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特表2024-533772ヒト肝細胞培養培地およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒト肝細胞の馴化培地ならびにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-12
(54)【発明の名称】ヒト肝細胞培養培地およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒト肝細胞の馴化培地ならびにその使用
(51)【国際特許分類】
C12P 1/00 20060101AFI20240905BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240905BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240905BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240905BHJP
【ＦＩ】
C12P1/00
C12N1/00 A
C12N5/071
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519257
(86)(22)【出願日】2022-09-30
(85)【翻訳文提出日】2024-05-27
(86)【国際出願番号】 US2022077330
(87)【国際公開番号】W WO2023056408
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/250,529
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/250,541
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592048844
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア
(71)【出願人】
【識別番号】503449018
【氏名又は名称】株式会社フェニックスバイオ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 剛
(72)【発明者】
【氏名】石田 雄二
(72)【発明者】
【氏名】菅原 豪
(72)【発明者】
【氏名】立野（向谷） 知世
(72)【発明者】
【氏名】山崎 ちひろ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ08
4B064CA10
4B064CC03
4B064DA20
4B065AA93X
4B065BB11
4B065CA60
(57)【要約】
ＨＨ培養培地および方法が、ＤＭＳＯを補充した培地の使用によって細胞単離手順および凍結融解サイクルに関連する傷害またはストレスからの回復を可能にするために提供される、すなわち、フェーズ１（回復フェーズ）。さらに、ＨＨ培養培地および方法が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した培地の使用によりヒト肝臓と同程度のレベルで培養されたＨＨの肝機能の支持を可能にするように提供される、すなわち、フェーズ２（維持適用フェーズ）。これらＨＨは、肝臓生物学、疾患薬物代謝および薬物動態のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に適している。さらに、フェーズ２の間のＨＨの培養上清、すなわちヒト肝細胞の馴化培養培地（ＣＭＨＨ）が提供され、それはｉＨｅｐ成熟を容易にし、肝細胞の細胞運命維持を支持する。採取されるべき培地中でヒト化肝臓キメラ動物に由来するヒト肝細胞および／または初代ヒト肝細胞を培養するステップを含む、ＣＭＨＨを調製する方法も提供される。
【選択図】図１９
【選択図】図１９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養ヒト肝細胞（ＨＨ）から馴化培地を調製するための方法であって、培養培地を生成するために培地中でＨＨを培養するステップと、
前記ＨＨと少なくとも１時間インキュベートした前記培養培地を、前記馴化培地として採取するステップと
を含む方法。
【請求項2】
前記ＨＨが、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、またはその組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ヒト化肝臓を持つ前記キメラ動物から得られる前記肝細胞が、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）であり、前記ＨＬＣＭ－ＨＨが、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に、前記マウスが、少なくとも１０％の置き換え指数を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）もしくはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭ）であり、前記ＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞維持培地（ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭ）であり、前記ＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＬ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記標準的な細胞培養基礎培地が、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）またはウィリアムＥ培地を含む群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記標準的な細胞培養基礎培地が、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充されている、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記標準的な細胞培養基礎培地がＤＭＥＭであり、前記ＤＭＥＭがＤＭＥＭ－１０であり、前記ＤＭＥＭ－１０が、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を含む、またはそれらから本質的になる、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記血清が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である、請求項８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭが、前記標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、またはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭ、ｔＨＣＧＭが、前記標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、請求項５に記載の方法。
【請求項13】
ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、前記標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、請求項６に記載の方法。
【請求項14】
ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、前記標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、ＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、請求項６に記載の方法。
【請求項15】
培地が、新たな容積で２４～１２０時間毎に置き換えられる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つ前記キメラ動物から得られる前記肝細胞、または前記組合せが、細胞密度０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２で培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項17】
前記ＨＨが、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞またはマウス肝細胞を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＨＨが、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を含み、前記方法が、前記培養ステップの前にヒト化肝臓を持つ前記キメラ動物から得られる前記肝細胞を得るステップであって、ヒト化肝臓を持つ前記キメラ動物から得られる前記肝細胞を得るステップが、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から得られる事前に単離された肝細胞を動物の脾臓内に注射した前記動物の肝臓から得られる肝細胞を単離するステップを含み、それによりヒト化肝臓を持つ前記キメラ動物から得られる前記肝細胞を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記キメラ動物から得られる前記肝細胞が、前記キメラ動物の前記肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、前記キメラ動物が、前記ＨＨが単離される前に少なくとも１０％の置き換え指数を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって調製された培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
【請求項21】
ＣＭＨＨが、肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含み、前記培地が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞またはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用される、ＣＭＨＨ。
【請求項22】
前記ＣＭＨＨが、ヒト肝細胞によって分泌される１つもしくは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含む、請求項２１に記載のＣＭＨＨ。
【請求項23】
前記肝細胞クローン性増殖培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項24】
前記肝細胞維持培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項25】
請求項２０～２４のいずれか一項に記載ＣＭＨＨと細胞外マトリックスを含む組合せ。
【請求項26】
請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨとフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質を含む組合せ。
【請求項27】
新たに単離された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項28】
冷凍保存された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項29】
肝二分化能前駆細胞（ｉＨｅｐ）および／もしくは化学的に誘導される肝臓プロジェニタを、それぞれ最終分化した肝細胞、ＨｅｐａｒＲＧ（商標）などの肝細胞腫細胞、または成熟肝細胞へと分化させるのに使用するための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項30】
非実質細胞と共培養するのに使用するための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項31】
低温保存においてＨＨを懸濁するのに使用するための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＣＭＨＨ。
【請求項32】
単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
前記量のＨＨから前記第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて前記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
前記第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、前記第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含む、方法。
【請求項33】
単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
前記量のＨＨから前記第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて前記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
前記第１の細胞培養培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、前記第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、
前記第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを含まない、方法。
【請求項34】
前記第１の期間が、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、前記第１のフェーズにおいて培養された前記量のＨＨが、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または健康な個体の成熟肝細胞もしくは肝臓組織の肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項35】
前記第１の期間が、約７日間であり、前記第１の（回復）フェーズの細胞培養培地が、３または４日間毎に任意選択で新たにされる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項36】
前記第２のフェーズにおいて培養される前記量のＨＨが、それだけには限らないが、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣＹＰ３Ａ４）およびシトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＥメンバー１（ＣＹＰ２Ｅ１）などの肝細胞代謝遺伝子の生理的レベルの発現を有し；または前記第２のフェーズにおいて培養される前記量のＨＨが、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項37】
前記第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＣＭＨＨであり、前記肝細胞培養培地またはＣＭＨＨが、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／またはＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含む、請求項３２～３６の方法。
【請求項38】
前記第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、もしくはＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／もしくは熱不活化ＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含むＣＭＨＨである、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記第１または第２の細胞培養培地が、最終濃度約２％容積／容積または２８１．６ｍＭのＤＭＳＯを含有する、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記第２の細胞培養培地が、終濃度約１４０．８ｍＭで前記ＤＭＳＯ２を含有する、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記第２の細胞培養培地が、最濃度約７０ｍＭでＴＭＳＯを含有する、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；前記第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中のそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；前記第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中のそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養培地中の０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含み；前記第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
ＨＨによるアルコール代謝の促進における候補薬剤の成績またはＨＨに対する候補薬剤の毒性をアッセイするのに使用するための方法であって、前記第２の細胞培養培地中で、前記第２のフェーズにおいて培養された前記量のＨＨを前記候補薬剤と接触させるステップと、前記候補薬剤との接触前に前記量のＨＨによるアルコールの代謝または前記候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、前記候補薬剤の存在下または接触後に、前記量のＨＨによる前記アルコールの代謝または前記候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む、請求項３２～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、前記細胞培養培地がＤＭＳＯを含まない、ＨＨの肝機能を確立し、維持するためのＨＨ培養培地。
【請求項47】
前記ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯが、標準的な細胞培養基礎培地中でそれぞれ約１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭの濃度に到達するように補充され、前記基礎培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／または熱不活化ＦＢＳのうち１つもしくは複数をさらに含む、請求項４６に記載のＨＨ培養培地。
【請求項48】
標準的な細胞培養基礎培地中の１４０．８ｍＭ ＤＭＳＯ２、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、請求項４６または４７に記載のＨＨ培養培地。
【請求項49】
標準的な細胞培養基礎培地中の７０．４ｍＭ ＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、請求項４６または４７に記載のＨＨ培養培地。
【請求項50】
標準的な細胞培養基礎培地中の５０～２００ｍＭ ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載のＨＨ培養培地。
【請求項51】
第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２および／またはＴＭＳＯを補充されている第２の容器
を含む、ＨＨを培養するためのキット。
【請求項52】
第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない第２の容器
を含む、ヒト肝細胞を培養するためのキット。
【請求項53】
ＨＨに対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法であって、ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
薬剤を、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された前記量のＨＨと接触させるステップと；
前記薬剤の存在下もしくは前記薬剤との接触後に前記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または前記薬剤の存在下もしくは前記薬剤との接触後に前記量のＨＨによる前記薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップと
を含む方法。
【請求項54】
前記薬剤が、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記接触および前記測定するステップが、密封装置中で実行される、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項56】
前記毒性のレベルが、それだけに限らないが、前記量のＨＨ中のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素など、非生体物質代謝酵素の発現または機能を定量化することによって測定される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記毒性のレベルが、前記量のＨＨ中のアセトアルデヒドなど、アルコールの毒性代謝産物、またはグルタチオンの還元、細胞死経路の活性化状態を定量化することによって測定される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイする方法であって、ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された前記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；
候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に前記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップと
を含む方法。
【請求項59】
使用される前記培地が、請求項２０～２４のいずれかのＨＨ由来馴化培地である、請求項３２～５８のいずれかの方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３０日に出願の米国特許出願公開第６３／２５０，５２９号明細書および２０２１年９月３０日に出願の米国特許出願公開第６３／２５０，５４１号明細書の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、それぞれの内容をその全体において参照により本明細書に組み込む。
本出願は、２０２１年９月３０日に出願の米国特許出願公開第６３／２５０，５２９号明細書および２０２１年９月３０日に出願の米国特許出願公開第６３／２５０，５４１号明細書の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、それぞれの内容をその全体において参照により本明細書に組み込む。
【0002】
本発明は、細胞培養培地およびその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した非癌性の最終分化したヒト肝細胞（ＨＨ）は、肝臓生物学および様々な肝臓疾患の研究のための主要なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験プラットフォームである。ＨＨは、新たに開発された臨床化合物の薬物毒性を査定することを含むがこれに限定されない、薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）の前臨床評価のための基本的なツールでもある。研究使用のためのＨＨの世界的な市場サイズは、５千万ドルと見積もられ、着実に成長すると推定されている。
【0004】
しかしながら、現在までのところ、ＨＨの有用性は、研究者の要求を満たすレベルにまだ達していない。細胞品質の急速な低下をもたらす冷温虚血、コラゲナーゼ潅流を伴う単離手順、および凍結融解貯蔵プロセスを含めた細胞獲得プロセスに起因する細胞に対する傷害およびストレスを考えると、この不足は主に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＨの洗練された培養または維持方法が無いためである。結果として、肝臓細胞生物学、様々な肝臓疾患およびＤＭＰＫの研究においてｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの成績／機能は望ましくない。
【0005】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟ＨＨの長期の細胞運命維持を支持する決定的な技術が無いことが、肝臓の分子／細胞生物学の理解を妨げている。加えて、ｉＨｅｐと呼ばれる、幹細胞またはｉＰＳ細胞由来ＨＨの完全な成熟を支持する決定的な技術は存在しない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟ＨＨの長期の細胞運命維持およびｉＨｅｐの完全な成熟を改善することは、肝細胞移植療法の確立を成功させることになろう。
【0006】
現在のところ、肝臓移植（ＬＴ）は、慢性ウイルス肝炎（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、アルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）ならびに肝臓の多数の遺伝的疾患などの様々な型の慢性肝臓疾患に起因する非代償性肝硬変および肝臓がんのような末期肝臓疾患に対する唯一の療法である。しかしながら、ＬＴは侵襲性手順であり、全国的な臓器不足が、その有用性を大いに限定している。加えて、ＬＴレシピエントは、日和見感染症および悪性新生物の発症を含めた著しい病的状態に関連する免疫抑制療法を一生受ける必要がある。
【0007】
