパク質産生における変動の内部対照としての役割を果たした。
【0146】
ｍｃｈｅｒｒｙＴＡＣ（対照）及びｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧ（アッセイ）プラスミドは、ｐＢＲ骨格から作製されたものである。このベクターは、カナマイシン耐性カセット、ａｒａＣリプレッサー遺伝子、及びｐＢａＤプロモーターを含むものである。プラスミド構築は、野生型ＧＦＰをｐＳＯＬにクローニングし、ｐＢＡＤプロモーターによって制御するｐＳＯＬ＿ＧＦＰから始めた。ｍＣｈｅｒｒｙのコーディング配列を、試験コドンＴＡＣまたはＴＡＧを含むリンカー配列がさらに付加及び導入されたＰＣＲプライマーを使用して増幅した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙインサートとｐＳＯＬ＿ＧＦＰ骨格をアセンブルした。アセンブリ反応物をＥＰＩ３００ 大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換し、キットのプラスミドをＮＧＳシークエンシングして検証した。
【0147】
図１に示されるように、各候補ＯＴＳを含む各コンストラクトには、低コピー数の複製起点ｐＡＣＹＣとテトラサイクリン耐性カセットが含まれた。Ｏ－ｔＲＮＡの発現は構成的プロモーターｐｌｐｐによって誘導され、ｒｒｎＢ１ターミネーターによって停止されたのに対して、Ｏ－ＲＳの発現は構成的プロモーターｐｇｌｎによって制御され、ｒｒｎＣ１ターミネーターによって停止された。ｗｔＧＦＰのコドンＮ１４９をアンバーコドンに変異させた。
【0148】
細胞をＬＢ（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で培養した。テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アラビノース（２５０μＭ）、プロピオン酸塩（２０ｍＭ）を必要に応じて加えた。アミノ酸としての４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（Ａ２０６８６５）、４－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン（Ａ７２１５５６）、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン水和物（Ａ９４３０９９）をＡｍｂｅｅｄより購入した。４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（９０９５６４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。Ｌ－チロシンのストック溶液をｄＨ２Ｏ中、５００ｍＭで調製した。４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン水和物及び４－アジド－Ｌ－フェニルアラニンについては、５００ｍＭストックを１Ｍ ＮａＯＨ溶液中で調製した。すべてのアミノ酸ストックを０．２２μｍフィルターを使用して滅菌した。すべてのｎｓＡＡのストック溶液は５００倍として調製した。
【0149】
各ＯＴＳ系は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、それぞれのＯ－ｔＲＮＡ変異体をプラスミドにクローニングすることによって構築した。各ＯＴＳプラスミドを、ｍｃｈｅｒｒｙＴＡＣ（対照）及びｍｃｈｅｒｒｙＴＡＧ（アッセイ）プラスミドのいずれかをすでに含み、１０％グリセロール洗浄によってエレクトロコンピテントとした大腸菌株ＥＢ１１４に個別に形質転換した。これらのクローン内のａａＲＳ及びｔＲＮＡ遺伝子は、ｎｓＡＡ組み込み測定キットを使用して試験する前に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術を使用してシークエンシングしてＯＴＳカセットに変異が生じていないことを確認した。
【0150】
キットアッセイでは、カナマイシンとテトラサイクリンを加えた５０ｍＬ三角フラスコ中の１０ｍＬ ＬＢ中の－８０℃のグリセロールストックから各株を復活させた。これらの培養物を、２４時間にわたってＲＰＭで直径１インチで回転振盪しながら３７℃でインキュベートした。これらの前調整済み培養物から、４℃で遠心分離して５００μＬの培養物中の細胞を濃縮し、上清をデカントした後、抗生物質、アラビノースを加え、ｎｓＡＡを加えた／加えない新鮮な培地１０ｍＬを添加することにより、希釈培養物を調製した。この手順により、新鮮な培地中、全体で１：１００の希釈液が作成される。ｎｓＡＡを含まない培養物に等量の滅菌ｄＨ２Ｏ水を添加して一貫したＬＢ濃度とした。ｎｓＡＡを含む／含まない試料ブランクも同様の方法で調製したが、細胞は省略した。
【0151】
蛍光及びＯＤの読み取りは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｅｎｓｐｉｒｅマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して行った。各候補ＯＴＳを試験するため、４つの生物学的複製物を比較した。各実験について、Ｃｏｓｔａｒ番号３６３１の黒色透明底９６ウェルプレートに、試験する各試料とブランクの１５０μＬアリコートを満たした。３０℃で継続的にインキュベートし、読み取りの前後に１５秒間振盪しながら、マイクロプレートリーダーでアッセイを３０時間行った。ＯＤ及びＧＦＰの測定を２０分ごとに行った。ＯＤは６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定した。ＧＦＰの励起は、発光が５０９ｎｍとなるよう３９５ｎｍに設定した。次に、各時点でこれら４つのウェルのセットのそれぞれについて測定されたＯＤ、ＲＲＥ、及びＭＭＦ値をこの時間枠にわたって平均して、その複製物の要約スコアを生成した。図４は、ＲＦＰ－ＧＦＰ融合タンパク質ツールキットを使用した各ＯＴＳの忠実度及び効率の評価の結果を示す。例示的な候補ｔＲＮＡであるＭＧ７２、ＭＧ３３、及びＭＧ２４は、従来知られているｔＲＮＡ（Ｆ１２）と比較して、ＲＲＥがより高く、ＭＭＦはより低い。
