特表 2024-533764 ＬＩＮＥ－１のＤＮＡメチル化変異を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】ＬＩＮＥ－１のＤＮＡメチル化変異を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6827 20180101AFI20240905BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6827 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519086

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-27

(86)【国際出願番号】 KR2022014662

(87)【国際公開番号】W WO2023055128

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0128751

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0124049

(32)【優先日】2022-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522110164

【氏名又は名称】ペンタメディックス・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＮＴＡＭＥＤＩＸ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】５１７ＨＯ， ５１６， ４２， ＣＨＡＮＧＥＯＰ‐ＲＯ， ＳＵＪＥＯＮＧ‐ＧＵ， ＳＥＯＮＧＮＡＭ‐ＳＩ ＧＹＥＯＮＧＧＩ‐ＤＯ １３４４９， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ

(71)【出願人】

【識別番号】518366555

【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジュン・ギュン

(72)【発明者】

【氏名】キム，キョン・フイ

(72)【発明者】

【氏名】シン，イン・キュン

(72)【発明者】

【氏名】ノ，スン・ジェ

(72)【発明者】

【氏名】チョ，デ・ヨン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA08

4B063QA17

4B063QQ43

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を獲得する段階を含み、前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーは、Ｌ１ＰＡ１２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＨＳ＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１０＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１３＿３ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、およびＬ１Ｐ１＿ｏｒｆ２からなる群より選択される１種以上である、癌治療反応性を予測するための情報提供方法に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を獲得する段階を含み、
前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーは、Ｌ１ＰＡ１２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＨＳ＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１０＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１３＿３ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、およびＬ１Ｐ１＿ｏｒｆ２からなる群より選択される１種以上である、
癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項2】

癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を獲得する段階は、
ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化および非メチル化ＤＮＡを検出する段階；
メチル化および非メチル化ＤＮＡ間の割合を用いて、ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化レベルの推定値を計算する段階；
を含む、請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項3】

前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーが複数個である場合、各メチル化レベルの推定値に重み係数値を乗じた上で、これらを合算してスコアを計算する段階を含む、請求項２に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項4】

前記メチル化および非メチル化ＤＮＡを検出する段階は、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行う段階を含む、請求項２に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項5】

前記癌治療は、免疫抗癌療法である、請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項6】

前記試料は、セルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）である、請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【請求項7】

前記癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌または肺癌からなる群より選択されたいずれかの癌である、請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を用いて、癌患者の免疫治療に対する反応性を予測するための情報を提供する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

癌は、全世界で最も高い死因の一つであり、早期診断の可否が完治率を決定することが多く、健康診断などを通じての癌の早期診断が重要視されている。一般に、健康診断の際によく利用される癌検査は、血液中のタンパク質腫瘍マーカー（ｍａｒｋｅｒ）検査であり、その他に内視鏡、組織検査などを通じて癌発生の有無を確認することができる。

【0003】

癌を引き起こすゲノム異常変異には３種類があることが知られているが、染色体の一部が丸ごと変わったり、塩基配列が１－２箇所変わる染色体の順番や塩基配列の変化に加えて、クロマチン修飾（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるエピジェネティクス修飾がその原因であるといえる （Ｓｔｉｃｋｅｒ Ｔ、Ｃａｔｅｎａｃｃｉ ＤＶ、Ｓｅｉｗｅｒｔ ＴＹ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ａ ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｂｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１ ３８（２）：１７３－８５）。一般に、染色体の一部または数箇所が変化する変異は、遺伝的（ｇｅｎｅｔｉｃ）なものがその原因とも考えられ、放射線のような突然変異の誘発要因により体細胞において局所的に起こり得る。エピジェネティックゲノム修飾の中でも最も代表とされる癌細胞におけるＤＮＡメチル化の変化は、正確な原因が明らかにされていないが、食生活や環境的要因がその原因であると考えられている。特にこのようなエピジェネティックゲノム修飾は、癌が発生した組織のゲノムに多く見られており、これを用いた診断法の開発など、臨床適用への関心が高まっている。

【0004】

ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、シトシンのピリミジン環の５位の炭素にメチル基（－ＣＨ３）が共有結合で添加される現象であって、ＤＮＡメチル化は、正常な個体の発生においてもゲノム刷り込み、Ｘ染色体不活性化など様々な生命現象で重要な役割を果たしている。