肝細胞移植技術は、将来、ＬＴ療法を置き換えることが期待されている；しかしながら、克服すべき技術的ハードルは多く残っている。最も重要な技術的障壁のうちの１つは、ｉＨｅｐの完全な成熟を可能にする決定的な方法がないことである。現在利用可能なｉＨｅｐの成熟の程度は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）のそれと比較してなおはるかに劣っている。実際に、ｉＨｅｐが、未成熟肝細胞と胆管細胞様細胞の両方からなるどちらかといえば不均一な細胞集団であることは、ｉＨｅｐの成熟程度が、肝二分化能前駆細胞の段階であることを示す。肝細胞の成熟程度は、「肝細胞マーカー遺伝子」の発現存在量、および内在性のマウス肝細胞において毒性遺伝子を発現する免疫不全マウス［ヒト化肝臓キメラマウス（ＨＬＣＭ）の作製に使用されるマウス系統］の肝臓における増加能力によって評価されうる。したがって、現在利用可能なｉＨｅｐは、ＨＬＣＭ宿主マウスの肝臓内で増加することができない。したがって、ｉＨｅｐを含む肝臓前駆細胞の最終的な成熟プロセスを可能にする技術の満たされていない必要性は著しいままである。
【発明の概要】
【0008】
本明細書における刊行物の全ては、各個々の刊行物または特許出願が、あたかも参照により組み込まれるために特におよび個別に示されたかのように、同程度に参照により組み込まれる。以下の説明は、本発明を理解する上で有用になりうる情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれかが、先行技術であるもしくは現在請求される発明に関連していること、または具体的もしくは暗黙のうちに参照される刊行物のいずれかが先行技術であることを承認するものではない。
【0009】
典型的な実施形態が、参照図に例示される。本明細書に開示される実施形態および図が、限定的なものではなく例示的なものと見なされることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】肝細胞培養培地の比較を示す図である：新たに単離されたＨＨが、ＨＨ回復培地（ｄＨＣＧＭ：対照）または市販の肝細胞培養培地と７日間培養された。次いで、ＨＨは：（左）ＭＲＰ２（矢印）を検出するための免疫蛍光顕微鏡分析（バーは２５μｍを示す）、（右上）指示した肝細胞マーカー遺伝子を検出するための免疫ブロット分析、または（右下）培養上清中のヒトアルブミンの定量化に供された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．００１を示す。
【図2A-B】培養されたＨＨおよび正常ヒト組織中のＡＤＨ活性、ならびにＡＤＨ活性のＤＭＳＯ阻害の比較を示す図である：（Ａ）ＨＨまたはヒト肝臓の細胞／組織ホモジェネートが、３４０ｎｍでの吸光度検出により、ＡＤＨ活性の代用であるＮＡＤＨ産生速度の測定に供された。肝細胞腫細胞（Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２）が、陰性対照として使用された。（Ｂ）ＨＨの相対的ＡＤＨ活性が、（Ａ）に記述されるのと同じ方法を使用して有機化合物の非存在下（ＮＴ）、およびＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２の存在下で評価された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊、＊＊および＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示す；ｎ．ｓ．（有意でない）；ｎ．ｄ．（検出されなかった）。
【図3】ＤＭＰＫ酵素のＤＭＳＯ阻害を示す図である：新たに単離されたＨＨは、ＤＭＳＯ含有培地（回復培地）と７日間培養された。次いで、細胞は、Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して有機化合物（ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２）の存在下でＣＹＰ３Ａ４（左）およびＣＹＰ２Ａ９（中央）活性の評価に使用された。ＣＹＰ２Ｅ１活性の評価（右）は、Ｖｉｖｉｄ（商標） ＣＹＰ２Ｅ１ Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して評価された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊、＊＊および＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示す；ｎ．ｓ．（有意でない）；ｎ．ｄ．（検出されなかった）。
【図4】酢酸塩の産生に対するエタノール代謝のＤＭＳＯ阻害を示す図である：新たに単離されたＨＨは、ＨＨ回復培地と７日間培養された。次いで、ＨＨは、１０ｍＭエタノールの非存在（０ｍＭ）または存在下でＤＭＳＯもしくはＤＭＳＯ２含有維持／適用培地のいずれかと２４時間培養された。エタノール処理の経過の間中密封装置が、適用された。エタノール処理終了時に、細胞培養培地が採取され、続いてＡｃｅｔａｔｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して酢酸塩濃度が測定された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．００１を示す。ｎ．ｄ．（検出されなかった）。酢酸塩産生速度をヒト肝臓の細胞数によって標準化して、各所与の条件でのＨＨのＥｔＯＨ代謝能力を健康なヒト肝臓と比較評価した（右）。
【図5A-C】ＤＭＳＯの中止が、肝細胞の細胞運命消失を促進することを示す図である：新たに単離されたＨＨは、ＨＨ回復培地と７日間培養され、続いて指示した濃度のＤＭＳＯを含有する培地とさらに４日間インキュベートされた。次いで、ＨＨは、（Ａ）ＭＲＰ２（矢印）を検出するための免疫蛍光分析、（Ｂ）免疫ブロットおよび（Ｃ）指示される肝細胞マーカー分子を検出するためのｑＰＣＲ分析に供された。バーは、２５μｍを示す。
【図6A-C】ＨＨの細胞運命回復におけるＤＭＳＯの役割を示す図である：新たに単離されたＨＨが、指示した濃度のＤＭＳＯを含有する培地と７日間培養された。次いで、ＨＨは、指示した時点で（Ａ）ＭＲＰ２（矢印）を検出するための免疫蛍光分析、（Ｂ）免疫ブロットおよび（Ｃ）指示される肝細胞マーカー分子を検出するためのｑＰＣＲ分析に供された。
【図7】肝細胞マーカー遺伝子の発現の維持における有機化合物の重要性を示す図である：新たに単離されたＨＨは、ＨＨ回復培地と７日間、続いて指示した有機化合物を含有する維持／適用培地とさらに７日間培養された。次いで、全細胞溶解物が、指示した分子を検出するために免疫ブロット分析に供された。ＮＴ；非処理。
【図8】ヒト肝細胞の形態学的維持における有機化合物の重要性を示す図である：新たに単離されたＨＨは、ＨＨ回復培地と７目間培養され、続いて指示した有機化合物を含有する維持／適用培地とさらに７日間インキュベートされた。次いで、ＨＨは、ＭＲＰ２（矢印）、Ｆ－アクチン、ＤＡＰＩを検出するための免疫蛍光分析に供された。バーは、２５μｍを示す。
【図9】ＣＹＰ遺伝子の誘導性に対するＤＭＳＯの影響を示す図である。新たに単離されたＨＨは、ＨＨ回復培地（ｄＨＣＧＭ）と７日間、続いて指示した濃度のＣＹＰ３Ａ４誘導物質（リファンピシンおよびカルバマゼピン）（左）およびＣＹＰ２Ｅ１誘導物質（エタノールおよびイソニアジド）（右）の存在下でＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２を含有する維持／適用培地とさらに７日間培養された。次いで、トータルＲＮＡおよび細胞溶解物が、指示した分子の誘導性を決定するために免疫ブロット分析（左）およびｑＰＣＲ分析（右）に供された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊、＊＊および＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示す。
【図10】アルコール代謝酵素のＴＭＳＯ阻害を示す図である：ＨＨの細胞ホモジェネートが、有機化合物（ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ）の存在下で３４０ｎｍにおける吸光度の検出により、ＡＤＨ活性の代用であるＮＡＤＨ産生速度の測定に供された。ＣＹＰ２Ｅ１活性の評価（右）は、Ｖｉｖｉｄ（商標） ＣＹＰ２Ｅ１ Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して評価された。グラフバーは、平均±ＳＤを表す；＊＊＊は、一元配置分散分析によるｐ＜０．００１を示す。ｎ．ｓ．（有意でない）；ｎ．ｄ．（検出されなかった）。
【図11】ＨＨのエタノール処理に対する密封装置の適用を示す図である：厳重なシリコーン封印装置をＨＨ培養ディッシュに適用して、培養培地からのエタノールの蒸発損失を最小限にした。左の画像は、標準的な細胞培養ディッシュのセットアップの代表例であり、右の画像は、密封装置の適用に関して同じ細胞培養ディッシュを実証するものである（上：蓋なし、および下：蓋あり）。
【図12】ＣＭＨＨ調製の概要を示す図である。懸濁培地（例えば、ＤＭＥＭ１０）中のヒト肝細胞（例えば、ＰＨＨおよびＨＬＣＭ－ＨＨ）が、付着細胞密度＞０．５×１０５個細胞／ｃｍ２に達するように最適化された播種細胞数で、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた細胞培養ディッシュ上に平板培養される。播種２４時間後に、平板培養培地（例えば、ＤＭＥＭ１０）が、肝細胞培養培地（ＤＭＳＯ含有ｄＨＣＧＭ）と置き換えられることになり、肝細胞培養培地は、２～４日毎に最長７日間置き換えられて、回復期培養が完了することになる。次いで、維持／適用期の間、上で示した通り、細胞は、培地交換および細胞培養上清（ＣＭＨＨ）の採集を４８時間毎に繰り返し受ける。回復されたＣＭＨＨは、使用されるまで－２０℃もしくは－８０℃で冷凍または凍結されることになる。
【図13】ＨＨの細胞構造に対するＣＭＨＨの生物学的効果を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）が、Ｉ型コラーゲンでコートされたウェルに１．０５×１０５個細胞／ｃｍ２で平板培養された。平板培養培地（ＤＭＥＭ１０）が、細胞播種の３０～６０分後に新しいｄＨＣＧＭ（ＦＭ）（左）またはＣＭＨＨ（右）と置き換えられ、続いて７日目まで２４時間毎に培地交換された（ＦＭまたはＣＭＨＨのいずれか）。次いで、細胞は、光学顕微鏡分析に供された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈する肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図14】胆汁分泌機構の機能的評価を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）が、図１３に記載の通りＦＭまたはＣＭＨＨと培養された。播種後７日目に、細胞は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ）で洗浄され、ＭＲＰ２特異的蛍光基質である１．２５ｎＭカルボキシＤＣＦＤＡ［５（６）－カルボキシ－２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）］を含有するＨＢＳと３７℃で１０分間インキュベートされ、続いてＨＢＳＳで洗浄され（３回）、ＨＢＳＳと３７℃で１０分間インキュベートされた。次いで、細胞は、ＣＤＦＤＡで満たされた胆細管（矢印）を検出するために蛍光顕微鏡分析に供された。
【図15-1】図１５Ａは、ＨＨの細胞運命に対するＣＭＨＨの生物学的影響を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）は、図１３に記載の通り新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）と培養された。播種後７日目に、トータルＲＮＡが、Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ（ＺｙｍｏＲｅｓｅｒａｃｈ）を使用して抽出され、続いてｃＤＮＡ ｓｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏ）を用いて合成された。ｃＤＮＡは、指示される遺伝子の相対定量のためにリアルタイムｑＰＣＲに次いで供された。バーは、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨに対する相対的発現レベルの平均±ＳＤを表す；＊、＊＊および＊＊＊は、対応のないｔ－検定によるｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【図15-2】図１５Ｂは、ＨＨの細胞運命に対するＤＭＳＯおよびＤＭＳＯ２含有ＣＭＨＨの生物学的影響を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨが、ＤＭＳＯもしくはＤＭＳＯ２のいずれかを含有する新たなｄＨＣＧＭまたはＣＭと７日間培養された。その後、トータルＲＮＡが、Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ（ＺｙｍｏＲｅｓｅｒａｃｈ）を使用して抽出され、続いてｃＤＮＡ ｓｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏ）を用いて合成された。ｃＤＮＡは、指示される遺伝子の相対定量のためにリアルタイムｑＰＣＲに次いで供された。バーは、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨに対する相対的発現レベルの平均±ＳＤを表す；統計的分析は、テューキーの多重比較検定を用いて実行された、＊Ｐ＜０．０００１。
【図16】ＨＢＶ感染症のＨＨ感受性に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）は、図１３に記載の通りｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）と培養された。ＦＭまたはＣＭのいずれかと７日間インキュベートされたＨＬＣＭ－ＨＨは、これまでの研究において確立された方法（ＰＭＩＤ：２５７９１５２７）を用いて５Ｇｅｑ／細胞でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（遺伝子型Ａ）を次いで接種された。ＨＢＶ感染細胞は、２日間毎に培地交換しながらＦＭまたはＣＭとさらに１４日間培養され、続いて抗ＨＢｓＡｇ抗体およびａｌｅｘａ４８８標識抗マウス抗体を使用してＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するために免疫蛍光顕微鏡分析された。矢印は、ＣＭ処理ＨＬＣＭ－ＨＨにおけるＨＢＶの活動性感染を示した。
【図17】ＨＢＶ感染症に対する抗ウイルス療法の効果を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）は、図１３に記載の通りｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）と培養された。ＦＭまたはＣＭのいずれかと７日間インキュベートされたＨＬＣＭ－ＨＨは、これまでの研究において記述される方法（ＰＭＩＤ：２５７９１５２７）を用いて５Ｇｅｑ／細胞でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（遺伝子型Ａ）を次いで接種された。ＨＢＶ感染細胞は、エンテカビル（ＥＴＶ）（２５０ｎＭ）の有り無しで２日間毎に培地交換しながらＦＭまたはＣＭとさらに１４日間培養された。終点において、培養上清は、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するウイルスＤＮＡ抽出、続いてＨＢＶゲノムの定量化のためにＴａｑＭａｎプローブに基づく１ステップＲＴ－ｑＰＣＲ分析に供された。バーは、平均±ＳＤを表す；＊＊＊は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によるｐ＜０．０００１を示す。
【図18】ＨＨの非生体物質代謝経路に対するＣＭＨＨの影響を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）は、図１３に記載の通りｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）と培養された。ＦＭまたはＣＭのいずれかと７日間インキュベートされたＨＬＣＭ－ＨＨは、Ｐ４５０－Ｇｌｏ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して指示されるＣＹＰ酵素の評価に次いで供された。バーは、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨに対する相対的発現レベルの平均±ＳＤを表す；＊＊および＊＊＊は、対応のないｔ－検定によるｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【図19】様々な細胞型から得られるＣＭの生物学的機能を示す図である。ＣＭは、図１３に記述される計画でＨＬＣＭ－ＨＨ、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、２９３細胞、およびマウス初代肝細胞で増やされ、次いでそれはＨＬＣＭ－ＨＨの培養に７日間適用され、続いて光学顕微鏡分析された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈する肝細胞間に生じた胆細管を示し、これは、最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図20】ＨＬＣＭ－ＨＨに対するＣＭの効果を示す図である。指示した細胞型で増やされたＣＭと７日間培養されたＨＬＣＭ－ＨＨが、指示した遺伝子を評価するためにＲＴ－ｑＰＣＲ分析に供された。バーは、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ＣＹＰ２Ｃ９、２Ｄ６ ＡＬＤＨ２およびＯＡＴＰ１Ｂ１）、または新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）と培養されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、Ｃｙｒ６１、ＣＴＧＦおよびＣＫ１９）における発現レベル対する相対的発現レベルを表す。統計的分析は、テューキーの多重比較検定を用いて実行された、対ＣＭＨＨ、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図21】ＨＨの細胞運命マーカーに対する様々な細胞型で増やされたＣＭの効果を示す図である。異なる２つのドナー（ＪＦＣおよびＢＤ１９５）から得られたＨＬＣＭ－ＨＨまたは異なる３つのドナー（ＳＭＣ、ＪＩＹおよびＴＡＫ）由来の市販の冷凍保存された初代ヒト肝細胞を用いて増やされたＣＭＨＨが、図１３に記述される計画で新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨの７日間の培養に使用された。細胞の形態学的構成が、光学顕微鏡によってその後評価された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図22】複数のドナー由来のＨＨで増やされたＣＭの生物学的効果を示す図である。図１３に記載の通り、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨが、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）、ＨＬＣＭ－ＨＨ（異なる２名のドナー）または初代ヒト肝細胞（異なる３名のドナー）で増やされたＣＭＨＨのいずれかと７日間培養され、続いて指示した遺伝子を検出するためにＲＴ－ｑＰＣＲ分析された。相対的発現存在量は、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ中の発現存在量を用いる標準化によって決定された。統計的分析は、テューキーの多重比較検定を用いて実行された、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図23】ＣＭ、５Ｃｎおよびマトリゲル（登録商標）処理の生物学的効果の比較を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）が、図１３に記載の通り平板培養され、ｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）と培養された。別法として、細胞は、これまでの報告（ＰＭＩＤ：３１０２３９２６、１６４６９４０５）に記述されている濃度の５Ｃまたはマトリゲル（登録商標）を補充した新たなｄＨＣＧＭで培養された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図24】ＣＭ、５Ｃｎおよびマトリゲル（登録商標）処理の生物学的効果の比較を示す図である。図２３に記載の通り、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ（ロット：ＪＦＣ）が平板培養され、新たなｄＨＣＧＭ、ＣＭＨＨ、５Ｃまたはマトリゲル（登録商標）を補充された新たなｄＨＣＧＭと培養され、続いて指示した遺伝子の相対定量のためにＲＴ－ｑＰＣＲ分析された。統計的分析は、テューキーの多重比較検定を用いて実行された、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図25】ＣＭＨＨの生物学的効果に対するサイズ排除カラム濾過の影響を示す図である。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨが、ＣＭＨＨまたは漸増するカットオフサイズの排除カラムによって濾過されたＣＭＨＨのいずれかと７日間培養され、続いて指示した遺伝子を検出するためにＲＴ－ｑＰＣＲ分析された。相対的存在量は、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ中の対応する遺伝子の発現存在量を用いて標準化することによって決定された。統計的分析は、テューキーの多重検定を用いて実行された、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図26】ＣＭＨＨの構成分析を示す図である。図１３に記述される計画で、マトリゲル（登録商標）を補充されたｄＨＣＧＭが、Ｉｍａｇｅ ＪソフトウェアおよびＥＬＩＳＡをそれぞれ使用する免疫ブロットシグナルの測定による指定された体液因子の相対または絶対定量に使用された。相対的存在量の評価は、指示された細胞型、またはＣＭＨＨと等しい総タンパク質量を含有するマトリゲル（登録商標）を補充されたｄＨＣＧＭで増やされた等容積のＣＭを使用して実施された。バーは、ＣＭＨＨに対する相対的タンパク質レベルを表す。
【図27】冷凍保存した初代ヒト肝細胞の形態構造に対するＣＭＨＨの生物学的効果を示す図である。市販の初代ヒト肝細胞（ロット：ＧＮＡ、ＢｉｏＩＶＴ）が、図１３に記述される計画で、市販の肝細胞培養培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ ＨＩ Ｍｅｄｉｕｍ、ＢｉｏＩＶＴ）、新たなｄＨＣＧＭまたはＣＭＨＨのいずれかで７日間培養された。細胞の形態学的構成が、光学顕微鏡によってその後評価された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図28】冷凍保存した初代ヒト肝細胞の胆汁分泌機構に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の初代ヒト肝細胞（ロット：ＧＮＡ、ＢｉｏＩＶＴ）が、図１３に記述される計画で、市販の肝細胞培養培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ ＨＩ Ｍｅｄｉｕｍ、ＢｉｏＩＶＴ）、新たなｄＨＣＧＭまたはＣＭＨＨのいずれかで７日間培養された。播種後７日目に、細胞は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ）で洗浄され、ＭＲＰ２特異的蛍光基質である１．２５ｎＭカルボキシＤＣＦＤＡ［５（６）－カルボキシ－２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）］を含有するＨＢＳと３７℃で１０分間インキュベートされ、続いてＨＢＳＳで洗浄され（３回）、ＨＢＳＳと３７℃で１０分間インキュベートされた。次いで、細胞は、ＣＤＦＤＡで満たされた胆細管（矢印）を検出するために蛍光顕微鏡分析に供された。
【図29】冷凍保存した初代ヒト肝細胞の細胞運命回復および細胞運命維持に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の初代ヒト肝細胞（ロット：ＧＮＡ、ＢｉｏＩＶＴ）が、図１３に記述される計画で、市販の肝細胞培養培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ ＨＩ Ｍｅｄｉｕｍ、ＢｉｏＩＶＴ）、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨ（ＣＭ）のいずれかで７日間培養された。播種７日後に、トータルＲＮＡが、指示した遺伝子を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲ分析用に抽出された。相対的発現存在量は、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ中の発現存在量を用いる標準化によって決定された。統計的分析は、テューキーの多重比較検定を用いて実行された、対ＣＭＨＨ、＊、＊＊および＊＊＊は、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【図30】イヌ、マウス、ラットの初代肝細胞の形態構造に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の冷凍保存されたイヌ、ラットおよびマウス初代肝細胞（ＢｉｏＩＶＴ）が、図１３に記述される計画で、市販の肝細胞培養培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ ＨＩ Ｍｅｄｉｕｍ、ＢｉｏＩＶＴ）、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）、またはＣＭＨＨのいずれかで７日間培養された。細胞の形態学的構成が、光学顕微鏡によってその後評価された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化した肝細胞の特徴である。
