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特表2024-533676脱落膜胎盤間葉系幹細胞及び血管新生促進医薬組成物の製造におけるその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】脱落膜胎盤間葉系幹細胞及び血管新生促進医薬組成物の製造におけるその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240905BHJP
A61K 35/50 20150101ALI20240905BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61K35/50
A61P9/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518405
(86)(22)【出願日】2021-09-27
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 CN2021120946
(87)【国際公開番号】W WO2023044902
(87)【国際公開日】2023-03-30
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521047672
【氏名又は名称】金湧長生醫學生物科技股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＶｉｔａＳｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｆ．－１１， Ｎｏ． ９３， Ｓｅｃ． １， Ｘｉｎｔａｉ ５ｔｈ Ｒｄ．， Ｘｉｚｈｉ Ｄｉｓｔ．， Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ， Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】朱莉莉
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BB19
4B065BB32
4B065BC50
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB58
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA36
(57)【要約】
本発明は、脱落膜胎盤間葉系幹細胞及びその培養方法を提供する。当該方法は、従来の間葉系幹細胞の培養方法に誘導ステップを導入して、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞にデコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）を高発現させることを含む。更に、本発明は、血管新生を促進する薬物の製造における脱落膜胎盤間葉系幹細胞の用途を提供する。
【選択図】図１０Ａ
【選択図】図１０Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脱落膜胎盤間葉系幹細胞を培養する方法であって、無血清培地の組成に誘導ステップを導入することを含み、前記誘導ステップは、培養過程で、細胞培地に少なくとも１種類のサイトカインを加えて刺激することで、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞にデコイ受容体３を高発現させるものであり、前記無血清培地の組成には、ＭＣＤＢ２０１培地、上皮成長因子及びＩＴＳ細胞培養添加物が含まれていることを特徴とする方法。
【請求項2】
前記少なくとも１種類のサイトカインは、腫瘍壊死因子－α、インターフェロン－γ又はそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記誘導ステップは、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞が容器に接着したあとに、前記少なくとも１種類のサイトカインを加えるものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記腫瘍壊死因子－αの有効量は１５～２０ｎｇ／ｍｌであり、且つ、前記インターフェロン－γの有効量は１０～２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記腫瘍壊死因子－α及び前記インターフェロン－γは、４８時間の刺激を行うものであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記腫瘍壊死因子－α及び前記インターフェロン－γは、一緒に前記細胞培地に加えられることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項7】
請求項１に記載の方法で培養される脱落膜胎盤間葉系幹細胞であって、デコイ受容体３を高発現させることを特徴とする脱落膜胎盤間葉系幹細胞。
【請求項8】
前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びデコイ受容体３を発現することを特徴とする請求項７に記載の脱落膜胎盤間葉系幹細胞。
【請求項9】
血管新生を促進する薬物の製造における医薬組成物の用途であって、前記医薬組成物は、有効量の請求項７に記載の脱落膜胎盤間葉系幹細胞を含むことを特徴とする用途。
【請求項10】
前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びデコイ受容体３を発現することを特徴とする請求項９に記載の用途。
【請求項11】