【0005】

癌組織では、正常細胞とは異なる２種のＤＮＡメチル化現象が現れるが、それは、ゲノム全体にわたるグローバルな低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）現象と、遺伝子発現の調節部位に位置するＣｐＧアイランド（ｉｓｌａｎｄ）の高メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）現象である。低メチル化現象は、主に遺伝子と遺伝子間領域（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に現れ、これは染色体を不安定にし、細胞分裂の過程で染色体の組換え、転移、欠失、再配列などを引き起こすことが推測されている。特にＬＩＮＥ－１のようなトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）は、通常はメチル化されて発現が抑制されているが、癌での低メチル化現象によって発現され、ゲノムのあちこちに転移され、染色体不安定性の一因となることが知られている。ここで、癌組織におけるＤＮＡメチル化の変化は、エピジェネティック（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）であると考えられているが、このようなエピジェネティック修飾は、細胞分裂後も維持されるため、低メチル化及び高メチル化は、トランスポゾン及びＣｐＧアイランド周辺に位置する遺伝子の発現に持続的な影響を与えることになる。実際、癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）、細胞周期調節遺伝子、ＤＮＡ修復関連遺伝子、細胞接着関連遺伝子などは、癌組織においてＤＮＡメチル化によって発現が抑制されることにより、これらの遺伝子が崩壊したことと同様の効果を奏することが知られている（ＭｃＣａｂｅ ＭＴ、Ｂｒａｎｄｅｓ ＪＣ、Ｖｅｒｔｉｎｏ ＰＭ．Ｃａｎｃｅｒ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ １５（１２）：３９２７－３７）。これら遺伝子の発現が抑制されることによって細胞は異常に増殖し、遺伝的安定性を維持することができなくなり、さらなる突然変異を誘発し、癌を進行させるのに重要な役割をすることになる。

【0006】

一方、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤などの免疫抗癌剤は、癌細胞または癌関連遺伝子を標的として作用する既存の抗癌剤とは異なり、体内免疫系を活性化して、免疫細胞が癌細胞を攻撃するように助ける。免疫抗癌剤は、高価格の割に完治に近い効果を示す患者は少数に過ぎず、免疫療法に適した患者群を選別することが重要であるが、治療反応性を予測する因子に関する知識は非常に制限的であり、免疫療法反応性とＤＮＡメチル化変異の相関関係に対する研究は、皆無であるのが実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、分離された患者の試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチルレベルに関する情報を利用して、患者の癌治療に対する応答を予測するための情報を提供することである。

【0008】

ただし、本発明が解決しようとする課題は、上述した課題に限定されず、言及されなかった他の課題は、以下の記載により当該技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されるはずであろう。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一実施例による癌治療反応性を予測するための情報提供方法は、癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する段階を含む。

【0010】

ここで、ＬＩＮＥ－１サブファミリーは、Ｌ１ＰＡ１２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＨＳ＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１０＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、Ｌ１Ｐ２＿５ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１３＿３ｅｎｄ、Ｌ１ＰＡ１１＿３ｅｎｄ、およびＬ１Ｐ１＿ｏｒｆ２からなる群より選択される１種以上であることができる。

【0011】

一実施例によれば、癌患者の分離された試料からＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルに関する情報を獲得する段階は、前記試料からＤＮＡを分離する段階；分離したＤＮＡのシトシン塩基を変形させる化合物を処理する段階；変形されたＤＮＡ配列に結合するプライマーを用いて、ＬＩＮＥ－１サブファミリーを増幅する段階；ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化および非メチル化ＤＮＡを検出する段階；メチル化および非メチル化ＤＮＡ間の割合を用いて、ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化レベルの推定値を計算する段階；を含む。

【0012】

前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化レベルの推定値は、ベータ値で表すことができ、該ベータ値は、メチル化程度を０～１の範囲の値で表すことができる。例えば、０は当該ＣｐＧ座位が完全にメチル化されないことを意味し、１は当該ＣｐＧ座位が完全にメチル化されたことを意味する。

【0013】

一実施例によれば、前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーが複数個である場合、各メチル化レベルの推定値に重み係数値を乗じた上、これを合算してスコアを計算する段階を含む。

【0014】

一実施例によれば、ＤＮＡのシトシン塩基を変形させる化合物を処理する段階は、バイサルファイト処理を行うことができるが、これに制限されるものではない。

【0015】

一実施例によれば、メチル化および非メチル化ＤＮＡを検出する段階は、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行う段階を含む。

【0016】

一実施例によれば、癌治療は、免疫抗癌療法である。

【0017】

一実施例によれば、試料はセルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）である。

【0018】

一実施例によれば、癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌、または肺癌である。

【0019】

本開示における用語「癌治療反応性を予測するための情報提供方法」とは、診断のための予備的段階であって、癌を診断するために必要な客観的な基礎情報を提供することであり、医師の臨床的判断または所見は除外される。

【0020】

本開示における「メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡを構成するシトシンのピリミジン環の５位の炭素にメチル基（－ＣＨ３）が共有結合で付着する現象を意味する。

【0021】

本開示における「プライマー」とは、標的核酸分子（例えば、標的遺伝子）の少なくとも６つの連続するヌクレオチド配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを表す。

【0022】

本開示における「次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）」とは、ゲノムの塩基配列の高速分析方法であって、従来の塩基配列の分析法とは異なり、多数のＤＮＡ断片を並列に処理することを特徴とし、大容量のゲノムデータを迅速に解読することができる。

【0023】

本開示における「セルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）」とは、血流や尿などの体液に乗って回る核酸として定義され、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）に由来するｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ）を含むことができる。

【0024】

前記メチル化レベルは、制限酵素で切断した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはメチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＳＰ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、パイロシークエンシング、ＭＳ－ＨＲＭ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、メチル化特異－高解像度融解曲線解析とメチル化感受性制限酵素を用いたメチル化の可否の測定、ＤＮＡチップおよびバイサルファイトシーケンシングのような自動塩基配列解析などの方法で測定することができるが、これに限定されるものではない。