【図31】ｉＨｅｐの形態構造に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の冷凍保存されたｉＨｅｐ（ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０、ＦｕｊｉＦｉｌｍ）が、解凍され、製造業者によって提供されるｉＨｅｐ培養培地（ｉＣｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて製造業者のプロトコールにしたがって５日間培養され、続いて製造業者によって提供される培地（ｉＣｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨのいずれかで２日毎に培地交換しながら６日間維持された。細胞の形態学的構成が、光学顕微鏡によってその後評価された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化したヒト肝細胞の特徴である。
【図32】ｉＨｅｐに対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の冷凍保存されたｉＨｅｐ（ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０、ＦｕｊｉＦｉｌｍ）が、解凍され、図３１に記載の通り培養され、続いて単一細胞ＲＮＡ配列決定分析された。３次元散布図における距離は、指示された培地で培養されたｉＨｅｐ間の多様性を表す。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨは、最終分化したヒト肝細胞の代表例として分析に含められた。
【図33】ｉＨｅｐ遺伝子発現に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。市販の冷凍保存されたｉＨｅｐ（ｉＣｅｌｌ肝細胞２．０、ＦｕｊｉＦｉｌｍ）が、解凍され、図３１に記載の通り培養され、続いて単一細胞ＲＮＡ配列決定分析された。円グラフは、指示された遺伝子で相対的発現がある細胞の割合を表す。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨは、最終分化したヒト肝細胞の代表例として分析に含められた。
【図34】ＣＬｉＰに対するＣＭＨＨの効果を示す図である。ＨＬＣＭ－ＨＨから得られたＣＬｉＰ細胞が、前述（ＰＭＩＤ：３１３９３２６３）の通り確立された。一巡目の継代後、ＣＬｉＰ細胞は、図１３に記述される計画で新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨで７日間培養された。指示された遺伝子の発現存在量は、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によってその後決定された。相対的発現存在量は、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ中の対応する遺伝子の発現存在量を用いる標準化によって決定された。対応のある検定、＊、＊＊および＊＊＊は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１を示す。
【図35】ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＨ増加に対するＣＭＨＨ前処理の影響を示す図である。ＣＭＨＨ処理ヒト肝細胞の生着および増加。新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨが、新たなｄＨＣＧＭ（対照）またはＣＭＨＨのいずれかで１４日間培養され、続いて３週齢のｃＤＮＡ－ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスの脾臓にｉｎ ｖｉｖｏ移植された（２．５×１０５個細胞／動物）。次いで、血液中のヒトアルブミンレベルの連続測定が、以前に記載されている方法（ＰＭＩＤ：１７７６１８９２）を用いて移植後の指示された日に実行された。
【図36】冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨの形態構造に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨが、解凍され、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨのいずれかで２日毎に培地交換しながら７日間培養された。細胞の形態学的構成が、光学顕微鏡によってその後評価された。矢印は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞間に形成された胆細管を示し、それは最終分化した初代肝細胞の特徴である。
【図37】冷凍保存したＨＬＣＭ－ＨＨの回復および運命維持に対するＣＭＨＨの効果を示す図である。冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨが、解凍され、新たなｄＨＣＧＭ（ＦＭ）またはＣＭＨＨのいずれかで２日毎に培地交換しながら７日間培養された。播種７日後に、トータルＲＮＡが、指示した遺伝子を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲ分析用に抽出された。相対的発現存在量は、新たに単離されたＨＬＣＭ－ＨＨ中の発現存在量を用いる標準化によって決定された。統計分析は、スチューデントのｔ検定、対ＣＭＨＨで実行され、＊、＊＊および＊＊＊は、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書に引用される参照文献の全ては、完全に説明されているかのように、その全体を参照により組み込む。別段の規定がない限り、本明細書に使用される技術および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有するものとする。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006)；March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013)；およびSambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)は、本出願において使用される多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。抗体を調製する方法に関する参照文献については、D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 2013)；Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511；Queen et al.米国特許第５５８５０８９号明細書；およびRiechmann et al., Nature 332: 323 (1988)；米国特許第４９４６７７８号明細書；Bird, Science 242:423-42 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)；Tomlinson I. and Holliger P. (2000) Methods Enzymol, 326, 461-479；Holliger P. (2005) Nat. Biotechnol. Sep;23(9):1126-36を参照のこと。
【0012】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を認識することになり、それは、本発明の実施において使用されうる。実際に、本発明は、記述される方法および材料に決して限定されるものではない。本発明のために、いくつかの用語が、以下に定義される。
【0013】
本出願者の発見は、肝細胞移植療法の確立に向けた再生／幹細胞生物学分野に使用されうる。さらに、本発明は、一般に、肝臓生物学および病態生理学の基礎研究に対して相当な程度の利益も提供する。
【0014】
本出願者は、最終分化したＨＨの培養培地（以後ヒト肝細胞の馴化培地；ＣＭＨＨ）が、再生医療および幹細胞生物学に使用するための優位性、例えば、ｉＨｅｐの細胞最終成熟および完全に成熟したｉＨｅｐの細胞運命維持を容易にするための優位性を協調して提供する多くの体液因子（例えば、肝細胞によって合成されるＥＣＭおよび血漿タンパク質）を含有することを発見した。加えて、ＣＭＨＨは、肝臓細胞生物学研究への支持を提供し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨ、他の種（例えば、イヌ、マウスラットおよびサル）由来初代肝細胞、ヒト化肝臓キメラ動物から得られる肝細胞ならびに肝臓の非実質細胞（ＮＰＣ）の細胞運命維持、機能および寿命を支持する。
【0015】
様々な実施形態において、ＣＭＨＨは、高品質のＨＨで増やされる。本明細書では、用語「高品質」とは、高い多様性および培養可能性をもつ細胞のことを指す。本明細書では、「培養可能性」とは、培養ディッシュに付着する能力がある生細胞のパーセンテージのことを指す。生細胞は、トリパンブルー染色などの技術によって決定されうる。細胞品質は、細胞が低集密度で平板培養される場合に損なわれ；したがって、生存率と培養可能性の決定は、両方とも重要である。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法によって培養される肝細胞は、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、および５０％の培養可能性を有する。加えて、ａ）器官調達中の温／冷虚血傷害、ｂ）細胞単離手順および凍結解凍プロセスによる細胞損傷に起因する細胞障害／ストレスからの高品質なＨＨの回復を促進することは重要である。一部の実施形態において、肝細胞機能をよりよく研究するために肝細胞の生物学的プロセスを最適化することは重要である。
【0016】
本出願の一部の態様において、本発明者らは、ＨＨ培養培地ならびに１）細胞単離手順および凍結融解サイクルに関連する細胞障害またはストレスからの迅速で強力な回復、すなわち、フェーズ１（回復期）、および２）ヒト肝臓と同程度のレベルの機能を呈し、そのため様々な実験適用、すなわち、フェーズ２（適用期）に適しているｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＨＨを可能にする方法について記載する。
【0017】
一部の実施形態において、第１のＨＨ培養培地は、フェーズ１回復のために提供される。一部の実施形態において、表１および表３に示すように、この第１の培地は、ＤＭＳＯを補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ）である。一部の実施形態において、ｄＨＣＧＭは、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0018】
標準的な細胞培養基礎培地は、当業技術者に周知である。標準的な細胞培養基礎培地の例には、それだけには限らないがＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ－１０、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）またはウィリアムＥ培地がある。
【0019】
一部の実施形態において、表２および表３に示すように、第１のＨＨ培養培地は、ＤＭＳＯを補充した肝細胞維持培地（ｄＨＭＭ）である。一部の実施形態において、ｄＨＭＭは、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0020】
ＨＨ培養の第１期に使用される培地は、細胞単離および保存プロセスに関連するストレスからのＨＨの回復を支持する。一部の実施形態において、ＨＨは、少なくとも０．５×１０５個細胞／ｃｍ２、好ましくは＞１．２×１０５個細胞／ｃｍ２で平板培養され、それは細胞播種直後に集密度＞２５％に相当し、第１のＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭ中で維持され、様々な単離手順および凍結融解貯蔵プロセスに起因する傷害／ストレスから回復することになり；この回復フェーズは、４～７日間かかりうる。
【0021】
一部の実施形態において、第１のＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭは、ＨＨの細胞運命維持のために使用される。一部の実施形態において、第１のＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭは、ＤＭＳＯのオフターゲット効果によって混乱しない適用ために使用される。
【0022】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、フェーズ２適用のために提供される。一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、ＨＨの肝機能の確立および維持のために提供される。一部の実施形態において、適用培地は、ＤＭＳＯを含有せず、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｅ１の生理的レベルの発現を可能にする。一部の実施形態において、ＤＭＳＯを補充するのではなく、第２の培地は、ＤＭＳＯ２を補充した細胞培養培地またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含む。
【0023】
本方法の一部の態様において、第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨは、ＣＹＰ３Ａ４の生理的レベルの発現およびＣＹＰ２Ｅ１の生理的レベルの発現を有し；または第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨは、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する。
【0024】
本方法の一部の態様において、ＨＨによるアルコール代謝の促進、ＨＨによる非生体物質代謝の促進における候補薬剤の成績、またはＨＨに対する候補薬剤の毒性のアッセイに使用するために、本方法は、第２の細胞培養培地中で、第２のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨを候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤との接触前に上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、候補薬剤の存在下または接触後に、上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む。
【0025】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、表４および表６に示されるように、ＤＭＳＯを補充した培地ではなくＤＭＳＯ２を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄ２ＨＣＧＭ）である。一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、ＤＭＳＯを補充した培地ではなく、テトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｔＨＣＧＭ）である。
【0026】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地、例えば、ｄ２ＨＣＧＭは、ＤＭＳＯ２、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0027】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地、例えば、ｔＨＣＧＭは、ＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0028】
様々な実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、表５および表６に示されるように、ＤＭＳＯを補充した培地ではなく、ＤＭＳＯ２を補充した肝細胞維持培地（ｄ２ＨＭＭ）である。一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地は、ＤＭＳＯを補充した培地ではなくＴＭＳＯを補充した肝細胞維持培地（ｔＨＭＭ）である。
【0029】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地、例えば、ｄ２ＨＭＭは、ＤＭＳＯ２、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、およびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0030】
一部の実施形態において、第２のＨＨ培養培地、例えば、ｔＨＭＭは、ＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、およびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０である。
【0031】
本方法の一部の態様において、第２のＨＨ培養培地は、終濃度約１４０．８ｍＭでＤＭＳＯ２を含有する。
【0032】
本方法の一部の態様において、ＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭは、標準的な細胞培養基礎培地中にそれぞれ濃度少なくとも約７０ｍＭ、３５ｍＭおよび３５ｍＭのある量のＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充され、標準的な細胞培養基礎培地は、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0033】
本方法の一部の態様において、ＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭは、標準的な細胞培養基礎培地中でそれぞれ約２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭおよび７０．４ｍＭの濃度に到達するようにある量のＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充され、標準的な細胞培養基礎培地は、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0034】
本方法の一部の態様において、ＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭは、標準的な細胞培養基礎培地中で約２（容積／容積）％の濃度に到達するようにある量のＤＭＳＯを補充され、標準的な細胞培養基礎培地は、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0035】
本方法の一部の態様において、ＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭまたはｔＨＭＭは、標準的な細胞培養基礎培地中でそれぞれ約２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭおよび７０．４ｍＭの濃度に到達するようにある量のＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充され、標準的な細胞培養基礎培地は、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0036】
本方法の一部の態様において、ＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＭＭは、標準的な細胞培養基礎培地中で約２（容積／容積）％の濃度に到達するようにある量のＤＭＳＯを補充され、標準的な細胞培養基礎培地は、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清のうちの１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0037】
単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法が提供され、本方法は、第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップとを含み、第１の細胞培養培地は、ＤＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ２を補充した細胞培養培地またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯを含まない。
【0038】
本方法の別の態様において、第１の細胞培養培地と第２の細胞培養培地は、両方とも、ＤＭＳＯを含有し、例えば、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭである。
【0039】
本方法の一部の態様において、第１の細胞培養培地は、２％（容積／容積）でＤＭＳＯおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清のうち１つもしくは複数を含み；第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯをそれぞれ１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清のうち１つもしくは複数を含み；好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0040】
本方法の一部の態様において、第１の細胞培養培地は、２％（容積／容積）でＤＭＳＯおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含み；第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯをそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含む。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0041】
本方法の一部の態様において、第１の細胞培養培地は、２％（容積／容積）でＤＭＳＯおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含む。第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯをそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含み；好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0042】
本方法の一部の態様において、第１の細胞培養培地は、２％（容積／容積）でＤＭＳＯおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含み；第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯをそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭおよび標準的な細胞培養基礎培地を含み、培地は、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含む。好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0043】
本方法の一部の態様において、第１の細胞培養培地は、０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含み；第２の細胞培養培地は、３５～２８１．６ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳまたはヒト血清を含み；好ましい態様において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0044】
本方法の一部の態様において、ＨＨは第１の培地中で一定期間培養され、例えば、回復フェーズは、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、第１のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨは、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する。
【0045】
本方法の一部の態様において、第１の期間、例えば、回復フェーズは、約７日間であり、第１の細胞培養培地は、３または４日間毎に任意選択で新たにされる。
【0046】
一部の実施形態において、キットが提供され、キットは、第１のＨＨ培養培地、例えば、ｄＨＣＧＭもしくはｄＨＭＭ、および第２のＨＨ培養培地、例えば、ｄ２ＨＣＧＭ、ｔＨＣＧＭ、ｄ２ＨＭＭもしくはｔＨＭＭを含有し、その培地は、単離または保存から解凍で得られたＨＨの培養、その後の実験アッセイに順次使用されうる。
【0047】
ヒト肝細胞を培養するためのキットも提供され、キットは、第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている、例えば、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭである第１の容器；ならびに第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない、例えばｄ２ＨＣＧＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＣＧＭまたはｔＨＭＭである第２の容器を含む。
【0048】
ヒト肝細胞（ＨＨ）に対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法がさらに提供され、その方法は、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；薬剤をＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した培地中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップとを含む。
【0049】
アッセイ方法の一部の態様において、薬剤は、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である。
【0050】
アッセイ方法の一部の態様において、接触および測定するステップは、密封装置中で実行される。
【0051】