前記有効量の脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、１×１０４～２×１０５個の細胞であることを特徴とする請求項９に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｄｅｃｉｄｕａｌ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及びその培養方法に関し、特に、従来の間葉系幹細胞の培養方法に誘導ステップを導入して、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞にデコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）を高発現させるものに関する。更に、本発明は、血管新生を促進する薬物の製造における脱落膜胎盤間葉系幹細胞の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、間葉系幹細胞の同定に使用されるバイオマーカーについては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現し、且つ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲは発現しないという国際細胞・遺伝子治療学会（ＩＳＣＴ）が公表している基準を参照することが多い。しかし、このバイオマーカーの組み合わせは骨髄間葉系幹細胞を基本としており、組織の特異性を欠いているため、異なる組織に由来する間葉系幹細胞同士を区別することが難しい。一方、間葉系幹細胞は、由来の違いによって異なる挙動を示すことが多数報告されている。よって、特定組織に由来する間葉系幹細胞を区別する特異性を備えた生体分子マーカーを開発する必要がある。
【0003】
間葉系幹細胞は多種類の血管新生因子を発現可能なことから、虚血性疾患を治療するための血管新生の促進に応用可能であると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、間葉系幹細胞は、由来の違いによって主要因子の発現が異なるため、血管新生促進のメカニズムが異なる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を高発現させる脱落膜（ｄｅｃｉｄｕａｌ）胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）を培養する方法を提供する。当該方法では、無血清培地の組成（ＭＣＤＢ２０１培地＋ＥＧＦ（上皮成長因子）＋ＩＴＳ細胞培養添加物（ＩＴＳとは、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、セレン（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）である））に誘導ステップを導入する。前記誘導ステップは、培養過程で、細胞培地に少なくとも１種類のサイトカインを加えて刺激することで、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞にデコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）を高発現させるものである。
【0006】
本発明における前記「高発現」とは、従来の間葉系幹細胞の培養方法で培養される脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｄｅｃｉｄｕａｌ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）におけるデコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）の発現量と比べて、本発明の培養方法で培養される脱落膜胎盤間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の発現量が統計学的に有意に高いことを言う。
【0007】
本発明の方法において、好ましくは、前記少なくとも１種類のサイトカインは、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）又はそれらの組み合わせから選択される。
【0008】
本発明の方法において、好ましくは、前記誘導ステップは、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞が容器に接着したあとに誘導を行うものである。
【0009】
本発明の方法において、より好ましくは、前記ＴＮＦ－αの有効量は１５～２０ｎｇ／ｍｌであり、且つ、前記ＩＦＮ－γの有効量は１０～２０ｎｇ／ｍｌである。
【0010】
本発明の方法において、より好ましくは、前記ＴＮＦ－α及び前記ＩＦＮ－γは４８時間の刺激を行うものである。
【0011】
本発明の方法において、より好ましくは、前記ＴＮＦ－α及び前記ＩＦＮ－γは一緒に前記細胞培地に加えられる。
【0012】
本発明は、更に、前述の方法で培養される脱落膜胎盤間葉系幹細胞を提供する。前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、デコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）を高発現させる。
【0013】
好ましくは、本発明における脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、エストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲ）、プロゲステロン受容体（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲ）及びデコイ受容体３（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３，ＤｃＲ３）を発現する。