【0025】

前記試料は、患者のＤＮＡを含むセルフリー（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）であることができる。また、前記患者のＤＮＡは、患者の血液や組織、ＦＦＰＥなどから抽出したｇＤＮＡなどを用いることができるが、これに限定されるものではない。

【0026】

前記癌治療は、免疫抗癌療法であって、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、免疫細胞治療剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、治療用抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などを含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞抑制に関与する免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断し、Ｔ細胞を活性化させて癌細胞を攻撃する薬剤であって、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１抗体を含むことができる。

【発明の効果】

【0027】

本発明の一実施例による癌治療反応性を予測するための情報提供方法は、 高正確性の患者の癌治療反応性に関する情報を提供することができる。

【0028】

本発明の一実施例による癌治療反応性を予測するための情報提供方法は、癌治療を進行する前に治療効果および良好な予後が予測される患者群を選別して不要な治療を減らし、副作用と治療費を軽減させることができる。

【0029】

ただし、本発明の効果は、上述した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能なあらゆる効果を含むことを理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化 値（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）に対する生存分析の結果である。

【図2】免疫抗癌療法に対する反応患者群（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と非反応患者群（ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）において、本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化値の高い患者と低い患者との割合を表す。

【図3】任意に選定されたＬＩＮＥ－１中の１０個の標的のメチル化値に対する生存分析の結果である。

【図4】免疫抗癌療法に対する反応患者群（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と非反応患者群（ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）において、任意に選定されたＬＩＮＥ－１中の１０個の標的のメチル化値の高い患者と低い患者との割合を表す。

【図5】任意に選定されたＬＩＮＥ－１中の１０個の標的と本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーそれぞれの生存分析および免疫抗癌療法に対する反応性予測に対するｐ－ｖａｌｕｅ（p-値）を表す。

【図6】反応患者群と非反応患者群間のメチル化値の分布を表す。本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対して左側はＩｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ方法により求めたメチル化値であり、右側はＮＧＳ方法により求めたｉＭｅｔｈｙｌ（ｉメチル）スコアを確認した結果である。

【図7】肺癌患者において、本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対してそれぞれＩｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ方法により求めたメチル化値（左側）とＮＧＳ方法（右側）により求めたｉＭｅｔｈｙｌスコアで免疫抗癌療法反応患者群と非反応患者群間の生存率の差を分析した結果である。

【図8】肺癌患者において、免疫治療反応性を予測する多様な因子で予測された免疫抗癌療法の反応患者群と非反応患者群間の生存率の差を比較した結果である。

【図9】肺癌患者の試料から抽出したＤＮＡから本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するｉＭｅｔｈｙｌスコアを通じて予測された免疫抗癌療法の反応患者群と非反応患者群間の生存率の差を分析した結果（左側）および免疫抗癌療法の反応性予測性能を評価するためのＲＯＣ曲線（右側）を表す。

【図10】乳癌患者の血液（ＰＢＭＣ）、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、腫瘍組織のＦＦＰＥ検体（Ｔｉｓｓｕｅ）に対する本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化値の分布を表す。

【図11a】本開示の一実施例による１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する血液と腫瘍組織のＦＦＰＥ検体間の相関性の結果（図１１ａ）およびｃｆＤＮＡと腫瘍組織のＦＦＰＥ検体間の相関性の結果（図１１ｂ）である。

【図11b】本開示の一実施例による１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する血液と腫瘍組織のＦＦＰＥ検体間の相関性の結果（図１１ａ）およびｃｆＤＮＡと腫瘍組織のＦＦＰＥ検体間の相関性の結果（図１１ｂ）である。

【図12】本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣＡ）の結果である。

【図13a】本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する階層クラスタリング（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）の結果である。

【図13b】本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する階層クラスタリング（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）の結果である。

【図13c】本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する階層クラスタリング（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）の結果である。

【図14】肺癌または乳癌患者の試料から抽出したｃｆＤＮＡから本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するｉＭｅｔｈｙｌスコアを通じて予測された免疫抗癌療法の反応患者群と非反応患者群間の生存率の差を分析した結果を表す。

【図15】肺癌または乳癌患者の試料から抽出したｃｆＤＮＡと腫瘍組織間の本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する生存分析ｐ－ｖａｌｕｅ分布を比較した結果である。

【図16】肺癌または乳癌患者の試料から抽出したｃｆＤＮＡから本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するｉＭｅｔｈｙｌスコアに重みを付与し、生存分析ｐ－ｖａｌｕｅ分布を比較した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下、添付された図面を参照にして実施例を詳細に説明する。しかし、実施例には様々な変更を加えられることができるので、特許出願の権利範囲はこれらの実施例によって制限されるまたは限定されるものではない。実施例の全ての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれることが理解されるべきである。

【0032】

実施例にて使用した用語は、単に説明のために用いられたものであって、限定する意図として解釈されるべきではない。単数の表現は、文脈上明らかに別段の意味がない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」等の用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定することを意図したものであり、１つまたはそれ以上の他の特徴、数字、段階、動作、構成要素、またはそれらの組み合わせの存在または付加の可能性を予め排除しないことが理解されるべきである。