アッセイ方法の一部の態様において、毒性のレベルは、それだけに限らないが、上記量のＨＨ中のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素など、非生体物質代謝酵素の発現または機能を定量化することによって測定される。
【0052】
アッセイ方法の一部の態様において、毒性のレベルは、上記量のＨＨ中のアセトアルデヒドなど、アルコールの毒性代謝産物、またはグルタチオンの還元、細胞死経路の活性化状態を定量化することによって測定される。
【0053】
方法は、アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイするステップをさらに提供し、本方法は、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した培地中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップとを含む。
【0054】
回復フェーズ（フェーズ１）からの培地、例えば、ｄＨＣＧＭもしくはｄＨＭＭ中でＨＨを最初に培養し、および／または適用フェーズ（フェーズ２）からの培地、例えば、ｄ２ＨＣＧＭ、ｔＨＣＧＭ、ｄ２ＨＭＭもしくはｔＨＭＭ中でＨＨを培養することは、高品質のＨＨを支持する。
【0055】
したがって、本発明の態様は：培養培地を生成するために培地中でＨＨを培養するステップと、高品質のＨＨと少なくとも１時間インキュベートした培養培地を、馴化培地として採取するステップとを含む、ＣＭＨＨを調製する方法を提供する。
【0056】
特定の実施形態において、ＨＨは、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物、例えば、ラット、マウス、ヒツジ、ブタもしくはサルから得られる肝細胞、またはその組合せを含む。一部の実施形態において、ＨＨは、ＰＨＨである。一部の実施形態において、ＨＨは、ＨＬＣＭ－ＨＨである。一部の実施形態において、ＨＨは、ヒト化肝臓を持つマウス以外のキメラ動物から得られる。
【0057】
特定の実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨは、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる。一部の実施形態において、ＨＨは、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から事前に単離されたＨＨを脾臓内に注射した別の動物（例えば、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、サル、等）から得られる肝臓から得られる。
【0058】
一部の実施形態において、マウスは、ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に少なくとも１０％のヒト肝細胞置き換え指数［組織学検査またはＨＨ由来因子（例えば、ヒトアルブミンおよびヒトアルファ１アンチトリプシン）の血中濃度によって示される］を有し；またはヒト化肝臓を持つキメラ動物は、ＨＨが単離または得られる前に少なくとも１０％のヒト肝細胞置き換え指数を有する。
【0059】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物から得られる肝細胞、または任意の２つの組合せもしくは３つ全てが、０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２の細胞密度で培養される。
【0060】
さらなる実施形態において、ＨＨは、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞およびマウス肝細胞のいずれも含まない。別の実施形態において、ＨＨはＨＬＣＭ－ＨＨを含み、ＨＨに加えて若干のマウス肝細胞およびマウス非実質細胞を含みうる。
【0061】
さらなる実施形態において、ＨＨは、ＨＬＣＭ－ＨＨを含み、本方法は、培養ステップ前にＨＬＣＭ－ＨＨを得るステップをさらに含み、ＨＬＣＭ－ＨＨを得るステップは、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨをマウスの脾臓内に注射したマウスの肝臓から得られる肝細胞を単離するステップと、それによってＨＬＣＭ－ＨＨを得るステップとを含む。
【0062】
さらなる実施形態において、マウスの肝臓から得られるＨＨは、マウスの肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、マウスは、ＨＨが単離される前に少なくとも１０％のヒト肝細胞置き換え指数を有する。
【0063】
本発明のさらなる態様は、ＨＨによって分泌される１つもしくは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含むＣＭＨＨを提供する。
【0064】
さらなる実施形態において、ＣＭＨＨを調製するために使用される培地は、ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭである。一部の実施形態において、ｄＨＣＧＭは、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、ｄ２ＨＣＧＭは、ＤＭＳＯ２、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、ｔＨＣＧＭは、ＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＡｓｃ－２Ｐを含むまたはそれらから本質的になる。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。
【0065】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨを調製するために使用される培地は、ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭまたはｔＨＭＭである。一部の実施形態において、ｄＨＭＭは、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態において、ｄ２ＨＭＭは、ＤＭＳＯ２、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態において、ｔＨＭＭは、ＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＡｓｃ－２Ｐを含む、またはそれらから本質的になる。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。
【0066】
さらなる実施形態において、ＣＭＨＨを調製するために使用される培地は、以下の成分からなりＬ－プロリンは、５～２５μｇ／ｍＬであり、インスリンは、０．１～０．５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンは、１０～１００ｎＭであり、ＥＧＦは、０～１０ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐは、０．０１～１ｍＭであり、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯは、３５～３００ｍＭであり、ＨＥＰＥＳは、１０～５０ｍＭであり、ペニシリンは、１０～３００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンは、１０～３００μｇ／ｍＬであり、血清は、２～２０％の熱不活化ＦＢＳもしくはヒト血清である。好ましくは、Ｌ－プロリンは、１５μｇ／ｍＬであり、インスリンは、０．２５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンは、５０ｎＭであり、ＥＧＦは、ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭもしくはｔＨＣＧＭ中に５ｎｇ／ｍＬまたはｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭもしくはｔＨＭＭ中に０ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐは、０．１ｍＭであり、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯは、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭであり、ＨＥＰＥＳは、２０ｍＭであり、ペニシリンは、１００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンは、１００μｇ／ｍＬであり、血清、例えば、ＦＢＳもしくはヒト血清は、１０％である。
【0067】
さらなる実施形態において、ＣＭＨＨを調製するために使用される培地は、新たな容積と１～１２０時間毎に置き換えられる。
【0068】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって調製されるＣＭＨＨを提供する。
【0069】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭを含み、ｄＨＣＧＭまたはｄＨＭＭを使用して、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養した。
【0070】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｄＨＣＧＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＤＭＳＯを補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0071】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｄＨＭＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＤＭＳＯを補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0072】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、ｄ２ＨＣＧＭまたはｄ２ＨＭＭを含み、ｄ２ＨＣＧＭまたはｄ２ＨＭＭを使用して、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養した。
【0073】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｄ２ＨＣＧＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＤＭＳＯ２を補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0074】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｄ２ＨＭＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＤＭＳＯ２を補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0075】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、ｔＨＣＧＭまたはｔＨＭＭを含み、ｔＨＣＧＭまたはｔＨＭＭを使用して、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養した。
【0076】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｔＨＣＧＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＴＭＳＯを補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0077】
さらなる実施形態において、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ＰＨＨまたはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用されるｔＨＭＭは、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＴＭＳＯを補充された標準的な細胞培養基礎培地を含む。特に望ましくは、標準的な細胞培養基礎培地は、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充される。一部の実施形態において、血清は、ＦＢＳまたはヒト血清である。好ましい実施形態において、標準的な細胞培養基礎培地は、ＤＭＥＭ－１０である。
【0078】
本発明のさらなる態様は、ＣＭＨＨおよび細胞外マトリックスを含む組合せを提供する。一部の態様において、細胞外マトリックスは、マトリゲル（登録商標）、エンジェルブレスホームスワーン（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物またはフィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチンおよびラミニンなどがあるがこれに限定されない個々の細胞外マトリックスを含む。
【0079】
本発明のさらなる態様は、本発明のＣＭＨＨとフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質とを含む組合せを提供する。
【0080】
様々な実施形態において、ＣＭＨＨは、肝臓細胞生物学研究のために使用される。肝臓細胞生物学の研究における現在の主要な制約は、最終分化したＨＨの安定なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系が存在しないことである。例えば、冷凍保存されたＰＨＨは、ほとんどの医薬産業が、前臨床研究段階で薬物安全性スクリーニングならびに薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）研究に利用する主力ツールである。
【0081】
本発明の態様は、最終分化したＰＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞、ならびに／または、冷凍保存された、ＰＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞を培養するために使用するＣＭＨＨを提供する。
【0082】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨの生物学的効果は、肝星細胞（ＨＳＣ）、肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、および肝マクロファージ（クップファー細胞）などの肝臓の非実質細胞（ＮＰＣ）の機能を支持する。
【0083】
本発明のさらなる態様は、最終分化したＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞を培養するために使用するＣＭＨＨを提供する。一部の実施形態において、提供されるＣＭＨＨは、最終分化したｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えばイヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の脱分化を防止する。
【0084】
本発明のさらなる態様は、ＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の分化形質転換を妨げるために使用するＣＭＨＨを提供する。
【0085】
本発明のさらなる態様は、冷凍保存されたＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の回復を促進するために使用するＣＭＨＨを提供する。
【0086】
本発明のさらなる態様は、細胞入手プロセスに関連するストレス／傷害からの、新たに単離されたＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の回復を促進するために使用するＣＭＨＨを提供する。
【0087】
本発明のさらなる態様は、低温保存に関連する細胞性ストレスからＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞を保護するために使用するＣＭＨＨを提供し、解凍に対する細胞の回復をさらに支持しうる。
【0088】
本発明のさらなる態様は、ＮＰＣ機能および形態構造の維持ならびに機能を支持するのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、ＮＰＣと共培養するのに使用するため、および／または低温保存においてヒト肝細胞を懸濁するのに使用するために提供される。
【0089】
本発明のさらなる態様は、スフェロイド、オルガノイドまたは３次元培養の形式で、ならびに器官－チップ形式を開発するために、ＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、およびＰＨＨ、および／もしくは別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の機能および寿命を支持／増強させるのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0090】
本発明のさらなる態様は、ＨＬＣＭを作製するために、ＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓から別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の有用性を増強させるのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0091】
本発明のさらなる態様は、ＨＨ、ＨＬＣＭ－ＨＨ、ヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、サル）から得られる肝細胞、ならびにＰＨＨ、および／または別の種（例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル）由来初代肝細胞の細胞運命維持を支持するのに使用するためのＣＭＨＨを提供し；それにより、ＣＭＨＨは、ＤＭＰＫ、薬物スクリーニング、感染疾患および代謝疾患など、様々な型の肝臓細胞生物学研究用としてこれら細胞の有用性を大いに増強させる。
【0092】
様々な実施形態において、ＣＭＨＨは、ＰＨＨおよびＨＬＣＭ－ＨＨならびにヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物から得られるＨＨの細胞運命維持に使用され；それにより、ＣＭＨＨは、ＤＭＰＫ、薬物スクリーニング、感染疾患および代謝疾患など、様々な型の肝臓細胞生物学研究用としてこれら細胞の有用性を大いに増強させる。
【0093】
方法は、ＨＨに対する薬剤の毒性または薬剤のＤＭＰＫをアッセイするためにさらに提供され、本方法は、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていないＣＭＨＨ中である量のＨＨを培養するステップと；薬剤をＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充したＣＭＨＨ中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップとを含む。
【0094】
アッセイ方法の一部の態様において、薬剤は、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である。
【0095】
アッセイ方法の一部の態様において、接触および測定するステップは、密封装置中で実行される。
【0096】
アッセイ方法の一部の態様において、毒性のレベルは、それだけに限らないが、上記量のＨＨ中のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素など、非生体物質代謝酵素の発現または機能を定量化することによって測定される。
【0097】
アッセイ方法の一部の態様において、毒性のレベルは、上記量のＨＨ中のアセトアルデヒドなど、アルコールの毒性代謝産物、またはグルタチオンの還元、細胞死経路の活性化状態を定量化することによって測定される。
【0098】
方法は、アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイするステップをさらに提供し、本方法は、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていないＣＭＨＨ中である量のＨＨを培養するステップと；候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充したＣＭＨＨ中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップとを含む。
【0099】
様々な実施形態において、ＣＭＨＨは、再生医療および幹細胞生物学に使用される。ＣＭＨＨは、最終分化したヒト肝細胞への、ｉＨｅｐ成熟の最終段階を可能にする必須因子でありうる。一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、肝細胞移植療法の調製に使用され、例えば、ｉＰＳ細胞から得られる成熟ヒト肝細胞（ＬＴの代用品になりうる）の大量生産に使用される。
【0100】
本発明のさらなる態様は、最終分化した肝細胞へのｉＨｅｐ（幹細胞由来肝二分化能前駆細胞）のさらなる成熟を容易にするのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0101】
本発明のさらなる態様は、胆管細胞または他の細胞型へのｉＨｅｐ（幹細胞由来肝二分化能前駆細胞）の分化を防止するのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0102】
本発明のさらなる態様は、成熟肝細胞への化学的に誘導される肝臓プロジェニタ（ＣＬｉｐ）の再分化を促進するのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0103】
本発明のさらなる態様は、肝細胞腫細胞（例えば、ＨｅｐａＲＧ細胞、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞）の肝機能を増強させるのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0104】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、ＨｅｐａＲＧの肝機能を増強させるために使用される。
【0105】
本発明のさらなる態様は、ＨＬＣＭ宿主マウスの肝臓におけるＣＭＨＨ処理ｉＨｅｐおよびＣＬｉＰの拡大／繁殖を可能にするのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＨＬＣＭ宿主マウスの肝臓におけるＣＭＨＨ処理ＰＨＨ、ならびに／または別の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来初代肝細胞の拡大／繁殖を可能にするのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0106】
本発明のさらなる態様は、肝細胞移植療法の結果である慢性肝臓疾患／肝臓線維症の退行を促進するのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0107】
本発明のさらなる態様は、肝臓がんに対するアジュバント療法に使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0108】
本発明のさらなる態様は、ｉＨｅｐ、ＣｌｉＰおよびＨｅｐａＲＧの分化および細胞運命維持を支持するために使用するＣＭＨＨを提供し、ＣＭＨＨは、成熟した肝細胞の特徴を損なわずにこれら細胞の安定な長期培養を可能にし、したがって、ＣＭＨＨは、ＤＭＰＫ、薬物スクリーニング、感染疾患および代謝疾患など、様々な型の肝臓細胞生物学研究用としてこれら細胞の有用性を大いに増強させる。
【0109】
本発明のさらなる態様は、化学的に誘導される肝臓プロジェニタ（ＣＬｉｐ）細胞を分化させるのに使用するためのＣＭＨＨを提供する。
【0110】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、成熟肝細胞へのＣＬｉＰの再分化を促進するために使用される。
【0111】
様々な実施形態において、ＣＨＭＭを使用して、ＨＨ、他の種、例えば、イヌ、マウス、ラットおよびサル由来ＰＨＨ、ヒト化肝臓キメラマウス（ＨＬＣＭ）から得られる肝細胞、またはヒト化肝臓を持つ別のキメラ動物（例えば、ラット、ヒツジ、ブタまたはサルから得られる肝細胞）から得られる肝細胞を含むことができる肝細胞を培養ならびに維持する。
【0112】
一部の実施形態において、ＣＭＨＨは、任意の型の肝臓疾患を患う患者への肝細胞移植（ＣＭＨＨによってさらに分化されたｉＨｅｐなど）のために使用される。
【0113】
本発明の様々な実施形態は、本発明の説明において上述されている。これら説明は、上記実施形態について直接記載しているが、当業技術者は、本明細書に図示および記載される特定の実施形態に対する修飾ならびに／または変形を考え得ると理解される。この説明の範囲に含まれる任意のそのような修飾または変形は、同様にその説明の範囲に含まれることが意図される。特に示されない限り、明細書および特許請求の範囲内の単語および熟語が、適用可能な技術において通常の知識を有する者にとって通常および習慣の意味を付与されることが、本発明者らの意図である。
【0114】
本出願の出願時に出願者に公知である本発明の様々な実施形態の前述の説明が提示され、例示および説明のためであることを意図するものである。本明細書は、網羅的であることも、本発明を、開示される正確な形態に限定することも意図せず、上記の教示に照らして、多くの修飾および変形が可能である。記述される実施形態は、本発明の原則およびその実用的な適用を説明し、他の当業者が、企図される特定の使用に適するように様々な実施形態において様々な修飾とともに本発明を利用できるようにするのに役立つ。したがって、本発明は、本発明を実施するために開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。
【0115】