【0014】
更に、脱落膜間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の応用可能性を探求すべく、本発明は、更に、所望の個体の血管新生を促進する薬物の製造における医薬組成物の用途を含む。前記医薬組成物は、デコイ受容体３を高発現させる有効量の脱落膜胎盤間葉系幹細胞を含む。
【0015】
好ましくは、本発明の用途において、前記個体はヒト又は哺乳動物である。
【0016】
好ましくは、本発明の用途において、前記有効量の脱落膜胎盤間葉系幹細胞は、１×１０４～２×１０５ｃｅｌｌｓである。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1B】図１Ｂは、脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）の免疫表現型解析において、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等のバイオマーカーが陽性となり、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲ等のバイオマーカーが陰性となったことを示している。
【図1C】図１Ｃは、骨生成（Ｃ２）、軟骨生成（Ｃ４）及び脂肪生成（Ｃ６）それぞれにおける脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）の生体外での分化能を示している。また、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ５は、それぞれ、各生体外誘導条件における対照群を示しており、骨生成、軟骨生成及び脂肪生成にそれぞれ属している。なお、縮尺は２００μｍである。
【図2】図２は、新生男児の胎盤から分離したｐｃＭＳＣｓの核型特性を示す。図中のＡは、２０世代目のｐｃＭＳＣｓ（Ｎ１００）の染色体分析における代表的な画像を示している。また、前記分析の結果として、Ｎ９８（Ｂ）、Ｎ９９（Ｃ）及びＮ１００（Ｄ）を含む３つの個体における４６本の独立した染色体を示す。新生男児の胎盤から分離したｐｃＭＳＣｓは、蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの結果、Ｘ染色体（赤色蛍光で示す）が陽性となり、Ｙ染色体（緑色蛍光で示す）が陰性となった（Ｆ）。これは、新生男児のヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣ）由来の場合にはＸ染色体及びＹ染色体の双方が陽性を示すとの結果（Ｅ）に反していた。なお、左下隅は、各パネルにおける白枠内の画像を拡大したものである。また、縮尺は５０μｍである。
【図3】図３は、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）と比較した場合のｐｃＭＳＣｓの遺伝子発現解析を示す。なお、略語については、ｐｃＭＳＣｓ：脱落膜胎盤間葉系幹細胞、ＢＭＭＳＣ：骨髄間葉系幹細胞、Ａｄｓｖ：脂肪間葉系幹細胞、ｈＥＳ：ヒト胚性幹細胞、ＵｎｉＲｅｆ：遺伝子ファミリーデータベースである。
【図4】図４は、ｐｃＭＳＣｓのホルモン受容体とＢＭＭＳＣのホルモン受容体との比較結果を示す。なお、略語については、ＰＲＡ：プロゲステロン受容体Ａ、ＰＲＢ：プロゲステロン受容体Ｂ、ＥＲ：エストロゲン受容体のαサブユニットである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
理解すべき点として、実施例の詳細な記載は本発明の好ましい実施例を説明するためのものであり、本発明をいずれかの実施例に制限しようとするものではない。注意すべき点として、本発明は、本発明と同じ精神及び範囲におけるあらゆる代替的な実施例を網羅することを意図している。よって、他人が本発明の理念に基づき実施する何らかの本質的でない修正及び調整もまた本発明の保護の範囲に属する。
【実施例1】
【0019】
脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）の同定
【0020】
本発明の研究において、我々は、ヒト胎盤脱落膜から間葉系幹細胞を分離することに成功し、これを胎盤絨毛膜・脱落膜間葉系幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａ ｃｈｏｒｉｏｄｅｃｉｄｕａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ｐｃＭＳＣｓ）と命名した。
【0021】
我々は、胎盤の絨毛膜及び脱落膜部位から、国際的な間葉系幹細胞の基本定義を満たす間葉系幹細胞を分離した（図１参照）。その後、染色体同定及び蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション染色分析において、この細胞が母体部位由来であること、即ち、脱落膜部位由来であることを特定した（図２参照）。
【0022】
間葉系幹細胞の基本定義では、異なる組織から分離された細胞を区別できないため、脱落膜間葉系幹細胞を十分に同定可能なバイオマーカーを見つけるべく、本発明では、骨髄間葉系幹細胞と脱落膜間葉系幹細胞の遺伝子発現を分析した。
【0023】
本発明では、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣｓ）とｐｃＭＳＣｓとの違いを証明するために、いくつかの受容体遺伝子を収集した。図３に示すように、ｐｃＭＳＣｓは、ＢＭＭＳＣｓには発現しないエストロゲン受容体（ＥＳＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）を発現した。また、ＢＭＭＳＣｓとｐｃＭＳＣｓは、いずれもＩＦＮ－γ受容体（ＩＦＮＧＲ）及びＴＮＦ－α受容体（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）を発現した。この結果より、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体が脱落膜間葉系幹細胞に特有のものであることが実証された。