【0033】

特に断りがない限り、技術的または科学的用語を含む本明細書で使用される全ての用語は、実施例が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有することと解釈されるべきであり、本出願で明白に定義されていない限り、理想的または過度に形式的な意味に解釈されるべきではない。

【0034】

実施例を説明するにあたって、関連する公知技術の具体的な説明が実施例の要旨を不明確にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
以下において、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。ただし、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

【0035】

実施例１．ＬＩＮＥ－１サブファミリーの選定
ＬＩＮＥ－１因子内のメチル化程度を確認するために、ＬＩＮＥ－１因子内に１０個の標的を、以下の表１のように選定した。次の表１において、Ａｒｒａｙ ＩＤは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ内のプローブＩＤであり、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータベース（ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）にて提供するｙｏｕｎｇ ＬＩＮＥ－１サブファミリーにマッピングされる情報である。以下の実施例では、表１に記載されている順にＬＩＮＥ－１サブファミリーをＴ１～Ｔ１０と命名して用いた。

【0036】

【表1】

【0037】

選定された１０個のサブファミリーが実際に免疫抗癌療法の予後を予測するのに有意な効果を有するか否かを確認するために、最初に肺癌患者１４１名に対して生存分析（Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を進めた。まず１０個のサブファミリーに対するメチル化値（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）で一つの代表値を求めた。具体的に、各サブファミリー毎のスケールの差を最小限にするために、患者全体のメチル化値に対して最小－最大正規化（Ｍｉｎ－Ｍａｘ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を進めた。そして、各患者毎に正規化された１０個のメチル化値の平均を計算し、代表値とした。それから、患者全体群の代表値に対する平均を基準に、各患者を高メチル化（ｈｉｇｈ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）（代表値が平均以上）または低メチル化(ｌｏｗ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ)（代表値が平均未満）群に分けて分析した。生存分析は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒモデルを用いて行った。

【0038】

その結果、図１に示すように、メチル化値の高い群（ｈｉｇｈ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が、低い群（ｌｏｗ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）より生存率が高いことが確認され、ｐ－ｖａｌｕｅが０．００９６と統計的有意性が立証された。選定された標的プローブセットだけでも免疫抗癌治療の予後が正常に予測されたことが確認された。

【0039】

次に、免疫抗癌療法の治療反応性に対する予測能力を評価するために、前記患者群を再び反応患者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）（ＤＣＢ、ｄｕｒａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ）と非反応患者（ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）（ＮＣＢ、ｎｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ）に分けた。そして反応患者と非反応患者群のそれぞれにおいてメチル化値の高い患者（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）とメチル化値の低い患者（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｏｗ）との割合を求めて比較した。

【0040】

その結果、図２に示すように、反応患者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）群では、メチル化値の高い患者の割合がより高いのに対し（０．６８３ ｖｓ ０．４８０）、非反応患者（ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）群では、メチル化値の高い患者の割合がより低く（０．３１７ ｖｓ ０．５２０）、統計的有意性も同様に確認された（ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０２６）。

【0041】

前記結果を通じて、本開示の一実施例によるＬＩＮＥ－１サブファミリーは、実際の免疫抗癌療法の治療反応性を予測することができることが確認することができた。

【0042】

実施例２．ＬＩＮＥ－１サブファミリーと任意（ｒａｎｄｏｍ）標的の治療反応性予測性能の比較
前記実施例１にて選定されたＬＩＮＥ－１サブファミリーが他の任意の標的に比べて免疫抗癌療法の治療反応性に対する予測性能に優れているか否かを検証するために、任意にＬＩＮＥ－１中の１０個の標的を抽出し、前記実施例１に記載された実験を繰り返した。

【0043】

その結果、図３および図４から確認できるように、任意に標的を定めたときには、生存分析と免疫抗癌療法の治療反応性予測能力分析において、有意な結果が示されなかった。すなわち、前記実施例１にて選定されたＬＩＮＥ－１サブファミリーは、ＬＩＮＥ－１中の他の標的と比較してより優れた治療反応性予測力を有している。

【0044】

次に、前記実施例１にて選定されたＬＩＮＥ－１サブファミリーがＬＩＮＥ－１中の他の標的と比較してより優れた予測力を有していることを明確に確認するために、１，０００回繰り返し、ＬＩＮＥ－１中の１０個の標的をランダムにサンプリングした後、生存分析のｐ－ｖａｌｕｅ分布と免疫抗癌療法の治療反応性予測能力分析のｐ－ｖａｌｕｅ分布を求めた。

【0045】

その結果、図５に示すように、左側の生存分析に対するｐ－ｖａｌｕｅ分布（ｐ－ｖａｌｕｅ平均０．４１８、中央値０．３８３）と右側の免疫抗癌療法 の治療反応性予測分析に対するｐ－ｖａｌｕｅ分布（ｐ－ｖａｌｕｅ平均 ０．５０２、中央値０．５０６）の全部において、前記実施例１にて選定されたＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化値を用いた場合、顕著に低いｐ－ｖａｌｕｅを有し（赤色星印、生存分析のｐ－ｖａｌｕｅ＝０．００９６、免疫抗癌療法の治療反応性予測分析のｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０２６）、分析の結果が有意であることを確認することができた。