【0152】
図５及び図６は、ＭＧ７２、ＭＧ３３、及びＭＧ２４を含む、例示的な候補ｔＲＮＡのクローバーリーフ構造及び配列を示す。図７は、例示的な候補ｔＲＮＡの配列アラインメントを示す。これらの結果は、以前に同定されているＦ１２、Ｆ１３及びＦ１４のＯ－ｔＲＮＡ配列と比較して、Ｄループ、Ｔループのステム、アクセプターステムのステム及び可変ループのいくつかの核酸位置が変化していることを示している。これらの以前に同定されているｔＲＮＡと比較して、候補ｔＲＮＡで同定された重要な構造上の違いには次のものが含まれる。すなわち、ａ．Ｄループにおいて、インデル、すなわちｔＲＮＡのＤループに存在する従来知られているＯ－ｔＲＮＡであるＦ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＣ１６が、候補ＭＧ２４、ＭＧ３３、ＭＧ７２、ＭＧ３７、ＭＧ２９、ＭＧ１７、ＭＧ９７、ＭＧ１０９、ＭＧ１６、ＭＧ３６、及びＭＧ２５で欠失している。ｂ．Ｔループのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわちＦ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＧ５３及びＣ６３が、候補ＭＧ７２ではＡ５２及びＴ６２に変異している。ｃ．Ｔループのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２のＣ５２とＧ６４、またはＦ１３のＴ５２とＡ６４、またはＦ１４のＡ５２とＴ６４が、候補ＭＧ３７、ＭＧ２９、ＭＧ１７、ＭＧ３５、ＭＧ９７、ＭＧ１０９、ＭＧ１６、及びＭＧ２２ではＧ５２とＣ６２に変異している。ｄ．Ｔループのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＣ５１とＧ６５が、候補ＭＧ２９、ＭＧ１７、ＭＧ３５及びＭＧ１０９ではＧ５１とＣ６５に変異している。ｅ．アクセプターステムのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＧ３、Ｇ６、Ｇ７、Ｃ６７、Ｃ６８、及びＣ７１が、候補ＭＧ１６、ＭＧ２２、ＭＧ２４、ＭＧ３０、ＭＧ３６ではＣ３、Ｃ６、Ｔ７、Ａ６６、Ｇ６７、及びＧ７０に変異している。ｆ．アクセプターステムのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＣ５、Ｇ７、Ｃ６７、及びＧ６９が、候補ＭＧ９７ではＴ５、Ｔ７、Ａ６７、及びＡ６９に変異している。ｅ．アクセプターステムのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＧ４、Ｇ６、Ｇ７、Ｃ６７、Ｃ６８、及びＣ７０が、候補ＭＧ１０９ではＡ４、Ｃ６、Ｔ７、Ａ６７、Ｇ６８、及びＴ７０に変異している。ｇ．アクセプターステムのステムに存在する異なる対合ヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＣ５、Ｇ６９、及びＣ７０が、候補ＭＧ６２ではＡ５、Ｔ６９、及びＴ７０に変異している。ｈ．可変ループに存在する異なるヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＧ４８が、候補ＭＧ９７ではＴ４８に変異している。ｉ．可変ループに存在する異なるヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＣ５１が、候補ＭＧ１７ではＧ５１に変異している。ｊ．可変ループ内に存在する異なるヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＴ４６、Ｇ４８が、候補ＭＧ３７、ＭＧ２２、ＭＧ３０、及びＭＧ３６ではＧ４６、Ｔ４８に変異している。ｋ．可変ループに存在する異なるヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＧ４８、Ｃ５１が、候補ＭＧ１０９ではＴ４８、Ｇ５１に変異している。及びｌ．可変ループに存在する異なるヌクレオチド、すなわち、Ｆ１２、Ｆ１３、及びＦ１４のＴ４６、Ｇ４８、Ｃ５１が、候補ＭＧ２９ではＧ４６、Ｔ４８、Ｇ５１に変異している。
【0153】
本発明は、好ましい実施形態及びさまざまな代替実施形態を参照して特に示され、説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細におけるさまざまな変更が本明細書になされ得ることは、関連する技術分野の当業者には理解されよう。
【0154】
本明細書の本文中で引用したすべての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0155】
非公式な配列表
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】