【0024】
更に、ｐｃＭＳＣｓのホルモン受容体とＢＭＭＳＣのホルモン受容体を比較した。タンパク質の発現について、異なる受容体特異性抗体をそれぞれ用いてウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）を行い、実証するとともに、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＴ４７Ｄをプロゲステロン受容体（ＰＲ）及びエストロゲン受容体（ＥＲ）の陰性対照及び陽性対照としてそれぞれ用いた。その結果、ＢＭＭＳＣｓ（ＢＭ）及び脂肪間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）と比較して、ｐｃＭＳＣｓのみがプロゲステロン受容体（ＰＲ）及びエストロゲン受容体（ＥＲ）を発現することが示された（図４参照）。
【0025】
エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体が脱落膜間葉系幹細胞に特有のものであることを特定するために、本発明では、更に、１０ｎＭのエストロゲン及び１μＭのプロゲステロン（Ｅ／Ｐ）で脱落膜間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）及び骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣｓ）を刺激した。そして、３日目、６日目及び９日目に培地と細胞を採取して、その後のｑＰＣＲ、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による定量分析に用いることで、プロラクチン（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）の発現を評価した。ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）ではβ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）を定量標準とした。また、全ての実験は３回繰り返した。
【0026】
その結果、図５に示すように、ｑＰＣＲ（Ａ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）（Ｂ）、或いはＥＬＩＳＡ（Ｃ）定量分析のいずれかに関わらず、脱落膜間葉系幹細胞のみが脱落膜分化を生じ、指標遺伝子ＰＲＬが顕著に上昇することが示された。一方、骨髄間葉系幹細胞はホルモンの制御を受けなかった。これにより、脱落膜間葉系幹細胞が脱落膜部位に由来する特異的挙動を示し得ることが再び実証された。
【0027】
そのほか、我々は、ｐｃＭＳＣｓ及びＢＭＭＳＣｓにおける腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー関連遺伝子の発現量も比較した。我々は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー関連遺伝子を採取して分析することで、ｐｃＭＳＣｓ及びＢＭＭＳＣｓにおける特定の表現形式を評価した。
【0028】
いくつかの遺伝子がｐｃＭＳＣｓにおいて区別可能な形式を示したが（図６参照）、我々は、特にデコイ受容体３（ＤｃＲ３又はＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）に注目し、ＤｃＲ３がｐｃＭＳＣｓにのみ発現し、ＢＭＭＳＣｓには発現しないことを確認するために、更なる分析を行った。その結果、図７に示すように、脱落膜間葉系幹細胞はＤｃＲ３を発現するが、異なる性別から分離されたＢＭＭＳＣｓには発現しないことが見出だされた。従って、我々は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、デコイ受容体３（ＤｃＲ３）が、異なる組織由来の間葉系幹細胞を区別するための生理学的意味を持つ脱落膜間葉系幹細胞のバイオマーカーになり得ると考えた。
【実施例2】
【0029】
デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を高発現させる脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）の培養方法
【0030】
本発明は、脱落膜胎盤間葉系幹細胞の新たな培養方法を提供する。前記方法は、従来の間葉系幹細胞の培養方法に炎症に関連するサイトカインＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γを加えて刺激するものである。
【0031】
具体的に、脱落膜胎盤間葉系幹細胞については、従来の無菌操作による細胞増殖及び培養方式を用い、無血清の幹細胞培地を使用して細胞の継代培養を行った。培養期間中は、３日ごとに新鮮な幹細胞培養液に交換した。当該培地には、ＭＣＤＢ２０１組成培地、濃度１％のインスリン－トランスフェリン－セレン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｓｅｌｅｎｉｕｍ，ＩＴＳ）、及び、濃度１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）が含まれていた。
【0032】
従来の培養方式とは異なり、本発明では、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞が容器に接着したあと、誘導ステップを導入した。
【0033】