【0046】

実施例３．ＬＩＮＥ－１サブファミリー検出ＰＣＲプライマーの設計
前記実施例１にて選定された１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するＰＣＲプライマー配列を設計した。Ａｍｐｌｉｃｏｎ ｓｉｚｅを１００－１２５ｂｐ範囲にし、ＬＩＮＥ－１サブファミリーが含まれるように順方向と逆方向のプライマーセットを設計した。ヒトゲノム参考配列としては、ＧＲＣｈ３７（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３７；ｈｇ１９）を用いており、次の表２に１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーが参考配列にマッピングされる代表位置に対する情報を記載した。

【0047】

【表2】

【0048】

選定された１０個の標的に対してＰＣＲ増幅を行うためのプライマーを設計した。プライマーは、リファレンスゲノム配列にバイサルファイト処理を行うことによって、ＣＴ置換されたと仮定して作られたｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅに対して、標的を含むＰＣＲプライマーとしてデザインした。選定されたプライマー配列は、次の表のとおりである。標的周囲の塩基配列に基づいてワトソンまたはクリック鎖に対してプライマーを設計した。

【0049】

【表3】

【0050】

実施例４．ＮＧＳライブラリーの調製
まず、患者の検体から抽出したＤＮＡにて非メチル化されたシトシンをウラシルに変化させるために、バイサルファイト処理した。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてメーカーの指示方法に従って進めた。

【0051】

バイサルファイト処理したＤＮＡに対して、前記実施例１にて選定された１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーを増幅させるために、前記実施例３にて作製したプライマーを用いて標的ＰＣＲを行った。本実施例では、１０個のサブファミリーの標的を２つの群（１群：Ｔ４、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ１０、２群：Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ９で構成）に分けて、多重ＰＣＲ方法により増幅した。

【0052】

具体的に、ＰＣＲプライマーは、ＮＧＳアダプターライゲーションのために、５´末端をリン酸化修飾して合成し、各２００ｎＭの濃度で用いた。ＰＣＲ試薬は、ＥｐｉＴｅｃｔ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた。バイサルファイト処理を行ったＤＮＡ１－１００ｎｇを用いて９５℃で５分間１回、９５℃で１５秒、６０℃で２分間からなるＰＣＲサイクルを計２３回～２９回実施し、標的領域を増幅した。

【0053】

ＰＣＲ産物は、二つの群のＰＣＲ反応液を混合した後、１．８×体積のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ビーズを用いて精製した。磁気ビーズを用いた精製は、メーカーの使用方法に従って進めた。精製したＰＣＲ産物にＮＧＳアダプターをライゲーションした。精製したＰＣＲ産物（１０－１００ｎｇ）にＮＧＳアダプターを１ｕＭの濃度になるように添加し、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅキット（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした。２５℃で３０分間反応させ、その後、１×体積のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ビーズを添加して精製した。アダプターがライゲーションされたライブラリーは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて増幅させた。精製したサンプルに以下のライブラリー増幅用プライマー各２００ｎＭとＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを添加し、９８℃で４５秒間１回、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒からなるＰＣＲサイクルを計７回、７２℃で５分間１回実施し、ライブラリーを増幅した。増幅後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ビーズを用いて、１×－０．５×（ｌｅｆｔ－ｒｉｇｈｔ）でｄｏｕｂｌｅ ｓｉｄｅ精製した。

【0054】

＜ライブラリー増幅用プライマー＞
Ｐ５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号５７）
Ｐ７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号５８）

【0055】

一方、ＮＧＳ分析のためのライブラリーは、前述した方法の外に既製のＡｍｐｌｉＳｅｑライブラリー作製試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ ＰＬＵＳなど）を用いて作製することができる。ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ ＰＬＵＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）ライブラリー作製試薬を用いた場合、ＦｕＰａ処理による部分切断（ｐａｒｔｉａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）のために、前記表３のプライマー配列において一部ＴをＵに置換した（表４）。ライブラリー作製方法は、メーカーのプロトコルに従って進めた。

【0056】

【表4】

【0057】

市販のキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ ＰＬＵＳ）を用いてライブラリーを作製する方法は、次のとおりである。まず、前記表４のプライマーを用いて多重ＰＣＲを進めた。このとき、プライマー濃度は、それぞれ２００ｎＭにし、１０個の標的に対して１つまたは２つの群に分けて多重ＰＣＲ方法により増幅した。バイサルファイト処理を行ったＤＮＡ１－１００ｎｇにＰＣＲプライマーセットとＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘを添加し、９９℃で２分間１回、９９℃で１５秒、６０℃で２分からなるＰＣＲサイクルを計２６回～３２回実施し、標的領域を増幅した。