本発明の特定の実施形態について示され、記述されてきたが、本明細書の教示に基づいて、変更および修飾が、本発明およびそのより広い態様を逸脱することなく行われてもよく、したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の精神および範囲内にあるそのような変更および修飾の全てをその範囲に包含すべきであることは当業技術者に明らかになろう。一般に、本明細書で使用される用語が、「開かれた」用語を一般に意味するものである（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「を含むが、これに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「を含むが、これに限定されない」と解釈されるべきである、等）ことは、当業者に理解されよう。
【0116】
本明細書では用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、方法、およびそのそれぞれの成分を参照して使用され、それらは、実施形態に有用であるが、有用か否かにかかわらず、不特定の要素の内包を受け入れる。一般に、本明細書で使用される用語が、「開かれた」用語を一般に意味するものである（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「を含むが、これに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「を含むが、これに限定されない」と解釈されるべきである、等）ことは、当業者に理解されよう。含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）などの用語の同義語である無制限の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本発明について記載および請求するために本明細書において使用されるが、あるいは本発明、またはその実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの代わりの用語を使用して記述されてもよい。
【0117】
単数用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または（ｏｒ）」は、文脈上別途明らかな指示がない限り「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等のものが、本開示の実施または試験に使用されうるが、適切な方法および材料については後述する。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」に由来し、非限定的な例を示すために本明細書において使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ」と同義である。
【0118】
本明細書に開示される本発明の選択的な要素または実施形態の群分けは、限定と解釈されるべきでない。各群メンバーは、個別にまたは群の他のメンバーと、もしくは本明細書に見られる他の要素との任意の組合せで参照および請求されうる。群の１つまたは複数のメンバーは、利便性および／もしくは特許性の理由で群に含められ、またはそこから削除されうる。そのような内包または削除のいずれかが生じる場合、本明細書は、修飾された群を含有すると本明細書において見なされ、したがって、添付の特許請求の範囲に使用される全てのマーカッシュ群の説明文を満たす。
【0119】
本明細書において別段の規定がない限り、本出願に関して使用される科学および技術的用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明が、本明細書に記述される特定の方法論、プロトコール、および試薬、等に限定されるものではなく、それ自体変動しうることは理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記述するためだけのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN- 1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；ならびにCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見ることができ、その内容は、その全体が参照により全て本明細書に組み込まれる。
【0120】
当業者は、使用する化学療法薬を容易に特定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning；Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition；Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier；およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照のこと）。
【0121】
本態様のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に記述される開示は、人間をクローニングするプロセス、人間の生殖細胞の遺伝的同一性を修飾するプロセス、ヒト胚の産業もしくは商業的使用、またはヒトもしくは動物にいかなる実質的な医学的利益もなしに苦痛をもたらす可能性がある動物の遺伝的同一性を修飾するプロセス、またそのようなプロセスの結果得られる動物には関係しない。
【0122】
他の用語は、本発明の様々な態様の説明において本明細書で定義される。
【0123】
本出願の全体を通じて引用される；文献参照、発行済み特許、公開特許出願および同時係属の特許出願を含めた特許および他の刊行物の全ては；例えば、本明細書に記述される技術に関連して使用される可能性があるそのような刊行物中に記述される方法論を記述および開示する目的で参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これら刊行物は、本出願の出願日前の開示だけ提供される。この点において、本発明者らが、先行発明または他のあらゆる理由のためにそのような開示に先だつ権利を持たないという承認と解釈されるべきでない。これら書類の日付に関する記載または内容に関する表示の全ては、出願者に利用可能な情報に基づくものであり、これら書類の日付または内容の正当性に関するいかなる承認も構成しない。
【0124】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または開示される正確な形態に本開示を限定することを意図するものではない。一方で本開示の特定の実施形態、および例は、例示目的で本明細書に記載されており、関連技術の当業者が認識することになるように、様々な同等の修飾が本開示の範囲内で可能になる。例えば、方法ステップまたは機能は、所与の順序で存在するが、別の実施形態は、機能を異なる順序で実行してもよく、機能は、実質的に同時に実行されてもよい。本明細書に提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用されうる。本明細書に記述される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様を、上の参照ならびに出願の組成物、機能および概念を利用するために必要に応じて修飾して、本開示のなおさらなる実施形態を得ることができる。さらに、生物学的機能的等価性を考慮することにより、生物または化学的作用の種類もしくは量に影響を及ぼすことなくタンパク質構造になんらかの変更が、行われうる。これらおよび他の変更は、詳細な説明の観点から本開示に行われうる。そのような修飾の全ては、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることを意図する。
【0125】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態における要素と組み合わせるまたは置換することができる。さらに、本開示の特定の実施形態に関連する優位性が、これら実施形態に記述されてきたが、他の実施形態が、そのような優位性を呈してもよく、全ての実施形態が、本開示の範囲に含まれるためにそのような優位性を呈する必要は必ずしもない。
【0126】
本明細書に記述される技術の一部の実施形態は、以下の付番されたパラグラフのいずれかによって定義されうる：
１．培養ヒト肝細胞から馴化培地を調製するための方法であって、
培養培地を生成するために培地中でヒト肝細胞を培養するステップと、
ヒト肝細胞と少なくとも１時間インキュベートした培養培地を、馴化培地として採取するステップと
を含む方法。
２．ヒト肝細胞が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、またはその組合せを含む、パラグラフ１の方法。
３．ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞が、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）であり、ＨＬＣＭ－ＨＨが、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる、パラグラフ２の方法。
４．ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に、マウスが、少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ３の方法。
５．培地が、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ）であり、ｄＨＣＧＭが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
６．ＤＭＥＭが、ＤＭＥＭ－１０であり、ＤＭＥＭ－１０が、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
７．Ｌ－プロリンが、ｄＨＣＧＭ中に１５μｇ／ｍＬであり、インスリンが、ｄＨＣＧＭ中に０．２５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンが、ｄＨＣＧＭ中に５０ｎＭであり、ＥＧＦが、ｄＨＣＧＭ中に５ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐが、ｄＨＣＧＭ中に０．１ｍＭであり、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２が、ｄＨＣＧＭ中に２％であり、ＨＥＰＥＳが、ｄＨＣＧＭ中に２０ｍＭであり、ペニシリンが、ｄＨＣＧＭ中に１００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンが、ｄＨＣＧＭ中に１００μｇ／ｍＬであり、ＦＢＳが、ｄＨＣＧＭ中の１０％熱不活化ＦＢＳである、パラグラフ５の方法。
８．Ｌ－プロリンがｄＨＣＧＭ中に５～２５μｇ／ｍＬであり、インスリンが、ｄＨＣＧＭ中に０．１～０．５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～１００ｎＭであり、ＥＧＦが、ｄＨＣＧＭ中に１～１０ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐが、ｄＨＣＧＭ中に０．０１～１ｍＭであり、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２が、ｄＨＣＧＭ中に０．５％～５％であり、ＨＥＰＥＳが、ｄＨＣＧＭ中に１０～５０ｍＭであり、ペニシリンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～３００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～３００μｇ／ｍＬであり、ＦＢＳが、ｄＨＣＧＭ中の２～２０％熱不活化ＦＢＳである、パラグラフ５の方法。
９．培地が、新たな容積で２４～１２０時間毎に置き換えられる、パラグラフ１～８のいずれか１つの方法。
１０．ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または組合せが、細胞密度０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２で培養される、パラグラフ２の方法。
１１．ヒト肝細胞が、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞またはマウス肝細胞を含まない、パラグラフ１～３のいずれかの方法。
１２．ヒト肝細胞が、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を含み、本方法が、培養ステップの前にヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップであって、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップが、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から得られる事前に単離された肝細胞を動物の脾臓内に注射した動物の肝臓から得られる肝細胞を単離するステップを含み、それによりヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
１３．キメラ動物から得られる肝細胞が、キメラ動物の肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、キメラ動物が、肝細胞が単離される前に少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ１２の方法。
１４．パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載の方法によって調製された培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
１５．肝細胞クローン性増殖培地を含み、肝細胞クローン性増殖培地が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞またはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用された、培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来の馴化培地。
１６．ヒト肝細胞によって分泌される１つまたは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地を含む、培養ヒト肝細胞由来馴化培地（ＣＭＨＨ）。
１７．肝細胞クローン性増殖培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、パラグラフ１５またはパラグラフ１６のＣＭＨＨ由来馴化培地。
１８．パラグラフ１４～１７のいずれか１つのＣＭＨＨ由来馴化培地と細胞外マトリックスを含む組合せ。
１９．パラグラフ１４～１７のいずれか１つのＣＭＨＨ由来馴化培地とフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質を含む組合せ。
２０．最終分化したヒト肝細胞、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞および／または冷凍保存された初代ヒト肝細胞を培養するのに使用するための培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２１．肝二分化能前駆細胞（ｉＨｅｐ）および／もしくは化学的に誘導される肝臓プロジェニタを、それぞれ最終分化した肝細胞または成熟肝細胞へと分化させるのに使用するための培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２２．非実質細胞と共培養するのに使用するための、および／または低温保存においてヒト肝細胞を懸濁するのに使用するための、培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２３．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにヒト肝細胞（ＨＨ）を培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充した細胞培養培地またはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、
第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを含まない、方法。
２４．第１の期間が、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、第１のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨが、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する、パラグラフ２３の方法。
２５．第１の期間が、約７日間であり、第１の細胞培養培地が、３または４日間毎に任意選択で新たにされる、パラグラフ２４の方法。
２６．第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣＹＰ３Ａ４）およびシトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＥメンバー１（ＣＹＰ２Ｅ１）の生理的レベルの発現を有し；または第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する、パラグラフ２３の方法。
２７．第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した肝細胞培養培地であり、肝細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、Ｌ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のうちの１つまたは複数を含む、パラグラフ２３～２５のいずれか１つの方法。
２８．第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ２を補充した肝細胞培養培地であり、肝細胞培養培地が、ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ＦＢＳのうちの１つまたは複数を含む、パラグラフ２３またはパラグラフ２６の方法。
２９．第２の細胞培養培地が、終濃度約１４０ｍＭでＤＭＳＯ２を含有する、パラグラフ２３の方法。
３０．第１の細胞培養培地が、２（容積／容積）％ ＤＭＳＯ、ＤＭＥＭ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含み；
第２の細胞培養培地が、１４０ｍＭ ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ２３の方法。
３１．第１の細胞培養培地が、０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ、ＤＭＥＭ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含み；
第２の細胞培養培地が、１００～１８０ｍＭ ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ２３の方法。
３２．ＨＨによるアルコール代謝の促進における候補薬剤の成績またはＨＨに対する候補薬剤の毒性をアッセイするのに使用するための方法であって、第２の細胞培養培地中で、第２のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨを候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤との接触前に上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、候補薬剤の存在下または接触後に、上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む、パラグラフ２３の方法。
３３．ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充した細胞培養培地またはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない、ヒト肝細胞（ＨＨ）の肝機能を確立し維持するためのヒト肝細胞培養培地。
３４．ＤＭＳＯ２が、ＤＭＥＭ中に濃度約１４０ｍＭまたは約２（容積／容積）％に達するように補充され、ＤＭＥＭが、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ＦＢＳのうち１つまたは複数をさらに含む、パラグラフ３３のヒト肝細胞培養培地。
３５．ＤＭＥＭ中の１４０ｍＭ ＤＭＳＯ２、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ３４のヒト肝細胞培養培地。
３６．ＤＭＥＭ中の１００～１８０ｍＭ ＤＭＳＯ２、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ３４のヒト肝細胞培養培地。
３７．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない第２の容器
を含む、ヒト肝細胞を培養するためのキット。
３８．ヒト肝細胞（ＨＨ）に対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
薬剤を、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；
薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップと
を含む方法。
３９．薬剤が、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である、パラグラフ３８の方法。
４０．接触および測定するステップが、密封装置中で実行される、パラグラフ３９の方法。
４１．毒性のレベルが、上記量のＨＨ中のアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）の発現または機能を定量化することによって測定される、パラグラフ３８の方法。
４２．アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；
候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップと
を含む方法。
１．培養ヒト肝細胞から馴化培地を調製するための方法であって、
培養培地を生成するために培地中でヒト肝細胞を培養するステップと、
ヒト肝細胞と少なくとも１時間インキュベートした培養培地を、馴化培地として採取するステップと
を含む方法。
２．ヒト肝細胞が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、またはその組合せを含む、パラグラフ１の方法。
３．ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞が、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）であり、ＨＬＣＭ－ＨＨが、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる、パラグラフ２の方法。
４．ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に、マウスが、少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ３の方法。
５．培地が、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ）であり、ｄＨＣＧＭが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
６．ＤＭＥＭが、ＤＭＥＭ－１０であり、ＤＭＥＭ－１０が、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
７．Ｌ－プロリンが、ｄＨＣＧＭ中に１５μｇ／ｍＬであり、インスリンが、ｄＨＣＧＭ中に０．２５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンが、ｄＨＣＧＭ中に５０ｎＭであり、ＥＧＦが、ｄＨＣＧＭ中に５ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐが、ｄＨＣＧＭ中に０．１ｍＭであり、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２が、ｄＨＣＧＭ中に２％であり、ＨＥＰＥＳが、ｄＨＣＧＭ中に２０ｍＭであり、ペニシリンが、ｄＨＣＧＭ中に１００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンが、ｄＨＣＧＭ中に１００μｇ／ｍＬであり、ＦＢＳが、ｄＨＣＧＭ中の１０％熱不活化ＦＢＳである、パラグラフ５の方法。
８．Ｌ－プロリンがｄＨＣＧＭ中に５～２５μｇ／ｍＬであり、インスリンが、ｄＨＣＧＭ中に０．１～０．５μｇ／ｍＬであり、デキサメタゾンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～１００ｎＭであり、ＥＧＦが、ｄＨＣＧＭ中に１～１０ｎｇ／ｍＬであり、Ａｓｃ－２Ｐが、ｄＨＣＧＭ中に０．０１～１ｍＭであり、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２が、ｄＨＣＧＭ中に０．５％～５％であり、ＨＥＰＥＳが、ｄＨＣＧＭ中に１０～５０ｍＭであり、ペニシリンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～３００ＩＵ／ｍＬであり、ストレプトマイシンが、ｄＨＣＧＭ中に１０～３００μｇ／ｍＬであり、ＦＢＳが、ｄＨＣＧＭ中の２～２０％熱不活化ＦＢＳである、パラグラフ５の方法。
９．培地が、新たな容積で２４～１２０時間毎に置き換えられる、パラグラフ１～８のいずれか１つの方法。
１０．ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または組合せが、細胞密度０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２で培養される、パラグラフ２の方法。
１１．ヒト肝細胞が、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞またはマウス肝細胞を含まない、パラグラフ１～３のいずれかの方法。