本発明では、細胞を（１）陰性対照群、（２）２０ｎｇ／ｍＬサイトカインＴＮＦ－α誘導群、（３）２０ｎｇ／ｍＬサイトカインＩＦＮ－γ誘導群、及び、（４）２０ｎｇ／ｍＬサイトカインＴＮＦ－α及び２０ｎｇ／ｍＬサイトカインＩＦＮ－γ同時添加誘導群の４群に分けた。
【0034】
まず、１×１０５個の脱落膜胎盤間葉系幹細胞を６穴培養プレートで培養した。次に、インキュベーター内で一晩培養したあと培地を除去し、各群の条件に応じて、（１）刺激因子を加えない完全培地、（２）２０ｎｇ／ｍＬのサイトカインＴＮＦ－αを含有する完全培地、（３）２０ｎｇ／ｍＬのサイトカインＩＦＮ－γを含有する完全培地、及び、（４）２０ｎｇ／ｍＬのサイトカインＴＮＦ－α及び２０ｎｇ／ｍＬのサイトカインＩＦＮ－γを同時に含有する完全培地をそれぞれ加え、４８時間培養した。そして、誘導後の脱落膜胎盤間葉系幹細胞をウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）で同定した結果、全ての誘導群で脱落膜間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の発現量を増大させられることが示された（図８参照）。
【0035】
本発明は、更に、脱落膜胎盤間葉系幹細胞においてＤｃＲ３の発現量の増大を誘導するサイトカインの適切な投与量をテストした。その結果、１５ｎｇ／ｍＬのサイトカインＴＮＦ－αを使用して脱落膜胎盤間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の発現量を増大させることもできるが、１０ｎｇ／ｍＬのサイトカインＩＦＮ－γを使用すれば脱落膜胎盤間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の発現量を増大させられることが分かった。また、同様に、これらを一緒に加えて誘導した場合にも、脱落膜胎盤間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の発現量が増大するとの結果が見られた。
【実施例3】
【0036】
脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）が有する血管新生促進の可能性
【0037】
更に、脱落膜間葉系幹細胞におけるＤｃＲ３の応用可能性を探求すべく、本発明では、前記脱落膜胎盤間葉系幹細胞（ｐｃＭＳＣｓ）を用いて研究を行った。
【0038】
本発明は、更に、血管新生試験において、サイトカインで処理していない脱落膜胎盤間葉系幹細胞と、サイトカインＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激した脱落膜胎盤間葉系幹細胞との違いについてテストした。
【0039】
前述の培養方法に基づき、本発明における脱落膜間葉系幹細胞を吊り下げ式薄膜細胞培養シャーレ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）で培養した。実験のフローは図９に示す通りとした。また、吊り下げ式薄膜細胞培養シャーレの穴径の違いに応じて使用する細胞の数を調整した。
【0040】
本発明では、まず、２４穴細胞培養プレート用の吊り下げ式薄膜細胞培養シャーレ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）において本発明の脱落膜間葉系幹細胞を１×１０４個培養した。次に、１５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで４８時間誘導したあと、前記吊り下げ式薄膜細胞培養シャーレ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を内皮細胞株（ＳＶＥＣ）のシャーレに移して、管形成測定のために、誘導後の本発明における脱落膜間葉系幹細胞とＳＶＥＣを共培養した。ＳＶＥＣ細胞株は、細胞培養用マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で培養した。そして、６時間共培養したあと、蛍光顕微鏡で撮影した画像から総分岐点数を計算した。
【0041】
本発明における脱落膜間葉系幹細胞をサイトカインで４８時間誘導したあと、培地中のＤｃＲ３濃度をＥＬＩＳＡ測定したところ、対照群と比較して、誘導群ではｐｃＭＳＣｓのＤｃＲ３発現量を著しく増加させられることが分かった（図１０Ａ参照）。
【0042】
本発明における脱落膜間葉系幹細胞とＳＶＥＣを６時間共培養したあと、蛍光顕微鏡で撮影した画像から総分岐点数を計算した。図１０Ｂに各群の代表的な画像を示す。
【0043】
本発明では、６穴細胞培養プレート用の吊り下げ式薄膜細胞培養シャーレ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）において本発明の脱落膜間葉系幹細胞を２×１０５個培養し、同様の実験を行った場合でも、同じ結果が得られた（結果は示していない）。
【0044】
統計の結果、通常培養条件群（Ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで誘導したｐｃＭＳＣｓはより多くの分岐点の生成を顕著に誘導することが示された。且つ、このような現象は、抗ＤｃＲ３抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した場合と反対であった（図１０Ｃ参照）。抗ＤｃＲ３抗体（ＤｃＲ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ）中和群の分岐点数は最も少なく、通常培養条件群よりも更に低かった。これは、ＤｃＲ３の定常的な発現が血管生成に影響を及ぼすことを反映していた。よって、脱落膜間葉系幹細胞は、ＤｃＲ３の発現によって血管新生を促進可能であった。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【国際調査報告】