【0058】

ＰＣＲ産物に１／１０ｖｏｌのＦｕＰａ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、５０℃で１０分間、５５℃で１０分間、６０℃で２０分間反応させた。その後、Ｓｗｉｔｃｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れてよく混合し、アダプターとＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを入れた後、２２℃で３０分間、６８℃で５分間、７２℃で５分間反応させて、ＰＣＲ産物にアダプターを付着した。

【0059】

ライゲーション産物は、１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ビーズを添加して精製した。精製の最後の段階で洗浄後、乾燥したビーズに溶出(ｅｌｕｔｉｏｎ)のための溶液の代わりに１×Ｌｉｂ Ａｍｐ Ｍｉｘ ４５ｕＬと１０×Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐ Ｐｒｉｍｅｒｓ ５ｕＬを添加した。９８℃で２分間１回、９８℃で１５秒間、６４℃で１分間からなるサイクルを計７回行い、ライブラリーを増幅した。増幅後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ビーズを用いて、１．２×－０．５×（ｌｅｆｔ－ｒｉｇｈｔ）でｄｏｕｂｌｅ ｓｉｄｅ精製した。

【0060】

前記の過程を通じて作製したライブラリーは、ＫＡＰＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲで定量した後、ＮＧＳ反応を進めた。

【0061】

実施例５．ＮＧＳ分析
ＮＧＳの装置で生成されたＢＣＬファイルからＢｃｌ２ｆａｓｔｑプログラム（ｖｅｒ２．２０．０．４２２）を用いて、各検体別に生成されたＮＧＳ配列をｆａｓｔｑファイルの形態で分離（デマルチプレクシング）した。公用データベースからダウンロードを受けたＵＣＳＣ ｈｇ１９ヒトゲノムの標準配列を基にｂｉｓｍａｒｋプログラム（ｖｅｒ０．２２．３）を適用し、バイサルファイト処理により発生し得るＣ－ｔｏ－Ｔ（シトシンベースがチミンベースに変換）或いはＧ－ｔｏ－Ａ（グアニンベースがアデニンベースに変換）変換を反映したバイサルファイト標準ゲノム配列と配列マッピングのためのインデックスファイルを予め用意した。各検体別にｆａｓｔｑファイルからイルミナユニバーサルアダプター配列をトリミングした上で、用意した前記バイサルファイト標準ゲノム配列にｂｉｓｍａｒｋプログラムを用いて、整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）した。ＳＡＭ（配列整列マップ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍａｐ）ファイルからワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎ ｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋ ｓｔｒａｎｄ）に整列された配列を分離し、ｂａｍ－ｒｅａｄｃｏｕｎｔプログラム（ｖｅｒ０．８．０）を用いて、各ＬＩＮＥ－１サブファミリー標的位置でのＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ塩基の個数の情報が入っているｂａｍ－ｃｏｕｎｔ－ｔａｂｌｅを得た。このｃｏｕｎｔ－ｔａｂｌｅから１０個のサブファミリーそれぞれの位置別にＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）サブファミリーのＤＮＡメチル化レベルを計算した。

【0062】

前記ＬＩＮＥ－１サブファミリーのメチル化レベルの推定値は、ベータ値で表すことができ、前記ベータ値は、メチル化程度を０～１の範囲の値で表すことができる。例えば、０は、当該ＣｐＧ座位が完全にメチル化されていないことを意味し、１は、当該ＣｐＧ座位が完全にメチル化されたことを意味する。
実施例１にて選定された１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリー標的の位置でのベータ値を統合し、検体別に一つのｉＭｅｔｈｙｌスコアで取った。ｉＭｅｔｈｙｌスコア計算およびカットオフ（ｃｕｔ－ｏｆｆ）値は、免疫抗癌剤の治療肺癌コホートでのベータ値と治療反応性データからマシンラーニングを適用した先行研究を基にロジスティック回帰分析法により選定し、肺癌コホートでの治療反応性予測に対するｉＭｅｔｈｙｌスコアカットオフ（ｃｕｔ－ｏｆｆ）値は０．３７であった。免疫抗癌剤の反応性データとＴ１～Ｔ１０のベータ値データを確保した９０名の患者に対して、ロジスティック回帰分析法を適用した３－ｆｏｌｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを通じて最適のプローブと変数の組み合わせを発見し、各プローブのベータ値から最終ｉＭｅｔｈｙｌスコアを求める数式は、次のとおりである。

【0063】

【数1】

【0064】

Ｔｉ_ｂｅｔａは、各プローブの位置でのベータ値、ａ_ｉおよびｂは、マシンラーニングを通じて得られた変数値である。

【0065】

実施例６．Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙとＮＧＳに対するメチル化値の比較
次に免疫チェックポイント阻害剤の治療履歴のある肺癌患者に対して、実施例１にて選定したＬＩＮＥ－１サブファミリーの治療反応性に対する予測能力を評価するために、反応患者群と非反応患者群間にメチル化値の分布の差を確認した。その結果、図６に示すように、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにより求めたメチル化値は、ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０４７であるのに対し、前記実施例５にて記述した方法により求めたｉＭｅｔｈｙｌスコアは、ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０３９とより優れた予測能力を示すことを確認することができた。