１２．ヒト肝細胞が、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を含み、本方法が、培養ステップの前にヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップであって、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップが、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から得られる事前に単離された肝細胞を動物の脾臓内に注射した動物の肝臓から得られる肝細胞を単離するステップを含み、それによりヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
１３．キメラ動物から得られる肝細胞が、キメラ動物の肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、キメラ動物が、肝細胞が単離される前に少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ１２の方法。
１４．パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載の方法によって調製された培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
１５．肝細胞クローン性増殖培地を含み、肝細胞クローン性増殖培地が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞またはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用された、培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来の馴化培地。
１６．ヒト肝細胞によって分泌される１つまたは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地を含む、培養ヒト肝細胞由来馴化培地（ＣＭＨＨ）。
１７．肝細胞クローン性増殖培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、パラグラフ１５またはパラグラフ１６のＣＭＨＨ由来馴化培地。
１８．パラグラフ１４～１７のいずれか１つのＣＭＨＨ由来馴化培地と細胞外マトリックスを含む組合せ。
１９．パラグラフ１４～１７のいずれか１つのＣＭＨＨ由来馴化培地とフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質を含む組合せ。
２０．最終分化したヒト肝細胞、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞および／または冷凍保存された初代ヒト肝細胞を培養するのに使用するための培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２１．肝二分化能前駆細胞（ｉＨｅｐ）および／もしくは化学的に誘導される肝臓プロジェニタを、それぞれ最終分化した肝細胞または成熟肝細胞へと分化させるのに使用するための培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２２．非実質細胞と共培養するのに使用するための、および／または低温保存においてヒト肝細胞を懸濁するのに使用するための、培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２３．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにヒト肝細胞（ＨＨ）を培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充した細胞培養培地またはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、
第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを含まない、方法。
２４．第１の期間が、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、第１のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨが、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する、パラグラフ２３の方法。
２５．第１の期間が、約７日間であり、第１の細胞培養培地が、３または４日間毎に任意選択で新たにされる、パラグラフ２４の方法。
２６．第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣＹＰ３Ａ４）およびシトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＥメンバー１（ＣＹＰ２Ｅ１）の生理的レベルの発現を有し；または第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する、パラグラフ２３の方法。
２７．第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した肝細胞培養培地であり、肝細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、Ｌ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のうちの１つまたは複数を含む、パラグラフ２３～２５のいずれか１つの方法。
２８．第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ２を補充した肝細胞培養培地であり、肝細胞培養培地が、ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ＦＢＳのうちの１つまたは複数を含む、パラグラフ２３またはパラグラフ２６の方法。
２９．第２の細胞培養培地が、終濃度約１４０ｍＭでＤＭＳＯ２を含有する、パラグラフ２３の方法。
３０．第１の細胞培養培地が、２（容積／容積）％ ＤＭＳＯ、ＤＭＥＭ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含み；
第２の細胞培養培地が、１４０ｍＭ ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ２３の方法。
３１．第１の細胞培養培地が、０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ、ＤＭＥＭ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含み；
第２の細胞培養培地が、１００～１８０ｍＭ ＤＭＳＯ２、ＤＭＥＭ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ２３の方法。
３２．ＨＨによるアルコール代謝の促進における候補薬剤の成績またはＨＨに対する候補薬剤の毒性をアッセイするのに使用するための方法であって、第２の細胞培養培地中で、第２のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨを候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤との接触前に上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、候補薬剤の存在下または接触後に、上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む、パラグラフ２３の方法。
３３．ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）を補充した細胞培養培地またはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない、ヒト肝細胞（ＨＨ）の肝機能を確立し維持するためのヒト肝細胞培養培地。
３４．ＤＭＳＯ２が、ＤＭＥＭ中に濃度約１４０ｍＭまたは約２（容積／容積）％に達するように補充され、ＤＭＥＭが、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび熱不活化ＦＢＳのうち１つまたは複数をさらに含む、パラグラフ３３のヒト肝細胞培養培地。
３５．ＤＭＥＭ中の１４０ｍＭ ＤＭＳＯ２、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ３４のヒト肝細胞培養培地。
３６．ＤＭＥＭ中の１００～１８０ｍＭ ＤＭＳＯ２、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％熱不活化ＦＢＳを含む、パラグラフ３４のヒト肝細胞培養培地。
３７．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない第２の容器
を含む、ヒト肝細胞を培養するためのキット。
３８．ヒト肝細胞（ＨＨ）に対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
薬剤を、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；
薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップと
を含む方法。
３９．薬剤が、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である、パラグラフ３８の方法。
４０．接触および測定するステップが、密封装置中で実行される、パラグラフ３９の方法。
４１．毒性のレベルが、上記量のＨＨ中のアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）の発現または機能を定量化することによって測定される、パラグラフ３８の方法。
４２．アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；
候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップと
を含む方法。
【0127】
本明細書に記述される技術の一部の実施形態は、以下の付番されたパラグラフのいずれかによって定義されうる：
１．培養ヒト肝細胞（ＨＨ）から馴化培地を調製するための方法であって、
培養培地を生成するために培地中でＨＨを培養するステップと、
ＨＨと少なくとも１時間インキュベートした培養培地を、馴化培地として採取するステップと
を含む方法。
２．ＨＨが、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、またはその組合せを含む、パラグラフ１の方法。
３．ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞が、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）であり、ＨＬＣＭ－ＨＨが、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる、パラグラフ２の方法。
４．ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に、マウスが、少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ３の方法。
５．培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）もしくはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭ）であり、ＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
６．培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞維持培地（ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭ）であり、ＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＬ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
７．標準的な細胞培養基礎培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＩＭＤＭまたはウィリアムＥ培地を含む群から選択される、パラグラフ５または６のいずれかの方法。
８．標準的な細胞培養基礎培地が、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充されている、パラグラフ７の方法。
９．標準的な細胞培養基礎培地がＤＭＥＭであり、ＤＭＥＭがＤＭＥＭ－１０であり、ＤＭＥＭ－１０が、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ７の方法。
１０．血清が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である、パラグラフ８または９のいずれかの方法。
１１．ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、またはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
１２．ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭ、ｔＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
１３．ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ６の方法。
１４．ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、ＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ６の方法。
１５．培地が、新たな容積で２４～１２０時間毎に置き換えられる、パラグラフ１～１４のいずれか１つの方法。
１６．ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または組合せが、細胞密度０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２で培養される、パラグラフ２の方法。
１７．ＨＨが、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞またはマウス肝細胞を含まない、パラグラフ１～３のいずれかの方法。
１８．ＨＨが、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を含み、本方法が、培養ステップの前にヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップであって、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップが、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から得られる事前に単離された肝細胞を動物の脾臓内に注射した動物の肝臓から得られる肝細胞を単離するステップを含み、それによりヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
１９．キメラ動物から得られる肝細胞が、キメラ動物の肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、キメラ動物が、ＨＨが単離される前に少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ１８の方法。
２０．パラグラフ１～１９のいずれか１つに記載の方法によって調製された培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２１．ＣＭＨＨが、肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含み、培地が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞またはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用された、ＣＭＨＨ。
２２．ＣＭＨＨが、ヒト肝細胞によって分泌される１つもしくは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含む、パラグラフ２１のＣＭＨＨ。
２３．肝細胞クローン性増殖培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、パラグラフ２０～２２のいずれかのＣＭＨＨ。
２４．肝細胞維持培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、パラグラフ２０～２２のいずれかのＣＭＨＨ。
２５．パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨと細胞外マトリックスを含む組合せ。
２６．パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨとフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質を含む組合せ。
２７．新たに単離された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨ。
２８．冷凍保存された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
２９．肝二分化能前駆細胞（ｉＨｅｐ）および／もしくは化学的に誘導される肝臓プロジェニタを、それぞれ最終分化した肝細胞、ＨｅｐａｒＲＧ（商標）などの肝細胞腫細胞、または成熟肝細胞へと分化させるのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３０．非実質細胞と共培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３１．低温保存においてＨＨを懸濁するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３２．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて２フェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含む、方法。
３３．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、
第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを含まない、方法。
３４．第１の期間が、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、第１のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨが、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または健康な個体の成熟肝細胞もしくは肝臓組織の肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する、パラグラフ３２または３３の方法。
３５．第１の期間が、約７日間であり、第１の（回復）フェーズの細胞培養培地が、３または４日間毎に任意選択で新たにされる、パラグラフ３２または３３の方法。
３６．第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、それだけには限らないが、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣＹＰ３Ａ４）およびシトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＥメンバー１（ＣＹＰ２Ｅ１）などの肝細胞代謝遺伝子の生理的レベルの発現を有し；または第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する、パラグラフ３２または３３の方法。
３７．第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＣＭＨＨであり、肝細胞培養培地またはＣＭＨＨが、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／またはＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含む、パラグラフ３２～３６のいずれか１つの方法。
３８．第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、もしくはＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／もしくは熱不活化ＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含むＣＭＨＨである、パラグラフ３２～３６のいずれかの方法。
３９．第１または第２の細胞培養培地が、最終濃度約２％容積／容積または２８１．６ｍＭのＤＭＳＯを含有する、パラグラフ３２～３８のいずれかの方法。
４０．第２の細胞培養培地が、終濃度約１４０．８ｍＭでＤＭＳＯ２を含有する、パラグラフ３２～３８のいずれかの方法。
４１．第２の細胞培養培地が、最濃度約７０ｍＭでＴＭＳＯを含有する、パラグラフ３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
４２．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４３．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中のそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４４．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養培地中の０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ（５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４５．ＨＨによるアルコール代謝の促進における候補薬剤の成績またはＨＨに対する候補薬剤の毒性をアッセイするのに使用するための方法であって、第２の細胞培養培地中で、第２のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨを候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤との接触前に上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、候補薬剤の存在下または接触後に、上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む、パラグラフ３２～４４のいずれかの方法。
４６．ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、細胞培養培地がＤＭＳＯを含まない、ＨＨの肝機能を確立し、維持するためのＨＨ培養培地。
４７．ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯが、標準的な細胞培養基礎培地中でそれぞれ約１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭの濃度に到達するように補充され、基礎培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／または熱不活化ＦＢＳのうち１つもしくは複数をさらに含む、パラグラフ４６のＨＨ培養培地。
４８．標準的な細胞培養基礎培地中の１４０．８ｍＭ ＤＭＳＯ２、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ４６または４７のＨＨ培養培地。
４９．標準的な細胞培養基礎培地中の７０．４ｍＭ ＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ４６または４７のＨＨ培養培地。
５０．標準的な細胞培養基礎培地中の５０～２００ｍＭ ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、パラグラフ４６～４９のいずれかのＨＨ培養培地。
５１．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２および／またはＴＭＳＯを補充されている第２の容器
を含む、ＨＨを培養するためのキット。
５２．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない第２の容器
を含む、ヒト肝細胞を培養するためのキット。
５３．ＨＨに対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
薬剤を、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；
薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップと
を含む方法。
５４．薬剤が、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である、パラグラフ５３の方法。
５５．接触および測定するステップが、密封装置中で実行される、パラグラフ５３または５４の方法。
５６．毒性のレベルが、それだけに限らないが、上記量のＨＨ中のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素など、非生体物質代謝酵素の発現または機能を定量化することによって測定される、パラグラフ５３～５５のいずれかの方法。
５７．毒性のレベルが、上記量のＨＨ中のアセトアルデヒドなど、アルコールの毒性代謝産物、またはグルタチオンの還元、細胞死経路の活性化状態を定量化することによって測定される、パラグラフ５３～５５のいずれかの方法。
５８．アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；および
候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップと
を含む方法。