【0066】

次に、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにより求めたメチル化値、または、前記実施例５にて記述した方法により求めたｉＭｅｔｈｙｌスコアに基盤した免疫チェックポイント阻害剤の反応予測群（治療反応性が高いことが予測された患者群）と非反応予測群（治療反応性が低いことが予測された患者群）間の生存率の差を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定技法を用いて分析した。

【0067】

その結果、図７に示すように、前記実施例５にて記述した方法により１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するｉＭｅｔｈｙｌスコア（ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０１２）が、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ方法に対する値（ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０９８）より優れた予測力を示すことが確認された。

【0068】

従来に広く知られた免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を予測する因子として、腫瘍変異負荷（Ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ、ＴＭＢ）、新生抗原負荷（Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄ、ＮｅｏＡｇ）、ＰＤ－Ｌ１（ＳＰ２６３）発現の有無がある。各予測因子に基盤して同様にＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定技法を用いて免疫チェックポイント阻害剤の反応予測群と非反応予測群に分けて、生存率の差を分析し、ログランク検定（Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を通じて反応予測群と非反応予測群間の生存曲線の差の統計的有意性をＰ－ｖａｌｕｅで導出した。免疫チェックポイント阻害剤の反応性予測因子間により有意な比較をするために、各因子毎に１，０００回繰り返し、患者サンプルをランダムにサンプリングを行い、生存分析のｐ－ｖａｌｕｅ分布を比較した。

【0069】

その結果、図８から確認できるように、ＩＮＥ－１サブファミリーに対するｉＭｅｔｈｙｌスコアが他の従来の因子よりも免疫チェックポイント阻害剤に対してより優れて予測することが確認でき、特に実施例５にて記述した方法により計算したｉＭｅｔｈｙｌスコアが最も高い予測力がみられた。

【0070】

実施例７．肺癌患者における治療反応性予測性能の検討
計１２３名のａｎｔｉ－ＰＤ１或いはａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤の治療履歴のある肺癌患者に対して、患者の組織またはＦＦＰＥ検体から抽出したＤＮＡを用いて、前記実施例５にて記述した方法（ｉＭｅｔｈｙｌ）により１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するメチル化レベル、すなわち、ベータ値を分析した。

【0071】

Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定技法を用いてｉＭｅｔｈｙｌスコアに基盤した免疫チェックポイント阻害剤の反応予測群（治療反応性が高いことが予測された患者群）と非反応予測群（治療反応性が低いことが予測された患者群）間の生存率の差を分析した。生存率は、基本的に無増悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＦＳ）を基準にした。ログランク検定（Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を通じて反応予測群と非反応予測群間の生存曲線の差の統計的有意性をＰ－ｖａｌｕｅで導出し、コックス比例ハザードモデル（Ｃｏｘ´ｓ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄ ｍｏｄｅｌ）を通じてバザード比（ＨＲ、Ｈａｚａｒｄ ｒａｔｉｏ）を導出した。感度と前記陽性率を用いたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線の曲線下の面積（ＡＵＣ、Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ａ Ｃｕｒｖｅ）値を通じて最終的な予測性能を評価した。カテゴリ変数の群間の差の統計的有意性は、Ｆｉｓｈｅｒ´ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ（２つの群の比較）で分析した。連続変数の平均値或いは中間値との差の統計的有意性は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにより分析した。

【0072】

予測されたｉＭｅｔｈｙｌスコアが高い群（反応予測群、ｈｉｇｈ、３９名）と低い群（非反応予測群、ｌｏｗ、８４名）に分けて、両群の生存率を比較した結果、図９に示すように、ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．０１０３の統計的に有意なレベルで非反応予測群の生存確率が反応予測群よりＨＲ＝０．６８４倍程低く、ＡＵＣは０．７８９と確認され、優れた予測性能を示した。

【0073】

実施例８．ＬＩＮＥ－１サブファミリーメチル化値に対する試料別の相関関係
まず、乳癌患者５０名に対して血液細胞（ＰＢＭＣ）、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および腫瘍組織のＦＦＰＥ検体（Ｔｉｓｓｕｅ）に対するメチル化値（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）分布を、前記実施例１にて選定した１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対して確認した。メチル化値は、前記実施例にて記述したＮＧＳ方法により求めた。

【0074】

その結果、図１０に示すように、前記の図のように各サブファミリーにおいて、全般的に血液細胞（ＰＢＭＣ）よりセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が腫瘍組織とより似たような傾向のメチル化値の分布を有し、血液対比ｃｆＤＮＡと腫瘍組織においてメチル化値がより低い分布を示した。

【0075】

次に、１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリー毎に血液と腫瘍組織のＦＦＰＥ 検体間、そして、ｃｆＤＮＡと腫瘍組織のＦＦＰＥ検体間の相関性を確認した。図１１ａおよび図１１ｂから確認できるように、全般的に血液は、腫瘍組織と相関性がさほど有意でないのに対し、ｃｆＤＮＡと腫瘍組織はほとんどが強く正の相関関係を示すことを確認することができた。

【0076】

さらに、全ＬＩＮＥ－１サブファミリーにおいて、ｃｆＤＮＡと腫瘍組織との相関関係をより分明に視覚化するために、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣＡ）により次元を縮小し、図１２に示した。図１２に示すように、血液は腫瘍組織と分離され分布した反面、ｃｆＤＮＡは、腫瘍組織と非常に類似に分布することが確認された。したがって、ｃｆＤＮＡと腫瘍組織の相関関係がより分明であることを確認することができた。

【0077】

また、ＬＩＮＥ－１サブファミリー間の群集の傾向性および関連性を確認するために、血液細胞（ＰＢＭＣ）、ｃｆＤＮＡ、腫瘍組織（Ｔｉｓｓｕｅ）それぞれにおいて、ＬＩＮＥ－１サブファミリーに対する階層クラスタリング（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を進めた。その結果、図１３ａ～図１３ｃに示すように、腫瘍組織（Ｔｉｓｓｕｅ）とｃｆＤＮＡは、［｛Ｔ５，Ｔ１，Ｔ３｝／｛Ｔ２，Ｔ９，Ｔ６，Ｔ７｝／｛Ｔ４｝／｛Ｔ８，Ｔ１０｝］のように、同様にクラスタリングされた。各クラスタを１群(ｇｒｏｕｐ１)から４群(ｇｒｏｕｐ４)で表した。この反面、血液（ＰＢＭＣ）は、［｛Ｔ４｝／｛Ｔ６，Ｔ７，Ｔ２，Ｔ９｝／｛Ｔ１０｝／｛Ｔ５，Ｔ１，Ｔ３，Ｔ８｝］のようにクラスタリングされながら、腫瘍組織と異なるパターンがみられた。

【0078】

実施例９．肺癌および乳癌患者におけるｃｆＤＮＡを用いた治療反応性予測性能の検証
免疫チェックポイント阻害剤の治療履歴のある計１６７名の肺癌患者と９０名の乳癌患者に対して、患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を用いて、前記実施例５にて記述した方法（ｉＭｅｔｈｙｌ）により１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリーに対するメチル化レベル、すなわち、ベータ値を分析した。

【0079】

実施例７にて記述した方法と同様にＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定技法を用いてｉＭｅｔｈｙｌスコアに基盤した免疫チェックポイント阻害剤の反応予測群（治療反応性が高いことが予測された患者群）と非反応予測群（治療反応性が低いことが予測された患者群）間の生存率の差を分析した。

【0080】

予測されたｉＭｅｔｈｙｌスコアが高い群（反応予測群、ｈｉｇｈ）と低い群（非反応予測群、ｌｏｗ）に分けて、両群の生存率を比較した結果、図１４に示すように、肺癌において、ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．００３、乳癌においてｐ－ｖａｌｕｅ＝０．００１７の統計的に有意なレベルで非反応予測群の生存確率が反応予測群よりも低く予測された。

【0081】

次に、ｃｆＤＮＡから得たメチル化値と腫瘍組織から得たメチル化値による免疫チェックポイント阻害剤の反応性予測力を比較した。統計的な有意性のために、各１，０００回繰り返し、患者のサンプルをランダムにサンプリングし、生存分析ｐ－ｖａｌｕｅを求めた。図１５にて確認できるように、肺癌患者と乳癌患者において、全部ｃｆＤＮＡを用いた生存分析が腫瘍組織を用いた生存分析においてより優れた予測力を示した。

【0082】

さらに、免疫チェックポイント阻害剤の反応性予測をより有意にするために、前記実施例１にて選定した各１０個のＬＩＮＥ－１サブファミリー毎に重みを異にし、ｉＭｅｔｈｙｌスコアを計算した（Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）。各１６７名のｃｆＤＮＡ肺癌患者群と９０名のｃｆＤＮＡ乳癌患者群において、最も優れた予測力を示す重みを適用するか（Ｓｅｌｆ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）、または他の患者群において最も優れた予測力を示す重みを交互適用（Ｃｒｏｓｓ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）した。その結果、図１６に示すように、従来のｉＭｅｔｈｙｌスコアより重みをおいて計算したｉＭｅｔｈｙｌスコアの方がより有意な予測力がみられた。特に、腫瘍組織での重みを交互適用するか、他の腫瘍ｃｆＤＮＡでの重みを交互適用しても同様に予測力がより優れることが確認できた。

【0083】

前記結果を総合してみると、ｃｆＤＮＡから得られたメチル化値は、腫瘍組織のメチル化値と高い相関関係を示すため、ｃｆＤＮＡを用いるとより高い正確度で免疫抗癌療法の治療反応性を予測できることが分かった。

【0084】

以上のように実施例が限定された図面によって説明されたが、当該技術分野で通常の知識を有する者であれば、前記に基づいて多様な技術的修正及び変形を適用することができる。例えば、記載された技術が記載された方法とは異なる順序で実行したり、および／または記載された構成要素が記載された方法とは異なる形で結合または組み合わせたり、他の構成要素または均等物によって代替されたり置換されたりしても、適切な結果が達成され得る。

【0085】

したがって、他の具現例、他の実施例および特許請求の範囲と同等なものも添付された特許請求の範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【図13c】

【図14】

【図15】

【図16】

【手続補正書】

【提出日】2024-04-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024533764000001.xml

【国際調査報告】