５９．使用される培地が、パラグラフ２０～２４のいずれかのＨＨ由来馴化培地である、パラグラフ３２～５８のいずれかの方法。
１．培養ヒト肝細胞（ＨＨ）から馴化培地を調製するための方法であって、
培養培地を生成するために培地中でＨＨを培養するステップと、
ＨＨと少なくとも１時間インキュベートした培養培地を、馴化培地として採取するステップと
を含む方法。
２．ＨＨが、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、またはその組合せを含む、パラグラフ１の方法。
３．ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞が、ヒト化肝臓キメラマウス由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）であり、ＨＬＣＭ－ＨＨが、ＰＨＨまたは事前に単離されたＨＬＣＭ－ＨＨを脾臓内に注射したマウスから得られる肝臓から得られる、パラグラフ２の方法。
４．ＨＬＣＭ－ＨＨが得られる前に、マウスが、少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ３の方法。
５．培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ２）もしくはテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）を補充した肝細胞クローン性増殖培地（ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭ）であり、ＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦおよびＬ－アスコルビン酸２－リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
６．培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞維持培地（ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭ）であり、ＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾンおよびＬ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ａｓｃ－２Ｐ）を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ１の方法。
７．標準的な細胞培養基礎培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＩＭＤＭまたはウィリアムＥ培地を含む群から選択される、パラグラフ５または６のいずれかの方法。
８．標準的な細胞培養基礎培地が、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を補充されている、パラグラフ７の方法。
９．標準的な細胞培養基礎培地がＤＭＥＭであり、ＤＭＥＭがＤＭＥＭ－１０であり、ＤＭＥＭ－１０が、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび血清を含む、またはそれらから本質的になる、パラグラフ７の方法。
１０．血清が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはヒト血清である、パラグラフ８または９のいずれかの方法。
１１．ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭまたはｔＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、またはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
１２．ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭ、ｔＨＣＧＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ５の方法。
１３．ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ６の方法。
１４．ｄＨＭＭ、ｄ２ＨＭＭ、ｔＨＭＭが、標準的な細胞培養基礎培地中の５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、ＴＭＳＯ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２～２０％血清を含むまたはそれらから本質的になる、パラグラフ６の方法。
１５．培地が、新たな容積で２４～１２０時間毎に置き換えられる、パラグラフ１～１４のいずれか１つの方法。
１６．ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または組合せが、細胞密度０．５×１０５個／ｃｍ２～５×１０５個／ｃｍ２で培養される、パラグラフ２の方法。
１７．ＨＨが、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞またはマウス肝細胞を含まない、パラグラフ１～３のいずれかの方法。
１８．ＨＨが、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を含み、本方法が、培養ステップの前にヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップであって、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップが、ＰＨＨまたはヒト化肝臓キメラ動物から得られる事前に単離された肝細胞を動物の脾臓内に注射した動物の肝臓から得られる肝細胞を単離するステップを含み、それによりヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞を得るステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
１９．キメラ動物から得られる肝細胞が、キメラ動物の肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離され、キメラ動物が、ＨＨが単離される前に少なくとも１０％の置き換え指数を有する、パラグラフ１８の方法。
２０．パラグラフ１～１９のいずれか１つに記載の方法によって調製された培養ヒト肝細胞（ＣＭＨＨ）由来馴化培地。
２１．ＣＭＨＨが、肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含み、培地が、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞またはその組合せを少なくとも１時間培養するために使用された、ＣＭＨＨ。
２２．ＣＭＨＨが、ヒト肝細胞によって分泌される１つもしくは複数の体液因子および肝細胞クローン性増殖培地または肝細胞維持培地を含む、パラグラフ２１のＣＭＨＨ。
２３．肝細胞クローン性増殖培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、パラグラフ２０～２２のいずれかのＣＭＨＨ。
２４．肝細胞維持培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、血清およびＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した標準的な細胞培養基礎培地を含む、パラグラフ２０～２２のいずれかのＣＭＨＨ。
２５．パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨと細胞外マトリックスを含む組合せ。
２６．パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨとフォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２およびＬＤＮ１９３１８９の５種類の化学物質を含む組合せ。
２７．新たに単離された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれか１つのＣＭＨＨ。
２８．冷凍保存された最終分化したＨＨ、ＰＨＨ、ヒト化肝臓を持つキメラ動物から得られる肝細胞、または他の種の動物由来の初代肝細胞を培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
２９．肝二分化能前駆細胞（ｉＨｅｐ）および／もしくは化学的に誘導される肝臓プロジェニタを、それぞれ最終分化した肝細胞、ＨｅｐａｒＲＧ（商標）などの肝細胞腫細胞、または成熟肝細胞へと分化させるのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３０．非実質細胞と共培養するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３１．低温保存においてＨＨを懸濁するのに使用するための、パラグラフ２０～２４のいずれかのＣＭＨＨ。
３２．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて２フェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含む、方法。
３３．単離および／または保存後の回復ならびに肝機能の確立のためにＨＨを培養する方法であって、
第１のフェーズにおいて第１の細胞培養培地である量のＨＨを第１の期間培養するステップと、
上記量のＨＨから第１の細胞培養培地を除去し、続いて第２のフェーズにおいて第２の細胞培養培地を用いて上記量のＨＨを第２の期間培養するステップと
を含み、
第１の細胞培養培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充した細胞培養培地を含み、第２の細胞培養培地は、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、
第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを含まない、方法。
３４．第１の期間が、少なくとも４日間および最長２ヵ月であり、第１のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨが、細胞極性、胆細管によって特徴付けられる細胞間構造および／または健康な個体の成熟肝細胞もしくは肝臓組織の肝機能を呈する対照ＨＨと同等の遺伝子発現レベルを確立する、パラグラフ３２または３３の方法。
３５．第１の期間が、約７日間であり、第１の（回復）フェーズの細胞培養培地が、３または４日間毎に任意選択で新たにされる、パラグラフ３２または３３の方法。
３６．第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、それだけには限らないが、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣＹＰ３Ａ４）およびシトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＥメンバー１（ＣＹＰ２Ｅ１）などの肝細胞代謝遺伝子の生理的レベルの発現を有し；または第２のフェーズにおいて培養される上記量のＨＨが、アルコール、非生体物質、ビタミンＡもしくはその組合せを代謝する、パラグラフ３２または３３の方法。
３７．第１の細胞培養培地が、ＤＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＣＭＨＨであり、肝細胞培養培地またはＣＭＨＨが、ＤＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／またはＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含む、パラグラフ３２～３６のいずれか１つの方法。
３８．第２の細胞培養培地が、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯを補充した肝細胞培養培地またはＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２、もしくはＴＭＳＯ、標準的な細胞培養基礎培地、ならびにＬ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／もしくは熱不活化ＦＢＳのうちの１つもしくは複数を含むＣＭＨＨである、パラグラフ３２～３６のいずれかの方法。
３９．第１または第２の細胞培養培地が、最終濃度約２％容積／容積または２８１．６ｍＭのＤＭＳＯを含有する、パラグラフ３２～３８のいずれかの方法。
４０．第２の細胞培養培地が、終濃度約１４０．８ｍＭでＤＭＳＯ２を含有する、パラグラフ３２～３８のいずれかの方法。
４１．第２の細胞培養培地が、最濃度約７０ｍＭでＴＭＳＯを含有する、パラグラフ３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
４２．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の、それぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４３．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の２（容積／容積）％または２８６．１ｍＭ ＤＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中のそれぞれ２８１．６ｍＭ、１４０．８ｍＭもしくは７０．４ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２もしくはＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４４．第１の細胞培養培地が、標準的な細胞培養培地中の０．５％～５％（容積／容積）ＤＭＳＯ（５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含み；
第２の細胞培養培地が、標準的な細胞培養基礎培地中の５０～３００ｍＭ ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、０～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、パラグラフ３２～４１のいずれかの方法。
４５．ＨＨによるアルコール代謝の促進における候補薬剤の成績またはＨＨに対する候補薬剤の毒性をアッセイするのに使用するための方法であって、第２の細胞培養培地中で、第２のフェーズにおいて培養された上記量のＨＨを候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤との接触前に上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第１のレベルを測定するステップと、候補薬剤の存在下または接触後に、上記量のＨＨによるアルコールの代謝または候補薬剤の排出の第２のレベルを測定するステップとを含む、パラグラフ３２～４４のいずれかの方法。
４６．ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯを補充した細胞培養培地を含み、細胞培養培地がＤＭＳＯを含まない、ＨＨの肝機能を確立し、維持するためのＨＨ培養培地。
４７．ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯが、標準的な細胞培養基礎培地中でそれぞれ約１４０．８ｍＭまたは７０．４ｍＭの濃度に到達するように補充され、基礎培地が、Ｌ－プロリン、インスリン、デキサメタゾン、ＥＧＦ、Ａｓｃ－２Ｐ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ヒト血清および／または熱不活化ＦＢＳのうち１つもしくは複数をさらに含む、パラグラフ４６のＨＨ培養培地。
４８．標準的な細胞培養基礎培地中の１４０．８ｍＭ ＤＭＳＯ２、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ４６または４７のＨＨ培養培地。
４９．標準的な細胞培養基礎培地中の７０．４ｍＭ ＴＭＳＯ、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０％血清を含む、パラグラフ４６または４７のＨＨ培養培地。
５０．標準的な細胞培養基礎培地中の５０～２００ｍＭ ＤＭＳＯ２またはＴＭＳＯ、５～２５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．１～０．５μｇ／ｍＬインスリン、１０～１００ｎＭデキサメタゾン、１～１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．０１～１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、１０～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０～３００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１０～３００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２～２０％血清を含む、パラグラフ４６～４９のいずれかのＨＨ培養培地。
５１．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ２および／またはＴＭＳＯを補充されている第２の容器
を含む、ＨＨを培養するためのキット。
５２．第１の細胞培養培地を保存する第１の容器であって、前記第１の細胞培養培地がＤＭＳＯを補充されている第１の容器；ならびに
第２の細胞培養培地を保存する第２の容器であって、前記第２の細胞培養培地がＤＭＳＯ２および／もしくはＴＭＳＯを補充され、ＤＭＳＯを補充されていない第２の容器
を含む、ヒト肝細胞を培養するためのキット。
５３．ＨＨに対する薬剤の毒性または薬剤の薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
薬剤を、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨと接触させるステップと；
薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨに対する毒性のレベルを測定するステップ、または薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによる薬剤の代謝もしくは排出のレベルを測定するステップと
を含む方法。
５４．薬剤が、エタノール、メタノール、エチレングリコール、イソプロパノールまたはその混合物を含むアルコール化合物である、パラグラフ５３の方法。
５５．接触および測定するステップが、密封装置中で実行される、パラグラフ５３または５４の方法。
５６．毒性のレベルが、それだけに限らないが、上記量のＨＨ中のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素など、非生体物質代謝酵素の発現または機能を定量化することによって測定される、パラグラフ５３～５５のいずれかの方法。
５７．毒性のレベルが、上記量のＨＨ中のアセトアルデヒドなど、アルコールの毒性代謝産物、またはグルタチオンの還元、細胞死経路の活性化状態を定量化することによって測定される、パラグラフ５３～５５のいずれかの方法。
５８．アルコールまたはビタミンＡの代謝を促進するための候補薬剤をアッセイする方法であって、
ＤＭＳＯ２を補充され、ＤＭＳＯを補充されていない培地中である量のＨＨを培養するステップと；
候補薬剤の存在下で、ＤＭＳＯ２を補充した培地中で培養された上記量のＨＨをアルコールまたはビタミンＡと接触させるステップと；および
候補薬剤の存在下もしくは薬剤との接触後に上記量のＨＨによるアルコールまたはビタミンＡの代謝のレベルを測定するステップと
を含む方法。
５９．使用される培地が、パラグラフ２０～２４のいずれかのＨＨ由来馴化培地である、パラグラフ３２～５８のいずれかの方法。
【実施例】
【0128】
以下の例は、請求される本発明をよりよく例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。特定の材料について言及される範囲において、これは単に例示目的であり、本発明を限定することを意図しない。当業者であれば、発明の能力を行使することなく、本発明の範囲から逸脱することなく同等の手段または反応物を開発しうる。
【0129】
[実施例１]
ＨＨの２ステップ培養方法の組成物およびレジメン。
維持肝細胞の細胞運命および肝機能は、２ステップ培養方法を必要とし、フェーズ１が、細胞単離手順および凍結－解凍プロセスの間に起こる細胞障害からの回復を促進する期間であることを発見した。このフェーズは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を少なくとも４日間、好ましくは７日間必要とする。フェーズ１の間に、「ＨＨ回復培地」（表１および表３）を使用する方法を用いて、ＨＨは、細胞極性および胆細管などがあるがこれに限定されない細胞間構造を復旧した。形態学的回復に加えて、フェーズ１により、ＨＨが遺伝子転写およびタンパク質発現レベルで肝細胞の特徴を取り戻すことも可能になった。フェーズ１培養培地の堅牢性を、ＨＨの公的に利用可能な他の培養培地と厳しく比較し、本方法が、これら条件［ＨＣＭ（商標）肝細胞培養培地ｂｕｌｌｅｔｋｉｔもしくはＨＭＭ（商標）肝細胞基本培地、両方ともＬＯＮＺＡ製、またはＴＡＫＡＲＡ製ＣＥＬＬＡＲＴＩＳ（登録商標）ＰＯＷＥＲ（商標）初代肝細胞培地などの市販の肝細胞培養培地］より実質的に優れていることを見出した（図１）。フェーズ１の培養条件が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの細胞運命維持を２ヵ月まで可能にすることも見出した。しかしながら、フェーズＩ培養条件が、アルコール代謝および薬物代謝などがあるがこれに限定されない肝細胞の代謝機能を実質的に妨げることを発見した（図２および図３）。この注釈は、回復および細胞運命維持を可能にする培養条件が、実験的ツールとしてのＨＨの汎用性を損なうことを示す。
ＨＨの２ステップ培養方法の組成物およびレジメン。
維持肝細胞の細胞運命および肝機能は、２ステップ培養方法を必要とし、フェーズ１が、細胞単離手順および凍結－解凍プロセスの間に起こる細胞障害からの回復を促進する期間であることを発見した。このフェーズは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を少なくとも４日間、好ましくは７日間必要とする。フェーズ１の間に、「ＨＨ回復培地」（表１および表３）を使用する方法を用いて、ＨＨは、細胞極性および胆細管などがあるがこれに限定されない細胞間構造を復旧した。形態学的回復に加えて、フェーズ１により、ＨＨが遺伝子転写およびタンパク質発現レベルで肝細胞の特徴を取り戻すことも可能になった。フェーズ１培養培地の堅牢性を、ＨＨの公的に利用可能な他の培養培地と厳しく比較し、本方法が、これら条件［ＨＣＭ（商標）肝細胞培養培地ｂｕｌｌｅｔｋｉｔもしくはＨＭＭ（商標）肝細胞基本培地、両方ともＬＯＮＺＡ製、またはＴＡＫＡＲＡ製ＣＥＬＬＡＲＴＩＳ（登録商標）ＰＯＷＥＲ（商標）初代肝細胞培地などの市販の肝細胞培養培地］より実質的に優れていることを見出した（図１）。フェーズ１の培養条件が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの細胞運命維持を２ヵ月まで可能にすることも見出した。しかしながら、フェーズＩ培養条件が、アルコール代謝および薬物代謝などがあるがこれに限定されない肝細胞の代謝機能を実質的に妨げることを発見した（図２および図３）。この注釈は、回復および細胞運命維持を可能にする培養条件が、実験的ツールとしてのＨＨの汎用性を損なうことを示す。
【0130】
【表1】
【0131】
【表2】
【0132】
【表3】
【0133】
フェーズ１培養条件がＨＨの基本的な代謝機能を妨げる機序を探索して、培養培地に含有されるＤＭＳＯが原因であることを同定した（図２、図３および図４）。重要なことに、培養培地のＤＭＳＯの中止は、肝細胞機能および形態構造の急速な悪化をもたらすので、実現不可能であることを発見した（図５）。フェーズ１中にＤＭＳＯなしでＨＨを培養することが、細胞単離／保存手順に起因する細胞傷害およびストレスからの回復を促進しないであろうことも明らかにした（図６）。
【0134】
ＤＭＳＯの代用品（すなわち、ＤＭＳＯを置き換える）を捜索し、その代用品は、肝細胞の代謝機能に抑制的でない一方で、最終分化したＨＨの細胞運命を維持する能力があることになる。試験した多数の有機化合物の中から（表３；図７および図８）、ＤＭＳＯの望ましい代用品として、ＤＭＳＯの酸化型であるＤＭＳＯ２を同定した。ＤＭＳＯ２を含有するが、ＤＭＳＯを含有しない培地によるフェーズ２培養（７日間、およびその後）は、ＨＨが、ヒト肝臓と同程度のレベルでアルコールを代謝することを可能にし（図２および図４）、フェーズ２培養培地（ＤＭＳＯ２含有）が、アルコール性肝臓疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のためのプラットフォームとして機能する可能性を示した。
【0135】
したがって、ＨＨが、フェーズ２（例えば、ＤＭＰＫおよび様々な肝臓疾患の研究）で肝細胞の基本的な機能を呈することができる培養条件を確立し、その条件はフェーズ１の間（０日～７日間）に完全に回復したＨＨの細胞運命を損なわない。表４および表６を参照のこと。
【0136】
【表4】
【0137】
【表5】
【0138】
【表6】
【0139】
加えて、フェーズ１培養培地（ＤＭＳＯ含有）で培養されたＨＨは、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｅ１の発現を超生理学的レベルまで促進し、ＤＭＳＯを含有する培地と培養されたＨＨが、これら酵素の代謝機能を強く妨げることを見出した（図６および９）。これら酵素は、薬物代謝、さらに薬物毒性の研究における中心的なプレーヤであるので、ＤＭＳＯ含有培地は、ＤＭＰＫの研究ツールとしてのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの汎用性を無効にする。対照的に、ＤＭＳＯ２含有培地で培養されたＨＨは、非生体物質の代謝においてＤＭＳＯで培養されたＨＨより大いに優れた能力を示した（図３）。したがって、ＤＭＳＯ２含有培地により、研究者は、ＤＭＰＫの研究にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨを適用することができる。これら結果は、ＤＭＳＯ２を含む細胞培養培地が、商業化にとって大きな潜在性を有することを全体的に示した。
【0140】
全体として、ＨＨの回復（フェーズ１）に適した培養条件は、最終分化したＨＨの特徴を取り戻し、維持するのに役立つが、ＨＨの多くの酵素活性に対するＤＭＳＯの強力な抑制効果のため、研究ツールとしてのＨＨの汎用性を限定する。影響を受ける代謝経路には、それだけには限らないが、アルコール代謝経路および非生体物質代謝経路があり、それによりアルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）およびＤＭＰＫの研究におけるＨＨの有用性がそれぞれ阻止される（図２、図３、図４および図９）。
【0141】
【表7】
【0142】
[実施例２]
ＡＬＤの研究に対するＤＭＳＯ２含有培地の使用。
ＤＭＳＯを含むフェーズ１培地は、２つの主要なアルコール代謝経路、すなわち、ＡＤＨ経路およびＣＹＰ２Ｅ１経路を有意に妨げる。研究者が、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）の最も有意な原因であり、有効な治療的介入がないＡＬＤ（米国におけるＣＬＤのほぼ５０％が、ＡＬＤによる）の研究に、回復されたＨＨを利用できる方法（培養条件）は存在しなかった。したがって、ＡＬＤの研究に適した培養条件の確立は、巨大な商業化の潜在性を持つ技術的進歩である。
ＡＬＤの研究に対するＤＭＳＯ２含有培地の使用。
ＤＭＳＯを含むフェーズ１培地は、２つの主要なアルコール代謝経路、すなわち、ＡＤＨ経路およびＣＹＰ２Ｅ１経路を有意に妨げる。研究者が、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）の最も有意な原因であり、有効な治療的介入がないＡＬＤ（米国におけるＣＬＤのほぼ５０％が、ＡＬＤによる）の研究に、回復されたＨＨを利用できる方法（培養条件）は存在しなかった。したがって、ＡＬＤの研究に適した培養条件の確立は、巨大な商業化の潜在性を持つ技術的進歩である。
【0143】
ＤＭＳＯ代用品の探索において、多数の有機化合物をスクリーニングした。化学物質のリスト（表７）は、分子サイズ、細胞培養培地に対する可溶性、標準的な温度における安定性（融解および沸騰温度）、取り扱い可能性（重大な化学的危険性の懸念がない）および費用などがあるがこれに限定されない、ＤＭＳＯと共有する特徴に基づいて選択される。これら化学物質は、ＤＭＳＯの代用として細胞培養培地に添加され、回復されたＨＨに直接毒性を引き起こさない最も高い濃度について最初にアッセイされた。可能な限り高い濃度で、回復されたＨＨ（７日齢）を、３～４日間毎の頻度で培地を新しくしながら７および１４日間さらに培養した。１４日および２１日目に、細胞を、機能的な評価に加えて形態学的および細胞運命評価に供した（図７および図８）。
【0144】
試験したそれらの中で、ＴＭＳＯおよびＤＭＳＯ２だけが、ＤＭＳＯ含有培地と同程度のレベルで形態構造およびマーカー遺伝子発現を維持する能力がある２つの条件である（図７および図８）。追跡実験から、ＴＭＳＯ含有培地が、ＤＭＳＯ含有培地とアルコール代謝経路に対して等しく抑制的であることが明らかになり（図１０）、一方ＤＭＳＯ２含有培地は、ＨＨが、ヒト肝臓の能力に似たレベルでエタノールを消費することを可能にする（図４）。
【0145】
研究は、密封装置を用いてＨＨにｉｎ ｖｉｔｒｏアルコール処理を実行することが重要であることも発見した（図１１）。エタノールの揮発性は高いため、エタノールは、肝細胞が代謝する速度より非常に高い速度で急速に蒸発する。その結果、ＤＭＳＯ２含有培地で培養されたエタノール処理ＨＨは、密封装置が適用される場合にのみＡＬＤに顕著な表現型である脂肪滴（ＬＤ）の蓄積を生ずる。ＡＬＤの研究に対する密封装置の使用は、技術的革新の別の態様である。
【0146】
ＨＨを培養するためにＤＭＳＯをＤＭＳＯ２に代える（すなわち、ＤＭＳＯをＤＭＳＯ２に置き換える）ことにより、細胞が完全回復を達成したら（ＤＭＳＯ含有培地で少なくともおよそ４日間、好ましくは７日間）、ＨＨはアルコール（エタノール）を代謝することが可能になる（図２、図３および図４）。ＤＭＳＯ２含有培地により、ＨＨは、メタノール、エチレングリコールおよびイソプロパノールなど、ヒト毒物学と関連性が高い他の型のアルコールの代謝ならびに毒性を試験することが可能になる。ＤＭＳＯ２含有培地により、ＨＨはビタミンＡ（これらも、ＡＤＨによって代謝される）を代謝することが可能になり、したがって、ＨＨは、ビタミンＡ生物学の研究に使用されることが可能になる。密封装置の適用は、ＡＬＤの研究（または高揮発性化学物質を用いるあらゆる代謝研究）の既定の実験条件になることになる（図１２）。
【0147】
[実施例３]
薬物毒性およびＤＭＰＫの研究におけるＤＭＳＯ２含有培地の使用。
ＤＭＰＫ研究は、薬物開発のプロセスにおける決定的なマイルストーンとして役立つので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの最高の適用の１つである。ＦＤＡおよび他の国の監督機関は、臨床研究前に新たに開発された化合物の前臨床スクリーニングのためのＨＨの利用を命じている。したがって、ＨＨは、前臨床研究スクリーニングツールとしてのその役割を満たすために、ヒト肝臓と同程度のレベルで完全に機能する薬物代謝経路を有するように義務付けられている。ＤＭＳＯ含有培地とＤＭＳＯ２含有培地で培養されたＨＨ間の類似性および差異を調査する研究において、結果から、ＤＭＳＯ含有培地が、非生体物質の取り込み、代謝および排出に関係する遺伝子を上方調節することが全体的に明らかになった（図１、図６および図９）。例えば、研究は、５０％を超える医薬の代謝に関与する最も重要な薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４の著しい上方調節を示した。加えて、研究は、ＤＭＳＯがＣＹＰ３Ａ４の代謝活性を強力に妨げることを見出し、薬物代謝酵素の超生理学的誘導が、阻害の程度を反映している可能性があることを示した（図３および図９）。そのような相互変化が、ＣＹＰ２Ｅ１においても見られ（図３および図９）、ＤＭＳＯ含有培地を用いる条件が、ＤＭＰＫの研究に適していないことをさらに示した。
薬物毒性およびＤＭＰＫの研究におけるＤＭＳＯ２含有培地の使用。
ＤＭＰＫ研究は、薬物開発のプロセスにおける決定的なマイルストーンとして役立つので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの最高の適用の１つである。ＦＤＡおよび他の国の監督機関は、臨床研究前に新たに開発された化合物の前臨床スクリーニングのためのＨＨの利用を命じている。したがって、ＨＨは、前臨床研究スクリーニングツールとしてのその役割を満たすために、ヒト肝臓と同程度のレベルで完全に機能する薬物代謝経路を有するように義務付けられている。ＤＭＳＯ含有培地とＤＭＳＯ２含有培地で培養されたＨＨ間の類似性および差異を調査する研究において、結果から、ＤＭＳＯ含有培地が、非生体物質の取り込み、代謝および排出に関係する遺伝子を上方調節することが全体的に明らかになった（図１、図６および図９）。例えば、研究は、５０％を超える医薬の代謝に関与する最も重要な薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４の著しい上方調節を示した。加えて、研究は、ＤＭＳＯがＣＹＰ３Ａ４の代謝活性を強力に妨げることを見出し、薬物代謝酵素の超生理学的誘導が、阻害の程度を反映している可能性があることを示した（図３および図９）。そのような相互変化が、ＣＹＰ２Ｅ１においても見られ（図３および図９）、ＤＭＳＯ含有培地を用いる条件が、ＤＭＰＫの研究に適していないことをさらに示した。
【0148】
したがって、研究は、ＤＭＳＯ２含有培地で培養された細胞が、生理的レベルでのＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｅ１の発現存在量を呈することを実証し、ＤＭＳＯ２で培養されたＨＨが、薬物代謝経路の点で生理的関連性を維持することを示した（図３および図９）。さらに、これら酵素の非生体物質代謝活性に対するＤＭＳＯ２の影響は、ＤＭＳＯ含有培地より実質的に少ない（図３および９）。
【0149】
研究は、ＤＭＯＳ２で培養された細胞が、薬物－薬物相互作用および薬物代謝酵素誘導の研究に適していることも明らかにした。例えば、古典的な抗発作（てんかん）薬の１つであるカルバマゼピンは、ＣＹＰ３Ａ４を誘導することが公知であり、さらに、ＣＹＰ３Ａ４によって代謝される。観察によると、ＤＭＳＯではなくＤＭＳＯ２で培養されたＨＨは、７日間のカルバマゼピン処理の間に用量依存的様式でＣＹＰ３Ａ４誘導を再現した。類似の結果は、リファンピシンで示される。加えて、ＤＭＳＯ２含有培地でなくＤＭＳＯ含有培地で維持されたＨＨが、超生理学的発現レベルのＣＹＰ２Ｅ１発現、および誘導物質（エタノールおよびイソニアジド）によるＣＹＰ２Ｅ１誘導の欠如を示すことを観察した（図９）。
【0150】
総合すれば、本発見は、ＤＭＳＯ２含有培地が、ＤＭＰＫの研究用としてのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＨＨの汎用性を大いに拡大することを示す。ＤＭＳＯ含有培地でなくＤＭＳＯ２含有培地は、非生体物質代謝のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の改善されたプラットフォームに役立つ。ＤＭＳＯ２含有培地の培養条件により、ＤＭＳＯ系培地の感度を超えてはるかに高い感度での生体異物代謝酵素誘導の検出が可能になる。ＤＭＳＯ２含有培地の培養条件は、長期培養にわたって生じる薬物毒性の検出のための実験的プラットフォームとして役立つ。ＤＭＳＯ２含有培地培養条件は、薬物－薬物相互作用（多薬投与）に起因する毒性を検出するための改善された実験条件を提供する。
【0151】
[実施例４]
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒト肝細胞の馴化培地の生産およびその固有の生物学的効果
ＣＭＨＨの発見は、ＨＬＣＭの生産における本技術により可能になった。手短に言えば、１匹のＨＬＣＭを生産するには、およそ１０５個のＰＨＨおよび／またはＨＬＣＭ－ＨＨが必要であり、それは宿主マウス（ｕＰＡ－ＳＣＩＤ系統など）の脾臓に注射される。これは、毒性導入遺伝子（ｕＰＡ）の過剰発現がある内在性マウス肝細胞が、移植されたヒト肝細胞との競合の結果増殖しない宿主マウスの肝臓においてＰＨＨの強力な増加をもたらす。（ＰＨＨ移植後に、内在性マウス肝細胞は減少し；一方、ＰＨＨ移植のない宿主マウスにおいて、マウス肝細胞は増殖することができ、減少しない）。ＰＨＨ移植後の８週間後、宿主マウスの肝臓は、９５％までヒト肝細胞によって置き換えられることになる。結果として、１匹のＨＬＣＭの肝臓から、２～３×１０８個のヒト肝細胞が得られ、それによりＨＬＣＭ－ＨＨの大量生産が可能になる。したがって、本技術は、ＨＬＣＭ－ＨＨの大量生産に使用されることになるＨＬＣＭ－ＨＨの安定な供給を提供する。加えて、ＣＭＨＨの生産においてＰＨＨに勝るＨＬＣＭ－ＨＨの優位性は、生存率および培養可能性である（Sugahara G. et al., Semin Liver Dis. 2020 May;40(2):189-212）。したがって、ＨＬＣＭ－ＨＨの使用は、ＰＨＨの使用に勝る経済的優位性を有する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒト肝細胞の馴化培地の生産およびその固有の生物学的効果
ＣＭＨＨの発見は、ＨＬＣＭの生産における本技術により可能になった。手短に言えば、１匹のＨＬＣＭを生産するには、およそ１０５個のＰＨＨおよび／またはＨＬＣＭ－ＨＨが必要であり、それは宿主マウス（ｕＰＡ－ＳＣＩＤ系統など）の脾臓に注射される。これは、毒性導入遺伝子（ｕＰＡ）の過剰発現がある内在性マウス肝細胞が、移植されたヒト肝細胞との競合の結果増殖しない宿主マウスの肝臓においてＰＨＨの強力な増加をもたらす。（ＰＨＨ移植後に、内在性マウス肝細胞は減少し；一方、ＰＨＨ移植のない宿主マウスにおいて、マウス肝細胞は増殖することができ、減少しない）。ＰＨＨ移植後の８週間後、宿主マウスの肝臓は、９５％までヒト肝細胞によって置き換えられることになる。結果として、１匹のＨＬＣＭの肝臓から、２～３×１０８個のヒト肝細胞が得られ、それによりＨＬＣＭ－ＨＨの大量生産が可能になる。したがって、本技術は、ＨＬＣＭ－ＨＨの大量生産に使用されることになるＨＬＣＭ－ＨＨの安定な供給を提供する。加えて、ＣＭＨＨの生産においてＰＨＨに勝るＨＬＣＭ－ＨＨの優位性は、生存率および培養可能性である（Sugahara G. et al., Semin Liver Dis. 2020 May;40(2):189-212）。したがって、ＨＬＣＭ－ＨＨの使用は、ＰＨＨの使用に勝る経済的優位性を有する。
【0152】
材料および方法：ＨＬＣＭは、肝臓中のヒト肝細胞の増加の程度、すなわち、置き換え指数（Ｒ．Ｉ．）の品質評価に供される。血清／血中ヒトアルブミンレベルは、Ｒ．Ｉ．とよく一致することが示された。１０ｍｇ／ｍＬより高い血中アルブミンレベルを持つＨＬＣＭは、高Ｒ．Ｉ．（＞７０％）と見なされる。高Ｒ．Ｉ．を持つＨＬＣＭは、コラゲナーゼ潅流に基づく方法によるヒト肝細胞の単離に優先的に供される。細胞品質（収率および生存率）の評価を受けて、ＨＬＣＭ由来ヒト肝細胞（ＨＬＣＭ－ＨＨ）は、細胞密度０．５～５×１０５個細胞／ｃｍ２（または一部の実現例では、２．１～４．２×１０５個細胞／ｃｍ２）で、コラーゲン［他の型の細胞外基質（ＥＣＭ）を含む／含まない］でコーティングされている細胞培養フラスコ／ディッシュ上に平板培養される。同様に、ＰＨＨまたはＨｅｐａＲＧ細胞は、コラーゲンコートされた細胞培養フラスコ／ディッシュ上へ平板培養される。［ＨＥＰＡＲＧ（商標）細胞株は、初代ヒト肝細胞の特徴を多く保持している不死化肝細胞株である。ＨＥＰＡＲＧ（商標）細胞は、最終分化しており、簡便な冷凍保存形式で提供される。］これら細胞は、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ２（またはその類似物もしくは等価物）を補充されたＨＣＧＭ（すなわち、ｄＨＣＧＭ、ｄ２ＨＣＧＭ、ｄＨＭＭまたはｄ２ＨＭＭ）培地（表８～表１０）（ＤＭＳＯ２を含有するｄＨＣＧＭなどがあるがこれに限定されない）で６ヵ月間（例えば、少なくとも２１日間、少なくとも４、５、６、７、８週間、または約２、３、４、５もしくは６ヵ月間）培養される。細胞播種４日後（好ましくは７日後）、培養培地は、２４～４８時間毎に置き換えられ、細胞とインキュベートされた培地は採取され、ヒト肝細胞馴化培地（ＣＭＨＨ）として保存される（図１２）。ＣＭＨＨの生物学的効果は、以下の節で述べる通り固有かつ強力である。
【0153】
【表8】
【0154】
【表9】
【0155】
【表10】
【0156】
ＣＭＨＨの生物学的効果は、ＨＬＣＭ－ＨＨを使用して評価され、その効果は、ＣＭＨＨとインキュベートされたＨＨの細胞構造が、多角形－立方体様細胞形態構造の再建および細胞間の緊密な接触の間の胆細管の形成によって証明される、健康な個体の肝臓組織中で最終分化したヒト肝細胞の細胞構造をよく再現していることを実証する（図１３）。加えて、胆汁分泌機構に関係するトランスポータの１つであるＭＲＰ２の蛍光基質を使用して、ＣＭＨＨ処理ＨＨにおいて生じた胆細管の機能を確認した（図１４）。さらに、ＣＭＨＨで処理されたＨＨは、肝細胞マーカー遺伝子の有意な上方調節、胆管細胞／肝前駆細胞マーカー遺伝子の下方調節、およびＨＨの細胞運命を損なうことが公知の経路であるＴＧＦ－β／Ｙａｐシグナル伝達の阻害を明らかにした（図１５）。さらに、予想した通り、新しいｄＨＣＧＭではなく、ＣＭＨＨで培養されたＨＨが、肝臓指向性ウイルス性病原体の１つであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する罹患性およびＨＢＶに対する抗ウイルス薬に対する応答（図１６および図１７）、ならびに非生体物質代謝経路の機能の増強（図１８）を示したことは；ＣＭＨＨで処理されたＨＨが、真正の最終分化したヒト肝細胞の細胞運命を呈することをさらに示した。最後に、ＤＭＳＯ２含有肝細胞培養培地（ｄＨＣＧＭ）で増やされたＣＭＨＨが、ＤＭＳＯ含有培地で調製されたものと比較して同レベルの生物学的効果を保有することを見出した（図１５）。
【0157】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された従来通りの肝細胞腫細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７細胞）、ならびに２９３細胞およびマウス初代肝細胞から得た馴化培地も試験し、その全てが、ＣＭＨＨに見られた生物学的効果を欠いている（図１９および図２０）。対照的に、ＨＬＣＭ－ＨＨ（異なる２名のドナー）またはＰＨＨ（異なる３名のドナー）で増やされたＣＭは全て、成熟した単核または二核細胞の多角形－立方体様の外観を含めた成熟し、最終分化したヒト肝細胞に特有の外見を維持する能力があり、緊密な細胞－細胞接触をよく確立し、胆細管形成を促進する（図２１）。加えて、ＨＬＣＭ－ＨＨ（２名の異なるドナー）またはＰＨＨ（３名の異なるドナー）で増やされたＣＭＨＨは全て、「肝細胞マーカー」遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＡＬＤＨ２）の上方調節／維持、および脱分化／分化形質転換遺伝子（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、Ｃｙｒ６１、ＣＴＧＦおよびＣＫ１９）の抑制を支持する能力があった（図２２）。
【0158】
マトリゲル（登録商標）および５種類の化学物質の組合せ（すなわち、５Ｃ）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された肝細胞の成熟および機能を増強させるために提案された方法論がいくつか存在した（Xiang C., Science. 2019 Apr 26;364(6438):399-402）。比較すると、本産物（ＣＭＨＨ）は、成熟ＨＨの特徴である外見の維持に対して実質的により強力な効果を呈した（図２３）。さらに、本遺伝子発現分析により、ＣＭＨＨの効果が、マトリゲル（登録商標）または５Ｃ［５種類の化学物質：フォルスコリン（ＦＳＫ；アデニル酸シクラーゼ活性化因子）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３；ＴＧＦ－β阻害剤）、ＤＡＰＴ（Ｎｏｔｃｈ阻害剤）、ＩＷＰ２（Ｗｎｔ阻害剤）、およびＬＤＮ１９３１８９（ＢＭＰ阻害剤）］の効果と大きく異なることが明らかになった（図２４）。本分析により、特にＨＨの脱分化／分化形質転換の防止においてマトリゲル（登録商標）および５Ｃの生物学的効果が、ＣＭＨＨと異なっており、弱いことが明らかになった。
【0159】
ＣＭＨＨ中に存在する体液因子も分析した。最初に、サイズ排除カラムによって濾過したＣＭの分析は、ＨＨの細胞運命および機能的維持に関与するＣＭＨＨの鍵となる生物活性組成物が、ＨＨから分泌されるタンパク質分子によって大部分が媒介されることを示す（図２５）。ＣＭＨＨ中に含有されるタンパク質分子の評価は、マトリゲル（登録商標）との明確な対比である、ＬＡＭＣ２、ＦＧＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ３およびＴＧＭ２の高い存在量を明らかにする（図２６）。加えて、ＣＭＨＨは、Ａ２ＭＧ、Ａ１ＡＴ、アルブミンなどがあるがこれに限定されない肝細胞に固有の分泌タンパク質を含有し、そのほとんどは、肝細胞保護特性を備える。
【0160】
総合すれば、細胞外基質とＨＨに固有の分泌タンパク質との組合せから構成されるＣＭＨＨ中のヘパトカインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒト肝細胞に特殊化した生物学的機能を呈する。
【0161】
[実施例５]
初代肝細胞の回復および維持に対するＣＭＨＨの適用
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の回復および維持に対するＣＭＨＨの生物学的効果を試験した。一般に、初代肝細胞における生存率、培養可能性および寿命は、ロット間およびドナー間で実質的に異なり；そのため、最適な細胞密度での細胞播種はほとんど達成されず、結果として本来の特性が消失する。したがって、ＰＨＨは、汎用性が限られた、すぐに使用期限が切れる研究ツールと認められた。冷凍保存されたヒト肝細胞の回復および細胞運命維持に対するＣＭＨＨの生物学的効果を試験した。この目的のために、冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨを解凍し、ＣＭＨＨまたは新しいｄＨＣＧＭのいずれかと７日間培養し、その後光学顕微鏡によって細胞構造を、蛍光顕微鏡的分析によって胆汁分泌機構を、および肝細胞マーカー遺伝子の発現存在量を評価した（図２７、図２８および図２９）。凍結－解凍プロセスに関連するストレスおよび傷害からのヒト肝細胞の強力な回復を観察し；ＣＭＨＨとのインキュベーションは、最終分化したヒト肝細胞の特徴である適切な設計上の構造の再建、機能、およびマーカー遺伝子の発現存在量を支持し、それは、新しいｄＨＣＧＭおよび製造業者によって供給される培養培地との明確な対比である。
初代肝細胞の回復および維持に対するＣＭＨＨの適用
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の回復および維持に対するＣＭＨＨの生物学的効果を試験した。一般に、初代肝細胞における生存率、培養可能性および寿命は、ロット間およびドナー間で実質的に異なり；そのため、最適な細胞密度での細胞播種はほとんど達成されず、結果として本来の特性が消失する。したがって、ＰＨＨは、汎用性が限られた、すぐに使用期限が切れる研究ツールと認められた。冷凍保存されたヒト肝細胞の回復および細胞運命維持に対するＣＭＨＨの生物学的効果を試験した。この目的のために、冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨを解凍し、ＣＭＨＨまたは新しいｄＨＣＧＭのいずれかと７日間培養し、その後光学顕微鏡によって細胞構造を、蛍光顕微鏡的分析によって胆汁分泌機構を、および肝細胞マーカー遺伝子の発現存在量を評価した（図２７、図２８および図２９）。凍結－解凍プロセスに関連するストレスおよび傷害からのヒト肝細胞の強力な回復を観察し；ＣＭＨＨとのインキュベーションは、最終分化したヒト肝細胞の特徴である適切な設計上の構造の再建、機能、およびマーカー遺伝子の発現存在量を支持し、それは、新しいｄＨＣＧＭおよび製造業者によって供給される培養培地との明確な対比である。
【0162】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス、ラットおよびイヌの初代肝細胞の回復および維持に対するＣＭＨＨの生物学的効果を試験した。これら種の初代肝細胞の生存率、培養可能性および寿命は、ＨＬＣＭ－ＨＨより実質的に低く；そのため、最適な細胞密度での細胞播種はほとんど達成されず、結果として本来の特性が消失する。ＰＨＨと類似して、マウス、ラットおよびイヌ初代肝細胞とＣＭＨＨとのインキュベーションは、初代肝細胞の形態学的外見および機能の特徴の維持における強力な生物学的効果を実証する（図３０）。
【0163】
ＣＭＨＨの強力な効果は、ＨＨの細胞運命および機能の維持のためだけではない可能性があり、幹細胞由来肝細胞様細胞、すなわち、ｉＨｅｐ（誘導性肝細胞様細胞）のさらなる分化に必要な環境を提供している可能性がある。その結果、形態学的構成に対するＣＭＨＨの効果を試験した。ＰＨＨおよびＨＬＣＭ－ＨＨに対する効果と類似して、ＣＭＨＨ処理は、多角形－立方体様の外観を呈するヒト肝細胞様細胞間の胆細管の形成を促進する（図３１）。単一細胞ＲＮＡ配列決定手法によりｉＨｅｐの特徴に対するＣＭＨＨの効果を評価した（図３２および図３３）。古典的次元縮小手法である主成分分析（ＰＣＡ）は、ＣＭＨＨで処理されたＨＬＣＭ－ＨＨとｉＨｅｐ間の次元が、ｉＨｅｐ培養培地で処理されたものよりはるかに低いことを実証する。
【0164】
ＣＭＨＨが、Ｃｌｉｐ細胞の再分化を促進するかどうかも試験する。Ｃｌｉｐ細胞とＣＭＨＨとのインキュベーションが、新しいｄＨＣＧＭで培養された細胞と比較して肝細胞マーカー遺伝子の有意な上方調節を促進する（図３４）ことは、ＣＭＨＨが、細胞運命維持特性だけでなく肝細胞誘導性分化特性も有することも示す。
【0165】
ヒト肝細胞の細胞運命維持に対するＣＭＨＨの好ましい効果および堅牢性を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。ＣＭＨＨまたはｄＨＣＧＭ（対照培地）のいずれかと培養されたヒト肝細胞は、ヒト化肝臓キメラマウスの宿主マウス内に移植され、生着および増加能力の程度が監視された。ＣＭＨＨ処理とｄＨＣＧＭ処理両方のヒト肝細胞から、移植後２日目に血中ヒトアルブミンレベルにより、同程度の生着が明らかになる（図３５）。しかしながら、後の時点、移植後１４日目および２１日目に、ＣＭＨＨ処理ＨＨは、血中ヒトアルブミンレベルに基づいてｄＨＣＧＭ処理ＨＨより強力な増加能力を呈する。ＨＬＣＭ宿主マウスの肝臓内で増殖する潜在性は、初代肝細胞の品質の代用となるので、このｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果は、ＣＭＨＨの生物学的効果に対する証拠のさらなる積み重ねを与える。
【0166】
最後に、冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨの回復および運命維持に対するＣＭＨＨの有用性を試験した。この目的のために、冷凍保存されたＨＬＣＭ－ＨＨは、解凍され、上の節に示される最適化条件で播種され、ＣＭＨＨまたは新しいｄＨＣＧＭの存在下で培養された。予想通りに、ＣＭＨＨ処理は、形態構造、および最終分化した肝細胞と同程度のレベルで肝細胞マーカー遺伝子の発現存在量を大いに改善した（図３６および図３７）。
【0167】
要約すると、本研究は、ＣＭＨＨが、初代肝細胞の回復および維持を強力に支持する培養補助剤となることを示す。これら効果は、新たに単離されたか冷凍保存されていたかにかかわらず、初代ヒト肝細胞だけでなく、ＨＬＣＭ－ＨＨ、マウス、ラットおよびイヌの初代肝細胞にも固有でない。加えて、ＣＭＨＨが、未成熟肝細胞（例えば、ｉＨｅｐ、ＣＬｉＰ）のさらなる成熟を促進することは、肝臓移植の代わりとなる幹細胞由来肝細胞移植療法の今後の開発に寄与する可能性が高いことになる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図】
【図12】
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【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
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【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【国際調査報告】